KR20240039025A - 인간 인터류킨-4 수용체 알파 항체 - Google Patents

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이칭 펑
마야 레이첼 카르타
돈미엔 도엔 문 릉
송칭 나
로라 앤 펠티에
다이애나 이자벨 루이즈
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Abstract

본 개시내용은 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체, 이러한 IL-4Rα 항체를 포함하는 조성물, 및 이러한 IL-4Rα 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

인간 인터류킨-4 수용체 알파 항체
본 개시내용은 의학 분야에 속한다. 특히, 본 개시내용은 인간 인터류킨-4 (IL-4) 수용체 알파 서브유닛 (IL-4Rα)에 특이적으로 결합하는 항체, 이러한 IL-4Rα 항체를 포함하는 조성물, 및 이러한 IL-4Rα 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
면역 염증성 장애 예컨대 제2형 염증성 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 천식, 식품 알레르기 등의 계속되는 유행은 상이한 표적 조직에 영향을 미치는 이질적인 장애 세트를 나타낸다. 면역학적 및 유전학적 연구에서 제2형 염증성 질환에서 수반되는 다양한 시토카인 및 시토카인 수용체가 확인되었고, 특히 인터류킨-4 수용체 알파 및 연관된 시토카인인 인터류킨-4 및 인터류킨-13이 제2형 염증성 경로의 주요 구동체로 확인되었다.
인간 인터류킨-4 수용체 알파 (일명 IL-4Rα; IL-4 수용체 서브유닛 알파; CD124; BSF 수용체)는 Th2-기반 면역 반응, 대안적인 대식세포 및 수지상 세포 활성화, 점막 면역, 알레르기성 염증, 종양 진행 및 죽종생성을 포함하는 다양한 생물학적 프로세스에서 중요한 역할을 하는 클래스 I 시토카인 수용체 패밀리 내의 막횡단 당단백질이다. IL-4Rα는 T 및 B 림프구, 호산구, 호염기구, 단핵구 및 대식세포, 수지상 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 기도 상피 세포 및 평활근 세포 상에서 발현되는 것으로 보고되었다. IL-4Rα는 신체 전반에 걸쳐 2가지 상이한 복합체 내에 존재한다. 제I형 수용체는 IL-4Rα 서브유닛과 통상적인 γ 쇄로 구성되고, IL-4에 특이적으로 결합하는 한편, 제II형 수용체는 IL-13Rα1로 공지된 상이한 서브유닛에 결합된 IL-4Rα 서브유닛으로 이루어진다. 제I형 및 제II형 IL-4Rα 수용체 둘 다는 IL-4 수용체 (IL-4R)로 지칭된다. 제I형 IL-4Rα는 예를 들어 림프구 및 골수 세포에서 발견되고, 제II형 IL-4Rα는 예를 들어 골수 세포 및 비-조혈 세포에서 발견된다. 이러한 제II형 수용체는 밀접하게 관련된 생물학적 기능이 있는 2개의 시토카인인 인터류킨-4 및 인터류킨-13 둘 다에 결합하는 능력을 갖는다.
인간 인터류킨-4 (일명 IL-4; BSF-1)는 조혈, 내피, 상피, 근육, 섬유모세포, 간세포 및 뇌 조직을 포함하는 광범위한 조직에 존재한다. 인간 IL-4는 체액 및 적응 면역에서 주요 조절인자인 것으로 확인되었고, 예를 들어, 활성화된 B-세포의 자극, T-세포 증식, B 세포의 형질 세포로의 분화, 나이브 CD4+ T 세포의 Th2 이펙터 세포로의 분화의 유도, B 세포 및 골수 계통 세포, 예컨대 단핵구 세포 상에서의 MHC 클래스 II 생산, CD23 및 IL-4Rα의 상향-조절, Th1 세포, 대식세포, IFN-감마 및 수지상 세포 IL-12의 생산의 감소에서 역할을 한다. (Hershey et al.,N. Engl. J. Med. 1997, 337 (24): 1720-5).
인간 인터류킨-13 (일명 IL-13; P600)은, 예를 들어, 알레르기성 천식에서, 예를 들어, 기도 상피에서의 술잔 세포 화생, 평활근 세포 수축 및 점액 생산에서 중요한 역할을 한다. IL-4Rα에 대한 IL-13 복합체의 결합은 티로신 키나제 2 (Tyk-2) 및 Janus 키나제 1 (JAK1)을 포함하는 다중 전달 경로의 활성화를 개시시킨다. 따라서, IL-4 및 IL-13 시토카인 둘 다는 STAT6 전사 인자를 활성화시키고, IgE로의 B-세포 클래스 전환 및 호산구의 주화성을 촉진하며, 또한 종양 증식, 세포 생존, 세포 부착 및 전이에서 잠재적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. (Suzuki, A., et al., Cytokine 2015; 75(1): 79-88). IL-13은 B 세포, 호염기구, 호산구, 비만 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 단핵구, 대식세포, 호흡 상피 세포, 및 평활근 세포를 포함하는 다중 세포 유형에 의해 발현된다. (Hershey et al., N. Engl. J. Med. 1997, 337 (24): 1720-5).
제2형 염증성 질환을 표적화하는 항체 치료제가 공지되어 있고, 승인되었거나 임상 개발 중이다. 이러한 항체는 IL-4Rα를 표적화하는 두필루맙; IL-4를 표적화하는 파스콜리주맙; IL-13 경로를 표적화하는 레브리키주맙, 안루킨주맙 및 트랄로키누맙을 포함한다. (Junttila, I., Frontiers in Immunology 2018, 9: 888). 그러나, 이러한 표적화된 요법의 개발에도 불구하고, 제2형 염증성 장애 예컨대 천식, 아토피성 피부염 및/또는 호산구성 식도염 (EoE)에 걸린 환자, 및 여전히 치료에 저항성이거나 현재의 요법, 예컨대 두필루맙의 지속적이지 않은 반응자인 환자에서 사용하기 위한 추가적인 IL-4Rα 항체가 여전히 요구된다.
상세한 설명
본 개시내용은 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하고 IL-4R, IL-4 및/또는 IL-13 매개 반응 (예를 들어, B 세포 증식, STAT-6 인산화, CD23 발현)을 억제하는 항체, 이러한 IL-4Rα 항체를 포함하는 조성물, 및 이러한 IL-4Rα 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα의 n-말단 제III형 피브로넥틴 도메인 1 및 2에 스패닝된 신규 에피토프에 결합하고/거나, 원하는 결합 친화력을 갖고/거나, IL-4 및 IL-13 매개 IL-4R 신호전달 둘 다를 차단하고/거나, 우수한 개발가능성 특성 예컨대 점도 및/또는 응집을 갖는 인간 IL-4Rα 항체를 제공한다. 이러한 인간 IL-4Rα 항체는 아토피성 피부염, 호산구성 식도염 (EoE), 비강 폴립증, 천식, 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 자발성 두드러기 (CSU)를 포함하는, IL-4 또는 IL-13 매개 IL-4R 신호전달과 연관된 제2형 염증성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 IL-4Rα 항체는 추가로 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 인간 IL-4Rα 항체는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: 1) 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα의 n-말단 제III형 피브로넥틴 도메인 1 및 2에 스패닝된 신규한 구조적 에피토프에 결합함, 2) 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα 상의 신규한 기능적 에피토프에 결합함, 3) 바람직한 결합 친화력으로 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα에 결합함, 4) IL-4 매개 IL-4R 신호전달을 억제함, 5) IL-13 매개 IL-4R 신호전달을 억제함, 6) 이펙터 기능 매개 사멸을 유의하게 유도하지 않음, 7) 보체 결합을 유의하게 유도하지 않음, 8) Fcγ 수용체 결합을 유지함 및/또는 9) 낮은 점도, 혈청 단백질 결합 및/또는 응집을 가짐.
일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 항체는 완전히 인간형인 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 IL-4Rα의 신규한 구조적 에피토프에 결합하며, 여기서 에피토프는 IL-4Rα의 n-말단 제III형 피브로넥틴 도메인의 도메인 1 및 도메인 2에 스패닝된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 IL-4Rα의 신규한 기능적 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 B 세포, T 세포, 및 골수 세포 상의 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합한다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα에 결합하고 IL-4Rα에 대한 IL-4 및 IL-13 결합을 차단함으로써 IL-4R 매개 신호전달을 예방한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 IL-4 및 IL-13 유도된 IL-4R STAT-6 인산화, B 세포 증식, 및 CD23 발현을 억제한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 이펙터 기능 매개 사멸을 유의하게 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG4P 또는 인간 IgG1A 백본을 갖는 항-인간 IL-4Rα 항체는 Fcγ 수용체 결합을 유지한다. 이러한 실시양태에서, 인간 IgG4P 또는 인간 IgG1A 백본을 갖는 항-인간 IL-4Rα 항체는 이펙터 널 백본 (예를 들어, IgG1AAA)을 갖는 인간 IL-4Rα 항체와 비교 시 B 세포 및 골수 세포에 대한 개선된 결합을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, F41, L42, L43, E45, H47, T48, C49, I50, E52, H62, L64, M65, D66, D67, V68, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호(SEQ ID NO): 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, F41, L42, L43, E45, H47, T48, C49, I50, E52, H62, L64, M65, D66, D67, V68, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, F41, L43, E45, H47, T48, C49, I50, H62, L64, M65, D66, D67, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, F41, L43, E45, H47, T48, C49, I50, H62, L64, M65, D66, D67, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 D12, M14, S15, I16, L39, F41, L42, T48, C49, I50, E52, H62, L64, M65, D66, D67, V68, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, L39, F41, L42, T48, C49, I50, E52, H62, L64, M65, D66, D67, V68, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, T48, C49, I50, E52, H62, M65, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, T48, C49, I50, E52, H62, M65, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 이들 잔기는 IL-4Rα의 N-말단 제III형 피브로넥틴 도메인의 도메인 2에 위치한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 잔기 D66, D67, 및 D125 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함) 중 적어도 1개 이상을 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 잔기 D66 및 D67 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함) 중 적어도 1개를 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 잔기 D66 및 D125 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함) 중 적어도 1개를 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 잔기 D66 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)을 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 구조적 및/또는 기능적 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 IL-4Rα의 n-말단 제III형 피브로넥틴 도메인의 도메인 1 및 도메인 2에 스패닝된다. 특정한 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 신규한 구조적 및/또는 기능적 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 IL-4Rα에 대한 IL-4 결합 부위와 중첩된다. 이러한 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 대한 IL-4의 결합을 차단한다. 특정한 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 신규한 구조적 및/또는 기능적 에피토프에 결합하피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 IL-4Rα에 대한 IL-13 결합 부위와 중첩된다. 이러한 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 대한 IL-13의 결합을 차단한다. 특정한 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 신규한 구조적 및/또는 기능적 에피토프에 결합하며, 여기서 에피토프는 IL-4Rα에 대한 IL-4 및 IL-13 결합 부위 둘 다와 중첩된다. 이러한 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 대한 IL-4 및 IL-13의 결합을 차단한다. 일부 실시양태에서, IL-4Rα 에피토프는 X선 결정학, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 입체 장애 돌연변이유발, 및/또는 HDX-MS에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, IL-4Rα 에피토프는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하고 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 VH는 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열식별번호: 1을 포함하고, HCDR2는 서열식별번호: 2를 포함하고, HCDR3은 서열식별번호: 3을 포함하고, LCDR1은 서열식별번호: 4를 포함하고, LCDR2는 서열식별번호: 5를 포함하고, LCDR3은 서열식별번호: 6을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 8을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 33을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 10을 포함하는 LC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 35를 포함하는 HC 및 서열식별번호: 10을 포함하는 LC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 9를 포함하는 HC 및 서열식별번호: 10을 포함하는 LC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 13을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 10을 포함하는 LC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 37을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 10을 포함하는 LC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 31을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 10을 포함하는 LC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 50을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 10을 포함하는 LC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 52를 포함하는 HC 및 서열식별번호: 10을 포함하는 LC를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열식별번호: 42를 포함하고, HCDR2는 서열식별번호: 2를 포함하고, HCDR3은 서열식별번호: 3을 포함하고, LCDR1은 서열식별번호: 22를 포함하고, LCDR2는 서열식별번호: 5를 포함하고, LCDR3은 서열식별번호: 6을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 44를 포함하는 VH 및 서열식별번호: 45를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 46을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 47을 포함하는 LC를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열식별번호: 19를 포함하고, HCDR2는 서열식별번호: 20을 포함하고, HCDR3은 서열식별번호: 3을 포함하고, LCDR1은 서열식별번호: 22를 포함하고, LCDR2는 서열식별번호: 5를 포함하고, LCDR3은 서열식별번호: 24를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체는 서열식별번호: 25를 포함하는 VH 및 서열식별번호: 26을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 27을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 28을 포함하는 경쇄 (LC)를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 이소타입을 갖는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 이소타입을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 가지며, 여기서 항체는 IgG1A로도 지칭되는 아미노산 잔기 322에서의 알라닌을 포함한다 (K322A 치환) (EU 넘버링). 이러한 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 보체 활성이 감소되거나 제거되었다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 IgG1AA 또는 IgGIAAA로도 지칭되는 L234A, L235A 및/또는 P329A를 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 가지며, 이는 Fcγ 및 C1q 수용체에 대한 결합이 감소되거나 제거되었다 (모든 잔기는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨). 일부 실시양태에서, 인간 IgG1A 백본을 갖는 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1AAA 이펙터 널 백본을 갖는 인간 IL-4Rα 항체와 비교 시 B 세포 및 골수 세포에 대한 개선된 결합을 나타낸다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG4 이소타입을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG4P로도 지칭되는, S228P 치환 (EU 넘버링)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 힌지 영역을 가지며, 이는 생체 내에서 IgG4 Fab-아암 교환을 감소시킨다 (문헌 [Labrijn, et al., Nat. Biotechnol. 2009, 27(8):767] 참조). 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG4AA로도 지칭되는 F234A 및/또는 L235A (EU 넘버링)를 포함하는 변형된 인간 IgG4 Fc 영역을 갖고, 이는 Fcγ 및 C1q 수용체에 대한 결합을 감소시킨다. 본 개시내용의 일부 실시양태에 따르면, Fc 영역은 IgG4PAA로도 지칭되는 S228P, F234A 및 L235A (모든 잔기는 IMGT 또는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG4P 백본을 갖는 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이펙터 널 백본을 갖는 인간 IL-4Rα 항체와 비교 시 B 세포 및 골수 세포에 대한 개선된 결합을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 야생형 인간 IgG4 HC 불변 영역이 있는 동일한 항체와 비교하여 항체의 점도를 감소시키는 변형된 인간 IgG4 HC 영역을 갖는다. 이러한 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 야생형 인간 IgG4 HC 불변 영역과 비교하여 하기의 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다: Q274K, Q355R, E419Q (모든 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨).
