CN117979962A - 用于治疗癌症的新颖协同组合及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新颖组合物、组合和方法，所述新颖组合物、组合和方法涉及抑制EZH2的化合物以及其用于治疗和/或预防与甲基转移酶EZH2相关的肿瘤的用途。更具体地，本发明涉及用于在治疗和/或预防与甲基转移酶EZH2相关的肿瘤的方法中使用的协同双重疗法组合物，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述组合物，其中所述组合物包括EZH2抑制剂和一种HMG‑CoA还原酶抑制剂或他汀类的组合。本发明还涉及协同三重疗法组合物以及其用于治疗和/或预防特定类型的癌症和肿瘤的方法，所述方法包括进一步施用有效量的一种或多种抗癌药物或化疗剂与上述双重疗法组合物的组合。

Description

用于治疗癌症的新颖协同组合及其使用方法
技术领域
本发明涉及新颖协同组合以及用于治疗和/或预防特定类型的癌症和肿瘤的方法，如具体地与组蛋白甲基转移酶Zeste同源物2增强子(EZH2)相关的癌症和肿瘤。本发明还涉及用于药物组合物，所述药物组合物包括用于治疗和/或预防组蛋白甲基转移酶EZH2相关的癌症和/或肿瘤的所述协同组合。本发明进一步涉及一种新标志物，所述Zeste同源物2增强子(EZH2)，以及EZH2作为更高复发或死亡概率的预后因子的用途，以及分析所述生物标志物EZH2以预测患有特定类型的癌症的受试者的预后的方法。
背景技术
表观遗传学修饰可以通过DNA甲基化和去甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等调控染色质状态和基因表达，而不会改变DNA序列。多梳基团蛋白(PcG)是一组重要的表观遗传学调控因子，在细胞增殖中起着重要作用，并且是干细胞的多能性和分化以及恶性转化期间异常基因表达的关键因素。PcG蛋白含有两种核心复合物，分别是维持复合物多梳抑制复合物1(PRC1)和起始复合物多梳抑制复合物2(PRC2)。已知PRC1通过RING1A和RING1B泛素连接酶在Lys 119处单泛素化组蛋白H2A。PRC2已经被认为催化组蛋白H3在Lys 27处的单甲基化、二甲基化和三甲基化以调控基因转录。
zeste同源物增强子2(EZH2)是一种在许多物种中鉴定的进化保守基因，共享相似的结构基序和结构域。组蛋白甲基转移酶EZH2已被鉴定为PRC2的催化亚基，用于通过其C末端中的SET结构域使组蛋白H3在Lys 27(H3K27me3)处三甲基化，从而沉默靶向的基因并参与各种生物功能(例如，细胞周期、细胞增殖、细胞分化等)。EZH2在癌症进展中的作用也已经被考虑。EZH2在各种恶性肿瘤(如前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌)中异常过表达。EZH2介导H3K27me3，并且在许多恶性肿瘤模型中作为促进肿瘤生长和转移的关键因素发挥作用。另外，在各种癌症中也发现了EZH2增益或功能缺失突变。一些研究表明，通过小分子抑制剂或基因敲低对EZH2的抑制引起癌细胞生长和肿瘤形成减少。除了以PCR2依赖性方式作为组蛋白修饰剂发挥作用外，EZH2还在癌症中以PCR2和组蛋白非依赖性方式发挥作用。例如，EZH2可以在胶质母细胞瘤中甲基化非组蛋白蛋白质STAT3，并且作为共同激活剂参与去势抗性前列腺癌(CRPC)中的雄激素受体相关复合物。如Gan L等人(《生物标志物研究(BiomarkRes)》6,10(2018).doi.org/10.1186/s40364-018-0122-2)所描述的，EZH2在癌症中的不同功能源自其在不同情况和不同类型的癌症中的遗传、转录、翻译后和翻译后调控。
最近出现了支持EZH2的致癌作用的进一步发现。研究表明，在22％的生发中心B细胞(GCB)弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤(DLBCL)和7％至12％的滤泡性淋巴瘤(FL)中，EZH2的C末端催化SET结构域内的酪氨酸641(Y641)的反复杂合点突变发生。这被证明赋予了酶活性的功能增益，引起H3K27向三甲基化的形式的转化增强。Y641突变体(Y641F、Y641N、Y641S、Y641C和Y641H)对未甲基化的H3K27的甲基化活性降低，但对H3k27的二甲基化的版本的活性增强。因此，突变体与野生型EZH2协同作用，使H3K27的稳定状态转变为有利于三甲基化，并且因此抑制多梳靶标的表达。在非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas，NHL)中也发现了A677和A687残基处的EZH2点突变，其中其类似地引起H3K27的超三甲基化。突变体EZH2在癌症中的功能增译作用的另外的支持来自于在通常拮抗EZH2活性的其它染色质调控因子中的癌症相关的功能丧失突变的鉴定。UTX(X染色体上普遍转录的三角形四肽重复基因)是一种组蛋白去甲基酶，其部分功能是通过从二甲基化的和三甲基化的H3K27中去除甲基来拮抗EZH2活性。影响UTX的灭活突变发生在若干种类型的人类癌症中，包含多发性骨髓瘤、髓母细胞瘤、食管癌、膀胱癌、胰腺癌和肾癌。这些突变包含纯合子(女性中)或半合子(男性中)大缺失、无义突变、小移框插入/缺失和导致过早终止密码子的共有剪接位点突变。几乎所有的突变都被预测会引起UTX的JmjC结构域的缺失，这对其脱甲基酶活性至关重要，并且已被证明会导致H3K27三甲基化水平的增加。因此，如Kim KH等人(靶向癌症中的EZH2(Targeting EZH2 in cancer).《自然医学(Nat Med.)》2016；22(2):128-134.doi:10.1038/nm.4036)所描述的，UTX中的功能缺失突变可能类似于EZH2中的功能增益突变引起的突变。
尽管有这样的理解，EZH2抑制剂用于预防和/或治疗肿瘤和癌症的功效仍然存在争议。若干候选物已经或目前正在进行临床试验，并因此且到目前为止可用的数据还不是决定性的。
第一种EZH2抑制剂是3-去氮腺嘌呤A(DZNep)。DZNep是一种已知的S-腺苷-L-半胱氨酸(SAH)水解酶抑制剂，通过SAH的增加间接抑制EZH2，所述SAH直接抑制S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性组蛋白甲基转移酶活性。DZNep全局抑制组蛋白甲基化，但对EZH2没有特异性。
第二种候选GSK-126(也称为GSK2816126)显示出抑制野生型和Y641突变体EZH2的效力相似，并且与EZH1(效力增加150倍)或20种其它甲基转移酶(对EZH2的选择性>1000倍)相比具有高选择性。2019年启动了一项多中心1期临床试验，以评估GSK-126(NCT02082977)在复发性/难治性实体瘤和血液系统恶性病患者中的安全性、最大耐受剂量(MTD)、药代动力学和药效学。四十一位参与者(21位实体瘤，20位淋巴瘤)接受了剂量范围为50mg至3000mg的GSK2816126，每周两次，作为静脉内溶液持续28天(3周用药/1周休息)。然而由于给药方法和相对较短的半衰期限制了有效暴露，结果显示临床活性证据不足，无法证明进一步的临床研究是合理的，因此这一临床期终止(参见临床试验第NCT02082977号)。Yap TA等人(《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》.2019年12月15日；25(24):7331-7339)也报告了此临床期的结果，得出结论，尽管临床前数据显示出多种实体瘤和淋巴瘤细胞系的敏感性，GSK2816126不是难治性/复发性实体瘤和血液系统恶性病患者中靶向EZH2的可行药物。所述研究将GSK2816126的最大耐受剂量(MTD)定义为2,400mg，但在此水平上，药物显示出不足的临床活性，其中脱靶剂量限制毒性(DLT)阻碍了进一步的剂量递增。
还开发了EZH2的若干种其它S-腺苷-甲硫氨酸竞争抑制剂，尤其包含GSK343、GSK926和他泽司他(tazemetostat，E7438/EPZ6438)。GSK926和GSK343可以抑制乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中的组蛋白H3K27me3水平并抑制EZH2活性，而GSK343由于在大鼠药代动力学研究中具有较高的清除率，因此只能在体外使用。
他泽司他显示出改进的效力和药代动力学特性，并且可以口服施用。Wiese M等人(《临床儿科(Klin Padiatr)》.2016年4月；228(3):113-7)研究了EZH2和其它PRC2基因(EZH1、SUZ12、EED)的表达与儿童多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者总生存率的相关性，以及他泽司他对携带H3.3突变或H3野生型的儿童多形性/弥漫性内生型桥脑胶质瘤/弥漫性中线胶质瘤(GBM/DIPG/DMG)细胞EZH2抑制的细胞毒性影响。然而，Wiese等人得出结论，用这种EZH2抑制剂治疗这些肿瘤并不代表一种有前景的方法。尽管如此，USFDA于2020年6月授予了EZH2抑制剂他泽司他(TAZVERIK，雅酶生物公司(Epizyme,Inc.))的加速批准，用于复发性或难治性(R/R)滤泡性淋巴瘤(FL)的成人患者，其肿瘤对EZH2突变呈阳性，如通过FDA批准的测试所检测的，并且之前接受过至少2次全身治疗，以及用于没有令人满意的替代性治疗选择的患有R/RFL的成人患者。
因此，目前需要具有更大治疗功效的新方法和组合物用于治疗和/或预防与甲基转移酶EZH2活性相关的许多恶性病。本发明解决了这一需求并提供了新颖疗法。
发明内容
本发明涉及协同双重疗法组合物以及其用于治疗和/或预防特定类型的癌症和肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述组合物，其中所述组合物包括EZH2抑制剂和一种他汀类的组合。
本发明还涉及协同三重疗法组合物以及其用于治疗和/或预防特定类型的癌症和肿瘤的方法，所述方法包括进一步施用有效量的一种或多种抗癌药物或化疗剂与上述双重疗法组合物的组合。
根据本发明的协同双重疗法和三重疗法组合物在治疗特定类型的癌症和与组蛋白甲基转移酶EZH2相关的肿瘤方面特别有效。
最重要的是，与先前的临床试验相比，根据本发明的协同双重疗法和三重疗法允许将EZH2抑制剂的剂量方案减少至少一半，并且因此表现出大幅降低的毒性，同时保持针对所述肿瘤的治疗效率。事实上，申请人在下文中显示，施用一种EZH2抑制剂(如GSK-126)与至少一种他汀类和/或一种或多种抗癌药物或化疗剂的组合使癌症或肿瘤对GSK-126敏感，由此逆转或降低患者对GSK-126的耐药性。
本发明还提供了EZH2作为一些癌症受试者，特别是患有肝母细胞瘤或弥漫性内生型桥脑胶质瘤(DIPG)的患者的不良预后的生物标志物的用途，以及预测所述受试者的不良预后的方法，所述方法包括确定所述受试者的分离的样品中的EZH2的水平。
附图说明
图1A-E：示出了DMG细胞在低剂量下对GSK-126抑制剂敏感，并且GSK-126阻断H3k27me3三甲基化。(A)与正常脑(n＝10)相比，EZH2转录物在一系列DMG活检(n＝35)中显著过表达(从GSE50021检索的微阵列数据)。虚线方形分隔围绕中值表达重新组合的样品。DMG活检与正常脑之间的参数t检验。(B)患者源性细胞系表达通过蛋白质印迹检测到的EZH2蛋白。(C-D)GSK-126强烈抑制NEM157i和SU-DIPG-IVi DMG细胞的增殖(C)，并且在处理5天后诱导肿瘤细胞死亡(D)。单向ANOVA(n＞3，p＜0.0001)，邦费罗尼多重比较(Bonferroni′s multiple comparisons)后检验。(E)在GSK-126处理的NEM157i和SU-DIPG-IVi DMG细胞中，H3k27me3三甲基化以剂量依赖性方式减少。一个印迹代表3个独立实验。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***；p＜0.001。
图2A-C：示出了DMG细胞在低剂量下对GSK-126抑制剂敏感。(A-C)在存在增加剂量的GSK-126(n＝3)的情况下，在处理72小时后测量SU-DIPG-IVi(A)、NEM157i(B)和NEM163i(C)DMG细胞的细胞活力。对于每个细胞系，IC50在对应的图中示出。
图3：示出了GSK-126处理的DIPG细胞中参与脂质和胆固醇合成的基因的增加的表达。图示出了通过实时定量PCR在用1.5％ DMSO或GSK-126处理的NEM163i、NEM157i和SUDIPG IVi细胞中测量的HMGCS,HMGCR、LDLR、NPC1和SQLE转录物的归一化的水平(在每个细胞系中测量的IC50，n＝6，未配对的曼-惠特尼检验(Mann&Whitney test))。GAPDH转录物被用作归一化的内部对照。**p<0.01；***p<0.001。
图4：示出了GSK-126处理的DIPG细胞中的SQLE蛋白和HMGCR蛋白的增加的表达。在用1.5％ DMSO或GSK-126处理的NEM163i和SU-DIPG-IVi细胞中通过蛋白质印迹测量的HMGCR蛋白和SQLE蛋白的水平(在每个细胞系中测量的IC50，n＝4至5，未配对的曼-惠特尼检验)。GAPDH蛋白用作归一化的内部对照。示出了2个至4个独立实验的代表性印迹，*p<0.05；**p<0.01。
图5A-C：示出了胆固醇生物合成通路酶的抑制剂(剂量在X轴上示出)对SU DIPGIVi细胞和NEM157i DMG细胞的活力没有影响。(A-C)涉及胆固醇生物合成途径并由GSK-126诱导的不同酶的三种不同的化学抑制剂[(A)特比萘芬(Terbinafine)：角鲨烯环氧化酶——SQLE，(B)阿托伐他汀(Atorvastatin)：羟甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶——HMGSC1，(C)ACSS2抑制剂：乙酸依赖性乙酰-CoA合成酶2——ACCS2]对至多30μM的DMG细胞增殖没有影响，这表明在不存在GSK-126的情况下，细胞对这些抑制剂不敏感。单向ANOVA(n＝3，p<0.0001)，邦费罗尼多重比较后检验。*，p<0.05；**，p<0.01。
图6A-C：示出了包括GSK-126和胆固醇生物合成途径酶的抑制剂的双重疗法对DMG细胞的协同作用。(A-C)暴露于4μM的GSK-126(对DMG细胞没有生长抑制作用(空心圆圈))以及暴露于增加剂量的ACSS2抑制剂(A)、阿托伐他汀(B)或特比萘芬(C)的NEM157i细胞和SUDIPG IVi细胞(如所指示的)的细胞生长测定。单向ANOVA(n＝3，p<0.0001)，邦费罗尼多重比较后检验。从低微摩尔剂量的他汀类开始(其单独没有显示出效果)，双重疗法处理显示出显著的增殖抑制(参见图3)。**，p<0.01；***，p<0.001。
图7A-E：示出了新的原代DMG细胞系BXdmg1的分子和表型特性。(A)BXdmg1原代细胞表征。左上小图：亮场显微镜示出了早期传代BXdmg1原代细胞的细胞形态。条＝200μm。中上小图：Cytoblock制备的H&E染色显示核不规则。右上小图：使用Ki-67染色的增殖状态。左下小图：BXdmg1细胞中存在H3K27M突变的证明。中下小图：BXdmg1细胞中的H3K27me三甲基化的状态。右下小图：组蛋白蛋白质分离的蛋白质印迹显示暴露于GSK-126后H3K27me的典型减少。(B，C)BXdmg1增殖被GSK-126抑制，其中IC50为10.36μM，与其它DMG细胞的敏感性相当(参见图2)。单向ANOVA(n＝3，p<0.0001)，邦费罗尼多重比较后检验。(D)BXdmg1细胞对暴露于胆固醇生物合成抑制剂不敏感。(E)GSK-126和阿托伐他汀(Ator)的组合处理显示出比单独的GSK-126或阿托伐他汀更强的生长抑制。组合效应在低剂量下是可见的，并且在较高剂量的GSK-126下由于其在这些浓度下的单独细胞毒性而丧失。单向ANOVA(n＝3，p<0.0001)，邦费罗尼多重比较后检验。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图8A-C：示出了GSK-126和胆固醇生物合成通路酶的抑制剂对DMG细胞迁移的协同作用。(A-C)通过伤口划痕测定在NEM157i(A)和NEM163i(B)细胞中以及BXdmg1原代细胞(C)中显示的组合处理中的细胞迁移损伤。单向ANOVA(n＝3，p<0.0001)，邦费罗尼多重比较后检验。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图9A-E：示出了GSK-126和胆固醇生物合成通路酶的抑制剂对DMG球体形成的协同作用。(A，B，D)暴露于指示的抑制剂后源自指示的DMG胶质瘤细胞的代表性球体的相位对比显微照片。(C，E)对源自DMG细胞系的球体的形成的处理效果的统计分析，如上方对应的图所示。表型标准是形成或未形成球体(分散的细胞)。费希尔精确检验(Fisher'Exact test)用于比较相关处理和组合(combination)(组合(combo))。NEM157i的GSK-126剂量是20μM，并且其它的剂量是15μM。***，p<0.001。
