TW202321691A - 用於分析病毒粒子之線上原生質譜方法 - Google Patents

Abstract

揭示用於測定病毒粒子之樣品中病毒衣殼組分之相對豐度的方法。在實施例中，揭示用於測定腺相關病毒之空衣殼、部分完全衣殼及完全衣殼（例如，含有異源核酸分子）之相對豐度的方法。

Description

用於分析病毒粒子之線上原生質譜方法

本發明係關於使用線上原生質譜分析定量測定完全、部分及空病毒衣殼（例如，AAV衣殼）的方法。

腺相關病毒（AAV）表示治療性基因遞送之主要平台，其具有多個當前市場上之FDA核准通過之基於AAV之療法及超過250個經歷臨床試驗之候選者。此類治療劑之快節奏的發展對能夠有效監測產物品質以確保安全性及功效以及支持製造及製程開發之穩固分析方法提出了較高要求。

分析型超速離心（AUC）為用於在溶液中對大分子進行定量分析的廣泛使用方法。AUC具有用於研究大範圍溶劑中之生物大分子及廣泛範圍之溶質濃度的廣泛應用。在沈降速度分析型超速離心（SV-AUC）中，使用流體動力學理論解釋溶質在高離心場中之移動以界定大分子之尺寸、形狀及相互作用。沈降平衡為熱力學方法，其中分析較低離心場下之平衡濃度梯度以界定分子質量、組裝化學計量、締合常數及溶液非理想性。SV-AUC可用於測定樣品之均質性且提供存在於溶液中之物質之性質的詳細圖片（Cole等人 ., 《細胞生物學方法（ Methods Cell Biol. ）》, 84:143-179, 2008）。

在AAV分析之情形下，SV-AUC被視為最先進方法，因為其提供用於分析不同血清型之AAV的高解析度及廣泛適用性（Khasa等人, 《分子療法：方法及臨床發展（ Molecular Therapy: Methods and Clinical Development）》, 21:585-591, 2021）。然而，SV-AUC可為耗時的（例如，約＞5小時），且需要500 µL範圍內之樣品尺寸。因此，仍需要能夠對病毒粒子進行較低效價及工序內樣品分析之高度敏感及快速分析方法。

本揭示案提供線上原生質譜分析（MS）方法，其提供完全、部分及空病毒衣殼（例如，AAV衣殼）之快速及定量評估。此等方法對衣殼偵測（LOD ≈ 1 µg/mL）高度敏感，使得其適用於較低效價及工序內樣品。

在一個態樣中，本發明提供一種用於測定包含異源核酸分子之重組病毒粒子之樣品中完整病毒衣殼組分之相對豐度的方法，其中該方法包含：（a）將病毒粒子之該樣品引入線上原生液相層析質譜分析（LC-MS）系統中，其中該LC-MS系統包含與電噴霧電離發射器、質譜儀及氣體入口流體連通之液相層析管柱；（b）經由該液相層析管柱分離病毒粒子之該樣品中之該等病毒衣殼組分；（c）在對該等病毒衣殼組分進行質譜分析之前，經由該氣體入口使該等病毒衣殼組分與電荷還原劑接觸；及（d）經由質譜分析鑑別該樣品中病毒衣殼組分之原始分數量，以測定病毒粒子之該樣品中兩種或更多種完整病毒衣殼組分中之每一者的相對豐度。

在一些實施例中，病毒粒子之該樣品包含腺相關病毒（AAV）粒子。在一些情況下，該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。在一些情況下，該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。

在一些實施例中，該等病毒衣殼組分包含空病毒衣殼及完全病毒衣殼。在一些實施例中，該等病毒衣殼組分進一步包含部分完全病毒衣殼。

在一些實施例中，該液相層析管柱為尺寸排阻層析（SEC）管柱。

在一些實施例中，該電荷還原劑為異丙醇或三乙胺。在一些情況下，電荷還原劑包含異丙醇與三乙胺之組合。在一些情況下，使病毒衣殼組分與電荷還原劑在氮氣（例如，去溶劑化氣體）中接觸。

在一些實施例中，該電噴霧電離發射器包括八個噴嘴。在一些實施例中，該質譜儀為電荷偵測質譜儀。

在一個態樣中，本發明提供一種用於測定包含異源核酸分子之重組病毒粒子之樣品中完整病毒衣殼組分之相對豐度的方法，其中該方法包含：（a）使病毒粒子之該樣品進行線上原生電噴霧電離質譜分析（ESI-MS）以鑑別病毒衣殼組分之原始分數量，其中使該樣品在原生ESI-MS之前進行層析分離及電荷還原劑；及（b）測定病毒粒子之該樣品中之該完整病毒衣殼組分的相對豐度。

在一些實施例中，該等病毒衣殼組分包括空病毒衣殼及完全病毒衣殼。在一些實施例中，該等病毒衣殼組分進一步包括部分完全病毒衣殼。

在一些實施例中，病毒粒子之該樣品包含腺相關病毒（AAV）粒子。在一些情況下，該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。在一些情況下，該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。

在一些實施例中，該層析分離係使用尺寸排阻層析（SEC）管柱進行。

在一些實施例中，該電荷還原劑為異丙醇或三乙胺。在一些情況下，電荷還原劑為異丙醇與三乙胺之組合。

在上文或本文所論述之方法中之任一者中，樣品可包含≤ 1000 ng病毒衣殼組分。在一些情況下，該樣品包含≤ 500 ng病毒衣殼組分。在一些情況下，該樣品包含≤ 100 ng病毒衣殼組分。在一些情況下，該樣品包含≤ 50 ng病毒衣殼組分。在一些情況下，該樣品包含≤ 10 ng病毒衣殼組分。在一些情況下，該樣品包含約5 ng病毒衣殼組分。

在上文或本文所論述之方法中之任一者中，該樣品中之病毒衣殼組分的濃度可為1 µg/mL至200 µg/mL。在一些情況下，該樣品中之病毒衣殼組分的濃度低於100 µg/mL。在一些情況下，該樣品中之病毒衣殼組分的濃度低於50 µg/mL。在一些情況下，該樣品中之病毒衣殼組分的濃度低於10 µg/mL。在一些情況下，該樣品中之病毒衣殼組分的濃度低於5 µg/mL。在一些情況下，該樣品中之病毒衣殼組分的濃度為約1 µg/mL。

