KR20240052776A - Mog-결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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토비아스 아벨
라 로사 마우러스 데
셀린 뒤몬트
데이비드 페나드
지안느 프리케체
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상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 MOG에 결합할 수 있는 신규한 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 개발 및 조절 면역 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 키메라 항원 수용체(CAR)에 상기 단백질의 항원-결합 부분의 포함시키는 것에 관한 것이다. 이들은 탈수초화를 감소 또는 방지하기 위한, 재수초화를 유도하기 위한, 그리고 염증성 CNS 질환/장애, 예컨대, 다발성 경화증을 치료하기 위한 가치있는 치료 도구를 제공한다.

Description

MOG-결합 단백질 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 9월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/240,626호의 우선권을 주장한다. 본 출원의 개시내용은 이의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 서열목록을 포함한다. 2022년 9월 2일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 025297_WO040_SL.xml이고, 용량이 96,546 바이트이다.
미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein: MOG)은 주로 중추신경계(CNS)에서 발견되는 당단백질이다. MOG는 수초성 희소돌기 아교세포의 표면 상에서 발견되며, 미엘린초의 구성성분이고; 뇌, 시신경 및 척수에서 신경 섬유를 둘러싸는 보호 덮개이다.
탈수초성 질환은 미엘린초(탈수초화)에 대한 손상 또는 파괴를 야기하는 임의의 병태이다. 미엘린초가 손상될 때, 신경 충격은 느려지거나 심지어 중단되어, 신경학적 증상을 야기한다. 이러한 증상은, 단리될 때, 임상적 단독 증후군(CIS)으로 정의된다. CIS를 경험하는 개체는 다발성 경화증(MS)이 진행될 수도 있고, 진행되지 않을 수도 있다.
MS는 중추신경계의 가장 흔한 탈수초성 질환이고, 염증, 탈수초화 및 신경퇴행의 다중 영역을 특징으로 한다. 3가지 주된 유형의 MS가 있다: 재발-완화형 MS(RRMS), 원발성-진행성 MS(PPMS) 및 이차-진행성 MS(SPMS). MS의 초기 단계에서, 신경 손상은 자가반응성 T 세포가 미엘린 에피토프를 인식하고 미엘린초를 공격하여 미엘린 발현 세포의 파괴를 야기하는 것으로 인해 일어나는 것으로 간주된다. 대다수의 환자는 초기에 상대적 양성 재발-완화형 질환 과정(RRMS)을 나타낸다. 일부는 궁극적으로 두 번째 진행 형태(SPMS)로 전환될 것이다. 더 적은 백분율의 환자에서 원발성 진행(PPMS)이 발생되고 관해의 임의의 회복기 없이 질환 진행이 시작부터 서서히 악화될 것이다.
T 조절 세포(Treg)는 면역관용을 확립 및 유지하고 염증 후 다양한 면역 반응을 억제하는 데 적극적인 역할을 한다. Treg의 고갈은 면역 반응-유발 질환으로부터의 자연적 회복을 저해할 수 있고, 이러한 세포의 전달은 질환 중증도를 감소시킬 수 있다. 인간 Treg는 면역 항상성의 유지에서 중요한 역할을 하고, 따라서, 다양한 임상 병태에서 치료 수단으로서 사용될 수 있다. 이들은 또한 치료 환경에서 항원-특이적 면역조절을 부여하기 위해 활용될 수 있는 강력한 면역억제 특성을 갖는다.
마우스 MOG를 표적화하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)을 발현시킨 조작된, CNS-표적화 조절 T 세포를 문헌[Fransson et al., Journal of Neuroinflammation, 2012, 9:112]의 EAE 마우스 및 시험관내에서 평가하였다.
중추신경계의 염증 질환/장애, 특히 자가-항원 및/또는 항-항체, 예컨대, MS에 의해 야기되거나 또는 악화되는 탈수초성 장애의 효과적인 치료에 대한 요구가 남아있다.
본 발명은 염증 부위에서의 MOG의 결합에 기반하여, 염증 부위에 조절 면역 세포를 활성화시키는 신규한 도구의 개발에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명자들은 본 명세서에서 MOG에 결합할 수 있는 신규한 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)을 개시한다. 조절 면역 세포의 세포 표면 상에서 발현된 키메라 항원 수용체(CAR)에서 상기 단백질의 항원-결합 부분(예를 들어, scFv)의 포함은 MOG에 결합 시 CNS에서 이러한 조작된 세포의 활성화를 가능하게 한다. 따라서 이러한 조작된 조절 면역 세포는 탈수초화를 감소 또는 방지하고, 재수초화를 유도하고, 염증성 CNS 질환/장애, 예컨대, MS를 치료하기 위한 가치있는 치료 도구일 것이다.
따라서 본 발명은 예상치 못하고 유리한 특징의 조합을 갖는 새로운 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 예상치 못하고 유리한 특징의 조합을 갖는 MOG를 표적으로 하는 새로운 키메라 항원 수용체(CAR)(본 명세서에서 '항-MOG CAR'로 지칭됨)에 관한 것이다. 추가로, MOG를 표적으로 하는 새로운 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 새로운 Treg(본 명세서에서 'CAR-MOG Treg'로 알려짐)가 제공된다. 본 발명은 추가로 탈수초화를 감소 또는 방지하고, 재수초화를 유도하고, 염증성 CNS 질환/장애, 예컨대, MS의 치료를 위한 치료제 및 방법을 제공한다.
제1 양상에서, 본 발명은 서열번호 3 내지 5를 각각 포함하는 상보성-결정 영역(HCDR) 1 내지 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 또는 서열번호 3 내지 5 중 하나와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 HCDR; 및 서열번호 6 내지 8을 각각 포함하는 LCDR 1 내지 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL); 또는 서열번호 6 내지 8 중 하나와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 LCDR을 포함하는, MOG-결합 단백질을 제공한다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 서열번호 3 내지 5를 각각 갖는 상보성-결정 영역(HCDR) 1 내지 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 서열번호 6 내지 8을 각각 갖는 LCDR 1 내지 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 실시형태에서, VH는 서열번호 11 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 9 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VH는 서열번호 11을 포함하고, VL은 서열번호 9를 포함한다.
추가 실시형태에서, MOG-결합 단백질은 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)이다. 더 바람직하게는, MOG-결합 단백질은 서열번호 12 또는 이와 적어도 약 95% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)이다. 더 바람직하게는, MOG-결합 단백질은 서열번호 12를 포함하는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)이다. 더 바람직하게는, MOG-결합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)이다. 더 바람직하게는, MOG-결합 단백질은 서열번호 51 또는 이와 적어도 약 95% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)이다. 더 바람직하게는, MOG-결합 단백질은 서열번호 51을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)이다. 더 바람직하게는, MOG-결합 단백질은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)이다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 마우스 및 인간 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질(MOG)에 결합할 수 있다. 바람직하게는, MOG-결합 단백질은 또한 사이노몰거스 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질(MOG)에 결합할 수 있다.
제2 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 MOG scFv 또는 항-MOG 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인; 막관통 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 선택적으로 서열번호 15 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및/또는 선택적으로 서열번호 16 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 막관통 도메인은 선택적으로 서열번호 14 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된다.
바람직한 실시형태에서, CAR은 본 발명에 따른 항-MOG scFv; 선택적으로 서열번호 13을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 힌지 도메인; 서열번호 14를 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인; 선택적으로 서열번호 15를 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 서열번호 16을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인; 및 선택적으로 태그 및/또는 리더 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, CAR은 선택적으로 서열번호 12를 포함하는 본 발명에 따른 항-MOG scFv를 포함하는 세포외 도메인; 선택적으로 서열번호 13을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 힌지 도메인; 선택적으로 서열번호 14를 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인; 선택적으로 서열번호 15를 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인, 선택적으로 서열번호 16을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인을 포함하는 세포질 도메인; 및 선택적으로 태그로서, 선택적으로 서열번호 2를 포함하는, 상기 태그, 및 선택적으로 리더 서열로서, 선택적으로 서열번호 1을 포함하는, 상기 리더 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, CAR은 선택적으로 서열번호 51을 포함하는 본 발명에 따른 항-MOG scFv를 포함하는 세포외 도메인; 선택적으로 서열번호 13을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 힌지 도메인; 선택적으로 서열번호 14를 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인; 선택적으로 서열번호 15를 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인, 선택적으로 서열번호 16을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인을 포함하는 세포질 도메인; 및 선택적으로 태그로서, 선택적으로 서열번호 2를 포함하는, 상기 태그, 및 선택적으로 리더 서열로서, 선택적으로 서열번호 1을 포함하는, 상기 리더 서열을 포함한다.
제3 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 MOG-결합 단백질 또는 본 발명에 따른 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
제4 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
제5 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 CAR을 발현시키거나, 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 조절 면역 세포를 제공한다. 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 T 세포이다.
본 발명은 또한 단리된 인간 T 세포를 제공하되, T 세포는 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 추가로 조절 면역 세포의 집단을 제공하되, 집단은 본 명세서에 정의된 바와 같은 복수의 세포를 포함한다.
제6 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명에 따른 조절 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
제7 양상에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명에 따른 조절 면역 세포의 집단을 제공한다.
본 발명은 또한 탈수초성 질환/장애, 특히 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 조절 면역 세포, 본 발명에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 MOG-관련 질환/장애(MOGAD), 특히 MOG-관련 염증성 질환/장애, 더 구체적으로는 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 조절 면역 세포, 본 발명에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 염증성 CNS 질환/장애를 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 조절 면역 세포, 본 발명에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다. 실시형태에서, 염증성 CNS 질환/장애는 다발성 경화증이다. 실시형태에서, 다발성 경화증은 재발-완화형 MS(RRMS)이다. 다른 실시형태에서, 다발성 경화증은 원발성-진행성 MS(PPMS)이다. 다른 실시형태에서, 다발성 경화증은 이차-진행성 MS(SPMS)이다.
본 발명은 추가로 자가-항원 및/또는 자가항체에 의해 야기되거나 악화되는 탈수초성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 조절 면역 세포, 본 발명에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 CNS의 탈수초화를 포함하는 염증 및/또는 손상을 감소시키거나 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 조절 면역 세포, 본 발명에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 장애 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체의 장애 또는 질환의 치료 방법을 제공하되, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조절 면역 세포, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조절 면역 세포의 집단 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 MOG-관련 질환/장애(MOGAD), 특히 MOG-관련 염증성 질환/장애, 더 구체적으로는 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 자가-항원 및/또는 자가항체에 의해 야기되거나 악화되는 탈수초성 장애이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CNS의 탈수초화를 포함하는 염증 및/또는 손상을 감소시키거나 방지하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 염증성 CNS 질환/장애를 치료하기 위한 것이되, 바람직하게는 염증성 CNS 질환/장애는 다발성 경화증이고, 더 바람직하게는 다발성 경화증은 재발-완화형 MS(RRMS), 원발성-진행성 MS(PPMS) 또는 이차-진행성 MS(SPMS)이다.
도 1은 인간 항-MOG 키메라 항원 수용체(CAR) 작제물("CAR 1")의 개략도를 나타낸다. 도 1의 항-MOG CAR 작제물은 인간/마우스 MOG에 대한 scFv, CD8 힌지(CD8 링커), 인간 CD28로부터 유래된 막관통 도메인(CD28 TM) 및 CD3 제타(CD3Z)를 포함한다.
도 2는 마우스 항-MOG 키메라 항원 수용체(CAR) 작제물의 개략도를 나타낸다. 도 2의 항-MOG CAR 작제물은 인간/마우스 MOG에 대한 scFv, CD8 힌지(CD8 링커), 마우스 CD28로부터 유래된 막관통 도메인(CD28 TM) 및 CD3 제타(CD3Z)를 포함한다.
도 3은 단백질-L에 의해 평가된 인간 세포 표면에서 GFP 발현 및 CAR 발현에 의해 평가된 형질도입 효율을 나타내는 유세포분석의 점 플롯이다.
도 4는 확장의 첫 주기의 마지막에 본 발명의 CAR-MOG에 의해 형질도입된 또는 형질도입되지 않은 인간 Treg 표현형(비형질도입의 경우 NT)을 모니터링한 그래프이다. Treg 세포를 인간 CD4, CD25, CD127 및 CTLA-4에 관한 항체로 표지되었다. FOXP3 및 Helios 전사 인자의 검출을 위해, 핵 내 표지를 수행하였다(A). 오차 막대는 전체에서 10명의 Treg 공여자를 포함하는 4회의 독립적 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 5는 총 8명의 Treg 공여자를 포함하는 3회의 독립적 실험으로부터 배지 단독에서 활성화 부재 하에(NoAct) 또는 CAR을 통한 24시간 자극 후(MOG 코팅 비드의 첨가를 통해) 또는 TCR을 통해(항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 비드를 통해; 3/28) 인간 Treg 활성화 상태(GFP 발현에서 개폐된 CD69 발현에 의해 측정됨)를 나타내는 그래프이다. MOG 비드 상의 결합은 CAR-매개 활성화를 나타낸다. CD3/CD28과의 결합은 TCR 매개 활성화를 나타낸다. Ctrl 세포는 CAR을 갖지 않고, 대신에 GFP를 발현시킨다. Ctrl 세포는 MOG의 존재 하에 결합 및 활성화 없음을 나타낸다. CD3-CD28 대조군은 세포가 이들의 TCR을 통해 활성화될 수 있다는 것을 보장하기 위해 수행된다.
도 6은 본 발명의 CAR-MOG를 발현시킨 Treg 세포가 효율적인 CAR-매개 억제 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 그래프의 조합이다. Ctrl 세포는 CAR을 갖지 않고, 대신에 GFP를 발현시킨다. 임의의 활성화의 부재 하에(회색 곡선) 또는 MOG-유도 CAR 활성화 후에(적색 곡선) 또는 TCR-유도 활성화 후에(청색 곡선) CAR-MOG에 의해 매개된 접촉-의존적 억제는 유세포분석을 이용하는 통상적인 T 세포(Tconv)의 증식을 측정함으로써 평가되었다. 오차 막대는 전체에서 7명의 Treg 공여자를 포함하는 4회의 독립적 실험으로부터의 평균±SEM을 나타낸다.
도 7은 마우스 세포 표면에서 NGFR 발현에 의해 평가된 형질도입 효율을 나타내는 유세포분석의 점 플롯이다.
도 8은 확장 7일 후에 NT 세포에 비해 마우스 CAR Treg 세포의 표현형 CD25+ FoxP3+을 나타내는 유세포분석의 점 플롯이다.
도 9는 4회의 독립적 실험으로부터 배지 단독에서 활성화의 부재(활성화 없음) 또는 TCR을 통한(항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 비드) 또는 CAR을 통한(MOG 코팅 비드의 첨가를 통한) 24시간 자극 후 마우스 Treg 세포 활성화 상태(CD69 발현에 의해 측정, NGFR 양성 세포 상에서 개폐)를 나타내는 그래프이다. MOG 비드 상의 결합은 CAR-매개 활성화를 나타낸다. CD3/CD28과의 결합은 TCR 매개 활성화를 나타낸다. CAR Ctrl 세포는 결합을 위한 항-MOG scFv를 포함하지만, 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 절단된 CAR을 갖는다. CAR Ctrl 세포는 MOG의 존재 하에 활성화를 나타내지 않는다. CD3-CD28 대조군은 세포가 이들의 TCR을 통해 활성화될 수 있다는 것을 보장하기 위해 수행된다.
도 10A은 CAR Ctrl 세포에 비해 CNS에서 마우스 CAR Treg 활성화(CD69의 %) 및 증식(Ki67의 %)을 나타내는 그래프의 조합이다. CAR MOG을 갖는 세포는 NGFR+ 세포이고, 대조군은 NGFR- 세포이다. 도 10B는 비장 세포에 비해 CNS에서 마우스 CAR Treg 활성화(CD69의 %) 및 증식(Ki67의 %)을 나타내는 그래프의 조합이다.
도 11A은 본 발명에 따른 항-MOG CAR인 "CAR 1"을 포함하는 다수의 항-MOG CAR에 대해 Treg 세포 활성화 상태(CD69 발현에 의해 측정됨, NGFR 양성 세포 상에서 개폐)를 나타내는 그래프이다. 도 11B는 절단된 대조군 CAR로 형질도입된 CAR Treg의 활성화 수준(MOG ScFv 및 비-신호전달 엔도도메인)에 대한 5일 후 MOG CAR을 주사한 동물("짧은 EAE 모델")의 CNS에서의 활성화 마커 CD69, CD71, LAP 및 증식 마커 Ki67의 생체내 배수 증가를 나타낸다.
도 12는 상이한 용량의 인간(검정 선) 또는 마우스(회색 점선) 코팅 MOG에 반응한 인간 MOG CAR Treg의 시험관내 활성화 수준을 나타낸다. 활성화는 초기 활성화 마커 CD69의 발현 수준을 조사하여 유세포분석에 의해 측정된다.
