KR20240028341A - 융합 폴리펩티드 - Google Patents

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KR20240028341A
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마이클 슈미트
그리고리오스 자르비스-파파스토이트시스
칼 데인 위트루프
대럴 어빈
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안키라 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 면역조절 모이어티 및 금속-수산화물 결합 모이어티를 포함하는 놀랍게도 유용한 융합 폴리펩티드뿐만 아니라 이러한 융합 폴리펩티드를 제조하고 사용하는 방법을 포함하는 다양한 관련 기술을 제공한다.

Description

융합 폴리펩티드
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2021년 5월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/184,620에 대한 우선권 및 그의 이익을 주장하며, 그 전체는 참조로 본 명세서에 포함된다.
금속 수산화물(예를 들어, 수산화알루미늄)과 접합되도록 조작된 면역조절 폴리펩티드는 비접합된 면역조절 폴리펩티드에 비해 종양내 주사에 의해 전달될 때 증가된 항-종양 효능을 나타낼 수 있다.
특정 사이토카인, 면역 체크포인트 조절제 등과 같은 다양한 면역조절 폴리펩티드는 암의 치료에서 상당한 가능성을 보여주었지만, 많은 강력한 사이토카인에 대해 보고된 용량-제한 독성을 포함하여 상당한 과제가 남아 있다. 예를 들어, Milling 등, Adv. Drug. Deliv. Rec. 114:79, 2017을 참조한다). 예를 들어, 국제 특허 출원 WO2020263399("융합 단백질 파일링")에 기술된 최근 연구에서는 이러한 독성을 다루고/다루거나 그렇지 않으면 치료 유용성을 개선하기 위한 특히 관심있는 접근법: 관련 면역조절 폴리펩티드를 금속 수산화물과 착화하는 능력을 특징으로 하는 다른 폴리펩티드와 융합하는 것을 기술했다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않고, 금속 수산화물은 주사 부위에서 연장된 기간(예를 들어, 며칠에서 몇 주) 동안 지속될 수 있는 미립자 스캐폴드로 작용할 수 있고, 그러한 착물화(즉, 금속 수산화물과 융합 폴리펩티드의 접합)은 주사 부위(예를 들어, 종양내 주사)에서 융합 폴리펩티드(이의 면역조절 폴리펩티드 모이어티 포함)를 유지한다는 것이 제안된다. 따라서, 면역조절 폴리펩티드는 종양 미세환경 내에서 지속되어 효능을 증강시키고 전신 노출이 제한되어 독성을 감소시킨다.
융합 단백질 파일링은 인산화되기 쉬운 폴리펩티드가 그 인산화된 형태(즉, 인산기가 수산기를 대체한 경우)에 있을 때 명반에 훨씬 더 강하게 흡착될 수 있음을 구체적으로 입증했다. Fam20C 키나제에 대한 인산화 부위를 포함하고 다른 폴리펩티드(예를 들어, 면역조절 폴리펩티드)와 융합될 수 있는 다양한 명반-결합 펩티드("ABP")가 개발되었다. 명반-결합 폴리펩티드가 전형적으로 링커의 방식에 의해 면역조절 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결된 융합 폴리펩티드가 생성되었다. 이들 융합 폴리펩티드의 인산화 정도는 단독으로 또는 Fam20C 키나제와 조합하여 발현될 때 평가되었고, 인산화된 폴리펩티드는 혈청의 존재에서 명반에 대한 그 흡착 및 이로부터 방출에 대해 특성화되었다. 더욱이, 명반과 착화된 융합 폴리펩티드의 종양내 지속성은 종양내 주사 후에 결정되었다.
인산화가 더 큰 융합 폴리펩티드가 혈청 조건에서의 명반에 더 오래 유지되는 경향이 있다. 분석된 ABP 중, ABP10으로 지칭되는 폴리펩티드인, GGGGSFQSEEQQGGGSGGSEEGGMESEESNGGGSGGSEEGGGGSHHHHHH는 단백질이 돌연변이체 키나제(예를 들어, 돌연변이체 Fam20C 키나제)로 발현되었을 때와 비교하여 단백질이 야생형(WT) 키나제(예를 들어, WT Fam20C 키나제)로 발현되었을 때 대략적으로 4- 내지 6-배수의 인산화의 증가로, 가장 높은 인산화를 입증했다. ABP10은 짧은 스페이서 서열로 분리된, 널리 퍼진 인산화 부위 모티프인 4개의 SXE 모티프로 구성된다. 융합 단백질 파일링은 ABP10에 연결된 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 인터루킨-2 및 인터루킨-12)가 ABP10이 없는 면역조절 폴리펩티드에 비해 흑색종의 마우스 모델에서 개선된 생존을 나타냄을 입증했다.
놀랍게도 본 발명자들은 개선된 금속-수산화물 결합 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 개선된 융합 폴리펩티드가 개발될 수 있음을 발견했다. 무엇보다도 본 발명자들은 적절한 기준(예를 들어, ABP10)에 비해 증강된 금속 수산화물(예를 들어, 명반) 보유를 특징으로 하는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 개발했다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제공된 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 종양이 있는 대상체에게 투여될 때 적절한 기준(예를 들어, ABP10)과 비교하여 개선된 효능을 특징으로 한다.
무엇보다도, 본 개시내용은 특히 유용한 융합 폴리펩티드를 제공한다(도 1). 더욱이, 본 개시내용은 종양이 있는 대상체를 치료하는데 있어서 융합 폴리펩티드의 유효성을 입증하고; 일부 실시형태에서, 유효성은 단일요법으로 입증된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 유효성은 예를 들어 면역-조절 요법, 화학요법제 또는 외과적 절제와 조합하여 입증된다.
무엇보다도, 본 개시내용은 제공된 융합 폴리펩티드 및/또는 이를 포함하는 조성물의 생산을 위한 특정 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 구체적으로 인산화된 제제를 포함하는 융합 펩티드 제제의 재현가능한 생산을 달성한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어 발현, 정제 및/또는 분석 기술을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 개시내용은 일부 실시형태에서는 인산화된 제제 및/또는 일부 실시형태에서는 금속 수산화물과 착화된 융합 폴리펩티드(예를 들어, 인산화된 융합 폴리펩티드)의 제제를 포함하는 제공된 융합 폴리펩티드의 바람직한 제제를 제공한다.
따라서, 무엇보다도, 본 개시내용은 특정 금속-수산화물 결합 폴리펩티드 및/또는 이를 포함하는 융합 폴리펩티드에 대한 문제의 근원을 동정한다. 예를 들어, 본 개시내용은 제조상의 어려움이 특정한 그러한 폴리펩티드 및/또는 융합과 연관될 수 있음을 인식한다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않고, 본 개시내용은 폴리펩티드에 대한 2차 인산화가 특정한 그러한 제조상의 어려움에 기여하고/하거나 책임이 있을 수 있음을 인지한다. 무엇보다도, 본 개시내용은 금속 수산화물에 대한 높은 수준의 흡착 및 또한 바람직한 제조상의 특성(예를 들어, 재현성, 점조성, 감소된 면역원성 등의 하나 이상)을 입증하는, 금속-수산화물-결합 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 (a) 면역 효능제 모이어티를 포함하는 면역조절 폴리펩티드; 및 (b) 아미노산 서열이 복수의 인산화 부위를 포함하여 인산화된 형태와 비인산화된 형태를 채택할 수 있는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 금속-수산화물에 노출될 때 그와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 금속 수산화물은 수산화알루미늄이다. 일부 실시형태에서, 복합체는 금속-수산화물-결합 폴리펩티드가 인산화되지 않은 형태일 때보다 인산화된 형태일 때 더 쉽게 형성된다.
일부 실시형태에서, 인산화 부위 중 하나 이상은 Fam20C 키나제에 의해 표적화된다. 일부 실시형태에서, 인산화 부위는 S-X-E 모티프이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 인산화 부위는 4개 초과의 S-X-E 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 인산화 부위는 8개의 S-X-E 모티프를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 2개의 인접한 S-X-E 모티프는 스페이서에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 하나의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 복수의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 4개의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 4개의 글리신 잔기를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 각각의 SXE 모티프는 스페이서에 의해 각각의 인접한 S-X-E 모티프로부터 분리된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) (i) 면역 효능제 모이어티를 포함하는 면역조절 폴리펩티드; 및 (ii) 금속-수산화물 결합 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드; 및 (b) 금속 수산화물을 포함하는 복합체로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, (a) 및 (b)는 함께 제형화된다. 일부 실시형태에서, (a) 및 (b)는 투여 이전에 혼합된다.
일부 실시형태에서, 복합체는 종양내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 복합체는 종양주위 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 복합체는 종양-배출 림프절 또는 림프절들에 투여된다.
일부 실시형태에서, 복합체는 제2 치료제와 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 방사선이다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 외과적 종양 절제이다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 외과적 종양 절제 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 화학요법이다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 항-종양 항체이다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 표적화된 요법(예를 들어, BRAF 억제제, MEK 억제제, 등)이다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 면역 조절*이다. 일부 실시형태에서, 면역 조절제는 체크포인트 억제제이다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, TIGIT 및 LAG3 중 하나 이상을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항체는 종양-표적화 CD3 이중특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, 면역 조절제는 세포 요법이다. 일부 실시형태에서, 세포 요법은 CAR-T 세포, 생체-외 확장된 TIL 및 NK 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 (a) 면역 효능제 모이어티를 포함하는 면역조절 폴리펩티드; 및 (b) 금속-수산화물 결합 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 종양을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 융합 폴리펩티드는 금속 수산화물과 제형화되고; 여기서 대상체는 적어도 하나의 추가 치료제로의 요법을 받았거나 받고 있다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드와 금속-수산화물은 함께 제형화되어 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드와 금속-수산화물은 투여 이전에 혼합된다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 종양내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 종양주위 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 종양-배출 림프절 또는 림프절들에 투여된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 방사선이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 외과적 종양 절제이다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 외과적 종양 절제 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 화학요법이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 항-종양 항체이다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 면역 조절제이다. 일부 실시형태에서, 면역 조절제는 체크포인트 억제제이다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는 MEK를 억제한다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, TIGIT 및 LAG3 중 하나 이상을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항체는 종양-표적화 CD3 이중특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, 면역 조절제는 세포 요법이다. 일부 실시형태에서, 세포 요법은 CAR-T 세포, 생체-외 확장된 TIL 및 NK 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드의 면역 효능제 모이어티는 제1 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 단편은 시그널링 능력이 있다. 일부 실시형태에서, 제1 모이어티는 IL12 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL12 모이어티는 IL12B 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드의 면역 효능제 모이어티는 제1 및 제2 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 모이어티는 IL12 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL12 모이어티는 IL12B 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 모이어티는 IL12 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 IL12 모이어티는 IL12A 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 모이어티 또는 이의 기능적 단편은 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 링커는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 (G4S)3 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드의 면역조절 폴리펩티드와 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 제2 링커를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제2 링커는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열, GGGGEGGGG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열, GGGGSGGGG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 면역조절 폴리펩티드의 c-말단에 직접적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 제2 링커를 통해 면역조절 폴리펩티드의 c-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 융합 폴리펩티드를 키나제와 접촉시킴에 의해 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드의 인산화된 형태를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 접촉시키는 것은 융합 폴리펩티드와 키나제를 공동-발현시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드와 키나제는 2:1 내지 100:1의 비율로 공동-발현된다. 일부 실시형태에서 비율은 4:1이다. 일부 실시형태에서, 4:1 비율은 융합 폴리펩티드와 키나제를 발현하기 위해 2개의 별도의 플라스미드를 사용하여 달성된다. 일부 실시형태에서, 2개의 별도의 플라스미드는 4:1의 비율을 생성하도록 서로 다른 강도의 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서 비율은 8:1이다. 일부 실시형태에서, 8:1 비율은 융합 폴리펩티드와 키나제를 발현하기 위한 2개의 프로모터를 갖는 단일 벡터를 사용하여 달성된다. 일부 실시형태에서, 키나제는 Fam20C이다.
일부 실시형태에서, 공동-발현시키는 단계는 비율에서 발현을 지시하도록 확립된 프로모터로부터 발현시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공동-발현시키는 단계는 바이-시스트론 작제물로부터 발현시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 인산화된 형태를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 정제하는 단계는 친화도 크로마토그래피를 포함한다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 금속-수산화물에 노출되어 그와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 대상체에게 투여하기 이전에 제조된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드는 인산화된 형태의 융합 폴리펩티드를 금속 수산화물과 접촉시킴에 의해 제조된다.
일부 실시형태에서, 복합체는 본 개시내용의 융합 폴리펩티드 및 금속 수산화물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 융합 폴리펩티드당 평균 2-8개의 인산염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 95% 초과의 금속 수산화물 보유를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 복합체는, 예를 들어, 금속 질량으로 정의된 바와 같이 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물의 1:1 내지 1:20의 질량비를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비율은, 예를 들어, 금속 질량으로 정의된 바와 같이 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물의 질량으로 1:5 내지 1:20이다. 일부 실시형태에서, 비율은, 예를 들어, 금속 질량으로 정의된 바와 같이 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물의 질량으로 1:10이다. 일부 실시형태에서, 비율은, 예를 들어, 금속 질량으로 정의된 바와 같이 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물의 질량으로 1:5이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 융합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체로서 제형화된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 인산화의 정도를 평가함에 의해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인산화의 정도는 단백질당 인산염의 수를 결정함에 의해 평가된다. 일부 실시형태에서, 단백질당 인산염의 수는 비색 검정을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 비색 검정은 말라카이트 그린 검정이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 제제의 이질성을 평가함에 의해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제제의 이질성은 분석적 이온 교환을 사용하여 평가된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 금속 수산화물 상의 융합 폴리펩티드의 보유를 평가함에 의해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 보유는 시험관내 보유 검정을 사용하여 평가된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 융합 폴리펩티드의 시그널링 활성을 평가함에 의해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 시그널링 활성은 시험관내에서 평가된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 평가는 리포터 검정을 활용한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 제제의 순도를 평가함에 의해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 특징화하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 인산염 함량을 평가함에 의해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인산염 함량을 평가하는 것은 말라카이트 그린 검정의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인산염 함량을 평가하는 것은 고성능 액체 크로마토그래피 검정의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 고성능 액체 크로마토그래피 검정은 SAX-10 컬럼을 활용한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 제제의 효력을 평가함에 의해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 효력은 면역 모이어티 시그널링을 평가함에 의해 특징화된다. 일부 실시형태에서, 면역 모이어티 시그널링은 리포터 검정을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 효력은 IL12 시그널링을 평가함에 의해 특성화된다. 일부 실시형태에서, IL12 시그널링은 리포터 검정을 사용하여 결정된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 금속 수산화물에 대한 본 개시내용의 융합 폴리펩티드의 보유를 평가하는 것을 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 복합체를 특징화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 보유를 평가하는 것은 금속 수산화물 보유 검정의 사용을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 제제의 순도; (b) 인산염 함량; (c) 약학적 조성물의 효력; (d) 금속 수산화물에 대한 융합 폴리펩티드의 보유; (e) 종양이 있는 대상체를 치료하는 효능; (f) 제2 치료제와의 조합 중 하나 이상을 평가하는 것을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을 특징화하는 방법을 제공한다
도 1은 본 개시내용의 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체의 예시적인 개략도를 제공한다. 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체는 대상체에게 투여될 수 있고 적절한 참조 표준과 비교하여 증강된 보유 및/또는 효능을 초래할 수 있다.
도 2는 제1(p40) 및 제2(p35) IL12 면역 효능제 모이어티와 복수의 인산화 부위를 갖는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함하는 본 개시내용의 예시적인 융합 폴리펩티드의 도해를 제공한다.
도 3a-c는 다양한 금속-수산화물 결합 폴리펩티드(예를 들어, 명반 결합 폴리펩티드)를 갖는 예시적인 인간 및 마우스 IL-12 작제물에 대한 말라카이트 그린 검정을 사용한 인산화 수준의 평가를 제공한다. 도 3a는 Fam20C와 공동-발현된 hIL12-ABP 및 mIL12-ABP 폴리펩티드("-K"로 표시됨)가 Fam20C 공동-발현을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 Fam20C와 공동-발현된 ABP를 결하는 야생형 hIL12 또는 mIL12에 비해 상당히 더 높은 인산염 수준을 가짐을 예시하는 예시적인 그래프를 도시한다. 도 3b는 Fam20C 공동-발현으로 일시적 HEK에서 1L 규모로 발현되고 순차적 Ni-NTA 및 SEC 크로마토그래피에 의해 정제된 마우스 IL12-ABP 변이체로부터의 결과를 예시하는 예시적인 그래프를 도시한다. 말라카이트 그린 검정에서 mIL12-ABP10은 다시 ABP20-G4-GS20, ABP20-G4 및 ABP20의 순서에 이어서 가장 높은 인산화를 가졌다. 도 3c는 예시적인 금속-수산화물 결합 폴리펩티드 서열을 제공한다.
도 4a-4g는 본 개시내용의 예시적인 금속-수산화물 결합 폴리펩티드 대비 ABP10의 예시적인 생체내 연구를 입증한다. 마우스 IL12-ABP 폴리펩티드를 전신 PD-1 차단과 조합하여 이중 옆구리 B16F10 동계 종양 모델에서 시험하였다. 비히클 처리를 대조군으로 활용했다. 도 4a는 비히클 또는 PD-1 단독으로 치료된 마우스에서의 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 4b는 비히클 또는 mIL12와 PD-1 조합 치료로 치료된 마우스에서의 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 4c는 비히클 또는 mIL12/명반 및 PD-1 조합 치료로 치료된 마우스에서의 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 4d는 비히클 또는 mIL12-ABP10-k/명반 및 PD-1 조합 치료로 치료된 마우스에서의 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 4e는 비히클 또는 mIL12-ABP20-K/명반 및 PD-1 조합 치료로 치료된 마우스에서의 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 4f는 비히클 또는 mIL12-ABP20-G4-K/명반 및 PD-1 조합 치료로 치료된 마우스에서의 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 4g는 비히클 또는 mIL12-ABP20-G4-GS20-K/명반 및 PD-1 조합 치료로 치료된 마우스에서의 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다.
도 5는 예시적인 ABP 서열을 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 예시적인 정제된 융합 폴리펩티드의 말라카이트 그린 검정을 사용한 인산화 수준의 분석을 입증한다. 모든 ABP는 음성 대조군(Fam20C 또는 TBS 없음)에 비해 유의하게 높은 인산화를 입증했다. 도 6a의 실행 1과 2는 동일한 실험의 기술적 복제이다.
도 7a-7c는 순차적 Ni-NTA 친화도 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 예시적인 융합 폴리펩티드의 정제를 도시한다. 모든 폴리펩티드는 SDS-PAGE 및 SEC에서 단일 피크로 나타났으며, 이는 유의한 분해 또는 응집이 없음을 입증한다. 도 7a는 mIL12-ABP10에 대한 결과를 도시한다. 도 7b는 mIL12-ABP20-G4-6x-GE에 대한 결과를 도시한다. 도 7c는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE에 대한 결과를 도시한다.
도 8은 대조군인, mIL12와 비교하여 예시적인 융합 폴리펩티드, mIL12-ABP10-K, mIL12-ABP20-G4-6x-GE-K 및 mIL-ABP20-G4-8x-GE-K에 대한 명반 보유의 평가를 제공한다. 비변형된 IL12인, mIL12-ABP20-G4-6x-GE에 비해 명반 상에 더 큰 보유를 나타낸 3개의 융합 폴리펩티드 모두는 mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE보다 더 빠르게 용리되었다.
도 9a 및 도 9b는 융합 폴리펩티드의 예시적인 정제를 입증한다. 보다 균질하게 인산화된 물질을 생성하기 위해, mIL12-ABP10-K(도 9a) 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE-K(도 9b)를 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제했다. 샘플은 선형 염 구배로 용리되었고 각 용리 피크의 후반부를 수집하고 풀링하여 더 낮은 수준의 인산화를 함유하는 초기 용리 분획을 제거했다.
도 10a-10c는 융합 폴리펩티드의 농후화된 풀의 예시적인 평가를 제공한다. 예비 음이온 교환 크로마토그래피 후 mIL12-ABP10(도 10a) 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE(도 10b)의 농후화된 풀을 분석 이온 교환 크로마토그래피를 통해 원래 물질과 비교했다. (mIL12-ABP10) 및 (mIL12-ABP20-G4-8x-GE)에 대한 용리 시간은 (도 10c)에 요약되어 있다.
도 11a 및 도 11b는 이온-교환 농후화된 융합 폴리펩티드의 예시적인 평가를 입증한다. 도 11a는 이온-교환 연마 이전 mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 샘플과 함께 명반 보유 검정에서 평가된 이온-교환 농후화된 mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE를 도시한다. 폴리펩티드는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화된 다음 5mM 인산염 및 20% 마우스 혈청을 함유하는 용리 완충액에서 24시간 동안 희석된 후 상등액에서의 유리 폴리펩티드가 정량되었다. 이온 교환 정제된 mIL12-ABP20-G4-8x-GE는 mIL12-ABP10의 경우 86% 및 비-이온 교환 물질의 경우 78%에 비해 24시간에 명반에 결합된 89%로 가장 높은 보유를 가졌으며 이는 낮은 인산염 분획이 명반에서 더 빨리 용리함을 입증한다. 도 11b는 샘플이 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄에 결합된 다음 최대 48시간 동안 5mM 인산염 및 20% 마우스 혈청으로 용리되었음을 도시한다. 이온 교환 정제된 mIL12-ABP20-G4-8x-GE는 다시 mIL12-ABP10의 경우 78% 및 비변형된 mIL12의 경우 17%에 비하여 48시간에 명반에 결합된 82%로 가장 높은 보유를 가졌다.
도 12a 및 도 12b는 HEK-Blue-IL12 리포터 검정에서 mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 평가를 입증하며 여기서 SEAP는 IL12 유도된 시그널링에 반응하여 발현된다. 도 12a는 mIL12-ABP10이 검정에서 3.5ng/mL의 EC50 값을 갖는 대조군인 mIL12에 비하여 3.6ng/mL의 EC50 값으로 활성적이었다는 것을 도시한다. 명반에 결합되면 EC50 값은 mIL12-ABP10에 대해 8ng/mL의 EC50 값으로 ~2-4배수 이동했다. 도 12b는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE가 검정에서 5.4ng/mL의 EC50 값을 갖는 대조군인 mIL12와 동일한 5.4ng/mL의 EC50 값으로 활성적이었다는 것을 도시한다. 명반에 결합되면 EC50 값은 mIL12-ABP20-G4-8x-GE에 대해 22ng/mL의 EC50 값으로 ~2-4배수 이동했다.
도 13은 mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 명반 결합 및 용리된 분획의 활성에 대한 예시적인 평가를 도시한다. 상등액 분획, 재현탁된 명반 펠렛 및 명반이 없는 용리 완충액에서 밤새 인큐베이션된 mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 대조군 샘플을 HEK-Blue-IL12 검정에서 테스트했다. 명반이 없는 대조군 샘플은 7ng/mL에서 이전 측정과 유사한 EC50을 가졌고, 상등액 분획은 EC50 >1000ng/mL를 가졌고, 명반 펠렛은 검정에서 ~5x의 효력 이전으로 활성적이어서 IL12가 연장된 시간 동안 명반 상에 보유되면서 활성적으로 유지했다는 것을 입증했다.
도 14a-14c는 CT26 결장직장암 모델에서 단일 주사 단일요법으로서의 mIL12-ABP10-K/명반 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE-K/명반의 효능을 입증한다. 도 14a는 종양 접종 후 6일차에 50μg 명반과 착화된 5μg의 mIL12-ABP 또는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE 융합 폴리펩티드의 단일 종양내 주사가 비히클 치료된 동물에 비해 증가된 생존을 초래했다는 것을 예시하는 예시적인 그래프를 도시한다. 도 14b 및 14c는 종양 접종 후 6일차에 50μg 명반과 착화된 5μg의 mIL12-ABP 또는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE 융합 폴리펩티드의 단일 종양내 주사가 비히클 치료된 마우스에 비하여 유의한 종양 지연 및 회귀을 초래했다는 것을 예시하는 예시적인 그래프를 도시한다. 측정가능한 종양이 없는 완전한 반응은 mIL12-ABP10 + 명반으로 치료된 마우스 4/10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE + 명반으로 치료된 마우스 5/10에서 관찰되었다.
도 15a-15e는 단일요법으로서 그리고 항-PD-1 항체와 조합하여 예시적인 융합 폴리펩티드가 난치성 B16F10 종양을 지연시킨다는 것을 입증한다. 50μg 명반과 착화된 7.7μg의 mIL12-ABP10 또는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE를 종양 접종에 이어 6 및 13일차에 종양내로 주사했다. 일부 동물에서는, 항-PD1 항체를 mIL12-ABP10 또는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE와 조합하여 0, 3, 6, & 9일차에 복강내로 투여했다. 비히클 치료 또는 단일요법으로서의 항-PD-1 항체를 대조군으로 사용하였다. 전신 PD-1 차단과 조합 치료를 받은 그룹에서는 종양 지연이 더욱 연장되었다. 단일요법과 PD-1 조합 그룹 둘 모두에서, mIL12-ABP10에 비해 mIL12-ABP20-G4-8x-GE로 치료한 마우스에서의 중앙 생존이 더 길었다. 도 15a는 시간에 걸친 퍼센트 생존의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 15b는 비히클에 비하여 mIL12-ABP10-K/명반으로 치료된 동물에서 시간에 걸친 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 15c는 비히클에 비하여 mIL12-ABP20-G4-8x-GE/명반으로 치료된 동물에서 시간에 걸친 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 15d는 항-PD-1 항체 단독으로의 치료에 비하여 mIL12-ABP10-K/명반 및 항-PD-1 항체로 치료된 동물에서 시간에 걸친 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다. 도 15e는 항-PD-1 항체 단독으로의 치료에 비하여 mIL12-ABP20-G4-8x-GE-K/명반 및 항-PD-1 항체로 치료된 동물에서 시간에 걸친 종양 부피의 예시적인 그래프를 도시한다.
도 16a 및 도 16b는 예시적인 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체, mIL12-ABP20-G4-8x-GE-K/명반이 동소이식 4T1 유방암 모델에서 자연 전이 형성을 감소시킨다는 것을 입증한다. 종양-담지 마우스를 종양 접종 후 7일차에 50μg 명반과 착화된 5μg의 mIL12-ABP 폴리펩티드의 단일 종양내 주사로 치료하였다. 도 16a는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE/명반 치료가 비히클 치료에 비하여 원발성 종양의 성장 지연을 초래했음을 예시하는 예시적인 그래프를 도시한다. 도 16b는 28일차에 희생된 동물의 결과를 예시하고 폐에서의 전이를 계수한 예시적인 그래프를 도시한다. 비히클 치료된 마우스 10/10은 적어도 하나의 폐 전이가 있었던 반면, mIL12-ABP20-G4-8x-GE/명반 치료된 마우스에서의 마우스 중 6/10은 전이가 없었다.
도 17a 및 도 17b는 상이한 인산화 수준을 갖는 분획을 단리하기 위해 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체, mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 정제로부터의 예시적인 결과를 제공한다. 도 17a는 Ni-NTA 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제한 다음 선형 염 용리 구배로 HiTrap Q 세파로스 음이온 교환 컬럼에서 실행한 융합 폴리펩티드에 대한 예시적인 결과를 도시한다. 도 17b는 개별 용리 분획을 수집하고 말라카이트 그린 검정에 의해 인산염 수준을 측정한 경우로부터 예시적인 결과를 도시한다. 분획당 평균 인산염 수준은 융합 폴리펩티드당 2 내지 7개의 인산염 그룹의 범위였다. 무 Fam20C가 음성 대조군으로 활용되었다. 분획 112-118의 풀이 양성 대조군으로 활용되었다.
도 18a 및 도 18b는 예시적인 융합 폴리펩티드, mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 개별 분획에 대한 명반 보유의 예시적인 평가를 제공한다. 음이온 교환 수지에서 더 일찍 용리되고 더 낮은 인산화 수준을 함유하는 분획은 더 높은 인산화 수준을 갖는 나중에 용리되는 분획에 비해 명반에 더 낮은 보유를 가졌다. 도 18a에서는 시간에 걸쳐서 ELISA에 의해 정량된 상등액에서 유리 단백질을 모든 단백질이 용리된 경우 12,500ng/mL의 이론 농도와 비교했다. 도 18b는 폴리펩티드당 2.4개의 인산염을 갖는 분획 110이 24시간에 명반에 보유된 <50% 폴리펩티드를 가졌고, 폴리펩티드당 3.7개의 인산염을 갖는 분획 111이 명반에 보유된 ~80%의 폴리펩티드를 가졌음을 예시하는 예시적인 결과를 도시한다. 폴리펩티드당 각각 4.6 및 5.8개의 인산염을 갖는 분획 112 및 113은 24시간에 명반에 결합된 >95%로 고도로 유지되었다. 폴리펩티드당 >6개의 인산염을 갖는 분획 114-117은 검정에서 명반에서 용리되는 측정가능한 유리 폴리펩티드가 없었다.