在一個態樣中，本發明提供一種純化病毒粒子之組合物的方法，其中該方法包含陰離子交換富集步驟及測定該組合物之樣品中完整病毒衣殼組分之相對豐度，其中完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定包含上文或本文論述之方法。

在一個態樣中，本發明提供一種監測病毒粒子之樣品在一段時間內之穩定性的方法，其中該方法包含陰離子交換富集步驟及測定病毒粒子之該樣品中之完整病毒衣殼組分的相對豐度，其中完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定包含如上文或本文論述之方法，且其中完整病毒衣殼組分之相對豐度係在初始時間點時測定及在初始時間點之後的一或多個時間點時再次測定。

在穩定性監測方法之一些實施例中，該等完整病毒衣殼組分在該一或多個時間點之相對豐度相較於該初始時間點之相對豐度的變化係指示病毒粒子之該樣品在該時間段期間之穩定性。在一些情況下，病毒粒子之該樣品係在該時間段期間儲存於指定條件下。在一些情況下，該等指定條件包括濕度條件及/或溫度條件。在一些情況下，該等指定條件包括（或進一步包括）攪拌條件及/或一或多個冷凍/解凍循環。

在一些實施例中，在該陰離子交換富集步驟之前進行完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定。在一些實施例中，在該陰離子交換富集步驟之後進行完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定。在一些實施例中，在該陰離子交換富集步驟之前及在該陰離子交換富集步驟之後進行完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定。在一些情況下，使用陰離子交換層析管柱進行該陰離子交換富集步驟。

在各種實施例中，上文或本文中所論述之實施例之特徵或組分中之任一者可組合，且此類組合涵蓋在本發明之範疇內。上文或本文所論述之任何具體值可與上文或本文所論述之另一相關值組合以敍述範圍，其中該等值代表該範圍之上端及下端，且此類範圍涵蓋在本揭示案之範疇內。

其他實施例將由隨後詳細說明之綜述變得顯而易見。

在描述本發明之前，應理解，本發明不限於描述之特定方法及實驗條件，因為此類方法及條件可變化。亦應理解，本文中所用之術語僅出於描述具體實施例之目的，且不意欲為限制性的，因為本發明之範圍將僅受隨附申請專利範圍限制。

除非另外規定，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。如本文所使用，當參考特定敍述數值使用時，術語「約」意謂值可與敍述值相差不超過1%。舉例而言，如本文所使用，表述「約100」包括99及101以及其間之所有值（例如，99.1、99.2、99.3、99.4等）。

如本文中所使用，術語「包括（include）」、「包括（includes）」及「包括（including）」意謂非限制性，且應理解為分別意謂「包含（comprise）」、「包含（comprises）」及「包含（comprising）」。

雖然類似或等效於本文所描述者之任何方法及材料可用於本發明之實施或測試中，但現描述的方法及材料較佳。本說明書中所提及之所有專利、申請案及非專利出版物均以全文引用之方式併入本文中。 所選擇的縮寫

MS：質譜分析

rAAV：重組AAV粒子或衣殼

AAV：腺相關病毒

LC：液相層析

SEC：尺寸排外層析法

ESI：電噴霧電離

SV-AUC：沈積速度分析型超速離心

AEX -陰離子交換層析 定義

「完整病毒衣殼組分」係指完整（亦即，尚未變性或以其他方式分解或分裂成其組分部分（例如，不同病毒蛋白質））且保留病毒衣殼之結構特徵（例如，AAV衣殼之二十面體構形）之病毒衣殼（例如，空病毒衣殼、部分完全病毒衣殼及/或完全病毒衣殼）。

術語「空病毒衣殼」或「空衣殼」係指不含異源核酸分子（例如，治療性基因）之衣殼，如圖1B中所繪示。

術語「部分完全病毒衣殼」或「部分完全衣殼」係指僅含有異源核酸分子（例如，治療性基因）之一部分之衣殼，如圖1B中所繪示。

術語「完全病毒衣殼」或「完全衣殼」係指含有完整的異源核酸分子（例如，治療性基因）之衣殼，如圖1B中所繪示。

如本文中所用，術語「樣品」係指根據本發明之方法經歷處理（包括例如，分離及分析）之病毒粒子（例如，AAV粒子）之混合物，其包含至少一種病毒衣殼組分（亦即，空衣殼、部分完全衣殼及/或完全衣殼）。

術語「分析法」或「分析」可互換地使用且係指各種用於分離、偵測、分離、純化及/或表徵病毒相關粒子（例如，AAV衣殼）之方法中之任一者。實例包括（但不限於）質譜分析（例如ESI-MS）、液相層析（例如，尺寸排阻層析法）及其組合。

如本文中所使用，「接觸」包括在溶液或固相中使至少兩種物質聚集在一起，例如使層析材料之固定相與樣品（諸如包含病毒粒子之樣品）接觸。

如本文所用之「完整質量分析」包括其中病毒粒子經表徵為完整粒子之實驗。完整質量分析可將樣品製劑降低至最小。

如本文中所使用，術語「液相層析」係指一種方法，其中由液體攜帶之化學混合物在其於固定液體或固相周圍或上方流動時可由於化學實體之示差分佈而分離成各種組分。液相層析之非限制性實例包括逆相液體層析、離子交換層析、尺寸排阻層析、親和層析及疏水性層析。

如本文中所用，術語「質譜儀」係指能夠偵測特定分子物質且準確地量測其質量的裝置。該術語可意謂包括任何分子偵測器，病毒粒子（例如，AAV衣殼）可溶離至該分子偵測器中用於偵測及/或特徵化。質譜儀由三種主要部分組成：離子源、質譜分析儀及偵測器。離子源之作用為產生氣相離子。分析物原子、分子或叢集可轉移至氣相中且同時電離化（如在電噴霧電離中）。離子源之選擇取決於應用。如本文所用，術語「電噴霧電離」或「ESI」係指噴霧電離過程，其中溶液中之陽離子或陰離子經由在高度帶電液滴之料流之大氣壓下形成及去溶劑化而轉移至氣相，該液滴由在含有溶液及相對電極之電噴霧發射器針的頂端之間施加電位差而產生。存在自溶液中之電解質離子產生氣相離子的三個主要步驟。此等為：（a）在ES輸注尖端處產生帶電液滴；（b）藉由溶劑蒸發及反覆液滴分裂使帶電液滴收縮，從而能夠產生氣相離子之較小高度帶電液滴；及（c）由極小且帶電液滴產生氣相離子的機制。階段（a）-（c）通常出現在裝置之大氣壓區域中。

