CN117859060A

CN117859060A - 用于测定病毒颗粒的在线非变性质谱方法

Info

Publication number: CN117859060A
Application number: CN202280054860.6A
Authority: CN
Inventors: V·科萨姆; 王顺海; 李宁
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2022-07-11
Publication date: 2024-04-09

Abstract

本发明公开了用于测定病毒颗粒样品中的病毒衣壳组分的相对丰度的方法。在实施方案中，公开了用于测定腺相关病毒的空衣壳、部分完全衣壳和完全衣壳(例如，含有异源性核酸分子)的相对丰度的方法。

Description

用于测定病毒颗粒的在线非变性质谱方法

技术领域

本发明涉及用于使用在线非变性质谱来进行完全病毒衣壳、部分病毒衣壳和空病毒衣壳(例如，AAV衣壳)的定量测定的方法。

背景技术

腺相关病毒(AAV)代表治疗性基因递送的领先平台，目前市场上有多种FDA批准的基于AAV的疗法，并且有超过250种正在进行临床试验的候选疗法。这类疗法的快速发展对强大的分析方法提出了很高的要求，所述强大的分析方法能够有效地监测产物质量，以确保安全性和有效性以及支持制备和过程开发。

分析超速离心(AUC)是一种广泛用于溶液中的大分子的定量分析的方法。AUC在各种溶剂和各种溶质浓度的生物大分子研究中具有广泛的应用。在沉降速度分析超速离心(SV-AUC)中，溶质在高离心场中的运动可使用定义大分子的大小、形状和相互作用的流体动力学理论来解释。沉降平衡是一种热力学方法，其中通过分析较低离心场处的平衡浓度梯度来定义分子质量、组装化学计量、缔合常数和溶液非理想性。SV-AUC可以用于测定样品的均匀性并且提供溶液中存在的物质的性质的详细图片(Cole等人,Methods Cell Biol.,84:143-179,2008)。

在AAV分析的背景中，SV-AUC被认为是一种最先进的方法，因为它为不同血清型的AAV的分析提供高分离度和广泛适用性(Khasa等人,Molecular Therapy:Methods andClinical Development,21:585-591,2021)。然而，SV-AUC可能很耗时(例如，大约>5小时)，并且需要的样品量在500μL的范围内。因此，仍然需要适合于病毒颗粒的低效价和过程中样品分析的高度灵敏和快速的分析方法。

发明内容

本公开提供了在线非变性质谱(MS)方法，所述在线非变性质谱方法提供完全病毒衣壳、部分病毒衣壳和空病毒衣壳(例如，AAV衣壳)的快速和定量评估。这些方法对衣壳检测具有高灵敏度(LOD≈1μg/mL)，因此适用于低效价和过程中样品。

在一个方面，本公开提供了一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，其中所述方法包括：(a)将所述病毒颗粒样品引入在线非变性液相色谱质谱(LC-MS)系统，其中所述LC-MS系统包括与电喷雾电离发射器流体连通的液相色谱柱、质谱仪和气体入口端口；(b)通过所述液相色谱柱分离所述病毒颗粒样品中的病毒衣壳组分；(c)通过所述气体入口端口使所述病毒衣壳组分与电荷减少剂接触，然后对所述病毒衣壳组分进行质谱分析；以及(d)通过质谱分析来鉴定所述样品中的病毒衣壳组分的原始级分量，以测定所述病毒颗粒样品中的两种或更多种完整病毒衣壳组分中的每种完整病毒衣壳组分的相对丰度。

在一些实施方案中，病毒颗粒样品包含腺相关病毒(AAV)颗粒。在一些情况下，AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。在一些情况下，AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。

在一些实施方案中，病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。在一些实施方案中，病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。

在一些实施方案中，液相色谱柱是尺寸排阻色谱(SEC)柱。

在一些实施方案中，电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。在一些情况下，电荷减少剂包括异丙醇和三乙胺的组合。在一些情况下，使病毒衣壳组分与氮气(例如，脱溶剂气)中的电荷减少剂接触。

在一些实施方案中，电喷雾电离发射器包括八个喷嘴。在一些实施方案中，质谱仪是电荷检测质谱仪。

在一个方面，本公开提供了一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，其中所述方法包括：(a)对所述病毒颗粒样品进行在线非变性电喷雾电离质谱(ESI-MS)，以鉴定病毒衣壳组分的原始级分量，其中对所述样品进行色谱分离并接受电荷减少剂，然后进行非变性ESI-MS；以及(b)测定所述病毒颗粒样品中的所述完整病毒衣壳组分的相对丰度。

在一些实施方案中，使用尺寸排阻色谱(SEC)柱来进行色谱分离。

在一些实施方案中，电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。在一些情况下，电荷减少剂是异丙醇和三乙胺的组合。

在上文或本文讨论的方法中的任一种中，样品样品包含≤1000ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含≤500ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含≤100ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含≤50ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含≤10ng病毒衣壳组分。在一些情况下，样品包含约5ng病毒衣壳组分。

在上文或本文讨论的方法中的任一种中，样品中的病毒衣壳组分的浓度可以为1μg/mL至200μg/mL。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度低于100μg/mL。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度低于50μg/mL。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度低于10μg/mL。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度低于5μg/mL。在一些情况下，样品中的病毒衣壳组分的浓度为约1μg/mL。

在一个方面，本公开提供了一种纯化病毒颗粒的组合物的方法，其中所述方法包括阴离子交换富集步骤和组合物的样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定包括上文或本文讨论的方法。

