KR20240035998A - 포획 리간드로서의 변형된 tnf - Google Patents
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Abstract
체액으로부터 sTNF-R2를 제거하기 위한 컬럼이 개시된다. 컬럼은 구획, 구획에 커플링되고 체액을 수용하도록 구성된 입구, 및 구획 내에 배치된 기재를 갖는다. 포획 리간드는 기재에 커플링되고 천연 TNF 서열의 일부를 포함하는 참조 서열 내에 아미노산 치환을 갖는 변형된 서열을 갖는다. 변형된 서열은 sTNF-R2에 대한 참조 서열의 친화성보다 큰 sTNF-R2에 대한 친화성을 갖는다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 본 출원은 2021년 6월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 63/211,709호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체내용이 본원에 포함된다.
서열 목록
[0002] 본 출원은 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 텍스트 파일의 형태로 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된다. 2022년 6월 17일에 생성된 상기 ASCII 카피는 "022947-0569654_Sequence_listing_ST25.txt"로 명명되고 크기가 9.54 KB이며, 이의 내용은 그 전체내용이 본원에 참조로서 포함된다.
[0003] 성분채집술은 환자의 혈액을 하나 이상의 특정 구성요소를 분리하고 나머지를 순환계로 돌려보내는 장치를 통해 통과시키는 의료 기술이다. 따라서, 이는 체외 요법이다. 이 기술은 일반적으로 헌혈 센터에서 혈소판을 수집하는 데 사용된다.
[0004] 염증 및 세포 아폽토시스의 신체 조절은 다수의 조절 단백질에 의해 관리되는 복잡한 과정이다. 종양 괴사 인자 알파(TNF)는 항종양제로서 특징화된 강력한 사이토카인이다. TNF의 결정학적 연구는 이러한 사이토카인이 생체내에서 동종삼량체를 형성하여 TNF 수용체와의 상호작용을 용이하게 하는 것을 보여준다. TNF 수용체 1 및 2(TNF-R1 및 TNF-R2)는 세포에 막-고정된 수용체로서 존재하며, 이를 통해 TNF 결합시 세포로의 신호전달이 일어난다. 막횡단 형태의 TNF 수용체는 또한 세포 표면으로부터 절단되어, 이러한 사이토카인에 결합하고 이를 격리함으로써 TNF의 활성을 조절하는 가용성 형태의 TNF 수용체(sTNF-R1 및 sTNF-R2)를 생성한다.
[0005] 암과 같은 질병에서 TNF의 활성을 증가시키기 위해 체외 치료 접근법을 사용하여 sTNF-R1 및 sTNF-R2 중 하나 또는 둘 모두를 효과적이고 동시에 제거하기 위한 치료적 접근법이 필요하다. 본 발명의 개시는 혈액 성분으로부터 sTNF-R1 및 sTNF-R2 중 하나 또는 둘 모두를 제거하기 위한 시스템 및 방법을 설명한다.
[0006] 체액으로부터 sTNF-R2를 제거하기 위한 컬럼이 개시된다. 컬럼은 구획, 구획에 커플링되고 체액을 수용하도록 구성된 입구, 및 구획 내에 배치된 기재를 갖는다. 포획 리간드는 기재에 커플링되고 천연 TNF 서열의 일부를 포함하는 참조 서열에서 아미노산 치환을 갖는 변형된 서열을 갖는다. 변형된 서열은 sTNF-R2에 대한 참조 서열의 친화성보다 큰 sTNF-R2에 대한 친화성을 갖는다.
[0007] 특정 구현예에서, 변형된 서열은 SEQ1(SEQ ID NO:1)의 부위 105, 221, 222, 및 223으로 구성된 군으로부터 선택된 부위에서 치환된 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 치환되는 아미노산은 아스파르트산(D), 글리신(G), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 참조 서열의 부위 221, 222, 및 223 중 하나 이상에서 D의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 부위 221, 222, 및 223 중 2개 이상에서 D의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 부위 221, 222, 및 223 모두에서 D의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 SEQ3(SEQ ID NO:3)을 포함한다.
[0008] 특정 구현예에서, 포획 리간드는 적어도 2개의 변형된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 변형된 서열의 삼량체를 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 SEQ11(SEQ ID NO:5)를 포함한다.
[0009] 특정 구현예에서, 포획 리간드는 적어도 2개의 변형된 서열 사이에 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 링커를 포함하지 않는다.
[0010] 특정 구현예에서, 포획 리간드는 참조 서열을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 변형된 서열의 제1 삼량체 및 참조 서열의 제2 삼량체를 포함하고, 제1 및 제2 삼량체 각각은 기재에 별도로 커플링된다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 변형된 서열 중 적어도 하나 및 참조 서열 중 적어도 하나를 포함하는 삼량체를 포함한다.
[0011] 특정 구현예에서, 변형된 서열은 참조 서열과 95% 이상, 98% 이상의 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 참조 서열과 99.9% 이하의 동일성을 갖는다.
[0012] 특정 구현예에서, 컬럼은 분당 2개의 컬럼 부피의 유량에서 60분의 연속 작업 후 80% 초과 또는 90% 초과인 sTNF-R2에 대한 포획 효율을 갖는다.
[0013] 특정 구현예에서, 변형된 서열은 참조 서열의 KD보다 적어도 30% 적거나 적어도 100% 적은 KD를 갖는다.
[0014] 체액으로부터 sTNF-R2를 제거하기 위한 방법이 개시된다. 상기 방법은 천연 TNF 서열의 일부를 포함하는 참조 서열에서 아미노산 치환을 포함하는 변형된 서열을 포함하는 포획 리간드에 커플링된 기재를 함유하는 구획을 통해 체액을 통과시키는 단계를 포함한다. 변형된 서열은 sTNF-R2에 대한 참조 서열의 친화성보다 큰 sTNF-R2에 대한 친화성을 갖는다.
[0015] 도 1은 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 실험 컬럼을 통해 통과된 시험 용액으로부터 제거된 sTNF-R2의 포획 효율의 플롯이다.
[0016] 도 2는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 실험 컬럼을 통해 통과된 시험 용액으로부터 제거된 sTNF-R1의 포획 효율의 플롯이다.
[0017] 도 3은 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 포획 리간드의 상이한 밀도에 대한 포획 효율 시험 측정치의 플롯이다.
[0018] 도 4는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 예시적인 성분채집술 컬럼을 도시한다.
[0019] 도 5는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 도 4의 성분채집술 컬럼의 예시적인 부분의 확대도를 도시한다.
[0020] 도 6은 선택적 링커를 갖는 고유 TNF 및 변형된(변이체) TNF 삼량체의 조합의 비제한적인 예시적인 구현예를 예시한다.
[0016] 도 2는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 실험 컬럼을 통해 통과된 시험 용액으로부터 제거된 sTNF-R1의 포획 효율의 플롯이다.
[0017] 도 3은 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 포획 리간드의 상이한 밀도에 대한 포획 효율 시험 측정치의 플롯이다.
[0018] 도 4는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 예시적인 성분채집술 컬럼을 도시한다.
[0019] 도 5는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 도 4의 성분채집술 컬럼의 예시적인 부분의 확대도를 도시한다.
[0020] 도 6은 선택적 링커를 갖는 고유 TNF 및 변형된(변이체) TNF 삼량체의 조합의 비제한적인 예시적인 구현예를 예시한다.
[0021] 하기 설명은 혈액 또는 혈액 성분으로부터 가용성 TNF 수용체를 제거하기 위한 리간드, 성분채집술 컬럼, 및 체외 요법의 방법의 구현예를 개시한다. 특정 구현예에서, 컬럼은 성분채집술 기계와 함께 사용된다.
[0022] 전형적인 기계는 환자로부터 전혈을 추출하고 혈액을 혈액 성분, 예를 들어, 적혈구, 혈소판 및 백혈구, 및 혈장으로 분리한다. 혈액 성분 중 하나, 예를 들어, 혈장은 컬럼을 통해 통과하여 표적 물질을 제거한다. 가공된 혈액 성분 및 나머지 혈액 성분은 이후 통합되어 환자의 혈류에 재도입된다. 상업적으로 이용 가능한 성분채집술 기계의 예는 Terumo BCT Spectra Optia System 뿐만 아니라 Fresenius, Haemonetics, Baxter, Nigale 및 Asahi에 의해 제조된 기계를 포함한다.
[0023] 본 발명의 개시의 맥락에서, 성분채집술 기계는 환자로부터의 혈액의 정맥내 제거 및 이어서 상기 환자로부터의 혈액의 혈장 및 세포 분획으로의 분리(예를 들어, 원심력, 막 필터, 및/또는 다른 성분을 사용함)를 용이하게 할 수 있다. 혈장 분획 또는 다른 체액은 혈장이 혈장의 성분을 선택적으로 포획하는 포획 지지체(이는 본원에 설명된 바와 같은 포획 리간드를 갖는 기재를 포함함)를 통해 통과하는 본원에 개시된 시스템을 통해 펌핑됨으로써 처리된다. 이후, 혈장은 환자의 분리된 세포와 재조합되고 환자의 순환계로 재도입된다.
[0024] 개시된 시스템의 사용은 면역계의 활성화가 요망되는 치료 영역에서의 적용에 바람직하다. 예시적인 의도는 염증을 유도하거나, 세포 아폽토시스를 촉발하거나, 세포 증식을 유발하거나, 다른 생물학적 경로를 변형시킬 수 있는 분자 TNF에 의한 신호전달을 유도하는 것이다. 일반적으로, 개시된 시스템 및 방법은 암, 특히 고형 종양 또는 혈액암의 치료 뿐만 아니라 감염성 질병, 대사 질병, 과증식성 장애, 자가면역 질병, 퇴행성 질병, 및 면역계 조절장애와 관련된 다른 장애의 치료에 유용하다.