图10A-C：示出了GSK-126和胆固醇生物合成通路酶的抑制剂对小鼠的DMG肿瘤发展的协同作用。(A)GSK-126腹膜内处理后植入NOD/LtSz-scid IL2Rγ(NSG)小鼠的脑干的SU-DIPG-IVi-Luc细胞(表达荧光素酶)的原位肿瘤生长抑制。在指定的处理后，通过生物发光实时成像和统计分析证明了所有小鼠的肿瘤生长抑制(溶剂对照：DMSO；GSK-126)。灰度条指示表达的水平，浅灰色值等于低，并且深灰色值等于高表达。参数t斯图登氏检验(Student test)(DMSO：n＝18；GSK-126：n＝23)。(B)在非细胞毒性剂量的GSK-126与非细胞毒性剂量的阿托伐他汀的组合下进行相同的方法。两种药物的组合显示出显著的生长抑制作用，而单一处理无效。条指示中值加范围。单向ANOVA(DMSO：n＝13；阿托伐他汀：n＝13；GSK-126：n＝17；组合：n＝13，p<0.0001)，邦费罗尼多重比较后检验。(C)使用雏鸡CAM DMG模型获得了类似的肿瘤生长抑制结果，其中在组合处理中观察到植入的肿瘤的血管生成表型较少，而单一处理没有抗血管生成作用，双侧费希尔精确检验。ns，不显著；*，p<0.05；**p<0.01。
图11A-B：示出了EZH2沉默阻碍了体内肝母细胞瘤的发展。(A-B)用对照siRNA(SiCTR)或针对EZH2的siRNA(SiEZH2)转染Huh6细胞(A)或HepG2细胞(B)。24小时后，在胚胎发育的第10天收集细胞并将其移植到雏鸡绒毛尿囊膜(CAM)上。从第11天至第16天监测肿瘤生长。对于两种细胞系和指示的条件，左上小图：肿瘤在第17天以及切除和多聚甲醛固定(泳道2)后在CAM(泳道1)上生长的代表性图片。对于两个细胞系，右上小图：SiCTR肿瘤与SiEZH2肿瘤在第7天出现或不出血的CAM的数量作为条示出。双侧费希尔精确检验。对于两种细胞系，下方小图：在SiEZH2或SiCTR转染的Huh6细胞植入后第6天，切除肿瘤并称重。左侧小图：在指示的条件下提取的肿瘤的代表性图片。右侧小图：条表示肿瘤重量的平均值+/-SD，单位为mg。每组分析的蛋的总数显示在对应的条件上方的括号中。参数t斯图登氏检验。**，p<0.01；****，p<0.0001。
图12A-B：示出了单独的顺铂(cisplatin)或两种EZH2抑制剂对肝母细胞瘤细胞的存活率的影响。(A-B)示出了Huh6和HepG2细胞在存在增加浓度的顺铂(A，上方小图)、GSK-126(A，下方小图)或EPZ-6438(他泽司他，B)的情况下生长48小时。使用来自普洛麦格公司(Promega)的CellTiter AQueous单溶液细胞增殖测定测量细胞存活率和IC50。对应的条件的IC50如所示出的。
图13A-C：示出了在2D培养条件和3D培养条件下将顺铂和GSK-126组合对肝母细胞瘤细胞的活力的影响。(A-B)Huh6细胞和HepG2细胞在经典2D培养条件下，或在存在单独的GSK-126、单独的顺铂或两者的组合的情况下作为肿瘤球体生长72小时。单独使用时，选择的药物浓度可杀伤50％的肝母细胞瘤细胞(参见图12中的每个细胞系和药物的IC50)。(A)使用来自普洛麦格公司的CellTiter AQueous单溶液细胞增殖测定测量细胞存活率(n＝5，单向ANOVA，p<0.0001)，西达克氏多重比较(Sidak'smultiple comparisons)后检验。(B)用钙黄绿素-AM底物(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Calcein-AM)将活细胞染成绿色，并且使用乙锭同二聚体(EthD-1，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/12328897)将死细胞染成红色。数据显示GSK-126和顺铂在体外对在2D条件和3D条件下生长的肝母细胞瘤细胞具有另外的抗肿瘤作用。***，p<0.001；****，p<0.0001。
图14A-B：示出了EZH2耗竭增加了肝母细胞瘤细胞对顺铂的敏感性。(A)Huh6(左侧)细胞和HepG2(右侧)细胞用对照(SiCTR)或两种不同的SiEZH2(SiEZH2-1和SiEZH2-2)转染，并且在存在增加浓度的顺铂的情况下生长72小时。使用来自普洛麦格公司的CellTiterAQueous单溶液细胞增殖测定测量细胞存活率。(n＝4，双向ANOVA，p<0.0001)，西达克氏多重比较后检验。浅灰色星号：对照细胞与SiEZH2-1转染的细胞之间的细胞活力的显著变化。黑色星号：对照细胞与SiEZH2-2转染的细胞之间的细胞活力的显著变化。(B)对照(SiCTR)或siEZH2转染的HepG2细胞在存在12μM的顺铂(＝IC50)的情况下作为肿瘤球体生长48小时。用钙黄绿素-AM底物将活细胞染成绿色，并且用EthD-1将死细胞染成红色(参见图11B)。3个独立实验的一个代表性说明。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01。
图15A-B：示出了他汀类与GSK-126协同以根除肝母细胞瘤细胞。(A)Huh6细胞(左侧)和HepG2细胞(右侧)在存在增加浓度的辛伐他汀(Simvastatin)或阿托伐他汀的情况下处理72小时(n＝3，单向ANOVA，p<0.0001；西达克氏多重比较后检验，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001)。(B)Huh6细胞(左侧)和HepG2细胞(右侧)在存在增加浓度的GSK-126(上方小图)或顺铂(下方小图)的情况下，或在不存在或存在4μM的辛伐他汀或8μM的阿托伐他汀的情况下处理72小时。(n＝3，双向ANOVA，p<0.0001，西达克氏多重比较后检验)。(A-B)使用来自普洛麦格公司的CellTiter AQueous单溶液细胞增殖测定在所有条件下测量细胞活力和IC50。浅灰色星号：单独的GSK-126和与指示的浓度的阿托伐他汀组合的GSK-126之间的细胞活力的显著变化。黑色星号：单独的GSK-126和与指示的浓度的辛伐他汀组合的GSK-126之间的细胞活力的显著变化。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图16A-B：示出了在不存在或存在顺铂的情况下，他汀类与GSK-126协同作用，用于在体外根除肝母细胞瘤细胞。(A-B)Huh6细胞(A)和HepG2细胞(B)在存在增加浓度的辛伐他汀(右侧小图)或阿托伐他汀(左侧小图)的情况下，用3μM的GSK-126与3μM的顺铂组合或不组合处理72小时。使用来自普洛麦格公司的CellTiter AQueous单溶液细胞增殖测定测量细胞活力(n＝3，双向ANOVA，p<0.0001；西达克氏多重比较后检验)。§：溶剂对照(DMSO)与单独的GSK-126或与任何测试的浓度的所指示的他汀类组合的GSK-126之间的细胞活力的显著变化。*：溶剂对照(DMSO)与GSK-126+顺铂或与任何测试的浓度的所指示的他汀类组合的GSK-126+顺铂之间的细胞活力的显著变化。#：在所指示的他汀类的所指示的浓度下，GSK-126与GSK-126+顺铂之间的细胞活力的显著变化。*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.0001；##，p<0.01；###，p<0.001；####，p<0.0001；§§，p<0.01；§§§，p<0.001；§§§§，p<0.0001；
图17：示出了他汀类强烈增加肝母细胞瘤细胞对他泽司他(EPZ-6438)的敏感性。Huh6细胞(左侧)和HepG2细胞(右侧)在不存在或存在8μM的阿托伐他汀或4μM的辛伐他汀的情况下，在存在增加浓度的他泽司他的情况下处理72小时(如每个图下方的图例所指示的)。使用来自普洛麦格公司的CellTiterAQueous单溶液细胞增殖测定测量每种条件下的细胞活力和IC50(参见括号中每种条件的值)(n＝3，双向ANOVA，p<0.0001；西达克氏多重比较后检验)。黑色星号：单独的他泽司他与存在辛伐他汀的情况下的他泽司他之间的细胞活力的显著变化。浅灰色星号：单独的他泽司他与存在阿托伐他汀的情况下的他泽司他之间的细胞活力的显著变化。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。
图18a-c：示出了EZH2在肝母细胞瘤中的增加的表达。特别是图18a示出了与C1亚组和C2B亚组以及来自我们的数据集(gse104766,Hooks KB,Audoux J,Fazli H,LesjeanS,Ernault T,Dugot-Senant N等人,增殖性肝母细胞瘤诊断和治疗选择的新见解(Newinsights into diagnosis and therapeutic options for proliferativehepatoblastoma).《肝病学(Hepatology)》2018；68:89-10)中的非肿瘤样品(NT，在此图和以下)相比，增殖性C2A亚组中的EZH2转录物的增加的表达(威尔科克森配对符号秩检验(Wilcoxon matched pairs signed rank test))。图18b是概括EZH2转录物的表达与TOP2A转录物(gse104766,Hooks KB,Audoux J,Fazli H,Lesjean S,Ernault T,Dugot-Senant N等人,增殖性肝母细胞瘤诊断和治疗选择的新见解.《肝病学》2018；68:89-10)的表达之间的双尾皮尔逊R相关性(Two-tailed Pearson R correlations)的图。R和p值如图所示的。图18c示出了来自池田氏数据集(Ikeda's dataset，gse131329,Hiyama E.日本儿童肝肿瘤研究组2(JPLT-2)试验的肝母细胞瘤病例的基因表达谱(Hiyama E.Gene expressionprofiling in hepatoblastoma cases of the Japanese Study Group for PediatricLiver Tumors-2(JPLT-2)trial):《科学库OU(Science Repository OU)》；2019 2019-02-12)、卡里略-里克赫氏数据集(Carrillo-Reixach's dataset，gse133039,Carrillo-Reixach J,Torrens L,Simon-Coma M,Royo L,Domingo-Sabat M,Abril-Fornaguera J等人,表观遗传足迹使肝母细胞瘤的分子风险分层具有临床意义(Epigenetic footprintenables molecular risk stratification of hepatoblastoma with clinicalimplications).《肝病学杂志(J Hepatol)》2020；73:328-341)、洛佩斯-寺田氏数据集(Lopez-Terrada's dataset，gse75271,Sumazin P,Chen Y,Trevino LR,Sarabia SF,Hampton OA,Patel K等人,肝母细胞瘤的基因组分析鉴定不同的分子亚组和预后亚组(Genomic analysis of hepatoblastoma identifies distinct molecular andprognostic subgroups).《肝病学》2017；65:104-121)、克伦氏数据集(Karns's dataset，gse81928,Valanejad L,Cast A,Wright M,Bissig KD,Karns R,Weirauch MT等人,PARP1激活增加经修饰的肿瘤抑制因子的表达和侵袭性肝母细胞瘤发展的潜在通路(PARP1activation increases expression of modified tumor suppressors and pathwaysunderlying development of aggressive hepatoblastoma).《通讯生物学(CommunBiol)》2018；1:67)、布恩迪亚氏数据集(Buendia's dataset，Cairo S,Armengol C,DeReynies A,Wei Y,Thomas E,Renard CA等人,侵袭性儿童肝癌中的肝类干表型以及Wnt/β-连环蛋白与Myc信号传导的相互作用(Hepatic stem-like phenotype and interplay ofWnt/beta-catenin and Myc signaling in aggressive childhood liver cancer).《癌细胞(Cancer Cell)》2008；14:471-484)以及卡普勒氏数据集(Kappler's dataset，gse151347,Eichenmuller M,Trippel F,Kreuder M,Beck A,Schwarzmayr T,Haberle B等人,肝母细胞瘤以及其具有HCC样特征的后代的基因组景观(The genomic landscape ofhepatoblastoma and their progenies with HCC-like features).《肝病学杂志》2014；61:1312-1320)的肝母细胞瘤和非肿瘤肝组织中的EZH2转录物的增加的表达。未配对的曼-惠特尼检验。*p<0.05；***p<0.001；****p<0.0001。
图19：示出了肝母细胞瘤数据集中的EZH2转录物与TOP2A转录物的水平之间的正相关性。图概括了来自池田氏数据集(gse131329,Hiyama E.日本儿童肝肿瘤研究组2(JPLT-2)试验的肝母细胞瘤病例的基因表达谱:《科学库OU》；2019 2019-02-12)、卡里略-里克赫氏数据集(gse133039,Carrillo-Reixach J,Torrens L,Simon-Coma M,Royo L,Domingo-Sabat M,Abril-Fornaguera J等人,表观遗传足迹使肝母细胞瘤的分子风险分层具有临床意义.《肝病学杂志》2020；73:328-341)、洛佩斯-寺田氏数据集(gse75271,Sumazin P,Chen Y,Trevino LR,Sarabia SF,Hampton OA,Patel K等人,肝母细胞瘤的基因组分析鉴定不同的分子亚组和预后亚组.《肝病学》2017；65:104-121)、克伦氏数据集(gse81928,Valanejad L,Cast A,Wright M,Bissig KD,Karns R,Weirauch MT等人,PARP1激活增加经修饰的肿瘤抑制因子的表达和侵袭性肝母细胞瘤发展的潜在通路.《通讯生物学》2018；1:67)、布恩迪亚氏数据集(Cairo S,Armengol C,De Reynies A,Wei Y,ThomasE,Renard CA等人,侵袭性儿童肝癌中的肝类干表型以及Wnt/β-连环蛋白与Myc信号传导的相互作用.《癌细胞》2008；14:471-484)以及卡普勒氏数据集(gse151347,Eichenmuller M,Trippel F,Kreuder M,Beck A,Schwarzmayr T,Haberle B等人,肝母细胞瘤以及其具有HCC样特征的后代的基因组景观.《肝病学杂志》2014；61:1312-1320)的HB样品中的EZH2转录物的表达与TOP2A转录物的表达之间的双尾皮尔逊R相关性。对于每个数据集，R和p值如对应的图所示。
