KR20240035368A - 고형암 환자의 화학요법 내성 억제용 약학 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
고형암 환자의 화학요법 내성 억제용 약학 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고형암(예컨대, 근침윤성 방광암(MIBC))의 선행화학요법(NAC)으로 투여되는 백금제제(예컨대, 시스플라틴)에 대한 내성을 예방 또는 치료하기 위한 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명은 글루타티온(GSH) 경로(pathway)는 고형암의 화학요법 내성과 연관되어 있음을 확인하여, 화학요법에 대한 내성이 있는 환자에서 글루타티온의 발현 억제를 유도하여 화학요법에 대한 내성을 치료하고, 고형암의 치료 효능을 향상시키는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 고형암 환자의 선행화학요법으로 처리되는 항암제에 대한 내성과 글루타티온 경로 간에 연관이 있음을 확인하고, 글루타티온 억제제를 이용하여 항암 효과가 증진된 약학 조성물을 완성하였다. 본 발명의 약학 조성물을 이용하는 경우, 항암제와 병용 투여 시 항암제에 대한 내성을 억제하거나 이를 예방할 수 있어, 항암제의 효능을 향상시킬 수 있다.
방광암(Bladder cancer, BC)은 발생률과 사망률이 높으며, 2020년에 약 573,278명의 신규 환자가 발생하고 212,536명이 사망하여 전 세계 남성에서 6번째로 흔한 악성 종양으로 평가된다. 이러한 방광암은 상당한 임상적, 병리학적 이질성을 나타내며, 방광벽 침범 정도에 따라 비근육층 침습성 방광암(NMIBC; Ta, 상피내 암종 및 T1) 또는 근침윤성 방광암(MIBC; ≥T2)으로 분류된다. 여기서, NMIBC는 초기 진단 당시 대부분의 방광암 환자(70~80%)를 차지하며, NMIBC는 일반적으로 비공격성 종양이며 경요도 방광종양 절제술(TURBT)과 방광내 화학요법 또는 BCG 백신으로 관리되나, 그러나 MIBC의 재발률과 진행률이 높기 때문에 평생 감시 비용이 많이 든다. 종양 발병률의 25%를 차지하는 MIBC는 빠르게 진행되어 전이성 방광암으로 변할 수 있으며, 대부분의 환자 사망률을 담당하여, 방광암의 사망률을 낮추려면 MIBC의 적절한 관리가 중요하다. 따라서, 방광종양 절제술(TURBT)를 통해 방광암을 진단한 후, 수술 전 시스플라틴 기반 화학요법, 즉 선행화학요법(NAC, neoadjuvant chemotherapy)을 사용한 근치 방광절제술이 현재 MIBC 치료의 표준이다. 선행화학요법은 병리학적 완전 반응률이 30~40%인 일부 환자에게 효과적이며 반응이 없는 환자는 종양학적 이점 없이 약물 독성을 겪을 수 있으며 최종 치료가 지연될 수 있다. 그러나 현재 MIBC 환자의 임상병리학적 특징은 선행화학요법에 대한 반응을 전향적으로 예측하기에는 부적절하다.
따라서 현재 항암제 내성을 억제시키고자 하는 많은 연구가 활발히 진행되고 있으며, 항암제 내성 세포주를 이용한 항암제 내성 연구와 신약 개발이 절실히 필요한 상황이다.
본 발명에서는, 4개의 독립적인 코호트에서 얻은 MIBC 종양의 유전자 발현 프로파일링은 MIBC NAC 반응의 분자 이질성에 대한 생물학적 기초를 밝히고 이러한 GSH 관련 대사 경로의 조정된 상향 조절의 중요성을 확인했다. 기계 학습 기반 종양-기질 분류기를 사용한 MIBC 종양 조직의 면역염색에 대한 디지털화된 분석은 MIBC NAC 반응에 대한 잠재적인 예측 바이오마커로서 GLS1 단백질의 임상적 관련성을 강조했다. 또한, 살아있는 세포 실시간 GSH 모니터링, 시험관 내 세포 배양 및 생체 내 동물 모델 분석을 통합함으로써 GLS1 매개 GSH 역학이 화학 저항성 MIBC를 재감작시키는 잠재적인 새로운 치료 표적임을 입증했다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 선행화학요법으로 투여되는 항암제에 대한 내성을 완화시킬 수 있는 약학 조성물을 제공하고자 함에 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 백금제제 및 글루타티온 억제제를 포함하는 고형암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 글루타티온 억제제를 포함하는, 고형암 환자의 화학요법 내성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 글루타티온 억제제에는 BPTES, BCNU (1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea), BSO(buthionine sulfoximine) 및 CB-839, 에타크린산(ethacrynic acid), EAG(에타크린산(ethacrynic acid) 및 글루코사민(glucosamine)), 에트크라플라틴(Ethacraplatin), NBDHEX, 에자티오스타트(Ezatiostat), TLK117, 파이퍼롱구민(Piperlongumine), RSL3, 에라스틴(Erastin) 및 술파살라진(Sulfasalazine)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서, NBDHEX는 6-[(7-Nitro-2,1,3-Benzoxadiazol-4-Yl)Sulfanyl]Hexan-1-Ol를, TLK117는 L-Gamma-Glutamyl-S-Benzyl-N-[(S)-Carboxy(Phenyl)methyl]-L-Cysteinamide를 의미한다.
본 발명에서, 상기 화학요법 내성은 백금제제(예컨대, 시스플라틴 류)에 대한 내성을 의미할 수 있으며, 상기 백금제제는 선행화학요법으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 고형암은 방광암(Bladder cancer), 대장암(Colon cancer), 위암(Stomach cancer), 폐암(Lung cancer), 폐선암(Lung adenocarcinoma), 유방침습성유관암종(Breast invasive ductal carcinoma), 결장선암(Colon adenocarcinoma), 전립선선암(Prostate adenocarcinoma), 방광요로피암종(Bladder urothelial carcinoma), 폐편평세포암종(Lung squamous cell carcinoma), 피부흑색종(Cutaneous melanoma), 원발부위불명암(Cancer of unknown primary), 췌장도관선암종(Pancreatic adenocarcinoma), 교모세포종(Glioblastoma multiforme), 대장선암(Colorectal adenocarcinoma), 고등급장액성난소암(High grade serous ovarian cancer), 위선암(Stomach adenocarcinoma), 신세포암종(Renal clear cell carcinoma), 식도암(Esophageal adenocarcinoma), 고환암 (Testicular cancer) 및 간내담관암(Intrahepatic cholangiocarcinoma)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 근침윤성 방광암(muscle-invasive bladder cancer, 이하 MIBC라고도 함) 이다.
본 발명은 글루타티온 경로가 고형암 환자의 선행화학요법에 대한 내성과 연관이 있음을 확인하고, 고형암 환자의 선행화학요법에 대한 내성을 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 고형암 환자의 치료에 이용되는 백금제제의 효능을 향상시키기 위한 병용투여제를 제공한다.
도 1은 근침윤성 방광암(MIBC) 환자의 다중 코호트 전사체 및 임상 데이터 분석을 통합하여 머신러닝 기반 종양-기질 분류기를 이용한 면역염색 디지털 분석, 생세포 실시간 세포 모니터링, 체외 세포배양 및 생체 내 동물 모델 실험 절차를 나타내는 모식도이다. 도 1을 참조하면, 본 발명은 수술 전 시스플라틴 기반 신보조 화학요법에 대한 MIBC 반응에 대한 잠재적인 예측 바이오마커로서 그리고 잠재적으로 화학저항성 MIBC를 재감작화하는 새로운 치료 표적으로서 글루타티온 역학의 생물학적 중요성과 임상적 관련성을 확인한다.
도 2a 내지 도 2n은 GSH 대사 바이오마커의 MIBC 세포의 산화환원 항상성 조절을 확인한 결과이다. 도 2a 및 도 2b는 시스플라틴 반응성(Cis_R) 및 무반응성(Cis_NR) T24 인간 MIBC 세포주에서 GSH 대사와 관련된 바이오마커의 실시간 qPCR(도 2a; n = 5) 및 웨스턴 블롯(도 2b) 분석결과이다. 여기서, 분자량(M.W.) 마커 크기(kD)는 왼쪽에 표시되었으며, β-ACTIN은 로딩 컨트롤로 사용되었다. 도 2c는 0.1 mM 디아미드(빨간색 화살표) 노출 후 실시간 라이브 세포 GSH 복구 용량(GRC) 분석의 개요도이다. 각 샘플의 GSH 역학 지수(GI)는 초기 F510/F580 형광 비율(FR 또는 총 GSH의 기준선)과 디아미드 처리 후 기울기(GRC)를 기반으로 정량화되었다. 도 2d 내지 도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따른 FR 플롯(도 2d), Cis_R 및 Cis_NR T24 세포(n = 6)에서 F510 및 F580 형광(도 2e) 및 GSH 지수 정량(도 2f) 이미지이다. 도 2g 및 도 2j는 표시된 세포에서 NADPH/NADP 비율의 정량화(n = 3) 그래프이다. 도 2h 내지 도 2l은 GLS1, GSR 또는 GCLM(H 및 I)에 대한 shRNA를 운반하는 Cis_NR T24 세포에서 FR 플롯(H 및 K), GSH 지수(I 및 L)의 정량화 결과이며, 표시된 농도(n = 3)에서 GLS1(BPTES), GSR(BCNU) 또는 GCLM(BSO)에 특이적인 소분자 억제제(K 및 L)로 처리한 후의 결과이다. 유전자 침묵을 위해 두 개의 독립적인 shRNA(#1 및 #2)가 사용되었다. 도 2m 및 도 2n은 Cis_R 및 Cis_NR T24 세포(n = 5)에서 표시된 GSH 역학 표적 유전자의 프로모터 영역에서 NRF2(도 2n) 모집을 위한 NRF2 발현(도 2m) 또는 ChIP-qPCR 분석에 대한 실시간 qPCR 및 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 정량적 데이터는 Cis_R 또는 대조군(비처리 또는 shEmpty) 세포에 대한 배수 변화로 표시되며 평균 ± SEM으로 표시된다. 본 실험에서는 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, unpaired Student's t-tests (도 2f, 2g, 2m), one-way ANOVA (도 2a, 2i 및 2j), 또는 two-way ANOVA (도 2d, 2h, 2k, 2l 및 도2n) 와 함께 Bonferroni 사후 테스트를 사용하였다.
