CN113967488A - 微流体分析设备 - Google Patents

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Abstract

一种通过光学介导的电润湿(oEWOD)在微流体基片上同时操控数千个微滴的方法。所述方法包括：快速地创建高度复杂的暂时电润湿位置的图案以便使用被紧密控制的电润湿力来精确地导控微滴；其中所述暂时电润湿位置的图案包括多个相伴延伸的第一电润湿路径；其中所述暂时电润湿位置的图案包括多个第三电润湿路径，所述第三电润湿路径与第一电润湿路径相交以产生至少一个微滴汇聚位置；利用第二电磁辐射询检在所述位置上的微滴并且检测由每个微滴发射的任何荧光或拉曼散射。

Description

微流体分析设备
本申请是2019年12月20日进入中国的PCT专利申请PCT/EP2018 /066574，国家申请号为201880041800.4，发明名称为“微流体分析 设备”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种研究核酸分子(nucleic acid molecule)的设备； 特别是用于对天然或合成来源的DNA或RNA进行测序的设备。
背景技术
在我们之前的申请WO 2014/053853、WO 2014/053854、WO2014 /167323、WO2014/167324和WO2014/111723中，我们已经描述 了一种新的测序方法，该方法涉及逐步消化多核苷酸分析物 (polynucleotide analyte)以产生有序的单核苷酸的流(stream)，优 选地，单核苷三磷酸(single nucleoside triphosphates)流，它们的每 一个可以被一个一个地捕获到微滴流中的相应微滴中。此后，可以对 每个液滴进行化学和/或酶促(enzymatically)处理以揭示其最初包含 的特定单核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶促处理包括 一种涉及使用一种或多种二组分寡核苷酸探针类型(two-componentoligonucleotide probe types)的方法，每种类型被适配为能够选择性 地捕获构成分析物的单核苷酸类型之一。通常，在这样的探针类型中 的每种中，两个寡核苷酸组分中的一个包含特征性荧光团 (fluorophores)，并且在探针未使用的状态下，这些荧光团发出荧光的能力由于存在于附近的淬灭剂(quenchers)或通过自身淬灭 (self-quenching)而消失。在使用中，当探针已捕获了其相应的单核 苷酸，其变得易感于随后的核酸外切(exonucleolysis)或核酸内切(endonucleolysis)，从而使荧光团从淬灭剂中释放和/或从彼此释放， 从而使它们能够自由地发出荧光。通过这种方式，可以通过光谱学手 段间接地推断出存在于每个液滴中的原始单核苷酸。
在设计测序设备时，需要操纵数千个微滴，以确保例如它们被可 靠地递送到位，在微滴被递送到的位置，它们可以与其他合并和/或 它们的内含物依据是否存在荧光而被分析。
这样做的一种可能的方式是在基底上建立路径，通过电润湿力可 以沿着该路径推动微滴。用于以这种方式操控相对大的液滴的设备先 前已经在本领域中被描述了；参见例如US6565727、US20130233425 和US20150027889。通常，这是通过使液滴，例如在不溶混的 (immiscible)载体流的存在下，穿过微流体通道来实现的，所述微 流体通道由盒体(cartridge)的两个相对的壁限定或由管道限定。嵌 在盒体壁或管道壁中的是覆盖有介电层的电极，每个电极都连接到A /C偏置电路，该电路可以间歇地快速打开和关闭，以修改所述层的 电润湿特性(electrowetting characteristics)。这引起局部化的方向性 毛细作用力，该作用力可用于沿着给定的路径导控液滴。
该方法的变体(基于光学介导的电润湿)已经在例如 US20030224528、US20150298125和US20160158748中被教导了。特 别地，这三个专利申请中的第一个公开了各种微流体设备，所述微流 体设备包括由第一壁和第二壁限定的微流体腔，并且其中第一壁是复 合设计的并且包括基底、光电导层和绝缘(介电的)层。在光电导层 和绝缘层之间设置有导电单元(conductive cells)阵列，所述导电单 元彼此电隔离并耦合至光敏层(photoactive layer)，并且它们的功能 是在绝缘层上产生相应的离散的液滴接收位置。在这些位置，液滴的 表面张力特性可以通过电润湿力来改变。所述导电单元则可以通过作用在光电导层上的光来接通或关断。该方法的优点在于使切换变得更 加容易和快捷，尽管在某种程度上其使用仍受电极布置的限制。此外， 对于液滴可以移动的速度以及实际液滴路径可以改变的程度存在限 制。