[0025] 가용성 수용체인 sTNF-R1 및 sTNF-R2는 면역 세포의 상이한 서브셋에 의해 생산되고, 단백질분해 처리에 의해 세포 표면으로부터 절단되며, 이는 세포외 도메인을 수용체의 막횡단 및 세포내 도메인으로부터 분리한다. 건강한 인간 환자에서, sTNF-R2의 혈장 수준은 일반적으로 sTNF-R1의 수준보다 높다. 특정 상황에서, 치료로서 상이한 양의 sTNF-R1 및 sTNF-R2를 제거하는 것이 바람직하다.
[0026] 하기에 기재된 상세한 설명은 본 발명의 기술의 다양한 구성의 설명으로 의도되며 본 발명의 기술이 실시될 수 있는 유일한 구성을 나타내려는 것은 아니다. 첨부된 도면은 본원에 포함되며 상세한 설명의 일부를 구성한다. 상세한 설명은 본 발명의 기술의 철저한 이해를 제공하기 위한 특정 세부사항을 포함한다. 본 발명의 기술은 특정한 특정 세부사항 없이 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 일부 예에서, 널리 공지된 구조 및 성분은 본 발명의 기술의 개념을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 블록도 형태로 제시된다. 유사하거나 실질적으로 유사한 성분은 이해의 편의를 위해 동일한 요소 번호로 표지된다.
[0027] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "환자"는 순환계를 갖는 임의의 유기체를 의미한다. 환자는 인간일 수 있다. 환자는 또한 개 또는 고양이 또는 다른 포유동물과 같은 동물일 수 있다.
[0028] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 어구 "체액" 및 "혈액 성분"은, 예를 들어, 원심분리에 의해 혈액이 분리될 수 있는 유체 중 하나를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 혈액은 주로 적혈구인 제1 혈액 성분, 주로 혈소판 및 백혈구인 제2 혈액 성분, 및 주로 혈장인 체액으로 분리될 수 있다.
[0029] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "컬럼" 및 어구 "성분채집술 컬럼"은 상호교환적으로 사용되며, 환자로부터의 체액이 통과하는 장치를 의미한다. 컬럼은 체액과 상호작용하는 포획 리간드가 고정된 기재를 포함하는 포획 지지체를 함유하는 내부 구획을 갖는다. 컬럼은 크기 및 형상이 다양한 구성일 수 있고, 하나 이상의 기재 또는 리간드를 포함한다.
[0030] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "기재" 및 "지지체"는 기재에 근접한 물질과 반드시 상호작용하는 것은 아니면서 구조를 제공하는 대상을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 기재 또는 기재의 표면은 다당류와 같은 하나 이상의 유기 물질을 포함할 수 있고, 또한 금속, 플라스틱, 세라믹, 또는 물과 같은 하나 이상의 무기 물질을 포함할 수 있다. 기재는 물질, 처리, 및/또는 환경에 대한 노출에 의해 상이한 형태, 예를 들어, 산화물로 전환된 부분을 포함할 수 있다. 기재는 하나 이상의 층, 예를 들어, 코팅 또는 도금을 포함할 수 있다.
[0031] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "비드"는 다른 기하학적 형상 또는 구조를 배제하지 않으면서 기재의 예시적인 구조적 구현예를 설명하는 데 사용된다. 비드는 고체 구와 같은 고체 형태일 수 있거나, 중공 요소 또는 오픈-셀 포움(open-cell foam)과 같은 구조를 가질 수 있다. 비드는 단순한 기하학적 형태, 예를 들어, 구 또는 막대, 또는 보다 복잡한 형태를 포함할 수 있다. 비드는 볼, 플레이트, 또는 막을 포함할 수 있다. 내부 구조, 예를 들어, 단일 예가 부피를 채울 수 있는 오픈-셀 포움을 갖는 구현예에서, 직경은 포움을 통한 통로의 평균 폭일 수 있다. 복잡한 구조, 예를 들어, 다중-아암 스타(multi-arm star)를 갖는 구현예에서, 직경은 서로의 상부에 적층될 때 구조의 예의 평균 중심-대-중심 분리일 수 있다.
[0032] 특정 구현예에서, 비드는 약 1-600 μm 범위의 평균(mean), 평균(average) 또는 절대 직경을 갖는 대략적인 구를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 약 45-165 μm의 범위 또는 약 60-200 μm의 범위의 평균(mean), 평균(average) 또는 절대 직경을 갖는다. 비드는 다공성 또는 비-다공성일 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 다공성이고, 약 10 nm 내지 100 nm 범위의 평균(mean), 평균(average) 또는 절대 직경을 갖는 기공을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 셀룰로스(예를 들어, 아가로스), 자일란, 덱스트란, 풀루란, 전분 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 Sepharose™ 입자이다. 특정 구현예에서, 리간드의 부착 전에 기재의 표면은 반응성 탄소를 포함한다. 특정 구현예에서, 기재 표면은 다당류, 가교된 다당류, 산화된 다당류, 중성 또는 하전된 다당류, 반응성 탄소, 또는 알데하이드 모이어티를 포함한다.
[0033] 특정 구현예에서, 기재 표면은 리간드 분자와 상호작용하여 안정한 화학 결합을 형성할 수 있는 화학적 활성 연결 기를 함유하도록 변형된다. 이의 예는 상기 기재 표면을 소듐 메타 퍼아이오데이트에 노출시킴으로써 아민 함유 리간드와의 환원성 아미노화 공정에 참여할 수 있는 포르밀 기를 형성시키는 표면 활성화이다.
[0034] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "표적" 및 어구 "표적 성분"은, 예를 들어, 리간드를 표적에 결합시킴으로써 포획 리간드가 상호작용하도록 의도된 화학적, 화합물, 및/또는 유기 구조를 의미한다. 특히, 표적 성분은 체액으로부터 제거되기를 원하는 유기 구조, 예를 들어, 단백질일 수 있다.
[0035] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "리간드"는 표적 성분에 대한 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 요소를 포함하는 물질을 의미한다. 일부 구현예에서, 리간드는 표적 성분 상의 특정 부위에만 실질적으로 결합할 결합 부위를 포함한다.
[0036] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "단량체"는 올리고머 단백질 내에 존재하는 가장 작은 단백질 단위 또는 폴리펩티드 단위로서 이해되어야 한다. 단량체에 대한 언급은 전체 개시된 아미노산 서열 및/또는 표적에 대한 활성 결합 부위를 포함하는 서열의 일부로 구성된 조성물을 포함한다.
[0037] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 "단편" 또는 "기능성 단편"은 단량체의 단편 및/또는 폴리펩티드 또는 단백질의 단편 둘 모두를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 이들은 단량체, 단백질, 또는 폴리펩티드의 단축된 아미노산 서열일 수 있다.
[0038] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "변형된" 및 "변이체"는 "천연" 및 "고유"로 본원에서 상호교환적으로 또한 지칭되는 천연 생리학적 서열에 대한 아미노산 서열 차이를 포함하는 단백질, 펩티드, 단량체, 폴리펩티드, 또는 이들 존재물 중 하나의 단편을 지칭한다. 서열 차이는 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
[0039] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "삼량체"는 상호작용, 예를 들어, 소수성 상호작용, 수소 결합, 공유 결합, 및/또는 단량체의 회합을 초래하는 구조적 모티프의 포함으로 인해 서로 회합되는 3개의 단백질 유닛, 폴리펩티드 또는 단량체를 지칭한다. 본 발명의 개시에서, 연결된 TNF 단량체를 포함하는 단일 가닥은 "폴리펩티드"로 지칭될 수 있다.
[0040] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "TNF", "TNFa", "TNFα", "TNF-α", "TNF 분자" 및 이들의 변형은 상호교환적으로 사용되며, 천연 TNF 또는 변형된 TNF의 전체 TNF 서열 및 부분적 TNF 서열을 포함하는 종양 괴사 인자 분자를 의미하며, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 천연 TNF 및 변형된 TNF 중 하나 또는 둘 모두의 하나 이상의 전체 또는 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
[0041] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 어구 "단일 사슬 TNF" 및 "scTNF" 및 이의 변형은 안정적으로 공유 연결된 고유 TNF 서열 또는 변이체 TNF 서열일 수 있는 적어도 2개의 TNF 분자를 포함하는 TNF 폴리펩티드를 지칭한다.
[0042] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "동종삼량체"는 동일한 아미노산 서열을 갖는 3개의 단량체로 구성된 단백질 또는 분자를 지칭한다.
[0043] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "이종삼량체"는 3개의 단량체 단위를 포함하는 단백질 또는 분자를 지칭하며, 여기서 3개의 단량체 중 적어도 하나는 다른 단량체의 서열과 이의 아미노산 서열에서 차이를 나타낸다.
[0044] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 어구 "기능적 동등물"은 개시된 분자로부터 구조적으로 변형되거나 다양하지만 개시된 분자와 동일한 언급된 기능성을 제공하는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, "기능적 동등물"은 표적 성분에 대한 분자의 부착에 영향을 미치지 않는 분자에 대한 변형을 지칭한다.
[0045] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 어구 "링커" 또는 "연결 요소"는 2개의 상이한 구조 사이(예를 들어, 리간드와 기재(예를 들어, 표면 또는 비드) 사이) 또는 리간드 내의 2개 이상의 단량체 사이를 커플링하는 화합물 또는 구조를 의미한다. 링커는 화학 결합, 아미노산 또는 선형 탄소 사슬일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커는 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 2 내지 30개의 아미노산, 및 바람직하게는 4 내지 20개의 아미노산으로 구성된다. 특정 구현예에서, 개시된 펩티드 링커는 글리신이 풍부하다(즉, 펩티드 링커는 글리신을 포함하는 높은 비율의 아미노산을 가지며, 바람직하게는 아미노산의 적어도 50%는 글리신이고, 보다 바람직하게는 아미노산의 적어도 80%는 글리신이다). 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 글리신 및 세린 구조를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 폴리펩티드 가닥의 단량체를 안정화시키기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 삼량체성 폴리펩티드의 형성은 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 향상된다.