图20a-e：示出了EZH2表达与肿瘤复发和患者死亡相关。EZH2转录物表达与临床或组织学特征之间的相关性分析。图20a：阶段(gse75271,Sumazin P,Chen Y,Trevino LR,Sarabia SF,Hampton OA,Patel K等人,肝母细胞瘤的基因组分析鉴定不同的分子亚组和预后亚组.《肝病学》2017；65:104-121)；图20b：所指示的组织病理学亚型(gse75271,Sumazin P,Chen Y,Trevino LR,Sarabia SF,Hampton OA,Patel K等人,肝母细胞瘤的基因组分析鉴定不同的分子亚组和预后亚组.《肝病学》2017；65:104-121)；图20c：缓解和复发(gse133039,Carrillo-Reixach J,Torrens L,Simon-Coma M,Royo L,Domingo-SabatM,Abril-Fornaguera J等人,表观遗传足迹使肝母细胞瘤的分子风险分层具有临床意义.《肝病学杂志》2020；73:328-341)；图20d：PRETEXT放射学分期系统(gse131329,Hiyama E.日本儿童肝肿瘤研究组2(JPLT-2)试验的肝母细胞瘤病例的基因表达谱:《科学库OU》；20192019-02-12)；图20e：存活患者和死亡患者(MAS5.0-u133a，Buendia等人的数据集)(CairoS,Armengol C,De Reynies A,Wei Y,Thomas E,Renard CA等人,侵袭性儿童肝癌中的肝类干表型以及Wnt/β-连环蛋白与Myc信号传导的相互作用.《癌细胞》2008；14:471-484)。单向ANOVA，**p<0.01，图20a-d的西达克氏多重比较后检验。图20e的未配对的曼-惠特尼检验。ns，不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图21a-e：示出EZH2沉默通过诱导细胞衰老抑制肝母细胞瘤细胞生长。图21a：使用两种不同的siRNA(siEZH2-1或siEZH2-2，如图21a-e和下图所指示的)在对照(siCTRL)和EZH2缺失的Huh6(左)或HepG2(右)细胞中的EZH2蛋白的水平。图21a和d：3个或更多个独立实验的代表性印迹在裁剪图像中示出(装载对照：GAPDH)。图21b：EZH2耗竭的Huh6(左)或HepG2(右)细胞相对于siCTRL细胞的生长(565nm处的吸光度)(n＝3，双向ANOVA，****p<0.0001；西达克氏多重比较后检验)。图21c：在siCTRL与EZH2耗竭的Huh6(左)或HepG2(右)细胞中测量的衰老。示出了代表性实验，并且条概括了平均值±标准偏差(SD)(n＝5，单向ANOVA，***p<0.001；西达克氏多重比较后检验)。图21d：EZH2耗竭的Huh6(左)或HepG2(右)细胞中的细胞周期抑制剂蛋白P16和P21相对于siCTRL的相对水平。图21e：呈现相对于siCTRL的EZH2耗竭的Huh6(左)或HepG2(右)细胞中的胱天蛋白酶3/7活性的图(n＝3，单向ANOVA，不显著；西达克氏多重比较后检验)。ns，不显著；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图22a-b：示出了EZH2沉默减少了肝母细胞瘤细胞的迁移和组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化。图22a：使用siEZH2-1或siEZH2-2的EZH2耗竭的Huh6细胞相对于siCTRL的迁移，如所指示的。上方小图：4个独立实验的代表性图像。下方小图：条形图概括平均值±SD(n＝4，双向ANOVA，****p<0.0001；西达克氏多重比较后检验)。图22b：相对于EZH2耗竭的Huh6(左)细胞或HepG2(右)细胞，siCTRL中的H3K27me3和总组蛋白H3的相对水平。3个独立实验的代表性印迹在裁剪图像中示出(装载对照：组蛋白H3)。***p<0.001；****p<0.0001。
图23a-b：示出了EZH2通过其组蛋白甲基转移酶活性增强肝母细胞瘤中的ERK信号传导。图23a：示出相对于使用如所指示的siEZH2-1或siEZH2-2的EZH2耗竭的Huh6(左)细胞或HepG2(右)细胞，siCTRL中的总ERK和磷酸ERK(p-ERK)蛋白的水平。图23b：示出了的表达空基因盒(LV-CTRL)、野生型EZH2蛋白(LV-EZH2盒)或H698A突变形式的EZH2蛋白(LV-EZH2*盒)的Huh6(左)细胞和HepG2(右)细胞中的总ERK和磷酸ERK(p-ERK)蛋白的水平。图23a-b：是裁剪图像中示出的3个实验的代表性印迹(装载对照：总蛋白质)。
图24a-e：示出了EZH2通过其甲基转移酶活性在肝母细胞瘤中起致癌基因的作用。图24a：示出了与EZH2甲基转移酶结构域相对应的编码序列。上方小图：野生型(WT)序列。下方小图：在残基689上编码丙氨酸(A)而不是组氨酸(H)的突变的序列(H698A突变体：称为EZH2*)。图24b：示出了由LV-CTRL(空基因盒)、LV-EZH2或LV-EZH2*转导的Huh6(左)细胞和HepG2(右)细胞中的内源性和转基因EZH2蛋白和EZH2*蛋白的水平。3个或更多个独立实验的代表性印迹在裁剪图像中示出(装载对照：GAPDH)。图24c：示出了表达空盒(LV-CTRL)、野生型(LV-EZH2)或H698A突变的EZH2蛋白(LV-EZH2*)的转导的Huh6(左)细胞或HepG2(右)细胞的细胞生长(565nm处的吸光度)(n＝3，双向ANOVA，****p<0.0001；西达克氏多重比较后检验)。图24d：示出了源自表达CTRL盒、EZH2或EZH2*的Huh6(上方)细胞和HepG2(下方)细胞的代表性96小时老化的球体的相位对比显微照片。图24e示出了呈现表达空盒(LV-CTRL)、野生型(LV-EZH2)或H698A突变的EZH2蛋白(LV-EZH2*)的Huh6(左)细胞和HepG2(右)细胞中的球体表面积(单位为mm2)的图(n＝4，单向ANOVA，****p<0.0001；西达克氏多重比较后检验)。ns，不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。
图25：示出了肝母细胞瘤细胞中的顺铂耐药性部分由EZH2甲基转移酶活性介导。表达空盒(LV-CTRL)、野生型(LV-EZH2)或H698A突变的EZH2蛋白(LV-EZH2*)的Huh6(左)细胞和HepG2(右)细胞对顺铂的应答。图示出了用增加剂量的顺铂处理的活Huh6(左)和HepG2(右)细胞的百分比(n＝3；条＝平均值+/-SD；双向ANOVA，****p<0.0001；西达克氏多重比较后检验)。*p<0.05；***p<0.001；****p<0.0001。
图26a-b：示出了EZH2耗竭降低了肝母细胞瘤细胞中的HMGCR水平。图26a：通过蛋白质组学分析测量的相对于siCTRL Huh6细胞，siEZH2-1中的蛋白质水平倍数变化(X轴，log2)与q值(Y轴，log10)的火山图。在EZH2耗竭的细胞中显著下调的和上调的蛋白质分别位于左侧和右侧虚线框中。HMGCR蛋白被描绘为大黑点，并且通过箭头示出。图26b：使用两种不同的siRNA(siEZH2-1或siEZH2-2，如所指示的)在对照(siCTRL)和EZH2缺失的Huh6(左)或HepG2(右)细胞中的HMGCR蛋白的水平。3个或更多个独立实验的代表性印迹在图像中示出(装载对照：GAPDH)。HMGCR蛋白示出为98kDa的带。
图27a-b：示出了由GSK-126引起的EZH2组蛋白甲基转移酶的失活诱导肝母细胞瘤细胞中的HMGCR水平和脂质合成。图27a：对照(DMSO处理的)与GSK-126处理的Huh6(左)细胞或HepG2(右)细胞中的H3K27me3和总H3蛋白的相对水平(GSK-126用于IC50；Huh6细胞和HepG2细胞分别为6μM和8μM)。3个独立实验的代表性印迹在裁剪图像中示出(装载对照：组蛋白H3)。图27b：对照(DMSO)与GSK-126处理的Huh6(左)细胞或HepG2(右)细胞中的HMGCR蛋白的水平。3个独立实验的代表性印迹在图像中示出(装载对照：GAPDH)。图27c：对照(DMSO)与GSK-126处理的Huh6(左)细胞或HepG2(右)细胞中的脂质的水平。脂质颗粒示出为细胞的细胞质中的深色颗粒。示出了3个独立实验的代表性图像。
图28：示出了GSK-126在非洲爪蟾胚胎中的毒性小于顺铂。如小图下方所指示的，非洲爪蟾胚胎在存在增加浓度的顺铂或GSK-126的情况下生长。3个独立实验的代表性图像。
图29：示出了GSK-126加他汀类完全阻断肝母细胞瘤细胞的克隆形成能力。肝母细胞瘤细胞的存活率和增殖使用克隆形成测定进行评估。用DMSO(对照：CTRL)、IC25剂量下的GSK-126(Huh6细胞和HepG2细胞分别为3μM和4μM)、他汀类(ATR：8μM的阿托伐他汀；SIM：4μM的辛伐他汀)或两者处理Huh6(上方小图)细胞和HepG2(下方小图)细胞。细胞铺板10天后，用结晶紫对集落进行染色，并且使用Fusion FX(Vilber Lourmat公司(Vilber Lourmat))对板进行成像。3个独立实验的代表性图像。
图30：示出了GSK-126加他汀类阻碍肝母细胞瘤细胞的迁移。使用伤口愈合测定评估Huh6细胞的迁移。用DMSO(对照：CTRL)、IC25剂量下的GSK-126(Huh6细胞和HepG2细胞分别为3μM和4μM)、他汀类(ATR：8μM的阿托伐他汀；SIM：4μM的辛伐他汀)或两者处理Huh6细胞。在细胞铺板和伤口诱导后，使用Incucyte S3活细胞分析仪(赛多利斯公司(Sartorius))监测相对伤口密度的百分比。上方小图：创伤诱导后20小时迁移的Huh6细胞的3个独立实验的代表性图像。下方小图：所指示的药物处理的Huh6细胞迁移的动力学分析。条形图概括平均值±SD(n＝3，24小时时间点的双向ANOVA，****p＜0.0001；西达克氏多重比较后检验)。***p＜0.001。
图31a-d：示出了GSK-126-阿托伐他汀组合在体内阻碍肝母细胞瘤发展，而不影响肝功能和肾功能。图31a：用媒剂(一周3次，含1％DMSO的PBS)、顺铂(一周两次，1mg/kg)、GSK-126(一周3次，50mg/kg)、阿托伐他汀(ATR，一周3次，20mg/kg)或GSK-126加阿托伐他汀处理的不同组的小鼠的示意性表示。图31b：图概括了以天为单位的时间与以mm3为单位的肿瘤体积之间的相关性。双向ANOVA(媒剂：n＝8；顺铂：n＝7；ATR：n＝7；GSK-126：n＝7；组合：n＝8，p＜0.0001)，图基多重比较(Tukey multiple comparisons)后检验。图31c：第28天从安乐死的小鼠中提取的肿瘤的图像。图31d：不同组小鼠的ASAT、ALAT、肌酐和尿素的血液循环水平。ns，不显著；*，p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
具体实施方式
因此，本发明涉及治疗和/或预防癌症的方法，以及用于治疗和/或预防与组蛋白甲基转移酶EZH2相关的癌症和肿瘤的方法的协同组合物和组合，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述组合物，其中所述组合物包括EZH2抑制剂和一种或多种他汀类的组合。所述协同组合物或组合在本文下文中称为双重疗法或组合疗法。
EZH2抑制剂通常是EZH2的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)竞争抑制剂，并且携带2-吡啶酮部分或四甲基哌啶苯甲酰胺部分，尤其如Fioravanti R.等人(《化学记录(Chem.Rec.)》2018，18，1818-1832)所描述的。
作为实例且不受任何限制，EZH2抑制剂可以包含具有双环杂芳环作为中心支架的催化2-吡啶酮EZH2抑制剂，如GSK-126或GSK2816126(1-[(2S)-丁-2-基]-N-[(4，6-二甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-4-吲哚甲酰胺)、UNC1999(N-[(6-甲基-2-氧代-4-丙基-1H-吡啶-3-基)甲基]-1-丙-2-基-6-[6-(4-丙-2-基哌嗪-1-基)吡啶-3-基]吲唑-4-甲酰胺)、EPZ005687(1-环戊基-N-[(4，6-二甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-6-[4-(吗啉-4-基甲基)苯基]吲唑-4-甲酰胺以及EI1(6-氰基-N-[(4，6-二甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-1-戊-3-基吲哚-4-甲酰胺)。还可以引用MC3629，其为EPZ005687和GSK-126的简化类似物，包括通过酰胺键与2-吡啶酮部分连接的基于吡唑和基于吡咯的化合物：GSK926(N-[(4，6-二甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-6-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基]-1-丙-2-基咪唑-4-甲酰胺)、GSK343(N-[(6-甲基-2-氧代-4-丙基-1H-吡啶-3-基)甲基]-6-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基]-1-丙-2-基咪唑-4-甲酰胺)和GSK503(N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-甲基-6-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基]-1-丙-2-基吲哚-4-甲酰胺)。可以进一步引用携带通过酰胺功能与吲哚核连接的2-吡啶酮部分的CPI-360、其类似物CPI-169和CPI-1205或利拉美托司他(Lirametostat，N-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-2-甲基-1-[(1R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基]乙基]吲哚-3-甲酰胺)。
还可以引用他泽司他，其也称为EPZ-6438或E7438(N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-[乙基(氧杂-4-基)氨基]-2-甲基-5-[4-(吗啉-4-基甲基)苯基]苯甲酰胺)，以及他泽司他的两种口服可用的苯甲酰胺甲基-2-吡啶酮类似物：EPZ011989，其也被定名为1598383-40-4(N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-3-[乙基-[4-[2-甲氧基乙基(甲基)氨基]环己基]氨基]-2-甲基-5-(3-吗啉-4-基丙-1-炔基)苯甲酰胺)和ZLD1039，其也被定名为1826865-46-6(3-[乙基(氧杂-4-基)氨基]-2-甲基-N-[(1-甲基-3-氧代-5,6,7,8-四氢-2H-异喹啉-4-基)甲基]-5-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基]苯甲酰胺)。他泽司他的其它类似物包含EBI-2511(N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-5-乙基-6-[乙基(氧杂环丁烷-4-基)氨基]-2-(1-丙-2-基哌啶-4-基)-1-苯并呋喃-4-甲酰胺)、皮诺美司他(pinometostat，(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-5-[[[3-[2-(6-叔丁基-1H-苯并咪唑-2-基)乙基]环丁基]-丙-2-基氨基]甲基]氧杂环丁烷-3,4-二醇)、利拉美托司他(N-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-2-甲基-1-[(1R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基]乙基]吲哚-3-甲酰胺)。
可以进一步引用JQEZ5，其也被命名为JQE5(1-异丙基-N-((6-甲基-2-氧代-4-丙基-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-6-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-甲酰胺)、PROTAC(PROteolysis TArgeting Chimeric)MS1943(参见Feral等人,《先进治疗(Adv.Therap.)》2020,3,2000148)、DZNep((1S,2R,5R)-5-(4-氨基咪唑并[4,5-c]吡啶-l-基)-3-(羟甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇))、MC1947和MC1948。
此外，可以引用PF-06821497化合物，所述化合物是一种催化EZH2抑制剂，除了2-吡啶酮部分外，还包括3,4-二氢异喹啉部分。完整化学名称是5,8-二氯-2-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1H-吡啶-3-基)甲基]-7-[(R)-甲氧基(氧杂环丁烷-3-基)甲基]-3,4-二氢异喹啉-1-酮。
可以用于根据本发明的协同双重疗法和三重疗法组合物的其它选择性EZH2抑制剂包含：
-5.8-二氯-2-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢-吡啶-3-基)甲基]-7-[甲氧基(氧杂环丁烷-3-基)甲基]-3,4-二氢异喹啉-1(2/-/)-酮；