도 19a-19d는 예시적인 융합 폴리펩티드, mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 개별 분획에 대한 시그널링 능력의 예시적인 평가를 제공한다. 개별 분획은 HEK-Blue-IL12 리포터 검정에서 단독으로 또는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화되어 테스트되었다. 도 19a 및 도 19b는 분획 110 및 112가 명반 존재 여부에 관계없이 유사한 피크 활성 수준을 갖고, 명반에 결합될 때 EC50에서 2-3배수 전이를 가짐을 예시한다. 도 19c 및 도 19d는 분획 114 및 117이 명반과 착화될 때 감소된 피크 활성을 가졌음을 예시한다.
도 20은 예시적인 융합 폴리펩티드, mIL12-ABP20-G4-8x의 개별 분획의 인산화 수준, 명반 보유 및 시그널링 능력을 요약한다.
도 21a-21c는 인간 IL12-ABP 물질이 활성이고 명반에 보유된다는 것을 입증한다. 도 21a는 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE가 HEK-Blue-IL12 검정에서 단독으로 3.6ng/mL 또는 수산화알루미늄과 착화되었을 때 8.2ng/mL의 EC50으로 활성임을 예시하는 예시적인 그래프를 도시한다. 도 21b는 1mM 인산염 및 20% 마우스 혈청을 함유하는 용리 완충액에서 폴리펩티드/명반 복합체의 인큐베이션에 이어서, 상등액 EC50이 >300-배수 전이하여 24시간 후에 최소 폴리펩티드 용리를 암시하는 반면, 펠렛은 5x EC50 전이로 활성을 유지했음을 예시하는 예시적인 그래프를 도시한다. 도 21c는 별도의 명반 보유 검정에서 hIL12 또는 hIL12-ABP가 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄에 결합된 다음 ELISA에 의해 검출된 유리 폴리펩티드를 갖는 20% 마우스 혈청과 1mM 인산염을 함유하는 용리 완충액으로 희석되었음을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다. hIL12-ABP20-G4-8x-GE의 대략적으로 80%가 비변형 IL12의 경우 0%에 비하여 24시간에 명반에 보유되었다.
도 22는 예시적인 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE 단백질의 평가의 예시적인 결과를 제시한다. 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리되었고 선택된 정제 분획은 말라카이트 그린 검정을 사용하여 단백질당 인산염의 수, HEK-Blue-IL12 검정을 사용한 IL12 시그널링 효력, 및 명반 보유 검정을 사용한 수산화알루미늄 결합에 대해 평가되었다.
도 23은 수산화알루미늄에 대한 예시적인 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE의 정제된 분획의 결합 및 보유를 평가한 예시적인 결과를 제시한다. 음이온 교환 수지에서 더 일찍 용리되고 더 낮은 인산화 수준을 함유하는 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE 정제 분획은 더 높은 인산화 수준을 갖는 나중에 용리되는 분획에 비해 수산화알루미늄에 더 낮은 보유를 가졌다.
도 24는 단독으로 또는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화된 HEK-Blue-IL12 리포터 검정을 사용하여 IL12-기반 시그널링을 유도하는 예시적인 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE의 정제된 분획의 능력의 평가의 예시적인 결과를 제시한다.
도 25는 예시적인 개과-IL12-ABP20-G4-8x-GE의 평가의 결과를 제시한다. 개과-IL12-ABP20-G4-8x-GE를 인간 Fam20C-KDEL 플라스미드와 함께 4:1 질량비로 HEK-293 세포 현탁액에서 공동-형질감염시켰다. 상등액을 수확하고 개과-IL12-ABP20-G4-8x-GE를 정제했다. 선택된 정제 분획은 말라카이트 그린 검정을 사용한 단백질당 인산염의 수, HEK-Blue-IL12 검정을 사용한 IL12 시그널링 효력, 및 명반 보유 검정을 사용한 수산화알루미늄 결합에 대해 평가되었다.
도 26은 수산화알루미늄에 대한 예시적인 개과-IL12-ABP20-G4-8x-GE의 정제된 분획의 결합 및 보유의 평가의 결과를 제시한다. 음이온 교환 수지에서 더 일찍 용리되고 더 낮은 인산화 수준을 함유하는 개과-IL12-ABP20-G4-8x-GE 정제 분획은 더 높은 인산화 수준을 갖는 나중에 용리되는 분획에 비해 수산화알루미늄에 더 낮은 보유를 가졌다.
도 27은 단독으로 또는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화된 HEK-Blue-IL12 리포터 검정을 사용하여 IL12-기반 시그널링을 유도하는 예시적인 개과-IL12-ABP20-G4-8x-GE의 정제된 분획의 능력의 평가의 결과를 제시한다.
정의
투여 : 본 명세서에 사용된 용어 "투여"는 전형적으로 대상체 또는 시스템에 대한 조성물의 투여를 지칭한다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어 인간에 대한 투여를 위해 활용될 수 있는 다양한 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 장내 또는 비경구일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 주사(예를 들어, 근육내, 종양내, 정맥내 또는 피하 주사)에 의해 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서 주사는 볼루스 주사, 점적, 관류 또는 주입을 포함할 수 있다. 많은 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 투여는 종양내 주사에 의해 이루어진다.
친화도 : 당업계에 공지된 바와 같이, "친화도"는 둘 이상의 결합 파트너가 서로 연관되는 견고성의 척도이다. 당업자는 친화도를 평가하는데 사용될 수 있는 다양한 검정을 알고 있고, 더욱이 그러한 검정에 대한 적절한 대조도 알고 있을 것이다. 일부 실시형태에서, 친화도는 정량 검정으로 평가된다. 일부 실시형태에서, 친화도는 복수의 농도(예를 들어, 한 번에 하나의 결합 파트너)에 걸쳐 평가된다. 일부 실시형태에서, 친화도는 하나 이상의 잠재적 경쟁자 개체의 존재(예를 들어, 관련 - 예를 들어 생리학적 - 설정에 존재할 수 있음)에서 평가된다. 일부 실시형태에서, 친화도는 기준(예를 들어, 특정 역치 이상의 알려진 친화도를 갖거나("양성 대조군" 기준) 또는 특정 역치 미만의 알려진 친화도를 갖는 것["음성 대조군" 기준"]에 대해 평가된다. 일부 실시형태에서, 친화도는 동시대의 기준에 대해 평가될 수 있고, 일부 실시형태에서, 친화도는 과거의 기준에 대해 평가될 수 있다. 전형적으로, 친화도가 기준에 대해 평가되는 경우, 비교가능한 조건 하에서 평가된다.
작용제 : 일반적으로, 본 명세서에 사용된 용어 "작용제"는 실체(예를 들어, 예로서 지질, 금속, 핵산, 폴리펩티드, 다당류, 소분자 등, 또는 이의 복합체, 조합, 혼합물 또는 시스템[예를 들어, 세포, 조직, 유기체]) 또는 현상(예를 들어, 열, 전류 또는 전기장, 자기력 또는 자기장 등)을 지칭하는데 사용된다. 적절한 상황에서, 당업자에게 문맥상 명확한 바와 같이, 용어는 세포 또는 유기체, 또는 이의 분획, 추출물 또는 성분이거나 이를 포함하는 실체를 지칭하는데 이용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 문맥에서 명확해지듯이, 용어는 자연에서 발견되고/되거나 자연으로부터 얻어지는 자연 생성물을 지칭하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에는, 다시 문맥상 명확한 바와 같이, 용어는 사람의 손의 작용을 통해 설계, 조작 및/또는 생산되고/되거나 자연에서는 발견되지 않는다는 점에서 사람이 만든 하나 이상의 실체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 단리된 형태 또는 순수한 형태로 이용될 수 있으며; 일부 실시형태에서, 작용제는 미정제 형태로 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 잠재적인 작용제는 예를 들어 그 안의 활성 작용제를 식별하거나 특성화하기 위해 스크리닝될 수 있는 컬렉션 또는 라이브러리로 제공될 수 있다.
효능제 : 당업자는 용어 "효능제"가 그 존재, 수준, 정도, 유형 또는 형태가 다른 작용제(즉, 효능화된 작용제 또는 표적 작용제)의 증가된 수준 또는 활성과 상관관계가 있는 작용제, 상태 또는 사건을 지칭하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일반적으로, 효능제는 예를 들어 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 및/또는 관련 활성화 활성을 나타내는 임의의 다른 실체를 포함하는 임의의 화학 부류의 작용제일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효능제는 직접적일 수 있으며(이 경우에는 그것은 그 표적에 직접으로 영향을 발휘함); 일부 실시형태에서, 효능제는 간접적일 수 있다(이 경우, 그것은 그 표적에 결합하는 것 이외의 방식으로, 예를 들어 표적의 조절제와 상호작용하여 표적의 수준 또는 활성을 변경함에 의해 영향을 발휘함).
아미노산 : 가장 넓은 의미에서, 본 명세서에 사용된 용어 "아미노산"은 예를 들어 하나 이상의 펩티드 결합의 형성을 통해 폴리펩티드 사슬 안으로 합체될 수 있거나, 되거나, 또는 합체된 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 일반 구조 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 자연적으로-발생하는 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 비-자연 아미노산이고; 일부 실시형태에서, 아미노산은 D-아미노산이고; 일부 실시형태에서, 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 자연적으로 발생하는 펩티드에서 흔히 발견되는 20개의 표준 L-아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. "비표준 아미노산"은 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭하며, 그것이 합성적으로 제조된 것인지, 자연 공급원에서 얻은 것인지를 불문한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 내의 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하는 아미노산은 상기 일반적인 구조와 비교하여 구조적 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 아미노산은 일반 구조와 비교하여 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 페길화, 글리코실화, 인산화 및/또는 치환(예를 들어, 아미노 기, 카르복실산 기, 하나 이상의 양성자 및/또는 수산기의 것)에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형은 예를 들어, 그렇지 않으면 동등한 변형되지 않은 아미노산을 함유하는 것과 비교하여 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 순환 반감기를 변경할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형은 그렇지 않으면 동등한 변형되지 않은 아미노산을 함유하는 것과 비교하여 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 관련 활성을 유의하게 변경시키지 않는다. 문맥에서 명확한 바와 같이, 일부 실시형태에서 용어 "아미노산"은 유리 아미노산을 지칭하는데 사용될 수 있으며; 일부 실시형태에서 이는 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 지칭하는데 사용될 수 있다.
동물: 본 명세서에 사용된 바와 같이 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "동물"은 어느 성별 및 임의의 발달 단계의 인간을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비-인간 동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 포유동물(예를 들어, 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 말, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 실시형태에서, 동물에는 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 및/또는 벌레류가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 동물은 형질전환 동물, 유전적으로 조작된 동물 및/또는 클론일 수 있다.
항체: 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 대한 특이적 결합을 부여하기에 충분한 규범적 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 자연에서 생산된 온전한 항체는 서로 회합하여 일반적으로 'Y-형상' 구조로 지칭되는 2개의 동등한 중쇄 폴리펩티드(각각 약 50kD) 및 2개의 동등한 경쇄 폴리펩티드(각각 약 25kD)로 구성된 대략적으로 150kD 사량체 작용제이다. 각 중쇄는 적어도 4개의 도메인(각각 약 110개의 아미노산 길이)―아미노-말단 가변(VH) 도메인(Y 구조의 선단에 위치됨)과, 이어서 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 카르복시-말단 CH3(Y의 줄기의 기저부에 위치됨)으로 구성된다. "스위치"로 알려진 짧은 영역은 중쇄 가변 영역과 불변 영역을 연결한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지 부분에 연결한다. 이 힌지 영역에서 2개의 이황화 결합은 온전한 항체에서 2개의 중쇄 폴리펩티드를 서로 연결한다. 각 경쇄는 2개의 도메인 - 아미노-말단 가변(VL) 도메인과, 이어서 또 다른 "스위치"에 의해 서로 분리된, 카르복시-말단 불변(CL) 도메인으로 구성된다. 온전한 항체 사량체는 중쇄와 경쇄가 단일 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄-경쇄 이량체로 구성되며; 2개의 다른 이황화 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하여 이량체가 서로 연결되고 사량체가 형성된다. 자연적으로-생성된 항체는 또한 전형적으로 CH2 도메인에서 글리코실화되어 있다. 자연 항체에서의 각 도메인은 압축된 역평행 베타 배럴에서 서로에 대해 패키징된 2개의 베타 시트(예를 들어, 3-, 4-, 또는 5-가닥 시트)로 형성된 "면역글로불린 접힘"을 특징으로 하는 구조를 가지고 있다. 각 가변 도메인은 "보체 결정 영역"(CDR1, CDR2 및 CDR3)으로 알려진 3개의 초가변 루프와 다소 불변인 4개의 "프레임워크" 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 함유한다. 자연 항체가 접히면, FR 영역은 도메인에 대한 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고 중쇄와 경쇄 둘 모두로부터 CDR 루프 영역은 3-차원 공간에서 함께 모여 Y 구조의 선단에 위치된 단일 초가변 항원 결합 부위를 생성한다. 자연적으로-발생하는 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소에 결합하고 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 효과기 세포를 포함한 효과기 세포의 수용체에 결합한다. 당업계에 공지된 바와 같이, Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 기타 결합 속성은 글리코실화 또는 기타 변형을 통해 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 생산 및/또는 이용되는 항체는 글리코실화와 같이 변형되거나 조작된 Fc 도메인을 포함한 글리코실화된 Fc 도메인을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 특정 실시형태에서, 자연 항체에서 발견되는 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 이러한 폴리펩티드가 자연적으로 생성되는지(예를 들어, 항원에 반응하는 유기체에 의해 생성됨), 또는 재조합 조작, 화학적 합성 또는 기타 인공 시스템이나 방법론에 의해 생성되는지 여부에 관계없이 "항체"로 지칭 및/또는 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 다클론성이고; 일부 실시형태에서 항체는 단일클론성이다. 일부 실시형태에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체의 특징인 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체 서열 요소는 당업계에 공지된 바와 같이 인간화된, 영장류화된, 키메라 등이다. 더욱이, 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 적절한 실시형태에서 (달리 명시되지 않거나 문맥상 명확하지 않는 한) 대체 제시에서 항체 구조적 및 기능적 특징을 이용하기 위한 임의의 당업계에 공지되거나 개발된 작제물 또는 형식을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체는 이에 제한되지는 않지만, 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중-특이적 항체(예를 들어, Zybodies® 등); Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편 및 이의 단리된 CDR 또는 세트와 같은 항체 단편; 단일 사슬 Fvs; 폴리펩티드-Fc 융합체; 단일 도메인 항체, 대체 스캐폴드 또는 항체 모방체(예를 들어, 안티칼린, FN3 모노바디, DARPins, Affibodies, Affilins, Affimers, Affitins, Alphabodies, Avimers, Fynomers, Im7, VLR, VNAR, Trimab, CrossMab, Trident); 나노바디, 비나노바디, F(ab')2, Fab', di-sdFv, 단일 도메인 항체, 삼작용성 항체, 디아바디 및 미니바디. 등으로부터 선택된 형식으로 된다. 일부 실시형태에서 관련 형식은 Adnectins®; Affibodies®; Affilins®; Anticalins®; Avimers®; BiTE®류; 카멜로이드 항체; Centyrins®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; 이중-친화도 재-표적화(DART) 작용제; Fynomers®; IgNAR과 같은 상어 단일 도메인 항체; 암에 대한 면역 동원성 단일클론 T 세포 수용체(ImmTAC); KALBITOR®류; 미세단백질류; Nanobodies® 미니바디; 차폐된 항체(예를 들어, Probodies®); 소형 모듈형 면역의약품("SMIPsTM"); 단일 사슬 또는 직렬 디아바디(TandAb®); TCR-유사 항체; Trans-bodies®; TrimerX®; VHH이거나 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 자연적으로 생성된다면 가질 수 있는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)을 결할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드[예를 들어, 검출가능한 모이어티, 치료적 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 다른 현수기[예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜, 등])를 함유할 수 있다.
항체 단편: 본 명세서에 사용된 "항체 단편"은 본 명세서에 기술된 항체 또는 항체 작용제의 부분을 지칭하고, 전형적으로 항원-결합 부분 또는 이의 가변 영역을 포함하는 부분을 지칭한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 항체 단편은 온전한 항체 또는 항체 작용제의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산될 수 있다(즉, 조작된 핵산 서열의 발현에 의함. 일부 실시형태에서, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 단편(특히 항원-결합 항체 단편)은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190개 아미노산 또는 그 초과, 일부 실시형태에서는 적어도 약 200개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
결합: 본 명세서에 사용된 용어 "결합"은 전형적으로 2개 이상의 실체 사이 또는 이들 중의 비-공유 회합을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. "직접" 결합은 실체 또는 모이어티 간의 물리적 접촉이 포함하고; 간접 결합은 하나 이상의 중간체 실체와의 물리적 접촉을 통한 물리적 상호작용을 포함한다. 2개 이상의 실체 간의 결합은 전형적으로 상호작용하는 실체 또는 모이어티가 단리되어 연구되거나 더 복잡한 시스템(예를 들어, 공유적으로, 정전기적으로 또는 그렇지 않으면 캐리어 실체와 연관되는 동안 및/또는 생물학적 시스템이나 세포 내)의 맥락에서 연구되는 경우를 포함하여 - 임의의 다양한 상황에서 평가될 수 있다. 평가된 조건 하에서 관련 실체가 다른 이용가능한 결합 파트너보다 서로 연관될 가능성이 더 높은 경우 2개 실체 사이의 결합은 "특이적"으로 간주될 수 있다.
암: 용어 "암", "악성종양", "신생물", "종양" 및 "암종"은 상대적으로 비정상적, 조절되지 않고/않거나 자율적인 성장을 나타내는 세포를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용되어, 그것은 세포 증식 조절의 상당한 상실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 종양은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 사전-전이성, 전이성 및/또는 비-전이성인 세포이거나 이를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 그의 교시가 특히 관련될 수 있는 특정 암을 구체적으로 식별한다. 일부 실시형태에서, 관련 암은 고형 종양을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관련 암은 혈액학적 종양을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 다양한 유형의 암의 예는, 예를 들어, 백혈병, 림프종(호지킨 및 비-호지킨), 골수종 및 골수증식성 장애를 포함하는 조혈암; 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 입, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 간암, 비뇨생식기암 예컨대 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 자궁암, 및 자궁내막암 및 신장 세포 암종, 골암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안내 흑색종, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 두경부암, 유방암, 위장암 및 신경계암, 양성 병변 예컨대 유두종 등을 포함한다.
특징적인 서열 요소: 본 명세서에 사용된 어구 "특징적인 서열 요소"는 중합체의 특징적인 부분을 나타내는 중합체(예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산)에서 발견되는 서열 요소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 특징적인 서열 요소의 존재는 중합체의 특정 활성 또는 특성의 존재 또는 수준과 상관관계가 있다. 일부 실시형태에서, 특징적인 서열 요소의 존재(또는 부재)는 특정 중합체를 그러한 중합체의 특정 계열 또는 그룹의 구성원(또는 구성원이 아님)으로 정의한다. 특징적인 서열 요소는 전형적으로 적어도 2개의 단량체(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 특징적인 서열 요소는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 단량체(예를 들어, 연속적으로 연결된 단량체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 특징적인 서열 요소는 그 길이가 서열 요소를 공유하는 중합체에 걸쳐 변할 수도 있고 변하지 않을 수도 있는 하나 이상의 스페이서 영역에 의해 이격된 연속 단량체의 적어도 제1 및 제2 스트레치를 포함한다.
화학요법제: 본 명세서에서 사용된 용어 "화학요법제"는 하나 이상의 향-세포자멸사, 세포증식억제 및/또는 세포독성 작용제, 예를 들어 구체적으로 바람직하지 않은 세포 증식과 연관된 하나 이상의 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위해 이용 및/또는 권장되는 작용제를 포함하는 것을 지칭하는 당업계에서 이해되는 의미를 갖는다. 많은 실시형태에서, 화학요법제는 암의 치료에 유용하다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 하나 이상의 알킬화제, 하나 이상의 안트라사이클린, 하나 이상의 세포골격 파괴물질(예를 들어 미세소관 표적화제 예컨대 탁산, 메이탄신 및 이의 유사체), 하나 이상의 에포틸론, 하나 이상의 히스톤 데아세틸라제 억제제 HDAC), 하나 이상의 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 토포이소머라제 I 및/또는 토포이소머라제 II의 억제제), 하나 이상의 키나제 억제제, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 전구체 유사체, 하나 이상의 펩티드 항생제, 하나 이상의 백금-기반 작용제, 하나 이상의 레티노이드, 하나 이상의 빈카 알칼로이드 및/또는 하나 이상의 다음 중 하나 이상의 유사체(즉, 관련 항-증식 활성을 공유함)이거나 포함할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 화학요법제는 악티노마이신, 올-트랜스 레티노산, 아우리스타틴, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 커큐민, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포사이드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메이탄신 및/또는 이의 유사체(예를 들어, DM1) 메클로레타민, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 메이탄시노이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉시드, 테니포사이드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈 및 이의 조합 중 하나 이상이거나 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 항체-약물 접합체의 맥락에서 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 hLL1-독소루비신, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-독소루비신, 젬투주맙 오조가미신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가미신, 글렘바투모맙 베도틴, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, 항-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, 보세투주맙 마포도틴, 및 로보투주맙 메르탄신으로 구성된 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체에서 발견되는 것이다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 Govindan 등, TheScientificWorldJOURNAL 10:2070, 2010, -2089 중 하나 이상에 기재되거나 논의된 바와 같이 항체-약물 접합체에 이용되는 것으로 기재된 것일 수 있다). 일부 실시형태에서, 화학요법제는 파르네실-티오살리실산(FTS), 4-(4-클로로-2-메틸페녹시)-N-하이드록시부탄아미드(CMH), 에스트라디올(E2), 테트라메톡시스틸벤(TMS), δ-토카트리에놀, 살리노마이신, 또는 커큐민조합 요법 중 하나 이상이거나 포함할 수 있다: 본 명세서에 사용된 용어 "조합 요법"은 대상체가 2개 이상의 치료적 처방(예를 들어, 2개 이상의 치료제)에 동시에 노출되는 이들 상황을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 작용제가 동시적으로 투여될 수 있으며; 일부 실시형태에서, 이러한 작용제는 순차적으로 투여될 수 있으며; 일부 실시형태에서, 이러한 작용제는 중복하는 복용 처방으로 투여된다.
조합 요법: 본 명세서에 사용된 용어 "조합 요법"은 대상체가 2개 이상의 치료적 처방(예를 들어, 2개 이상의 치료제)에 동시에 노출되는 이들 상황을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 처방은 동시적으로 투여될 수 있으며; 일부 실시형태에서, 이러한 처방은 순차적으로 투여될 수 있으며(예를 들어, 제1 처방의 모든 "용량"은 제2 처방의 임의의 용량의 투여 이전에 투여됨); 일부 실시형태에서, 이러한 작용제는 중복하는 복용 처방으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조합 요법의 "투여"는 조합으로 다른 작용제(들) 또는 양식(들)을 받는 대상체에게 하나 이상의 작용제(들) 또는 양식(들)의 투여를 포함할 수 있다. 명확하게 하기 위해, 조합 요법은 개별 작용제가 단일 조성물로 함께(또는 심지어 반드시 동시에) 투여될 것을 요구하지 않지만, 일부 실시형태에서는 2개 이상의 작용제 또는 이의 활성 모이어티는 조합 조성물, 또는 심지어 조합 화합물(예를 들어, 단일 화학 복합체 또는 공유 실체의 일부)로 함께 투여될 수 있다.
복용 처방 : 당업자는 용어 "복용 처방"이 대상체에게 개별적으로, 전형적으로 기간별로 분리되어 투여되는 일련의 단위 용량(전형적으로 1회 초과)을 지칭하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 주어진 치료제는 1회 이상의 용량을 포함할 수 있는 권장 복용 처방을 갖는다. 일부 실시형태에서, 복용 처방은 각각이 시간에 따라 다른 용량과 분리되는 복수의 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개별 용량은 동일한 길이의 기간만큼 서로 분리되고; 일부 실시형태에서, 복용 처방은 복수의 용량 및 개별 용량을 분리하는 적어도 2개의 상이한 기간을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복용 처방 내의 모든 용량은 동일한 단위 용량 양의 것이다. 일부 실시형태에서, 복용 처방 내에서 상이한 용량은 상이한 양의 것이다. 일부 실시형태에서, 복용 처방은 제1 용량 양에서의 제1 용량에 이어 제1 용량 양과 상이한 제2 용량 양에서의 하나 이상의 추가 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복용 처방은 제1 용량의 제1 용량 양에서의 제1 용량에 이어 제1 용량 양과 동일한 제2 용량 양에서의 하나 이상의 추가 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복용 처방은 관련 모집단에 걸쳐 투여될 때 원하는 또는 유익한 결과와 상관관계가 있다(즉, 치료적 복용 처방이다).
에피토프: 본 명세서에 사용된 용어 "에피토프"는 면역글로불린(예를 들어, 항체 또는 수용체) 결합 성분에 의해 특이적으로 인식되는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 항원 상의 복수의 화학 원자 또는 기로 구성된다. 일부 실시형태에서, 이러한 화학 원자 또는 기는 항원이 관련된 3-차원 형태를 채택할 때 표면-노출된다. 일부 실시형태에서, 이러한 화학 원자 또는 기는 항원이 이러한 형태를 채택할 때 공간에서 물리적으로 서로 근접한다. 일부 실시형태에서, 이러한 화학 원자 기의 적어도 일부는 항원이 대체 형태를 채택할 때(예를 들어 선형화됨) 물리적으로 서로 분리된다.
부형제: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 예를 들어 원하는 점조성 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 약학적 조성물에 포함될 수 있는 비-치료제를 지칭한다. 적합한 약학적 부형제는 예를 들어 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
발현: 본 명세서에 사용된 용어 핵산 서열의 "발현"은 핵산 서열로부터 임의의 유전자 생성물의 생성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 전사체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열의 발현은 다음 중 하나 이상을 포함한다: (1) DNA 서열로부터 (예를 들어, 전사에 의해) RNA 주형의 생성; (2) (예를 들어, 스플라이싱, 편집 등에 의한) RNA 전사체의 처리; (3) 폴리펩티드 또는 단백질로 RNA의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형.
기능적: 본 명세서에서 사용되는 용어 "기능적"은 특정 특성 및/또는 활성을 나타내는 실체의 형태 또는 단편을 지칭하는데 사용된다.
단편: 본 명세서에 기술된 물질 또는 실체의 "단편"은 전체 중 별도의 부분을 포함하지만 전체에서 발견되는 하나 이상의 모이어티를 결하는 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편은 이러한 별도의 부분으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 단편은 전체에서 발견되는 특징적인 구조적 요소 또는 모이어티로 구성되거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 , 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 또는 그 초과의 단량체 단위(예를 들어, 잔기)를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 단량체 단위(예를 들어, 잔기)의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과를 포함하거나 이로 구성된다. 전체 물질 또는 실체는 일부 실시형태에서 단편의 "모"로 지칭될 수 있다.
유전자: 본 명세서에 사용된 용어 "유전자"는 생성물(예를 들어, RNA 생성물 및/또는 폴리펩티드 생성물)을 인코딩하는 염색체에서의 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 코딩 서열(즉, 특정 생성물을 인코딩하는 서열)을 포함하고; 일부 실시형태에서, 유전자는 비-코딩 서열을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 유전자는 코딩(예를 들어, 엑손) 및 비-코딩(예를 들어, 인트론) 서열 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 예를 들어 유전자 발현의 하나 이상의 측면(예를 들어, 세포-유형-특이적 발현, 유도성 발현 등)을 제어하거나 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함할 수 있다.
유전자 산물 또는 발현 산물: 본 명세서에서 사용된 용어 "유전자 산물" 또는 "발현 산물"은 일반적으로 유전자(처리-전 및/또는 처리-후)로부터 전사된 RNA 또는 유전자로부터 전사된 RNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드(변형-전 및/또는 변형-후)를 지칭한다.
게놈: 본 명세서에 사용된 용어 "게놈"은 그 염색체의 완전한 DNA 서열에 의해 표시되는, 개별 유기체 또는 세포에 의해 운반되는 전체 유전 정보를 지칭한다.
숙주 세포: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 외인성 DNA(재조합 또는 기타)가 그 안으로 도입된 세포를 지칭한다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자는 그러한 용어가 특정 대상체 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 외인성 DNA(예를 들어, 재조합 핵산 서열)를 발현하는데 적합한 임의의 생명계으로부터 선택된 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 예시적인 세포는 원핵생물과 진핵생물의 것(단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포(예를 들어, 대장균, 바실러스 spp., 스트렙토마이세스 spp. 등의 계통), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S. 세레비지애, S. 폼베, P. 파스토리스, P. 메탄올리카 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바쿨로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플러시아 나이 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 세포 융합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트 또는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵 세포이고 다음 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3 A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 이전에 언급된 세포로부터 유래된 세포주이다. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함한다.