如本文所用，術語「電噴霧電離源」係指可與用於對病毒粒子進行質量分析之質譜儀相容的電噴霧電離系統。

原生MS為基於電噴霧電離之特定方法，其中生物分析物自非變性溶劑中噴灑。其定義為生物分子（諸如大生物分子）及其複合物可在經冷凝液相中經由電噴霧電離質譜（ESI-MS）之方法自三維功能性存在轉移至氣相的方法。

如本文所用，術語「奈米電噴霧」或「奈米噴霧」係指在極低溶劑流動速率下電噴霧電離，通常在不使用外部溶劑遞送之情況下，數百奈升/分鐘之樣品溶液或更低。

如本文中所用，「質量分析器」係指根據其質量可分離物質，亦即原子、分子或叢集之裝置。可用於快速蛋白質定序之質量分析器的非限制性實例為飛行時間（TOF）、磁性/電扇形、四極質量過濾器（Q）、四極離子阱（QIT）、orbitrap、傅里葉變換離子迴旋共振（FTICR）以及加速器質譜分析（AMS）技術。

如本文中所用，「質荷比」或「m/z」用於表示藉由將統一原子質量單位中之離子質量除以其電荷數（不考慮符號）而形成之無量綱數量。一般而言，空、部分完全及完全AAV衣殼在原生ESI期間具有類似電荷數目，使得原生m/z光譜可用於由m/z範圍及相對豐度之差異直接解釋樣品中之AAV衣殼組分之分數組合物。

如本文中所使用，術語「四極-Orbitrap雜交質譜儀」係指藉由將四極質譜儀耦接至orbitrap質量分析儀而製成的雜交系統。使用四極-Orbitrap雜交質譜儀之串聯實時實驗除在自四極質譜儀之所選擇之較窄m/z範圍內的彼等離子之外所有離子均開始噴射。所選擇之離子可插入至orbitrap中且藉由低能量CID片段化。截獲之m/z接受範圍內的片段應保持在截留器中，且可獲得MS-MS光譜。

「腺相關病毒」或「AAV」為非病原性微小病毒，其具有單股DNA、約4.7 kb之基因體、無包膜且具有二十面體構形。AAV係於1965年作為腺病毒製劑之污染物被首次發現。AAV屬於依賴病毒（Dependovirus genus）及微小病毒科（Parvoviridae family），需要來自疱疹病毒或腺病毒之輔助功能以進行複製。在不存在輔助病毒之情況下，AAV設置藉由在19q13.4位置處整合至人類染色體19中來建立潛伏期。AAV基因體由兩個開讀框（ORF）組成，兩個AAV基因，即Rep及Cap中之每一者各有一個。AAV DNA末端具有145 bp反向末端重複序列（ITR），且125個末端鹼基係回文型，產生特徵性T形髮夾結構。

如本文中所使用，術語「多核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸（核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸）之聚合形式。因此，此術語包括（但不限於）單股、雙股或多股DNA或RNA、基因體DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體或包含嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、經化學或生物化學修飾、非天然或衍生之核苷酸鹼基的聚合物。核酸之主鏈可包含糖及磷酸酯基團（如通常可在RNA或DNA中發現），或經修飾或取代之糖或磷酸酯基團。

「重組病毒粒子」係指包括一或多個異源序列（例如，非病毒來源之核酸序列）之病毒粒子，該一或多個異源序列可側接至少一個病毒核苷酸序列。

「重組AAV粒子」係指包括一或多個異源序列（例如，非AAV起源之核酸序列）之腺相關病毒粒子，該一或多個異源序列可側接有至少一個，例如兩個AAV反向末端重複序列（ITR）。當存在於已被適合的輔助病毒感染（或表現適合的輔助功能）且表現AAV rep及cap基因產物（亦即，AAV Rep及Cap蛋白質）之宿主細胞中時，此類rAAV粒子可被複製及封裝。

「病毒粒子」係指由至少一個病毒衣殼蛋白質及經囊封之病毒基因體構成之病毒粒子。

「異源」意謂衍生自與所比較或引入或併入之實體之其餘部分在基因型上不同之實體。舉例而言，藉由遺傳工程化技術引入不同細胞類型中之核酸為異源核酸（且在經表現時可編碼異源多肽）。類似地，併入病毒粒子中之細胞序列（例如，基因或其部分）為相對於病毒粒子之異源核苷酸序列。

「反向末端重複」或「ITR」序列為在病毒基因體之末端發現的相反定向之相對較短之序列。「AAV反向末端重複（ITR）」序列為存在於單股AAV基因體之兩個末端處之具有約145個核苷酸之序列。 一般說明

本發明提供線上層析及原生質譜分析（MS）方法，其提供病毒粒子之樣品（例如，AAV粒子）之病毒衣殼組分（例如，完全衣殼、部分完全衣殼及空衣殼）的靈敏及快速定量表徵，及使用此類分析技術之純化方法。需要進行病毒粒子組合物之病毒衣殼組分（諸如AAV粒子之樣品中之病毒衣殼組分）之完全表徵以確保產物品質及一致性，從而維持組合物之安全性及功效。

重組病毒載體組合物（例如，AAV載體組合物）可含有變化程度之由各種生產、純化及儲存條件產生的完全、部分及空衣殼。然而，由病毒蛋白質化學計量變化及異源核酸材料含量變化以及低樣品濃度產生之高質量異質性使此類樣品之傳統完整質譜分析具有挑戰性。本發明方法藉由限制樣品稀釋（例如，低流動速率需求）、藉由提供快速線上去鹽（以維持樣品穩定性）及藉由提供電荷還原以改進病毒粒子物種（例如，AAV衣殼）之解析來解決此等問題。 用於測定完整病毒衣殼組分之相對豐度的方法

