KR20240037633A

KR20240037633A - 작약 추출물을 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화 기반 선천성 및 후천성 면역반응 증진용 조성물

Info

Publication number: KR20240037633A
Application number: KR1020220116381A
Authority: KR
Inventors: 정진부; 이정훈
Original assignee: 국립안동대학교 산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2022-09-15
Filing date: 2022-09-15
Publication date: 2024-03-22

Abstract

본 발명은 작약(Paeonia lactiflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화를 기반으로 하는 선천성 또는 후천성 면역반응 증진 효능이 있는 조성물에 관한 것이다.
상기 작약 추출물은 대식세포의 식균작용을 활성화하고, NO, iNOS, COX-2, IL-β 및 TNF-α의 생성을 증진시키며, TLR4의 자극을 유도한다. 또한 대식세포 자가포식을 활성화함으로써 면역증진활성을 보여, 작약 추출물이 각종 건강기능식품으로의 응용이 가능함을 제시한다.

Description

작약 추출물을 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화 기반 선천성 및 후천성 면역반응 증진용 조성물 {Composition comprising extract of Paeonia lactiflora for enhancing innate and acquired immune response based on macrophage activation}

본 발명은 작약(Paeonia lactiflora) 추출물을 포함하는 대식세포 활성화 기반 선천성 및 후천성 면역반응 증진용 조성물에 관한 것이다.

면역 반응의 자극은 외부 병원체에 대한 인체의 방어 능력을 강화하기 위한 중요한 전략 중 하나로 간주되고 있다. 따라서 면역 자극을 통한 인체의 면역체계와 면역반응을 개선하는 것은 질병의 발생으로부터 인체를 보호하고 건강을 회복시키는 데 중요하다.

다양한 면역세포 중 선천성 면역세포 중 하나이자 외래 병원체에 대한 1차 방어선인 대식세포는 선천성 면역과 후천성 면역반응 등 인체의 면역반응에 직·간접적으로 참여하는 것으로 알려져 있다. 활성화된 대식세포는 식균작용을 통해 외부 병원체를 제거한다. 또한 활성화된 대식세포가 분비하는 일산화질소(NO), 유도성 산화질소 합성효소(iNOS), 사이클로옥시게나제-2(COX-2), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6), 종양 괴사 인자-α(TNF-α)등은 후천성 면역 반응에 관여하는 T 세포 및 B 세포의 활성화를 유도한다. NO는 바이러스에 감염된 세포, 암세포 및 외래 병원체를 제거한다. 따라서 대식세포에서 분비되는 NO는 대식세포의 활성화 상태를 나타내는 좋은 지표로 사용된다. iNOS는 NO 생성뿐만 아니라 정상적인 면역 기능과 외부 병원체에 대한 숙주 방어에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. IL-1β는 적응면역세포 중 하나인 T세포의 생존율을 높이고 선천면역세포의 활성화를 유도한다. 또한, IL-1β는 대식세포의 항원 제시 활성을 촉진한다. IL-6은 적응 면역 세포인 T 세포와 B 세포의 분화와 대식세포의 식균 작용을 촉진한다. TNF-α는 대식세포의 식균작용을 활성화하여 외래 병원체 제거에 기여하므로, TNF-α 생산은 초기 감염에서 숙주 방어에 유익한 것으로 알려져 있다.

또한, 대식세포의 Toll-like receptors (TLRs)는 외래 병원체를 인식하여 숙주방어기작의 활성화를 유도한다. 이런 TLRs의 활성화는 선천성 및 후천성 면역반응을 모두 활성화한다고 알려져 있다. TLRs 중 TLR4는 면역질환 환자들의 면역기능을 증진시킬 수 있는 주요 타겟으로 알려져 있으며 실제 TLR4를 자극하는 약물들이 임상에서 사용되고 있다.

