KR20240023030A - 게놈 세이프 하버 - Google Patents
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Abstract
게놈 세이프 하버(GSH) 유전자좌를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법이 개시된다. 신규한 GSH 유전자좌를 확인하는 방법이 추가로 개시된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 5월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 63/190,996에 대한 우선권의 이익을 주장하며; 이의 전체 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
배경
기능적 트랜스진 및 다른 유전 요소의 안정적인 삽입에 의한 인간 게놈의 변형은 생물의학 연구 및 의학(예를 들어, 유전자 요법용)에서 큰 가치가 있다. 유전자 변형된 인간 세포는 또한 유전자 기능의 연구, 및 리포터 시스템을 사용한 추적 및 계통 분석에 유용하다. 이러한 모든 적용은 새로운 환경에 도입된 유전자의 신뢰할 수 있는 기능에 의존한다. 그러나, 무작위로 삽입된 유전자는 위치 효과 및 침묵의 영향을 받아 이들의 발현을 신뢰할 수 없고 예측할 수 없게 만든다. 동원체 및 서브-텔로머 영역은 특히 트랜스진 침묵이 발생하기 쉽다.
상반되게, 새로 통합된 유전자는 주변의 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 미쳐 세포 거동을 잠재적으로 변경하거나 세포 형질전환을 지지할 수 있다. 따라서, 치료 유전자 전달의 성공에도 불구하고, 줄기 세포 유전자 요법 후 종양유전자의 삽입 활성화와 관련된 악성 형질전환의 사례가 있어, 새로 통합된 DNA가 어디에 위치하는지의 중요성이 강조된다. 또한, 전구 세포의 게놈으로의 외래 DNA의 삽입은 특정 세포 유형으로의 말단 분화에 악영향을 미칠 수 있다.
게놈 세이프 하버(GSH)는 체세포, 전구 세포, 또는 생식계열 세포의 생존력 및 개체발생에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 구성적 또는 조건부/유도성 발현 활성을 갖는 외인성 DNA의 삽입을 수용하는 유전자좌를 지칭한다. GSH 유전자좌의 이용 가능성은 리포터 유전자, 자살 유전자, 선택 가능한 유전자, 또는 치료 유전자를 발현시키는데 매우 유용하다.
3개의 유전자내 부위가 GSH로서 제안되었다(뮤린 세포에서 AAVS1, CCR5 및 ROSA26 및 알부민)(예를 들어, 미국 특허 번호 7,951,925; 8,771,985; 8,110,379; 7,951,925; 미국 공개 번호 20100218264; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983; 20130177960; 20150056705 및 20150159172 참조; 모두는 참조로 포함된다). 그러나, 이러한 제안된 GSH는 비교적 유전자-풍부한 영역에 있고 암과 관련된 유전자 근처에 있다. AAVS1에 인접한 유전자는 일부 프로모터에 의해 회피될 수 있지만, 아직 다수의 조직에서 안전성 검증이 수행되어야 한다. 또한, 종종 엔도뉴클레아제-매개 표적화의 경우에서와 같이, 특히 이중대립유전자 파괴 후, 파괴된 유전자의 분배성은 추가로 조사되어야 한다.
따라서, 추가적인 GSH 유전자좌의 확인 및 검증 뿐만 아니라 확인된 GSH 유전자좌에 대한 다양한 조성물 및 방법이 매우 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 부분적으로 본원에서 확인된 신규한 GSH 유전자좌가, 예를 들어, 환자를 치료하거나(예를 들어, 유전자 요법을 통해) 의약(예를 들어, 예를 들어, 생물학적 제제 또는 백신)을 제조하는데 필요한 다양한 트랜스진의 안정적인 삽입 및 예측 가능한 발현에 특히 유용하다는 발견에 기초한다.
특정 양태에서, 신규한 GSH 유전자좌를 확인하는 다양한 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 기능적 검정 뿐만 아니라 인실리코(in silico) 접근법을 포함한다. 확인된 GSH를 검증하기 위한 다양한 시험관내, 생체외, 및 생체내 방법이 본원에 추가로 제공되며, 이는 마커 유전자의 삽입 효율 및 발현 수준을 평가하기 위해 세포(예를 들어, 인간 세포)의 GSH 유전자좌로의 마커 유전자의 새로운 표적화된 삽입: 시험관내에서 전구 세포 또는 줄기 세포의 분화에 미치는 영향을 결정하기 위해 전구 세포 또는 줄기 세포의 GSH 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입; 생체내 모든 발달 계통에서 마커 유전자 발현을 결정하기 위해 전구 세포 또는 줄기 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 면역-고갈된 마우스로의 세포의 생착; 세포의 전체 전사 프로파일에 대한 GSH 유전자좌에서의 삽입의 영향을 결정하기 위해 세포의 GSH 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 전체 세포 전사 프로파일의 결정(예를 들어, RNAseq 또는 마이크로어레이 사용); 및/또는 마우스의 게놈 DNA가 유전자좌에 삽입된 마커 유전자를 갖는 트랜스제닉 녹-인 마우스의 생성을 포함한다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 GSH 유전자좌를 포함하는 다양한 조성물이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 GSH 핵산의 적어도 일부를 포함하는 핵산 벡터가 본원에 제공된다. 바람직한 구체예에서, GSH 유전자좌에 상동성을 갖는 서열(5' 및 3' 상동성 아암)은 상동성 아암이 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 GSH 유전자좌 내로 통합시키는 것을 촉진하도록 적어도 하나의 비-GSH 핵산에 플랭킹된다. 이러한 비-GSH 핵산은 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 인간 단백질 또는 이의 단편; 치료 단백질 또는 이의 단편, 항원-결합 단백질, 또는 펩티드; 자살 유전자, 예를 들어, 단순 포진 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK); 바이러스 단백질 또는 이의 단편; 뉴클레아제; 마커; 및/또는 약물 내성 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 또한 본 개시의 다양한 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 추가로 본 개시의 핵산 벡터를 포함하는 세포 뿐만 아니라 게놈의 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 또한, 세포 게놈에서 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 트랜스제닉 유기체와 함께, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 및/또는 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 조성물을 사용하고 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 다양한 질병을 예방하거나 치료하는 방법; 세포 또는 대상체에서 단백질의 수준 및/또는 활성을 조절하는 방법(예를 들어, 상기 단백질을 인코딩하는 유전자의 여분의 카피를 도입함으로써 단백질 수준을 증가시키거나, 비-코딩 RNA를 도입하고/거나 상기 단백질을 인코딩하는 유전자를 하향조절하거나 제거하는 CRISPR 유전자 편집에 의해 단백질 수준을 감소시키는 방법); 항원-결합 단백질 및/또는 치료 단백질(예를 들어, 인슐린)과 같은 생물학적 제제를 제조하는 방법; 유전자 요법을 위한 것을 포함하는 바이러스 벡터를 제조하는 방법을 포함한다. 추가로 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에 바이러스 항원을 노출시킴으로써 생체내 면역화를 가능하게 하는, 본 개시의 GSH 유전자좌에서 바이러스 표면 단백질을 통합하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 중요하게는, 이러한 바이러스 항원은 바이러스 항원의 박동성 발현을 가능하게 하는 본 개시의 유도성 프로모터를 사용함으로써 간헐적으로 켜지거나 꺼질 수 있다.
도 1은 안전한 유전자 요법에 대한 현재의 과제 및 무차별(무작위) DNA 통합의 가능한 결과를 보여준다. 무차별적인 유전자 치료 통합이 삽입 돌연변이유발, 유전독성을 유발하거나, 관심 유전자(예를 들어, 본원에서 비-GSH 핵산에 의해 포함됨) 발현에 영향을 미칠 수 있고, 이는 유전자 요법의 가능성을 실현하는데 주요 장벽을 나타낸다는 증거가 증가하고 있다.
도 2a 및 도 2b는 GSH로의 표적화된 통합이 예측 가능한 트랜스진 발현을 가능하게 하고 숙주 게놈에서 삽입 돌연변이유발의 위험을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 2b는 신테닉(syntenic) GSH가 관련 연구 모델에 걸쳐 예측성을 가져와 비임상 및 임상 개발을 용이하게 함을 보여준다. 영구적인 트랜스제네시스를 위한 안전하고 잘 특성화된 게놈 유전자좌의 사용은 안전하고 성공적인 생체외 및 생체내 유전자 요법 치료를 위한 전제조건이 될 수 있다.
도 3은 GSH 유전자좌를 확인하기 위한 대표적인 방법의 다이어그램을 보여준다.
도 4a-도 4c는 신규한 GSH 유전자좌의 특성화를 보여준다. 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC)의 분화 가능성을 시험하기 위한 CFU(콜로니 형성 단위) 검정. 도 4a는 본원에서 수행된 검정을 나타내는 개략도이다. 본원에서 확인된 신규한 GSH 유전자좌인 SYNTX-GSH1로의 유전자 지시 통합은 수임 적혈구 전구 세포로의 성공적인 HSC 분화를 허용하였다. 도 4b는 수임 적혈구 전구 세포에서 높은 트랜스진 발현(GFP)을 보여준다. 도 4c는 HSC 분화(적혈구형성)를 예시하는 다이어그램을 보여준다.
도 5a-도 5b는 본원에서 확인된 GSH 유전자좌로의 마커 유전자의 유전자 편집을 보여준다. 도 5a는 본원에서 확인된 CD34+ HSC의 GSH로의 유전자 편집의 효율을 보여준다. 이전에 공지된 GSH 유전자좌인 AAVS1을 양성 대조군으로 사용하였다. 도 5b는 수임된 CD71+/CD235a+ 적혈구모세포로의 일차 CD34+ HSC의 분화가 SYNTX-GSH(SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2)로의 유전자 삽입 후 영향을 받지 않았음을 보여준다.
도 6a-도 6b는 상이한 GSH 유전자좌에 통합된 마커 유전자(GFP)의 발현을 보여준다. GFP 발현은 CD34+ HSC의 SYNTX-GSH 및 AAVS1(양성 대조군)로의 유전자 편집 14일 후에 결정되었다. (SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2). SYNTX-GSH로의 유전자 편집은 AAVS1로의 편집보다 더 효율적이었다. 편집된 세포는 유전자 편집 2주 후에 GFP를 안정적으로 발현하였고, CD34+ HSC에서 적혈구 전구 세포로의 분화를 진행하였다. SYNTX-GSH1 및 2 편집된 세포는 AAVS1 편집된 세포보다 더 높은 수준의 트랜스진(GFP)을 발현하였다. (SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2).
도 7a-도 7d는 세포의 전체 전사 프로파일에 대한 SYNTX-GSH로의 트랜스진 녹-인의 영향을 보여준다. 도 7a는 RNAseq에 의한 세포 교란 분석 실험 설계를 보여준다. 도 7b는 야생형 세포 및 AAVS1과 비교하여 SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2에 대해 수행된 RNAseq 분석을 보여준다. 도 7c는 주성분 분석을 보여준다. 도 7d는 녹-인 세포주에서 통합된 마커 유전자 GFP 발현을 보여준다. SYNTX-GSH로의 트랜스진 통합은 AAVS1 부위로의 통합보다 세포 전사 프로파일에 더 낮은 영향을 미쳤다. SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2는 인간 세포에서 AAVS1보다 더 높고 더 안정적인 트랜스진 발현을 나타내었다.
도 8a-도 8c는 세포 계대에 걸쳐 GFP 발현의 안정성을 결정함으로써 GSH 성능을 평가한다. 도 8a는 실험의 개략도를 보여준다. 도 8b 및 도 8c는 SYNTX-GSH 유전자좌에 삽입된 마커 유전자(GFP)의 발현을 보여준다. 4개의 상이한 SYNTX-GSH 유전자좌로의 트랜스진 통합은 상이한 편집 효율 및 트랜스진 발현을 초래하였다. SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2는 AAVS1보다 더 높고 더 안정적인 트랜스진 발현을 나타내었다. SYNTX-GSH3 및 SYNTX-GSH4는 더 낮은 수준의 발현을 나타내었고, 더 낮은 수준의 발현을 필요로 하는 유전자(예를 들어, 치사 유전자)의 삽입에 유용할 수 있다. 본원에서 확인된 GSH 유전자좌는 특정 유전자 요법 프로그램에 적응하기 위해 상이한 특성을 갖는 개별 GSH의 팔레트를 제공한다.
도 9a 및 도 9b는 AAV ITR의 이차 구조 및 롤링 헤어핀 복제 모델의 개략도를 보여준다. 도 9a는 광범위한 이차 구조를 형성하는 AAV ITR의 구조를 보여준다. ITR은 2개의 구성(플립 및 플롭)을 획득할 수 있다. 도 9b는 바이러스 핵산이 복제되는 롤링 헤어핀 복제 모델을 보여주는 개략도를 보여준다.
도 10은 하나 이상의 HS 서열에 의해 5' 말단에서 플랭킹된 β-글로빈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 β-글로빈 유전자를 함유하는 이종성 핵산/트랜스진 작제물을 나타내는 개략도를 보여준다. 포유동물 β-글로빈 유전자는 일련의 5개의 DNase I 과민성 부위(HS1-HS5)를 함유하는 유전자좌 제어 영역(LCR)으로 불리는 조절 영역에 의해 조절된다. HS는 β-글로빈 유전자의 효율적인 발현에 필요하다. 각각의 트랜스진 작제물은 2개의 상동성 아암(5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암) 사이에 배치되며, 이는 상동성 재조합에 의해 표적 세포 게놈에서 부위-특이적 통합을 용이하게 한다.
도 11은 다양한 프로모터를 함유하는 이종성 핵산/트랜스진 작제물을 나타내는 개략도를 보여준다. 각각의 프로모터(예를 들어, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, W-A 프로모터, PKLR 프로모터)는 관심 트랜스진에 작동 가능하게 연결되고, 전체 작제물은 2개의 상동성 아암(5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암) 사이에 위치하여, 상동성 재조합에 의해 표적 세포 게놈의 GSH 유전자좌에서 부위-특이적 통합을 용이하게 한다.
도 12는 PKLR의 적혈구-특이적 프로모터의 부분 DNA 서열을 보여준다. 상류 조절 도메인을 포함하는 469-bp 영역. 인간과 래트 PK-R 프로모터 사이의 보존된 요소는 점선으로 도시되어 있다. PK-R 전사 시작 부위의 시토신은 밑줄로 표시된다. GATA-1, CAC/Sp1 모티프, 및 상류 270-bp 영역의 조절 요소 PKR-RE1은 박스로 표시된다(배향은 화살표로 표시됨).
도 13a 및 도 13b는 본원에 기재된 재조합 비리온에 의해 표적화될 수 있는 예시적인 miRNA를 보여준다. 에리트로파보바이러스 재조합 비리온은 miRNA 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 재조합 비리온은 miRNA를 불활성화시키는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
도 14는 박동성 트랜스진 발현 시스템을 보여준다. 개략도는 발현의 음성 및 양성 조절 둘 모두를 나타낸다. 실시예 I(상부 패널)은 ASO(안티센스 올리고뉴클레오티드 ASO 또는 AON)가 전사후 유전자 발현을 음성으로 조절할 수 있음을 보여준다. ASO 없이, 일차 전사체(좌측)는 번역 가능한 mRNA로 스플라이싱된다(윗줄). 인트론의 3' 말단/엑손 2의 5' 말단에서 스플라이스 수용자에 상보적인 ASO(적색 선)의 첨가는 스플라이싱을 방해한다. 따라서, ASO의 존재 하에, 인트론은 전사체에 남아 있다. 처리되지 않은 RNA는 번역이 불가능하거나 번역시 비-기능성 단백질을 생산한다. 실시예 II(하부 패널)는 ASO가 전사후 유전자 발현에 양성적인 영향을 미칠 수 있음을 예시한다. 일차 전사체(좌측)는 4개의 엑손을 함유한다: 엑손 1, 엑손 3, 및 엑손 4는 치료 단백질을 인코딩하고, 엑손 2는 넌센스 돌연변이(들) 또는 프레임외 돌연변이(out-of-frame-mutation)(OOF)를 함유한다. 이러한 엑손 2는 임의의 트랜스진으로 조작될 수 있다. ASO 없이, 전사체는 4개의 엑손을 포함하는 성숙한 mRNA(아랫줄), 즉, 넌센스 돌연변이(들) 또는 OOF 돌연변이를 갖는 엑손 2가 남아 있도록 처리된다. 따라서, 생성된 mRNA는 트렁케이션된 또는 비-기능성 단백질로 번역된다. 대조적으로, ASO의 첨가는 스플라이싱을 방해하고, 성숙한 mRNA는 엑손 1, 엑손 3, 및 엑손 4로 구성되며, 즉, 넌센스 돌연변이(들) 또는 OOF 돌연변이를 갖는 엑손 2가 스플라이싱된다. 따라서, 디폴트 상태(ASO 없음)에서, 치료 단백질은 생산되지 않는다. ASO의 첨가시에만, 치료 단백질이 생산되어, 양성 조절을 초래한다.
도 15는 ATACseq 적용 범위 및 피크를 보여준다. EVE 삽입 부위는 플롯의 중심에 검은색 수직선으로 표시된다. 각 공여자에 대해, ATACseq 적용 범위는 공여자별로 색상별로 구분된 피크라고 불리는 수직 막대와 함께 부드러운 회색 선으로 표시된다. 공여자 전체에 걸쳐 EVE 삽입으로부터 가장 가까운 피크까지의 거리는 접근 가능한 염색질을 나타내는 1,144개 염기쌍이다.
도 2a 및 도 2b는 GSH로의 표적화된 통합이 예측 가능한 트랜스진 발현을 가능하게 하고 숙주 게놈에서 삽입 돌연변이유발의 위험을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 2b는 신테닉(syntenic) GSH가 관련 연구 모델에 걸쳐 예측성을 가져와 비임상 및 임상 개발을 용이하게 함을 보여준다. 영구적인 트랜스제네시스를 위한 안전하고 잘 특성화된 게놈 유전자좌의 사용은 안전하고 성공적인 생체외 및 생체내 유전자 요법 치료를 위한 전제조건이 될 수 있다.
도 3은 GSH 유전자좌를 확인하기 위한 대표적인 방법의 다이어그램을 보여준다.
도 4a-도 4c는 신규한 GSH 유전자좌의 특성화를 보여준다. 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC)의 분화 가능성을 시험하기 위한 CFU(콜로니 형성 단위) 검정. 도 4a는 본원에서 수행된 검정을 나타내는 개략도이다. 본원에서 확인된 신규한 GSH 유전자좌인 SYNTX-GSH1로의 유전자 지시 통합은 수임 적혈구 전구 세포로의 성공적인 HSC 분화를 허용하였다. 도 4b는 수임 적혈구 전구 세포에서 높은 트랜스진 발현(GFP)을 보여준다. 도 4c는 HSC 분화(적혈구형성)를 예시하는 다이어그램을 보여준다.
도 5a-도 5b는 본원에서 확인된 GSH 유전자좌로의 마커 유전자의 유전자 편집을 보여준다. 도 5a는 본원에서 확인된 CD34+ HSC의 GSH로의 유전자 편집의 효율을 보여준다. 이전에 공지된 GSH 유전자좌인 AAVS1을 양성 대조군으로 사용하였다. 도 5b는 수임된 CD71+/CD235a+ 적혈구모세포로의 일차 CD34+ HSC의 분화가 SYNTX-GSH(SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2)로의 유전자 삽입 후 영향을 받지 않았음을 보여준다.
도 6a-도 6b는 상이한 GSH 유전자좌에 통합된 마커 유전자(GFP)의 발현을 보여준다. GFP 발현은 CD34+ HSC의 SYNTX-GSH 및 AAVS1(양성 대조군)로의 유전자 편집 14일 후에 결정되었다. (SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2). SYNTX-GSH로의 유전자 편집은 AAVS1로의 편집보다 더 효율적이었다. 편집된 세포는 유전자 편집 2주 후에 GFP를 안정적으로 발현하였고, CD34+ HSC에서 적혈구 전구 세포로의 분화를 진행하였다. SYNTX-GSH1 및 2 편집된 세포는 AAVS1 편집된 세포보다 더 높은 수준의 트랜스진(GFP)을 발현하였다. (SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2).
도 7a-도 7d는 세포의 전체 전사 프로파일에 대한 SYNTX-GSH로의 트랜스진 녹-인의 영향을 보여준다. 도 7a는 RNAseq에 의한 세포 교란 분석 실험 설계를 보여준다. 도 7b는 야생형 세포 및 AAVS1과 비교하여 SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2에 대해 수행된 RNAseq 분석을 보여준다. 도 7c는 주성분 분석을 보여준다. 도 7d는 녹-인 세포주에서 통합된 마커 유전자 GFP 발현을 보여준다. SYNTX-GSH로의 트랜스진 통합은 AAVS1 부위로의 통합보다 세포 전사 프로파일에 더 낮은 영향을 미쳤다. SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2는 인간 세포에서 AAVS1보다 더 높고 더 안정적인 트랜스진 발현을 나타내었다.
도 8a-도 8c는 세포 계대에 걸쳐 GFP 발현의 안정성을 결정함으로써 GSH 성능을 평가한다. 도 8a는 실험의 개략도를 보여준다. 도 8b 및 도 8c는 SYNTX-GSH 유전자좌에 삽입된 마커 유전자(GFP)의 발현을 보여준다. 4개의 상이한 SYNTX-GSH 유전자좌로의 트랜스진 통합은 상이한 편집 효율 및 트랜스진 발현을 초래하였다. SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2는 AAVS1보다 더 높고 더 안정적인 트랜스진 발현을 나타내었다. SYNTX-GSH3 및 SYNTX-GSH4는 더 낮은 수준의 발현을 나타내었고, 더 낮은 수준의 발현을 필요로 하는 유전자(예를 들어, 치사 유전자)의 삽입에 유용할 수 있다. 본원에서 확인된 GSH 유전자좌는 특정 유전자 요법 프로그램에 적응하기 위해 상이한 특성을 갖는 개별 GSH의 팔레트를 제공한다.
도 9a 및 도 9b는 AAV ITR의 이차 구조 및 롤링 헤어핀 복제 모델의 개략도를 보여준다. 도 9a는 광범위한 이차 구조를 형성하는 AAV ITR의 구조를 보여준다. ITR은 2개의 구성(플립 및 플롭)을 획득할 수 있다. 도 9b는 바이러스 핵산이 복제되는 롤링 헤어핀 복제 모델을 보여주는 개략도를 보여준다.
도 10은 하나 이상의 HS 서열에 의해 5' 말단에서 플랭킹된 β-글로빈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 β-글로빈 유전자를 함유하는 이종성 핵산/트랜스진 작제물을 나타내는 개략도를 보여준다. 포유동물 β-글로빈 유전자는 일련의 5개의 DNase I 과민성 부위(HS1-HS5)를 함유하는 유전자좌 제어 영역(LCR)으로 불리는 조절 영역에 의해 조절된다. HS는 β-글로빈 유전자의 효율적인 발현에 필요하다. 각각의 트랜스진 작제물은 2개의 상동성 아암(5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암) 사이에 배치되며, 이는 상동성 재조합에 의해 표적 세포 게놈에서 부위-특이적 통합을 용이하게 한다.
도 11은 다양한 프로모터를 함유하는 이종성 핵산/트랜스진 작제물을 나타내는 개략도를 보여준다. 각각의 프로모터(예를 들어, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, W-A 프로모터, PKLR 프로모터)는 관심 트랜스진에 작동 가능하게 연결되고, 전체 작제물은 2개의 상동성 아암(5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암) 사이에 위치하여, 상동성 재조합에 의해 표적 세포 게놈의 GSH 유전자좌에서 부위-특이적 통합을 용이하게 한다.