本發明之態樣係關於用於測定包含異源核酸分子之重組病毒粒子之樣品中的完整病毒衣殼組分之相對豐度的方法。

在一些情況下，該方法包含：（a）將病毒粒子之該樣品引入線上原生液相層析質譜分析（LC-MS）系統中，其中該LC-MS系統包含與電噴霧電離發射器、質譜儀及氣體入口流體連通之液相層析管柱；（b）經由該液相層析管柱分離病毒粒子之該樣品中之該等病毒衣殼組分；（c）在對該等病毒衣殼組分進行質譜分析之前，經由該氣體入口使該等病毒衣殼組分與電荷還原劑接觸；（d）經由質譜分析鑑別該樣品中病毒衣殼組分之原始分數量；及（e）將校正因子應用於該病毒衣殼組分之該原始分數量且鑑別該校正分數量之該病毒衣殼組分，藉此測定該病毒粒子之樣品中兩個或更多個完整病毒衣殼組分中之每一者的相對豐度，其中該校正因子係藉由對該線上原生LC-MS系統進行參考標準且鑑別該參考標準中標準病毒衣殼組分之分數量，且比較該標準病毒衣殼組分之所鑑別分數量與如藉由沈降速度分析型超速離心（SV-AUC）所測定之已知分數量的標準病毒衣殼組分來預定。

在一些情況下，該方法包含：（a）使病毒粒子之該樣品進行線上原生電噴霧電離質譜分析（ESI-MS）以鑑別病毒衣殼組分之原始分數量，其中使該樣品在原生ESI-MS之前進行層析分離及電荷還原劑；及（b）將校正因子應用於該病毒衣殼組分之該原始分數量且鑑別該校正分數量之該病毒衣殼組分，藉此測定該病毒粒子之樣品中完整病毒衣殼組分中之每一者的相對豐度，其中該校正因子係藉由對該線上原生LC-MS系統進行參考標準且鑑別該參考標準中標準病毒衣殼組分之分數量，且比較該標準病毒衣殼組分之所鑑別分數量與如藉由沈降速度分析型超速離心（SV-AUC）所測定之已知分數量的標準病毒衣殼組分來預定。

在該等方法之各種實施例中，病毒衣殼組分包括空病毒衣殼及完全病毒衣殼，且鑑別出校正分數量之空病毒衣殼及校正分數量之完全病毒衣殼。在一些情況下，病毒衣殼組分進一步包括部分完全病毒衣殼，且鑑別出校正分數量之部分完全病毒衣殼。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法可用於鑑別重組病毒粒子（例如，AAV粒子）之樣品中之空病毒衣殼、部分完全病毒衣殼及完全病毒衣殼的相對豐度。

在本文所揭示之方法中，LC-MS系統由圖2中所繪示之示意圖例示。在圖2中所示之實例中，LC-MS系統100包括液相層析管柱102（例如，1 mm內部直徑x 50 mm SEC管柱），病毒粒子之該樣品在例如10 µL/min之流動速率下引入其中，以自彼此及可存在於該樣品中之任何雜質（例如，鹽）中分離該樣品之病毒衣殼組分。經分離組分隨後以例如5 µL/min之流動速率通過分離器104且進入電噴霧電離發射器106中。ESI發射器106耦接至氣體入口108，經改質去溶劑化氣體（例如，經諸如含三乙胺之異丙醇之電荷還原劑（改質劑）改質之氮氣）在質譜儀110中進行質譜分析之前接觸樣品（例如，Orbitrap ^TMUHMR質譜儀）。

在本文所論述之各種方法中，樣品之質譜分析產生展示病毒粒子之樣品的病毒衣殼組分之相對豐度的質譜，該等病毒粒子以基於衣殼中所含有之異源核酸分子之含量的質量分離。如將瞭解，完全衣殼（其含有完整異源核酸分子）之質量大於部分完全衣殼（其僅含有一部分異源核酸分子）之質量，其又大於空衣殼（其不含異源核酸分子）之質量。考慮到衣殼之病毒蛋白質的化學計量變化（例如圖1C），由樣品之質譜分析產生的質譜可含有表示樣品中病毒衣殼組分中之每一者的寬峰。 病毒粒子

在某些態樣中，病毒粒子為AAV粒子且所揭示之方法可用於測定AAV粒子之樣品中之病毒衣殼組分的相對豐度。AAV粒子可為重組AAV（rAAV）粒子。rAAV粒子包括編碼異源轉殖基因或異源核酸分子之AAV載體。

在某些態樣中，AAV粒子包括AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAV9衣殼、AAV10衣殼、AAV11衣殼、AAV 12衣殼或其變異體。在某些態樣中，該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。在一些實施例中，該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。

雖然AAV為用於本發明之模型病毒粒子，但預期所揭示之方法可用於表徵多種病毒，例如病毒家族、子族及屬。本發明之方法可用於例如表徵病毒粒子以監測或偵測此類組合物之產生、純化或儲存期間病毒粒子之組合物中病毒衣殼組分的相對豐度。

在例示性實施例中，病毒粒子屬於選自由腺病毒科、微小病毒科、逆轉錄病毒科、桿狀病毒科及疱疹病毒科組成之群的病毒家族。

在某些態樣中，病毒粒子屬於選自由以下組成之群的病毒屬：腺胸腺病毒、禽腺病毒、魚腺病毒、哺乳動物腺病毒、唾液酸酶病毒、雙義濃核病毒、短濃核病毒、肝胰腺濃核病毒、重複濃核病毒、對蝦濃核病毒、阿留申細小病毒、禽細小病毒、博卡小病毒、牛豬細小病毒、依賴細小病毒、赤小病毒、原始小病毒、四細小病毒、α逆轉錄病毒、β逆轉錄病毒、δ逆轉錄病毒、ε逆轉錄病毒、γ逆轉錄病毒、慢病毒、泡沫病毒、α桿狀病毒、β桿狀病毒、δ桿狀病毒、ε桿狀病毒、喉氣管炎病毒、馬立克病毒、單純疱疹病毒、水痘病毒、巨細胞病毒、鼠巨細胞病毒、長鼻動物病毒、玫瑰疹病毒、淋巴濾泡病毒屬、瑪卡病毒、細小病毒及蛛猴病毒。

在某些態樣中，逆轉錄病毒為莫洛尼鼠類肉瘤病毒（MoMSV）、哈維鼠類肉瘤病毒（HaMuSV）、鼠類乳房腫瘤病毒（MuMTV）、長臂猿白血病病毒（GaLV）、貓白血病病毒（FLV）、泡沫病毒、弗蘭德病毒、鼠類幹細胞病毒（MSCV）、勞氏肉瘤病毒（RSV）、人類T細胞白血病病毒、人類免疫缺乏病毒（HIV）、貓免疫缺乏病毒（FIV）、馬免疫缺乏病毒（EIV）、梅迪-維思納病毒；山羊關節炎-腦炎病毒；馬感染性貧血病毒；貓免疫缺乏病毒（FIV）；牛免疫缺乏病毒（BIV）；或猿猴免疫缺乏病毒（SIV）。