인간: 일부 실시형태에서, 인간은 배아, 태아, 유아, 어린이, 10대, 성인 또는 노인이다.
"개선된", "증가된" 또는 "감소된": 본 명세서에 사용된 이들 용어 또는 문법적으로 비교가능한 비교 용어는 비교가능한 기준 측정에 상대적인 값을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 관심있는 작용제로 달성된 평가된 값은 비교가능한 기준 작용제로 얻은 값에 비해 "개선"될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서 관심있는 대상체 또는 시스템에서 달성된 평가된 값은 다른 조건(예를 들어, 관심있는 작용제의 투여와 같은 사건 이전 또는 후) 하에서, 또는 다른, 비교가능한 대상체에서(예를 들어, 관심있는 특정 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 지표의 존재에서 관심있는 대상체 또는 시스템과 다른 비교가능한 대상체 또는 시스템에서, 또는 상태 또는 작용제 등에 대한 사전 노출에서) 동일한 대상체 또는 시스템에서 얻은 값에 비해 "개선"될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비교 용어는 통계적으로 관련된 차이(예를 들어, 통계적 관련성을 달성하기에 충분한 유병률 및/또는 크기)를 지칭한다. 당업자는 주어진 맥락에서 이러한 통계적 유의성을 달성하는데 필요하거나 충분한 차이의 정도 및/또는 유력을 알고 있거나 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
시험관내: 본 명세서에서 사용된 용어 "시험관내"는 다중-세포 유기체 내부가 아닌 인공 환경, 예를 들어 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양물 등에서 발생하는 사건을 지칭한다.
생체내: 본 명세서에 사용된 바와 같이 인간 및 비-인간 동물과 같은 다중-세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 지칭한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 용어는 살아있는 세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하는데 사용될 수 있다(예를 들어 시험관내 시스템과 반대).
단리된: 본 명세서에 사용된 바와 같이, (1) (자연에서든 및/또는 실험 환경에서든) 처음으로 생산되었을 때 그것이 회합되었던 구성요소 중 적어도 일부로부터 분리된, 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 설계, 생산, 준비 및/또는 제조된 물질 및/또는 실체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 실체는 그것이 처음으로 회합되었던 다른 구성요소의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과 순수한다. 본 명세서에 사용된 물질은 다른 구성요소가 실질적으로 없으면 "순수"하다. 일부 실시형태에서, 당업자가 이해하는 바와 같이, 물질은 예를 들어 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)와 같은 특정 다른 구성요소와 조합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있고; 그러한 실시형태에서, 물질의 단리 또는 순도 퍼센트는 그러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 한 가지 예를 들자면, 일부 실시형태에서 자연에서 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 중합체는 a) 그 기원 또는 유래의 공급원으로 인해 자연에서의 그 고유한 상태에 수반되는 구성요소 중 일부 또는 전부와 연관되지 않는 경우; b) 자연에서 이를 생산하는 종과 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로 없는 경우; c) 자연에서 이를 생산하는 종이 아닌 세포 또는 기타 발현 시스템으로부터 구성요소에 의해 발현되거나 그렇지 않으면 이와 연관되어 있는 경우 "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예로서 일부 실시형태에서, 화학적으로 합성되거나 자연에서 생성되는 것과 다른 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드로 간주된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 정제 기술을 거친 폴리펩티드는 a) 그것이 자연에서 회합되어 있는; 및/또는 b) 처음으로 생산되었을 때 회합되었던 다른 구성요소로부터 분리된 정도까지 "단리된" 폴리펩티드로 간주될 수 있다.
링커: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 서로 다른 요소를 서로 연결하는 다중-요소 작용제의 그 부분을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, 당업자는 구조가 2개 이상의 기능적 또는 조직적 모이어티 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 종종 이러한 모이어티 또는 도메인 사이에 그들을 서로 연결하는 아미노산의 스트레치를 포함한다는 것을 인식한다. 일부 실시형태에서, 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드는 일반 형태 S1-L-S2의 전반적인 구조를 가지며, 여기서 S1 및 S2는 동일하거나 상이할 수 있고 링커에 의해 서로 회합된 2개의 모이어티 또는 도메인을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 링커는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 그 초과 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 단단한 3-차원 구조를 채택하지 않고 오히려 폴리펩티드에 유연성을 제공하는 경향이 있는 것을 특징으로 한다. 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 조작할 때 적절하게 사용될 수 있는 다양한 서로 다른 링커 요소가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Holliger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444, 1993; Poljak 등 Structure 2:1121, 1994 참조).
조절제: 용어 "조절제"는 관심있는 활성이 관찰되는 시스템에서의 존재 또는 수준이 조절제가 부재하는 그렇지 않은 비교가능한 조건 하에서 관찰된 것과 비교하여 그 활성의 수준 및/또는 본성에서의 변화와 상관관계가 있는 실체를 지칭하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 조절제는 조절제가 부재하는 때 그렇지 않은 비교가능한 조건 하에서 관찰되는 것과 비교하여 그 존재에서 활성이 증가한다는 점에서 활성화제이다. 일부 실시형태에서, 조절제는 조절제가 부재하는 때 그렇지 않은 비교가능한 조건과 비교하여 그 존재에서 활성이 감소된다는 점에서 길항제 또는 억제제이다. 일부 실시형태에서, 조절제는 관심있는 그 활성이 있는 표적 실체와 직접적으로 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 조절제는 관심있는 그 활성이 있는 표적 실체와 간접적으로(즉, 표적 실체와 상호작용하는 중간 작용제와 직접적으로) 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 조절제는 관심있는 표적 실체의 수준에 영향을 미치고; 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 조절제는 표적 실체의 수준에 영향을 미치지 않고 관심있는 표적 실체의 활성에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 조절제는 관심있는 표적 실체의 수준 및 활성 둘 모두에 영향을 미쳐, 관찰된 활성에서의 차이가 관찰된 수준에서의 차이에 의해 완전히 기술되지 않거나 이와 상응하지 않게 된다.
모이어티: 당업자는 "모이어티"가 본 명세서에 기술된 바와 같이 특정 구조 및/또는 활성을 갖는 정의된 화학 기 또는 실체라는 것을 인식할 것이다. 전형적으로 "모이어티"는 분자 또는 실체의 전체가 아닌 일부이다.
돌연변이체: 본 명세서에 사용된 용어 "돌연변이체"는 참조 실체와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만 참조 실체와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준에서 참조 실체와 구조적으로 다른 실체를 지칭한다. 많은 실시형태에서, 돌연변이체는 또한 그의 참조 실체와 기능적으로 상이하다. 일반적으로 특정 실체가 참조 실체의 "돌연변이체"로 적절하게 간주되는지 여부는 참조 실체와의 그 구조적 동일성의 정도에 기반된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 실체는 특정한 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 정의에 따르면, 돌연변이체는 하나 이상의 그러한 특징적인 구조적 요소를 공유하는 별개의 화학적 실체이다. 단지 몇 가지 예를 들자면, 소분자는 특징적인 핵심 구조적 요소(예를 들어, 거대고리 코어) 및/또는 하나 이상의 특징적인 현수 모이어티를 가질 수 있어 소분자의 돌연변이체는 핵심 구조적 요소와 특징적인 현수 모이어티를 공유하지만 다른 현수 모이어티 및/또는 코어 내에 존재하는 결합의 유형(단일 대 이중, E 대 Z 등)이 다른 것이고, 폴리펩티드는 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고및/갖거나 특정 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고, 핵산은 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열에서 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유적으로 부착된 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질 등)에서 하나 이상의 차이로 인해 참조 폴리펩티드와 다를 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 99%인 참조 폴리펩티드와의 전반적인 서열 동일성을 나타낸다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 결한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 나타낸다.
작동가능하게 연결된: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 기술된 구성요소가 그 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 기능적 요소에 "작동가능하게 연결된" 제어 요소는 기능적 요소의 발현 및/또는 활성이 제어 요소와 호환되는 조건 하에서 달성되는 그러한 방식으로 연관된다. 일부 실시형태에서, "작동가능하게 연결된" 제어 요소는 관심있는 코딩 요소와 인접하고(예를 들어, 공유적으로 연결되고); 일부 실시형태에서, 제어 요소는 관심있는 기능적 요소와 반대쪽으로 또는 그렇지 않은 방식으로 작동한다.
환자: 본 명세서에 사용된 용어 "환자"는 제공된 조성물이 예를 들어 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적으로 투여되거나 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 비-인간 영장류 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시형태에서, 환자는 하나 이상의 장애 또는 병태를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉽다. 일부 실시형태에서, 환자는 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 환자는 하나 이상의 장애 또는 병태를 갖는 것으로 진단되었다. 일부 실시형태에서, 장애 또는 병태는 암, 또는 하나 이상의 종양의 존재이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 질환, 장애 또는 병태를 진단 및/또는 치료하기 위한 특정 요법을 받고 있거나 받은 적이 있다.
약학적 조성물: 본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 조성물"은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 활성 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 활성제는 관련 모집단에 투여될 때 미리결정된 치료적 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료적 처방에서 투여하기에 적합한 단위 용량으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 투여 경로에 적합한 것을 포함하여 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제형화될 수 있다.
약학적으로 허용가능한: 본 명세서에 사용된 문구 "약학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 부합한 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증이 없이 인간 및/또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 작용제 또는 실체를 지칭하는데 사용된다.
약학적으로 허용가능한 담체: 본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체 화합물을 신체의 일 기관 또는 일부에서 신체의 다른 기관 또는 일부로 운반 또는 이송에 관여하는, 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이 있고 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "허용가능"하여야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는: 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당; 옥수수 전분, 감자 전분과 같은 전분; 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 그 유도체; 분말 트라가칸스; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레이트, 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 완충액; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 약학적 제형에 이용되는 기타 무-독성 호환 물질을 포함한다.
약학적으로 허용가능한 염: 본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 약학적 맥락에서 사용하기에 적합한 이러한 화합물의 염, 즉 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하급 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 염을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)에 약학적으로 허용가능한 염을 자세히 기술한다. 일부 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 아세트산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산으로부터, 또는 이온 교환과 같은 당업계에서 사용되는 다른 방법을 사용함에 의해 형성된 아미노기의 염인 무독성 산부가염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 요오드화수소산염, 2-하이드록시-에탄술포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 황산염, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙틴에이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 인산염, 피크산염, 피발산염, 프로피오네이트, 스테아르산염, 숙신산염, 황산염, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 발레산염 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 염은 적절한 경우 할로겐화물, 수산화물, 카르복실산염, 황산염, 인산염, 질산염, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 술포네이트 및 아릴 술포네이트와 같은 반대이온을 사용하여 형성된 무독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다.
폴리펩티드: 본 명세서에 사용된 바와 같이 아미노산의 중합체 사슬을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 사람의 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생산되도록 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 또는 둘 모두를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산만 또는 비-천연 아미노산만을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 D-아미노산, L-아미노산, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 L-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 현수 기 또는 다른 변형, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단, 폴리펩티드의 C-말단, 또는 이의 임의의 조합에서 하나 이상의 아미노산 측쇄를 변형하거나 이에 부착되는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 현수 기 또는 변형은 아세틸화, 아미드화, 지질화, 메틸화, 페길화 등으로, 이의 조합을 포함하는 것으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 환형일 수 있고/있거나 환형 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 환형이 아니고/아니거나 임의의 환형 부분을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 선형이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 스테이플링된 폴리펩티드이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "폴리펩티드"는 참조 폴리펩티드의 명칭, 활성 또는 구조에 첨부될 수 있고; 그러한 경우, 이는 관련 활성 또는 구조를 공유하는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용되고, 따라서 동일한 부류 또는 계열의 폴리펩티드의 구성원으로 간주될 수 있다. 이러한 각 부류에 대해, 본 명세서는 그 아미노산 서열 및/또는 기능이 공지되어 있는 부류 내의 예시적인 폴리펩티드를 제공하고/하거나 당업자는 이를 알 것이고; 일부 실시형태에서, 이러한 예시적인 폴리펩티드는 폴리펩티드 부류 또는 계열에 대한 참조 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 부류 또는 계열의 구성원은 부류의 참조 폴리펩티드와; 일부 실시형태에서는 부류 내의 모든 폴리펩티드와 유의미한 서열 상동성 또는 동일성을 나타내고, 이와 공통 서열 모티프(예를 들어 특징적인 서열 요소)를 공유하고/하거나 (일부 실시형태에서는 필적할만한 수준에서 또는 지정된 범위 내에서) 공통 활성을 공유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 구성원 폴리펩티드는 적어도 약 30-40%이고, 종종 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 초과하는 참조 폴리펩티드와의 서열 상동성 또는 동일성의 전반적인 정도를 나타내고 및/또는 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하는 매우 높은 서열 동일성을 나타내는 적어도 하나의 영역(예를 들어, 일부 실시형태는 특징적인 서열 요소이거나 이를 포함할 수 있는 보존된 영역)을 포함한다. 이러한 보존된 영역은 일반적으로 적어도 3-4개, 종종 최대 20개 이상의 아미노산을 포괄하고; 일부 실시형태에서, 보존된 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 인접 아미노산의 적어도 하나의 스트레치를 포괄한다. 일부 실시형태에서, 관련 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 단편을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 폴리펩티드는 복수의 단편을 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 이들 각각은 관심있는 폴리펩티드에서 발견되는 것보다 서로에 대해 상이한 공간 배열에서의 동일한 모 폴리펩티드에서 발견되어(예를 들어, 모체에서 직접적으로 연결된 단편은 관심있는 폴리펩티드에서 공간적으로 분리될 수 있거나 그 반대일 수 있고/있거나 단편은 관심있는 폴리펩티드에서 모체에서의 것과 다른 순서로 존재할 수 있어), 관심있는 폴리펩티드는 그 모 폴리펩티드의 유도체이다.
미리결정된: 미리결정된다는 것은 예를 들어 무작위로 발생하거나 달성되는 것과는 대조적으로 의도적으로 선택되는 것을 의미한다.
순수: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 작용제 또는 실체는 다른 구성요소가 실질적으로 없다면 그것은 "순수"하다. 예를 들어, 약 90% 초과의 특정 작용제 또는 실체를 함유하는 제제는 전형적으로 순수 제제인 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 작용제 또는 실체는 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 순수하다.
재조합체: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 제조, 발현, 생성, 제조 및/또는 단리된 폴리펩티드, 예컨대 숙주 세포 안으로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드; 재조합체, 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드; 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 구성요소(들), 부분(들), 요소(들), 또는 도메인(들)의 발현을 인코딩 및/또는 지시하는 유전자 또는 유전자들, 또는 유전자 구성요소를 발현하도록 형질전환되거나 달리는 조작된 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 양, 물고기 등)로부터 단리된 폴리펩티드; 및/또는 선택된 핵산 서열 요소를 서로 스플라이싱하거나 결찰시키는 것, 선택된 서열 요소를 화학적으로 합성하는 것, 및/또는 달리는 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 구성요소(들), 부분(들), 요소(들) 또는 도메인(들)의 발현을 인코딩 및/또는 지시하는 핵산을 생성하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩티드를 지칭하도록 의도된다. 일부 실시형태에서, 그러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시형태에서, 그러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 인 실리코 설계된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 그러한 선택된 서열 요소는 예를 들어 천연 또는 합성 공급원 예컨대, 예를 들어 관심있는 공급원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스 등)의 생식계열로부터의 공지된 서열 요소의 돌연변이유발(예를 들어, 생체내 또는 시험관내)로부터 발생한다.
참조 표준: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 비교가 수행되는 것과 관련한 표준 또는 대조를 기술한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 관심있는 작용제, 동물, 개체, 모집단, 샘플, 서열 또는 값은 참조 또는 대조 작용제, 동물, 개체, 모집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교된다. 일부 실시형태에서, 참조 또는 대조는 관심있는 테스트 또는 결정과 실질적으로 동시에 테스트 및/또는 결정된다. 일부 실시형태에서, 참조 또는 대조는 선택적으로 유형 배지에 구현된 과거의 참조 또는 대조이다. 전형적으로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 참조 또는 대조는 평가 중인 것과 비교가능한 조건 또는 상황 하에서 결정되거나 특징화된다. 당업자는 특정한 가능한 참조 또는 대조에 대한 의존 및/또는 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재하는 경우를 인식할 것이다.
특이적 결합: 본 명세서에 사용된 용어 "특이적 결합"은 결합이 발생하는 환경에서 가능한 결합 파트너 간을 구별하는 능력을 지칭한다. 다른 잠재적 표적이 존재할 때 하나의 특정 표적과 상호작용하는 결합제는 그것이 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합"한다고 언급된다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 결합제와 그 파트너 사이의 회합의 정도를 검출하거나 결정함에 의해 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리의 정도를 검출하거나 결정함에 의해 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 그의 파트너와 또 다른 실체 사이의 대안적 상호작용과 경쟁하는 결합제의 능력을 검출하거나 결정함에 의해 평가된다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 농도의 범위에 걸쳐 그러한 검출 또는 결정을 수행함에 의해 평가된다.
특이적: 활성을 갖는 작용제와 관련하여 본 명세서에서 사용될 때 용어 "특이적"은 작용제가 잠재적인 표적 실체 또는 상태 간을 구별한다는 것을 의미하는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 작용제는 하나 이상의 경쟁하는 대체 표적의 존재에서 표적과 우선적으로 결합하는 경우 표적에 "특이적으로" 결합하는 것으로 언급된다. 많은 실시형태에서, 특정 상호작용은 표적 실체의 특정 구조적 특징(예를 들어, 에피토프, 틈, 결합 부위)의 존재에 의존한다. 특이성은 절대적일 필요는 없다는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, 특이성은 하나 이상의 다른 잠재적인 표적 실체(예를 들어, 경쟁자)에 대한 결합제의 특이성과 비교하여 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특이성은 참조 특이적 결합제의 특이성과 비교하여 평가된다. 일부 실시형태에서 특이성은 참조 비-특이적 결합제의 특이성과 비교하여 평가된다. 일부 실시형태에서, 작용제 또는 실체는 그 표적 실체에 대한 결합의 조건 하에서 경쟁하는 대체 표적에 검출가능하게 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 결합제는 경쟁하는 대체 표적(들)과 비교하여 그의 표적 실체에 더 높은 온-속도, 더 낮은 오프-속도, 증가된 친화도, 감소된 해리 및/또는 증가된 안정성으로 결합한다.
특이성: 당업계에 공지된 바와 같이, "특이성"은 그의 결합 파트너를 다른 잠재적인 결합 파트너와 구별하는 특정 리간드의 능력의 척도이다.
대상체: 본 명세서에 사용된 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물(예를 들어, 일부 실시형태에서는, 출생전의 인간 형태를 포함하는 인간)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대한 민감성 또는 위험의 특징적인 하나 이상의 특성을 갖는 사람이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개체이다.
치료제: 본 명세서에 사용된 어구 "치료제"는 대상체에게 투여될 때 치료적 효과를 갖고/갖거나 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유도하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특성의 발생률을 경감, 개선, 완화, 억제, 예방, 발현 지연, 중증도 감소 및/또는 감소시키기 위해 사용될 수 있는 임의의 물질이다.
치료적으로 유효한 양: 본 명세서에 사용된 용어 "치료적으로 유효한 양"은 치료 처방의 일부로 투여될 때 원하는 생물학적 반응을 유도하는 물질(예를 들어, 치료제, 조성물 및/또는 제형)의 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 물질의 치료적으로 유효한 양은 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있거나 이에 민감한 대상체에게 투여될 때, 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료, 진단, 예방 및/또는 개시를 지연시키기에 충분한 양이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 물질의 유효한 양은 원하는 생물학적 평가변수, 전달되어 지는 물질, 표적 세포 또는 조직 등과 같은 요인에 의존할 수 있다. 예를 들어, 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하기 위한 제형에서 화합물의 유효한 양은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특성의 발생률을 경감, 개선, 완화, 억제, 예방, 발현 지연, 중증도 감소 및/또는 감소시키는 양이다. 일부 실시형태에서, 치료적으로 유효한 양은 단일 용량으로 투여되고; 일부 실시형태에서, 치료적으로 유효한 양을 전달하기 위해서는 다중 단위 용량이 필요하다.
형질전환: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 외인성 DNA가 숙주 세포 안으로 도입되는 임의의 과정을 지칭한다. 형질전환은 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 사용하여 자연적 또는 인공적 조건 하에서 일어날 수 있다. 형질전환은 외래 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포 안으로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 형질전환 방법론은 형질전환되는 숙주 세포에 기반하여 선택되고, 바이러스 감염, 전기천공, 교배, 리포펙션을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자율적으로 복제하는 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있다는 점에서 안정적으로 형질전환된다. 일부 실시형태에서, 형질전환된 세포는 제한된 기간 동안 도입된 핵산을 일시적으로 발현한다.
치료: 본 명세서에 사용된 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특성 및/또는 원인의 발생률을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 억제, 발현 지연, 중증도 감소 및/또는 감소시키는 요법의 투여를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 그러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 그러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 상태의 발병 위험 증가와 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 민감성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체에 대한 것일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 치료는 예방적일 수 있고; 일부 실시형태에서 치료는 치료적일 수 있다.
종양: 본 명세서에 사용된 용어 "종양"은 세포 또는 조직의 비정상적인 성장을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 종양은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전이성-전, 전이성 및/또는 비-전이성인 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양은 암과 연관되거나 암의 징후이다. 일부 실시형태에서, 종양은 분산성 종양 또는 액체 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양일 수 있다.
변이체: 분자, 예를 들어 핵산, 단백질 또는 소분자의 맥락에서 본 명세서에서 사용된 용어 "변이체"는 참조 분자와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만, 예를 들어 참조 실체와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 부재에서 또는 그의 수준에서, 참조 분자와 구조적으로 다른 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 또한 그의 참조 분자와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 분자가 참조 분자의 "변이체"로 적절하게 간주되는지 여부는 참조 분자와의 그 구조적 동일성의 정도에 기반된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 분자는 특정한 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 변이체는 정의에 따르면 하나 이상의 그러한 특징적인 구조적 요소를 공유하지만 참조 분자와 적어도 하나의 측면에서 다른 별개의 분자이다. 몇 가지 예를 들자면, 폴리펩티드는 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대하여 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 구조적 모티프 및/또는 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고; 핵산은 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대하여 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 차이 및/또는 공유적으로 폴리펩티드 또는 핵산의 구성요소인(예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 골격에 부착된) 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질, 인산염 기)에서 하나 이상의 차이로 인해 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 다를 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 99%인 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 전반적인 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상을 결한다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 비교하여 하나 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 관심있는 폴리펩티드 또는 핵산은 참조의 것과 동일하지만 특정 위치에서 서열 변경의 수가 적은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는 경우 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 "변이체"인 것으로 간주된다. 전형적으로, 변이체에서 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 또는 약 2% 미만의 잔기가 참조와 비교하여 치환, 삽입 또는 결실된다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조와 비교하여 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개, 약 5개, 약 4개, 약 3개, 약 2개 또는 약 1개의 치환된 잔기를 포함한다. 종종, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조에 비하여 매우 적은 수(예를 들어, 약 5개, 약 4개, 약 3개, 약 2개 또는 약 1개 미만)의 치환, 삽입 또는 결실된 기능성 잔기(즉, 특정 생물학적 활동에 참여하는 잔기)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조에 비교하여 약 5개, 약 4개, 약 3개, 약 2개 또는 약 1개 이하의 추가 또는 결실을 포함하고, 일부 실시형태에서는 추가 또는 결실을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조에 비교하여 약 25개, 약 20개, 약 19개, 약 18개, 약 17개, 약 16개, 약 15개, 약 14개, 약 13개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개 미만, 그리고 일반적으로 약 5개, 약 4개, 약 3개 또는 약 2개 미만의 추가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 자연에서 발견되는 것이다. 일부 실시형태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 인간 폴리펩티드 또는 핵산이다.
벡터: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 그것이 연결된 또 다른 핵산을 이송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 일 유형은 추가적인 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈 안으로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 안으로 도입 시 숙주 세포의 게놈 안으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
야생형: 본 명세서에 사용된 용어 "야생형"은 당업계에서 이해되는 의미를 가지고 자연에서 "정상"(돌연변이체, 질환있는, 변경된 것과 대조) 상태 또는 맥락에서 발견되는 바와 같은 구조 및/또는 활성을 갖는 실체(예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산)의 형태를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 특정 폴리펩티드 또는 핵산의 하나 이상의 "야생형" 형태는 예를 들어 특정 유전자의 "대립유전자" 또는 특정 폴리펩티드의 정상 변이체로서 자연에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 모집단(예를 들어, 인간 모집단)에서 가장 일반적으로 관찰되는 특정 폴리펩티드 또는 핵산의 그 형태(또는 이들 형태)는 "야생형" 형태이다.
특정 실시형태의 상세한 설명
융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체
면역-조절 치료적 접근법은 암을 포함한 다양한 질환 상태를 치료하는데 유용할 수 있다. 확립된 면역-조절 치료적 접근법은 단일클론 항체, T 세포 요법, 면역 체크포인트 조절제 및 면역조절 폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용은 무엇보다도 면역조절 폴리펩티드 및 금속-수산화물-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 기술뿐만 아니라 이러한 융합 폴리펩티드를 생산 및/또는 활용하는 기술을 제공한다(예를 들어, 도 2). 일부 실시형태에서, 제공된 융합 폴리펩티드는 적어도 제1 및 제2 상태를 채택하는 금속-수산화물-결합 폴리펩티드를 활용하며, 그 중 하나는 다른 것보다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드에 포함될 때) 실질적으로 더 높은 금속-수산화물 결합을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 그러한 제1 및 제2 상태는 하나 이상의 하이드록실 모이어티의 치환에 의해(예를 들어 인산화에 의해) 서로 상이하다.
일부 실시형태에서, 제공된 융합 폴리펩티드는 융합 단백질 파일링에 기술된 바와 같이 참조 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 개선된 구조적 또는 기능적 특징을 나타내고; 이러한 일부 실시형태에서, 참조 폴리펩티드는 ABP10을 포함한다.
무엇보다도, 본 개시내용은 개선된(예를 들어, 참조가 ABP10이거나 이를 포함할 수 있는 융합 단백질 파일링에 기술된 참조에 비해) 금속-수산화물 결합 폴리펩티드가 개발될 수 있다는 놀라운 발견을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 그러한 적절한 참조(예를 들어, 단독으로 및/또는 예를 들어 본 명세서에 기재 및/또는 예시된 바와 같은 융합 폴리펩티드에 포함될 때)에 비하여 증강된 금속 수산화물(예를 들어, 명반) 접합(예를 들어, 증강된 회합의 속도 및/또는 정도 및/또는 감소된 방출의 속도 및/또는 정도)을 특징으로 하는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 제공한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 제공된 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 그러한 적절한 참조(예를 들어, 단독으로 및/또는 예를 들어 본 명세서에 기재 및/또는 예시된 바와 같은 융합 폴리펩티드에 포함될 때)에 비교하여 개선된 종양내 보유(예를 들어, 종양내 주사 후) 효능을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 융합 폴리펩티드는 ABP10을 포함하는 적절한 비교가능한 참조 융합 폴리펩티드와 비교하여 개선된 종양 보유 및/또는 효능을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 개선된 금속-수산화물 결합 폴리펩티드 및/또는 이를 포함하는 융합 폴리펩티드를 개발, 제공 및/또는 활용하기 위한 기술을 제공하고; 일부 실시형태에서, 개선은 (예를 들어, 금속-수산화물-결합 폴리펩티드의 및/또는 이를 포함하는 융합 폴리펩티드의) 인산염 함량을 최적화하는 것을 포함 및/또는 수반한다.
무엇보다도, 본 개시내용은 놀랍게도 특정 금속-수산화물-결합 폴리펩티드 및/또는 이를 포함하는 하나 이상의 융합 폴리펩티드가 개선된 제조 특성에서의 하나 이상을 특징으로 한다(예를 들어, 보다 손쉬운 및/또는 재현가능한 제조에 순응할 수 있다)는 것을 교시한다.
무엇보다도, 본 개시내용은 특히 유용한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 더욱이, 본 개시내용은 종양이 있는 대상체를 치료하는데 있어서 제공된 융합 폴리펩티드의 유효성을 입증한다. 또 더욱이, 본 개시내용은 놀랍게도 일부 실시형태에서 특정 융합 폴리펩티드가 단일요법으로 유용하고/하거나, 일부 실시형태에서, 특정 융합 폴리펩티드가 조합 요법(예를 들어, 면역 조절제 예컨대 면역 체크포인트 억제제 예컨대, 예를 들어, 항-PD-1 항체와 같은 항-PD-1 작용제와 조합에서 특히 유용하다는 것을 교시한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 제공된 융합 폴리펩티드, 이를 포함하는 조성물, 및/또는 그 내의 성분(예를 들어, 면역조절 폴리펩티드, 금속-수산화물 결합)의 생산 및/또는 특성화를 위한 특정 기술을 제공한다. 폴리펩티드, 링커 등).