도 13은 유세포분석을 이용하는 세포 기반 결합 분석에 의해 평가된 상이한 종(인간, 마우스 및 사이노몰거스)로부터의 MOG-단백질에 대한 반응성을 나타낸다. MOG-CAR 발현 효모 세포를 scFV 발현을 검출하는 형광 표지된 항-myc 항체와 함께, 그리고 표시된 농도의 각각의 바이오틴일화된 MOG 단백질과 함께 공동 배양시켰다(좌측). scFV/MOG 이중 양성 세포를 측정함으로써 결합을 정량화하였다(우측).
도 14A 및 도 14B는 본 발명의 CAR MOG Treg가 EAE가 병리학적 세포에 의해 유도된 마우스에게 투여된 예시적인 연구를 나타낸다.
도 15는 IFN-감마 양성 세포가 본 개시내용의 MOG CAR로 처리된 EAE 마우스로부터 유래된 세포의 MOG 펩타이드 자극 후에 결정된 예시적인 연구를 나타낸다.
정의
본 개시내용에서, 다음의 용어는 다음의 의미를 갖는다:
"약"은 양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때, 명시된 값의 ±20%, 또는 일부 예에서 ±10%, 또는 일부 예에서 ±5%, 또는 일부 예에서 ±1%, 또는 일부 예에서 ±0.1%의 변화를 포괄하는 의미이며, 이러한 변화는 개시된 방법을 수행하는 데 적절하다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 관심의 하나 이상의 값에 적용되는 바와 같은 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상기 용어는 달리 언급되거나 문맥으로부터 달리 분명하지 않다면 방향(초과 또는 미만) 중 하나에서 언급된 참조 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
"친화도"는 단백질(예를 들어, 항체)-항원 복합체의 강도를 정하기 위해 사용된다. 친화도는 에피토프와 단백질(예를 들어, 항체) 상의 항원 결합 부위 사이의 상호작용 강도를 측정한다. 이는 친화도 상수 Ka에 의해 또는 해리 상수 KD에 의해 발현될 수 있다. 단백질(예를 들어, 항체)는 KD가 1μM 이하, 바람직하게는 100nM 이하 또는 10nM 이하일 때 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다. KD는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR)(BIAcore™) 또는 생물층 간섭계에 의해, 예를 들어, IBIS Technologies로부터의 IBIS MX96 SPR 시스템, Bio-Rad로부터의 ProteOn™ XPR36 SPR 시스템, 또는 ForteBio로부터의 Octet™ 시스템에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "항체" 또는 "면역글로불린"은 이황화결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 사량체를 지칭한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성되고, 카파(κ) 경쇄 또는 람다(λ) 경쇄일 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. CH의 아미노산 서열에 기반하여, 항체는 상이한 아이소타입에 배정될 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM. IgG 및 IgA 아이소타입은 하위부류로 추가로 분류된다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2. VH와 VL의 짝짓기는 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항-MOG 항체는 IgG 항체, 예컨대, IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원-결합 단편"은 전체 항체보다 소수의 아미노산을 포함하고 아직 전체 항체의 항원(예를 들어, MOG)에 결합할 수 있는 채로 남아있는 항체의 부분 또는 영역 또는 유도체를 지칭한다. 항원-결합 단편은, 임의의 제한 없이, 단일 쇄 항체, Fv(예를 들어, scFv), Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab)'2, Fd, 탈푸코실화된 항체, 다이어바디, 트라이어바디 및 테트라바디를 포괄한다.
"키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 세포(예를 들어, 조절 면역 세포)에서 발현될 때, 표적 리간드에 특이성을 갖고 세포내 신호 생성을 갖는 세포를 제공하는 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, CAR은 이량체화 분자의 존재에 대해, 폴리펩타이드를 다른 것에 결합시킬 수 있는, 예를 들어, 리간드-결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 결합시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함하는 폴리펩타이드의 세트를 포함한다. 일 실시형태에서, CAR은 N-말단에서 선택적 리더 서열을 포함하되, 리더 서열은 세포 가공 및 세포막에 대한 키메라 항원 수용체의 편재화 동안 절단된다.
"상보성-결정 영역" 또는 "CDR"은 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL) 내에서 발견되는 비-인접 항원 조합 부위를 의미한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest,"5th Ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., JMB (1997) 273:927-948 ("Chothia" numbering scheme)]에 의해 기재된 것, 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 잘 알려진 체계를 이용하여 결정될 수 있다. 더 최근에, 보편적 넘버링 시스템이 개발되었고, 광범위하게 채택되었다, ImMunoGeneTics (IMGT) Information System®(Lefranc et al., Nucleic Acids Res. (1999) 27:209-212). 일 실시형태에서, 본 명세서의 CDR 경계는 문헌[Kabat et al. (1991)]에 따라 정의된다. VH 도메인의 CDR은 본 명세서에서 HCDR 도메인으로 표지될 수 있다. VL 도메인의 CDR은 LCDR 도메인으로 표지될 수 있다. VH 도메인의 CDR 1 내지 3은 각각 CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH로, 또는 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 표지될 수 있다. VL 도메인의 CDR 1 내지 3은 각각 CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL로, 또는 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 표지될 수 있다.
"공자극 분자"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합함으로써, T 세포에 의한 공자극 반응, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 상대를 지칭한다. 공자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 이외의 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자. 공자극 신호전달 도메인은 공자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공자극 분자는 다음의 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체.
"에피토프"는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 결합하는 단백질 또는 단백질들 상에 위치된 아미노산의 특정 배열을 지칭한다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화로 이루어지고, 특정 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특정 하전 특징을 갖는다. 에피토프는 선형(또는 순차적) 또는 입체구조일 수 있으며, 즉, 반드시 인접하지 않을 수도 있는 항원의 다양한 영역에서 아미노산의 2개 이상의 서열을 수반한다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결되는 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용성 구성요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 구성요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 혼입하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 포함됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 당업계에 알려진 모두를 포함한다.
"Fc 도메인", "Fc 부분" 및 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 C-말단의 단편, 예를 들어, 인간 감마 중쇄의 약 아미노산(aa) 230 내지 약 aa 450 또는 다른 유형의 항체 중쇄(예를 들어, 인간 항체의 경우 α, δ, ε 및 μ)에서의 이의 상대 서열, 또는 이의 자연 발생적 알로타이프를 지칭한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 포함하는 최소 항원 단편이다. 이 단편은 빽빽한, 비-공유 회합에서 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 두 도메인의 접힘으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(각각 H 및 L 쇄로부터의 3개의 루프)가 나온다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 전체 결합 부위보다 친화력이 낮다고 해도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"동일성" 또는 "동일한"은, 둘 이상의 아미노산 서열 사이, 또는 둘 이상의 핵산 서열 사이의 관계를 설명하기 위해 본 명세서에서 사용될 때, 비교되는 서열 사이의 서열 관계 정도를 지칭한다. "동일성"은 (만약에 있다면) 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 처리되는 갭 정렬에 의해 둘 이상의 서열 중 더 작은 것 사이의 동일한 매치의 백분율을 측정한다. 관련된 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 동일성은 알려진 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Lesk A. M. (1988). Computational molecular biology: Sources and methods for sequence analysis. New York, NY: Oxford University Press; Smith D. W. (1993). Biocomputing: Informatics and genome projects. San Diego, CA: Academic Press; Griffin A. M. & Griffin H. G. (1994). Computer analysis of sequence data, Part 1. Totowa, NJ: Humana Press; von Heijne G. (1987). Sequence analysis in molecular biology: treasure trove or trivial pursuit. San Diego, CA: Academic press; Gribskov M. R. & Devereux J. (1991). Sequence analysis primer. New York, NY: Stockton Press; Carrillo et al., SIAM J Appl Math. (1988) 48(5):1073-82]에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험한 서열 사이의 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 기재된다. 두 서열 사이의 동일성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI; Devereux et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12(1 Pt 1):387-95), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul et al., J Mol Biol. (1990) 215(3):403-10)를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 생물정보센터(NCBI) 및 기타 공급원(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894)으로부터 공개적으로 이용 가능하다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘은 또한 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 키메라 수용체 함유 세포의 면역 효과기 기능을 촉진시키는 신호를 생성한다. 키메라 수용체-T 세포에서 면역 효과기 기능의 예는 사이토카인의 분비를 비롯한, 세포용해 활성, 억제 활성, 조절 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, MOG에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 MOG 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, MOG에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대, 다른 종으로부터의 MOG 분자와의 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질, 특히, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 구성성분을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항체의 치료 용도를 방해하는 것이 실질적으로 없을 수 있다. 본 명세서의 단리된 항체는 IgG 항체, 예컨대, IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된 핵산"은 다른 게놈 DNA 서열뿐만 아니라 자연적으로 천연 서열을 수반하는 단백질 또는 복합체, 예컨대, 리보솜 및 중합효소로부터 실질적으로 단리된 핵산을 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 이의 자연적 발생 환경에서 제거되고, 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종성 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함하는 핵산 서열을 포괄한다. 실질적으로 순수한 핵산은 핵산의 단리된 형태를 포함한다.
이는 본래 단리된 바와 같은 핵산을 지칭하며, 사람의 손에 의해 단리된 핵산에 이후에 첨가된 유전자 또는 서열을 제외하지는 않는다.
"대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 포유류, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다. 일 실시형태에서, 대상체는 진료를 받는 것을 기다리고 있거나, 진료를 받는 중이거나 의학적 절차의 대상이거나, 목적으로 하는 질환 또는 병태, 예를 들어, 염증성 또는 자가면역 병태 발생에 대해 모니터링되는 "환자", 즉, 온혈동물, 더 바람직하게는 인간일 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 성인(예를 들어, 18세 초과의 대상체)이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 아동(예를 들어, 18세 미만의 대상체)이다. 일 실시형태에서, 대상체는 남성이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 여성이다. 일 실시형태에서, 대상체는 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애에 의해 영향받고, 바람직하게는 진단된다. 일 실시형태에서, 대상체는 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애가 발생할 위험에 있다. 위험 인자의 예는 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애의 유전적 소인 또는 가족력을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일 쇄 Fv"는 항체 경쇄(VL)의 가변 도메인 및 항체 중쇄(VH)의 가변 도메인을 포함하는 단백질을 지칭하되, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은, 예를 들어, 합성 링커, 예를 들어, 짧은 가요성 폴리펩타이드 링커를 통해 인접하여 연결되고, 단일쇄 폴리펩타이드로서 발현될 수 있고, scFv는 이것이 유래된 무손상 항체의 특이성을 보유한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 바와 같은 scFv는 순서 중 하나로, 예를 들어, 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단에 대해, VL 및 VH 가변 도메인을 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나, VH-링커-VL을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 항원-결합 단편은 단일 쇄 Fv(scFv)이다.
"치료적 유효량"은 표적에 대한 유의미한 부정적 또는 유해한 부작용을 야기하는 일 없이, (1) 질환, 장애 또는 병태의 발병을 지연 또는 예방하거나; (2) 질환, 장애, 또는 병태의 하나 이상의 증상의 진행, 심화 또는 악화를 늦추거나 중단시키거나; (3) 질환, 장애, 또는 병태의 증상의 개선을 초래하거나; (4) 질환, 장애, 또는 병태의 중증도 또는 발생을 감소시키거나; 또는 (5) 질환, 장애, 또는 병태를 치유하는 것을 목적으로 하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 수준 또는 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 질환, 장애, 또는 병태의 발병 전에 예방적 또는 방지적 작용을 위해 투여될 수 있다. 대안적 또는 추가적으로, 치료적 유효량은 질환, 장애, 또는 병태의 개시 후에, 치료적 작용을 위해 투여될 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "경감"은 치료적 처치와 예방적 또는 방지적 척도를 지칭하되, 목적은 목표로 하는 병리적 병태 또는 장애를 방지하거나 늦추는(줄이는) 것이다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 장애로 진단된 대상체뿐만 아니라 장애를 갖는 경향이 있는 대상체 또는 장애가 예방될 대상체를 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는, 본 개시내용에 따른 항체 또는 세포의 치료적 양을 투여받은 후에, 대상체가 다음 중 적어도 하나를 나타내는 경우, 질환 또는 장애에 대해 성공적으로 "치료된다": 병적 세포의 수 또는 백분율의 감소; 치료될 질환 또는 장애와 관련된 증상 중 하나 이상의 일부 정도에 대한 경감; 감소된 이환율 및 사망률; 및 삶의 질 문제의 개선. 질환에서 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 위의 파라미터는 의사에게 익숙한 일상적인 절차에 의해 용이하게 측정 가능하다.
"제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 GenBank Acc. No. BAG36664.1로 제공되는 단백질, 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 제타 쇄의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기, 또는 T 세포 활성화에 필수적인 초기 신호를 기능적으로 전달하는 데 충분한 이의 기능적 유도체로서 정의된다. 일 실시형태에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank Acc. No. BAG36664.1의 잔기 52 내지 164 또는 이의 기능적 오솔로그인 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다.
I. 항원-결합 단백질
본 발명의 MOG-결합 단백질은 MOG에 결합할 수 있는 항원-결합 단백질(본 명세서에서 이후에 MOG-결합 단백질로 지칭됨)이다. 본 발명의 MOG-결합 단백질은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 scFv일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서, 중쇄 가변 도메인은 다음의 중쇄 HCDR 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VH: SSYAFS(서열번호 3)
CDR2-VH: RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)
CDR3-VH: RERLYAGYY(서열번호 5).
일 실시형태에서, 본 발명은 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하며; 여기서, 중쇄 가변 도메인은 다음의 중쇄 HCDR 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VH: SSYAFS(서열번호 3)
CDR2-VH: RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)
CDR3-VH: RERLYAGYY(서열번호 5).
일 실시형태에서, 본 발명은 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하며; 여기서, 중쇄 가변 도메인은 다음의 중쇄 HCDR의 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VH: SSYAFS(서열번호 3)
CDR2-VH: RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)
CDR3-VH: RERLYAGYY(서열번호 5).
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서, 경쇄 가변 도메인은 다음의 경쇄 LCDR 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VL: RASQSVSSNYLA(서열번호 6)
CDR2-VL: GASSRAT(서열번호 7)
CDR3-VL: QQYGTSPGLT(서열번호 8).
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서, 중쇄 가변 도메인은 다음의 중쇄 HCDR 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두를 포함하고:
CDR1-VH: SSYAFS(서열번호 3)
CDR2-VH: RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)
CDR3-VH: RERLYAGYY(서열번호 5);
여기서, 경쇄 가변 도메인은 다음의 경쇄 LCDR 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VL: RASQSVSSNYLA(서열번호 6)
CDR2-VL: GASSRAT(서열번호 7)
CDR3-VL: QQYGTSPGLT(서열번호 8).
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서,
CDR3-VH는 아미노산 서열 RERLYAGYY(서열번호 5)를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서, CDR3-VH는 아미노산 서열 RERLYAGYY(서열번호 5)를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서,
CDR1-VH는 아미노산 서열 SSYAFS(서열번호 3)를 포함하고;
CDR2-VH는 아미노산 서열 RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)를 포함하며;
CDR3-VH는 아미노산 서열 RERLYAGYY(서열번호 5)를 포함하고;
CDR1-VL은 아미노산 서열 RASQSVSSNYLA(서열번호 6)을 포함하며;
CDR2-VL은 아미노산 서열 GASSRAT(서열번호 7)를 포함하고; 그리고
CDR3-VL은 아미노산 서열 QQYGTSPGLT(서열번호 8)를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서,
CDR1-VH는 아미노산 서열 SSYAFS(서열번호 3)를 갖고;
CDR2-VH는 아미노산 서열 RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)를 가지며;
CDR3-VH는 아미노산 서열 RERLYAGYY(서열번호 5)를 갖고;
CDR1-VL은 아미노산 서열 RASQSVSSNYLA(서열번호 6을 가지며;
CDR2-VL은 아미노산 서열 GASSRAT(서열번호 7)를 갖고; 그리고
CDR3-VL은 아미노산 서열 QQYGTSPGLT(서열번호 8)를 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서,
CDR1-VH는 아미노산 서열 SSYAFS(서열번호 3) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며;
CDR2-VH는 아미노산 서열 RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
CDR3-VH는 아미노산 서열 RERLYAGYY(서열번호 5) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며;
CDR1-VL은 아미노산 서열 RASQSVSSNYLA(서열번호 6) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
CDR2-VL은 아미노산 서열 GASSRAT(서열번호 7) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 그리고
CDR3-VL은 아미노산 서열 QQYGTSPGLT(서열번호 8) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서,
CDR1-VH는 아미노산 서열 SSYAFS(서열번호 3) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
CDR2-VH는 아미노산 서열 RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
CDR3-VH는 아미노산 서열 RERLYAGYY(서열번호 5) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
CDR1-VL은 아미노산 서열 RASQSVSSNYLA(서열번호 6) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
CDR2-VL은 아미노산 서열 GASSRAT(서열번호 7) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; 그리고
CDR3-VL은 아미노산 서열 QQYGTSPGLT(서열번호 8) 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서,
CDR1-VH는 아미노산 서열 SSYAFS(서열번호 3)를 갖고;
CDR2-VH는 아미노산 서열 RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)를 가지며;
CDR3-VH는 아미노산 서열 RERLYAGYY(서열번호 5)를 갖고;
CDR1-VL은 아미노산 서열 RASQSVSSNYLA(서열번호 6)을 가지며;
CDR2-VL은 아미노산 서열 GASSRAT(서열번호 7)를 갖고; 그리고
CDR3-VL은 아미노산 서열 QQYGTSPGLT(서열번호 8)를 갖고;
여기서, VH는 서열번호 11 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 9 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서, VH는 서열번호 11을 포함하고, VL은 서열번호 9를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은,
- 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 상보성-결정 영역(LCDR) CDR1-VL, CDR2-VL 및 CDR3-VL을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
을 포함하는 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되,
여기서, VH는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고, VL은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 scFv, sdAb 또는 DARPin이다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 항-MOG 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 단일-쇄 가변 단편(scFv)이다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 갖는 단일-쇄 가변 단편(scFv)이며, 여기서, VH는 서열번호 11 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 9 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 갖는 단일-쇄 가변 단편(scFv)이며, VH는 서열번호 11을 포함하고, VL은 서열번호 9를 포함한다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 서열번호 12 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(scFv)이다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 서열번호 12를 포함하는 단일-쇄 가변 단편(scFv)이다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 서열번호 51 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(scFv)이다.
