KR20240032120A - 바이러스 입자를 검정하기 위한 온라인 고유 질량 분광분석 방법 - Google Patents

바이러스 입자를 검정하기 위한 온라인 고유 질량 분광분석 방법 Download PDF

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šœ하이 왕
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

바이러스 입자 샘플에서 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 방법이 개시된다. 구현예에서, 아데노-연관 바이러스의 빈 캡시드, (예를 들어, 이종 핵산 분자를 함유하는) 부분 충진된 캡시드, 및 충진된 캡시드의 상대적 풍부도를 결정하는 방법이 개시된다.

Description

바이러스 입자를 검정하기 위한 온라인 고유 질량 분광분석 방법
본 발명은 온라인 고유 질량 분광분석을 사용하여 충진된 바이러스 캡시드, 부분 충진된 바이러스 캡시드, 및 빈 바이러스 캡시드(예: AAV 캡시드)를 정량적으로 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
아데노-연관 바이러스(AAV)는 치료 유전자 전달을 위한 선도 플랫폼을 대표하며, 다수의 FDA 승인된 AAV 기반 치료법이 현재 시판 중이고 250 개가 넘는 후보가 임상 시험 중에 있다. 이러한 부류의 치료제가 빠르게 개발됨에 따라, 안전성과 효능을 보장하고 제조 및 공정 개발을 지원하기 위해, 생성물의 품질을 효율적으로 모니터링할 수 있는 강력한 분석 방법에 대한 요구가 높아지고 있다.
분석 초원심분리(AUC)는 용액 내 거대분자의 정량적 분석에 널리 사용되는 방법이다. AUC는 광범위한 용매에서 그리고 광범위한 용질 농도에 걸쳐 생체거대분자 연구에 널리 응용된다. 침강 속도(sedimentation velocity) 분석 초원심분리(SV-AUC)에서는, 유체역학적 이론을 사용해 높은 원심력장에서의 용질의 이동을 해석하여 거대분자의 크기, 형상, 및 상호작용을 정의한다. 침강 평형은 낮은 원심력장에서의 평형 농도 구배를 분석하여 분자 질량, 조립 화학량론, 결합 상수, 및 용액 비이상성(nonideality)을 정의하는 열역학적 방법이다. SV-AUC는 샘플의 균질성을 결정하고 용액에 존재하는 종의 성질에 대한 상세한 그림을 제공하는 데 사용될 수 있다(Cole 등의 문헌[Methods Cell Biol., 84:143-179, 2008]).
AAV 분석의 맥락에서, SV-AUC는 혈청형이 상이한 AAV의 분석을 위한 고분해능 및 광범위한 적용 가능성을 제공하기 때문에 최첨단 방법으로서 간주된다(Khasa 등의 문헌[Molecular Therapy: Methods and Clinical Development, 21:585-591, 2021]). 그러나, SV-AUC에는 많은 시간이 소요될 수 있고(예: > 5시간 정도), 500 μL 범위의 샘플 크기가 필요할 수 있다. 따라서, 바이러스 입자의 낮은 역가 및 공정 중(in-process) 샘플 분석에 적합한 매우 민감하고 신속한 분석 방법이 여전히 필요하다.
본 개시는 충진된 바이러스 캡시드, 부분 충진된 바이러스 캡시드, 및 빈 바이러스 캡시드(예: AAV 캡시드)를 신속하고 정량적으로 평가하는 온라인 고유 질량 분광분석(MS) 방법을 제공한다. 이들 방법은 캡시드 검출에 매우 민감(약 1 μg/mL의 LOD)하여, 낮은 역가의 샘플 및 공정 중 샘플에 적합하다.
일 양태에서, 본 개시는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) 바이러스 입자 샘플을 온라인 고유 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS) 시스템 내로 도입하는 단계로서, LC-MS 시스템은 전기분무 이온화 방출기와 유체 연통하는 액체 크로마토그래피 컬럼, 질량 분광기, 및 가스 유입구 포트를 포함하는, 단계; (b) 액체 크로마토그래피 컬럼을 통해 바이러스 입자 샘플에서 바이러스 캡시드 성분을 분리하는 단계; (c) 바이러스 캡시드 성분을 대상으로 질량 분광분석을 수행하기 전에, 가스 유입구 포트를 통해 바이러스 캡시드 성분을 전하 감소제와 접촉시키는 단계; 및 (d) 질량 분광분석을 통해 샘플 내의 바이러스 캡시드 성분의 원시(raw) 분획량을 식별하여 바이러스 입자 샘플에서 2개 이상의 온전한 바이러스 캡시드 성분 각각의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자 샘플은 아데노 연관 바이러스(AAV)를 포함한다. 일부 경우에, AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV-Rh10, AAV-레트로, AAV-PHP.B, AAV8-PHP.eB, 또는 AAV-PHP.S이다. 일부 경우에, AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV5 또는 AAV8이다.
일부 구현예에서, 바이러스 캡시드 성분은 빈 바이러스 캡시드 및 충진된 바이러스 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 캡시드 성분은 부분 충진된 바이러스 캡시드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피 컬럼은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼이다.
일부 구현예에서, 전하 감소제는 이소프로판올 또는 트리에틸아민이다. 일부 경우에, 전하 감소제는 이소프로판올과 트리에틸아민의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 바이러스 캡시드 성분은 질소 가스(예: 탈용매화 가스) 내에서 전하 감소제와 접촉한다.
일부 구현예에서, 전기분무 이온화 방출기는 8개의 노즐을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광기는 전하 검출 질량 분광기이다.
일 양태에서, 본 개시는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) 바이러스 입자 샘플을 대상으로 온라인 고유 전기분무 이온화 질량 분광분석(ESI-MS)을 수행하여 바이러스 캡시드 성분의 원시 분획량을 식별하는 단계로서, 샘플이 고유 ESI-MS 이전에 크로마토그래피에 의해 분리되고 전하 감소제로 처리되는, 단계; 및 (b) 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 캡시드 성분은 빈 바이러스 캡시드 및 충진된 바이러스 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 캡시드 성분은 부분 충진된 바이러스 캡시드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자 샘플은 아데노 연관 바이러스(AAV) 입자를 포함한다. 일부 경우에, AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV-Rh10, AAV-레트로, AAV-PHP.B, AAV8-PHP.eB, 또는 AAV-PHP.S이다. 일부 경우에, AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV5 또는 AAV8이다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 분리는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 전하 감소제는 이소프로판올 또는 트리에틸아민이다. 일부 경우에, 전하 감소제는 이소프로판올과 트리에틸아민의 조합이다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나에서, 샘플은 ≤ 1000 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 ≤ 500 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함한다. 일부 경우에, 샘플은 ≤ 100 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함한다. 일부 경우에, 샘플은 ≤ 50 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함한다. 일부 경우에, 샘플은 ≤ 10 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함한다. 일부 경우에, 샘플은 약 5 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함한다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나에서, 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 1 μg/mL 내지 200 μg/mL일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 100 μg/mL 미만이다. 일부 경우에, 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 50 μg/mL 미만이다. 일부 경우에, 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 10 μg/mL 미만이다. 일부 경우에, 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 5 μg/mL 미만이다. 일부 경우에, 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 약 1 μg/mL이다.
일 양태에서, 본 개시는 바이러스 입자의 조성물을 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 음이온 교환 농축 단계 및 조성물 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 위에서 또는 본원에서 논의된 방법을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 일정 시간에 걸쳐 바이러스 입자 샘플의 안정성을 모니터링하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 음이온-교환 농축 단계 및 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 위에서 또는 본원에서 논의된 방법을 포함하고, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도는 초기 시점에 결정되고, 초기 시점 이후의 하나 이상의 시점에 다시 결정된다.