-5.8-二氯-2-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢-吡啶-3-基)甲基]-7-[(R)-甲氧基(氧杂环丁烷-3-基)甲基]-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；
-5.8-二氯-2-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢-吡啶-3-基)甲基]-7-[(S)-甲氧基(氧杂环丁烷-3-基)甲基]-3,4-二氢异喹啉-1(2/-/)-酮；
-5-溴-8-氯-2-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-7-(1,4-二甲基-f/-/-1,2,3-三唑-5-基)-3,4-二氢异喹啉-1(2/-/)-酮；5,8-二氯-7-(3,5-二甲基-1,2-噁唑-4-基)-2-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-3,4-二氢异喹啉-1{2H)-酮；
-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-5-[乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基]-4-甲基-4'-(吗啉-4-基甲基)联苯-3-甲酰胺；
-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-5-[乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基]-4-甲基-4'-(吗啉-4-基甲基)联苯-3-甲酰胺；
-N-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2-甲基-1-[(1R)-1-[1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基]乙基]-1H-吲哚-3-甲酰胺；
-N-(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基甲基)-1-异丙基-3-甲基-6-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基]-1H-吲哚-4-甲酰胺；
-N-[(6-甲基-2-氧代-4-丙基-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-6-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基]-1-(丙-2-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺。
所述一种他汀类可以选自由以下组成的组：阿托伐他汀、氟伐他汀(fluvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、美伐他汀(mevastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀、西立伐他汀(cerivastatin)和/或其类似物。他汀类可凭处方获得。还有若干正在进行临床研究。然而，用于根据本发明的双重疗法的所述一种他汀类优选地不包括洛伐他汀(lovastatin)，并且因此不含任何洛伐他汀。
他汀类是作为降脂化合物发挥作用的3-羟基-3-甲基-戊二酰-辅酶A还原酶抑制剂(也称为HMG-CoA抑制剂或HMGCR抑制剂)的一组化合物。HMG-CoA是一种酶(即NADH依赖性(EC 1.1.1.88)，NADPH依赖性(EC 1.1.1.34))，其为甲羟戊酸通路(即产生胆固醇和其它类异戊二烯的代谢通路)的限速酶。HMG-CoA通常受到胆固醇的抑制，所述胆固醇源自低密度脂蛋白(LDL)通过LDL受体的内化和降解，以及胆固醇的氧化物种。他汀类对HMG-CoA的竞争抑制最初会减少胆固醇产生，并且作为适应性应答，降低的细胞胆固醇水平会触发固醇调控元件结合蛋白(SREBP)介导的基因表达的激活，包含肝脏和其它组织中的LDL受体(LDLR)的激活，其导致循环中LDL的增加的摄取，从而降低血液胆固醇水平。
根据本发明的协同组合物或双重疗法对治疗和/或预防与组蛋白甲基转移酶EZH2相关的癌症和肿瘤是有效的。其已经被证明可以对患者的癌症状态产生有益的改变。变化可以是主观的或客观的，并且可以涉及如正在治疗的癌症的症状或体征的特征，如减少癌细胞的数量、癌细胞的生长、癌症肿瘤的大小、癌细胞对另一种癌症药物的耐药性和/或防止患者的状态恶化。另外，与先前的临床试验相比，这些双重疗法能够施用减少EZH2抑制剂的剂量方案，从而使患者能够遭受EZH2抑制剂较小毒性的副作用，但仍能保持对其针对癌症的治疗功效。与目前临床试验中使用的剂量相比，EZH2抑制剂(如GSK-126)的剂量可以减少至少一半的剂量。因此，GSK-126在根据本发明的双重疗法或三重疗法中的剂量方案可以介于20mg与1500mg之间，优选地介于50mg与1200mg之间，并且更优选地介于100mg与1000mg之间，通过静脉内施用，每周两次。
实际上，申请人在下文中显示，施用一种EZH2抑制剂(如GSK-126)与至少一种他汀类和/或一种或多种抗癌药物或化疗剂的组合使癌症或肿瘤对GSK-126敏感，由此逆转或降低患者对GSK-126的耐药性。
如本文所使用的，患者或受试者可以互换使用，并且是指需要癌症治疗或有发展癌症/肿瘤风险的人。
与组蛋白甲基转移酶EZH2相关的癌症和肿瘤可以特别选自肝母细胞瘤(HB)、弥漫性内生型桥脑胶质瘤(DIPG，也称为“弥漫性中线胶质瘤H3K27M突变体”，因为组蛋白H3基因的突变的频率与疾病的出现有关；Louis,D.N.等人,2016年世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类：综述(The 2016World Health Organization Classification of Tumors of theCentral Nervous System:a summary).《神经病理学学报(Acta Neuropathol)》,2016.131(6):第803-20页)、弥漫性中线胶质瘤(DMG)、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、横纹肌样肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌、睾丸癌、胰腺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、皮肤癌、头颈癌。所述肿瘤和癌症优选地与内皮-间充质转化相关的病理学无关。
优选地在抗癌标准治疗、放射疗法或其它一线或二线癌症疗法后，将根据本发明的协同双重疗法组合物或组合疗法施用于复发性或难治性患者，因为这些癌症或肿瘤中的一些可能对某些抗癌药物具有耐药性。
事实上，如申请人在以下实例中所证明的，所述双重疗法具有显著的协同治疗效果：当GSK-126和一种他汀类组合施用或共同施用时，产生的治疗和/或有益效果比单独施用时更大，并且比单个化合物的效果的总和所产生的效果更大(即大于相加效应的效应)。具体地，已经证实了组合疗法或双重疗法在细胞迁移和粘附方面具有出乎意料的功效。鉴定协同作用的方法在各种出版物中进行了讨论，如Foucquier J.等人(《药理学研究与展望(Pharmacology Research&Perspectives)》(2015)(3)3:e00l49)。
由于双重疗法组合物的协同作用，已经与一种他汀类组合施用或共同施用于患者的EZH2抑制剂的治疗或预防有效量可以远低于目前临床期中施用的剂量。GSK-126的此类减少的有效剂量可以包括患者的1mg/kg与20mg/kg之间或5mg/kg与10mg/kg之间。在本发明的双重疗法内，EZH2抑制剂的此类剂量方案的减少在大幅降低药物对患者的总体毒性方面具有显著影响，同时维持有效的抗癌作用，包含癌细胞的延迟或抑制、肿瘤生长的抑制、肿瘤血管形成、进展和/或转移，肿瘤大小的减小、细胞死亡的诱导、平均存活时间的增加，以及癌细胞对其已经变为或具有耐药性的抗癌药物的敏感性。
包括GSK-126和根据本发明的他汀类的组合的协同组合物和治疗方法显示在体外根除肝母细胞瘤细胞，并且在体内阻断肝母细胞瘤生长和血管形成。这些组合物在治疗顺铂耐药性肝母细胞瘤方面也是有效的。
具体地，申请人在实例2和4中清楚地证明了甲基转移酶EZH2是肝母细胞瘤中的关键致癌基因，并且是治疗此儿童肝肿瘤的相关治疗靶标。申请人证明了EZH2一方面通过其对组蛋白H3和非组蛋白靶标的甲基转移酶活性作为增殖性肝母细胞瘤的关键致癌基因发挥作用，由此引起染色质浓缩和肿瘤抑制基因的抑制。事实上，申请人清楚地表明，EZH2甲基转移酶活性是细胞迁移、存活、顺铂耐药性以及肿瘤发展和血管形成所必需的，并且因此EZH2甲基转移酶活性在癌性过程和耐药性中是居于中心的。另一方面，EZH2被证明是诱导HMG-CoA还原酶(其负责胆固醇和脂质合成)和DUSP9(一种涉及侵袭性肝母细胞瘤的双特异性磷酸酶)的过表达的转录辅因子(参见Khoubai和Grosset,《国际分子科学学报(Int JMol Sci)》2021,https://doi.org/10.3390/ijms222111538)。
关于双重疗法和三重疗法的协同作用，申请人表明，在用GSK-126处理的肝母细胞瘤细胞中诱导了HGMCR蛋白，这表明EZH2与羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGCR)基因之间存在功能联系。例如，两种他汀类阿托伐他汀和辛伐他汀已经被广泛用于治疗心脏病和血脂异常，在相同剂量下，这些他汀类均未对肝母细胞瘤产生影响。然而，令人惊讶地发现，这些他汀类实际上增加了肝母细胞瘤对EZH2抑制剂(如GSK-126或EPZ6438)的敏感性。另外，通过添加GSK-126(以IC50剂量的50％使用)，肝母细胞瘤对阿托伐他汀和辛伐他汀的敏感性增加，并且当向双重疗法中添加顺铂(以IC50剂量的25％使用)时，肝母细胞瘤甚至更快地死亡。
以同样的方式，申请人表明，在用GSK126处理的DIPG中，参与脂质和胆固醇合成的基因的表达增加。具体地，诱导羟甲基戊二酰-CoA合成酶(HMGCS)、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、尼曼-皮克C1蛋白(Niemann-Pick C1protein，NPC1)和角鲨烯环氧酶(SQLE)基因以及HMGCR蛋白和SQLE蛋白的表达，由此证明GSK-126激活DIPG中的脂质和胆固醇合成通路。
这是对包括EZH2抑制剂与至少一种他汀类的双重疗法组合物的协同作用的机制解释和证实，其已在以下实例中得到证明。因此，肝母细胞瘤和DIPG不太容易逃脱药物作用。此外，EZH2抑制剂可以单独使用或与顺铂组合使用，以改善肝母细胞瘤的管理，并且他汀类的添加通过阻断甲羟戊酸通路增强了GSK-126的作用。
使用基于基因或药物的药理学方法来使EZH2功能失活，申请人表明，EZH2蛋白是肝母细胞瘤细胞体外2D和3D生长和存活以及雏鸡胚胎模型中的侵袭性和血管生成肿瘤的发展所必需的。
申请人进一步发现，EZH2的耗竭增加了肝母细胞瘤细胞对顺铂的敏感性，并且顺铂与GSK-126的组合对体外肿瘤细胞的消除具有相加效应。单独使用的GSK-126在5μM至10μM的浓度范围内也能非常有效地在体外杀伤肝母细胞瘤细胞。因此，这些数据清楚地表明，包括例如顺铂和GSK-126的此类双重疗法在一线治疗中是有效的，可以提高化疗效率，并且可用于复发和对顺铂呈现出获得性耐药性的患者的二线治疗。
另外，申请人实施了一种根据本发明的三重疗法，其包括EZH2抑制剂、他汀类(例如辛伐他汀或阿托伐他汀)和顺铂，并且表明单独的GSK-126的抗肿瘤潜力也通过添加辛伐他汀或阿托伐他汀而增加，由此证明了三重疗法的治疗益处。
根据本发明的三重疗法组合物包括如本文上文所描述的双重疗法组合物，并且进一步包括一种或多种抗癌药物，所述抗癌药物可以选自铂化合物或基于铂的药剂、酪氨酸激酶抑制剂、紫杉烷衍生物、拓扑异构酶抑制剂、激素治疗剂、抗雄激素药物、雄激素受体药剂、抗血管生成剂、免疫治疗制剂、抗炎药、放射治疗剂、具有抗癌作用的生物制剂、由天然物质制备的抗癌制剂。
在本发明的三重疗法中使用的优选的抗癌药物是铂化合物或基于铂的药剂，例如顺铂、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)、沙铂(satraplatin)、吡铂(picoplatin)、奈达铂(nedaplatin)、三铂(triplatin)和/或脂铂(lipoplatin)。申请人在下面的实例中证明，施用包括有效量的GSK-126、具有另外的抗癌药物(如所述铂化合物)的他汀类的三重疗法组合提供了优异的治疗效果，由此引起了显著抑制癌细胞生长、抑制癌细胞转移、减小肿瘤大小、增加受试者的存活时间，并且更一般地显著改善癌症的一个或多个体征和/或症状。此类三重疗法组合逆转或降低癌细胞对抗癌药物的耐药性，和/或使癌细胞对抗癌药物敏感，但作用机制未知。
可以用于此类三重疗法的其它化疗剂可以包含但不限于蒽二酮(蒽醌)，如蒽环类药物(例如，道诺霉素(daunorubicin，正定霉素(daunomycin)；红比霉素(rubidomycin)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依达比星(idarubicin)和戊柔比星(valrubicin)))；三苯氧胺以及其代谢产物，如4-羟基三苯氧酮(阿非昔芬(afimoxifene))和N-去甲基-4-羟基三苯氧胺(他莫昔芬(endoxifen))；紫杉烷，如紫杉醇(taxol)、多西他赛(docetaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)、红豆杉A(hongdoushan A)、红豆杉B(hongdoushan B)、红豆杉C(hongdoushan C)、巴卡亭I(baccatin I)和巴卡亭II(baccatinII)；烷基化剂(例如，氮芥，如二氯甲基二乙胺(HN2)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(melphalan，L-苯基丙氨酸氮芥)和苯丁酸氮芥)；乙基烯胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲基三聚氰胺、噻替派(thiotepa)、烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、亚硝基脲，如卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司丁(lomustine，CCNLJ)、司莫司汀(semustine，甲基-CCN-U)和链脲佐菌素(streptozotocin)，以及三氮烯，如鸨烯咪胺(decarbazine，DTIC；二甲基三氮烯基-咪唑甲酰胺))；抗代谢药物(例如，叶酸类似物，如甲氨蝶呤(methotrexate，氨甲蝶呤(amethopterin))、嘧啶类似物，如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(cytosine arabinoside)以及嘌呤类似物和相关抑制剂，如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；6-TG)和喷司他丁(pentostatin)或2'-脱氧助间型霉素(2'-deoxycoformycin))；天然产物，例如长春花生物碱，如长春碱(vinblastine，VLB)和长春新碱(vincristine)，表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，如更生霉素(dactinomycin，放线菌素D(actinomycin D))、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin，光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素(mitomycin，丝裂霉素Q(mitomycin Q))；酶，如L-天冬酰胺酶；经取代的脲，如羟基脲；甲基肼衍生物，如甲基苄肼(N-甲基肼；MIH)；和/或肾上腺皮质抑制剂，如米托坦(mitotane)和氨鲁米特(aminoglutethimide)。