일부 실시형태에서, 제공된 기술은 특히 인산화된 제제 및/또는 금속-수산화물-착화된 제제를 포함하는 융합 펩티드 제제의 재현가능한 생산을 달성한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어 발현, 정제 및/또는 분석 기술을 포함할 수 있다. 더욱이, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 일부 실시형태에서 인산화된 제제 및/또는 일부 실시형태에서 금속 수산화물과 착화된 융합 폴리펩티드(예를 들어, 인산화된 융합 폴리펩티드)의 제제를 포함하는 제공된 융합 폴리펩티드의 바람직한 제제를 제공한다.
표 1은 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 예시적인 아미노산 서열을 제공한다.
표 1: 예시적인 아미노산 서열
표 2는 본 명세서에 기술된 폴리펩티드를 인코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
표 2: 예시적인 뉴클레오티드 서열
융합 폴리펩티드
면역조절 폴리펩티드
본 개시내용의 융합 폴리펩티드는 적어도 하나의 면역조절 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 적어도 하나의 면역 효능제 모이어티이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 효능제 모이어티는 모(예를 들어, 야생형) 폴리펩티드의 기능적 단편이거나 이를 포함하고; 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 시그널링 능력 단편인 기능적 단편이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 면역 효능제 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 2개 이상의 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 2개 이상의 면역 효능제 모이어티)를 포함한다. 이러한 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 동일한 2개 이상의 면역조절 폴리펩티드를 포함하고; 이러한 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 융합 폴리펩티드에서의 모든 면역조절 폴리펩티드는 동일하다. 이러한 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 서로 상이한 2개 이상의 면역조절 폴리펩티드를 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 다양한 실시형태에서 동일하거나 상이할 수 있는 하나 초과의 면역 효능제 모이어티를 포함할 수 있다. 그러한 일부 실시형태에서, 2개 이상의 그러한 면역 효능제 모이어티는 동일하고; 일부 실시형태에서, 그러한 면역 효능제 모이어티 모두는 동일하다. 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 서로 다른 2개 이상의 면역 효능제 모이어티를 포함하고; 일부 실시형태에서, 그러한 면역 효능제 모이어티 2개는 동일하지 않다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 2개의 하위유형의 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 면역 효능제 모이어티)를 포함하는 2개 이상의 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 2개 이상의 면역 효능제 모이어티)를 포함하여 - 예를 들어 따라서 융합 폴리펩티드는 적어도 2개의 제1 하위유형과 적어도 2개의 제2 하위유형을 포함한다. 이러한 일부 실시형태에서, 동일한 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 면역 효능제 모이어티)의 하위세트는 융합 폴리펩티드에서의 총 2개 모이어티 중 1개의 면역조절 폴리펩티드, 총 2개 중 2개의 면역조절 폴리펩티드, 3개 중 1개의 면역조절 폴리펩티드, 총 3개 중 2개의 면역조절 폴리펩티드, 또는 3개 중 3개의 면역조절 폴리펩티드와 동일하다. 그러한 일부 실시형태에서, 다양한 면역조절 폴리펩티드의 하위세트는 총 2개 중 1개의 면역 면역조절 폴리펩티드, 총 2개 중 2개의 면역조절 폴리펩티드, 총 3개 중 1개의 면역조절 폴리펩티드, 총 3개 중 2개의 면역조절 폴리펩티드, 또는 총 3개 중 3개의 면역조절 폴리펩티드와 동일하다.
일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 면역 효능제 모이어티)는 면역계의 세포의 활성을 활성화하거나 억제한다(예를 들어 시그널링 능력이 있다). 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 면역 효능제 모이어티)는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 융합 폴리펩티드의 일부로서 평가된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 신호 능력은 특정 결합 파트너에 대한 결합에 대해 평가할 때 면역 효능제 모이어티 또는 모이어티들 또는 이의 기능적 단편이 참조 표준(예를 들어, 야생형 폴리펩티드)의 것에 비교가능한 결합을 나타내는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 신호 능력은 예를 들어 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 효과에 대해 평가할 때 면역 효능제 모이어티 또는 모이어티들 또는 이의 기능적 단편이 참조 표준(예를 들어, 야생형 폴리펩티드)의 것에 비교가능한 상기 생물학적 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 면역 효능제 모이어티)는 면역 반응 자극 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 반응 자극 모이어티는 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 효능성 항체, 면역 체크포인트 억제제 또는 이의 조합이지만 이에 제한되지는 않는다.
IL-12
일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 인터루킨-12(IL-12) 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, IL-12 면역 효능제 모이어티)를 포함한다.
IL-12는 선천성 및 적응성 면역에서 중요한 역할을 수행하는 향-염증성 사이토카인이다. 야생형 IL-12는 이황화 결합으로 연결된 2개 하위단위인, p35(IL-12A; GenBenk GeneID: 3592)와 p40(IL-12B; GenBank GeneID: 3593)을 포함하는 이종이량체 단백질이다. T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 상의 IL-12 수용체 복합체(IL-12Rβ1/IL-12Rβ2)에 대한 IL-12의 결합은 전사 4의 신호 변환기 및 활성화제(STAT4) 및 후속 인터페론 γ(IFN-γ) 생산 및 분비를 통한 시그널링을 유도한다.
IL-12 하위단위인 IL-12A 및 IL-12B는 또한 다른 IL-12 계열 구성원과 이종이량체를 형성할 수 있다. 예를 들어, IL-12A는 또한 엡스타인-바 바이러스 유도된 유전자 3(EBI3)과 이량체화하여 IL-12 계열 구성원을 형성할 수 있고, IL-35 및 IL-12B는 p19 단량체와 이량체화하여 IL-12 계열 구성원인 IL23을 형성할 수 있다.
IL-12는 선천성 및 적응성 면역 반응에서 중요한 역할을 수행하고, IL-12의 조절장애는 다수의 질환 상태와 관련되어 있다. 예시적인 이러한 질환 상태는 염증성 장 질환, 건선, 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 암, 홍반성 루푸스, 주로 담도 담관염 및 쇼그렌 증후군을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다(Ullrich 등 EXCLI journal　vol. 19 1563-1589. 11 Dec. 2020). 치료적 양식으로서 IL-12의 사용은 종양의 치료에 대한 것을 포함하여 광범위하게 연구되었다(Nastala CL 등 J Immunol. 1994 Aug 15; Lasek 등　Cancer immunology, immunotherapy: CII　vol. 63,5 (2014): 419-35).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 면역조절 폴리펩티드는 IL-12 면역 효능제 모이어티이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 면역조절 폴리펩티드는 복수의 IL-12 면역 효능제 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 면역조절 폴리펩티드는 정확히 2개의 IL-12 면역 효능제 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수(예를 들어, 2개)의 IL-12 모이어티 중 2개 이상의 IL-12 모이어티는 동일한 모이어티이다. 그러한 일부 실시형태에서, 복수(예를 들어, 2개)의 IL-12 모이어티는 다른 모이어티이다. 그러한 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 IL-12A 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 IL-12B 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-12B 면역 효능제 모이어티는 면역조절 폴리펩티드에서 IL-12A 면역 효능제 모이어티의 N-말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, IL-12A 면역 효능제 모이어티는 면역조절 폴리펩티드에서 IL-12B 면역 효능제 모이어티의 N-말단에 위치한다.
일부 실시형태에서, 복수(예를 들어, 2개)의 IL-12 모이어티(예를 들어, IL-12A 및/또는 IL-12B)를 포함하는 면역조절 폴리펩티드는 직접적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 복수(예를 들어, 2개)의 IL-12 모이어티(예를 들어, IL-12A 및/또는 IL-12B)를 포함하는 면역조절 폴리펩티드는 제1 링커를 통해 연결된다. 링커의 비-제한적인 예는 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 면역조절 폴리펩티드는 변이체를 포함하는 IL-12A 및/또는 IL-12B 면역 효능제 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12A 및/또는 IL-12B 면역 효능제 모이어티 변이체는 야생형 IL-12A 또는 IL-12B 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대한 치환, 결실, 추가 및/또는 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12A 및/또는 IL-12B 면역 효능제 모이어티는 복수의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 변이체는 야생형 IL-12A 또는 IL-12B에 비해 하나 이상의 치환, 결실, 추가 및/또는 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 야생형 IL-12A 또는 IL-12B에 비해 아미노산 서열을 변화시키지 않는 치환체를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S43X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S154X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S168X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S227X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S233X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 T364X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 T 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S365X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S398X 돌연변이를 포함하고, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S365X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S480X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S481X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S365X 및 S481X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 서열번호: 25에 비해 S365X, S398X 및 S481X 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 것들을 포함한 변이체의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 면역조절 폴리펩티드는 그의 기능성 단편(예를 들어, 시그널링 능력 단편)인 IL-12A 및/또는 IL-12B 면역 효능제 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 기능성 IL-12A 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 기능성 IL-12B 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 전장 IL-12A 및 기능성 IL-12B 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 전장 IL-12B 및 기능성 IL-12A 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-12A 또는 IL-12B 단편은 야생형 IL-12A 또는 IL-12B에서 발견되는 바와 같은 단량체 단위(예를 들어, 잔기) 중 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상을 포함하거나 이로 구성된다.
금속-수산화물 결합 폴리펩티드
융합 단백질 파일링은 (예를 들어, 인산염 기로) 하이드록실 대체가 금속 수산화물(예를 들어, 수산화알루미늄)과의 리간드 교환을 통해 폴리펩티드의 흡착을 증가시킬 수 있고, 더욱이 이러한 폴리펩티드(예를 들어, 특히 면역조절 폴리펩티드와 이러한 하이드록실 대체가 발생한 금속-수산화물-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드)의 종양 보유 및 항-종양 효능을 향상시킬 수 있음을 교시했다.
상기에서 논의한 바와 같이, 면역조절 폴리펩티드에 융합되어 수산화알루미늄에 강한 결합을 허용할 수 있는 금속-수산화물-(예를 들어, 명반-)결합 폴리펩티드가 개발되었다. ABP에 융합된 다양한 면역조절 폴리펩티드를 평가했다. ABP는 혈청에서 명반에 흡착되고 종양에서 단백질과 펩티드를 유지하는데 사용될 수 있었다는 것이 결정되었다. 추가적으로, 인산화가 더 큰 폴리펩티드는 혈청 조건에서 훨씬 더 오랫동안 명반에 유지되는 경향이 있었다. 분석된 ABP 중에서 ABP10으로 불리는 폴리펩티드 GGGGSFQSEEQQGGGSGGSEEGGMESEESNGGGSGGSEEGGGGSHHHHHH는 단백질이 돌연변이체 키나제(예를 들어, 돌연변이체 Fam20C 키나제)로 발현되었을 때와 비교하여 야생형(WT) 키나제(예를 들어, WT Fam20C 키나제)로 발현되었을 때 인산화가 4-6-배수 증가하여 가장 높은 인산화를 입증했다. ABP10은 짧은 스페이서 서열로 분리된 일반적 인산화 부위 모티프인 4개의 SXE 모티프로 구성된다. ABP10에 연결된 면역조절 폴리펩티드(예를 들어, 인터루킨-2 및 인터루킨-12)는 ABP10을 갖지 않는 면역조절 폴리펩티드에 비해 흑색종의 마우스 모델에서 향상된 생존을 보였다는 것이 입증되었다.
놀랍게도 본 발명자들은 개선된 금속-수산화물 결합 폴리펩티드가 개발될 수 있음을 발견했다. 무엇보다도 본 발명자들은 적절한 참조(예를 들어, ABP10)에 비해 증강된 금속 수산화물(예를 들어, 명반) 보유를 특징으로 하는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 개발했다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제공된 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 종양이 있는 대상체에게 투여될 때 적절한 참조(예를 들어, ABP10)와 비교하여 향상된 효능을 특징으로 한다.
따라서, 무엇보다도, 본 개시내용은 특정 금속-수산화물 결합 폴리펩티드 및/또는 이를 포함하는 융합 폴리펩티드에 대한 문제의 근원을 식별한다. 예를 들어, 본 개시내용은 제조상의 난제가 특정한 그러한 폴리펩티드 및/또는 융합체와 연관될 수 있음을 인식한다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않고, 본 개시내용은 폴리펩티드에 대한 2차 인산화가 특정한 그러한 제조상의 난제에 기여하고/하거나 책임이 있을 수 있음을 인지한다. 무엇보다도, 본 개시내용은 금속 수산화물에 대한 높은 수준의 흡착 및 또한 바람직한 제조상의 특성(예를 들어, 균일하게-인산화된 제제의 재현성, 점조성, 생산 등 중 하나 이상)을 입증하는 금속-수산화물-결합 폴리펩티드 및 이를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 인산화된 형태와 비인산화된 형태를 채택할 수 있도록 복수의 인산화 부위를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 적어도 하나의 키나제 표적 모티프를 포함한다. 표적 키나제 모티프는 키나제에 의해 인산화되는 아미노산을 포함한다. 전형적으로 인산화되는 아미노산은 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T) 및 티로신(Tyr, Y) 잔기와 같은 하이드록실을 포함한다. 키나제 모티프는 인산화될 수 있는 아미노산 잔기에 대해 바로 N- 및/또는 C-말단인 아미노산 서열을 지칭한다. 어느 하나의 이론에 구속되기를 바라지 않고, 많은 키나제는 키나제가 특정 키나제 표적 모티프의 특정 아미노산(예를 들어, 세린, 트레오닌 또는 티로신)을 인산화하도록 특이성을 부여하는 구조적 특징을 포함한다.
인식된 키나제 표적 모티프는 특정 유형의 키나제에 따라 매우 다양하다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 분비 경로 키나제의 하나 이상의 키나제 표적 모티프를 포함하는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 제공한다. 세포가 단백질 및/또는 기타 생체분자를 세포외 공간 안으로 분비하는 경로인 분비 경로는 소포체(ER), 골지체(Golgi), 세포막 및 리소좀 저장 구획뿐만 아니라 그 사이를 이동하는 소포를 지칭한다. 분비 경로 키나제는 분비 경로(예를 들어, ER, Golgi 등에서) 전반에 걸쳐 국소화되어 있고 분비될 단백질을 인산화하는 기능을 한다(Sreelatha 등 Biochimica et biophysica acta vol. 1854,10 Pt B (2015): 1687 -93).
일부 실시형태에서, 관련 키나제는 자연적으로 발생하는 분비 경로 키나제이다(예를 들어, 기능을 위한 분비 경로에 내인적으로 표적화된다). 일부 실시형태에서, 분비 경로 키나제는 분비 경로에 대해 키나제를 표적화하는 신호 서열을 포함한다. 자연적으로-발생하는 인간 분비 경로 키나제는 예를 들어 4-마디로된 박스 키나제 1, Fam20A, Fam20B, Fam20C, 척추동물 고립 키나제(VLK), SGK196 및 Fam69A, Fam69B 및 Fam69C를 포함한다.
일부 실시형태에서, 관련 키나제는 비-자연적으로 발생하는 분비 경로 키나제이다. 일부 실시형태에서, 비-자연적으로 발생하는 키나제는 분비 신호 펩티드를 비-분비 경로 세포 구획에 내인적으로 국소화된 키나제에 연결함에 의해 생산된다.
일부 실시형태에서, 키나제 표적 모티프는 분비 경로 키나제의 표적 키나제 모티프이다. 일부 실시형태에서, 분비 경로 키나제 표적 키나제 모티프는 S-X-E 모티프를 포함한다. 예를 들어, Fam20C는 세린을 인산화하고 아미노산 서열 Ser-X-Glu(예를 들어, S-X-E), Ser-X-pSer(예를 들어, S-X-pS) 및 Ser-X-Gln-X-X-Asp-Glu-Glu(S-X-Q-X-X-D-E-E)을 포함하는 키나제 표적 모티프를 인산화하는 것으로 나타났으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이고 pS는 인산화된 세린이다(Mercier, 등 (1981) Biochimie, 63: 1-17; Mercier 등 (1971) Eur J. Biochem. 23:41-51; Lasa-Benito (1996) FEES Lett. 382:149; Brunati, 등 (2000) 3:765, Tagliabracci, 등 (2015) Cell 161:1619-1632; Tagliabracci, 등 (2012) Science 336:1150-1153). 일부 실시형태에서, 표적 키나제 모티프는 아미노산 서열 SEEE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 키나제 모티프는 아미노산 서열 SEEA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 키나제 모티프는 아미노산 서열 SEEQ를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 키나제 모티프는 아미노산 서열 SEE를 포함한다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 표적 키나제 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 S-X-E 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 4개 초과의 S-X-E 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 8개의 S-X-E 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 키나제 모티프(예를 들어, S-X-E 모티프)의 수는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드 상의 인산화된 잔기의 수에 기여한다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 그 아미노산 서열이 복수의 인산화 부위를 포함하는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 복수의 인산화 부위는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 표적 키나제 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 인산화 부위는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 S-X-E 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 인산화 부위는 4개 초과의 S-X-E 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 인산화 부위는 8개 초과의 S-X-E 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 키나제 모티프(예를 들어, S-X-E 모티프)의 수는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드 상의 인산화된 잔기의 수에 기여한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 표적 키나제 모티프(예를 들어, S-X-E 모티프)는 다음 표적 키나제(예를 들어, S-X-E 모티프)에 직접적으로 인접해 있다(예를 들어, 연결된다). 일부 실시형태에서, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 표적 키나제 모티프(예를 들어, S-X-E 모티프)는 스페이서에 의한 다음 표적 키나제 모티프(예를 들어, S-X-E 모티프)에서 분리된다(예를 들어, 연결된다). 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 하나의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 복수의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 3개의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 4개의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 4개의 글리신 잔기를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 GGGSGGGG를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 GGGEGGGG를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 4개의 S-X-E 모티프와 4개의 글리신 잔기를 포함하는 3개의 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 6개의 S-X-E 모티프와 4개의 글리신 잔기를 포함하는 5개의 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 8개의 S-X-E 모티프와 4개의 글리신 잔기를 포함하는 7개의 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 아미노산 서열, SEEE를 갖는 4개의 모티프, 및 3개의 글리신 잔기를 포함하는 3개의 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 아미노산 서열, SEEA를 갖는 4개의 모티프, 및 3개의 글리신 잔기를 포함하는 3개의 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 아미노산 서열, SEEQ를 갖는 4개의 모티프, 및 3개의 글리신 잔기를 포함하는 3개의 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 아미노산 서열, SEE를 갖는 4개의 모티프, 및 아미노산 서열 GGGSGGGG를 포함하는 3개의 스페이서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 아미노산 서열, SEE를 갖는 4개의 모티프, 및 아미노산 서열 GGGEGGGG를 포함하는 3개의 스페이서를 포함한다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 6개의 S-X-E 모티프를 포함하며, 여기서 각각의 S-X-E 모티프는 다음 S-X-E 모티프에 직접적으로 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 8개의 S-X-E 모티프를 포함하며, 여기서 각각의 S-X-E 모티프는 다음 S-X-E 모티프에 직접적으로 인접해 있다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 종결 서열(예를 들어, 융합 폴리펩티드의 c-말단에서의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종결 서열은 복수의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 아미노산 잔기는 GGGG를 포함한다. 그러한 일부 실시형태에서, 종결 서열은 아미노산 서열 GGGGS를 포함한다. 그러한 일부 실시형태에서, 종결 서열은 아미노산 서열 GGGGHHHHHH를 포함한다 그러한 일부 실시형태에서, 종결 서열은 아미노산 서열 GGGGSHHHHHH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 종결 서열은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같은 선택적 태그를 포함한다.
무엇보다도, 본 개시내용은 특정 금속-수산화물 결합 폴리펩티드 및/또는 이를 포함하는 융합 폴리펩티드에 대한 문제의 근원을 식별한다. 무엇보다도, 본 개시내용은 금속 수산화물에 대한 높은 수준의 흡착 및 또한 바람직한 제조상의 특성(예를 들어, 균일하게-인산화된 융합 폴리펩티드의 재현성, 점조성, 생산 등 중 하나 이상)을 입증하는 금속-수산화물-결합 폴리펩티드 및 이를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 최적의 수의 키나제 표적 모티프(예를 들어, 인산화 부위)가 활용된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 키나제 표적 모티프(예를 들어, 인산화 부위)의 이격은 최적화되거나 최적화되었다.
일부 실시형태에서, 원하는(예를 들어, 최적의) 수의 키나제 표적 모티프 및/또는 키나제 모티프의 이격은 하나 이상의, 예를 들어, 강한 금속-수산화물 보유 및/또는 하나 이상의 제조상의 난제(예를 들어, 본 개시내용이 인식하는 것은 고도로 인산화된 요소와 연관될 수 있음)의 회피를 달성하기 위한 바람직한 인산염 함량에 기반하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키나제 모티프의 원하는(예를 들어, 최적의) 수 및/또는 이격은 원하는 수준의 융합 폴리펩티드 인산화를 달성하도록 키나제에 대한 폴리펩티드의 노출을 초래한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 개선된 융합 폴리펩티드는 균질하게-인산화된 융합 폴리펩티드의 개선된 재현성, 점조성 및/또는 생성 중 하나 이상을 초래한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드(예를 들어, 인산화된 융합 폴리펩티드) 및/또는 복합체의 비교가능한 제제(예를 들어, 확립된 매개변수 내에서 일관되게 있는 제제)의 재현가능한 제조를 달성한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 적절한 참조 표준(예를 들어, ABP-10을 포함하는 융합 폴리펩티드)과 비교하여 감소된 면역원성을 달성한다. 어느 하나의 이론에 구속되기를 바라지 않고, 소수성 아미노산을 제거하고 따라서 주요 조직적합성 복합체에 대한 결합을 감소시킴에 의해 감소된 면역원성이 달성된다.
링커
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 링커 또는 스페이서를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 제1 및 제2 면역 효능제 모이어티를 포함하는 면역조절 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 면역 효능제 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드는 면역조절 폴리펩티드 및 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드 및 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 제2 링커를 통해 연결된다.
일부 실시형태에서, 제1 링커 및/또는 제2 링커는 폴리펩티드 링커이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 링커는 합성이다. 예를 들어, 합성 폴리펩티드 링커는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드의 변형된 형태인 비-자연적으로 발생하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 링커는 길이가 적어도 하나의 아미노산이고 임의의 적합한 수의 아미노산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 링커는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 제1 링커는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 링커는 글리신-세린(Gly-Ser 또는 G-S 링커)을 포함하거나 이로 구성된다. Gly-Ser 링커는 글리신과 세린 잔기로 구성된 폴리펩티드 링커이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)n의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 양의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)1이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)2이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)3이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)4이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)5이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)6이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)7이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)8이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)9이다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)10이다.
일부 실시형태에서, 제2 링커는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 링커는 복수의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 링커는 아미노산 서열, GGGGSGGGG를 갖는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 링커는 아미노산 서열, GGGGEGGGG를 갖는 폴리펩티드 링커를 포함한다.
변이체
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 활용되는 면역조절 폴리펩티드 또는 금속-수산화물-결합 폴리펩티드는 관련 참조 폴리펩티드의 변이체(예를 들어, 야생형 폴리펩티드 또는 그의 기능성 부분)이다.
일부 실시형태에서, 변이체는 그 참조 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 동일성을 나타낸다. 그러한 일부 실시형태에서, 변이체는 그 참조 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 변이체는 그 참조에 비하여 하나 이상의 보존적 또는 달리는 비-파괴적 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 첨가)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체에는 임의의 파괴적인 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 첨가)이 없어 면역조절 폴리펩티드가 참조의 하나 이상의 기능성 특징을 유지한다. 일부 실시형태에서, 유지된다는 것은 면역조절 폴리펩티드가 적절한 참조 표준(예를 들어, 야생형 면역조절 폴리펩티드)과 비교하여 비교가능한 활성(예를 들어, 시그널링 능력 또는 결합)을 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, 그러한 일부 실시형태에서, 면역조절 폴리펩티드는 적절한 참조 표준(예를 들어, 야생형 면역조절 폴리펩티드)과 비교하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 활성을 유지한다.
금속 수산화물
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 면역조절 폴리펩티드 및 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 융합 폴리펩티드는 금속-수산화물에 노출될 때 그와 복합체를 형성한다. 복합체는 금속-수산화물에 대한 융합 폴리펩티드의 흡착을 통해 형성된다. 임의의 하나의 이론에 구속되기를 바라지 않고, 금속 수산화물에 대한 융합 폴리펩티드의 흡착이 리간드 교환에 의해 일어난다는 가설이 세워졌다. 예를 들어, 리간드 교환은 표면 수산기의 다른 리간드에 의한 치환 또는 교환이다. 일부 실시형태에서, 표면 하이드록실의 치환 또는 교환은 하이드록실-대체기(예를 들어, 인산염기)에 의해 발생한다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물은 금속에 결합된 적어도 하나의 하이드록실기를 포함하는 물질이다. 본 개시내용에 따르면, 일부 실시형태에서, 금속-수산화물은 하이드록실-대체 모이어티를 포함하는 융합 폴리펩티드를 흡착할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이드록실-대체 모이어티는 인산염 기이다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물은 그 고유한 품질 또는 특징에 기반하여 선택된다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물은 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에 사용하기 위한 그 생체적합성으로 인해 선택된다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물은 수산화알루미늄(예를 들어, 명반)이다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물은 수산화-철이다. 숙련된 기술자는 임의의 수의 금속-수산화물이 본 개시내용에 따라 성공적으로 활용될 수 있음을 인식할 것이다.
태그
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드는 면역 효능제 모이어티 및 그 아미노산 서열이 복수의 인산화 부위를 포함하여 인산화 및 비인산화된 형태를 채택할 수 있는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함하는 면역조절 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드는 종결 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종결 서열은 태그를 포함한다. 본 명세서에 사용된 태그는 특정 샘플에서 검출 및/또는 측정될 때 그것이 연결된 단백질이 샘플에 존재함을 나타내고 이의 정량적 측정을 제공할 수 있는 아미노산 서열이다. 당업계에 공지된 다양한 태그가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 태그는 FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, V5 태그, MBP 태그를 포함한다.
일부 실시형태에서, 태그는 융합 폴리펩티드 기능에 대한 간섭을 최소화하기 위해 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서 삽입된다. 일부 실시형태에서, 태그는 기능서에 영향을 주지 않고 융합 폴리펩티드 서열 내에서 인-프레임 내부에 배치된다. 태그에 대한 바람직한 위치는 부분적으로 이용가능한 경험적 데이터(예를 들어, 친화도 태그 또는 다른 융합 폴리펩티드 실험 예컨대 폴리히스티딘, FLAG 태그, MBP 태그 등으로부터의 것), 융합 폴리펩티드 또는 유사한 폴리펩티드의 3차원 구조 및/또는 생체내 또는 시험관내 발현 실험에 기반하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 태그는 또한 복잡한 혼합물 또는 제제로부터 부분적 또는 완전한 정제를 허용하도록 친화도 태그 또는 크로마토그래피 태그와 같은 짧은 서열 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩티드 태그는 미리선택된(예를 들어, 1개, 2개, 3개 이상) 아미노산 세트의 고정된 수(예를 들어, 1개, 2개, 3개 이상)의 함입을 허용하도록 설계될 수 있다.
융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체의 생산
본 개시내용의 일 양태에서, 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체는 (1) 융합 폴리펩티드를 제조하는 단계; (2) 융합 폴리펩티드를 인산화시키는 단계; (3) 융합 폴리펩티드를 금속 수산화물과 접촉시키는 단계에 의해 생산된다.
융합 폴리펩티드의 생산
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드는 외인성 발현을 위한 기술을 사용하여 숙주 세포에서 만들어진다. 폴리펩티드를 외인적으로 발현시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 숙련된 기술자는 다양한 기술이 성공적으로 활용될 수 있음을 인식할 것이다.
본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA)는 이용가능한 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 제한 효소를 사용하여 DNA로부터 절단될 수 있거나, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 플라스미드 또는 게놈 폴리뉴클레오티드 서열로부터 증폭될 수 있거나, 화학적 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공지된 방법의 조합을 이용하여 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조한다.
본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터 안으로 클로닝될 수 있다. 클로닝은 이용가능한 다양한 방법(예를 들어, Gibson 어셈블리, 제한효소 단리 및 결찰 등)에 따라 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 플라스미드이다.
일부 실시형태에서, 발현할 수 있는 벡터는 발현을 제어하는 서열 또는 서열들(예를 들어, 프로모터, 개시 신호, 정지 신호, 폴리아데닐화 신호, 활성화제, 억압자 등)에 작동가능하게 연결된 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현을 제어하는 서열 또는 서열들은 원하는 수준의 발현을 달성하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 발현을 제어하는 하나 이상의 서열(예를 들어, 프로모터)이 활용된다. 일부 실시형태에서, 발현을 제어하는 하나 이상의 서열(예를 들어, 프로모터)은 복수의 폴리펩티드를 인코딩하는 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드의 원하는 수준의 발현을 달성하기 위해 활용된다. 일부 실시형태에서, 복수의 재조합 폴리펩티드는 동일한 벡터(예를 들어, 바이-시스트론 벡터, 트리-시스트론 벡터, 멀티-시스트론)로부터 발현된다. 일부 실시형태에서, 복수의 재조합 폴리펩티드가 발현되고, 이들 각각은 별도의 벡터로부터 발현된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하여 발현할 있는 벡터는 숙주 세포에서 융합 폴리펩티드를 발현하는데 사용된다. 숙주 세포는 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드를 발현하기에 적합한 다양한 이용가능하고 공지된 숙주 세포(예를 들어, 인간 배아 신장(HEK) 세포, 현탁 HEK293 세포, 차이니스 햄스터 난소 세포)로부터 선택될 수 있다.