在一个方面，本公开提供了一种监测病毒颗粒样品在一定时间段内的稳定性的方法，其中所述方法包括阴离子交换富集步骤和病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定包括上文或本文讨论的方法，并且其中完整病毒衣壳组分的相对丰度在初始时间点测定并且在初始时间点之后的一个或多个时间点再次测定。

在稳定性监测方法的一些实施方案中，与在初始时间点的相对丰度相比，在一个或多个时间点的完整病毒衣壳组分的相对丰度的变化指示病毒颗粒样品在所述时间段内的稳定性。在一些情况下，将病毒颗粒样品在指定条件下储存所述时间段。在一些情况下，指定条件包括湿度条件和/或温度条件。在一些情况下，指定条件包括(或另外包括)搅拌条件和/或一个或多个冷冻/解冻循环。

在一些实施方案中，完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在阴离子交换富集步骤之前进行。在一些实施方案中，完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在阴离子交换富集步骤之后进行。在一些实施方案中，完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在阴离子交换富集步骤之前和阴离子交换富集步骤之后进行。在一些情况下，阴离子交换富集步骤使用阴离子交换色谱柱来进行。

在各种实施方案中，上文或本文讨论的实施方案的任何特征或组件可以组合，并且此类组合涵盖在本公开的范围内。上文或本文讨论的任何指定值可以与上文或本文中讨论的另一相关值组合，以列举一个范围，所述值代表该范围的上限和下限，并且此类范围涵盖在本公开的范围内。

通过阅读随后的详细描述，其他实施方案将变得显而易见。

附图说明

图1A、1B和1C示出了包含异源性核酸分子(例如，治疗性基因)的AAV衣壳(图1A)；空、部分完全和完全衣壳(图1B)；以及由60个拷贝的三种病毒蛋白(VP1、VP2和VP3)(产生一系列理论衣壳化学计量)组成的AAV衣壳(图1C)。

图2示出了根据本公开的实施方案的示例性LC-MS系统100，该LC-MS系统包括联接至分流器104的液相色谱柱102(例如SEC柱)，该分流器又联接至微制造的整体式多喷嘴(M3)电喷雾电离发射器106，该微制造的整体式多喷嘴电喷雾电离发射器联接至气体入口端口108和质谱仪110(例如，Orbitrap^TM UHMR)。

图3显示了说明通过图2的液相色谱柱从盐分离AAV衣壳组分的色谱图，以及显示空病毒衣壳和完全病毒衣壳的相对丰度的质谱图。质谱图示出了在质谱分析之前向含有AAV衣壳的样品施加(下)电荷减少剂(例如，0.01％三乙胺/异丙醇)和不施加(上)电荷减少剂所获得的差异。电荷减少改善了AAV衣壳组分的分离度。

图4A和4B显示了各种AAV血清型(AAV1、AAV5和AAV8)的质谱图(图4A)以及相同的AAV血清型的对应SV-AUC数据(图4B)。质谱图显示，本公开的方法产生与各种AAV血清型的SV-AUC数据一致的结果。

图5A和5B显示了通过使不同数量的空衣壳AAV材料进样至本公开的LC-MS系统而产生的质谱图(图5A)以及质谱响应与进样数量之间的相关性(图5B)。这些结果表明，本公开的方法对病毒衣壳材料(例如，AAV衣壳)的检测具有高灵敏度，这使得该方法非常适合于过程中样品监测。

图6示出了病毒衣壳的示例性纯化过程，该过程包括用于完全病毒衣壳而不是空病毒衣壳的富集的阴离子交换(AEX)柱，并且显示了对应于在AEX富集之前和在AEX富集之后进行的测量的质谱图。

图7A和7B显示了通过将不同的空AAV衣壳:完全AAV衣壳比率引入本公开的LC-MS系统而产生的质谱图(图7A)以及已知的SV-AUC数据与从质谱图获得的测量的衣壳组分的百分比之间的相关性(图7B)。如图7B所示，测量的MS数据与已知的SV-AUC数据之间的相关性良好。

图8示出了通过采用本公开的测定技术而产生的示例性结果，由此监测热应激后衣壳稳定性的变化。

具体实施方式

在描述本发明前，应当理解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而无意进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指所述值可以从列举的值变动不大于1％。举例来说，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及它们之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“包括(include、includes和including)”旨在作为非限制性的，并且可被理解为分别意指“包含(comprise、comprises和comprising)”。

尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实践或检验，但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物全文以引用的方式并入本文中。

选定的缩写

MS：质谱

rAAV：重组AAV颗粒或衣壳

AAV：腺相关病毒

LC：液相色谱

SEC：尺寸排阻色谱

ESI：电喷雾电离

SV-AUC：沉降速度分析超速离心

AEX–阴离子交换色谱

定义

“完整病毒衣壳组分”是指完整(即，尚未变性或者分解或崩解为它们组成部分(例如，不同的病毒蛋白)并且保留病毒衣壳的结构特征(例如，AAV衣壳的二十面体构象))的病毒衣壳(例如，空病毒衣壳、部分完全病毒衣壳和/或完全病毒衣壳)。

术语“空病毒衣壳”或“空衣壳”是指不含有异源性核酸分子(例如，治疗性基因)的衣壳，如图1B所示。

术语“部分完全病毒衣壳”或“部分完全衣壳”是指仅含有异源性核酸分子(例如，治疗性基因)的一部分的衣壳，如图1B所示。

术语“完全病毒衣壳”或“完全衣壳”是指含有全部异源性核酸分子(例如，治疗性基因)的衣壳，如图1B所示。

如本文所用，术语“样品”是指病毒颗粒(例如，AAV颗粒)的混合物，所述病毒颗粒包含至少一种病毒衣壳组分(即，空衣壳、部分完全衣壳和/或完整衣壳)，所述病毒衣壳组分根据本发明的方法(包括例如分离和分析)进行操纵。