在一些態樣中，病毒粒子（例如，AAV粒子）含有異源核酸分子（例如，治療性基因）。在一些態樣中，異源核酸分子可操作地連接至啟動子。例示性啟動子包括（但不限於）巨細胞病毒（CMV）即刻早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1（PGK）啟動子、猿猴病毒40（SV40）啟動子及CK6啟動子、甲狀腺素運載蛋白啟動子（TTR）、TK啟動子、四環素反應性啟動子（TRE）、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝特異性啟動子（LSP）、E2F啟動子、端粒酶（hTERT）啟動子；巨細胞病毒強化子/雞β-肌動蛋白/兔.β.-血球蛋白啟動子及延長因子1-α啟動子（EF1-α）啟動子。在一些態樣中，啟動子包含人類.β.-葡糖苷酸酶啟動子或連接至雞.β.-肌動蛋白（CBA）啟動子之巨細胞病毒強化子。啟動子可為組成型、誘導型或可抑制型啟動子。在一些態樣中，本發明提供一種重組載體，其包含可操作地連接至CBA啟動子之編碼本發明之異源轉殖基因之核酸。在一些情況下，將使用轉殖基因之原生啟動子或其片段。當需要轉殖基因之表現應模擬原生表現時，可使用原生啟動子。當轉殖基因之表現必須在時間上或發育上，或以組織特異性方式，或回應於特定轉錄刺激調節時，可使用天然啟動子。在另一態樣中，其他原生表現控制元件，諸如強化子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列，亦可用於模擬原生表現。 線上原生液相層析質譜分析（ LC-MS ）系統

在一些例示性實施例中，該等方法包括使病毒粒子進行液相層析/質譜分析（LC/MS）。如此項技術中已知，LC/MS利用液相層析進行離子之物理分離及質譜分析以自離子產生質譜資料。此類質譜資料可用於測定例如分子量或結構，以質量、數量、純度等鑑別粒子。此等資料可表示偵測到之離子的特性，諸如隨時間推移（例如，滯留時間）之訊號強度（例如，豐度）或相對於質荷比之相對豐度。圖2中所繪示之例示性LC-MS系統可用於測定病毒粒子之樣品中之病毒衣殼組分的相對豐度。然而，亦可採用對所繪示之例示性系統的修飾來測定完整病毒衣殼組分之相對豐度。

液相層析管柱102之非限制性實例包括逆相液相層析、離子交換層析、尺寸排阻層析、親和層析、親水性相互作用層析及疏水性層析。液相層析，包括HPLC，可用於分離病毒粒子之樣品的組分。

在各種實施例中，管柱溫度可在整個層析操作中維持在恆定溫度下。特定言之，使管柱溫度維持在環境室溫（亦即，約23℃至25℃）下。在一些實施例中，使管柱維持在約22℃至約28℃範圍內之溫度下。在一些實施例中，使管柱維持在約23℃至約27℃範圍內之溫度下。在一些實施例中，使管柱維持在約24℃±1℃至約26℃±1℃範圍內之溫度下。在一些情況下，使管柱溫度維持在約22℃至約26℃範圍內。在一些情況下，使管柱維持在以下之溫度下或為約：22℃、22.5℃、23℃、23.5℃、24℃、24.5℃、25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、27.5℃或28℃。在一些實施例中，使用商業管柱加熱器維持該溫度。在一些實施例中，該溫度為環境室溫（不使用管柱加熱器）。

在一些實施例中，LC分析包括與原生質譜分析系統流體連通之尺寸排阻層析（SEC）管柱。在各種實施例中，LC分析可如此項技術中已知進行，但值得注意的是，使用陰離子交換管柱可引起部分完全衣殼與完全衣殼之間的解析度降低。該等管柱適合於與病毒粒子一起使用。在一個實施例中，SEC管柱為Waters BEH ^®SEC管柱（1 × 50 mm）。

管柱（諸如SEC）經由可調節至質譜儀之流動速率的分析型分流器104與質譜儀流體連通。

在一些實施例中，移動相為水移動相。在一些實施例中，移動相為含有乙酸銨之水性鹽緩衝液。在一些實施例中，利用等度溶離（例如，在整個操作中維持恆定緩衝液組合物）。在例示性實施例中，用於溶離蛋白質之移動相為與質譜儀相容之移動相。可使用緩衝液之梯度，例如，若使用兩種緩衝液，則在層析運行過程中，第一緩衝液之濃度或百分比可減少，而第二緩衝液之濃度或百分比增加。舉例而言，在層析運行過程中，第一緩衝液之百分比可自約100%、約99%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約50%、約45%或約40%減少至約0%、約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40%。作為另一實例，在同一運行過程中，第二緩衝液之百分比可自約0%、約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40%增加至約100%、約99%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約50%、約45%或約40%。在某些態樣中，層析中移動相A之比例隨時間推移而增加。視情況，第一及第二緩衝液之濃度或百分比可在層析運行結束時返回其起始值。百分比可以線性梯度或非線性（例如，逐步）方式逐漸變化。舉例而言，梯度可為多相的，例如雙相、三相等。

在一些例示性實施例中，移動相可具有通過液相層析管柱之0.1 µL/min至約100 µL/min的流動速率。在一些情況下，流動速率為約0.5 µL/min、約1 µL/min、約1.5 µL/min、約2 µL/min、約2.5 µL/min、約3 µL/min、約3.5 µL/min、約4 µL/min、約4.5 µL/min、約5 µL/min、約5.5 µL/min、約6 µL/min、約6.5 µL/min、約7 µL/min、約7.5 µL/min、約8 µL/min、約8.5 µL/min、約9 µL/min、約9.5 µL/min、約10 µL/min、約10.5 µL/min、約11 µL/min、約11.5 µL/min、約12 µL/min、約12.5 µL/min、約13 µL/min、約13.5 µL/min、約14 µL/min、約14.5 µL/min、約15 µL/min、約15.5 µL/min、約16 µL/min、約16.5 µL/min、約17 µL/min、約17.5 µL/min、約18 µL/min、約18.5 µL/min、約19 µL/min、約19.5 µL/min、約20 µL/min、約25 µL/min、約30 µL/min、約35 µL/min、約40 µL/min、約45 µL/min、約50 µL/min、約75 µL/min或約100 µL/min。在一些情況下，流動速率為10 µL/min。