벡터를 숙주 세포 안으로 도입하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 일부 실시형태에서, 벡터는 형질감염을 사용하여 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 형질감염은 예를 들어 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 또는 폴리에틸렌이민-매개된 형질감염을 사용하여 성취된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 형질도입을 사용하여 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 형질전환된 숙주 세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하기 위해 숙주 세포 안으로 벡터의 도입에 이어 배양된다. 일부 실시형태에서, 형질전환된 숙주 세포는 적어도 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 28시간, 32시간, 36시간 40시간, 44시간, 48시간, 52시간, 56시간, 60시간, 64시간, 68시간, 72시간 이상 동안 배양된다. 형질전환된 숙주 세포는 선택된 숙주 세포의 필요사항에 따른 성장 조건(예를 들어, 온도, 이산화탄소 수준, 성장 배지)에서 배양된다. 숙련된 기술자는 선택된 숙주 세포에 대한 배양 조건이 당업계에 잘 알려져 있음을 인식할 것이다.
융합 폴리펩티드 인산화
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 키나제와 접촉시킴에 의해 인산화된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 키나제와 함께 숙주 세포에서 융합 폴리펩티드를 공동-발현시킴에 의해 키나제와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 공동-발현은 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 키나제를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터인, 2개의 벡터를 숙주 세포 안으로 도입함에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 공동-발현은 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단일, 다중-시스트론(예를 들어, 바이-시스트론) 벡터를 도입함에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드 및 키나제를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 형질전환된 숙주 세포는 숙주 세포 안으로 벡터의 도입에 이어서 배양된다. 임의의 하나의 이론에 구속되기를 바라지 않고, 숙주 세포에서 융합 폴리펩티드와 키나제의 동시-발현 시, 키나제는 융합 폴리펩티드와 접촉하여 이를 인산화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 공동-발현은 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 키나제를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터인, 2개의 벡터를 숙주 세포 안으로 도입함에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 2개의 벡터는 키나제에 대한 융합 폴리펩티드의 원하는 상대적 발현 수준을 달성하기 위해 최적화된 숙주 세포 안으로 도입된 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터 대 키나제를 인코딩하는 벡터의 비율로 도입된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터 대 키나제를 인코딩하는 벡터의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1 또는 100:1이다.
일부 실시형태에서, 공동-발현은 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드와 키나제를 인코딩하는 재조합 폴리펩티드(예를 들어, 바이-시스트론 벡터) 둘 모두를 포함하는 하나의 벡터를 숙주 세포 안으로 도입함에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 키나제를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 발현을 제어하는 서열 또는 서열들(예를 들어, 프로모터, 시작 신호, 정지 신호, 폴리아데닐화 신호, 활성화제, 억압자 등)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 발현을 제어하는 서열 또는 서열들은 원하는 수준의 발현을 달성하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 발현을 제어하는 다중 서열(예를 들어, 프로모터)을 활용하여 융합 폴리펩티드 대 키나제의 원하는 발현 비율이 달성된다. 일부 실시형태에서 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1 또는 100:1이다..
Fam20C 키나제의 예시적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 표 3에 기술된 것들을 포함한다.
표 3: Fam20C 키나제의 예시적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
복합체 형성
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드는 금속-수산화물(예를 들어, 수산화알루미늄)에 노출될 때 그와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 금속 수산화물과의 리간드 교환을 통한 흡착을 위한 하이드록실 대체 기(예를 들어, 인산염 기)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 정전기적 상호작용을 통해 금속 수산화물과 복합체를 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체는 혼합에 의해 형성된다. 일부 실시형태에서, 혼합은 완충액(예를 들어, 트리스-완충 식염수 완충액)에서 발생한다. 그러한 일부 실시형태에서, 완충액은 인산염을 함유하지 않는다. 그러한 일부 실시형태에서, 완충액은 금속-수산화물을 용해시키는 물질 또는 물질들(예를 들어, 시트르산, 말산 또는 젖산)을 함유하지 않는다. 임의의 하나의 이론에 구속되지 않고, 인산염을 함유한 완충액은 복합체 형성과 경쟁하고 이를 방해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합은 특정 온도에서 지속 시간 동안 발생한다. 그러한 일부 실시형태에서, 지속 시간은 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분 또는 45분이다. 그러한 일부 실시형태에서, 특정 온도는 대략적으로 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃ 또는 35℃이다.
정제
일반적으로 비정상 생성물(예를 들어, 잔류 단백질, 숙주 세포 오염물 등)은 융합 폴리펩티드 제제에서 제거된다. 다양한 정제 기술이 이용가능하고 숙련된 기술자에게 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 그러한 크로마토그래피 정제 방법은 고성능 액체 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 크로마토그래피 방법으로 수행될 수 있으며, 여기서 혼합물의 구성요소는 서로 다른 속도에서 정지상을 통해 이동하여, 서로 분리를 초래한다. 다양한 고체 기재가 사용될 수 있다는 것은 숙련된 기술자에게 명백할 것이다(예를 들어, 비드, 입자, 미소구체, 수지 등). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 기재는 본 개시내용에 따라 융합 폴리펩티드의 제조에서 임의의 다른 바람직하지 않은 구성요소에 비해 융합 폴리펩티드에 대해 상이한 체류 시간을 허용하도록 하는 특성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 친화도-기반 정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 그러한 친화도-기반 정제 방법은 당업계에 공지된 고체 기재를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 멤브레인, 중합체 비드, 자기 비드 또는 복합재와 같은 다양한 기재가 활용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 기재 또는 조성물(예를 들어, 니켈 이온)로 코팅되거나 사전-충전된 고체 기재(예를 들어, 중합체 비드 또는 입자)가 본 개시내용에 따라 유용할 수 있어 융합 폴리펩티드는 고체 기재에 결합할 것인 반면 제제에 존재하는 임의의 다른 바람직하지 않은 구성요소는 용액에 남아 있을 것이다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 고체 기재로부터 용리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용리는 특이적 용리를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 특이적 용리는 기재 또는 폴리펩티드와의 착물화를 위해 경쟁할 작용제 또는 작용제들에 의해 폴리펩티드-기재 복합체를 시험하여 폴리펩티드를 용액 안으로 방출함에 의해 완료된다. 일부 실시형태에서, 용리는 비-특이적 용리를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 비-특이적 용리는 용매 또는 완충액 조건(예를 들어, 완충액, 예를 들어 이미다졸 완충액의 농도를 증가시키는 것)을 조작하여 회합 속도 상수를 감소시켜 기재로부터 폴리펩티드의 해리를 초래함에 의해 완료된다.
특징화
무엇보다도, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 융합 폴리펩티드(예를 들어, 이의 인산화 또는 비인산화된 제제) 및/또는 이러한 융합 폴리펩티드 및 금속 수산화물을 포함하는 복합체를 특징화하기 위한 기술을 제공한다. 특징화는 생산 공정 중 및/또는 그에 이어서 수행된다. 일부 실시형태에서, 특정 제조 공정은 특징화에 비추어 변형되거나 종료될 수 있다(예를 들어, 특정 제조가 하나 이상의 사양을 충족하지 못하는 경우). 일부 실시형태에서, 이러한 특징화는 금속-수산화물 보유, 인산화의 정도, 인산화의 이질성, 시그널링 활성 및/또는 효능 중 하나 이상의 평가를 수반할 수 있다.
인산염 함량의 예시적인 특징화
일부 실시형태에서, (예를 들어, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드 및/또는 그의 제제의) 인산화의 정도가 특징화된다. 다양한 방법이 인산화의 정도(예를 들어, 폴리펩티드당 인산염 분자의 평균 수)의 측정에 이용가능하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 인산화의 정도는 비색법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비색법은 말라카이트 그린 검정이거나 이를 포함한다. 임의의 하나의 이론에 구속되기를 바라지 않고, 말라카이트 그린 검정은 측정될 수 있는 말라카이트 그린, 몰리브덴산염 및 유리 오르토인산염 사이에 형성된 녹색 복합체의 정량화(예를 들어, 분광광도계 또는 플레이트 판독기를 사용함)를 기반으로 한다.
일부 실시형태에서, 인산화의 정도(예를 들어, 폴리펩티드당 인산염 분자의 평균 수)는 0.5-7, 1-7, 2-7, 3-7, 4-7, 5-7, 6-7, 0.5-6, 0.5-5, 0.5-4, 1-6, 2-6, 3-6, 4-6, 5-6, 0.5-10, 0.5-9, 0.5-8, 1-10, 1-9, 1-8, 2-10, 2-9, 2-8, 3-10, 3-9, 3-8, 4-10, 4-9, 4-8, 5-10, 5-9, 5-8, 6-10, 6-9, 또는 6-8이다. 일부 실시형태에서, 인산화의 정도(예를 들어, 폴리펩티드당 인산염 분자의 평균 수)는 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7. 7.8, 7.9, 7.10, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 또는 10이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드 및/또는 그의 제제의 인산화의 이질성이 특징화된다. 일부 실시형태에서, 인산화의 이질성은 주어진 융합 폴리펩티드의 제제 내 인산화의 정도의 측정이다. 일부 실시형태에서, 인산화의 이질성은 복수의 융합 폴리펩티드의 제제에 걸친 인산화의 정도의 측정이다. 일부 실시형태에서, 인산화의 이질성은 주어진 융합 폴리펩티드의 제제 내 폴리펩티드 상의 특정 인산염 기의 위치의 측정이다. 일부 실시형태에서, 인산화의 이질성은 복수의 융합 폴리펩티드의 제제에 걸친 폴리펩티드 상의 특정 인산염 기의 위치의 측정이다.
다양한 기술이 인산화의 이질성의 측정을 위해 이용가능하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 인산화의 정도는 크로마토그래피 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 방법은 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 크로마토그래피 방법은 분석적 음이온-교환 크로마토그래피를 포함한다. 음이온-교환 크로마토그래피는 음으로 하전된 생체분자(예를 들어, 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드의 인산화된 형태)가 양으로 하전된 수지에 결합하는 이온 교환의 한 형태이다. 일부 실시형태에서, 음이온-교환 크로마토그래피는 인산화된 아미노산 잔기의 수가 다른 폴리펩티드(예를 들어, 차별적으로 인산화된 폴리펩티드)를 분리하는데 사용될 수 있다. 임의의 하나의 이론에 구속되기를 바라지 않고, 폴리펩티드 인산화는 폴리펩티드의 전하에서 가변성을 부여하여, 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온-교환 크로마토그래피)를 사용하여 차등적으로 인산화된 폴리펩티드를 분리할 수 있게 한다. 이온 교환(예를 들어, 음이온 교환) 컬럼에서 용리하기 위해 구배 용리 완충액(예를 들어, 염 농도가 증가하는 완충액)의 사용은 차등적으로 인산화된 폴리펩티드의 분리를 허용한다. 일부 실시형태에서, 완충액은 예를 들어 트리스 완충액이다. 일부 실시형태에서, 트리스 완충액의 선형 구배가 활용된다. 일부 실시형태에서, 트리스 완충액의 선형 구배는 미리-정의된 기간에 걸쳐 20mM 트리스, pH 7.1에서 20mM 트리스, 525mM NaCl, pH 7.1까지의 선형 구배를 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 구배는 1분, 5분, 10분, 15분, 20분, 22분, 24분, 26분, 28분, 30분, 32분, 34분, 36분, 36분, 38분, 40분 또는 더 긴 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시형태에서, 차등적으로 인산화된 폴리펩티드는 탈인산화된다. 일부 실시형태에서, 탈인산화는 포스파타제(예를 들어, 람다 포스파타제)의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 상기 포스파타제의 활성 및 상기 융합 폴리펩티드의 탈인산화를 허용하는 온도 및 기간 동안 포스파타제와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 탈인산화는 대략적으로 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃ 이상의 인큐베이션 온도에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 탈인산화는 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 또는 더 긴 인큐베이션 시간 동안 발생한다. 일부 실시형태에서, 탈인산화는 25-65분, 30-60분, 35-55분, 40-50분, 30-65분, 35-65분, 40-65분, 45-65분, 50-65분 또는 55-65분의 인큐베이션 시간 동안 발생한다
일부 실시형태에서, 차등적으로 인산화된 폴리펩티드는 분리 이전에 탈인산화된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 차등적으로 인산화된 폴리펩티드는 적절한 참조 표준(예를 들어, 융합 폴리펩티드의 탈인산화 및/또는 비-인산화된 형태)과 비교하여 평가된다.
일부 실시형태에서, (예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피에 의해) 차등적으로 인산화된 폴리펩티드의 분리 후, 각각의 차등적으로 인산화된 폴리펩티드의 양이 측정된다. 일부 실시형태에서, 각각의 차등적으로 인산화된 폴리펩티드의 양은 당업계에서 이용가능한 다양한 방법에 따라 측정된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 제한 없이, 차등적으로 인산화된 폴리펩티드는 말라카이트 그린 검정, 분석적 이온 교환, 분광광도계, 비색 검정 및/또는 웨스턴 블롯을 사용하여 측정된다.
금속-수산화물 보유의 예시적인 특징화
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드는 금속-수산화물(예를 들어, 수산화알루미늄)에 노출될 때 그와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 금속-수산화물에 대한 본 개시내용의 융합 폴리펩티드의 보유(예를 들어, 금속-수산화물 보유)가 특징화된다. 다양한 방법이 금속-수산화물 보유를 측정하는데 이용가능하다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 제한 없이, 금속-수산화물 보유는 타원편광법, 표면 플라스몬 공명, 광 도파관 광모드 분광법, 감쇄된 총 내부 반사율-적외선 분광법, 원편광 이색성 분광법(CD), 총 내부 반사율-적외선 분광법(TIRF) 및 기타 고해상도 현미경 기술에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 금속-수산화물 보유는 시험관내 검정을 사용하여 특징화된다. 예를 들어, 알려진 농도의 융합 폴리펩티드가 과잉의 금속-수산화물과 혼합된다. 유리, 비-착화된 융합 폴리펩티드의 농도가 정량화되고 표준 곡선과 비교되어 금속-수산화물 보유를 결정한다. 유리, 비-착화된 융합 폴리펩티드의 농도는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 따라 평가될 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 일부 실시형태에서, 유리, 비-착화된 융합 폴리펩티드는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯, 비신코닌산 검정 또는 브래드포드 검정에 의해 정량화된다.
일부 실시형태에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 융합-폴리펩티드는 금속-수산화물과 혼합될 때 이와 복합체를 형성한다(예를 들어, 보유된다).
시그널링 활성의 예시적인 특징화
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드(및/또는 이의 복합체)는 활성(예를 들어, 시그널링 활성)에 대해 특징화된다. 일부 실시형태에서, 활성은 적절한 참조 표준과 비교하여 시그널링 활성(예를 들어, 시그널링 능력)을 평가함에 의해 특징화된다. 적절한 참조 표준은 예를 들어 야생형 폴리펩티드 및/또는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 결하는 융합 폴리펩티드일 수 있다.
다양한 방법이 시그널링 능력을 평가하기 위해 이용가능하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 시그널링 능력은 시험관내 또는 생체내-기반 활성 검정을 사용하여 평가된다.
일부 실시형태에서, 시그널링 활성은 시험관내 활성 검정으로 평가된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 활성 검정은 융합 폴리펩티드의 하류 시그널링의 활성화 또는 억제를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 활성의 활성화 또는 억제를 측정하는 것은 리포터(예를 들어, 리포터 검정)의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 리포터 검정은 융합 폴리펩티드 활성과 상관관계가 있는 검출가능한 분자(예를 들어, 리포터)를 사용하여 활성을 측정한다.
일부 실시형태에서, 리포터는 당업자에게 공지된 형광, 생물발광 및/또는 기타 검출가능한 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리포터는 유전자 리포터의 사용을 포함한다. 예를 들어, 유전자 리포터는 폴리펩티드로부터 유도된 시그널링 시 활성화될 수 있다. 예를 들어, 유전자 리포터 전사의 활성화 시, 검출가능한 생성물 또는 기질의 첨가 시 활성화되어 검출가능한 생성물 및/또는 부산물을 생성할 수 있는 효소가 활용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포터 검정에 따라 유용한 효소는 예를 들어 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제(예를 들어, 분비된 알칼리성 포스파타제, SEAP)이다. 그러한 일부 실시형태에서, HEK-Blue-IL12 리포터 검정이 활용된다.
일부 실시형태에서, 시그널링 활성은 생체내 활성 검정으로 평가된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 대상체(예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류, 인간 등)에게 투여되고 활성이 평가된다. 일부 실시형태에서, 활성은 예를 들어 적절한 참조 표준(예를 들어, 야생형 폴리펩티드의 활성)과 비교하여 융합 폴리펩티드의 하류 시그널링의 활성화 또는 억제를 측정함에 의해 평가된다. 다양한 방법이 융합 폴리펩티드의 하류 시그널링의 활성화 또는 억제를 측정하기 위해 이용가능하다. 예를 들어, 제한 없이, 융합 폴리펩티드에 의해 유도된 차등적인 유전자 발현, 단백질 발현, 및/또는 번역-후 변형에서의 변경이 측정될 수 있다.
예시적인 효능 특징화
일부 실시형태에서, 효능은 이용가능한 다양한 방법에 따라 특징화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 융합 폴리펩티드(또는 이의 복합체)는 대상체(예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류, 인간 등)에게 (예를 들어, 종양내 또는 종양주위 주사에 의해) 투여되고 효능은 적절한 참조 표준과 비교하여 결정된다. 적절한 참조 표준은 예를 들어 야생형 폴리펩티드 및/또는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 결하거나, 비-결합(예를 들어, 비-인산화된) 상태에서의 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 효능은 동물 모델(예를 들어, 마우스, 랫트, 비-인간 영장류 등)에서 전-임상적으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 동물 모델에 (예를 들어, 종양내 또는 종양주위 주사에 의해) 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 동물 모델은 종양이 있는 동물 모델(예를 들어, 암의 동물 모델)이다. 일부 실시형태에서, 암 동물 모델은 상기 동물 모델에 종양 세포를 접종함에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 동물 모델은 옆구리 영역에 종양 세포가 접종된다. 일부 실시형태에서, 동물 모델은 임상적으로 관련된 영역(예를 들어, 유방 지방 패드)에 종양 세포가 접종된다.
일부 실시형태에서, 암의 동물 모델에는 본 개시내용의 융합 폴리펩티드가 투여된다. 일부 실시형태에서, 암의 동물 모델에는 참조 표준(예를 들어, 야생형 폴리펩티드 및/또는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 결하는 폴리펩티드)이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 종양 부피 및/또는 생존 퍼센트와 같은 당업계에 공지된 효능에 대한 다양한 이용가능한 사전-결정된 측정은 적절한 참조 표준(예를 들어, 야생형 폴리펩티드 및/또는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 결하는 폴리펩티드)과 비교하여 시간에 걸쳐서 평가된다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드의 효능은 임상적으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드는 종양이 있는 대상체에게 (예를 들어, 종양내, 종양주위 주사에 의해, 또는 종양-배출 림프절 안으로) 투여된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 종양 부피 및/또는 생존 퍼센트와 같은 당업계에 공지된 효능에 대한 다양한 이용가능한 사전-결정된 측정은 종양 투여된 참조 표준(예를 들어, 당업계에서의 공지된 효능 및/또는 위약의 치료)을 갖는 대상체와 비교하여 시간에 걸쳐서 평가된다.
조성물
융합 폴리펩티드의 제조
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 무엇보다도 융합 폴리펩티드 제제를 제공한다. 융합 폴리펩티드 제제는 일부 실시형태에서 본 명세서에 기술된 상기 융합 폴리펩티드의 세포 배양 생산물로부터 정제되는 융합 폴리펩티드를 포함하는 제제이다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 제제는 융합 폴리펩티드의 인산화되지 않은 형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 제제는 융합 폴리펩티드의 인산화된 형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 제제는 융합 폴리펩티드의 인산화되지 않은 및 인산화된 형태 둘 모두의 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 제제는 약학적-등급 융합 폴리펩티드를 포함하는 제제이다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 제제는 그 하나 이상의 특징화 속성이 평가되고 방출 및/또는 허용 기준(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 충족시키는 것으로 결정되는 융합 폴리펩티드를 포함하는 제제이다. 그러한 생성물 품질 속성의 예에는 인산화의 정도 및/또는 인산화의 이질성이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 제제는 융합 폴리펩티드의 인산화된 형태 및 융합 폴리펩티드를 인산화하는데 사용되는 키나제(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키나제는 융합 폴리펩티드 제제로부터 제거된다.
일부 실시형태에서, 인산화된 융합 폴리펩티드 제제는 다양한 정도의 인산화를 갖는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드의 제제의 인산화의 정도(예를 들어, 폴리펩티드당 인산염 분자의 평균 수)는 0.5-7, 1-7, 2-7, 3-7, 4-7, 5-7, 6-7, 0.5-6, 0.5-5, 0.5-4, 1-6, 2-6, 3-6, 4-6, 5-6, 0.5-10, 0.5-9, 0.5-8, 1 -10, 1-9, 1-8, 2-10, 2-9, 2-8, 3-10, 3-9, 3-8, 4-10, 4-9, 4-8, 5-10 , 5-9, 5-8, 6-10, 6-9 또는 6-8이다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드의 제제의 인산화의 정도(예를 들어, 폴리펩티드당 인산염 분자의 평균 수)는 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7. 7.8, 7.9, 7.10, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 또는 10이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 무엇보다도 융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체를 포함하는 융합 폴리펩티드 제제를 제공한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체를 포함하는 제제는 당업계에 공지된 임의의 다양한 적합한 금속-수산화물을 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, 금속-수산화물은 수산화알루미늄 또는 수산화철일 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체는 예를 들어 금속(예를 들어, 알루미늄) 질량으로 정의되는 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물(예를 들어, 수산화알루미늄)의 질량비를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비율은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1: 11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 무엇보다 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체로서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 허용가능한 약학적 조성물 제형 물질은 바람직하게는 이용된 복용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 일부 실시형태에서, 제형 물질(들)은 피하 및/또는 정맥내 투여용이다. 일부 실시형태에서, 제형 물질(들)은 국소 투여(예를 들어, 종양내 또는 종양주위 투여)용이다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은, 예를 들어 융합 폴리펩티드의 pH, 삼투질농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적합한 제형 재료는 아미노산(예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항균제; 항산화제(예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충액(예컨대 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 구연산염, 인산염 또는 기타 유기산); 증량제(예컨대 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충진제; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 향료 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온(예컨대 나트륨); 방부제(예컨대 벤잘코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 증강제(예컨대 수크로스 또는 소르비톨); 등장성 증강제(예컨대 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약학적 보조제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995)). 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 PBS; 20mM NaOAC, pH 5.2, 50mM NaCl; 및/또는 10mM NAOAC, pH 5.2, 9% 수크로스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 최적의 약학적 조성물은 예를 들어 의도된 투여 경로, 전달 형식 및 원하는 복용량에 의존하여 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 상기 Remington's Pharmaceutical Sciences를 참조한다. 일부 실시형태에서, 그러한 조성물은 융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 청소 속도에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물에서 일차 비히클 또는 담체는 사실상 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적합한 비히클 또는 담체는 주사용수, 생리 식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있으며, 가능하게는 비경구 투여용 조성물에 일반적인 다른 물질이 보충될 수 있다. 일부 실시형태에서, 식염수는 등장성 인산염-완충 식염수를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 추가의 예시적인 비히클이다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 약 pH 7.0-8.5의 트리스 완충액, 또는 약 pH 4.0-5.5의 아세테이트 완충액를 포함하며, 이는 소르비톨 또는 이에 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 금속 수산화물 복합체 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 선택된 조성물을 동결건조된 케이크 또는 수용 용액의 형태에서 선택적 제형 작용제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기)와 혼합함에 의해 저장용으로 제조된다. 추가로, 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체 또는 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화된다.
사용
치료 방법
일 양태에서, 본 개시내용은 의학적 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 종양이 있는 대상체(예를 들어, 암이 있는 대상체)를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로 치료 방법은 종양 부피 감소, 전이 감소 및/또는 예방, 생존 연장, 및/또는 병태 치유를 목표로 한다. 본 개시내용의 융합 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드 금속 수산화물 복합체를 투여받는 적절한 대상체 또는 개체에는, 예를 들어, 종양(예를 들어, 암)이 있는 인간 또는 다른 포유동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 말, 고양이, 돼지 또는 비-인간 영장류)이 포함된다.
일부 실시형태에서, 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법은 면역 효능제 모이어티 및 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함하는 면역조절 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드 및 금속 수산화물을 포함하는 복합체로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법은 면역 효능제 모이어티 및 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함하는 면역조절 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 융합 폴리펩티드는 금속 수산화물과 제형화된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 복합체는 단일요법으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 복합체는 제2 치료제와 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 복합체는 대상체에게 투여되며 여기서 대상체는 적어도 하나의 추가 치료제로의 요법을 받았거나 받고 있다.
본 개시내용의 융합 폴리펩티드 및/또는 이의 제제 및/또는 복합체는 무엇보다도 종양이 있는 대상체를 치료하는데 유용하다. 종양과 연관된 질환의 비-제한적인 예에는 암(예를 들어, 암종, 육종, 전이성 질환 또는 조혈 신생물 장애)이 포함된다. 전이성 종양을 포함한 종양은 복수의 원발성 종양 유형으로부터 발생할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 일부 실시형태에서 종양 또는 전이성 종양은 신장(예를 들어, 신세포 암종), 두경부(예를 들어, 두경부 편평 세포 암종), 전립선, 유방(예를 들어, 삼중-음성), 대장, 피부(예를 들어, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 피부 T-세포 림프종, 피부 편평 세포 암종, 기저 세포 암종), 폐(예를 들어, 비소세포폐암) 및 췌장의 원발성 종양으로부터 발생할 수 있다. 따라서, 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체 및 이의 제제를 포함하는 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드 및 이의 제제는 암이 있는 대상체에게 투여될 수 있다.
종양 성장 및 크기를 감소시키기에 충분한 융합 폴리펩티드-금속 수산화물 복합체, 융합 폴리펩티드 또는 이의 제제의 양, 또는 치료적으로 유효한 양은 선택된 특정 화합물 또는 제제에 의해서뿐만 아니라 투여의 경로, 치료되는 병태의 성격, 환자의 연령 및 병태에 따라 다를 것이고 궁극적으로 환자의 의사 또는 약사의 재량 및/또는 임상적 지침에 근거할 것이다는 것을 당업자라면 인식될 것이다. 본 방법에 사용되는 화합물이 제공되는 기간은 개인별로 다르고/다르거나 임상 지침에 기반할 것이다.
일부 실시형태에서, 종양(예를 들어, 암)이 있는 대상체를 치료하는 방법은 면역 효능제 모이어티 및 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함하는 면역조절 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드와 금속 수산화물을 포함하는 복합체로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드와 금속-수산화물은 함께 제형화된다. 예를 들어, 함께 제형화되면 사전-형성된 융합 폴리펩티드와 금속-수산화물의 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드와 금속-수산화물은 투여 직전에 혼합된다.
일부 실시형태에서, 종양(예를 들어, 암)이 있는 대상체를 치료하는 방법은 복합체로 대상체를 치료하는 것을 포함하며 여기서 복합체는 종양내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 종양(예를 들어, 암)이 있는 대상체를 치료하는 방법은 복합체로 대상체를 치료하는 것을 포함하며 여기서 복합체는 종양주위 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 종양(예를 들어, 암)이 있는 대상체를 치료하는 방법은 복합체로 대상체를 치료하는 것을 포함하며 여기서 복합체는 종양-배출 림프절 또는 림프절들에 투여된다.
본 발명의 방법은 종종 치료적으로 유효한 양의 특정 작용제의 투여를 포함한다. 치료적으로 유효한 양은 (원칙적으로, 종, 신체 유형, 크기, 질환 또는 장애의 정도, 증상의 정도 또는 유형, 반응 이력 및/또는 전반적인 건강과 같은 비교가능한 특징의 대상체에 대해) 조직, 시스템 또는 대상체에서 의도된 생물학적 또는 의학적 반응 또는 치료적 이점을 달성하기에 충분한 양이다. 예를 들어, 바람직한 반응에는 다음 중 하나 이상이 포함될 수 있다: 의학적 병태, 질환 또는 장애의 발병을 지연 또는 예방하는 것, 병태의 증상의 진행, 심화 또는 악화를 늦추거나 중단시키는 것, 병태의 증상의 개선을 초래하는 것, 및 병태를 치유하는 것.