Pei在加利福尼亚大学伯克利分校的论文UCB/EECS-2015-119中 公开了后一种技术的双壁实施例。在此，描述了一种单元，该单元通 过横跨沉积在介电层上的Teflon AF的表面地使用光学电润湿来允许 对尺寸在100-500μm的范围的较大液滴进行操控。在未图案化的电 偏压(electrically biased)非晶硅上的光图案(light-pattern)被以示 意性的形式描述。然而，在所示方案中，介电层很薄(100nm)，并 且仅设置在承载光敏层的壁上。
发明内容
现在，我们已经开发出一种核酸研究(investigative)设备，该设 备能够符合可靠的单核苷酸检测方法的要求地同时操控数千个微滴。 它的优点是可以通过计算机软件的应用轻松地重新配置以使其用途 广泛；例如，通过允许用户容易地将其适配为用于最佳精度、通量 (throughput)或检测特定的表观遗传修饰(epigenetic modifications)。 因此，根据本发明，提供了一种用于研究核酸分析物的设备，其特征 在于包括：
·第一区，其包括附着位所，分析物附着到所述附着位所；第一 路径，所述第一路径用于导致第一流体介质流过所述附着位所从而使 核酸得以逐渐地被焦磷酸解成它的组成三磷酸核苷；第二路径，第二 路径用于从所述附着位所周围除去所述三磷酸核苷，以及用于在第二 路径中产生第二介质的装置，所述第二介质包括与水不混溶的载体中 的水性微滴；
·微滴操控区，其使用光学介导的电润湿来操控微滴，所述微滴 操控区包括：
·第一复合壁，包括
第一透明基底；
所述基底上的第一透明导体层，第一透明导体层的厚度在 70到250nm的范围；
在导体层上具有由波长在400-1000nm的范围的电磁辐射激 活的光敏层，光敏层厚度在300-1000nm的范围，和
在导体层上的第一介电层，第一介电层的厚度在120到 160nm的范围；
·第二复合壁，包括
第二基底；
所述基底上的第二透明导体层，第二导体层厚度在70到 250nm的范围，和
可选地，在所述导体层上的第二介电层，第二介电层的厚度 在25到50nm的范围；
其中，第一介电层和第二介电层的暴露表面被间隔开小于 10μm，以限定适于容纳微滴的微流体空间。
·A/C源，用于横跨第一复合壁和第二复合壁地提供电位差 (potentialdifference)，所述第一复合壁和第二复合壁连接第一导体 层和第二导体层；
·至少一个第一电磁辐射源，其能量高于可光激发层 (photoexcitable layer)的带隙(bandgap)，其适配为作用在光敏层 上以在第一介电层的表面上引发相应的暂时第一电润湿位置；
·用于操控电磁辐射在光敏层上的作用点以改变暂时电润湿位置 的布置从而形成至少一个第一电润湿路径的装置，沿着该路径能够导 致微滴移动；
·检测区，所述检测区位于微滴操控区下游或与微滴操控区集成， 以及
·荧光或拉曼散射检测系统，其包括第二电磁辐射源和检测器， 所述第二电磁辐射源适于作用在检测区中的微滴上，所述检测器用于 检测从那里发出的荧光或拉曼散射。
本发明的装置特别适合于分析核酸分析物的组成核苷酸，并且在 一个实施方案中是一种用于DNA或RNA测序的设备。在核酸分析物 是DNA的应用中，其合适地是双链多核苷酸并且可以具有核苷酸链 长度，核苷酸链长度原则上可以是无限的；例如，在基因组片段中发 现的，包含多达数百万个核苷酸碱基对。因此，在一个实施方案中， 分析物将为至少50个核苷酸碱基对长，优选至少150个核苷酸碱基 对长；适当地，它将大于500，大于1000，并且在某些情况下，它将 是5000+个核苷酸碱基对长。在一个实施方案中，分析物是自然来源 的DNA(例如，来自植物、动物、细菌或病毒的遗传物质)，尽管该 方法同样适用于对部分或完全合成的DNA或实际上的其他核酸进行 测序，所述其他核酸完全或部分由包括由自然界中不常见的核苷酸碱 基组成的核苷酸构成；即，具有腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶 和尿嘧啶以外的核碱基的核苷酸。此类核碱基(nucleobases)的实例 包括4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、2-O-甲基胞嘧啶、5-羧 甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基-甲基尿苷、二氢尿苷、2-O- 甲基伪尿苷、2-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异丁基腺苷、1-甲基腺苷、1- 甲基伪尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、 2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、 5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基尿苷、 5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、2-甲硫基-N6- 异戊烯基腺苷、尿苷-5-氧乙酸-甲基酯、尿苷-5-氧乙酸、怀丁氧苷(wybutoxosine)、怀丁苷wybutosine、假尿苷、Q(核)苷(queuosine)、 2-硫胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、2-O- 甲基-5-甲基尿苷和2-O-甲基尿苷。当分析物是RNA时，将采用类似 的考虑。
