KR20240050845A - 여드름 완화 효과가 있는 토복령 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents
여드름 완화 효과가 있는 토복령 추출물을 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 여드름 완화 효과가 있는 토복령 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 토복령 추출물을 포함하는 여드름 원인균 생육 억제 즉, 여드름 완화 효과가 있는 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 여드름 완화 효과가 있는 토복령 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 토복령 추출물을 포함하는 여드름 원인균 생육 억제 즉, 여드름 완화 효과가 있는 조성물에 관한 것이다.
약용식물인 망개덩굴(Smilax china)은 외떡잎식물 백합목 백합과의 낙엽덩굴로 중국, 우리나라, 일본 등 동남아 전역에 분포하며 특히 우리나라에서는 중부 이남의 산지에 많이 자생하는 덩굴식물이다. 예로부터 망개덩굴의 어린 잎은 나물로 먹기도 했고 또 떡(남부지방에서는 망개떡이라 부름)을 싸서 보관하면 여름철에도 잘 시지 않는 천연보존제로써 사용해 왔으며 최근에는 추출물을 팥 등에 첨가하여 식품용 첨가물로 사용하기도 한다. 토복령은 망개덩굴의 근경을 지칭하는 생약이며, 한방에서는 토복령을 이뇨, 해독, 소염, 위암, 식도염 등에 사용하고 있다.
화장품산업이 급성장하고 있음에 따라 화장품에 사용되는 천연소재에 대한 관심이 증가하고 있다. 그러나 화장품 소재에 대한 연구는 아직 기대에 못 미치고 있는 형편으로 화장품 산업이 한 단계 더 도약하기 위해서는 고부가가치를 창출할 수 있는 소재의 개발이 필수적이다. 최근 화장을 하는 젊은 계층의 나이가 점점 낮아지고 있고 그와 더불어 화장품의 사용량도 증가하고 있는 추세이다. 그러나 화학소재인 첨가물에 의해 피부트러블을 경험하는 경우가 많아지고 있으며 특히 젊은 세대에서 피지분비 및 세균 감염 등에 의해 염증을 동반한 여드름이 생겨 외모에 자신감을 잃게 하며 심한 경우 심한 흉터를 남길 수 있다.
여드름 완화 또는 치료제 성분으로는 과산화벤조일 같은 살균제, 피지분비를 억제하는 레티노이드, 각질제거 효능의 살리실산 및 풀빅산 등이 사용되나 얼굴이 화끈거리고 타는 듯한 느낌 및 피부 자극성을 주는 등 많은 부작용이 알려져 있다. 또한 여드름 치료용 의약품 성분으로써 클린다마이신과 에리트로마이신 같은 항생제가 사용되나 항생제 내성 등을 유발할 수 있으므로 화장품처럼 매일 사용하는 제품의 성분으로 사용하기는 어렵다.
따라서 화학소재가 아닌 저자극성, 안전성이 높은 천연소재의 여드름 치료 또는 완화 효과가 있는 소재의 개발이 절실히 요구된다. 본 연구에 의하면 한약재로 사용되는 토복령이 여드름균인 Cutibacterium acnes를 저해함을 알 수 있으므로 여드름을 완화할 수 있는 새로운 천연소재로써 화장품에 사용할 경우 고부가가치를 창출할 수 있을 것으로 기대된다.
천연소재의 추출에는 일반적으로 액상 추출에는 유기용매가 사용된다. 유기용매는 값이 싸고 추출효율이 좋은 장점을 가지고 있으나 실험자의 건강에 유해하고 환경오염 문제를 야기시킬 수 있는 단점이 있다. 최근 이러한 유기용매의 단점을 극복하고자 여러 가지 청정용매(green solvents)에 대한 연구가 진행되고 있다. 이에 따라 유기용매의 대안으로 이온성 액체나 공융 용매(Deep Eutectic Solvents)의 사용이 제시되어 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
이온성 액체(ionic liquids)는 거대 헤테로 고리 양이온과 다양한 무기 음이온의 결합으로 이루어진 염으로, 낮은 융점을 가져 상온에서 액체로 존재한다. 이온성 액체는 끓는점이 낮고, 낮은 증기압, 비휘발성, 낮은 융해점, 높은 이온 전도성 등을 갖기 때문에 추출과 분리 분야에 적용되어 왔다. 그러나 한편으로는 이러한 이온성 액체가 인체에 유해한 독성을 갖고 있으며 생분해성이 낮고 미량의 불순물에 의해서도 이온성 액체의 물리적 특성이 영향을 받을 수 있으며, 이온성 액체 합성 시 음이온의 완전한 교환을 위해 많은 염과 용매를 사용하기 때문에 환경친화적인 용매에 부적합하며 가격이 높다는 단점이 있다.