도 3a 내지 도 3k는 GSH 역학에 따른 인간 MIBC 세포의 줄기(세포) 특성 향상을 확인한 결과이다. 도 3a 내지 도 3d는 종양 구 형성(도 3b; n = 45), 클론 생성(도 3c; n = 4) 및 Matrigel 침입(도 3d; n = 5) 용량을 기반으로 한 Cis_R 및 Cis_NR T24 세포 증식(도 3a; n = 4) 및 줄기(세포) 특성을 확인한 결과이다. 여기서, 종양 구체 형성에 대한 대표적인 이미지는 X40(상단 이미지) 또는 X 100(하단 이미지) 배율(눈금 막대 = 200 μm)로 표시되며, Matrigel 침입 분석은 X100(상단 이미지) 또는 X200(하단 이미지) 배율(스케일 바= 100μm)로 표시된다. 도 3e는 각 shRNA(2개의 독립적인 shRNA, #1 및 #2)를 암호화하는 렌티바이러스로 감염된 후 Cis_NR T24 세포에서 GLS1, GSR 또는 GCLM을 침묵시키기 위한 웨스턴 블롯 분석결과이다. 도 3f 내지 3k는 GLS1, GSR 또는 GCLM의 유전자 녹다운(도 3f 내지 3h) 또는 화학적 억제(도 3i 내지 3k)가 있는 Cis_NR T24 세포에서, 종양 구 형성(3f 및 3i, n = 45), 클론 생성 제한 희석(3g 및 3j, n = 5) 및 Matrigel 침입(3h 및 3k, n = 5) 용량을 평가하는 줄기(Stemness) 기능 분석 결과이다. 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, unpaired Student's t-tests (도 3b, 3c 및 3d), one-way ANOVA (도 3f 내지 3k), 또는 two-way ANOVA (도 3a) 와 함께 Bonferroni 사후 테스트를 사용하였다.
도 4a 내지 도 4i는 GSH 역학에 따른 인간 MIBC 세포의 화학 저항성 조절을 확인한 결과이다. 도 4a 내지 도 4d는 GSH 역학 조절제의 유전자 침묵(도 4a 및 4c) 또는 화학적 억제(도 4d)를 사용하는 Cis_NR T24 세포 및 표시된 유전자를 이소적으로 발현하는 나이브 T24 인간 MIBC 세포(도 4b)에서 표시된 농도의 시스플라틴에 노출된 후 세포 생존율 분석 결과이다(NT, 처리되지 않은 대조군). 도 4e 내지 도 4g는 Annexin-V/PI 염색(좌측 이미지) 및 절단된 카스파제-3 및 폴리-(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)의 면역블롯팅(도 4g) 및 24시간 동안 최적이 아닌 시스플라틴 농도(2μg/mL) 및 표시된 GSH 역학 억제제로 처리된 Cis_NR T24 세포의 유세포 분석(도 4e 및 도 4f)을 기반으로 한 세포 사멸 분석 결과이다. 도 4f는 세포사멸 세포의 정량화(Annexin-V+/PI- 및 -V+/PI+ 모집단의 %) 결과이다. 도 4h 및 도 4i는 젬시타빈(20μM) 및 표시된 GSH 역학 억제제로 처리된 Gem_NR KU-19-19 세포의 세포 생존율(도 4h) 및 세포사멸(도 4i) 분석결과이다 (NT, 처리되지 않은 대조군). 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 본 실험에서는 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, two-way ANOVA (도 4a, 4b, 4c, 4d, 4f 및 도 4h) 와 함께 Bonferroni 사후 테스트를 사용하였다.
도 5a 내지 5f는 GSH 간섭에 따른 시스플라틴 내성 인간 MIBC 세포의 재민감화를 확인한 결과이다. 도 5a는 시스플라틴(1 mg/kg), BPTES(5 mg/kg), BCNU(5 mg/kg) 또는 BSO(2 mg/kg)를 사용한 단독요법, 시스플라틴과 이러한 GSH 역학 억제제를 사용한 병용 요법의 효능을 평가하기 위한 동소이식 BC 이종이식 모델에 대한 실험 개요를 나타낸다. 도 5b 및 도 5c는 중복 실험(복제당 5마리의 마우스)에서 표시된 단일 요법(파란색) 또는 병용 요법(빨간색) 후에 종양이 있는 방광의 대표 이미지(B) 및 무게(C)를 나타낸다. 각 데이터는 각 그룹의 10마리 동물의 평균 ± SEM의 도트 플롯으로 표시된다. 도 5d는 X40(상부 패널, 스케일 바 = 200 μm) 또는 X200(하부 패널, 스케일 바 = 100 μm) 배율로 표시된 이종 이식 그룹의 방광 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지이다. 도 5e 및 도 5f는 GSH 역학(GLS1, GSR 및 GCLM) 또는 줄기 특성(CD44v6 및 KRT14)과 관련된 단백질(녹색)을 검출하기 위한 면역형광 분석(도 5e), 이종 이식 종양에서 GLS1(녹색)과 CD44v6(빨간색) 단백질(도 5f)의 동시발현을 확인한 결과이다. 해당 도면에서, 대표적인 병합 이미지는 X200 배율로 표시되며, 스케일 바 = 100 μm, 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었다. 본 실험에서, Bonferroni 사후 테스트를 통한 양방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행했으며, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 베히클 컨트롤(대조군) 관련하여, #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001이다.
도 6a 내지 도 6c는 시스플라틴 내성 MIBC 세포의 향상된 항산화 메커니즘을 확인한 결과이다. 도 6a는 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFDA)로 라벨링한 후 Cis_R 및 Cis_NR T24 세포의 세포내 ROS 수준 정량화한 결과이다. 도 6b는 Cis_R 및 Cis_NR 세포에서 GST 유전자 하위 집합(subset)의 qPCR 분석 결과이다. 도 6b에서의 발현 수준은 % GAPDH(n = 4)로 표시된다. 도 6c는 Cis_R 및 Cis_NR 세포에서 GST 활동의 정량화(n = 4) 결과이다. 모든 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 7은 시스플라틴과 GSH 파괴물질(disruptor)을 이용한 병용 요법의 생체 내 효능을 확인한 결과로, 도 7에 표시된 농도의 시스플라틴 및 BSO, BCNU 및 BPTES를 포함한 소분자 억제제로 처리된 Cis_NR T24 세포의 세포 생존율 분석한 결과이다. 도 7에서 NT는 비처리 대조군(nontreated control)을 의미한다.
도 2a 내지 도 2n은 GSH 대사 바이오마커의 MIBC 세포의 산화환원 항상성 조절을 확인한 결과이다. 도 2a 및 도 2b는 시스플라틴 반응성(Cis_R) 및 무반응성(Cis_NR) T24 인간 MIBC 세포주에서 GSH 대사와 관련된 바이오마커의 실시간 qPCR(도 2a; n = 5) 및 웨스턴 블롯(도 2b) 분석결과이다. 여기서, 분자량(M.W.) 마커 크기(kD)는 왼쪽에 표시되었으며, β-ACTIN은 로딩 컨트롤로 사용되었다. 도 2c는 0.1 mM 디아미드(빨간색 화살표) 노출 후 실시간 라이브 세포 GSH 복구 용량(GRC) 분석의 개요도이다. 각 샘플의 GSH 역학 지수(GI)는 초기 F510/F580 형광 비율(FR 또는 총 GSH의 기준선)과 디아미드 처리 후 기울기(GRC)를 기반으로 정량화되었다. 도 2d 내지 도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따른 FR 플롯(도 2d), Cis_R 및 Cis_NR T24 세포(n = 6)에서 F510 및 F580 형광(도 2e) 및 GSH 지수 정량(도 2f) 이미지이다. 도 2g 및 도 2j는 표시된 세포에서 NADPH/NADP 비율의 정량화(n = 3) 그래프이다. 도 2h 내지 도 2l은 GLS1, GSR 또는 GCLM(H 및 I)에 대한 shRNA를 운반하는 Cis_NR T24 세포에서 FR 플롯(H 및 K), GSH 지수(I 및 L)의 정량화 결과이며, 표시된 농도(n = 3)에서 GLS1(BPTES), GSR(BCNU) 또는 GCLM(BSO)에 특이적인 소분자 억제제(K 및 L)로 처리한 후의 결과이다. 유전자 침묵을 위해 두 개의 독립적인 shRNA(#1 및 #2)가 사용되었다. 도 2m 및 도 2n은 Cis_R 및 Cis_NR T24 세포(n = 5)에서 표시된 GSH 역학 표적 유전자의 프로모터 영역에서 NRF2(도 2n) 모집을 위한 NRF2 발현(도 2m) 또는 ChIP-qPCR 분석에 대한 실시간 qPCR 및 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 정량적 데이터는 Cis_R 또는 대조군(비처리 또는 shEmpty) 세포에 대한 배수 변화로 표시되며 평균 ± SEM으로 표시된다. 본 실험에서는 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, unpaired Student's t-tests (도 2f, 2g, 2m), one-way ANOVA (도 2a, 2i 및 2j), 또는 two-way ANOVA (도 2d, 2h, 2k, 2l 및 도2n) 와 함께 Bonferroni 사후 테스트를 사용하였다.
도 3a 내지 도 3k는 GSH 역학에 따른 인간 MIBC 세포의 줄기(세포) 특성 향상을 확인한 결과이다. 도 3a 내지 도 3d는 종양 구 형성(도 3b; n = 45), 클론 생성(도 3c; n = 4) 및 Matrigel 침입(도 3d; n = 5) 용량을 기반으로 한 Cis_R 및 Cis_NR T24 세포 증식(도 3a; n = 4) 및 줄기(세포) 특성을 확인한 결과이다. 여기서, 종양 구체 형성에 대한 대표적인 이미지는 X40(상단 이미지) 또는 X 100(하단 이미지) 배율(눈금 막대 = 200 μm)로 표시되며, Matrigel 침입 분석은 X100(상단 이미지) 또는 X200(하단 이미지) 배율(스케일 바= 100μm)로 표시된다. 도 3e는 각 shRNA(2개의 독립적인 shRNA, #1 및 #2)를 암호화하는 렌티바이러스로 감염된 후 Cis_NR T24 세포에서 GLS1, GSR 또는 GCLM을 침묵시키기 위한 웨스턴 블롯 분석결과이다. 도 3f 내지 3k는 GLS1, GSR 또는 GCLM의 유전자 녹다운(도 3f 내지 3h) 또는 화학적 억제(도 3i 내지 3k)가 있는 Cis_NR T24 세포에서, 종양 구 형성(3f 및 3i, n = 45), 클론 생성 제한 희석(3g 및 3j, n = 5) 및 Matrigel 침입(3h 및 3k, n = 5) 용량을 평가하는 줄기(Stemness) 기능 분석 결과이다. 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, unpaired Student's t-tests (도 3b, 3c 및 3d), one-way ANOVA (도 3f 내지 3k), 또는 two-way ANOVA (도 3a) 와 함께 Bonferroni 사후 테스트를 사용하였다.