在该设备的第一区中，分析物被逐渐地焦磷酸解 (pyrophosphorolysed)，在3-5'方向上以生成单核苷三磷酸的流，所 述单核苷三磷酸的顺序与分析物的序列相对应。所述焦磷酸解作用 (pyrophosphorolysis)本身大体在包含酶(例如聚合酶)的反应介质 的存在下，在20至90℃的范围的温度下进行。合适地，它被进行以 使得：通过含水的流动流体介质，单核苷三磷酸被连续地从颗粒周围 的焦磷酸解区域中移除。在一个实施方案中，该介质被缓冲(buffered) 并且还包含维持焦磷酸解反应所需的那些其他组分(聚合酶、焦磷酸根阴离子、镁阳离子等)。在另一个实施方案中，所述介质另外包含 以下项目的一种或多种：(a)在我们较早的专利申请中说明的探针类 型(或具有等效功能的探针)；(b)使探针结合到并捕获相关的单核 苷三磷酸所需的各种化学物质和酶(例如聚合酶和/或连接酶)，以及 (3)让用过的探针发生后续的核酸外切(exonucleolysis)所需的酶。 在一个实施方案中，在其他一些点或区域，将这些组分中的一些或全 部一起或分阶段地引入流动的水性介质或引入从其形成的微滴(视情 况而定)。例如，一些或所有这些组分直接到微滴内的后续引入可以 通过使用注射器注射或通过微滴汇聚来实现。
优选地，该设备被设计成可操作的，使得焦磷酸解的速率尽可能 快，并且在一个实施方案中，该速率在每秒1至50个单核苷三磷酸 的范围。关于应用于多核苷酸的逐步降解的焦磷酸解反应的更多信息， 可例如在J.Biol.Chem.244(1969)第3019-3028页中找到244。
所述设备的第一区的部分特征在于，包括附着位所，所述附着位 所适于结合至分析物。在一个实施方案中，该位所适于临时地结合至 具有两个不同的表面区域的颗粒。适当地，它包括位于第一区内的表 面，该表面被改性为能够可释放地附着到承载分析物的分子的相应颗 粒；例如通过化学改性的金属涂层。在一个实施方案中，该颗粒包括 珠子；例如微珠，其由惰性材料如玻璃、二氧化硅、氧化铝、金属或 不可降解的聚合物制成。在另一个实施方案中，颗粒具有顺磁材料的 核，使其能够被磁性操控。
颗粒上的两个不同的表面区域适合分别与附着位所和分析物上 的互补位所结合。在一个实施例中，这些区域中的第一个区域包括化 学改性的金属涂层；例如，金、银、铜或其他金属的功能化涂层。在 另一个实施方案中，这些区域中的第二个区域包括颗粒上的一个或多 个反应位所，所述反应位所被专门适配为用于物理地或化学地结合至 分析物的分子。
有许多方法可以创建在所述颗粒和所述附着位所上的反应位所。 例如，对于颗粒上的第一区域，它可以通过以下方式制备，首先使用 已知的方法(诸如金属气相沉积、原子层沉积，等离子体沉积等)用 金属部分地涂覆颗粒。此后，金属表面可以被化学改性(chemically modified)以引入一个或多个第一部分，所述一个或多个第一部分可 以可逆地结合到所述附着位所上的互补的第二部分。在一个实施方案 中，第一部分和第二部分的这些对被选择为，使得它们之间产生的结 合可以在环境温度或接近环境温度的温度下可逆地形成和断开。通过 这种方式，珠子可以被附着到所述附着位所，分析物通过焦磷酸解被 消化，并且然后珠子被从基底上剥离下来使得基底能够再接收另一个 新鲜的珠子。在一个实施方案中，第一部分和第二部分的这些对可导 致在焦磷酸解条件下稳定的蛋白质复合物的形成，例如通过使用亲和 素(avidin)或链霉亲和素(streptavidin)部分和互补的生物素(biotin) 部分。在另一个中，这些对可以产生不稳定的(labile)化学键；例 如在多组氨酸/螯合金属离子对中(在低pH值下或在咪唑或强金属螯 合剂的存在下断裂的键)；硼酸/合适的碳水化合物对(在低pH下断 裂的键)或马来酰亚胺/硒醇对(使用间氯过氧苯甲酸断裂的键)。在 这些情况下，通过改变流过第一区的水性介质的pH值或组份，颗粒 可以被后续分离。因此，在设备的一个实施例中，第一区进一步包括 用于向第一区引入颗粒和从第一区移除颗粒的装置，或者用于将颗粒 分离手段向其中引入和从中去除的装置，如下文进一步解释的。在另 一个中，在分离时，颗粒被从附着位所移除，悬浮在其自身的微滴中， 该微滴穿过设备的其余部分。如果采用这种方法，则在一个实施方案 中，颗粒将包括其自身的特征性荧光或拉曼散射标记，使用户能够检 测焦磷酸解作用何时完成。
在一个优选的实施方案中，上面提到的部分的对包括多组氨酸部 分和螯合剂部分，所述多组氨酸部分包括多个组氨酸残基(优选大于 六个)，所述螯合剂部分选自例如过渡金属(例如钴、铜或镍)的次 氮基三乙酸酯(NTA)或亚氨基二乙酸酯(IDA)的盐衍生物。应当理 解，这些第一部分和第二部分可以以任意顺序分别部署在颗粒和所述 附着位所上。