术语“分析(analysis)”或“分析(analyzing)”可互换使用，并且是指分离、检测、隔离、纯化和/或表征所关注的病毒颗粒(例如，AAV衣壳)的各种方法中的任一种。实例包括但不限于质谱(例如，ESI-MS)、液相色谱(例如，尺寸排阻色谱)以及它们的组合。

如本文所用，“接触”包括将溶液或固相中的至少两种物质放置在一起，例如使色谱材料的固定相与样品(诸如包含病毒颗粒样品)接触。

如本文所用，“完整质量分析”包括其中病毒颗粒被表征为完整颗粒的实验。完整质量分析可以将样品制备减少到最低限度。

如本文所用，术语“液相色谱”是指其中由液体携带的化学混合物可以由于化学实体在静止液相或固相周围或上方流动时的差异分布而被分离成组分的过程。液相色谱的非限制性实例包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱和疏水色谱。

如本文所用，术语“质谱仪”是指能够检测特定分子物质并且准确测量它们的质量的装置。该术语可以意味着包括这样的任何分子检测器：病毒颗粒(例如，AAV衣壳)可以被洗脱到其中以进行检测和/或表征。质谱仪由三个主要部分组成：离子源、质量分析仪和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转换为气相或同步电离(如电喷雾电离)。离子源的选择取决于应用。如本文所用，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指喷雾电离的过程，其中溶液中的阳离子或阴离子通过在高带电液滴流的大气压处形成和去溶剂化而转换为气相，所述高带电液滴流通过在含有溶液的电喷雾发射器针的尖端和对电极之间施加电势差而产生。从溶液中的电解质离子产生气相离子的过程分为三个主要步骤。这些步骤是：(a)在ES输注尖端处产生带电液滴；(b)由于溶剂蒸发和重复的液滴分裂而导致带电液滴收缩，从而产生小的高带电液滴，这些小的高带电液滴能够产生气相离子；以及(c)从非常小且高带电液滴产生气相离子的机制。阶段(a)-(c)通常发生在设备的大气压区域。

如本文所用，术语“电喷雾电离源”是指可以与用于病毒颗粒的质量分析的质谱仪兼容的电喷雾电离系统。

非变性MS是一种基于电喷雾电离的特别方法，其中生物分析物从非变性溶剂中喷洒出来。它被定义为通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)的过程使生物分子(诸如大生物分子)以及它们的复合物可以从凝聚液相的三维功能性存在转换为气相的过程。

如本文所用，术语“纳电喷雾”或“纳喷雾”是指以非常低的溶剂流速(通常样品溶液每分钟数百纳升或更低，通常不使用外部溶剂输送)进行的电喷雾电离。

如本文所用，“质量分析仪”是指可以根据物质(即原子、分子或簇)的质量来分离物质的装置。可用于快速蛋白质测序的质量分析仪的非限制性实例是飞行时间(TOF)、磁/电扇区、四极杆质量过滤器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)以及加速器质谱(AMS)技术。

如本文所用，“质荷比”或“m/z”用于表示通过将统一原子质量单位的离子的质量除以其电荷数而形成的无量纲量(无论符号如何)。一般而言，空AAV衣壳、部分完全AAV衣壳和完全AAV衣壳在非变性ESI期间具有相似的电荷数，以使得非变性m/z谱可以用于根据m/z范围和相对丰度的差异直接解释样品中的AAV衣壳组分的级分组成。

如本文所用，术语“四极杆-轨道阱混合质谱仪”是指通过将四极杆质谱仪耦合到轨道阱质量分析仪而制成的混合系统。使用四极杆-轨道阱混合质谱仪进行的串联实时实验首先从四极杆质谱仪中喷射除选定的窄m/z范围内的离子之外的所有离子。选定的离子可以被插入轨道阱中，并且最常通过低能CID来进行片段化。阱的m/z接受范围内的片段应保留在阱中，并且可以获得MS-MS谱。

“腺相关病毒”或“AAV”是一种非致病性细小病毒，具有单链DNA，基因组为大约4.7kb，无包膜，具有二十面体构象。AAV于1965年首次作为腺病毒制备物的污染物被发现。AAV属于依赖性病毒属和细小病毒科，需要疱疹病毒或腺病毒的辅助功能才能复制。在没有辅助病毒的情况下，AAV可以通过整合进人19号染色体的19q13.4位置来设置潜伏期。AAV基因组由两个开放阅读框(ORF)组成，一个开放阅读框对应于两个AAV基因Rep和Cap中的每个。AAV DNA末端具有145bp的反向末端重复序列(ITR)，并且125个末端碱基是回文的，产生特征性的T形发夹结构。

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。核酸的主链可以包含糖和磷酸基团(如可以通常存在于RNA或DNA中)，或者经修饰的或取代的糖或磷酸基团。

“重组病毒颗粒”是指包含一个或多个异源性序列(例如，非病毒来源的核酸序列)的病毒颗粒，该序列可以侧接至少一个病毒核苷酸序列。

“重组AAV颗粒”是指包含一个或多个异源性序列(例如，非AAV来源的核酸序列)的腺相关病毒颗粒，该序列可以侧接至少一个(例如，两个)AAV反向末端重复序列(ITR)。当这种rAAV颗粒存在于已经感染有合适的辅助病毒(或表达合适的辅助功能)并且表达AAV rep和cap基因产物(即，AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，可以复制和包装。