실시형태에서, MOG-결합 단백질은 서열번호 51을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(scFv)이다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)은 그 자체가 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 단백질에 융합됨으로써, 융합 단백질을 형성할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 본 발명의 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 scFv)과 동일한 MOG 상의 에피토프에 결합하는 MOG-결합 단백질을 제공한다.
본 발명은 추가로 경쟁 결합 분석에서 MOG에 대한 결합에 대해 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명의 MOG-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 scFv)과 경쟁하는 MOG-결합 단백질을 제공한다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명의 단백질, 예를 들어, 본 발명의 scFv는 CAR의 세포외 결합 도메인, 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR에 포함될 수 있다.
A. MOG-결합 단백질 기능: 항원 결합 특이성 및 친화도
본 발명의 MOG-결합 단백질은 세포 표면 상에서 발현된 MOG에 결합할 수 있다. 본 발명의 MOG-결합 단백질은 또한 가용성 MOG에 결합할 수 있다(즉, 막 결합되지 않는다).
유리하게는, 본 발명의MOG-결합 단백질은 인간과 마우스 MOG 둘 다에 결합할 수 있는 것으로 발견되었다. 본 발명의 MOG-결합 단백질은 또한 사이노몰거스 MOG에 결합할 수 있다. 이 교차 반응성은 마우스 및 사이노몰거스에서 전임상 연구로부터의 결과와 약물 승인 과정에 대한 인간 임상 연구에 대한 결과를 추정하는 데 유용하다. 특히, 본 발명의MOG-결합 단백질은 인간과 마우스 MOG 둘 다에 결합할 수 있는 것으로 발견되었다.
본 발명의 MOG-결합 단백질은 인간 MOG를 인식하고 이에 결합한다. 인간 MOG는 8 엑손을 포함하는 1775bp 길이 mRNA에 의해 암호화된 단백질이다(UniProtKB 식별자 Q16653 및 Genbank 수탁번호: NM_002544.5).
일 실시형태에서, 본 단백질은 MOG 변이체, 예컨대, 인간 MOG의 변이체를 인식하고 이에 결합할 수 있다. MOG의 변이체는 변형된 MOG를 지칭하되, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산은 본래(야생형) MOG에 비해 결실, 첨가 또는 치환된다.
인간 MOG의 스플라이스 변이체는 이전에 확인되었다. 특히, MOG의 13종의 상이한 아이소폼이 기재되었다: 아이소폼 1(알파 1로도 알려짐)(UniProtKB 식별자 Q16653-1을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 2(알파 2로도 알려짐)(UniProtKB 식별자 Q16653-2를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 3(알파 3으로도 알려짐)(UniProtKB 식별자 Q16653-3을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 4(알파 4로도 알려짐)(UniProtKB 식별자 Q16653-4를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 5(베타 1로도 알려짐)(UniProtKB 번호 Q16653-5를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 6(베타 2로도 알려짐)(UniProtKB 식별자 Q16653-6을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 7(베타 3으로도 알려짐)(UniProtKB 식별자 Q16653-7을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 8(베타 4로도 알려짐)(UniProtKB 식별자 Q16653-8을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 9 (UniProtKB 식별자 Q16653-9를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 10(UniProtKB 식별자 Q16653-10을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 11 (UniProtKB 식별자 Q16653-11을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 아이소폼 12 (UniProtKB 식별자 Q16653-12를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨) 및 아이소폼 13(UniProtKB 식별자 Q16653-13을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨).
따라서, 일 실시형태에서, 본 단백질은 아이소폼 1, 아이소폼 2, 아이소폼 3, 아이소폼 4, 아이소폼 5, 아이소폼 6, 아이소폼 7, 아이소폼 8, 아이소폼 9, 아이소폼 10, 아이소폼 11, 아이소폼 12 및 아이소폼 13을 포함하는 군으로부터 선택된 인간 MOG의 하나 이상의 스플라이스 변이체를 인식하고, 이에 결합할 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 단백질, 예를 들어, 본 발명의 scFv는 마우스와 인간 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질(MOG) 모두에 결합할 수 있다. 따라서, scFv와 마우스 및 인간 MOG의 교차 반응성은 유리한 특징이다.
따라서, 실시형태에서, 단백질은 또한 마우스 MOG(UniProtKB 식별자 Q61885)를 인식하고 이에 결합한다.
일 실시형태에서, 본 단백질은 MOG 변이체, 예컨대, 마우스 MOG의 변이체를 인식하고 이에 결합할 수 있다. MOG의 변이체는 변형된 MOG를 지칭하되, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산은 본래(야생형) MOG에 비해 결실, 첨가 또는 치환된다.
유리하게는, 본 단백질은 인간 MOG(즉, 인간 MOG 또는 인간 MOG 변이체) 및 마우스 MOG(즉, 마우스 MOG 또는 마우스 MOG 변이체)를 인식하고 이에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 본 단백질은 인간 MOG 및 마우스 MOG 변이체를 인식하고 이에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 본 단백질은 인간 MOG 변이체 및 마우스 MOG를 인식하고 이에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 본 단백질은 인간 MOG 변이체 및 마우스 MOG 변이체를 인식하고 이에 결합할 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 단백질, 예를 들어, 본 발명의 scFv는 또한 사이노몰거스 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질(MOG)에 결합할 수 있다. 따라서, scFv와 마우스, 사이노몰거스 및 인간 MOG의 교차 반응성은 유리한 특징이다.
따라서, 실시형태에서, 단백질은 또한 사이노몰거스 MOG(UniProtKB 식별자 Q9BGS7)를 인식하고 이에 결합한다.
일 실시형태에서, 본 단백질은 사이노몰거스 변이체, 예컨대, 사이노몰거스 MOG의 변이체를 인식하고, 이에 결합할 수 있다. MOG의 변이체는 변형된 MOG를 지칭하되, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산은 본래(야생형) MOG에 비해 결실, 첨가 또는 치환된다.
유리하게는, 본 단백질은 인간 MOG(즉, 인간 MOG 또는 인간 MOG 변이체), 마우스 MOG(즉, 마우스 MOG 또는 마우스 MOG 변이체) 및 사이노몰거스 MOG(즉, 마우스 MOG 또는 마우스 MOG 변이체)를 인식하고, 이에 결합할 수 있다.
B. 단백질 서열
1. CDR 서열
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 scFv)은 상보성-결정 영역(CDR)을 각각 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. CDR은 Kabat CDR 정의 시스템에 따라 결정된다.
일 실시형태에서, 본 단백질의 중쇄는 다음의 중쇄 CDR(HCDR) 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VH: SSYAFS(서열번호 3)
CDR2-VH: RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)
CDR3-VH: RERLYAGYY(서열번호 5)
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 서열번호 3 내지 5를 모두 포함한다. 일 실시형태에서, CDR-VH1, CDR2-VH 및/또는 CDR3-VH 중 어느 것은 각각 서열번호 3 내지 5에 비해 1, 2, 3개 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, CDR1-VH, CDR2-VH 및/또는 CDR3-VH 중 어느 것은 각각 서열번호 3 내지 5와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질의 경쇄는 다음의 경쇄 CDR(LCDR) 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VL: RASQSVSSNYLA(서열번호 6)
CDR2-VL: GASSRAT(서열번호 7)
CDR3-VL: QQYGTSPGLT(서열번호 8)
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 서열번호 6 내지 8을 모두 포함한다. 일 실시형태에서, CDR1-VL, CDR2-VL 및/또는 CDR3-VL 중 어느 것은 각각 서열번호 6 내지 8에 비해 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, CDR1-VL, CDR2-VL 및/또는 CDR3-VL 중 어느 것은 각각 서열번호 6 내지 8과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 단백질의 일 실시형태에서, 이의 중쇄 HCDR 1 내지 3 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두는 각각 서열번호 3 내지 5를 포함하고; 이의 경쇄 LCDR 1 내지 3 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 더 바람직하게는 셋 모두는 각각 서열번호 6 내지 8을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 각각 서열번호 3 내지 8의 서열을 갖는 중쇄 HCDR 1 내지 3 및 경쇄 LCDR 1 내지 3을 포함한다.
본 발명의 단백질의 일 실시형태에서, CDR1-VH, CDR2-VH 및/또는 CDR3-VH 중 어느 것은 각각 서열번호 3 내지 5와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖고; CDR1-VL, CDR2-VL 및/또는 CDR3-VL 중 어느 것은 각각 서열번호 6 내지 8과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는다.
2. VH 및 VL 서열
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 scFv)은 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 서열번호 11을 포함하는 VH 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 서열번호 11로 이루어진 VH 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, VH 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 서열번호 11을 포함한다.
일 실시형태에서, VH 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 서열번호 11로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 아미노산 서열은 위에 기재된 중쇄 HCDR(예를 들어, 서열번호 3 내지 5)을 포함하고, 서열번호 11과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 서열번호 9를 포함하는 VL 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 서열번호 9로 이루어진 VL 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 서열번호 9를 포함한다.
일 실시형태에서, VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 서열번호 9로 이루어진다.
일 실시형태에서, VL 아미노산 서열은 위에 기재된 경쇄 LCDR(예를 들어, 서열번호 6 내지 8)을 포함하고, 서열번호 9와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 VH와 본 명세서에 기재된 임의의 VL의 조합을 분명하게 예상한다.
일 실시형태에서, VH는 서열번호 11을 포함하고, VL은 서열번호 9를 포함하며, 각각은 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 갖는다.
일 실시형태에서, 아미노산 변형은 삽입, 결실 또는 치환일 수 있다. 일 실시형태에서, 아미노산 변형은 변형을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 특징에 유의미하게 영향을 미치지 않는다. 명시된 가변 도메인 및 CDR 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 아미노산 변형은 바람직하게는 보존적 아미노산에 의해 이루어진 치환이다. 보존적 아미노산은 본래의 아미노산과 유사한 물리 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되었다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 항체 또는 항원-결합 단편의 CDR 및/또는 가변 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변형된 항체 또는 항원-결합 단편은 본 명세서에 기재된 분석을 이용하여 유지된 기능(예를 들어, MOG에 대한 결합)에 대해 시험될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 항체 또는 항원-결합 단편의 CDR 및/또는 가변 도메인 내의 아미노산의 문자열은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 문자열로 대체될 수 있다.
일 실시형태에서, VH는 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의(바람직하게는 3개의) 중쇄 HCDR을 포함하고, 서열번호 11 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; VL은 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나(바람직하게는 3개의) 경쇄 LCDR을 포함하고, 서열번호 9, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 및 VL은 위에 기재된 바와 같은 CDR(예를 들어, 서열번호 3 내지 8)을 포함하고, 각각 서열번호 11 및 9와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유한다.
일 실시형태에서, VH는 서열번호 11을 포함하고, VL은 서열번호 9를 포함한다.
일 실시형태에서, VH는 서열번호 11로 이루어지고, VL은 서열번호 9로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH는 서열번호 11로 이루어지고, VL은 서열번호 9를 포함한다.
일 실시형태에서, VH는 서열번호 11를 포함하고, VL은 서열번호 9로 이루어진다.
3. 링커
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 scFv)은 이의 VH와 VL을 연결하는 링커(본 명세서에서 VH-VL 링커로 지칭됨)를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지, VL, VH-VL 링커 및 VH를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지, VH, VH-VL 링커 및 VL을 포함한다.
일 실시형태에서, VH-VL 링커는, 예를 들어, 2 내지 20 또는 2 내지 15개의 아미노산 범위의 길이를 갖는 펩타이드 링커이다.
예를 들어, 글리신-세린 더블렛은 특히 적합한 링커(GS　링커)를 제공한다. 일 실시형태에서, VH-VL 링커는 GS 링커이다. GS 링커의 예는 GS 링커, G2S 링커(예를 들어, GGS 및 (GGS)2), G3S 링커 및 G4S 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
G3S 링커는 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n 또는 (GGGS)n을 포함하며, 여기서, n은 1 이상의 양의 정수이다(예를 들어, n=l, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9, 또는 n=10). G3S 링커의 예는 n=1일 때 (GGGS)1에 상응하는 GGGS(서열번호 71) 및 (GGGS)4에 상응하는 GGGSGGGSGGGSGGGS(서열번호 72)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
G4S 링커의 예는 GGGGS(서열번호 73)에 상응하는 (Gly4-Ser); GGGGSGGGGS(서열번호 74)에 상응하는 (Gly4-Ser)2; GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 10)에 상응하는 (Gly4-Ser)3; 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 75)에 상응하는 (Gly4-Ser)4를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 링커는 서열번호 10이다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 VH-VL 링커와 본 명세서에 기재된 임의의 VH 및 VL 도메인의 조합을 분명하게 예상한다.
4. 단백질의 유형
본 발명의 MOG-결합 단백질은 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 본 발명의 MOG-결합 단백질은 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
일 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체, 예를 들어, 단일 쇄 항체, Fv(예를 들어, scFv), Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab)'2, Fd, 탈푸코실화된 항체, 다이어바디, 트라이어바디 또는 테트라바디의 항원-결합 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질은 scFv이다.
5. scFv 서열
본 발명의 scFv는 유리하게는 마우스 및 인간 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질(MOG)에 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 scFv는 하기를 포함한다:
- 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 1개의(바람직하게는 3개의) 중쇄 CDR(HCDR)을 포함하고, 서열번호 11 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 1개의(바람직하게는 3개의) 경쇄 CDR(HCDR)을 포함하고, 서열번호 9 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 경쇄 가변 도메인(VL).
바람직하게는, 본 발명의 scFv는 하기를 포함한다:
- 서열번호 3 내지 5를 각각 포함하는 상보성-결정 영역(HCDR) 1 내지 3; 또는 서열번호 3 내지 5 중 하나와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
- 서열번호 6 내지 8을 각각 포함하는 LCDR 1 내지 3; 또는 서열번호 6 내지 8 중 하나와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL).
실시형태에서, 본 발명의 scFv는 서열번호 11 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 9 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 scFv는 서열번호 11을 포함하는 VH; 및 서열번호 9를 포함하는 VL을 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명의 scFv는 서열번호 11로 이루어진; 및 서열번호 9로 이루어진 VL을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 scFv는 본 명세서에 정의된 바와 같은 CDR을 포함하고, 서열번호 12 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 바람직하게는, 본 발명의 scFv는 서열번호 12 또는 이와 적어도 약 95% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명의 scFv는 서열번호 12를 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명의 scFv는 서열번호 12로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 scFv는 본 명세서에 정의된 바와 같은 CDR을 포함하고, 서열번호 51 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 바람직하게는, 본 발명의 scFv는 서열번호 51 또는 이와 적어도 약 95% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명의 scFv는 서열번호 51을 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명의 scFv는 서열번호 51로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 scFv는 서열번호 23 또는 서열번호 23과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 scFv는 서열번호 23에 의해 암호화된다.
실시형태에서, 본 발명의 scFv는 추가로 VH와 VL을 연결하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 VH-VL 링커를 포함한다. 바람직하게는, 링커는 서열번호 10이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 scFv는 서열번호 76 또는 서열번호 76과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 scFv는 서열번호 76에 의해 암호화된다.
C. 핵산
본 단백질을 암호화하는 단리된 핵산은 이하에 개시된다.
일 실시형태에서, 핵산은 본 발명의 MOG-결합 단백질의 적어도 VH 또는 VL을 암호화한다. 일 실시형태에서, 핵산은 본 발명의 MOG-결합 단백질의 경쇄의 가변 도메인(VL) 및 불변 영역을 암호화한다. 일 실시형태에서, 핵산은 본 발명의 MOG-결합 단백질의 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 불변 영역을 암호화한다. 일 실시형태에서, 핵산은 본 발명의 MOG-결합 단백질의 중쇄와 경쇄를 둘 다 암호화한다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 핵산은 본 발명의 단백질의 VH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지되, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 핵산은 본 발명의 단백질의 VL을 암호화하는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지되, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 20 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 핵산은 본 발명의 MOG-결합 단백질의 VH 및 VL을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 본 명세서의 핵산은 서열번호 22 및 20을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 핵산은 VL과 VH 암호화 서열 사이에 링커 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 추가 실시형태에서, 링커 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 21을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 핵산은 서열번호 23 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 핵산은 서열번호 76 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.
