KR20240051316A - 마이크로 유체 분석 장치 - Google Patents

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KR20240051316A
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토마스 헨리 아이삭
페드로 쿤하
에오인 셰리단
데이비드 러브
레베카 팔머
더글러스 제이. 켈리
가레스 포드
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라이트캐스트 디스커버리 엘티디
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Abstract

본 발명은, 분석물이 부착되는 부착 부위를 포함하는 제1영역; 제1유체 매질이 부착 부위 위로 흐르도록 함으로써 핵산이 점진적으로 그의 구성 뉴클레오시드(nucleoside) 트리포스페이트(triphosphates)로 가(加)파이로인산분해(pyrophosphorolysed)되도록 하는 제1경로; 부착 부위로부터 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제거하기 위한 제2경로; 및 제2경로 내에 수-불혼화성 담체 내에 수성 마이크로 액적으로 구성된 제2매질을 생성을 하기 위한 수단; 다음에 기재된 요소로 구성된 광학 매개 전기 습윤을 사용하여 마이크로 액적을 조작하기위한 마이크로 액적 조작 영역을 포함하는 핵산 분석물 조사 장치에 관한 것이다. 마이크로 액적 조작 영역은, 투명한 제1기판, 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 투명한 제1전도체층, 전도체층 상에, 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 갖는 400 내지 1000 nm 범위의 파장 범위를 갖는 전자기장 방사에 의해 활성화된 광활성층 및 전도체층 상에, 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 제1유전체층을 포함하는 제1복합벽; 제2기판, 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 제2전도체층 및 선택적으로, 전도체층 상에, 25 내지 50 nm 범위의 두께를 갖는 제2유전체층을 포함하는 제2복합벽을 포함하되, 제1 및 제2유전체층의 노출된 표면은 10 μm 미만으로 이격되어 마이크로 액적을 수용하는 마이크로 유동 공간을 형성하도록 배치되고, 제1 및 제2전도체층을 연결하는 제1 및 제2복합벽에 걸쳐 전압을 제공하는 A/C소스; 제1유전체층의 표면 상에 대응하는 임시 제1전기 습윤 지점을 유도하기 위해 광활성층 상에 충돌하도록 구성된 광활성화(photoexcitable) 층의 밴드 갭보다 높은 에너지를 갖는 적어도 하나의 제1전자기장 방사 소스; 임시 전기 습윤 지점의 배치를 변화시키기 위해 광활성층 상의 전자기장 방사의 충돌 지점을 조작하여 마이크로 액적이 이동될 수 있는 하나 이상의 제1전기 습윤 경로를 생성하는 조작 수단; 마이크로 액적 조작 영역의 하류에 배치되거나 그와 일체인 검출 영역 및 검출 영역 내의 마이크로 액적에 충동하도록 구성된 제2전자기장 방사 소스 및 그 영역으로부터 방출되는 형광 또는 라만 산란(Raman-scattering)을 검출하기 위한 검출기를 포함하는 형광 또는 라만 산란 검출 시스템을 포함한다.

Description

마이크로 유체 분석 장치{Microfluidic Analytical Device}
본 발명은 핵산 분자를 조사하기 위한 장치; 특히 천연 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 시퀀싱(sequencing)하기 위한 장치에 관한 것이다.
이 부분에 기술된 내용은 단순히 본 실시예에 대한 배경 정보를 제공할 뿐 종래기술을 구성하는 것은 아니다.
본 발명자들의 이전 출원 WO2014/053853, WO2014/053854, WO2014/167323, WO2014/167324 및 WO2014/111723에서, 본 발명자들은 단일 뉴클레오티드 (nucleotides)의 정렬된 스트림(stream), 바람직하게는 단일 뉴클레오티드 트리포스페이트(triphosphates)의 스트림이며 이들 각각은 마이크로 액적 스트림 내의 상응하는 마이크로 액적에 하나씩 포획될 수 있는 스트림을 생성하기 위해 폴리 뉴클레이티드 분석물(analyte)을 점진적으로 분해(digest)하는 것을 포함하는 새로운 시퀀싱(sequencing) 방법을 기술했다. 그 후(스트림 생성 후), 각각의 액적은 화학적으로 및/또는 효소적(enzymatically)으로 조작되어 그것이 원래 함유한 특정 단일 뉴클레오티드를 드러낼 수 있다. 일 실시예에서, 이들 화학적 및/또는 효소적 조작은 분석물을 구성하는 단일 뉴클레오티드 유형 중 하나를 선택적으로 포획할 수 있도록 조정된 하나 이상의 2-성분 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브(probe) 형태의 사용을 포함하는 방법을 포함한다. 전형적으로, 각각의 이러한 프로브 형태에서, 두 개의 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나는 특징적인 형광단(fluophores)을 포함하고, 프로브의 미사용 상태에서 프로브에 근접한 소광자(quenchers)의 존재에 의해 또는 자가-소광(self-quenching)에 의해 이들 형광단의 형광 능력은 꺼진 상태로 유지된다. 사용시에는, 프로브가 상응하는 단일 뉴클레오티드를 포획했을 때, 프로브는 후속 외부핵산분해(exonucleolysis) 또는 내부핵산분해(endonucleolysis)에 민감하게 됨으로써 소광자로부터 형광단 및/또는 형광단 각각을 유리(liberating)시켜 자유롭게 형광을 낼 수 있게 한다. 이와 같은 방법으로 각각의 액적에 존재하는 원래의 단일 뉴클레오티드는 분광 수단에 의해 간접적으로 추론될 수 있다.
시퀀싱 장치를 설계할 때는, 예를 들어 수천 개의 마이크로 액적을 조작하여 다른 것들과 합쳐질 수 있는 위치 및/또는 형광의 존재 또는 부재에 의해 내용물을 분석할 수 있는 위치로 안정적으로 전달할 수 있어야 한다.
이를 수행하는 한 가지 가능한 방법은 기판 상에 마이크로 액적이 전기 습윤 힘에 의해 추진될 수 있는 경로를 확립하는 것이다. 비교적 큰 액적을 조작하기 위한 장치는 종래 기술로서 예를 들어 US6565727, US20130233425 및 US20150027889에 기술되었다. 일반적으로, 예를 들어 비혼화성 담체 유체의 존재 하에서 액적이 카트리지의 대향하는 두 벽 또는 마이크로 유동 튜브에 의해 형성된 마이크로 유동 채널을 통해 이동하게 함으로써 달성된다. 카트리지 또는 튜브의 벽에는 유전체층으로 피복된 전극이 있으며, 이들 각각은 층의 전기 습윤 전계 특성을 수정하기 위해 간격을 가지며 빠르게 온/오프 될 수 있는 A/C 바이어싱(biasing) 회로에 연결된다. 이는 주어진 경로를 따라 액적을 조종하는데 사용될 수 있는 국부적이고 방향성을 가지는 모세관 힘을 발생시킨다.
이러한 접근법의 변형으로서 광학-매개 전기 습윤에 기초한 방법이 예를 들어 US20030224528, US20150298125 및 US20160158748에 개시되어 있다. 특히, 이들 3개 특허출원 중 첫번째는 제1 및 제2벽에 의해 정의되는 마이크로 유동 공동을 포함하고, 제1벽은 복합 구조이며 기판, 광전도체층 및 절연(유전체)층으로 구성되는, 다양한 마이크로 유체 장치를 개시한다. 광전도체층과 절연층 사이에는 서로 전기적으로 격리되고, 광활성층에 연결되며, 절연층 상에 대응하는 개별적인 액적 수용 위치를 생성하도록 기능하는 전도성 셀 어레이가 배치된다. 이들 위치에서, 액적의 표면 장력 특성은 전기 습윤 전계에 의해 변경될 수 있다. 이어서, 전도성 셀은 광전도체층 상에 충돌하는 광에 의해 스위칭 될 수 있다. 이 접근법은 그 유용성이 전극의 배열에 의해 여전히 어느 정도 제한되어 있지만, 스위칭이 훨씬 쉽고 빠르다는 장점이 있다. 또한, 액적의 이동 속도 및 실제 액적 경로가 변경될 수 있는 정도에 대한 제한이 있다.