在一些態樣中，質譜分析（例如，用於如本文中所描述之LC/MS中）可指電噴霧電離質譜分析（ESI-MS）。ESI-MS在此項技術中已知為使用電能來使用質譜分析自溶液衍生之離子的技術。藉由在帶電液滴之霧劑中分散，將離子物質，包括在溶液中或在氣相中電離之中性物質自溶液轉移至氣相。隨後，進行溶劑蒸發以減小帶電液滴之大小。隨後，在溶液穿過相對於地面具有電壓之較小毛細管時自帶電液滴噴射出樣品離子。舉例而言，藉由將樣品與揮發性酸及有機溶劑混合且通過充有高電壓的導電針將其注入來形成周圍ESI腔室之壁。將自針頭噴霧（或噴射）之帶電液滴導引至質譜儀中，且在其飛入時藉由加熱及真空來乾燥。在液滴乾燥之後，藉由電磁透鏡將剩餘帶電分子導引至質量偵測器中，且進行質量分析。在一個態樣中，將經溶離之樣品直接自毛細管沈積至電噴霧噴嘴中，例如，毛細管充當樣品加載器。在另一態樣中，毛細管本身充當萃取裝置和電噴霧噴嘴。

在一些例示性實施例中，電噴霧電離發射器108包含多個發射器噴嘴，諸如至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個發射器噴嘴，諸如兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個發射器噴嘴。在一些例示性實施例中，電噴霧電離發射器108為來自陰性Newomics（Berkeley, CA）之M3發射器，其包括8個發射器噴嘴。

在一些實施例中，使用其他電離模式，例如渦輪噴霧電離質譜、奈米噴霧電離質譜、熱噴霧電離質譜、聲波噴霧電離質譜、SELDI-MS及MALDI-MS。一般而言，此等方法的優點在於其允許對樣品進行「及時」純化且將其直接引入至電離環境中。值得注意的是，各種電離及偵測模式對所用解吸溶液之性質引入了其自身的限制，且重要的是解吸溶液與兩者相容。舉例而言，許多應用中之樣品基質必須具有低離子強度，或存在於特定pH值範圍內等。在ESI中，樣品中之鹽可藉由降低電離或堵塞噴嘴來阻止偵測。此問題可藉由在低鹽中呈現分析物及/或藉由使用揮發性鹽來加以解決。在MALDI的情況下，分析物應處於與在靶上噴濺及所採用之電離基質相容的溶劑中。

在一些例示性實施例中，可經由氣體入口108引入經修飾去溶劑化氣體（例如，氮氣）以在質譜分析之前接觸樣品。在各種實施例中，改質劑包含至少一種有機溶劑及鹼。有機溶劑之非限制性實例包括乙腈、丙醇、異丙醇、水及甲醇。鹼之非限制性實例包括氨、二乙胺、三乙胺、N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）及哌啶。在一些例示性實施例中，改質劑為異丙醇中之三乙胺。

在一些例示性實施例中，電噴霧電離源提供溶劑流動速率為約1 µL/min至約20 µL/min之電噴霧。在各種實施例中，進入ESI發射器中之流動速率為約1 µL/min、約2 µL/min、約3 µL/min、約4 µL/min、約5 µL/min、約6 µL/min、約7 µL/min、約8 µL/min、約9 µL/min、約10 µL/min、約11 µL/min、約12 µL/min、約13 µL/min、約14 µL/min、約15 µL/min、約16 µL/min、約17 µL/min、約18 µL/min、約19 µL/min或約20 µL/min。

原生質譜儀可為原生ESI質譜分析系統。在一些例示性實施例中，質譜儀110可為四極-Orbitrap雜交質譜儀。四極-Orbitrap雜交質譜儀可為Q Exactive™ Focus雜交四極-Orbitrap™質譜儀、Q Exactive™ Plus雜交四極-Orbitrap™質譜儀、Q Exactive™ BioPharma Platform、Q Exactive™ UHMR雜交四極-Orbitrap™質譜儀、Q Exactive™ HF雜交四極-Orbitrap™質譜儀、Q Exactive™ HF-X雜交四極-Orbitrap™質譜儀及Q Exactive™雜交四極-Orbitrap™質譜儀。在一些例示性實施例中，質譜分析系統為Thermo Exactive EMR質譜儀。質譜分析系統亦可含有紫外光偵測器。

適合於LC/MS之多種質量分析器為此項技術中已知的，包括（但不限於）飛行時間（TOF）分析器、四極質量過濾器、四極TOF（QTOF）及離子捕獲器（例如，基於傅里葉變換之質譜儀或Orbitrap）。在Orbitrap中，在地面電勢處之類筒狀外部電極及類軸桿中心電極用於藉由沿著中心軸之振盪以軌跡旋轉之橢圓形捕獲離子，該等振盪由離心力與靜電力之平衡限制。此等儀器之使用採用傅里葉變換操作以將來自影像電流之偵測的時域訊號（例如，頻率）轉換成高解析度質量量測。 純化病毒粒子之組合物的方法

亦提供純化病毒粒子之組合物的方法。在一些態樣中，該等方法包含層析富集步驟（例如，陰離子交換富集步驟）及測定該組合物之樣品中完整病毒衣殼組分之相對豐度，其中完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定包含如上文所描述之該等方法中的任一者。

在一些實施例中，組合物之樣品中完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定係在層析富集步驟（例如，AEX層析）之前進行。在一些實施例中，完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定係在層析富集步驟（例如，AEX層析）之後進行。在一些實施例中，完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定係在層析富集步驟（例如，AEX層析）之前及在層析富集步驟（例如，AEX層析）之後進行。在一些情況下，層析富集步驟係使用陰離子交換層析管柱進行之陰離子交換富集步驟。 監測病毒粒子之穩定性的方法

亦提供監測病毒粒子之樣品在一段時間內之穩定性的方法。在一些態樣中，該等方法包含層析富集步驟（例如，陰離子交換富集步驟）及在初始時間點（t0）測定病毒粒子之樣品中完整病毒衣殼組分之相對豐度及在初始時間點後之一或多個時間點（例如，數天、數週或數月後）再次測定。