최근 연구에서 자가포식(Autophagy)는 항원 제시 세포와 T 세포의 기능을 조절하여 T 세포 반응을 증가시킬 수 있다고 보고되었다. 특히, TLR4 자극을 통한 대식세포 자가포식의 활성화는 대식세포 항원 처리 및 제시를 증가시켜 선천성 및 후천성 면역 반응을 향상시키는 것으로 보고되었다. 자가포식에서 미세소관 관련 단백질 1A/1B-경쇄 3(LC3)은 자가포식소체 및 자가포식 활성을 조사하는 데 사용되었으며 자가포식소체로 화물을 모집하는 역할을 한다. LC3-I로부터 형성된 LC3-II는 autophagosome에 국한되어 있기 때문에 LC3-II의 양은 autophagosome과 autophagy 관련 구조의 수에 정비례하는 것으로 알려져 있다. p62/sequestosome 1(SQSTM1)은 선택적 자가포식 수용체이며 다양한 유비퀴틴화된 화물을 자가포식 경로로 전달하는 데 중요하다. 따라서 LC3-II 및 p62/SQSTM1의 증가는 자가포식의 주요 지표로 알려져 있다.

체내 질병이 발생된 상태는 면역 기능이 저하된 상태인 경우가 많으므로, 암 환자 또는 노약자 등에서 면역 능력을 증진시킬 수 있는 물질이 요구된다. 현재까지 면역 증진을 목적으로 한 다양한 치료제와 보조제가 개발되어 시판되고 있으나, 장기간 복용에 따른 부작용을 이유로 치료제보다는 상대적으로 안전한 보조제의 사용이 바람직한 방향으로 제시되고 있다. 면역 능력을 증진시킬 수 있는 물질은 화학 합성물이나 동, 식물 유래로부터 얻을 수 있다. 그러나 화학 합성물인 경우 약리 기작이 다양하거나, 독성에 의한 부작용이 생길 수 있으며, 동물에서 의약품 원료를 얻는 경우에는 인수 공통 전염 바이러스나 희귀 난치성 질병을 일으키는 독성 물질이 발견될 수 있다는 부작용의 위험이 문제점으로 지적된다. 또한 화학 합성물이나 동물을 이용한 물질을 얻는 것보다 식물을 활용한 경우 속도와 비용 측면에서도 유리하므로, 부작용이 없는 식물 유래 천연 면역증강 물질의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

생약으로 사용하는 작약(Paeonia lactiflora)은 뿌리(Peony root)이며, 뿌리의 껍질을 벗기고 말린 것이 백작약이며, 껍질이 있는 채 말린 뿌리를 적작약이라고 한다. 작약은 예로부터 진통제, 소염제나 해열제로 이용되었고, 기혈 보충, 간 보호에 효과가 있으며, 복통이나 저린 증상 등의 해소에도 이용된다. 월경 불순, 이뇨작용, 위염 등의 완화에도 사용되었다.

이에 본 발명자들은 작약 추출물이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 작약 추출물이 면역증진 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0126681호 (발명의 명칭 : 홍삼, 오가피, 산삼배양근의 생약재 추출물 및 이를 유효성분으로 하는 면역활성 증진용 건강 보조식품, 출원인 : 경희대학교 산학협력단, 공개일 : 2019년12월09일) 대한민국 등록특허 제10-2168531호 (발명의 명칭 : 한약재 추출물을 포함하는 피부 탄력 증진 또는 주름 개선용 화장료 조성물, 출원인 : 주식회사 엘지생활건강, 등록일 : 2020년10월15일)

본 발명의 목적은 작약(Paeonia lactiflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화 기반 선천성 및 후천성 면역반응 증진용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 작약(Paeonia lactiflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물에 관한 것이다.

상기 추출물은 작약의 뿌리인 적작약의 추출물일 수 있다.

상기 추출물은 대식세포 활성화를 기반으로 하는 선천성 또는 후천성 면역반응 증진 효능이 있는 것을 특징으로 한다.

상기 작약 추출물은 작약을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 추출용매로 하여 추출할 수 있다.

상기 추출물은 작약에 4~60℃ 조건에서 1~3시간 동안 추출 용매를 가하여 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 추출물 제조시, 상기 여과액은 건조하여 분말화할 수 있으며, 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등의 통상적인 건조법을 통해 분말화될 수 있다.

상기 작약 추출물은 대식세포에서 면역조절인자의 생성 증가 또는 식균작용의 활성화를 유도하는 것을 특징으로 한다.