도 4a 내지 도 4i는 GSH 역학에 따른 인간 MIBC 세포의 화학 저항성 조절을 확인한 결과이다. 도 4a 내지 도 4d는 GSH 역학 조절제의 유전자 침묵(도 4a 및 4c) 또는 화학적 억제(도 4d)를 사용하는 Cis_NR T24 세포 및 표시된 유전자를 이소적으로 발현하는 나이브 T24 인간 MIBC 세포(도 4b)에서 표시된 농도의 시스플라틴에 노출된 후 세포 생존율 분석 결과이다(NT, 처리되지 않은 대조군). 도 4e 내지 도 4g는 Annexin-V/PI 염색(좌측 이미지) 및 절단된 카스파제-3 및 폴리-(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)의 면역블롯팅(도 4g) 및 24시간 동안 최적이 아닌 시스플라틴 농도(2μg/mL) 및 표시된 GSH 역학 억제제로 처리된 Cis_NR T24 세포의 유세포 분석(도 4e 및 도 4f)을 기반으로 한 세포 사멸 분석 결과이다. 도 4f는 세포사멸 세포의 정량화(Annexin-V+/PI- 및 -V+/PI+ 모집단의 %) 결과이다. 도 4h 및 도 4i는 젬시타빈(20μM) 및 표시된 GSH 역학 억제제로 처리된 Gem_NR KU-19-19 세포의 세포 생존율(도 4h) 및 세포사멸(도 4i) 분석결과이다 (NT, 처리되지 않은 대조군). 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 본 실험에서는 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, two-way ANOVA (도 4a, 4b, 4c, 4d, 4f 및 도 4h) 와 함께 Bonferroni 사후 테스트를 사용하였다.
도 5a 내지 5f는 GSH 간섭에 따른 시스플라틴 내성 인간 MIBC 세포의 재민감화를 확인한 결과이다. 도 5a는 시스플라틴(1 mg/kg), BPTES(5 mg/kg), BCNU(5 mg/kg) 또는 BSO(2 mg/kg)를 사용한 단독요법, 시스플라틴과 이러한 GSH 역학 억제제를 사용한 병용 요법의 효능을 평가하기 위한 동소이식 BC 이종이식 모델에 대한 실험 개요를 나타낸다. 도 5b 및 도 5c는 중복 실험(복제당 5마리의 마우스)에서 표시된 단일 요법(파란색) 또는 병용 요법(빨간색) 후에 종양이 있는 방광의 대표 이미지(B) 및 무게(C)를 나타낸다. 각 데이터는 각 그룹의 10마리 동물의 평균 ± SEM의 도트 플롯으로 표시된다. 도 5d는 X40(상부 패널, 스케일 바 = 200 μm) 또는 X200(하부 패널, 스케일 바 = 100 μm) 배율로 표시된 이종 이식 그룹의 방광 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지이다. 도 5e 및 도 5f는 GSH 역학(GLS1, GSR 및 GCLM) 또는 줄기 특성(CD44v6 및 KRT14)과 관련된 단백질(녹색)을 검출하기 위한 면역형광 분석(도 5e), 이종 이식 종양에서 GLS1(녹색)과 CD44v6(빨간색) 단백질(도 5f)의 동시발현을 확인한 결과이다. 해당 도면에서, 대표적인 병합 이미지는 X200 배율로 표시되며, 스케일 바 = 100 μm, 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었다. 본 실험에서, Bonferroni 사후 테스트를 통한 양방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행했으며, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 베히클 컨트롤(대조군) 관련하여, #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001이다.
도 6a 내지 도 6c는 시스플라틴 내성 MIBC 세포의 향상된 항산화 메커니즘을 확인한 결과이다. 도 6a는 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFDA)로 라벨링한 후 Cis_R 및 Cis_NR T24 세포의 세포내 ROS 수준 정량화한 결과이다. 도 6b는 Cis_R 및 Cis_NR 세포에서 GST 유전자 하위 집합(subset)의 qPCR 분석 결과이다. 도 6b에서의 발현 수준은 % GAPDH(n = 4)로 표시된다. 도 6c는 Cis_R 및 Cis_NR 세포에서 GST 활동의 정량화(n = 4) 결과이다. 모든 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 7은 시스플라틴과 GSH 파괴물질(disruptor)을 이용한 병용 요법의 생체 내 효능을 확인한 결과로, 도 7에 표시된 농도의 시스플라틴 및 BSO, BCNU 및 BPTES를 포함한 소분자 억제제로 처리된 Cis_NR T24 세포의 세포 생존율 분석한 결과이다. 도 7에서 NT는 비처리 대조군(nontreated control)을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 발명에서, '선행화학요법(neoadjuvant chemotherapy, 이하 NAC)'는 종양의 수술 전 시행하는 화학요법을 의미한다.
본 발명에서, 'MIBC'는 근침윤성 방광암(muscle-invasive bladder cancer, 이하 MIBC)을 의미한다.
본 발명에서, '글루타티온(glutathione, 이하 GSH)'은 글라싸이온이라고도 하는 생체 내의 산화환원 반응에 중요한 역할을 하는 항산화 물질을 의미한다.
본 발명에서, '경요도 방광종양 절제술(Transurethral resectin of bladder tumor, 이하 TURBT)은 방광암 수술방법 중 개복 없이 요도를 통해 접근하여 방광 내의 종양을 정제하는 방법을 의미한다.
수술 전 백금제제(예컨대, 시스플라틴) 기반의 NAC를 이용한 근치 방광절제술은 MIBC 치료의 표준이다. 그러나 반응률은 여전히 낮고 MIBC 환자와 분자 분류자의 현재 임상병리학적 특징은 NAC 반응을 전향적으로 평가하는 데 효과적이지 않다. 본 발명에서는 실시간 라이브 세포 이미징, 시험관 내 MIBC 세포 모델 및 생체 내 이종이식 MIBC 모델과 함께 TURBT 환자 표본의 유전자 발현 프로파일링 및 디지털화된 IHC 분석을 클러스터링하여 GSH 역학 시그니처가 구별된다는 것을 나타낸다. NAC에 대한 차별적 반응으로 MIBC의 하위 집합을 억제하고 GSH 파괴 물질과의 병용 치료가 MIBC를 백금제제(예컨대, 시스플라틴)에 다시 민감하게 만들 수 있다.
본 발명에 따르면, GSH는 여러 메커니즘을 통해 백금제제(예컨대, 시스플라틴)에 대한 저항성을 조절할 수 있다. 첫째, 많은 시스플라틴 내성 세포가 GSH 및 GCL 하위 단위의 수준을 증가시켰다는 관찰에 기초하여 GSH는 산화환원 조절 항산화 능력으로 기능할 수 있다. 둘째, GSH는 후속 해독을 위해 GST에 의해 생체이물질에 접합될 수 있으며, 이어서 다중약물 내성 관련 단백질-2에 의해 매개되는 시스플라틴 유출을 촉진할 수 있다. 일반적으로 항산화 유전자의 활성화는 NRF2의 통제하에 있으며 NRF2는 여러 유형의 종양에서 구성적으로 활성화되어 세포 보호, 종양의 진행 및 화학 요법 저항성을 조절한다. 이러한 발견과 일치하여 AMC 코호트 환자에서 NRF2 매개 항산화 경로는 NAC 민감군에 비해 NAC 무반응 환자의 종양에서 상당히 풍부했다. NRF2의 발현과 활성은 시스플라틴 내성(Cis_NR) MIBC 세포에서 증가되었으며, 이는 GSH 역학의 실시간 라이브 세포 모니터링을 기반으로 향상된 항산화 능력을 나타냈다.
본 발명에 따르면, Cis_NR T24 세포에서 NRF2는 임상 샘플의 단백질 수준에서 검증된 GLS1, GSR 및 GCLM과 같은 GSH 관련 유전자의 프로모터에 직접 결합하는 것으로 나타났다. 중요하게도, 이러한 GSH 관련 유전자의 녹다운은 이종 이식 동물 모델에서 시험관 내 및 생체 내 모두에서 시스플라틴에 대한 MIBC 화학 민감성을 증가시켜 MIBC의 화학 요법 반응을 정의하는 데 NRF2 매개 GSH 역학의 중요한 역할을 지원한다. 산화환원 균형을 유지하기 위해 포도당과 글루타민 유래 탄소 및 NAD(P)H/NAD(P)와 같은 보조 인자의 흐름을 항산화 생산으로 전환할 수 있다. 글루타민 대사의 첫 번째 단계에서 GLS1은 글루타민을 글루타메이트로 전환하며, 글루타민분해로 알려진 이 대사 과정은 여러 메커니즘을 통해 종양 세포의 산화환원 상태를 유지한다. 글루타민의 분해는 GSH 생합성에서 직접적인 역할을 하며 글루타메이트를 제공한다. 수송체 단백질 xCT/SLC7A11을 통한 세포내 글루타메이트 교환은 시스틴 흡수를 중재하며 이는 GSH 생합성을 위한 기질 이용가능성에 영향을 미친다. 또한, 글루타민 대사는 말산 조절을 통해 NADPH 생산을 지원함으로써 환원된 형태의 GSH 유지에 기여한다. 이러한 맥락에서 글루타민 고갈 또는 GLS1 녹다운은 ROS 수준을 증가시키고 광범위한 종양 세포에서 세포 스트레스를 촉진할 수 있다.
따라서 GLS1 억제제는 ROS 수준을 증가시켜 세포 사멸과 화학 요법 저항성 암세포의 재감작을 초래한다. 본 발명에서 GLS1 단백질 상향 조절은 AMC 발견 및 검증 코호트 모두에서 NAC에 대한 저항성과 유의하게 연관되어 있으며, 이는 GLS1 매개 글루타민 대사가 MIBC의 NAC 반응에 유의미한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 기능적 중요성은 GLS1의 유전적 또는 화학적 파괴가 Cis_NR BC 세포의 GSH 역학을 손상시켜 생체 내 이종 이식 MIBC 모델에서 시스플라틴 화학 요법의 효능을 향상시킨다는 본 발명에 의해 더욱 뒷받침된다.