다른 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 야생형 인간 IgG4 HC 영역과 비교하여 하기의 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 영역을 갖는다: E137G, D203N, Q274K, Q355R, E419Q (모든 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨).
일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 E137G 치환 (EU 넘버링)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 D203N 치환 (EU 넘버링)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Q274K 치환 (EU 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Q355R 치환 (EU 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 E419Q 치환 (EU 넘버링에 따름)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Q274K 및 Q355R 치환 (모든 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Q274K 및 E419Q 치환 (모든 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Q355R 및 E419Q 치환 (모든 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Q274K, Q355R, 및 E419Q 치환 (모든 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 S228P, Q274K, Q355R, E419Q 치환 (모든 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 S228P, E137G, D203N, Q274K, Q355R, E419Q 치환 (모든 위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)을 포함하는 변형된 인간 IgG4 HC 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 아미노산 잔기 137 (EU 넘버링)에서의 글리신, 아미노산 잔기 203 (EU 넘버링)에서의 아스파라긴, 아미노산 잔기 274 (EU 넘버링)에서의 리신, 아미노산 잔기 355 (EU 넘버링)에서의 아르기닌, 또는 아미노산 잔기 419 (EU 넘버링)에서의 글루타민.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: 아미노산 잔기 274 (EU 넘버링)에서의 리신, 아미노산 잔기 355에서의 아르기닌, 및 아미노산 잔기 419 (EU 넘버링)에서의 글루타민.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: 아미노산 잔기 137 (EU 넘버링)에서의 글리신, 아미노산 잔기 203 (EU 넘버링)에서의 아스파라긴, 아미노산 잔기 274 (EU 넘버링)에서의 리신, 아미노산 잔기 355에서의 아르기닌, 및 아미노산 잔기 419 (EU 넘버링)에서의 글루타민.
추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 접합체 화합물 (바이오접합체로도 지칭됨)의 생성에서 사용하기 위한 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 변형된 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 불변 도메인을 갖는다 (WO 2018/232088 A1 참조). 더욱 특히, 본 개시내용의 이러한 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 잔기 124 (EU 넘버링)에서의 시스테인, 또는 아미노산 잔기 378 (EU 넘버링)에서의 시스테인, 또는 아미노산 잔기 124 (EU 넘버링)에서의 시스테인 및 아미노산 잔기 378 (EU 넘버링)에서의 시스테인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 변형된 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 프레임워크 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형은 VH의 프레임워크 영역 내에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 VL의 프레임워크 영역 내에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 VH 및 VL의 프레임워크 영역 내에 있다. 추가 실시양태에서, 변형된 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 프레임워크 영역은 항체의 면역원성 위험을 저하시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IL-4Rα에 결합하고 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및 인간 IL-13의 결합을 억제한다. 이러한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4의 결합을 억제하고 따라서 인간 IL-4R 활성화, STAT-6 인산화, B 세포 및/또는 T 세포 증식, 및 CD23 발현을 억제한다. 이러한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 결합하고 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4의 결합을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 감소시킨다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B 및 T 세포 상의 인간 IL-4Rα에 결합하고 B 및 T 세포에서의 IL-4 유도된 STAT-6 인산화를 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 억제한다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B 세포 상의 IL-4Rα에 결합하고 IL-4 유도된 B 세포 증식을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 골수 세포 상의 인간 IL-4Rα에 결합하고 인간 골수 세포 상에서의 IL-4 유도된 CD23 발현을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-13의 결합을 억제한다. 이러한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-13의 결합을 억제하고 따라서 인간 IL-4R 활성화, STAT-6 인산화, B 및/또는 T 세포 증식 및 CD23 발현을 억제한다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 결합하고 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-13의 결합을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 억제한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B 세포 상의 인간 IL-4Rα에 결합하고 B 세포에서의 IL-13 유도된 STAT-6 활성화를 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 억제한다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-13의 결합을 억제하고 B 세포 및/또는 T 세포 증식을 억제한다. 이러한 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B 세포 및/또는 T 세포 상의 인간 IL-4Rα에 결합하고 IL-13 유도된 B 및/또는 T 세포 증식을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 골수 세포 상의 인간 IL-4Rα에 결합하고 인간 골수 세포 상에서의 IL-13 유도된 CD23 발현을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 신규 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, F41, L42, L43, E45, H47, T48, C49, I50, E52, H62, L64, M65, D66, D67, V68, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및/또는 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, F41, L43, E45, H47, T48, C49, I50, H62, L64, M65, D66, D67, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및/또는 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, L39, F41, L42, T48, C49, I50, E52, H62, L64, M65, D66, D67, V68, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및/또는 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, T48, C49, I50, E52, H62, M65, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및/또는 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 여기서 이들 잔기는 IL-4Rα의 N-말단 제III형 피브로넥틴 도메인의 도메인 2 내에 위치한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및/또는 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 아미노산 잔기 D66, D67, 및 D125 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함) 중 적어도 1개를 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및/또는 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 아미노산 잔기 D66 및 D67 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함) 중 적어도 1개를 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및/또는 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 아미노산 잔기 D66 및 D125 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함) 중 적어도 1개를 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 인간 IL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합함으로써 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4 및/또는 인간 IL-13의 결합을 억제하며, 여기서 에피토프는 아미노산 잔기 D66 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함)을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 신규 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 VH 또는 VL을 코딩하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 11, 12, 14, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 48, 49, 51, 또는 53의 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 9, 10, 13, 27, 28, 31, 33, 35, 37, 46, 47, 50, 또는 52를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 9, 13, 27, 31, 33, 35, 37, 46, 50, 또는 52를 포함하는 항체 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 예를 들어, 핵산은 서열식별번호: 11, 14, 29, 32, 34, 36, 38, 48, 51, 또는 53으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 10, 28, 또는 47을 포함하는 항체 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 예를 들어, 핵산은 서열식별번호: 12, 30, 또는 49로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 7, 8, 25, 26, 44, 또는 45를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 7, 25, 또는 44를 포함하는 항체 VH를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 8, 26, 또는 45를 포함하는 항체 VL을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 항체 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 예를 들어, 이러한 벡터는 서열식별번호: 9, 13, 27, 31, 33, 35, 37, 46, 50, 또는 52를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 10, 28, 또는 47을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
항체 VH 또는 VL을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 또한 본원에서 제공된다. 예를 들어, 이러한 벡터는 서열식별번호: 7, 25, 또는 44를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 8, 26, 또는 45를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
항체 중쇄를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 항체 경쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 벡터 또한 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 9, 13, 27, 31, 33, 35, 37, 46, 50, 또는 52를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10, 28, 또는 47을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 9를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 13을 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 27을 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 28을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 31를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 33을 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 35를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 37을 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 50을 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 52를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 46을 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 47을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
항체 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 항체 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 9, 13, 27, 31, 33, 35, 37, 46, 50 또는 52를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10, 28, 또는 47을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 9를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 13을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 27을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 28을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 31을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 33을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 35를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 37을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 50을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 52를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 46을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 47을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다.
본 개시내용의 핵산은, 예를 들어, 핵산이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 후에, 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 자신이 작동가능하게 연결된 핵산을 발현할 수 있는 발현 제어 서열이 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 폴리펩티드(들)의 분비를 용이하게 하는 하나 이상의 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 관심 핵산 (예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산)을 함유하는 발현 벡터가 널리 공지된 방법, 예를 들어, 안정적 또는 일시적 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 추가적으로, 발현 벡터는 원하는 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포의 검출을 돕기 위해 하나 이상의 선별 마커, 예를 들어, 테트라시클린, 네오마이신 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기술된 핵산, 벡터 또는 핵산 조성물을 포함하는 세포, 예를 들어, 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 숙주 세포는 본원에 기술된 항체 전체 또는 이의 일부분을 발현하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염되거나, 형질전환되거나, 형질도입되거나 또는 감염된 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본 개시내용의 항체의 HC 및 LC 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염되거나, 형질전환되거나, 형질도입되거나 또는 감염될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 항체의 HC 폴리펩티드를 발현하는 제1 벡터 및 LC 폴리펩티드를 발현하는 제2 벡터로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염되거나, 형질전환되거나, 형질도입되거나 또는 감염될 수 있다. 이러한 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 숙주 세포는 본원에 기술된 바와 같은 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체를 발현할 수 있다. 항체를 발현할 수 있는 것으로 공지된 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포, HEK293 세포, COS 세포, 및 NS0 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포, 예를 들어, 숙주 세포는 서열식별번호: 9, 13, 27, 31, 33, 35, 37, 46, 50, 또는 52를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10, 28, 또는 47을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포, 예를 들어, 숙주 세포는 서열식별번호: 9, 13, 27, 31, 33, 35, 37, 46, 50, 또는 52를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10, 28, 또는 47을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함한다.
본 개시내용은 상기 기술된 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 숙주 세포를 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 배양하고, 발현된 항체를 배양 배지로부터 회수함으로써, 본원에 기술된 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 항체가 분비된 배양 배지를 통상적인 기술에 의해 정제할 수 있다. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)] 및 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)]에 기술되어 있다.
본 개시내용은 임의의 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 추가로 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기술된 항체, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 또한 포함할 수 있다. 제약 조성물은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed. (2012), A. Loyd et al., Pharmaceutical Press]).
본원에 기술된 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 또는 제약 조성물은 IL-4R 연관 장애 예컨대 면역 염증성 장애, 예컨대 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 비강 폴립증, 천식, 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 자발성 두드러기 (CSU)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 제2형 염증성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 항체는 암, 예를 들어, B 세포 연관 암, 예컨대 CLL, 또는 기타 암 예컨대 악성 신경교종, 난소암, 폐암, 유방암, 두경부의 편평세포 암종 (SCCHN), 췌장암, 신장암, 결장암, 전립선암, 및 방광암을 치료하는데 추가로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 하나 이상의 화학요법 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학요법 작용제는 본원에 기술된 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 제약 조성물과 동시에, 별개로 또는 순차적으로 조합되어 투여된다. 본 개시내용의 실시양태는 이온화 방사선과 동시에, 별개로 또는 순차적으로 조합하여 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 제약 조성물로 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 치료 유효량의 본원에 기술된 바와 같은, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 이러한 항체를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 또는 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 이러한 항체, 핵산 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 IL-4R 연관 장애, 예를 들어, 면역 염증성 장애 예컨대 제2형 면역 염증성 장애, 또는 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 본원에 기술된 항체, 핵산, 벡터 또는 제약 조성물은 비경구 경로 (예를 들어, 피하 및 정맥내)에 의해 투여될 수 있다. 실시양태에서, IL-4Rα/IL-4 및/또는 IL-4Rα/IL-13과 연관된 면역 염증성 장애는 제2형 염증성 장애이다. 이러한 제2형 염증성 장애는 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 비강 폴립증, 천식, 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 자발성 두드러기 (CSU)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, IL-4R 장애는 암, 예를 들어, B 세포 연관 암, 예컨대 CLL, 또는 기타 암 예컨대 악성 신경교종, 난소암, 폐암, 유방암, 두경부의 편평세포 암종 (SCCHN), 췌장암, 신장암, 결장암, 전립선암, 및 방광암이다.
요법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터 또는 제약 조성물 또한 본원에서 제공된다. 추가로, 본 개시내용은 IL-4R 장애, 예를 들어, 면역 염증성 장애 예컨대 제2형 염증성 장애, 또는 암의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기술된 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터 또는 제약 조성물을 또한 제공한다. 이러한 제2형 염증성 장애는 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 비강 폴립증, 천식, 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 자발성 두드러기 (CSU)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, IL-4R 연관 장애는 암, 예를 들어, B 세포 연관 암, 예컨대 CLL, 또는 기타 암 예컨대 악성 신경교종, 난소암, 폐암, 유방암, 두경부의 편평세포 암종 (SCCHN), 췌장암, 신장암, 결장암, 전립선암, 및 방광암이다.