[0046] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 어구 "특이적으로 결합한다(specifically binds)" 및 "특이적으로 결합한다(binds specifically)"는, 예를 들어, 적합한 시험관내 검정(예를 들어, Elisa, Immunoblot, 및 Flow cytometry)에 의해 결정된 바와 같은 다른 분자 또는 다른 펩티드에 대한 결합보다 표적 성분에 결합하는 리간드를 지칭한다. 특이적 결합은 비-특이적 결합을 약 2배 이상, 약 10배 이상, 약 100배 이상, 1000배 이상, 10,000배 이상, 100,000배 이상, 또는 1,000,000배 이상만큼 구별한다.
[0047] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 어구 "포획 효율"은 컬럼을 통한 유체의 단일 통과 동안 유체로부터 제거되는 표적 성분의 백분율 또는 양을 지칭한다. 본 발명의 개시의 맥락에서, 컬럼의 포획 효율은 식 (1-x/y)*100에 의해 결정되며, 여기서 y는 컬럼에 진입하는 유체 중 표적의 농도(예를 들어, pg/ml)이고, x는 컬럼을 떠나는 유체 중 표적의 농도이고, 포획 효율은 백분율로 표현된다. 특정 구현예에서, x 및 y의 단위는 몰 농도이다.
[0048] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "침출"은 유체가 컬럼을 통해 통과되는 동안 기재로부터 리간드 또는 이의 일부의 손실 또는 분리(예를 들어, 해리)를 의미한다. 본 발명의 개시 내에서 사용되는 바와 같이, 침출 속도는 일정 기간에 걸쳐 기재로부터 해리되는 리간드의 양이다.
[0049] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "컬럼 부피"는 컬럼 자체의 부피와 대략적으로 동등한 컬럼을 통과하는 유체의 부피를 지칭한다. 예를 들어, 15 ml 비드 베드를 포함하는 컬럼의 경우, 유체의 1 컬럼 부피는 대략 15 ml와 동등할 것이다.
[0050] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "환자 혈장 부피"는 평균의 건강한 환자에서 혈액의 총량과 대략 동등한 유체의 부피를 지칭한다.
[0051] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "독성"은 컬럼의 출구를 통과하는 유체가 환자에게 허용될 수 없는 위험을 제공하는 것으로 간주되는 양의 물질을 함유함을 의미한다.
[0052] 본 발명의 개시 내에서 사용되는 용어 "동일성"은 일반적으로 백분율로 표현되는, 2개의 서열에서 동일한 아미노산 잔기의 양을 의미한다.
천연 TNF
[0053] TNF 신호전달은 2개의 수용체: TNF-R1 및 TNF-R2를 통해 발생한다. TNF는 혈액에서 막횡단 형태(mTNF) 및 가용성 형태(sTNF)로 존재한다. TNF-R1은 대부분의 조직에서 발현되며 sTNF 및 mTNF 둘 모두에 결합할 수 있다. TNF-R2는 전형적으로 면역계의 세포에서 발견되며 mTNF에 반응한다. sTNF 또는 mTNF에 결합하는 가용성 TNF 수용체는 해당 TNF 분자의 신호전달을 차단하여, TNF를 효과적으로 불활성화시킨다. sTNF-R1 및/또는 sTNF-R2의 상승된 수준은 환자에서 암의 존재와 관련하여 관찰되었으며, 면역계의 활성화를 감소시키기 위해 암에 의해 유도되는 것으로 여겨진다.
[0054] 막-결합된 TNF 수용체에 영향을 미치지 않으면서 환자에게 존재하는 가용성 형태의 TNF 수용체를 선택적으로 제거하기 위한 시스템 및 방법이 개시된다. 본원에 개시된 시스템 및 방법은 종양 세포 및/또는 종양 혈관계의 파괴를 유발하는 사이토카인인 TNF의 활성 및/또는 생체이용률을 증가시킴으로써 환자에서 면역 반응을 개선시키는데 유용하다.
[0055] 단백질의 구조는 본원에서 아미노산의 서열로서 논의된다. 아미노산 1-문자 코드는 표 1에 열거되어 있다.
표 1 - 아미노산 1-문자 코드
[0056] 표 2(SEQ1)는 www.uniprot.org/uniprot/P01375로부터의 천연 TNF의 제1 참조 서열이다.
표 2 - SEQ1 천연 TNF 서열
[0057] 표 3(SEQ2 (SEQ ID NO:2))은 부분적 천연 TNF의 예시적인 제2 참조 서열이다.
표 3 - SEQ2 부분 천연 TNF 서열.
변형된 TNF
[0058] 특정 구현예에서, 단백질, 펩티드, 단량체, 또는 폴리펩티드는 보존적 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은 동일한 부류로부터의 아미노산에 대한 특정 유형의 측쇄를 갖는 아미노산의 교환을 포함한다. 예를 들어, 극성 측쇄를 갖는 아미노산은 극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 대체된다. 또 다른 예에서, 소수성 측쇄를 갖는 제1 아미노산은 소수성 측쇄를 갖는 제2 아미노산으로 대체된다. 특정 구현예에서, 변형된 서열과 천연 서열 사이의 동일성은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 98%이다.
[0059] 본원에 개시된 바와 같은 TNF 분자의 변형은 천연 TNF 분자에 비해 sTNF-R1 또는 sTNF-R2에 대한 이의 결합 친화성을 개선시키기 위해 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 천연 TNF는 TNF-R2에 대한 이의 친화성을 증가시키도록 변형되었다. 표 4는 TNF 분자의 예시적인 서열 변이체를 열거한다.
표 4 - TNF 서열 변이체
[0060] 표 5는 예시적인 변형된 서열 SEQ3을 천연 TNF의 참조 서열(SEQ1)과 비교하였다.
표 5 - SEQ3 대 참조 서열의 비교
[0061] 폴리펩티드는 직접적으로 또는 중간체 링커를 통해 커플링되는 적어도 2개의 단량체로부터 형성될 수 있다. 폴리펩티드가 중간체 링커를 갖거나 갖지 않는 3개의 단량체로 구성될 때, 이는 삼량체로 지칭된다. 단량체가 동일한 서열인 경우, 이는 동종삼량체이다. 단량체 중 적어도 하나가 또 다른 단량체와 상이한 경우, 즉, 2개의 단량체 사이에서 100% 미만으로 동일한 경우, 이는 이종삼량체이다. 삼량체는 3개의 연결된 단량체의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착된 다른 서열, 예를 들어, 비오틴을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 삼량체는 한쪽 말단에 부착된 기재에 결합하도록 선택된 결합 기를 갖는다. 특정 구현예에서, 결합 기는 아민의 존재 하에 기재와 쉬프 염기 결합을 형성하도록 선택된다.
[0062] 표 6은 변형된 TNF 동종삼량체인 예시적인 SEQ11(SEQ ID NO:5)을 열거한다. 특정 구현예에서, 변형된 서열은 변형된 서열의 2개 이상의 카피를 포함한다. 특정 구현예에서, 삼량체 변형된 서열은 변형된 TNF의 카피 사이에 링커, 예를 들어, 스트링 "GGGS"(SEQ ID NO:4) 또는 이의 배수를 포함한다. 이 예에서, SEQ3의 3개 카피는 링커에 의해 단일 사슬 삼량체에 커플링되고, 여기서 각각의 링커는 밑줄 표시된 "GGGS"(SEQ ID NO:4)의 4개 카피이다. 이탤릭체 문자 “**xxxx”로 표시된 바와 같이, 추가적인 서열이 삼량체의 각 말단에 첨가될 수 있다.
표 6 - SEQ11 변형된 단일 사슬 TNF(scTNF) 서열
[0063] SEQ11 단백질을 E 콜리(E coli)에서 발현시키고, 고정화된 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(IMAC) 컬럼에 의해 80% 순도로 정제하였다. SEQ11 단백질을 비드 부피당 1 mg/ml 및 2 mg/ml의 리간드의 밀도로 아가로스 비드에 커플링시켰다. TNF-R1 및 TNF-R2를 갖는 인간 혈장을 각각의 컬럼에 통과시키고, 수용체의 잔류량을 측정하고 혈장 중의 원래 양과 비교하였다.
[0064] 도 1은 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 다양한 컬럼에 대한 sTNF-R2의 포획 효율의 플롯이다. 3개의 포획 리간드로 전체-크기 컬럼(15 ml)을 제조하였다:
● 천연 TNF 삼량체
● TNF 변이체 삼량체(SEQ11)
● 천연 TNF 삼량체 및 TNF 변이체 삼량체 SEQ11의 조합
[0065] 천연 TNF 및 TNF 변이체 컬럼의 경우, 비드를 비드 밀리리터 당 대략 1 mg의 포획 리간드(1 mg/ml 밀도)로 코팅하였다. 혼합물 컬럼용 비드를 1 mg의 각각의 포획 리간드(천연 및 변이체)로 코팅하였다. 변이체 TNF 및 천연 TNF의 비는 컬럼을 통해 통과하는 혈액 성분으로부터 제거되는 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 상대적인 양을 결정하기 위해 조정될 수 있다. 특정 구현예에서, 비는 천연 TNF 포획 리간드 단독에 의해 제거되는 것보다 더 많은 sTNF-R2를 제거하도록 선택된다. 특정 구현예에서, 비는 sTNF-R1보다 더 많은 sTNF-R2를 제거하도록 조정된다. 특정 구현예에서, 비는 대략 동일한 양의 sTNF-R2 및 sTNF-R1을 제거하도록 조정된다. 특정 구현예에서, 비는 sTNF-R1보다 더 적은 sTNF-R2를 제거하도록 조정된다.