抗雄激素药物是通过阻断雄激素受体、竞争细胞的表面上的结合位点或影响或介导雄激素产生来改变雄激素通路的药物。抗雄激素药物包含但不限于恩扎鲁胺(enzalutamide)、阿比特龙(abiraterone)、比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、阿帕他胺(apalutamide)、非那雄胺(finasteride)、度他雄胺(dutasteride)、阿法他二醇(alfatradiol)以及其组合。
放射治疗剂在本领域是众所周知的，并且包括外部束放射疗法和/或内部放射疗法。外部束放射疗法将高能X射线和/或γ射线的放射性束递送到患者的肿瘤，而内部束放射疗法将放射性原子递送到患者的肿瘤。外部射束放射疗法和内部放射疗法两者都用于通过向靶位点递送足够量的放射性来抑制肿瘤生长或杀伤癌细胞。在一些实施例中，放射治疗剂包括放射性原子，并且与生物或合成剂络合以增加向靶位点的递送。因此，放射治疗剂可以与靶向部分(如抗体)偶联，以改善放射治疗剂对癌细胞的定位。
所述三重疗法组合物优选地不包括RORy(视黄酸受体相关孤儿受体y)的任何抑制剂，不包括任何抗VEGF药剂(如舒尼替尼(sunitinib))或药剂(如吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼、达沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、硼替佐米(bortezomib)或盐霉素(salinomycin))，不包括VEFG/VEGFR抑制剂，不包括BCL2抑制剂或LSD1抑制剂。
因此，本发明还提供了一种组合物，所述组合物用于治疗和/或预防与甲基转移酶EZH2相关的肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效的如上文所描述的双重疗法或三重疗法，其中在抗癌标准治疗、放射疗法或其它一线或二线癌症疗法之后向复发性或难治性患者施用所述双重疗法或所述三重疗法。
根据另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物用于治疗和/或预防C2A亚组肝母细胞瘤的方法，所述肝母细胞瘤特征尤其在于EZH2和/或拓扑异构酶2-α(TOP2A)上调，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的EZH2抑制剂。
另外，本发明提供了一种组合物，所述组合物用于治疗和/或预防DIPG的方法，所述DIPG特征尤其在于EZH2和/或TOP2A上调，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的EZH2抑制剂。
治疗的受试者具有所有年龄，但大多数受试者的年龄介于1岁与5岁之间。
根据本发明的此方面，GSK-126优选作为EZH2抑制剂，因为其毒性是顺铂的毒性的1/20，所述顺铂迄今为止一直被用作肝母细胞瘤的一线治疗的黄金标准药物，但已知具有高毒性并且可引起严重的继发性病理。因此，根据此方面，GSK-126被用作增殖性和侵袭性肝母细胞瘤的新治疗选择，或用于复发或对顺铂表现出化学耐药性的患者的二线疗法。
事实上，申请人在实例3中证明，EZH2上调与特别侵袭性肝母细胞瘤(HB)的存在相关，并且构成一种新的不利的预后因素，允许预测如更高的复发或死亡风险等患者的结果。此类上调已经在一个被定名为C2A亚组的HB肿瘤的亚组中得到证实，所述亚组是HB肿瘤的三个亚组之一，被命名为C2A和C2B，具有最差的预后、更晚期的肿瘤阶段和最差的总存活率。转录物谱将HB分为三个不同的亚组，命名为C1、C2A和C2B，可通过简洁的四基因特征进行鉴定：羟基类固醇17-β脱氢酶6、整合素α6、拓扑异构酶2-α和波形蛋白，其中拓扑异构酶2-α(TOP2A)是增殖性C2A肿瘤的特性(参见Hooks KB等人,《肝病学》,2018年7月；68(1):89-102.doi:10.1002/hep.29672)。申请人进一步证明，高增殖性肿瘤C2A亚型不仅以拓扑异构酶2-α基因上调为特征，而且以EZH2上调(与TOP2A的上调正向且强烈地相关)为特征。EZH2和/或TOP2A的上调是肿瘤的特别侵袭性和癌细胞的高增殖率的指标，对于复发或死亡的患者来说结果较差。
表明了EZH2在HB中上调，并且在具有不利分子和临床生物标志物(包含表达TOP2A的细胞)的肿瘤以及复发或死亡的患者中其表达显著增加。因此，EZH2可以用作HB或DIPG中的患者的复发或死亡的独立预后因子。可替代地，EZH2和TOP2A，或者EZH2和DUSP9(双特异性磷酸酶9)，或者EZH2、TOP2A和DUPS9的组合因此可以用作HB或DIPG中的患者的复发或死亡的预后因子。
根据此方面，本发明因此提供了EZH2作为患有HB或DIPG的患者具有更高复发甚至死亡的可能性的不良预后的生物标志物的用途，以及一种评估和/或预测患有选自HB或DIPG的癌症的患者的预后的方法，所述方法包括体外确定所述受试者的分离的样品中的EZH2的水平。当EZH2的水平等于或高于参考对照值时，确定HB或DIPG的不良预后。通常，参考对照值是由患有HB或DIPG的受试者的队列的EZH2水平的中值产生的EZH2的血清水平。例如，EZH2的水平相等或更高。
根据此方面，预测患有HB或DIPG的受试者的预后的方法包括(i)在来自所述受试者的分离的样品中以蛋白质水平或RNA水平检测EZH2的水平和浓度，以及(ii)将检测结果与来自对照样品的对应的生物标志物的检测结果或参考值的检测结果进行比较，其中与对照或参考值相比，所述受试者体内至少所述生物标志物EZH2的增加的浓度、增加的水平指示所述受试者的负演化。除了评估生物标志物EZH2之外，所述方法可以进一步包括评估所述患者的负临床演化的另外的生物标志物，包含例如评估TOP2A和/或DUSP9生物标志物。
在同一方面内，本发明提供了体外试剂盒，所述体外试剂盒包括适于在蛋白质水平或RNA水平上检测至少EZH2的水平、浓度和/或存在的药剂。此类试剂盒可以进一步包括允许在蛋白质水平或RNA水平上评估TOP2A和/或DUSP9的水平、浓度和/或存在的药剂。这些药剂在本领域中是众所周知的。一些用于运行用于蛋白质检测和定量的测定，例如蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫扩散测定、免疫电泳、免疫染色、免疫沉淀、质谱法和蛋白质微阵列。其它药剂适于在RNA水平上单独或与TOP2A和/或DUSP9组合检测生物标志物EZH2的过表达。
本发明还提供了癌症疗法，所述癌症疗法包括患者的预筛选步骤，以检测单独的一种生物标志物EZH2或与TOP2A和/或DUSP9组合的过表达，由此允许计划这些患者的特定治疗方案和特定随访。
本发明进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包括如上文所描述的双重疗法或三重疗法组合以及药学上可接受的赋形剂和/或载剂和/或稀释剂。药物组合物还可以任选地包括一种或多种抗癌药物。本文设想适于本组合物的调配和期望的施用的任何药学上可接受的载剂和/或赋形剂和/或稀释剂。
通常，此类药学上可接受的赋形剂可以包含盐或稀释剂，并且可以进一步包括药物冷冻保护剂，如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、谷氨酸钠、PVP、HPpCD、CD、甘油、麦芽糖、甘露醇和蔗糖。
本发明的药物组合物包含适于局部、肠胃外、肺、鼻、直肠或口服施用的调配物。在任何给定情况下，最合适的施用途径将部分取决于癌症病状的性质和严重程度，以及任选地癌症的阶段。优选的药物组合物被配制用于肠胃外施用，并且最优选地用于静脉内施用。立即释放和持续释放剂型两者都在本发明的范围内。
本发明的药物组合物可以通过药学领域中已知的任何方法制备。适于用于本发明的药学上可接受的载剂包含任何标准的药物载剂、缓冲液和赋形剂，包含磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液(如油/水或水/油乳液)，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。合适的药物载剂以及其调配物在《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(伊斯顿的麦克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton),第19版.1995)中进行了描述。优选的药物载剂取决于活性剂的预期施用模式。
因此，优选地通过注射，例如通过团注或连续输注调配药物组合物用于肠胃外施用。用于注射的调配物可以以单位剂型存在，例如在安瓿或在多剂量容器中，并添加有防腐剂。可注射组合物优选地是等渗水溶液或悬浮液。调配物可以被灭菌和/或含有佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液。
根据本发明，EZH2抑制剂有利地与他汀类和任选地抗癌剂共同施用，以对癌症和肿瘤的治疗和/或预防产生协同作用。EZH2抑制剂、他汀类以及抗癌剂可以同时(共同施用)或顺序施用。
在三重疗法的情况下，EZH2抑制剂和他汀类可通过相同或不同的施用途径与抗癌药物组合施用(口服或肠胃外(例如，静脉内))于患者。例如，EZH2抑制剂和他汀类肠胃外施用(例如，静脉内施用)，而抗癌药物可以口服施用，反之亦然。
因此，患者可以接受治疗有效量的GSK-126化合物和一种他汀类。此类施用可以包含在指定的时段内提供有效量，例如，持续约1小时至24小时或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天或更多天，或以指定的顺序，例如施用GSK-126和他汀类，随后施用一种或多种抗癌药物，反之亦然。治疗方案可以包含顺序或同时施用两种或更多种结构不同的化合物。例如，两种或更多种结构不同的药物活性化合物可以通过施用适于口服施用的药物组合物来共同施用，所述药物组合物含有两种或更多种结构不同的活性药物活性化合物。作为另一个实例，两种或更多种结构不同的化合物可以通过施用一种化合物并且然后施用另一种化合物来共同施用。在一些情况下，共同施用的化合物通过相同的途径施用。在其它情况下，共同施用的化合物通过不同的途径施用。例如，一种化合物可以口服施用，并且其它化合物可以例如通过静脉内或腹膜内注射顺序或同时施用。
因此，药物组合物可以制备为单一药物或单独的药物，其包括通过将EZH2抑制剂与一种他汀类(例如，阿托伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、罗苏伐他汀、美伐他汀、西立伐他汀、普伐他汀和/或匹伐他汀)、药学上可接受的载剂和/或赋形剂或稀释剂，以及任选地一种或多种抗癌药物混合而制备的单独剂量单位。
药物组合物或药物可以按治疗有效剂量施用于受试者以预防、治疗、增敏或控制对EZH2抑制有应答的癌症。将药物组合物或药物以足以引发受试者的有效治疗应答的量施用于受试者。有效的治疗应答包含至少部分阻止或减缓癌症的症状或并发症的应答。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。
施用的活性剂的剂量取决于受试者的体重、年龄、个人状况、待治疗区域的表面积或体积以及施用的形式。剂量的大小也将由特定受试者施用特定调配物所产生的任何不良影响的存在、性质和程度确定。通常，本发明的活性化合物的剂量是足以实现期望的效果的剂量。最佳给药时间表可以根据受试者体内活性剂积累的测量值来计算。通常，剂量可以每天、每周或每月给予一次或多次。本领域普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。本发明的组合物的最佳剂量、毒性和治疗功效可以根据所施用的组合物的相对效力而变化，并且可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如通过确定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体具有治疗有效性的剂量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且可以被表示为比率LD50/ED50。展现出大治疗指数的药剂是优选的。尽管可以使用展现出毒副作用的药剂，但应当注意设计一种将此类药剂靶向到受影响的组织的部位，用于最小化对正常细胞的潜在损伤并且由此减少副作用的递送系统。
通常，通过首先施用低剂量或少量的组合物，并且然后逐渐增加施用的剂量(dose)或剂量(dosage)，根据需要添加第二种或第三种药物，直到在治疗的受试者中观察到期望的效果(其中毒副作用最小或无毒副作用)来确定组合物的有效(efficacious)或有效(effective)量。
根据患者所需和耐受的剂量和频率，施用组合物的单次或多次施用。无论如何，组合物应提供有效量的本发明的组合物以有效地治疗患者。通常，剂量足以治疗或改善疾病的症状或体征，而不会对患者产生不可接受的毒性。
贯穿本申请，引用了各种参考文献，并且通过引用特此将这些出版物的全部公开内容并入本申请，以更全面地描述本发明所属的领域的现状。
实例
实例1：用于治疗和/或预防弥漫性中线胶质瘤(DMG)的双重疗法效率
实例1.1：方法
微阵列分析
GSE50021表达谱(35个DMG样品，10个正常脑样品)从基因表达综合数据库中提取。对原始读数进行分位数归一化和log2转换。提取由EZH2的ILMN_1652913探针鉴定的表达值，并且使用GraphPad Prism进行分析。
DMG细胞系和原代BXdmg1细胞
此研究中使用的DMG细胞系是NEM157i、NEM157i-VEGF、NEM163i、SU-DIPG-IVi、SU-DIPG-IVi-Luc和原代细胞BXdmg1。起源和慢病毒修饰程序(包含永生化)以及培养条件已在下文中进行了描述。
化学抑制剂
已经使用EZH2抑制剂GSK-126、阿托伐他汀、ACSS2抑制剂和特比萘芬(美国休斯顿的塞莱克化学公司(Selleckchemicals,Houston,USA))。
蛋白质印迹
使用标准技术进行印迹(参见下文)。
组蛋白提取
根据制造商的说明进行组蛋白提取(组蛋白提取试剂盒-ab113476，法国巴黎的艾博抗公司(Abcam,Paris,France))。
增殖测定
根据制造商的说明，使用体外毒理学测定试剂盒(磺基罗丹明B(SulforhodamineB)，法国圣昆汀法拉维尔的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,Saint QuentinFallavier,France))测量细胞生长。将细胞以每孔2000个细胞的密度铺板在96孔板中，一式三份。在指示的时间点，使用CLARIOstar多板读取器(法国马恩河畔尚皮尼的BMGLabtech公司(BMG Labtech,Champigny-sur-Marne,France))在565nm处测量吸光度。
凋亡测定
在暴露于指示的浓度和时间的药物后，用膜联蛋白V-PE(法国勒克莱尔桥的BD生物科学公司(BD Biosciences,Le Pont de Claix,France))和7-氨基放线菌素D(7-AAD)(BD生物科学公司)标记细胞，并且使用流式细胞术进行分析，如所描述的[4]。
迁移测定
将2×104个细胞/孔置于96孔中并温育24小时。IncuCyte伤口制造机(96针伤口制造工具)用于制造划痕。
球体培养
DMG细胞系和肝母细胞瘤细胞系两者都使用了球体培养的标准培养方法。
DMG体内模型
动物程序是根据欧洲(指令2010/63/UE)和法国(法令2013-118)指南进行的。小鼠实验已经获得当地伦理委员会的授权，并且得到了法国高等教育、研究和创新部长(FrenchMinister of Higher Education,Research and Innovation)的验证(APAFIS#13466-2019032112211281，授权号B33063916)。
DMG NEM157i/NEM157i-VEGF CAM模型先前已经在Capdevielle V等人,《神经肿瘤学(Neuro Oncol)》2019；10.1093/neuonc/noz215中进行了描述。
基于Mohammed等人(《自然医学》2017；23(4):483-492)的工作，开发了小鼠原位模型(NOD/LtSz-scid IL2Rγ小鼠中的SU-DIPG-IVi-Luc)。
化学抑制剂
GSK-126是一种高选择性EZH2甲基转移酶抑制剂，其IC50为9.9nM(对EZH2的选择性是20种其它人甲基转移酶的选择性的>1000倍)。GSK-126(塞莱克化学公司(SelleckChem))与DMSO(二甲亚砜)一起溶解并在-20℃下储存。已经使用了胆固醇合成通路的三种抑制剂：阿托伐他汀(HMG-CoA还原酶的抑制剂)、靶向乙酸依赖性乙酰-CoA合成酶2(ACSS2)的ACSS2抑制剂和特比萘芬(角鲨烯环氧化酶抑制剂)。所有抑制剂均购自塞莱克化学公司(美国休斯顿)。所有抑制剂均在DMSO中等分并在-20℃下储存。
原代细胞的分离、培养和表征