이러한 단점을 극복하기 위해 공융용매(Deep Eutectic solvent, DES)가 개발되었다. 이러한 DES는 가격이 싸며, 독성이 없어 인체에 무해하고 밀도, 점도, 이온 전도도 등 많은 물리화학적 특성이 이온성 액체와 유사하기 때문에 새로운 청정용매로 많은 연구가 진행되고 있다.
토복령 추출물의 주요 활성성분 중 하나인 레스베라트롤, 옥시레스베라트롤 같은 스틸벤노이드계 성분의 열적 불안정성 등도 고려해야 할 사항이다. 따라서 항균성을 유지하면서 토복령 추출물의 유효성분을 오랫동안 비교적 안정적으로 유지될 수 있는 최적의 제형 및 제조방법의 개발이 요구된다.
본 발명의 목적은 여드름 예방 또는 완화용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토복령 추출물에 함유된 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 여드름 예방 또는 완화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 여드름균 저해 효능을 가진 레스베라트롤, 옥시레스베라트롤, 케르세틴이 함유된 토복령 추출물을 공융용매를 이용하여 저해 효능을 극대화한 추출물을 얻는 방법 및 이를 최종 소재로 사용하여 여드름에 효과적인 조성물을 제조할 수 있다.
도 1은 토복령 추출 및 분액 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 토복령 추출물의 LC/MS/QTOF 크로마토그램(ESI- 모드) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 분리한 천연물의 여드름 균[C. acnes KCTC3314(좌)와 KCTC3320(우)]들에 대한 항균 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 토복령 추출물에 함유된 유효성분의 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314에 대한 최소저해농도 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1 중 실시예 2로 기재된 토복령 추출물의 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314에 대한 최소저해농도(MIC) 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 여드름균 C. acnes KCTC 3314 균주에 대한 토복령 추출물 함유 클렌징 폼의 항균 활성 (대조구(토복령 추출물 무첨가 크렌징 폼), 시료 #G1과 #G2 (토복령 0.1% 첨가 클렌징 폼))을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 여드름균 C. acnes KCTC 3314 균주에 대한 토복령 추출물 함유 클렌징 로션의 항균 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 여드름균 C. acnes KCTC 3314 균주에 대한 토복령 추출물 함유 클렌징 크림의 항균 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 토복령 추출물의 LC/MS/QTOF 크로마토그램(ESI- 모드) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 분리한 천연물의 여드름 균[C. acnes KCTC3314(좌)와 KCTC3320(우)]들에 대한 항균 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 토복령 추출물에 함유된 유효성분의 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314에 대한 최소저해농도 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1 중 실시예 2로 기재된 토복령 추출물의 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314에 대한 최소저해농도(MIC) 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 여드름균 C. acnes KCTC 3314 균주에 대한 토복령 추출물 함유 클렌징 폼의 항균 활성 (대조구(토복령 추출물 무첨가 크렌징 폼), 시료 #G1과 #G2 (토복령 0.1% 첨가 클렌징 폼))을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 여드름균 C. acnes KCTC 3314 균주에 대한 토복령 추출물 함유 클렌징 로션의 항균 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 여드름균 C. acnes KCTC 3314 균주에 대한 토복령 추출물 함유 클렌징 크림의 항균 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
토복령의 주성분으로 parilin, smilacin등의 saponin이 함유되어 있어 우리 몸의 면역과 여러 가지 세균의 감염으로부터 방어 역할을 하여, 강력한 항염, 항균제 역할을 한다. 다양한 미생물을 대상으로 한 토복령 추출물의 항균효과에 대해 많은 연구들이 이루어지고 있으나 아직 여드름균의 저해 효능에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 본 연구그룹에서는 특히 타 미생물에 비해 다루기가 까다로운 혐기성 여드름균(Cutibacterium acnes KCTC3314 및 KCTC3320)을 대상으로 토복령 추출물의 항균효과를 검증하여 효능을 확인하였다. 연구결과 피부 트러블을 일으키는 여드름 균과 같은 유해균에 대해 효능이 우수한 성분들이 토복령 추출물에 많이 함유되어 있음이 밝혀졌다.