IL-4R 연관 장애, 예를 들어, 면역 염증성 장애 예컨대 제2형 염증성 장애 또는 암의 치료를 위한 약제의 제조에서의 본원에 기술된 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터 또는 제약 조성물의 용도가 본원에서 제공된다. 이러한 제2형 염증성 장애는 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 비강 폴립증, 천식, 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 자발성 두드러기 (CSU)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, IL-4R 연관 장애는 암, 예를 들어, B 세포 연관 암, 예컨대 CLL, 또는 기타 암 예컨대 악성 신경교종, 난소암, 폐암, 유방암, 두경부의 편평세포 암종 (SCCHN), 췌장암, 신장암, 결장암, 전립선암, 및 방광암이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "IL-4Rα"는, 달리 언급되지 않는 한, 세포 내에서 IL-4Rα 전구체 단백질의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 천연 성숙 IL-4Rα를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 이 용어는 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 또는 레서스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 IL-4Rα를 포함한다. 이 용어는 IL-4Rα의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 또한 포함한다. 인간 IL-4Rα의 예의 아미노산 서열, 예를 들어, 유니프롯(UniProt) 참조 서열 P24394 (서열식별번호: 39)가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα의 예의 아미노산 서열, 예를 들어, NCBI 참조 서열 XP_005591572.2 (서열식별번호: 40) 또한 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 용어 "IL-4Rα"는 모든 공지된 인간 IL-4Rα 아이소형 및 다형성 형태를 총괄적으로 지칭하도록 본원에서 사용된다. 본원에서 사용된 서열 넘버링은 신호 펩티드가 없는 성숙 단백질을 기초로 한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "IL-4R"은, 달리 언급되지 않는 한, IL-4Rα 서브유닛과 통상적인 γ 쇄의 복합체 (제I형 수용체) 또는 IL-4Rα 서브유닛과 IL-13Rα1의 복합체 (제II형 수용체)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "IL-4"는, 달리 언급되지 않는 한, 세포 내에서 IL-4 전구체 단백질의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 천연 성숙 IL-4를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 이 용어는 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 또는 레서스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 IL-4를 포함한다. 이 용어는 IL-4의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 또한 포함한다. 인간 IL-4의 예의 아미노산 서열, 예를 들어, 유니프롯 참조 서열 P05112 (서열식별번호: 17)가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 용어 "IL-4"는 모든 공지된 인간 IL-4 아이소형 및 다형성 형태를 총괄적으로 지칭하도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "IL-13"은, 달리 언급되지 않는 한, 세포 내에서 IL-13 전구체 단백질의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 천연 성숙 IL-13을 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 이 용어는 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 또는 레서스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 IL-13을 포함한다. 이 용어는 IL-13의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 또한 포함한다. 인간 IL-13의 예의 아미노산 서열, 예를 들어, 유니프롯 참조 서열 P35225 (서열식별번호: 18)가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 용어 "IL-13"은 모든 공지된 인간 IL-13 아이소형 및 다형성 형태를 총괄적으로 지칭하도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CD23"은, 달리 언급되지 않는 한, 세포 내에서 CD23 전구체 단백질의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 천연 성숙 CD23을 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 이 용어는 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 또는 레서스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 CD23을 포함한다. 이 용어는 CD23의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 또한 포함한다. 인간 CD23의 예의 아미노산 서열, 예를 들어, 유니프롯 참조 서열 P06734 (서열식별번호: 41)가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 용어 "CD23"은 모든 공지된 인간 CD23 아이소형 및 다형성 형태를 총괄적으로 지칭하도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "IL-4R 연관 장애"는 IL-4R 매개 신호전달과 연관된 장애, 예컨대 예를 들어 제1형 IL-4R 및 제II형 IL-4R 신호전달과 연관된 장애를 지칭한다. 이러한 IL-4R 연관 장애는, 예를 들어, 면역 염증성 장애를 포함할 수 있다. 이러한 면역 염증성 장애는 본원에 개시된 바와 같은 제2형 염증성 장애를 포함할 수 있다. IL-4R 연관 장애는 추가로 암을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항원에 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 항체의 실시양태는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 또는 접합 항체를 포함한다. 항체는 임의의 클래스 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA), 및 임의의 서브클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 것일 수 있다.
예시적인 항체는 쇄간 디술피드 결합을 통해 가교된 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)인 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성된 이뮤노글로불린 G (IgG) 유형 항체이다. 4개의 폴리펩티드 쇄 각각의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 아미노산 약 100-125개 이상의 가변 영역을 포함한다. 4개의 폴리펩티드 쇄 각각의 카르복실-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 함유한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 항체 중쇄의 Fc 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 항체의 영역을 지칭한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG 이소타입은 서브클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)로 추가로 분류될 수 있다. 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 카바트(Kabat) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991))에서와 같은 EU 인덱스를 기초로 한다. 용어 EU 인덱스 넘버링 또는 EU 넘버링은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해지는 더욱 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. CDR은 단백질의 표면 상에 노출되고, 항원 결합 특이성을 위한 항체의 중요한 영역이다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복실-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원에서, 중쇄의 3개의 CDR은 "HCDR1, HCDR2 및 HCDR3"으로 지칭되고, 경쇄의 3개의 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"으로 지칭된다. CDR은 항원과의 특이적 상호작용을 형성하는 잔기의 대부분을 함유한다. CDR에 대한 아미노산 잔기의 할당은 카바트 (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), 코티아(Chothia) (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)), North (North et al., "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)), 또는 IMGT (www.imgt.org에서 입수가능한 국제 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics) 데이터베이스; 문헌 [Lefranc et al., Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212] 참조)에 기술된 것들을 포함하는 널리 공지되어 있는 체계에 따라 행해질 수 있다. North CDR 정의가 본원에 기술된 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체에 사용된다.
본 개시내용의 실시양태는 항원과 특이적으로 상호결합하는 능력을 유지하는 항체의 적어도 일부분을 포함하는 항체 단편 또는 항원 결합 단편 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv, scFab, 디술피드-연결 Fv (sdFv), Fd 단편 또는 선형 항체를 또한 포함하며, 이는 예를 들어 Fc 영역 또는 IgG 중쇄 불변 영역에 융합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 영역을 지칭한다. 임의적으로, Fc 영역은 항체 중쇄의 힌지 영역의 일부분 또는 전체 힌지 영역을 포함할 수 있다. 생물학적 활성 예컨대 이펙터 기능이 Fc 영역에 기인하며, 이는 항체 이소타입에 따라 변한다. 항체 이펙터 기능의 예는 Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포 매개 포식작용 (ADCP), C1q 결합, 보체 의존적 세포독성 (CDC), 포식작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 항원의 아미노산 잔기를 지칭한다. 에피토프는 선형 에피토프, 입체형태적 에피토프, 또는 하이브리드 에피토프일 수 있다. 용어 "에피토프"는 구조적 에피토프와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 구조적 에피토프는 항체에 의해 덮이는 항원의 영역 (예를 들어, 항원에 결합될 때의 항체의 발자국)을 기술하도록 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구조적 에피토프는 항체의 아미노산 잔기로부터 특정한 근접성 (예를 들어, 특정 숫자의 옹스트롬) 이내에 있는 항원의 아미노산 잔기를 기술할 수 있다. 용어 "에피토프"는 기능적 에피토프와 관련하여 사용될 수도 있다. 일부 실시양태에 따르면, 기능적 에피토프는 항원과 항체 사이의 결합 에너지에 기여하는 방식으로 항체의 아미노산 잔기와 상호작용하는 항원의 아미노산 잔기를 기술하도록 사용될 수 있다. 에피토프는 "에피토프 맵핑 기술"로도 칭해지는 상이한 실험 기술에 따라 결정될 수 있다. 에피토프의 결정은 사용된 상이한 에피토프 맵핑 기술에 따라 변할 수 있고, 예를 들어, 특정 실험 조건에 의해 유도된 항원의 구조적 변화 또는 절단으로 인해, 사용된 상이한 실험 조건에 따라서도 변할 수 있는 것으로 이해된다. X선 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 부위-지정 돌연변이유발, 종 교환 돌연변이유발, 알라닌-스캐닝 돌연변이유발, 입체 장애 돌연변이유발, 수소-중수소 교환 (HDX), 및 교차-차단 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 에피토프 맵핑 기술이 관련 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Rockberg and Nilvebrant, Epitope Mapping Protocols: Methods in Molecular Biology, Humana Press, 3rd ed. 2018]; [Holst et al., Molecular Pharmacology 1998, 53(1): 166-175]).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "결합한다"는, 달리 지시되지 않는 한, 또 다른 단백질 또는 분자와 화학 결합 또는 끌림 상호작용을 형성하는 단백질 또는 분자의 능력을 의미하도록 의도되며, 이는 관련 기술 분야에 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 결정되는 바와 같은 2개의 단백질 또는 분자의 근접을 초래한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "핵산"은 천연 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드의 유사체가 혼입되어 있는, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 뉴클레오티드-함유 분자, 예컨대 DNA, cDNA 및 RNA 분자를 포함하는 뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 DNA 또는 RNA 중합효소 또는 합성 반응에 의해 내부에 혼입된 물질을 또한 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 인간, 침팬지, 유인원, 원숭이, 소, 말, 양, 염소, 돼지, 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스, 기니 피그 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물을 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효량"은 대상체에게 단일 또는 다중 용량으로 투여되었을 때 진단 또는 치료 중인 대상체에서 원하는 효과를 제공하는 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 양을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효량"은 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응, 예를 들어, 효소 또는 단백질 활성의 감소 또는 억제를 유발하거나, 또는 증상을 호전시키거나, 컨디션을 완화시키거나, 질환 진행을 둔화 또는 지연시키거나, 또는 질환을 예방할 것 등의 본 개시내용의 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 양 또는 용량을 또한 지칭한다. 비제한적 실시양태에서, 용어 "치료 유효량"은 대상체에게 투여되었을 때 컨디션 또는 장애 또는 질환을 적어도 부분적으로 완화시키고/거나, 억제하고/거나, 예방하고/거나 호전시키는데 효과적인 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 양 (투여량에서 및 기간 동안 및 투여 수단에 대한)을 지칭한다. 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유발하는 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 또한 유효량은 치료적으로 이로운 효과가 본 발명의 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 임의의 독성이거나 해로운 효과보다 우세한 양이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "억제한다"는, 예를 들어, 생물학적 반응 또는 활성의 절감, 저하, 둔화, 감소, 정지, 파괴, 폐지, 길항 또는 차단을 지칭하지만, 반드시 생물학적 반응의 완전한 제거를 지시하지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 본원에 개시된 장애 또는 질환의 둔화, 제어, 지연 또는 정지, 또는 장애 또는 질환 증상의 호전이 있을 수 있는 모든 프로세스를 지칭하지만, 반드시 모든 장애 또는 질환 증상의 완전한 제거를 지시하지는 않는다. 치료는 환자, 특히 인간에서의 질환 또는 컨디션의 치료를 위한 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 투여를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 5% 이내를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 문맥에서 (특히 청구범위의 문맥에서) 사용된 단수형 및 유사한 용어는 본원에서 달리 지시되거나 또는 문맥적으로 명확하게 모순되지 않는 한 단수형 및 복수형 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 바와 같은 "화학요법 작용제" 또는 "화학요법제"는 암 세포 및 조직에 대해 선택적으로 파괴적인 화학 작용제 또는 약물이다. 화학요법제는 탁산 화합물, 탁산 메커니즘을 통해 작용하는 화합물, 백금 화합물, 안트라시클린 화합물, 항대사물질, 알킬화제, 에피도필로톡신 화합물, 캄프토테신 화합물, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 또는 이의 임의의 조합물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 화학요법 작용제는 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이온화 방사선"은 암 세포를 파괴하거나 손상시키도록 사용된 특정 파장의 방사선이다. 이온화 방사선은 라돈, x선, 감마선, 및 기타 형태의 고에너지 방사선을 포함한다. 이온화 방사선은 외부 방사선 (또는 외부 빔 방사선), 내부 방사선 (또는 근접치료) 또는 전신 방사선을 포함할 수 있다.
도 1은 IL-4Rα ECD에 결합된 8660 인간 IL-4Rα 항체의 Fab 부분의 X선 결정 구조와 인간 IL-4Rα와 복합체를 이룬 크리스탈 카파(Crystal Kappa) 디자인의 두필루맙 Fab 부분 (pdb 접속 코드 6WGL)의 결정 구조의 오버레이를 제시한다.
도 2는 인간 IL-4Rα ECD와 복합체를 이룬 크리스탈 카파 디자인의 5F3 Fab 부분의 결정 구조 내의 기능적 에피토프 아미노산 잔기 위치 (인간 IL-4Rα 잔기 Asp66 및 Asp125)를 제시한다.
도 3A-3B는 MSD ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같은 인간 IL-4Rα (3A) 및 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα (3B)에 대한 5F3 및 5559 인간 IL-4Rα 항체의 결합 특이성을 제시한다.
도 4A-4C는 인간 B 세포 (4A 및 4C) 및 T 세포 (4B) 상의 IL-4Rα에 대한 5559 인간 IL-4Rα 항체의 결합 특이성을 제시한다.
도 5A-5B는 5F3, 8660, 및 5559 인간 IL-4Rα 항체가 세포-기반 검정에서 IL-4Rα에 대한 IL-4 (5A) 및 IL-13 (5B)의 결합을 차단한다는 것을 제시한다.
도 6A-6B는 5559 인간 IL-4Rα 항체가 1차 인간 B 세포 (6B) 및 T 세포 (6A)에서 IL-4 유도된 pSTAT6 인산화를 억제한다는 것을 제시한다. 도 6C는 5559 인간 IL-4Rα 항체가 인간 B 세포에서 IL-13 유도된 pSTAT6 인산화를 억제한다는 것을 제시한다.
도 7은 5559 인간 IL-4Rα 항체가 IL-4 유도된 B 세포 증식을 억제한다는 것을 제시한다.
도 8A-8B는 5559 인간 IL-4Rα 항체가 골수 세포에서 IL-4 (8A) 및 IL-13 (8B) 유도된 CD23 발현을 억제한다는 것을 제시한다.
도 9는 5559 인간 IL-4Rα 항체가 ELISA 검정에서 보체 성분 C1q에 결합하지 않는다는 것을 제시한다.
도 10A-10B는 5559 인간 IL-4Rα 항체가 리포터 유전자-기반 검정 (10A) 또는 1차 세포-기반 검정 (10B)에서 ADCC 활성을 유의하게 유도하지 않는다는 것을 제시한다.
도 11은 5559 인간 IL-4Rα 항체가 Daudi 세포에서 CDC 활성을 유도하지 않는다는 것을 제시한다.
도 12A-12B는 5559 인간 IL-4Rα 항체의 시차 주사 열량측정법 (DSC) 써모그램을 제시한다.
도 13은 IL-4Rα ECD에 결합된 5559 인간 IL-4Rα 항체의 Fab 부분의 X선 결정 구조와 인간 IL-4Rα와 복합체를 이룬 크리스탈 카파 디자인의 두필루맙 Fab 부분 (pdb 접속 코드 6WGL)의 결정 구조의 오버레이를 제시한다.
도 14는 인간 IL-4Rα ECD와 복합체를 이룬 크리스탈 카파 디자인의 5559 Fab 부분의 결정 구조 내의 인간 IL-4Rα 아미노산 잔기 위치 Asp66, Asp67 및 Asp125 (모두 구조적 에피토프에서 확인되고, 추가적으로 Asp66은 기능적 에피토프에서 확임됨)를 제시한다.