이러한 후자의 이중벽 실시예는 캘리포니아 버클리 대학의 Pei의 학위논문 UCB/EECS-2015-119에 소개되었다. 여기에서, 패턴화 되지 않은 전기 바이어스 된 비정질 실리콘 상에 광 패턴을 이용하여 유전체층 상에 증착된 테프론 AF의 표면에 걸쳐 광학 전기 습윤을 사용함으로써 100 내지 500 μm 크기의 비교적 큰 액적을 조작할 수 있는 셀이 기술되어 있다. 그러나, 예시된 방식에서 유전체층은 얇고(100 nm), 광활성층을 갖는 벽 상에만 배치된다.
이와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체 분석 장치는, 핵산 분석물 조사 장치로서, 분석물이 부착되는 부착 부위를 포함하는 제1영역; 제1유체 매질이 부착 부위 위로 흐르도록 함으로써 핵산이 점진적으로 그의 구성 뉴클레오시드(nucleoside) 트리포스페이트(triphosphates)로 가(加)파이로인산분해(pyrophosphorolysed)되도록 하는 제1경로; 부착 부위로부터 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제거하기 위한 제2경로; 및 제2경로 내에 수-불혼화성 담체 내에 수성 마이크로 액적으로 구성된 제2매질을 생성을 하기 위한 수단; 다음에 기재된 요소로 구성된 광학 매개 전기 습윤을 사용하여 마이크로 액적을 조작하기위한 마이크로 액적 조작 영역: 제1복합벽으로서, 투명한 제1기판; 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 투명한 제1전도체층; 전도체층 상에, 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 가지고, 400 내지 1000 nm 범위의 파장 범위를 갖는 전자기장 방사에 의해 활성화되는 광활성층; 및 전도체층 상에, 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 제1유전체층을 포함하는 제1복합벽, 제2복합벽으로서, 제2기판; 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 제2전도체층; 및 선택적으로, 전도체층 상에, 25 내지 50 nm 범위의 두께를 갖는 제2유전체층을 포함하되, 제1 및 제2유전체층의 노출된 표면은 10 μm 미만으로 이격되어 마이크로 액적을 수용하는 마이크로 유동 공간을 형성하도록 배치되고, 제1 및 제2전도체층을 연결하는 제1 및 제2복합벽에 걸쳐 전압을 제공하는 A/C소스; 제1유전체층의 표면 상에 대응하는 임시 제1전기 습윤 지점을 유도(induce)하기 위해 광활성층 상에 충돌하도록 구성된 광활성화(photoexcitable) 층의 밴드 갭보다 높은 에너지를 갖는 적어도 하나의 제1전자기장 방사 소스; 임시 전기 습윤 지점의 배치를 변화시키기 위해 광활성층 상의 전자기장 방사의 충돌 지점을 조작하여 마이크로 액적이 이동될 수 있는 하나 이상의 제1전기 습윤 경로를 생성하는 조작 수단; 마이크로 액적 조작 영역의 하류에 배치되거나 그와 일체인 검출 영역 및 검출 영역 내의 마이크로 액적에 충동하도록 구성된 제2전자기장 방사 소스 및 그 영역으로부터 방출되는 형광 또는 라만 산란(Raman-scattering)을 검출하기 위한 검출기를 포함하는 형광 또는 라만 산란 검출 시스템을 포함하는 것을 특징으로 한다.
도 1은 투명한 플라스틱으로 제조된 단일 칩에 통합된 마이크로 액적 제조 영역(1) 및 마이크로 액적 조작 영역(3)을 포함하는 마이크로 유동 칩의 평면도를 나타낸다.
도 2는 다양한 마이크로 액적이 조작되는 방법을 도시한 (3)의 부분 단면도를 나타낸다.
도 3은 (21b) 상의 위치(25)에 위치한 접촉 정도를 한정하는 점선 윤곽선(7')을 갖는 전형적인 마이크로 액적(여기서 7b)을 위에서 내려다본 평면도를 도시한다.
이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
또한, 본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 '포함', '구비'한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 '…부', '모듈' 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어나 소프트웨어 또는 하드웨어 및 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.
본 발명자들은 신뢰할 수 있는 단일 뉴클레오티드 검출 방법의 요구 사항에 따라 수천 개의 마이크로 액적을 동시에 조작할 수 있는 핵산 조사 장치(nucleic acid investigative device)를 개발했다. 이는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 쉽게 재구성될 수 있어, 예를 들어, 사용자가 최적의 정확도, 처리량 또는 특정 후성 유전적(epigenetic) 변형을 탐지하도록 용이하게 적응시킬 수 있고, 따라서 매우 가변성이 높다. 따라서, 본 발명에 따르면, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분석물 조사 장치가 제공된다:
* 분석물이 부착되는 부착 부위를 포함하는 제1영역; 제1유체 매질이 부착 부위 위로 흐르도록 함으로써 핵산이 점진적으로 그의 구성 뉴클레오시드(nucleoside) 트리포스페이트(triphosphates)로 가(加)파이로인산분해(pyrophosphorolysed)되도록 하는 제1경로; 부착 부위로부터 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제거하기 위한 제2경로; 및 제2경로 내에 수-불혼화성 담체 내에 수성 마이크로 액적으로 구성된 제2매질을 생성을 하기 위한 수단;
* 다음에 기재된 요소로 구성된 광학 매개 전기 습윤을 사용하여 마이크로 액적을 조작하기위한 마이크로 액적 조작 영역:
* 제1복합벽으로서,
* 투명한 제1기판;
* 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 투명한 제1전도체층;
* 전도체층 상에, 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 갖는 400 내지 1000 nm 범위의 파장 범위를 갖는 전자기장 방사에 의해 활성화된 광활성층; 및
* 전도체층 상에, 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 제1유전체층;
을 포함하는 제1복합벽,
* 제2복합벽으로서,
* 제2기판;
* 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 제2전도체층; 및
* 선택적으로, 전도체층 상에, 25 내지 50 nm 범위의 두께를 갖는 제2유전체층;
을 포함하되,
* 제1 및 제2유전체층의 노출된 표면은 10 μm 미만으로 이격되어 마이크로 액적을 수용하는 마이크로 유동 공간을 형성하도록 배치되는 제2복합벽;
* 제1 및 제2전도체층을 연결하는 제1 및 제2복합벽에 걸쳐 전압을 제공하는 A/C소스;
* 제1유전체층의 표면 상에 대응하는 임시 제1전기 습윤 지점을 유도(induce)하기 위해 광활성층 상에 충돌하도록 구성된 광활성화(photoexcitable) 층의 밴드 갭보다 높은 에너지를 갖는 적어도 하나의 제1전자기장 방사 소스;
* 임시 전기 습윤 지점의 배치를 변화시키기 위해 광활성층 상의 전자기장 방사의 충돌 지점을 조작하여 마이크로 액적이 이동될 수 있는 하나 이상의 제1전기 습윤 경로를 생성하는 조작 수단;
* 마이크로 액적 조작 영역의 하류에 배치되거나 그와 일체인 검출 영역 및
* 검출 영역 내의 마이크로 액적에 충동하도록 구성된 제2전자기장 방사 소스 및 그 영역으로부터 방출되는 형광 또는 라만 산란(Raman-scattering)을 검출하기 위한 검출기를 포함하는 형광 또는 라만 산란 검출 시스템
을 포함하는 핵산 분석물 조사 장치.