본 발명은 전사체 및 디지털화된 IHC 프로파일링을 갖춘 4개의 독립적인 코호트의 임상 MIBC 샘플에 대한 다중 플랫폼 분석을 활용하여 NAC 반응 및 저항성 MIBC의 GSH 역학 프로파일에 대한 통찰력을 제공한다. 본 발명은 MIBC의 맥락에서 GSH 역학에 대한 예측 및 치료 잠재력을 확인하고 임상 옵션으로 종양 하위 유형을 구별하기 위한 프레임워크를 확립했다. GLS1을 포함한 GSH 역학 시스템의 구성요소는 MIBC의 수술 전 화학요법(선행 화학요법)에 대한 반응을 정의하는 관련 매개변수임을 제공하며, 이 조절 메커니즘은 MIBC 환자의 임상 관리의 정확성과 효능을 향상시키기 위한 새로운 치료 전략을 제시한다.
본 발명은 항암제 및 글루타티온 억제제를 포함하는 고형암 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 글루타티온 억제제는 항암제와 병용투여되어, 항암제의 내성을 억제하는 등 항암제의 효능을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 '항암제'는 암세포의 증식을 억제하기 위하여 사용하는 화학요법 치료제를 의미하며, 바람직하게는 선행화학요법으로 투여되는 치료제가 이에 해당하고, 가장 바람직하게는 백금제제를 의미한다. 본 발명에서, 상기 백금제제에는 헵타플라틴, 네다플라틴, 보플라틴 등 포함되며, 바람직하게는 시스플라틴을 의미한다.
본 발명에서, 상기 고형암은 방광암(Bladder cancer), 대장암(Colon cancer), 위암(Stomach cancer), 폐암(Lung cancer), 폐선암(Lung adenocarcinoma), 유방침습성유관암종(Breast invasive ductal carcinoma), 결장선암(Colon adenocarcinoma), 전립선선암(Prostate adenocarcinoma), 방광요로피암종(Bladder urothelial carcinoma), 폐편평세포암종(Lung squamous cell carcinoma), 피부흑색종(Cutaneous melanoma), 원발부위불명암(Cancer of unknown primary), 췌장도관선암종(Pancreatic adenocarcinoma), 교모세포종(Glioblastoma multiforme), 대장선암(Colorectal adenocarcinoma), 고등급장액성난소암(High grade serous ovarian cancer), 위선암(Stomach adenocarcinoma), 신세포암종(Renal clear cell carcinoma), 식도암(Esophageal adenocarcinoma), 고환암 (Testicular cancer) 및 간내담관암(Intrahepatic cholangiocarcinoma)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 근침윤성 방광암이다.
본 발명에서, 상기 글루타티온 억제제는 글루타티온의 합성 또는 활성을 억제하는 제제를 의미하며, 바람직하게는 BPTES, BCNU (1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea), BSO(buthionine sulfoximine) 및 CB-839, 에타크린산(ethacrynic acid), EAG(에타크린산(ethacrynic acid) 및 글루코사민(glucosamine)), 에트크라플라틴(Ethacraplatin), NBDHEX, 에자티오스타트(Ezatiostat), TLK117, 파이퍼롱구민(Piperlongumine), RSL3, 에라스틴(Erastin) 및 술파살라진(Sulfasalazine)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 글루타티온 경로(글루타티온 합성)을 억제할 수 있는 물질이면, 제한없이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 글루타티온 억제제를 포함하는, 고형암 환자의 화학요법 내성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있으며, 상기 담체에는 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염, 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카 르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지가 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장 관, 피하, 설하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 긴장성 조정제, 방부제, 증점제 또는 점도 개질제 등의 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔 또는 분말의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 증상의 경중도, 환자의 체중, 연령, 성, 투여 방식 및 투여시간 등 과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에서 '환자'는 통상 인간을 포함할 뿐 아니라 다른 동물, 예를 들어 다른 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등을 포함할 수 있다. 본 발명의'환자'는 고형암으로 판정되거나, 의심되는 인간을 제외한 대상을 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실험방법
1-1. 세포 배양(Cell culture)
차등 시스플라틴 반응(Cis_R) 및 무반응(Cis_NR) 행동을 보이는 인간 T24 MIBC 세포 및 그 파생물(derivative)은 10% 열-불활성화 FBS(Hyclone, Pittsburgh, PA, USA) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Cellgro, Pittsburgh, PA, USA)이 보충된 McCoy's 5a Medium Modified에서 유지되었다. 젬시타빈 무반응(Gem_NR) 및 반응(Gem_R) KU19-19 세포를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 Medium Modified(Hyclone)에서 유지했다. 인간 BC 세포주 5637, HT1197, HT1376 및 RT4는 이전에 보고된 대로 유지되었다. 세포는 시스플라틴(Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA), 젬시타빈(Sigma-Aldrich) 또는 BPTES(비스-2-(5-페닐아세트아미도-1,3,4-티아디아졸-2-일)에틸 설파이드; Sigma-Aldrich), BCNU(Carmustine; Sigma-Aldrich), BSO(부티오닌 설폭시민; Sigma-Aldrich) 및 CB-839(Sigma-Aldrich)를 하기 표시된 농도에서 24시간 동안 처리했다. 세포 실험에 사용된 각 백금제제 및 글루타티온 억제제의 농도는 시스플라틴(1, 2, 4μg/mL), 젬시타빈(20μM), BPTES(10μM), BCNU(5μM), BSO(50μM), CB-839(10μM)이다.
1-2. 동소 이종이식(Orthotopic xenograft) MIBC 동물 모델
본 연구의 모든 동물 실험은 울산대학교 의과대학 동물실험연구위원회의 지침 및 규정(IACUC-2021-12-172)에 따라 승인되고 수행되었다. 8주령 수컷 NOD/ShiLtJ-Prkdc em1AMC Il2rg em1AMC (NSGA) 마우스는 JA BIO(대한민국 경기도 수원시)에서 구입하였다. AMC 실험동물 시설에서 1주일 동안 적응한 후, 이전에 보고된 바와 같이, 500μm 주사기와 26-게이지의 바늘을 사용하여 방광의 전벽과 돔의 외층에 직접 주사하여 마우스에 시스플라틴 내성 인간 T24 MIBC 세포(Cis_NR T24)(100μL 중 1.0 x 106개 세포)를 처리했다. Cis_NR T24 세포를 정위 이식한 지 2주 후, 마우스에 BPTES(5mg/kg), BCNU(5mg/kg), BSO(2mg/kg) 또는 CB-839(20mg/kg)를 포함한 GSH 억제제 단독 또는 시스플라틴(1mg/kg) 및 각 GSH억제제와의 조합으로, 매일 주입되는 BSO 및 CB-839를 제외하고 3일 간격으로 10회 주입 주기를 통해 복강 내 주사하였다. BC 세포의 초기 투여 후 42일 동안 마우스 및 주사 부위를 3일마다 모니터링하였다. 실험 종료점에서 종양 크기를 측정하고 조직학적 검사 또는 면역형광 염색을 수행하기 위해 종양을 절제했다. 마우스를 치료군(n=10/군)에 무작위로 배정하였고, 세포 이식, 치료, 평가 및 일일 검사의 순서를 무작위로 배정하였다. 종양 크기 측정 및 조직학적 평가에 참여한 연구자들은 치료군에 대해 알 수 없도록 하였다.
1-3. 실시간 라이브 셀 이미징을 통한 GSH 복구 용량(GRC) 분석
개별적으로 살아있는 세포의 GSH 변화에 대한 실시간 모니터링은 이전에 설명한대로 평가되었다. 이러한 GRC 분석은 다양한 배양 조건에서 인간 MIBC 세포의 GSH 역학의 질적 및 정량적 측면에 대한 비파괴적이고 통합된 이미지 기반의 높은 처리량의 분석을 허용한다. 본 발명에서, GRC 분석은 GSH에 대한 가역적 화학 프로브인 FreSHtracer(Fluorescent real-time thiol tracer; Cell2in, Inc., Seoul, Republic of Korea)의 고유한 특성을 기반으로 하였다. GSH와 반응하면 FreSHtracer는 520nm에서 430nm까지 자외선-가시선 흡수의 λmax에서 스펙트럼 이동을 나타내며, 그 결과 580nm(F580, λex 520nm)에서 형광 방출 강도가 감소하고 510nm에서 형광 강도가 증가한다(F510, λex 430nm). 따라서, 본 실시예에서는 FreSHtracer의 형광 비율(FR)을 결정하기 위해 각각 430 및 520 nm에서 여기시킨 후, 510 및 580 nm에서 형광 방출을 측정했다. 전체 실험 기간 동안의 이러한 형광 신호는 sCMOS 카메라(Cell2in, Seoul, Korea)를 갖춘 자동 고함량 라이브 세포 이미징 시스템인 FreSHcell Q를 사용하여 X200 또는 X400 배율로 라이브 세포에서 제조업체의 지침에 따라 실시간으로 기록되었다. 형광 이미지는 NIS-Elements AR 소프트웨어(Nikon, Minato-ku, Tokyo, Japan)를 사용하여 분석되었다. 각 형광 이미지는 롤링 볼 프로세스를 통해 세포 분할을 위해 재구성되어 이미지 배경 강도를 수정한 다음 음영 보정을 수행하여 이미지의 조명 불균일성을 수정했다. 이러한 이미지에서 세포는 배경과 구별되고, NIS-Elements AR 소프트웨어의 인공 지능 모듈을 기반으로 분할되었다. 결과를 분석하여 각 플롯의 GI, 관련 초기 FR(기준 총 GSH의 경우) 및 디아미드 처리 후의 기울기(GRC의 경우)를 계산했으며 이는 소스 데이터 세트에 표시된다.