同样，对于颗粒的第二区域，可以通过多种方式创建分析物反应 位所。因此，在一个实施方案中，所述颗粒的未涂覆表面可以用官能 化剂涂装(primed)，例如在二氧化硅珠、氧化铝珠或玻璃珠的情况 下，可以用环氧硅烷、氨基烃基硅烷或巯基硅烷，以形成分析物可以 附着的化学反应位所。此后，这些反应位所可以用分析物的衍生物处 理，该分析物已被相应地改性成包括末端涂装-反应性(primer-reactive) 基团；例如，在一个实施方案中，胺基、琥珀酰基或硫醇基。在另一 个实施方案中，化学附着可以通过到衔接子寡核苷酸(adaptor oligonucleotides)的连接而发生或通过上述的蛋白质复合物的类型而 发生。
在又一个实施方案中，如此涂装的粒子将包括仅具有一个分析物 反应位所的第二区域，使得分析物的仅一个分子可以被附着。如果分 析物是小的多核苷酸片段，则这可能是重要的，因为否则在制备期间 多个分子会趋于附着，这是不希望的。如果多核苷酸片段较大，则较 少地考虑它，因为空间效应将起对抗这种结果的作用。适当地，该颗 粒的最大直径在0.5至5微米(μm)的范围。
在一个优选的实施方案中，所述颗粒是球形珠，并且第一区域和 第二区域包括在表面上彼此邻接的半球形区域。在该实施方案中，该 颗粒合适地是具有磁芯的珠子；例如以
Figure RE-GDA0003376219150000081
的名称出售的那 些。
在珠子具有磁芯的实施方案的情况下，可以使用磁场将珠子附着 到降解位所和从降解位所分离，所述磁场由置于测序设备附近的永磁 体的电磁体引发。
所述第一区合适地是微流体尺寸的腔室，其容纳有包括所述附着 位所的结构，或者在另一实施例中，包括微流体管，所述微流体管的 内表面被部分地涂覆有所述附着位所。在一个实施例中，所述附着位 所可以进一步包括座体，颗粒可以紧密地配合在座体中。在另一实施 方案中，可以通过表面结合或磁性将颗粒保持在所需位置处。在又一 个实施方案中，颗粒可以具有例如铁磁性芯或铁磁性表面，从而使得 它们可以通过在其附近施加电磁体而被引导至附着位所。在又一个实 施方案中，通过使用常规的或光学介导的设备上电润湿(EWOD)技 术向颗粒施加毛细作用力，从而将颗粒定位到附着位所并从附着位所 移除。这样，在一个实施例中，第一区进一步包括在腔室或管道中的 被电介质涂覆的电极或光敏元件(可以是永久性的或暂时的)，如果 需要它们可以为此目的被激活。
在一个实施例中，该设备还包括位于第一区的上游的制备区，在 该区中制备珠子；以及借助于第二电润湿路径将珠子从制备区移动到 附着位所的装置。
在焦磷酸解之后，流动的第二流体介质被从附着位所周围移除， 所述第二流体介质例如是第二水性介质，该第二流体介质包含有在空 间和时间上彼此分离并以与分析物的核苷酸序列相对应的顺序排列 的单核苷三磷酸。在一个实施方案中，焦磷酸水解降解发生在第一流 体介质的连续流中，其随后将被液滴化，使得先前在第二流体介质中 的核苷三磷酸分子被包封。
在另一个实施方案中，焦磷酸解降解在液滴化的第一流体介质中 以瞬时方式发生，其中随着微滴被驱动经过目标珠的表面，悬浮在不 混溶的载体介质中的微滴对目标珠进行暂时地润湿和去润湿。这样， 如果核苷三磷酸分子在微滴与微珠接触时被从DNA链中释放出来， 它将立即被包封则，并且然后它在微滴从微珠去润湿时在第二流体介 质中被向下游移除。
将理解的是，如果对分析物进行的渐进化学转化不是焦磷酸解， 则该微滴润湿/去润湿方法将具有除测序之外的应用。因此，根据本 发明的第二方面，提供了一种对固定在给定位置上的目标分子进行化 学转化的通用方法，其特征在于以下步骤：(a)产生微滴的流，所述 微滴的每个微滴包含能够使所述化学转化发生的介质；(b)在可能发 生化学转化的条件下，使每个微滴依次在给定位置与目标分子接触给 定的时间段；以及(c)在给定的时间段结束时，将微滴从给定位置 移除。在一个实施方案中，所述化学转化是上述类型的焦磷酸解，并 且第三方面包括提供一种用于对固定在给定位置上的目标多核苷酸 进行焦磷酸解的方法，其特征在于以下步骤：(a)产生水性微滴的流， 所述水性微滴的每个水性微滴包括进行焦磷酸裂解的介质；(b)在可 能发生焦磷酸解的条件下，使每个微滴依次在给定位置与目标多核苷 酸接触给定的时间段，依次接触；以及(c)在给定的时间段结束时，将微滴从给定位置移除。在该实施方案中，至少一些在步骤(c)中 被移除的微滴将含有从目标多核苷酸导出的单核苷三磷酸，所述目标 多核苷酸通过上述任何方式被固定在给定位置。在另一方面，被移除 的微滴将对应于核苷三磷酸的有序流，所述核苷三磷酸的有序流与靶 标的核苷酸序列相对应。合适地，微滴被悬浮在本文所述类型的不混 溶(immiscible)的载体中。
在又一个实施方案中，第二流体介质是水性的，并被输送到第二 区，在该处其随后被转化成相应的水性微滴的流；所述水性微滴中的 至少一些含有一个单核苷三磷酸分子。在一个实施方案中，这是通过 使第二水性介质从具有适当尺寸和几何形状的微滴液滴产生头中喷 出到流动的载体介质中来实现的，该流动的载体介质包含不混溶的液 体，例如烃、碳氟化合物或硅油。