실시예
실시예 1: 인간 IL-4Rα에 결합하는 항체 (항-인간 IL-4Rα 항체)의 생성 및 조작
항체 생성: 인간 IL-4Rα에 특이적인 항체를 개발하기 위해, 인간 이뮤노글로불린 가변 영역을 갖는 트랜스제닉 마우스를 인간 IL-4Rα의 Fc-태그 세포외 도메인 (ECD)으로 면역화시키고, 인간 및 시노몰구스 원숭이 Fc-태그 IL-4Rα ECD 단백질을 교대로 추가 접종하였다. 교차 반응성을 확인하고, 과량의 가용성 IL-4의 부재 또는 존재 하에 IL-4 차단 항체를 확인하기 위해 히스티딘-태그 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα ECD로 스크리닝을 행하였다. 교차 반응성 항체를 Fab로서 클로닝하고, 발현하고, 표준 절차에 의해 정제하고, 리포터 세포주인 인간 배아 신장 (HEK)-블루(Blue) IL-4/IL-13 (인비보젠(InvivoGen))에서 IL-4 및 IL-13에 대한 차단 활성에 대해 테스트하였다. 항체를 선택하고, 이의 CDR, 가변 도메인 프레임워크 영역, 및 IgG 이소타입에서 조작하여, 친화력, 안정성, 용해도, 점도, 소수성과 같은 특장을 개선시키고, 뿐만 아니라 응집을 감소시켰다.
인간 IL-4Rα ECD의 아미노산 서열이 서열식별번호: 15로 제공되고, 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα ECD의 아미노산 서열이 서열식별번호: 16으로 제공되고, 인간 IL-4의 아미노산 서열이 서열식별번호: 17로 제공되고, 인간 IL-13의 아미노산 서열이 서열식별번호: 18로 제공된다.
본 발명의 항체는 널리 공지된 방법에 의해 합성 및 정제될 수 있다. 2개의 벡터가 사용되는 경우 사전 결정된 HC:LC 벡터 비를 사용하거나 또는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 단일 벡터 시스템을 사용하여 항체를 분비시키기 위해 발현 시스템으로 적합한 숙주 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)를 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 항체가 분비된 정화된 배지를 통상적으로 사용되는 기술을 사용하여 정제할 수 있다.
IL-4Rα 항체의 항체 조작: 친화력 및/또는 생물물리학적 특성 (예컨대 열적, 화학적 안정성, 또는 용해도, 감소된 응집 또는 소수성)을 개선시키는 돌연변이를 찾기 위해 고처리량, 부위-특이적, 포화 돌연변이유발 프로토콜을 사용하여 IL-4Rα 항체 5F3 IgG4PAA를 포유동물 세포 발현 벡터에서 Fab로서 조작하였다. 5F3 IgG4PAA는, FcγR에 대한 결합을 감소시키는, IgG4 Fc 영역 내의 아미노산 잔기 치환 F234A 및 L235A, 및 힌지를 안정화시키고 아암 교환을 방지하는 아미노산 치환 S228P를 포함한다.
조작에 대해 간략하게, 384-미량역가 플레이트에 배열된 일련의 전방향 및 역방향 올리고를 사용하여, 5F3 IgG4PAA의 VL 및 VH 쇄 둘 다의 CDR 내의 모든 아미노산이 개별적인 돌연변이유발 반응에서 돌연변이되어 총 18개의 변이체 (시스테인 제외)가 생성되었을 뿐만 아니라, 원래의 아미노산 잔기로 되돌아갔다 (내장형 야생형 대조군 WT를 구성함). 확립된 절차에 따라 부위-지정 돌연변이유발 반응이 수행되었고, DpnI 제한 효소와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 WT 플라스미드의 소화가 달성되었다. 소화 생성물을 이. 콜라이(E. coli) 내로 형질전환시키고, 37℃에서의 밤새 인큐베이션 후 벌크 형질전환체로부터 DNA를 단리하였다. 각각의 개별적인 VL 및 VH 돌연변이유발 반응으로부터의 DNA를 적합한 WT 항체 가변 영역과 혼합하고, 96-딥 웰 플레이트 내의 CHO 세포에서 발현하였다. 분비된 항체를 정량하고, 일관된 역가에 대해 정규화한 후, 열 챌린지 단계의 존재 또는 부재 하에 ELISA 포맷으로 IL4Rα에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. CDR 돌연변이체를 평가하는 것에 더하여, 프레임워크 영역 내의 비정형 생식계열 잔기를 더욱 전형적인 아미노산으로 전환시키는 돌연변이체를 유사하게 평가하였다.
ELISA 적정, 옥텟(Octet), 또는 비아코어8K(Biacore8K)에 의해 히트를 확인한 후, 구조-기반 고려사항의 안내를 받고, 선택하고, 조합하고, 전장 항체 포맷으로 도입하고, 부틸-HIC, 헤파린, 칼럼 상호작용 및 크기 배제 크로마토그래피, 시차 주사 열량측정법, 및 질량 분광법에 의한 혈청 단백질 결합을 사용하여 친화력 및 생물물리학적 특성에 대해 평가하였다.
친화력 결합 분석은 5F3 IgG4PAA 항체가 10-9 M 범위의 KD로 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα에 대해 중등도의 친화력을 갖는다는 것을 제시하였다. 5F3 IgG4PAA 내의 CDR 아미노산 잔기의 돌연변이유발로 CDR 치환 LCDR3 H91W, N92S가 확인되었으며, 이는 생성된 항체의 친화력을 10-11 M 범위로 유의하게 개선시켰다.
추가로, 열 챌린지 ELISA에서 개선된 열 안정성에 이르는 아미노산 잔기 치환 또한 확인되었다: VH: A23V, N92S, I31H; VL: G28D. 추가적으로, VH: A23V, I58V; VL: G28D의 아미노산 잔기 치환이 친화력을 유지하면서 자가-회합 및 소수성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. VH: I31H의 아미노산 잔기 치환은 혈청 단백질 결합을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
추가적으로, 5F3 IgG4PAA 항체는 스트레스가 많은 조건 하에 탈아미드화되는 HC 프레임워크 3 내의 아스파라긴 (N72)을 함유한다. N72 아미노산 잔기를 더욱 생식계열인 Asp (N72D)로 치환하였으며, 이는 탈아미드화의 제거를 초래하였다.
5F3 IgG4PAA의 돌연변이유발 분석으로 7개의 조작용 아미노산 잔기가 확인되었다. 이러한 7개의 아미노산 잔기가 하기와 같이 치환되었다: VH 영역 내의 I31H, I58V, N72D 및 VL 영역 내의 H91W 및 N92S가 조합되어 8660 항체 변이체가 생성되었고, 이러한 5개의 치환에 더하여, VH 영역 내의 A23V 및 VL 영역 내의 G28D가 부가되어 5559 항체 변이체가 생성되었다. 표 1은 예시된 항체의 CDR 아미노산 서열을 제시한다.
표 2에 제공된 바와 같은 것들을 포함하여, 상이한 IgG 백본을 갖는 5559 및 8660 항체의 여러 버전이 생성되었다. 7개의 아미노산 잔기의 조작으로 유의하게 개선된 친화력, 및 친화력을 유지하면서 다른 생물물리학적 특성 예컨대 열 안정성, 감소된 자가-회합, 소수성, 및/또는 혈청 단백질 결합을 갖는 5559 항체 변이체가 생성되었다.
점도를 개선시키기 위한 항체 불변 영역 조작: 전하 밸런싱을 통해 5559 IgG4 인간 IL-4Rα 항체 중쇄 불변 영역을 조작하여, 점도를 개선시키고 항체의 Fab와 불변 도메인 사이의 잠재적인 정전기 상호작용을 완화시켰다. 인간 IgG1 HC 불변 영역과 비교 시 인간 IgG4 항체의 HC 불변 영역 내의 CH1, CH2, 및 CH3 도메인은 균일하지 않은 전하 분포로 인해 보다 낮은 등전점 (pI)을 갖는다. 따라서, 5559 IgG4 항체의 점도에 영향을 미치는 CH1, CH2, 및 CH3 도메인 내의 5개의 주요 아미노산 잔기가 확인되었다: 1) E137 (CH1 도메인), 2) D203 (CH1 도메인), 3) Q274 (CH2 도메인), 4) Q355 (CH3 도메인), 및 5) E419 (CH3 도메인). 이러한 5개의 아미노산에 대한 hIgG1 불변 영역 내의 유사한 위치는 상이하고, 각각의 도메인의 전체적인 pI에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.
IgG4 항체의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 pI를 IgG1 항체에 매칭시키고, 면역원성 펩티드의 잠재적인 도입을 최소화하기 위해, IgG4 불변 영역 내의 5개의 확인된 위치 중 3개에서의 잔기를 IgG1 불변 영역에서 확인되는 상응하는 잔기로 전환시켰다. 아미노산 잔기 치환은 하기를 포함하였다: 위치 274에서의 중성으로 하전된 글루타민을 치환하는 양으로 하전된 리신 (Q274K), 위치 355에서의 중성으로 하전된 글루타민을 치환하는 양으로 하전된 아르기닌 (Q355R) 및 위치 419에서의 중성으로 하전된 글루탐산을 치환하는 중성으로 하전된 글루타민 (E419Q). 생성된 IgG4 Fc를 "KRQ"로 명명하였다.
모든 5개의 확인된 아미노산 잔기에서의 IgG1에서 발견된 것들로의 치환 (E137G, D203N, Q274K, Q355R, 및 E419Q)을 포함하는 IgG4 불변 영역을 또한 구축하였고, "GNKRQ"로 명명하였다.
IgG4 KRQ 및 IgG4 GNKRQ 항체는 힌지를 안정화시키고 아암 교환을 방지하는 S228P 돌연변이를 또한 포함하였으며, 이는 IgG4P로 명명되었다. 야생형 IgG4 CH1 도메인을 인간 카파 불변 도메인과 함께 사용하여 구축물을 완성하였다. 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 항체를 합성하고, 발현하고, 정제하였다.
IgG4P 또는 IgG1A 백본의 선택 : B 세포 및 골수 세포에 대한 예상치 못한 결합 특성으로 인해 예시된 5559 항체에 대해 인간 IgG1A 및/또는 인간 IgG4P 백본이 선택되었다. 표 5B 및 도 4C에 나타난 바와 같이, 예시된 5559 IgG4P 및 5559 IgG1A IL-4Rα 항체는 5559 IgG1AAA 이펙터 널 항체와 비교 시 B 세포에 대한 보다 큰 결합 친화력을 갖는 것으로 밝혀졌고, 따라서 이펙터 널이도록 조작되지 않은 5559 항체의 Fc 부분이 B 세포 결합에 긍정적으로 영향을 미쳤다는 것을 지시한다.
표 1: 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 CDR 아미노산 서열
Figure pct00001
표 2: 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 아미노산 서열
Figure pct00002
실시예 2: 인간 IL-4Rα 항체의 구조적 및 기능적 에피토프
예시된 항-IL-4Rα 항체의 구조적 에피토프를 X선 결정학에 의해 결정하고, 예시된 항-IL-4Rα 항체의 기능적 에피토프를 ELISA에 의해 결정하였다.
실시예2a. X선 결정학에 의한 8660 Fab의 구조적 에피토프 결정
인간 IL-4Rα 상의 8660 항-IL-4Rα 항체의 Fab의 물리적 에피토프를 인간 IL-4Rα와 예시된 항체 사이의 상호작용 계면을 확인함으로써 결정하였다. 간략하게, 구조적 에피토프를 결정하기 위해, 인간 IL-4Rα ECD를 8660의 Fab 부분과 공동-결정화시켰다. 8660 Fab의 CH1 도메인 이후에 말단절단된 중쇄 및 "크리스탈 카파" 버전의 경쇄의 헥사히스티딘-태그 IgG1 변이체를 생성시킴으로써 IL-4Rα와 복합체를 형성한 8660 Fab의 구조를 결정하였다 (본원에 전문이 참조로 포함된 문헌 [Lieu et al., "Rapid and Robust Antibody Fab Fragment Crystallization Utilizing Edge-to-edge Beta-sheet Packing", PLoS One, 15(9) (2020)] 참조). 8660 변이체를 C182L 돌연변이를 함유하는 헥사히스티딘-태그 버전의 인간 IL-4Rα ECD와 공동-발현한 후, 복합체를 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, 결정화에 대해 시판되는 표준 스크린을 사용하여 스크리닝하였다. 어드밴스드 포톤 소스(Advanced Photon Source)에서 결정이 수득되고 x선 회절 데이터 데이터가 수집되었다. 분자 교체에 의해 회절 데이터가 감소 및 해상되었고, 예시된 8660 Fab 및 IL-4Rα ECD 복합체의 2.8 Å 구조가 산출되도록 정련되었다. 생성된 결정 구조로부터, 공동-결정화된 8660 Fab의 원자로부터 4.5 Å 이내의 임의의 IL-4Rα 아미노산 잔기가 에피토프의 일부로서 카운팅되었다 (파이몰(PyMOL) 시각화 소프트웨어 [슈뢰딩거(Schroedinger)®]를 사용함).
파이몰 분석은 결정 구조 복합체 내의 8660 Fab로부터 4.5 Å 이내에 있는 IL-4Rα 아미노산 잔기 (서열식별번호: 15와 관련됨)가 예시된 항체에 대한 구조적 에피토프를 구성하였음을 나타냈다. 구체적으로, 분석에서 구조적 에피토프가 하기 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 결정되었다: 위치 12에서의 Asp, 위치 14에서의 Met, 위치 15에서의 Ser, 위치 16에서의 Ile, 위치 37에서의 Tyr, 위치 39에서의 Leu, 위치 41에서의 Phe, 위치 43에서의 Leu, 위치 45에서의 Glu, 위치 47에서의 His, 위치 48에서의 Thr, 위치 49에서의 Cys, 위치 50에서의 Ile, 위치 62에서의 His, 위치 64에서의 Leu, 위치 65에서의 Met, 위치 66에서의 Asp, 위치 67에서의 Asp, 위치 69에서의 Val, 위치 72에서의 Asp, 위치 99에서의 Arg, 위치 121에서의 Pro, 위치 123에서의 Pro, 위치 124에서의 Pro, 위치 125에서의 Asp. 구조적 에피토프가 IL-4Rα의 N-말단 제III형 피브로넥틴 도메인의 도메인 1 및 2에 스패닝된다는 것이 분석에서 추가로 결정되었다. 또한, 구조적 에피토프의 하기 아미노산 잔기가 IL-4Rα의 N-말단 제III형 피브로넥틴 도메인의 도메인 2에 위치한다는 것이 분석에서 결정되었다: R99, P121, P123, P124, D125.