1-4. NADPH/NADP 정량화
NADPH/NADP+ 비율은 제조업체의 지침에 따라 NADP/NADPH Quantitation Colorimetric Kit(K347-100, Biovision Incorporated, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 결정하였다. 4×106개의 세포를 트립신 처리하고 얼음 추출 완충액에 용해시킨 다음 60℃에서 배양하여 NADP 입자를 분해했다. 총 NADP/NADPH 및 NADPH는 NADP 순환 효소 혼합물과 함께 배양하여 측정했다. NADP+와 NADPH는 OD450nm에서 검출되었으며, 전체 NADP에 대한 NADPH의 비율(NADPH + NADP+)로 표시되었다.
1-5. 세포내 ROS 측정
세포내 ROS 수준은 DCFDA/H2DCFDA - Cellular ROS 분석 키트(ab113851, Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 측정하였다. 세포를 암벽(dark-wall) 96-웰 플레이트에 1×104 cells/well로 시딩하고 밤새 부착되도록 두었다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 어두운 조건에서 37℃에서 30분 동안 10μM의 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFDA)와 함께 배양하고, 키트에서 제공하는 완충액으로 세척하고, 이후 제조업체의 지침에 따라 485nm 여기 및 535nm 방출을 사용하여 마이크로플레이트 판독기(VICTOR X Multilabel Plate Reader, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에서 분석했다. 표지되지 않은 세포를 분석하여 음성 대조군으로 사용했다.
1-6. 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 활성 분석
GST 활성 분석은 Glutathione-S-Transferase 활성 분석 키트(E-BC-K278-S, Elabscience, TX, USA)를 사용하여 수행되었다. 1 Х 105 cells/well을 12-웰 플레이트에 밤새 접종한 후 10μM 시스플라틴으로 24시간 동안 처리했다. 그런 다음, 세포를 미리 냉각된 PBS 300μl로 세척하고 긁어서 분리했다. 세포를 수집하고 총 5분 동안 3초 간격으로 2초 동안 초음파 처리(200W)하여 용해시킨 후, 4℃, 10,000 Xg에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액을 분석 완충액과 혼합하고 20초(A1) 및 320초(A2)에서 흡광도(340 nm)를 측정하여 A2에서 A1을 뺀 값인 ΔA를 계산했다.
1-7. 유전자 발현 분석
표시된 표적 유전자의 전사 수준은 이전에 설명한 대로 정량화하였다. 인간 MIBC 세포주로부터 분리된 총 RNA(50ng)를 Taqman Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 역전사시켰으며, 이후 이전에 설명한 대로 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 역치 주기(Ct)를 결정했다. AMC 코호트 환자의 개별 유전자 발현을 검증하기 위해 LCMD 샘플에서 추출한 RNA(50ng)를 역전사하고 SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2(634411, Takara, Kusatsu, Shiga, Japan)를 사용하여 증폭하였으며, 제조업체의 지침에 따라 증폭된 cDNA 라이브러리를 qPCR 분석에 사용했다. 2-DDCt 방법을 이용하여 표적 유전자의 상대적인 발현 정도를 측정하였으며, 내인성 대조 유전자로는 β2-마이크로글로불린(B2M)을 사용하였다. 본 qPCR 분석에 사용되는 모든 프라이머는 하기 표 1에 나열하였다. (이하 표에서 F는 forward (포워드 프라이머)를, R은 reverse (리버스 프라이머)를 의미한다.)
| 프라이머 명칭 | Sequence (5'-3') | 서열번호 |
| Human ANPEP_F | CGGGCCACGGCGATT | 1 |
| Human ANPEP_R | GGAGTGGGTAGGGTGTGTCATAA | 2 |
| Human BDNF_F | CTACGAGACCAAGTGCAATCCC | 3 |
| Human BDNF_R | AATCGCCAGCCAATTCTCTTT | 4 |
| Human BICDL1_F | AGCTGCTCACAACCGATTCA | 5 |
| Human BICDL1_R | GTACATTCTTGCCGCGCATC | 6 |
| Human B2MG_F | GAGGGCTGGCAACTTAGAGG | 7 |
| Human B2MG_R | ACAAGCTTTGAGTGCAAGAGA | 8 |
| Human CBS_F | CCCCCTGGCTCACTACGA | 9 |
| Human CBS_R | CACTGAAGCCACCAGCATGT | 10 |
| Human CD11c_F | CCGACCATATCTGCCAGGAC | 11 |
| Human CD11c_R | GCCCTTCAGGGTGAAATCCA | 12 |
| Human CD247_F | GCCAGAACCAGCTCTATAACGA | 13 |
| Human CD247_R | GGCCACGTCTCTTGTCCAA | 14 |
| Human CD44_F | CTGCCGCTTTGCAGGTGTA | 15 |
| Human CD44_R | CATTGTGGGCAAGGTGCTATT | 16 |
| Human CDK1_F | AAACTACAGGTCAAGTGGTAGCC | 17 |
| Human CDK1_R | TCCTGCATAAGCACATCCTGA | 18 |
| Human CK14_F | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | 19 |
| Human CK14_R | GATGACTGCGATCCAGAGGA | 20 |
| Human CK20_F | GGACGACACCCAGCGTTTAT | 21 |
| Human CK20_R | CGCTCCCATAGTTCACCGTG | 22 |
| Human CK5_F | CCAAGGTTGATGCACTGATGG | 23 |
| Human CK5_R | TGTCAGAGACATGCGTCTGC | 24 |
| Human CTNNB1_F | CATCTACACAGTTTGATGCTGCT | 25 |
| Human CTNNB1_R | GCAGTTTTGTCAGTTCAGGGA | 26 |
| Human EMX1_F | CACGAAGCAGGCCAATGG | 27 |
| Human EMX1_R | CTCTGCCCTCGTGGGTTTGT | 28 |
| Human EOGT_F | GTGAAATTGGAGGGCACTGTAAA | 29 |
| Human EOGT_R | CCATGACTGCAGAGGGCTTT | 30 |
| Human FOXA1_F | GCAATACTCGCCTTACGGCT | 31 |
| Human FOXA1_R | TACACACCTTGGTAGTACGCC | 32 |
| Human FZD9_F | TGCGAGAACCCCGAGAAGT | 33 |
| Human FZD9_R | GGGACCAGAACACCTCGAC | 34 |
| Human GAD2_F | ATTGGGAATTGGCAGACCAAC | 35 |
| Human GAD2_R | TTGAAGTATCTAGGATGCCCTGTG | 36 |
| Human GATA3_F | GCCCCTCATTAAGCCCAAG | 37 |
| Human GATA3_R | TTGTGGTGGTCTGACAGTTCG | 38 |
| Human GCLC_F | GGAGGAAACCAAGCGCCAT | 39 |
| Human GCLC_R | CTTGACGGCGTGGTAGATGT | 40 |
| Human GCLM_F | TGTCTTGGAATGCACTGTATCTC | 41 |
| Human GCLM_R | CCCAGTAAGGCTGTAAATGCTC | 42 |
| Human GCST_F | TGGGAATGACATTGATGAACACA | 43 |
| Human GCST_R | CAGGGAAGTCCATAGCAGCTC | 44 |
| Human GGT7_F | CTACAGTACAGCCAGGCAGG | 45 |
| Human GGT7_R | GAACTGGAAGACAAGGCCCA | 46 |
| Human GLS_F | GCATTCCTGTGGCATGTATGACTT | 47 |
| Human GLS_R | CCCCCAGCAACTCCAGATTT | 48 |
| Human GPX1_F | CCAGTTTGGGCATCAGGAGA | 49 |
| Human GPX1_R | AGCATGAAGTTGGGCTCGAA | 50 |
| Human GPX2_F | GACTTCACCCAGCTCAACGA | 51 |
| Human GPX2_R | ATGCTCGTTCTGCCCATTCA | 52 |
| Human GPX4_F | CAGTGAGGCAAGACCGAAGT | 53 |
| Human GPX4_R | CGGTGTCCAAACTTGGTGAAG | 54 |
| Human GPX7_F | CCCACCACTTTAACGTGCTC | 55 |
| Human GPX7_R | GGCAAAGCTCTCAATCTCCTT | 56 |
| Human GSR_F | TTCCAGAATACCAACGTCAAAGG | 57 |
| Human GSR_R | GTTTTCGGCCAGCAGCTATTG | 58 |
| Human GSTA4_F | CCGGATGGAGTCCGTGAGAT | 59 |
| Human GSTA4_R | GGGCACTTGTTGGAACAGC | 60 |
| Human GSTM1_F | TCTGCCCTACTTGATTGATGGG | 61 |
| Human GSTM1_R | TCCACACGAATCTTCTCCTCT | 62 |
| Human HS3ST6_F | ATCTCCGACTACGCCCAGAC | 63 |
| Human HS3ST6_R | CGTGACGACCCGTTTCAGG | 64 |
| Human ICAM1_F | CGGCTGACGTGTGCAGTAATA | 65 |
| Human ICAM1_R | GGCGCCGGAAAGCTGTA | 66 |
| Human IL15RA_F | CCCAGCTCAAACAACACAGC | 67 |
| Human IL15RA_R | AGGTAGCATGCCAGGAGAGA | 68 |
| Human IL27B_F | ATCCGTTACAAGCGTCAGGG | 69 |
| Human IL27B_R | TCCCCGTAGTCTGTGAGGTC | 70 |
| Human KIFC2_F | CGCCTTTTACTCGTTGCTCA | 71 |
| Human KIFC2_R | CTGTCAACAGTGAGGGGACC | 72 |
| Human KIR3DL1_F | CCAGGTCCCCTGGTGAAATC | 73 |
| Human KIR3DL1_R | CGCTGTTGGCTGTTCTGTTC | 74 |
| Human MITF_F | AGGGAGCTCACAGCGTGTAT | 75 |
| Human MITF_R | AGGTCTTGGCTGCAGTTCTC | 76 |
| Human NRF2_F | TGAGGATTCCTTCAGCAGCAT | 77 |
| Human NRF2_R | GACTGTGGCATCTGAATTTAATGAGT | 78 |
| Human NQO1_F | GGCTAGGTATCATTCAACTCTCCAA | 79 |
| Human NQO1_R | CTTCTCTGAGCAATTCCCTTCTG | 80 |
| Human PLOD2_F | CATGGACACAGGATAATGGCTG | 81 |
| Human PLOD2_R | AGGGGTTGGTTGCTCAATAAAAA | 82 |
| Human PPP2R5A_F | TGCCAATTATGTTTGCCAGTTT | 83 |
| Human PPP2R5A_R | TCCATTAGGGTTTTCAGCACATT | 84 |
| Human PRDX1_F | CATTCCTTTGGTATCAGACCCG | 85 |