[0066] 0.025% 소 혈청 알부민(BSA)을 갖는 포스페이트-완충 염수(PBS)를 사용하여 시험 용액을 제조하였다. TNF-R1은 10 mg/ml에 도달하도록 첨가되고, TNF-R2는 40 ng/ml의 수준으로 첨가된다. 용액의 pH는 7.4이다. 실험을 30 ml/분으로 60분 동안 수행하여 1800 ml의 유출물을 생성하였다. 각 샘플에서 sTNF-R2의 양을 측정하고, 원래 용액에서 sTNF-R2의 양과 비교하여 포획 효율을 결정하였다. 곡선(120)은 천연 TNF 포획 리간드의 포획 효율이 떨어져 60분 내에 대략 76%로 감소함을 보여준다. 이에 비해, 변이체 SEQ11에 대한 곡선(110)은 60분 후에 여전히 대략 94%이다. 천연 TNF와 변이체 TNF의 혼합물에 대한 곡선(130)은 곡선(110)과 비교하여 작은 하락을 나타내지만, 60분 후에 여전히 90% 초과이다.
[0067] 도 2는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 다양한 컬럼에 대한 sTNF-R1의 포획 효율의 플롯(200)이다. 천연 TNF 삼량체에 대한 곡선(210)은 높게 유지되고 60분 후에 대략 98%이다. 그러나, 곡선(220)은 변이체 TNF 포획 리간드의 포획 효율이 빠르게 떨어지며, 20분 미만 내에 70% 미만임을 보여준다. 천연 TNF와 변이체 TNF의 혼합물에 대한 곡선(230)은 곡선(210)과 비교하여 작은 하락을 나타내지만, 60분 후에 여전히 95% 초과이다.
[0068] 도 3은 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, TNF 변이체 포획 리간드의 상이한 밀도에 대한 포획 효율 시험 측정치의 플롯(300)이다. 시험 컬럼(1 ml 용량)을 1 mg/ml 리간드 밀도 및 2 mg/ml 리간드 밀도로 제조하였다. sTNF-R1 및 sTNF-R2로 스파이킹된 시험 유체를 수평 축에 지시된 바와 같이 다양한 속도로(순차적으로 4, 2, 1, 2, 및 4 ml/분) 컬럼에 통과시켰다. 1 mg/ml 컬럼에 대한 데이터는 좌측에 제시되고, 2 mg/ml 컬럼은 우측에 제시된다. 샘플을 각 유량에서 1분 동안 수집하고 분석하였다. 줄무늬 막대(310)는 포획된 sTNF-R1의 양을 나타내고, 실선 막대는 포획된 sTNF-R2의 양을 나타낸다. 1 mg/ml 밀도는 이 시험의 지속기간 동안 sTNF-R2에 대한 98-99% 포획 효율을 유지하기에 충분하고 밀도를 2 mg/ml로 증가시킴으로써 유의하게 개선되지 않는다는 것을 알 수 있다. sTNF-R1에 대한 포획 효율은 초기에 78-91% 범위에서 97%로 유의하게 개선되었지만, 5번째 샘플에 의해 90%로 떨어졌다. 평균 포획 효율은 표 7에 요약되어 있다.
표 7 - 포획 효율
결합 친화성
[0069] 리간드와 이의 표적의 결합의 결합 강도는 "평형 해리 상수" 또는 "KD"로서 특징지어지며, 이는 평형에서 적정 측정에서 획득되거나 해리 속도 상수(koff)를 결합 속도 상수(kon)로 나눔으로써 회득된 값이다. 결합 및 해리 속도 상수를 결정하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. KD는 수용체에 대한 리간드의 친화성의 역수를 나타내며, 따라서 더 작은 KD 값은 리간드와 수용체 사이의 더 높은 결합 친화성을 나타낸다.
[0070] 특정 구현예에서, 이러한 방법은 이들의 표적에 대한 다양한 리간드의 결합 친화성을 비교하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 가용성 TNF 수용체에 대한 TNF 단량체 리간드의 친화성이 측정된다. 특정 구현예에서, 가용성 TNF 수용체에 대한 결합에 대한 고유 TNF 분자의 친화성은 가용성 TNF 수용체에 대한 결합에 대한 변형된 TNF 분자의 친화성과 비교된다.
[0071] 고유 TNF 및 변형된 TNF 흡착제에 대한 실험적으로 측정된 친화성 동역학을 측정하고 결과를 표 8에 제공하였다. 리간드 친화성은 나노몰(nM)로 측정되는 해리 상수(KD)로서 직접 측정될 수 있으며, 여기서 더 낮은 KD는 더 높은 결합 친화성과 관련이 있다. 고유 TNF는 변형된 버전보다 sTNF-R1에 대해 10배 이상 더 높은 친화성을 갖는다. 대조적으로, 변형된 TNF는 고유 TNF와 비교하여 sTNF-R2에 대한 증가된 친화성을 나타낸다.
표 8 - sTNF-R에 대한 TNF 폴리펩티드의 결합에 대한 친화성 측정치
[0072] 본 발명의 개시의 맥락에서, 리간드의 "증가된" 친화성은 또 다른 리간드와 비교하거나 상이한 가용성 TNF 수용체에 대한 이의 친화성을 비교할 때 가용성 TNF 수용체와의 상호작용 동안 친화성의 상대적 개선(즉, 더 낮은 측정된 KD)을 지칭한다.
[0073] 특정 구현예에서, 변형된 TNF 리간드는 천연 TNF 리간드의 KD보다 작은 sTNF-R2에 대한 결합에 대한 KD를 갖는다. 특정 구현예에서, 변형된 TNF 리간드는 천연 TNF 리간드의 KD보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 100%, 또는 적어도 200% 더 작은 sTNF-R2에 대한 결합에 대한 KD를 갖는다.
침출
[0074] 흡착제의 침출은 성분채집술 컬럼의 공지된, 그리고 일반적으로 바람직하지 않은 특징이다. 포획 리간드는 혈액 성분이 컬럼을 통해 흐르면서 일정 기간에 걸쳐 기재로부터 해리된다. 침출 속도는 종종 컬럼의 유출에서 검출된 리간드의 양에 의해 결정된다. 초기 침출 속도는 미리 결정된 유량(예를 들어, 10 ml/분)에서 미리 결정된 초기 기간(예를 들어, 1 내지 10 분) 동안 혈액 생성물과 리간드의 첫 번째 접촉 후에 측정된 침출 속도이다. 특정 구현예에서, 초기 침출 속도는 처리 기간 나머지의 침출 속도보다 더 빠르며, 컬럼의 침출 속도는 초기 기간이 경과한 후 미리 결정된 유량에서 측정된 침출 속도를 특징으로 한다.
[0075] 표 8은 공정의 다양한 단계에서 취해진 측정치를 보고한다. 수집된 총 부피를 분자-컷오프 필터에 통과시키고, 여액의 부피를 측정하였다. 이어서, 여액 샘플에서 TNF의 농도를 측정하고 1800 ml의 총 부피로 확장하여 총 부피에서 TNF의 총량을 결정하였다(pg에서 ng로 전환됨). 1시간 동안 시험을 수행함에 따라, 침출 속도(ng/분)는 유출물 중 TNF의 총량을 60분으로 나누어 결정한다.
표 8 - 평균 침출 속도
[0076] 고유 TNF의 최대 허용 용량(MTD)은 300 μg/m2인 것으로 추정되었다. 체표면적(BSA) 평균이 여성의 경우 1.6 m2 및 남성의 경우 1.9 m2이기 때문에, 추정된 총 MTD는 4.8-5.7 μg 범위이다. 치료 과정에 걸쳐 성분채집술 컬럼에 의해 방출된 총 TNF는 이러한 MTD보다 적고, 바람직하게는 훨씬 더 적은 것이 바람직하다. 특정 변형된 TNF 분자는 천연 TNF보다 독성이 덜한 것으로 보고되었다.
[0077] 2시간 성분채집술 치료의 예를 위해, 2.1 ng/분의 침출 속도(표 8의 변형된 TNF 컬럼의 경우)는 환자에게 대략 252 ng의 변형된 TNF를 도입할 것이다. 이는 상기 추정된 MTD보다 대략 20배 낮은 대략 0.25 μg의 이러한 치료로부터의 총 용량과 동등하다.
[0078] 특정 구현예에서, 50 ng/분 이하, 10 ng/분 이하, 5 ng/분 이하, 3 ng/분 이하, 2 ng/분 이하, 또는 1 ng/분 이하의 침출 속도를 갖는 컬럼이 개시된다.
성분채집술 컬럼
[0079] 도 4는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른 예시적인 성분채집술 컬럼(400)을 도시한다. 컬럼(400)은 입구(430) 및 출구(434)를 갖는 구획(420)을 포함하는 본체(410)를 포함한다. 도 2의 예에서, 구획(420)은 일반적으로 입구(430) 및 출구(434) 둘 모두가 평면 원형 디스크인 우측 실린더이다. 특정 구현예에서, 구획(420)의 단면 형상은 타원형, 직사각형, 또는 다른 규칙적 또는 불규칙적 또는 비평면 기하학적 형상일 수 있다. 특정 구현예에서, 입구(430) 및 출구(434) 중 하나 또는 둘 모두의 크기 및 형상은 구획(420)의 공칭 단면의 크기 및 형상과 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 유체는 입구 포트(432)에 들어가고 입구(430)로 이송된다. 유사하게, 특정 구현예에서, 출구(434)로부터 나오는 유체는 출구 포트(436)로 이송된다. 사용시, 컬럼은 도 4의 중력 방향이 임의의 방향일 수 있도록 거꾸로를 포함하여 임의의 방향으로 배향될 수 있다.