도 12는 PKLR의 적혈구-특이적 프로모터의 부분 DNA 서열을 보여준다. 상류 조절 도메인을 포함하는 469-bp 영역. 인간과 래트 PK-R 프로모터 사이의 보존된 요소는 점선으로 도시되어 있다. PK-R 전사 시작 부위의 시토신은 밑줄로 표시된다. GATA-1, CAC/Sp1 모티프, 및 상류 270-bp 영역의 조절 요소 PKR-RE1은 박스로 표시된다(배향은 화살표로 표시됨).
도 13a 및 도 13b는 본원에 기재된 재조합 비리온에 의해 표적화될 수 있는 예시적인 miRNA를 보여준다. 에리트로파보바이러스 재조합 비리온은 miRNA 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 재조합 비리온은 miRNA를 불활성화시키는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
도 14는 박동성 트랜스진 발현 시스템을 보여준다. 개략도는 발현의 음성 및 양성 조절 둘 모두를 나타낸다. 실시예 I(상부 패널)은 ASO(안티센스 올리고뉴클레오티드 ASO 또는 AON)가 전사후 유전자 발현을 음성으로 조절할 수 있음을 보여준다. ASO 없이, 일차 전사체(좌측)는 번역 가능한 mRNA로 스플라이싱된다(윗줄). 인트론의 3' 말단/엑손 2의 5' 말단에서 스플라이스 수용자에 상보적인 ASO(적색 선)의 첨가는 스플라이싱을 방해한다. 따라서, ASO의 존재 하에, 인트론은 전사체에 남아 있다. 처리되지 않은 RNA는 번역이 불가능하거나 번역시 비-기능성 단백질을 생산한다. 실시예 II(하부 패널)는 ASO가 전사후 유전자 발현에 양성적인 영향을 미칠 수 있음을 예시한다. 일차 전사체(좌측)는 4개의 엑손을 함유한다: 엑손 1, 엑손 3, 및 엑손 4는 치료 단백질을 인코딩하고, 엑손 2는 넌센스 돌연변이(들) 또는 프레임외 돌연변이(out-of-frame-mutation)(OOF)를 함유한다. 이러한 엑손 2는 임의의 트랜스진으로 조작될 수 있다. ASO 없이, 전사체는 4개의 엑손을 포함하는 성숙한 mRNA(아랫줄), 즉, 넌센스 돌연변이(들) 또는 OOF 돌연변이를 갖는 엑손 2가 남아 있도록 처리된다. 따라서, 생성된 mRNA는 트렁케이션된 또는 비-기능성 단백질로 번역된다. 대조적으로, ASO의 첨가는 스플라이싱을 방해하고, 성숙한 mRNA는 엑손 1, 엑손 3, 및 엑손 4로 구성되며, 즉, 넌센스 돌연변이(들) 또는 OOF 돌연변이를 갖는 엑손 2가 스플라이싱된다. 따라서, 디폴트 상태(ASO 없음)에서, 치료 단백질은 생산되지 않는다. ASO의 첨가시에만, 치료 단백질이 생산되어, 양성 조절을 초래한다.
도 15는 ATACseq 적용 범위 및 피크를 보여준다. EVE 삽입 부위는 플롯의 중심에 검은색 수직선으로 표시된다. 각 공여자에 대해, ATACseq 적용 범위는 공여자별로 색상별로 구분된 피크라고 불리는 수직 막대와 함께 부드러운 회색 선으로 표시된다. 공여자 전체에 걸쳐 EVE 삽입으로부터 가장 가까운 피크까지의 거리는 접근 가능한 염색질을 나타내는 1,144개 염기쌍이다.
발명의 상세한 설명
특정 양태에서, GSH 유전자좌를 확인하고 검증하는 신규한 방법, 새롭게 확인된 GSH 유전자좌, 상기 GSH 유전자좌의 서열을 포함하는 조성물, 및 환자를 치료하기 위해(예를 들어, 유전자 요법 또는 세포 요법을 통해) GSH 유전자좌 및 이를 포함하는 조성물을 사용하는 방법, 의약(예를 들어, 생물학적 제제 또는 백신) 제조, 및 본원에 기재된 다른 적용이 본원에 제공된다.
정의
단수 형태는 하나 내지 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 물품의 문법적 대상을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "투여하는"은 요법으로 하여금 이의 의도된 기능을 수행할 수 있게 하는 투여 경로를 포함하는 것으로 의도된다. 투여 경로의 예는 주사(근육내, 피하, 정맥내, 비경구, 복강내, 척추강내, 종양내, 비강내, 두개내, 유리체내, 망막하 등) 경로를 포함한다. 투여 경로는 또한 흡입 뿐만 아니라 골수로의 직접 주사를 포함한다. 주사는 볼루스 주사일 수 있거나 연속 주입일 수 있다. 투여 경로에 따라, 제제는 흡수를 개선시키거나 이의 의도된 기능을 수행하는 능력에 해로운 영향을 미칠 수 있는 천연 조건으로부터 이를 보호하기 위해 선택된 물질로 코팅되거나 배치될 수 있다.
용어 "고래류(cetacea)"는 특히 수염 고래, 이빨 고래, 돌고래 및 알락돌고래, 및 어뢰-모양의 거의 털이 없는 몸체, 뒷다리는 없으나 패들-모양의 앞다리, 머리 꼭대기에서 외부로 열리는 하나 또는 두 개의 콧구멍, 및 이동에 사용되는 수평으로 편평한 꼬리를 갖는 관련 형태를 포함하는 수생 해양 포유동물의 분류학적 (하)목을 지칭한다.
용어 "박쥐목(chiroptera)"은 진정한 비행이 가능한 포유동물의 분류학적 목을 지칭하고, 박쥐를 포함한다.
본원에서 사용되는 "공여자 서열"은 숙주 세포 게놈에 삽입되거나 이에 대한 복구 주형으로 사용되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 공여자 서열은 유전자 편집 동안 만들어지기를 원하는 변형을 포함할 수 있다. 혼입될 서열은 표적 서열에서 상동성 지시 복구를 통해 표적 핵산 분자에 도입될 수 있고, 이에 의해 원래의 표적 서열로부터 공여자 서열에 포함된 서열로의 표적 서열의 변경을 야기할 수 있다. 따라서, 공여자 서열에 포함되는 서열은 표적 서열과 관련하여, 삽입, 결실, 인델, 점 돌연변이, 돌연변이의 복구 등일 수 있다. 공여자 서열은, 예를 들어, 단일-가닥 DNA 분자; 이중-가닥 DNA 분자; DNA/RNA 하이브리드 분자; 및 DNA/modRNA(변형된 RNA) 하이브리드 분자일 수 있다. 구체예에서, 공여자 서열은 상동성 아암에 대해 외래이다. 편집은 RNA 뿐만 아니라 DNA 편집일 수 있다. 공여자 서열은 원하는 유전자 편집의 특성에 따라 숙주 세포 게놈에 내인성 또는 외인성일 수 있다.
용어 "내인성 바이러스 요소" 또는 "EVE"는 바이러스로부터 유래된 DNA 서열이고, 비-바이러스 유기체의 생식계열 내에 존재한다. EVE는 전체 바이러스 게놈(프로바이러스) 또는 바이러스 게놈의 단편일 수 있다. 이들은 바이러스 DNA 서열이 생존 가능한 유기체를 생산하기 위해 계속되는 생식 세포의 게놈에 통합될 때 발생한다. 새로 확립된 EVE는 숙주 종의 대립유전자로서 한 세대에서 다음 세대로 유전될 수 있고, 심지어 고정에 도달할 수 있다.
용어 "상동성 재조합"은 당 분야에 공지되어 있으며, 표적 게놈에서 핵산 삽입과 관련하여 사용될 때, 상동성-의존적 복구를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "상동성(homology)" 또는 "상동성(homologous)"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후, 표적 염색체 상의 상응하는 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 상동성 아암의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다. 핵산 서열의 영역 사이의 동일성은, 예를 들어, 문헌[Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (other programs include the GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)]에서와 같은 디폴트 매개변수를 사용하는 "FASTA" 프로그램과 같은 공지된 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 동일성의 백분율로 결정될 수 있다. 예를 들어, 국립 생명공학 정보 센터 데이터베이스의 BLAST 기능은 주체를 결정하는데 사용될 수 있다. 다른 상업적으로 또는 공개적으로 이용 가능한 프로그램은 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, Wis.) 및 University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG) "Gap" 프로그램(Madison Wis.)을 포함한다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 복구 주형의 상동성 아암의 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)은 해당 서열이 숙주 세포의 상응하는 천연 또는 편집되지 않은 핵산 서열(예를 들어, 게놈 서열)과 적어도 또는 약 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 때 "상동성"인 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 "상동성 아암"은 상동성 재조합을 통해 게놈에 공여자 서열을 표적화하기에 적합한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 전형적으로, 2개의 상동성 아암이 공여자 서열에 플랭킹되고, 여기서 각각의 상동성 아암은 통합 유전자좌의 상류 및 하류에 게놈 서열을 포함한다.
용어 "토끼목(lagomorpha)"는 토끼, 산토끼, 및 우는토끼를 포함하는 2개의 과(토끼과를 포함하는 토끼속 및 우는토끼속)로 구성된, 하나가 다른 것 뒤에 있는 상악에 두 쌍의 앞니, 보통 부드러운 털, 및 짧거나 흔적 꼬리를 갖는 갉아먹는 초식성 포유동물의 분류학적 목을 지칭한다.
용어 "캥거루과(Macropodiadae)"는 긴 뒷다리와 약하게 발달된 앞다리를 갖는 모든 도약성 동물이고 전형적으로 공격적이지 않은 육상 초식동물인 캥거루, 왈라비, 및 래트 캥거루를 포함하는 쌍문치류 유대류 포유동물의 분류학적 과를 지칭한다.
용어 "단공목(monotremata)"은 오리너구리 및 가시두더지를 포함하는 알을 낳는 포유동물의 분류학적 목을 지칭한다.
용어 "프로바이러스"는 숙주 세포의 DNA에 통합되거나 삽입될 때 바이러스의 게놈을 지칭한다. 프로바이러스는 세포 염색체에 연결된 레트로바이러스 게놈의 듀플렉스 DNA 형태를 지칭한다. 프로바이러스는 RNA 게놈의 역전사 및 숙주 세포의 염색체 DNA로의 후속 통합에 의해 생산된다.
용어 "영장류"는 특히 입체적 깊이 지각을 초래하는 양안 시력의 진보된 발달, 움켜잡기 위한 손과 및 발의 특수화, 및 대뇌 반구의 확대를 특징으로 하는 포유동물의 분류학적 목을 지칭하고 인간, 유인원, 원숭이, 및 관련 형태(예를 들어, 여우원숭이 및 안경원숭이)를 포함한다.
본원에서 사용되는 "Rep"는 바이러스 게놈의 복제를 가능하게 하는데 필요한 기능(들)을 제공할 수 있는 임의의 비-구조적 레플리카제, Rep 단백질, 또는 Rep 단백질의 조합을 지칭한다.
용어 "쥐목(Rodentia)"은 양 턱에 끌 모양의 가장자리를 갖는 한 쌍의 앞니를 갖는 비교적 작은 갉아먹는 포유동물(예를 들어, 마우스, 다람쥐, 또는 비버)의 분류학적 목을 지칭한다. 여기에는 모든 설치류가 포함된다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 임의의 건강하거나 질병에 걸린 동물, 포유동물 또는 인간, 또는 임의의 동물, 포유동물 또는 인간을 지칭한다. 일부 구체예에서, 대상체는 혈액 질환을 앓고 있다. 본 발명의 방법의 다양한 구체예에서, 대상체는 치료를 받지 않았다. 다른 구체예에서, 대상체는 치료를 받았다.
용어 "신테닉"은 상이한 종에서 일련의 유전자의 유사한 조직 또는 배열을 지칭한다.
물질 또는 세포 또는 비리온의 "치료적 유효량"은 바람직하게는 인간 또는 비인간 포유동물에서 허용되는 이익:위험 비율로 치료된 환자에서 의학적으로 바람직한 결과(예를 들어, 임상 개선)를 생성할 수 있는 양이다.
용어 "분류학적 목"는 추정되는 자연적 관계에 따라 식물 및 동물을 질서 있게 분류하는 것을 지칭한다. 게놈 서열 데이터의 분석에 기반한 종 관련성은 물리적 관계로부터 추론된 자연적 관계에 대한 정량적 대안적 접근법을 제공한다.
용어 "치료하는"은 예방적 및/또는 치료적 치료를 포함한다. 용어 "예방적 또는 치료적" 치료는 당 분야에 인식되어 있으며, 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 원하지 않는 질환(예를 들어, 대상체의 질병 또는 다른 원하지 않는 상태)의 임상적 징후 전에 투여되는 경우, 치료는 예방적이다(즉, 이는 원하지 않는 질환이 발생하지 않도록 대상체를 보호한다); 반면, 원하지 않는 질환의 발현 후에 투여되는 경우, 치료는 치료적이다(즉, 이는 기존의 원하지 않는 질환 또는 이의 부작용을 감소, 개선 또는 안정화시키기 위한 것이다).
게놈 세이프 하버(GSH)
본원에서 "GSH" 또는 "세이프 하버 유전자" 또는 "세이프 하버 유전자좌"로도 상호교환적으로 지칭되는 용어 "게놈 세이프 하버"는 외인성 핵산을 통합하는데 사용될 수 있고, 여기서 통합은 외인성 핵산 단독의 첨가에 의해 숙주 세포의 성장에 어떠한 유의한 해로운 영향을 일으키지 않는 게놈 DNA의 영역 또는 특정 부위를 포함하는 게놈 내의 위치를 지칭한다. 즉, GSH는 서열이 내인성 유전자 활성에 유의한 부정적인 결과, 또는 암의 촉진 없이 예측 가능한 방식으로 통합되고 기능할 수 있도록(예를 들어, 관심 단백질의 발현) 핵산 서열이 삽입될 수 있는 게놈 내의 유전자 또는 유전자좌를 지칭한다. 예를 들어, GSH는 새로 삽입된 유전 요소가 (i) 예측 가능하게 기능하고(예를 들어, 예측 가능한 발현) (ii) 숙주 게놈의 유의한 변경을 일으키지 않음으로써 숙주 세포 또는 유기체에 대한 위험을 피하고, (iii) 바람직하게는 삽입된 핵산이 이웃 유전자로부터의 임의의 연속-판독 발현에 의해 교란되지 않고, (iv) 가까운 유전자를 활성화하지 않도록 보장하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 잇는 숙주 세포 게놈의 부위이다. GSH는 특정 부위일 수 있거나 게놈 DNA의 영역일 수 있다. GSH는 트랜스진이 내인성 유전자 구조 또는 발현에 악영향을 미치지 않으면서 모든 관심 조직에서 안정적이고 확실하게 발현될 수 있는 염색체 부위일 수 있다. 일부 구체예에서, GSH는 외인성 핵산의 삽입이 적절하게 분화하는(예를 들어, 줄기 세포의 분화) 세포의 능력을 유의하게 변경시키지 않는 유전자좌 또는 유전자이다. 일부 구체예에서, GSH는 또한 삽입된 핵산 서열이 비-세이프 하버 부위보다 더 높은 수준으로 효율적으로 발현될 수 있는 유전자좌 또는 유전자이다.
따라서, GSH는 숙주 세포 또는 유기체에 대한 유의한 악영향 없이 새로 통합된 DNA의 예측 가능한 발현을 수용할 수 있는 인간 및 모델 종 게놈의 유전자내, 유전자간, 또는 유전자외 영역을 포함한다. GSH는 인트론 또는 엑손 유전자 서열 뿐만 아니라 유전자간 또는 유전자외 서열을 포함할 수 있다. 이론으로 제한되지는 않지만, 유용한 세이프 하버는 원하는 수준의 트랜스진-인코딩된 단백질 또는 비-코딩 RNA를 생성하기에 충분한 트랜스진 발현을 허용해야 한다. GSH는 또한 세포가 악성 형질전환을 일으키게 하거나, 전구 세포 분화를 방해하거나, 정상 세포 기능을 유의하게 변경시켜서는 안 된다. GSH를 우연한 우수한 통합 사건과 구별하는 것은 GSH의 사전 지식 및 검증에 기반한 결과의 예측 가능성이다.
일부 구체예에서, GSH는 제한된 표적외 활성을 갖고 유전독성 또는 외래 DNA의 통합시 삽입 종양형성을 야기할 위험을 최소화하면서, 최소의 표적외 활성으로 고도로 특이적 뉴클레아제에 접근할 수 있는 안전하고 표적화된 유전자 전달을 가능하게 한다.
게놈 세이프 하버의 확인
GSH 유전자좌를 확인하는 예시적인 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 예시적인 방법 중 어느 하나를 사용하여 GSH 유전자좌를 확인한다. 일부 구체예에서, 적어도 2개의 예시적인 방법의 조합이 GSH 유전자좌를 확인하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 적어도 3개의 예시적인 방법의 조합이 GSH 유전자좌를 확인하는데 사용된다. 다수의 예시적인 방법 중 어느 하나 또는 조합은 확인된 GSH 유전자좌를 검증하기 위해 적어도 하나의 검정(시험관내, 생체외, 또는 생체내)을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.
방법 1: 마커의 무작위 통합을 통한 GSH 유전자좌의 기능적 확인
특정 양태에서, (a) 세포의 게놈으로의 적어도 하나의 마커 유전자의 무작위 삽입을 유도하는 단계; (b) 마커 유전자 발현의 안정성 및/또는 수준을 결정하는 단계; 및 (c) 삽입된 마커 유전자가 안정한 및/또는 높은 수준의 발현을 나타내는 게놈 유전자좌를 GSH로서 확인하는 단계를 포함하는 게놈 세이프 하버(GSH) 유전자좌를 확인하는 방법이 본원에 제공된다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 (a) 삽입된 마커 유전자가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 게놈 유전자좌를 확인하는 단계; 및/또는 (b) 삽입된 마커가 세포의 분화 능력에 영향을 미치지 않는 게놈 유전자좌를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, GSH 유전자좌에서 마커 유전자의 삽입은 세포(예를 들어, 줄기 세포 또는 전구 세포)의 만능성, 전능성, 또는 다능성에 영향을 미치지 않는다.
일부 구체예에서, 방법에 사용되는 세포는 세포주, 일차 세포, 줄기 세포, 또는 전구 세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포이다. 이러한 일부 구체예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 방법에 사용되는 세포는 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 및 간 전구 세포로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 방법에 사용되는 세포는 포유동물 세포이다. 이러한 일부 구체예에서, 포유동물 세포는 마우스 세포, 개 세포, 돼지 세포, 비인간 영장류(NHP) 세포, 또는 인간 세포이다.
특정 구체예에서, 세포의 게놈으로의 적어도 하나의 마커 유전자의 무작위 삽입은 (a) 마커 유전자를 포함하는 핵산 분자로 세포를 트랜스펙션시키는 단계로서, 선택적으로 핵산이 플라스미드인 단계; 또는 (b) 마커 유전자를 포함하는 통합 바이러스로 세포를 형질도입시키는 단계에 의해 유도된다. 일부 구체예에서, 무작위 삽입은 마커 유전자를 포함하는 통합 바이러스로 세포를 형질도입시키는 단계에 의해 유도되고; 통합 바이러스는 레트로바이러스이다. 일부 구체예에서, 레트로바이러스는 감마 레트로바이러스이다.
특정 구체예에서, 방법은 스크리닝 가능한 마커 및/또는 선택 가능한 마커를 포함하는 적어도 하나의 마커 유전자를 사용한다. 일부 구체예에서, 스크리닝 가능한 마커 유전자는 녹색 형광 단백질(GFP), 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 및/또는 베타-글루쿠로니다제를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 선택 가능한 마커 유전자는 항생제 내성 유전자이다. 이러한 일부 구체예에서, 항생제 내성 유전자는 블라스티시딘 S-데아미나제 또는 아미노 3'-글리코실 포스포트랜스퍼라제(네오마이신 내성 유전자)를 인코딩한다.
특정 구체예에서, 방법은 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않은 마커 유전자를 사용한다. 여기서, 프로모터-없는 마커의 사용은 이웃하는 프로모터 및 조절 요소를 사용하여 외인성 핵산의 발현을 허용하는 GSH 유전자좌의 확인을 가능하게 한다. 일부 구체예에서, 이웃하는 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다.
특정 구체예에서, 마커 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다.
일부 구체예에서, 확인된 GSH는 유전자내(예를 들어, 엑손 또는 인트론) 또는 유전자간 GSH이다. 바람직한 구체예에서, 확인된 GSH는 인트론 또는 유전자간 GSH이다.
방법 2: 내인성 바이러스 요소(EVE)를 사용한 GSH 유전자좌의 확인
특정 양태에서, 예를 들어, 후생동물 종의 게놈에서 내인성 바이러스 요소(EVE)로 지칭되는 임의의 프로바이러스 잔여물(예를 들어, 파보바이러스 잔여물)을 확인하기 위해 진화 생물학을 사용하여 GSH 유전자좌를 확인하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 결과는 EVE가 종의 방사선에 앞서 선조 종의 생식계열 내로 획득될 수 있어, 모든 진화된 종 또는 후손 종이 EVE 대립유전자를 보유함을 입증한다. 반면, "내인성화" 사건 전에 진화하거나 방사된 밀접하게 관련된 종은 빈 유전자좌를 보유한다. 단지 예시적인 예로서, 캥거루과(캥거루 및 관련 종)에서 유전자간 EVE에 의해 점유된 유전자좌는 디델피스 버지아나(Didelphis virgiana)(북아메리카 주머니쥐)를 포함하는 다른 유대류에서 확인될 수 있다. 이러한 비점유된 유전자좌는 다른 분류학적 과에서 확인될 수 있고, EVE 오픈 리딩 프레임이 파괴되더라도, 바이러스 서열은 전능성 생식 세포의 게놈에 삽입된 외래 DNA를 나타내며, 따라서 후보 게놈 세이프-하버 유전자좌를 확인한다. EVE를 GSH 유전자좌로 확인하는 근거는 EVE 유전자좌에서의 삽입이 유기체의 생존력, 기능, 성장, 분화, 및 종분화에 영향을 미치지 않아, 외인성 핵산의 삽입을 가능하게 하는 불활성 부위를 제공한다는 것이다.
일부 구체예에서, EVE는 유전자내 또는 유전자간 EVE이다. 일부 구체예에서, EVE는 유전자내 EVE이다. 일부 구체예에서, EVE는 인트론 또는 엑손이다. 일부 구체예에서, EVE는 인트론이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, GSH 유전자좌는 진화 계통에서 EVE(들)의 삽입을 용인한 엑손 유전자좌이다. 바람직한 구체예에서, GSH는 인트론 또는 유전자간 유전자좌이다. 이러한 유전자좌의 경우, 활발히 전사되는 외인성 핵산의 삽입을 통해 근처 유전자 또는 조절 서열의 기능 및 구조를 파괴할 가능성이 더 낮다.