D. 본 발명의 단백질의 생산
본 발명은 또한 본 발명의 MOG-결합 단백질의 발현을 위한 벡터 및 단백질을 생산하기 위해 벡터를 이용하는 방법을 제공한다.
일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 숙주 유기체, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 하나 이상의 선택 가능한 마커, 및 선택적으로 인핸서에서 기능성인 복제기점을 포함한다.
포유류 세포에 대한 발현 벡터에서 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서, LTR 프로모터, 및 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 인핸서, 및 면역글로불린 H쇄의 프로모터 및 인핸서를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한 전사 조절 서열의 추가적인 예에 대해 이하를 참조한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 MOG-결합 단백질을 생산하고 정제하는 방법을 추가로 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 단백질에 대해 발현 카세트를 포함하는 시험관내 또는 생체외 발현 벡터를 적격 숙주 세포(예를 들어, 포유류 세포, 예컨대, CHO 세포 및 NS0 세포)에 도입하는 단계;
- 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 형질전환된 숙주 세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양시키는 단계;
- 선택적으로 상기 단백질을 발현 및/또는 분비하는 세포를 선택하는 단계; 및
- 발현된 단백질을 세포 배양물로부터 회수하는 단계, 및
- 선택적으로 회수된 단백질을 정제하는 단계.
단백질, 특히 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)을 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 단백질 A-세파로스, 겔전기영동 및 크로마토그래피(예를 들어, 친화도 크로마토그래피, 예컨대, 단백질 L 아가로스 상의 친화도 크로마토그래피)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
II. 키메라 항원 수용체(CAR)
특정 관심의 본 발명의 단백질은 CAR에서 사용하기에 적합하다. 조절 면역 세포에 의해 발현된 CAR에서 사용될 때, 본 발명의 단백질은 세포 표면에서 발현된다.
따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 단백질을 포함하는 CAR에 관한 것이다. CAR은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명의 MOG-결합 단백질, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-MOG scFv, sdAb 또는 DARPin을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 CAR에서 사용하기에 적합한 본 발명의 단백질은 서열번호 3 내지 5를 각각 포함하는 중쇄의 상보성-결정 영역(HCDR) 1 내지 3; 또는 서열번호 3 내지 5 중 하나와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CDR을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR에서 사용하기 위한 본 발명의 단백질은 서열번호 6 내지 8을 각각 포함하는 경쇄의 상보성-결정 영역(LCDR) 1 내지 3; 또는 서열번호 6 내지 8 중 하나와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CDR을 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 CAR에서 사용하기 위한 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되, 단백질은 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며; 여기서, 중쇄 가변 도메인은 다음의 중쇄 CDR 중 적어도 하나, 바람직하게는 둘, 더 바람직하게는 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VH: SSYAFS(서열번호 3)
CDR2-VH: RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)
CDR3-VH: RERLYAGYY(서열번호 5).
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 CAR에서 사용하기 위한 MOG-결합 단백질(예를 들어, scFv)을 제공하되, 단백질은 상보성-결정 영역(HCDR) CDR1-VH, CDR2-VH 및 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며; 여기서, 중쇄 가변 도메인은 다음의 중쇄 CDR의 셋 모두를 포함한다:
CDR1-VH: SSYAFS(서열번호 3)
CDR2-VH: RIVPVVGTPNYAQKFQG(서열번호 4)
CDR3-VH: RERLYAGYY(서열번호 5).
실시형태에서, 본 발명의 CAR의 세포외 결합 도메인은 scFv, sdAb 또는 DARPin과 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 표적 결합 도메인을 포함한다.
A. 중요하게는, 본 발명의 CAR에서 사용하기에 적합한 본 발명의 단백질은 안정하며 낮은 면역원성을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR에서 사용하기에 적합한 본 발명의 단백질은 임의의 의도되지 않은 2차 효과를 갖지 않는다.CAR
본 발명의 일 양상에서, MOG에 특이적인 CAR이 제공된다. CAR은 (i) 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명의 MOG-결합 단백질을 포함하는 세포외 결합 도메인, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 scFv, (ii) 선택적으로 세포외 힌지 도메인, (iii) 막관통 도메인, (iv) 세포내 신호전달 도메인, 및 (v) 선택적으로 태그 및/또는 리더 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 폴리펩타이드, 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 (i) 세포외 결합 도메인(ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인의 임의의 그리고 모든 조합을 분명하게 예상한다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 (i) 세포외 결합 도메인(ii) 세포외 힌지 도메인, (iii) 막관통 도메인, (iv) 세포내 신호전달 도메인, 및 (v) 태그 및/또는 리더 서열의 임의의 그리고 모든 조합을 분명하게 예상한다.
1. 세포외 결합 도메인
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은, 본 발명의 MOG-결합 단백질, 예를 들어, scFv, sdAb 또는 DARPin을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은, 본 발명의 MOG-결합 scFv를 포함한다.
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은, 본 발명의 MOG-결합 단백질, 예를 들어, scFv, sdAb 또는 DARPin으로 이루어진다. 일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은, 본 발명의 MOG-결합 scFv로 이루어진다.
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 3개의 상보성-결정 영역(LCDR)을 각각 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 중쇄 HCDR 1 내지 3의 적어도 하나는 각각 서열번호 3 내지 5를 갖고; 그리고/또는 경쇄 LCDR 1 내지 3의 적어도 하나는 각각 서열번호 6 내지 8을 갖는다.
추가 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 각각 서열번호 3 내지 8의 서열을 갖는 중쇄 HCDR 1 내지 3 및 경쇄 LCDR 1 내지 3을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 11의 서열, 또는 서열번호 11과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 9의 서열, 또는 서열번호 9와 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 갖는 VL을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 VH와 VL 사이에 펩타이드 링커를 갖는 항-MOG scFv를 포함하되, 펩타이드 링커는 서열번호 10 또는 이와 적어도 약 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 VH와 VL 사이에 펩타이드 링커를 갖는 항-MOG scFv를 포함하되, 펩타이드 링커는 서열번호 10 또는 이와 적어도 약 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 12 또는 또는 이와 적어도 약 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-MOG scFv를 포함한다.
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 12 또는 또는 이와 적어도 약 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-MOG scFv로 이루어진다.
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 51 또는 또는 이와 적어도 약 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-MOG scFv를 포함한다.
일 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 51 또는 또는 이와 적어도 약 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-MOG scFv로 이루어진다.
2. 힌지 도메인
일 실시형태에서, 세포외 MOG-결합 도메인은 힌지 도메인에 의해 막관통 도메인에 연결된다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 약 2 내지 약 100 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 약 2 내지 약 75 아미노산 범위의 길이를 갖는 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 약 2 내지 약 20 아미노산 범위의 길이를 갖는 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 약 2 내지 약 15 아미노산 범위의 길이를 갖는 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 13) 또는 서열번호 13과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 13) 또는 서열번호 13과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 서열번호 13을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 서열번호 13을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 힌지 도메인은 서열번호 24 또는 서열번호 24와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD8 힌지이다.
본 발명은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 힌지 도메인과 본 명세서의 다른 곳에 기재된 세포외 결합 도메인의 임의의 그리고 모든 조합을 분명하게 예상한다.
3. 막관통 도메인
본 CAR에서 사용될 수 있는 막관통 도메인의 예는, T 세포 수용체(TCR)의 알파 또는 베타 쇄의; 또는 CD28, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CDl la, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CDl1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDIOO(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및 NKG2C의, 막관통 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 14) 또는 서열번호 14와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 14) 또는 서열번호 14와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 14를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 14를 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 25 또는 서열번호 25와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD8 막관통 도메인이다.
다른 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 29) 또는 서열번호 29와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 30 또는 서열번호 30과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CD28 막관통 도메인이다.
다른 실시형태에서, 막관통 도메인은 4-1BB(CD137) 막관통 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 31) 또는 서열번호 31과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 32 또는 서열번호 32와 적어도 약 95(예를 들어, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 4-1BB 막관통 도메인이다.
다른 실시형태에서, 막관통 도메인은 TNFR2 막관통 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 33) 또는 서열번호 33과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 34 또는 서열번호 34와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 TNFR2 막관통 도메인이다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 완전히 인공일 수 있고, 예를 들어, 대부분 소수성 아미노산, 예컨대, 발린 및 류신을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 막관통 도메인과 본 명세서의 다른 곳에 기재된 세포외 결합 도메인의 임의의 그리고 모든 조합을 분명하게 예상한다.
4. 세포내 신호전달 도메인
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 T 세포 공자극 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 T 세포 공자극 도메인 및 T 세포 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 T 세포 공자극 도메인 및 T 세포 1차 신호전달 도메인으로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 T 세포 공자극 도메인 및 T 세포 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 T 세포 공자극 도메인 및 T 세포 1차 신호전달 도메인으로 이루어진다.
일 실시형태에서, T 세포 1차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, T 세포 1차 신호전달 도메인은 서열번호 16의 CD3 제타 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 적어도 약 95%(예를 들어, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, T 세포 1차 신호전달 도메인은 서열번호 16의 CD3 제타 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 적어도 약 95%(예를 들어, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, T 세포 1차 신호전달 도메인은 서열번호 16의 CD3 제타 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, T 세포 1차 신호전달 도메인은 서열번호 16의 CD3 제타 세포내 도메인의 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, CD3 제타 1차 신호전달 도메인은 서열번호 16의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(그러나, 20, 10 또는 5개 이하의 변형)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, CD3 제타 1차 신호전달 도메인은 서열번호 16의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(그러나, 20, 10 또는 5개 이하의 변형)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, CD3 제타 1차 신호전달 도메인은 서열번호 27 또는 서열번호 27과 적어도 약 95(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
자극 방식에서 작용하는 T 세포 1차 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAMS)로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, T 세포 1차 신호전달 도메인은 천연 ITAM 도메인에 비해 변경된(예를 들어, 증가 또는 감소된) 활성을 갖는 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어, 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 최적화 및/또는 절단된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 1, 2, 3, 4개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인과 조합된 T 세포 1차 신호전달 도메인(예를 들어, CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함한다.
공자극 신호전달 도메인은 T 세포 공자극 분자 또는 면역 세포 상에서 발현된 다른 세포 표면 분자의 세포내 도메인으로부터 유래될 수 있다. 공자극 신호 도메인의 예는 CD28, CD27, 4-1BB(CD137), MHC 클래스 I 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, ARHR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160(BY55), CD19, CD19a, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2ra, IL6Ra, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, IL-13RA1/RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R(CSF2RB), IL-21R, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a/CD18, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, CTLA-4(CD152), CD95, TNFR1(CD120a/TNFRSF1A), TNFR2(CD120b/TNFRSF1B), TGFbR1/2/3, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, 공통 감마 쇄, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및 이들의 임의의 조합의 세포내 도메인으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 CD28, TNFR2, 4-1BB, ICOS, CD27, OX40, CTLA4 및 PD-1을 포함하는 군으로부터 선택된 T 세포 공자극 분자의 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 15) 또는 서열번호 15와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 15) 또는 서열번호 15와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(그러나, 20, 10 또는 5개 이하의 변형)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(그러나, 20, 10 또는 5개 이하의 변형)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 15를 갖는 아미노산을 포함한다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 15를 갖는 아미노산으로 이루어진다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 26 또는 서열번호 26과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 4-1BB 세포내 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 35) 또는 서열번호 35와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(그러나, 20, 10 또는 5개 이하의 변형)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 36 또는 서열번호 36과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 CD27 세포내 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 37) 또는 서열번호 37과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(그러나, 20, 10 또는 5개 이하의 변형)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 38 또는 서열번호 38과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 TNFR2 세포내 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 39) 또는 서열번호 39와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(그러나, 20, 10 또는 5개 이하의 변형)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, T 세포 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 40 또는 서열번호 40과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 본 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하기를 포함한다:
- 서열번호 15의 CD28 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
- 서열번호 16의 CD3 제타 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열.
일 실시형태에서, 본 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 무작위 순서 또는 명시된 순서로 서로 연결될 수 있는 적어도 2개의 상이한 도메인(예를 들어, T 세포 공자극 분자의 1차 신호전달 도메인 및 적어도 1개의 세포내 도메인)을 포함한다.
선택적으로, 펩타이드 링커는 별도의 신호전달 도메인을 연결하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 글리신-세린 더블렛(GS)은 적합한 링커로서 사용된다. 일 실시형태에서, 단일 아미노산, 예를 들어, 알라닌(A) 또는 글리신(G)은 링커로서 사용된다. 펩타이드 링커의 다른 예는 위의 부문 I에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 본 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의) 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 둘 이상의 공자극 신호전달 도메인은 펩타이드 링커, 예컨대, 본 명세서에 기재된 것에 의해 분리된다.
일 실시형태에서, 본 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 16) 및 CD28의 공자극 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 15)을 포함한다.
본 발명은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 본 명세서의 다른 곳에 기재된 세포외 결합 도메인의 임의의 그리고 모든 조합을 분명하게 예상한다.
5. 리더 서열
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 MOG-특이적 세포외 결합 도메인에 대해 N-말단에 위치된 리더 서열을 더 포함한다. 단백질이 골지체로부터 분비된 후에 리더 서열이 CAR 단백질의 세포 표면 발현을 가능하게 할 수 있다. 리더 서열의 비제한적 예는 서열번호 1을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있는 CD8의 리더 서열이다. 바람직하게는, 리더 서열은 서열번호 1로 이루어진 CD8의 리더 서열이다.
일 실시형태에서, 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 CD8 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 서열번호 18) 또는 서열번호 18과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.
본 발명은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 리더 서열과 본 명세서의 다른 곳에 기재된 세포외 결합 도메인의 임의의 그리고 모든 조합을 분명하게 예상한다.
6. 태그
일 실시형태에서, CAR은, 예를 들어, 품질 관리, 풍부화 및 생체내 수송을 위해 태그를 더 포함한다. 상기 태그는 CAR의 N-말단 또는 C-말단에, 또는 내부에서 CAR 폴리펩타이드 내에 위치될 수 있다. 태그의 예는 혈구응집소 태그, 폴리 아르기닌 태그, 폴리 히스티딘 태그, Myc 태그, Strep 태그, S-태그, HAT 태그, 3x Flag 태그, 칼모듈린-결합 펩타이드 태그, SBP 태그, 키틴 결합 도메인 태그, GST 태그, 말토스-결합 단백질 태그, 형광 단백질 태그, T7 태그, V5 태그 및 Xpress 태그를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 HA 태그(서열번호 2)를 포함한다. 일 실시형태에서, 태그는 서열번호 19 또는 서열번호 19와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
본 발명은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 태그와 본 명세서의 다른 곳에 기재된 세포외 결합 도메인의 임의의 그리고 모든 조합을 분명하게 예상한다.
7. 예시적인 CAR
본 발명은 본 발명에 따른 MOG-결합 단백질(예를 들어, 본 발명에 따른 scFv)를 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다.
양상에서, 본 발명은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 도메인), 선택적으로 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인, T 세포 공자극 분자의 단일 세포내 도메인 및 T 세포 1차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다.
실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 선택적으로 서열번호 15 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및/또는 선택적으로 서열번호 16 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 막관통 도메인은 선택적으로 서열번호 14 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 12); CD8의 막관통 도메인(예를 들어, 서열번호 14); CD28의 세포내 도메인(예를 들어, 서열번호 15); 및 CD3 제타 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 16)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 12); CD8의 힌지 도메인(예를 들어, 서열번호 13); CD8의 막관통 도메인(예를 들어, 서열번호 14); CD28의 세포내 도메인(예를 들어, 서열번호 15); 및 CD3 제타 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 16)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 56 또는 서열번호 56와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 56을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 56 또는 서열번호 56와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 56으로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 57 또는 서열번호 57과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 57을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 57 또는 서열번호 57과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 57로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 58 또는 서열번호 58과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 58을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 58 또는 서열번호 58과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 58로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 59 또는 서열번호 59와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 59를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 59 또는 서열번호 59와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 59로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 60 또는 서열번호 60과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 60을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 60 또는 서열번호 60과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 60으로 이루어진다.
실시형태에서, CAR은 하기를 포함한다:
(i) 선택적으로 서열번호 12를 포함하는 항-MOG scFv,
(ii) 선택적으로 서열번호 13을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 힌지 도메인,
(iii) 선택적으로 서열번호 14을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인,
(iv) 선택적으로 서열번호 15를 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및 선택적으로 서열번호 16을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인을 포함하는, 세포내 신호전달 도메인 및
(v) 선택적으로 태그 및/또는 리더 서열.
다른 양상에서, 본 발명은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 도메인), 선택적으로 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인, T 세포 공자극 분자의 단일 세포내 도메인 및 T 세포 1차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다.