| Human PRDX1_R | CCCTGAACGAGATGCCTTCAT | 86 |
| Human PSAT1_F | GGCCAGTTCAGTGCTGTCC | 87 |
| Human PSAT1_R | GCTCCTGTCACCACATAGTCA | 88 |
| Human QARS1_F | CGGCGTCTCTCCTTCCTTGT | 89 |
| Human QARS1_R | TACTCAAGGGCAGCGCTTAGC | 90 |
| Human RPAP1_F | TCCTGGGAGCAGGTTGTTTG | 91 |
| Human RPAP1_R | AGACCTTCAGAAGCCCCAGA | 92 |
| Human RPL9_F | TGCTCACTTCCCCATCAACG | 93 |
| Human RPL9_R | GCTTGCTGAATCAAAGCCG | 94 |
| Human SALL4_F | TGCGGAGTCTGTGGTGTACCTA | 95 |
| Human SALL4_R | GATTCACCGCCACCTTGG | 96 |
| Human SIRT6_F | GCAGTCTTCCAGTGTGGTGT | 97 |
| Human SIRT6_R | GATAGAGCCGTTGATCCGGG | 98 |
| Human SOX2_F | AACCAGCGCATGGACAGTTA | 99 |
| Human SOX2_R | GACTTGACCACCGAACCCAT | 100 |
| Human TFCP2L1_F | GCTCTTCAACGCCATCAAA | 101 |
| Human TFCP2L1_R | CAGGGGCACTCGATTCTG | 102 |
| Human TRAF2_F | GGAGGCATCCACCTACGATG | 103 |
| Human TRAF2_R | GGGAGAAGATGGCGGGTATG | 104 |
| Human TRAF6_F | CTGCTTGATGGCATTACGAGAA | 105 |
| Human TRAF6_R | TGCAGGCTTTGCAGAACCTA | 106 |
| Human GSTA1_F | CCAGCTTCCCTCTGCTGAAG | 107 |
| Human GSTA1_R | GGCTGCCAGGCTGTAGAAAC | 108 |
| Human GSTA2_F | CATTCACCTGGTGGAACTTCTCT | 109 |
| Human GSTA2_R | GGGCAGGTTACTGATTCTGGTT | 110 |
| Human GSTA3_F | GGCCCTGAAAACCAGAATCA | 111 |
| Human GSTA3_R | TCTGCGGGAGGCTTCCTT | 112 |
| Human GSTA4_F | ACAAGTTGCAGGATGGTAACCA | 113 |
| Human GSTA4_R | GCTTCGGGTCTGTACCAACTTC | 114 |
| Human GSTK1_F | GCCCAGGGACTTCTGGAAAA | 115 |
| Human GSTK1_R | AGCCCAAAGGCTCCGTATCT | 116 |
| Human GSTM1_F | GGGACGCTCCTGATTATGACA | 117 |
| Human GSTM1_R | TGTGAGCCCCATCAATCAAG | 118 |
| Human GSTM2_F | CCAGAGCAACGCCATCCT | 119 |
| Human GSTM2_R | CTTCGCGAATCTGCTCCTTT | 120 |
| Human GSTM3_F | CCGTTTTGAGGCTTTGGAGAA | 121 |
| Human GSTM3_R | CCCACTGGGCCATCTTGTT | 122 |
| Human GSTM4_F | CCTCGCCTATGATGTCCTTGA | 123 |
| Human GSTM4_R | CAAAGCGGGAGATGAAGTCCTT | 124 |
| Human GSTP1_F | CCCTGGTGGACATGGTGAAT | 125 |
| Human GSTP1_R | CCCGCCTCATAGTTGGTGTAG | 126 |
| Human GSTT1_F | CGCATCGTGGATCTGATTAAAG | 127 |
| Human GSTT1_R | TTCAAGGCTGGCACCTTCTT | 128 |
| Human GSTT2_F | CGTGGACGAGTGGAGGCTTT | 129 |
| Human GSTT2_R | GCCTGTTCCAGGATGCTCAA | 130 |
1-8. 웨스턴 블롯 분석
프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Roche, Indianapolis, IN)이 보충된 RIPA 용해 완충액(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에서 세포 추출물(30μg)을 제조하고 12% SDS-PAGE 젤에서 분리했다. 표시된 단백질의 발현 수준은 하기 표 2에 나열된 특정 항체를 조사하여 측정하였다.
| 항체명 | 입수처 |
| ANPEP (CD13) | Santa cruz |
| BDNF | Invitrogen |
| BICDL1 (CCDC64) | Invitrogen |
| CBS | Origene |
| CD11c | NOVUS |
| CD247 (CD3-zeta) | Santa cruz |
| CD44v6 | Abcam |
| CDK1 | Abcam |
| CK5/6 | DAKO |
| CK14 | DAKO |
| CK20 | DAKO |
| EMX1 | Santa cruz |
| EOGT | Invitrogen |
| FOXA1 | Santa cruz |
| FZD9 | Invitrogen |
| GAD2 | Santa cruz |
| GATA3 | Cell marque |
| GCLC | Abcam |
| GCLM | Abcam |
| GGT7 | Invitrogen |
| GLS1 | Abcam |
| GPX1 | Abcam |
| GPX2 | Abcam |
| GPX4 | Abcam |
| GSR | Abcam |
| ICAM1 | Invitrogen |
| IL15RA | NSJ Bioreagents |
| IL27B (EBI3) | Invitrogen |
| KIFC2 | NOVUS |
| KIR3DL1 | Invitrogen |
| MITF | Invitrogen |
| Non-phosphorylated β-Catenin | Cell signaling |
| NRF2 | Abcam |
| Phosphorylated NRF2 (p-NRF2) | Abcam |
| PLOD2 | Protein tech |
| PPP2R5A | Santa cruz |
| PRDX1 | Abcam |
| PSAT1 | NOVUS |
| QARS1(GlnRS) | Santa cruz |
| RPAP1 | Invitrogen |
| RPL9 | Santa cruz |
| SALL4 | Biocare |
| SIRT6 | Cell signaling |
| SOX2 | Abcam |
| TFCP2L1-middle | Aviva |
| TRAF2 | Santa cruz |
| TRAF6 | Santa cruz |
| β-Catenin | Santa cruz |
| Alexa488 anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific |
| Alexa488 anti-mouse | Thermo Fisher Scientific |
| Alexa546 anti-mouse | Thermo Fisher Scientific |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology |
| DAPI | Sigma-Aldrich |
1-9. 크로마틴 면역침전(ChIP) 분석
ChIP 분석은 이전에 설명한 바와 같이, 3μg ChIP 등급 항-NRF2 항체(ab62352, Abcam) 또는 토끼 면역글로불린(Ig)G 대조 항체(2729S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 미국)를 사용하는 Magna ChIP G 키트(Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 수행되었다. NRF2 단백질의 농축(Enrichment)은 결합된 앰플리콘 분획과 결합되지 않은 앰플리콘 분획의 비율로 계산되었으며 4개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표시되었다. ChIP 분석에 사용되는 모든 프라이머는 하기 표 3에 나열되어 있다.
| 프라이머 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| Human GLS_qChIP_F | AGAGCCGAGAGAAATTTGACT | 131 |
| Human GLS_qChIP_R | ATTGCCGCGACCGGTTCTCTT | 132 |
| Human GSR_qChIP_F | TCTTTCAAAGCCCCTACCTCTCT | 133 |
| Human GSR_qChIP_R | CATGATTGCCAAGTCACAGTGA | 134 |
| Human GCLM_qChIP_F | TGCATAAGCCTACTGGATCAGAGT | 135 |
| Human GCLM_qChIP_R | TCATGCAGGTCAAAAAGGAAGTAA | 136 |
| Human GCLC_qChIP_F | TGGTGCACTGGCTTCTTCCT | 137 |
| Human GCLC_qChIP_R | CGAGCTAGCGGACGCAAAG | 138 |
| Human PRDX1_qChIP_F | GCCCAACTCAGTCTCCCAAA | 139 |
| Human PRDX1_qChIP_R | TGCGCCCAGTGGTCTTG | 140 |
1-10. RNA 간섭(RNAi) 및 이소성 발현(ectopic expression)
RNAi 매개 녹다운(KD) 또는 관심 유전자의 과발현을 위해, 각 표적 유전자 또는 인간 GLS1 오픈 리딩 프레임(ORF)에 대해 설계된 shRNA를 각각 pLKO.1(Sigma-Aldrich) 또는 pCDH-CMV(Addgene, plasmid #72265, Kazuhiro Oka) 플라스미드에 클로닝했다. 인간 GSR(EX-Z1404-Lv105) 또는 GCLM(EX-M0714-Lv105) ORF 구조물을 암호화하는 pEZ-CMV 렌티바이러스 플라스미드는 GeneCopoeia(Rockville, MD, USA)에서 구입했다. 렌티바이러스(Lentivirus)는 4-플라스미드 형질감염 시스템(Invitrogen)을 사용하여 생산되었으며, 이전에 설명한 대로 Lenti-X Concentrator 키트(Clontech, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 농축되었다. 유전자 발현 및 기능 분석은 렌티바이러스 감염 4일 후에 수행되었다. 각 ORF의 정보와 각 shRNA의 표적 서열은 표 4에 나열되어 있다.
| 프라이머 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| Human GSR shRNA_#1 | GCCCTGGGTTCTAAGACATCA | 141 |
| Human GCLM shRNA_#1 | GCGAGGAGCTTCATGATTGTA | 142 |
| Human GCLM shRNA_#2 | GGAATGCACTGTATCTCATGC | 143 |
| Human GCLC shRNA_#1 | GCGATGAGGTGGAATACATGT | 144 |
| Human GCLC shRNA_#2 | GCTCTTTGCACAATAACTTCA | 145 |
| Human PRDX1 shRNA_#1 | GCACCATTGCTCAGGATTATG | 146 |
| Human PRDX1 shRNA_#2 | GGTCTTAAAGGCTGATGAAGG | 147 |
1-11. 세포 증식 및 세포 사멸 분석
세포 증식 능력은 MTT 분석(Sigma-Aldrich)을 사용하여 결정되었다. FITC Annexin-V 세포사멸 검출 키트 I(556547, BD Biosciences., San Diego, CA, USA)을 사용하여 세포사멸 세포 사멸을 분석했다. FITC 및/또는 요오드화 프로피듐(PI) 표지된 세포 집단을 정량화하고 BD FACSCanto II 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 분석했다.