안정성 모니터링 방법의 일부 구현예에서, 초기 시점에서의 상대적 풍부도와 비교하여 하나 이상의 시점에서의 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도의 변화는 일정 시간 동안 바이러스 입자 샘플의 안정성을 나타낸다. 일부 경우에, 바이러스 입자 샘플은 특정 조건 하에서 일정 시간 동안 보관된다. 일부 경우에, 특정 조건은 습도 조건 및/또는 온도 조건을 포함한다. 일부 경우에, 특정 조건은 교반 조건 및/또는 하나 이상의 동결/해동 주기를 포함한다(또는 추가로 포함한다).
일부 구현예에서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도의 결정은 음이온 교환 농축 단계 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도의 결정은 음이온 교환 농축 단계 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도의 결정은 음이온-교환 농축 단계 전 및 음이온-교환 농축 단계 후에 수행된다. 일부 경우에, 음이온 교환 농축 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수행된다.
다양한 구현예에서, 상기 또는 본원에서 논의된 구현예의 특징 또는 구성 요소 중 임의의 것이 조합될 수 있고, 이러한 조합은 본 개시의 범주 내에 포함된다. 위에서 또는 본원에서 논의된 임의의 특정 값은 위에서 또는 본원에서 논의된 다른 관련 값과 조합되어 범위의 상단과 하단을 나타내는 값을 갖는 범위를 열거할 수 있으며, 이러한 범위는 본 개시의 범주 내에 포함된다.
다른 구현예는 다음의 상세한 설명을 검토함으로써 명백해질 것이다.
도 1a, 도1b, 및 도 1c는 이종 핵산 분자(예: 치료 유전자)를 포함하는 AAV 캡시드(도 1a); 빈 캡시드, 부분 충진된 캡시드, 및 충진된 캡시드(도 1b); 및 광범위한 이론적 캡시드 화학양론을 생성하는 3개의 바이러스 단백질(VP1, VP2 및 VP3)의 60개의 카피로 이루어진 AAV 캡시드(도 1c)를 도시한다.
도 2는 본 개시의 일 구현예에 따른 예시적인 LC-MS 시스템(100)을 도시한 것으로서, 상기 시스템은 분할기(splitter)(104)에 결합된 액체 크로마토그래피 컬럼(102)(예: SEC 컬럼)을 포함하고, 상기 분할기는 미세 제조된 모놀리식(monolithic) 다중 노즐(M3) 전기분무 이온화 방출기(106)에 결합되고, 상기 방출기는 가스 유입구 포트(108) 및 질량 분광기(110)(예: OrbitrapTM UHMR)에 결합된다.
도 3은 도 2의 액체 크로마토그래피 컬럼을 통해 염으로부터 AAV 캡시드 성분이 분리된 것을 도시하는 크로마토그램, 및 빈 바이러스 캡시드 및 충진된 바이러스 캡시드의 상대적 풍부도를 보여주는 질량 스펙트럼을 나타낸다. 질량 스펙트럼은 질량 분광분석 전에 AAV 캡시드 함유 샘플에 전하 감소제(예: 이소프로판올 중 0.01% 트리에틸아민)를 적용한 경우(하단) 및 적용하지 않은 경우(상단)의 차이를 도시한다. 전하 감소는 AAV 캡시드 성분의 분해능을 개선하였다.
도 4a 및 도 4b는 다양한 AAV 혈청형(AAV1, AAV5, 및 AAV8)의 질량 스펙트럼(도 4a) 및 동일한 AAV 혈청형(도 4b)에 대한 상응하는 SV-AUC 데이터를 보여준다. 질량 스펙트럼은 본 개시의 방법이 다양한 AAV 혈청형에 걸쳐 SV-AUC 데이터와 일치하는 결과를 생성함을 보여준다.
도 5a 및 도 5b는 본 개시의 LC-MS 시스템 내로 다양한 양의 빈 캡시드 AAV 물질을 주입함으로써 생성된 질량 스펙트럼(도 5a) 및 질량 스펙트럼 반응과 주입량 사이의 상관 관계(도 5b)를 보여준다. 이들 결과는 본 개시의 방법이 바이러스 캡시드 물질(예: AAV 캡시드)의 검출에 매우 민감하며, 이로 인해 상기 방법은 공정 중 샘플 모니터링에 매우 적합하다는 것을 보여준다.
도 6은, 빈 바이러스 캡시드에 비해 상대적으로 충진된 바이러스 캡시드를 농축하기 위한 음이온 교환(AEX) 컬럼을 포함하는 예시적인 바이러스 캡시드용 정제 프로세스를 도시하고, AEX 농축 전 및 AEX 농축 후 취한 측정치에 상응하는 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 7a 및 도 7b는, 본 개시의 LC-MS 시스템 내로 다양한 비율의 빈 AAV 캡시드:충진된 AAV 캡시드를 도입하여 생성된 질량 스펙트럼(도 7a) 및 기지의 SV-AUC 데이터와 질량 스펙트럼으로부터 얻은 캡시드 성분의 측정된 백분율 간의 상관 관계(도 7b)를 보여준다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 측정된 MS 데이터와 기지의 SV-AUC 데이터 사이의 상관 관계는 양호하다.
도 8은 본 개시의 검정 기술을 사용하여 생성된 예시적인 결과를 도시하며, 이에 의한 캡시드 안정성의 변화는 열 응력 후에 모니터링된다.
본 발명을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 하는데, 이는 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문이다. 또한 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정되므로 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 목적이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 설명에 사용된 용어 "약"은 인용된 특정 수치와 관련하여 사용될 때, 이러한 값이 인용된 값과 1% 이내에서 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본 설명에 사용된 바와 같이, "약 100"이라는 표현은 99와 101을 포함하고 그 사이의 모든 값(예: 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다(include, includes, 및 including)"는 비제한적인 것을 의미하며, "포함하다(comprise, comprises, 및 comprising)"를 각각 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 기술된 것들과 유사한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 실시하거나 또는 검사하는 데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 지금부터 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원, 및 비 특허 공개문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
선택된 약어
MS: 질량 분광분석
rAAV: 재조합 AAV 입자 또는 캡시드
AAV: 아데노-연관 바이러스
LC: 액체 크로마토그래피
SEC: 크기 배제 크로마토그래피
ESI: 전기분무 이온화
SV-AUC: 침강 속도 분석 초원심분리
AEX - 음이온 교환 크로마토그래피
정의
"온전한 바이러스 캡시드 성분"은 온전한(즉, 변성되지 않았거나, 달리 분해되거나 그들의 성분 부분(예: 상이한 바이러스 단백질)으로 나눠지지 않았고, 바이러스 캡시드의 구조적 특성(예: AAV 캡시드의 이십면체 형태)을 유지하는) 바이러스 캡시드(예: 빈 바이러스 캡시드, 부분 충진된 바이러스 캡시드, 및/또는 충진된 바이러스 캡시드)를 지칭한다.
"빈 바이러스 캡시드" 또는 "빈 캡시드"라는 용어는 도 1b에 도시된 바와 같이, 이종 핵산 분자(예: 치료 유전자)를 함유하지 않는 캡시드를 지칭한다.
"부분 충진된 바이러스 캡시드" 또는 "부분 충진된 캡시드"라는 용어는 도 1b에 도시된 바와 같이, 이종 핵산 분자(예: 치료 유전자)의 일부분만을 함유하는 캡시드를 지칭한다.