실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 선택적으로 서열번호 15 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및/또는 선택적으로 서열번호 16 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 막관통 도메인은 선택적으로 서열번호 14 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 51); CD8의 막관통 도메인(예를 들어, 서열번호 14); CD28의 세포내 도메인(예를 들어, 서열번호 15); 및 CD3 제타 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 16)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 51); CD8의 힌지 도메인(예를 들어, 서열번호 13); CD8의 막관통 도메인(예를 들어, 서열번호 14); CD28의 세포내 도메인(예를 들어, 서열번호 15); 및 CD3 제타 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 16)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 17 또는 서열번호 17과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 17을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 17 또는 서열번호 17과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 17로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 52 또는 서열번호 52와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 52를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 52 또는 서열번호 52와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 52로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 53 또는 서열번호 53과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 53을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 53 또는 서열번호 53과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 53으로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 54 또는 서열번호 54와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 54를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 54 또는 서열번호 54와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 54로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 55 또는 서열번호 55와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 55를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 55 또는 서열번호 55와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 55로 이루어진다.
실시형태에서, CAR은 하기를 포함한다:
(i) 선택적으로 서열번호 51을 포함하는 항-MOG scFv,
(ii) 선택적으로 서열번호 13을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 힌지 도메인,
(iii) 선택적으로 서열번호 14를 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인,
(iv) 선택적으로 서열번호 15를 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및 선택적으로 서열번호 16을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인을 포함하는, 세포내 신호전달 도메인 및
(v) 선택적으로 태그 및/또는 리더 서열.
8. 마우스 CAR
양상에서, 본 발명은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 도메인), 선택적으로 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인, T 세포 공자극 분자의 단일 세포내 도메인 및 T 세포 1차 신호전달 도메인을 포함하는 마우스 CAR을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 12); 마우스 CD8의 막관통 도메인(예를 들어, 서열번호 42); 마우스 CD28의 세포내 도메인(예를 들어, 서열번호 43); 및 마우스 CD3 제타 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 44)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스 CAR은 또한 마우스 CD8의 힌지 도메인(예를 들어, 서열번호 41)을 포함할 수 있다. 위의 도메인의 임의의 조합을 갖는 마우스 CAR이 상정된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 65 또는 서열번호 65와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 65를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 65 또는 서열번호 65와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 65로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 66 또는 서열번호 66과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 66을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 66 또는 서열번호 66과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 66으로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 67 또는 서열번호 67과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 67을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 67 또는 서열번호 67과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 67로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 68 또는 서열번호 68과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 68을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 68 또는 서열번호 68과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 68로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 69 또는 서열번호 69와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 69를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 69 또는 서열번호 69와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 69로 이루어진다.
다른 양상에서, 본 발명은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 도메인), 선택적으로 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인, T 세포 공자극 분자의 단일 세포내 도메인 및 T 세포 1차 신호전달 도메인을 포함하는 마우스 CAR을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 MOG-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 51); 마우스 CD8의 막관통 도메인(예를 들어, 서열번호 42); 마우스 CD28의 세포내 도메인(예를 들어, 서열번호 43); 및 마우스 CD3 제타 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 44)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스 CAR은 또한 마우스 CD8의 힌지 도메인(예를 들어, 서열번호 41)을 포함할 수 있다. 위의 도메인의 임의의 조합을 갖는 마우스 CAR이 상정된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 45 또는 서열번호 45와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 45를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 45 또는 서열번호 45와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 45로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 61 또는 서열번호 61과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 61을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 61 또는 서열번호 61과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 61로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 62 또는 서열번호 62와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 62를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 62 또는 서열번호 62와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 62로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 63 또는 서열번호 63과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 63을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 63 또는 서열번호 63과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 63으로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 항-MOG scFv(예를 들어, 서열번호 51을 포함하거나 이것으로 이루어진 scFv), CD8의 힌지 영역, 마우스 CD8의 막관통 도메인, 마우스 CD28의 세포내 도메인 및 마우스 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 64 또는 서열번호 64와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 64를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 서열번호 64 또는 서열번호 64와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 CAR은 서열번호 64로 이루어진다.
B. CAR을 암호화하는 핵산
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 이러한 핵산 서열의 예는 서열번호 28 또는 이의 축중 또는 코돈-최적화 형태이다.
일 실시형태에서, 인간 본 발명의 CAR은 서열번호 28 또는 축중 또는 이의 코돈-최적화 형태에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 인간 CAR은 서열번호 28 또는 서열번호 28과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 인간 본 발명의 CAR은 서열번호 77 또는 축중 또는 이의 코돈-최적화 형태에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 인간 CAR은 서열번호 77 또는 서열번호 77과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 인간 본 발명의 CAR은 서열번호 78 또는 축중 또는 이의 코돈-최적화 형태에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 인간 CAR은 서열번호 78 또는 서열번호 78과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 인간 본 발명의 CAR은 서열번호 79 또는 축중 또는 이의 코돈-최적화 형태에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 인간 CAR은 서열번호 79 또는 서열번호 79와 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 인간 본 발명의 CAR은 서열번호 80 또는 축중 또는 이의 코돈-최적화 형태에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 인간 CAR은 서열번호 80 또는 서열번호 80과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 인간 CAR은 서열번호 81 또는 축중 또는 이의 코돈-최적화 형태에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 인간 CAR은 서열번호 81 또는 서열번호 81과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 서열번호 50 또는 축중 또는 이의 코돈-최적화 형태에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 마우스 CAR은 서열번호 50 또는 서열번호 50과 적어도 약 95%(예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
C. CAR을 발현시키기 위한 벡터
본 발명은 추가로 본 명세서의 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
일 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 DNA이다. 일 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 RNA이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 예는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 에피솜, 바이러스 벡터(예를 들어, 동물 바이러스)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 발현 벡터는 숙주 세포에서 이들에 대한 이식유전자(예를 들어, CAR)의 발현을 야기하거나 지시하기 위해 조절 구성요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서 및 전사 종결자를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다.
동물 세포에 대한 발현 벡터에서 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서, LTR 프로모터, 및 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 인핸서, 및 면역글로불린 H쇄 등의 프로모터 및 인핸서를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 구성적 프로모터의 다른 예는 급초기 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 서열, 연장인자 lα(EF-lα) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, FOXP3 유래 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 포유류 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르 바이러스 급초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터, 마이오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 큐메이트 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 이방향성 프로모터의 예는 i) 거대세포바이러스(CMV) 또는 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 게놈으로부터 유래된 제1 최소 프로모터 서열 및 ii) 동물 유전자로부터 유래된 전체 효율적인 프로모터 서열을 포함하는 이방향 프로모터를 개시하는, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 Luigi Naldini의 미국 특허 제8,501,464호에 기재된 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 벡터의 예는 pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 베타 d2-4 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
플라스미드의 예는 복제기점, 또는 통합 플라스미드, 예컨대, pUC, pcDNA, pBR 등을 포함하는 복제 플라스미드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다수의 바이러스 기반 시스템은 포유류 세포에 유전자 전달을 위해 개발되었다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
레트로바이러스는 유전자 전달 시스템에 대판 편리한 플랫폼을 제공할 수 있다. 선택된 유전자는 당업계에 알려진 기법을 이용하여 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고 생체내 또는 생체외 중 하나에서 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다.
일 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
일 실시형태에서, AAV 벡터가 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "AAV"는 모든 혈청형 및 변이체, 자연 발생적 형태와 조작된 형태 둘 다를 아우른다. 예를 들어, 상기 용어는 1형 AAV(AAV-1), 2형 AAV(AAV-2), 3형 AAV(AAV-3), 4형 AAV(AAV-4), 5형 AAV(AAV-5), 6형 AAV(AAV-6), 7형 AAV(AAV-7) 및 8형 AAV(AAV-8) 및 9형 AAV(AAV-9)를 포괄한다. 일 실시형태에서, 벡터는 AAV6 벡터이다. 일 실시형태에서, AAV는 위형 AAV, 예컨대, AAV6 캡시드 및 다른 AAV 혈청형으로부터 유래된(예를 들어, AAV2로부터의 ITR을 갖는) 재조합 게놈을 갖는 AAV이다.
재조합 바이러스는 당업계에 알려진 기법에 의해, 예컨대, 형질감염 패키징 세포에 의해 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스에 의한 일시적 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+　세포, 293 세포, 293T 세포 등을 포함한다. 이러한 복제-결함 재조합 바이러스를 생성하기 위한 상세한 프로토콜은 당업계에서 찾을 수 있다. 곤충 세포는 또한 재조합 AAV와 같은 재조합 바이러스를 생성하는 데 사용될 수 있다.
III. CAR을 발현시키는 세포
A. 조절 면역 세포
본 발명은 추가로 세포 표면 상에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 발현시키도록 조작된 조절 면역 세포 및 조절 면역 세포 집단에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 CAR을 발현시키거나, 또는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 조절 면역 세포를 제공한다.
일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 T 세포, 예컨대, 조절 T 세포(Treg), CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 NK T 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 CD4+CD25+CD127low T reg이다. Foxp3 및 Helios는 Treg 세포에 의해 발현된 전사 인자이고, 세포의 목적하는 표현형의 유지를 나타낸다. 따라서, 바람직하게는, Treg는 고수준의 Foxp3 및/또는 Helios를 발현시킨다(예를 들어, 도 4 참조). 실시형태에서, Treg는 고수준의 Foxp3을 발현시킨다. 실시형태에서, Treg는 고수준의 Helios를 발현시킨다.
본 발명은 또한 단리된 인간 T 세포를 제공하되, T 세포는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명의 벡터를 포함한다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 T 세포, 예컨대, 조절 T 세포(Treg), CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 NK T 세포이다. 실시형태에서, 단리된 인간 T 세포는 CD4+CD25+CD127low T reg이다. 바람직하게는, Treg는 고수준의 Foxp3 및/또는 Helios를 발현시킨다. 실시형태에서, Treg는 고수준의 Foxp3을 발현시킨다. 실시형태에서, Treg는 고수준의 Helios를 발현시킨다.
본 발명은 또한 세포 표면 상에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 발현시키도록 조작된 조절 면역 세포를 포함하거나 이것으로 이루어진 단리된 및/또는 실질적으로 정제된 조절 면역 세포 집단, 바람직하게는 T 세포 집단에 관한 것이다.
본 발명의 CAR을 발현시키는 조절 면역 세포는 이들의 표면 상에서 MOG를 발현시키는 중추신경계의 세포에 관한 것이다. 조절 면역 세포는 CAR을 통해 MOG에 국재화되고 결합되고, 이어서, 활성화된다. 이 과정은 면역 세포가 자가면역 활성 및 염증을 억제하여 탈수초화를 야기함으로써, 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 것을 가능하게 한다. 이런 의미에서, 조절 면역 세포는 면역 공격에 대해 MOG 발현 세포에 대한 보호 차폐를 제공하는 것으로 간주될 수 있다. 조절 면역 세포는 또한 신경 병변의 재수초화를 개선시킬 수 있다.
유리하게는, 양호한 활성화(높은 신호 대 배경 비) 및 양호한 억제 활성을 입증하는 것에 추가로, 본 발명의 CAR을 발현시키는 조절 면역 세포는 낮은 강성(tonic) 신호전달을 갖는 것으로 발견되었다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "강성 신호전달"은 활성화의 항원-독립적 배경을 지칭한다. 강성 신호전달을 측정하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, CAR-발현 세포의 대사 활성을 측정하는 단계, 수용체에 의해 인식되는 항원에 의한 자극의 부재 하에 세포 활성화의 하나 이상의 지표를 측정하는 단계, 세포 가령(cell aging) 또는 세포 노화와 관련된 하나 이상의 표현형 변화를 측정하는 단계, 항원 자극의 부재 하에 세포 주기 진행을 결정하는 단계; 및 비변형 세포의 크기에 비해 수용체를 발현시키는 세포 크기를 측정하는 단계를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
비형질도입 Treg 세포에 비해 CAR Treg 세포에 의한 CD69 자발적 발현을 모니터링하는 것은 강성 신호전달 강도의 결정을 가능하게 한다.
본 명세서에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 상기 CAR 작제물을 발현시키는 조작된 T 세포 및 조작된 Treg 세포는 낮은 강성 신호전달을 제시하고, CAR 관여(engagement) 후에, 조작된 Treg 세포는 T 효과기 세포 증식에 대한 고도로 효율적인 억제 활성을 나타냄으로써, 세포 요법에 대한 이러한 Treg 세포의 이점을 입증한다.
일 실시형태에서, 조절 면역 세포 집단, 바람직하게는 T 세포 집단은 Treg 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 NK T 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 조절 면역 세포 집단, 바람직하게는 T 세포 집단은 Treg 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 NK T 세포로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 T 세포는 Treg 세포이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 세포 집단에서 Treg 세포는 모두 본 명세서에 기재된 CAR을 발현시키고, 따라서 CAR-단일특이적으로 정의될 수 있다(즉, 모든 Treg 세포는 동일한 항원(MOG)을 인식한다). 일 실시형태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이다(즉, 모든 Treg 세포는 이들의 TCR과 동일한 항원을 인식한다). 다른 실시형태에서, Treg 세포 집단은 TCR-다중특이적이다(즉, Treg 세포는 이들의 TCR과 상이한 항원을 인식할 수 있다).
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은, T(예를 들어, Treg) 세포에 의해 발현될 때, T 세포에 이들의 세포 표면 상에서 MOG를 발현시키는 세포에 결합하는 능력 및 MOG에 대한 결합에 의해 활성화되는 능력을 부여한다.
MOG는 CNS에서 주로 희소돌기 아교세포에 의해 발현된다.
본 발명의 조절 면역 세포 집단(예를 들어, 본 발명의 T 세포(예를 들어, Treg) 집단)은 전향된(redirected) 조절 면역 세포 집단으로서 정의될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "전향된"은 조절 면역 세포에, 조절 면역 세포가 특이적이거나 활성화되는 것과 상이한 리간드에 결합하고 이런 리간드에 의해 활성화되는 능력을 부여하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 운반하는 조절 면역 세포를 지칭한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 Treg 세포는 세포독성이 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 Treg 세포는 세포독성이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 Treg 세포는 CD4+CD25+CD127low FOXP3+ Treg 세포, CD4+CD25+FOXP3+ Treg 세포, Tr1 세포, TGF-β-분비 Th3 세포, 조절 NK T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 CD8+ T 세포, 및 이중 음성 조절 T 세포를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 CD4+ Treg 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 흉선-유래 Treg 또는 적응 또는 유도 Treg이다. 일 실시형태에서, Treg 세포는 CD4+FOXP3+ Treg 세포, 또는 CD4+FOXP3- 조절 T 세포(Tr1 세포)이다.
일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 CD8+ Treg 세포이다. 일 실시형태에서, CD8+ Treg 세포는 CD8+CD28- Treg 세포, CD8+CD103+ Treg 세포, CD8+FOXP3+ Treg 세포, CD8+CD122+ Treg 세포 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조절 세포는 INFγ+IL10+IL34+CD8+CD45RClow Treg 세포이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조절 면역 세포는 인간 Treg 세포이다.
일 실시형태에서, 조절 면역 세포(예를 들어, T 세포 또는 Treg 세포)는 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유도 다능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 탈-분화 또는 재프로그래밍에 의해 비-다능성 세포(예를 들어, 성인 체세포)로부터 유래된 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 특히, iPSC는 다능성-관련 유전자(재프로그래밍 인자)의 특정 세트를 세포에 도입함으로써 얻어질 수 있다. 재프로그래밍 인자는, 예를 들어, 전사 인자 Oct4(Pou5f1), Sox2, c-Myc 및 Klf4일 수 있다.
일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: CD4+CD25+, 예컨대, CD4+CD25+CD127- 및 CD4+CD25+CD127-CD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: CD4+CD25+, 예컨대, CD4+CD25+CD127low 및 CD4+CD25+CD127lowCD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: CD4+CD25+, 예컨대, CD4+CD25+CD127low/- 및 CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: FOXP3+CD4+CD25+, 예컨대, FOXP3+CD4+CD25+CD127- 및 FOXP3+CD4+CD25+CD127-CD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: FOXP3+CD4+CD25+, 예컨대, FOXP3+CD4+CD25+CD127low 및 FOXP3+CD4+CD25+CD127lowCD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: FOXP3+CD4+CD25+, 예컨대, FOXP3+CD4+CD25+CD127low/- 및 FOXP3+CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+.
일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: CD4+CD25high, 예컨대, CD4+CD25highCD127- 및 CD4+CD25highCD127-CD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: CD4+CD25high, 예컨대, CD4+CD25highCD127low 및 CD4+CD25highCD127lowCD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: CD4+CD25high, 예컨대, CD4+CD25highCD127low/- 및 CD4+CD25highCD127low/-CD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: FOXP3+CD4+CD25high, 예컨대, FOXP3+CD4+CD25highCD127- 및 FOXP3+CD4+CD25highCD127-CD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: FOXP3+CD4+CD25high, 예컨대, FOXP3+CD4+CD25highCD127low 및 FOXP3+CD4+CD25highCD127lowCD45RA+. 일 실시형태에서, Treg 세포는 다음의 표현형을 갖는다: FOXP3+CD4+CD25high, 예컨대, FOXP3+CD4+CD25highCD127low/- 및 FOXP3+CD4+CD25highCD127low/-CD45RA+.