추가적으로, 예시된 8660 Fab 및 인간 IL-4Rα와 복합체를 형성한 크리스탈 카파 디자인의 두필루맙 Fab (pdb 접속 코드 6WGL)의 결정 구조의 오버레이는 두필루맙과 비교 시 8660 Fab가 IL-4Rα 상의 신규 에피토프에 결합하였음을 지시하였다 (도 1).
또한, IL-4 및 IL-13 및 각각의 구조 내의 IL-4Rα 성분 상의 이들의 각각의 수용체의 공개된 복합체 (pdb 접속 코드 3BPN 및 3BPO)와 예시된 IL-4Rα 8660 Fab:IL-4Rα 복합체 결정 구조의 정렬 (파이몰 시각화 소프트웨어를 사용함)은 예시된 8660 Fab 항체 에피토프가 IL-4Rα에 대한 IL-4 및 IL-13 결합 부위 둘 다와 중첩되었음을 제시하였으며, 따라서 이는 IL-4Rα에 대한 예시된 항체의 결합이, 예시된 항체의 Fab 변이체 부분이 IL-4Rα에 결합될 때 IL-4 및 IL-13 시토카인이 IL-4Rα에 결합하는 것을 물리적으로 차단할 것임을 지시한다.
실시예 2b. 5F3 IgG4PAA의 기능적 에피토프 결정
예시된 인간 IL-4Rα 항체 5F3 IgG4PAA의 기능적 에피토프를 ELISA에 의해 결정하였다. 간략하게, 하기와 같이 헥사히스티딘-태그 인간 IL-4Rα 세포외 도메인 (ECD) 내로 30개의 표면 아미노산 잔기 치환을 개별적으로 도입하였다: K2D, E6R, K22D, P26R, T31R, F41A, L42G, L43G, E45R, G56R, D66R, A71R, Q82G, K87D, E94R, H107A, D108R, P124R, D125R, D143R, R148D, L155R, R160D, S164R, S168R, Q181R, P192R, K195D, 또는 H197G. 상기 기술된 바와 같은 단일 아미노산 잔기 치환이 있는 각각의 돌연변이체 단백질을 CHO 세포에서 일시적으로 발현하고, 표준의 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제하였다. ELISA 플레이트를 PBS 내의 1 μg/mL 염소 항-인간 카파 항체 (서던 바이오테크(Southern Biotech), 카탈로그# 2060-01)로 4℃에서 밤새 코팅한 후, PBST에서 3회 세정하고, PBS 카세인으로 30분 동안 실온에서 차단하였다. 그 후, 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, 예시된 인간 IL-4Rα 항체 5F3 IgG4PAA를 PBS-카세인 내의 1 μg/mL의 최종 농도로 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, IL-4Rα 돌연변이체 단백질을 PBS-카세인에서 1 μg/mL로부터 3배 연속 희석하고, 50 μL/웰로 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, PBS-카세인 내의 항-히스티딘 태그 항체 HRP 접합체 (R&D 시스템즈(R&D Systems), Cat. # MAB050H)의 5000배 희석물을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세정하고, TMB 기질 (피어스(Pierce), Cat. # 34021)을 제조사의 지침에 따라 첨가하고, H2SO4로 반응을 켄칭시키고, ELISA 플레이트 판독기에서 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 결합 신호를 나타내지 않았거나 또는 대조군 항체와 비교 시 유의하게 감소된 결합 신호를 나타낸 웰에 상응하는 돌연변이된 아미노산 잔기로서 항체의 기능적 에피토프가 결정되었다.
표 3에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 5F3 IgG4PAA 항체에 대한 기능적 에피토프가 아미노산 잔기 D66 및 D125를 포함한다는 것을 제시한다. 구조적 에피토프에서 확인된 아미노산 잔기 중에서, IL-4Rα 상에서의 D66R 및 D125R의 아미노산 잔기 치환이 돌연변이된 IL-4Rα에 대한 예시된 5F3 IgG4PAA의 결합에 대한 유의하게 부정적인 영향을 각각 나타냈다. 구체적으로, IL-4Rα의 아미노산 잔기 D66이 아르기닌으로 치환되는 것이 돌연변이된 IL-4Rα에 대한 5F3 IgG4PAA의 결합을 대조군의 것 미만으로 감소시켰다 (각각 0.04 OD450 및 0.14 OD450). 또한, IL-4Rα의 결정 구조 상에서 아미노산 잔기 D66 근처에 위치하는 아미노산 잔기 D125 (도 2 참조)가 아르기닌으로 치환되는 것 또한 0.59 OD450의 유의하게 감소된 결합을 제시하였다. 나머지 아미노산 치환은 양성 결합 범위 내에 있거나 또는 결정된 구조적 에피토프의 외부에 있었다.
표 3a: 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 기능적 에피토프 결정
Figure pct00003
실시예 2c: 인간 IL-4Rα 5559 항체의 구조적 에피토프
X선 결정학에 의한 5559 Fab의 구조적 에피토프 결정 . 인간 IL-4Rα 상의 5559 항체의 Fab의 물리적 에피토프를 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 결정하였다. 어드밴스드 포톤 소스에서 결정이 수득되고 x선 회절 데이터 데이터가 수집되었다. 분자 교체에 의해 회절 데이터가 감소 및 해상되었고, 예시된 5559 Fab 및 IL-4Rα ECD 복합체의 2.49 Å 구조가 산출되도록 정련되었다. 생성된 결정 구조로부터, 공동-결정화된 5559 Fab의 원자로부터 4.5 Å 이내의 임의의 IL-4Rα 아미노산 잔기가 에피토프의 일부로서 카운팅되었다 (몰레큘러 오퍼레이팅 인바이론먼트(Molecular Operating Environment) (MOE) 시각화, 모델링 및 시뮬레이션 소프트웨어 [케미컬 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group)], 쿠트(Coot) (일반 공중 사용 허가서) 및 파이몰 시각화 소프트웨어 [슈뢰딩거®]를 사용함).
MOE, 쿠트, 및 파이몰 분석은 결정 구조 복합체 내의 5559 Fab로부터 4.5 Å 이내에 있는 IL-4Rα 아미노산 잔기 (서열식별번호: 15와 관련됨)가 예시된 항체에 대한 구조적 에피토프를 구성하였음을 나타냈다. 구체적으로, 분석에서 구조적 에피토프가 하기 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 결정되었다: 위치 12에서의 Asp, 위치 14에서의 Met, 위치 15에서의 Ser, 위치 16에서의 Ile, 위치 39에서의 Leu, 위치 41에서의 Phe, 위치 42에서의 Leu, 위치 48에서의 Thr, 위치 49에서의 Cys, 위치 50에서의 Ile, 위치 52에서의 Glu, 위치 62에서의 His, 위치 64에서의 Leu, 위치 65에서의 Met, 위치 66에서의 Asp, 위치 67에서의 Asp, 위치 68에서의 Val, 위치 69에서의 Val, 위치 72에서의 Asp, 위치 99에서의 Arg, 위치 121에서의 Pro, 위치 123에서의 Pro, 위치 124에서의 Pro, 위치 125에서의 Asp, 위치 192에서의 Pro. 위치 66에서의 Asp는 5559 Fab의 중쇄와의 상호작용이 2.6 - 2.9 Å 사이이면서 잘 배위되었다. 위치 67에서의 Asp는 상호작용이 3.1 -3.5 Å 사이로 더 길었고, 이의 측쇄 주변에서 과도한 밀도가 관찰되는 것에 의해 증명되는 바와 같이, 이의 결합 위치에서 유연성을 나타냈다. 구조적 에피토프가 IL-4Rα의 N-말단 제III형 피브로넥틴 도메인의 도메인 1 및 2에 스패닝된다는 것이 분석에서 결정되었다. 또한, 구조적 에피토프의 하기 아미노산 잔기가 IL-4Rα의 N-말단 제III형 피브로넥틴 도메인의 도메인 2에 위치한다는 것이 분석에서 결정되었다: R99, P121, P123, P124, D125, P192.
예시된 5559 Fab 및 인간 IL-4Rα와 복합체를 형성한 크리스탈 카파 디자인의 두필루맙 Fab (pdb 접속 코드 6WGL)의 결정 구조의 오버레이는 두필루맙과 비교 시 5559 Fab가 IL-4Rα 상의 신규 에피토프에 결합하였음을 제시하였다 (도 13).
IL-4 및 IL-13 및 각각의 구조 내의 IL-4Rα 상의 이들의 각각의 수용체의 공개된 복합체 (pdb 접속 코드 3BPN 및 3BPO)와 예시된 IL-4Rα 5559 Fab:IL-4Rα 복합체 결정 구조의 정렬 (파이몰 시각화 소프트웨어를 사용함)은 예시된 5559 Fab 항체 에피토프가 IL-4Rα에 대한 IL-4 및 IL-13 결합 부위 둘 다와 중첩되었음을 제시하였다. 이는 예시된 5559 항체의 결합이 IL-4 및 IL-13 시토카인이 IL-4Rα에 결합하는 것을 물리적으로 차단할 것임을 지시하였다.
실시예 2d. 인간 IL-4Rα 5559 항체의 기능적 에피토프 결정
예시된 인간 IL-4Rα 항체 5559 IgG4P KRQ의 기능적 에피토프를 ELISA에 의해 결정하였다. 간략하게, 하기와 같이 헥사히스티딘-태그 인간 IL-4Rα 세포외 도메인 (ECD) 내로 30개의 표면 아미노산 잔기 치환을 개별적으로 도입하였다: K2D, E6R, K22D, P26R, T31R, F41A, L42G, L43G, E45R, E52R, G56R, D66R, A71R, Q82G, K87D, E94R, H107A, D108R, P124R, D125R, D143R, R148D, L155R, R160D, S164R, S168R, Q181R, P192R, K195D, 또는 H197G. 상기 기술된 바와 같은 단일 아미노산 잔기 치환이 있는 각각의 돌연변이체 단백질을 CHO 세포에서 일시적으로 발현하고, 표준의 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제하였다. ELISA 플레이트를 PBS 내의 1 μg/mL 염소 항-인간 IgG Fc 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories), 카탈로그# 109-005-098)로 4℃에서 밤새 코팅한 후, PBST에서 3회 세정하고, PBS 카세인으로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 그 후, 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, 예시된 인간 IL-4Rα 항체 5559 IgG4P KRQ를 PBS-카세인 내의 1 μg/mL의 최종 농도로 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, IL-4Rα 돌연변이체 단백질을 PBS-카세인에서 3개의 지점에 대해 1 μg/mL로부터 5배 연속 희석하고, 50 μL/웰로 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, PBS-카세인 내의 항-히스티딘 태그 항체 HRP 접합체 (R&D 시스템즈, Cat. # MAB050H)의 1000배 희석물을 첨가하고, 45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세정하고, TMB 기질 (피어스, Cat. # 34028)을 제조사의 지침에 따라 첨가하고, H2SO4로 반응을 켄칭시키고, ELISA 플레이트 판독기에서 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 결합 신호를 나타내지 않았거나 또는 야생형 대조군과 비교 시 유의하게 감소된 결합 신호를 나타낸 웰에 상응하는 돌연변이된 아미노산 잔기로서 항체의 기능적 에피토프가 결정되었다.
표 4에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 5559 IgG4P KRQ 항체에 대한 기능적 에피토프가 아미노산 잔기 D66을 포함한다는 것을 제시한다. IL-4Rα 상에서의 D66에서 D66R로의 아미노산 잔기 치환은 D66R IL-4Rα에 대한 5559 IgG4P KRQ의 결합을 음성 대조군의 것 미만으로 감소시켰다 (각각 0.047 OD450 및 0.063 OD450). 아미노산 잔기 D66은 IL-4Rα의 결정 구조 상에서 구조적 에피토프 잔기 D67 및 D125 근처에 위치한다 (도 14). 나머지 아미노산 치환은 양성 결합 범위 내에 있거나 또는 결정된 구조적 에피토프의 외부에 있었다.
표 3b: 예시된 인간 IL-4Rα 5559 항체의 기능적 에피토프 결정
Figure pct00004
실시예 3. 인간 IL-4Rα 항체의 결합 친화력 및 기능적 활성
결합 친화력: 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα에 대한 예시된 항-IL-4Rα 항체의 결합 친화력을 경쟁 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) (MSD) ELISA 결합 검정을 사용하여 측정하였다. 일정한 농도의 각각의 항체를 각각의 5559 항체에 대해 10 pM, 5F3에 대해 100 pM의 최종 농도를 제공하도록 IL-4Rα의 3배 희석물 시리즈와 혼합하였고, 희석물은 5559 항체에 대해 10 nM IL-4Rα, 5F3에 대해 200 nM IL-4Rα으로 시작하였으며, 혼합물을 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 96웰 멀티어레이 플레이트 (메조 스케일 다이아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics), Cat. # L15XA-3)를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내의 0.5 μg/mL 헥사히스티딘-태그 인간 또는 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα ECD로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후, 플레이트를 200 μL PBST (PBS + 0.05% 트윈(Tween)® 20)로 10회 세정하고, 150 μL/웰의 PBS 카세인 차단 완충제 (피어스, Cat. # 37528)로 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 그 후, 플레이트를 상기와 같이 10회 세정하고, 50 μL의 사전인큐베이션된 항체:IL-4Rα 희석물 시리즈를 웰로 옮기고, 37℃에서 300 rpm으로 진탕시키면서 150초 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 10회 세정하고, 50 μL의 1 μg/mL 항-인간 항체 술포-태그 20 (메조 스케일 다이아그노스틱스, Cat. #R32AJ-1)을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 300 rpm으로 진탕시키면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 10회 세정하고, 150 μL/웰의 1X 판독 완충제 T를 웰에 첨가하고, 완충제 첨가 15분 후에 섹터® 이미저(SECTOR® Imager) 6000 (메조 스케일 다이아그노스틱스)에서 분석하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 9를 사용하여 S자형 곡선을 전기화학발광 (ECL) 반응 vs. log(가용성 IL-4Rα 농도)에 피팅함으로써 겉보기 KD가 결정된다. 정규화된 ECL 값으로 데이터가 그래프화된다.