为了避免某个给定的微滴包含一个以上的单核苷三磷酸分子的 风险，优选在焦磷酸解步骤中释放它们和/或调节通过第一区的流体 流，以使所产生的每个被填充的微滴平均被从1到20(最好是2到 10个)空的微滴隔开。合适地，微滴的有限体积小于500pL(皮升)， 优选小于65pL，更优选小于4pL，甚至更优选小于2pL。最优选地， 所有它们的体积在4fL(飞升)至4pL的范围。在一个实施方案中， 微滴通过设备的流速在每秒50至3000微滴的范围，优选100至2000 微滴。
此后，微滴的流可以被微流体地操控并输送至微滴操控区。
关于微滴操控区，其适当地是由第一复合壁和第二复合壁构造或 限定的结构，该第一复合壁和第二复合壁包括第一基底和第二基底、 第一导体层和第二导体层、光敏层以及第一介电层和第二介电层。在 一个实施例中，该区包括基片(chip)或扁平盒体，所述基片或扁平 盒体是中空的并容纳微流体空间。在另一个中，至少第一基底和第一 导体层是透明的，使得来自电磁辐射源(例如多个激光束或LED二极 管)的光直接作用到光敏层上。在另一个中，第二基底、第二导体层 和第二介电层是透明的，从而可以获得相同的目的。在又一个实施例 中，所有这些层都是透明的，使得照明能够从任一侧发生。
适当地，第一基底和第二基底由机械强度高的材料制成，例如玻 璃、金属或工程塑料。在一个实施例中，基底可具有一定程度的柔性。 在又一个实施例中，第一基底和第二基底的厚度在100-1000μm的范 围。
第一导体层和第二导体层位于第一基底和第二基底的一个表面 上，并且通常非常薄；每个具有70至250nm的范围的厚度，优选70 至150nm的范围的厚度。在一个实施例中，这些层中的至少一层由 透明导电材料(诸如铟锡氧化物(ITO))、导电金属(诸如银)或导电聚合物(诸如PEDOT等)的非常薄的膜制成。所述层可以形成为 连续的片或一系列离散的结构(例如丝)。替代地，导体层可以是导 电材料的网，电磁辐射被引导在所述网的空隙之间。
光敏层适当地包括半导体材料，该半导体材料可以响应于电磁辐 射源的刺激而产生局部化的电荷区域。实例包括厚度为300至 1000nm范围的非晶硅(amorphoussilicon)。在一个实施例中，通过 施加可见光来激活光敏层。
光敏层(在第一壁的情况下)，并且可选地导电层(在第二壁的 情况下)被涂覆有介电层，该介电层非常薄并且通常在120nm至 160nm的范围。该层的介电性能优选地包括＞10^7V/m的高介电强 度和＞3的介电常数。在一个实施例中，介电层选自高纯度氧化铝(alumina)或二氧化硅(silica)、氧化铪(hafnia)或薄的非导电聚 合物膜。
在所述设备的另一种形式中，至少第一介电层，优选两者，涂覆 有防污层，以帮助在各个电润湿位置处建立所需的微滴/油/表面接触 角并且还防止微滴内含物附着在表面上并随着液滴在设备上移动而 减少。如果第二壁不包括第二介电层则第二防污层可以直接施加到第 二导体层上。为了获得最佳性能，当在25℃下以气液表面三点界面 进行测量时，防污层应有助于建立在50-70°的范围的接触角。取决 于载体相的选择，在填充有水性乳液(aqueous emulsion)的设备中， 微滴的相同的接触角将更高；大于100°。在一个实施例中，这些层 的厚度小于50nm，并且通常是单分子层。在另一个中，这些层由丙 烯酸酯(例如甲基丙烯酸甲酯或其被亲水基团(例如烷氧基甲硅烷基 (alkoxysilyl))取代的衍生物)的聚合物组成。优选地，所述防污层 中的任一者或两者是疏水的(hydrophobic)，以确保最佳性能。
第一介电层和第二介电层(并且由此第一壁和第二壁)限定了微 流体空间，所述微流体空间深度小于10μm并且其中包含微滴。在 一个实施例中，在微滴被包含在微滴空间中之前，其自身的固有直径 (intrinsic diameter)比微滴空间的深度大10％以上，适合地大20％ 以上。在具有期望直径的微滴在载体介质中被生成的情况下，这例如 可以通过为设备提供上游入口(例如微流体孔)来实现。通过这种方 式，微滴在进入设备中时受到压缩，从而通过在微滴的未压缩的球形 状况上添加表面势能而为某些操作带来增强的电润湿性能。
在另一个实施方案中，微流体空间包括一个或多个间隔物，所 述间隔物用于保持第一壁和第二壁分开预定的深度。可选的间隔物包 括从中间抗蚀剂层(intermediateresist layer)产生的珠或柱、脊等， 该中间抗蚀剂层是通过光图案化(photo-patterning)产生的。各种间 隔物几何形状也可用于限定狭窄通道、锥形通道或由支柱的线限定的 部分封闭的(enclosed)通道。通过细心设计，可以使用这些结构来 帮助微滴变形，以进而执行液滴分裂并对变形的微滴进行操作。
第一壁和第二壁之间的深度影响微滴的变形水平；增加或减小阻 止微滴运动的表面拖拽。通过将所述设备构造为第一壁和第二壁之间 的间距在整个设备上变化，可以得到复合设备，在该复合设备中优选 的性能特性可被用于不同的操作；例如，在要变形直径为5μm的微 滴以进行分裂的区域中，该区域的深度可以小于2um，而相邻区域的 间距可以为5μm左右，在其中类似尺寸的微滴经受较少的表面拖拽 并且从而能以更高的速度移动。