"충진된 바이러스 캡시드" 또는 "충진된 캡시드"라는 용어는 도 1b에 도시된 바와 같이, 완전한 이종 핵산 분자(예: 치료 유전자)를 함유하는 캡시드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "샘플"이란 용어는 적어도 하나의 바이러스 캡시드 성분(즉, 빈 캡시드, 부분 충진된 캡시드, 및/또는 충진된 캡시드)을 포함하는 바이러스 입자(예: AAV 입자)의 혼합물로서, 본 발명의 방법에 따라 조작(예: 분리 및 분석)되는 혼합물을 지칭한다.
"분석(analysis)" 또는 "분석하는(analyzing)"이란 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 관심 있는 바이러스 입자 또는 바이러스 단백질(예: AAV 단백질)을 분리, 검출, 단리, 정제, 및/또는 특성화하는 다양한 방법 중 어느 하나를 지칭한다. 예로는 질량 분광분석(예: ESI-MS), 액체 크로마토그래피(예: 크기 배제 크로마토그래피), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "접촉"은 용액 또는 고상인 적어도 2개의 물질을 합치는 것, 예를 들어 크로마토그래피 물질의 고정상(stationary phase)을 바이러스 입자를 포함하는 샘플과 같은 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 "온전한 질량 분석"은 바이러스 입자가 온전한 입자인 것을 특징으로하는 실험을 포함한다. 온전한 질량 분석은 샘플 제제를 최소로 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "액체 크로마토그래피"라는 용어는 액체에 의해 운반되는 화학 혼합물이 고정된 액상 또는 고상 주위로 또는 위로 흐를 때 화학적 엔티티들의 차등 분포로 인해 여러 성분으로 분리되는 프로세스를 지칭한다. 액체 크로마토그래피의 비제한적인 예는 역상 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 및 소수성 크로마토그래피를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "질량 분광기"라는 용어는 특정 분자 종을 검출하고 이의 질량을 정확하게 측정할 수 있는 장치를 지칭한다. 상기 용어는 바이러스 단백질(예: AAV 단백질)이 검출 및/또는 특성화를 위해 용리되어 들어갈 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하는 것을 의미할 수 있다. 질량 분광기는 이온 공급원, 질량 분석기, 및 검출기의 세 가지 주요 부분으로 구성된다. 이온 공급원의 역할은 기상 이온을 생성하는 것이다. 분석물 원자, 분자, 또는 클러스터는 기상으로 전환되고, (전기분무 이온화에서와 같이) 동시에 이온화되거나 그렇지 않을 수 있다. 이온 공급원의 선택은 응용 분야에 따라 달라진다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "전기분무 이온화" 또는 "ESI"라는 용어는 분무 이온화 프로세스를 지칭하며, 여기서 용액 중 양이온 또는 음이온 중 어느 하나가 대기압에서 고도로 하전된 액적 스트림의 형성 및 용해를 통해 기상으로 전환된다. 고도로 하전된 액적은 용액을 함유하는 전기분무 방출기 바늘의 팁과 상대 전극 사이에 전위차를 인가함으로써 발생한다. 용액 중 전해질 이온으로부터 기상 이온을 생성하는 데에는 세 가지 주요 단계가 있다. 이는, (a) ES 주입(infusion) 팁에서 하전된 액적을 생성하는 단계; (b) 용매 증발 및 반복된 액적 분해에 의해 하전된 액적의 수축 및, 이로 인해 기상 이온을 생성할 수 있는 고도로 하전된 작은 액적으로 이어지는 단계; 및 (c) 매우 작고 고도로 하전된 액적으로부터 기상 이온을 생성하는 메커니즘이다. 단계 (a) 내지 (c)는 일반적으로 장치의 대기압 영역에서 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "전기분무 이온화 공급원"이란 용어는 바이러스 입자의 질량 분석에 사용되는 질량 분광기와 호환될 수 있는 전기분무 이온화 시스템을 지칭한다.
고유 MS는 생물학적 분석물이 비변성 용매로부터 분무되는 전기분무 이온화에 기초한 특별한 접근법이다. 이는 큰 생체분자와 같은 생체분자 및 이의 복합체가 응축된 액상 형태의 3차원적 기능적 존재에서 전기분무 이온화 질량 분광분석(ESI-MS) 프로세스를 통해 기상으로 전환될 수 있는 프로세스로 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "나노전자분무" 또는 "나노분무"라는 용어는 매우 낮은 용매 유속, 통상적으로는 분당 수백 나노리터 이하의 샘플 용액의 유속에서의 전기분무 이온화를 지칭하며, 대개는 외부 용매 전달을 사용하지 않고 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "질량 분석기"는 종(원자, 분자, 또는 클러스터)을 질량에 따라 분리할 수 있는 장치를 지칭한다. 고속 단백질 시퀀싱에 사용될 수 있는 질량 분석기의 비제한적인 예에는 비행 시간(TOF), 자기/전기 섹터, 사중극자(quadrupole) 질량 필터(Q), 사중극자 이온 트랩(QIT), 오비트랩(orbitrap), 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FTICR)이 있고 또한 가속기 질량 분광분석(AMS) 기술이 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "질량 대 전하 비율" 또는 "m/z"는 통합된 원자 질량 단위로 된 이온의 질량을 그 전하 수(부호에 관계없이)로 나눔으로써 형성된 무차원 양을 나타내는 데 사용된다. 일반적으로, 빈 AAV 캡시드, 부분 충진된 AAV 캡시드, 및 충진된 AAV 캡시드는 고유 ESI 동안 유사한 수의 전하를 가지고 있어서, 고유 m/z 스펙트럼을 사용하여 샘플 내 AAV 캡시드 성분의 분획 조성을 m/z 범위 및 상대적 풍부도에서의 차이로부터 직접 해석할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "사중극자-오비트랩 하이브리드 질량 분광기"라는 용어는 사중극자 질량 분광기를 오비트랩 질량 분석기에 결합시킴으로써 만들어진 하이브리드 시스템을 지칭한다. 사중극자-오비트랩 하이브리드 질량 분광기를 사용하는 탠덤 인-타임(tandem in-time) 실험은 선택된 좁은 m/z 범위 내의 이온을 제외한 모든 이온을 사중극자 질량 분광기로부터 배출함으로써 시작한다. 선택된 이온은 오비트랩에 삽입되고 가장 흔하게는 저에너지 CID에 의해 단편화될 수 있다. m/z의 허용 포획 범위 내의 단편들은 포획 상태로 유지되므로, MS-MS 스펙트럼을 얻을 수 있다.
"아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV"는 단일 가닥 DNA를 가진, 비병원성 파보바이러스로서, 약 4.7 kb의 게놈을 가지며, 외피가 없는, 이십면체 형태를 갖는다. AAV는 1965년에 아데노바이러스 제제의 오염물로서 처음 발견되었다. AAV는 디펜도바이러스속(Dependovirus genus) 및 파보바이러스과(Parvoviridae family)에 속하며, 복제를 위해 헤르페스 바이러스 또는 아데노바이러스 중 어느 하나의 헬퍼(helper) 기능을 필요로 한다. 헬퍼 바이러스가 없는 경우, AAV는 19q13.4 위치에서 인간 19번 염색체 내에 혼입됨으로써 잠복기를 설정할 수 있다. AAV 게놈은 두 개의 AAV 유전자인, Rep 및 Cap 각각에 대해 하나씩 두 개의 개방 판독 프레임(ORF)으로 구성된다. AAV DNA 단부는 145-bp 역위 말단 반복(ITR)을 가지며, 125개의 말단 염기는 특징적인 T-형 헤어핀 구조를 생성하는 회문이다.