특정 양태에서, GSH 유전자좌를 확인하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 후생동물 종의 게놈에서 내인성 바이러스 요소(EVE)의 존재 및 위치를 결정하는 단계; (b) EVE에 근접한 유전자간 또는 인트론 경계를 결정하는 단계; 및 (c) GSH 유전자좌로서 EVE를 포함하는 유전자간 또는 인트론 유전자좌를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, EVE의 존재 및 위치는 바이러스 요소에 상동성인 서열에 대해 인 실리코 검색에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 후생동물 종에서 EVE는 바이러스 요소의 서열과 적어도, 약, 또는 최대 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, EVE에 근접한 유전자간 또는 인트론 경계는 EVE에 플랭킹된 서열 및 유전자간 또는 인트론 경계가 알려진 하나 이상의 종의 이종상동성(orthologous) 서열을 정렬함으로써 결정된다. 일부 구체예에서, EVE에 근접한 유전자간 또는 인트론 경계는 유전자간 또는 인트론 경계가 알려진 하나 이상의 종의 이종상동성 서열의 서열과 적어도, 약, 또는 최대 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 GSH 유전자좌가 포유동물 게놈에 있음을 확인하고, 선택적으로 포유동물 게놈은 마우스 게놈, 개 게놈, 돼지 게놈, NHP 게놈, 또는 인간 게놈이다.
일부 구체예에서, EVE는 비-바이러스 숙주 세포의 DNA에 통합된 바이러스 게놈인 프로바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, EVE는 바이러스 게놈의 일부 또는 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, EVE는 레트로바이러스로부터의 프로바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, EVE는 레트로바이러스로부터 유래되지 않는다. 일부 구체예에서, EVE는 비-레트로바이러스로부터의 프로바이러스 또는 바이러스 게놈의 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, EVE는 바이러스 핵산, 바이러스 DNA, 또는 바이러스 RNA의 DNA 카피를 포함한다. 일부 구체예에서, EVE는 바이러스 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, EVE 또는 EVE의 바이러스 핵산은 구조적 또는 비-구조적 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 인코딩한다.
일부 구체예에서, EVE는 레트로바이러스로부터의 바이러스 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, EVE는 비-레트로바이러스, 파보바이러스, 및/또는 써코바이러스로부터의 바이러스 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 파보바이러스는 B19, 마우스의 미세 바이러스(mvm), RA-1, AAV, 부파바이러스, 호코바이러스, 보카바이러스, 및 본원에 기재된 파보바이러스(예를 들어, 표 1A-1D에 열거된 파보바이러스) 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 파보바이러스는 AAV이다. 일부 구체예에서, 바이러스 핵산은 써코바이러스로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 써코바이러스는 돼지 써코바이러스(PCV)(예를 들어, PCV-1, PCV-2)이다. 일부 구체예에서, EVE의 바이러스 핵산은 비-레트로바이러스 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 비-레트로바이러스 핵산은 비-구조적 또는 구조적 바이러스 단백질(예를 들어, 각각 rep(복제) 단백질, 또는 cap(캡시드) 단백질)을 인코딩한다.
일부 구체예에서, EVE 또는 바이러스 핵산은 구조적 또는 비-구조적 바이러스 단백질을 인코딩한다. 일부 구체예에서, EVE 또는 바이러스 핵산은 Rep 및 어셈블리 활성화 비-구조적(NS) 단백질(예를 들어, 바이러스 복제, 캡시드 어셈블리 등에 필요한 것들), 및/또는 구조적(S) 바이러스 단백질(캡시드 단백질, 예를 들어, VP)를 인코딩한다. 이러한 단백질은 비제한적으로 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40을 포함하는 Rep(복제) 단백질; 및 비제한적으로, 예를 들어, AAV로부터의 VP1, VP2 및 VP3을 포함하는 Cap(캡시드) 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구조적 단백질은 또한, 예를 들어, AAV로부터의 구조적 단백질 A, B, 및 C를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, EVE는 문헌[Francois et al. "Discovery of parvovirus-related sequences in an unexpected broad range of animals." Nature Scientific reports 6 (2016)]의 보충 표 S2에 개시된 비-구조적(NS) 단백질 또는 구조적(S) 단백질의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산이다.
일부 구체예에서, 포유동물 게놈에서 GSH를 확인하는 방법은 내인성 바이러스 요소(EVE) 또는 게놈 DNA에서 프로바이러스 핵산 삽입을 확인하기 위해 분류학적 순위 내의 다수의 종에 의해 선조 종으로부터 추론된 게놈 DNA의 서열의 초기 시퀀싱 및/또는 인 실리코 분석을 포함한다.
일부 구체예에서, 후생동물 종의 게놈 서열은 EVE의 존재에 대해 분석된다. 후생동물 종은 고래류, 박쥐목, 토끼목, 및 캥거루과를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 계통발생 분류군으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 후생동물 종은 고래류, 박쥐목, 토끼목, 및 캥거루과로부터 선택된다. 다른 후생동물 종, 예를 들어, 설치류, 영장류, 단공목이 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lui et al, J Virology 2011; 9863-9876, 전문은 본원에 참조로 포함됨]의 도 4A, 4B에 열거된 바와 같은 다른 종이 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, EVE는 파보바이러스과의 바이러스인 파보바이러스로부터의 핵산을 포함한다. 파보바이러스 과는 2개의 아과를 포함한다; 척추동물 숙주를 감염시키는 파보비리나에(Parvovirinae) 및 무척추동물 숙주를 감염시키는 덴소비리나에(Densovirinae). 각 아과는 여러 속으로 세분되었다.
일부 구체예에서, EVE는 다음 속 중 어느 하나의 덴소비리나에로부터의 핵산을 포함한다: 암비덴소바이러스(ambidensovirus), 브레비덴소바이러스(brevidensovirus), 헤판덴소바이러스(hepandensovirus), 이테라덴소바이러스(iteradensovirus), 및 펜스틸덴소바이러스(penstyldensovirus).
일부 구체예에서, EVE는 다음 속 중 어느 하나의 파보비리나에로부터의 핵산을 포함한다: 암도파보바이러스(amdoparvovirus), 아베파보바이러스(aveparvovirus), 보카파보바이러스(bocaparvovirus), 코피파보바이러스(copiparvovirus), 디펜도파보바이러스(dependoparvovirus), 에리트로파보바이러스(erythroparvovirus), 프로토파보바이러스(protoparvovirus), 및 테트라파보바이러스(tetraparvovirus). 일부 구체예에서, EVE는 에리트로파보바이러스 또는 디펜도파보바이러스로부터의 핵산을 포함한다.
일부 구체예에서, EVE는 덴소비리나에의 아과로부터 유래되며 다음 속을 포함한다:
a.
암비덴소바이러스 속. 종 유형: 나비목 암비덴소바이러스 1. 속은 11개의 인식된 종을 포함한다.
b.
브레비덴소바이러스 속. 종 유형: 디프테란 브레비덴소바이러스 1. 속은 2개의 인식된 종을 포함한다.
c.
헤판덴소바이러스 속. 종 유형: 데카포드 덴소바이러스 1. 속은 단일의 인식된 종을 포함한다.
d.
이테라덴소바이러스 속. 종 유형: 나비목 이테라덴소바이러스 1. 속은 5개의 인식된 종을 포함한다.
e.
펜스틸덴소바이러스 속. 종 유형: 데카포드 펜스틸덴소바이러스 1. 속은 단일의 인식된 종을 포함한다.
f.
배정되지 않은 속. 종 유형: 오르소프테란 덴소바이러스 1. 속은 단일의 인식된 종을 포함한다.
일부 구체예에서, EVE는 파보비리나에의 아과로부터 유래되며 다음 속을 포함한다:
a.
암도파보바이러스 속. 종 유형: 육식동물 암도파보바이러스 1. 속은 밍크 및 여우를 감염시키는 4개의 인식된 종을 포함한다.
b.
아베파보바이러스 속. 종 유형: 닭목 아베파보바이러스 1. 속은 칠면조 및 닭을 감염시키는 단일 종을 포함한다.
c.
보카파보바이러스 속. 종 유형: 유제류 보카파보바이러스 1. 속은 영장류를 포함하는 여러 목의 포유동물을 감염시키는 21개의 인식된 종을 포함한다.
d.
코피파보바이러스 속. 종 유형: 유제류 코피파보바이러스 1. 속은 돼지 및 소를 감염시키는 2개의 인식된 종을 포함한다.
e.
디펜도파보바이러스 속. 종 유형: 아데노-관련 디펜도파보바이러스 A. 속은 포유동물, 조류 또는 파충류를 감염시키는 7개의 인식된 종을 포함한다.
f.
에리트로파보바이러스 속. 종 유형: 영장류 에리트로파보바이러스 1. 속은 포유동물, 특히 영장류, 다람쥐 또는 소를 감염시키는 6개의 인식된 종을 포함한다.
g.
프로토파보바이러스 속. 종 유형: 설치류 프로토파보바이러스 1. 속은 영장류를 포함하는 여러 목의 포유동물을 감염시키는 11개의 인식된 종을 포함한다.
h.
테트라파보바이러스 속. 종 유형: 영장류 테트라파보바이러스 1. 속은 영장류, 박쥐, 돼지, 소 및 양을 감염시키는 6개의 인식된 종을 포함한다.
표 1A: 파보비리나에 아과의 에리트로파보바이러스의 예시적인 바이러스
표 1B: 파보비리나에 아과의 예시적인 바이러스
표 1C: 파보비리나에 아과의 프로토파보바이러스의 예시적인 바이러스
표 1D: 파보비리나에 아과의 테트라파보바이러스의 예시적인 바이러스
파보비리나에 아과는 주로 온혈 동물 숙주와 관련이 있다. 이들 중, 파보바이러스 속의 RA-1 바이러스, 에리트로바이러스 속의 B19 바이러스, 및 디펜도바이러스 속의 아데노-관련 바이러스(AAV) 1-9는 인간 바이러스이다. 일부 구체예에서, EVE는 5개의 속으로 인식되는 인간을 감염시킬 수 있는 바이러스로부터의 핵산을 포함한다: 보카파보바이러스(인간 보카바이러스 1-4, HboV1-4), 디펜도파보바이러스(아데노-관련 바이러스; 적어도 12개의 혈청형이 확인되었음), 에리트로파보바이러스(파보바이러스 B19, B19), 프로토파보바이러스(부파바이러스 1-2, BuV1-2) 및 테트라파보바이러스(인간 파보바이러스 4 Gl-3, PARV4 G1-3).
일부 구체예에서, EVE는 파보바이러스로부터 유래되고, 일부 구체예에서 EVE는 AAV(아데노-관련 바이러스)로부터의 핵산을 포함한다. 파보바이러스 과의 구성원인 아데노-관련 바이러스(AAV)는 4.7 킬로베이스(kb) 내지 6 kb의 단일-가닥 선형 DNA 게놈을 갖는 작은 비외피, 정이십면체 바이러스이다. AAV는 디펜도파보바이러스 속에 배정되며, 바이러스가 정제된 아데노바이러스 스톡에서 오염물로 발견되었기 때문에, 원래는 아데노바이러스 관련(또는 위성) 바이러스로 지정되었다. AAV의 수명 주기는 감염 후 AAV 게놈이, 예를 들어, AAVS1과 같은 정의된 유전자좌에서 빈번하게 숙주 세포 염색체 DNA 내로 통합될 수 있는 잠복기, 및 세포가 아데노바이러스 또는 단순 포진 바이러스 및 AAV로 동시-감염되거나, 잠복 감염된 세포를 중복감염시키는 경우, 통합된 게놈이 후속하여 구제되고, 복제되고, 감염성 바이러스로 패키징되는 용해기를 포함한다. 혈청학적 감시 분석에 기초하여, AAV에 대한 노출은 인간 및 다른 영장류에서 매우 만연하며 여러 혈청형이 다양한 조직 샘플로부터 분리되었다. 혈청형 2, 3, 6, 및 13은 배양된 인간 세포에서 발견되었고, AAV5는 임상 표본으로부터 분리된 반면, AAV 혈청형 1, 4, 및 7-12는 비인간 영장류(NHP) 조직 샘플 또는 세포로부터 분리되었다. 2013년 현재, 13개의 AAV 혈청형이 기술되었다. 문헌[Weitzman, et al. (2011). "Adeno-Associated Virus Biology." In Snyder, R. O.; Moullier, P. Adeno-associated virus methods and protocols. Totowa, NJ: Humana Press. ISBN 978-1- 61779-370-7; Mori S, et al., (2004). "Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein." Virology 330 (2): 375-83)].
일부 구체예에서, EVE는 표 1A-1D에 열거된 임의의 파보바이러스로부터의 핵산 또는 핵산의 일부; 또는 표 1A-1D에 열거된 임의의 파보바이러스로부터의 핵산 또는 핵산의 일부와 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일부 구체예에서, EVE는 AAV의 임의의 혈청형으로부터의 핵산 또는 핵산의 일부; 또는 AAV의 임의의 혈청형으로부터의 핵산 또는 핵산의 일부와 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, AAV는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 AAV13으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, EVE는 B19, 마우스의 미세 바이러스(MVM), RA-1, AAV, 부파바이러스, 호코바이러스, 보카바이러스, 또는 표 1A-1D에 열거된 임의의 바이러스, 또는 이의 변이체, 즉, 적어도 또는 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 갖는 바이러스로부터 선택된 임의의 군으로부터의 핵산 서열을 포함한다.
방법 3: 이종상동성 유기체에서 GSH 유전자좌를 확인하는 방법
특정 양태에서, 이종상동성 유기체에서 GSH 유전자좌를 확인하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 종 A에서 GSH 유전자좌를 확인하는 단계(예를 들어, 기능적 방법(방법 1), 또는 EVE를 활용하는 방법(방법 2) 사용); (b) (i) 종 A에서 GSH 유전자좌에 근접한 적어도 하나의 시스-작용 요소 및 (ii) 종 B에서 상응하는 시스-작용 요소(들)의 위치를 결정하는 단계; 및 (c) 종 B에서 유전자좌를 GSH 유전자좌로서 확인하는 단계로서, 종 B에서 상기 유전자좌와 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리가 종 A에서 GSH 유전자좌와 상응하는 시스-작용 요소(들) 사이의 거리에 실질적으로 비례하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 종 A 및/또는 종 B에서 GSH 유전자좌에 근접한 적어도 하나의 시스-작용 요소는 알려져 있을 수 있거나, 대안적으로, 이러한 요소의 위치는 서열 분석에 의해(예를 들어, 하나 이상의 유기체에서 GSH 유전자좌 및 이들의 이종상동성 서열에 플랭킹된 서열을 정렬함에 의해, 여기서 GSH 유전자좌에 근접한 적어도 하나의 시스-작용 요소는 공지되어 있음) 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 종 A 또는 종 B에서 적어도 하나의 시스-작용 요소는 적어도 하나의 이종상동성 유기체에서 알려진 시스-작용 요소와 적어도 또는 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 종 A에서 GSH 유전자좌에 근접한 적어도 하나의 시스-작용 요소는 종 B에서 GSH 유전자좌에 근접한 적어도 하나의 시스-작용 요소와 적어도 또는 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일하다.
대안적으로, 당업자는 실험에 의해 GSH 유전자좌에 근접한 적어도 하나의 시스-작용 요소를 결정하는 방법(예를 들어, RNA seq에 의해 또는 cDNA를 클로닝함으로써 RNA 서열을 결정하고; 이를 게놈 서열과 비교하여 스플라이싱 공여자 부위, 스플라이싱 수용자 부위, 폴리아데닐화 부위 등을 맵핑함)을 이해할 것이다.
많은 시스-작용 요소가 당 분야에 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 시스-작용 요소는 스플라이싱 공여자 부위, 스플라이싱 수용자 부위, 폴리피리미딘 트랙, 폴리아데닐화 신호, 인핸서, 프로모터, 종결자, 스플라이싱 조절 요소, 인트론 스플라이싱 인핸서, 및 인트론 스플라이싱 사일런서로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 시스-작용 요소는 2개 이상의 시스-작용 요소를 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 시스-작용 요소는 2개의 시스-작용 요소를 포함하고; 제1 시스-작용 요소는 GSH 유전자좌의 상류(즉, 5'측)에 위치하고, 제2 시스-작용 요소는 GSH 유전자좌의 하류(즉, 3'측)에 위치한다.
일부 구체예에서, 종 B에서 2개의 시스-작용 요소 사이의 거리에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소와 GSH 유전자좌 사이의 거리는 종 A에서 2개의 시스-작용 요소 사이의 거리에 대한 상응하는 시스-작용 요소와 GSH 유전자좌 사이의 거리에 실질적으로 비례한다.
일부 구체예에서, 종 B에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리는 종 A에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리의 적어도, 약, 또는 최대 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930%, 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990%, 또는 1000%이다.
일부 구체예에서, 종 B에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리는 종 A에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리의 20% 이상 내지 500% 이하이다.
일부 구체예에서, 종 B에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리는 종 A에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리의 80% 이상 내지 250% 이하이다.
일부 구체예에서, 종 B에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리는 종 A에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리의 90% 이상 내지 110% 이하이다.
일부 구체예에서, 방법은 포유동물 게놈에서 GSH 유전자좌를 확인한다. 일부 구체예에서, 포유동물 게놈은 마우스 게놈, 개 게놈, 돼지 게놈, NHP 게놈, 또는 인간 게놈이다.
상기 나타낸 바와 같이, GSH 유전자좌를 확인하는 임의의 한 방법은 임의의 다른 방법에서의 단계 및/또는 고려 사항을 추가로 포함할 수 있고, 즉, 본원에 기재된 임의의 수의 방법은 임의의 순서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 방법 1에 의한 GSH 유전자좌의 기능적 확인은 방법 2의 단계 및/또는 고려 사항(예를 들어, EVE의 확인)을 추가로 포함할 수 있다. 방법 1은 방법 3의 단계 및/또는 고려 사항(예를 들어, 이종상동성 유기체에서 GSH 유전자좌의 확인)을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 방법 2는 방법 3의 단계 및/또는 고려 사항을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법 1은 방법 2 및 방법 3의 단계 및/또는 고려 사항을 추가로 포함할 수 있다.
GSH 유전자좌 또는 GSH의 핵산 영역을 선택하기 위한 선택적 기준
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 GSH는 공지된 유전자 또는 게놈 조절 서열로부터 먼 유전자외 부위 또는 유전자간 부위, 또는 파괴가 허용되는 것으로 간주되는 유전자내 부위(유전자 내)이다.
일부 구체예에서, GSH는 인트론 또는 엑손 유전자 서열을 포함하는 유전자내 DNA를 포함하는 유전자를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 기능적 시험관내 및 생체내 분석을 사용하여 확인된 GSH를 검증하는 것 외에도, 후보 GSH는, 예를 들어, 비제한적으로, 다음 중 임의의 하나 이상을 평가하는 후보 GSH가 특정 기준을 충족하는지 여부를 결정하는 생물정보학을 사용하여 선택적으로 평가될 수 있다: 암 유전자 또는 원종양유전자에 대한 근접성, 유전자 내의 위치 또는 유전자의 5' 말단 근처의 위치, 선택된 하우스키핑 유전자에서의 위치, 유전자외 영역에서의 위치, mRNA에 대한 근접성, 초-보존 영역에 대한 근접성 및 긴 비코딩 RNA 및 다른 이러한 게놈 영역에 대한 근접성. 예로서, 이전에 확인된 GSH AAVS1(아데노-관련 바이러스 통합 부위 1)은 염색체 19 상에서 아데노-관련 바이러스 공통 통합 부위로서 확인되었고, 염색체 19(위치 19q13.42)에 위치하며, 주로 시험관내에서 AAV로 감염된 배양된 인간 세포주의 게놈에서 야생형 AAV의 반복적으로 복구된 통합 부위로서 확인되었다. AAVS1 유전자좌에서의 통합은 명확하게 기술되지 않은 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자 포스파타제 1 조절 서브유닛 12C(PPP1R12C; MBS85로도 공지됨)를 방해한다. PPP1R12C의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자를 파괴하는 유기체적 결과는 현재 알려져 있지 않다. AAVS1에서 표적화된 트랜스진을 보유하는 인간 및 마우스 다능성 줄기 세포에서는 총체적 이상 또는 분화 결손이 관찰되지 않았다. AAVS1 부위의 이전 평가는 전형적으로 표적화된 대립유전자의 기능성을 보존하고 비-표적화된 세포에서와 유사한 수준으로 PPP1R12C의 발현을 유지하는 Rep-매개 표적화를 사용하였다. AAVS1은 또한 iPSC 또는 CD34+ 세포로의 ZFN-매개 재조합을 사용하여 평가되었다.
원래 특성화된 바와 같이, AAVS1 유전자좌는 >4 kb이고 염색체 19 뉴클레오티드 55,113,873-55,117,983(인간 게놈 어셈블리 GRCh38/hg38)로서 확인되며 단백질 포스파타제 1 조절 서브유닛 12C를 인코딩하는 PPP1R12C 유전자의 엑손 1과 중첩된다. 이러한 >4 kb 영역은 매우 G+C 뉴클레오티드 함량이 풍부하고, 특히 유전자-풍부 염색체 19의 유전자-풍부 영역이며(문헌[Sadelain et al, Nature Revs Cancer, 2012; 12; 51-58]의 도 1A 참조), 일부 통합된 프로모터는 실제로 이웃 유전자를 활성화하거나 시스-활성화할 수 있으며, 그 결과는 상이한 조직에서 현재 알려져 있지 않다.
AAVS1 GSH는 잠복 감염된 클론 세포주로부터 생성된 재조합 박테리오파지 게놈 라이브러리(Detroit 6 클론 7374 IIID5)(Kotin and Bems 1989)를 갖는 잠복 감염된 인간 세포주에서 AAV 프로바이러스 구조를 특성화함으로써 확인되었다. Kotin 등은 프로바이러스에 플랭킹된 비-바이러스성 세포 DNA를 분리하였고 "좌측" 및 "우측" 플랭킹 DNA 단편의 서브세트를 프로브로 사용하여 독립적으로 유래된 잠복 감염된 클론 세포주의 패널을 스크리닝하였다. 클론 분리물의 대략 70%에서, AAV DNA가 세포-특이적 프로브로 검출되었다(Kotin et al. 1991; Kotin et al. 1990). 사전-통합 부위의 서열 분석으로 AAV 역 말단 반복부의 일부와 거의 상동성임이 확인되었다(Kotin, Linden, and Bems 1992). 특징적인 중단된 회문은 없지만, AAVS1 유전자좌는 말단 분해 부위로도 지칭되는 p5 Rep 단백질 결합 및 니킹(nicking)을 유지하였다(Chiorini et al. 1994; Chiorini et al. 1995; Im and Muzyczka 1989, 1990, 1992). 흥미롭게도, 인간 이종상동체(orthologue)는 DNA 합성의 p5 Rep 시험관내 기원으로서 기능하므로, AAVS1 통합이 Rep-의존적 과정이라는 초기 추측을 뒷받침한다(Kotin et al., 1990; Kotin et al., 1992; Urcelay et al. 1995; Weitzman et al. 1994). 시스의(in cis) Rep 결합 요소가 AAV 통합에 필요하고 표적화된 비-상동성 재조합 과정에서 Rep 단백질 관여에 대한 추가 지원을 제공하는 것으로 나타났다(Urabe, et al., Linden, Bems). 이러한 요소는 Rep-매개 DNA 합성의 최소 기원을 RNA-프라이머 독립적인 가닥-변위 DNA(리딩 가닥) 합성을 가능하게 하는 Rep 결합 및 니킹 부위의 배열로서 정의한다.