상기 작약 추출물은 면역조절인자로서, 산화질소(NO), 유도성 산화질소 합성효소(iNOS), 사이클로옥시게나제-2(COX-2), 인터루킨 1β(IL-1β) 또는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 생성을 유도하는 것을 특징으로 한다. 이 때, 상기 추출물 처리농도 100㎍/㎖에서 산화질소(NO)는 3~6배, 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)는 8~9배, 사이클로옥시게나제-2(COX-2)는 2~3배, 인터루킨 1β(IL-1β)은 6~8배, 또는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)는 2~3배 증가한다.

상기 작약 추출물은 대식세포의 자가포식을 유도한다. 바람직하게는 추출물 처리농도 25㎍/㎖에서 자가포식 활성이 2배 이상, 바람직하게는 2~4배 증가하는 것을 특징으로 한다.

상기 작약 추출물은 면역증강용 조성물로 이용되기 위해 유효농도 12.5~200㎍/㎖로 처리되는 것이 좋다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 작약 추출물은 작약을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 용매는 바람직하게는 물 또는 C1~C4 알코올의 혼합용매일 수 있다. 상기 혼합용매는 30~90%(v/v) C1~C4 알코올 수용액 추출물, 바람직하게는 50~80%(v/v) C1~C4 알코올 수용액 추출물일 수 있다. 상기 C1~C4 알코올 중 에탄올이 사용될 수 있다. 용매 중 가장 바람직한 것은 물일 수 있다.

상기 작약 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 작약 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 작약 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.

이에 본 발명의 추출물은 면역증진용 식품 조성물, 건강기능식품, 반려동물의 사료 조성물, 각종 약학 조성물 등으로 적용 가능하다.

본 발명의 추출물은, 또한, 당분야의 통상적인 방법으로서, 이를 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다.

상기 작약 추출물 또는 분획물의 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 작약 추출물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 작약 추출물 또는 분획물은 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.

상기 작약 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 컬럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 작약 추출물을 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 작약 추출물은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 작약 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 작약 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 면역증진용 건강기능식품을 제공한다. 상기 작약 추출물은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명은 작약(Paeonia lactiflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화를 기반으로 하는 선천성 또는 후천성 면역반응 증진 효능이 있는 조성물에 관한 것이다.

상기 작약 추출물은 대식세포의 식균작용을 활성화하고, NO, iNOS, COX-2, IL-β 및 TNF-α의 생성을 증진시키며, TLR4의 자극을 유도한다. 또한 대식세포 자가포식을 활성화함으로써 면역증진활성을 보여, 작약 추출물이 각종 건강기능식품으로의 응용이 가능함을 제시한다.

도 1은 온도조건별 적작약 추출물(PRR)을 대식세포에 처리한 경우, 면역증진인자인 NO, iNOS, COX-2, IL-β 및 TNF-α의 생성을 비교한 결과다.
도 2는 60℃에서 시간조건별 적작약 추출물(PRR)을 대식세포에 처리한 경우, 면역증진인자인 NO, iNOS, COX-2, IL-β 및 TNF-α의 생성을 비교한 결과다.
도 3은 적작약(PRR)과 백작약(PRA) 추출물을 대식세포에 처리한 경우, 면역증진인자인 NO, iNOS, COX-2, IL-β 및 TNF-α의 생성을 비교한 결과다.
도 4는 적작약 추출물(PRR)을 농도별로 대식세포에 처리한 경우, 농도의존적으로 면역증진인자인 NO, iNOS, COX-2, IL-β 및 TNF-α의 생성을 유도하는 것을 확인한 결과다.
도 5는 적작약 추출물(PRR)을 농도별로 대식세포에 처리한 경우, 농도의존적으로 대식세포의 식균작용을 활성화함을 나타낸다.
도 6은 대식세포에서 적작약 추출물(PRR)은 TLR2/4의 자극을 통해 면역증진인자의 생성을 증가시킴을 나타낸다.
도 7은 대식세포에서 MAPK가 적작약 추출물(PRR)에 의한 면역증진인자 생성과 관련된 주요 상류 키나아제임을 나타낸다.
도 8은 대식세포에서 적작약 추출물(PRR)이 자기포식을 유도함을 나타낸다.
- 상기 도 1 내지 8의 각 도면에서 유전자/단백질 발현 이미지 결과는 각각 수치화하여 그래프로 나타냈다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1: 작약 추출물의 제조>

본 발명의 작약 추출물을 제조하기 위해, 증류수를 추출 용매로 사용하여 작약 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 적작약(작약 뿌리)과 백작약(작약의 뿌리 중, 껍질을 벗긴 것)을 증류수로 2~3회 세척하고 열풍 건조기로 건조하고 분쇄기로 분쇄하여 -20℃에서 보관하였다. 분쇄된 적작약과 백작약 각각 10g에 대해 20배 부피에 해당하는 물을 첨가하고 4℃~80℃에서 1시간~24시간 추출하여 각 조건별 추출물을 수득하였다. 이후 추출물을 여과한 후, 동결건조하여 최종 적작약 추출물(PRR)과 백작약 추출물(PRA)을 수득하였다.