該等完整病毒衣殼組分在該一或多個時間點之相對豐度相較於該初始時間點之相對豐度的變化指示病毒粒子之該樣品在該時間段期間之穩定性。舉例而言，在指定條件下，完全病毒衣殼之相對豐度在一段時間內的降低提供在評估時間段期間在此類指定條件下病毒粒子之樣品的相對穩定性之指示（亦即，自t0至隨後的時間點，在該時間點再次測定病毒衣殼組分之相對豐度）。在一些情況下，病毒粒子之該樣品係在該時間段期間儲存於指定條件下。在一些情況下，指定條件包括濕度條件（例如，60%或75%相對濕度）及/或溫度條件（例如0℃、2℃至5℃、15℃、25℃、45℃）。在一些情況下，指定條件包括（或進一步包括）攪拌條件（例如，在迴轉式震盪器上攪拌30至90分鐘之時間段）及/或一或多個冷凍/解凍循環。可選擇此等條件以監測病毒衣殼樣品在現實世界或加速條件下之穩定性以監測或表徵樣品之穩定性。

在一些實施例中，病毒粒子之樣品中完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定係在層析富集步驟（例如，AEX層析）之前進行。在一些實施例中，完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定係在層析富集步驟（例如，AEX層析）之後進行。在一些實施例中，完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定係在層析富集步驟（例如，AEX層析）之前及在層析富集步驟（例如，AEX層析）之後進行。在一些情況下，層析富集步驟係使用陰離子交換層析管柱進行之陰離子交換富集步驟。 實例

提出以下實例以便為本領域普通技術人員提供如何製得及使用本發明之方法及組合物之完整揭示內容及描述，且不意欲限制本發明人視作其發明之範疇。已努力確保關於所用數字（例如量、溫度等）之準確性，但應考慮一些實驗誤差及偏差。除非另有指示，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。 實例 1 ：測定 AAV 粒子之樣品中之完整病毒衣殼組分的相對豐度 .

在分析之前立即以1:2至1:10將AAV儲備溶液或工序內樣品之等分試樣儲存於-80℃下且稀釋於水中。使用具有150 mM等度溶離之乙酸銨的Waters BEH200 SEC保護管柱（1 × 50 mm）在適用於低流量條件之原生LC-MS平台上以10 µL/min進行線上原生去鹽SEC-MS（參見圖2）。所得AAV溶離劑隨後使用0.01%（v/v）TEA於經IPA改質之去溶劑化氣體（2 L/min，氮）進行前端電荷降低，接著使用經最佳化用於傳輸高質量離子之Orbitrap Q-Exactive UHMR儀器進行原生MS分析（參見圖2）。

電荷偵測質譜分析（CD-MS）研究顯示空、部分及完全AAV衣殼在原生ESI期間具有類似電荷數目。因此，原生 m/z光譜可用於根據其 m/z範圍（亦即， m/z質量 ，當 z為恆定時）及相對豐度之差異直接解釋AAV衣殼粒子之分數組合物。

在本發明方法中，藉由使用整合式去鹽SEC-MS平台來改進原生AAV分析以達成10 min/樣品之線上緩衝液交換及總分析時間（參見圖3）。另外，經由去溶劑化氣體改質之電荷減少增強AAV衣殼粒子之光譜解析度以用於改進之定量（參見圖3）。該等方法係使用低流動條件（10 µl/min）進行，以限制樣品稀釋且促進以低至6E+10衣殼/mL之效價敏感性偵測AAV衣殼材料（參見圖5A）。該等方法證明能夠監測在完全衣殼材料之AEX富集之前及之後收集的工序內樣品（參見圖6）。如上文所論述之方法用於監測在37℃下經45天之時段儲存之樣品中病毒衣殼組分（AAV1及AAV8）的相對豐度，如圖8中所示。

本發明之範疇不限於本文所描述之特定實施例。實際上，根據前述描述，除本文所描述之修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言亦會變得顯而易見。此等修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。

100:LC-MS系統 102:液相層析管柱 104:分離器;分析型分流器 106:顯微製造單體式多噴嘴（M3）電噴霧電離發射器;電噴霧電離發射器;ESI發射器 108:氣體入口;電噴霧電離發射器 110:質譜儀

圖1A、1B及1C繪示包含異源核酸分子（例如，治療性基因）之AAV衣殼（圖1A）；空、部分完全及完全衣殼（圖1B）；及由三個病毒蛋白質（VP1、VP2及VP3）之60個複本構成之產生廣泛範圍之理論衣殼化學計量的AAV衣殼（圖1C）。

圖2繪示根據本發明之實施例的例示性LC-MS系統100，其包含耦接至分離器104之液相層析管柱102（例如，SEC管柱），該分離器繼而耦接至顯微製造單體式多噴嘴（M3）電噴霧電離發射器106，該電噴霧電離發射器耦接至氣體入口108及質譜儀110（例如Orbitrap ^TMUHMR）。

圖3展示繪示經由圖2之液相層析管柱將AAV衣殼組分與鹽分離之層析圖，及展示空病毒衣殼及完全病毒衣殼之相對豐度的質譜。質譜繪示在質譜分析之前，藉由（底部）及不藉由（頂部）將電荷還原劑（例如，含0.01%三乙胺之異丙醇）應用於含有AAV衣殼之樣品所獲得之差異。電荷減少AAV衣殼組分之解析度改進。

圖4A和4B展示各種AAV血清型（AAV1、AAV5及AAV8）及相同AAV血清型之相應SV-AUC資料（圖4B）的質譜（圖4A）。質譜顯示，本發明之方法產生與各種AAV血清型上之SV-AUC資料一致的結果。

圖5A和圖5B質譜由將不同數量之空衣殼AAV材料噴射至本發明之LC-MS系統中產生之質譜（圖5A）及在質譜反應與注射數量之間的相關性（圖5B）。此等結果證明，本發明之方法對病毒衣殼材料（例如，AAV衣殼）之偵測高度敏感，其使得該等方法良好適合於工序內樣品監測。

圖6繪示病毒衣殼之例示性純化方法，其包括用於完全病毒衣殼相對於空病毒衣殼富集之陰離子交換（AEX）管柱，且展示對應於AEX富集之前及AEX富集之後所獲得之量測的質譜。

圖7A及圖7B展示由引入不同比率之孔:完整AAV衣殼至本發明之LC-MS系統中產生的質譜（圖7A）及已知SV-AUC資料與自質譜獲得之衣殼組分的經量測百分比之間的相關性（圖7B）。如圖7B中所繪示，所量測之MS資料與已知SV-AUC資料之間的相關性良好。