야생형 아데노-관련 바이러스는 증식형 또는 잠복 감염을 유발할 수 있으며, 여기서 야생형 바이러스 게놈은 배양된 세포에서 인간 염색체 19 상의 AAVS1 유전자좌에 빈번하게 통합된다(Kotin and Bems 1989; Kotin et al. 1990). AAV의 이러한 독특한 양태는 iPSC 유전자 변형을 위한 최초의 소위 "세이프-하버" 중 하나로 이용되었다. 원래 정의된 바와 같은(Kotin et al., 1991) AAVS1은 뉴클레오티드 55,113,873-55,117,983(인간 게놈 어셈블리 GRCh38/hg38) 사이의 염색체 19에 위치하고, 단백질 포스파타제 1 조절 서브유닛 12C를 인코딩하는 PPP1R12C 유전자의 엑손 1과 중첩된다. 흥미롭게도, PPP1R12C 엑손 1, 5' 비번역 영역은 하기 서열 내에 표시된 DNA 합성의 기능적 AAV 기원을 함유한다(Urcelay et al. 1995): GCTC Rep-결합 모티프 및 말단 분해 부위(GGTTGG)는 굵은 폰트로 표시된다: 55,117,600 -
놀랍게도, 인간 염색체 19 AAVS1 세이프-하버는 단백질 포스파타제 조절 1 조절 서브유닛 12C를 인코딩하는 유전자인 PPP1R12C의 엑손 영역 내에 있다. 외래 DNA의 삽입 및 발현이 내인성 유전자의 발현을 방해할 가능성이 있기 때문에 엑손 통합 부위의 선택은 명백하지 않고 아마도 반직관적이다. 명백하게, 이 유전자좌로의 AAV 게놈의 삽입은 세포 생존력 또는 iPSC 분화에 악영향을 미치지 않는다(DeKelver et al. 2010; Wang et al. 2012; Zou et al. 2011). 통합은 둘 모두의 재조합 기질 상에서 트랜스로 AAV Rep 단백질의 존재 및 시스로 AAV DNA 합성의 최소 기원을 필요로 하는 비-상동성 재조합에 의해 발생하며, 이는 이후 AAV 및 게놈 DNA의 Rep-단백질 매개 병치(juxtapositioning)를 가능하게 한다(Weitzman et al. 1994).
DNA 합성의 Rep-의존적 최소 기원은 AAV2 trs AGT|TGG 및 AAV5 trs AGTG|TGG(수직선은 니킹 위치를 나타냄)로 예시되는 바와 같이 p5 Rep 단백질 결합 요소(RBE)와 적절하게 위치된 말단 분해 부위(trs)로 구성된다. 또한, 세포 단백질 복합체의 관여가 추론되었지만 아직 확인되거나 특성화되지 않았다.
이러한 바이러스 복제 요소는 매우 효율적으로 기능해야 하며, 그렇지 않으면 복제 적합성의 부족으로 인해 바이러스가 멸종되는 반면, AAVS1의 작은, 비-코딩, 약 35 bp 요소는 숙주에서 기능을 갖지 않을 수 있다. 그러나, AAVS1 유전자좌는 체세포 세이프 하버로서 확립되었고, 전능성 또는 생식계열 세포에서 유전자좌의 파괴는 개체발생을 방해할 수 있다.
AAVS1 유전자좌는 고도로 보존된 PPP1R12C 유전자의 5' UTR 내에 있다. DNA 합성의 Rep-의존적 최소 기원은 인간, 침팬지, 및 고릴라 PPP1R12C 유전자의 5' UTR에서 보존된다. 그러나, 설치류 종(마우스 및 래트)에서, 치환은 인접한 비-코딩 DNA와 비교하여 바람직한 말단 분해 부위 내에서 증가된 빈도로 발생한다. 선택되거나 획득된 유전자형보다는 우발적인 유전자형이 5' UTR에서 특정 서열의 다른 종의 효율에 영향을 미칠 수 있다.
일부 구체예에서, 본원의 구체예에 따라 확인된 후보 GSH는 최소의 표적외 활성으로 고도로 특이적 뉴클레아제에 접근 가능하면서, 제한된 표적외 활성을 갖고 유전독성 또는 외래 DNA의 통합시 삽입 종양형성을 야기할 위험을 최소화한 안전하고 표적화된 유전자 전달이 달성될 수 있는 경우 GSH의 기준을 충족시키는 것으로 확인된다.
GSH는 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 및 생체내 검정에 기초하여 검증되지만, 일부 구체예에서, GSH가 특정 기준에 속하는지 여부를 결정하는 것에 기초하여 추가의 선택이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본원에서 확인된 GSH 유전자좌는 엑손, 인트론 또는 불필요한 유전자의 비번역 영역에 위치한다. 분석은 종양에서 프로바이러스의 통합 부위가 일반적으로 전사의 시작점 근처, 상류 또는 바로 전사 단위 내, 종종 5' 인트론 내에 있음을 보여준다. 이러한 위치의 프로바이러스는 바이러스 프로모터 또는 바이러스 인핸서 삽입을 통해 전사 속도를 증가시킴으로써 발현 조절 장애를 일으키는 경향이 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에서 확인된 GSH 유전자좌는 암 유전자에 근접하지 않은 것에 기초하여 선택된다. 일부 구체예에서, GSH는 암 유전자의 전사의 출발점 근처, 예를 들어, 암 유전자 또는 원암유전자의 5' 인트론 또는 상류에 위치한 통합 부위를 갖지 않는다. 이러한 암 유전자는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌[Sadelain et al., Nature Revs Cancer, 2012; 12; 51-58, 전문은 본원에 참조로 포함됨]의 표 1에 기술되어 있다. 암과 관련된 유전자의 예시적인 데이터베이스는 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Atlas 유전자 세트, CAN 유전자 세트, CIS(RTCGD) 유전자 세트, 및 아래 표 2에 기재된 것들이다.
표 2: 암과 관련된 유전자의 예시적인 데이터베이스
*유전자 목록 및 원본 출처에 대한 링크는 The Bushman lab 암 유전자 목록 웹사이트에서 이용 가능하다(World Wide Web at bushmanlab.org/links/genelists 참조). CAN, 암; CIS, 공통 삽입 부위; 마지막 컬럼의 참조는 Sadelain et al., Nature Revs Cancer (2012) 12:51-58의 참조 번호를 나타낸다.
일부 구체예에서, 본원에서 확인된 GSH 유전자좌는 (i) 유전자 전사 단위의 외부; (ii) 임의의 유전자의 5' 말단으로부터 5-50 킬로베이스(kb) 떨어져 위치함; (iii) 암-관련 유전자로부터 5-300 kb 떨어져 위치함; (iv) 임의의 확인된 microRNA로부터 5-300 kb 떨어져 위치함; 및 (v) 초-보존 영역 및 긴 비코딩 RNA 외부로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다. 일부 구체예에서, 본원에서 확인된 GSH 유전자좌는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: (i) 유전자 전사 단위의 외부; (ii) 임의의 유전자의 5' 말단으로부터 >50 킬로베이스(kb)에 위치함; (iii) 암-관련 유전자로부터 >300 kb에 위치함; (iv) 임의의 확인된 microRNA로부터 >300 kb에 위치함; 및 (v) 초-보존 영역 및 긴 비코딩 RNA 외부. 형질도입된 유도된 다능성 줄기 세포에서의 렌티바이러스 벡터 통합의 연구에서, 5,000개 이상의 통합 부위를 분석한 결과 통합의 약 17%가 세이프 하버에서 발생한 것으로 밝혀졌다. 이러한 세이프 하버에 통합된 벡터는 내인성 유전자 발현을 교란시키지 않고 이들의 트랜스진으로부터 치료 수준의 β-글로빈을 발현할 수 있었다.
상동성 및 서열 정렬
본원에서 사용되는 상동성은 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역 사이 또는 2개의 상이한 핵산 가닥의 영역 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성의 백분율을 지칭한다. 두 영역 모두의 뉴클레오티드 잔기 위치가 동일한 뉴클레오티드 잔기에 의해 점유될 때, 해당 영역은 그 위치에서 상동성이다. 각 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기 위치가 동일한 잔기에 의해 점유되는 경우 첫 번째 영역은 두 번째 영역과 상동성이다. 두 영역 사이의 상동성은 동일한 뉴클레오티드 잔기가 점유하는 두 영역의 뉴클레오티드 잔기 위치의 비율로 표현된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 5'-ATTGCC-3'를 갖는 영역 및 뉴클레오티드 서열 5'-TATGGC-3'를 갖는 영역은 50% 상동성을 공유한다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하여, 각 부분의 뉴클레오티드 잔기 위치의 적어도 약 50% 및 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%는 동일한 뉴클레오티드 잔기에 의해 점유된다. 보다 바람직하게는, 각 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기 위치는 동일한 뉴클레오티드 잔기에 의해 점유된다.
핵산의 경우, 용어 "실질적인 상동성"은 최적으로 정렬되고 비교될 때, 2개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하여, 뉴클레오티드의 적어도 약 60%에서, 일반적으로 뉴클레오티드의 적어도 약 적어도 또는 약 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 및 보다 바람직하게는 적어도 약 97%, 98%, 99% 이상에서 동일함을 나타낸다. 대안적으로, 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건 하에 가닥의 보체에 하이브리드화될 때 실질적인 상동성이 존재한다.
두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치 수의 함수이다(즉, % 동일성= 동일한 위치 수/전체 위치 수 x 100). 두 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적인 예에 기술된 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(GCG 회사 웹사이트의 월드 와이드 웹에서 이용 가능)의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. CMP 매트릭스 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 테이블, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers and W. Miller(CABIOS, 4:11 17 (1989))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(GCG 회사 웹사이트의 월드 와이드 웹에서 이용 가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman and Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444 453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드길이=12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389 3402]에 기재된 바와 같은 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(NCBI 웹사이트의 월드 와이드 웹에서 이용 가능).
시험관내 및 생체내 검정을 이용한 GSH의 검증
이론으로 제한되지는 않지만, 유용한 GSH 영역은 원하는 수준의 벡터-인코딩된 단백질 또는 비-코딩 RNA를 생성하기에 충분한 트랜스진 발현을 허용해야 하고, 세포를 악성 형질전환시키거나 세포 기능을 크게 부정적으로 변경시키지 않아야 한다.
본원에 개시된 후보 GSH 영역을 검증하기 위한 방법 및 조성물은 생물정보학, 시험관내 유전자 발현 검정, 근처 유전자를 질의하기 위한 시험관내 및 생체내 발현 어레이, 이종발생성 이식 모델에서 시험관내-지시된 분화 또는 생체내 재구성 검정, 신테닉 영역의 트랜스제네시스 및 개인으로부터의 환자 데이터베이스의 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 GSH 유전자좌를 확인하기 위한 방법 중 임의의 하나 또는 조합은 적어도 하나의 시험관내, 생체외, 및/또는 생체내 방법을 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, GSH의 검증은 도입된 유전자의 생식계열 통합이 없음을 확인하여 유전자 요법 벡터의 생식계열 전달이 있을 위험을 감소시키기 위해 결정된다.
표적 유전자좌 또는 후보 GSH의 확인 후, 일련의 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여 안전성 및 특히 발암 가능성의 부재를 확립할 수 있다. 시험관내 발암성 검정은 이전의 유전자 요법 T-세포 생성물 특성화에서의 경험에 기초할 수 있다.
일부 구체예에서, GSH는 다수의 검정에 의해 검증될 수 있다. 일부 구체예에서, 기능적 검정은 다음 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된다: (a) 인간 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 삽입 및 시험관내 마커 유전자 발현의 측정; (b) 전구 세포 또는 줄기 세포의 이종상동성 유전자좌로의 마커 유전자의 삽입 및 세포를 면역고갈된 마우스에 생착 및/또는 모든 발달 계통에서 마커 유전자 발현의 평가; (c) 조혈 CD34+ 세포를 말단 분화된 세포 유형으로 분화, 여기서 조혈 CD34+ 세포는 후보 GSH 유전자좌에 삽입된 마커 유전자를 가짐; 또는 (d) 마우스의 게놈 DNA가 후보 GSH 유전자좌에 삽입된 마커 유전자를 갖는 트랜스제닉 녹-인 마우스의 생성, 여기서 마커 유전자는 조직 특이적 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결됨.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 시험관내, 생체외, 및/또는 생체내 검정은 (a) 세포(예를 들어, 인간 세포)의 유전자좌로의 마커 유전자의 새로운 표적화된 삽입 및 (i) 세포 생존력, (ii) 삽입 효율 및/또는 (iii) 마커 유전자 발현의 결정;
(b) 전구 세포 또는 줄기 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 시험관내 분화 및 (i) 모든 발달 계통에서의 마커 유전자 발현, 및/또는 (ii) 마커 유전자의 삽입이 상기 전구 세포 또는 줄기 세포의 분화에 영향을 미치는지 여부의 결정;
(c) 전구 세포 또는 줄기 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 세포를 면역-고갈된 마우스에 생착 및 생체내 모든 발달 계통에서 마커 유전자 발현의 평가;
d) 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 전체 세포 전사 프로파일의 결정(예를 들어, RNAseq 또는 마이크로어레이 사용); 및
e) 마우스의 게놈 DNA가 유전자좌에 삽입된 마커 유전자를 갖고, 선택적으로 마커 유전자가 조직 특이적 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 트랜스제닉 녹-인 마우스의 생성으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 검증 검정에서 사용되는 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 세포, 전구 세포 또는 줄기 세포는 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 및 간 전구 세포로부터 선택된다.
GSH를 검증하기 위한 예시적인 시험관내 검정
일부 구체예에서, GSH를 검증하기 위한 기능적 검정은 인간 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 삽입 및 시험관내 마커의 발현 결정을 포함한다. 일부 구체예에서, 마커 유전자는 상동성 재조합에 의해 도입된다. 일부 구체예에서, 마커 유전자는 프로모터, 예를 들어, 항시적 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 마커 유전자의 유전자 발현의 결정 및 정량화는 당업자에게 통상적으로 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 이를 테면, RT-PCR, Affymetrix 유전자 어레이, 전사체 분석을 이용한 유전자 발현; 및/또는 단백질 발현 분석(예를 들어, 웨스턴 블롯) 등에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 이웃 유전자 발현에 대한 통합된 마커 트랜스진의 효과는 시험관내 배양된 세포에서 결정된다.
일부 구체예에서, 마커 유전자는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포 또는 마우스 세포 또는 래트 세포에 도입된다. 일부 구체예에서, 세포는 세포주, 예를 들어, 섬유모세포 세포주, HEK293 세포 등이다. 일부 구체예에서, 검정에 사용되는 세포는 다능성 세포, 예를 들어, iPSC 또는 클로닝 가능한 세포 유형, 예를 들어, T 림프구이다. 일부 구체예에서, 일차 세포를 포함하는 다양한 상이한 세포 집단으로 삽입된 마커 유전자의 유전자 발현이 평가된다. 일부 구체예에서, 도입된 마커 유전자를 갖는 iPSC는 상이한 계통에서 마커 유전자의 일관되고 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 확인하기 위해 다수의 계통으로 분화된다.
일부 구체예에서, 마커 유전자는, 예를 들어, CD34+ 세포와 같은 조혈 세포의 게놈에서 후보 GSH 유전자좌에 삽입되고, 상이한 말단 분화된 세포 유형으로 분화된다.
일부 구체예에서, 후보 GSH에 도입된 마커 유전자를 갖는 세포 집단은 가능한 조직 기능장애 및/또는 형질전환에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, CD34+ 세포 또는 iPSC는 정상 계통 분화로부터 벗어난 비정상적인 분화, 및/또는 암의 위험을 나타내는 증가된 증식에 대해 평가된다.
일부 구체예에서, 근접한 유전자의 유전자 발현 수준이 결정된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 통합된 마커 유전자가 주변 또는 이웃 유전자 발현의 비정상적인 유전자 발현, 또는 다른 조절 장애, 예를 들어, 이웃 유전자의 유전자 발현의 하향조절 또는 상향조절을 초래하는 경우, 후보 유전자좌는 적합한 GSH로서 선택되지 않는다. 일부 구체예에서, 이웃 유전자의 발현 수준에서 변화가 검출되지 않으면, 후보 유전자좌는 GSH로서 지정되거나 선택된다. 일부 구체예에서, 플랭킹, 근접 또는 이웃 유전자의 유전자 발현이 결정되고, 여기서 근접한 또는 이웃 유전자는 마커 유전자의 삽입 부위(즉, 삽입 유전자좌의 5' 또는 3'에 플랭킹된 유전자 또는 RNA 서열)로부터 약 350kb, 또는 약 300kb, 또는 약 250kb 또는 약 200kb 또는 약 100kb, 또는 10-100kb, 또는 약 1-10kb 또는 1kb 미만의 거리(상류 또는 하류) 내에 있을 수 있다.
일부 구체예에서, 표적화된 후보 GSH 유전자좌의 후성적 특징 및 프로파일은 마커 유전자의 도입이 GSH의 후성적 서명(예를 들어, 히스톤 변형, DNA 변형, 진정염색질 또는 이질염색질 단백질의 결합 등), 및/또는 통합 부위의 약 350 kb 상류 및 하류 내의 주변 또는 이웃 유전자에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 마커 유전자의 도입 전후에 평가된다.
일부 구체예에서, 후보 GSH 유전자좌로의 마커 유전자의 삽입은 유전자좌가 상이한 통합된 전사 단위를 수용할 수 있는지를 알아보기 위해 평가된다. 일부 구체예에서, 유전자좌 제어 영역, 매트릭스 부착 영역 및 절연체 요소를 포함하는, 프로모터, 인핸서, 및 염색질 결정인자를 포함하는 다양한 상이한 유전 요소에 작동 가능하게 연결된 마커 유전자의 유전자 발현 뿐만 아니라, 일부 구체예에서, 마커 유전자의 삽입 부위로부터 약 350kb, 또는 약 300kb, 또는 약 250kb 또는 약 200kb 또는 약 100kb, 또는 10-100kb, 또는 약 1-10kb 또는 1kb 미만의 거리(상류 또는 하류) 내에 있는 이웃 유전자의 유전자 발현이 평가된다.
일부 구체예에서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않은 마커 유전자는 임의의 프로모터 및/또는 이웃 유전자의 다른 조절 요소의 효과를 평가하기 위해 GSH 유전자좌에 삽입된다.
일부 구체예에서, 본원에서 입증된 바와 같이, 후보 GSH 유전자좌로의 마커 유전자의 삽입을 평가하여 이것이 전체 전사 패턴을 변화시키는지 확인한다. 이러한 분석은, 예를 들어, DNA 또는 RNA의 차세대 시퀀싱(NGS), Affymetrix 유전자 어레이 등에 의해 달성될 수 있다.
일부 구체예에서, GSH 유전자좌가 특정 유전자와 관련된 경우, 그 유전자의 녹-다운은 유전자가 필요하지 않거나 필수적이지 않다는 것을 검증하기 위해 평가될 수 있다. 예시적인 예로서, 본원에 개시된 바와 같이, SYNTX-GSH2는 여러 상이한 코딩 유전자 및 RNA 유전자에 의해 둘러싸여 있다. 따라서, 일부 구체예에서, SYNTX-GSH2의 RNAi 녹-다운에 대한 세포 기능 및 이웃 세포의 유전자 발현에 대한 효과가 평가될 수 있고, GSH 유전자좌에서 후보 유전자의 녹-다운이 유의한 효과를 갖지 않는 경우, 유전자는 GSH로서 검증될 수 있다. 또한, GSH 유전자를 녹-다운시키기 위해 RNAi를 사용한 시험관내 검정은 종종 엔도뉴클레아제-매개 표적화의 경우에서와 같이, 특히 이중 대립유전자 파괴로 인한 유전자의 분배성을 결정하는데 중요하다.
일부 구체예에서, 암 화학요법 세포독성제는 유전독성 및 발암 가능성을 갖기 때문에, 이러한 유형의 약물의 전임상 평가를 위한 표준 시험관내 연구는 또한 GSH 유전자좌 파괴를 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 및 세포 신호전달 없이 성장하는 일차 T 세포의 능력은 발암성 형질전환의 특징이다.
예를 들어, 일부 구체예에서, 마커 유전자를 T-세포, 예를 들어, SB-728-T 세포의 후보 GSH 유전자좌에 도입하고 사이토카인 지원 없이 몇 주 동안 배양하여 정상적인 세포 사멸이 발생함을 입증할 수 있다.
다른 구체예에서, 고전적인 생물학적 세포 형질전환 검정은 섬유모세포의 고정-독립적 성장이고, 발암에 대한 엄격한 시험이다. 따라서, 일부 구체예에서, 마커 유전자는 섬유모세포의 표적 GSH 유전자좌에 삽입되고 고정-독립적 성장에 대해 평가될 수 있다. 종양형성을 평가하기 위한 다른 시험관내 검정 또는 시험, 예를 들어, 마우스 소핵 시험, 고정 독립적 성장, 및 마우스 림프종 TK 유전자 돌연변이 검정이 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 마커 유전자는 임의의 형광 리포터 유전자, 예를 들어, GFP, RFP 등 뿐만 아니라 생물발광 리포터 유전자로부터 선택된다. 예시적인 마커 유전자가 본원에 기재된다.
일부 구체예에서, 마커 유전자 또는 리포터 유전자 서열은 β-락타마제, β-갈락토시다제(LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 및 당 분야에 잘 알려진 다른 것들을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 리포터 서열은 이들의 발현을 유도하는 조절 요소와 결합되는 경우, 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 다른 분광 검정, 형광 활성화 세포 분류 검정 및 면역학적 검정, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 측정(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 면역조직화학을 포함하는 통상적인 수단에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 운반하는 벡터의 존재는 β-갈락토시다제 활성에 대한 검정에 의해 검출된다. 일부 구체예에서, 마커 유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제인 경우, 신호를 운반하는 벡터는 루미노미터에서 각각 가시광선 흡광도 또는 광 생산에 기초하여 비색적으로 측정될 수 있다. 이러한 리포터는, 예를 들어, 핵산의 조직-특이적 표적화 능력 및 조직 특이적 프로모터 조절 활성을 검증하는데 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, 생물정보학을 사용하여 GSH를 검증할 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Papapetrou et al., 2011, Na. Biotechnology, 29; 73-78, 전문은 본원에 참조로 포함됨]에 기술된 바와 같이, 환자-유래 자가 iPSC의 데이터베이스 서열을 검토한다.
또한, GSH 및 GSH의 표적 통합 부위가 확인되면, 생물정보학 및/또는 웹-기반 도구를 사용하여 잠재적인 표적외 부위를 확인할 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas9 표적을 설계하고 표적외 부위를 예측하기 위한 게놈-전체 뉴클레아제 표적외 부위의 예측 보고서(PROGNOS, World Wide Web at baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/prognos.html) 및 CRISPOR(World Wide Web at crispor.tefor.net/)와 같은 생물정보학 도구. CRISPOR 및 PROGNOS는 ZFN 및 TALEN에 대한 잠재적인 게놈-전체 뉴클레아제 표적 부위의 보고서를 제공할 수 있다. 특정 표적 부위가 확인되면, 프로그램은 잠재적인 표적외 부위의 순위를 매기는 목록을 제공할 수 있다.
GSH를 검증하기 위한 생체내 검정
일부 구체예에서, GSH를 기능적으로 검증하기 위한 생체내 검정이 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, GSH의 생체내 평가는 신테닉 영역으로 통합된 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 마우스에서 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, GSH를 검증하기 위한 생체내 기능적 검정은 iPSC의 유전자좌에 마커 유전자를 삽입하고 면역결핍 마우스에 이식하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, iPSC에 마커 유전자를 삽입하고 변형된 iPSC를 면역결핍 마우스에 이식하고 일정 기간에 걸쳐 평가한다. 이러한 생체내 검정은 비정형 또는 비정상적인 분화(예를 들어, 조혈 형질전환의 변화 및/또는 조혈의 클론 왜곡)를 포함하는 임의의 유전독성 사건을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 종양원성 세포의 증식물을 드문 사건으로부터 평가할 수 있다.