“病毒颗粒”是指由至少一种病毒衣壳蛋白和包封的病毒基因组组成的病毒颗粒。

“异源性”意指衍生自与所比较或所引入或掺入的实体的其余部分相比在基因型上不同的实体。例如，通过基因工程技术引入不同细胞类型的核酸是异源性核酸(并且当表达时可以编码异源性多肽)。类似地，掺入病毒颗粒中的细胞序列(例如，基因或其部分)是关于病毒颗粒的异源性核苷酸序列。

“反向末端重复序列”或“ITR”序列是处于相反取向的存在于病毒基因组的末端的相对较短的序列。“AAV反向末端重复(ITR)”序列是存在于单链AAV基因组的两个末端的大约145个核苷酸的序列。

一般说明

本公开提供了在线色谱和非变性质谱(MS)方法，所述方法提供病毒颗粒(例如，AAV颗粒)的样品的病毒衣壳组分(例如，完全衣壳、部分完全衣壳和空衣壳)的灵敏且快速的定量表征，以及采用此类分析技术的纯化方法。病毒颗粒组合物的病毒衣壳成分(诸如AAV颗粒的样品的病毒衣壳组分)的完全表征对于确保产物质量和一致性以维持组合物的安全性和功效是必要的。

重组病毒载体组合物(例如，AAV载体组合物)可以含有由不同的产生、纯化和储存条件产生的不同水平的完全衣壳、部分衣壳和空衣壳。然而，由病毒蛋白化学计量的变化和异源性核酸材料含量的变化产生的高质量不均匀性，以及低样品浓度，使得此类样品的传统完整质谱法具有挑战性。本发明方法通过限制样品稀释度(例如，通过低流速要求)，通过提供快速在线脱盐(以维持样品稳定性)，以及通过提供电荷减少(以改善病毒颗粒物质(例如，AAV衣壳)的分离度)来解决这些问题。

用于测定完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法

本公开的方面涉及用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法。

在一些情况下，所述方法包括：(a)将所述病毒颗粒样品引入在线非变性液相色谱质谱(LC-MS)系统，其中所述LC-MS系统包括与电喷雾电离发射器流体连通的液相色谱柱、质谱仪和气体入口端口；(b)通过所述液相色谱柱分离所述病毒颗粒样品中的病毒衣壳组分；(c)通过所述气体入口端口使所述病毒衣壳组分与电荷减少剂接触，然后对所述病毒衣壳组分进行质谱分析；(d)通过质谱分析来鉴定所述样品中的病毒衣壳组分的原始级分量；以及(e)将校正系数应用于所述病毒衣壳组分的所述原始级分量并且鉴定所述病毒衣壳组分的校正级分量从而测定所述病毒颗粒样品中的两种或更多种完整病毒衣壳组分中的每种完整病毒衣壳组分的相对丰度，其中所述校正系数通过以下步骤来预先确定：使参考标准进行所述在线非变性LC-MS系统并且鉴定所述参考标准中的标准病毒衣壳组分的级分量，并且将所述标准病毒衣壳组分的级分量与所述标准病毒衣壳组分的已知级分量进行比较，如通过沉降速度分析超速离心(SV-AUC)所测定。

在一些情况下，所述方法包括：(a)对所述病毒颗粒样品进行在线非变性电喷雾电离质谱(ESI-MS)，以鉴定病毒衣壳组分的原始级分量，其中对所述样品进行色谱分离并接受电荷减少剂，然后进行非变性ESI-MS；以及(b)将校正系数应用于所述病毒衣壳组分的所述原始级分量并且鉴定所述病毒衣壳组分的校正级分量从而测定所述病毒颗粒样品中的所述完整病毒衣壳组分的相对丰度，其中所述校正系数通过以下步骤来预先确定：使参考标准进行所述在线非变性ESI-MS并且鉴定所述参考标准中的标准病毒衣壳组分的级分量，并且将所述标准病毒衣壳组分的级分量与所述标准病毒衣壳组分的已知级分量进行比较，如通过沉降速度分析超速离心(SV-AUC)所测定。

在所述方法的各种实施方案中，病毒衣壳组分包括空病毒衣壳和完全病毒衣壳，并且空病毒衣壳的校正级分量和完全病毒衣壳的校正级分量得以鉴定。在一些情况下，病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳，并且部分完全病毒衣壳的校正级分量得以鉴定。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于鉴定重组病毒颗粒(例如，AAV颗粒)的样品中的空病毒衣壳、部分完全病毒衣壳和完全病毒衣壳的相对丰度。

在本文公开的方法中，LC-MS系统通过图2所示的示意图来示例。在图2所示的实例中，LC-MS系统100包括液相色谱柱102(例如，1mm内径×50mm SEC柱)，其中病毒颗粒样品以例如10μL/min的流速引入液相色谱柱中，以使样品的病毒衣壳组分彼此分离以及与可能存在于样品中的任何杂质(例如，盐)分离。然后使分离的组分以例如5μL/min的流速通过分离器104并且进入电喷雾电离发射器106。ESI发射器106联接至气体入口端口108，在质谱仪110(例如，Orbitrap^TM UHMR质谱仪)中进行质谱分析之前，经改性的脱溶剂气(例如，用电荷减少剂(“改性剂”)诸如三乙胺/异丙醇改性的氮气)通过该气体入口端口接触样品。