표 4 및 도 3A 및 3B에 나타난 바와 같은 결과는 5F3 IgG4PAA 항체와 비교 시 예시된 5559 항-IL-4Rα 항체 변이체에 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL4-Rα 둘 다에 대한 결합 친화력에서의 유의한 증가가 있었다는 것을 제시한다. 구체적으로, 각각의 5559 항체 변이체의 인간 IL4-Rα에 대한 결합 친화력은 5F3 IgG4PAA (1993 pM)와 비교 시 5559 IgG1A 124C/378C (45.08 pM), 5559 IgG4P KRQ 124C/378C (20.82 pM), 및 5559 IgG4P 124C/378C (24.63 pM)였다.
표 4. 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-4Rα에 대한 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 결합 친화력
Figure pct00005
B 세포 및 T 세포에 대한 결합: B 세포 및 T 세포에 대한 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 결합을 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 검정에서 테스트하였다. 표준 피콜-파크™ 플러스(Ficoll-Paque™ plus) (지이 헬스케어(GE HEALTHCARE)) 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 인간 혈액 샘플로부터 인간 PBMC를 단리하였다. 신선하게 단리된 세포 PBMC를 2×106개 세포/mL로 재현탁시키고, 15분 동안 실온에서 휴지시킨 후, 100 μL/웰로 둥근 바닥 96웰 플레이트 (코스타(COSTAR)®) 내로 플레이팅하고, FACS 완충제 (코닝(Corning)®으로부터의 2% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS)로 세정하였다. 제조사의 프로토콜 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 따라 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647에 접합된 각각의 대조군 IgG 항체 및 예시된 인간 IL-4Rα 항체를 66.67 nM로 웰에 첨가하고, 이중으로 4배 희석하였다. 그 후, 하기를 함유하는 등가 부피의 2X 항체 칵테일을 웰에 첨가하였다: 휴먼 트루스테인 FcX(Human TruStain FcX)™, FITC 항-인간 CD3 항체, 알렉사 플루오르® 700 항-인간 CD4 항체 (모두 바이오레전드(Biolegend)®) 및 CD20 모노클로날 항체 (2H7), PerCP-시아닌(PerCP-Cyanine)5.5 (써모 피셔 사이언티픽). 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, FACS 완충제로 2회 세정하고, 최종 부피 100 μL의 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 생존력 염료인 사이톡스™ 블루(Sytox™ blue) (써모 피셔 사이언티픽)를 첨가하고, 유동 세포측정기 (LSR포르테사(LSRFortessa)™ X-20; BD 바이오사이언시즈(BD BIOSCIENCES))를 통해 샘플을 분석하였다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였고, 그래프패드 프리즘 9를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 데이터는 6명의 공여자로부터의 CD20 B 세포 및 CD4-양성 T 세포 집단으로부터의 IL-4Rα 발현 세포의 백분율의 평균 ± SEM을 나타낸다. log(Ab 농도) vs. 개별적인 세포 집단으로부터의 양성 IL-4Rα 발현 세포의 퍼센트의 S자형 곡선을 피팅함으로써 곡선이 생성되었다.
표 5A, 및 도 4A 및 4B에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 IL-4Rα 항체 5559 IgG1A 124C/378C 및 5559 IgG4P KRQ 124C/378C가 인간 PBMC에서 단리된 B 세포 (각각 0.14 nM 및 0.15 nM의 EC50) 및 CD4 T 세포 (각각 28.7 nM 및 26.3 nM의 EC50)에 유사한 친화력으로 결합하였음을 제시한다. 추가적으로, 결과는 KRQ 아미노산 잔기 치환 및 124C/378C 아미노산 잔기 치환이 B 또는 T 세포에 대한 예시된 항-IL-4Rα 5559 항체의 결합에 영향을 미치지 않았음을 제시하였다.
또한, 표 5B 및 도 4C에 나타난 바와 같이, 5559 IgG1AAA 124C/378C 이펙터 널 항체는 5559 IgG1A 124C/378C 항체 (0.27 nM의 EC50)와 비교 시 B 세포에 대한 예상치 못하게 감소된 친화력 (1.07 nM의 EC50)을 제시하였으며, 이는 항체의 Fc 부분이 B 세포에 대한 예시된 IL-4Rα 항체의 결합에 영향을 미칠 수 있다는 것을 지시한다.
표 5A: B 및 T 세포에 대한 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 결합
Figure pct00006
표 5B: B 세포에 대한 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 결합
Figure pct00007
세포 기반 IL-4 및 IL-13 시토카인 차단 활성: 분비된 배아 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 활성을 측정함으로써 HEK-블루 IL-4R 및 IL-13R 발현 세포주 (인비보젠)로 IL-4 및 IL-13에 대한 예시된 항-IL-4Rα 항체의 길항제 활성을 수행하였다. HEK-블루 세포를 폴리-리신이 코팅된 플레이트에서 50 μL의 성장 배지 내에 5×104개 세포/웰로 밤새 플레이팅하였다. 예시된 IL-4Rα 항체 (5F3 IgG4PAA, 5559 IgG4P 124C/378C, 5559 IgG4P KRQ 124C/378C, 5559 IgG1A 124C/378C 및 8660 IgG4P 124C/378C)를 그레이너(Greiner) 96웰 저 단백질 결합 플레이트에서 성장 배지 내의 20 μg/mL로 시작하여 4배 희석물로 제조하였다. 희석물 시리즈를 동일한 부피의 성장 배지 내의 재조합 인간 IL-4 또는 IL-13 (일라이 릴리(Eli Lilly))과 혼합하였다. 그 후, 50 μL의 혼합물을 HEK-블루 세포가 있는 플레이트에 100 pg/mL 인간 IL-4 또는 10 ng/mL 인간 IL-13의 최종 농도로 첨가한 후, 플레이트를 37℃의 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션된 플레이트로부터의 20 μL의 상청액을 96웰의 조직 배양물로 처리된 플레이트로 옮기고, 웰당 180 μL의 퀀티-블루(QUANTI-Blue)™ (인비보젠)를 첨가하고, 혼합물을 45분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 분비된 배아 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 활성을 스펙트라맥스(SpectraMax) 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))에서 650 nm에서 측정하였다. 결과는 650 nm에서의 광학 밀도 (OD)로서 보고되었고, 통계 분석은 그래프패드 프리즘 9를 사용하여 수행되었다. log(Ab 농도) vs. 각각의 예시된 항체에 대한 650 nm에서의 OD의 S자형 곡선을 피팅함으로써 IC50 및 곡선이 생성되었다.
표 6 및 도 5A 및 5B에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 IL-4Rα 항체 5559 IgG1A 124C/378C, 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 및 8660 IgG4P 124C/378C가 IL-4 (도 5A) 및 IL-13 (도 5B) 유도된 SEAP 활성 둘 다를 용량 의존적 방식으로 억제하였음을 제시한다. 구체적으로, 표 6 및 도 5A에 제시된 바와 같이, 5559 IgG1A 124C/378C, 5559 IgG4P KRQ 124C/378C, 및 8660 IgG4P 124C/378C 항체에 대한 IL-4 유도된 SEAP 활성의 억제는 각각 0.07, 0.08 및 0.03 nM의 IC50 값을 초래하였다. 또한, 표 6 및 도 5B에 제시된 바와 같이, 5559 IgG1A 124C/378C, 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 및 8660 IgG4P 124C/378C 항체에 대한 IL-13 유도된 SEAP 활성의 억제는 각각 0.51, 0.67 및 0.24 nM의 유사한 IC50 값을 초래하였다.
표 6. 예시된 인간 IL-4Rα 항체에 의한 세포 기반 IL-4 및 IL-13 차단 활성
Figure pct00008
인간 PBMC에서의 IL-4 및 IL-13 유도된 pSTAT6 인산화의 억제: 예시된 항-IL-4Rα 항체에 의한 IL-4 및 IL-13 매개 IL-4R pSTAT6 인산화의 억제를 1차 B 및/또는 T 세포에서 평가하였다. 표준 피콜-파크™ 플러스 (지이 헬스케어) 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 인간 혈액 샘플로부터 인간 PBMC를 단리하였다. 단리된 세포를 T175 플라스크 (팔콘(FALCON)) 내의 100 mL의 완전 배지 (RPMI-1640 + 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 (코닝®), 및 1% 글루타맥스™ 및 0.1% β-메르캅토에탄올 (깁코(Gibco)™))에 100-300백만개 세포로 재현탁시키고, 2 μg/mL PHA (시그마(SIGMA)), 0.5 μg/mL LPS (시그마) 및 100 ng/mL 재조합 인간 IL-6으로 밤새 자극하였다. 세포를 신선한 배지로 세정하고, 4배 희석 및 11-지점 적정에서 하향 희석된 10 μg/mL의 예시된 항체를 함유하는 100 μL 완전 배지 내에 5×104개 내지 2×105개 세포/웰로 96웰 둥근 바닥 플레이트 (코닝®)에 플레이팅하였다. 세포를 항체와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 20 μL 완전 배지 내의 120 ng/mL (6X 농도)의 인간 재조합 IL-4 또는 인간 재조합 IL-13 (R&D 시스템즈)으로 12분 동안 실온에서 자극하였다. 120 μL의 1X 용해/고정 완충제 (BD 바이오사이언시즈)를 5분 동안 첨가함으로써 자극을 정지시킨 후, 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하였다. 세포 펠릿을 100 μL 빙냉 메탄올 (시그마)에 재현탁시키고, 20분 동안 얼음 상에 놓고, 2% FBS를 함유하는 DPBS (코닝®)로 세정하였다. 세포를 하기 단백질에 대한 50 μL의 항체 칵테일에 재현탁시키고: CD4, CD33, CD8, 및 CD3 (써모 피셔 사이언티픽), 인산화된 STAT6 (바이오레전드®) 및 CD20 (BD 바이오사이언시즈), 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 2% FBS를 함유하는 DPBS로 세정하였다. 세포 샘플을 유동 세포측정기를 사용하여 분석하였다. 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였고, 그래프패드 프리즘 9를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 2명의 공여자로부터의 log(Ab 농도) vs. 개별적인 세포 집단으로부터의 인산화된 STAT6의 퍼센트 억제의 S자형 곡선을 피팅함으로써 곡선이 생성되었다.
표 7 및 도 6A 및 6B에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 IL-4Rα 항체가 IL-4 유도된 STAT6 인산화를 CD4+ T 세포 (도 6A) 및 B 세포 (도 6B) 둘 다에서 용량 의존적 방식으로 억제하였음을 제시한다. 구체적으로, 예시된 5559 IgG1A 124C/378C 및 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 항체에 의한 IL-4 유도된 pSTAT6 인산화의 억제에 대한 IC50 값이 둘 다의 항체에 대해 CD4 T 세포에서는 0.07 μg/mL이고, B 세포에서는 0.05 μg/mL였다.
또한, 표 8 및 도 6C에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 IL-4Rα 항체가 또한 IL-13 유도된 STAT6 인산화를 B 세포 (도 6C)에서 용량 의존적 방식으로 억제하였음을 제시한다. 구체적으로, 5559 IgG1A 124C/378C 및 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 항체에 의한 B 세포에서의 IL-13 유도된 pSTAT6 인산화의 억제에 대한 IC50 값이 둘 다의 항체에 대해 0.06 μg/mL였다.
표 7. 예시된 인간 IL4Rα 항체에 의한 인간 T 및 B 세포에서의 IL-4 유도된 STAT6 인산화의 억제
Figure pct00009
표 8. 예시된 인간 IL4Rα 항체에 의한 인간 B 세포에서의 IL-13 유도된 STAT6 인산화의 억제
Figure pct00010
IL-4 유도된 B 세포 증식의 억제: 예시된 인간 IL-4Rα 항체에 의한 B 세포 증식의 억제를 인간 PBMC로부터 단리된 1차 B 세포에서 평가하였다. 표준 피콜-파크™ 플러스 (지이 헬스케어) 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 인간 혈액 샘플로부터 인간 PBMC를 단리하고, 제조사의 프로토콜 (스템셀™ 테크놀로지즈(STEMCELL™ Technologies))에 따라 이지셉(EasySep)™ 인간 나이브 B 세포 강화 키트로 음성 선택에 의해 PBMC 현탁액으로부터 1차 B 세포를 단리하였다. 단리된 인간 1차 B 세포를 1×106개 세포/mL로 재현탁시키고, 폴리스티렌 96웰 u자형 바닥 플레이트에서 완전 배지 (10% 소 태아 혈청, 1X MEM-비필수 아미노산, 1 mM 피루브산나트륨, 1X 페니실린-스트렙토마이신 용액 (모두 코닝®) 및 1X 글루타맥스™ (깁코™), 0.1% β-메르캅토에탄올 (라이프 테크놀로지즈(LIFE TECHNOLOGIES))를 함유하는 RPMI-1640) 내에 플레이팅하였다. 세포를 4배 및 10-지점 적정으로 희석된 66.67 nM로 항-IL-4Rα 항체 또는 이소타입 대조군으로 0.5-1시간 동안 사전처리하였다. 세포를 인간 CD40/TNFRSF5 항체 (200 ng/mL; R&D 시스템즈) 및 IL-4 재조합 인간 단백질 (5 ng/mL; R&D 시스템즈)로 37℃ 및 5% CO2에서 2일 동안 자극하였다. 그 후, 18시간 동안 37℃에서 [3H]-티미딘 (1 μCi 티미딘/웰; 퍼킨엘머(PerkinElmer)®)을 세포에 펄싱시키고, [3H]-티미딘 혼입 수준을 마이크로플레이트 카운터(Microplate Counter) (마이크로베타(MicroBeta)2; 퍼킨엘머®)로 측정하였으며, 이는 분당 세포 카운트 (CCPM)로 표현되었다. 그래프패드 프리즘 9를 사용하여 통계 분석을 수행하였고, log(Ab 농도) vs. CCPM의 S자형 곡선을 피팅함으로써 곡선이 생성되었다.
표 9 및 도 7에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 IL-4Rα 항체가 IL-4 유도된 B 세포 증식을 용량 의존적 방식으로 억제하였음을 제시한다. 구체적으로, 5559 IgG1A 124C/378C 및 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 항체에 의한 IL-4 유도된 B 세포 증식의 억제에 대한 IC50이 각각 0.95 nM 및 1.32 nM이었다.