조혈 세포를 갖는 면역결핍 마우스에서의 이러한 생체내 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 문헌[Zhou, et al. "Mouse transplant models for evaluating the oncogenic risk of a self-inactivating XSCID lentiviral vector." PloS one 8.4 (2013): e62333, 전문은 본원에 참조로 포함됨]에 기술되어 있으며, 여기서 도입된 변형된 조혈 세포 또는 iPSC로부터의 악성종양 발병률은 대조군 또는 GSH의 표적 유전자좌에 마커 유전자가 도입되지 않은 세포와 비교하여 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, 조혈 악성종양이 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, 수용자 면역결핍 마우스에서 말초 혈액 세포의 계통 분포를 평가하여 골수 왜곡 및 삽입 형질전환의 신호 또는 GSH 유전자좌에 삽입된 마커 유전자로 인한 악영향을 결정한다.
일부 구체예에서, 수용자 마우스 균주는 면역결핍이기 때문에, 종양이 이러한 마우스에서 발생하는 경우, 이러한 종양을 특성화하여 이것이 인간 기원인지를 평가할 수 있다. 종양이 인간 기원인 경우, GSH 유전자좌에서 마커 유전자의 삽입 또는 플랭킹 RNA 서열 또는 유전자와 같은 표적 또는 표적외 부위의 임의의 유전자 발현 조절 장애(상향조절 또는 하향조절)와 관련하여 이들의 클론성을 추가로 평가하는 것이 필요할 것이다. 그러나, 마커-유전자 도입된 세포에서 관찰된 클론성이 반드시 인과성과 동일하지는 않으며, 대신 단지 종양의 클론 기원을 반영하는 무고한 표지일 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 T 세포가 면역결핍 NOG 마우스에서 유지될 수 있다는 사실에 의존하는 생체내 검정이 사용될 수 있다. 이러한 검정은 마커 유전자가 표적 GSH 유전자좌에 도입되고 변형된 인간 T 세포가 NOG 모델에서 수개월 동안 생존 및 확장될 수 있으며, 비-변형된 T 세포와 비교될 것을 요구한다. 일부 구체예에서, 인간 T-세포 이종-GVHD를 갖는 모델이 사용될 수 있고, 여기서 동물이 GVHD로 사망하기 전 세포의 증식을 위해 허용되는 최대 시간은 2개월이며, NOG 마우스에서 신뢰할 수 있는 GVHD를 제공하는 용량 및 공여자를 정의한다. 2개월 후, 동물을 안락사시키고 조직을 신생물에 대한 조직학, 인간 세포를 검출하기 위한 면역염색, 및 표적 및 표적외 부위의 변형된 유전자 발현의 검출을 위한 유전자 발현 분석(예를 들어, GSH 삽입 유전자좌를 둘러싸는 플랭킹 유전자의 Affymetrix 어레이 또는 RT-PCR)에 의해 평가한다.
일부 구체예에서, GSH로서 후보 유전자좌를 기능적으로 검증하기 위한 또 다른 생체내 검정은 녹-인 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 마우스를 생성하는 것이다.
iPSC 또는 T-림프구 또는 다른 숙주 세포의 GSH로의 마커 유전자의 성공적인 유전자 편집에 대한 시험
당 분야에 널리 공지된 검정을 이용하여 시험관내 및 생체내 모델 둘 모두에서 마커 유전자의 삽입 효율을 시험할 수 있다. 마커 유전자의 발현은 원하는 트랜스진의 mRNA 및 단백질 수준을 측정함으로써(예를 들어, 역전사 PCR, 웨스턴 블롯 분석, 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)) 당업자에 의해 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, 마커 또는 리포터 단백질의 발현을 이용하여, 예를 들어, 형광 현미경 또는 발광 플레이트 리더에 의한 리포터 단백질의 발현을 조사함으로써, 원하는 트랜스진의 발현을 평가할 수 있다. 생체내 적용을 위해, 단백질 기능 검정을 사용하여 주어진 유전자 및/또는 유전자 생성물의 기능성을 시험하여 유전자 편집이 성공적으로 발생했는지 결정할 수 있다. 세포 또는 대상체에서 유전자 편집의 효과는 적어도, 약, 또는 최대 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 10개월, 12개월, 18개월, 2년, 5년, 10년, 20년 동안 지속될 수 있거나, 영구적일 수 있는 것으로 본원에서 고려된다.
마커/리포터 유전자
마커/리포터 유전자는 스크리닝 가능하거나 선택 가능할 수 있다.
예시적인 마커 유전자는 임의의 형광 리포터 유전자, 예를 들어, GFP, RFP 등 뿐만 아니라 생물발광 리포터 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 마커 유전자는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, 에메랄드(Emerald), 아자미 그린(Azami Green), 단량체 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, EYFP, 시트린, Venus YPet, PhiYFP, ZsYellow), 시안 형광 단백질(예를 들어, ECFP, 세룰리언(Cerulean), CyPet AmCyanl, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRPl, DsRed-Express, DsRed2, HcRed-Tandem, HcRed 1, AsRed2, eqFP6l 1, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 오렌지색 형광 단백질(예를 들어, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체 Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 및 청색 형광 단백질(BFP)를 포함하는 자가형광 단백질 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
마커 유전자는 또한 β-락타마제, β-갈락토시다제(LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 및 당 분야에 잘 알려진 다른 것들을 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 리포터 서열은 이들의 발현을 유도하는 조절 요소와 결합되는 경우, 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 다른 분광 검정, 형광 활성화 세포 분류 검정 및 면역학적 검정, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 측정(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 면역조직화학을 포함하는 통상적인 수단에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 운반하는 벡터의 존재는 β-갈락토시다제 활성에 대한 검정에 의해 검출된다. 일부 구체예에서, 마커 유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제인 경우, 신호를 운반하는 벡터는 루미노미터에서 각각 가시광선 흡광도 또는 광 생산에 기초하여 비색적으로 측정될 수 있다. 이러한 리포터는, 예를 들어, 핵산의 조직-특이적 표적화 능력 및 조직 특이적 프로모터 조절 활성을 검증하는데 유용할 수 있다.
마커 유전자는 항생제 내성(예를 들어, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 퓨로마이신 내성)을 매개하는 단백질(예를 들어, 블라스티시딘 S-데아미나제, 아미노 3'-글리코실 포스포트랜스퍼라제)을 인코딩하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 향상된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시퍼라제), 및 세포 대사를 매개하여 향상된 세포 성장 속도 및/또는 유전자 증폭을 초래하는 단백질(예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제)을 인코딩하는 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
GSH의 적어도 일부를 포함하는 벡터
특정 양태에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 확인된 GSH의 적어도 일부 또는 영역을 포함하는 벡터 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터)이 본원에 제공된다. GSH의 부분 또는 영역은, 예를 들어, 점 돌연변이가 본원에서 확인된 GSH 유전자의 유전자 기능을 파괴하거나 녹-아웃시킬 수 있는 경우에 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 벡터에서 GSH의 부분 또는 영역은 삽입된 가이드 RNA(gRNA), 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 뉴클레아제에 대한 가이드 RNA를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, GSH 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 가이드 RNA(gRNA)에 대한 표적 부위, 또는 대안적으로 본원에 개시된 바와 같은 관심 핵산의 도입을 위한 제한 클로닝 부위를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, loxP와 같은 재조합효소 인식 부위는 rAAV 또는 다른 유전자 전달 벡터로부터 발현된 Cre 재조합효소를 사용하여 지시된 재조합을 용이하게 하기 위해 도입될 수 있다. GSH에 삽입된 loxP 부위는 또한 조직 특이적 방식으로 Cre를 발현하는 tg 마우스와 교배함으로써 사용될 수 있다.
예시적인 예로서, 벡터 조성물은 플라스미드, 코스미드, 또는 인공 염색체(예를 들어, BAC), 미니써클 핵산, 또는 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, rAd, AAV, rHSV, BEV 또는 이들의 변이체)일 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 재조합효소 인식 부위(RRS), 예를 들어, LoxP 부위, attP, AttB 부위 등을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 벡터 내의 핵산은 본원에 기재된 방법에서 게놈 세이프 하버(GSH)로서 확인된 GSH 핵산의 적어도 일부를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 핵산은 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드 또는 인공 염색체, 예를 들어, 이를 테면, BAC에 존재한다. 일부 구체예에서, 핵산 조성물은 GSH에서 적어도 표적 통합 부위, 및 표적 통합 부위에 플랭킹된 GSH 핵산의 5' 및 3' 부분을 포함한다.
일부 구체예에서, 벡터 조성물은 30-1000개의 뉴클레오티드, 1-3kb, 3-5kb, 5-10kb, 또는 10-50kb, 50-100kb, 또는 100-300kb, 또는 100-350kb, 또는 10개 염기쌍 내지 350kb 길이 사이의 임의의 정수인 GSH 핵산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 벡터 조성물은 GSH의 5' 영역을 포함하는 제1 핵산 서열, 및/또는 GSH의 3' 영역을 포함하는 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 5' 영역은 표적 통합 부위의 근접부 및 상류 내에 있고, GSH의 3' 영역은 표적 통합 부위의 근접부 및 하류에 있다.
플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스(HSV) 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824(전문은 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 또한, 임의의 이러한 벡터는 치료에 필요한 하나 이상의 서열을 포함할 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 하나 이상의 관심 핵산이 세포에 도입될 때, 관심 핵산이 관심 유전자 편집 핵산인 경우, 추가의 뉴클레아제 및/또는 공여자 서열이 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에서 운반될 수 있다. 다수의 벡터가 사용될 때, 각각의 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 관심 핵산을 포함할 수 있다.
GSH의 적어도 일부를 포함하는 핵산 벡터
특정 양태에서, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서 확인된 GSH 핵산의 적어도 일부를 포함하는 핵산 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, GSH 핵산은 번역되지 않은 서열 또는 인트론을 포함한다. 일부 구체예에서, GSH는 표 3에 열거된 GSH 또는 이의 단편의 서열과 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, GSH는 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 또는 SYNTX-GSH4의 게놈 DNA 또는 이의 단편의 서열과 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시의 핵산 벡터는 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함한다(추가 설명은 하기 참조).
일부 구체예에서, 본 개시의 핵산 벡터는 (a) 전사 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 전사 종결 서열, 비번역 영역(5' 또는 3' UTR), 근위 프로모터 요소, 유전자좌 제어 영역(예를 들어, β-글로빈 LCR 또는 β-글로빈 LCR의 DNase 과민성 부위(HS), 폴리아데닐화 신호 서열), 및/또는 (b) 번역 조절 요소(예를 들어, Kozak 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소)를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산 벡터는 플라스미드, 미니써클, 코스미드, 인공 염색체(예를 들어, BAC), 선형 공유 폐쇄(LCC) DNA 벡터(예를 들어, 미니써클, 미니벡터 및 미니노트), 선형 공유 폐쇄(LCC) 벡터(예를 들어, MIDGE, MiLV, 미니스터링, 미니플라스미드), 미니-인트론 플라스미드, pDNA 발현 벡터, 또는 이들의 변이체로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 핵산 벡터는 원핵 또는 진핵 세포를 형질전환시킬 수 있고, 복제 및/또는 발현될 수 있다. 벡터는 원핵생물 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 곤충 벡터, 또는 진핵생물 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 또한, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, supra 및 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 및 20060188987, 및 국제 공개 WO 2007/014275]에 기재된 표준 기술을 사용하여 식물 세포, 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 인간 세포, 진균 세포, 박테리아 세포, 또는 원생동물 세포에 투여하기 위한 것일 수 있다.
본 개시의 핵산 벡터는, 예를 들어, DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 네이키드 파지 DNA, 미니써클 DNA, 및 선형 플라스미드(예를 들어, US2009/0263900에 개시됨), 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 원형 DNA 발현 벡터 또는 미니써클 벡터는 문헌[WO2002/083889, WO20l4/l70,238, W02004/099420, WO20 102/026099, 미국 특허 6,143,530, 5,622,866, 7,622,252, 8,460,924, 6,277,608, 미국 출원 2003/0032092, 2004/0214329, 전문은 본원에 참조로 포함됨]에 기재되어 있다.
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 적합한 핵산 벡터는 선형 공유 폐쇄 DNA 벡터(예를 들어, 문헌[Nafissi and Slavcev "Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system." Microbial cell factories 11.1 (2012): 154]에 기재됨) 뿐만 아니라 선형 공유 폐쇄(UCC) 미니-플라스미드(예를 들어, 문헌[Slavcev, Sum, and Nafissi "Optimized production of a safe and efficient gene therapeutic vaccine versus HIV via a linear covalently closed DNA minivector." BMC Infectious Diseases 14. S2 (2014): P74]에 기재됨), DNA 미니스트링(예를 들어, 미국 특허 9,290,778; Nafiseh, et al. "DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors." Molecular Therapy-Nucleic Acids 3.6 (2014): el65; Wong, Shirley, et al. "Production of double-stranded DNA ministrings." Journal of visualized experiments: JoVE 108 (2016)에 기재됨), 또는 ceDNA 벡터(예를 들어, Ui U, et al, (2013) Production and Characterization of Novel Recombinant Adeno-Associated Virus Replicative-Form Genomes: A Eukaryotic Source of DNA for Gene Transfer. PLoS ONE 8(8): e69879)를 포함한다.
핵산 벡터는 또한, 예를 들어, 최소화 벡터, 플라스미드(항생제 비함유 플라스미드 포함), 미니플라스미드, 미니써클, 미니벡터, 예를 들어, 문헌[Hardee, Cinnamon L., et al. "Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy." Genes 8.2 (2017): 65]에 기재된 것들을 포함한다. 원형 공유 폐쇄 벡터(CCC 벡터)의 예는 미니써클, 미니벡터 및 미니노트를 포함한다. 선형 공유 폐쇄(LCC) 벡터의 예는 MIDGE, MiLV, 미니스트링을 포함한다. 미니-인트론 플라스미드가 또한 사용될 수 있다. 이들은 문헌[Hardee, Cinnamon L., et al. "Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy." Genes 8.2 (2017): 65]의 표 2에 개시되어 있다.
핵산 벡터는 문헌[Gill, et al, "Progress and prospects: the design and production of plasmid vectors." Gene therapy 16.2 (2009): 165-171, and Yin, Hao, et al. "Non-viral vectors for gene-based therapy." Nature Reviews Genetics 15.8 (2014): 541-555]의 검토 기사에서 논의된 바와 같이, 예를 들어, 플라스미드 DNA 벡터(pDNA 발현 벡터)를 추가로 포함한다.
표적 게놈의 GSH 유전자좌로의 통합을 위한 핵산 벡터
특정 양태에서, 관심 표적 게놈의 GSH 유전자좌로의 통합에 사용되는 본원에 기재된 핵산 벡터(예를 들어, GSH의 적어도 일부를 포함하는 핵산 벡터)가 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산 벡터(예를 들어, GSH의 적어도 일부를 포함하는 핵산 벡터)는 표적 게놈의 GSH 유전자좌로의 통합을 위한 추가적인 서열 또는 변형(예를 들어, GSH 서열과 상동성인 서열의 특정 배향)을 추가로 포함한다. 표적 게놈으로의 통합은 상동성 재조합 또는 비-상동성 말단-결합(NHEJ)과 같은 세포 과정에 의해 유도될 수 있다. 통합은 또한 외인성으로 도입된 뉴클레아제에 의해 개시 및/또는 촉진될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 핵산 벡터는 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 비-GSH 핵산은 표적 게놈의 GSH 유전자좌로 통합될 예정이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산(정방향 또는 역방향)은 GSH 5' 상동성 아암 및/또는 GSH 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹되고, 여기서 상동성 아암은 표적 GSH 핵산과 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, GSH 상동성 아암은 10-5000개 염기쌍, 50-3000개 염기쌍, 100-1500개 염기쌍, 또는 10-10,000개 염기쌍 사이의 임의의 정수의 길이이다. 일부 구체예에서, GSH 상동성 아암은 100-1500개 염기쌍의 길이이다. 일부 구체예에서, GSH 상동성 아암은 적어도 30개 염기쌍의 길이이다. 바람직한 구체예에서, GSH 상동성 아암은 세포의 게놈에서 GSH 유전자좌로의 상동성-의존적 통합을 매개하기에 충분한 길이이다.
일부 구체예에서, GSH 상동성 아암(들)에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 정방향으로 GSH에 통합되기 위한 배향이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 역방향으로 GSH에 통합되기 위한 배향이다.
일부 구체예에서, 핵산은 제한 클로닝 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 제한 클로닝 부위는 표적 게놈의 GSH 유전자좌로 통합될 예정인 적어도 하나의 비-GSH 핵산의 클로닝을 촉진하기 위해 GSH-5' 상동성 아암 및/또는 3'GSH 상동성 아암에 의해 플랭킹된다.
따라서, 일부 구체예에서, 핵산 벡터 조성물은 (a) GSH 5' 상동성 아암, (b) 제한 클로닝 부위를 포함하는 핵산 서열, 및 (c) GSH 3' 상동성 아암을 포함하고, 여기서 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암은 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 확인된 GSH 유전자좌에 위치한 표적 부위에 결합하고, 여기서 5' 및 3' 상동성 아암은 게놈 세이프 하버 내에 위치한 유전자좌로의 상동성 재조합에 의해 (상동성 아암 사이에 위치한 핵산의) 삽입을 허용한다. 일부 구체예에서, 이러한 핵산 벡터는 표적 게놈의 GSH 유전자좌로 통합될 예정인 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 추가로 포함한다.
5' 및 3' 상동성 아암은 숙주 세포의 게놈에서 GSH 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 5' 및 3' 상동성 아암은 본원에 기재된 GSH의 부분과 상동성일 수 있다. 또한, 5' 및 3' 상동성 아암은 비-코딩 또는 코딩 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
일부 구체예에서, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 염색체 상의 통합 또는 DNA 절단 부위의 바로 상류 및/또는 하류의 서열과 상동성일 수 있다. 대안적으로, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 통합 또는 DNA 절단 부위에서 멀리 떨어진 서열, 예를 들어, 통합 또는 DNA 절단 부위로부터 적어도, 약, 또는 최대 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000개 이상의 염기쌍만큼 떨어져 있는 서열과 상동성일 수 있거나, DNA 절단 부위와 부분적으로 또는 완전히 중첩될 수 있다(예를 들어, 외인성-도입된 뉴클레아제에 의해 유도된 DNA 절단일 수 있음). 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열의 3' 상동성 아암은 바이러스 벡터의 ITR에 근접한다.
일부 구체예에서, 핵산은 상동성 재조합에 이어 외인성-도입된 뉴클레아제에 의해 유도된 DNA 절단 형성에 의해 표적 게놈으로 통합된다. 일부 구체예에서, 뉴클레아제는 TALEN, ZFN, 메가뉴클레아제, megaTAL, 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체)이다. 일부 구체예에서, CRISPR 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA와의 복합체이다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 개시의 핵산 벡터는 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 이의 변이체, ZFN, TALEN) 및/또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 뉴클레아제 또는 뉴클레아제/gRNA 복합체는 GSH에서 DNA 절단을 만들고, 이는 공여자 핵산을 사용하여 복구되며, 이에 의해 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 GSH에 통합된다. 다른 구체예에서, 뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 독립적인 핵산 벡터로 제공된다.
5' 및 3' 상동성 아암 사이에 위치한 핵산의 통합을 위해, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 GSH를 표적화하기에 충분히 길어야 하고 상동성 재조합에 의해 게놈으로의 통합을 허용(예를 들어, 안내)해야 한다. 정확한 위치에서의 통합 가능성을 증가시키고 상동성 재조합의 가능성을 향상시키기 위해, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 충분한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 적어도 10개 염기쌍 내지 5,000개 이하의 염기쌍, 적어도 50개 염기쌍 내지 5,000개 이하의 염기쌍, 적어도 100개 염기쌍 내지 5,000개 이하의 염기쌍, 적어도 200개 염기쌍 내지 5,000개 이하의 염기쌍, 적어도 250개 염기쌍 내지 5,000개 이하의 염기쌍, 또는 적어도 300개 염기쌍 내지 5,000개 이하의 염기쌍을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 5' 및/또는 3' 상동성 아암은 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500개의 염기쌍을 포함한다. 상동성 아암의 길이 및 재조합 빈도에 관한 상세한 정보는 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Zhang et al. "Efficient precise knock in with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage." Genome biology 18.1 (2017): 35, 전문은 본원에 참조로 포함됨]을 참조한다.
본 개시의 핵산 벡터는 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 화학적 방법, 전기천공, 핵산 벡터를 포함하는 세포와의 융합, 형질도입 등에 의해 게놈으로의 통합을 위해 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 핵산 벡터는 형질도입시 표적 세포의 게놈 내로 통합된다.
비-GSH 핵산
본 개시의 벡터(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터)는 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함할 수 있다. 비-GSH 핵산은 본원에서 확인된 GSH의 서열을 포함하지 않는 임의의 핵산, 예를 들어, GSH에 이종성인 서열을 갖는 핵산, 예를 들어, GSH 유전자좌에 천연적으로 존재하지 않는 핵산 서열, 예를 들어, 트랜스진을 지칭할 수 있다. 비-GSH 핵산은 벡터의 복제 및/또는 유지에 필요한 서열, 예를 들어, 복제 기점, 선택 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 성공적인 통합을 위한 선택 또는 스크리닝을 돕는 마커) 등을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 비-GSH 핵산은 표적 게놈으로 통합될 예정인 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 비-GSH 핵산은 치료 또는 연구 목적을 제공하는 서열, 예를 들어, 유해한 내인성 유전자를 하향 조절하는 서열, 결핍 유전자를 상향 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는다. 일부 구체예에서, 비-GSH 핵산은 발현을 위한 것이 아닌 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 비-GSH 핵산은 발현을 위한 서열을 포함할 수 있고, 발현은 통합 부위 근처의 내인성 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 치료 유전자의 발현을 위해 이웃 프로모터의 사용이 이용되어 왔다(예를 들어, LogicBio Therapeutic의 관심 유전자의 알부민 유전자좌로의 통합 참조, 여기서 유전자 발현은 알부민 프로모터에 의해 촉진된다).
특정 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 프로모터는 (a) 작동 가능하게 연결된 핵산에 이종성인 프로모터; (b) 핵산의 조직-특이적 발현을 촉진하는 프로모터; (c) 핵산의 구성적 발현을 촉진하는 프로모터; (d) 유도성 프로모터; (e) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터; (f) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터; 및 (g) 곤충 세포 프로모터로부터 선택된다.
본원에 개시된 바와 같이, 일부 구체예에서, 유도성 프로모터는 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 제제는 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 프로모터는 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 뉴런 세포, 기도 상피 세포, 또는 간 전구 세포에서 조직-특이적 발현을 촉진한다.
일부 구체예에서, 프로모터는 CMV 프로모터, β-글로빈 프로모터, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, Wiskott-Aldrich 프로모터, PKLR 프로모터, 다면체(polh) 프로모터, 및 즉시 초기 1 유전자 (IE-1) 프로모터로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 증가시키거나 회복시킨다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 추가의 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 (a) 전사 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 전사 종결 서열, 비번역 영역(5' 또는 3' UTR), 근위 프로모터 요소, 유전자좌 제어 영역(예를 들어, β-글로빈 LCR 또는 β-글로빈 LCR의 DNase 과민성 부위(HS), 폴리아데닐화 신호 서열), 및/또는 (b) 번역 조절 요소(예를 들어, Kozak 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소)를 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 하기 기재된 바와 같이 코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA를 인코딩할 수 있다.