在本文讨论的各种方法中，样品的质谱分析产生显示病毒颗粒样品的病毒衣壳组分的相对丰度的质谱图，该病毒衣壳组分基于衣壳中含有的异源性核酸分子的含量按质量进行分离。如所理解，完全衣壳(含有完全异源性核酸分子)的质量大于部分完全衣壳(仅含有异源性核酸分子的一部分)的质量，部分完全衣壳的质量又大于空衣壳(不含异源性核酸分子)的质量。鉴于衣壳的病毒蛋白的化学计量变化(例如，图1C)，样品的质谱分析产生的质谱图可以含有代表样品中的病毒衣壳组分中的每种的宽峰。

病毒颗粒

在某些方面，病毒颗粒是AAV颗粒，并且所公开的方法可以用于测定AAV颗粒的样品中的病毒衣壳组分的相对丰度。AAV颗粒可以是重组AAV(rAAV)颗粒。rAAV颗粒包含编码异源性转基因或异源性核酸分子的AAV载体。

在某些方面，AAV颗粒包含AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAV11衣壳、AAV12衣壳或它们的变体。在某些方面，AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。在一些实施方案中，AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。

虽然AAV是本公开的模式病毒颗粒，但是预期所公开的方法可以应用于表征多种病毒，例如病毒科、亚科和属。本公开的方法可以用于例如表征病毒颗粒，以监测或检测在病毒颗粒的组合物的产生、纯化或储存期间此类组合物中的病毒衣壳组分的相对丰度。

在示例性实施方案中，病毒颗粒属于选自由以下各项组成的组的病毒科：腺病毒科(Adenoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)。

在某些方面，病毒颗粒属于选自由以下各项组成的组的病毒属：鸟腺病毒属(Atadenovirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、鱼腺病毒属(Ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)、双义浓核病毒属(Ambidensovirus)、短浓核病毒属(Brevidensovirus)、肝胰浓核病毒属(Hepandensovirus)、伊特拉浓核病毒属(Iteradensovirus)、对虾浓核病毒属(Penstyldensovirus)、阿多细小病毒属(Amdoparvovirus)、鸟细小病毒属(Aveparvovirus)、博卡细小病毒属(Bocaparvovirus)、科比细小病毒属(Copiparvovirus)、依赖性细小病毒属(Dependoparvovirus)、红细小病毒属(Erythroparvovirus)、原细小病毒属(Protoparvovirus)、四细小病毒属(Tetraparvovirus)、α逆转录病毒属(Alpharetrovirus)、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)、ε逆转录病毒属(Epsilonretrovirus)、γ逆转录病毒属(Gammaretrovirus)、慢病毒属(Lentivirus)、泡沫病毒属(Spumavirus)、甲型杆状病毒属(Alphabaculovirus)、乙型杆状病毒属(Betabaculovirus)、丁型杆状病毒属(Deltabaculovirus)、丙型杆状病毒属(Gammabaculovirus)、传染性喉气管炎病毒属(Iltovirus)、马立克病毒属(Mardivirus)、单纯疱疹病毒属(Simplexvirus)、水痘病毒属(Varicellovirus)、巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)、鼠巨细胞病毒属(Muromegalovirus)、长鼻动物病毒属(Proboscivirus)、玫瑰疹病毒属(Roseolovirus)、淋巴潜隐病毒属(Lymphocryptovirus)、玛卡病毒属(Macavirus)、马疱疹病毒属(Percavirus)和蛛猴病毒属(Rhadinovirus)。

在某些方面，逆转录病毒科是莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人T细胞白血病病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)、梅迪-维斯纳病毒；山羊关节炎-脑炎病毒；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。

在一些方面，病毒颗粒(例如，AAV颗粒)含有异源性核酸分子(例如，治疗性基因)。在一些方面，异源性核酸分子可操作地连接至启动子。示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和CK6启动子，转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子和延伸因子1-α启动子(EF1-α)启动子。在一些方面，启动子包括连接至鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的人β-葡萄糖醛酸酶启动子或巨细胞病毒增强子。启动子可以是组成型、诱导型或阻遏型启动子。在一些方面，本发明提供了重组载体，所述重组载体包含可操作地连接至CBA启动子的编码本公开的异源性转基因的核酸。在一些情况下，将使用转基因的天然启动子或其片段。当需要转基因的表达模拟天然表达时，可以使用天然启动子。当转基因的表达必须在时间上或发育上、或以组织特异性方式、或响应于特定转录刺激而调节时，可以使用天然启动子。在另一个方面，其他天然表达控制元件(诸如增强子元件、多腺苷酸化位点或Kozak共有序列)也可以用于模拟天然表达。

在线非变性液相色谱质谱(LC-MS)系统

在一些示例性实施方案中，所述方法包括使病毒颗粒进行液相色谱/质谱(LC/MS)。如本领域所已知，LC/MS利用液相色谱来对离子进行物理分离，并且利用质谱来从离子生成质谱数据。此类质谱数据可以用于确定例如分子量或结构，通过质量、数量、纯度等等来鉴定颗粒。这些数据可以代表所检测的离子的性质，诸如随时间(例如，保留时间)推移的信号强度(例如，丰度)，或者相对丰度与质荷比。图2所示的示例性LC-MS系统可以用于测定病毒颗粒样品中的病毒衣壳组分的相对丰度。然而，对所示的示例性系统的修改也可以用于测定完整病毒衣壳组分的相对丰度。

液相色谱柱102的非限制性实例包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、亲水相互作用色谱和疏水色谱。液相色谱(包括HPLC)可以用于分离病毒颗粒样品的组分。