본 발명의 장치는 핵산 분석물의 구성 뉴클레오티드를 분석하는데 특히 적합하며, 일 실시예에서는 DNA 또는 RNA를 시퀀싱하기 위한 장치이다. 핵산 분석물 DNA에 대한 적용에서, 이는 적절하게는 이중 가닥 폴리 뉴클레오티드이고, 원칙적으로 무제한 일 수 있는 뉴클레오티드 사슬 길이를 가질 수 있으며; 예를 들어 게놈(genome)의 단편에서 발견되는 수백만 개의 뉴클레오티드 염기쌍을 포함하는 것일 수 있다. 일 실시예에서, 분석물은 따라서 적어도 50개, 바람직하게는 150개 이상의 뉴클레오티드 염기쌍 길이일 것이다; 적합하게는 500개 초과, 1000개 초과, 일부 경우에는 5000개가 넘는 뉴클레오티드 염기쌍 길이일 것이다. 일 실시예에서, 분석물은 천연 기원의 DNA(예를 들어, 식물, 동물, 박테리아 또는 바이러스로부터 유래된 유전 물질)이지만, 이 방법은 부분적으로 또는 전체적으로 합성된 DNA 또는 자연에서 일반적으로 접할 수 없는 뉴클레오티드 염기로 구성된 뉴클레오티드로 전체 또는 일부가 구성된 전적으로 다른 핵산, 즉, 아데닌(adenine), 티민(thymine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine) 및 우라실(uracil) 이외의 핵 염기를 갖는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 핵 염기의 예에는 4-아세틸시티딘(4-acetylcytidine), 5-(카르복시히드록실메틸(carboxyhydroxylmethyl))우리딘(uridine), 2-O- 메틸시티딘(methylcytidine), 5-카르복시메틸아미노메틸(carboxymethylaminomethyl)-2-티오우리딘(thiouridine), 5-카르복시메틸아미노-메틸우리딘(carboxymethylamino-methyluridine), 디히드로우리딘(dihydrouridine), 2-O- 메틸슈도우리딘(methylpseudouridine), 2-O- 메틸구아노신(methylguanosine), 이노신(inosine), N6-이소펜틸라데노신(isopentyladenosine), 1-메틸아데노신(methyladenosine), 1-메틸슈도우리딘(methylpseudouridine), 1-메틸구아노신(methylguanosine), 1-메틸이노신(methylinosine), 2,2-디메틸구아노신(dimethylguanosine), 2-메틸아데노신(methyladenosine), 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신(methyladenosine), 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘(methylaminomethyluridine), 5-메톡시아미노메틸(methoxyaminomethyl)-2-티오우리딘(thiouridine), 5-메톡시우리딘(methoxyuridine), 5-메톡시카르보닐메틸(methoxycarbonylmethyl)-2-티오우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘(methoxycarbonylmethyluridine), 2-메틸티오(methylthio)-N6-이소펜테닐아데노신(isopentenyladenosine), 우리딘-5-옥시아세트산(oxyacetic acid)-메틸에스테르(methylester), 우리딘-5-옥시아세트산, 위부톡소신(wybutoxosine), 위부토신(wybutosine), 슈도우리딘(pseudouridine), 큐오신(queuosine), 2-티오시티딘(thiocytidine), 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, 2-O-메틸-5-메틸우리딘 및 2-O-메틸우리딘을 포함한다. 분석물이 RNA 인 경우 유사한 고려 사항이 적용된다.
장치의 제1영역에서, 분석물은 점진적으로 가(加)파이로인산분해되어 3-5' 방향으로 단일 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 스트림을 생성하며, 이의 순서는 분석물의 시퀀스 순서와 일치한다. 가(加)파이로인산분해 자체는 일반적으로 폴리머라제(polymerase)와 같은 효소를 포함하는 반응 매질의 존재 하에서 20 내지 90 ℃의 온도에서 수행된다. 적합하게는, 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트가 수성인 유동성 유체 매질에 의해 입자 주위의 가(加)파이로인산분해 영역으로부터 연속적으로 제거되도록 수행된다. 일 실시예에서, 이 매질은 완충되고(buffered) 또한 가(加)파이로인산분해 반응(폴리머라제, 파이로인산 음이온(pyrophosphate anion), 마그네슘 양이온 등)을 유지하는데 필요한 다른 성분을 함유한다. 다른 실시예에서, 매질은 (a) 본 발명자들의 이전 특허 출원에서 특정된 프로브 유형 (또는 동등한 기능을 갖는 프로브); (b) 프로브가 관련된 단일 뉴클레오사이드 트리포스페이트(예를 들어, 폴리머라제 및/또는 리가제(ligase))에 결합하여 이를 포획하게 하는 데 필요한 다양한 화학물질 및 효소 및 (c) 사용된 프로브의 후속적인 외부핵산분해가 일어나도록 하는 데 필요한 효소를 추가로 함유한다. 일 실시예에서, 이들 성분의 일부 또는 전부는 소정의 다른 지점(들) 또는 영역(들)에서 흐르는 수성 매질 또는 그곳에서 형성되는 마이크로 액적 내로 함께 또는 단계적으로 도입된다. 예를 들어, 인젝터를 사용한 주입 또는 마이크로 액적의 결합(coalescence)에 의해 이들 성분 중 일부 또는 전부를 마이크로 액적에 직접 후속적으로 도입할 수 있다.
바람직하게는, 장치는 가(加)파이로인산분해 속도가 가능한 한 빠르게 동작하도록 설계되고, 일 실시예에서 이 속도는 초당 1 내지 50개의 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 범위이다. 폴리 뉴클레오티드의 점진적인 분해에 적용되는 가(加)파이로인산분해 반응에 대한 추가 정보는 예를 들어 J. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028에서 찾을 수 있다.
장치의 제1 영역은 부분적으로 분석물에 결합하도록 구성된 부착 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다. 일 실시예에서, 이 부위는 2개의 상이한 표면 영역을 갖는 입자에 일시적으로 결합하도록 구성된다. 적합하게는, 이는 분석물의 분자를 보유하는 상응하는 입자에 해제 가능하게 부착되도록, 예를 들어 화학적으로 변형된 금속 코팅을 통해, 변형된 제1영역 내에 위치하는 표면을 포함한다. 일 실시예에서, 이 입자는 비드; 예를 들어, 유리, 실리카, 알루미나, 금속 또는 비분해성 중합체와 같은 불활성 물질로 만들어진 마이크로 비드를 포함한다. 다른 실시예에서, 입자는 자기적으로 조작될 수 있게 하는 상자성(paramagnetic) 물질의 코어를 갖는다.
입자 상의 2개의 상이한 표면 영역은 부착 부위 및 분석물의 상보 부위에 각각 결합하도록 구성된다. 일 실시예에서, 이들 영역 중 제1영역은 화학적으로 변형된 금속 코팅; 예를 들어, 금, 은, 구리 또는 다른 금속의 기능화 된 코팅을 포함한다. 다른 실시예에서, 이들 영역 중 제2영역은 분석물 분자에 물리적으로 또는 화학적으로 결합하도록 특별히 구성된 입자 상의 하나 이상의 반응성 부위를 포함한다.
입자 및 부착 부위에 반응성 부위를 생성할 수 있는 방법은 여러 가지가 있다. 예를 들어, 입자상의 제1영역의 경우, 금속 증착, 원자 층 증착, 플라즈마 증착 등과 같은 공지된 방법을 사용하여 입자를 금속으로 먼저 코팅함으로써 제조될 수 있다. 그 후, 금속 표면은 부착 부위의 상보적인 제2부분(moieties)에 가역적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 제1부분(moieties)을 도입하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일 실시예에서, 이들 제1 및 제2부분의 쌍은 주변 온도(ambient temperatures) 또는 주변 온도 근방에서 그들 간에 만들어진 결합이 가역적으로 만들어질 수 있고 분리될 수 있도록 선택된다. 이와 같은 방법으로, 비드는 부착 부위에 부착될 수 있고, 분석물은 가(加)파이로인산분해에 의해 소화된 후 비드가 기판으로부터 분리되어 후자가 다른 새로운 비드를 수용할 수 있게 한다. 일 실시예에서, 이들 제1 및 제2부분의 쌍은 예를 들어 상보적인 비오틴 부분(biotin moieties)과 함께 아비딘(avidin) 또는 스트랩타비딘(streptavidin) 부분(moieties)을 사용함으로써 가(加)파이로인산분해 조건 하에서 안정한 단백질 복합체의 형성을 야기할 수 있다. 다른 한편으로, 이들 쌍은 불안정한 화학 결합을 생성할 수 있다; 예를 들어 폴리히스티딘/킬레이트(polyhistidine/chelated) 금속 이온 쌍에서 (낮은 pH에서 또는 이미다졸(imidazole) 또는 강한 금속 킬레이터(chelator)의 존재 하에서 결합이 끊어짐); 보론산(boronic acid)/적합한 탄수화물 쌍(낮은 pH에서 결합이 끊어짐) 또는 말레이미도/셀레놀(maleimido/selenol) 쌍(메타-클로로퍼옥시벤조산(chloroperoxybenzoic acid)을 사용하여 결합이 끊어짐). 이러한 경우, 입자는 제1영역을 통해 흐르는 수성 매질의 pH 또는 조성을 개질함으로써 후속적으로 분리될 수 있다. 따라서, 장치의 일 실시예의 경우, 제1영역은 제1영역으로부터 입자를 도입하고 제거하기 위한 수단 또는 입자 분리 수단을 도입하고 제거하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 다른 경우에, 입자는 분리되면 장치의 나머지 부분을 통과하는 자체 마이크로 액적에 현수된(suspended) 부착 부위로부터 제거된다. 이러한 접근법이 사용되는 경우, 일 실시예에서, 입자는 가(加)파이로인산분해가 완료된 시점을 사용자가 검출할 수 있게 하는 고유한 형광 또는 라만 산란 마커를 포함할 것이다.