使用附接到导体层的A/C电源对第一壁和第二壁施加偏压，以 在它们之间提供电势差；适当地在10至50伏的范围。
本发明的测序设备还包括电磁辐射源，该电磁辐射源的波长在 400-1000nm的范围，并且其能量高于可光激发层的带隙。适当地， 光敏层将在所用辐射的入射强度在0.01至0.2Wcm-2的范围的电润湿 位置被激活。在一个实施例中，电磁辐射源被高度减小(attenuated) 并且在另一个中被像素化，以便在光敏层上产生也被像素化的相应的 光激发区域。通过这种方式，在第一介电层上的相应的电润湿位置被 引发。与US20030224528中教导的设计相反，由于不存在导电单元， 因此这些像素化电润湿点不与第一壁中的任何相应的永久结构相关。 结果，在本发明的设备中并且在没有任何照明的情况下，第一介电层表面上的所有点都具有相等的倾向成为电润湿位置。这使得设备非常 灵活并且电润湿路径高度可编程。为了将该特征与现有技术中教导的 永久性结构的类型区分开，我们选择将设备中产生的电润湿位置表征 为“暂时/暂时的”，并且我们的申请的权利要求应作相应解释。
这里教导的优化的结构设计是特别有利的，因为所得的复合叠层 使来自涂覆的单层(或非常薄的功能化层)的防污和接触角改变特性 与具有高介电强度和高介电常数(例如氧化铝或氧化铪(Hafnia))的 较厚中间层的性能相结合。所得的层状结构非常适合于处理非常小体 积的微滴，例如直径小于10μm的液滴，例如在2至8μm、2至6 μm，2至5μm或2至4μm的范围。对于这些极小的微滴，光敏 层上方的整个非导电叠层具有最小厚度的性能优势将极为有利，因为 液滴尺寸开始接近介电叠层的厚度，并且因此对于较厚的电介质，横 跨液滴的场梯度(对于电润湿引发的运动的要求)被减少。
在电磁辐射源被像素化的情况下，则可以使用由LED发出的光照 亮的反射屏直接或间接地来提供。这使得高度复杂的暂时电润湿位置 的图案能够在第一介电层中被快速地创建和破坏，从而使用被紧密控 制的电润湿力，微滴能够沿着电润湿路径被精确地导控。当目的是沿 着多个电润湿路径同时操控数千个这样的微滴时，这是特别有利的。 可以将这种电润湿路径看作是由第一介电层上的虚拟(virtual)电润 湿位置的接续所构成的。
电磁辐射源在光敏层上的作用点可以是任何方便的形状，包括常 规的圆形。在一个实施例中，这些点的形态由相应像素化点 (pixelations)的形态确定，并且在另一个中，一旦微滴进入微流体 空间，则这些点的形态全部或部分地对应于微滴的形态。在一个优选的实施例中，作用点(并且因此电润湿位置)可以是新月形的 (crescent-shaped)并且定向在预期的微滴行进方向上。在另一实施 例中，第二壁也包括光敏层，该光敏层使得进一步的暂时电润湿位置 得以在第二介电层上被引发；或者通过相同的电磁辐射源，或者通过本文所述类型的第二源。适当地，电润湿位置本身小于粘附到第一壁 上的微滴表面，并横跨形成在液滴和表面电介质之间的接触线地产生 最大的场强梯度。第二光敏层的添加使得可以将润湿边缘从微滴操控 区的上表面过渡到下表面，并且使得能够有目标地向每个微滴施加替 代的或附加的电润湿力。
在一个实施例中，用于操控电磁辐射在光敏层上的作用点的装置 被适配或编程为在第一介电层上并且可选地在第二介电层上产生多 个相伴延伸的(例如平行的)第一电润湿路径。在另一个实施例中， 其被适配或被编程为在第一介电层上并且可选地在第二介电层上还 产生多个第三电润湿路径，第二电润湿路径与第一电润湿路径相交以 产生至少一个微滴汇聚(coalescing)位置，在所述微滴汇聚位置处 可以使得沿着不同路径行进的不同微滴汇聚。第一电润湿路径和第三 电润湿路径可以彼此成直角相交，或以任何角度相交，这包括正面 (head-on)相交。在希望将另外的组分(例如核苷三磷酸捕获系统 的组分和/或各种酶和其他化学组分)输送到微滴操控区中的微滴中 情况下，该实施方案是特别有用的。在一优选实施例中，捕获系统基 于荧光探针，该荧光探针在其未使用的状态下是不发出荧光的。合适 的系统的示例包括我们的专利申请以上所教导的那些系统，并且另外还包括我们未公开的专利申请EP16187112.4、EP16187493.8和 EP16189791.3中的那些，尽管该列表不应被解释为限制性的。在采用 多个第一、第二和第三润湿路径的另一个实施例中，用于操控作用点 的装置由微处理器适当地控制，该微处理器不仅创建微滴通过的路径， 而且使每个微滴的运动相对每个其他微滴同步。