본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"이란 용어는 임의의 길이의 뉴클레오티드, 즉, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 및 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연의, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연의 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 핵산의 골격은 당 및 인산염기(일반적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 인산염기를 포함할 수 있다.
"재조합 바이러스 입자"는 적어도 하나의 바이러스 뉴클레오티드 서열이 측면에 위치할 수 있는 하나 이상의 이종 서열(예: 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다.
"재조합 AAV 입자"는 적어도 하나, 예를 들어, 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITRs)이 측면에 위치할 수 있는 하나 이상의 이종 서열(예: AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 아데노-연관 바이러스 입자를 지칭한다. 이러한 rAAV 입자는, 적절한 헬퍼 바이러스로 감염되고(또는 적절한 헬퍼 기능을 발현하고) AAV rep 및 cap 유전자 산물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포내에 존재할 때 복제되고 포장될 수 있다.
"바이러스 입자"는 적어도 하나의 바이러스 캡시드 단백질 및 캡슐화된 바이러스 게놈으로 이루어진 바이러스 입자를 지칭한다.
"이종"은 비교 대상이거나 도입 또는 혼입 대상인 나머지 엔티티와 유전자형적으로 구별되는 엔티티로부터 유래되는 것을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 상이한 세포 유형 내로 도입된 핵산은 이종 핵산이다(이종 핵산이 발현되면, 이는 이종 폴리펩티드를 암호화할 수 있음). 유사하게, 바이러스 입자 내로 혼입되는 세포 서열(예: 유전자 또는 이의 일부)은 바이러스 입자에 대해서 이종 뉴클레오티드 서열이다.
"역위 말단 반복" 또는 "ITR" 서열은 바이러스 게놈의 말단에서 발견되는, 반대로 배향된, 비교적 짧은 서열이다. "AAV 역위 말단 반복(ITR)" 서열은 단일-가닥 AAV 게놈의 양쪽 말단에 존재하는 대략 145-뉴클레오티드 서열이다.
일반적인 설명
본 개시는 바이러스 입자(예: AAV 입자) 샘플의 바이러스 캡시드 성분(예: 충진된 캡시드, 부분 충진된 캡시드, 및 빈 캡시드)를 민감하고 신속하게 정량적으로 특성화하는 온라인 크로마토그래피 및 고유 질량 분광분석(MS) 방법, 및 이러한 분석 기술을 사용하는 정제 방법을 제공한다. 생성물의 품질 및 일관성을 보장하여 조성물의 안전성과 효능을 유지하기 위해서는 AAV 입자 샘플의 바이러스 캡시드 성분 같은, 바이러스 입자 조성물의 바이러스 캡시드 성분을 완전히 특성화하는 것은 필요하다.
재조합 바이러스 벡터 조성물(예: AAV 벡터 조성물)은 다양한 생산, 정제, 및 보관 조건으로부터 발생하는 다양한 수준의 충진된 캡시드, 부분 충진된 캡시드, 및 빈 캡시드를 함유할 수 있다. 그러나, 바이러스 단백질 화학량론의 변동 및 이종 핵산 물질의 함량의 변동, 뿐만 아니라 낮은 샘플 농도로 인해 발생하는 높은 질량 이종성은 이러한 샘플의 전통적인 온전한 질량 분광분석을 어렵게 한다. 본 방법은 샘플 희석(예를 들어, 저유속 요건에 의함)을 제한함으로써, 고속 온라인 탈염(샘플 안정성을 유지하기 위함)을 제공함으로써, 그리고 바이러스 입자 종(예: AAV 캡시드)의 분해능을 개선하기 위한 전하 감소를 제공함으로써 이러한 문제를 해결한다.
온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 방법
본 개시의 양태는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.
일부 경우에, 상기 방법은: (a) 바이러스 입자 샘플을 온라인 고유 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS) 시스템 내로 도입하는 단계로서, LC-MS 시스템은 전기분무 이온화 방출기와 유체 연통하는 액체 크로마토그래피 컬럼, 질량 분광기, 및 가스 유입구 포트를 포함하는, 단계; (b) 액체 크로마토그래피 컬럼을 통해 바이러스 입자 샘플에서 바이러스 캡시드 성분을 분리하는 단계; (c) 바이러스 캡시드 성분을 대상으로 질량 분광분석을 수행하기 전에 가스 유입구 포트를 통해 바이러스 캡시드 성분을 전하 감소제와 접촉시키는 단계; (d) 질량 분광분석을 통해 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 원시 분획량을 식별하는 단계; 및 (e) 바이러스 캡시드 성분의 원시 분획량에 보정 인자를 적용하고 바이러스 캡시드 성분의 보정 분획량을 식별하여 바이러스 입자 샘플에서 2개 이상의 온전한 바이러스 캡시드 성분 각각의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하되, 보정 인자는, 기준 표준을 대상으로 온라인 고유 LC-MS 시스템을 수행하고, 기준 표준에서 표준 바이러스 캡시드 성분의 분획량을 식별하고, 침강 속도 분석 초원심분리(SV-AUC)에 의해 결정했을 때의 표준 바이러스 캡시드 성분의 식별된 분획량을 표준 바이러스 캡시드 성분의 알려진 분획량과 비교함으로써 미리 결정된다.
일부 경우에, 상기 방법은: (a) 바이러스 입자 샘플을 대상으로 온라인 고유 전기분무 이온화 질량 분광분석(ESI-MS)을 수행하여 바이러스 캡시드 성분의 원시 분획량을 식별하는 단계로서, 샘플이 고유 ESI-MS 이전에 크로마토그래피에 의해 분리되고 전하 감소제로 처리되는, 단계; 및 (b) 바이러스 캡시드 성분의 원시 분획량에 보정 인자를 적용하고 바이러스 캡시드 성분의 보정된 분획량을 식별함으로써 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하되, 보정 인자는, 기준 표준을 대상으로 온라인 고유 ESI-MS를 수행하고, 기준 표준에서 표준 바이러스 캡시드 성분의 분획량을 식별하고, 침강 속도 분석 초원심분리(SV-AUC)에 의해 결정했을 때의 표준 바이러스 캡시드 성분의 식별된 분획량을 표준 바이러스 캡시드 성분의 알려진 분획량과 비교함으로써 미리 결정된다.
상기 방법의 다양한 구현예에서, 바이러스 캡시드 성분은 빈 바이러스 캡시드 및 충진된 바이러스 캡시드를 포함하고, 빈 바이러스 캡시드의 보정된 분획량 및 충진된 바이러스 캡시드의 보정된 분획량이 식별된다. 일부 경우에, 바이러스 캡시드 성분은 부분 충진된 바이러스 캡시드를 추가로 포함하고, 부분 충진된 바이러스 캡시드의 보정된 분획량이 식별된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 재조합 바이러스 입자(예: AAV 입자) 샘플에서 빈 바이러스 캡시드, 부분 충진된 바이러스 캡시드, 및 충진된 바이러스 캡시드의 상대적 풍부도를 식별하는 데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법에서, LC-MS 시스템은 도 2에 도시된 개략도에 의해 예시된다. 도 2에 도시된 실시예에서, LC-MS 시스템(100)은 액체 크로마토그래피 컬럼(102)(예: 1 mm 내경 x 50 mm SEC 컬럼)을 포함하며, 상기 칼럼 내로, 예를 들어, 10 μL/min의 유속으로 바이러스 입자 샘플을 도입하여 샘플의 바이러스 캡시드 성분을 서로로부터 그리고 샘플에 존재할 수 있는 임의의 불순물(예: 염)로부터 분리한다. 그런 다음, 분리된 성분은 분할기(104)를 통과하여 전기분무 이온화 방출기(106) 내로 예를 들어 5 μL/min의 유속으로 들어간다. ESI 방출기(106)는 가스 유입구 포트(108)에 결합되고, 이를 통해 변형된 탈용매화 가스(예를 들어, 이소프로판올 중 트리에틸아민과 같은 전하 감소제("개질제(modifier)")로 변형된 질소)가, 질량 분광기(110)(예: OrbitrapTM UHMR 질량 분광기)에서의 질량 분광분석 전에, 샘플과 접촉한다.