바람직한 일 실시예에서, 전술한 한 쌍의 부분(moieties)은 복수의 폴리히스티딘(polyhistidine) 잔기(바람직하게는 6보다 큰)를 포함하는 폴리히스티딘 부분 및 예를 들어 코발트, 구리 또는 니켈과 같은 전이 금속의 이미노디아세테이트(IDA: iminodiacetate) 염 유도체 또는 니트로트리아세테이트(NTA: nitrotriacetate)로부터 선택되는 킬레이터(chelator) 부분을 포함한다. 이들 제1 및 제2부분은 각각의 방식으로 입자 및 부착 부위에 배치될 수 있음을 이해할 것이다.
마찬가지로, 입자의 제2영역의 경우, 분석물-반응성 부위를 생성할 수 있는 많은 방법이 있다. 따라서, 일 실시예에서, 입자의 코팅되지 않은 표면은 예를 들어 실리카, 알루미나 또는 유리 비드의 경우에 에폭시실란(epoxysilane), 아미노하이드로카르빌실란(aminohydrocarbylsilane) 또는 머캅토실란(mercaptosilane)와 같은 기능성 작용제(agent)로 프라이밍(priming)되어 분석물이 부착될 수 있는 화학적으로 반응성인 부위를 생성할 수 있다. 그 후, 이들 반응성 부위는, 예를 들어 일 실시예에서는 아민(amine), 숙시닐(succinyl) 또는 티올(thiol) 기(group)와 같은, 말단 프라이머-반응성 기를 포함하도록 상응하게 변형된 분석물의 유도체로 처리될 수 있다. 다른 실시예에서, 화학적 부착은 어댑터 올리고뉴클레오티드(adaptor oligonucleotides)에 대한 결찰 또는 전술한 단백질 복합체의 유형을 통해 일어날 수 있다.
또 다른 실시예에서, 이렇게 프라이밍 된 입자는 단 하나의 분석물의 분자만이 부착될 수 있는 단 하나의 분석물-반응성 부위를 갖는 제2영역을 포함할 것이다. 이는 분석물이 작은 폴리뉴클레오티드 단편인 경우 중요할 수 있는데, 그렇지 않으면 준비 단계에서 다수의 분자가 부착되는 바람직하지 않은 경향이 있기 때문이다. 폴리뉴클레오티드 단편이 큰 경우에는 입체 효과(steric effects)가 그러한 결과가 완화되도록 작용할 것이 때문에 그러한 우려는 감소한다. 적합하게는, 입자는 0.5 내지 5 미크론(μm) 범위의 최대 직경을 가질 것이다.
바람직한 일 실시예에서, 입자는 구형 비드이고 제1 및 제2영역은 표면 상에서 서로 인접하는 반구형 영역을 포함한다. 일 실시예에서, 입자는 적합하게는 자기 코어(magnetic core)를 갖는 비드이고; 예를 들어 Dynabeads®라는 이름으로 판매되는 제품이다. 비드가 자기 코어를 갖는 일 실시예의 경우, 시퀀싱 장치의 근처에 배치된 영구 자석의 전자석으로부터 유도된 자기장을 사용하여 분해 부위로부터 부착 및 탈착 될 수 있다.
제1영역은 부착 부위를 포함하는 구조를 포함하는 마이크로 유동 치수의 챔버이거나, 다른 실시예에서는 내부 표면이 부착 부위로 부분적으로 코팅된 마이크로 유동 튜브를 포함한다. 일 실시예에서, 부착 부위는 입자가 밀착될 수 있는 안착부를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 입자는 표면-결합 또는 자기적(magnetically)으로 원하는 위치에 배치되고 유지될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 입자는 예를 들어 강자성 코어 또는 표면을 가질 수 있으며, 전자석을 근접하여 적용함으로써 부착 부위로 안내될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 입자는 종래의 또는 광학 매개 전기 습윤 장치(EWOD) 기술을 사용하여 모세관 힘을 적용함으로써 부착 부위로 배치 및 부착 부위로부터 제거된다. 따라서, 일 실시예에서, 제1영역은 필요에 따라 이러한 목적을 위해 활성화될 수 있는 챔버 또는 튜브 내에 유전체 코팅 전극 또는 광활성 요소(영구적이거나 임시일 수 있음)를 더 포함한다.
일 실시예에서, 장치는 비드가 준비되는 제1영역의 상류에 위치한 준비 영역 및 제2전기 습윤 경로에 의해 비드를 준비 영역으로부터 부착 부위로 이동시키기 위한 수단을 추가로 포함한다.
가(加)파이로인산분해 후, 공간적으로 그리고 시간적으로 서로 분리되고 분석물의 뉴클레오티드 시퀀스에 상응하는 순서로 배열된 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트를 함유하는, 예를 들어 제2수성 매질인, 유동하는 제2유체 매질이 부착 부위 주위에서 제거된다. 일 실시예에서, 가(加)파이로인산분해 분리는 후속적으로 액적화되는 제1유체 매질의 연속 스트림에서 발생하여, 이전에 제2유체 매질에 있던 뉴클레오시드 트리포스페이트 분자의 캡슐화를 야기한다.
또 다른 실시예에서, 가(加)파이로인산분해 분리는 비혼화성인 담체 매질에 현탁된 마이크로 액적이 표적 비드가 그 표면에 걸쳐 이동될 때 일시적으로 습윤 및 탈습윤(de-wet) 상태가 되는 액적화된 제1유체 매질에서 일시적인 방식으로 일어난다. 따라서, 액적이 비드와 접촉할 때 뉴클레오시드 트리포스페이트 분자가 DNA 가닥으로부터 방출되면, 마이크로 액적이 비드로부터 탈습윤 될 때, 이는 즉시 캡슐화되고 이어서 제2유체 매질에서 하류로 제거될 것이다.
분석물에서 수행되는 점진적인 화학적 변형이 가(加)파이로인산분해 이외의 경우에는, 이 마이크로 액적을 습윤/탈습윤 하는 방법은 시퀀싱 이상의 용도에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 제2양태에 따르면, (a) 화학적인 변형이 일어나도록 할 수 있는 매질을 각각 포함하는 마이크로 액적의 스트림을 생성하는 단계; (b) 화학적 변형이 일어날 수 있는 주어진 위치에서 각각의 마이크로 액적을 차례로 표적 분자와 접촉시키는 단계; 및 (c) 주어진 기간의 끝에서 주어진 위치로부터 마이크로 액적을 제거하는 단계를 특징으로 하는 주어진 위치에 고정된 표적 분자의 화학적 변화를 수행하는 일반적인 방법이 제공된다. 일 실시예에서, 화학적 변형은 전술한 유형의 가(加)파이로인산분해이고, 제3양태는 (a) 가(加)파이로인산분해 매질을 각각 포함하는 수성 마이크로 액적의 스트림을 생성하는 단계; (b) 가(加)파이로인산분해가 일어날 수 있는 조건 하의 주어진 위치에서 주어진 기간 동안 각각의 마이크로 액적을 차례로 표적 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및 (c) 주어진 기간 끝에서 주어진 위치로부터 마이크로 액적을 제거하는 단계를 특징으로 하는 주어진 위치에 고정된 표적 폴리뉴클레에오티드의 가(加)파이로인산분해를 수행하는 방법을 제공하는 것을 포함한다. 이 실시예에서, 단계 (c)에서 제거된 마이크로 액적 중 적어도 일부는 표적 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트를 함유할 것이며, 이는 전술한 임의의 수단에 의해 주어진 위치에 고정된다. 다른 측면에서, 제거된 마이크로 액적은 표적의 뉴클레오티드 시퀀스에 상응하는 정렬된 뉴클레이시드 트리포스페이트 스트림에 상응할 것이다. 적합하게는, 마이크로 액적은 본 발명에 기재된 유형의 비혼화성 담체에 현탁된다.