本发明的测序仪进一步包括检测区和相关联的荧光或拉曼散射 系统，所述检测区可以与微滴操控区成一体(例如在基片内)或分开 地位于微滴操控区下游，所述荧光或拉曼散射系统适于作用在微滴上。 在一个优选的实施方案中，采用了源自荧光团的荧光检测，所述荧光 团通过核酸外切消化(exonucleolytic digestion)或核酸内切裂解(endonucleolytic cleavage)而被释放。在一个实施例中，检测区可 以包括表面，该表面设置有微滴由常规或光学介导的EWOD或它们的 组合最终驱动到的位置。可以用诸如凹陷(wells)之类的结构来对这 样的表面进行轮廓化，以产生微滴的最终目的地。在该实施例中，荧 光检测系统被配置为使得第二电磁辐射作用在这些最终目的地上，以 刺激来自微滴的荧光发射，该荧光发射由光电检测器等检测。在另一 个实施方案中，检测区包括毛细管块，在被出口处的荧光检测系统询 检之前，每个微滴都通过毛细管块堆叠并行进。
关于荧光检测系统，它包括用于询检每个微滴的内含物的一个或 多个第二电磁辐射源(例如多个激光器或LED)和一个或多个光电检 测器或等效设备，所述光电检测器或等效设备被调整至荧光团的特征 荧光波长或波长包络，所述荧光团是在所使用的特定捕获系统中所采 用的各种荧光团。此后，由光检测器检测到的任何荧光都会产生电信 号，所述电信号可以在计算机中使用已知算法进行处理和分析，以揭 示分析物的序列的数据特征。
在一个实施例中，本发明的设备还包括中央微处理器和相关联的 计算机程序/算法，以用于控制和自动化其各种操作中的一些或全部。
显然，本发明的设备可以与相应的测序方法结合使用。因此，根 据本发明的第四方面，提供了一种研究多核苷酸分析物的方法，其特 征在于包括以下步骤：
·使水性焦磷酸解介质与固定在附着位所的分析物接触，所述附 着位所位于第一路径；从而使分析物逐渐地焦磷酸解为它的组成三磷 酸核苷；
·通过第二微流体路径以第二水性介质的形式从附着位所周围移 除核苷三磷酸；
·使用光学介导的电润湿设备操控从不混溶的载体介质中的第二 水性介质导出的微滴，所述光学介导的电润湿设备包括：
·第一复合壁，包括
第一透明基底；
在所述基底上的第一透明导体层，第一透明导体层厚度 在70到250nm的范围；
在所述导体层上的由在400-1000nm的波长范围的电磁 辐射激活的光敏层，光敏层的厚度在300-1000nm的范 围，和
在导体层上的第一介电层，第一介电层的厚度在120到 160nm的范围；和
·第二复合壁，包括
第二基底；
所述基底上的第二透明导体层，第二导体层的厚度在 70到250nm的范围，和
可选地，导体层上的第二介电层，第二介电层的厚度在 25到50nm的范围；
其中第一介电层和第二介电层的暴露表面间隔开小于 10μm，以限定适于容纳微滴的微流体空间；
A/C源，用于横跨连接第一和第二导体层的第一和第二 复合壁提供电位差；
至少一个第一电磁辐射源，其能量高于可光激发层的带隙， 其适于作用在光敏层上，以在第一介电层的表面上引发相应 的暂时第一电润湿位置，以及
用于操控电磁辐射在光敏层上的作用点，以改变暂时电润 湿位置的布置从而形成至少一个第一电润湿路径的装置，可 以使微滴沿着该路径移动；
其中，所述微滴在操控过程中的某个点的微滴进一步包含以下项 目的一些或全部：三磷酸核苷，寡核苷酸捕获系统(寡核苷酸捕获系 统包括荧光探针，所述荧光探针在未使用状态下为不发出荧光的)， 聚合酶，聚合酶(可选地是连接酶和核酸外切酶和/或核酸内切酶， 它们能够使荧光团以荧光状态从已使用的捕获系统中释放出来)；
·在受到电磁辐射源照射后，检测从每个微滴中被释放的荧光团 得到的荧光。
分析物可以是天然或合成来源的DNA或RNA，并且所选择的捕 获系统将与其相容。该方法特别适合于测序，并且在一个实施方案中 可以有利地与上述本发明的第三方面一起使用。
附图说明
图1示出了微流体基片的俯视图；
图2示出了微滴操控区的局部剖视图；以及
图3示出了典型微滴的俯视图。
具体实施方式
现在通过以下附图和描述来说明根据本发明的适于对多核苷酸 DNA分析物进行测序的设备。
图1示出了微流体基片的俯视图，该微流体基片包括微滴制备区 1和微滴操控区3，所述微滴制备区1和微滴操控区3集成到由透明 塑料制成的单个基片中。1包括包含附接到入口4、5和6的容纳流 体的区域7、8和9，所述入口4、5和6分别向基片中引入焦磷酸水 解流、无机焦磷酸酶流以及各种检测化学物质和酶的流，它们是根据 我们较早的专利申请之一鉴定核苷三磷酸所需的。这些流然后被分别 输送到孔口7a、8a和9a，从这些孔口产生各种微滴7b、8b和9b(例 如，使用液滴分配头或通过从较大的中间液滴切出)。10是容纳顺磁性聚合物复合微珠11的储库(reservoir)，待测序的多核苷酸分析物 的单个分子附着到所述复合微珠上。11中的每一个都沿着电润湿路 径12被传输到位置7c，在此处它被保持并与7b的流相接触。在该 过程中，附着在11上的分析物以一定的速度被逐步地焦磷酸解，以 使得每个7b在从11脱离后要么是空的，要么仅包含一个核苷三磷酸 分子。在脱离后，7b及微滴8b和9b被移至3，在此处它们被沿着各 种光电润湿路径(此处由方形电润湿位置25限定)在30-40℃的条 件下根据图2所示的方案被操控。在该过程中，首先使7b和8b在第 一汇聚点12处汇聚以产生中间微滴13，然后使中间微滴13在第二 汇聚点14处与9b汇聚以产生最终微滴15的多个流，通过光电润湿， 最终微滴流向前移动在60-75℃的温度下通过温育(incubation)区域 16，以使内含物得以温育并使必要的化学和酶促反应得以进行。之后，15被运到检测区2中的最终位置，在该位置中，它们被来自LED光 源的光拷问并且每个微滴发出的任何荧光被用光电检测器检测到。光 电检测器的输出是数据流，所述数据流对应于分析物的序列，所述分 析物可以使用已知的测序算法对其进行分析。