본원에서 논의된 다양한 방법에서, 샘플을 질량 분광분석하면, 캡시드에 함유된 이종 핵산 분자의 함량에 기초하여 질량별로 분리되는, 바이러스 입자 샘플의 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 보여주는 질량 스펙트럼이 생성된다. 이해되는 바와 같이, (완전한 이종 핵산 분자를 함유하는) 충진된 캡시드의 질량은 (이종 핵산 분자의 일부만을 함유하는) 부분 충진된 캡시드의 질량보다 크고, 이는 다시 (이종 핵산 분자를 함유하지 않은) 빈 캡시드의 질량보다 크다. 캡시드의 바이러스 단백질의 화학량론적 변이를 고려하면(예: 도 1c), 샘플의 질량 분광분석으로부터 생성된 질량 스펙트럼은 샘플 내의 바이러스 캡시드 성분의 각각을 나타내는 넓은 피크를 포함할 수 있다.
바이러스 입자
특정 양태에서, 바이러스 입자는 AAV 입자이고, 개시된 방법은 AAV 입자 샘플에서 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 데 사용될 수 있다. AAV 입자는 재조합 AAV(rAAV) 입자일 수 있다. rAAV 입자는 이종 전이유전자(transgene) 또는 이종 핵산 분자를 암호화하는 AAV 벡터를 포함한다.
특정 양태에서, AAV 입자는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정 양태에서, AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV-Rh10, AAV-레트로, AAV-PHP.B, AAV8-PHP.eB, 또는 AAV-PHP.S이다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV5 또는 AAV8이다.
AAV가 본 개시를 위한 모델 바이러스 입자였지만, 개시된 방법은 다양한 바이러스, 예를 들어 바이러스 과(family), 아과(subfamily), 및 속(genera)을 특성화하기 위해 적용될 수 있는 것으로 생각된다. 본 개시의 방법은, 예를 들어, 바이러스 입자를 특성화하여 이러한 조성물의 생산, 정제, 또는 보관 동안 바이러스 입자의 조성물 중 바이러스 캡시드 성분의 상대적인 풍부도를 모니터링하거나 검출하는 데 사용될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 바이러스 입자는 아데노바이러스과, 파보바이러스과, 레트로바이러스과, 바큘로바이러스과, 및 헤르페스바이러스과로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스과(viral family)에 속한다.
특정 양태에서, 바이러스 입자는, 아타데노바이러스, 아비아데노바이러스, 이크타데노바이러스, 마스타데노바이러스, 시아데노바이러스, 앰비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헵판덴소바이러스, 이테라덴소바이러스, 펜틸덴소바이러스, 암도파보바이러스, 아베파보바이러스, 보카파보바이러스, 코피파보바이러스, 데펜도파보바이러스, 에리스로파보바이러스, 프로토파보바이러스, 테트라파보바이러스, 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 엡실론레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스, 알파바큘로바이러스, 베타바큘로바이러스, 델타바큘로바이러스, 감마바큘로바이러스, 일토바이러스, 마르디바이러스, 심플렉스바이러스, 바리셀로바이러스, 시토메갈로바이러스, 무로메갈로바이러스, 프로보시바이러스, 로졸로바이러스, 림포크립토바이러스, 마카바이러스, 페르카바이러스, 및 라디노바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 속(genus)에 속한다.
특정 양태에서, 레트로바이러스과(Retroviridae)는 몰로니(moloney) 쥐 육종(murine sarcoma) 바이러스(MoMSV), 하비(harvey) 쥐 육종 바이러스(HaMuSV), 쥐 유방(mammary) 종양(tumor) 바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이(gibbon ape) 백혈병(leukemia) 바이러스(GaLV), 고양이(feline) 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스(spumavirus), 프렌드(friend) 바이러스, 쥐 줄기 세포(stem cell) 바이러스(MSCV), 루스(rous) 육종 바이러스(RSV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말(equine) 면역 결핍 바이러스(EIV), 비스나-메디(visna-maedi) 바이러스; 카프린(caprine) 관절염-뇌염(arthritis-encephalitis) 바이러스; 말 감염성 빈혈(anemia) 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소(bovine) 면역 결핍 바이러스(BIV); 또는 유인원(simian) 면역결핍 바이러스(SIV)이다.
일부 양태에서, 바이러스 입자(예: AAV 입자)는 이종 핵산 분자(예: 치료 유전자)를 함유한다. 일부 양태에서, 이종 핵산 분자는 프로모터promoter)에 작동 가능하게 연결된다. 예시적인 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터 및 CK6 프로모터, 트랜스티레틴(transthyretin) 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라(chimeric) 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 거대세포바이러스 인핸서(enhancer)/닭 베타-액틴(beta-actin)/토끼 .베타.-글로빈 프로모터 및 신장(elongation) 인자 1-알파 프로모터(EF1-알파) 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 양태에서, 프로모터는 인간 .베타.-글루쿠로니다제(glucuronidase) 프로모터 또는 닭 .베타.-액틴(CBA) 프로모터에 연결된 거대세포바이러스 인핸서를 포함한다. 프로모터는 구성적, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 CBA 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 이종 전이유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 일부 경우에, 전이유전자에 대한 고유 프로모터 또는 이의 단편이 사용될 것이다. 고유 프로모터는 전이유전자의 발현이 고유 발현을 모방해야 하는 것이 바람직할 때 사용될 수 있다. 고유 프로모터는 전이유전자의 발현이 시간적으로 또는 발달적으로, 또는 조직 특이적(tissue-specific) 방식으로, 또는 특정 전사 자극(specific transcriptional stimuli)에 반응하여 조절되어야 할 때 사용될 수 있다. 추가 양태에서, 다른 고유 발현 조절 요소, 예컨대, 인핸서 요소, 폴리아데닐화(polyadenylation) 부위 또는 코작 컨센서스(Kozak consensus) 서열도 또한 고유 발현을 모방하는 데 사용될 수 있다.
온라인 고유 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS) 시스템
일부 예시적인 구현예에서, 상기 방법은 바이러스 입자를 대상으로 액체 크로마토그래피/질량 분광분석(LC/MS)를 수행하는 단계를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, LC/MS는 이온의 물리적 분리를 위한 액체 크로마토그래피 및 이온으로부터 질량 스펙트럼 데이터를 생성하기 위한 질량 분광분석을 사용한다. 이러한 질량 스펙트럼 데이터는, 예를 들어 분자량 또는 구조, 질량, 양, 순도 등에 의한 입자의 식별을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이들 데이터는 검출된 이온의 특성, 예컨대 시간(예: 유지 시간)에 따른 신호 강도(예: 풍부도), 또는 질량 대 전하 비율에 대한 상대적 풍부도를 나타낼 수 있다. 도 2에 도시된 예시적인 LC-MS 시스템은 바이러스 입자 샘플에서 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 도시된 예시적인 시스템에 대한 변형도 또한 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
액체 크로마토그래피 컬럼(102)의 비제한적인 예는 역상 액체 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 친수성-상호작용 크로마토그래피, 및 소수성 크로마토그래피를 포함한다. HPLC를 포함하는 액체 크로마토그래피는 바이러스 입자 샘플의 성분을 분리하는 데 사용될 수 있다.