또 다른 실시예에서, 제2유체 매질은 수성이고 제2영역으로 전달된 다음, 상응하는 수성 마이크로 액적의 스트림으로 전환되고; 이들 중 적어도 일부는 단일 뉴클레오사이드 트리포스페이트 분자를 함유한다. 일 실시예에서, 이는 적합한 치수와 기하 구조의 마이크로 액적 생성 헤드로부터 제2수성 매질이 탄화수소, 플루오로카본(flouorocarbon) 또는 실리콘 오일과 같은 비혼화성 액체를 포함하는 유동성 담체 매질로 배출되게 함으로써 달성된다.
주어진 마이크로 액적이 하나 이상의 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 분자를 함유하는 위험을 피하기 위해, 가(加)파이로인산분해 단계에서 그것들을 방출하고/하거나 채워진 마이크로 액적 각각은 평균적으로 1 내지 20 개, 바람직하게는 2 내지 10개의 빈 마이크로 액적에 의해 구분되도록 제1영역을 통한 유체 흐름을 조정하는 것이 바람직하다. 적합하게는, 미세 방울의 유한 부피는 500 pL(picolitres) 미만, 바람직하게는 65 pL 미만, 보다 바람직하게는 4 pL 미만, 더욱더 바람직하게는 2 pL 미만이다. 가장 바람직하게는 모든 부피는 4 fL(femtolitres) 내지 4 pL 범위에 있는 것이다. 일 실시예에서, 장치를 통한 마이크로 액적의 유량은 초당 50 내지 3000 마이크로 액적, 바람직하게는 100 내지 2000의 범위이다.
마이크로 액적 조작 영역과 관련하여, 이것은 적절하게는 제1 및 제2기판, 제1 및 제2전도체층, 광활성층 및 제1 및 제2유전체층으로 구성된 제1 및 제2복합벽으로 구성되거나 정의된 구조이다. 일 실시예에서, 이 영역은 중공형이고 마이크로 유동 공간을 수용하는 칩(chip) 또는 편평한 카트리지(cartridge)를 포함한다. 다른 실시예에서, 제1기판 및 제1전도체층은 전자기장 방사 소스(예를 들어, 다수의 레이저 빔 또는 LED 다이오드)로부터의 광이 광활성층에 충돌할 수 있도록 투명하다. 다른 실시예에서, 제2기판, 제2전도체층 및 제2유전체층은 동일한 목적에서 투명할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 이 층들은 모두 투명하여 어느 측에서도 조광할 수 있다.
적합하게는, 제1 및 제2기판은 유리 금속 또는 엔지니어링 플라스틱과 같이 기계적으로 강한 재료로 만들어진다. 일 실시예에서, 기판은 어느 정도의 유연성을 가질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 제1 및 제2기판은 100 내지 1000 μm 범위의 두께를 갖는다.
제1 및 제2전도체층은 제1 및 제2기판의 일면에 위치하고, 전형적으로 70 내지 250 nm, 바람직하게는 70 내지 150 nm의 두께를 갖는다. 일 실시예에서, 이들 층 중 적어도 하나는 인듐 주석 산화물(ITO: Indium Tin Oxide)과 같은 투명한 전도성 재료, 은(silver)과 같은 전도성 금속의 매우 얇은 필름 또는 PEDOT 등과 같은 전도성 폴리머로 만들어진다. 이들 층은 연속 시트 또는 와이어와 같은 일련의 개별 구조로 형성될 수 있다. 대안적으로, 전도체층은 전자기장 방사가 메시(mesh)의 간극들 사이로 향하게 하는 전도성 물질의 메시일 수 있다.
광활성층은 전자기장 방사 소스에 의한 자극에 응답하여 국소 전하 영역을 생성할 수 있는 반도체 재료로 적합하게 구성된다. 예로서 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 갖는 수소화 된 비정질 실리콘 층을 포함한다. 일 실시예에서, 광활성층은 가시 광선을 사용하여 활성화된다.
제1벽의 경우에 광활성층 및 선택적으로 제2벽의 경우에 전도체층은, 전형적으로 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 유전체층으로 코팅된다. 이 층의 유전 특성은 바람직하게는 10^7 V/m 이상의 높은 유전 강도 및 3 이상의 유전 상수를 포함한다. 일 실시예에서, 유전체층은 고순도 알루미나 또는 실리카, 하프니아(hafnia) 또는 얇은 비전도성 중합체 필름으로부터 선택된다.
장치의 다른 실시예에서, 적어도 제1유전체층, 바람직하게는 둘 모두는 방오층으로 코팅되어 다양한 전기 습윤 지점에서 원하는 마이크로 액적/기름/표면 접촉각을 형성하도록 보조하고, 추가적으로 액적이 장치를 가로 질러 이동함에 있어 표면에 흡착되어 액적의 내용물이 감소되는 것을 방지한다. 제2벽이 제2유전체층을 포함하지 않으면, 제2방오층은 제2전도체층 상에 직접 적용될 수 있다. 최적의 성능을 위해 방오층은 25 ℃에서 기액 표면(air-liquid surface) 3점 인터페이스로 측정할 때 50° 내지 70° 범위의 마이크로 액적/담체/표면 접촉 각도를 형성하는 데 도움을 주어야 한다. 담체 상(phase)의 선택에 따라, 수성 에멀전으로 충전된 장치에서 액적의 동일한 접촉각은 100° 보다 높을 것이다. 일 실시예에서, 이들 층(들)은 50 nm 미만의 두께를 가지고, 통상 단분자층이다. 다른 실시예에서, 이들 층은 메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate)와 같은 아크릴레이트 에스테르(acrylate ester)의 중합체 또는 친수성기로 치환된 이의 유도체, 예컨대 알콕시 실릴(alkoxysilyl)로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 방오층 중 하나 또는 둘 모두는 최적의 성능을 보장하기 위해 소수성이다.
제1 및 제2유전체층, 따라서 제1 및 제2벽은 폭이 10 μm 미만이고 마이크로 액적이 포함되는 마이크로 유동 공간을 형성한다. 일 실시예에서, 이 마이크로 액적 공간에 포함되기 전에, 마이크로 액적은 마이크로 액적 공간의 폭보다 10 % 이상, 적합하게는 20 % 이상인 고유 직경을 갖는다. 이는 예를 들어, 담체에서 원하는 직경을 가지는 마이크로 액적이 생성되는 예컨대 마이크로 유동 오리피스(orifice)와 같은 상류 유입구를 장치에 제공함으로써 달성될 수 있다. 이러한 수단에 의해, 마이크로 액적은 장치에 들어가면서 압축되어 표면 전위 에너지를 추가함으로써 특정 작업에 대해 마이크로 액적의 비압축 구형 조건과 비교하여 향상된 전기 습윤 성능을 제공한다.
다른 실시예에서, 마이크로 유동 공간은 제1 및 제2벽을 미리 결정된 깊이만큼 이격시키기 위한 하나 이상의 스페이서(spacer)를 포함한다. 스페이서에 대한 옵션으로서 비드(beads) 또는 필라(pillars), 포토 패터닝에 의해 생성된 중간 레지스트 층으로부터 만들어지는 리지(ridges)가 포함된다. 다양한 스페이서 형상이 좁은 채널, 테이퍼 진 채널 또는 필라 라인으로 정의된 부분적으로 둘러싸인 채널을 형성하는 데 사용될 수 있다. 세심한 설계에 의해, 마이크로 액적의 변형을 돕고, 이어서 액적 분리 및 변형된 마이크로 액적에 대한 작업을 수행하도록 이러한 구조가 사용될 수 있다.