所有细胞系都定期测试支原体的存在，并且于2021年4月成功进行了用于鉴别的STR谱(法国莫尔塞姆的LGC公司(LGC,Molsheim,France))。根据法国国家指南，在波尔多大学医院(University Hospital in Bordeaux)接受疗法的患者(或其监护人)书面同意生物探针可以以匿名方式用于研究目的。
在实验室中接受DMG活组织检查，并且在24小时内使用GentleMAC细胞分离器(法国巴黎的美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotech,Paris,France))，使用MACSBrain肿瘤解离试剂盒(法国巴黎的美天旎生物技术有限公司)和标准GentleMAC脑组织分离程序进行分离。将产生的细胞在Amniomax C100SUP加Amniomax C100基础培养基(法国伊尔基希地区的吉博科公司、赛默飞世尔公司(Gibco,ThermoFisher,Illkirch Cedex,France))中培养。活检的分子和细胞分析详见图7(参见Rahal,F.,C.Capdevielle,B.Rousseau,J.Izotte,J.W.Dupuy,D.Cappellen,G.Chotard,M.Menard,J.Charpentier,V.Jecko,C.Caumont,E.Gimbert,C.F.Grosset和M.Hagedorn(2022).“EZH2阻断剂通过脱靶效应使组蛋白突变的弥漫性中线胶质瘤对胆固醇代谢抑制剂敏感(An EZH2 blocker sensitizeshistone mutated diffuse midline glioma to cholesterol metabolisminhibitorsthrough an off-target effect”.《神经肿瘤学进展(Neurooncol Adv)》4(1):vdac018)。
使用免疫组织化学对活检源性细胞(BXdmg1)进行表征。在切片和染色之前，采集细胞并将其包含在CytoBlock中(图7A)。在柠檬酸盐缓冲液中加热抗原回收、Flex扩增处理并与以下抗体一起温育后，在Omnis染色机上进行自动染色：Ki-67(丹科公司(Dako)，克隆MIB1，1/100)、H3-K27M(Diagomics公司(Diagomics)，克隆RM192，1/5000)和H3-K27me3(艾博抗公司，克隆8290，1/100)。使用二氨基联苯胺(丹科公司)进行揭示。这些细胞有规律地传代，并且表现出均匀的形态学表型，其被称为BXdmg1。
蛋白质印迹
通过使用RIPA缓冲液(西格玛奥德里奇公司)加蛋白酶抑制剂(西格玛奥德里奇公司)刮取细胞制备细胞裂解物，并且在4℃下以13000g离心15分钟。使用PierceTM BCATM蛋白质测定(赛默飞世尔公司)测量蛋白质浓度，并且将等量的细胞提取物装载在4％至15％的预制聚丙烯酰胺凝胶(伯乐公司(Bio-Rad))中进行蛋白质印迹分析。将蛋白质印迹在硝化纤维膜(Turbo中等大小，伯乐公司)上，用Odyssey封闭缓冲液(法国莱叙利斯的LI-COR生物科学公司、ScienceTec公司(LI-COR Biosciences,ScienceTec,Les Ulis,France))或用在Tris缓冲盐水中稀释的BSA(含0.1％Tween 20(TBST))封闭，并且在4℃下用一级抗体探测过夜。使用的一级抗体是：兔多克隆抗EZH2(1:1000稀释，#5246S，法国圣西尔的Ozyme公司/细胞信号传导公司(Ozyme/Cells signaling,Saint Cyr l'Ecole,France))、兔抗GAPDH(1:15000，BLE649203，Ozyme公司/细胞信号传导公司)、兔单克隆H3K27me3(1:1000，9733S，Ozyme公司/细胞信号传导公司)、小鼠单克隆组蛋白H3(1:500，sc-517576，德国海德堡的圣克鲁兹生物技术有限公司(Santa-Cruz,Heidelberg,Germany))、小鼠单克隆肌动蛋白(C-2)(1:500，sc-8432，圣克鲁兹生物技术有限公司)、小鼠单克隆抗HMGCR(1:1000，CL0259，瑞典布鲁玛的阿特拉斯抗体公司(Atlas antibodies,Bromma,Sweden))、兔多克隆抗SQLE(1:1000，12544-1-AP，英国曼彻斯特的蛋白技术公司(Proteintech,Manchester,UK))，在封闭缓冲液或5％ BSA中稀释。用TBST洗涤后，将膜与对应的山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP缀合物(1:3000，170-6516，法国马尔讷拉科凯特的伯乐公司(Biorad,Marnes-la-Coquette,France))或抗兔IgG-HRP(1:3000，A0545，法国圣昆汀法拉维尔的西格玛奥德里奇公司)一起温育。用TBST洗涤(两次，10分钟)后，用Fusion FX(Vilber Lourmat公司(Vilber Lourmat))揭示膜。使用ImageJ(美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland,USA))进行定量。/>
siRNA转染
在1x siMAX稀释缓冲液(30mM HEPES，100mM KCl，1mM MgCl2，pH＝7.3(德国埃伯斯贝格的欧陆集团(Eurofins,Ebersberg,Germany))中稀释siRNA。用每种EZH2 siRNA或对照siRNA(AllStars阴性对照siRNA，法国科塔布夫的凯杰公司(Qiagen,Courtaboeuf,France))独立转染细胞。简而言之，根据制造商的反向转染和正向转染的说明，用RNAiMAX转染试剂(英杰公司(Invitrogen))转染10nM的siRNA。转染前，将Lipofectamine RNAiMAX(赛默飞世尔公司)在转染培养基(OptiMEM，法国伊尔基希地区的吉博科公司、赛默飞世尔公司)中稀释1/100。
细胞迁移测定和球体培养
通过使用IncuCyte S3活细胞分析系统(英国罗伊斯顿赫特福德郡的艾森生物科学有限公司(Essen BioScience,Ltd,Royston Hertfordshire,United Kingdom))监测迁移。原始未经修饰的Incucyte图像用于统计分析，但为了演示效果，已使用AdobePhotoshop CS4(美国圣何塞(San Jose,USA))对图像进行了转换。以下功能已经用于优化细胞的可见性：灰度模式、双铬模式、负片、对比度/光度、曝光/γ、负片。
对于球体形成测定，在96孔板中的每孔使用104个细胞。每个孔的甲基纤维素/培养基/细胞和抑制剂(10μM、15μM或20μM)混合物的体积是100μL，其中甲基纤维素的最终浓度为0.5％。在快速而温和的均质化后，将混合物放置在圆底细胞培养微孔板(U形)上，所述微孔板经过处理以限制细胞粘附。之后，将球体在37℃和5％ CO2的温育箱中温育24小时。球体的照片和胶片由InCellis细胞成像仪(法国蒙蒂尼勒布勒托讷的贝尔廷医疗器械公司(Bertin instruments,Montigny-le-Bretonneux,France))拍摄。由于在测试的剂量下没有观察到剂量依赖性效应，将所有剂量汇集进行统计分析。
RNA纯化和实时定量PCR分析
按照制造商的说明，用TRI试剂(西格玛公司(Sigma))从细胞系中分离总RNA。为了信使RNA(mRNA)表达的定量，使用Maxima逆转录酶(赛默科技公司(Thermo Scientific))逆转录总RNA。在含有1XPremix Ex TaqTM(欧洲塔卡拉生物公司(Takara BioEurope))的12μL多重PCR反应中进行RT-qPCR扩增。正向引物和反向引物如表1所描述的。GAPDH mRNA作为归一化的内部对照。
表1：用于实时定量PCR分析的引物
SEQ ID NO:1 SQLE正向 5'-GCCTGCCTTTCATTGGCTTC-3'
SEQ ID NO:2 SQLE反向 5'-TTCCTTTTCTGCGCCTCCTG-3'
SEQ ID NO:3 NPC1正向 5'-ACTCAGTTACATAGGGCCATCA-3'
SEQ ID NO:4 NPC-1反向 5'-CGACCGATCCTTAGACACAG-3'
SEQ ID NO:5 LDLR正向 5'-AGCTACCCCTCGAGACAGAT-3'
SEQ ID NO:6 LDLR反向 5'-ACTCTCCGAAGCCTGTTCTG-3'
SEQ ID NO:7 HMGCR正向 5'-AGTGAGATCTGGAGGATCCAAG-3'
SEQ ID NO:8 HMGCR反向 5'-ACAAAGACGCCATCCATTCG-3'
SEQ ID NO:9 HMGCS正向 5'-CTTGTGCCCGAAGCAGGAAA-3'
SEQ ID NO:10 HMGCS反向 5'-GGCATGGTGAAACAGCTGTG-3'
雏鸡和小鼠模型
对于雏鸡CAM测定DMG模型，将1×106个NEM157i/NEM157i-VEGF(50:50)细胞与Matrigel(包含指定的浓度的抑制剂)混合，并且将40μl直接放在CAM上。每隔两天或三天使用立体显微镜(DS-Fi2，Nikon/SMZ745T)监测肿瘤生长。肿瘤用PFA 4％固定，并且进行照片记录。类似的方法用于肝母细胞瘤Huh6细胞和HepG2细胞。
对于小鼠模型，使用永生化的SU-DIPG-IV系。用MOI为10的荧光素酶载体(Luc)转导SU-DIPG-IVi。出生后两天，使用2μl NeuroSyringe(Hamilton Neuros，比利时布鲁塞尔的Dutscher公司(Dutscher,Bruxelles,Belgium))在2％异氟烷和50％富氧的麻醉下，通过颈部将2μl中的105个SU-DIPG-IVi-Luc细胞直接注射到脑干中，深度为3mm。8天后开始处理，一周3次，使用溶剂对照(DMSO)或GSK-126(6mg/kg或10mg/kg)、阿托伐他汀(10mg/kg)或组合(他汀类和GSK-126一起)。每次治疗后1天至2天，用麻醉的小鼠在Biospace成像仪(法国内勒拉瓦莱的Biospace实验室公司(Biospace Lab,Nesles la Vallée,France))上非侵入性地评估肿瘤生长。
在处理之前，对小鼠进行微纹身(Aramis试剂盒，法国BiosebLab公司(BiosebLab,France))。将动物称重，并且然后按照IACUC建议在右下象限接受i.p.注射。使用1ml结核菌素(tuberculin)注射器和26号针头，注射体积为200μl，用于30g小鼠(3mg/ml)，每周根据实际体重进行调整。从第8天开始，一周进行3次处理。在Biospace成像仪(法国内勒拉瓦莱的Biospace实验室公司)上非侵入性地评估肿瘤生长。整个程序在37℃的加热垫上进行。将动物剃毛并在无菌条件下(在PSM-2下)在专用于成像的盒中麻醉。在成像之前，根据动物的体重，动物接受了在PBS(50μl至100μl)中稀释的150mg/kg的D-Luc(普洛麦格公司，E264X)的i.p.注射。然后将盒放置在37℃下的加热垫上，在所述加热垫中维持2％异氟烷和50％氧气。一周进行两次成像。麻醉时间约为15分钟，因为只期望不动，并且动物的苏醒几乎是瞬间发生的。在第21天，通过颈脱位处死动物。
统计方法
使用GraphPad Prism 5软件(美国圣迭戈的GraphPad软件有限公司(GraphPadSoftware,Inc.San Diego,USA))进行统计分析。对于多于两个样品的定量比较，使用单向ANOVA检验，随后进行邦费罗尼后检验。如果数据分布不正常，则在选定的相关条件的邓恩氏后检验(Dunn's post-test)后使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)。对于两个小独立样品的比较，使用了未配对的t检验。对于使用半定量方法通过表型评估分析的实验，使用费舍尔氏精确检验(Fisher's Exact test)。所有实验(体内实验除外)均独立进行至少3次，n＝独立实验。p值<0.05被认为是统计学上显著的。对于图中的所有数据，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001或指示的精确p值。
实例1.2：结果
DMG样品和细胞系中的EZH2基因和蛋白质表达
与正常脑相比，EZH2的转录物在DMG样品中显著过表达(图1A)。在前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌等其它实体恶性病中也发现了类似的结果。由于两组之间的高表达变异性，与对照相比，平均EZH2过表达并没有很高，但一组核心样品围绕中值EZH2表达重新组合，并且差异仍然显著(图1A，左图，箱形框)。此研究中使用的细胞系均显示出EZH2蛋白的表达，如蛋白质印迹所示(图1B)。
DMG细胞对GSK-126抑制剂敏感
在高于6μM的剂量下观察到GSK-126的显著生长抑制，并且在高于25μM的较高剂量下则完全抑制(图1C)。当细胞增殖强烈减少时，在类似剂量下，生长抑制伴随着肿瘤细胞凋亡的增加(图1D)。此外，GSK-126有效地抑制DMG细胞中的H3K27me3三甲基化(图1E)。最后，在三种DMG细胞系中测量了GSK-126的半最大抑制浓度(IC50)，并且范围为7.6μM至10.3μM(图2)。
GSK-126处理的DIPG细胞中参与脂质和胆固醇合成的基因的增加的表达
GSK-126对DIPG细胞的处理诱导了HMGCS、HMGCR、LDLR、NPC1和SQLE基因以及HMGCR和SQLE蛋白的表达(图3和图4)。这些结果证实了蛋白质组学数据(参见Rahal,F.,C.Capdevielle,B.Rousseau,J.Izotte,J.W.Dupuy,D.Cappellen,G.Chotard,M.Menard,J.Charpentier,V.Jecko,C.Caumont,E.Gimbert,C.F.Grosset和M.Hagedorn(2022).“EZH2阻断剂通过脱靶效应使组蛋白突变的弥漫性中线胶质瘤对胆固醇代谢抑制剂敏感”.《神经肿瘤学进展》4(1):vdac018)，并且进一步证明GSK-126激活DIPG细胞中的脂质和胆固醇合成通路。
单独的或与GSK-126组合的ACSS2抑制剂、阿托伐他汀和特比萘芬对DMG细胞的影响
为了解释这些变化，假设参与胆固醇的生物合成的若干种关键酶[角鲨烯环氧化酶、羟甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶、乙酰CoA乙酸盐依赖性乙酰-CoA合成酶2]对GSK-126处理的DMG细胞变得重要。长期以来，已知这些酶涉及与脂质代谢相关的疾病。对于每种测试的胆固醇生物合成抑制剂，对单独的两种不同的肿瘤细胞系没有观察到影响(图5)。
然而，当用低剂量的GSK-126(4μM)共同处理时，这不会影响DMG细胞生长(图1C，图7D)，在范围为1μM至5μM的剂量下，所有三种抑制剂都发生了显著的生长抑制(图6，A-C)。
在新分离的DMG细胞上验证DMG细胞系数据
永生化的或培养一定时间的细胞系可以表现出与原始细胞不同的行为。因此，从DMG活检中分离细胞进行功能分析。亮场显微镜显示了均匀的纺锤体形成的细胞群体(图7A和插入物)。BXdmg1细胞的H&E染色显示非典型嗜酸性细胞具有不规则的异核型细胞核，具有非常高的有丝分裂活性，几乎所有肿瘤细胞都表达Ki-67抗原(图7A)。肿瘤细胞对H3K27M突变也呈强阳性，并且对H3K27me3三甲基化呈阴性(图7A)。BXdmg1细胞来源的活检的细胞、分子和基因表征，显著证实c83A>T；组蛋白H3F3A中的pK28M突变，导致驱动致癌事件，这在BXdmg1细胞中是保守的。
GSK-126处理以剂量依赖性方式减少H3K27me3三甲基化，如通过组蛋白纯化的蛋白质提取物的蛋白质印迹所示(图7A，右下小图)。BXdmg1细胞对GSK-126的生长抑制敏感(图7B)，其中IC50约为10μM(图7C)，与其它DMG系相当。BXdmg1细胞生长不受三种胆固醇生物合成抑制剂(至多为10μM)的影响(图7D)。GSK-126和阿托伐他汀在每种抑制剂的3μM和5μM的低剂量下都显示出显著的生长抑制，如所预期的，在更高剂量下，这种作用被掩盖了，因为单独的GSK-126的细胞毒性已经确立(图7E)。
阿托伐他汀、GSK-126以及组合对细胞迁移的影响
还使用具有活细胞S3分析系统(赛多利斯公司)的自动细胞刮片器研究了药物对DMG细胞迁移的影响。在汇合和伤口开始后24小时至48小时测量细胞移动。初始剥蚀区域非常干净，并且用相同大小的框架进行标记，以便在所有条件下进行说明(图8A-C)。Incucyte软件报告了24小时后迁移DMG细胞NEM157i、NEM163i和原代BXdmg1细胞覆盖的剥蚀区域的百分比，并且在右图中按条件显示(图8A-C)。对于所有测试的细胞，与单一处理或溶剂对照相比，组合处理观察到迁移活性的显著抑制(约2倍)(p<0.001)。在NEM163i细胞和BXdmg1细胞中，与DMSO相比，阿托伐他汀也减缓了迁移(p<0.05和p<0.001)，但与单独的阿托伐他汀相比，暴露于组合处理的细胞被迁移细胞覆盖的面积仍然较小(p<0.001)。