[0080] 특정 구현예에서, 입구(430) 및 출구(434) 중 하나 또는 둘 모두는 폴리에틸렌 비드를 함께 용융시킴으로써 제조되는, 통상적으로 "프릿(frit)"으로 지칭되는 다공성 웨이퍼를 포함한다. 비드의 직경 및 압축 정도는 평균 기공 크기를 생성하도록 선택된다. 특정 구현예에서, 평균 기공 크기는 20 마이크론이다. 특정 구현예에서, 프릿은 금속 또는 세라믹을 포함하는 비드를 동일한 효과로 소결시킴으로써 형성된다. 유입 유체에 존재하는 가장 큰 요소가 입구(430) 및 출구(434)를 통과하도록 하여 컬럼(400)의 막힘을 방지하는 프릿에 대한 평균 기공 크기를 선택하는 것이 일반적으로 바람직하다. 구획(420) 내에 도 5의 비드(450)와 같은 기재를 보유하기 위해 평균 기공 크기를 선택하는 것이 추가로 바람직하다.
[0081] 도 5는 본 발명의 개시의 특정 양태에 따른, 도 4의 성분채집술 컬럼(400)의 예시적인 부분 "A"의 확대도를 도시한다. 특정 구현예에서, 구획(420)은 기재, 예를 들어, 도 5에 제시된 바와 같은 복수의 비드(450)로 적어도 부분적으로 충전된다. 특정 구현예에서, 비드(450)는 10-10000 마이크론, 20-1000 마이크론, 30-500 마이크론, 40-250 마이크론, 45-165 마이크론, 75-125 마이크론 범위의 직경, 또는 다른 범위의 직경을 갖는 구이다. 특정 구현예에서, 비드(750)는 25, 50, 75, 100, 125, 또는 150 마이크론의 공통 공칭 직경 또는 다른 공칭 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드(450)는 복수의 공칭 직경을 포함한다.
[0082] 도 6은 선택적 링커를 갖는 고유 TNF 및 변형된(변이체) TNF 삼량체의 조합의 비제한적인 예시적인 구현예를 예시한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 도 6의 A-H의 군으로부터 선택된 복수의 삼량체를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 삼량체는 기재에 별도로 커플링된다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 천연 TNF 단량체 또는 변형된 TNF 단량체의 동종삼량체이다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 천연 및 변형된 TNF 단량체 둘 모두를 갖는 이종삼량체이다. 특정 구현예에서, 삼량체는 적어도 한 쌍의 단량체 사이에 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 삼량체는 단량체 사이에 임의의 링커를 포함하지 않는다.
치료 방법
[0083] 본원에 개시된 방법은 암 또는 자가면역 및 염증성 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 또 다른 질병 상태를 갖는 환자에 대한 면역 조절에 유용하다. 특정 구현예에서, 면역흡착 수단을 사용하여 환자의 혈액 또는 혈액 성분으로부터 가용성 TNF 수용체의 체외 제거가 질병 또는 질환의 치료를 위해 제공된다. 특정 구현예에서, 개시된 방법은, 예를 들어, 본원에 개시된 방법을 사용하여 면역 세포의 아폽토시스의 유도를 통해 과증식성 장애의 치료에 사용된다. 특정 구현예에서, 개시된 방법은 감염성 질병, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 또는 원생동물 감염의 치료에 사용된다. 특정 구현예에서, 개시된 방법은, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액 악성종양을 갖는 환자에서 암의 치료를 위해 수행된다.
[0084] 개시된 방법은 가용성 TNF 수용체가 일부 질병 동안 높은 수준으로 방출된다는 지식에 기반한다. 다양한 질병 및 의학적 상태는 건강한 개인에서 발견되는 가용성 TNF 수용체의 수준과 비교하여 혈액 표본(예를 들어, 혈청 또는 혈장)에서 가용성 TNF 수용체의 상승된 수준과 관련이 있다. 혈청 또는 혈장에서 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 농도는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, Meso Scale Discovery(MSD) 검정 또는 ELISA를 사용하여 측정될 수 있다.
[0085] 특정 구현예에서, 가용성 TNF 수용체의 체외 조작, 고갈 및/또는 제거가 수행되고, 가용성 TNF 수용체가 부분적으로 고갈된 치료된 혈액 또는 혈액 분획이 환자에게 반환된다. 이러한 절차를 수행하기 위해, 말초 혈액을 환자로부터 제거하고, 항응고제를 선택적으로 혈액에 첨가하고, 혈액을 이의 주요 성분으로 분리하고, 예를 들어, 액체 성분, 예를 들어, 혈장으로부터 혈액 세포의 분리는 성분채집술 기계를 사용하여 수행될 수 있다. 이후, 액체 성분은 바람직하게는 가용성 TNF 수용체의 제거를 위해 본원에 개시된 바와 같은 컬럼을 포함하는 이차 회로에서 처리된다. 특정 구현예에서, 컬럼은 성분채집술 기계 튜빙 세트, 정맥내 튜빙 연장 세트, 유체 튜빙 어댑터, 필터, 스톱콕(stopcock), 및/또는 폐쇄-루프 환자 유체 라인 어셈블리에 통상적으로 사용되는 다른 요소에 유체적으로 커플링되도록 구성된다. 특정 구현예에서, 컬럼은 액체 성분이 약 10 ml/분 내지 약 100 ml/분의 유량으로 시스템을 통해 흐르도록 구성된다. 특정 구현예에서, 유량은 약 20 ml/분 내지 약 60 ml/분이다. 특정 구현예에서, 유량은 약 25 ml/분 내지 약 50 ml/분이다. 특정 구현예에서, 유량은 약 30 ml/분 내지 약 45 ml/분이다. 특정 구현예에서, 유량은 sTNF-R1 및/또는 sTNF-R2에 대한 컬럼의 포획 효율의 결정된 수준을 유지하도록 선택된다.
[0086] 특정 구현예에서, 유체 성분은 컬럼에서 고정된 포획 리간드에 대한 유체 성분 내의 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 일부의 결정된 최소 수준의 결합을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 리간드와 접촉된다. 특정 구현예에서, 컬럼은 유체 성분에서 sTNF-R1 및 sTNF-R2 둘 모두의 부분을 제거한다.
[0087] 특정 구현예에서, 환자는, 예를 들어, 본원에 개시된 방법의 개시 전에 상기 환자로부터 획득된 혈청 또는 혈장에서 측정된 바와 같이, 혈액 표본에 존재하는 가용성 TNF 수용체의 양 또는 농도에 기반하여 본원에 개시된 방법 또는 시스템을 사용하여 요법을 위해 선택된다. 특정 구현예에서, 환자는 혈액 표본에서 측정시 적어도 500 pg/ml, 적어도 750 pg/ml, 적어도 1,000 pg/ml, 적어도 1,500 pg/ml, 또는 적어도 2,000 pg/ml의 역치 sTNF-R1 수준에 기반하여 본원에 개시된 방법을 사용하여 요법을 위해 선택된다.
[0088] 특정 구현예에서, 환자는 혈액 표본에서 측정시 적어도 500 pg/ml, 적어도 750 pg/ml, 적어도 1,000 pg/ml, 적어도 1,500 pg/ml, 적어도 2,000 pg/ml, 적어도 5,000 pg/ml, 또는 적어도 10,000 pg/ml의 역치 sTNF-R2 수준에 기반하여 본원에 개시된 방법 또는 시스템을 사용하여 요법을 위해 선택된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법 또는 시스템을 사용한 요법은 sTNF-R2에 대한 높은 포획 효율을 달성하는 고정된 리간드를 포함하는 컬럼을 사용하여 수행된다. 특정 구현예에서, sTNF-R2에 대한 높은 포획 효율을 달성하는 리간드는 SEQ3 - SEQ10로부터 선택된다.
[0089] 특정 구현예에서, 환자는 혈액 표본에서 정량화된 TNF 농도에 기반하여 본원에 개시된 방법 또는 시스템을 사용하여 요법을 위해 선택된다. 특정 구현예에서, 혈액 표본에서 역치 TNF 농도는 0.5 ng/ml 내지 5.0 ng/ml, 0.5 ng/ml 내지 2.5 ng/ml, 또는 2.5 ng/ml 내지 5 ng/ml의 TNF이다. 혈액 표본에서 TNF의 농도는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, TNF의 역치 농도, 예를 들어, 적어도 0.5 ng/ml, 적어도 0.5 ng/ml, 적어도 1.0 ng/ml, 적어도 1.5 ng/ml, 적어도 2.0 ng/ml, 적어도 2.5 ng/ml, 또는 적어도 5.0 ng/ml의 수준이 혈액 성분에 존재하는지 여부를 정의하기 위해 본원에 개시된 방법을 수행하기 전에 내인성 TNF 수준이 측정된다. 특정 구현예에서, 환자에서 측정된 TNF의 농도는 상기 환자의 혈장 또는 혈청에 존재하는 TNF의 내인성 수준을 반영한다. 특정 구현예에서, TNF의 농도의 정량화는 가용성 TNF 수용체(예를 들어, sTNF-R1, sTNF-R2, 또는 둘 모두)의 제거가 환자에서 TNF의 활성을 개선시키거나 질병 상태를 치료하는데 영향을 미칠 가능성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
[0090] 특정 구현예에서, 체외 요법으로 환자를 치료하는 개시된 방법은 절차를 수행하기 위해 이용된 컬럼의 포획 효율에 기초하여 평가된다. 특정 구현예에서. 본원에 개시된 컬럼의 임상 성능 측정은, 예를 들어, 말초 혈액을 샘플링함으로써 측정된, 환자의 총 혈액 풀로부터의 sTNF-R1 및 sTNF-R2 감소를 포함한다. 특정 구현예에서. 임상 성능은 치료되는 체액에서 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 유입 농도 및 성분채집술 절차 동안 특정 시점에서 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 유출 농도를 샘플링함으로써 측정되는 컬럼의 포획 효율의 결정에 의해 정의된다.