제1벽과 제2벽 사이의 깊이는 마이크로 액적의 변형 수준에 영향을 주어, 마이크로 액적의 운동을 방해하는 표면 드래그(drag)를 부가하거나 제거한다. 제1벽과 제2벽 사이의 간격이 장치를 가로 질러 변하도록 장치를 구성함으로써, 상이한 작업에 대해 바람직한 성능 프로파일을 이용할 수 있는 복합 장치를 제공할 수 있다. 예를 들어, 5 μm 직경의 마이크로 액적의 분리를 위해 변형되는 영역에서 이러한 영역은 2 μm 미만의 깊이를 가질 수 있고, 비슷한 크기의 마이크로 액적이 표면 드래그가 덜 발생하여 더 빠른 속도로 움직일 수 있도록 인접 영역은 약 5 μm의 간격을 가질 수 있다.
제1 및 제2벽은 그들 사이에 전압 전위차를 제공하기 위해 전도체층에 부착된, 적합하게는 10 내지 50 볼트의 범위인, A/C 전력 소스를 사용하여 바이어스 된다.
본 발명의 시퀀싱 장치는 400 내지 1000 nm 범위의 파장 및 광활성화(photoexcitable) 층의 밴드 갭보다 높은 에너지를 갖는 전자기장 방사 소스를 더 포함한다. 적합하게는, 사용된 방사선의 입사 강도가 0.01 내지 0.2 Wcm-2의 범위에 있는 전기 습윤 지점에서 광활성층이 활성화될 것이다. 일 실시예에서, 전자기 방사선 소스는 픽셀화 되는 광활성층 상에 대응하는 광화성화 된 영역을 생성하기 위해 고도로 감쇠되고 또한 다른 예에서는 픽셀화 된다. 이에 의해, 또한 픽셀화 되는 제1유전체층 상의 대응되는 전기 습윤 지점이 유도된다. US20030224528에 개시된 디자인과는 대조적으로 전도성 셀이 없기 때문에, 픽셀화 된 전기 습윤 지점은 대응되는 제1벽 내의 어떠한 영구적인 구조와도 연계되지 않는다. 결과적으로, 본 발명의 장치에서 임의의 조명이 없다면, 제1유전체층의 표면 상의 모든 지점은 동일한 경향을 갖는 전기 습윤 지점이 된다. 이것은 장치를 매우 유동적으로 만들고 전기 습윤 경로를 고도로 프로그램 가능하게 한다. 이 특성을 종래 기술에서 개시된 영구 구조의 유형과 구별하기 위해, 본 발명자들은 장치에서 생성된 전기 습윤 지점을 '일시적(ephemeral)'이라고 특징짓기로 했으며, 본 발명자들 실시예들의 주장은 그에 따라 해석되어야 한다.
본 명세서에 개시된 최적화된 구조 설계는 결과적인 복합 스택이 (예컨대 산화 알루미늄(aluminium oxide) 또는 하프니아(Hafnia)와 같은) 고 유전 강도 및 고 유전율 상수를 갖는 더 두꺼운 중간층의 성능을 제공하는 코팅된 단일층(monolayer)으로부터 (또는 매우 얇은 기능화 된 층으로부터) 방오 및 접촉각 변형 특성을 갖는다는 점에서 특히 유리하다. 결과적인 층 구조는 10 μm 미만, 예를 들어 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5 또는 2 내지 4 μm 범위의 매우 작은 부피의 액적 조작에 매우 적합하다. 이러한 매우 작은 액적의 경우, 액적 치수가 유전체 스택의 두께에 근접하고, 따라서 액적을 가로지르는 전계 구배(전기 습윤에 의한 움직임을 위한 요구 사항)가 더 두꺼운 유전체에 대해 감소됨에 따라, 광활성층 위에 완전한 비전도성인 스택을 갖는 성능상의 이점은 매우 유리한 것이다.
전자기장 방사 소스가 픽셀화 되는 경우, LED로부터의 빛에 의해 조광(illuminated)되는 반사 스크린을 사용하여 직접 또는 간접적으로 적절하게 제공된다. 이는 제1유전체층에서 매우 복잡한 패턴의 임시 전기 습윤 지점이 신속하게 생성 및 소멸될 수 있게 함으로써, 미세하게 제어되는 전기 습윤 힘을 이용하여 마이크로 액적이 임의의 임시 경로를 따라 정밀하게 조종될 수 있게 한다. 이는 다수의 전기 습윤 경로를 따라 수천 개의 이러한 마이크로 액적을 동시에 조작하는 것이 목적인 경우에 특히 유리하다. 이러한 전기 습윤 경로는 제1유전체층 상의 연속적인 가상 전기 습윤 지점들의 연속체로부터 구성되는 것으로 간주될 수 있다.
광활성층 상에 전자기장 방사 소스의 충돌 지점은 일반적인 원형을 포함하는 임의의 용이한 형상일 수 있다. 일 실시예에서, 이들 점의 형태는 대응하는 픽셀화의 형태에 의해 결정되고, 다른 예에서는 마이크로 유동 공간에 들어간 후의 마이크로 액적의 형태에 전적으로 또는 부분적으로 대응한다. 바람직한 일 실시예에서, 충돌 지점 및 이에 따른 전기 습윤 지점은 초승달 모양 일 수 있고 마이크로 액적의 의도된 이동 방향으로 지향(oriented)될 수 있다. 다른 실시예에서, 제2벽은 또한, 동일한 전자기장 방사 소스 또는 본 발명에 기술하고 있는 제2소스에 의해, 추가 전기 습윤 지점이 유도(induce)될 수 있게 하는 광활성층을 포함한다. 적절하게는, 전기 습윤 지점 자체는 제1벽에 부착된 마이크로 액적 표면보다 작고, 액적과 표면 유전체 사이에 형성된 접촉 선을 가로 질러 최대 전계 강도 구배(gradient)를 제공한다. 제2광활성층의 추가는 전기 습윤 경계(edge)를 마이크로 액적 조작 영역의 상부 표면에서 하부 표면으로 전이(transition)시키고, 각각의 마이크로 액적에 대안적인 또는 추가의 전기 습윤 힘을 가할 수 있게 한다.
일 실시예에서, 광활성층 상의 전자기장 방사의 충돌 지점을 조작하기위한 수단은 복수의 동시에 흐르는(running), 예컨대 평행하게 흐르는, 제1전기 습윤 경로를 제1 및 선택적으로 제2유전체층 상에 생성하도록 구성되거나 프로그래밍 된다. 다른 실시예에서, 서로 다른 경로를 따라 진행한 서로 다른 마이크로 액적이 결합될 수 있도록 적어도 하나의 마이크로 액적 결합 위치(coalescing location)를 생성하기 위한 제1전기 습윤 경로와 교차하는 복수의 제3전기 습윤 경로를 제1 및/또는 선택적으로 제2유전체층 상에 추가로 생성하도록 구성되거나 프로그래밍 된다. 제1 및 제2전기 습윤 경로는 직각 또는 서로 정면으로 마주함을 포함하는 임의의 각도로 교차할 수 있다. 이 실시예는 다른 성분, 예를 들어 뉴클레오시드 트리포스페이트 포획 시스템의 성분 및/또는다양한 효소 및 다른 화학 성분을 마이크로 액적 조작 구역의 마이크로 액적 내로 전달하는 것이 요구되는 경우에 특히 유용하다. 바람직한 일 실시예에서, 포획 시스템은 사용되지 않은 상태에서 비형광인 형광 프로브에 기초한다. 적합한 시스템의 예는 전술한 본 발명자들의 특허 출원 및 추가로 미공개 특허 출원 EP16187112.4, EP16187493.8 및 EP16189791.3에 개시된 것들을 포함하지만, 이 목록에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 다수의 제1, 제2 및 제 3습윤 경로가 사용되는 또 다른 실시예에서, 충돌 지점을 조작하기위한 수단은 마이크로 프로세서에 의해 적절하게 제어되며, 이는 마이크로 액적이 통과하는 경로를 생성할 뿐만 아니라, 각각의 마이크로 액적의 이동을 서로 동기화 시킨다.