<실시예 2: 세포 배양 및 작약 추출물의 세포 독성 확인>

마우스 대식세포인 RAW264.7은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, Dulbecco의 Modified Eagle 배지(DMEM)/F-12 1:1 Modified 배지(Lonza, Walkersville, MD, USA)에 10% 소 태아 혈청(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 혼합한 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다.

실험 전 적작약 추출물(PRR)과 백작약 추출물(PRA)은 각각 멸균수에 녹여 세포에 처리하였다.

한편 세포독성 평가는 MTT 분석법을 사용하였는데 이 분석법은 대사 과정이 온전한 세포의 미토콘드리아 내의 탈수소효소가 노란색 수용성 tetrazoliumsalt [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT)를 비수용성의 짙은 자주색 MTT formazan 결정으로 환원시키는 원리를 이용한 것으로서, 상기 결정에 대해 적절한 파장 (주로 500-600 nm)에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하는 방법이다.

먼저, RAW 264.7 세포를 1×10⁵cells/well의 농도로 96well에 분주 후 24시간 동안 배양 후, 각 조건별 추출물을 각각 0, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리하고 24시간 배양 후 1 mg/mL 농도의 MTT를 넣고 2시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 후 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 넣어 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

확인 결과 실시예 1에서 제조한 적작약 추출물(PRR)과 백작약 추출물(PRA)에서 세포가 95% 이상 생존하여 세포독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다.

<실시예 3: 작약 추출물의 면역자극인자 생성 유도 활성 측정>

적작약 추출물(PRR)로 인해 면역 조절물질인 NO(nitric oxide), iNOS (inducible nitric oxide synthase), IL-1β (Interluekin 1 beta) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor alpha)의 생성이 증가되는지 알아보기 위해 Griess 분석과 RT-PCR로 측정하였다.

NO 생성 측정을 위한 Griess 분석을 위해서, 먼저, RAW264.7 세포(2×10⁵세포/웰)를 12-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후, 적작약 추출물(PRR)를 처리하고 추가적으로 24시간 동안 배양했다. 이 후, 100㎕의 세포 배양 배지를 취하고 동일한 양의 Griess 시약(Sigma Aldrich)과 혼합하여 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 후 UV/Visible 분광 광도계 (Human Cop., Xma-3000PC, Seoul, Korea)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.

iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의 발현에 대한 적작약 추출물(PRR)의 효과를 평가하기 위해서는 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석을 수행하였다. 이를 위해, RAW264.7 세포(2×10⁵세포/웰)를 12-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후, 적작약 추출물(PRR)을 처리하고 추가적으로 24시간 동안 배양했다. 모든 처리가 완료된 후 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 세포에서 전체 RNA를 분리하고 전체 RNA를 정량적으로 분석했다. 그런 다음, 1㎍의 총 RNA로부터 Verso cDNA Kit(Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성했다. 이 후, PCR Master Mix Kit(Promega, Madison, WI, USA)와 표 1에 제시된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행했다. PCR 결과는 아가로즈 젤 전기 영동을 사용하여 시각화하였다. mRNA 밴드의 밀도는 소프트웨어 UN-SCAN-IT 겔 버전 5.1 (Silk Scientific Inc. Orem, UT, USA)을 사용하여 계산하였다.