1-12. 종양 영역 형성, 제한-희석 및 시험관 내 세포 침입 분석
인간 MIBC 세포의 줄기세포 특성(stemness features)은 이전에 설명한 대로 종양 구 형성 및 클론 생성 능력을 평가하고 시험관 내 Matrigel 침입 활성을 사용하여 검사했다.
1-13. 면역세포화학 분석 및 조직학적 검사
면역세포화학을 위해 4% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)로 고정된 인간 MIBC 세포를 NRF2(ab62352, Abcam)에 대한 항체로 염색한 후 Alexa Fluor 488-콘쥬게이트 항-토끼 항체(A11008, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 시각화했다. 염색된 세포는 Zeiss LSM710 공초점 현미경(Carl Zeiss, 뮌헨, 독일)을 사용하여 이미지화하였다.
이종이식 샘플의 조직학적 분석을 위해 방광을 4% 파라포름알데히드에 1일 동안 고정했다. 24시간 동안 30% 수크로스에서 동결보호(cryoprotection)한 후, 각 방광을 저온 유지 장치(Leica, Lussloch, Germany)를 사용하여 20μm 섹션으로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색했다. 면역형광(IF) 염색을 위해, 방광 섹션을 상기 표 2에 나열된 특정 항체로 염색했다. Alexa Fluor 488 결합(A11001 및 A11008) 항-마우스 및 항-토끼 항체 또는 Alexa Fluor 546-콘쥬게이트 항-마우스 항체(A11060)를 2차 항체(Thermo Fisher Scientific)로 사용했다. 핵은 4',6-diamino-2-phenylindole(DAPI; D9542; Sigma-Aldrich)로 대비염색하였다. 염색된 샘플은 도립형광현미경(EVOS® FL Color Imaging System, Life Technologies)을 사용하여 이미지화하였다.
1-14. 정량화 및 통계 분석
본 발명에서 모든 정량적 데이터는 평균 ±평균의 표준 오차(SEM)로 표시된다. 3개 이상의 그룹에 대한 통계적 유의성은 Bonferroni 사후 테스트를 통한 단방향 또는 양방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 결정되었다. 두 그룹 간의 통계적 유의성은 짝을 이루지 않은 Student's t-test를 사용하여 분석되었다. GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) 또는 SPSS 버전 21.0 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행했다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001에 대해 유의성이 가정되었다.
결과
2-1. 라이브 MIBC 셀에서 GSH 역학의 실시간 측정
본 발명자들은 4개의 독립적인 코호트의 MIBC 환자 종양에 대한 전사체 프로파일링을 통해 GSH 관련 대사 반응이 NAC 반응 MIBC 서브타입의 생물학적 특징을 나타낼 수 있고, 면역 반응 경로가 NAC-민감성 MIBC 서브타입의 생물학적 특징을 나타낼 수 있음을 입증했다.
이러한 임상 결과에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위해 우리는 먼저 시스플라틴 반응(Cis_R) 및 무반응(Cis_NR) 행동을 보이는 T24 인간 MIBC 세포주에서 GSH 대사 관련 유전자 발현의 잠재적인 변화를 조사했다. 임상 샘플의 결과와 일치하게, GGT7 및 CBS를 제외한 대부분의 GSH 대사 유전자는 전사체 및 단백질 수준 모두에서 Cis_NR T24 세포에서 상향조절되었다(도 2a 및 2b). 다른 경로와 관련된 바이오마커와 관련하여 Cis_NR T24 세포는 GPX1, β-CATENIN, SIRT6, MITF, TFCP2L1 및 CK14의 강력한 발현을 나타냈지만 단백질 수준에서 PLOD2 및 GATA3의 약한 발현을 나타냈다.
GSH 대사와 관련된 단백질의 발현 수준을 시험관 내에서 측정한 결과, GLS1, GSR 및 GCLM 단백질이, 시스플라틴에 매우 민감한 1197 및 5637 세포주에 비해 시스플라틴에 덜 민감한 HT1376 및 RT4 세포주에서 상향조절되는 것으로 나타났으며, 이는 GSH 대사 경로와 시스플라틴 반응 사이의 연관성을 뒷받침한다.
이어서, GSH 관련 대사 경로의 기능적 관련성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 비파괴적이고 통합적이며 이미지 기반의 높은 처리량 분석을 허용하는 GSH에 대한 가역적 화학 프로브인 FreSHtracer를 사용하여 살아있는 T24 MIBC 세포에서 GSH 역학의 질적 및 정량적 측면을 실시간으로 모니터링했다. GSH 회수 용량(GRC)은 티올(thiol) 특이적 산화제인 100 μM 디아미드에 노출된 후 약 1시간 동안 평가하였다(그림 4C). 유전자 발현 결과(도 2a 및 2b)와 일치하게, Cis_NR T24 세포는 디아미드에 단기 노출 후 초기 F510/F580 형광 비율(FR)(기본 총 GSH 수준의 경우) 및 기울기(GRC의 경우)의 증가를 기반으로 Cis_R 세포보다 더 높은 GSH 역학 지수(GI)를 나타냈다(도 2c 내지 2f). 또한 Cis_NR T24 세포는 NADPH/NADP 비율이 증가한 것으로 나타났으며, 이는 GSSG를 GSH로 전환하는 데 중요하다(도 2g).
2-2. GSH 대사 바이오마커 조절 MIBC 세포 산화환원 항상성
이어서, 본 발명자들은 GSH 생합성(GLS1, GCLM 및 GCLC) 또는 활용(GSR 및 PRDX1)과 관련된 주요 표적 유전자의 역할을 조사하기 위해 고처리량 GRC 분석을 수행하였으며, 이는 NAC 내성 MIBC 환자의 종양에서 변경되었거나 Cis_NR 인간 MIBC 세포주에서 단백질 수준에서 상향 조절되었다(도 2b). 각 유전자를 표적으로 하는 shRNA가 포함된 렌티바이러스에 의한 감염은 Cis_NR T24 세포(도 2h 및 2i) 및 나이브 T24 MIBC 세포에서 디아미드 처리 후 GSH의 기본 수준을 크게 감소시키고 GRC를 손상시켰다. GLS1 매개 대사 경로의 억제가 세포 NADPH/NADP 비율을 유의하게 감소시킨다는 것을 입증한 'Kimmelman 등'의 이전 연구와 일치하여, 본 발명자들은 GLS1을 침묵시키면 Cis_NR T24 세포에서 세포내 NADPH/NADP 비율이 감소하여 MIBC에서 산화환원 항상성 유지에 GLS1의 결정적인 역할을 뒷받침한다는 것을 확인하였다(도 2j).
GRC 분석은 GLS1 (bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) ethyl sulfide; BPTES), GSR (Carmustine; BCNU), 및 GCL (buthionine sulfoximine; BSO), 을 억제하는 특정 작은 화합물의 생물학적 결과를 평가하는 데 사용되었으며, 이러한 선택적 GSH 억제제는 Cis_NR T24 세포에서 GSH 역학을 크게 손상시켰음을 나타낸다(도 2k 및 2l). 더욱이, GLS1, GSR 또는 GCLM의 이소성 발현은 나이브(na
ve) T24 MIBC 세포에서 세포내 GSH 수준과 GRC를 증가시켰다. NAC에 사용되는 또 다른 화학요법제인 젬시타빈에 민감하거나(Gem_R) 내성이 있는(Gem_NR) KU-19-19 방광암종 세포주에서 이러한 GSH 대사 바이오마커에 대한 유사한 역할이 관찰되었다.
이러한 발견의 작동 메커니즘을 결정하기 위해 우리는 AMC 검증 코호트의 NR 종양에서 강력하게 농축된 산화환원 항상성 마스터 조절자 NRF2의 발현과 활성을 조사했다(도 2m 및 2n). NRF2 단백질의 대부분이 핵에 국한되어 NRF2 경로의 활성화를 나타내는 Cis_NR T24 세포에서 전사체와 단백질 NRF2 수준이 모두 증가했다(도 2m). 염색질-면역침전(ChIP) 분석 결과, Cis_NR T24 세포에서 GSH 대사 유전자의 프로모터에 대한 NRF2의 결합이 증가한 것으로 나타났다(도 2n). 따라서, NRF2를 억제하면 GSH 지수 프로파일이 크게 감소했으며, 이는 GSH 역학과 관련된 유전자의 억제와 동시에 나타났다. 일관되게 Cis_NR T24 MIBC 세포에서는 활성 산소종(ROS) 수준이 크게 감소했다(도 6a). GSH는 이후의 해독을 위해 GST에 의해 비생체성분(xenobiotics)과 결합될 수 있으며, 이어서 다중약물 내성 관련 단백질-2에 의해 매개되는 시스플라틴 유출을 촉진할 수 있다. 특히 GST-P1을 포함한 대부분의 GST isoform은 상향 조절되었으며, GST 활성은 Cis_R 세포에 비해 Cis_NR T24 세포에서 더 높았다(도 6b 및 도 6c). 이는 향상된 GSH 역학이 여러 메커니즘에 의해 시스플라틴 저항성을 조절할 수 있음을 나타낸다.
2-3. 인간 MIBC 세포의 증식 및 줄기세포 특성에 대한 GSH 역학의 역할
본 발명자들은 이전에 GSH 역학이 여러 암의 화학 저항성과 관련이 있고 BC의 임상 행동에 중요한 성체 줄기 세포의 증식 및 줄기 세포 특성을 증가시킨다는 것을 확인한 바 있다. GRC 결과(도 2d 내지 도 2f)와 일치하게, Cis_NR T24 세포는 Cis_R 세포(도 3a)보다 빠르게 증식했다. 세포가 클론 생성 밀도에서 낮은 부착 플레이트에 시드된 후 5일 배양 기간 동안 Cis_NR T24 세포는 Cis_R 세포보다 더 높은 종양 구 형성 능력을 나타냈다(도 3b). 또한 제한 희석 및 트랜스웰 챔버 분석을 기반으로 Cis_NR T24 세포의 클론 생성 및 침습적 용량이 각각 증가했다(도 3c 및 3d).