적어도 하나의 비-GSH 핵산을 세포의 GSH 유전자좌에 삽입하는 방법이 본원에 추가로 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 핵산 벡터 중 어느 하나, 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 어느 하나, 또는 본원에 기재된 약학적 조성물 중 어느 하나를 세포에 도입하는 것을 포함하고, 이에 의해 게놈에서 비-GSH 핵산에 플랭킹된 GSH 5' 상동성 아암 및 GSH 3' 상동성 아암과 GSH 유전자좌의 상동성 재조합이 비-GSH 핵산을 GSH 유전자좌에 통합시킨다. 일부 구체예에서, 비-GSH 핵산은 정방향으로 GSH에 통합된다. 다른 구체예에서, 비-GSH 핵산은 역방향으로 GSH에 통합된다.
비-코딩 RNA 및 코딩 RNA
특정 양태에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 본원에 제공되고, 여기서 비-GSH 핵산은 코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 코딩 RNA를 인코딩하는 서열은 표적 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화된다. 일부 구체예에서, 코딩 RNA를 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 막-국소화되거나 분비된 폴리펩티드의 생산을 가능하게 하는 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 (a) 단백질 또는 이의 단편, 바람직하게는 인간 단백질 또는 이의 단편;
(b) 치료 단백질 또는 이의 단편, 항원-결합 단백질, 또는 펩티드; (c) 자살 유전자, 선택적으로 단순 포진 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK); (d) 바이러스 단백질 또는 이의 단편; (e) 뉴클레아제, 선택적으로 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, megaTAL, 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체); (f) 마커, 예를 들어, 루시퍼라제 또는 GFP; 및/또는 (g) 약물 내성 단백질, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 네오마이신 내성을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편은 구조적 단백질(예를 들어, VP1, VP2, VP3) 또는 비-구조적 단백질(예를 들어, Rep 단백질)을 포함한다. 이러한 비-GSH 핵산은 재조합 바이러스 단백질을 생산하기 위해 세포를 조작하고/거나(예를 들어, 백신 생산을 위해) 재조합 바이러스 입자(예를 들어, AAV 등)를 생산하기 위해 세포를 조작하는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편은 (a) 파보바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 VP1, VP2, VP3, NS1, 또는 Rep; (b) 레트로바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 외피 단백질, gag, pol, 또는 VSV-G; (c) 아데노바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, 또는 구조적 단백질(예를 들어, A, B, C); 및/또는 (d) 단순 포진 바이러스 단백질 또는 이의 단편, 임의로 ICP27, ICP4, 또는 pac를 포함한다.
일부 구체예에서, 바이러스 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 바이러스의 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩한다. 일부 구체예에서, (a) 표면 단백질 또는 이의 단편은 숙주에서 면역 반응을 유발하는 면역원성 표면 단백질이고/거나, (b) 표면 단백질 또는 이의 단편은 신호 펩티드를 추가로 포함하고/거나, (c) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 유전자는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고/거나, (d) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산은 자살 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 표면 단백질은 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스의 표면 단백질이다. 일부 구체예에서, 표면 단백질은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 헤모글로빈 유전자(HBA1, HBA2, HBB, HBG1, HBG2, HBD, HBE1, 및/또는 HBZ), 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP), 응고 인자 VIII, 응고 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, 디스트로핀 또는 트렁케이션된 디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 유트로핀 또는 트렁케이션된 유트로핀, 마이크로-유트로핀, 우세린(USH2A), GBA1, 프리프로인슐린, 인슐린, GIP, GLP-1, CEP290, ATPB1, ATPB11, ABCB4, CPS1, ATP7B, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, KIND1, INS, F8 또는 이의 단편(예를 들어, B-도메인 결실된 폴리펩티드(예를 들어, VIII SQ, p-VIII)를 인코딩하는 단편), IRGM, NOD2, ATG2B, ATG9, ATG5, ATG7, ATG16L1, BECN1, EI24/PIG8, TECPR2, WDR45/WIP14, CHMP2B, CHMP4B, 다이네인, EPG5, HspB8, LAMP2, LC3b UVRAG, VCP/p97, ZFYVE26, PARK2/파킨, PARK6/PINK1, SQSTM1/p62, SMURF, AMPK, ULK1, RPE65, CHM, RPGR, PDE6B, CNGA3, GUCY2D, RS1, ABCA4, MYO7A, HFE, 헵시딘, (예를 들어, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-1β 수용체의) 가용성 형태를 인코딩하는 유전자, 및 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(CFTR)로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 항원-결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG(CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, CCR5, 또는 병원체(예를 들어, 박테리아 독소, 바이러스 캡시드 단백질 등)에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
따라서, 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 수용체, 독소, 호르몬, 효소, 마커 유전자(상기 참조)에 의해 인코딩된 마커 단백질, 또는 세포 표면 단백질 또는 치료 단백질, 펩티드 또는 항체 또는 이의 단편을 인코딩한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 조성물에 사용하기 위한 관심 핵산은 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체), 항원, 효소, 수용체(세포 표면 또는 핵), 호르몬, 림포카인, 사이토카인, 마커 폴리펩티드, 성장 인자, 및 상기 임의의 것의 기능성 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 세포에서의 발현이 요망되는 임의의 폴리펩티드를 인코딩한다. 코딩 서열은, 예를 들어, cDNA일 수 있다.
코딩 RNA는 태그, 예를 들어, 에피토프 태그를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하여, 태그가 용이한 검출 및/또는 정제를 위해 관심 단백질에 융합될 수 있다. 예시적인 태그는, 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출 가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다.
당업자는 분비를 위한 단백질이 신호 펩티드를 포함하고, 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산이 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다는 것을 이해한다.
특정 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 조성물에 사용하기 위한 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 표적화된 통합을 거친 세포의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자(본원에 기술됨)를 인코딩하는 핵산 서열, 및 추가 기능을 인코딩하는 연결된 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 포유동물에서 하나 이상의 유전적 결핍 또는 기능장애, 예를 들어, 포유동물에서 폴리펩티드 결핍 또는 폴리펩티드 과잉을 예방하거나 치료하고, 특히 세포 및 조직에서 이러한 폴리펩티드의 결핍과 관련된 하나 이상의 장애를 나타내는 인간에서 결핍의 중증도 또는 정도를 예방, 치료 또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한 핵산을 포함한다. 상기 방법은 이러한 장애로 고통받는 대상체의 결핍 또는 장애를 예방하거나 치료하기에 충분한 양 및 기간 동안 대상체에게 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 또는 본원에 기재된 바와 같은 상기 핵산 벡터 또는 바이러스 벡터를 포함하는 세포에서, 바람직하게는 약학적 허용되는 조성물로 하나 이상의 치료 펩티드, 폴리펩티드, siRNA, microRNA, 안티센스 뉴클레오티드 등을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 본 개시에 기재된 바와 같은 핵산)을 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 일부 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 벡터 조성물에 사용하기 위한 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 포유동물 대상체에서 질병의 치료 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 인코딩할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 방법에 사용하기 위한 예시적인 비-GSH 핵산은 BDNF, CNTF, CSF, EGF, FGF, G-SCF, GM-CSF, 생식샘자극호르몬, IFN, IFG-1, M-CSF, NGF, PDGF, PEDF, TGF, VEGF, TGF-B2, TNF, 프로락틴, 소마토트로핀, XIAP1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10(187A), 바이러스 IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, VEGF, FGF, SDF-1, 코넥신 40, 코넥신 43, SCN4a, HIFia, SERCa2a, ADCYl, 및 ADCY6을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 핵산은 포유동물 β 글로빈 유전자(예를 들어, HBA1, HBA2, HBB, HBG1, HBG2, HBD, HBE1, 및/또는 HBZ), 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP), B-세포 림프종/백혈병 11A(BCL11A) 유전자, 크루펠-유사 인자 1(KLF1) 유전자, CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12C(AAVS1) 유전자, 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자, 알부민 유전자, 인자 VIII 유전자, 인자 IX 유전자, 류신-풍부 반복 키나제 2(LRRK2) 유전자, 헌팅틴(HTT) 유전자, 로돕신(RHO) 유전자, 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(CFTR) 유전자, F8 또는 이의 단편(예를 들어, B-도메인 결실된 폴리펩티드(예를 들어, VIII SQ, p-VIII)을 인코딩하는 단편), 계면활성제 단백질 B 유전자(SFTPB), T-세포 수용체 알파( TRAC) 유전자, T-세포 수용체 베타(TRBC) 유전자, 프로그램된 세포 사멸 1(PD1) 유전자, 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4) 유전자, 인간 백혈구 항원(HLA) A 유전자, HLA B 유전자, HLA C 유전자, HLA-DPA 유전자, HLA-DQ 유전자, HLA-DRA 유전자, LMP7 유전자, 항원 처리(TAP) 1 유전자와 관련된 수송체, TAP2 유전자, 타파신 유전자(TAPBP), 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 트랜스활성화제(CUT A) 유전자, 디스트로핀 유전자(DMD), 글루코코르티코이드 수용체 유전자(GR), IL2RG 유전자, RFX5 유전자, FAD2 유전자, FAD3 유전자, ZP15 유전자, KASII 유전자, MDH 유전자, 및/또는 EPSPS 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 코딩 서열 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 비-GSH 핵산은 대상체(예를 들어, 암을 갖는 대상체에서 침묵된 종양 억제인자)에서 발현이 감소되거나, 침묵되거나, 달리 기능장애가 있는 유전자의 발현을 회복시키기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 일부 구체예에서, 비-GSH 핵산은 또한 대상체에서 비정상적으로 발현되는 유전자(예를 들어, 암을 갖는 대상체에서 발현되는 종양유전자)의 발현을 녹다운시키는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 기능장애 유전자는 암을 갖는 대상체에서 침묵된 종양 억제인자이다. 일부 구체예에서, 기능장애 유전자는 암을 갖는 대상체에서 비정상적으로 발현되는 종양유전자이다. 암과 관련된 예시적인 유전자(종양유전자 및 종양 억제인자)는 AARS, ABCB 1, ABCC4, ABI2, ABL1, ABL2, ACK1, ACP2, ACY1, ADSL, AK1, AKR1C2, AKT1, ALB, ANPEP, ANXAS, ANXA7, AP2Ml, APC, ARHGAPS, ARHGEFS, ARID4A, ASNS, ATF4, ATM, ATPSB, ATPSO, AXL, BARD1, BAX, BCL2, BHLHB2, BLMH, BRAF, BRCA1, BRCA2, BTK, CANX, CAP1, CAPN1, CAPNS1, CAV1, CBFB, CBLB, CCL2, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CCTS, CCYR61, CD24, CD44, CD59, CDC20, CDC25, CDC25A, CDC25B, CDC2LS, CDK10, CDK4, CDK5, CDK9, CDKL1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2D, CEBPG, CENPC1, CGRRF1, CHAF1A, CIB1, CKMT1, CLK1, CLK2, CLK3, CLNS1A, CLTC, COL1A1, COL6A3, COX6C, COX7A2, CRAT, CRHR1, CSF1R, CSK, CSNK1G2, CTNNA1, CTNNB1, CTPS, CTSC, CTSD, CUL1, CYR61, DCC, DCN, DDX10, DEK, DHCR7, DHRS2, DHX8, DLG3, DVL1, DVL3, E2F1, E2F3, E2F5, EGFR, EGR1, EIF5, EPHA2, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC3, ETV1, ETV3, ETV6, F2R, FASTK, FBN1, FBN2, FES, FGFR1, FGR, FKBP8, FN1, FOS, FOSL1, FOSL2, FOXG1A, FOXO1A, FRAP1, FRZB, FTL, FZD2, FZDS, FZD9, G22P1, GAS6, GCNSL2, GDF1S, GNA13, GNAS, GNB2, GNB2Ll, GPR39, GRB2, GSK3A, GSPT1, GTF21, HDAC1, HDGF, HMMR, HPRT1, HRB, HSPA4, HSPAS, HSPA8, HSPB1, HSPH1, HYAL1, HYOU1, ICAM1, ID1, ID2, IDUA, IER3, IFITM1, IGF1R, IGF2R, IGFBP3, IGFBP4, IGFBPS, IL1B, ILK, ING1, IRF3, ITGA3, ITGA6, ITGB4, JAK1, JARID1A, JUN, JUNB, JUND, K-ALPHA-1, KIT, KITLG, KLK10, KPNA2, KRAS2, KRT18, KRT2A, KRT9, LAMB1, LAMP2, LCK, LCN2, LEP, LITAF, LRPAP1, LTF, LYN, LZTR1, MADH1, MAP2K2, MAP3K8, MAPK12, MAPK13, MAPKAPK3, MAPRE1, MARS, MAS1, MCC, MCM2, MCM4, MDM2, MDM4, MET, MGST1, MICB, MLLT3, MME, MMP1, MMP14, MMP17, MMP2, MNDA, MSH2, MSH6, MT3, MYB, MYBL1, MYBL2, MYC, MYCLI, MYCN, MYD88, MYL9, MYLK, NEO1, NF1, NF2, NFKB I, NFKB2, NFSF7, NID, NINJ1, NMBR, NME1, NME2, NME3, NOTCH 1, NOTCH2, NOTCH4, NPM1, NQO1, NRlD1, NR2Fl, NR2F6, NRAS, NRG1, NSEP1, OSM, PA2G4, PABPC1, PCNA, PCTK1, PCTK2, PCTK3, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDPK1, PEAl5, PFDN4, PFDN5, PGAM1, PHB, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG, PIM1, PKM2, PKMYT1, PLK2, PPARD, PPARG, PPIH, PPP1CA, PPP2RSA, PRDX2, PRDX4, PRKAR1A, PRKCBP1, PRNP, PRSS15, PSMA1, PTCH, PTEN, PTGS1, PTMA, PTN, PTPRN, RABSA, RAC1, RADSO, RAF1, RALBP1, RAP1A, RARA, RARB, RASGRF1, RB1, RBBP4, RBL2, REA, REL, RELA, RELB, RET, RFC2, RGS19, RHOA, RHOB, RHOC, RHOD, RIPK1, RPN2, RPS6KB 1, RRM1, SARS, SELENBP1, SEMA3C, SEMA4D, SEPP1, SERPINH1, SFN, SFPQ, SFRS7, SHB, SHH, SIAH2, SIVA, SIVA TP53, SKI, SKIL, SLC16A1, SLC1A4, SLC20Al, SMO, SMPD1, SNAI2, SND1, SNRPB2, SOCS1, SOCS3, SOD1, SORT1, SPINT2, SPRY2, SRC, SRPX, STAT1, STAT2, STAT3, STAT5B, STC1, TAF1, TBL3, TBRG4, TCF1, TCF7L2, TFAP2C, TFDP1, TFDP2, TGFA, TGFB1, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, THBS1, TIE, TIMP1, TIMP3, TJP1, TK1, TLE1, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF6, TNFSF7, TNK1, TOB1, TP53, TP53BP2, TP5313, TP73, TPBG, TPT1, TRADD, TRAM1, TRRAP, TSG101, TUFM, TXNRD1, TYR03, UBC, UBE2L6, UCHL1, USP7, VDAC1, VEGF, VHL, VIL2, WEE1, WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNTSA, WT1, XRCC 1, YES 1, YWHAB, YWHAZ, ZAP70, 및 ZNF9를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 기능장애 유전자는 HBB이다. 일부 구체예에서, HBB는 β-글로빈 생산을 감소시키거나 제거하는 적어도 하나의 넌센스, 프레임시프트, 또는 스플라이싱 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, HBB는 HBB의 프로모터 영역 또는 폴리아데닐화 신호에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, HBB 돌연변이는 c.17A>T, c.-1360G, c.92+1G>A, c.92+6T>C, c.93-21G>A, c.1180T, c.316-106OG, c.25_26delAA, c.27_28insG, c.92+5G>C, c.1180T, c.l35delC, c.315+lG>A, c.-78A>G, c.52A>T, c.59A>G, c.92+5G>C, c.l24_127delTTCT, c.316- 1970T, c.-78A>G, c.52A>T, c.l24_127delTTCT, c.316-197C>T, C.-1380T, c.-79A>G, c.92+5G>C, c.75T>A, c.316-2A>G, 및 c.316-2A>C 중 적어도 하나이다.
특정 구체예에서, 겸상 적혈구 질환은 항-겸상적혈구화 활성을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 HBB 변이체를 도입하는 유전자 요법(예를 들어, 줄기 세포 유전자 요법)에 의해 개선된다. 일부 구체예에서, HBB 변이체는 이중 돌연변이체(βAS2; T87Q 및 E22A)일 수 있다. 다른 구체예에서, HBB 변이체는 삼중-돌연변이체 β-글로빈 변이체(βAS3; T87Q, E22A, 및 G16D)일 수 있다. 글리신에서 아스파르트산으로의 β16의 변형은 α 사슬에 대한 결합에 있어 겸상 글로빈(βS, HbS)에 비해 경쟁적 이점을 제공한다. 글루탐산에서 알라닌으로의 β22의 변형은 α20 히스티딘과의 축 상호작용을 부분적으로 향상시킨다. 이러한 변형은 단일 T87Q-변형된 변이체의 것보다 더 크고 태아 글로빈에 필적하는 항-겸상적혈구화 특성을 초래한다. SCD 뮤린 모델에서, βAS3을 운반하는 SIN 렌티바이러스로 형질도입된 골수 줄기 세포의 이식은 적혈구 생리학 및 SCD 임상 증상을 역전시켰다. 따라서, 이 변이체는 임상 시험(식별자 번호: NCT02247843), Cytotherapy (2018) 20(7): 899-910에서 시험 중이다.
일부 구체예에서, 기능장애 유전자는 CFTR이다. 일부 구체예에서, CFTR은 ΔF508, R553X, R74W, R668C, S977F, L997F, K1060T, A1067T, R1070Q, R1066H, T3381, R334W, G85E, A46D, I336K, H1054D, M1V, E92K, V520F, H1085R, R560T, L927P, R560S, N1303K, M1101K, L1077P, R1066M, R1066C, L1065P, Y569D, A561E, A559T, S492F, L467P, R347P, S341P, I507del, G1061R, G542X, W1282X, 및 2184InsA로부터 선택된 돌연변이를 포함한다.
당업자는 관심 핵산이 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 보존적 아미노산 치환을 초래하는 돌연변이가 트랜스진에서 만들어져 단백질 또는 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체 또는 상동체를 제공할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 양태에서, 본 개시는 트랜스진의 보존적 아미노산 치환을 초래하는 서열 변경을 포함한다. 일부 구체예에서, 비-GSH 핵산은 우성 음성 돌연변이를 갖는 유전자를 인코딩한다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 관심 핵산은 야생형 단백질과 동일한 요소와 상호작용함으로써 야생형 단백질의 기능의 일부 양태를 차단하는 돌연변이체 단백질을 인코딩한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 유도성 프로모터 및/또는 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 자살 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 벡터는 신호에 따라 세포를 사멸시키거나, 특정하고 별개의 신호에 따라 세포가 아폽토시스 또는 프로그램된 세포 사멸을 겪도록 유도하는데 사용될 수 있다. 자살 유전자를 포함하는 이러한 벡터는 유전자 표적화 또는 유전자 편집 시스템이 예상대로 기능하지 않는 경우 탈출구로 사용될 수 있다. 대안적으로, 자살 유전자는 암 세포를 사멸시키거나 암 세포를, 예를 들어, 화학요법에 민감하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 자살 유전자는 당 분야에 잘 알려져 있으며, 티미딘 키나제(TK, 바이러스), 시토신 데아미나제(CD, 박테리아 및 효모), 카르복시펩티다제 G2(CPG2, 박테리아) 및 니트로리덕타제(NTR, 박테리아)를 포함한다. 일부 구체예에서, 자살 유전자는 단순 포진 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK)이다.
임의의 관심 서열의 세포 내로의 표적화된 삽입 방법이 본원에 추가로 기재된다. 일부 구체예에서, 관심 핵산은 발현이 줄기 세포의 특정 분화 계통과 관련된 것으로 알려진 유전자 또는 유전자의 그룹을 인코딩하는 핵산이다. 줄기 세포 분화의 세포 운명 또는 다른 마커에 관여하는 유전자를 포함하는 서열이 또한 삽입될 수 있다. 예를 들어, 이러한 유전자를 함유하는 프로모터 없는 작제물은 그 유전자좌의 내인성 프로모터가 유전자 생성물의 발현을 유도하도록 특정 영역(유전자좌)에 삽입될 수 있다.
유사하게, 특정 구체예에서, 본원에서 확인된 GSH 유전자좌에서의 게놈 변형(예를 들어, 트랜스진 통합)은 해당 세이프 하버 유전자좌에서 발견된 프로모터를 이용할 수 있는 관심 핵산의 통합을 허용하거나, 삽입 전에 관심 핵산에 융합되는, 본원에 기재된 바와 같은 외인성 프로모터 또는 제어 요소에 의한 트랜스진의 발현 조절을 허용한다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 비-코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 비-코딩 RNA는 안티센스 폴리뉴클레오티드, lncRNA, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, snoRNA, snRNA, scaRNA, 및/또는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 비-코딩 RNA는 DMT-1, 페로포틴, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-1β 수용체, 돌연변이된 단백질(예를 들어, 돌연변이된 HFE, CFTR)을 인코딩하는 유전자로부터 선택된 유전자를 표적화한다.
작은 핵산은 암과 관련된 유전자 생성물(예를 들어, 종양유전자)의 발현을 조절할 수 있고 암을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 비-GSH 핵산은, 예를 들어, 치료, 연구 목적, 예를 들어, 암을 연구하거나 암을 예방하거나 치료하는 치료제를 확인하기 위해 사용되는 암과 관련된 유전자 생성물(또는 암과 관련된 유전자의 발현을 억제하는 기능적 RNA)을 인코딩한다.
당업자는 또한 비-GSH 핵산이 단백질 또는 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체 또는 상동체를 제공할 수 있는 보존적 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있음을 이해한다. 우성 음성 돌연변이를 갖는, 본원에 기재된 GSH 유전자좌에 통합된 관심 핵산이 본 개시에서 추가로 고려된다. 예를 들어, 관심 핵산은 야생형 단백질과 동일한 요소와 상호작용함으로써 야생형 단백질의 기능의 일부 양태를 차단하는 돌연변이체 단백질을 인코딩할 수 있다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 RNA 간섭을 매개하는 비-코딩 RNA를 포함한다. 예를 들어, 비-코딩 RNA는 짧은 간섭 RNA를 포함한다. 짧은 간섭 RNA(siRNA)는, 예를 들어, RNAi에 의해 표적 핵산의 발현을 억제하는 기능을 하는 제제이다. siRNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 시험관내 전사에 의해 생산될 수 있거나, 숙주 세포 내에서 생산될 수 있다. 일부 구체예에서, siRNA는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 15 내지 약 28개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이, 및 더욱 바람직하게는 약 19, 20, 21, 또는 22개의 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자이고, 각각의 가닥에 약 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 3' 및/또는 5' 오버행을 함유할 수 있다. 오버행의 길이는 2개의 가닥 사이에서 독립적이며, 즉, 한 가닥의 오버행 길이는 제2 가닥의 오버행 길이에 의존하지 않는다. 바람직하게는, siRNA는 표적 메신저 RNA(mRNA)의 분해 또는 특정 전사후 유전자 침묵(PTGS)을 통해 RNA 간섭을 촉진할 수 있다.