본 발명의 시퀀서는 마이크로 액적 조작 영역과 통합되거나 (예를 들어 칩 내에) 그 하류 영역에 별도로 배치될 수 있는 검출 영역 및 마이크로 액적에 충돌하도록 구성된 관련 형광 또는 라만-산란 시스템을 더 포함한다. 하나의 바람직한 실시예에서, 외부핵산분해 소화 또는 내부핵산분해 절단에 의해 유리된 형광단으로부터 유도된 형광 검출이 사용된다. 일 실시예에서, 검출 영역은 종래의 또는 광학 매개 EWOD의 하나 또는 조합에 의해 마이크로 액적이 최종적으로 구동되는 위치가 제공되는 표면을 포함할 수 있다. 마이크로 액적에 대한 최종 목적지를 생성하기 위해 이러한 표면은 벽들 및 유사한 것들 등과 같은 구조로 프로파일링 될 수 있다. 이 실시예에서, 형광 검출 시스템은 제2전자기장 방사가 이들 최종 목적지에 충돌하여 마이크로 액적으로부터 광 검출기 및 유사한 것에 의해 검출되는 형광 방출을 자극하도록 구성된다. 다른 실시예에서, 검출 영역은 각 마이크로 액적이 적층되고 출구 지점에서 형광 검출 시스템에 의해 조사되기(interrogated) 전까지 이동하는 모세관의 블록을 포함한다.
형광 검출 시스템과 관련하여, 이는 각각의 마이크로 액적의 내용물을 조사(interrogate)하기 위해 예를 들어 하나 이상의 레이저 또는 LED와 같은 하나 이상의 제2전자기장 방사 소스 및 사용되는 특정한 포획 시스템에 채용된 다양한 형광단의 특징적인 형광 파장(들) 또는 파장 포락선(envelope)에 맞춰진 하나 이상의 광 검출기 또는 동등한 장치를 포함한다. 그 후 광 검출기(들)에 검출된 임의의 형광은 분석물의 시퀀스의 데이터 특성을 나타내기 위해 공지된 알고리즘을 사용하여 컴퓨터에서 처리되고 분석될 수 있는 전기적 신호를 발생시킨다.
일 실시예에서, 본 발명의 장치는 중앙 마이크로 프로세서 및 동작의 일부 또는 전부를 제어하고 자동화하기위한 다양한 관련 컴퓨터 프로그램/알고리즘을 더 포함한다.
본 발명의 장치는 상응하는 시퀀싱 방법과 관련하여 사용될 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 제4양태에 따르면, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 분석물을 조사하는 방법이 제공된다:
* 제1경로에 위치한 부착 부위에 고정화된 분석물에 수성 가(加)파이로인산분해 매질을 접촉시키는 단계; 이에 의해 분석물이 그의 구성 뉴클레오시드 트리포스페이트로 점진적으로 가(加)파이로인산분해 되도록 하는 단계;
* 제2마이크로 유동 경로를 통해 제2수성 매질의 형태로 부착 부위 주위에서 뉴클레오시드 프리포스페이트를 제거하는 단계;
* 다음에 기재된 요소를 포함하는 광학 매개 전기 습윤 장치를 사용하여 비혼화성 담체 내의 제2수성 매질로부터 유래된 마이크로 액적을 조작하는 단계로서,
* 제1복합벽으로서,
* 투명한 제1기판;
* 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 투명한 제1전도체층;
* 전도체층 상에, 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 갖는 400 내지 1000 nm 범위의 파장 범위를 갖는 전자기장 방사에 의해 활성화된 광활성층; 및
* 전도체층 상에, 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 제1유전체층;
을 포함하는 제1복합벽,
* 제2복합벽으로서,
* 제2기판;
* 기판 상에, 70 내지 250 nm범위의 두께를 갖는 제2전도체층; 및
* 선택적으로, 전도체층 상에, 25 내지 50 nm 범위의 두께를 갖는 제2유전체층;
을 포함하되,
* 제1 및 제2유전체층의 노출된 표면은 10 μm 미만으로 이격되어 마이크로 액적을 수용하는 마이크로 유동 공간을 형성하도록 배치되는 제2복합벽,
* 제1 및 제2전도체층을 연결하는 제1 및 제2복합벽에 걸쳐 전압을 제공하는 A/C소스;
* 제1유전체층의 표면 상에 대응하는 임시 제1전기 습윤 지점을 유도하기 위해 광활성층 상에 충돌하도록 구성된 광활성화(photoexcitable) 층의 밴드 갭보다 높은 에너지를 갖는 적어도 하나의 제1전자기장 방사 소스; 및
* 임시 전기 습윤 지점의 배치를 변화시키기 위해 광활성층 상의 전자기장 방사의 충돌 지점을 조작하여 마이크로 액적이 이동될 수 있는 하나 이상의 제1전기 습윤 경로를 생성하는 조작 수단;
을 포함하되,
조작 동안 어느 시점에서 마이크로 액적은, 뉴클레오시드 프리포스페이트, 미사용 상태에서 비형광성인 형광 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템, 선택적으로 리가제일 수 있는 폴리머라제(polymerase) 및 형광 상태에서 사용된 포획 시스템으로부터 형광단(들)이 방출되도록 작용할 수 있는 핵산말단분해효소(exonuclease) 및/또는 핵속핵산분해효소(endonuclease)의 일부 또는 전부를 더 포함하는 단계; 및
* 전자기장 방사 소스로 조사될(irradiated) 때 각각의 마이크로 액적에서 방출된 형광단에서 파생되는 형광을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
분석물은 천연 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA 일 수 있고 선택된 포획 시스템은 그와 호환될 것이다. 이 방법은 특히 시퀀싱에 적합하며, 일 실시예에서 전술한 본 발명의 제3양태와 함께 바람직하게 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 DNA 분석물을 시퀀싱하기에 적합한 본 발명에 따른 장치는 이제 하기 도면 및 서술에 의해 설명된다.
도 1은 투명한 플라스틱으로 제조된 단일 칩에 통합된 마이크로 액적 제조 영역(1) 및 마이크로 액적 조작 영역(3)을 포함하는 마이크로 유동 칩의 평면도를 나타낸다. (1)은 가(加)파이로인산분해 스트림, 무기(inorganic) 가(加)파이로인산분해 스트림 및 본 발명자들의 이전 특허 출원 중 하나에 따른 뉴클레오시드 트리포스페이트를 식별하는데 필요한 다양한 검출 화학 물질 및 효소의 스트림 각각을 칩으로 도입하는 유입구(4, 5 and 6)에 부착된 유체(7, 8 and 9)를 함유하는 영역을 포함한다. 이들 스트림은 이어서 다양한 마이크로 액적(7b, 8b 및 9b)이 (예를 들어, 액적-분배 헤드를 사용하거나 또는 중간물인 더 큰 액적을 잘라내어) 생성되는 오리피스(7a, 8a 및 9a)로 각각 전달된다. (10)은 시퀀싱 될 폴리뉴클레오티드 분석물의 단일 분자가 부착되는 상자성(paramagnetic)-중합체 복합 마이크로 비드(11)를 함유하는 저장소이다. 각각의 (11)은 전기 습윤 경로(12)를 따라 위치(7c)로 이동되어 위치유지 되고 (7b)의 스트림과 접촉된다. 이 과정에서, (11)에 부착된 분석물은 각각의 (b)가 (11)로부터 분리된 후 비워지거나 또는 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 분자만을 함유하는 속도로 점진적으로 가(加)파이로인산분해된다. 분리 후, 마이크로 액적(8b 및 9b)과 함께 (7b)는 도 2에서 도시된 방식에 따라 30 내지 40 ℃의 온도 범위에서 (여기서 정사각형 전기 습윤 지점(25)로 정의된) 다양한 광전자 습윤(optoelectrowetting) 경로를 따라 조작되는 (3)으로 이동하게 된다. 이 과정에서, (7b) 및 (8b)는 먼저 제1결합 지점(12)에서 합체되어 중간물인 마이크로 액적(13)을 생성한 후, 제2결합 지점(14)에서 (9b)와 합쳐져서 내용물이 배양되고 필요한 화학적 및 효소적 반응이 일어나도록 60-75 ℃ 온도 범위에서 광전자 습윤에 의해 배양 영역(16)을 지나 전방으로 이동하는 복수의 최종 마이크로 액적(15) 스트림을 생성한다. 그 후, (15)는 검출 영역(2) 내의 최종 위치로 이송되고, 여기서 LED 소스로부터의 광 및 광 검출기를 사용하여 검출되는 각각의 마이크로 액적에 의해 방출되는 임의의 형광을 이용하여 조사된다(interrogated). 광 검출기의 출력은 공지된 시퀀싱 알고리즘을 사용하여 분석될 수 있는 분석물의 시퀀스에 상응하는 데이터 스트림이다.