다양한 구현예에서, 컬럼 온도는 크로마토그래피 실행 전체에 걸쳐 일정한 온도로 유지될 수 있다. 특히, 컬럼 온도는 주변 실온(즉, 약 23 내지 25℃)으로 유지된다. 일부 구현예에서, 컬럼은 약 22℃ 내지 약 28℃ 범위의 온도로 유지된다. 일부 구현예에서, 컬럼은 약 23℃ 내지 약 27℃ 범위의 온도로 유지된다. 일부 구현예에서, 컬럼은 약 24℃ ± 1℃ 내지 약 26℃ ± 1℃ 범위의 온도로 유지된다. 일부 경우에, 컬럼 온도는 약 22℃ 내지 약 26℃의 범위로 유지된다. 일부 경우에, 컬럼은 22℃, 22.5℃, 23℃, 23.5℃, 24℃, 24.5℃, 25℃, 25.5℃, 26℃, 26.5℃, 27℃, 27.5℃, 또는 28℃의 온도 또는 대략 이의 온도로 유지된다. 일부 구현예에서, 온도는 상업용 컬럼 히터를 사용하여 유지된다. 일부 구현예에서, 온도는 (컬럼 히터를 사용하지 않는) 주변 실온이다.
일부 구현예에서, LC 분석은 고유 질량 분광분석 시스템과 유체 연통하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 포함한다. 다양한 구현예에서, LC 분석은 당업계에 공지된 바와 같이 수행될 수 있지만, 음이온-교환 컬럼의 사용은 부분 충진된 캡시드와 충진된 캡시드 사이의 분해능을 감소시킬 수 있음을 주목한다. 컬럼은 바이러스 입자와 함께 사용하기에 적합하다. 일 실시예에서, SEC 컬럼은 Waters BEH® SEC 컬럼 (1 x 50 mm)이다.
SEC와 같은 컬럼은 질량 분광분석기로의 유속을 조정할 수 있는 분석 유속 분할기(104)를 통해 질량 분광분석기와 유체 연통한다.
일부 실시예에서 이동상은 수성 이동상이다. 일부 구현예에서, 이동상은 암모늄 아세테이트를 함유하는 수성 염 완충액이다. 일부 구현예에서, 등용매(isocratic) 용리(예를 들어, 실행 전체에 걸쳐 유지되는 일정한 완충액 조성물)가 사용된다. 예시적인 구현예에서, 단백질을 용리하는 데 사용되는 이동상은 질량 분광기와 호환적인 이동상이다. 완충액(들)의 구배가 사용될 수 있는데, 예를 들어, 2개의 완충액이 사용되는 경우, 크로마토그래피가 실행되는 동안 제1 완충액의 농도 또는 백분율은 감소할 수 있고, 제2 완충액의 농도 또는 백분율은 증가한다. 예를 들어, 제1 완충액의 백분율은 크로마토그래피가 실행되는 동안 약 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 50%, 약 45%, 또는 약 40% 내지 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 또는 약 40%로 감소할 수 있다. 다른 예로서, 제2 완충액의 백분율은 동일한 실행 과정 동안 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 또는 약 40% 내지 약 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 50%, 약 45%, 또는 약 40%로 증가할 수 있다. 특정 양태에서, 크로마토그래피 내의 이동상 A의 비율은 시간이 지남에 따라 증가한다. 선택적으로, 제1 및 제2 완충액의 농도 또는 백분율은 크로마토그래피 실행의 종료 시 이들의 시작 값으로 복귀할 수 있다. 백분율은 선형적 구배로 또는 비선형(예를 들어, 단계적) 방식으로 점진적으로 변할 수 있다. 예를 들어, 구배는 다상성(multiphasic), 예를 들어 이상성, 삼상성 등일 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 이동상은 약 0.1 μL/분 내지 약 100 μL/분의 액체 크로마토그래피 컬럼을 통한 유속을 가질 수 있다. 일부 경우에는 유속은 약 0.5 μL/분, 약 1 μL/분, 약 1.5 μL/분, 약 2 μL/분, 약 2.5 μL/분, 약 3 μL/분, 약 3.5 μL/분, 약 4 μL/분, 약 4.5 μL/분, 약 5 μL/분, 약 5.5 μL/분, 약 6 μL/분, 약 6.5 μL/분, 약 7 μL/분, 약 7.5 μL/분, 약 8 μL/분, 약 8.5 μL/분, 약 9 μL/분, 약 9.5 μL/분, 약 10 μL/분, 약 10.5 μL/분, 약 11 μL/분, 약 11.5 μL/분, 약 12 μL/분, 약 12.5 μL/분, 약 13 μL/분, 약 13.5 μL/분, 약 14 μL/분, 약 14.5 μL/분, 약 15 μL/분, 약 15.5 μL/분, 약 16 μL/분, 약 16.5 μL/분, 약 17 μL/분, 약 17.5 μL/분, 약 18 μL/분, 약 18.5 μL/분, 약 19 μL/분, 약 19.5 μL/분, 약 20 μL/분, 약 25 μL/분, 약 30 μL/분, 약 35 μL/분, 약 40 μL/분, 약 45 μL/분, 약 50 μL/분, 약 75 μL/분, 또는 약 100 μL/분이다. 일부 경우에, 유속은 10 μL/분이다.
일부 양태에서, 질량 분광분석(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 LC/MS에 사용됨)은 전기분무 이온화 질량 분광분석(ESI-MS)을 지칭할 수 있다. ESI-MS는 질량 분광분석을 사용하여 용액으로부터 유래된 이온을 분석하기 위해 전기 에너지를 사용하는 기술로서 당업계에 공지되어 있다. 용액 또는 기상에서 이온화된 중성 종을 포함하는 이온 종은 하전된 액적의 에어로졸에 분산시킴으로써 용액에서 기상으로 전환된다. 이어서, 용매 증발을 수행하여 하전된 액적의 크기를 감소시킨다. 그런 다음, 샘플 이온은 접지에 대비하여 전압을 갖는 작은 모세관을 통과하는 용액으로서 전하 액적으로부터 배출된다. 예를 들어, ESI 챔버의 주변 벽은 샘플을 휘발성 산 및 유기 용매와 혼합하고 고전압이 하전된 전도성 바늘을 통해 이를 주입하는 역할을 수행한다. 바늘 말단으로부터 분무(또는 배출)되는 하전된 액적은 질량 분광기 내로 유도되고, 이들이 비행하면서 열 및 진공에 의해 건조된다. 액적이 건조 후, 나머지 하전된 분자는 전자기 렌즈에 의해 질량 검출기 내로 유도되고 질량이 분석된다. 일 양태에서, 용리된 샘플은 모세관으로부터 전기분무 노즐 내로 직접 침전되며, 예를 들어 모세관은 샘플 로더로서 기능한다. 다른 양태에서, 모세관 자체는 추출 장치 및 전기분무 노즐 둘 모두로서 기능한다.