[0091] 본원에 개시된 방법의 특정 구현예에서, 전혈 샘플은 기준선(시간 = 0분), 30분, 60분, 90분, 및 치료 종료시(예를 들어, 시스템을 통해 순환되는 2 혈장 부피의 완료시)에 환자의 단일 치료 동안 환자의 중앙 라인 카테터로부터 수집된다. 특정 구현예에서, 샘플 수집을 위한 다른 시간 간격이 치료 동안 사용된다. 특정 구현예에서, 혈장 샘플은 상기 컬럼의 포획 효율의 측정을 위해 컬럼의 입구 및 컬럼의 출구에서 대략 동시에 채취된다. 특정 구현예에서, 전혈 및 혈장 샘플은 성분채집술 절차의 중단 후 시간 간격으로, 예를 들어, 치료 후 30분, 60분, 12시간, 24시간, 36시간, 및 48시간에 채취된다. 혈액 또는 혈액 성분의 수집된 샘플의 sTNF-R1 및/또는 sTNF-R2의 농도는 정량적 검정을 사용하여 측정된다. 컬럼의 입구 대 출구에서의 특정 가용성 TNF 수용체의 농도 사이의 차이는 혈액 성분으로부터 가용성 TNF 수용체를 포획하는데 있어서 컬럼의 효과의 지표이다.
[0092] 특정 구현예에서, sTNF-R1 및 sTNF-R2 중 하나 또는 둘 모두에 대한 포획 효율은 적어도 30%이다. 특정 구현예에서, sTNF-R1 및 sTNF-R2 중 하나 또는 둘 모두에 대한 포획 효율은 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과이다.
[0093] 특정 구현예에서, 변형된 TNF는 동일한 수용체에 대한 천연 TNF의 친화성보다 가용성 TNF 수용체에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 특정 구현예에서, sTNF-R1 및 sTNF-R2에 대한 컬럼의 상대적 포획 효율은 컬럼에서 포획 리간드로서 사용된 천연 TNF 및 변형된 TNF의 상대적인 양에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 변형된 TNF의 삼량체를 포함하는 포획 리간드의 TNF 수용체에 대한 포획 효율은 천연 TNF의 삼량체를 포함하는 포획 리간드의 동일한 TNF 수용체에 대한 포획 효율보다 크다.
[0094] 특정 구현예에서, 컬럼의 포획 효율은 성분채집술 절차 과정 동안, 예를 들어, 치료 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 또는 180분 후에 변한다. 예를 들어, 혈액 샘플에서 가용성 TNF 수용체의 적어도 70%는 약 30분 이내에 컬럼 내의 리간드에 결합될 수 있다. 특정 구현예에서, 흐르는 생물학적 샘플에서 가용성 TNF 수용체의 적어도 80% 또는 그 초과는 약 30분 이내에 컬럼 내의 포획 리간드에 결합된다. 특정 구현예에서, 흐르는 생물학적 샘플에서 가용성 TNF 수용체의 적어도 90% 또는 그 초과는 약 30분 이내에 컬럼 내의 포획 리간드에 결합된다. 특정 구현예에서, 개시된 컬럼은 30분, 45분, 60분, 120분, 또는 180분의 처리 시간에 걸쳐 결정된 포획 효율을 유지한다.
[0095] 임의의 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본원에 설명된 포획 효율 값은 본원에 설명된 변형된 TNF 분자, 및 이의 이량체, 및 삼량체, 특히 sTNF-R2에 대해 예외적으로 높은 표적 친화성을 갖는 것들의 사용으로부터 초래된다. 특정 구현예에서, sTNF-R2에 대한 컬럼의 포획 효율은 고유 서열 SEQ1의 부위 105, 221, 222, 및 223의 군으로부터 선택된 부위에서 아미노산 치환을 포함하는 적어도 하나의 변형된 TNF 단량체의 적용에 의해 개선된다. 특정 구현예에서, 포획 효율은 SEQ3 - SEQ10으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 TNF 단량체의 적용에 의해 달성된다. 특정 구현예에서, 변형된 TNF를 포함하는 리간드는 성분채집술 절차의 대략 30분, 대략 45분, 대략 60분, 대략 120분, 또는 대략 180분 후에 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98% 또는 그 초과의 포획 효율을 부여한다.
[0096] 특정 구현예에서, 본원에 설명된 변형된 TNF 단량체, 이량체, 또는 삼량체를 포함하는 포획 리간드는 대략 1명의 환자 혈장 부피의 체액, 대략 1.5명의 환자 혈장 부피의 체액, 또는 대략 2명의 환자 혈장 부피의 체액을 처리한 후 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 그 초과의 포회 효율을 부여한다.
[0097] 특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료될 혈액 성분의 총 부피, 총 치료 시간, 및 치료의 투여 빈도는 각각의 환자에 대해 개별화되는 파라미터이다. 특정 구현예에서, 치료될 혈장의 총 부피는 1명의 환자 혈장 부피이다. 특정 구현예에서, 치료될 혈장의 총 부피는 2명의 환자 혈장 부피이다.
[0098] 총 혈장 부피 V p (ml)를 계산하기 위한 공식은 다음과 같다:
[0099] 여기서, W는 환자 체중(kg)이고 HCT는 헤마토크릿(%)이다.
[0100] 치료될 혈장 부피에 기초하여 환자 치료 시간 T(분)를 계산하기 위한 공식은 다음과 같다:
[0101] 여기서, V p 는 환자 혈장 부피이고, V x 는 치료될 환자 혈장 부피의 수이고, Q는 컬럼을 통한 체액의 유량(ml/분)이다. 특정 구현예에서, 환자 치료 시간은 1-4 시간의 기간이다. 특정 구현예에서, 환자 치료 시간은 2-3 시간의 기간이다.
[0102] 특정 구현예에서, 성분채집술 절차 동안 sTNF-R1 또는 sTNF-R2 또는 둘 모두의 특정 표적 농도 감소의 달성에 기반하여 치료 시간을 결정하기 위한 방법이 개시된다. 특정 구현예에서, 제1 포획 효율을 갖는 컬럼을 이용한 성분채집술 절차는 환자의 혈장으로부터 sTNF-R1, sTNF-R2, 또는 둘 모두의 총량 또는 농도의 특정 표적 농도 감소를 달성하기 위해 컬럼을 통한 2명의 환자 혈장 부피의 순환을 필요로 한다. 특정 구현예에서, 제1 포획 효율보다 2배인 제2 포획 효율을 갖는 컬럼을 사용한 성분채집술 절차는 sTNF-R1, sTNF-R2 또는 둘 모두의 총량 또는 농도에서 동등한 감소를 달성하기 위해 컬럼을 통한 1명의 환자 혈장 부피의 순환을 필요로 한다.
[0103] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 컬럼은 적어도 200 마이크로그램의 가용성 TNF 수용체(즉, sTNF-R1 및/또는 sTNF-R2)를 제거하도록 구성된다. 특정 구현예에서, 컬럼은 변형된 TNF 리간드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 변형된 TNF 리간드는 삼량체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 컬럼은 50 마이크로그램 내지 250 마이크로그램의 가용성 TNF 수용체를 제거하도록 구성된다. 예시의 목적으로, 예시적인 환자는 혈장에서 3-10 ng/ml 범위의 가용성 TNF 수용체(조합된 sTNF-R1 및 sTNF-R2)의 농도를 갖고 체중이 70 kg이고, 여기서 환자 혈장 부피 Vp는 체중 kg(W) 당 대략 50 ml이다. 환자에서 가용성 TNF 수용체의 총량 R(ng)은 다음과 같이 주어진다:
[0104] 또한, 환자의 혈액 성분에서 발견되는 가용성 TNF 수용체의 양에 영향을 미치는 질병-관련 변수를 포함하는 다른 기저 인자가 있을 수 있다. 예를 들어, sTNF-R1의 총 양은 일부 환자의 혈장에서 1-10 마이크로그램의 범위일 수 있고, sTNF-R2의 총 양은 일부 환자의 혈장에서 5-50 마이크로그램의 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 가용성 TNF 수용체의 양은 본원에 개시된 체외 요법의 투여 전 및/또는 본원에 개시된 체외 요법의 투여 후에 환자에서 추정된다.
[0105] 가용성 TNF 수용체의 효과적인 제거를 위해, 혈장은 가용성 TNF 수용체의 일부의 결합 및 제거를 허용하기에 충분한 시간 동안 리간드와 접촉된다. 후속하여, 혈장은 분리된 혈액 성분과 재조합되어 환자에게 돌려보내진다. 일부 구현예에서, 혈장은 혈액 성분으로부터 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 일부의 결합 및 제거를 허용하기에 충분한 시간 동안 리간드와 접촉된다.
양태
[0106] 혈액 성분에서 sTNF-R2의 농도 또는 양을 감소시키기 위한 방법이 개시되며, 상기 방법은,
(a) 환자로부터의 sTNF-R2를 포함하는 혈액 또는 혈장을 상기 sTNF-R2에 결합하는 변형된 TNF 동종삼량체를 포함하는 체외 컬럼으로 도입하는 단계;
(b) sTNF-R2가 상기 변형된 TNF 동종삼량체에 결합하도록 하기에 충분한 시간 동안 환자로부터의 혈액 또는 혈장을 체외 컬럼 내의 변형된 TNF 리간드와 접촉시키는 단계;
(c) (b) 후에 획득된 혈액 또는 혈장을 상기 환자에게 재도입하는 단계로서, (b) 후에 획득된 혈액 또는 혈장이 (b) 전의 상기 환자의 혈액 또는 혈장과 비교하여 감소된 농도 또는 양의 sTNF-R2를 갖는, 단계; 및
(d) 선택적으로, (a) 전 또는 (b) 후 또는 둘 모두에 상기 환자로부터의 샘플, 예를 들어, 혈장 또는 혈청 샘플에서 sTNF-R2를 검출하거나 확인하고/하거나, 선택적으로 sTNF-R2의 농도 또는 양을 감소시키는 요법을 받기 위해 환자를 선택하거나 확인하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
[0107] 혈액 성분에서 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 농도 또는 양을 감소시키기 위한 방법이 개시되며, 상기 방법은,
(a) 환자로부터의 sTNF-R1 및 sTNF-R2를 포함하는 혈액 또는 혈장을 제1 리간드 및 제2 리간드를 포함하는 체외 컬럼으로 도입하는 단계로서, 제1 리간드가 고유-서열 TNF 동종삼량체를 포함하고 제2 리간드가 변형된 TNF 동종삼량체를 포함하는, 단계;
(b) 환자로부터의 혈액 또는 혈장을 제1 리간드와 접촉시키는 단계로서, sTNF-R1에 대한 포획 효율이 적어도 80%인, 단계;
(c) 환자로부터의 혈액 또는 혈장을 제2 리간드와 접촉시키는 단계로서, sTNF-R2에 대한 포획 효율이 적어도 80%인, 단계;
(d) (b) 및 (c) 후에 획득된 혈액 또는 혈장을 상기 환자에게 재도입하는 단계로서, (b) 및 (c) 후에 획득된 혈액 또는 혈장이 (b) 및 (c) 전의 상기 환자의 혈액 또는 혈장과 비교하여 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 농도 또는 양이 감소한, 단계 중 하나 이상을 포함한다.