도 2는 다양한 마이크로 액적이 조작되는 방법을 도시한 (3)의 부분 단면도를 나타낸다. (3)은 두께가 130 nm인 전도성 ITO(Indium Tin Oxide, 18a 및 18b)의 투명층으로 코팅된 각각 500 μm 두께인 상단 및 하단 유리판(17a 및 17b)을 포함한다. (17a) 및 (17b) 각각은 A/C 소스(19)에 연결되고, (18b)의 ITO 층은 접지(grounded)된다. (18b)는 800 nm 두께의 비정질 실리콘 층(20)으로 코팅된다. (18a) 및 (20)은 각각 160 nm 두께의 고순도 알루미나 또는 하프니아(21a)로 코팅된 후, 폴리(3-(트리메톡시실릴)프로필 메타아크릴레이트, 22) 단일층으로 코팅되어 고순도 알루미나 또는 하프니아 층(21a)의 표면에 소수성을 제공한다. (21a) 및 (21b)는 스페이서(미도시)를 사용하여 3 μm 이격되어 마이크로 액적이 장치에 도입될 때 어느 정도 압축되도록 한다. LED 광원(23)에 의해 조광되는, 반사형 픽셀화 된 스크린의 이미지는 일반적으로 (17b) 아래에 배치되고, 0.01 Wcm-2 레벨의 가시광(파장 660 또는 830 nm)이 각각의 다이오드(24)로부터 방출되고, 복수의 상향 화살표의 방향으로 전파되어 (17b) 및 (18b)을 통과하여 (20)에 충돌하게 된다. 다양한 충돌 지점에서, 상응하는 전기 습윤 지점(25)에서 (21b)의 액체-고체(liquid-solid) 접촉각 변화를 야기하는 전하의 광활성화 된 영역(26)이 (20)에 생성된다. 이러한 변화된 특성은 마이크로 액적을 한 지점(25)에서 다른 지점으로 추진하는 데 필요한 모세관 힘을 제공한다. (23)은 사전에 프로그래밍 된 알고리즘에 의해 임의의 주어진 시간에 어레이 중 어느 (26)가 조광되도록 할지를 결정하는 마이크로 프로세서(12)에 의해 제어된다. 이와 같은 방법으로 다양한 마이크로 액적이 도 1에 도시된 다양한 경로를 따라 동기화되어 이동될 수 있다.
도 3은 (21b) 상의 위치(25)에 위치한 접촉 정도를 한정하는 점선 윤곽선(7')을 갖는 전형적인 마이크로 액적(여기서 7b)을 위에서 내려다본 평면도를 도시한다. 이 예에서, (26)은 (7b)의 이동 방향으로 초승달 모양이다.
이상의 설명은 본 실시예의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 실시예의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 실시예들은 본 실시예의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 실시예의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 실시예의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 실시예의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 광학 매개 전기 습윤(optically-mediated electrowetting, oEWOD)을 통해 수천 개의 마이크로 액적을 동시에 조작하는 장치로서,
    제1유전체층을 포함하는 칩;
    LED로부터의 빛에 의해 조광되는 반사 스크린으로서, 상기 제1유전체층에서 매우 복잡한 패턴의 임시 전기 습윤 지점 또는 상기 빛의 충돌 지점이 신속하게 생성 및 소멸될 수 있게 함으로써, 미세하게 제어되는 전기 습윤 힘을 이용하여 상기 마이크로 액적이 정밀하게 조종될 수 있게 하는 반사 스크린;
    상기 마이크로 액적이 통과하는 경로를 생성하기 위해 상기 충돌 지점을 조작하도록 구성되며, 각각의 마이크로 액적의 이동을 서로 동기화시키도록 구성되는 마이크로 프로세서; 및
    상기 마이크로 액적으로부터 형광 방출을 자극하도록 구성된 제2 전자기 방사를 포함하는 형광 또는 라만-산란 검출 시스템; 및 상기 형광 방출을 검출하는 광 검출기를 포함하되,
    상기 칩은,
    투명한 제1기판;
    상기 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 투명한 제1전도체층;
    상기 전도체층 상에, 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 갖는 400 내지 1000 nm 파장 범위의 전자기 방사에 의해 활성화되는 광활성층; 및
    상기 광활성층 상에 마련되며, 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 제1유전체층
    을 포함하는 제1복합벽; 및
    제2기판;
    상기 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 제2전도체층; 및
    상기 전도체층 상에, 25 내지 50 nm 범위의 두께를 갖는 제2유전체층
    을 포함하는 제2복합벽을 포함하고,
    마이크로 액적을 포함하도록 조정된 마이크로 유동 공간을 정의하기 위해 제1벽과 제2벽을 미리 결정된 깊이만큼 이격시키기 위한 스페이서가 마련되며,
    상기 제1전도체층 및 상기 제2전도체층을 연결하는 상기 제1복합벽 및 상기 제2복합벽에 걸쳐 10 내지 50 V의 전압을 제공하기 위한 A/C소스를 포함하는 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1복합벽 및 상기 제2복합벽은,
    상기 제1유전체층과 상기 제2유전체층 각각 상에 제1방오층과 제2방오층을 더 포함하는 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 스페이서는 필라(pillar)인 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 스페이서는 비드(bead)인 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 스페이서는 리지(ridge)인 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 스페이서는 테이퍼 진 채널(tapered channel)에 의해 제공되는 장치.
  7. 제1항 내지 제6항에 따른 마이크로 유동 칩 상에서 광학 매개 전기 습윤(oEWOD)에 의해 수천 개의 마이크로 액적을 동시에 조작하는 방법에 있어서,
    매우 복잡한 패턴의 임시 전기 습윤 위치를 신속하게 생성하여 미세하게 제어된 전기 습윤 힘을 이용하여 상기 마이크로 액적을 정밀하게 조종하는 과정;
    상기 제1전도체층과 상기 제2전도체층을 연결하는 상기 제1복합벽 및 상기 제2복합벽에 걸쳐 10 내지 50 V 범위의 전압 전위차를 제공하는 과정;
    상기 마이크로 액적의 조향은 스페이서에 의해 보조되는 변형(deformation)을 포함하며,
    상기 임시 전기 습윤 지점의 패턴은 복수의 동시에 흐르는 제1전기 습윤 경로를 포함하고,
    상기 임시 전기 습윤 지점의 패턴은 적어도 하나의 마이크로 액적 결합 지점을 생성하도록 상기 제1 전기 습윤 경로와 교차하는 복수의 제3 전기 습윤 경로를 포함하며,
    상기 지점에서 제2 전자기 방사로 상기 마이크로 액적을 조사(interrogating)하고, 각 마이크로 액적에 의해 방출되는 형광 또는 라만-산란을 검출하는 과정
    을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 복수의 동시에 흐르는 제1전기 습윤 경로들은 평행한 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 제1전기 습윤 경로와 상기 제3전기 습윤 경로는 서로 수직으로 교차하는 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로 액적 결합 지점에서 마이크로 액적을 결합하는 과정을 더 포함하는 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로 액적을 조사하는 과정은, 상기 제2 전자기 방사로서 하나 이상의 LED를 사용하여 수행되는 과정인 방법.
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