在各种实施方案中，柱温可以在整个色谱运行期间维持在恒定温度。具体而言，柱温维持在环境室温(即，约23-25℃)处。在一些实施方案中，将柱维持在约22℃至约28℃的范围内的温度处。在一些实施方案中，将柱维持在约23℃至约27℃的范围内的温度处。在一些实施方案中，将柱维持在约24℃±1℃至约26℃±1℃的范围内的温度处。在一些情况下，将柱温维持在约22℃至约26℃的范围内。在一些情况下，将柱维持在22℃、22.5℃、23℃、23.5℃、24℃、24.5℃、25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、27.5℃或28℃的温度处。在一些实施方案中，使用商业化柱加热器来维持温度。在一些实施方案中，温度是环境室温(不使用柱加热器)。

在一些实施方案中，LC分析包括与非变性质谱系统流体连通的尺寸排阻色谱(SEC)柱。在各种实施方案中，LC分析可以如本领域已知的那样进行，但值得注意的是，阴离子交换柱的使用可能导致部分完全衣壳和完全衣壳之间的分离度降低。柱适合于与病毒颗粒一起使用。在一个实施方案中，SEC柱是WatersSEC色谱柱(1×50mm)。

柱(诸如SEC)通过分析性分流器104与质谱仪流体连通，该分析性分流器可以调节通向质谱仪的流速。

在一些实施方案中，流动相是水性流动相。在一些实施方案中，流动相是含有乙酸铵的水性盐缓冲液。在一些实施方案中，采用等度洗脱(例如，在整个运行期间维持恒定的缓冲液组合物)。在示例性实施方案中，用于洗脱蛋白质的流动相是与质谱仪兼容的流动相。可以使用缓冲液的梯度，例如，如果使用两种缓冲液，则在色谱运行过程中第一缓冲液的浓度或百分比可以降低，而第二缓冲液的浓度或百分比增加。例如，在色谱运行过程中，第一缓冲液的百分比可以为从约100％、约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约50％、约45％或约40％减少至约0％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％。又如，在同一运行过程中，第二缓冲液的百分比可以从约0％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％增加至约100％、约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约50％、约45％或约40％。在某些方面，色谱中的流动相A的比例随时间推移而增加。任选地，第一缓冲液和第二缓冲液的浓度或百分比可以在色谱运行结束时返回到它们的起始值。百分比可以以线性梯度或以非线性(例如，逐步)方式逐渐变化。例如，梯度可以是多相的，例如双相的、三相的等。

在一些示例性实施方案中，流动相可以具有约0.1μL/min至约100μL/min的通过液相色谱柱的流速。在一些情况下，流速为约0.5μL/min、约1μL/min、约1.5μL/min、约2μL/min、约2.5μL/min、约3μL/min、约3.5μL/min、约4μL/min、约4.5μL/min、约5μL/min、约5.5μL/min、约6μL/min、约6.5μL/min、约7μL/min、约7.5μL/min、约8μL/min、约8.5μL/min、约9μL/min、约9.5μL/min、约10μL/min、约10.5μL/min、约11μL/min、约11.5μL/min、约12μL/min、约12.5μL/min、约13μL/min、约13.5μL/min、约14μL/min、约14.5μL/min、约15μL/min、约15.5μL/min、约16μL/min、约16.5μL/min、约17μL/min、约17.5μL/min、约18μL/min、约18.5μL/min、约19μL/min、约19.5μL/min、约20μL/min、约25μL/min、约30μL/min、约35μL/min、约40μL/min、约45μL/min、约50μL/min、约75μL/min或约100μL/min。在一些情况下，流速为10μL/min。

在一些方面，质谱(例如，在如本文所述的LC/MS中使用)可以指电喷雾电离质谱(ESI-MS)。ESI-MS在本领域中被认为是一种使用电能来通过质谱分析来源于溶液的离子的技术。离子物质(包括在溶液或气相中电离的中性物质)通过分散在带电液滴的气溶胶中而从溶液转换为气相。随后，进行溶剂蒸发以减小带电液滴的大小。然后，当溶液以相对于接地的电压通过小毛细管时，样品离子从带电液滴中喷射出来。例如，周围ESI室的壁是通过以下方式来进行：将样品与挥发性酸和有机溶剂混合并使其通过带有高压的导电针来输注。从针端喷洒(或喷射)的带电液滴被引导至质谱仪中，并且在飞入时通过热量和真空而干燥。在液滴干燥后，其余的带电分子被电磁透镜引导至质量检测器中并进行质量分析。在一个方面，洗脱的样品直接从毛细管沉积到电喷嘴中，例如，毛细管充当样品装载器。在另一个方面，毛细管本身既充当提取装置又充当电喷嘴。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离发射器108包括多个发射器喷嘴，诸如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个发射器喷嘴，诸如两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个发射器喷嘴。在一些示例性实施方案中，电喷雾电离发射器108是来自Newomics(Berkeley,CA)的M3发射器，它包括8个发射器喷嘴。

在一些示例性实施方案中，使用其他电离模式，例如涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、SELDI-MS和MALDI-MS。一般而言，这些方法(如ESI-MS)的优点是它们可以“及时”纯化样品并且将样品直接引入电离环境。值得注意的是，各种电离和检测模式对所用的解吸溶液的性质产生了各自的限制，并且重要的是解吸溶液与二者兼容。例如，很多应用中的样品基质必须具有低离子强度，或位于特定的pH范围内等。在ESI中，样品中的盐可以降低电离或堵塞喷嘴，从而妨碍检测。该问题可以通过提供低盐形式的分析物和/或通过使用挥发性盐来解决。就MALDI而言，分析物应处于与靶标的点样和所用的电离基质兼容的溶剂中。