阿托伐他汀/GSK-126组合对肿瘤细胞球体形成的抑制
为了进一步研究细胞中的细胞移动和粘附现象，使用了允许DMG细胞的球体形成的方案，并且用IncuCyte S3分析系统分析了细胞移动和聚集。肿瘤球体被认为是比经典2D模型更逼真的培养系统，添加了更接近体内生长条件的3D复杂性。使用三种不同的DMG细胞系，包含原代BXdmg1细胞，可以用所有细胞系可靠地产生肿瘤神经球(图9A、9B、9D)。圆形球体在24小时内迅速形成，尽管大小略有不同，并且有时边界形状也有所不同(清晰边界与不规则边界)。然而，与单一GSK-126处理相比，暴露于组合处理的细胞几乎从未形成球体(p<0.001，对于所有细胞，图9C和9E)。在一些GSK-126处理的培养物中，球体形成受到影响，尤其是在原代细胞中(图9D、9E)。
GSK-126对NOD/LtSz-scid IL2Rγ(NSG)小鼠的原位SU DIPG IVi-Luc植入的肿瘤细胞的影响。
在新生免疫受损的小鼠中开发了原位脑干胶质瘤模型。使用慢病毒转染程序产生的SU-DIPG-IVi-Luc细胞。在第一个实验中，在此模型中测试了GSK-126处理的功效，并且发现与溶剂对照组(n＝18，图10A)相比，在10mg/kg的i.p.剂量下，处理的小鼠(n＝23)的生物发光(p＝0.009)证明了显著的生长减少。对于阿托伐他汀/GSK-126组合处理实验，将GSK-126的剂量降低到6mg/kg以避免生长抑制。在四次处理后，与阿托伐他汀(n＝13)、GSK-126(n＝17)(p<0.05)以及DMSO对照(p<0.01，n＝13，图10B)相比，组合的肿瘤生长抑制显著更强(n＝13)。对照和单一治疗之间没有发现显著差异。示出了此研究中使用的所有动物生物发光图像(图10A、B)。阿托伐他汀/GSK-126组合治疗在最近开发的雏鸡CAM DMG模型中也表现出更好的抗肿瘤效果。在此短期模型中，基于先前建立的成人胶质瘤CAM模型，药物可以直接应用于肿瘤，并且通过生物显微镜监测生长。药物作用的表型表征可以通过将肿瘤血管化的程度分类为高或低/中等来进行(图10C，右侧小图)。血管化的程度应解释为肿瘤细胞与宿主组织相互作用的能力，这是肿瘤细胞侵袭性的间接指标。与阿托伐他汀(p＝0.036)、GSK-126(p＝0.0248)和DMSO对照(p＝0.03，图10C，左侧小图)相比，组合治疗的实验性肿瘤显示出减少的血管形成。
实例2：用于治疗和/或预防肝母细胞瘤的三重疗法效率
EZH2是增殖性肝母细胞瘤的中心致癌基因
使用经典的2D培养和3D球体模型，发现RNA干扰对EZH2的耗竭通过激活衰老来阻断体外HB源性细胞系Huh6和HepG2的生长(参见下文的实例4和图21)。在体内，使用绒毛尿囊膜测定(CAM，Indersie等人,《肿瘤靶标(Oncotarget)》,2017,PMID:29662633)，EZH2的耗竭完全阻碍了肝母细胞瘤的发展，并且通过降低肿瘤血管生成降低了肿瘤细胞侵袭性(图11)。因此，EZH2是治疗肝母细胞瘤的相关治疗靶标。
然后，测量了GSK-126和他泽司他(也称为EPZ-6438——参见https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/66558664)这两种EZH2抑制剂对肝母细胞瘤细胞的生长的影响。虽然他泽司他在高于20μM的浓度下有效(图12)，GSK-126的IC50(半最大有效浓度)为约6μM至8μM，此浓度是顺铂的浓度的二分之一(图12)。
因此，使用经典的2D培养条件和3D肿瘤球体测试了将顺铂和GSK-126(参见图12A中每个细胞系中每种药物所测量的IC50)组合以消除肝母细胞瘤细胞的效果。如图13所示，在两种培养模型中，GSK-126和顺铂对消除肝母细胞瘤细胞具有相加效应。
随后，检验了EZH2参与肝母细胞瘤细胞对顺铂耐药性的假设，这种情况经常在用顺铂治疗的复发性患者中观察到。如图14A所示，在不存在EZH2蛋白的情况下，Huh6细胞和HepG2细胞对顺铂的敏感性增加了35％至48％，这表明EZH2参与了顺铂耐药性。当肝母细胞瘤细胞不表达EZH2时，顺铂也更有效地消除培养为3D球体的肝母细胞瘤细胞(图14B)。
由于EZH2抑制剂GSK-126有效地消除肝母细胞瘤细胞并调节DMG细胞中的胆固醇代谢(参见实例1.2)，在体外测试了他汀类是否与GSK-126和/或顺铂协同作用以消除这些肿瘤肝细胞。如图15A所示，单独的辛伐他汀或阿托伐他汀在20μM和50μM以及以上的浓度下对Huh6细胞和HepG2细胞具有抗肿瘤作用。如所预期的，在存在辛伐他汀或阿托伐他汀的情况下，Huh6细胞和HepG2细胞对GSK-126的敏感性显著增加(至少两倍)，但对顺铂的敏感性没有增加(图15B)，这表明他汀类与GSK-126协同消除肝母细胞瘤细胞，但不与顺铂协同。
接下来，测试了通过将GSK-126、顺铂和他汀类组合的三重疗法。如图16A-B所示，在存在辛伐他汀或阿托伐他汀的情况下，Huh6细胞和HepG2细胞对GSK-126+顺铂(各3μM)的组合的敏感性显著增加。三重疗法GSK-126+顺铂+他汀类在杀伤肝母细胞瘤细胞方面显著比组合GSK-126+他汀类更有效(图16A-B)。同样，辛伐他汀在单独或与顺铂组合增强GSK-126的抗肿瘤作用方面比阿托伐他汀略微有效。
最后，验证了GSK-126和他汀类的协同作用可以扩展到其它EZH2甲基转移酶抑制剂的假设。值得注意的是，图17中的数据示出了辛伐他汀或阿托伐他汀显著增强肝母细胞瘤细胞对EZH2抑制剂他泽司他(E7438/EPZ6438)的敏感性，这支持了我们的发现，即他汀类可能协同所有EZH2抑制剂。
总之，DMG和肝母细胞瘤细胞中的这些体外和体内数据清楚地表明，EZH2抑制剂(GSK-126，他泽司他……)对EZH2酶活性的抑制激活了胆固醇生物合成，这是一种适应性代谢过程，有助于肿瘤细胞存活并抵抗由EZH2抑制剂介导的有害作用。通过将他汀类和EZH2抑制剂组合，肿瘤细胞无法合成由EZH2失活介导的胆固醇，并且通过凋亡过程编程死亡。
实例3：EZH2上调与增殖性肝母细胞瘤和不良预后指标相关
实例3.1：材料与方法
细胞培养
人HB细胞系Huh6和HepG2分别在DMEM 1g/L和DMEM 4.5g/L(杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)，吉博科公司)中单层培养。培养基补充10％胎牛血清(FBS，西格玛公司)和青霉素/链霉素(1,000单位/mL)(吉博科公司)。使用短串联重复序列(STR)谱定期鉴定所有使用的细胞，并每月测试两次支原体感染。
对于3D培养，在低连接96孔板中每孔形成具有10,000个细胞的球体。在每个孔中，将细胞与100μl的培养基和100μl的甲基纤维素混合，最终浓度为0.5％。使用S3活细胞分析系统(艾森生物科学有限公司)培育并定期扫描具有球体的板。/>
siRNA转染
用靶向EZH2 mRNA或对照RNA(AllStars阴性对照siRNA，凯杰公司)的两种不同siRNA[siEZH2-1，如SEQ ID NO:11:GAG GGA AAG UGU AUG AUA A(TT)中所示；siEZH2-2，如SEQ ID NO:12:UUU GGC UUC AUC UUU AUU G(TT)中所示]转染细胞。转染在每孔具有250,000个细胞的6孔微孔板中进行。将siRNA在1x siMAX稀释缓冲液(6mM HEPES，20mM KCl，0.2mM MgCl2，pH＝7.3；德国埃伯斯贝格的欧陆集团)中稀释。使siRNA与在转染培养基(OptiMEM，吉博科公司)中稀释至1/100的lipofectamine(RNAiMax，英杰公司)接触。对于每个siRNA使用20nM的最终浓度。将混合物在室温下温育20分钟以形成脂质体，并且然后将其添加到在不含抗生素的培养基中温育6小时的细胞中。转染后，用含有抗生素的新鲜培养基置换培养基。
诱变和质粒构建
为了进行克隆，使用慢病毒质粒pSIN-EF1αL-eGFP-IRES-Puro。克隆了两个与野生型EZH2和突变的版本的EZH2(EZH2*)相对应的插入物。简而言之，使用从义翘神州公司(SinoBiological)订购的cDNA作为基质和以下引物通过PCR扩增野生型EZH2开放阅读框：正向：5'-GCG CGC TAG CAC CAT GGG CCA GAC TGG GAA-3'，如SEQ ID NO:13中所示；反向：5'-GCG CAC GCG TTC AAG GGA TTT CCA TTT CTC-3'，如SEQ ID NO:14中所示。称为EZH2*的H689A突变体是通过如Jung Kim等人(EZH2作为转录激活剂的多梳和甲基化无关作用(Polycomb-and Methylation-Independent Roles of EZH2 as a TranscriptionActivator.)《细胞报告(Cell Rep)》,2018.25(10):第2808-2820页e4)所描述的诱变，使用以下引物获得的：正向：5'-GTTTGGATTTACCGAAGCATTTGCAAAACGAATTTTGTTACCCTTGCG-3'，如SEQ ID NO:15中所示，以及反向：5'-CGCAAGGGTAACAAAATTCGTTTTGCAAATGCTTCGGTAAATCCAAAC-3'，如SEQ ID NO:16中所示。将PCR产物克隆在pSIN-EF1αL-eGFP-IRES-Puro载体的NheI/MluI位点中，并且在送往载体学核心设施用于慢病毒产生之前进行完全测序。
慢病毒产生、滴定和细胞转导
传染性慢病毒颗粒的产生和滴定是通过载体学平台VECT'UB完成的。Maurel M等人(功能筛选鉴定控制磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的五种微小RNA：miR-1271在肝细胞癌中的下调作用(A functional screening identifies five microRNAs controlling glypican-3:role of miR-1271down-regulation in hepatocellular carcinoma.)《肝病学》,2013.57(1):第195-204页)和Laloo B等人(通过功能、整合和定量方法分析转录后调控(Analysis of post-transcriptional regulations by a functional,integrated,andquantitative method.)《分子细胞蛋白质组学(Mol Cell Proteomics)》,2009.8(8):第1777-88页)先前已经描述了程序和策略。将慢病毒颗粒添加到细胞中并温育24小时。之后，用PBS将细胞洗涤两次，并且然后在实验使用前培养几天。每个实验都证实了蛋白质的异位表达。
药物处理
顺铂(S1166)、EPZ6438(也称为他泽司他，S7128)、GSK-126(S7061)、阿托伐他汀(S5715)和辛伐他汀(S1792)购自塞莱克化学公司。顺铂用0.9％的NaCl溶解。用DMSO(二甲亚砜)溶解EPZ6438、GSK-126、阿托伐他汀和辛伐他汀。对于辛伐他汀，在细胞测定中使用之前，药物在EtOH处理中被NaOH激活。所有药物均在-20℃下储存。
细胞生长和活力测定
对于2D培养，将总共2,000个细胞/孔的Huh6和总共3,000个细胞/孔的HepG2接种在96孔微量滴定板中。在基因操纵后24小时、48小时、72小时或96小时，以及药物处理后48小时或72小时，使用体外MTS测定试剂盒或磺基罗丹明B(SRB，565nm下的吸光度)测定(西格玛公司)，按照制造商的说明测量细胞生长。对于3D培养，如上文所描述的形成球体，冰球将微孔板在S3活细胞分析系统中温育，并且每8小时扫描一次。对于基因操纵，慢病毒转导或基因耗竭在铺板前进行。对于药物处理，根据实验和药物，在第4天或第5天对球体进行48小时或72小时的处理。使用1μM钙黄绿素AM(百进生物公司(BioLegend))和2μM乙锭同源二聚体1(西格玛公司)在37℃下进行30分钟的球体中的细胞活力测定。使用S3活细胞分析系统对球体进行成像。对于所有细胞活力测定，药物以半最大抑制浓度(IC50)使用。
细胞衰老
将EZH2沉默的细胞或对照细胞接种到24孔板中。三天后，固定细胞，并且根据制造商的说明，使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(美国马萨诸塞州丹弗斯的细胞信号传导公司(Cell Signaling,Danvers,Massachusetts,USA))通过衰老测定测量β-半乳糖苷酶活性。使用InCellis显微镜(法国贝尔坦科技公司(Bertin Technologies,France))对细胞进行观察和成像。使用ImageJ对衰老细胞进行计数。
凋亡
在基因操纵或药物处理后，使用胱天蛋白酶3/7活性测定(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega Corp.,Madison,WI,USA))在接种到96孔板中的EZH2沉默的细胞或对照细胞中测量凋亡。
细胞迁移
将EZH2沉默的细胞或对照细胞以每孔35,000个细胞的密度接种到2孔细胞培养插入物(法国生物谷公司(Biovalley,France))中。十八小时后，用InCellis显微镜(法国贝尔坦科技公司)在0小时、8小时和24小时对细胞迁移进行成像。用Image J进行定量。
为了研究药物对细胞迁移的影响，将细胞以每孔50,000个细胞的密度铺板在96孔板中，并且温育直到连接。IncuCyte伤口制造机(96针伤口制造工具)用于制造划痕。然后，用IC25下的药物处理细胞，并且通过使用S3活细胞分析系统每小时扫描每个孔，持续24小时来监测细胞迁移。
脂滴测定
将细胞以每孔250,000个细胞的密度在6孔板中铺板。24小时后，以先前确定的IC50用药物处理或不处理细胞。处理48小时后，将细胞在4％ PFA中固定15分钟，然后在室温下用红油染色15分钟。最后，将细胞洗涤若干次，并且使用InCellis显微镜(法国贝尔坦科技公司)进行扫描。
蛋白质印迹
使用RIPA缓冲液(西格玛公司)、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche))的混合物在处理后48小时或基因操纵后72小时裂解细胞并提取总蛋白质。在用BCA蛋白测定(赛默飞世尔公司)进行蛋白质定量后，将40ug的总蛋白质装载在4％至15％的预制凝胶(伯乐公司)中用于迁移。然后，将蛋白质转移到硝化纤维膜上(Turbo中等大小，伯乐公司)。用5％ BSA或Odyssey封闭缓冲液(LI-COR生物科学公司)封闭膜，并且用对应的抗体检测(表2)。使用Fusion FX(Vilber Lourmat公司)通过化学发光进行揭示，并且使用ImageJ软件(美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院)进行定量。
表2：用于蛋白质印迹分析的抗体。
蛋白质组学
通过波尔多大学的蛋白质组学核心设施(Proteomics Core Facility at theUniversity of Bordeaux)在Huh6细胞系缺失的EZH2或对照中进行蛋白质组学分析(https://proteome.cgfb.u-bordeaux.fr/en)。所有步骤都如Ghousein等人(miR-4510通过RAF1靶向和RAS/RAF/MEK/ERK信号传导失活阻断肝细胞癌发展(miR-4510 blockshepatocellular carcinoma development through RAF1 targeting and RAS/RAF/MEK/ERK signalling inactivation.)《国际肝杂志(Liver Int)》,2020.40(1):第240-251页)所描述的进行。
雏鸡CAM测定
根据欧洲(指令2010/63/UE)和法国(法令2013-118)指南，如先前所描述的(Indersie,E.,等人,以物种特异性方式跟踪体内实验性肿瘤进展期间的细胞和分子变化(Tracking cellular and molecular changes in a species-specific manner duringexperimental tumor progression in vivo.)》《肿瘤靶标》,2018.9(22):第16149-16162页)(Indersie,E.等人,微小RNA疗法通过靶向β-连环蛋白和Wnt信号传导抑制肝母细胞瘤的体内生长(MicroRNA therapy inhibits hepatoblastoma growth in vivo bytargeting beta-catenin and Wnt signaling.)《肝病学通讯(Hepatol Commun)》,2017.1(2):第168-183页)进行动物程序。简而言之，受精胚胎是在分割阶段接受的。然后，将其在37.4℃和70％湿度下温育。在发育的第3天，蛋壳顶部被打开，并且开口用医用级Durapore胶带密封。在胚胎发育的第10天，将100万个Huh6细胞或HepG2细胞包埋在(生长因子减少，康宁公司(Corning))液滴(40μL)中，并且沉积在CAM上。通过立体显微镜(SMZ745T)监测肿瘤生长和血管形成，并且在第1天、第3天和第7天使用相机(DS-Fi2)拍摄图片。第7天，所有肿瘤均用4％ PFA固定并提取。然后使用精密天平测量重量。/>