치료제의 조합이 투여되는 경우, 조합에 필요한 임의의 개별 작용제의 양은 단독에서 그 치료적 효과를 달성하기 위한 그 동일한 작용제에 필요한 양과 다를 수 있다. 일부 경우에는 조합하여 사용되는 치료제 간 또는 그 중의 시너지 효과가 필요한 양이 감소시킬 수 있으며; 다른 경우에는 억제성 상호작용으로 인해 필요한 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일반적으로, 작용제 조합의 치료적으로 유효한 양은 작용제의 치료적으로 유효한 양을 개별적으로 구성하는 것보다 작용제의 상이한 절대량을 활용할 수 있다.
조합 요법
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체 또는 이의 제제는 제2 치료제와 조합하여 투여된다. 제2 치료제는 당업계에 공지된 다양한 이용가능한 항-종양제로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체의 투여 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체와 동시적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체로의 투여 후에 투여된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 방사선(예를 들어, 이온화 방사선)이다. 일부 실시형태에서, 투여되는 이온화 방사선의 양은 약 1 Gy 내지 약 1,000 Gy, 약 5 Gy 내지 약 900 Gy, 약 10 Gy 내지 약 800 Gy, 약 10 Gy 내지 약 700 Gy, 약 10 Gy 내지 약 600 Gy, 약 10 Gy 내지 약 500 Gy, 약 10 Gy 내지 약 400 Gy, 약 10 Gy 내지 약 300 Gy, 약 10 Gy 내지 약 200 Gy, 약 10 Gy 내지 약 100 Gy, 약 5 Gy 내지 약 15 Gy, 약 7.5 Gy 내지 약 12 Gy, 또는 약 10 Gy 내지 약 12 Gy이다. 일부 실시형태에서, 투여되는 이온화 방사선의 양은 약 12 Gy이다. 일부 실시형태에서, 이온화 방사선의 양은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 또는 1,000 Gy 초과이다. 일부 실시형태에서, 이온화 방사선의 양은 약 1,000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 Gy 미만이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 화학요법제이다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 표적화된 요법(예를 들어, BRAF 억제제, MEK 억제제 등)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 임의의 승인된 화학요법제일 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 화학요법제는 아드리아마이신, 아나스트로졸, 시클로포스파미드, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에를로티닙, 플루오로우라실, 젬시타빈, 이마티닙, 이레사, 레트로졸, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 타르세바 및 트라스투주맙 중 하나 이상일 수 있다. 화학요법제는 당업계에서 임의의 승인되고/되거나 공지된 요법에 따라 투여될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 항-종양 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-종양 항체는 면역 조절제이다. 일부 실시형태에서, 면역 조절제는 체크포인트 억제제이다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, TIGIT 및/또는 LAG3 중 하나 이상을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1(예를 들어, 펨브롤리주맙)을 표적화한다. 항-종양 항체는 당업계에서 임의의 승인되고/되거나 공지된 요법에 따라 투여될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 외과적 종양 절제이다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체는 외과적 종양 절제 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체는 종양 절제 후 조직에 투여되며, 이 조직은 예를 들어 잔존하는 종양(예를 들어, 종양 세포)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체는 상기 절제 동안 외과적 종양 절제로 제거될 수 없는 조직, 또는 절제에 가까운 조직에 투여된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 세포 요법이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 요법은 자연 살해(NK) 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 요법은 종양 침윤 림프구(TIL)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 요법은 대식세포 또는 기타 골수 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 요법은 생체외에서 확장된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 요법은 키메라 항원 수용체(CAR) 효과기 세포 요법(예를 들어, CAR T 세포)이거나 이를 포함한다. CAR은 유전적으로-조작된 인공 막횡단 수용체로, 이는 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, 자연 살해 세포 또는 기타 면역 세포) 상에 선택한 리간드에 대해 선택된 특이성을 부여하고 인식 시 효과기 세포의 활성화 및 리간드에 대한 결합을 초래한다. 종종 그러한 리간드 특이성은 CAR 안으로 단일클론 항체의 항원 특이성을 조작함에 의해 CAR T 세포를 항체에 의해 인식되는 항원에 표적화함에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체-발현 효과기 세포(예를 들어, CAR-T 세포)는 질환 또는 병태가 있는 환자로부터 유래(예를 들어, 단리)되고 리간드에 대해 임의의 특이성을 갖는 적어도 하나의 CAR을 발현하도록 시험관내에서 유전적으로 변형된 세포이다. 세포는 CAR에 대한 리간드의 특이적 결합에 의해 자극되거나 유도되고 동일한 환자의 질환 또는 병태의 치료에 유용한 적어도 하나의 효과기 기능(예를 들어, 사이토카인의 유도)을 수행한다. 효과기 세포는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포 또는 보조 T 세포)일 수 있다. 본 개시내용을 읽는 당업자는 일부 실시형태에서 T 세포 이외의 세포(예를 들어, 자연 살해 세포, 줄기 세포 등)가 CAR을 발현하도록 조작될 수 있어서 키메라 항원 수용체 효과기 세포는 T 세포 이외의 효과기 세포를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, CAR 효과기 세포는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포)이고; 일부 실시형태에서, 그러한 CAR-T 세포는 표적 또는 표적 세포(예를 들어 암세포)와 접촉하거나 근접하게 될 때 표적 세포에 그의 효과기 기능(예를 들어 세포독성 T 세포 반응)을 발휘한다(예를 들어, Chang and Chen (2017) Trends Mol Med 23(5):430-450 참조). 일부 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, CAR 효과기 세포 요법)은 종양 침윤 림프구(TIL)를 활용한다. TIL은 암세포를 표적화한다. 일부 실시형태에서, TIL은 암이 있는 대상체로부터 단리되고 생체외에서 확장된다. 그러한 일부 실시형태에서, TIL은 종양의 외과적 절제 후에 단리되고 생체외에서 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 투여 전에, 대상체는 림프구고갈 조건화 요법으로 치료된다(Rohaan, Maartje W 등 "Adoptive cellular therapies: the current landscape."　Virchows Archiv : an international journal of pathology　vol. 474,4 (2019): 449-461).
일부 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, CAR 효과기 세포 요법)은 자연 살해(NK) 세포를 활용한다. 자연 살해(NK) 세포는 종양 면역감시의 필수적인 부분으로, 마우스 모델 및 임상 연구에서 약화된 NK 활성과 연관하여 더 높은 암 감수성 및 전이에 의해 입증된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 생식계열-인코딩된 표면 수용체의 어레이를 사용하여 NK 세포는 이전 감작화 없이 악성 세포를 인식하고 이에 대해 신속하게 작용할 수 있다(iu, S., Galat, V., Galat4, Y.　등　NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development.　J Hematol Oncol　14,　7 (2021)).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체 또는 이의 제제는 적어도 하나의 추가적인 치료제로의 요법을 받았거나 받고 있는 대상체에게 투여된다. 추가적인 치료제는 당업계에 공지된 다양한 항-종양제로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체의 투여 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체와 동시적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체로의 투여 후에 투여된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 방사선(예를 들어, 이온화 방사선)이다. 일부 실시형태에서, 투여되는 이온화 방사선의 양은 약 1 Gy 내지 약 1,000 Gy, 약 5 Gy 내지 약 900 Gy, 약 10 Gy 내지 약 800 Gy, 약 10 Gy 내지 약 700 Gy, 약 10 Gy 내지 약 600 Gy, 약 10 Gy 내지 약 500 Gy, 약 10 Gy 내지 약 400 Gy, 약 10 Gy 내지 약 300 Gy, 약 10 Gy 내지 약 200 Gy, 약 10 Gy 내지 약 100 Gy, 약 5 Gy 내지 약 15 Gy, 약 7.5 Gy 내지 약 12 Gy, 또는 약 10 Gy 내지 약 12 Gy이다. 일부 실시형태에서, 투여되는 이온화 방사선의 양은 약 12 Gy이다. 일부 실시형태에서, 이온화 방사선의 양은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 또는 1,000 Gy 초과이다. 일부 실시형태에서, 이온화 방사선의 양은 약 1,000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 Gy 미만이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 화학요법제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 표적화된 요법(예를 들어, BRAF 억제제, MEK 억제제 등)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 임의의 승인된 화학요법제일 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 화학요법제는 아드리아마이신, 아나스트로졸, 시클로포스파미드, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에를로티닙, 플루오로우라실, 젬시타빈, 이마티닙, 이레사, 레트로졸, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 타르세바 및 트라스투주맙 중 하나 이상일 수 있다. 화학요법제는 임의의 당업계에 승인되고/되거나 공지된 요법에 따라 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 항-종양 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-종양 항체는 면역 조절제이다. 일부 실시형태에서, 면역 조절제는 체크포인트 억제제이다. 일부 실시형태에서, 체크포인트 억제제는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, TIGIT 및/또는 LAG3 중 하나 이상을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1(예를 들어, 펨브롤리주맙)을 표적화한다. 항-종양 항체는 임의의 당업계에 승인되고/되거나 공지된 요법에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 추가적인 치료제는 세포 요법이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 요법은 키메라 항원 수용체(CAR) 효과기 세포 요법(예를 들어, CAR T 세포)이거나 이를 포함한다. CAR은 유전적으로-조작된 인공 막횡단 수용체로, 이는 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, 자연 살해 세포 또는 기타 면역 세포) 상에 선택한 리간드에 대해 선택된 특이성을 부여하고 인식 시 효과기 세포의 활성화 및 리간드에 대한 결합을 초래한다. 종종 그러한 리간드 특이성은 CAR 안으로 단일클론 항체의 항원 특이성을 조작함에 의해 CAR T 세포를 항체에 의해 인식되는 항원에 표적화함에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체-발현 효과기 세포(예를 들어, CAR-T 세포)는 질환 또는 병태가 있는 환자로부터 유래(예를 들어, 단리)되고 리간드에 대해 임의의 특이성을 갖는 적어도 하나의 CAR을 발현하도록 시험관내에서 유전적으로 변형된 세포이다. 세포는 CAR에 대한 리간드의 특이적 결합에 의해 자극되거나 유도되고 동일한 환자의 질환 또는 병태의 치료에 유용한 적어도 하나의 효과기 기능(예를 들어, 사이토카인의 유도)을 수행한다. 효과기 세포는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포 또는 보조 T 세포)일 수 있다. 본 개시내용을 읽는 당업자는 일부 실시형태에서 T 세포 이외의 세포(예를 들어, 자연 살해 세포, 줄기 세포 등)가 CAR을 발현하도록 조작될 수 있어서 키메라 항원 수용체 효과기 세포는 T 세포 이외의 효과기 세포를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, CAR 효과기 세포는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포)이고; 일부 실시형태에서, 그러한 CAR-T 세포는 표적 또는 표적 세포(예를 들어 암세포)와 접촉하거나 근접하게 될 때 표적 세포에 그의 효과기 기능(예를 들어 세포독성 T 세포 반응)을 발휘한다(예를 들어, Chang and Chen (2017) Trends Mol Med 23(5):430-450 참조). 일부 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, CAR 효과기 세포 요법)은 종양 침윤 림프구(TIL)를 활용한다. TIL은 암세포를 표적화한다. 일부 실시형태에서, TIL은 암이 있는 대상체로부터 단리되고 생체외에서 확장된다. 그러한 일부 실시형태에서, TIL은 종양의 외과적 절제 후에 단리되고 생체외에서 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 투여 전에, 대상체는 림프구고갈 조건화 요법으로 치료된다(Rohaan, Maartje W 등 "Adoptive cellular therapies: the current landscape."　Virchows Archiv : an international journal of pathology　vol. 474,4 (2019): 449-461).
일부 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, CAR 효과기 세포 요법)은 자연 살해(NK) 세포를 활용한다. 자연 살해(NK) 세포는 종양 면역감시의 필수적인 부분으로, 마우스 모델 및 임상 연구에서 약화된 NK 활성과 연관하여 더 높은 암 감수성 및 전이에 의해 입증된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 생식계열-인코딩된 표면 수용체의 어레이를 사용하여 NK 세포는 이전 감작화 없이 악성 세포를 인식하고 이에 대해 신속하게 작용할 수 있다(iu, S., Galat, V., Galat4, Y.　등　NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development.　J Hematol Oncol　14,　7 (2021)).
일부 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, CAR 효과기 세포 요법)은 골수 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 골수 세포는 대식세포이거나 이를 포함한다. 대식세포는 명반을 흡수하는 것으로 나타났다.
예증
실시예 1: 증가된 인산화 및 수산화알루미늄 결합을 위한 예시적인 금속-수산화물 결합 폴리펩티드( 예를 들어 , 명반 결합 폴리펩티드(ABP)) 서열의 최적화
방법
유전자 합성 - 유전자는 ATUM Bio(캘리포니아주 뉴어크 소재)에서 합성하고 pD2610-v10 벡터 안으로 클로닝하였다. 인간 Fam20C(Uniprot Q8IXL6)는 c-말단에 융합된 세포내 보유를 위해 그 천연 신호 펩티드 및 링커-KDEL 서열(GGGSKDEL)로 클로닝하였다. 단일-사슬 인간 IL12 작제물을 인간 IL2 신호 펩티드 및 성숙한 인간 IL12A/p35(Uniprot P29459)에 융합된 성숙한 인간 IL12B/p40(Uniprot P29460)으로 (G4S)3 링커를 통해 클로닝하였다. 단일-사슬 마우스 IL12 작제물을 인간 IL2 신호 펩티드 및 마우스 IL12A/p35(Uniprot P43431)에 융합된 성숙한 마우스 IL12B/p40(Uniprot P43432)으로 (G4S)3 링커를 통해 클로닝하였다. 다양한 명반 결합 폴리펩티드(ABP) 서열을 마우스 및 인간 IL12의 c-말단에 유전적으로 융합시키고 이어서 친화도 정제를 위해 His6 태그를 융합시켰다.
폴리펩티드 발현 및 정제 - 인간 또는 마우스 IL12 작제물을 인코딩하는 플라스미드는 인간 Fam20C-KDEL 플라스미드와의 공동-형질감염을 갖거나 갖지 않는 현탁 HEK-293 세포에 일시적으로 형질감염되었다. 대부분의 공동-형질감염에서는 IL12 플라스미드 대 Fam20C-KDEL 플라스미드의 4:1의 질량비가 사용되었다. 상등액을 수집하고 IL12 융합 폴리펩티드를 NiSepharose Excel(Cytiva 17-3712-02)에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제했다. 용리된 융합 폴리펩티드를 트리스-완충 식염수(TBS), pH 7.4에서 제형화하고 순도를 Perkin Elmer GXII 모세관 전기영동 시스템에서 결정했다. 폴리펩티드 응집은 300Å 기공 크기를 갖는 HPLC-SEC에 의해 평가되었다. 필요한 경우 단백질을 HiLoad 16/600 또는 26/600 Superdex 200 pg 컬럼(Cytiva 28-9893-36) 상에서 FPLC-SEC에 의해 추가로 정제하고 단량체 피크 분획을 모았다.
일부 경우에, 융합 폴리펩티드는 고도로 인산화된 종을 농후화하기 위해 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 연마되었다. TBS에서의 융합 폴리펩티드를 WFI에서 3-배수 희석하고 HiTrap Q 세파로스 컬럼 상에 장입했다. 샘플을 0.33x TBS에서 1% Tx-13에 이어 15 컬럼 부피의 20mM Tris, pH 8.1로 세정했다. 샘플을 20 컬럼 부피에 걸쳐 20mM Tris, pH 8.1에서 20mM Tris, pH 8.1, 600mM NaCl까지의 선형 구배로 용리하였다. 선택된 분획을 모아 TBS 안으로 완충액 교환했다.
말라카이트 그린 검정 - 폴리펩티드당 인산염 분자의 평균 수는 제조업체의 지침에 따라 Pierce 인단백질 추정 검정 키트(23270)를 사용하여 결정하였다. 인산화된 단백질 표준 포스비틴을 TBS에 재현탁하고 100에서 2.5ug/mL로 희석하여 표준 곡선을 생성했다. 각 테스트 폴리펩티드를 TBS에서 300μg/mL 및 100μg/mL로 희석했다. 50μL의 각 표준 또는 시험 작용제를 세릴 및 트레오닐 잔기로부터 인산염의 알칼리성 가수분해를 위해 평평한 바닥, 96웰 플레이트(Griener 655101)에서 2.0N NaoH 50μL와 혼합했다. 샘플을 65℃에서 30분 동안 또는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 각 웰에 50μL의 4.7N HCL을 추가하고 진탕기에서 30초 동안 혼합함에 의해 중화했다. 1 부피의 몰리브덴산 암모늄 용액과 3 부피의 말라카이트 그린 용액으로 구성된 50μL의 인산염 시약을 그 다음 각 웰에 첨가하고 30초 동안 혼합했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후 650nm에서 흡광도를 측정했다. 시험 작용제당 인산염 분자의 수는 포스비틴 표준 곡선에서 알려진 인산염 함량에 기반하여 도출되었다.
수산화알루미늄(명반) 보유 분석 - 수산화알루미늄에 대한 융합 폴리펩티드의 결합 및 보유를 시험관내에서 시험하였다. TBS에서 100-250μg/mL의 최종 농도에서의 시험 폴리펩티드를 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄(Invivogen Cat# alu-vac-250) 또는 대조군으로서 TBS 단독과 최종 부피 50μL로 혼합했다. 융합 폴리펩티드/명반 혼합물을 피펫팅으로 완전하게 재현탁시키고 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션에 걸친 중간에 혼합물을 피펫팅으로 다시 재현탁시켰다. 융합 폴리펩티드/명반 혼합물 또는 폴리펩티드 단독 대조군을 그 다음 최종 농도 1mM 인산염, 20% 마우스 혈청을 함유하는 용리 완충액에 20x 희석하여 최종 부피 1mL로 하였다. 희석된 샘플을 24-48시간 동안 부드러운 회전으로 37℃에서 인큐베이션했다. 각 시점에서 샘플 50μL를 제거하고 18,000xg에서 10분 동안 원심분리하여 수산화알루미늄을 펠렛화했다. 제거된 상등액을 새 튜브로 옮기고 분석 준비가 될 때까지 4℃에서 보관했다. 각 상등액 샘플에서 유리 폴리펩티드의 농도를 마우스 IL12p70 ELISA 키트(R&D Systems m1270)를 사용하여 정량화했다. 모든 희석은 TBS + 1% BSA + 0.1% Tween-20에서 이루어졌다. 시험 작용제는 최고 농도 1ng/mL 및 2x 희석으로 표준 곡선에 대해 사용되었고, 모든 폴리펩티드가 방출된 경우 상등액 샘플은 이론 농도 1ng/mL 및 0.5ng/mL로 희석되었다.
SAX-10 HPLC 검정 - 융합 폴리펩티드 인산화는 또한 Thermo ProPac SAX-10 컬럼(4 x 250mM, 10μm)에서 분석용 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가되었다. 샘플을 20mM Tris, pH 7.1에서 4-배수 희석하고 1.0mL/분 유속으로 컬럼에 장입했다. 샘플은 28분에 걸쳐 20mM Tris, pH 7.1에서 20mM Tris, 525mM NaCl, pH 7.1까지 선형 구배로 용리되었다. 일부 경우에, 융합 폴리펩티드는 컬럼에서 실행되기 이전에 람다 단백질 포스파타제(New England Biolabs, P0753L)로 탈인산화되었다. 50μg의 융합 폴리펩티드를 10x PMP 완충액, 10mM MnCL2 및 2-4μL 포스파타제와 함께 30℃에서 30-60분 동안 인큐베이션했다.
동계 종양 모델 - B16F10 세포를 37℃, 5% CO2에서 DMEM + 10% FBS에서 성장시켰다. 7-9주령의 C57BL/6 마우스에 오른쪽 옆구리 영역에서 0.1mL의 PBS 용액에서의 1x106개 B16F10 세포를 접종했다. 종양이 ~75㎣에 도달했을 때, 마우스를 무작위로 선정하고 20μL 비히클 또는 실온에서 30분 동안 금속 질량으로 정의된 25-50μg 수산화알루미늄과 혼합되고 사전-인큐베이션된 5-7.7μg mIL12-ABP를 종양내로 주사했다. 일부 그룹에서는 50μL 부피에서의 200μg 항-PD1(Bioxcell BP0273)을 0, 3, 6 및 9일차에 복강내로 주사했다. 연구의 기간 동안 종양 부피와 체중을 매주 3회 측정했고 마우스는 그 종양 부피가 2000㎣에 도달하면 안락사된다. 일부 연구에서, 오른쪽 옆구리에 1x106 B16F10 세포를 주입하고 왼쪽 옆구리에 1x105 세포를 주입하여 각 동물에 2개의 종양을 접종했다. 이들 이중 옆구리 연구에서, mIL12-ABP/명반 복합체 또는 대조군은 더 큰 오른쪽 옆구리 종양에만 주사되었다.
결과
친화도 정제를 위해 (G4S)3 링커와 c-말단 His6 태그에 의해 연결된 성숙한 IL12B 및 IL12A 서열을 함유하는 단일-사슬 인간 및 마우스 IL12 작제물을 생성하였다. 변이체를 함유하는 명반 결합 폴리펩티드(IL12-ABP)는 IL12에 대한 c-말단 및 His 태그 앞에 다양한 ABP 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하여 클로닝하였다. 인간 및 마우스 IL12-ABP 융합 폴리펩티드의 제1 세트는 세포내 보유를 위해 c-말단 KDEL 서열을 갖는 인간 Fam20C 키나제를 인코딩하는 플라스미드와의 공동-형질감염을 갖거나 갖지 않는 100mL HEK 배양물에서 일시적으로 발현되었다. 융합 폴리펩티드는 Ni-NTA 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 융합 폴리펩티드당 평균 인산화 수준은 말라카이트 그린 검정에 의해 평가되었(도 3a). Fam20C와 공동-발현된 hIL12-ABP 및 mIL12-ABP 융합 폴리펩티드("-K"로 표시됨)는 Fam20C 공동-발현이 없는 융합 폴리펩티드 또는 Fam20C와 공동-발현된 ABP를 결하는 야생형 hIL12 또는 mIL12에 비해 상당히 더 높은 인산염 수준을 가졌다. 모든 ABP 서열이 인산화된 반면, ABP10 서열과의 융합 폴리펩티드는 테스트된 다른 ABP 변이체보다 재현적으로 더 높은 인산화 수준을 가졌다.
마우스 IL12-ABP 변이체는 Fam20C 공동-발현으로 일시적 HEK에서 1L 규모로 발현되었고 순차적 Ni-NTA 및 SEC 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 말라카이트 그린 검정에서, mIL12-ABP10은 다시 ABP20-G4-GS20, ABP20-G4 및 ABP20의 순서에 이어 가장 높은 인산화를 가졌다(도 3b). 마우스 IL12-ABP 융합 폴리펩티드를 그 다음 전신 PD-1 차단과 조합하여 이중 옆구리 B16F10 동계 종양 모델에서 시험하였다. 5μg mIL12 또는 mIL12-ABP를 금속 질량으로 정의된 25μg 수산화알루미늄과 혼합하고 30분 동안 인큐베이션한 후 종양 이식 후 6일차에 오른쪽 옆구리 종양 안으로 주사했다. 모든 mIL12-ABP/명반 복합체는 PD-1 단독 또는 mIL12 + PD-1에 비해 종양 성장을 지연시켰지만, 가장 큰 지연은 mIL12-ABP10에서 관찰되었는데 이는 증가된 인산화가 명반과 착화되었을 때 단일 주사 후 생체내 효능을 향상시킬 수 있음을 시사한다(도 4a-4g).
ABP 인산화, 명반 보유 및 생체내 효능을 추가로 증강시키기 위해, SXE 부위의 수, SXE 부위의 이격, 측접하는 잔기 및 링커 서열에서 다른 도 5에서 열거된 ABP 서열을 갖는 mIL12-ABP 작제물의 더 큰 패널을 생성하였다. 폴리펩티드를 HEK 세포에서 Fam20C로 공동-형질감염시키고 Ni-NTA 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 폴리펩티드의 인산화 수준은 말라카이트 그린 검정에서 특징화되었다(도 6a 및 도 6b). 모든 ABP는 음성 대조군에 비해 유의하게 높은 인산화 수준을 갖지만, ABP10, ABP20-G8-GS, ABP20-G4-6x 및 ABP20-G4-8x를 포함하는 mIL12 융합 폴리펩티드에서 가장 높은 인산화 수준이 검출되었다.
ABP 서열에서 추가적인 세린의 표적-외 인산화 가능성을 감소시키기 위해, ABP20-G4-6x 및 ABP20-G4-8x에 대한 링커를 GGGGSGGGG에서 GGGGEGGGG로 변경하고 His-태그의 바로 상류에서 세린을 제거했다. 이들 새로운 서열은 ABP20-G4-6x-GE 및 ABP20-G4-8x-GE로 지칭된다(도 5). ABP10, ABP20-G4-6x-GE 또는 ABP20-G4-8x-GE에 융합된 mIL12는 일시적 HEK에서 1L 규모로 Fam20C와 공동-발현되었다. 융합 폴리펩티드는 순차적 Ni-NTA 친화도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 모든 융합 폴리펩티드는 SDS-PAGE 및 SEC에서 단일 피크로 나타났으며 이는 유의미한 분해 또는 응집이 없음을 입증한다(도 7a-7c). 3개의 예시적인 융합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 TBS에서 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 30분 동안 인큐베이션한 다음 24시간 동안 5mM 인산염 및 20% 마우스 혈청을 함유하는 용리 완충액에 희석하는 명반 보유 검정에서 테스트되었다. 3개의 융합 폴리펩티드 모두 비변형된 IL12에 비해 명반 상에 유의하게 더 높은 보유를 가지는 반면, mIL12-ABP20-G4-6x-GE는 mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE보다 더 빠르게 용리되었다(도 8).
HEK 세포에서 Fam20C로 일시적 공동-형질감염에 이어서, 주어진 융합 폴리펩티드 샘플 내 IL12-ABP 분자 사이의 인산염 수준에 이질성이 있을 가능성이 있다. 보다 균질하게 인산화된 물질을 생성하기 위해, mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE를 컬럼에 더 단단히 결합하고 나중에 용리되는 더 과하게 인산화된 융합 폴리펩티드와 추가된 음전하를 기반으로 상이한 인-종을 분리할 수 있는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제했다. 샘플은 선형 염 구배로 용리되었으며 각 용리 피크의 후반부를 수집하고 모아서 더 낮은 수준의 인산화를 함유하는 초기 용리 분획을 제거했다(도 9a-9b). 예비적 음이온 교환 크로마토그래피 후 mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 농후화된 풀을 분석용 이온 교환 크로마토그래피로 원래 물질과 비교했다(도 10a-10c). 각 융합 폴리펩티드의 추가 샘플을 포스파타제로 효소적으로 탈인산화하고 대조군으로 실행했다. 음이온 교환 연마 이전에 두 샘플 모두 탈인산화된 흔적과 부분적으로 중첩하는 초기 용리 분획을 갖는다. 그러나, 이온 교환 연마 후에 샘플은 탈인산화된 융합 폴리펩티드보다 나중에 용리되는 보다 균질한 프로파일을 가지며 이는 더 높은 인산화를 갖는 융합 폴리펩티드에 대한 농후화를 시사한다.
이온 교환 농후화된 mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE는 이온-교환 연마 이전에 mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 샘플과 함께 명반 보유 검정에서 테스트되었다(도 11a). 폴리펩티드를 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화한 다음 5mM 인산염 및 20% 마우스 혈청을 함유하는 용리 완충액에서 24시간 동안 희석한 후 상등액에서 유리 폴리펩티드를 정량화했다. 이온 교환 정제된 mIL12-ABP20-G4-8x-GE는 mIL12-ABP10의 경우 86%, 비-이온 교환된 물질의 경우 78%에 비해 24시간에 명반에 결합된 89%로 가장 높은 보유를 가졌으며 이는 낮은 인산염 분획이 명반을 더 빨리 용리시킨다는 것을 입증한다. 제2 명반 보유 검정에서, 샘플을 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄에 결합시킨 다음 최대 48시간 동안 5mM 인산염 및 20% 마우스 혈청으로 용리시켰다(도 11b). 이온 교환 정제된 mIL12-ABP20-G4-8x-GE는 다시 mIL12-ABP10의 경우 78%, 비변형된 mIL12의 경우 17%에 비해 48시간에 명반에 결합된 82%로 가장 높은 보유를 가졌다.
실시예 2: 예시적인 융합-폴리펩티드-금속 수산화물 복합체의 세포 활성
방법
HEK-Blue-IL12 효력 검정 - 시험관내 IL12 시그널링 활성은 제조업체의 지침에 따라 HEK-Blue-IL12 리포터 검정(Invivogen hkb-il12)을 사용하여 평가하였다. 이 세포주는 STAT4 유도성 프로모터의 제어 하에 인간 IL12Rβ1과 hIL12Rβ2 및 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포로부터 유래된다. 마우스 IL12는 인간 IL12 수용체와 교차-반응하기 때문에, 이 세포주는 인간 및 마우스 IL12 유래된 작제물 둘 모두의 효력을 평가하는데 사용될 수 있다. HEK-Blue-IL12 세포를 DMEM + 4.5g/l 글루코스, 2mM L-글루타민, 10% 열 불활성화된 FBS, Pen-Strep(100U/mL) 및 100ug/mL Normocin에서 배양하고 70-80% 컨플루언시에서 계대배양했다. 효력 시험을 위해 Normocin 없는 동일한 배지를 사용했다.