일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 방출기(108)는 다수의 방출기 노즐, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상의 방출기 노즐, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 방출기 노즐을 포함한다. 일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 방출기(108)는 8개의 방출기 노즐을 포함하는 Newomics(캘리포니아주 버클리)로부터의 M3 방출기이다.
일부 예시적인 구현예에서, 다른 이온화 모드, 예를 들어, 터보스프레이 이온화 질량 분광분석, 나노스프레이 이온화 질량 분광분석, 열분무 이온화 질량 분광분석, 초음파 분무 이온화 질량 분광분석, SELDI-MS 및 MALDI-MS가 사용된다. 일반적으로, (ESI-MS 같은) 이들 방법의 장점은 이들이 샘플의 "적시(just-in-time)" 정제 및 이온화 환경 내로의 직접 도입을 가능하게 한다는 것이다. 다양한 이온화 및 검출 모드는 사용되는 탈착 용액의 성질에 대한 자체 제약을 가지고 있다는 것을 주목하는 것이 중요하며, 탈착 용액이 둘 모두와 호환될 수 있는 것이 중요하다. 예를 들어, 많은 응용에서 샘플 매트릭스는 낮은 이온 강도를 갖거나 특정 pH 범위 내, 등의 조건에서 존재해야 한다. ESI에서, 샘플 내의 염은 이온화를 낮추거나 노즐을 막음으로써 검출을 못하게 할 수 있다. 이러한 문제점은 분석물을 저염으로 제공하고/하거나 휘발성 염을 사용하여 해결할 수 있다. MALDI의 경우, 분석물은 표적 상에 스파팅(spotting)하는 것과 호환되고 사용된 이온화 매트릭스와 호환되는 용매 내에 있어야 한다.
일부 예시적인 구현예에서, 변형된 탈용매화 가스(예를 들어, 질소)는 가스 유입구 포트(108)를 통해 도입되어 질량 분광분석 전에 샘플과 접촉할 수 있다. 다양한 구현예에서, 개질제는 적어도 하나의 유기 용매 및 염기를 포함한다. 유기 용매의 비제한적인 예는 아세토니트릴, 프로판올, 이소프로판올, 물 및 메탄올을 포함한다. 염기의 비제한적인 예는 암모니아, 디에틸아민, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), 및 피페리딘을 포함한다. 일부 예시적인 구현예에서, 개질제는 이소프로판올 중 트리에틸아민이다.
일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 공급원은 약 1 μL/분 내지 약 20 μL/분의 용매 유속을 갖는 전기분무를 제공한다. 다양한 구현예에서, ESI 방출기 내로의 유속은 약 1 μL/분, 약 2 μL/분, 약 3 μL/분, 약 4 μL/분, 약 5 μL/분, 약 6 μL/분, 약 7 μL/분, 약 8 μL/분, 약 9 μL/분, 약 10 μL/분, 약 11 μL/분, 약 12 μL/분, 약 13 μL/분, 약 14 μL/분, 약 15 μL/분, 약 16 μL/분, 약 17 μL/분, 약 18 μL/분, 약 19 μL/분, 또는 약 20 μL/분이다.
고유 질량 분광기는 고유 ESI 질량 분광분석 시스템일 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 질량 분광기(110)는 사중극자-오비트랩 하이브리드 질량 분광기일 수 있다. 사중극자-오비트랩 하이브리드 질량 분광기는 Q Exactive™ Focus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분광기, Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분광기, Q Exactive™ BioPharma Platform, Q Exactive™ UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분광기, Q Exactive™ HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분광기, Q Exactive™ HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분광기, 및 Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분광기일 수 있다. 일부 예시적인 실시예에서, 질량 분광분석 시스템은 Thermo Exactive EMR 질량 분광기이다. 질량 분광분석 시스템은 자외선 검출기도 포함할 수 있다.
LC/MS에 적합한 다양한 질량 분석기가 당업계에 공지되어 있으며, 여기에는 비행 시간(TOF) 분석기, 사중극자 질량 필터, 사중극자 TOF(QTOF), 및 이온 트랩(예: 푸리에 변환 기반 질량 분광기 또는 오비트랩)이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 오비트랩에서 접지 전위의 배럴형(barrel-like) 외부 전극 및 스핀들형(spindle-like) 중심 전극은, 원심력과 정전기력의 균형에 의해 갇혀 있는, 중심 축을 따라 진동하면서 중심 전극 주위에서 타원형으로 회전하는 궤적내 이온을 포획하는 데 사용된다. 이러한 기기의 사용에는 푸리에 변환 작업을 적용하여 이미지 전류 검출로부터의 시간 영역 신호(예: 주파수)를 고분해능 질량 측정치로 변환한다.
바이러스 입자의 조성물을 정제하는 방법
바이러스 입자의 조성물을 정제하는 방법이 또한 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 크로마토그래피 농축 단계(예: 음이온 교환 농축 단계) 및 조성물의 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 상기 논의된 방법 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물의 샘플 내의 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 크로마토그래피 농축 단계(예: AEX 크로마토그래피) 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 크로마토그래피 농축 단계(예: AEX 크로마토그래피) 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 크로마토그래피 농축 단계(예: AEX 크로마토그래피) 전 및 크로마토그래피 농축 단계(예: AEX 크로마토그래피) 후에 수행된다. 일부 경우에, 크로마토그래피 농축 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수행되는 음이온 교환 농축 단계이다.
바이러스 입자의 안정성을 모니터링하는 방법
일정 기간에 걸쳐 바이러스 입자 샘플의 안정성을 모니터링하는 방법이 또한 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 크로마토그래피 농축 단계(예: 음이온 교환 농축 단계), 및 초기 시점(t0) 및 초기 시점 이후 다시 하나 이상의 시점(예를 들어, 수일, 수주, 또는 수개월 후)에 바이러스 입자 샘플 내의 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함한다.
초기 시점에서의 상대적 풍부도와 비교하여 하나 이상의 시점에서의 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도의 변화는 그 기간 동안 바이러스 입자 샘플의 안정성을 나타낸다. 예를 들어, 특정 조건 하에서 일정 기간에 걸쳐 충진된 바이러스 캡시드의 상대적 풍부도의 감소는 평가 기간 동안(즉, t0부터 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도가 다시 결정되는 후기 시점까지) 이러한 특정 조건 하에서 바이러스 입자 샘플의 상대적 안정성을 표시하는 것이다. 일부 경우에, 바이러스 입자 샘플은 특정 조건 하에서 일정 기간 동안 보관된다. 일부 경우에, 특정 조건은 습도 조건(예를 들어, 60% 또는 75% 상대 습도) 및/또는 온도 조건(예를 들어, 0℃, 2 내지 5℃, 15℃, 25℃, 45℃)을 포함한다. 일부 경우에, 명시된 조건은 교반 조건(예를 들어, 30 내지 90분의 기간 동안 궤도 쉐이커 상에서 교반) 및/또는 하나 이상의 동결/해동 주기를 포함한다(또는 추가로 포함한다). 이들 조건은 샘플의 안정성을 모니터링하거나 특성화하기 위해 실제 또는 가속 조건 하에서 바이러스 캡시드 샘플의 안정성을 모니터링하도록 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 크로마토그래피 농축 단계(예: AEX 크로마토그래피) 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 크로마토그래피 농축 단계(예: AEX 크로마토그래피) 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 크로마토그래피 농축 단계(예: AEX 크로마토그래피) 전 및 크로마토그래피 농축 단계(예: AEX 크로마토그래피) 후에 수행된다. 일부 경우에, 크로마토그래피 농축 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수행되는 음이온 교환 농축 단계이다.