克隆形成性测定
Huh6细胞和HepG2细胞分别以500个和1000个细胞/孔接种在12孔板中。连接后，用药物处理细胞。对于Huh6，阿托伐他汀(8uM)、辛伐他汀(4uM)和/或GSK-126(3uM)，并且对于HepG2，阿托伐他汀(8uM)、辛伐他汀(4uM)和/或GSK-126(4uM)。
在37℃下温育10天后，用4％ PFA固定细胞，并且用0.05％结晶紫染色。在FusionFX(Vilber Lourmat公司)下阅读。
非洲爪蟾胚胎中的毒理学测定
在存在所指示浓度的顺铂或GSK-126的情况下，在24孔板中温育原肠胚阶段胚胎的批次(每个批次10个胚胎)。将胚胎留在溶液中，直到未经处理的对照胚胎达到第41阶段。对照或顺铂处理的胚胎在0.1x马克改良的林格氏溶液(Marc's Modified Ringer)中温育。GSK-126处理的胚胎在补充有0.1％ DMSO的0.1x马克改良的林格氏溶液中温育。
肿瘤异种移植物
NOD/LtSz-scid IL2Rγ无效(NSG)小鼠在符合监管机构(法国政府)的标准条件下饲养。消毒后的食物和水可以随意获得。在8周龄至9周龄雌性小鼠(26g至32g；APAFIS#32917-2021121316283534v2，协议#B33063916，Ministère de l'Enseignement Supérieur,de la Recherche et de l'Innovation)的右侧皮下注射50％的Matrigel中的一百万个Huh6细胞，总体积为100μl。
通过卡尺测量监测肿瘤生长，直到肿瘤达到250mm3的平均体积(在第12天，参见箭头)。因此，将小鼠随机分为5组，并且通过腹膜内途径用不同的药物进行处理。顺铂以1mg/kg的剂量每周注射两次。GSK-126和阿托伐他汀(ATR)分别以50mg/kg和20mg/kg的剂量每周注射3次。媒剂(含有5％ DMSO的PBS)每周注射3次。在另外16天期间监测肿瘤生长，直到肿瘤对照达到2000mm3的大小。因此，所有小鼠都被实施了安乐死。从所有安乐死的小鼠收集血液，并且测量循环ASAT、ALAT、肌酐和尿素以评估不同处理对肝脏和肾脏的毒性。
统计分析
使用GraphPad Prism 6.0或7.0软件进行统计分析。所有数据显示为至少三个独立实验的平均值，并且误差条指示平均值的标准偏差(SD)。当实验含有两组不匹配的值时，使用非参数曼-惠特尼检验来比较平均值。当实验含有两组匹配的值时，并且根据数据是否被认为遵循高斯分布(Gaussian distribution)，使用参数t检验或非参数威尔科克森配对符号秩检验。当实验含有三组值或更多值时，采用常规的单向方差分析(ANOVA)。当实验含有三组值或更多值以及两个实验因素时，使用双向ANOVA来比较多个平均值和条件。单向和双向ANOVA检验之后进行西达克氏多重比较后检验。当实验含有两组分类变量时，采用双尾卡方检验。当p<0.05时，结果被认为是显著的。对于图中的所有数据，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001或指示的精确p值。
转录组学数据
转录组数据和数据集(表3)如先前出版物中所描述的(Hiyama E.日本儿童肝肿瘤研究组2(JPLT-2)试验的肝母细胞瘤病例的基因表达谱.2019,《科学库OU》；Carrillo-Reixach,J.等人,表观遗传足迹使肝母细胞瘤的分子风险分层具有临床意义.《肝病学杂志》,2020.73(2):第328-341页；Sumazin,P.等人,肝母细胞瘤的基因组分析鉴定不同的分子亚组和预后亚组.《肝病学》,2017.65(1):第104-121页；Valanejad,L.等人,PARP1激活增加经修饰的肿瘤抑制因子的表达和侵袭性肝母细胞瘤发展的潜在通路.《通讯生物学》,2018.1:第67页；Cairo,S.等人,侵袭性儿童肝癌中的肝类干表型以及Wnt/β-连环蛋白与Myc信号传导的相互作用.《癌细胞》,2008.14(6):第471-84页；ichenmuller,M.等人,肝母细胞瘤以及其具有HCC样特征的后代的基因组景观.《肝病学杂志》,2014.61(6):第1312-20页；Hooks,K.B.等人,增殖性肝母细胞瘤诊断和治疗选择的新见解.《肝病学》,2018.68(1):第89-102页)或从NCBI的基因表达综合(Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，参见对应的图和/或图例中的登录号和参考文献)(Edgar,R.,M.Domrachev和A.E.Lash,基因表达综合：NCBI基因表达和杂交阵列数据库(GeneExpression Omnibus:NCBI gene expression and hybridization array datarepository.)《核酸研究(Nucleic Acids Res)》,2002.30(1):p.207-10)或从自R2：基因组学分析和可视化平台(https://r2.amc.nl)上传。
表3：
GEO：基因表达综合；NT：非肿瘤肝脏；T：肿瘤；R：复发
实例3.2：EZH2是不良预后指标的证据
由于EZH2在肝母细胞瘤中的作用鲜为人知，首先通过考虑C1、C2A和C2B肿瘤分类来分析已发表的数据集中的EZH2转录物的表达(Hooks KB等人,《肝病学》，2018年7月；68(1):89-102.doi:10.1002/hep.29672)。如图18a所示，与非肿瘤(NT)样品相比，肝母细胞瘤中的EZH2 mRNA增加，并且此表达与增殖性和拓扑异构酶2-α(TOP2A)蛋白阳性的C2A组特别相关(Hooks KB等人,《肝病学》,2018年7月；68(1):89-102.doi:10.1002/hep.29672。与此结果一致，在队列的肝母细胞瘤样品中发现EZH2与TOP2A mRNA之间存在强烈正相关(图18b)。为了证实这些数据，在另外六个已发表的转录组数据集中分析了EZH2 mRNA水平。在所有情况下，肝母细胞瘤中的EZH2 mRNA表达显著增加(图18c)，并且其表达与TOP2A mRNA表达强烈相关(图19)。这些数据表明，EZH2表达可能与增殖性和侵袭性肝母细胞瘤亚型有关。为了证实此趋势，使用临床和组织学数据进行了比较分析。EZH2 mRNA在肿瘤发展的所有阶段(如Sumazin等人所定义的(《肝病学》2017年1月；35(1):104-121.doi:10.1002/hep.28888))并且所有PRETEXT组中都上调。EZH2 mRNA表达在预后不良的胚胎、混合和小细胞组织学亚型中高于预后良好的胎儿亚型，并且在复发性肿瘤以及在死亡患者中显著增加(图20)。这些数据表明EZH2可能是肝母细胞瘤中的独立预后因素。
实例4：EZH2蛋白通过其组蛋白甲基转移酶活性作为肝母细胞瘤中的关键致癌基因发挥作用
为了阐明EZH2在增殖性肝母细胞瘤中的作用，首先将RNA干扰技术和C2A源性肝母细胞瘤细胞系Huh6和HepG2的使用相结合(Hooks KB等人,《肝病学》,2018年7月；68(1):89-102.doi:10.1002/hep.29672)。如图21a所示，EZH2-1或EZH2-2 siRNA在转染后3天有效地沉默了两种细胞系中的EZH2蛋白水平。EZH2耗竭九十六小时后，肝母细胞瘤细胞的生长减少了一半(图21b)，并且细胞进入衰老，没有凋亡迹象，如P16和P21增加、β-半乳糖苷酶阳性染色和缺乏胱天蛋白酶3/7激活所展示的(图21c-e)。Huh6细胞的迁移也受到EZH2蛋白的损失的抑制(图22a)。HepG2细胞在培养条件下不迁移。在分子水平上，EZH2沉默显著降低了组蛋白H3赖氨酸27(H3K27，图22b)的三甲基化和细胞外信号调节激酶(ERK，图23a)的磷酸化。这些数据表明EZH2诱导的肝母细胞瘤细胞中的浓缩的染色质的松弛，肿瘤抑制剂的有效表达以及MAPK/ERK信号传导的失活，所述信号传导在增殖性肝母细胞瘤中起着至关重要的作用(Mosca等人,《肝癌(Liver Cancer)》2022；11:126-140)。
为了确定组蛋白甲基转移酶活性是否对EZH2蛋白的致癌活性至关重要，开发了异位表达野生型EZH2转基因或EZH2催化死亡突变体H689A的转基因细胞系(图24a，在图23b、24a-e和25中称为EZH2*)。此突变体缺乏EZH2的甲基转移酶活性(图24a)(Kim等人,《细胞报告》2018；25:2808-2820e2804)。首先通过蛋白质印迹在Huh6细胞和HepG2细胞中验证了这两种形式的EZH2蛋白的异位表达(图22b)。然后，在体外研究了其特异性作用。如图23b、24c-e和25所示，野生型EZH2蛋白增强了ERK的磷酸化、肝母细胞瘤细胞的生长、更大球体的形成和对顺铂的耐药性，而突变体EZH2*蛋白没有影响。总之，这些数据清楚地表明，组蛋白甲基转移酶活性负责肝母细胞瘤细胞中的EZH2的致癌功能以及其增殖和抵抗基于顺铂的化疗的能力。
实例5：EZH2组蛋白甲基转移酶活性与脂质合成有关
为了进一步探索EZH2在肝母细胞瘤中的致癌作用的分子机制，对EZH2沉默的和对照Huh6细胞进行了比较蛋白质组学分析(图26a)。使用1.8的截断倍数变化和0.05的截断p值，相对于对照细胞，54个和87个基因在EZH2沉默的细胞中分别显著上调和下调(图26a)。通过蛋白质印迹在Huh6细胞中评估P16和β-连环蛋白的上调以及CTSV和DUSP9蛋白的下调，并且结果证实了蛋白质组学数据的准确性(图21d和未示出的数据)。在下调的蛋白质中，3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGCR)在EZH2沉默的Huh6细胞和HepG2细胞两者中均减少(图26a-b)。如所预期的，GSK-126(一种特异性抑制剂或EZH2组蛋白甲基转移酶)对这些细胞的处理减少了组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化(图27a)，然而，其触发了HMGCR的表达和脂质的合成(图27b-c)。这些数据表明，作为补偿机制，肝母细胞瘤细胞增强了响应于GSK-126的脂质合成。
由于GSK-126有效阻断癌蛋白EZH2的活性，其可以被认为是肝母细胞瘤的新治疗选择。因此，在非洲爪蟾胚胎中将其毒性与顺铂的毒性进行了比较。顺铂作为肝母细胞瘤的一线治疗的标准药物已使用了30年。在原肠胚阶段，胚胎用增加浓度的顺铂或GSK-126处理(图28)。结果表明，顺铂在50μM的低剂量下是有毒性的，而GSK-126在1mM的高剂量下变得有毒性。因此，GSK-126的毒性比顺铂小，其可以被认为是增殖性和侵袭性肝母细胞瘤的新治疗选择，或用于复发或对顺铂表现出化学耐药性的患者的二线疗法。
实例6：GSK-126与他汀类组合在体外和体内有效根除肝母细胞瘤细胞
由于GSK-126诱导HMGCR蛋白水平和脂质合成(图27b和c)，测试了GSK-126与两种HMGCR酶的特异性抑制剂阿托伐他汀(ATR)或辛伐他汀(SIM)组合的效果。如图29所示，单独的亚最佳剂量的GSK-126(Huh6细胞和HepG2细胞分别为3μM和4μM)、ATR(8μM)或SIM(4μM)对肝母细胞瘤细胞的增殖和存活几乎没有影响，如克隆形成细胞测定所揭示的(图29)。然而，在相同浓度下，GSK-126与ATR或SIM的组合具有协同作用，并且在体外完全消除了来自两种细胞系的肝母细胞瘤细胞(图29)。另外，组合GSK-126+ATR或GSK-126+SIM显著阻断Huh6细胞迁移，而单独的每种药物作用有限(图30)。最后，在免疫受损的NSG小鼠中使用Huh6细胞的异种移植物模型在体内测试了这些药物的效果(图31a)(Hooks KB,Audoux J,Fazli H,Lesjean S,Ernault T,Dugot-Senant N等人,增殖性肝母细胞瘤诊断和治疗选择的新见解.《肝病学》2018；68:89-10)。如图31b所示，GSK-126+ATR组合(GSK-126，50mg/kg；ATR，20mg/kg)有效抑制了小鼠的肝母细胞瘤的发展，而单独的GSK-126和ATR在相同剂量下没有效果。在1mg/kg的剂量下，顺铂也阻碍肿瘤生长，但其效率低于组合(图11和31b)。肿瘤提取后，并且与顺铂或单独使用的各种药物相比，所述组合显然是减少肿瘤生长和血管形成的最有效的药物(图31c)。同时，不同药物和组合对血液循环ASAT、ALAT、肌酐和尿素水平没有影响，表明没有肝毒性和肾毒性(图31d)。总之，数据证明了将GSK-126与他汀类组合在体外根除肝母细胞瘤细胞并在体内阻断肿瘤生长和血管形成的益处。

Claims (12)

1.一种用于在治疗和/或预防与甲基转移酶EZH2相关的肿瘤的方法中使用的组合物，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述组合物，其中所述组合物包括EZH2抑制剂和一种他汀类的组合。
2.根据权利要求1或2所述的在方法中使用的组合物，其中所述EZH2抑制剂选自GSK-126、UNC1999、EPZ005687、EI1、MC3629、GSK926、GSK343、GSK503、CPI-360、CPI-169、CPI-1205、他泽司他(tazemetostat)、EPZ011989、ZLD1039、EBI-2511、皮诺美司他(pinometostat)、利拉美托司他(lirametostat)、JQEZ5、PROTAC MS1943、DZNep、MC1947、MC1948和/或PF-06821497。
3.根据权利要求1或2所述的在方法中使用的组合物，其中与甲基转移酶EZH2相关的肿瘤选自肝母细胞瘤、弥漫性内生型桥脑胶质瘤(DIPG)、弥漫性中线胶质瘤(DMG)、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、横纹肌样肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌、睾丸癌、胰腺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、皮肤癌、头颈癌。
4.根据前述权利要求中任一项所述的在方法中使用的组合物，其中所述一种他汀类选自阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)以及其类似物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的在方法中使用的组合物，其中所述EZH2抑制剂是GSK-126或他泽司他。
6.根据前述权利要求中任一项所述的在方法中使用的组合物，其中所述EZH2抑制剂是GSK-126或他泽司他，并且其中所述他汀类是阿托伐他汀或辛伐他汀。
7.根据前述权利要求中任一项所述的在方法中使用的组合物，其中EZH2抑制剂是GSK-126，并且其中GSK-126以包括20mg至1500mg、或50mg至1200mg或100mg至1000mg的剂量静脉内施用于所述受试者，每周两次。
8.根据前述权利要求中任一项所述的在方法中使用的组合物，其中所述组合物进一步包括有效量的抗癌药物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的在方法中使用的组合物，其中所述抗癌药物选自铂化合物、紫杉烷衍生物、拓扑异构酶抑制剂、激素治疗剂、雄激素剥夺剂、雄激素受体剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗血管生成剂、免疫治疗制剂、抗炎药、具有抗癌作用的生物制剂、由天然物质制备的抗癌制剂。
10.根据权利要求9所述的在方法中使用的组合物，其中所述抗癌药物是顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和/或奥沙利铂(oxaliplatin)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的在方法中使用的组合物，其中所述组合物通过静脉内途径、肠胃外途径和非肠胃外途径或局部注射施用于有需要的患者。
12.根据前述权利要求中任一项所述的在方法中使用的组合物，其中所述组合物在抗癌标准治疗、放射疗法或其它一线或二线癌症疗法后施用于复发性患者或难治性患者。
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