프라이머 이름	염기서열
iNOS F	5'-ttgtgcatcgacctaggctggaa-3'
iNOS R	5'-gacctttcgcattagcatggaagc-3'
COX-2 F	5'-gtactggctcatgctggacga-3'
COX-2 R	5'-caccatacactgccaggtcagcaa-3'
IL-1β F	5'-ggcaggcagtatcactcatt-3'
IL-1β R	5'-cccaaggccacaggtattt-3'
TNF-α F	5'-tggaactggcagaagaggca-3'
TNF-α R	5'-tgctcctccacttggtggtt-3'
GAPDH F	5'-ggactgtggtcatgagcccttcca-3'
GAPDH R	5'-actcacggcaaattcaacggcac-3'

도 1에서 나타난 바와 같이 대식세포에 온도 조건별로 추출된 적작약 추출물(PRR)을 처리할 경우, 4℃에서 60℃까지는 온도가 높아질수록 NO, iNOS, IL-1β의 생성은 증가하였으며, COX-2의 생성은 유사하였다. 그러나 80℃에서는 TNF-α를 제외한 NO, iNOS, COX-2, IL-1β의 생성이 유의적으로 감소하였다. 따라서 적작약 추출물(PRR)의 최적 추출온도는 60℃인 것으로 확인된다.

또한 도 2에서 나타난 바와 같이 대식세포에 60℃에서 시간 조건별로 추출된 적작약 추출물(PRR)을 처리할 경우, 시간조건별로는 큰 차이 없이 모든 조건에서 높게 NO, COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α의 생성을 유도하였다. 도 2의 결과와 향후 산업적 활용 측면에서 볼 때, 최적 추출시간을 1시간으로 하였다.

도 1과 도2의 결과를 통해, 이후의 적작약의 최적 추출 조건을 증류수를 용매로 사용하여 60℃에서 1시간 추출하는 것으로 하였다.

<실시예 4: 적작약 및 백작약 추출물의 활성 비교>

시중에 생약재로 유통되는 작약은 적작약과 백작약으로 구분되기에, 적작약과 백작약의 대식세포 활성화 활성을 비교 분석하였다. 실험방법은 실시예 3의 방법을 그대로 이용하였고, 이에 대한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3을 살펴보면, 적작약과 같은 조건으로 추출한 백작약 추출물(PRA)을 대식세포에 처리한 결과 NO, iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의 생성이 매우 약하게 증가하였으나, 적작약 추출물(PRR)을 대식세포에 처리한 결과 NO, iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의 생성이 높게 나타났다.

적작약 추출물(PRR)은 또한, 도 4의 결과에서처럼 농도의존적으로도 대식세포의 NO, iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α 생성을 증가시켰다.

<실시예 5: 적작약 추출물의 대식세포 식균작용에 미치는 영향 측정>

대식세포에서 분비되는 면역 조절제는 대식세포의 식균작용을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 대식세포의 식균작용은 대식세포 활성화의 지표로 사용된다. 따라서 RAW264.7 세포에 대한 식균 작용에 대한 적작약 추출물(PRR)의 효과를 평가하기 위해 Neutral red uptake assay를 수행했다.

구체적으로, RAW264.7세포(2×10⁵세포/웰)를 12-well plate에서 24시간 동안 배양한 후, 적작약 추출물(PRR)을 농도에 따라 처리하고 추가로 24시간 동안 배양했다. 24시간 후, 각 세포를 1xPBS로 3회 세척 한 다음, 0.01 % neutral red 용액 1㎖를 각 세포에 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. 그 후 각 세포를 1xPBS로 3회 세척한 다음 세포용해완충액(에탄올 산:아세트산 = 1:1) 1㎖를 가하여 세포에 흡수된 neutral red 용액을 용출시켰다. 흡광도는 UV/Visible 분광 광도계(Human Cop., Xma-3000PC, Seoul, Korea)를 사용하여 540㎚에서 측정되었다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 적작약 추출물(PRR)이 대식세포 식균 작용을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다.

<실시예 6: 적작약 추출물에 의해 유도된 대식세포 활성화 관련 수용체 확인>

본 발명의 적작약 추출물(PRR)이 대식세포의 활성화를 유도한다는 것을 확인하였으므로, 그 기작을 추적하기 위해 대식세포 활성화와 관련된 주요 수용체를 확인하였다.

이를 위해, TLR2/4(Toll-like receptor 2/4)는 대식세포 활성화와 관련된 주요 수용체로 알려져 있기 때문에 적작약 추출물(PRR)에 의해 유도된 면역 조절제 생산에 대한 TLR2/4의 효과를 평가했다.