실시예
다음 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것으로, 본 발명자들이 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였으나 약간의 실험 오차와 편차는 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부(parts)는 중량 부(parts by weight)이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 1: AAV 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도의 결정.
AAV 스톡 용액 또는 공정 중 샘플의 부분 표본을 -80℃에서 보관하고, 분석 직전에 1:2 내지 1:10의 비율로 물에 희석하였다. 저유속 조건에 적합한 고유 LC-MS 플랫폼 상에서 10 μL/분으로 150 mM의 암모늄 아세테이트의 등용매 용리를 갖는 Waters BEH200 SEC 가드 컬럼(1 x 50 mm)을 사용하여 온라인 고유 탈염 SEC-MS를 수행하였다(도 2 참조). 그런 다음, 생성된 AAV 용리액을 IPA-변형 탈용매화 가스(2 L/분, 질소) 내 0.01%(v/v) TEA를 사용하여 프론트엔드 전하 감소를 시킨 다음, 고 질량 이온의 전달에 최적화된 Orbitrap Q-Exactive UHMR 기기를 사용하여 고유 MS 분석을 수행하였다(도 2 참조).
전하 검출 질량 분광분석(CD-MS) 연구를 통해 빈 AAV 캡시드, 부분 충진된 AAV 캡시드, 및 충진된 AAV 캡시드가 고유 ESI 동안 유사한 전하 수를 갖는다는 것을 알게되었다. 따라서, 고유 m/z 스펙트럼은 이들의 m/z (즉, z가 일정할 때, m/z 질량) 범위의 차이로부터 AAV 캡시드 입자의 분획 조성 및 상대적 풍부도를 직접 해석하는 데 사용될 수 있다. 본 방법에서, 고유 AAV 분석은 통합 탈염 SEC-MS 플랫폼을 사용함으로써 개선되어 온라인 완충액 교환 및 총 분석 시간을 샘플당 10분으로 달성하였다(도 3 참조). 또한, 탈용매화 가스의 변형을 통한 전하 감소는 AAV 캡시드 입자의 스펙트럼 분해능을 향상시켜 정량화를 개선하였다(도 3 참조). 상기 방법은, 샘플 희석을 제한하고 6E+10 캡시드/mL의 낮은 역가를 갖는 AAV 캡시드 물질의 고감도 검출을 용이하게 하기 위해, 저유속 조건(10 μl/분)을 사용하여 수행되었다(도 5a 참조). 상기 방법은 충진된 캡시드 물질의 AEX 농축 전 및 후에 수집된 공정 중 샘플을 모니터링하는 데 적합한 것으로 입증되었다(도 6 참조). 도 8에 도시된 바와 같이, 위에서 논의된 방법을 사용하여 37℃에서 45일의 기간에 걸쳐 보관된 샘플에서 바이러스 캡시드 성분(AAV1 및 AAV8)의 상대적 풍부도를 모니터링하였다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형은 전술된 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 이내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (41)

  1. 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 방법으로서:
    (a) 상기 바이러스 입자 샘플을 온라인 고유 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS) 시스템 내에 도입하는 단계로서, 상기 LC-MS 시스템은 전기분무 이온화 방출기와 유체 연통하는 액체 크로마토그래피 컬럼, 질량 분광분석기, 및 가스 유입구 포트를 포함하는, 단계;
    (b) 상기 액체 크로마토그래피 컬럼을 통해 상기 바이러스 입자 샘플에서 상기 바이러스 캡시드 성분을 분리하는 단계;
    (c) 상기 바이러스 캡시드 성분을 대상으로 질량 분광분석을 수행하기 전에 상기 가스 유입구 포트를 통해 전하 감소제와 상기 바이러스 캡시드 성분을 접촉시키는 단계; 및
    (d) 질량 분광분석을 통해 상기 샘플 내의 바이러스 캡시드 성분의 원시 분획량을 식별하여 상기 바이러스 입자 샘플에서 2개 이상의 온전한 바이러스 캡시드 성분 각각의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 바이러스 입자 샘플은 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV-Rh10, AAV-레트로, AAV-PHP.B, AAV8-PHP.eB, 또는 AAV-PHP.S인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV5 또는 AAV8인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드 성분은 빈 바이러스 캡시드 및 충진된 바이러스 캡시드를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드 성분은 부분 충진된 바이러스 캡시드를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 컬럼은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전하 감소제는 이소프로판올 또는 트리에틸아민인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드 성분은 질소 가스 중에서 상기 전하 감소제와 접촉되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기분무 이온화 방출기는 8개의 노즐을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분광기는 전하 검출 질량 분광기인, 방법.
  12. 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 바이러스 입자 샘플을 대상으로 온라인 고유 전기분무 이온화 질량 분광분석(ESI-MS)을 수행하여 바이러스 캡시드 성분의 원시 분획량을 식별하는 단계로서, 상기 샘플은 고유 ESI-MS 이전에 크로마토그래피에 의해 분리되고 전하 감소제로 처리되는, 단계; 및
    (b) 상기 바이러스 입자 샘플에서 상기 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드 성분은 빈 바이러스 캡시드 및 충진된 바이러스 캡시드를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드 성분은 부분 충진된 바이러스 캡시드를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 입자 샘플은 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV-Rh10, AAV-레트로, AAV-PHP.B, AAV8-PHP.eB, 또는 AAV-PHP.S인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 AAV 입자는 혈청형 AAV1, AAV5 또는 AAV8인, 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 분리는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 사용하여 수행되는, 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전하 감소제는 이소프로판올 또는 트리에틸아민인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 ≤ 1000 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 샘플은 ≤ 500 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 샘플은 ≤ 100 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 샘플은 ≤ 50 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 샘플은 ≤ 10 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 샘플은 약 5 ng의 바이러스 캡시드 성분을 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 1 μg/mL 내지 200 μg/mL인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 100 μg/mL 미만인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 50 μg/mL 미만인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 10 μg/mL 미만인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 5 μg/mL 미만인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 샘플 내 바이러스 캡시드 성분의 농도는 약 1 μg/mL인, 방법.
  32. 바이러스 입자의 조성물을 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 음이온 교환 농축 단계 및 상기 조성물의 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는, 방법.
  33. 일정 기간에 걸쳐 바이러스 입자 샘플의 안정성을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 음이온-교환 농축 단계 및 상기 바이러스 입자 샘플에서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법을 포함하고, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도는 초기 시점에 결정되고, 초기 시점 이후의 하나 이상의 시점에 다시 결정되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 초기 시점에서의 상대적 풍부도와 비교하여 하나 이상의 시점에서의 상기 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도의 변화는 상기 기간 동안 상기 바이러스 입자 샘플의 안정성을 나타내는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 바이러스 입자 샘플은 상기 기간 동안 특정 조건 하에서 보관되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 특정 조건은 습도 조건 및/또는 온도 조건을 포함하는, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 특정 조건은 교반 조건 및/또는 하나 이상의 동결/해동 주기를 포함하는, 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 상기 음이온 교환 농축 단계 전에 수행되는, 방법.
  39. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 상기 음이온 교환 농축 단계 후에 수행되는, 방법.
  40. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 온전한 바이러스 캡시드 성분의 상대적 풍부도를 결정하는 단계는 상기 음이온-교환 농축 단계 전 및 상기 음이온-교환 농축 단계 후에 수행되는, 방법.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 농축 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수행되는, 방법.
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