표 9. 예시된 인간 IL4Rα 항체에 의한 IL-4 유도된 B 세포 증식의 억제
Figure pct00011
골수 세포 상에서의 IL-4 및 IL-13 유도된 CD23 발현의 억제: 예시된 인간 IL 4Rα 항체에 의한 IL-4 및 IL-13 유도된 CD23 발현의 억제를 골수 세포에서 평가하였다. 표준 피콜-파크™ 플러스 (지이 헬스케어) 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 인간 혈액 샘플로부터 인간 PBMC를 단리하였다. 세포를 2×105개 세포/웰로 96웰 편평 바닥 플레이트에 시딩하였다. 50 μL의 3X 연속 희석 항체를 웰에 첨가하고, 37℃에서 5% CO2로 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 완전 배지 내의 재조합 인간 IL-4 또는 IL-13 (R&D 시스템즈)의 3X 자극물 50 μL를 10 ng/mL의 최종 농도로 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 48시간 동안 인큐베이션하고, 세포를 세정하고, 휴먼 트루스테인 FcX™, 브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet) 785™ 항-인간 CD33 항체, FITC 항-인간 CD3 항체 (바이오레전드®), CD20 모노클로날 항체 (2H7) PerCP-시아닌5.5, 및 CD23 모노클로날 항체 (EBVCS2), APC (써모 피셔 사이언티픽)를 함유하는 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, FACS 완충제로 2회 세정하고, 최종 부피 100 μL의 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 생존력 염료인 사이톡스™ 블루 (써모 피셔 사이언티픽)를 웰에 첨가하고, 유동 세포측정기 (LSR포르테사™ X-20; BD 바이오사이언시즈)를 통해 샘플을 분석하였다. 플로우조 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 사이톡스™ 블루, CD3 및 CD20 음성, CD33 양성 세포로서 골수 세포가 확인되었다. 2명의 공여자의 퍼센트 억제 vs. log(Ab 농도)의 S자형 곡선 피트로서 데이터가 제시되었고, 그래프패드 프리즘 9를 사용하여 통계 분석이 수행된다.
표 10 및 도 8A 및 8B에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 IL-4Rα 항체가 골수 세포에서 IL-4 (도 8A) 및 IL-13 (도 8B) 유도된 CD23 발현 둘 다를 억제하였음을 제시한다. 구체적으로, 5559 IgG1A 124C/378C 및 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 항체에 의한 IL-4 유도된 CD23 발현의 억제에 대한 IC50 값이 각각 4.44 nM 및 18.25 nM이었다. 또한, 5559 IgG1A 124C/378C 및 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 항체에 의한 IL-13 유도된 CD23 발현의 억제에 대한 IC50 값이 각각 1.28 nM 및 5.37 nM이었다.
표 10. 예시된 인간 IL-4Rα 항체에 의한 골수 세포에서의 IL-4 및 IL-13 유도된 CD23 발현의 억제
Figure pct00012
실시예 4. 인간 IL-4Rα 항체의 이펙터 기능 활성
인간 Fcγ 수용체 결합. 인간 Fcγ 수용체에 대한 예시된 항-IL-4Rα 항체의 결합 친화력을 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석에 의해 평가하였다. 시리즈 S CM5 칩 (사이티바(Cytiva) P/N BR100530)을 제조사의 EDC/NHS 아민 커플링 방법 (사이티바 P/N BR100050)을 사용하여 제조하였다. 간략하게, EDC/NHS의 1:1 혼합물을 7분 동안 10 μL/분으로 주입함으로써 4개 모두의 유동 셀 (FC)의 표면을 활성화시켰다. 단백질 A (칼바이오켐(Calbiochem) P/N 539202)를 10 mM 아세테이트, pH 4.5 완충제에서 100 μg/mL로 희석하고, 대략 4000 RU에 대해 유속 10 μL/분으로의 7분 주입에 의해 4개 모두의 FC 상으로 고정화시켰다. 10 μL/분으로 에탄올아민을 7분 동안 주입하여 미반응 부위를 차단하였다. 2×10 μL의 글리신, pH 1.5의 주입을 사용하여 임의의 비-공유결합으로 회합된 단백질을 제거하였다. 러닝 완충제는 1x HBS-EP+ (테크노바(TEKNOVA), P/N H8022)였다. FcγR 세포외 도메인 (ECD) - FcγRI (CD64), FcγRIIA_131R, 및 FcγRIIA_131H (CD32a), FcγRIIIA_158V, FcγRIIIA_158F (CD16a), 및 FcγRIIb (CD32b)가 안정적인 CHO 세포 발현으로부터 생산되었고, 이를 IgG 세파로스 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. FcγRI 결합에 대해, 항체를 러닝 완충제에서 2.5 μg/mL로 희석하였고, 대략 150 RU의 각각의 항체가 FC 2 내지 4에서 포획되었다 (RU 포획). FC1은 기준 FC였고, 따라서 항체가 FC1에서 포획되지 않았다. FcγRI ECD를 러닝 완충제에서 200 nM로 희석한 후, 러닝 완충제에서 0.78 nM로 2배 연속 희석하였다. 각각의 농도의 이중 주입물을 120초 동안 40 μL/분으로 모든 FC에 걸쳐 주입한 후, 1200초 해리 단계가 이어졌다. 모든 FC에 걸쳐 30 μL/분으로 15 μL의 10 mM 글리신, pH 1.5를 주입함으로써 재생을 수행하였다. 기준물-차감 데이터가 FC2 FC1, FC3-FC1, 및 FC4-FC1로서 수집되었고, 측정치는 25℃에서 수득되었다. 스크루버 2 비아코어(Scrubber 2 Biacore) 평가 소프트웨어로의 정상 상태 평형 분석 또는 BIA 평가에서의 "1:1 (랭뮤어(Langmuir)) 결합" 모델을 사용하여 친화력 (KD)을 계산하였다. FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 결합에 대해, 항체를 러닝 완충제에서 5 μg/mL로 희석하였고, 대략 500 RU의 각각의 항체가 FC 2 내지 4에서 포획되었다. FC1은 기준 FC였다. Fcγ 수용체 ECD를 러닝 완충제에서 10 μM로 희석한 후, 러닝 완충제에서 39 nM로 2배 연속 희석하였다. 각각의 농도의 이중 주입물을 60초 동안 40 μL/분으로 모든 FC에 걸쳐 주입한 후, 120초 해리 단계가 이어졌다. 모든 FC에 걸쳐 30 μL/분으로 15 μL의 10 mM 글리신, pH 1.5를 주입함으로써 재생을 수행하였다. 기준물-차감 데이터가 FC2-FC1, FC3-FC1, 및 FC4-FC1로서 수집되었고, 측정치는 25℃에서 수득되었다. 스크루버 2 비아코어 평가 소프트웨어로의 정상 상태 평형 분석을 사용하여 친화력 (KD)을 계산하였다. 각각의 수용체를 적어도 2회 평가하였다.
표 11에 나타난 바와 같은 결과는 인간 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa 수용체 ECD에 대한 예시된 IL-4Rα 항체 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 및 5559 IgG1A 124C/378C의 결합 친화력 (KD)을 요약한다.
표 11. 인간 Fcγ 수용체에 대한 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 결합 친화력
Figure pct00013
C1q 결합. 인간 C1q에 대한 예시된 항-IL-4Rα 항체의 결합을 ELISA에 의해 평가하였다. 96웰 마이크로플레이트를 10 μg/mL 내지 0.19 μg/mL의 DPBS (둘베코(Dulbecco)의 하이클론(HyClone))에 희석된 100 μL/웰의 각각의 예시된 항체로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 시약을 제거하고, 플레이트를 200 μL/웰 카세인 차단 완충제 (써모)로 차단하고, 2시간 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정 완충제 (1 x TBE + 0.05% 트윈 20)로 3회 세정하고, 카세인 차단 시약에 희석된 10 μg/mL 인간 C1q (MS 바이오메디컬(MS Biomedical))를 100 μL/웰로 첨가하고, 3시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 인간화 IgG1 및 인간화 IgG4P 이소타입 대조군 항체가 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용되었다. 그 후, 플레이트를 세정 완충제로 3회 세정하고, 100 μL/웰의 카세인 차단제 내의 양 항-인간 C1q-HRP (압캠(Abcam) #ab46191)의 1:800배 희석물을 첨가하고, 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세정 완충제로 6회 세정하고, 100 μL/웰의 TMB 기질 (피어스)을 각각의 웰에 첨가하고, 7분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 1 N HCl을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 광학 밀도를 비색 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서 즉각적으로 측정하였다. 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 7.1 데이터 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다
도 9에 제시된 바와 같은 결과는 예시된 항체 5559 IgG1A 124C/378C, 및 5559 IgG4P KRQ 124C/378C가 보체 성분 C1q에 결합하지 않았음을 나타낸다.
항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC): 예시된 항체의 시험관내 ADCC 검정을 리포터 유전자 기반 ADCC 검정 또는 1차 인간 NK 및 Th2 세포 기반 ADCC 검정을 사용하여 평가하였다.
리포터 유전자 기반 ADCC 검정의 경우, 표적 세포주로서의 인간 IL-4Rα 및 인간 CD20을 발현하는 Daudi 세포 (ATCC, #CCL-213) 및 이펙터 세포주로서의 기능성 FcγRIIIa (V158)-NFAT-Luc를 발현하는 Jurkat 세포 (일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company))가 사용되었다. 모든 테스트 항체 및 세포가 RPMI-1640 (페놀 레드 없음) + 0.1 mM 비필수 아미노산 (NEAA), 1 mM 피루브산나트륨, 2 mM L-글루타민, 500 U/mL의 페니실린-스트렙토마이신, 및 0.1% w/v BSA를 함유하는 검정 배지에서 희석되었다. 먼저 테스트 항체를 3.3 μg/mL의 3X 농도로 희석한 후, 1:4 비로 7회 연속 희석하였다. 50 μL/웰의 각각의 항체를 백색 불투명 바닥 96웰 플레이트 (코스타, #3917)에서 이중으로 분취하였다. CD20 항체가 양성 대조군으로서 사용되었다. 그 후, Daudi 표적 세포를 50 μL 분취량으로 플레이트에 5×104개 세포/웰로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로, Jurkat V158 세포를 50 μL 분취량으로 웰에 150,000개 세포/웰로 첨가하고, 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 100 μL/웰의 원-글로(One-Glo) 루시퍼라제 기질 (프로메가(Promega), #E8130)을 첨가하였다. 플레이트의 내용물을 플레이트 진탕기를 사용하여 저속으로 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 0.2 cps 통합을 사용하여 바이오텍(BioTek) 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍 인스트루먼츠(BioTek Instruments))에서 발광 신호를 판독하였다. 그래프패드 프리즘 9를 사용하여 데이터를 분석하고, 각각의 항체 농도에 대한 상대적 발광 단위 (RLU)를 항체 농도 대 RLU의 산포 포맷으로 플롯팅하였다. 결과는 2개의 독립적인 실험을 대표한다.
1차 인간 NK 및 Th2 세포 기반 ADCC 검정의 경우, 1차 인간 NK 세포와 공동-배양된 1차 인간 B 세포 및 인간 Th2 세포가 사용되었다. 인간 1차 B 세포, NK 세포 및 나이브 CD4 T 세포를 신선하게 정제된 인간 PBMC로부터 제조사의 프로토콜 (인간 B 세포 강화 키트, 스템셀 테크놀로지즈 #19054; 인간 NK 세포 단리 키트, 스템셀 테크놀로지즈 #17955; 인간 나이브 CD4+ T 세포 단리 키트 II, 스템셀 테크놀로지즈 #17555)에 따라 면역자기 음성 선택에 의해 단리하였다. 정제된 나이브 CD4 T 세포를 항-인간 CD3 (바이오엑스셀(BioXCell) #BE0001-2), 항-인간 CD28 (바이오레전드 #302934), 항-인간 IFNγ (R&D 시스템즈 #MAB285-500), 재조합 인간 IL-2 (R&D 시스템즈 #202-IL-050/CF), 및 재조합 인간 IL-4 (R&D 시스템즈 #6507-IL-100/CF)와 함께 14일 동안 배양함으로써, 인간 Th2 세포를 시험관 내에서 분화시켰다. 유동 세포측정법 염색을 사용하여 BD LSR포르테사 세포 분석기에서 세포 순도를 평가하였다. NK 세포가 CD56+ (항-인간 CD56-PE/대즐(Dazzle)-594, 바이오레전드 #318348) 및 FcγRIII+ (항-인간 CD16-수퍼브라이트(SuperBright)-702, 피셔 사이언티픽 #67-0168-42)로 확인되었고, B 세포가 CD19+ (항-인간 CD19-PE-Cy5, 피셔 사이언티픽 #15-0199-42) 및 IL-4Rα+ (5559-알렉사 플루오르-647, 릴리)인 것으로 확인되었으며, Th2 세포가 CD4+ (항-인간 CD4-이플루오르(eFluor)-450, 피셔 사이언티픽 #48-0047-42), GATA3+ (항-인간 GATA3-PerCP/시아닌5.5, 바이오레전드 #653812), 및 IL-4Rα+인 것으로 확인되었다. 5×104개 B 세포 또는 Th2 세포/웰을 각각 30 μg/mL 또는 5 μg/mL의 5559 IgG1 A 124C/378C 항체로 처리하고, 24시간 동안 37℃에서 250,000개의 NK 세포와 공동-배양하였다. 양성 대조군 웰은 항-인간 CD52 항체 (일라이 릴리 앤드 캄파니)로 처리하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 사이토톡스-글로(CytoTox-Glo) 세포독성 검정 (프로메가 #G9292)을 사용하여 ADCC를 측정하였다. 바이오텍 사이테이션(Biotek Cytation) 5 영상화 멀티-모드 판독기를 사용하여 상대적 발광을 검출하였다. 데이터는 공여자당 3개의 기술적 사본을 대표한다. 그래프패드 프리즘 9를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 데이터는 상대적 발광 단위의 평균 + SD를 나타낸다. 개별적으로 각각의 세포 유형에 대해 1원 ANOVA를 사용하여 처리 차이를 평가하였고, Ab 없음 군에 대한 군 비교는 0.05의 유의 수준으로 다중 비교를 위한 튜키(Tukey) 검정을 사용하여 평가된다.