[0108] 환자에서 암을 치료하거나 억제하는 방법이 개시되며, 상기 방법은,
(a) 선택적으로, 혈액으로부터 혈액 분획을 분리하는 단계;
(b) 기재에 커플링된 제1 리간드를 사용하여 가용성 TNF 수용체를 발현하는 혈액 또는 혈액 분획의 일부를 제거하는 단계로서, 상기 제1 리간드가 변형된 TNF 단량체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 단계;
(c) 기재에 커플링된 제2 리간드에 대해 가용성 TNF 수용체를 발현하는 혈액 또는 혈액 분획의 일부를 제거하는 단계로서, 상기 제2 리간드가 고유 TNF 단량체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 단계;
(d) (b) 및 (c) 후의 혈액 또는 혈액 분획을 상기 환자에게 재도입하는 단계로서, (b) 및 (c) 후에 획득된 혈액 또는 혈액 분획이 (b) 및 (c) 전의 상기 환자의 혈액 또는 혈액 분획과 비교하여 감소된 양의 가용성 TNF 수용체를 갖는, 단계; 및
(e) 선택적으로, (b) 및 (c) 전 또는 (b) 및 (c) 후 또는 둘 모두에 상기 환자로부터의 샘플에서 가용성 TNF 수용체의 수준 또는 양을 측정하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
[0109] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 성능 규격을 갖는 컬럼이 개시된다:
(a) 생물학적 안전성: 순환 혈액에 대한 장기간 노출을 지원하는 체외 장치로서 사용하기에 생물학적으로 안전한 것으로 입증됨;
(b) 표적: sTNF-R1 및 sTNF-R2;
(c) 포획 효율: 10-100, 20-60, 25-50, 또는 30-45 ml/분의 유량으로 30분 처리 후 sTNF-R1 및 sTNF-R2에 대해 > 80%;
(d) 포획 용량: > 200 μg의 sTNF-R(sTNF-R1 + sTNF-R2);
(e) 컬럼을 통한 유량: ≤ 60 ml/분;
(f) 처리 시간: 대략 2시간;
(g) 치료 부피: 2 환자 혈장 부피;
(h) 포획 리간드의 침출 속도 < 50 ng/분.
[0110] 환자에서 암을 치료하거나 억제하는 방법이 개시되며, 상기 방법은,
(a) 선택적으로, 혈액으로부터 혈액 분획을 분리하는 단계;
(b) 기재에 커플링된 제1 리간드를 사용하여 가용성 TNF 수용체를 발현하는 혈액 또는 혈액 분획의 일부를 제거하는 단계로서, 상기 제1 리간드가 변형된 TNF 단량체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 단계;
(c) 기재에 커플링된 제2 리간드에 대해 가용성 TNF 수용체를 발현하는 혈액 또는 혈액 분획의 일부를 제거하는 단계로서, 상기 제2 리간드가 고유 TNF 단량체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 단계;
(d) (b) 및 (c) 후의 혈액 또는 혈액 분획을 상기 환자에게 재도입하는 단계로서, (b) 및 (c) 후에 획득된 혈액 또는 혈액 분획이 (b) 및 (c) 전의 상기 환자의 혈액 또는 혈액 분획과 비교하여 감소된 양의 가용성 TNF 수용체를 갖는, 단계; 및
(e) 선택적으로, (b) 및 (c) 전 및/또는 (b) 및 (c) 후에 환자로부터의 샘플에서 가용성 TNF 수용체의 수준 또는 양을 측정하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
[0111] 특정 구현예에서, 제1 리간드는 sTNF-R1 또는 sTNF-R2에 대해 더 높은 포획 효율을 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 리간드는 sTNF-R1 또는 sTNF-R에 대해 더 높은 포획 효율을 갖는다. 특정 구현예에서, 가용성 TNF 수용체에 대한 제1 리간드의 포획 효율은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%이다. 특정 구현예에서, 가용성 TNF 수용체에 대한 제2 리간드의 포획 효율은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%이다.
[0112] 요약하면, 변형된 TNF는 천연 TNF와 비교하여 sTNF-R2에 대해 증가된 친화성을 나타낸다. 또한, 컬럼에 천연 NTF 및 변형된 TNF 둘 모두의 포함은 sTNF-R1 및 sTNF-R2 둘 모두에 대한 효과적인 제거 수준을 나타낸다.
[0113] 표제 및 소제목이 있는 경우, 이는 단지 편의상 사용되며 본 발명을 제한하지 않는다.
[0114] 본원에 인용된 모든 출원, 간행물, 특허 및 다른 참고문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체내용이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
[0115] 본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 특징(예를 들어, 리간드(예를 들어, 고유 또는 변형된 TNF)), 컬럼, 기재, 구획은 동등하거나 유사한 특징의 속의 예이다.
[0116] 본원에서 사용되는 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 이러한 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예시하기 위해, 약 1 x 10-6 - 1 x 10-9, 1 x 10-6 - 1 x 10-8, 1 x 10-6 - 1 x 10-7, 1 x 10-7 - 1 x 10-9, 1 x 10-7 - 1 x 10-8, 또는 1 x 10-8 - 1 x 10-9M (mol/리터)의 범위 내의 KD에 대한 언급은 2 x 10-6 - 1 x 10-9, 2 x 10-6 - 1 x 10-8, 2 x 10-6 - 1 x 10-7, 2 x 10-7 - 1 x 10-9, 2 x 10-7 - 1 x 10-8, 2 x 10-8 - 1 x 10-9M (mol/리터)의 범위를 포함하고, 3 x 10-6 - 1 x 10-9, 3 x 10-6 - 1 x 10-8, 3 x 10-6 - 1 x 10-7, 3 x 10-7 - 1 x 10-9, 3 x 10-7 - 1 x 10-8, 3 x 10-8 - 1 x 10-9M (mol/리터)의 범위를 포함하고, 4 x 10-6 - 1 x 10-9, 4 x 10-6 - 1 x 10-8, 4 x 10-6 - 1 x 10-7, 4 x 10-7 - 1 x 10-9, 4 x 10-7 - 1 x 10-8, 4 x 10-8 - 1 x 10-9M (mol/리터)의 범위를 포함하고, 5 x 10-6 - 1 x 10-9, 5 x 10-6 - 1 x 10-8, 5 x 10-6 - 1 x 10-7, 5 x 10-7 - 1 x 10-9, 5 x 10-7 - 1 x 10-8, 5 x 10-8 - 1 x 10-9M (mol/리터)의 범위를 포함하고, 6 x 10-6 - 1 x 10-9, 6 x 10-6 - 1 x 10-8, 6 x 10-6 - 1 x 10-7, 6 x 10-7 - 1 x 10-9, 6 x 10-7 - 1 x 10-8, 6 x 10-8 - 1 x 10-9M (mol/리터)의 범위를 포함하고, 기타 등등이다.
[0117] 보다 많은(큰, 적어도) 또는 작은 정수에 대한 언급은 각각 참조 수보다 크거나 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 100 미만에 대한 언급은 숫자 일(1)까지 줄곧 99, 98, 97 등을 포함하고; 10 미만은 숫자 일(1)까지 줄곧 9, 8, 7, 6, 5, 4 등을 포함한다.
[0118] 본원에서 사용되는 모든 수치 값 또는 범위는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 이러한 범위 내의 값 및 정수의 분수 및 이러한 범위 내의 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예시하기 위해, 1 x 10-6 - 1 x 10-9, 1 x 10-6 - 1 x 10-8, 1 x 10-6 - 1 x 10-7, 1 x 10-7 - 1 x 10-9, 1 x 10-7 - 1 x 10-8, 및 1 x 10-8 - 1 x 10-9M (mol/리터)와 같은 숫자 범위에 대한 언급은 1.1 x 10-6 - 1 x 10-9, 1.1 x 10-6 - 1 x 10-8, 1.1 x 10-6 - 1 x 10-7, 1.1 x 10-7 - 1 x 10-9, 1.1 x 10-7 - 1 x 10-8, 및 1.1 x 10-8 - 1 x 10-9M (mol/리터)의 범위를 포함하고, 1 x 10-6 - 0.9 x 10-9, 1 x 10-6 - 0.9 x 10-8, 1 x 10-6 - 0.9 x 10-7, 1 x 10-7 - 0.9 x 10-9, 1 x 10-7 - 0.9 x 10-8, 및 1 x 10-8 - 0.9 x 10-9M (mol/리터)의 범위를 포함하고, 기타 등등이다.
[0119] 일련의 범위에 대한 언급은 계열 내의 상이한 범위의 경계 값을 조합하는 범위를 포함한다. 따라서, 일련의 범위에 대한 언급을 예시하기 위해, 예를 들어, 70% - 80%, 70% - 85%, 80% - 90%, 90% - 95% 및 95% - 98%는, 예를 들어, 70% - 90%, 70% - 95%, 80% - 85%, 80% - 95%, 85% - 90%, 85% - 95% 및 90% - 98%를 포함한다.