구체적으로, RAW264.7 세포에서 C29(TLR2 억제제) 또는 TAK-242(TLR4 억제제)로 TLR2 또는 TLR4를 억제한 후 적작약 추출물(PRR)을 24시간 동안 처리했다. NO 레벨은 Griess 분석, NOS, IL-1β 및 TNF-α는 RT-PCR로 분석하였고, 식균작용은 Neutral Red assay로 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, C29 처리는 적작약 추출물(PRR)에 의한 NO와 IL-1β, TNF-α의 활성을 매우 약하게 감소시키나, TAK-242 처리는 적작약 추출물(PRR)의 활성 억제를 통해 NO, iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의 생성을 모두 현저히 감소시켰다.

따라서 적작약 추출물(PRR)에 의한 대식세포 활성화 관련 주된 대식세포의 수용체는 TLR4임을 알 수 있다. 즉, 적작약 추출물(PRR)이 대식세포에서 TLR4(Toll-like receptor 4)의 발현을 주로 유도하여 면역 조절제의 생성을 증가시키는 것으로 확인된다.

<실시예 7: 적작약 추출물에 의해 유도된 면역 조절제 생성과 관련된 상류 키나아제 확인>

TLR4의 활성화는 MAPK (mitogen-activated protein kinases) 신호 전달 경로를 활성화하여 대식세포에서 면역 조절제 생성을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에, 대식세포에서 적작약 추출물(PRR) 매개 면역 조절물질 생성에 MAPK 신호전달이 관여하는지 분석하였다.

구체적으로, RAW264.7 세포에 적작약 추출물(PRR)을 처리하기 전 ERK1/2 억제제인 PD98059(40μM), p38 억제제인 SB203580(40μM), JNK 억제제인 SP600125(40μM)를 전처리하여 각 신호 전달 경로를 억제한 후 적작약 추출물(PRR)을 24시간 동안 처리했다. NO 레벨은 Griess 분석, NOS, IL-1β 및 TNF-α는 RT-PCR로 분석하였다.

그 결과, 도 7a와 7b에 나타난 바와 같이, 적작약 추출물(PRR)이 대식세포에서 ERK1/2, p38 및 JNK의 억제시 적작약 추출물(PRR)로 인해 증가되는 면역자극인자들의 생성이 감소하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, MAPK 신호전달은 적작약 추출물(PRR)에 의한 면역 자극인자들의 생성과 관련된 주요 상류 키나아제임을 나타낸다.

다음으로는 적작약 추출물(PRR)이 p38, ERK1/2 및 JNK 활성화에 미치는 영향을 분석하기 위해, RAW264.7 세포에 적작약 추출물(PRR)을 시간별로 처리한 다음 Western blot 분석을 통해 p38, ERK1/2 및 JNK의 인산화 형태를 확인하였다.

실험을 위해, 적작약 추출물(PRR)을 처리한 세포를 차가운 1xPBS로 3회 세척한 다음, 프로테아제(protease) 억제제(Sigma-Aldrich) 및 포스파타아제(phosphatase) 억제제(Sigma-Aldrich)가 포함된 방사면역침전분석 (radioimmunoprecipitation; RIPA) 완충액(Boston Bio Products, Ashland, MA, USA)에 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. RIPA 완충액과 반응한 세포를 4℃에서 10분 동안 15,000rpm에서 원심분리한 후, 상층액을 취하고 단백질을 BCA(bicinchoninic acid; BCA) 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA)를 사용하여 정량적으로 분석했다.

그 후 SDS-PGAE에서 단백질을 분리하여 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 실온에서 블록킹 완충액(5% 탈지 우유를 함유하는 0.05% Tween 20(TBS-T))에서 1시간 동안 반응하였다. 다음으로 PDVF 막을 TBS-T 완충액으로 세척 한 후 0.05% TBS-T의 5% BSA에서 특정 1차 항체로 처리하고 4℃에서 16시간 동안 두었다. 1차 항체 처리 후 PVDF 막을 TBS-T 완충액으로 세척하고, 연속적으로 2차 항체를 실온에서 블록킹 완충액과 교반 처리하였다. PVDF 막을 TBS-T 버퍼로 세척한 후, 화학발광(Chemiluminescence)은 ECL Western blotting 기질(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)로 하였으며, LI-COR C-DiGit Blot Scanner(Li-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA)를 이용해 시각화하였다. 웨스턴 블롯의 밴드의 밀도는 UN-SCAN-IT gel version 5.1(Silk Scientific Inc. Orem, UT, USA)을 이용하여 계산되었다.