일 실시형태에서, 조절 면역 세포(예를 들어, T 또는 Treg 세포)는 자가 세포이다. 자가 요법은 각 환자에 대한 "맞춤" 제품이다. 다른 실시형태에서, 조절 면역 세포(예를 들어, T 또는 Treg 세포)는 동종 세포이다. 동종 세포는 다수의 환자를 치료하기 위해 사용되는 "기성품(off-the-shelf)" 제품을 제공하기 위해 동종이형 치료법에서 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 세포는 세포에 대한 숙주 거부(이식편 거부) 및/또는 숙주에 대한 세포의 잠재적 공격(이식편 대 숙주 질환)을 감소시키기 위해 조작될 수 있다. 예로서, 세포는 다음 중 하나 이상의 무효(null) 유전자형을 갖도록 조작될 수 있다: (i) T 세포 수용체(TCR 알파 쇄 또는 베타 쇄); (ii) 다형성 주조직 적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II 분자(예를 들어, HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C; HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 또는 HLA-DR; 또는 β2-마이크로글로불린(B2M)); (iii) 항원 가공과 연관된 수송체(예를 들어, TAP-1 또는 TAP-2); (iv) 클래스 II MHC 전사활성체(CIITA); (v) 부조직적합 항원(MiHA; 예를 들어, HA-1/A2, HA-2, HA-3, HA-8, HB-1H 또는 HB-1Y); 및(vi) 이들의 임의의 조합.
분자의 발현 수준은 유세포분석, 면역형광 또는 영상 분석에 의해 결정될 수 있다. 세포내 단백질을 검출하기 위해, 세포는 유세포분석 분석 전에 고정되고 투과될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 집단에서 분자의 발현 수준은 분자를 발현시키는 세포 집단의 세포(즉, 분자의 경우 세포 "+")의 백분율로 표시된다. 분자를 발현시키는 세포의 백분율은 FACS에 의해 측정될 수 있다. 관심 세포 마커의 발현 수준은 이 마커에 특이적인 형광 표지된 항원으로 염색된 세포 집단으로부터의 세포의 중앙값 형광 강도(MFI)를 관련없는 특이성을 갖지만 동일한 아이소타입, 동일한 형광 프로브를 갖고 동일한 종으로부터 유래된 형광 표지된 항체(아이소타입 대조군으로 지칭됨)로 염색된 동일한 세포 집단으로부터의 세포의 형광 강도(FI)와 비교함으로써 결정될 수 있다. 이 마커에 특이적인 형광 표지된 항체로 염색되고 아이소타입 대조군으로 염색된 세포와 동등한 MFI 또는 더 낮은 MFI를 나타내는 집단의 세포는 이 마커를 발현시키지 않으며, 이어서, (-) 또는 음성으로 표기된다. 이 마커에 특이적인 형광 표지된 항체로 염색되고 아이소타입 대조군으로 염색된 세포보다 우수한 MFI 값을 나타내는 집단의 세포는 이 마커를 발현시키지 않으며, 이어서, (+) 또는 양성으로 표기된다.
용어 "발현시키는"(즉, "양성" 또는 "+") 및 "발현시키지 않는"(즉, "음성" 또는 "-")는 관심 세포 마커의 발현 수준을 지칭하며, 즉, "+"에 상응하는 세포 마커의 발현 수준은 "+/-"로도 지칭되는 높음 또는 중간이고, "-"에 상응하는 세포 마커의 발현 수준은 무효이다. 용어 "낮음" 또는 "lo" 또는 "낮음/-"는 세포 마커의 발현 수준이 전체로서 분석 중인 세포 집단에서 해당 세포 마커의 발현 수준에 비해 낮은 관심 세포 마커의 발현 수준을 지칭한다. 더 구체적으로는, 용어 "lo"는 하나 이상의 다른 별도의 세포 집단보다 더 낮은 수준에서 세포 마커를 발현시키는 세포의 별도의 집단을 지칭한다. 용어 "높음" 또는 "hi" 또는 "선명함"은 세포 마커의 발현 수준이 전체로서 분석 중인 세포 집단에서 해당 세포 마커의 발현 수준에 비해 높은 관심 세포 마커의 발현 수준을 지칭한다. 일반적으로, 염색 강도의 상위 2, 3, 4 또는 5%의 세포는 "hi"로 표기되며, 집단의 상위 절반에 속하는 것은 "+"로 범주화된다. 형광 광도의 50% 이하에 속하는 해당 세포는 "lo" 세포로 표기되고, 5% 이하는 "-" 세포로 표기된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은, Treg 세포에 의해 발현될 때, MOG로 향하는 다른 CAR 작제물에 비해서 상기 Treg 세포의 활성화 배경 감소를 가능하게 한다.
B. 조절 면역 세포의 활성화
중요하게는, 일단 CAR이 이의 표적에 결합하면, 세포가 사이토카인(예를 들어, IL-10, TGF-B) 및 효과기 T 세포(Teff 세포)의 활성을 억제하고 말초관용(peripheral tolerance)을 확립하는 다른 가용성 매개체를 방출하도록 조절 면역 세포, 바람직하게는 T 세포, 더 바람직하게는 Treg 세포, 예를 들어, CD4+CD25+CD127low Treg 세포의 활성화가 추가로 필요하다. 세포는 또한 세포 접촉에 의해, 예를 들어, CTLA4 - CD80/86 및 LAG3을 통해 작용한다. 생리적 방식으로 활성화가 일어나기 위해서는 세포의 신호전달이 필요하다. 이러한 신호전달을 얻는 것은, CAR이 이의 표적에 어떻게 결합하는지(예를 들어, 위치 또는 입체배치)에 따르기 때문에 문제가 된다. 다시 말해서, MOG+ 희소돌기 아교세포에 대한 단순한 결합만으로는 기능적 조절 면역 세포 및 CNS에서 이의 유지를 유도하는 데 충분하지 않다.
본 발명자들은 본 발명의 CAR을 발현시키는 조절 면역 세포, 특히 Treg 세포, 예를 들어, CD4+CD25+CD127low T reg 세포가 MOG-제시 세포에 결합할 수 있는 이들의 표면 상에 MOG-결합 CAR을 제시한다는 것을 입증하였다.
본 발명의 CAR은 활성화 없이 낮은 CD69 발현(낮은 강성/배경 활성화) 및 양호한 CAR-매개 활성화(높은 신호 대 배경 비), 예를 들어, 적어도 2배만큼 활성화 증가를 포함하는, 실시예에 입증된 바와 같은 유리한 특징의 조합을 갖는 새로운 CAR이다. 도 11 참조.
본 발명의 CAR은 마우스 및 인간 MOG 단백질에 결합할 수 있는 새롭고 교차 반응성인 CAR이다. 도 12 참조.
Treg 세포의 CAR-특이적 활성화 및 Treg 세포에 대한 활성화의 낮은 배경을 도 5 및 도 9에 나타낸다. 본 발명의 CAR-MOG를 발현시키는 Treg 세포는 도 6에 나타낸 바와 같이 효율적인 CAR-매개 억제 활성을 나타낸다. 중요하게는, CAR의 활성화 및 증식은 CNS에서 일어나는 것으로 나타났다, 도 10A 및 도 10B 참조.
IV. 조성물, 약제학적 조성물, 의약
양상에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 MOG-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 특히 scFv)을 포함하는(본질적으로 이루어짐 및 이루어짐 포함) 조성물을 제공한다.
양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는(본질적으로 이루어짐 및 이루어짐 포함) 조성물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 CAR을 포함하는 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단을 포함하는(본질적으로 이루어짐 및 이루어짐 포함) 조성물을 제공한다. 실시형태에서, 조성물은 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명의 조절 면역 세포의 집단을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이고, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함한다.
결과적으로, 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 CAR을 포함하는 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 CAR을 포함하는 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 MOG-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 특히 scFv), 핵산 또는 발현 벡터, 또는 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단은 상기 조성물 내의 유일한 치료제 또는 생물학적 활성을 갖는 제제이다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 완충제, 등장제, 안정제, 보존제, 흡수-지연제 등을 지칭한다. 상기 부형제는 인간과 같은 대상체에게 투여될 때 역반응, 알레르기 반응 또는 다른 뜻밖의 반응을 생성하지 않는다.
본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 예는 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민), 완충제(예를 들어, 포스페이트), 글리신, 솔브산, 솔브산칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질(예를 들어, 염화나트륨, 황산프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨 및 아연염) 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 주사용으로 약제학적으로 적합한 비히클을 포함한다. 이들은, 예를 들어, 등장성, 멸균 식염수 용액(예를 들어, 제일인산나트륨 또는 제이인산나트륨; 염화나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘; 또는 이러한 염의 혼합물); 또는 멸균수 또는 생리 식염수와 같은 적합한 담체의 첨가 시, 주사 가능한 용액의 구성을 가능하게 하는 건조(예를 들어, 냉동 건조된) 조성물일 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 MOG-결합 단백질을 포함하는(본질적으로 이루어짐 및 이루어짐 포함) 의약을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 CAR을 발현시키는 조절 면역 세포 집단을 포함하는(본질적으로 이루어짐 및 이루어짐 포함) 의약을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 MOG-결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 의약을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 벡터를 포함하는 의약을 제공한다.
V. 투여 경로
예시적인 투여 형태는 비경구, 흡입 스프레이에 의해, 직장, 비강 또는 이식 저장소를 통하는 것을 포함한다.
예시적인 투여 형태는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 윤활액 내, 흉골내, 척추강내, 복강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기법; 바람직하게는 정맥내, 척추강내 또는 복강내 주사; 더 바람직하게는 정맥내 주사를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 주사를 포함한다.
주사에 적합한 예시적인 형태는 용액, 예를 들어, 멸균 수용액, 겔, 분산액, 에멀션, 현탁액, 사용 전 액체의 첨가 시 용액 또는 현탁액을 제조하기 위해 사용하는 데 적합한 고체 형태, 예를 들어, 분말, 리포솜 형태 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
VI. 투약량
그러나, 치료적 유효량 및 투약 빈도가 타당한 의학적 판단 내에서 담당 의사가 결정한다는 것이 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효 용량 수준은 치료 중인 질환 및 질환의 중증도; 사용되는 단리된 MOG-결합 단백질, 핵산, 발현 벡터 또는 조절 면역 세포의 활성; 대상체의 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별 및 식이요법; 사용되는 특정 치료제의 투여 시간, 투여 경로, 및 배설 속도; 치료의 지속기간; 사용되는 특정 치료제와 조합되거나 함께 사용되는 약물; 및 의학 분야에 잘 알려진 유사한 인자를 포함하는 다양한 인자에 따를 것이다. 예를 들어, 목적하는 치료 효과를 달성하고 목적하는 효과가 달성될 때까지 투약량을 점진적으로 증가시키는 데 필요한 것보다 적은 수준에서 화합물의 용량을 개시하는 것은 당업계의 기술 내에서 용이하다. 각 치료에 필요한 총 용량은 다회 용량 또는 단일 용량으로 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 인간)는 본 발명의 치료제(예를 들어, 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단)의 단일 투여를 받는다.
일 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 인간)는 본 발명의 치료제(예를 들어, 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단)의 적어도 2회의 투여를 받는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 치료제(예를 들어, 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단)는 1주 1회, 1개월에 1회 또는 1년에 1회 대상체에게 투여된다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조절 면역 세포의 수는 약 102 내지 약 109, 약 103 내지 약 108, 약 104 내지 약 107, 또는 약 105 내지 약 106개의 범위이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 치료제(예를 들어, 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단)는 다른 활성제와 병용하여 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 상기 다른 활성제는 염증성 CNS 질환/장애, 예를 들어, 다발성 경화증을 치료하기 위해 사용될 수 있는 제제이다. 다른 활성제의 예는 글루코코르티코이드(덱사메타손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 베도메타손, 틱소코르톨, 트라이암시놀론, 하이드로코티손, 부데소나이드 또는 플루드로코티손을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다), 인간 사이토카인의 항체 또는 길항제, 분자(예를 들어, 항-CD20, 예컨대, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 오비누투주맙; 항-CD52, 예컨대, 알렘투주맙; 항-α4β1 인테그린, 예컨대, 나탈리주맙; 항-CD25, 예컨대, 다클리주맙; 항-LINGO-1, 예컨대, 오피시누맙); 인터페론-베타-1a, 페그인터페론-베타-1a, 인터페론-베타-1b, 글라티라머 아세테이트, 미톡산트론, 이부딜라스트, 심바스타틴, 바이오틴, 라퀴니모드, 오자니모드, 핀골리모드, 시포니모드, 포네시모드, 에보브루티닙 테리플루노마이드, 모노메틸 퓨마레이트, 다이메틸 퓨마레이트, 다이록시멜 퓨마레이트, 면역조절제(예를 들어, 타크롤리무스, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 탈리도마이드, 레플루노마이드 및 퓨린의 유사체, 예컨대, 클라드리빈, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린) 및 혈장 교환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 치료제(예를 들어, 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단)의 투여는 대상체가 투여받은 상기 다른 활성제 양의 감소를 가능하게 한다.
일 실시형태에 따르면, 본 발명의 치료제(예를 들어, 조절 면역 세포 또는 조절 면역 세포 집단)는 다른 활성제의 투여 전에, 동시에 또는 후에 투여된다.
VII. 치료 용도
본 발명은 추가로 의약으로서 사용하기 위한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 CAR을 발현시키는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Treg 세포)에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 MS와 같은 염증성 CNS 질환/장애에서 사용하기 위한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 CAR을 발현시키는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Treg 세포)에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 탈수초성 질환/장애, 특히 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 데 사용하기 위한 CAR을 발현시키는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Treg 세포)에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 MOG-관련 질환/장애(MOGAD), 특히 MOG-관련 염증성 질환/장애, 더 구체적으로는 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 데 사용하기 위한 CAR을 발현시키는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Treg 세포)에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 CNS의 염증을 감소 또는 방지하기 위한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 CAR을 발현시키는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Treg 세포)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CNS의 탈수초화를 포함하는 손상을 감소 또는 방지하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 발현시키는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Treg 세포)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CNS의 신경 병변의 재수초화를 유도하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 발현시키는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Treg 세포)에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 의약으로서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명의 조절 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 염증성 CNS 질환/장애, 예컨대, MS를 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명의 조절 면역 세포의 집단의 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 탈수초성 질환/장애, 특히, 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명의 조절 면역 세포의 집단의 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 MOG-관련 질환/장애(MOGAD), 특히 MOG-관련 염증성 질환/장애, 더 구체적으로는 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명의 조절 면역 세포의 집단의 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 CNS의 탈수초화를 포함하는 염증 및/또는 손상을 감소 또는 방지하기 위한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명의 조절 면역 세포의 집단의 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 CAR을 발현시키는 세포 집단(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Treg 세포)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환, 장애 또는 질환 또는 장애의 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 염증성 CNS 질환/장애를 치료하기 위한 방법이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 탈수초성 질환/장애, 특히 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 방법이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 MOG-관련 질환/장애(MOGAD), 특히 MOG-관련 염증성 질환/장애, 더 구체적으로는 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하기 위한 방법이다.
본 발명은 추가로 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 조절 면역 세포 또는 본 발명의 조절 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 질환, 장애 또는 질환 또는 장애의 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 염증성 CNS 질환/장애를 치료하기 위한 방법이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 탈수초성 질환/장애, 특히 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 방법이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 MOG-관련 질환/장애(MOGAD), 특히 MOG-관련 염증성 질환/장애, 더 구체적으로는 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하기 위한 방법이다.
본 발명은 추가로 염증 및/또는 손상의 감소 또는 방지를 필요로 하는 대상체에서 CNS의 탈수초화를 포함하는 염증 및/또는 손상의 감소 또는 방지를 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 염증성 CNS 질환/장애, 예를 들어, 다발성 경화증의 치료를 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 세포 요법 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 조절 면역 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 Treg 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 투여될 조절 면역 세포는 자가 세포이고; 다시 말해서, 세포 요법은 자가 세포 요법이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "자가"는 이후에 재도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
일 실시형태에서, 세포 요법은 이종성 세포 요법이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "이종성"은 치료될 대상체로부터 유래되지 않았지만 외부 공급원, 예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 사체 기원의 세포로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
일 실시형태에서, 세포 요법은 이종발생성이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "이종발생성"은 물질이 도입된 대상체와 상이한 종의 대상체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
다른 실시형태에서, 투여될 조절 면역 세포는 동종 세포이고; 다시 말해서, 세포 요법은 동종 세포 요법이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "동종이계"는 물질이 도입된 대상체와 동일한 종의 상이한 대상체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 이상의 대상체는 하나 이상의 좌위에서 유전자가 동일하지 않을 때 서로 동종이계인 것으로 언급된다. 추가 실시형태에서, 조절 면역 세포는 건강하나 인간 공여자로부터 유래된다.