이를 고려하여, 본 발명은 토복령 추출물에 함유된 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 여드름 예방 또는 완화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 토복령 추출물은 토복령의 물 및/또는 에탄올 추출물을 물, 비테인(Betaine) 및 사카로즈(Saccharose)를 포함하는 천연 공융용매 (Natural Deep Eutectic Solvents, NADES)로 추출한 다음, 여과하여 수득될 수 있다. 공융용매 중에서도 천연 화합물에 의해 이루어지는 공융 용매인 천연 공융용매(Natural Deep Eutectic Solvents, NADES)를 이용하는 천연물 추출에 관해 연구하여 피부 안전성이 확보된 새로운 천연소재를 개발하고자 하였으며, 상기 용매를 사용하며 본 연구의 토복령 추출물을 제조하는 경우 그 활성이 증대되어 우수한 여드름 항균활성을 가질 수 있음을 확인하였다.
토복령 추출물로부터 여드름균에 효능이 있는 활성성분을 액체크로마토그래피 및 고성능의 액체크로마토그래피/질량분석기(UPLC/MS/QTOF)를 이용하여 분리, 분석하여 여드름 저해 효능을 가진 각 성분들의 화학적 구조를 밝혔다.
토복령 추출 및 분액 후 분액물의 다양한 물질의 성분 및 구조를 확인한 결과, 플라보노이드 (Flavonoids)와 스틸벤노이드 (Stilbenoids) 성분이 주성분으로 나타났다. 여드름균에 저해 활성을 보이는 분리액을 확인하고, Prep-HPLC를 통해 순수하게 분리된 물질들을 대상으로 저해능을 조사한 결과 옥시레스베라트롤(13), 레스베라트롤(17) 및 케르세틴(20)이 가장 우수한 여드름균 저해효능을 가진 유효성분인 것으로 나타났다.
이를 바탕으로, 본 발명은 토복령 추출물에 함유된 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
구체적으로, 본 발명은 토복령 추출물에 함유된 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤을 유효성분으로 포함할 수 있다. 여드름균에 항균효과를 가지는 유효성분은 토복령 추출물에 함유된 스틸벤노이드계 화합물인 옥시레스베라트롤(13) 및 레스베라트롤(17)과 플라보노이드계 항균효과를 가지는 유효성분은 케르세틴(20)이다.
상기 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤의 함량비는 예를 들어, 1:3-5:7-9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤의 함량비는 토복령 추출물에 함유된 유효성분인 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤의 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314에 대한 최소저해농도(MIC) 또는 최소살균농도(MBC)가 각각 31.25, 125 및 250 ug/ml임을 근거로, 예를 들어 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤의 함량비는 1:4:8일 수 있다.
상기 조성물은 여드름 원인균 생육 억제 즉, 여드름 완화 효과가 있는 조성물로, Cutibacterium acnes KCTC 3314 및/또는 Cutibacterium acnes KCTC 3320에 대한 항균 활성을 나타낼 수 있다.
상기 토복령 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 예를 들어, 0.01~10중량%로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 토복령 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.025wt% 또는 0.06wt% 이상으로 포함될 수 있다. 상기 토복령 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 1wt% 이하로 포함될 수 있다. 상기 토복령 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.025wt% 내지 1 wt%, 0.025wt% 내지 0.06 wt% 또는 0.06 내지 1 wt%로 포함될 수 있다.