도 7c에 나타낸 바와 같이, 적작약 추출물(PRR)은 p38, ERK1/2 및 JNK의 인산화를 모두 유도하여, 이들의 활성화를 유도하는 것이 입증된다.

마지막으로 적작약 추출물(PRR)로 인한 p38, ERK1/2 및 JNK의 활성화에 TLR4가 미치는 영향을 분석하기 위해, TAK-242로 TLR4를 억제시킨 후 적작약 추출물(PRR)을 15분 처리한 후 Western blot 분석을 통해 p38, ERK1/2 및 JNK의 인산화를 확인하였다.

그 결과 도 7d에 나타낸 바와 같이, TLR4의 억제는 적작약 추출물(PRR)에 의한 p38, ERK1/2 및 JNK의 인산화를 감소시켰다. 이 결과를 미루어 볼 때, PRR은 TLR4의 자극을 통해 p38, ERK1/2 및 JNK의 활성화를 유도하는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 8: 적작약 추출물의 대식세포 자가포식 유도 확인>

최근 연구에서 자가포식(Autophagy)는 항원 제시 세포와 T 세포의 기능을 조절하여 T 세포 반응을 증가시킬 수 있다고 보고되었다. 특히, TLR4 자극을 통한 대식세포 자가포식의 활성화는 대식세포 항원 처리 및 제시를 증가시켜 선천성 및 후천성 면역 반응을 향상시킨다. 따라서 자가포식 촉진제는 면역 반응을 향상시키는 잠재적인 면역보조제 후보로 여겨지고 있다. 자가포식에서 미세소관 관련 단백질 1A/1B-경쇄 3(LC3)은 자가포식소체 및 자가포식 활성을 조사하는 데 사용되었으며 자가포식소체로 화물을 모집하는 역할을 한다. LC3-I로부터 형성된 LC3-II는 autophagosome에 국한되어 있기 때문에 LC3-II의 양은 autophagosome과 autophagy 관련 구조의 수에 정비례하는 것으로 알려져 있다. p62/sequestosome 1(SQSTM1)은 선택적 자가포식 수용체이며 다양한 유비퀴틴화된 화물을 자가포식 경로로 전달하는 데 중요하다. 따라서 LC3-II 및 p62/SQSTM1의 증가는 자가포식의 주요 지표로 확인된다.

이에 적작약 추출물(PRR)을 처리한 대식세포에서 자가포식이 유도되는지 알아보기 위해, Western blot으로 LC3-II와 p62/SQSTM1을 분석하였다.

그 결과, 도 8a와 8b에서 나타나 있듯이, 적작약 추출물(PRR)은 시간 및 농도의존적으로 LC3-II와 p62/SQSTM1의 생성을 증가시켰으며, 이로 인해 적작약 추출물(PRR)이 대식세포의 자가포식을 유도하는 것을 확인할 수 있다.

<제제예 1. 약학적 제제>

본 발명의 적작약 추출물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 적작약 추출물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 적작약 추출물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 적작약 추출물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 적작약 추출물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 2-5. 야채주스 제조

본 발명의 적작약 추출물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-6. 과일주스 제조

본 발명의 적작약 추출물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims

작약(Paeonia lactiflora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대식세포 활성화를 기반으로 하는 선천성 또는 후천성 면역반응 증진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 면역조절인자의 생성 증가 또는 식균작용의 활성화를 유도하는 것을 특징으로 하는 대식세포 활성화를 기반으로 하는 선천성 또는 후천성 면역반응 증진용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 면역조절인자는 산화질소(NO), 유도성 산화질소 합성효소(iNOS), 사이클로옥시게나제-2(COX-2), 인터루킨 1β(IL-1β) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 대식세포 활성화를 기반으로 하는 선천성 또는 후천성 면역반응 증진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 대식세포의 자가포식 유도를 특징으로 하는 대식세포 활성화를 기반으로 하는 선천성 또는 후천성 면역반응 증진용 조성물.
제1항의 조성물을 함유하는 면역증진용 식품 조성물.
제1항의 조성물을 함유하는 면역증진용 건강기능식품.
제1항의 조성물을 함유하는 반려동물의 면역증진용 사료 조성물.