염증성 CNS 질환/장애의 예는 진행성 핵상마비(PSP), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 근위축성 축삭경화증(ALS), 자폐 스펙트럼 장애, 라스무센뇌염, 만성 외상성 뇌병증(CTE)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 염증성 CNS 질환/장애는 자가-항원 및/또는 자가항체, 예컨대, 다발성 경화증(MS), 임상적 단독 증후군(CIS), 시신경 척수염(NMO), 시신경염, 급성 횡단성 척수염, 횡단성 척수염, 부신백질이영양증, 소멸백질병 및 풍진 유발 정신 지체에 의해 야기되거나 악화된 탈수초성 장애이다. 더 바람직한 탈수초성 장애는 다발성 경화증(MS) 및 시신경 척수염(NMO)이다. 특정 실시형태에서, 상기 MS는 재발-완화형 MS(RRMS), 2차 진행성 MS(SPMS), 1차 진행성 MS(PPMS), 급성 전격성 다발성 경화증 및 MS-의심 방사선 단독 증후군(RIS)으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 염증성 CNS 질환/장애는 임상적 단독 증후군(CIS)이다.
일 실시형태에서, 염증성 CNS 질환/장애는 다발성 경화증(MS)이다.
일 실시형태에서, 다발성 경화증은 재발-완화형 MS(RRMS)이다.
일 실시형태에서, 다발성 경화증은 원발성-진행성 MS(PPMS)이다.
일 실시형태에서, 다발성 경화증은 이차-진행성 MS(SPMS)이다.
VIII. 제조 항목
본 발명은 또한 본 발명에 따른 염증성 CNS 질환/장애, 예를 들어, 다발성 경화증의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 항목에 관한 것이다.
제조 항목은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 백(bag), 보틀, 바이알, 주사기, 파우치 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다.
제조 물품, 라벨 또는 포장 삽입물은 본 발명의 Treg 세포 집단을 환자에게 투여하기 위한 지도용 자료를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 조절 면역 세포 집단을 포함하는 키트를 제공한다. "키트"는 본 발명의 Treg 세포 집단을 포함하는 임의의 제조 물품(예를 들어, 패키지 또는 용기)을 의미하는 것으로 의도된다. 키트는 또한 사용을 위한 지침을 포함할 수 있다.
본 명세서에 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 자료를 이하에 기재하지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 자료가 또한 본 개시내용의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서로 조절할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 의학, 의료 및 약제 화학, 세포 생물학, 분자와 관련하여 사용되는 명명법 및 이의 기법은 잘 알려져 있고 당업계에서 통상적으로 사용된다. 추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 실시형태 전체적으로, 단어 "갖다" 및 "포함하다" 또는 변형, 예컨대, "가지다", "갖는", "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 정수 또는 정수의 그룹을 제외하지 않는다는 것이 이해될 것이다.
본 개시내용이 더 양호하게 이해될 수 있도록, 다음의 실시예가 제시된다. 이러한 실시예는 단지 예시의 목적을 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
다음의 실시예 의해 추가로 예시되는 경우의 본 발명.
재료 및 방법
상이한 MOG 변이체에 대한 MOG-결합의 결정
본 발명의 MOG-CAR을 발현시키는 효모 세포를 바이오틴일화된 인간 MOG-His(Uniprot Q16653), 마우스 MOG-His(Uniprot Q61885)(둘 다 RND Systems); 또는 표시된 농도에서 발현시킨 사이노몰거스 원숭이 MOG-FC 단백질(Q9BGS7) 포유류 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, scFV 발현 효모 세포에 결합된 MOG-단백질을 형광단-태그된 스트렙타비딘을 이용하여 유세포분석에 의해 검출한 한편, scFV 발현을 유전적으로 암호화된, N-말단이 융합된 MYC-태그의 염색에 의해 검출하였다. 도 13 참조.
A. 인간 세포에 의한 경험
1. 인간 PBMC 단리
건강한 공여자의 혈액을 Etablissement du Sang(EFS)에 의해 수집한다. 혈액 수집 다음 날에, 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 과립구, 혈소판 및 남아있는 적혈구 오염물질과 같은 혈액 생성물의 원치않는 분획 제거를 가능하게 하는 Ficoll 구배 원심분리에 의해 버피 코트로부터 단리시켰다. 이어서, 관심 세포 집단을 다음과 같이 단리시켰다.
2. FoxP3 Treg 및 CD4 + CD25 - 통상적인 인간 T 세포 단리
제조업자의 지침에 따라 인간 CD4+CD127lowCD25+ 조절 T 세포 단리 키트(#18063; StemCell)를 이용하여 CD4+CD25+CD127low Treg를 단리시켰다. 간략하게, CD25+ 세포를 EasySep™ Releasable RapidSpheres™을 이용하여 무칼럼, 면역자기 양성 선택에 의해 400 내지 500×106개의 PBMC로부터 처음 단리시켰다. 이어서, 결합된 자기 입자를 EasySep™-단리 CD25+ 세포로부터 제거하였고, 고갈을 위해 원치않는 비-Treg를 표적화하였다. 최종 단리된 분획은 고수준의 Foxp3을 발현시키는 고도로 정제된 CD4+CD127lowCD25+ 세포를 함유하고 하류의 적용을 위해 즉시 사용하였다. 키트 #18063(줄기 세포)으로부터 CD4+CD25- 반응자 T 세포의 단리를 위해; Treg와 병행한 기능적 연구에서 사용을 위해 선택적 프로토콜을 수행함으로써 CD4+CD25- 통상적인 T 세포를 단리시켰다.
3. 단리된 인간 Treg의 활성화 및 배양
단리된 Treg 세포를 활성화시키고, 9일 동안 배양시켰다. 간략하게, 제0일에, Treg 세포(0.5×106개)를 인간 트랜스페린(OZYME)을 함유하고 1000 U/㎖ IL-2 (Euromedex)에 100nM 라파마이신(Sigma-Aldrich)을 더하여 보충한 Xvivo15 무혈청 배지와 함께 24 웰 플레이트(Costar)에서 배양하였다. 이어서, Life Technology로부터의 Dynabeads(웰당 0.5×106개 비드)로 CD3/CD28 활성화를 수행하였다. 제2일, 제4일 및 제7일에, 1000 U/㎖ IL-2로 보충한 신선한 배양 배지로 세포를 공급하였다. 최종적으로, 제9일에, 세포를 회수하고, 계수하고 나서, 재활성화시켰다.
4. 렌티바이러스 벡터 생성 및 역가
고전적 4-플라스미드 렌티바이러스 시스템을 이용하여 CAR-발현 렌티바이러스 벡터(LV)를 생성하였다. 간략하게, HEK293T 세포(Lenti-X, Ozyme)를 CAR-발현 전달 벡터, HIV-1 Gag/pol을 발현시키는 플라스미드(pMDLg/pRRE), HIV-1 Rev(pRSV.Rev)로 형질감염시키고, 바이러스 외피의 경우, 인간 Treg의 형질도입을 위한 VSV-G 당단백질(pMD2.G)(Didier Trono, EPFL, Switzerland) 및 마우스 Treg의 형질도입을 위한 Ecotropic MLV 외피 당단백질(pCMV-Eco, Cell Biolabs Inc.)로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간에, 바이러스 상청액을 채취하고, 원심분리로 농축시키고 나서, 분취시키고, 장기간 저장을 위해 -80℃에서 냉동시켰다. 바이러스 상청액의 연속 희석 및 GFP 발현을 모니터링함으로써 4일 후에 평가한 형질도입 효율을 이용하여 Jurkat T 세포주(VSV-G 위형의 경우) 또는 NIH-3T3(EcoMLV 위형의 경우)의 형질도입 후에 밀리리터당 형질도입 단위(TU/㎖)로 표현되는 감염 역가를 얻었다.
5. 인간 Treg 형질도입 프로토콜
Treg는 키메라 수용체에 의한 이들의 활성화 2일 후에 형질도입하였다(이하 참조). 간략하게 각 웰에 ㎖당 2 내지 5×106개의 형질도입 단위(TU)를 로딩함으로써 형질도입을 수행하였다. 37℃에서 6시간 후에, 바이러스 입자를 세척에 의해 제거하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션시켰다. 형질도입 5일 후에, 형질도입 효율을 분석하였다: 유세포분석에서 GFP 양성 세포의 백분율 분석에 의해 유전자-전달 효능을 측정하였다.
6. 형질도입을 위해 사용한 인간 CAR 작제물.
CD3ζ과 나란히 있고 MOG로 향하는 ScFv와 CD8 막관통(TM) 및 CD28의 세포내 도메인으로 구성된 MOG CAR을 설계한다. 이 연구에서 사용한 작제물을 도 1에 열거하고 기재한다.
7. 형질도입된 인간 Treg의 표현형 분석
배양의 제9일에, 표 1에 열거된 마커를 이용하여 유세포분석에서 Treg 표현형을 분석하였다.
8. 인간 CAR의 활성화 분석
배양의 제9일에 활성화 분석을 수행하였다. 간략하게, 0.05×106개의 Treg를 96 U 바닥 플레이트 단독에서 또는 항 CD28/항CD3 코팅 비드(1 대 1의 Treg 대 비드 비), 또는 MOG 코팅 비드(1 대 1의 Treg 대 비드 비)의 존재 하에 200㎕ 최종 용적으로 파종하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간 후에, 세포를 CD4 및 CD69 동안 염색하였고, 이어서, 유세포분석을 이용하여 분석하였다. 비형질도입 Treg 세포와 비교하여 CAR Treg 세포에 의한 CD69 자발적 발현을 모니터링하는 것은 강성 신호전달 강도의 결정을 가능하게 한다.
9. 인간 T 세포 증식의 억제 분석
배양의 제9일에 억제 분석을 수행하였다. 간략하게, 항 CD28/항CD3 코팅 비드(1 대 1의 Treg 대 비드비)를 이용하여 TCR을 통해, MOG 코팅 비드(1 대 1의 Treg 대 비드 비)를 이용하여 CAR을 통해 Treg를 회수하고, 계수하고 활성화시키거나, 이들의 자발적 억제 활성을 평가하기 위해 활성화 없이 유지하였다. 동시에, 동종이계 Tconv를 해동시키고, Cell Trace Violet(CTV)로 염색하고 나서, 항 CD28/항 CD3 코팅 비드(3 대 1의 Tconv 대 비드 비)로 활성화시켰다. 다음 날, 비활성화 또는 활성화된 Treg(비형질도입 또는 형질도입)와 함께 이들의 공동배양 전에 Tconv로부터 비드를 제거하였다. 제3일에, 세포를 채취하고, CTV 희석의 결정을 통해 유세포분석에 의해 Tconv의 증식을 평가하였다. Tconv 증식의 저해 백분율을 다음과 같이 계산하였다:
B. 마우스 세포에 의한 경험
1. 마우스 Treg의 단리
C57/Bl6으로부터 비장을 채취하고, 세포 스트레이너를 통해 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻었다. 제조업자의 지침에 따라 EasySep™ 마우스 CD4+CD25+ 조절 T 세포 단리 키트 II(#18783; StemCell)를 이용하여 CD4+ CD25+를 단리시켰다. 간략하게, CD4+ 세포를 무 칼럼, 면역자기 음성 선택에 의해 비장세포로부터 처음 사전 농축시켰다. 이어서, 자기 입자에 연결하는 CD25를 인식하는 항체를 함유하는 CD25 양성 선택 칵테일을 이용하여 CD25+를 선택한다. 단리된 세포는 세포 배양물에 대해 즉시 이용 가능하다.
2. 단리된 마우스 Treg의 활성화 및 배양
단리된 Treg 세포를 활성화시키고, 최대 8일 동안 배양시켰다. 간략하게, 제0일에, Treg 세포(0,5.106)를 10% FBS, 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 0,1mM 비필수 아미노산, 1% 페니실린-스트렙타비딘 및 5μM 2-베타머캅토-에탄올(RPMI10)을 함유하고 1000U/㎖ Rec huIL2 및 50nM 라파마이신을 보충한 RPMI와 함께 24 웰 플레이트(Costar)에 배양시켰다. 이어서, Life Technologies(2:1, 비드:세포비)로부터 Dynabeads 마우스 T 활성체를 이용하여 CD3/CD28 활성화를 수행하였다. 제2일, 제4일 및 제6일에, 세포를 계수하고, 1000 U/㎖ IL-2 및 Rapa(제4일에만)를 보충한 신선한 배양 배지를 공급하였다.
3. 마우스 Treg 형질도입 프로토콜
Treg는 키메라 수용체에 의한 이들의 활성화 2일 후에 형질도입하였다. 간략하게, 15㎍/㎖의 프로트란스듀신 B(PTDB)를 더한 각각의 웰에 ㎖당 2×107개 형질도입 단위(TU)의 CAR 벡터를 로딩함으로써 형질도입을 수행하였다. PTDB와 벡터를 5분 동안 37℃에서 혼합한 후에 Treg에 첨가하였다. 32℃, 1000g에서 90분 동안 스피노컬레이션(spinoculation)을 수행한다. 37℃에서 4시간 후에, 바이러스 입자와 PTDB를 세척에 의해 제거하고, IL-2(1000 U/㎖)를 함유하는 신선한 배지를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션시켰다. 형질도입의 4 내지 5일 후에, 형질도입 효율을 분석하였다: 유세포분석에서 NGFR 양성 세포의 백분율 분석에 의해 유전자-전달 효능을 측정하였다.
4. 형질도입을 위해 사용한 마우스 CAR 작제물.
CD3ζ과 나란히 있고 MOG로 향하는 ScFv와 CD8 막관통(TM) 및 CD28의 세포내 도메인으로 구성된 MOG CAR을 설계한다. 이 연구에서 사용한 작제물을 도 2에 열거하고 기재한다.
5. 형질도입된 마우스 Treg의 표현형 분석
배양의 제6일 내지 제7일에, 표 2에 열거된 마커를 이용하여 유세포분석에서 Treg 표현형을 분석하였다.
6. 마우스 CAR의 활성화 분석
배양의 제7일에 활성화 분석을 수행하였다. 간략하게, 0.05×106개의 Treg를 96 U 바닥 플레이트 단독에서 또는 항 CD28/항CD3 코팅 비드(1 대 1의 Treg 대 비드 비), 또는 MOG 코팅 비드(1 대 1의 Treg 대 비드 비)의 존재 하에 200㎕ 최종 용적으로 파종하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간 후에, 세포를 CD4 및 CD69 동안 염색하였고, 이어서, 유세포분석을 이용하여 분석하였다. 대조군 Treg 세포와 비교하여 CAR Treg 세포에 의한 CD69 자발적 발현을 모니터링하는 것은 강성 신호전달 강도의 결정을 가능하게 한다.
7. 마우스 CAR의 생체내 활성화 분석: 짧은 모델
본 발명자들의 MOG CAR이 표적 기관(중추 신경계: CNS)에 들어가서 활성화되고 증식될 수 있는지를 결정하기 위해, EAE를 이용하는 짧은 모델을 개발하였다. 간략하게, 암컷 마우스를 MOG 펩타이드 + CFA를 함유하는 에멀션으로 면역화하여 질환을 유발하였다. 제0일 및 제2일에 백일해 독소(Pertusis toxin: PTX)의 i.p 주사를 수행하여 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier: BBB)의 개방을 도왔다. 질환의 발병 시(면역화 후 9 내지 11일), MOG CAR 및 CAR Ctrl Treg를 i.v 주사하였다. 5일 후에, 마우스를 희생시키고, 배수 림프절(draining lymph node: dLN) 및 CNS를 채취하고 유세포분석에 의해 분석하여 세포의 활성화(CD69, LAP 및 CD71) 및 증식 (Ki67)을 평가하였다.
8. 마우스 EAE 모델에서의 마우스 CAR의 생체내 효능 분석
표준 프로토콜을 이용하여 공여자 마우스를 CFA/MOG 에멀션으로 면역화하였다. 각 마우스는 MOG 펩타이드 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(H37Ra)를 함유하는 총 100㎕ CFA 에멀션으로 꼬리 기저부 및 옆구리에 피하로 면역화하였다. 14일 후에, 마우스를 희생시키고, 비장 및 LN을 채취하고, 이어서, 분쇄하였다. MOG 특이적 병원성 세포를 향상시키기 위해 비장 세포를 분극화 칵테일과 함께 배양시켰다. 3일 후에, 이러한 세포를 채취하고, 암컷 CD45.1 C57BL/6 마우스에 주사하여 EAE(25×106개의 세포/마우스)를 유발하였다. 병원성 세포의 24시간 후에 본 개시내용의 마우스 CAR MOG Treg, CAR 대조군 Treg 또는 식염수를 i.v 주사하였다. 다음의 기준을 이용하는 EAE 점수화에 기반하여 질환 진행을 평가하였다: 0(정상), 1(부분적으로 사지 꼬리), 2(마비된 꼬리), 3(뒷다리 쇠약 또는 협응의 상실), 4(뒷다리 마비), 4.5(앞다리 쇠약을 수반한 뒷다리 마비) 및 5(빈사상태 또는 사망). 임상 점수 및 체중(BW)을 제6일 내지 제15일에 격일로 측정하였다. 편향된 결과를 피하기 위해, 이중맹검 연구의 부분으로서 EAE 점수화를 수행하였다.