다음으로, 본 발명자들은 인간 MIBC 세포의 줄기 특성에서 NRF2 매개 GSH 관련 바이오마커의 중요성을 조사했다. GLS1, GSR 또는 GCLM이 Cis_NR T24 세포에서 녹다운(KD)되었을 때(도 3E), 종양 구 형성(도 3F)과 클론 생성 용량(도 3g)이 크게 감소하여 MIBC 세포의 줄기 특성에서 이러한 매개체의 중요한 역할을 확인했다. 각 유전자의 침묵으로 인해 침입 능력도 크게 손상되었다(도 3h). 나이브(naive) T24 MIBC 세포에서도 유사한 결과가 얻어졌으며, GCLC 또는 PRDX1의 간섭으로 인해 Cis_NR 및 나이브(naive) T24 MIBC 세포 모두에서 줄기세포 특성이 손상되었다. 유전자 침묵 결과와 일치하게 GSH 억제제(BPTES, BCNU 또는 BSO)를 사용한 치료는 종양 구체 형성 및 클론 생성 및 침습 능력을 기반으로 Cis_NR T24 세포의 줄기 특성을 강력하게 억제했다(도 3i-3k). 이러한 결과는 GLS1, GSR 및 GCLM의 상향 조절에 의해 조절되는 증가된 GSH 역학이 세포 성장, 줄기 특성 및 MIBC 세포의 침습성을 자극한다는 것을 입증한다.
2-4. GSH 파괴(disruption)에 따른 화학 저항성 MIBC 세포의 재민감성 회복
인간 MIBC에서 시스플라틴 기반 수술 전 화학 요법에 대한 반응을 조절하는 이러한 GSH 역학 표적 유전자의 치료 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 Cis_NR T24 세포에서 GLS1, GSR 또는 GCLM을 침묵시키고 고갈된 세포를 다양한 용량의 시스플라틴으로 처리했다. 각 유전자의 침묵은 시스플라틴이 있는 경우 Cis_NR T24 세포의 성장을 크게 감소시켰고, 시스플라틴 처리가 없는 경우 세포 성장을 약간 감소시켰다(도 4a). 또한, GLS1, GSR 또는 GCLM의 이소성 발현은 시스플라틴에 노출된 naive T24 MIBC 세포의 생존 가능성을 증가시켰다(도 4b). GCLC 또는 PRDX1의 침묵은 또한 Cis_NR BC 세포에서 시스플라틴 처리에 대한 민감도를 증가시켰다(도 4c).
이러한 결과와 일치하게, 시스플라틴과 GSH 억제제(BPTES, BCNU 또는 BSO)의 조합은 최적이 아닌 농도(1ug/mL)의 시스플라틴에서 세포 성장을 심각하게 손상시켰지만, GSH 억제제 단독 처리는 세포 성장을 크게 손상시키지 않았다(도 4d). GSH 억제제와 시스플라틴을 병용 처리하면 Cis_NR T24 세포의 성장이 용량 의존적으로 상승적으로 감소했다(도 7). 더욱이, GLS1, GSR 또는 GCLM의 화학적 파괴는 시스플라틴 처리 시 세포사멸을 초래했으며(도 4e 및 도 4f), 이펙터 카스파제-3를 활성화하고 Cis_NR BCs BC세포에서 폴리-(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)의 절단을 유도했으나(도 4g), GSH 조절제나 최적이 아닌 시스플라틴만으로는 카스파제-3 및 PARP의 절단 또는 세포사멸에 영향을 미치지 않았다. 또한, 표적 소분자 GSH 억제제를 사용하여 GSH 역학을 방해하면 젬시타빈(Gemcitabine) 민감도가 증가하고 Gem_NR KU-19-19 세포에서 세포사멸이 활성화되었다(도 4h 및 4i).
즉, 이러한 결과는 GSH 역학을 파괴하는 것이 시스플라틴에 대한 MIBC의 화학 민감성을 향상시키는 잠재적인 새로운 치료 접근법이 될 수 있음을 시사한다.
2-5. GSH 파괴(disruption)에 따른 MIBC에서의 시스플라틴 화학 요법 효능 향상
상기 결과의 생체 내 관련성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 1 X 106 Cis_NR BC 세포가 NOD/ShiLtJ-Prkdcem1AMCIl2rgem1AMC(NSG) 면역결핍 마우스의 방광 외층에 이식된 동소 이종이식 BC 모델에서 각 GSH 조절제(BPTES, BCNU 또는 BSO) 단독 또는 시스플라틴과의 조합에 따른 효과를 조사했다. 2주 후, 이종이식 이식된 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누어, BSO의 일일 주입을 제외하고 i) PBS 비히클, ii) 시스플라틴(1mg/kg) 단독, 및 iii) GSH 억제제(BPTES 5mg/kg, BCNU 5mg/kg 또는 BSO 2mg/kg), 또는 iv) 시스플라틴 + GSH 억제제를 3일 간격으로 10회 복강내 주사하였다(도 5a). 이식 후 6주에 종양 형성을 측정한 결과, 시스플라틴 단독요법군에서 종양 성장이 17.1±3.76% 억제된 것으로 나타났다(도 4b 및 4c). 또한, BPTES(26.3 ± 2.46%), BCNU(28.3 ± 3.82%) 또는 BSO(8.12 ± 3.74%) 단독 처리로 종양 성장이 약간 억제되었다. 대조적으로, 저용량 시스플라틴(1 mg/kg)의 항종양 효과는 각 GSH 억제제와의 병용 치료에 의해 크게 향상되었다. 병용 요법에서 종양 성장 억제는 BSO와 시스플라틴을 함께 치료한 동물에서 가장 컸고(85.03 + 3.02%), BPTES와 시스플라틴을 함께 치료한 동물에서 강력했으며(59.21±5.94%), BCNU와 시스플라틴을 함께 치료한 동물에서 중간 정도로 나타났다 (42.67 ± 2.52%) (도 4c).
조직학적 분석에 따르면 시스플라틴과 GSH 억제제의 병용 치료는 방광의 종양 성장을 유의하게 억제하는 것으로 나타났으며, 비히클, 시스플라틴 단독요법 또는 GSH 억제제 단독요법으로 치료된 동물에서는 억제 효과가 검출되지 않았다(도 5d). 본 발명자들은 이후 GSH 역학과 관련된 유전자의 발현에 대한 시스플라틴과 GSH 억제제 병용 치료의 효과를 조사했다. 면역형광염색 결과, 비히클 치료를 받은 이종 이식 종양은 가짜 그룹(sham group)의 방광 조직에 비해 GLS1, GSR 및 GCLM 단백질의 수준이 더 높았으며, 시스플라틴 단독은 비히클 치료 그룹에 비해 이종이식 종양에서 이러한 단백질을 추가로 증가시켰다(도 5e). 그러나 이러한 유도는 시스플라틴과 GSH 억제제의 병용 치료에 의해 크게 억제되었다. 시험 관내 세포 모델 분석 결과 (도 4)와 일치하여 GSH 억제제와 시스플라틴을 사용한 공동 처리는 CD44v6 및 KRT14를 포함한 BC 줄기 세포 마커의 발현을 효율적으로 억제했다 (도 5e). 구체적으로, 높은 수준의 CD44v6 단백질을 가진 일부 종양 세포는 시스플라틴 단독 또는 비히클로 치료한 동물의 이종이식 종양에서 GLS1 단백질을 공동발현했으며, CD44v6+/GLS1+ 공동발현 세포의 빈도는 시스플라틴 + BPTES 및 시스플라틴 + BSO를 모두 사용한 병용 처리에 의해 크게 감소했다(도 7f).
본 전임상 연구의 임상적 타당성을 극대화하기 위해 본 발명자들은 현재 여러 종양의 치료를 위해 임상 시험이 진행 중인 추가 GLS1 억제제인 CB-839를 사용했다. Cis_NR T24 세포를 CB-839로 처리하면 세포 내 GSH 수준과 GRC가 용량 의존적으로 감소했다. Cis_NR T24 세포와 CB-839 및 시스플라틴의 병용 치료는 세포 성장을 손상시켰고, 세포사멸 세포 사멸을 활성화했다. 시험관 내 연구 결과와 일치하게, CB-839는 Cis_NR BC 세포를 사용하는 동소 이종이식 BC 모델에서 시스플라틴의 항종양 효과를 크게 증가시켰다.
종합적으로, 이러한 결과는 GSH 역학이 MIBC에 사용 가능한 화학요법 약물에 대한 반응을 결정하는 데 중요한 역할을 하며 GSH 억제제 화합물과의 병용 치료가 MIBC 환자에서 시스플라틴과 같은 화학요법 약물에 대한 민감도를 잠재적으로 증가시킬 수 있음을 보여준다.
상기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 상기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
Claims (9)
- 백금제제 및 글루타티온 억제제를 포함하는 고형암 치료용 약학 조성물.
- 제1 항에 있어서,
상기 고형암은 근침윤성 방광암인, 고형암 치료용 약학 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 글루타티온 억제제는 BPTES, BCNU (1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea), BSO(buthionine sulfoximine), CB-839, 에타크린산(ethacrynic acid), EAG(에타크린산(ethacrynic acid) 및 글루코사민(glucosamine)), 에트크라플라틴(Ethacraplatin), NBDHEX, 에자티오스타트(Ezatiostat), TLK117, 파이퍼롱구민(Piperlongumine), RSL3, 에라스틴(Erastin) 및 술파살라진(Sulfasalazine)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 화합물인, 고형암 치료용 약학 조성물. - 글루타티온 억제제를 포함하는, 고형암 환자의 화학요법 내성 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제4 항에 있어서,
상기 고형암은 근침윤성 방광암인, 고형암 환자의 화학요법 내성 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4 항에 있어서,
상기 글루타티온 억제제는 BPTES, BCNU (1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea), CB-839, 에타크린산(ethacrynic acid), EAG(에타크린산(ethacrynic acid) 및 글루코사민(glucosamine)), 에트크라플라틴(Ethacraplatin), NBDHEX, 에자티오스타트(Ezatiostat), TLK117, 파이퍼롱구민(Piperlongumine), RSL3, 에라스틴(Erastin) 및 술파살라진(Sulfasalazine)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 화합물인, 고형암 환자의 화학요법 내성 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4 항에 있어서,
상기 화학요법 내성은 백금제제에 대한 내성인, 고형암 환자의 화학요법 내성 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제7 항에 있어서,
상기 백금제제는 시스플라틴인, 고형암 환자의 화학요법 내성 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제7 항에 있어서,
상기 백금제제는 선행화학요법으로 투여되는 것인, 고형암 환자의 화학요법 내성 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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