圖8繪示藉由採用本發明之分析技術產生的例示性結果，藉此監測在熱應力之後的衣殼穩定性變化。

100:LC-MS系統

102:液相層析管柱

104:分離器；分析型分流器

106:顯微製造單體式多噴嘴(M3)電噴霧電離發射器；電噴霧電離發射器；ESI發射器

108:氣體入口；電噴霧電離發射器

110:質譜儀

Claims (41)

1. 一種用於測定包含異源核酸分子之重組病毒粒子之樣品中的完整病毒衣殼組分之相對豐度的方法，其包含： （a）    將病毒粒子之該樣品引入線上原生液相層析質譜分析（LC-MS）系統中，其中該LC-MS系統包含與電噴霧電離發射器、質譜儀及氣體入口流體連通之液相層析管柱； （b）   經由該液相層析管柱分離病毒粒子之該樣品中之該等病毒衣殼組分； （c）    在對該等病毒衣殼組分進行質譜分析之前，經由該氣體入口使該等病毒衣殼組分與電荷還原劑接觸；及 （d）   經由質譜分析鑑別該樣品中病毒衣殼組分之原始分數量，以測定病毒粒子之該樣品中兩種或更多種完整病毒衣殼組分中之每一者的相對豐度。
2. 如請求項1之方法，其中病毒粒子之樣品包含腺相關病毒（AAV）粒子。
3. 如請求項2之方法，其中該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。
4. 如請求項3之方法，其中該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。
5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該等病毒衣殼組分包含空病毒衣殼及完全病毒衣殼。
6. 如請求項5之方法，其中該等病毒衣殼組分進一步包含部分完全病毒衣殼。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該液相層析管柱為尺寸排阻層析（SEC）管柱。
8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該電荷還原劑為異丙醇或三乙胺。
9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中使該等病毒衣殼組分與該電荷還原劑在氮氣中接觸。
10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該電噴霧電離發射器包括八個噴嘴。
11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該質譜儀為電荷偵測質譜儀。
12. 一種用於測定包含異源核酸分子之重組病毒粒子之樣品中的完整病毒衣殼組分之相對豐度的方法，其包含： （a）    使病毒粒子之該樣品進行線上原生電噴霧電離質譜分析（ESI-MS）以鑑別病毒衣殼組分之原始分數量，其中使該樣品在原生ESI-MS之前進行層析分離及電荷還原劑；及 （b）   測定病毒粒子之該樣品中之該完整病毒衣殼組分的相對豐度。
13. 如請求項12之方法，其中該等病毒衣殼組分包括空病毒衣殼及完全病毒衣殼。
14. 如請求項13之方法，其中該等病毒衣殼組分進一步包括部分完全病毒衣殼。
15. 如請求項12至14中任一項之方法，其中病毒粒子之該樣品包含腺相關病毒（AAV）粒子。
16. 如請求項15之方法，其中該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-Rh10、AAV-retro、AAV-PHP.B、AAV8-PHP.eB或AAV-PHP.S。
17. 如請求項16之方法，其中該等AAV粒子具有血清型AAV1、AAV5或AAV8。
18. 如請求項12至17中任一項之方法，其中該層析分離係使用尺寸排阻層析（SEC）管柱進行。
19. 如請求項12至18中任一項之方法，其中該電荷還原劑為異丙醇或三乙胺。
20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該樣品包含≤ 1000 ng病毒衣殼組分。
21. 如請求項20之方法，其中該樣品包含≤ 500 ng病毒衣殼組分。
22. 如請求項21之方法，其中該樣品包含≤ 100 ng病毒衣殼組分。
23. 如請求項22之方法，其中該樣品包含≤ 50 ng病毒衣殼組分。
24. 如請求項23之方法，其中該樣品包含≤ 10 ng病毒衣殼組分。
25. 如請求項24之方法，其中該樣品包含約5 ng病毒衣殼組分。
26. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該樣品中之病毒衣殼組分的濃度為1 µg/mL至200 µg/mL。
27. 如請求項26之方法，其中該樣品中之病毒衣殼組分的濃度低於100 µg/mL。
28. 如請求項27之方法，其中該樣品中之病毒衣殼組分的濃度低於50 µg/mL。
29. 如請求項28之方法，其中該樣品中之病毒衣殼組分的濃度低於10 µg/mL。
30. 如請求項29之方法，其中該樣品中之病毒衣殼組分的濃度低於5 µg/mL。
31. 如請求項30之方法，其中該樣品中之病毒衣殼組分的濃度為約1 µg/mL。
32. 一種純化病毒粒子之組合物的方法，其中該方法包含陰離子交換富集步驟及測定該組合物之樣品中完整病毒衣殼組分之相對豐度，其中完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定包含如請求項1至31中任一項之方法。
33. 一種監測病毒粒子之樣品在一段時間內之穩定性的方法，其中該方法包含陰離子交換富集步驟及測定病毒粒子之該樣品中之完整病毒衣殼組分的相對豐度，其中完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定包含如請求項1至31中任一項之方法，且其中完整病毒衣殼組分之相對豐度係在初始時間點時測定及在初始時間點之後的一或多個時間點時再次測定。
34. 如請求項33之方法，其中該等完整病毒衣殼組分在該一或多個時間點之相對豐度相較於該初始時間點之相對豐度的變化係指示病毒粒子之該樣品在該時間段期間之穩定性。
35. 如請求項33或34之方法，其中病毒粒子之該樣品係在該時間段期間於指定條件下儲存。
36. 如請求項35之方法，其中該等指定條件包括濕度條件及/或溫度條件。
37. 如請求項35或36之方法，其中該等指定條件包括攪拌條件及/或一或多個冷凍/解凍循環。
38. 如請求項32至37中任一項之方法，其中在該陰離子交換富集步驟之前進行完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定。
39. 如請求項32至37中任一項之方法，其中在該陰離子交換富集步驟之後進行完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定。
40. 如請求項32至37中任一項之方法，其中在該陰離子交換富集步驟之前及在該陰離子交換富集步驟之後進行完整病毒衣殼組分之相對豐度的測定。
41. 如請求項32至40中任一項之方法，其中使用陰離子交換層析管柱進行該陰離子交換富集步驟。

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