15일 후에, 마우스를 희생시키고, CNS 세포를 채취하고 나서, 분쇄하였다. 37℃에서 30분 동안 콜라게나제 분해를 수행한 후에, CNS를 침윤시킨 면역 세포를 Percoll 구배로 단리시켰다. 이러한 세포를 MOG 펩타이드(10㎍/㎖)를 함유하는 완전 RPMI 배지에서 밤새 배양시켜 MOG 특이적 세포를 자극하였다. 16시간 후에, 상청액을 채취하였고, Brefeldin A를 배지에 첨가하여 사이토카인 분비를 중단시켰다. 이어서, 세포를 세포 염색 완충제에서 린스하고, Attune NxT에서 획득 전에 세포내 사이토카인에 대해 염색하였다.
결과
A. 인간 세포에 의한 경험
1. 세포 표면에서의 형질도입 효율 및 CAR 발현
GFP 양성 세포 발현의 백분율에 의해 형질도입 효율을 평가하였고, 재조합 단백질 L, 면역글로불린 카파 경쇄-결합 단백질을 이용하여 CAR 발현을 모니터링하였다. 비형질도입 세포(NT)에 비교하여 형질도입 효율의 백분율 및 세포표면에서 CAR을 발현시킨 형질도입 세포의 백분율에 대한 결과를 원 데이터의 예로서 도 3에 제공한다.
2. 새로운 scFv는 양호한 Treg 표현형 안정성을 강조하였다
일반적으로 조작된 T 세포에 의한 주된 문제는 특히 CAR의 높은 발현이 원치않는 항원-독립적 CAR 활성화와 연관된 것으로 나타났기 때문에 목적하는 표현형의 유지를 보장하는 것이다(Frigault, 2015). Treg 표현형이 확장 및 CAR 맞물림 동안 변경되는지의 여부를 확인하기 위해 Treg 동일성과 관련된 마커의 패널을 분석하였다. 본 명세서에서 Helios 및 FoxP3 발현뿐만 아니라 Treg 표현형과 관련된 다른 마커의 유지를 FoxP3 Treg 상에서 확인하였다(도 4). MOG CAR-Treg는 제9일에 확장 후 FOXP3 및 Helios의 높은 발현을 유지하였다.
3. New scFv-유래 CAR은 CAR-특이적 활성화를 유지한다
작제물 둘 다에 의해 활성화의 낮은 배경이 관찰되었고, 본 발명의 CAR-MOG는 MOG 비드에 의해 분명하게 활성화된다(도 5).
4. 새로운 scFV를 포함하는 MOG CAR은 효율적인 CAR-매개 억제 활성을 나타낸다
새로운 scFV를 보유하는 CAR-MOG 작제물의 경우, CAR 대조군에 비해 억제 활성의 CAR-특이적 촉발이 관찰되었다(도 6).
5. MOG CAR Treg는 마우스 또는 인간 MOG에 반응한 활성화를 나타낸다
인간 및 마우스 MOG에 의한 활성화 후에 MOG CAR-Treg에서 CD69 발현 수준을 분석함으로써, 본 발명의 scFv의 교차 활성을 입증하였다. 인간과 마우스 MOG 표적 둘 다에 반응한 동일한 활성화 곡선이 관찰되었다(도 12).
B. 마우스 세포에 의한 경험
1. 형질도입 효율
NGFR 양성 세포 발현 백분율에 따라 형질도입 효율을 평가하였다. 비형질도입 세포(NT)에 비교하여 형질도입 효율의 백분율에 대한 결과를 원 데이터의 예로서 도 7에 제공한다.
2. 새로운 scFv는 양호한 Treg 표현형을 강조하였다
Treg 표현형이 확장 및 CAR 맞물림 동안 변경되는지의 여부를 확인하기 위해 Treg 동일성과 관련된 마커의 패널(표 2)을 분석하였다. 여기서, 단리 후 제7일에 FoxP3의 유지를 Treg에 대해 확인하였다(도 8). MOG CAR-Treg는 확장 후 FOXP3의 높은 발현을 유지하였고, 세포의 60 내지 70%는 CD25+ FoxP3+이다.
3. New scFv-유래 CAR은 CAR-특이적 활성화를 유지한다
작제물 둘 다에 의해 활성화의 낮은 배경이 관찰되었고, MOG CAR은 MOG 비드에 의해 분명하게 활성화되었다(도 9).
도 11A는 유세포분석에 의한 초기 활성화 마커 CD69의 발현 수준에 의해 측정한 바와 같이 MOG-코팅 비드(검정 막대) 대 대조군 비드(백색 막대)에 의한 다수의 상이한 MOG-CAR(NGFR+ 세포)로 형질도입된 마우스 Treg의 시험관내 활성화 수준을 나타낸다. CAR 1은 도 9에서 사용되는 동일한 MOG CAR 작제물이고 본 발명의 예시적인 작제물이다. CAR 2 내지 6은 비교 MOG CAR 작제물이다.
점선은 비활성화된 참조 MOG-CAR(강성 신호전달)의 CD69 발현 역치를 나타낸다. 박스는 낮은 강성 신호전달 수준 및 표적 항원 MOG에 의한 높은 활성화 수준을 나타내는 2가지의 최상의 후보를 강조한다(최상의 신호 대 노이즈 비). 도 11A의 표는 활성화 후 MOG CAR Treg 상에서의 CD69 발현의 배수 증가를 나타낸다. HLA-A2 CAR을 분석에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 11B는 절단된 대조군 CAR로 형질도입된 CAR Treg의 활성화 수준(MOG ScFv 및 비-신호전달 엔도도메인)에 대한 5일 후 MOG CAR을 주사한 동물("짧은 EAE 모델")의 CNS에서의 활성화 마커 CD69, CD71, LAP 및 증식 마커 Ki67의 생체내 배수 증가를 나타낸다.
4. 마우스 CAR의 생체내 활성화 분석: 짧은 모델 - MOG CAR Treg는 CNS로 들어가고, 활성화되고 거기에서 증식된다.
마우스 MOG CAR Treg의 i.v 주사 6일 후에, NGFR+ 및 NGFR- Treg의 활성화 및 증식을 CNS 및 비장에서 유세포분석에 의해 분석하였다(도 10A 및 도 10B). CAR-MOG Treg(NGFR+ 세포)는 Ctrl Treg(NGFR- 세포)에 비해 CNS에서 더 활성화되었고, CNS에서의 증식에 대해, CAR-MOG Treg는 Ctrl Treg에 비해 Ki67의 더 높은 발현을 나타낸다(도 10A). 비장에 비해 CNS에서 CAR-MOG Treg의 활성화 및 증식을 보면, CAR-MOG Treg는 비장에서보다 CNS에서 더 높은 CD69(활성화) 및 Ki67(증식) 수준을 나타냈다(Fig. 10B).
5. 마우스 EAE 모델에서 본 개시내용의 MOG CAR Treg의 예시적인 생체내 효능
본 개시내용의 본 발명자들의 CAR MOG Treg 세포의 기능적 생체내 효능을 입증하기 위한 이런 예시적인 연구에서, 본 발명자들은 C57Bl6 마우스에서 입양 전달 EAE를 사용하였다. MOG에 의한 직접 유도에 대한 대안으로서, 이들 항원에 의해 면역화된 마우스로부터 시험관내 CNS 항원 활성화 림프구의 입양 전달에 의해 C57BL/6 마우스에서 EAE가 또한 유도될 수 있다. 도 14A 및 도 14B에 나타낸 바와 같이, 병원성 세포를 주사한 마우스는 중증의 마비 징후가 발생되고 있다. 병원성 세포 주사의 24시간 후에 본 개시내용의 CAR MOG Treg로 처리한 마우스는 식염수 또는 CAR 대조군(Ctrl) 그룹에 비해 더 낮은 임상 점수(도 14A) 및 질환 발생률의 지연(도 14B)을 나타낸다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 MOG CAR, 대조군 CAR 또는 식염수로 처리한 마우스로부터의 CNS 세포의 백분율을 MOG 펩타이드로 생체외 자극 후에 측정하였다. 마우스 희생 후에, CNS로부터의 세포를 밤새 MOG 펩타이드(10㎍/㎖)와 함께 인큐베이션시켰다. BFA의 16시간 후에 배지에 첨가하였고, 세포내 염색을 수행하였다. 오차 막대는 전체에서 15마리 마우스/그룹을 포함하는 2회의 독립적 실험으로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다. 이 예시적인 연구에서, 본 개시내용의 MOG CAR로 처리한 마우스로부터의 CNS 세포는 식염수 또는 CAR 대조군으로 처리한 마우스로부터 유래된 세포에 비해 MOG 펩타이드 인큐베이션 후 IFN-감마 양성 세포의 더 낮은 백분율을 나타냈다.
서열 표

Claims (36)

  1. 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein: MOG)-결합 단백질로서,
    (i) 서열번호 3 내지 5를 각각 포함하는 상보성-결정 영역(HCDR) 1 내지 3; 또는 서열번호 3 내지 5 중 하나와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 HCDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
    (ii) 서열번호 6 내지 8을 각각 포함하는 LCDR 1 내지 3; 또는 서열번호 6 내지 8 중 하나와 적어도 약 90%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 LCDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
    을 포함하는, 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질-결합 단백질.
  2. 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질(MOG)-결합 단백질로서,
    (i) 서열번호 3 내지 5를 각각 갖는 상보성-결정 영역(HCDR) 1 내지 3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
    (ii) 서열번호 6 내지 8을 각각 갖는 LCDR 1 내지 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
    을 포함하는, 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질-결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 VH는 서열번호 11 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
    상기 VL은 서열번호 9 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, MOG-결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VH는 서열번호 11을 포함하고, 그리고
    상기 VL은 서열번호 9를 포함하는, MOG-결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)인, MOG-결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 12 또는 이와 적어도 약 95% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)인, MOG-결합 단백질.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 12를 포함하는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)인, MOG-결합 단백질.
  8. 제5항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 51 또는 이와 적어도 약 95% 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)인, MOG-결합 단백질.
  9. 제5항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 51을 포함하는 단일-쇄 가변 단편(항-MOG scFv)인, MOG-결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 마우스, 사이노몰거스 및 인간 MOG에 결합할 수 있는, MOG-결합 단백질.
  11. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 MOG-결합 단백질을 포함하는 세포외 도메인;
    (ii) 막관통 도메인; 및
    (iii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은
    선택적으로 서열번호 15 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및/또는
    선택적으로 서열번호 16 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인
    을 포함하는, CAR.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 막관통 도메인은, 선택적으로 서열번호 14 또는 이와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된, CAR.
  14. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (i) 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 항-MOG scFv,
    (ii) 선택적으로 서열번호 13을 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 힌지 도메인,
    (iii) 선택적으로 서열번호 14를 포함하는 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인,
    (iv) 선택적으로 서열번호 15를 포함하는 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및 선택적으로 서열번호 16을 포함하는 인간 CD3 제타 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인,
    (v) 선택적으로 태그로서, 선택적으로 서열번호 2를 포함하는, 상기 태그 및
    (vi) 선택적으로 리더 서열로서, 선택적으로 서열번호 1을 포함하는, 상기 리더 서열
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  15. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (i) 항-MOG scFv를 포함하는 세포외 도메인으로서, 선택적으로 서열번호 12를 포함하는, 상기 세포외 도메인;
    (ii) 인간 CD8로부터 유래된 힌지 도메인으로서, 선택적으로 서열번호 13을 포함하는, 상기 힌지 도메인,
    (iii) 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인으로서, 선택적으로 서열번호 14를 포함하는, 상기 막관통 도메인; 및
    (iv) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인으로서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및 인간 CD3 제타 도메인을 포함하고, 상기 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인은 선택적으로 서열번호 15를 포함하고, 상기 인간 CD3 제타 도메인은 선택적으로 서열번호 16을 포함하는, 상기 세포질 도메인;
    (v) 선택적으로 태그로서, 선택적으로 서열번호 2를 포함하는, 상기 태그, 및
    (vi) 선택적으로 리더 서열로서, 선택적으로 서열번호 1을 포함하는, 상기 리더 서열
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  16. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (i) 항-MOG scFv를 포함하는 세포외 도메인으로서, 선택적으로 서열번호 51을 포함하는 상기 세포외 도메인;
    (ii) 인간 CD8로부터 유래된 힌지 도메인으로서, 선택적으로 서열번호 13을 포함하는, 상기 힌지 도메인,
    (iii) 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인으로서, 선택적으로 서열번호 14를 포함하는, 상기 막관통 도메인; 및
    (iv) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인으로서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인 및 인간 CD3 제타 도메인을 포함하고, 상기 인간 CD28 공자극 신호전달 도메인은 선택적으로 서열번호 15를 포함하고, 상기 인간 CD3 제타 도메인은 선택적으로 서열번호 16을 포함하는, 상기 세포질 도메인;
    (v) 선택적으로 태그로서, 선택적으로 서열번호 2를 포함하는, 상기 태그, 및
    (vi) 선택적으로 리더 서열로서, 선택적으로 서열번호 1을 포함하는, 상기 리더 서열
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  17. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인 또는 항-MOG scFv는 서열번호 12의 서열을 포함하는, CAR.
  18. 제11항 내지 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인 또는 항-MOG scFv는 서열번호 51의 서열을 포함하는, CAR.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 MOG-결합 단백질 또는 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 암호화하는 핵산 분자.
  20. 제19항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  21. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 발현시키거나, 제19항에 따른 핵산 분자 또는 제20항의 벡터를 포함하는 조절 면역 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조절 면역 세포는 조절 T 세포인, 조절 면역 세포.
  23. 단리된 인간 T 세포로서, 상기 T 세포는 제19항에 따른 핵산 분자 또는 제20항의 벡터를 포함하는, 단리된 인간 T 세포.
  24. 조절 면역 세포의 집단으로서, 상기 집단은 제21항 또는 제22항에 규정된 바와 같은 복수의 세포를 포함하는, 조절 면역 세포의 집단.
  25. 제21항 또는 제22항에 따른 조절 면역 세포 또는 제24항에 따른 조절 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물.
  26. 의약으로서 사용하기 위한, 제21항 또는 제22항에 따른 조절 면역 세포, 제24항에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 제25항에 따른 조성물.
  27. 탈수초성 질환/장애, 특히 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 데 사용하기 위한, 제21항 또는 제22항에 따른 조절 면역 세포, 제24항에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 제25항에 따른 조성물.
  28. MOG-관련 질환/장애(MOGAD), 특히 MOG-관련 염증성 질환/장애, 더 구체적으로는 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것을 치료하는 데 사용하기 위한, 제21항 또는 제22항에 따른 조절 면역 세포, 제24항에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 제25항에 따른 조성물.
  29. 염증성 CNS 질환/장애를 치료하는 데 사용하기 위한 제21항 또는 제22항에 따른 조절 면역 세포, 제24항에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 제25항에 따른 조성물로서, 바람직하게는 상기 염증성 CNS 질환/장애는 다발성 경화증이고, 더 바람직하게는 상기 다발성 경화증은
    (i) 재발-완화형 MS(RRMS),
    (ii) 원발성-진행성 MS(PPMS), 또는
    (iii) 이차-진행성 MS(SPMS)
    인, 조절 면역세포, 조절 면역 세포의 집단 또는 조성물.
  30. 자가-항원 및/또는 자가항체에 의해 야기되거나 악화되는 탈수초성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 제21항 또는 제22항에 따른 조절 면역 세포, 제24항에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 제25항에 따른 조성물.
  31. CNS의 탈수초화를 포함하는 염증 및/또는 손상을 감소시키거나 또는 방지하는 데 사용하는 데 사용하기 위한, 제21항 또는 제22항에 따른 조절 면역 세포, 제24항에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 제25항에 따른 조성물.
  32. 장애 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체의 장애 또는 질환의 치료 방법으로서, 제21항 또는 제22항에 따른 조절 면역 세포, 제24항에 따른 조절 면역 세포의 집단 또는 제25항에 따른 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 MOG-관련 질환/장애(MOGAD), 특히 MOG-관련 염증성 질환/장애, 더 구체적으로는 자가항체 또는 자기-반응성 면역 세포의 존재와 관련된 것인, 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 자가-항원 및/또는 자가항체에 의해 야기되거나 악화되는 탈수초성 장애인, 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 방법은 CNS의 탈수초화를 포함하는 염증 및/또는 손상을 감소시키거나 방지하기 위한 것인, 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 방법은 염증성 CNS 질환/장애를 치료하기 위한 것이되, 바람직하게는 상기 염증성 CNS 질환/장애는 다발성 경화증이고, 더 바람직하게는 상기 다발성 경화증은
    (i) 재발-완화형 MS(RRMS),
    (ii) 원발성-진행성 MS(PPMS), 또는
    (iii) 이차-진행성 MS(SPMS)
    인, 방법.
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