여드름은 모낭 피지선의 염증성 질환으로, 개방성 면포, 구진, 낭종, 결절 등 다양한 피부 병변을 나타낸다. 여드름은 주로 안드로겐 호르몬의 이상 작용에 의해 과도하게 분비된 오일이 모낭에 정체되어 모낭의 입구를 막아 공기의 순환을 차단함으로써 모낭 내부에 상주하는 혐기성 세균이 과도하게 증식하여 발생한다. 세균에 의한 여드름 피부염의 치료에 있어서, 에리스로마이신(erythromycin), 테트라사이틀린(tetracycline), 신다마이신(cindamycine)과 같은 항균 물질들이 주로 사용되어 왔으나, 이러한 항균 물질은 장기간 사용시 여드름 원인균의 내성, 광과민 작용과 같은 부작용을 야기한다.
본 발명에 따른 여드름 피부염의 예방 또는 완화용 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 상기 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학조성물을 제공한다. 백두산떡쑥 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 여드름 완화 기능 외에 여드름 치료용으로도 사용될 수 있다.
'치료'는 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하는 것을 의미한다. '예방'은 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병의 발현을 완화시키거나, 저해, 억제하는 것을 의미한다.
"유효량(또는, 유효한 양)"은 바람직한 효과를 전달하기에는 매우 충분하지만 의학적 판단 범위 내에서 심각한 부작용을 충분히 방지할 정도로 적은 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의하여 체내에 투여되는 조성물의 양은 투여 경로, 투여 대상을 고려하여 적절하게 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 여드름 피부염의 예방 또는 완화용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 상기 화장료 조성물을 사용하여 여드름에 효과적인 화장품을 제조할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예
실시예 1. 토복령 추출물 성분 분석
토복령 파우더 30g을 시료의 10배에 해당하는 에탄올 95%를 첨가하여 6시간 환류 냉각 추출하였다. 동일한 방법으로 3번 추출하고, 여과를 통해 이물질을 제거한 뒤 회전식 진공농축기를 이용하여 용매를 제거하였다. 수득한 건조 에탄올 추출물의 수득률은 8~10%였다. 도 1에 토복령 추출 및 분액 과정을 구체적으로 나타내었다.
토복령 분액물의 다양한 물질의 성분 및 구조를 확인하기 위하여 HPLC, FT-NMR, 고분해능 UPLC/MS/QTOF(Bruker)를 사용하였다. 확인된 24개의 물질의 구조는 표 1과 2에 나타내었으며 Flavonoids와 Stilbenoids 성분이 주성분으로 나타났다. 토복령 추출물의 LC/MS/QTOF 크로마토그램(ESI- 모드) 결과를 도 2에 나타내었다.
[표 1] 토복령 추출물의 성분물질
[표 2] 토복령 추출물 성분들의 화학적 구조
토복령 추출물을 얻은 후 다양한 용매로 분액을 하고 RCM agar plate에 분주한 여드름균 Cutibacterium acnes KCTC 3314를 대상으로 저해환을 보이는 분액물을 확인하였다. 또한 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 통해 분리액을 얻은 후 여드름균에 저해 활성을 보이는 분리액을 확인하였다. 최종적으로 Prep-HPLC를 통해 순수하게 분리된 물질들을 대상으로 저해능을 조사한 결과 옥시레스베라트롤(13), 레스베라트롤(17) 및 케르세틴(20) 등이 가장 우수한 여드름균 저해효능을 가진 유효성분인 것으로 나타났다.
실시예 2. 토복령 추출물에 함유된 유효성분의 항균활성
토복령 추출물을 얻은 후 다양한 용매로 분액을 하고 RCM agar plate에 분주한 여드름균 Cutibacterium acnes KCTC 3314를 대상으로 저해환을 보이는 분액물을 확인하였다. 또한 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 통해 분리액을 얻은 후 여드름균에 저해 활성을 보이는 분리액을 확인하였다. 최종적으로 Prep-HPLC를 통해 순수하게 분리된 물질들을 대상으로 저해능을 조사한 결과 레스베라트롤, 옥시레스베라트롤 및 케르세틴 등이 여드름균 저해효능을 가진 유효성분인 것으로 나타났다. 분리한 천연물의 여드름균[C. acnes KCTC3314와 KCTC3320]들에 대한 항균효과를 도 3에 나타내었다.