[0120] 단수의 요소에 대한 언급은 특별히 언급되지 않는 한 "하나 및 단지 하나"를 의미하는 것이 아니라 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다. 관사 "a" 및 "an"의 사용은 "적어도 하나"의 어구와 동등한 것으로 해석되어야 한다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "세트" 및 "일부"는 하나 이상을 지칭한다.
[0121] 본 발명의 개시에서 사용되는 "상단", "하단", "상부", "하부", "좌측", "우측", "전면", "후면" 등과 같은 용어는 일반적인 중력 기준계가 아니라 임의의 기준계를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상단 표면, 하단 표면, 전면 표면, 및 후면 표면은 중력 기준계에서 상향, 하향, 대각선, 또는 수평으로 연장될 수 있다.
[0122] 또한, 본원에 개시된 어떠한 것도 이러한 개시가 청구범위에 명시적으로 인용되는지 여부에 관계없이 대중에게 헌정되는 것으로 의도되지 않는다. "양태"와 같은 어구는 그러한 양태가 본 발명의 기술에 필수적이거나 그러한 양태가 본 발명의 기술의 모든 구성에 적용된다는 것을 의미하지 않는다. 양태에 관한 개시는 모든 구성, 또는 하나 이상의 구성에 적용될 수 있다. 양태와 같은 어구는 하나 이상의 양태를 지칭할 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다. "구현예"와 같은 어구는 그러한 구현예가 본 발명의 기술에 필수적이거나 그러한 구현예가 본 발명의 기술의 모든 구성에 적용된다는 것을 의미하지 않는다. 구현예와 관련된 개시는 모든 구현예, 또는 하나 이상의 구현예에 적용될 수 있다. 구현예와 같은 어구는 하나 이상의 구현예를 지칭할 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다.
[0123] 용어 "예시적인"은 본원에서 "예 또는 예시로서 제공되는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "예시적인" 것으로 설명된 임의의 양태 또는 설계는 반드시 다른 양태 또는 설계에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 해석되어서는 안 된다.
[0124] 당업자에게 공지되어 있거나 나중에 공지되게 되는 본 발명의 개시 전체에 걸쳐 설명된 다양한 양태의 요소에 대한 모든 구조적 및 기능적 등가물은 명백히 참조로서 본원에 포함되며, 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 어떠한 청구항 요소도 이러한 요소가 "~을 위한 수단"이라는 어구를 사용하여 명백히 언급되거나, 방법 청구항의 경우, 이러한 요소가 "~을 위한 단계"라는 어구를 사용하여 언급되지 않는 한, 35 U.S.C. §112, 여섯 번째 단락의 조항에 따라 해석되지 않아야 한다. 또한, 용어 "포함하다", "갖다" 등이 설명 또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어는 "포함하다"가 청구범위에서 과도기적 용어로서 사용되는 경우에 해석되는 것과 같이 "포함하다"라는 용어와 유사한 방식으로 포함하는 것으로 의도된다.
[0125] 본 발명의 개시의 구현예가 상세히 설명되고 예시되었지만, 이는 단지 예시 및 예를 위한 것이며 제한의 방식으로 취해져서는 안 되며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 조건에 의해서만 제한되는 것으로 명확하게 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Immunicom, Inc.
<120> MODIFIED TNF AS A CAPTURE LIGAND
<130> 022947-0566243
<150> US63/211,709
<151> 2021-06-17
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic Construct
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515 520
Claims (44)
- 구획;
구획에 커플링되고 체액을 수용하도록 구성된 입구;
구획 내에 배치된 기재; 및
기재에 커플링되고, 천연 종양 괴사 인자(TNF) 서열의 일부를 포함하는 참조 서열 내에 아미노산 치환을 포함하는 변형된 서열을 포함하는 포획 리간드를 포함하는,
체액으로부터 가용성 종양 괴사 인자 수용체 2(sTNF-R2)를 제거하기 위한 컬럼으로서,
상기 변형된 서열이 sTNF-R2에 대한 참조 서열의 친화성보다 큰 sTNF-R2에 대한 친화성을 갖는,
컬럼. - 제1항에 있어서, 변형된 서열이 SEQ1(SEQ ID NO:1)의 부위 105, 221, 222, 및 223으로 구성된 군으로부터 선택된 부위에서 치환된 아미노산을 포함하는 컬럼.
- 제2항에 있어서, 치환되는 아미노산이 아스파르트산(D), 글리신(G), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택되는 컬럼.
- 제3항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열의 부위 221, 222, 및 223 중 하나 이상에서 D의 치환을 포함하는 컬럼.
- 제4항에 있어서, 변형된 서열이 부위 221, 222, 및 223 중 2개 이상에서 D의 치환을 포함하는 컬럼.
- 제5항에 있어서, 변형된 서열이 부위 221, 222, 및 223 모두에서 D의 치환을 포함하는 컬럼.
- 제6항에 있어서, 변형된 서열이 SEQ3(SEQ ID NO:3)을 포함하는 컬럼.
- 제1항에 있어서, 포획 리간드가 적어도 2개의 변형된 서열을 포함하는 컬럼.
- 제8항에 있어서, 포획 리간드가 변형된 서열의 삼량체를 포함하는 컬럼.
- 제9항에 있어서, 포획 리간드가 SEQ11(SEQ ID NO:5)을 포함하는 컬럼.
- 제8항에 있어서, 포획 리간드가 적어도 2개의 변형된 서열 사이에 링커를 포함하는 컬럼.
- 제8항에 있어서, 포획 리간드가 링커를 포함하지 않는 컬럼.
- 제1항에 있어서, 포획 리간드가 참조 서열을 추가로 포함하는 컬럼.
- 제13항에 있어서, 포획 리간드가 변형된 서열의 제1 삼량체 및 참조 서열의 제2 삼량체를 포함하고, 제1 및 제2 삼량체 각각이 기재에 별도로 커플링되는, 컬럼.
- 제13항에 있어서, 포획 리간드가 변형된 서열 중 적어도 하나 및 참조 서열 중 적어도 하나를 포함하는 삼량체를 포함하는 컬럼.
- 제1항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 컬럼.
- 제16항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열과 98% 이상의 동일성을 갖는 컬럼.
- 제16항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열과 99.9% 이하의 동일성을 갖는 컬럼.
- 제13항에 있어서, 컬럼이 분당 2 컬럼 부피의 유량에서 60분의 연속 작업 후 80% 초과인 sTNF-R2에 대한 포획 효율을 갖는 컬럼.
- 제19항에 있어서, 컬럼이 분당 2 컬럼 부피의 유량에서 60분의 연속 작업 후 90% 초과인 sTNF-R2에 대한 포획 효율을 갖는 컬럼.
- 제1항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열의 KD보다 적어도 10% 작은 KD를 갖는 컬럼.
- 제21항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열의 KD보다 적어도 30% 작은 KD를 갖는 컬럼.
- 천연 종양 괴사 인자(TNF) 서열의 일부를 포함하는 참조 서열 내에 아미노산 치환을 포함하는 변형된 서열을 포함하는 포획 리간드에 커플링된 기재를 함유하는 구획을 통해 체액을 통과시키는 단계를 포함하는, 체액으로부터 가용성 TNF 수용체 2(sTNF-R2)를 제거하기 위한 방법으로서,
상기 변형된 서열이 sTNF-R2에 대한 참조 서열의 친화성보다 큰 sTNF-R2에 대한 친화성을 갖는,
방법. - 제23항에 있어서, 변형된 서열이 SEQ1(SEQ ID NO:1)의 부위 105, 221, 222, 및 223으로 구성된 군으로부터 선택된 부위에서 치환된 아미노산을 포함하는 방법.
- 제24항에 있어서, 치환되는 아미노산이 아스파르트산(D), 글리신(G), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제25항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열의 부위 221, 222, 및 223 중 하나 이상에서 D의 치환을 포함하는 방법.
- 제26항에 있어서, 변형된 서열이 부위 221, 222, 및 223 중 2개 이상에서 D의 치환을 포함하는 방법.
- 제27항에 있어서, 변형된 서열이 부위 221, 222, 및 223 모두에서 D의 치환을 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 변형된 서열이 SEQ3(SEQ ID NO:3)을 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 포획 리간드가 적어도 2개의 변형된 서열을 포함하는 방법.
- 제30항에 있어서, 포획 리간드가 변형된 서열의 삼량체를 포함하는 방법.
- 제31항에 있어서, 포획 리간드가 SEQ11(SEQ ID NO:5)을 포함하는 방법.
- 제30항에 있어서, 포획 리간드가 적어도 2개의 변형된 서열 사이에 링커를 포함하는 방법.
- 제30항에 있어서, 포획 리간드가 링커를 포함하지 않는 방법.
- 제23항에 있어서, 포획 리간드가 참조 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제35항에 있어서, 포획 리간드가 변형된 서열의 제1 삼량체 및 참조 서열의 제2 삼량체를 포함하고, 제1 및 제2 삼량체 각각이 기재에 별도로 커플링되는, 방법.
- 제35항에 있어서, 포획 리간드가 변형된 서열 중 적어도 하나 및 참조 서열 중 적어도 하나를 포함하는 삼량체를 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 방법.
- 제38항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열과 98% 이상의 동일성을 갖는 방법.
- 제38항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열과 99.9% 이하의 동일성을 갖는 방법.
- 제35항에 있어서, 컬럼이 분당 2 컬럼 부피의 유량에서 60분의 연속 작업 후 80% 초과인 sTNF-R2에 대한 포획 효율을 갖는 방법.
- 제41항에 있어서, 컬럼이 분당 2 컬럼 부피의 유량에서 60분의 연속 작업 후 90% 초과인 sTNF-R2에 대한 포획 효율을 갖는 방법.
- 제23항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열의 KD보다 적어도 10% 작은 KD를 갖는 방법.
- 제43항에 있어서, 변형된 서열이 참조 서열의 KD보다 적어도 30% 작은 KD를 갖는 방법.
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