图2示出了3的局部剖视图，其示出了各个微滴是被如何操控的 3包括顶部玻璃(或透明塑料)板和底部玻璃(或透明塑料)板(17a 和17b)，每个板厚500μm，并且涂有厚度为130nm的透明的导电铟 锡氧化物(ITO)层18a和18b。18a和18b的每个都连接到A/C源 19，并且在18b上的ITO层作为地。18b被涂有一层800nm厚的非晶 硅20。18a和20分别涂有160nm厚的高纯度氧化铝或氧化铪(Hafnia) 层21a和21b，层21a和21b继而被涂有聚(甲基丙烯酸3-(三甲氧 基甲硅烷基)丙酯)的单层(monolayer)22以使它们的表面疏水。 21a和21b被用隔离物(未示出)间隔开3μm，从而使微滴在被引 入设备中时受到一定程度的压缩。由LED光源23照射的反射型像素 化屏幕的图像通常布置在17b下方，并且水平为0.01Wcm2的可见光(波长660或830nm)被从每个二极管24发出，并且通过在穿过17b 和18b的多个向上的箭头的方向上传播而作用在20上。在各个作用 点处，电荷的光激发区26被在20中创建，这些光激发区在21b中相 应的电润湿位置25处引发改变的液-固接触角。这些改变的特性提供 了将微滴从一个点25推进到另一个点所需的毛细管作用力(capillary force)。23由微处理器(未示出)控制，该微处理器通过预编程的算 法确定在任何给定的时刻阵列中的26的哪个被照亮。通过这种方式， 可以使各个微滴以同步的方式沿着图1所示的各个路径移动。
图3示出了典型微滴(这里是7b)的俯视图，所述微滴位于21b 上的为准25处，其中虚线轮廓7’限定了接触的范围。在此示例中， 26在7b的行进方向上呈新月形。

Claims (14)

1.一种通过光学介导的电润湿(oEWOD)在微流体基片上同时操控数千个微滴的方法，所述方法包括：
快速地创建高度复杂的暂时电润湿位置的图案以便使用被紧密控制的电润湿力来精确地导控微滴；
其中所述暂时电润湿位置的图案包括多个相伴延伸的第一电润湿路径；
其中所述暂时电润湿位置的图案包括多个第三电润湿路径，所述第三电润湿路径与第一电润湿路径相交以产生至少一个微滴汇聚位置；
利用第二电磁辐射询检在所述位置上的微滴并且检测由每个微滴发射的任何荧光或拉曼散射。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个相伴延伸的第一电润湿路径是平行的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一电润湿路径和所述第三电润湿路径彼此成直角相交。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括在所述微滴汇聚位置处合并微滴的步骤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，使用一个或多个LED作为第二电磁辐射来执行询检所述微滴的步骤。
6.一种通过光学介导的电润湿(oEWOD)同时操控数千个微滴的设备，所述设备包括：
基片，所述基片包括第一介电层；
反射屏，所述反射屏被由LED发出的光照射，并配置成能够在第一介电层中快速地创建和破坏高度复杂的暂时电润湿位置的图案，从而使用被紧密控制的电润湿力使得微滴能够被精确地导控；
微处理器，所述微处理器被配置成操控作用点以便创建所述微滴沿其通过的路径，并还配置为使每个微滴的运动相对于彼此同步；以及
荧光或拉曼散射检测系统，所述荧光或拉曼散射检测系统包括第二电磁辐射和光电检测器，所述第二电磁辐射被配置为刺激来自微滴的荧光发射，所述光电检测器用于检测所述荧光发射。
7.根据权利要求6所述的设备，其中所述基片还包括第一复合壁和第二复合壁，所述第一复合壁和所述第二复合壁包括第一基底和第二基底、第一导体层和第二导体层、光敏层和第一介电层和第二介电层。
8.根据权利要求7所述的设备，其中所述第一复合壁和第二复合壁还包括分别在所述第一介电层和第二介电层上的第一防污层和第二防污层。
9.根据权利要求7或8所述的设备，其中设置有间隔物以用于保持第一壁和第二壁分开预定的深度。
10.根据权利要求8所述的设备，其中所述间隔物是柱。
11.根据权利要求8所述的设备，其中所述间隔物是珠。
12.根据权利要求8所述的设备，其中所述间隔物是脊。
13.根据权利要求8所述的设备，其中所述间隔物设置为锥形通道。
14.根据权利要求6所述的设备，还包括A/C电源，所述A/C电源附接到导体层以在其间提供10-50伏的范围的电势差。
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