在一些示例性实施方案中，经改性的脱溶剂气(例如，氮气)可以通过气体入口端口108引入，以在质谱分析之前接触样品。在各种实施方案中，改性剂包括至少一种有机溶剂和碱。有机溶剂的非限制性实例包括乙腈、丙醇、异丙醇、水和甲醇。碱的非限制性实例包括氨、二乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)和哌啶。在一些示例性实施方案中，改性剂是三乙胺/异丙醇。

在一些示例性实施方案中，电喷雾电离源提供溶剂流速为约1μL/min至约20μL/min的电喷雾。在多个实施方案中，进入ESI发射器的流速为约1μL/min、约2μL/min、约3μL/min、约4μL/min、约5μL/min、约6μL/min、约7μL/min、约8μL/min、约9μL/min、约10μL/min、约11μL/min、约12μL/min、约13μL/min、约14μL/min、约15μL/min、约16μL/min、约17μL/min、约18μL/min、约19μL/min或约20μL/min。

非变性质谱仪可以是非变性ESI质谱系统。在一些示例性实施方案中，质谱仪110可以是四极杆-轨道阱混合质谱仪。四极杆-轨道阱混合质谱仪可以是Q Exactive^TMFocus混合Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪、QExactive^TMPlus混合Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪、QExactive^TMBioPharma平台、Q Exactive^TMUHMR混合Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪、QExactive^TMHF混合Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪、Q Exactive^TMHF-X混合Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪和Q Exactive^TM混合Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪。在一些示例性实施方案中，质谱系统是Thermo Exactive EMR质谱仪。质谱系统还可以包括紫外光检测器。

适用于LC/MS的多种质量分析仪是本领域已知的，包括但不限于飞行时间(TOF)分析仪、四极杆质量过滤器、四极杆TOF(QTOF)和离子阱(例如，基于傅里叶变换的质谱仪或轨道阱)。在轨道阱中，使用处于接地电势的桶状外电极和纺锤状中心电极来捕获处于围绕中心电极椭圆旋转并且沿着中心轴线振荡的轨迹中，并且受到离心力和静电力的平衡的限制的离子。此类仪器的使用采用傅立叶变换运算来转换从图像电流的检测到高分离度质量测量的时域信号(例如，频率)。

纯化病毒颗粒的组合物的方法

还提供了纯化病毒颗粒的组合物的方法。在一些方面，所述方法包括色谱富集步骤(例如，阴离子交换富集步骤)和组合物的样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定包括上文讨论的方法中的任一种。

在一些实施方案中，组合物的样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在色谱富集步骤(例如，AEX色谱)之前进行。在一些实施方案中，完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在色谱富集步骤(例如，AEX色谱)之后进行。在一些实施方案中，完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在色谱富集步骤(例如，AEX色谱)之前和色谱富集步骤(例如，AEX色谱)之后进行。在一些情况下，色谱富集步骤是使用阴离子交换色谱柱进行的阴离子交换富集步骤。

监测病毒颗粒的稳定性的方法

还提供了监测病毒颗粒样品在一定时间段内的稳定性的方法。在一些方面，所述方法包括色谱富集步骤(例如，阴离子交换富集步骤)，以及在初始时间点(t0)进行和在初始时间点之后的一个或多个时间点(例如，其后几天、几周或几个月)再次进行的病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定。

与在初始时间点的相对丰度相比，在一个或多个时间点的完整病毒衣壳组分的相对丰度的变化指示病毒颗粒样品在所述时间段内的稳定性。例如，在指定条件下一定时间段内完全病毒衣壳的相对丰度的减少表明了在评估期间(即，从t0至再次测定病毒衣壳组分的相对丰度的较晚时间点)病毒颗粒样品在此类指定条件下的相对稳定性。在一些情况下，将病毒颗粒样品在指定条件下储存所述时间段。在一些情况下，指定条件包括湿度条件(例如，60％或75％相对湿度)和/或温度条件(例如，0℃、2-5℃、15℃、25℃、45℃)。在一些情况下，指定条件包括(或另外包括)搅拌条件(例如，在回旋振荡器上搅拌30-90分钟)和/或一个或多个冷冻/解冻循环。可以选择这些条件来监测病毒衣壳样品在现实世界或加速条件下的稳定性，以监测或表征样品的稳定性。

在一些实施方案中，病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在色谱富集步骤(例如，AEX色谱)之前进行。在一些实施方案中，完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在色谱富集步骤(例如，AEX色谱)之后进行。在一些实施方案中，完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定在色谱富集步骤(例如，AEX色谱)之前和色谱富集步骤(例如，AEX色谱)之后进行。在一些情况下，色谱富集步骤是使用阴离子交换色谱柱进行的阴离子交换富集步骤。

实施例

提供以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，而非旨在限制发明人认为是其发明的范围。已努力确保有关所用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑某些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是按摄氏度计并且压力是大气压或接近大气压。

实施例1：AAV颗粒的样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定。

将AAV储液或过程中样品的等分试样储存在-80℃处，并且在分析之前用水以1:2至1:10稀释。使用Waters BEH200 SEC保护柱(1×50mm)来进行在线非变性脱盐SEC-MS，在适合低流量条件的非变性LC-MS平台上采用150mM乙酸铵以10μL/min进行等度洗脱(参见图2)。然后，使用0.01％(v/v)TEA/IPA改性的脱溶剂气(2L/min，氮气)对所得的AAV洗脱液进行前端电荷减少，然后使用针对高质量离子的传输进行优化的Orbitrap Q-Exactive UHMR仪器来进行非变性MS分析(参见图2)。