추출물 성분 중 가장 효능이 우수한 이 세 가지 물질 레스베라트롤, 옥시레스베라트롤 및 케르세틴을 대상으로 최소저해농도 (MIC) 및 최소살균농도 (MBC)를 측정하였다.
2-1. 최소저해농도(MIC)
MIC 테스트란 물질의 항균력을 측정하는 방법으로 특정한 미생물의 성장을 억제하는 항균물질의 최소 저해 농도를 측정하는 테스트를 말한다. 96well 마이크로플레이트에 RCM broth 176ul를 분주한 후 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314 20ul(최종농도 1x105CFU)와 농도별 시료 4ul를 각각 첨가한 후 24시간 배양하였다. 이후 각 well당 20ul의 resazurin(1mg/ml)을 첨가한 후 37℃, 100rpm, 2시간 반응 후 색의 변화를 관찰하여 균의 저해유무를 판단하였다.
토복령 추출물에 함유된 유효성분의 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314에 대한 최소저해농도 확인 시험 결과를 도 4에 나타내었다.
토복령 추출물에 함유된 유효성분의 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314에 대한 최소저해농도(MIC)를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
2-2. 최소살균농도(MBC)
96well 마이크로플레이트에 RCM broth 176ul를 분주한 후 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314 20ul(1x105CFU)와 농도별 시료 4ul를 각각 첨가한 후 24시간 배양하였다. 이후 각 well에서 배양액 2ul를 취해 RCM agar plate에 점적한 후 37℃에서 24시간 혐기적으로 배양한 후 콜로니 생성 유무를 관찰하였다.
토복령 추출물에 함유된 유효성분의 여드름 원인균 Cutibacterium acnes KCTC 3314에 대한 최소살균농도(MBC)를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
실험예 1. 토복령 추출물의 최소저해농도(MIC)
[비교예 1] 토복령 파우더 30g을 시료의 10배에 해당하는 ethanol 95% 첨가하여 6시간 환류 냉각 추출하였다. 동일한 방법으로 3번 추출하고, 여과를 통해 이물질을 제거한 뒤 회전식 진공농축기를 이용하여 용매를 제거하였다. 수득한 건조 ethanol 추출물의 수득률은 8~10%였다.
[비교예 2] 건조 후 분쇄된 토복령 100g에 30배 중량의 추출용매로서 정제수 300g, 에탄올 700g을 사용하였으며 25℃에서 3시간 동안 환류 추출하고, 50℃에서 감압 농축하여 13.5g의 추출물을 얻었다.
[비교예 3] 건조 후 분쇄된 토복령 100g에 30배 중량의 추출용매로서 정제수 300g, 에탄올 700g을 사용하였으며 50℃에서 3시간 동안 환류 추출하고, 50℃에서 감압 농축하여 13.7g의 추출물을 얻었다.
[실시예 1] 건조 후 분쇄된 토복령 100g에 물 90%, Betaine 5%, Saccharose 5% 용매에 50℃에서 3시간, 40kHz 초음파 추출하였다. 이후 와트만 GFC150mm 여과지로 여과하여 토복령 추출물을 얻었다.
[실시예 2] 건조 후 분쇄된 토복령 100g에 30배 중량의 추출용매로서 정제수 300g, 에탄올 700g을 사용하였으며 50℃에서 3시간 동안 환류 추출하고, 50℃에서 감압 농축하여 12g의 추출물을 얻었다.
이후 12g의 추출물을 NADES 공법으로 추출하기 위해 물 90%, Betaine 5%, Saccharose 5% 용매에 50℃에서 3시간, 40kHz 초음파 추출하였다. 이후 와트만 GFC150mm 여과지로 여과하여 토복령 추출물을 얻었다.