시험 작용제 또는 IL12 대조군을 검정 배지에 희석하여 최고 농도 10μg/mL 및 3x 희석으로 적정 시리즈를 생성했다. 명반과 혼합된 샘플의 경우, 최종 농도 50μg/mL에서의 융합 폴리펩티드를 TBS에서 금속 질량으로 정의된 10x 질량 과잉의 수산화알루미늄과 혼합하고 실온에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션한 후 상기와 같이 검정 배지에서 희석했다. 적정 시리즈에서의 각 샘플 20μL를 96웰 플레이트로 옮기고 최종 최고 융합 폴리펩티드 농도 1μg/mL 및 50,000개 세포/웰을 위해 180μL의 HEK-Blue-IL12 세포 현탁액(280,000개 세포/mL)과 혼합했다. 그런 다음 플레이트를 5% CO2에서 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날, 각 웰로부터 상등액 20μL를 새로운 플레이트로 옮기고 분비된 알칼리성 포스파타제의 존재에서 그 다음 파란색으로 변하는 비색 시약인 QUANTI-Blue 용액(Invivogen rep-qbs) 180μL와 혼합했다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음 620-655nm에서 흡광도를 측정했다.
일부 실험에서, TBS에서의 시험 작용제를 금속 질량으로 정의된 최종 농도 200μg/mL 융합 폴리펩티드 및 2mg/mL 수산화알루미늄이 되도록 수산화알루미늄과 혼합한 다음, 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그 다음 혼합물을 1mM 인산염 및 20% 마우스 혈청과 함께 최종 농도 40μg/mL 융합 폴리펩티드가 되도록 용리 완충액에서 5x 희석하고 24시간 동안 회전시키면서 37℃에서 인큐베이션했다. 샘플을 18,000xg에서 4℃에서 10분간 원심분리하여 명반을 펠렛화하고 상등액을 조심스럽게 제거하여 보관했다. 펠렛을 동일한 부피의 용리 완충액에 재현탁했다. 그런 다음 상등액과 재현탁된 명반 펠렛을 검정 배지에 희석하고 상기에 기술된 바와 같이 HEK-Blue-IL12 검정에서 활성을 테스트했다.
결과
mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE는 IL12 유도된 시그널링에 반응하여 SEAP를 발현하는 HEK-Blue-IL12 리포터 검정에서 테스트했다. IL12-ABP 융합 폴리펩티드는 단독으로 또는 TBS에서 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 혼합하고 30분 동안 인큐베이션한 후에 적정하였다. 두 융합 폴리펩티드 모두는 비변형된 mIL12의 경우 3.5-5.4ng/mL인 것과 비교하여 각각 mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 경우 3.6 및 5.4ng/mL의 EC50 값으로 검정에서 활성이었다(도 12a-12b). 명반에 결합되면 EC50 값은 mIL12-ABP10의 경우 8ng/mL, mIL12-ABP20-G4-8x의 경우 22ng/mL의 EC50 값으로 ~2-4 배수 이동했다. 효력 이동은 IL12가 수산화알루미늄과 착화되는 동안 제시되는 방식에서의 입체 장애의 산물일 가능성이 높다.
명반 결합 및 용리된 분획의 활성을 평가하기 위해, mIL12-ABP20-G4-8x-GE를 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화한 다음 1mM 인산염 및 20% 마우스 혈청을 함유하는 용리 완충액에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 명반을 그 다음 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상등액을 제거하고, 펠렛을 동일한 부피의 용리 완충액에 재현탁시켰다. 명반이 없는 용리 완충액에서 밤새 인큐베이션된 상등액 분획, 재현탁된 명반 펠렛 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE의 대조군 샘플을 HEK-Blue-IL12 검정에서 테스트했다. 명반이 없는 대조군 샘플은 7ng/mL에서의 이전 측정과 유사한 EC50을 가졌지만, 상등액 분획은 >1000ng/mL의 EC50을 가졌으며 이는 연장된 인큐베이션 동안 최소의 IL12가 명반에서 용리되었음을 입증한다. 대조적으로, 명반 펠렛은 ~5x의 효력 이동으로 검정'에서 활성이었으며 이는 IL12가 연장된 시간 동안 명반에 유지되는 동안 활성으로 유지함을 입증한다(도 13).
실시예 3: 융합-폴리펩티드-금속 수산화물 복합체의 단독 요법으로 및 조합 요법에서의 사용
방법
동계 종양 모델 - CT26 세포를 RPMI1640 + 10% FBS에서 배양했다. 7-9주령 BALB/c 마우스를 오른쪽 옆구리 영역에서 0.1mL PBS 내 5x105 CT26 세포로 피하로 접종했다. 종양이 ~75㎣에 도달했을 때, 마우스를 무작위화하고 20μL 비히클 또는 실온에서 30분 동안 금속 질량으로 정의된 50μg 수산화알루미늄과 혼합되고 사전-인큐베이션된 5μg mIL12-ABP로 종양내로 주사했다. 연구 기간 동안 종양 부피와 체중을 매주 3회 측정하고, 그 종양 부피가 2000㎣에 도달하면 마우스를 안락사시켰다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 측정하고 다음 공식을 사용하여 부피를 계산했다: V = (L x W x W)/2, 여기서 V는 종양 부피이고, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수)이고 W는 종양 폭(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다.
B16F10 세포는 37℃, 5% CO2에서 DMEM + 10% FBS에서 성장했다. 7-9주령의 C57BL/6 마우스를 오른쪽 옆구리 영역에서 0.1mL의 PBS 용액 내 1x106 B16F10 세포로 접종했다. 종양이 ~75㎣에 도달하면 마우스를 무작위화하고 20μL 비히클 또는 실온에서 30분 동안 금속 질량으로 정의된 50μg 수산화알루미늄과 혼합되고 사전-인큐베이션된 7.7μg mIL12-ABP로 종양내로 주사했다. 일부 그룹에서는 50μL 부피에서 200μg 항-PD1(Bioxcell BP0273)을 0, 3, 6 및 9일차에 복강내로 주사했다. 연구 기간 동안 종양 부피와 체중을 매주 3회 측정했고 그 종양 부피가 2000㎣에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
4T1 세포는 37℃, 5% CO2에서 RPMI1640 + 10% FBS에서 성장했다. 7-9주령의 BALB/c 마우스에 0.1mL PBS 내 3x105 4T1 세포로 오른쪽 유방 지방 패드에 접종했다. 종양이 ~75㎣에 도달했을 때, 마우스를 무작위화하고 20μL 비히클 또는 실온에서 30분 동안 금속 질량으로 정의된 50μg 수산화알루미늄과 혼합되고 사전-인큐베이션된 5μg mIL12-ABP로 종양내로 주사했다. 종양 부피 및 체중을 매주 3회 측정했다. 종양 접종 후 28일차에, 마우스를 안락사시키고 폐에서의 전이를 계수하였다.
결과
mIL12-ABP10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE를 다중 동계 종양 모델에서 비교했다. 융합 폴리펩티드를 TBS에서 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 혼합하고 동물에 주입하기 이전에 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 융합 폴리펩티드-수산화알루미늄 복합체를 형성했다. CT26 결장직장암 모델에서, 종양 접종 후 6일차에 금속 질량으로 정의된 50μg 명반과 착화된 5μg의 mIL12-ABP 또는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE 융합 폴리펩티드의 단일 종양내 주사는 비히클 치료된 마우스와 비교하여 유의한 종양 지연 및 퇴행을 유도했다. mIL12-ABP10 + 명반으로 치료된 마우스 4/10 및 mIL12-ABP20-G4-8x-GE + 명반으로 치료된 마우스 5/10에서 측정가능한 종양이 없는 완전한 반응이 관찰되었다(도 14a-14c).
불응성 B16F10 종양 모델에서의 제2 연구에서, 금속 질량으로 정의된 50μg 명반과 착화된 7.7μg의 mIL12-ABP10 또는 mIL12-ABP20-G4-8x-GE를 종양 접종에 이어 6 및 13일차에 종양내로 주사했다. 일부 동물에서는 항-PD1 항체를 0, 3, 6 & 9일차에 복강내로 투여하기도 했다. 명반과 착화된 두 mIL12-ABP 작용제 모두는 비히클에 비해 종양 성장을 유의하게 지연시켰다. 종양 지연은 전신 PD-1 차단과의 조합 치료를 받은 그룹에서 더욱 연장되었다. 단일요법 및 PD-1 조합 그룹 둘 모두에서, mIL12-ABP10에 비해 mIL12-ABP20-G4-8x-GE로 치료된 마우스에서 중앙 생존이 더 길었다(도 15a-15e).
mIL12-ABP20-G4-8x-GE는 또한 자발적 폐 전이를 형성하는 동소 4T1 모델에서 테스트되었다(도 16a-16b). 종양-담지 마우스를 종양 접종 후 7일차에 금속 질량으로 정의된 50μg 명반과 착화된 5μg의 mIL12-ABP 융합 폴리펩티드의 단일 종양내 주사로 치료하였다. mIL12-ABP20-G4-8x-GE /명반 치료는 비히클의 IT 주사와 비교하여 원발성 종양의 성장 지연을 야기했다(도 16a). 28일차에, 동물을 희생시키고 폐에서의 전이를 계수하였다. 비히클 치료된 마우스 10/10이 적어도 하나의 폐 전이를 가지고 있는 반면, mIL12-ABP20-G4-8x-GE /명반 치료된 마우스에서의 마우스 6/10은 전이가 없었으며 이는 mIL12-ABP/명반 복합체의 국소 주사는 또한 원위 비-주사된 병변에 대해 항-종양 효과를 유도했다는 것을 입증한다(도 16b).
실시예 4: mIL12-ABP에 대한 최적의 인산화 수준의 식별
mIL12-ABP20-G4-8x-GE는 상기에서 기술한 바와 같이 HEK에서 Fam20C-KDEL과 일시적으로 공동-발현되었다. 융합 폴리펩티드를 Ni-NTA 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제한 다음 선형 염 용리 구배를 갖는 HiTrap Q 세파로스 음이온 교환 컬럼에서 실행했다. 개별 용리 분획을 수집하고 말라카이트 그린 검정에 의해 인산염 수준을 측정했다. 분획당 평균 인산염 수준은 2 내지 7의 범위였으며 더 낮은 인산화된 융합 폴리펩티드는 더 일찍 용리되었고 고도로 인산화된 분획은 컬럼 상에 더 오래 유지되었다(도 17a-17b). 개별 분획을 그 다음 명반 보유 검정에서 평가했다. 융합 폴리펩티드를 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄에 결합시킨 다음, 1mM 인산염과 50% 마우스 혈청을 함유한 용액에서 용리시켰다. 음이온 교환 수지에서 더 일찍 용리되고 더 낮은 인산화 수준을 함유하는 분획이 더 높은 인산화 수준을 갖는 나중에 용리되는 분획에 비해 명반에 더 낮은 보유을 갖는 분명한 경향이 있었다. 융합 폴리펩티드당 2.4개의 인산염을 갖는 분획 110은 24시간에 명반에 <50% 융합 폴리펩티드가 유지되었고, 융합 폴리펩티드당 3.7개의 인산염을 갖는 분획 111은 명반에 ~80% 융합 폴리펩티드가 유지되었다. 융합 폴리펩티드당 각각 4.6 및 5.8개의 인산염을 갖는 분획 112 및 113은 24시간에 명반에 결합된 >95%로 고도로 유지되었다. 융합 폴리펩티드당 >6개의 인산염을 갖는 분획 114-117에는 검정에서 명반에서 용리되는 측정가능한 유리 융합 폴리펩티드가 없었다(도 18a-18b).
개별 분획을 또한 HEK-Blue-IL12 리포터 검정에서 단독으로 또는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화하여 테스트했다(도 19a-19d). 분획 110과 112는 명반을 가지거나 또는 없이 유사한 피크 활성 수준을 가졌으며 명반에 결합된 경우 EC50에서 2-3 배수 이동을 가졌다. 대조적으로, 분획 114 및 117은 명반과 착화될 때 감소된 피크 활성을 가졌다. 이는 특정 지점을 넘어서면 융합 폴리펩티드에 대한 과도한 인산화가 명반의 존재에서 기능적 활성을 감소시킬 수 있음을 시사한다.
함께, 도 20에 요약된 이들 데이터는 기능 검정에서 불충분한 명반 보유 및 >6 손실 활성을 갖는 것 미만으로 ~4-6에서 뮤어라인 융합 폴리펩티드당 인산화의 최적 수준이 있을 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5: 태그 없는 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE의 생산 및 특징화
C-말단에서 ABP20-G4-8x-GE 펩티드를 갖는 (G4S)3 링커를 통해 성숙한 인간 IL12A/p35(Uniprot P29459)에 융합된 성숙한 인간 IL12B/p40(Uniprot P29460)을 포함하는 단일-사슬 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE를 인코딩하는 유전자를 합성했다. 마우스 작제물과 달리, 융합 폴리펩티드는 단일 세린 잔기에서 종결하는 대신에 c-말단 His 태그 없이 클로닝되었다. 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE 작제물 및 Fam20C-KDEL 유전자는 Fam20C-KDEL보다 8-배수 더 높은 수준에서 hIL12-ABP20-G4-8x-GE 융합 폴리펩티드를 발현하도록 선택된 상이한 프로모터를 갖는 2개의 발현 카세트를 갖는 단일 벡터 안으로 클로닝되었다. 융합 폴리펩티드는 ATUM Leap-In-Transposase 시스템 및 선택된 안정한 풀을 사용하여 CHO 세포에 안정적으로 형질감염시켰다. 유가식 배양에서 14일 발현 후, 상등액을 수집하고 음이온 교환 크로마토그래피 포획 및 크기 배제 크로마토그래피 연마를 포함한 다중 크로마토그래피 단계에 의해 정제했다. 정제 후, 태깅되지 않은 hIL12-ABP20-G4-8x-GE는 SDS-PAGE 및 SEC로 측정했을 때 >97% 순수했다.
인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE는 HEK-Blue-IL12 검정에서 단독으로 3.6ng/mL 또는 수산화알루미늄과 착화되었을 때 8.2ng/mL의 EC50으로 활성이다(도 21a). 1mM 인산염과 20% 마우스 혈청을 함유한 용리 완충액에서 융합 폴리펩티드/명반 복합체를 인큐베이션 후, 상등액 EC50은 >300-배수 이동하여 24시간 후 최소의 융합 폴리펩티드 용리를 암시하는 반면, 펠렛은 5x EC50 이동으로 활성을 유지했다(도 21b). 별도의 명반 보유 검정에서, hIL12 또는 hIL12-ABP는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄에 결합된 다음 ELISA에 의해 검출된 유리 융합 폴리펩티드를 갖는 1mM 인산염 및 20% 마우스 혈청을 함유하는 용리 완충액에 희석되었다(도 21c). hIL12-ABP20-G4-8x-GE의 ~80%는 변형되지 않은 IL12의 경우 0%와 비교하여 24시간에서 명반에 유지된다.
인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE의 제2 로트를 상기에 기술된 바와 같이 제조하고 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제하고 선형 염 구배로 용리했다. 개별 용리 분획을 수집하고 인산염 수준을 말라카이트 그린 검정으로 측정했다. 더 낮은 인산화된 융합 폴리펩티드가 더 일찍 용리되고 고도로 인산화된 분획은 컬럼 상에 더 오래 유지되어 분획당 평균 인산염 수준은 5.8 내지 8.8의 범위였다(도 22).
융합 폴리펩티드가 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄에 결합된 다음 1mM 인산염 및 40% 혈청을 함유하는 용액에서 용리되는 명반 보유 검정에서 개별 분획을 평가했다(도 23). 뮤어라인 IL12-ABP20-G4-8x-GE 단백질과 유사하게, 음이온 교환 수지에서 더 일찍 용리되고 더 낮은 인산화 수준을 함유하는 인간 IL12-ABP20-G4-8x-GE의 분획은 더 높은 인산화 수준으로 나중에 용리하는 분획과 비교하여 명반에 더 낮은 보유를 가졌다.
개별 분획은 또한 HEK-Blue-IL12 리포터 검정에서 단독으로 또는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화되어 테스트되었다(도 24). 수산화알루미늄 착물화의 부재에서, 테스트된 모든 분획은 3.4 - 3.6ng/mL 사이의 EC50 값으로 검정에서 유사한 효력을 가졌다. 수산화알루미늄 착물화에 이어서 낮은 인산화를 갖는 초기에 용리하는 분획은 더 낮은 EC50 값을 가졌고(분획 645 및 650에 대해 각각 5 및 6.4ng/mL), 반면에 더 높은 인산화 수준을 갖는 나중에 용리하는 분획은 EC50에서 더 유의한 이동을 가졌다(분획 655 및 660에 대해 각각 8.6 및 14ng/mL). 테스트된 모든 분획은 수산화알루미늄 착화물이 있거나 없는 검정에서 유사한 최대 활성을 가졌다.
함께, 분획 650-660은 명반 보유 및 IL12 시그널링 활성의 특히 유리한 균형을 갖는 것으로 식별되었다. 따라서, 융합 폴리펩티드당 약 5.8개 인산염 또는 그 초과(예를 들어, 약 5.8 내지 약 8.4개 초과)를 특징으로 하는 제제는 특히 바람직한 특성을 보여주었다. 예를 들어 추가 시험관내 및/또는 생체내 평가를 포함하여 이러한 특성을 확인하기 위해 추가 평가가 수행될 수 있다. 그러한 일부 연구에서는 분획 650-660(또는 다른 합리적으로 비교가능한 제제 - 예를 들어, 다른 배치로부터의 것 또는 다른 공정을 통해 생산되었지만 비교가능한 인산화 특성 등을 달성하는 것)을 평가를 위해 모으거나 달리는 조합할 수 있으며; 대안적으로 또는 추가로, 이들 분획(또는 기타 합리적으로 상응하는 제제)은 별도로 평가될 수 있다.
실시예 6: 개과 IL12-ABP20-G4-8x-GE-His의 생산 및 특징화
본 실시예는 본 명세서에 기술된 IL-12 융합 폴리펩티드 및 이의 금속 수산화물 복합체의 유익하게 인산화된 제제의 생산 및 활성을 문헌화한다. 무엇보다도, 본 실시예는 융합 폴리펩티드당 약 5.5개 인산염 초과(예를 들어, 약 5.5 내지 약 8.3개 초과)를 특징으로 하는 이 융합 폴리펩티드의 제제가 명반-결합과 IL-12 시그널링 활성의 특히 바람직한 균형을 보여주었다는 것을 문헌화한다.
단일-사슬 개과-IL12-ABP20-G4-8x-GE를 인코딩하는 예시적인 유전자 카세트를 ATUM Bio에서 합성하고 pD2610-v5 발현 벡터 안으로 클로닝하였다. 예시적인 개과 IL12-ABP20-G4-8x-GE 서열은 C-말단에서 ABP20-G4-8x-GE 펩티드 및 His 태그와 (G4S)3 링커를 통해 성숙한 개과 IL12A/p35(Uniprot F1PPC0)에 융합된 성숙한 개과 IL12B/p40(Uniprot Q28268)을 포함한다. 예시적인 작제물은 현탁액 HEK-293 세포에서 인간 Fam20C-KDEL 플라스미드와 4:1 질량비로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 상등액을 수확하고 NiSepharose Excel 수지(Cytiva 17-3712-02)에서 친화도 크로마토그래피에 이어서 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 컬럼(Cytiva 28-9893-36) 상에서 FPLC-SEC에 의해 IL12 융합 폴리펩티드를 정제하여 응집체를 제거했다. 예시적인 개과 IL12-ABP20-G4-8x-GE 단백질을 HiTrap Q Sepaharose 컬럼 상에서 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 연마하여 차등적으로 인산화된 종을 농후화하고 선형 염 구배로 용리했다. 선택된 분획은 말라카이트 그린 검정을 사용하여 단백질당 인산염의 수, HEK-Blue-IL12 검정을 사용하여 IL12 시그널링 효력, 및 상기에 기술된 프로토콜로 명반 보유 검정을 사용하여 수산화알루미늄 결합에 대해 평가했다(도 25).
더 낮은 인산화된 단백질은 더 일찍 용리되고 고도로 인산화된 단백질은 컬럼 상에 더 오래 유지되어, 각 분획에서의 평균 인산염 수준은 0.4 내지 11.3 PO4/단백질의 범위였다. 그런 다음 개별 분획을 명반 보유 검정에서 평가했으며 여기서 폴리펩티드는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄에 결합된 다음 개과 IL12p40 ELISA 키트(R&D Systems)를 사용하여 시간 경과에 걸쳐 정량화된 유리 단백질을 갖는 1mM 인산염과 40% 혈청을 함유한 용액에서 용리되었다. 음이온 교환 수지에서 더 일찍 용리되고 더 낮은 인산화 수준을 함유하는 분획이 더 높은 인산화 수준을 갖는 나중에 용리되는 분획에 비해 명반에 더 낮은 보유를 갖는 경향이 관찰되었다(도 26). 각각 2.0 및 4.5 PO4/단백질을 갖는 분획 91 및 92는 24시간에 명반에 보유된 분획 91에서 IL12 폴리펩티드 28% 및 분획 92에서 65%로 가장 낮은 보유를 가졌다. 융합 폴리펩티드당 각각 5.5 및 6.5개 인산염을 갖는 분획 93 및 93.5는 24시간에 명반에 결합된 >95%로 고도로 유지되었다. 융합 폴리펩티드당 >6.5 포스페이트를 갖는 분획 94-98에는 검정에서 명반에서 용리되는 측정가능한 유리 융합 폴리펩티드가 없었다.
개별 분획을 또한 HEK-Blue-IL12 리포터 검정에서 단독으로 또는 금속 질량으로 정의된 10-배수 질량 과잉의 수산화알루미늄과 착화하여 테스트했다(도 27). 분획은 유리 단백질로 테스트했을 때 비슷한 EC50 값을 가졌지만, 명반 착물화 후 EC50에서 더 큰 증가를 갖는 높은 수준의 PO4를 함유한 분획과 명반에 대해 착화했을 때 상이한 효력을 가졌다. 분획 93-94.5는 명반 보유 및 IL12 시그널링 활성의 특히 유익한 균형을 갖는 것으로 식별되었다. 따라서, 융합 폴리펩티드당 약 5.5개 인산염 또는 그 초과(예를 들어, 약 5.5 내지 약 8.3개 초과)를 특징으로 하는 제제는 특히 바람직한 특성을 보여주었다. 이러한 특성을 확인하기 위해 추가의 시험관내 및/또는 생체내 평가(예를 들어, 적절한 동물계에서 - 예를 들어, 이 경우에 개에서)를 포함한 추가적인 평가가 수행될 수 있다. 그러한 일부 연구에서, 분획 93-94.5(또는 다른 합리적으로 비교가능한 제제 - 예를 들어, 다른 배치로부터의 것, 또는 다른 공정을 통해 생산되었지만 비교가능한 인산화 특성 등을 달성하는 것)를 평가를 위해 모으거나 달리는 조합할 수 있으며; 대안적으로 또는 추가적으로, 이들 분획(또는 기타 합리적으로 상응하는 제제)은 별도로 평가할 수 있다.
실시예 7: 예시적인 개과 연구
본 실시예는 본 개시내용의 기술(예를 들어, IL-12 융합 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 제제)의 추가 평가를 문헌화한다. 예를 들어, 본 실시예는 인산염 함량, 금속-수산화물 보유, 시그널링 활성, 효능 및/또는 효력 등의 추가 확인 및/또는 평가를 제공한다. 무엇보다도, 본 실시예는 예를 들어 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 말, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지를 포함하여 비-인간 대상체를 포함하는 대상체에서 본 개시내용의 IL-12 융합 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드 제제의 사용의 평가 및/또는 추가 확인을 문헌화한다. 본 개시내용의 기술(예를 들어, IL-12 융합 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 제제)은 당업계에 공지된 임의의 적합한 동물 모델을 사용하여 평가된다(예를 들어, Paoloni M 등 Defining the Pharmacodynamic Profile and Therapeutic Index of NHS-IL12 Immunocytokine in Dogs with Malignant Melanoma. PLoS One. 2015;10(6):e0129954; Cutrera J 등 Safe and effective treatment of spontaneous neoplasms with interleukin 12 electro-chemo-gene therapy. J Cell Mol Med. 2015;19(3):664-675; Cutrera J 등 Safety and efficacy of tumor-targeted interleukin 12 gene therapy in treated and non-treated, metastatic lesions. Curr Gene Ther. 2015;15(1):44-54; Von Rueden SK 등 Cancer-Immunity Cycle and Therapeutic Interventions- Opportunities for Including Pet Dogs With Cancer. Front Oncol. 2021;11:773420. Published 2021 Nov 19 참조).