电荷检测质谱(CD-MS)研究显示，空AAV衣壳、部分AAV衣壳和完全AAV衣壳在非变性ESI期间具有相似数量的电荷。因此，非变性m/z谱可以用于根据它们的m/z范围(即，m/z质量，当z为常数时)和相对丰度的差异直接解释AAV衣壳颗粒的级分组成。在本发明方法中，非变性AAV分析通过使用集成脱盐SEC-MS平台而得以改善，以实现在线缓冲液交换和10分钟/样品的总分析时间(参见图3)。此外，通过脱溶剂气的改性产生的电荷减少增强了AAV衣壳颗粒的光谱分离度，从而改善了定量(参见图3)。所述方法使用低流量条件(10μL/min)来进行，以限制样品稀释度并且促进效价低至6E+10个衣壳/mL的AAV衣壳材料的灵敏性检测(参见图5A)。事实证明，所述方法适合于监测在完全衣壳材料的AEX富集之前和之后收集的过程中样品(参见图6)。上文讨论的方法用于监测在37℃处储存45天的样品中的病毒衣壳组分(AAV1和AAV8)的相对丰度，如图8所示。

本发明的范围不受本文所述的具体实施方案限制。事实上，除本文所述的那些之外，本发明的各种修改根据前文描述书对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落在所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，所述方法包括：

(a)将病毒颗粒样品引入在线非变性液相色谱质谱(LC-MS)系统，其中所述LC-MS系统包括与电喷雾电离发射器、质谱仪和气体入口端口流体连通的液相色谱柱；

(b)通过所述液相色谱柱分离所述病毒颗粒样品中的病毒衣壳组分；

(c)通过所述气体入口端口使所述病毒衣壳组分与电荷减少剂接触，然后对所述病毒衣壳组分进行质谱分析；以及

(d)通过质谱分析来鉴定所述样品中的病毒衣壳组分的原始级分量，以测定所述病毒颗粒样品中的两种或更多种完整病毒衣壳组分中的每种完整病毒衣壳组分的相对丰度。

2.如权利要求1所述的方法，其中病毒颗粒样品包含腺相关病毒(AAV)颗粒。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述液相色谱柱是尺寸排阻色谱(SEC)柱。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述病毒衣壳组分在氮气中与所述电荷减少剂接触。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述电喷雾电离发射器包括八个喷嘴。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述质谱仪是电荷检测质谱仪。

12.一种用于测定包含异源性核酸分子的重组病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的方法，所述方法包括：

(a)对所述病毒颗粒样品进行在线非变性电喷雾电离质谱(ESI-MS)，以鉴定病毒衣壳组分的原始级分量，其中对所述样品进行色谱分离并接受电荷减少剂，然后进行非变性ESI-MS；以及

(b)测定所述病毒颗粒样品中的所述完整病毒衣壳组分的相对丰度。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述病毒衣壳组分包含空病毒衣壳和完全病毒衣壳。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述病毒衣壳组分还包含部分完全病毒衣壳。

15.如权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒样品包含腺相关病毒(AAV)颗粒。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述AAV颗粒具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。

18.如权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述色谱分离使用尺寸排阻色谱(SEC)柱来进行。

19.如权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述电荷减少剂是异丙醇或三乙胺。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述样品包含≤1000ng病毒衣壳组分。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述样品包含≤500ng病毒衣壳组分。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述样品包含≤100ng病毒衣壳组分。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述样品包含≤50ng病毒衣壳组分。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述样品包含≤10ng病毒衣壳组分。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述样品包含约5ng病毒衣壳组分。

26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度为1μg/mL至200μg/mL。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度低于100μg/mL。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度低于50μg/mL。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度低于10μg/mL。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度低于5μg/mL。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述样品中的所述病毒衣壳组分的浓度为约1μg/mL。

32.一种纯化病毒颗粒的组合物的方法，其中所述方法包括阴离子交换富集步骤和所述组合物的样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度的所述测定包括如权利要求1至31中任一项所述的方法。

33.一种监测病毒颗粒样品在一定时间段内的稳定性的方法，其中所述方法包括阴离子交换富集步骤和所述病毒颗粒样品中的完整病毒衣壳组分的相对丰度的测定，其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度的所述测定包括如权利要求1至31中任一项所述的方法，并且其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度在初始时间点测定并且在所述初始时间点之后的一个或多个时间点再次测定。

34.如权利要求33所述的方法，其中与在所述初始时间点的相对丰度相比，在所述一个或多个时间点的所述完整病毒衣壳组分的相对丰度的变化指示所述病毒颗粒样品在所述时间段内的稳定性。

35.如权利要求33或34所述的方法，其中将所述病毒颗粒样品在指定条件下储存所述时间段。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述指定条件包括湿度条件和/或温度条件。

37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述指定条件包括搅拌条件和/或一个或多个冷冻/解冻循环。

38.如权利要求32至37中任一项所述的方法，其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度的所述测定在所述阴离子交换富集步骤之前进行。

39.如权利要求32至37中任一项所述的方法，其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度的所述测定在所述阴离子交换富集步骤之后进行。

40.如权利要求32至37中任一项所述的方法，其中所述完整病毒衣壳组分的相对丰度的所述测定在所述阴离子交换富集步骤之前和所述阴离子交换富集步骤之后进行。

41.如权利要求32至40中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换富集步骤使用阴离子交换色谱柱来进行。