다른 구체예에서, siRNA는 작은 헤어핀(스템 루프로도 불림) RNA(shRNA)이다. 일부 구체예에서, 이러한 shRNA는 짧은(예를 들어, 19-25개 뉴클레오티드) 안티센스 가닥에 이어, 5-9개 뉴클레오티드 루프, 및 유사한 센스 가닥을 포함한다. 대안적으로, 센스 가닥은 뉴클레오티드 루프 구조에 선행할 수 있고 안티센스 가닥은 뒤따를 수 있다. 이러한 shRNA는 플라스미드, 레트로바이러스, 및 렌티바이러스에 함유될 수 있고, 예를 들어, pol III U6 프로모터 또는 다른 프로모터로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stewart, et al. (2003) RNA Apr;9(4):493-501] 참조, 본원에 참조로 포함됨).
일부 구체예에서, 비-코딩 RNA는 piRNA를 포함한다. Piwi-상호작용 RNA(piRNA)는 가장 큰 부류의 작은 비-코딩 RNA 분자이다. piRNA는 piwi 단백질과의 상호작용을 통해 RNA-단백질 복합체를 형성한다. 이러한 piRNA 복합체는 생식계열 세포, 특히 정자형성에서 레트로트랜스포존 및 다른 유전 요소의 후성적 및 전사후 유전자 침묵 둘 모두와 관련이 있었다. 이들은 크기(21-24 nt가 아닌 26-31 nt), 서열 보존의 부족, 및 증가된 복잡성에서 microRNA(miRNA)와 구별된다. 그러나, 다른 작은 RNA와 마찬가지로, piRNA는 유전자 침묵, 특히 트랜스포존의 침묵에 관여하는 것으로 생각된다. 대부분의 piRNA는 트랜스포존 서열에 대한 안티센스이며, 이는 트랜스포존이 piRNA 표적임을 시사한다. 포유동물에서, 트랜스포존 침묵에서 piRNA의 활성은 배아의 발달 동안 가장 중요한 것으로 보이며, 씨. 엘레간스(C. elegans) 및 인간 둘 모두에서, piRNA는 정자형성에 필요하다. piRNA는 RNA-유도된 침묵화 복합체(RISC)의 형성을 통해 RNA 침묵에서 역할을 한다.
일부 구체예에서, 비-코딩 RNA는 miRNA를 포함한다. miRNA 및 다른 작은 간섭 핵산은 표적 RNA 전사체 절단/분해 또는 표적 메신저 RNA(mRNA)의 번역 억제를 통해 유전자 발현을 조절한다. miRNA는 전형적으로 최종 19-25개의 비-번역된 RNA 생성물로서 본래 발현된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)과의 서열-특이적 상호작용을 통해 이들의 활성을 나타낸다. 이러한 내인성으로 발현된 miRNA는 헤어핀 전구체를 형성하고, 이는 후속적으로 miRNA 듀플렉스로, 그리고 추가로 "성숙한" 단일 가닥 miRNA 분자로 처리된다. 이러한 성숙한 miRNA는 성숙한 miRNA에 대한 상보성에 기초하여 표적 mRNA의, 예를 들어, 3' UTR 영역에서 표적 부위를 확인하는 다중단백질 복합체, miRISC를 안내한다. 도 13a 및 도 13b는 miRNA 유전자 및 이들의 상동체의 비제한적인 목록, 또는 본원에 기재된 핵산에 의해 인코딩된 작은 간섭 핵산(예를 들어, miRNA 스폰지, 안티센스 올리고뉴클레오티드, TuD RNA)에 대한 표적을 개시한다.
miRNA는 이것이 표적화하는 mRNA의 기능을 억제하고, 결과적으로 mRNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 억제한다. 따라서, miRNA의 활성을 (부분적으로 또는 완전히) 차단하는 것(예를 들어, miRNA를 침묵시키는 것)은 발현이 억제된 폴리펩티드의 발현을 효과적으로 유도하거나 회복시킬 수 있다(폴리펩티드의 탈-억제). 일부 구체예에서, miRNA의 mRNA 표적에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 탈-억제는 다양한 방법 중 어느 하나를 통해 세포에서 miRNA 활성을 억제함으로써 달성된다. 예를 들어, miRNA의 활성 차단은 miRNA에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 작은 간섭 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA 스폰지, TuD RNA)과의 하이브리드화에 의해 달성될 수 있고, 이에 의해 표적 mRNA와의 miRNA의 상호작용을 차단할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, miRNA에 실질적으로 상보적인 작은 간섭 핵산은 miRNA와 하이브리드화될 수 있고, miRNA의 활성을 차단할 수 있는 것이다. 일부 구체예에서, miRNA에 실질적으로 상보적인 작은 간섭 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개의 염기를 제외하고는 모두 miRNA와 상보적인 작은 간섭 핵산이다. 일부 구체예에서, miRNA에 실질적으로 상보적인 작은 간섭 핵산 서열은 적어도 하나의 염기에서 miRNA와 상보적인 작은 간섭 핵산 서열이다.
유전자-편집 시스템
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 표적 게놈 내의 본 개시의 GSH로 핵산을 통합하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 통합은 외인성으로 도입된 뉴클레아제에 의해 개시 및/또는 촉진되고, 뉴클레아제에 의해 유도된 DNA 절단은 상동성 재조합을 위한 가이드로서 상동성 아암을 사용하여 복구되어, 상기 상동성 아암에 의해 플랭킹된 핵산을 표적 게놈으로 삽입한다.
일부 구체예에서, 유전자-편집 시스템은 유전자 또는 조절 요소에 특정 변형을 도입함으로써 내인성 유전자의 발현을 녹-다운시키기 위해 GSH에 도입된다. 일부 구체예에서, 유전자-편집 시스템은 GSH에 도입되어 내인성 유전자의 전부 또는 일부를 녹-아웃하거나 결실시켜 유전자의 유해한 카피를 제거할 수 있다. 일부 구체예에서, 유전자 발현의 이러한 음성 조절은 조절되며, 예를 들어, 유전자-편집 시스템은 유도성 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터 하에 있을 수 있고, 이는 예를 들어, 시간적 제어(예를 들어, 유전자는 분화의 특정 단계에서 결실될 수 있음)를 사용하여 선택적 유전자 하향 조절, 및/또는 유전자의 조직-특이적 녹-다운 또는 녹-아웃을 허용한다.
예를 들어, 이중-가닥 절단(DSB)은 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제(TALEN)와 같은 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Urnov et al. (2010) Nature 435(7042):646-51; U.S. Patent Nos. 8,586,526; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054, 이의 개시는 참조로 포함됨] 참조.
또 다른 뉴클레아제 시스템은 CRISPR/Cas 시스템으로 알려진 박테리아 및 고세균에서 발견되는 소위 후천 면역 시스템의 사용을 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 박테리아의 40% 및 고세균의 90%에서 발견되며 이들 시스템의 복잡성은 상이하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,697,359 참조. CRISPR 유전자좌(규칙적으로 이격된 클러스터링된 짧은 회문 반복)는 외래 DNA의 짧은 세그먼트가 짧은 반복 회문 서열 사이에 통합되는 유기체의 게놈 내의 영역이다. 이러한 유전자좌는 전사되고 RNA 전사체("pre-crRNA")는 짧은 CRISPR RNA(crRNA)로 처리된다. 이러한 RNA 및 "Cas" 단백질(CRISPR 관련)로 공지된 단백질을 모두 혼입하는 3가지 유형의 CRISPR/Cas 시스템이 있다. 타입 I 및 III 둘 모두는 pre-crRNA를 처리하는 Cas 엔도뉴클레아제를 가지며, 이는 crRNA로 완전히 처리될 때, crRNA에 상보적인 핵산을 절단할 수 있는 다중-Cas 단백질 복합체를 어셈블링한다.
타입 II 시스템에서, crRNA는 프리-crRNA의 반복 서열에 상보적인 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA)가 Cas9 단백질 또는 이의 변이체의 존재 하에 이중 가닥-특이적 RNase III에 의한 처리를 촉발하는 상이한 메커니즘을 사용하여 생산된다. 이후, Cas9는 성숙한 crRNA에 상보적인 표적 DNA를 절단할 수 있지만, Cas9에 의한 절단은 crRNA와 표적 DNA 사이의 염기쌍-형성, 및 PAM 서열(프로토스페이서 인접 모티프)로 지칭되는 crRNA에 있는 짧은 모티프의 존재 둘 모두에 의존한다(Qi et al (2013) Cell 152: 1173 참조). 또한, tracrRNA는 또한 이의 3' 말단에서 crRNA와 염기쌍을 이루기 때문에 존재해야 하며, 이러한 결합은 Cas9 활성을 촉발한다.
Cas9 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인을 갖는다: 하나의 뉴클레아제 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 유사하고, 다른 하나는 Ruv 엔도뉴클레아제 도메인과 유사하다. HNH-타입 도메인은 crRNA에 상보적인 DNA 가닥을 절단하는 역할을 하는 반면 Ruv 도메인은 비-상보적 가닥을 절단하는 것으로 보인다. Cas9의 변이체는 당 분야에 인지된, 예를 들어, 표적외 활성을 감소시키는 Cas9 닉카제 돌연변이체이다(예를 들어, 문헌[Ran et al. (2014) Cell 154(6): 1380-1389), nCas, Cas9-D10A] 참조).
crRNA-tracrRNA 복합체의 요건은 crRNA 및 tracrRNA의 어닐링에 의해 정상적으로 형성된 헤어핀을 포함하는 조작된 "단일-가이드 RNA"(sgRNA)의 사용에 의해 회피될 수 있다(Jinek et al (2012) Science 337:816 and Cong et al (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143 참조). 따라서, 외인성으로 도입된 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 이의 변이체) 및 가이드 RNA(예를 들어, sgRNA 또는 gRNA)는 표적 세포의 게놈 내의 특정 유전자좌에서 DNA 절단을 유도할 수 있다. 표적화에 적합한 단일-가이드 RNA 또는 가이드 RNA(sgRNA 또는 gRNA) 서열의 비제한적인 예는 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 출원 2015/0056705의 표 1에 제시되어 있다. 또한, sgRNA 또는 gRNA는 본원에 기재된 GSH 유전자좌의 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 유전자 편집 핵산 서열은 서열 특이적 뉴클레아제, 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA), CRISPR/Cas, 리보핵단백질(RNP) 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 서열-특이적 뉴클레아제는 TAL-뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, megaTAL, 또는 CRISPR/Cas 시스템의 RNA 가이드 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas 단백질, 예를 들어, CAS 1-9, Csy, Cse, Cpfl, Cmr, Csx, Csf, cpfl, nCAS 등)를 포함한다. 이러한 유전자 편집 시스템은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 전문이 참조로 포함된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2013/038536 및 미국 특허 공개 번호 2017-0191078-A9에 기재된 TALENS를 참조한다. CRISPR cas9 시스템은 당 분야에 공지되어 있고 2013년 3월에 출원된 미국 특허 출원 번호 13/842,859 및 미국 특허 번호 8,697,359, 8771,945, 8795,965, 8,865,406, 8,871,445에 기재되어 있다. GSH는 또한 불활성화된 뉴클레아제 시스템, 예를 들어, CRISPRi 또는 CRISPRa dCas 시스템, nCas, 또는 Cas13 시스템에 유용하다.
가이드 RNA(gRNA)
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드되고 선택된 게놈 표적 서열에 대한 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 복합체의 서열-특이적 표적화를 지시하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구체예에서, 가이드 RNA는 표적 서열, 및 예를 들어, 리보핵단백질(RNP), 예를 들어 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는 CRISPR 관련 단백질에 결합한다.
일부 구체예에서, 가이드 RNA(gRNA) 서열은 gRNA 서열을 게놈의 요망되는 부위로 지시하는 표적화 서열을 포함하고, 가이드 서열과 RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 결합을 허용하는 crRNA 및/또는 tracrRNA 서열에 융합된다. 일부 구체예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 적어도, 약, 또는 최대 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler Transform에 기반한 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies, ELAND(Illumina, San Diego, Calif.), SOAP, 및 Maq과 같은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내 또는 본원에 개시된 바와 같은 GSH 내의 서열이다. 일부 구체예에서, 가이드 RNA는 표적화된 DNA 서열의 어느 한 가닥에 상보적일 수 있다. RNA-가이드 엔도뉴클레아제에 의한 표적화된 절단의 목적을 위해, 게놈에서 독특한 표적 서열이 게놈에서 1회 초과로 발생하는 표적 서열보다 바람직하다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 생물정보학 소프트웨어는 가이드 RNA의 표적외 효과를 예측하고 최소화하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Naito et al. "CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites" Bioinformatics (2014), epub; Heigwer et al. "E-CRISP: fast CRISPR target site identification" Nat. Methods 11:122-123 (2014); Bae et al. "Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases" Bioinformatics 30(10): 1473-1475 (2014); Aach et al. "CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes" BioRxiv (2014)] 참조).
일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "crRNA/tracrRNA 융합 서열"은 독특한 표적화 서열에 융합되고 가이드 RNA 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 포함하는 복합체의 형성을 허용하는 기능을 하는 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 서열은 (i) 본원에 기재된 바와 같은 표적 서열에 상응하는 "프로토스페이서"로 지칭되는 가변 서열, 및 (ii) CRISPR 반복부를 포함하는, 원핵생물에서 CRISPR RNA(crRNA) 서열을 모델로 삼을 수 있다. 유사하게, 융합체의 tracrRNA("트랜스활성화 CRISPR RNA") 부분은 엔도뉴클레아제 복합체의 형성을 허용하기 위해 원핵생물에서 tracrRNA 서열과 유사한 이차 구조(예를 들어, 헤어핀)를 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 전사체는 전사 종결 서열, 예를 들어, polyT 서열, 예를 들어, 6개의 T 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 가이드 RNA는 2개의 RNA 분자를 포함할 수 있고, 본원에서 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로 지칭된다. 일부 구체예에서, dgRNA는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자, 및 tracrRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 RNA 분자는 crRNA 상의 깃대와 tracrRNA 사이의 염기쌍 형성을 통해 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다. dgRNA를 사용할 때, 깃대는 길이와 관련하여 상한을 가질 필요는 없다.
다른 구체예에서, 가이드 RNA는 단일 RNA 분자를 포함할 수 있고, 본원에서 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로 지칭된다. 일부 구체예에서, sgRNA는 tracrRNA에 공유적으로 연결된 crRNA를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, crRNA 및 tracrRNA는 링커를 통해 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, sgRNA는 crRNA 상의 깃대와 tracrRNA 사이의 염기쌍-형성을 통해 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단일-가이드 RNA는 적어도, 약, 또는 최대 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120개 이상의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 75-120, 75-110, 75-100, 75-90, 75-80, 80-120, 80-110, 80-100, 80-90, 85-120, 85-110, 85-100, 85-90, 90-120, 90-110, 90-100, 100-120, 100-120개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 구체예에서, GSH 유전자좌로의 관심 핵산의 통합을 위한 본원에 기재된 바와 같은 핵산 벡터 또는 이의 조성물은 적어도 1개의 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 1개 gRNA 내지 50개 gRNA, 또는 적어도, 약, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 gRNA를 인코딩할 수 있다. 상이한 gRNA를 인코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 gRNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 동일한 프로모터일 수 있다. 상이한 gRNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 상이한 프로모터일 수 있다. 프로모터는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 억제성 프로모터, 또는 조절성 프로모터일 수 있다.
일부 구체예에서, 비-GSH 핵산은 Cas 닉카제(nCas; 예를 들어, Cas9 닉카제 또는 Cas9-D10A)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 또 다른 벡터와 함께 표적 세포를 포함하거나 이에 도입된다. 이러한 nCas 효소는 본원에 기재된 바와 같은 GSH에 대한 상동성을 포함하는 가이드 RNA와 함께 사용되며, 예를 들어, 물리적으로 제한된 서열을 방출하거나 비틀림 방출을 제공하기 위해 사용될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 물리적으로 제한된 서열을 방출하는 것은, 예를 들어, 상동성 지시 복구(HDR) 주형 상동성 아암(들)이 게놈 서열과의 상호작용을 위해 노출되도록 벡터를 "언와인드(unwind)"할 수 있다.
일부 구체예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 원하는 핵산의 통합을 용이하게 하는 DNA 절단을 유도하는데 사용된다. 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "ZFN"은 완전히 어셈블링될 때 DNA를 절단할 수 있는 적어도 하나의 뉴클레아제 또는 뉴클레아제의 일부에 효과적으로 연결된 적어도 하나의 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "아연 핑거"는 DNA 서열을 인식하고 이에 결합하는 단백질 구조를 지칭한다. 아연 핑거 도메인은 인간 프로테옴에서 가장 흔한 DNA-결합 모티프이다. 단일 아연 핑거는 대략 30개의 아미노산을 함유하고, 도메인은 전형적으로 염기쌍 당 단일 아미노산 측쇄의 상호작용을 통해 DNA의 3개의 연속적인 염기쌍에 결합함으로써 기능한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 통합을 위한 핵산은, 예를 들어, 문헌[Porro et al., Promoterless gene targeting without nucleases rescues lethality of a Crigler-Najjar syndrome mouse model, EMBO Molecular Medicine, (2017)]에 기재된 바와 같이, 뉴클레아제가 없는 상동성-의존적 복구 시스템에서 표적 게놈에 통합된다. 일부 구체예에서, 생체내 유전자 표적화 접근법은 뉴클레아제를 사용하지 않고 공여자 서열을 삽입하는데 적합하다. 일부 구체예에서, 공여자 서열은 프로모터가 없을 수 있다.
일부 구체예에서, 제한 부위 사이에 위치한 뉴클레아제는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "RNA-가이드 엔도뉴클레아제"는 선택된 표적 DNA 서열에 상보적인 영역을 포함하는 RNA 분자와 복합체를 형성하여, RNA 분자가 본원에서 확인된 GSH에서 선택된 표적 DNA 서열에 대한 엔도뉴클레아제 활성을 지시하도록 선택된 서열에 결합하는 엔도뉴클레아제를 지칭한다.
CRISPR/CAS 시스템
당 분야에서 인지되고 상기 기재된 바와 같이, CRISPR-CAS9 시스템은 유기체의 유전 서열을 변경할 수 있는 단백질 및 리보핵산("RNA")의 조합을 포함한다(예를 들어, US 공개 2014/0170753 참조). CRISPR-Cas9는 포유동물 세포에서 비상동성 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성 재조합을 통한 Cas9-매개 게놈 편집을 위한 도구 세트를 제공한다. 당업자는 타입 I, 타입 II, 및 타입 III과 같은 다수의 공지된 CRISPR 시스템 중에서 선택할 수 있다. 일부 구체예에서, GSH 유전자좌로의 관심 핵산의 통합을 위한 본원에 기재된 핵산은 가이드 RNA, tracrRNA, 또는 Cas(예를 들어, Cas9 또는 이의 변이체)와 같은 이러한 시스템의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 특정 구체예에서, 단일 프로모터는 가이드 서열 및 tracrRNA의 발현을 유도하고, 별도의 프로모터는 Cas(예를 들어, Cas9 또는 이의 변이체) 발현을 유도한다. 당업자는 특정 Cas 뉴클레아제가 표적 핵산 서열에 인접한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 존재를 필요로 한다는 것을 이해할 것이다.
Cas(예를 들어, Cas9 또는 이의 변이체)를 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제는 본원에 기재된 핵산의 통합을 개시 및/또는 촉진하기에 적합하다. 가이드 RNA는 DNA의 동일한 가닥 또는 상보적 가닥으로 지시될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 CRISPRi(CRISPR 간섭) 및/또는 CRISPRa(CRISPR 활성화) 시스템을 포함하고/하거나 이를 숙주 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다. CRISPRi 및 CRISPRa 시스템은 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 없는 불활성화된 RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 이의 변이체)를 포함한다. 이는 가이드 RNA와 함께 엔도뉴클레아제가 게놈에서 표적 서열에 특이적으로 결합하고 RNA-지시된 가역적 전사 제어를 제공하도록 한다.
따라서, 일부 구체예에서, GSH 유전자좌로의 관심 핵산의 통합을 위한 본원에 기재된 핵산 조성물 및 방법은 불활성화된 엔도뉴클레아제, 예를 들어, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 및/또는 Cas9 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고, 여기서 불활성화된 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성이 없지만, 예를 들어, 하나 이상의 가이드 RNA 및/또는 sgRNA와 함께 부위-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 벡터는 하나 이상의 tracrRNA, 가이드 RNA, 또는 sgRNA를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 불활성화된 엔도뉴클레아제는 전사 활성화 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, GSH 유전자좌로의 관심 핵산의 통합을 위한 본원에 기재된 핵산 조성물 및 방법은 하이브리드 재조합효소를 포함할 수 있다. 예를 들어, Cys2-His2 아연-핑거 또는 TAL 이펙터 DNA-결합 도메인에 융합된 세린 재조합효소의 레졸바제/인버타제 패밀리로부터 유래된 활성화된 촉매 도메인에 기반한 하이브리드 재조합효소는 포유동물 세포에서 표적화 특이성을 개선시킬 수 있는 시약 부류이고 우수한 부위-특이적 통합 속도를 달성한다. 적합한 하이브리드 재조합효소는 문헌[Gaj et al. Enhancing the Specificity of Recombinase-Mediated Genome Engineering through Dimer Interface Redesign, Journal of the American Chemical Society, (2014)]에 기재된 것들을 포함한다.
본원에 기재된 뉴클레아제는 변경될 수 있고, 예를 들어, 서열 특이적 뉴클레아제를 설계하도록 조작될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 8,021,867 참조). 뉴클레아제는, 예를 들어, 문헌[Certo et al. Nature Methods (2012) 9:073-975; 미국 특허 번호 8,304,222; 8,021,867; 8,119,381; 8,124,369; 8,129,134; 8,133,697; 8,143,015; 8,143,016; 8,148,098; 또는 8,163,514, 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨]에 기재된 방법을 사용하여 설계될 수 있다. 대안적으로, 부위 특이적 절단 특징을 갖는 뉴클레아제는 상업적으로 이용 가능한 기술, 예를 들어, Precision BioSciences의 Directed Nuclease Editor™ 게놈 편집 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
MEGATAL
일부 구체예에서, 본원에 기재된 뉴클레아제는 megaTAL일 수 있다. MegaTAL은 전사 활성화제-유사(TAL) 이펙터 도메인 및 메가뉴클레아제 도메인을 포함하는 조작된 융합 단백질이다. MegaTAL은 TAL의 표적 특이성 조작의 용이성을 유지하면서 표적외 효과 및 전체 효소 크기를 감소시키고 활성을 증가시킨다. MegaTAL 작제 및 용도는, 예를 들어, 문헌[Boissel et al. 2014 Nucleic Acids Research 42(4):259l-60l and Boissel 2015 Methods Mol Biol 1239: 171-196]에 보다 상세히 기재되어 있다. MegaTAL-매개 유전자 녹아웃 및 유전자 편집을 위한 프로토콜은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sather et al. Science Translational Medicine 2015 7(307):ral56 and Boissel et al. 2014 Nucleic Acids Research 42(4):259l-60l]을 참조한다. MegaTAL은 본원에 기재된 임의의 방법 및 조성물에서 대안적인 엔도뉴클레아제로서 사용될 수 있다.