비교예 1~3, 실시예 1~2에서 얻은 추출물의 항균력을 알아보기 위하여 여드름균을 대상으로 최소저해 농도를 측정하였다. 96 well 마이크로플레이트에 RCM broth 176 ul를 분주한 후 여드름 원인균 C. acnes KCTC 3314 20 ul(1x105CFU)와 농도별 시료 4 ul를 각각 첨가한 후 24시간 배양하였다. 이후 각 well당 20 ul의 resazurin(1mg/ml)을 첨가한 후 37℃, 100rpm, 2시간 반응 후 색의 변화를 관찰하여 균의 저해유무를 판단하였다. 시료에 따른 최소저해농도 시험결과는 표 5 및 도 5에 나타내었다. 추출용매로서 에탄올, 공융용매, 초음파를 사용하여 실험하였다. 실시예 2에서 공융용매로 추출한 추출물이 C. acnes KCTC 3314 균주에서 250μg/ml로 가장 낮은 최소저해농도를 나타나 여드름균에 대한 항균효과가 가장 우수함을 알 수 있다.
[표 5] 토복령 추출물의 최소저해농도(MIC)
비교예와 실시예에서 최소저해 농도(MIC)를 바탕으로 여드름균 저해 효능을 나타내는 기능성 화장품 제로에 필요한 토복령 추출물의 농도는 최대 0.06wt%(비교예 1)에서 최소 0.025wt%(비교예 2)로 나타나 공융용매를 사용한 추출물이 여드름균에 대한 저해 효능이 가장 우수함을 알 수 있다.
실험예 2. 토복령 추출물의 적용한 클렌징폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림의 항균활성
2-1. 클렌징 크림, 로션 및 폼 제형
클렌징 크림, 클렌징 로션 및 클렌징폼의 구체적 제형을 표 6 및 7에 기재하였다.
[표 6]
[표 7]
한천확산법에 의한 클렌징 폼의 항균활성을 측정하기 위하여 시료를 3차 증류수로 2배 희석한 후 원심분리(13,000 rpm, 5분) 및 상층액 여과 필터(주사필터; 0.45 um)를 진행하였다. 이를 C. acnes KCTC 3314 균주가 접종된 RCM soft agar (1.2% agar, w/v)가 덮여 있는 MRS agar plate 위에 2 ul씩 점적하였다. 이후 37℃, 24시간 배양 후 생육저해환을 관찰하였다. 또한 생균수 측정을 통한 항균활성을 측정하기 위하여 C. acnes KCTC 3314 균주가 최종농도 약 1x105 CFU/ml이 되게 접종된 RCM broth 4 ml에 클렌징 크림 및 클렌징 로션 희석액 1ml (최종농도 20%)을 첨가한 후 37℃에서 배양하면서 경시적으로(0, 6, 12시간) 생균수를 측정하였다.
토복령 추출물의 적용한 클렌징 폼, 로션, 크림의 항균활성을 평가하였다. 도 6 내지 도 8에서와 같이, 세가지 제형 모두 토복령 추출물이 포함되었을 때 여드름 균에 대한 항균활성이 증가하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
Claims (6)
- 토복령 추출물에 함유된 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 여드름 예방 또는 완화용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 토복령 추출물에 함유된 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤을 유효성분으로 포함하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 케르세틴, 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤의 함량비는 1:3-5:7-9인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 토복령 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.025wt% 이상 포함되는 조성물.
- 제1항에 있어서, Cutibacterium acnes KCTC 3314 및/또는 Cutibacterium acnes KCTC 3320에 대한 항균 활성을 나타내는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 토복령 추출물은 토복령의 물 및/또는 에탄올 추출물을 물, 비테인(Betaine) 및 사카로즈(Saccharose)를 포함하는 천연 공융용매 (Natural Deep Eutectic Solvents, NADES)로 추출한 다음, 여과하여 수득되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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| KR1020220130733A KR20240050845A (ko) | 2022-10-12 | 2022-10-12 | 여드름 완화 효과가 있는 토복령 추출물을 포함하는 조성물 |
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