등가물
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 설명으로 제한되는 것으로 의도되기 보다는 다음의 청구범위에 제시된 바와 같다:
SEQUENCE LISTING <110> ANKYRA THERAPEUTICS, INC. <120> FUSION POLYPEPTIDES <130> 2013762-0012 <140> 17/736,431 <141> 2022-05-04 <150> 63/184,620 <151> 2021-05-05 <160> 144 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 313 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys 85 90 95 Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser 100 105 110 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys 115 120 125 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr 130 135 140 Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro 165 170 175 Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln 180 185 190 Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile 195 200 205 Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn 210 215 220 Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro 225 230 235 240 His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys 245 250 255 Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe 260 265 270 Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val 275 280 285 Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp 290 295 300 Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 305 310 <210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg 1 5 10 15 Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys 20 25 30 Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile 35 40 45 Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu 50 55 60 His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr 65 70 75 80 Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu 85 90 95 Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe 100 105 110 Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile 115 120 125 Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu 130 135 140 Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala 145 150 155 160 Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe 165 170 175 Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser 180 185 190 Ala <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 521 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys 85 90 95 Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser 100 105 110 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys 115 120 125 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr 130 135 140 Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro 165 170 175 Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln 180 185 190 Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile 195 200 205 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gagactgaag aggggtgcaa ccagaagggc gctttcctgg tggaaaagac ctcgaccgaa 840 gtgcagtgca aagggggcaa cgtctgcgtg caagcccaag accgctacta caactcctcc 900 tgctccaaat gggcatgcgt gccgtgtaga gtgcggtccg gtggtggagg atccggaggg 960 ggtggatcag ggggaggcgg atctagggtc attccggtgt ccggtcctgc tcgctgcctg 1020 agtcagtccc ggaatctgct taagactact gacgatatgg tcaagactgc ccgcgagaag 1080 ctgaagcact actcctgcac cgccgaggac attgaccacg aagatatcac ccgggaccaa 1140 accagcaccc tcaagacttg cctgccactt gaactgcaca agaacgagag ctgcctggca 1200 accagagaaa ccagctcaac cacacgcgga tcatgtctgc ccccgcaaaa gacctccctg 1260 atgatgactc tctgtctggg aagcatctac gaagatctga agatgtatca gaccgaattc 1320 caggccatca acgcggcgct gcagaaccac aatcatcagc agattatcct ggataagggc 1380 atgctggtcg ccatcgacga gctgatgcag tccttgaatc acaacggcga aacgctccgc 1440 caaaagccgc cagtgggcga agcggaccct tatcgcgtga agatgaagct ctgcatcctg 1500 ctgcatgcct tttcgacccg ggtggtcacc atcaacagag tgatgggata cctgagctca 1560 gctggaggcg gaggctcagg aggtggcggc agcgaggaga gcgaagaatc cgaggagtcc 1620 gaggaaggcg gtggtggatc tcaccaccat caccatcat 1659 <210> 54 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 atgtgggaac tcgaaaagga tgtgtacgtg gtggaagtcg actggactcc tgatgccccg 60 ggagagacag tgaacctgac ctgtgacact cccgaagagg acgacattac ttggaccagc 120 gatcagcggc acggcgtgat cggatccggc aaaaccctga ccatcaccgt gaaagaattc 180 cttgacgcgg gacagtacac ttgccacaag ggcggcgaaa ccctcagcca ttcccacctt 240 ttgctccaca agaaggaaaa cggaatctgg tccaccgaaa ttctgaagaa cttcaagaac 300 aagaccttcc tgaagtgcga ggcgcccaac tactcgggaa ggttcacatg ctcctggctg 360 gtgcagagga acatggatct gaagttcaac atcaagagct cctcctcctc cccggattca 420 agagccgtga cttgcgggat ggcatccctg agcgccgaga aagtcactct ggaccagaga 480 gactacgaga agtactccgt gtcgtgccag gaggacgtga cctgtcctac cgccgaagag 540 actctgccca ttgagctggc tctggaagcc cgccagcaga acaaatacga aaactactcc 600 acgtcattct ttatccggga catcatcaag cccgaccctc ctaagaacct ccagatgaag 660 cccctcaaga acagccaggt cgaggtgtcc tgggaatacc 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cctgagctca 1560 gctggcggag ggggctcagg aggaggcgga agcgaagagg ggggtggtgg atccgaggag 1620 ggaggaggag gctcggaaga gggaggcgga ggatcggagg agggcggtgg tggatctcac 1680 caccatcacc atcat 1695 <210> 55 <211> 1725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 55 atgtgggagc tggagaagga tgtgtacgtg gtggaggtgg actggacccc tgacgctcct 60 ggagaaaccg tgaacttgac gtgcgacacc cctgaggaag atgacatcac ctggacctcc 120 gaccaaagac acggcgtgat cggctccgga aagaccctga ccatcaccgt gaaggagttc 180 ctggatgccg ggcagtacac ttgccacaag gggggcgaaa cgctgtccca ctcccatctg 240 ctgctgcaca agaaagaaaa cgggatctgg tccaccgaga ttctcaagaa cttcaagaac 300 aagaccttcc ttaagtgcga ggcccccaac tactccggcc gcttcacttg ctcctggctg 360 gtgcagcgca acatggacct gaagttcaat atcaagtcat cctcctcgtc gcctgattcg 420 agagcagtca cttgcgggat ggcgtccctg agcgctgaaa aggtcaccct ggatcagcgg 480 gactacgaga agtactccgt gtcctgccaa gaggacgtga cctgtccgac cgccgaagaa 540 actttgccca tcgaattggc cctcgaagcc aggcagcaga 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 atgtgggaac tcgaaaagga tgtgtacgtg gtggaagtcg actggactcc tgatgccccg 60 ggagagacag tgaacctgac ctgtgacact cccgaagagg acgacattac ttggaccagc 120 gatcagcggc acggcgtgat cggatccggc aaaaccctga ccatcaccgt gaaagaattc 180 cttgacgcgg gacagtacac ttgccacaag ggcggcgaaa ccctcagcca ttcccacctt 240 ttgctccaca agaaggaaaa cggaatctgg tccaccgaaa ttctgaagaa cttcaagaac 300 aagaccttcc tgaagtgcga ggcgcccaac tactcgggaa ggttcacatg ctcctggctg 360 gtgcagagga acatggatct gaagttcaac atcaagagct cctcctcctc cccggattca 420 agagccgtga cttgcgggat ggcatccctg agcgccgaga aagtcactct ggaccagaga 480 gactacgaga agtactccgt gtcgtgccag gaggacgtga cctgtcctac cgccgaagag 540 actctgccca ttgagctggc tctggaagcc cgccagcaga acaaatacga aaactactcc 600 acgtcattct ttatccggga catcatcaag cccgaccctc ctaagaacct ccagatgaag 660 cccctcaaga acagccaggt cgaggtgtcc tgggaatacc cggactcctg gagcacccca 720 cactcctact tctcgctgaa gtttttcgtg cggatccagc ggaagaaaga gaagatgaaa 780 gagactgaag aggggtgcaa ccagaagggc gctttcctgg tggaaaagac ctcgaccgaa 840 gtgcagtgca aagggggcaa cgtctgcgtg caagcccaag accgctacta caactcctcc 900 tgctccaaat gggcatgcgt gccgtgtaga gtgcggtccg gtggtggagg atccggaggg 960 ggtggatcag ggggaggcgg atctagggtc attccggtgt ccggtcctgc tcgctgcctg 1020 agtcagtccc ggaatctgct taagactact gacgatatgg tcaagactgc ccgcgagaag 1080 ctgaagcact actcctgcac cgccgaggac attgaccacg aagatatcac ccgggaccaa 1140 accagcaccc tcaagacttg cctgccactt gaactgcaca agaacgagag ctgcctggca 1200 accagagaaa ccagctcaac cacacgcgga tcatgtctgc ccccgcaaaa gacctccctg 1260 atgatgactc tctgtctggg aagcatctac gaagatctga agatgtatca gaccgaattc 1320 caggccatca acgcggcgct gcagaaccac aatcatcagc agattatcct ggataagggc 1380 atgctggtcg ccatcgacga gctgatgcag tccttgaatc acaacggcga aacgctccgc 1440 caaaagccgc cagtgggcga agcggaccct tatcgcgtga agatgaagct ctgcatcctg 1500 ctgcatgcct tttcgacccg ggtggtcacc atcaacagag tgatgggata cctgagctca 1560 gctgggggtg gaggttcggg tggcggagga tccgaggaat cggaagagtc cgaagagtcg 1620 gaagaatccg aggaaagcga agagtcagag gaatctgagg agggtggtgg cggaagccat 1680 catcaccacc accac 1695 <210> 60 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 atgtgggaac tcgaaaagga tgtgtacgtg gtggaagtcg actggactcc tgatgccccg 60 ggagagacag tgaacctgac ctgtgacact cccgaagagg acgacattac ttggaccagc 120 gatcagcggc acggcgtgat cggatccggc aaaaccctga ccatcaccgt gaaagaattc 180 cttgacgcgg gacagtacac ttgccacaag ggcggcgaaa ccctcagcca ttcccacctt 240 ttgctccaca agaaggaaaa cggaatctgg tccaccgaaa ttctgaagaa cttcaagaac 300 aagaccttcc tgaagtgcga ggcgcccaac tactcgggaa ggttcacatg ctcctggctg 360 gtgcagagga acatggatct gaagttcaac atcaagagct cctcctcctc cccggattca 420 agagccgtga cttgcgggat ggcatccctg agcgccgaga aagtcactct ggaccagaga 480 gactacgaga agtactccgt gtcgtgccag gaggacgtga cctgtcctac cgccgaagag 540 actctgccca ttgagctggc tctggaagcc cgccagcaga acaaatacga aaactactcc 600 acgtcattct ttatccggga catcatcaag cccgaccctc ctaagaacct ccagatgaag 660 cccctcaaga acagccaggt cgaggtgtcc 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 73 atctgggagc tgaagaagga cgtctatgtg gtggaacttg actggtaccc ggatgcccct 60 ggagaaatgg tcgtgctgac gtgcgacacc cccgaagagg acggcattac ttggaccctg 120 gaccagtcct ccgaagtgct cgggagcgga aagaccctga ccatccaagt caaggaattc 180 ggcgatgccg gacagtacac ctgtcacaag ggcggagaag tgctgagcca ctccctgctg 240 ctgctgcaca agaaggaaga tggcatctgg tccaccgaca tcctgaaaga ccagaaggag 300 ccgaagaaca agactttcct ccgctgcgaa gccaagaact actccggccg gtttacttgt 360 tggtggctga ccaccatatc aacggatctc accttctccg tgaaatcgtc ccggggaagc 420 tcggaccccc aaggagtgac ttgcggggca gcgaccttgt ccgccgaacg cgtcagaggg 480 gacaacaagg aatacgagta ctccgtggag tgccaagagg actccgcatg tccggctgct 540 gaagagtcgc tgccgattga ggtcatggtg gacgccgtgc acaagctgaa atacgagaat 600 tacacctcct ccttcttcat ccgggacatc attaagcccg accctcctaa gaacctccag 660 ctgaagcctc tgaagaactc ccgccaagtg gaagtgtcct gggagtaccc cgacacttgg 720 tccacccccc attcgtattt ctcactgact ttctgcgtcc aagtgcaggg gaaatccaag 780 agagagaaga 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Synthetic polynucleotide <400> 78 atgtatagaa tgcagcttct gtcctgtatc gccctctccc tcgcccttgt gaccaactcc 60 atctgggaac tgaagaagga cgtctacgtg gtggaactgg attggtaccc agacgcccct 120 ggagaaatgg tggtgctcac ctgtgatacc cccgaagagg acgggattac ttggaccctg 180 gatcagtcat ccgaagtgct gggatccgga aagaccctga cgatccaggt caaggaattc 240 ggggacgcgg gacagtacac ttgccataag ggcggcgaag tgctgtccca ctccttgctc 300 ctgctccaca agaaagaaga tggaatttgg agcaccgaca tcctgaagga ccagaaagag 360 ccgaagaaca agaccttcct gcgctgcgag gccaagaact acagcggacg ctttacctgt 420 tggtggctga ccactatctc caccgacctg accttctcgg tcaagtcctc gcgcgggagc 480 agcgatcctc agggagtgac ttgcggtgcc gcgactctgt cggccgaaag ggtccggggc 540 gacaacaagg agtacgagta ctcagtcgag tgccaggagg acagcgcatg tccggccgct 600 gaggaatccc tgcctattga agtcatggtg gacgccgtcc acaagctgaa atacgagaac 660 tacacctcct ctttctttat ccgggatatc atcaagcccg acccgcctaa gaaccttcaa 720 ctgaagccac tgaagaacag cagacaagtg gaggtgtcct gggagtaccc ggatacttgg 780 tccactccgc actcctattt ctcgctcacc ttctgcgtcc aagtgcaggg 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Synthetic polypeptide <400> 104 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu 20 25 30 Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys 35 40 45 His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln Ser Ser 50 55 60 Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe 65 70 75 80 Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser 85 90 95 Arg Ser Leu Leu Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr 100 105 110 Asp Ile Leu Lys Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys 115 120 125 Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr 130 135 140 Ala Ile Ser Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe 145 150 155 160 Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu 165 170 175 Arg Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys 180 185 190 Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 105 Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp Pro Gln 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Val 145 150 155 160 Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser 165 170 175 Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp 180 185 190 Ala Ile His Lys 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 113 Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asn Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asn Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asn Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Thr Gly Lys Thr Leu Thr Ile His Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys Arg Lys Gly Gly Ala Val Leu Ser Gln Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Ser Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Thr Asp Pro Arg 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Thr Ala Thr Leu Ser Glu Asp Leu Gly Glu Tyr 145 150 155 160 Lys Lys Tyr Arg Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ala Ala 165 170 175 Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Leu Glu Ala Val His Lys Leu 180 185 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Leu Ile Asp Pro Gln 115 120 125 Arg Gln Ile Phe Leu Asp Glu Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp Lys Leu 130 135 140 Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Pro Ser 145 150 155 160 Leu Glu Gly Leu Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Val Lys Leu Cys Ile Leu 165 170 175 Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asn Arg Met Met Gly 180 185 190 Tyr Leu Asn Ala Ser 195 <210> 116 <211> 519 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 116 Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asn Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Glu Gly Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln Ser Asn Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Trp Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Arg 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Ser Val 145 150 155 160 Asp Asp Arg Glu Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser 165 170 175 Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Ile Val Val Asp 180 185 190 Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Gly Phe Phe Ile 195 200 205 Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro 210 215 220 Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Glu Thr 225 230 235 240 Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Ser Ile Gln Val 245 250 255 Gln Gly Lys Asn Lys Lys Glu Arg Lys Asp Arg Leu Phe Met Asp Glu 260 265 270 Thr Ser Ala Thr Val Thr Cys His Lys Asp Gly Gln Ile Arg Val Gln 275 280 285 Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val 290 295 300 Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Arg Asn Leu Pro Thr Ala Thr Pro Gly Pro Gly Met Phe Gln 325 330 335 Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Thr Val Ser Asn Thr Leu 340 345 350 Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu 355 360 365 Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Ser Ser Thr Val Ala Ala 370 375 380 Cys Leu Pro Leu Glu Leu Ala Pro Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg 385 390 395 400 Glu Ile Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Thr Pro Gly Lys Ala 405 410 415 Ser Ser Met Met Thr Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys 420 425 430 Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Ile Asp 435 440 445 Pro Gln Arg Gln Ile Phe Leu Asp Glu Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp 450 455 460 Lys Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys 465 470 475 480 Pro Ser Leu Glu Gly Leu Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Val Lys Leu Cys 485 490 495 Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asn Arg Met 500 505 510 Met Gly Tyr Leu Asn Ala Ser 515 <210> 117 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 117 Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asn Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Glu Gly Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln Ser Asn Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Trp Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Arg 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Ser Val 145 150 155 160 Asp Asp Arg Glu Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser 165 170 175 Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Ile Val Val Asp 180 185 190 Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Gly Phe Phe Ile 195 200 205 Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro 210 215 220 Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Glu Thr 225 230 235 240 Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Ser Ile Gln Val 245 250 255 Gln Gly Lys Asn Lys Lys Glu Arg Lys Asp Arg Leu Phe Met Asp Glu 260 265 270 Thr Ser Ala Thr Val Thr Cys His Lys Asp Gly Gln Ile Arg Val Gln 275 280 285 Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val 290 295 300 Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Arg Asn Leu Pro Thr Ala Thr Pro Gly Pro Gly Met Phe Gln 325 330 335 Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Thr Val Ser Asn Thr Leu 340 345 350 Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu 355 360 365 Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Ser Ser Thr Val Ala Ala 370 375 380 Cys Leu Pro Leu Glu Leu Ala Pro Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg 385 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 118 atctgggaac tggagaagga tgtgtacgtg gtcgagctcg attggcatcc tgatgcgcct 60 ggcgaaatgg tggtgctgac ttgccacact cccgaggagg acgacattac ctggacctcg 120 gcccagtcct ccgaagtcct gggaagcggg aaaactctga caattcaggt caaagagttc 180 ggcgacgcag gacagtacac ctgtcacaag ggtggaaagg tcctgagcag atcgctgttg 240 ctgatccaca agaaggaaga tggcatctgg tccacggaca tcctgaagga gcagaaggaa 300 tccaagaaca agatctttct taagtgcgaa gccaagaact actcgggccg gttcacctgt 360 tggtggctta ctgccatatc aaccgacctg aagttttccg tgaaatcgag ccgcggcttc 420 tcggaccctc aaggagtgac ttgcggagcc gtgaccctct ccgccgagag agtgcgggtc 480 gacaaccggg actacaagaa gtacaccgtg gagtgccagg aaggatccgc ctgtccaagc 540 gccgaggaaa gcctgccgat tgaggtggtc gtcgatgcca tccacaagct gaaatacgag 600 aattacactt cgtccttctt catccgggac atcatcaagc ccgatccgcc aaccaacttg 660 caactcaagc cgctgaagaa ttcgcgccac gtggaggtgt cctgggagta ccccgatacg 720 tggtccaccc cgcatagcta tttctccctc actttctgcg tgcaagccca gggaaagaac 780 aaccgcgaga agaaggaccg gctgtgcgtg gataagacca gcgcgaaagt ggtctgccac 840 aaggacgcga agatcagagt gcaggctcgg gacagatatt acagcagctc ctggtccgac 900 tgggcctccg tgtcctgttc cggcggagga ggatccggag gagggggttc cggtggaggc 960 ggttcgaggt ccctgcctac tgctagccct tcccccggga ttttccagtg cctgaaccac 1020 tcccagaact tgctgagggc cgtgtccaac acccttcaaa aggctcggca gaccctggaa 1080 ctgtactcct gcacttccga ggaaattgac cacgaagata tcaccaagga caagacttcc 1140 accgtggagg cctgtctgcc cctggaactt actatgaacg agtcatgcct cgcaagccgc 1200 gagattagcc tgattaccaa cggctcctgc ctggcttcgg ggaaggcgtc gttcatgacc 1260 gtgctctgcc tgtcaagcat ctacgaggac ctgaaaatgt accagatgga attcaaggcc 1320 atgaacgcca agctcctgat ggacccgaag aggcagatct tcctggacca aaacatgctg 1380 actgccattg acgaactgct tcaggcactc aacttcaact ctgtgaccgt gccgcagaag 1440 tcatcgttgg aggaaccaga tttctacaag accaagatta agctttgcat tctcctccat 1500 gcgtttcgca tccgcgccgt gaccatcgac aggatgatgt cctacctgaa ttcaagcgga 1560 ggaggcggag aaggaggcgg tggaagcgaa gagggcggtg gaggcagtga agaaggaggg 1620 ggcggatctg aagaaggggg cggtggatca gaagagggag ggggaggctc agaggaagga 1680 ggtggcggtt ccgaggaagg gggtggcgga tcagaggagg gaggcggagg atcggaggaa 1740 ggcggaggtg gacaccacca ccatcatcac 1770 <210> 119 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 119 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Ser Glu Glu Ser 1 5 10 15 Glu Glu Ser Glu Glu Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 120 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 120 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Glu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Glu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 121 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 121 Gly Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Glu Glu Gly Gly Met Glu Ser Glu Glu Ser Asn Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Ser Glu Glu Gly Gly Gly Gly Ser His His His His 35 40 45 His His 50 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 122 Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 123 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> Any amino acid <400> 124 Ser Xaa Gln Xaa Xaa Asp Glu Glu 1 5 <210> 125 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 125 Ser Glu Glu Glu 1 <210> 126 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Ser Glu Glu Ala 1 <210> 127 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 127 Ser Glu Glu Gln 1 <210> 128 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 129 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 130 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 132 Gly Gly Gly Gly His His His His His His 1 5 10 <210> 133 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 1 5 10 <210> 134 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> SITE <222> (1)..(50) <223> This sequence may encompass 1-10 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 134 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 135 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 135 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 136 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 136 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 137 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 137 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 138 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 138 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 139 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 139 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 140 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 141 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 141 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 142 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 142 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 143 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 143 Gly Gly Gly Ser Lys Asp Glu Leu 1 5 <210> 144 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: "KDEL" motif peptide sequence <400> 144 Lys Asp Glu Leu 1

Claims (120)

  1. (a) 면역 효능제 모이어티를 포함하는 면역조절 폴리펩티드; 및
    (b) 아미노산 서열이 복수의 인산화 부위를 포함하여 인산화된 형태와 비인산화된 형태를 채택할 수 있는 금속-수산화물 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 금속-수산화물에 노출될 때 그와 복합체를 형성하는, 융합 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 금속 수산화물은 수산화알루미늄인, 복합체.
  4. 제2항에 있어서, 복합체는 금속-수산화물-결합 폴리펩티드가 인산화되지 않은 형태에 있을 때보다 인산화된 형태에 있을 때 더 쉽게 형성되는, 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 인산화 부위는 Fam20C 키나제에 의해 표적화되는, 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 인산화 부위는 S-X-E 모티프이거나 이를 포함하는, 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 복수의 인산화 부위는 4개 초과의 S-X-E 모티프를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 복수의 인산화 부위는 8개의 S-X-E 모티프를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  9. 제7항에 있어서, 적어도 2개의 인접한 S-X-E 모티프는 스페이서에 의해 분리되는, 융합 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 스페이서는 적어도 하나의 글리신 잔기를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 스페이서는 복수의 글리신 잔기를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 스페이서는 적어도 4개의 글리신 잔기를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 스페이서는 4개의 글리신 잔기를 포함하는 서열을 갖는, 융합 폴리펩티드.
  14. 제7항에 있어서, 각각의 SXE 모티프는 스페이서에 의해 각각의 인접한 S-X-E 모티프로부터 분리되는, 융합 폴리펩티드.
  15. 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 다음을 포함하는 융합 폴리펩티드:
    (i) 면역 효능제 모이어티를 포함하는 면역조절 폴리펩티드; 및
    (ii) 금속-수산화물 결합 펩티드; 및,
    (b) 금속 수산화물
    을 포함하는 복합체로 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, (a)와 (b)는 함께 제형화되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, (a)와 (b)는 투여 이전에 혼합되는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 복합체는 종양내 주사에 의해 투여되는, 방법.
  19. 제15항에 있어서, 복합체는 종양주위 주사에 의해 투여되는, 방법.
  20. 제15항에 있어서, 복합체는 종양-배출 림프절 또는 림프절들에 투여되는, 방법.
  21. 제15항에 있어서, 복합체는 제2 치료제와 조합하여 투여되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제2 치료제는 방사선인, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제2 치료제는 외과적 종양 절제인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 외과적 종양 절제 이전에 투여되는, 방법.
  25. 제21항에 있어서, 제2 치료제는 화학요법 또는 표적화된 요법인, 방법.
  26. 제21항에 있어서, 제2 치료제는 항-종양 항체인, 방법.
  27. 제21항에 있어서, 제2 치료제는 면역 조절제인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 면역 조절제는 체크포인트 억제제인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 체크포인트 억제제는 항체 또는 이의 기능적 단편인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 항체는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, TIGIT 및 LAG3 중 하나 이상을 표적화하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항체는 PD-1을 표적화하는, 방법.
  32. 제26항에 있어서, 항체는 종양-표적화 CD3 이중특이적 항체인, 방법.
  33. 제27항에 있어서, 면역 조절제는 세포 요법인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 세포 요법은 CAR-T 세포, 생체-외 확장된 TIL 및 NK 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 면역 효능제 모이어티를 포함하는 면역조절 폴리펩티드; 및
    (b) 금속-수산화물 결합 펩티드
    를 포함하는 융합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하며,
    여기서 융합 폴리펩티드는 금속 수산화물과 제형화되고; 그리고
    여기서 대상체는 적어도 하나의 추가 치료제로의 요법을 받았거나 받고 있는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 융합 폴리펩티드와 금속-수산화물은 함께 제형화되어 복합체를 형성하는, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 융합 폴리펩티드와 금속-수산화물은 투여 이전에 혼합되는, 방법.
  38. 제35항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 종양내 주사에 의해 투여되는, 방법.
  39. 제35항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 종양주위 주사에 의해 투여되는, 방법.
  40. 제35항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 종양-배출 림프절 또는 림프절들에 투여되는, 방법.
  41. 제35항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 방사선인, 방법.
  42. 제35항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 외과적 종양 절제인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 외과적 종양 절제 이전에 투여되는, 방법.
  44. 제35항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 화학요법 또는 표적화된 요법인, 방법.
  45. 제35항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 항-종양 항체인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 제2 치료제는 면역 조절제인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 면역 조절제는 체크포인트 억제제인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 체크포인트 억제제는 항체 또는 이의 기능적 단편인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 항체는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, TIGIT 및 LAG3 중 하나 이상을 표적화하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 항체는 PD-1을 표적화하는, 방법.
  51. 제45항에 있어서, 항체는 종양-표적화 CD3 이중특이적 항체인, 방법.
  52. 제46항에 있어서, 면역 조절제는 세포 요법인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 세포 요법은 CAR-T 세포, 생체-외 확장된 TIL, NK 세포 및 대식세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제1항에 있어서, 면역 효능제 모이어티는 제1 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  55. 제54항에 있어서, 기능성 단편은 시그널링 능력을 갖는, 융합 폴리펩티드.
  56. 제54항에 있어서, 제1 모이어티는 IL12 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  57. 제56항에 있어서, IL12 모이어티는 IL12B 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  58. 제1항에 있어서, 면역 효능제 모이어티는 제1 및 제2 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  59. 제58항에 있어서, 제1 모이어티는 IL12 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  60. 제59항에 있어서, IL12 모이어티는 IL12B 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  61. 제58항에 있어서, 제2 모이어티는 IL12 모이어티 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  62. 제61항에 있어서, 제2 IL12 모이어티는 IL12A 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  63. 제58항에 있어서, 제1 및 제2 모이어티 또는 이의 기능적 단편은 제1 링커를 통해 연결되는, 융합 폴리펩티드.
  64. 제63항에 있어서, 제1 링커는 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  65. 제64항에 있어서, 폴리펩티드는 (G4S)3 링커를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  66. 제1항에 있어서, 면역조절 폴리펩티드와 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 제2 링커를 통해 연결되는, 융합 폴리펩티드.
  67. 제66항에 있어서, 제2 링커는 폴리펩티드를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  68. 제67항에 있어서, 폴리펩티드는 아미노산 서열 GGGGEGGGG를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  69. 제67항에 있어서, 폴리펩티드는 아미노산 서열 GGGGSGGGG를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  70. 제1항에 있어서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 면역조절 폴리펩티드의 c-말단에 직접적으로 연결되는, 융합 폴리펩티드.
  71. 제1항에 있어서, 금속-수산화물 결합 폴리펩티드는 제2 링커를 통해 면역조절 폴리펩티드의 c-말단에 연결되는, 융합 폴리펩티드.
  72. 융합 폴리펩티드를 키나제와 접촉시킴에 의해, 제1항의 융합 폴리펩티드의 인산화된 형태를 제조하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 접촉시키는 것은 융합 폴리펩티드와 키나제를 공동-발현시키는 것을 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 융합 폴리펩티드와 키나제는 2:1 내지 100:1의 비율로 공동-발현되는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 비율은 4:1인, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 4:1 비율은 융합 폴리펩티드 및 키나제를 발현하기 위해 2개의 별도 플라스미드를 사용하여 달성되는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 2개의 별도 플라스미드는 4:1의 비율을 생성하도록 강도가 다른 프로모터를 포함하는, 방법.
  78. 제74항에 있어서, 비율은 8:1인, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 8:1 비율은 융합 폴리펩티드 및 키나제를 발현하기 위해 2개의 프로모터를 갖는 단일 벡터를 사용하여 달성되는, 방법.
  80. 제72항에 있어서, 키나제는 Fam20C인, 방법.
  81. 제72항에 있어서, 방법은 인산화된 형태를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 정제하는 단계는 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
  83. 제73항에 있어서, 공동-발현시키는 단계는 비율에서의 발현을 지시하도록 확립된 프로모터로부터 발현시키는 것을 포함하는, 방법.
  84. 제73항에 있어서, 공동-발현시키는 단계는 바이-시스트론 작제물로부터 발현시키는 것을 포함하는, 방법.
  85. 제72항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 금속-수산화물에 노출되어 그와 복합체를 형성하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 복합체는 대상체에게 투여하기 이전에 제조되는, 방법.
  87. 제1항의 융합 폴리펩티드의 인산화된 형태를 금속 수산화물과 접촉시킴에 의해 복합체를 제조하는 방법.
  88. 제1항의 융합 폴리펩티드와 금속 수산화물을 포함하는 복합체.
  89. 제88항에 있어서, 복합체는 융합 폴리펩티드당 평균 2-8개의 인산염을 포함하는, 복합체.
  90. 제88항에 있어서, 복합체는 95% 초과의 금속 수산화물 보유를 갖는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  91. 제88항에 있어서, 복합체는 금속 질량으로 정의된 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물의 1:1 내지 1:20의 질량비를 포함하는, 복합체.
  92. 제91항에 있어서, 비율은 금속 질량으로 정의된 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물의 질량으로 1:5 내지 1:20인, 복합체.
  93. 제91항에 있어서, 비율은 금속 질량으로 정의된 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물의 질량으로 1:10인, 복합체.
  94. 제91항에 있어서, 비율은 금속 질량으로 정의된 융합 폴리펩티드 대 금속 수산화물의 질량으로 1:5인, 복합체.
  95. 제1항의 융합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 융합 폴리펩티드 금속-수산화물 복합체로서 제형화되는, 약학적 조성물.
  97. 인산화의 정도를 평가함에 의해 제1항의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 인산화의 정도는 단백질당 인산염의 수를 결정함에 의해 평가되는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 단백질당 인산염의 수는 비색 검정을 사용하여 결정되는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 비색 검정은 말라카이트 그린 검정인, 방법.
  101. 제제의 이질성을 평가함에 의해 제1항의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 제제의 이질성을 분석적 이온 교환을 사용하여 평가되는, 방법.
  103. 금속 수산화물 상의 융합 폴리펩티드의 보유를 평가함에 의해 제1항의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법.
  104. 제103항에 있어서, 보유는 시험관내 보유 검정을 사용하여 평가되는, 방법.
  105. 융합 폴리펩티드의 시그널링 활성을 평가함에 의해 제1항의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 시그널링 활성은 시험관내에서 평가되는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 시험관내 평가는 리포터 검정을 활용하는, 방법.
  108. 제제의 순도를 평가하는 것을 포함하는 제1항의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법.
  109. 인산염 함량을 평가하는 것을 포함하는 제1항의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법.
  110. 제109항에 있어서, 인산염 함량을 평가하는 것은 말라카이트 그린 검정의 사용을 포함하는, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 인산염 함량을 평가하는 것은 고성능 액체 크로마토그래피 검정의 사용을 포함하는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피 검정은 SAX-10 컬럼을 이용하는, 방법.
  113. 제제의 효력을 평가하는 것을 포함하는 제1항의 융합 폴리펩티드의 제제를 특징화하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 효력은 면역 모이어티 시그널링을 평가함에 의해 특징화되는, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 면역 모이어티 시그널링은 리포터 검정을 사용하여 결정되는, 방법.
  116. 제114항에 있어서, 효력은 IL12 시그널링을 평가함에 의해 특징화되는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, IL12 시그널링은 리포터 검정을 사용하여 결정되는, 방법.
  118. 금속 수산화물에 대한 융합 폴리펩티드의 보유를 평가하는 것을 포함하는 제88항의 복합체를 특징화하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 보유를 평가하는 것은 금속 수산화물 보유 검정의 사용을 포함하는, 방법.
  120. 다음 중 하나 이상을 평가하는 것을 포함하는 제95항의 약학적 조성물을 특징화하는 방법:
    (a) 제제의 순도;
    (b) 인산염 함량;
    (c) 약학적 조성물의 효력;
    (d) 금속 수산화물에 대한 융합 폴리펩티드의 보유;
    (e) 종양을 갖는 대상체를 치료하는 효능; 및
    (f) 제2 치료제와의 조합.
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