도 10A에 나타난 바와 같은, 리포터 유전자-기반 검정의 결과는 양성 대조군과 비교 시 예시된 IL-4Rα 항체 5559 IgG1A 124C/378C, 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 및 5559 IgG4P 124C/378C가 ADCC 활성이 유의하게 결여되었거나 또는 ADCC 활성이 없었음을 제시한다.
또한, 도 10B에 나타난 바와 같은 1차 인간 NK 및 Th2 세포 기반 ADCC 검정의 결과는 음성 대조군과 비교 시 1차 인간 B 세포 (p<0.0001) 및 Th2 세포 (p=0.032) 둘 다에서 유의한 ADCC 활성이 실연된 양성 대조군과 비교 시 예시된 IL-4Rα 항체 5559 IgG1A 124C/378C가 1차 인간 B 세포 및 인간 Th2 세포에서 ADCC 활성을 유도하지 않았음을 제시한다.
보체 의존적 세포성 세포독성 (CDC): 예시된 항체의 시험관내 CDC 검정을 Daudi 세포 (ATCC, #CCL-213)를 사용하여 수행하였다. 모든 테스트 항체, 보체, 및 세포가 RPMI-1640 (페놀 레드 없음) + 0.1 mM 비필수 아미노산 (NEAA), 1 mM 피루브산나트륨, 2 mM L-글루타민, 500 U/mL의 페니실린-스트렙토마이신, 및 0.1% w/v BSA를 함유하는 검정 배지에서 희석되었다. 먼저 테스트 항체를 100 μg/mL의 3X 농도로 희석한 후, 1:4 비로 7회 연속 희석하였다. 50 μL/웰의 각각의 항체 (CD20 양성 대조군 항체를 포함함)를 백색 불투명 바닥 96웰 플레이트 (코스타, #3917)에서 이중으로 분취하였다. Daudi 표적 세포를 50 μL/웰로 5×104개 세포/웰로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 37℃ 수조에서 신속하게 해동된 인간 혈청 보체 (퀴델(Quidel), #A113)를 검정 배지에서 1:6 희석하고, 50 μL/웰로 검정 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 100 μL/웰의 셀타이터 글로(CellTiter Glo) 기질 (프로메가, #G7571)을 첨가하였다. 플레이트의 내용물을 플레이트 진탕기를 사용하여 저속으로 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 0.2 cps 통합을 사용하여 바이오텍 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍 인스트루먼츠)에서 발광 신호를 판독하였다. 그래프패드 프리즘 9를 사용하여 데이터를 분석하고, 각각의 항체 농도에 대한 상대적 발광 단위 (RLU)를 항체 농도 대 RLU의 산포 포맷으로 플롯팅하였다. 결과는 2개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 11에 나타난 바와 같은 결과는 양성 대조군과 비교 시 예시된 IL-4Rα 항체 5559 IgG1A 124C/378C, 5559 IgG4P KRQ 124C/378C, 및 5559 IgG4P 124C/378C가 CDC 활성을 유도하지 않았음을 제시한다.
실시예 5. 인간 IL-4Rα 항체의 생물물리학적 특성
예시된 인간 IL-4Rα 항체 5559 IgG1A, 5559 IgG1A 124C/378C, 5559 IgG4P 124C/378C, 및 5559 IgG4P KRQ 124C/378C의 생물물리학적 특성을 평가하였다.
세포 배양으로부터의 응집: 예시된 항체를 CHO 세포에서 일시적으로 발현하였다. 항체 역가 및 단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제 후의 고분자량 종의 백분율 (% HMW)이 표 12에 열거된다. 표 12에 나타난 바와 같은 결과는 예시된 항체 내로의 조작된 시스테인의 혼입 또는 예시된 5559 IgG4P 항체 내로의 KRQ 돌연변이의 도입이 항체 역가 또는 항체 응집에 유의하게 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
점도: 예시된 항체 샘플을 부형제와 함께 5 mM 히스티딘을 함유하는 pH 6의 통상적인 제형 완충제 매트릭스에서 약 125 mg/mL로 농축시켰다. 각각의 항체에 대한 점도를 9회 반복 측정의 평균을 사용하여 15℃에서 VROC® 이니티움(initium) (레오센스(RheoSense))을 사용하여 측정하였다. 표 12에 나타난 바와 같이, 결과는 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 및 5559 IgG4P GNKRQ 124C/378C 항체가, KRQ 아미노산 잔기 치환이 결여된 5559 IgG4P 124C/378C와 비교 시, 각각 11.6cP 및 9.6cP의 유의하게 개선된 점도를 나타냈다는 것을 제시한다. 결과는 추가로 5559 IgG4P KRQ 124C/378C 및 5559 IgG4P GNKRQ 124C/378C 항체의 점도가 5559 IgG1A 124C/378C 항체에 필적하였음을 제시하였다. 예시된 항체의 낮은 점도는 항체의 바람직한 개발가능성 특성을 지시하였다.
열 안정성: 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 사용하여 열 변성에 대한 예시된 항체의 안정성을 평가하였다. PBS, pH 7.2 완충제 내의 항체의 열 용융 온도가 표 12에서 열거된다. 각각의 도메인에 대한 열 전이 온도가 IgG1 또는 IgG4P 구축물에서 잘 해상되지 않았지만, 표 12 및 도 12A 및 12B에 나타난 바와 같은 데이터는 예시된 항체 내로의 조작된 시스테인의 혼입 또는 예시된 5559 IgG4P 항체 내로의 KRQ 돌연변이의 도입이 항체의 열 안정성에 음성적으로 영향을 미치거나 이의 구조적 통합성을 변경시키지 않았음을 제시한다.
온도 스트레스 시의 응집: 예시된 항체의 경시적인 용액 안정성을 부형제가 있는 통상적인 5 mM 히스티딘 pH 6.0 완충제에서 대략 100 mg/mL에서 평가하였다. 농축된 샘플을 4-주 기간 동안 각각 5℃ 및 35℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 고분자량 종의 백분율 (%HMW)에 대해 분석하였다. 표 12에 나타난 바와 같은 예시적인 결과는 예시된 항체 내로의 조작된 시스테인의 혼입 또는 예시된 5559 IgG4P 항체 내로의 KRQ 돌연변이의 도입이 5℃ 또는 35℃에서 4-주 기간에 걸쳐 항체의 응집 프로파일에 영향을 미치지 않았음을 제시하며; 구체적으로, 예시적인 결과는 항체가 필적하는 용액 안정성을 갖는다는 것을 제시한다.
표 12. 예시된 인간 IL-4Rα 항체의 예시적인 생물물리학적 특성
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Claims (52)

  1. 인간 IL-4Rα의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 에피토프는 하기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    i. D12, M14, S15, I16, Y37, L39, F41, L42, L43, E45, H47, T48, C49, I50, E52, H62, L64, M65, D66, D67, V68, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함);
    ii. D12, M14, S15, I16, Y37, L39, F41, L43, E45, H47, T48, C49, I50, H62, L64, M65, D66, D67, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함); 또는
    iii. D12, M14, S15, I16, L39, F41, L42, T48, C49, I50, E52, H62, L64, M65, D66, D67, V68, V69, D72, R99, P121, P123, P124, D125, P192 (아미노산 잔기 위치는 서열식별번호: 15에 상응함).
  2. 제1항에 있어서, 에피토프가 D12, M14, S15, I16, Y37, L39, T48, C49, I50, E52, H62, M65, R99, P121, P123, P124, D125, P192로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 에피토프가 R99, P121, P123, P124, D125, P192로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 에피토프가 D66, D67, 및 D125로부터 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 에피토프가 D66 및 D67로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 1개를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 에피토프가 D66 및 DI25로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 1개를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 에피토프가 아미노산 잔기 D66을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-4의 결합을 억제하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IL-4Rα에 대한 인간 IL-13의 결합을 억제하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 항체는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서:
    HCDR1은 서열식별번호: 1을 포함하고;
    HCDR2는 서열식별번호: 2를 포함하고;
    HCDR3은 서열식별번호: 3을 포함하고;
    LCDR1은 서열식별번호: 4를 포함하고;
    LCDR2는 서열식별번호: 5를 포함하고;
    LCDR3은 서열식별번호: 6을 포함하는 것인
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, VH가 서열식별번호: 7을 포함하고, VL이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 항체는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서:
    HCDR1은 서열식별번호: 42를 포함하고;
    HCDR2는 서열식별번호: 2를 포함하고;
    HCDR3은 서열식별번호: 3을 포함하고;
    LCDR1은 서열식별번호: 22를 포함하고;
    LCDR2는 서열식별번호: 5를 포함하고;
    LCDR3은 서열식별번호: 6을 포함하는 것인
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, VH가 서열식별번호: 44를 포함하고, VL이 서열식별번호: 45를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    i. 서열식별번호: 33을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 10을 포함하는 경쇄 (LC);
    ii. 서열식별번호: 35를 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 10을 포함하는 경쇄 (LC);
    iii. 서열식별번호: 9를 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 10을 포함하는 경쇄 (LC);
    iv. 서열식별번호: 13을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 10을 포함하는 경쇄 (LC);
    v. 서열식별번호: 31을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 10을 포함하는 경쇄 (LC);
    vi. 서열식별번호: 37을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 10을 포함하는 경쇄 (LC);
    vii. 서열식별번호: 52를 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 10을 포함하는 경쇄 (LC);
    viii. 서열식별번호: 50을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 10을 포함하는 경쇄 (LC); 또는
    ix. 서열식별번호: 46을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 47을 포함하는 경쇄 (LC).
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG1 이소타입을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 항체가 아미노산 잔기 322 (EU 넘버링)에서의 알라닌을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG4 이소타입을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, 항체가 하기 중 하나 이상을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    아미노산 잔기 137 (EU 넘버링)에서의 글리신;
    아미노산 잔기 203 (EU 넘버링)에서의 아스파라긴;
    아미노산 잔기 274 (EU 넘버링)에서의 리신;
    아미노산 잔기 355 (EU 넘버링)에서의 아르기닌; 또는
    아미노산 잔기 419 (EU 넘버링)에서의 글루타민.
  19. 제17항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    아미노산 잔기 274 (EU 넘버링)에서의 리신, 아미노산 잔기 355에서의 아르기닌, 및 아미노산 잔기 419 (EU 넘버링)에서의 글루타민.
  20. 제17항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    아미노산 잔기 137 (EU 넘버링)에서의 글리신, 아미노산 잔기 203 (EU 넘버링)에서의 아스파라긴, 아미노산 잔기 274 (EU 넘버링)에서의 리신, 아미노산 잔기 355에서의 아르기닌, 및 아미노산 잔기 419 (EU 넘버링)에서의 글루타민.
  21. 인간 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 항체는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 여기서 VH는 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서:
    HCDR1은 서열식별번호: 19를 포함하고;
    HCDR2는 서열식별번호: 20을 포함하고;
    HCDR3은 서열식별번호: 3을 포함하고;
    LCDR1은 서열식별번호: 22를 포함하고;
    LCDR2는 서열식별번호: 5를 포함하고;
    LCDR3은 서열식별번호: 24를 포함하는 것인
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제21항에 있어서, VH가 서열식별번호: 25를 포함하고, VL이 서열식별번호: 26을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 27을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 28을 포함하는 LC를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제14항 내지 제20항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    아미노산 잔기 124 (EU 넘버링)에서의 시스테인;
    아미노산 잔기 378 (EU 넘버링)에서의 시스테인; 또는
    아미노산 잔기 124 (EU 넘버링)에서의 시스테인 및 아미노산 잔기 378 (EU 넘버링)에서의 시스테인.
  25. 서열식별번호: 9, 10, 13, 27, 28, 31, 33, 35, 37, 46, 47, 50, 또는 52를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
  26. 제25항의 핵산을 포함하는 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 벡터가 서열식별번호: 9, 13, 31, 33, 35, 37, 46, 50, 또는 52를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 10 또는 47을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  28. 제26항에 있어서, 벡터가 서열식별번호: 27을 코딩하는 제1 핵산 서열 및 서열식별번호: 28을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  29. 서열식별번호: 9, 13, 31, 33, 35, 37, 46, 50, 또는 52를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 10 또는 47을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 조성물.
  30. 서열식별번호: 27을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터 및 서열식별번호: 28을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 조성물.
  31. 제26항 또는 제28항의 벡터를 포함하는 세포.
  32. 제31항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 세포.
  33. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서, 제31항 또는 제32항의 세포를 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 배양하고, 발현된 항체를 배양 배지로부터 회수하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제33항의 방법에 의해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 제1항 내지 제24항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 항체 약물 접합체.
  36. 제1항 내지 제24항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  37. IL-4R 연관 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IL-4R 연관 장애를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제24항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제36항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, IL-4R 연관 장애가 면역 염증성 장애인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 면역 염증성 장애가 제2형 염증성 장애인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 제2형 염증성 장애가 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 비강 폴립증, 천식, 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 자발성 두드러기 (CSU)로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제37항에 있어서, IL-4R 연관 장애가 암인 방법.
  42. 제1항 내지 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  43. 제1항 내지 제24항, 제34항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, IL-4R 연관 장애의 치료에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제약 조성물.
  44. 제43항에 있어서, IL-4R 연관 장애가 면역 염증성 장애인 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제약 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 면역 염증성 장애가 제2형 염증성 장애인 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제약 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 제2형 염증성 장애가 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 비강 폴립증, 천식, 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 자발성 두드러기 (CSU)로부터 선택되는 것인 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제약 조성물.
  47. 제43항에 있어서, IL-4R 연관 장애가 암인 사용하기 위한 항체 또는 제약 조성물.
  48. IL-4R 연관 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제24항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  49. 제48항에 있어서, IL-4R 연관 장애가 면역 염증성 장애인 용도.
  50. 제49항에 있어서, 면역 염증성 장애가 제2형 염증성 장애인 용도.
  51. 제50항에 있어서, 제2형 염증성 장애가 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 비강 폴립증, 천식, 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 자발성 두드러기 (CSU)로부터 선택되는 것인 용도.
  52. 제51항에 있어서, IL-4R 연관 장애가 암인 용도.
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