조절 서열
본원에 개시된 핵산 벡터는 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 절연체, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 인코딩하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 조절 서열은 본원에 기재된 바와 같은 관심 핵산과 같은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 지시할 수 있는 적합한 프로모터 서열을 포함한다. 구체예에서, 인핸서 서열은 프로모터의 효능을 증가시키기 위해 프로모터의 상류에 제공된다. 일부 구체예에서, 조절 서열은 인핸서 및 프로모터를 포함하고, 여기서 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 인트론 서열을 포함하고, 인트론은 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위(들)를 포함하고, 프로모터는 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본원에 기재된 것들을 포함하는 적합한 프로모터는 바이러스로부터 유래될 수 있고, 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 이들은 원핵 또는 진핵 유기체를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터는 곤충 세포 또는 포유동물 세포로부터 유래된다. 적합한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라제(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 포진 바이러스(HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어, CMV 즉시 초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 작은 핵 프로모터(Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), 향상된 U6 프로모터(예를 들어, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)), 인간 H1 프로모터(H1) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 이러한 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 변경된다.
프로모터는 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 시작 부위로부터 수천 개만큼의 염기쌍에 위치될 수 있는 원위 인핸서 또는 억제인자 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 항시적으로, 또는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 또는 발현이 발생하는 발달 단계와 관련하여, 또는 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여 차별적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 운영자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터 뿐만 아니라 하기에 열거된 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터 및/또는 인핸서는 임의의 관심 유전자, 예를 들어, 유전자 편집 분자, 공여자 서열, 치료 단백질 등의 발현을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 DNA 엔도뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas9-기반 시스템에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. CRISPR/Cas9-기반 시스템 또는 부위-특이적 뉴클레아제 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 유인원 바이러스 40(SV40)으로부터의 프로모터, CAG 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 프로모터, 예를 들어, 소 면역결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니(Moloney) 바이러스 프로모터, 조류 백혈증 바이러스(ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어, CMV 즉시 초기 프로모터, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유비퀴틴 C(hUbC), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 천연 또는 합성의 간 특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 구체예에서, 간으로의 전달은 간세포의 표면에 존재하는 저밀도 지단백질(LDL) 수용체를 통해 간세포로의 벡터를 포함하는 조성물의 내인성 ApoE 특이적 표적화를 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, 조절 요소의 어셈블리를 갖는 인 실리코 설계된 합성 프로모터가 사용된다. 이러한 합성 프로모터는 자연적으로 발생하지 않으며, 표적 조직에서의 최적 발현, 조절된 발현, 또는 바이러스 캡시드에서의 수용을 위해 설계된다.
일부 구체예에서, 프로모터는 (a) 핵산에 이종성인 프로모터, (b) 핵산의 조직-특이적 발현을 용이하게 하는 프로모터, 바람직하게는 프로모터가 조혈 세포-특이적 발현 또는 적혈구 계통-특이적 발현을 촉진함, (c) 핵산의 구성적 발현을 용이하게 하는 프로모터, 및 (d) 선택적으로 대사산물 또는 소분자 또는 화학적 실체에 반응하여, 유도적으로 발현되는 프로모터로부터 선택될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린, 큐메이트, 라파마이신, FKCsA, ABA, 타목시펜, 청색광, 및 리보스위치에 의해 조절되는 것들을 포함한다. 추가 세부사항은, 예를 들어, 문헌[Kallunki et al. (2019) Cells 8:E796, 참조로 포함됨]에서 제공된다. 일부 구체예에서, 프로모터는 CMV 프로모터, β-글로빈 프로모터, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, Wiskott-Aldrich 프로모터, 및 PKLR 프로모터로부터 선택된다. 또한 "박동성 유전자 발현 및 조정 가능한 유전자 발현" 섹션을 참조한다.
내인성 유전자의 발달 및 계통-특이적 발현을 지시하는 상당한 수의 유전자 및 이들의 제어 요소(프로모터 및 인핸서)가 공지되어 있다. 따라서, 줄기 세포에 삽입된 제어 요소(들) 및/또는 유전자 생성물의 선택은 어떤 계통 및 어떤 발달 단계에 관심이 있는지에 따라 달라질 것이다. 또한, 계통-특이적 발현 및 줄기 세포 분화의 더 미세한 기계론적 구별에 대한 자세한 내용이 이해됨에 따라, 이를 실험 프로토콜에 통합하여 광범위한 원하는 줄기 세포의 효율적인 분리를 위한 시스템을 완전히 최적화할 수 있다.
임의의 계통-특이적 또는 세포 운명 조절 요소(예를 들어, 프로모터) 또는 세포 마커 유전자가 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 계통-특이적 및 세포 운명 유전자 또는 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특정 관심 계통을 평가하기 위해 용이하게 선택될 수 있다. 비제한적인 예는 Ang2, Flkl, VEGFR, MHC 유전자, aP2, GFAP, Otx2(예를 들어, 미국 특허 번호 5,639,618 참조), Dlx(Porteus et al. (1991) Neuron 7:221-229), Nix(Price et al. (1991) Nature 351:748-751), Emx(Simeone et al. (1992) EMBO J . 11:2541- 2550), Wnt(Roelink and Nuse (1991) Genes Dev. 5:381-388), En(McMahon et al.), Hox(Chisaka et al. (1991) Nature 350:473-479), 아세틸콜린 수용체 베타 사슬(ACHRP)(Otl et al. (1994) J . Cell. Biochem. Supplement 18A: 177)와 같은 유전자로부터 수득된 조절 요소를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 조절 요소가 수득될 수 있는 계통-특이적 유전자의 다른 예는 인터넷을 통해 쉽게 접근할 수 있고 당업자에게 잘 알려진 NCBI-GEO 웹사이트에서 이용 가능하다.
서열
본원에서 사용되는 코딩 영역은 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 지칭하는 반면, 비코딩 영역은 아미노산으로 번역되지 않는 뉴클레오티드 서열의 영역을 지칭한다. 전사된 비-코딩 서열은 상류(5'-UTR), 하류(3'-UTR), 또는 인트론일 수 있다. 전사되지 않은 비-코딩 서열은 인핸서 및 프로모터와 같이 시스-작용 조절 기능을 가질 수 있거나, 벡터 게놈의 크기를 증가시키는데 사용되는 폴리링커 또는 "스터퍼(stuffer)" DNA와 같이 DNA에서 작용기를 분리하는데 사용되는 전사되지 않은 DNA인 "스페이서"로서 작용할 수 있다.
"~에 보체인" 또는 "상보적인"은 2개의 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2개 영역 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 잔기가 티민 또는 우라실인 경우 제1 영역에 역평행인 제2 핵산 영역의 잔기와 특이적 수소 결합(염기쌍 형성)을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 잔기가 구아닌인 경우 제1 가닥에 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 핵산의 제1 영역은, 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 경우 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 일부 구체예에서, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이에 의해, 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 부분의 뉴클레오티드 잔기의 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100%는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 전사 조절 서열과 관련하여, 작동 가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는데 필요한 경우, 인접하고 리딩 프레임 내에 있음을 의미한다.
유전 부호(하기 제시됨)에 의해 정의된 바와 같이, 특정 단백질의 아미노산 서열과 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열 사이에는 공지되고 명확한 일치성이 존재한다. 마찬가지로, 유전 부호에 의해 정의된 바와 같이, 특정 핵산의 뉴클레오티드 서열과 그 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 사이에는 공지되고 명확한 일치성이 존재한다.
유전 부호
알라닌(Ala, A)
GCA, GCC, GCG, GCT
아르기닌(Arg, R)
AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
아스파라긴(Asn, N)
AAC, AAT
아스파르트산(Asp, D)
GAC, GAT
시스테인(Cys, C)
TGC, TGT
글루탐산(Glu, E)
GAA, GAG
글루타민(Gln, Q)
CAA, CAG
글리신(Gly, G)
GGA, GGC, GGG, GGT
히스티딘(His, H)
CAC, CAT
이소류신(Ile, I)
ATA, ATC, ATT
류신(Leu, L)
CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
리신(Lys, K)
AAA, AAG
메티오닌(Met, M)
ATG
페닐알라닌(Phe, F)
TTC, TTT
프롤린(Pro, P)
CCA, CCC, CCG, CCT
세린(Ser, S)
AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
트레오닌(Thr, T)
ACA, ACC, ACG, ACT
트립토판(Trp, W)
TGG
티로신(Tyr, Y)
TAC, TAT
발린(Val, V)
GTA, GTC, GTG, GTT
종결 신호(종료)
TAA, TAG, TGA
유전 부호의 중요하고 잘 알려진 특징은 이의 축퇴성이며, 이에 의해 단백질을 제조하는데 사용되는 대부분의 아미노산에 대해, 하나 초과의 코딩 뉴클레오티드 삼중항이 사용될 수 있다(상기 예시됨). 따라서, 다수의 상이한 뉴클레오티드 서열이 주어진 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 유전 부호의 보편성은, 미토콘드리아 및 원형자 및 유사한 공생 세포기관이 약간 상이한 유전 부호를 갖더라도, 이러한 뉴클레오티드 서열이 모든 유기체에서 동일한 아미노산 서열의 생산을 초래하기 때문에 기능적으로 동등한 것으로 간주된다는 것을 제공한다. 모든 코돈이 유사한 번역 효율로 이용되는 것은 아니지만, 드문 코돈은 tRNA 풀을 제한하기 때문에 단백질 생산을 낮출 수 있다. 또한, 때때로, 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화된 변이체가 주어진 뉴클레오티드 서열에서 발견될 수 있다. 이러한 메틸화는 트리뉴클레오티드 코돈과 상응하는 아미노산 사이의 코딩 관계에 영향을 미치지 않는다.
폴리펩티드의 아미노 서열을 변화시킬 때, 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당 분야에서 이해된다. 아미노산의 상대적인 소수성 특성은 생성된 단백질의 이차 구조에 기여하고, 이는 차례로 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 정의하는 것으로 인정된다. 각각의 아미노산은 이들의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 소수성 지수가 할당되었다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(<RTI 3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
특정 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성할 수 있으며, 즉, 여전히 생물학적으로 기능적으로 동등한 단백질을 수득할 수 있다는 것이 당 분야에 공지되어 있다.
상기 개요된 바와 같이, 따라서, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기반한다. 다양한 전술한 특성을 고려한 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
또한, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 아미노산 서열을 변경하지 않고 특정 숙주 세포에 대해 코돈-최적화될 수 있다는 것이 당 분야에 공지되어 있다. 코돈-최적화는 단백질 생산을 증가시키기 위해 동의 코돈 변화를 사용하는 유전자 공학 접근법을 설명한다. 이는 대부분의 아미노산이 하나 초과의 코돈에 의해 인코딩되기 때문에 가능하다. 드문 코돈을 자주 사용되는 코돈으로 대체하는 것은 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.
전술한 바와 같이, 본원에 기재된 핵산(또는 이의 임의의 부분)(예를 들어, 치료 핵산)을 인코딩하는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA를 아미노산 서열로 번역하기 위한 유전 부호를 사용하여, 폴리펩티드 아미노산 서열을 유도하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드 아미노산 서열의 경우, 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 상응하는 뉴클레오티드 서열은 유전 부호로부터 추론될 수 있다(이의 중복성으로 인해, 임의의 주어진 아미노산 서열에 대해 다중 핵산 서열을 생성할 것임). 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 본원의 설명 및/또는 개시는 또한 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에 대한 설명 및/또는 개시를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 유사하게, 본원의 폴리펩티드 아미노산 서열에 대한 설명 및/또는 개시는 또한 아미노산 서열을 인코딩할 수 있는 모든 가능한 뉴클레오티드 서열에 대한 설명 및/또는 개시를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
마지막으로, 본 발명에서 유용한 핵산 및 폴리펩티드 분자에 대한 핵산 및 아미노산 서열 정보는 당 분야에 잘 알려져 있으며, 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)와 같은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 용이하게 이용 가능하다.
표 3: GSH 유전자좌의 예시적인 서열
* 표 3의 좌표는 인간 게놈 어셈블리 GRCh38/hg38로부터의 것이다.
* 상기에는 cDNA, ssDNA, 및 RNA 핵산 분자(예를 들어, 우리딘으로 대체된 티미딘), 인코딩된 단백질의 이종상동체 또는 변이체를 인코딩하는 핵산 분자 뿐만 아니라 상기 열거된 임의의 SEQ ID NO의 핵산 서열 또는 이의 부분과 전장에 걸쳐 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열이 포함된다. 이러한 핵산 분자는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 전장 핵산의 기능을 가질 수 있다.
* 대표적인 GSH 유전자좌의 예시적인 특성화는 실시예 3의 표 5를 참조한다.
박동성 유전자 발현 및 조정 가능한 유전자 발현
특정 양태에서, 본 개시의 벡터(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터), 세포, 약학적 조성물, 및/또는 방법은 박동성 및/또는 조정 가능한 유전자 발현을 이용한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 조정 가능한 유전자 발현은, 예를 들어, 소분자 또는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 각각 테트라사이클린 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO 또는 AON))를 사용하여 트랜스진 발현을 마음대로 조절하여 트랜스진의 발현을 켜거나 끌 수 있다. 조정 가능한 유전자 발현은 종종 유도성 프로모터 또는 억제성 프로모터를 사용하여 달성되지만, 조정 가능한 조절은 전사를 넘어 유전자 발현의 조절을 포함하는 것으로 의도된다.
따라서, 조정가능한 유전자 발현은 전사, 전사후, 번역, 및/또는 번역후 수준에서 시간적 조절을 포함하는 것으로 의도된다. 조정 가능한 발현은 유전자 발현의 공간적 제어와 양립 가능하다. 예를 들어, 트랜스진의 공간적 제어는 트랜스진을 조직-특이적 프로모터 하에 배치한 후, 이를 시간적 제어를 매개하는 발현-조절제(예를 들어, 테트라사이클린 또는 ASO)와 조합함으로써 촉진될 수 있다.
박동성 유전자 발현은 규칙적인 간격으로 트랜스진의 생산을 켜고 끄는 것을 지칭한다. 임의의 조정 가능한 유전자 발현 시스템은 박동성 유전자 발현을 위해 이용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 임의의 유전자 발현의 조절은 박동성 유전자 발현과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다.
박동성 유전자 발현은 유전자 요법의 성공에 중요하다. 생리학적 및 장기적인 단백질 발현 수준을 얻는 것은 유전자 요법 적용에서 주요 과제로 남아 있다. 트랜스진의 고수준 발현은 치료 수개월 후에 ER 스트레스 및 언폴딩된 단백질 반응을 유도하여, 전-염증성 상태 및 세포 사멸을 초래하여, 요법의 이점을 위태롭게 할 수 있다. 박동성 트랜스진 발현 전략(PTES)은 표적 세포를 과발현 스트레스로부터 보호할 수 있고, 시간 경과에 따른 발현의 점진적인 감소 없이 트랜스진의 장기적인 발현을 가능하게 한다. 또한, 박동성 및/또는 조정 가능한 발현은, 예를 들어, 트랜스진에 의해 인코딩되는 단백질의 생산 효율 및/또는 안정성을 개선시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 PTES는 시약이 발현을 켜거나 발현을 억제하지 않을 때까지 디폴트 상태가 꺼져 있어, 환자의 특정 요구를 충족시키기 위한 용량의 보정을 가능하게 함으로써, 더 큰 안전성 및 장기적인 이점을 제공하는 조정 가능한 발현 시스템이다. 펄스의 타이밍은 관심 단백질의 초기 혈청 수준(t0) 및 반감기(t1/2)로부터 결정될 수 있다(실시예 11 참조).
예시적인 조정 가능한 발현 시스템
테트라사이클린-제어된 운영자 시스템
박테리아 조절 요소인 이. 콜라이(E. coli)의 Tn10-지정 테트라사이클린-내성 오페론은 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 시스템의 세 가지 예시적인 구성이 있다: (1) Tet 운영자(TetO)가 항시적 프로모터와 관심 유전자 사이에 삽입되고 운영자에 대한 tet 억제인자(TetR)의 결합이 하류 유전자 발현을 억제하는 억제-기반 구성. 이 시스템에서, 테트라사이클린의 첨가는 TetR과 TetO 사이의 결합을 파괴하여, TetO-의존적 유전자 발현을 촉발시킨다. (2) 탠덤 TetO 서열이 최소 항시적 프로모터의 상류에 위치하고 관심 유전자의 cDNA가 뒤따르는 Tet-off 구성. 여기서, 단순 포진 바이러스 타입 1로부터 유래된 진핵생물의 트랜스활성화제인 TetR 및 VP16(tTA)으로 구성된 키메라 단백질은 전사 활성화제로 전환되고, 발현 플라스미드는 운영자 플라스미드와 함께 트랜스펙션된다. 따라서, 테트라사이클린과 함께 세포를 배양하면 외인성 유전자 발현이 꺼지고, 테트라사이클린을 제거하면 이것이 켜진다. (3) 테트라사이클린이 성장 배지에 첨가될 때 외인성 유전자가 발현되는 Tet-on 구성. 테트라사이클린은 TetO-의존적 유전자 발현을 조절하는데 필요한 낮은 농도에서 포유동물 세포에 비독성이지만, 이의 지속적인 존재는 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, rtTA로 명명된 4개의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이체 tTA를 tTA의 무작위 돌연변이유발에 의해 개발하였다. tTA와 달리, rtTA는 테트라사이클린의 존재 하에 TetO 서열에 결합하여, 침묵하는 최소 프로모터를 활성화시킨다.
큐메이트-제어된 운영자 시스템
큐메이트-제어된 운영자는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 p-cmt 및 p-cym 오페론에서 기원한다. 상응하는 억제인자는 프로모터와 p-시멘 분해 경로에서 제1 유전자의 시작 사이의 불완전한 반복을 인식하는 N-말단 DNA-결합 도메인을 함유한다. 테트라사이클린-제어된 운영자 시스템과 유사하게, 큐메이트 운영자(CuO) 및 이의 억제인자(CymR)는 세 가지 구성으로 설계될 수 있다: (1) 항시적 프로모터의 하류에 CuO를 배치함으로써 실현되는 억제인자 구성, 여기서 CuO에 대한 CymR의 결합은 하류 유전자 발현을 효율적으로 억제한다. 큐메이트의 첨가는 CymR을 방출하여, 하류 유전자 발현을 촉발시킨다. (2) 활성화제 구성, 여기서 키메라 분자(cTA)는 CymR 및 VP16의 융합을 통해 형성된다. 이러한 구성에서, 최소 프로모터를 다량체화된 운영자 결합 부위의 하류에 배치하였다(6xCuO). (3) 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝 후, 큐메이트의 첨가시 CuO에 결합하는 cTA 돌연변이체(rcTA)가 생성된 역 활성화제 구성. 이러한 구성에서, 큐메이트의 첨가는 하류 유전자 발현을 촉발시켰다.
단백질-단백질 상호작용-기반 키메라 시스템
1.
FKBP12와 mTOR 사이의 상호작용의 제어에 의한 표적 유전자의 유도
라파마이신 및 이의 유사체 FK506은 세포질 단백질 FKBP12에 결합한다. 이 복합체는 mTOR에 추가로 결합하여 3구획 복합체를 형성한다. 따라서, FKBP12 및 mTOR를 각각 ZFHD1의 DNA-결합 도메인 및 NF-κB p65 단백질의 활성화 도메인과 융합시키는 것은 라파마이신-의존적 방식으로 관심 유전자의 발현을 유도하기 위해 둘 모두의 도메인을 연결한다. FK506 및 라파마이신의 면역억제성 및 세포 주기 억제 효과로 인해, FK506 및 사이클로스포린 A(단백질 사이클로필린과 복합체화된 면역억제제)의 이종이량체인 새로운 합성 화합물 FKCsA가 개발되었고 독성 또는 면역억제 효과를 나타내지 않는 것으로 나타났다. 유전자 발현을 촉발시키기 위해, 세포에 FKCsA의 첨가는 Gal4 DNA-결합 도메인(Gal4DBD)과 융합된 FKBP12 및 VP16과 융합된 사이클로필린을 힌지함으로써, 상류 활성화 서열(UAS, Gal4DBD 결합 부위)의 하류에서 관심 유전자의 발현을 활성화시킨다.
2.
PYL1과 ABI1 사이의 상호작용의 제어에 의한 표적 유전자의 유도
2개의 식물 단백질 사이의 앱시스산(ABA)-조절된 상호작용은 포유동물 세포에서 시간적 및 정량적 방식으로 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 2개의 단백질은 PYL1(앱시스산 수용체) 및 ABI1(단백질 포스파타제 2C56)이며, 이들은 식물에서 스트레스 반응 및 발달 결정에 필요한 ABA 신호전달 경로에서 중요한 역할을 한다. PYL1-ABA-ABI1 복합체의 결정 구조에 따라, PYL1(아미노산 33 내지 209) 및 ABI1(아미노산 126 내지 423)의 상호작용 상보적 표면을 키메라 단백질 작제를 위해 선택하였다. 유사하게, Gal4DBD는 ABI1과 융합되고, VP16은 PYL1과 융합되었다. 따라서, 이 ABA-활성화제 카세트 및 UAS-유도된 리포터를 포유동물 세포에 트랜스펙션시킨 후, ABA는 리포터의 생산을 유의하게 유도하였다. 라파마이신 시스템과 비교하여, ABA 시스템은 두 가지 강력한 이점을 갖는다: 첫째, ABA는 식물 추출물 및 오일을 함유하는 많은 식품에 존재한다 - 독성이 없다는 것은 환경 보호국(EPA)에 의한 광범위한 평가에 의해 뒷받침됨, 둘째, ABA 신호전달 경로는 포유동물 세포에 존재하지 않기 때문에, 라파마이신 시스템에서와 같이 경쟁하는 내인성 결합 단백질이 없어야 한다. ABI1에 의한 가능한 예상하지 못한 기질의 임의의 촉매작용을 추가로 피하기 위해, 이의 포스파타제 활성에 중요한 돌연변이를 키메라 단백질에 도입하였다.
3.
감광성 단백질-단백질 상호작용에 의한 표적 유전자의 유도
2개의 광-전환 가능한 트랜스진 시스템이 광-유도된 단백질-단백질 상호작용을 이용하여 개발되었다. 첫 번째는 균류의 일주기 리듬의 분자 기반에서 영감을 얻었다. 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)로부터의 광수용체 및 광-산소-전압(LOV) 도메인-함유 단백질인 비비드(Vivid)(VVD)는 청색광 활성화시 빠르게 교환되는 이량체를 형성한다. 따라서, VVD 및 Gal4 잔기 1-65로 구성된 키메라 단백질은 청색광-조명 하에 이량체화되어 전사 활성화제가 되는 반면, 활성 이량체는 청색광의 부재 하에 해리된다. 이는 UAS 하류의 리포터 발현이 청색광을 이용하여 시공간 방식으로 켜지거나 꺼질 수 있음을 의미한다. 또한, VVD의 돌연변이유발 최적화는 배경 발현을 최소 수준으로 추가로 감소시켜 시스템을 훨씬 더 실현 가능하게 만들었다. 또 다른 광-전환 가능한 트랜스진 시스템(광활성화 가능한 (PA)-Tet-OFF/ON)은 크립토크롬 2(Cry2) 광수용체 및 크립토크롬-상호작용 기본 나선-루프-나선 1(CIB1)로 구성된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)-유래된 청색광-반응성 이종이량체 형성을 활용한다. Cry2의 N-말단 부분에서 광분해효소 상동성 영역(PHR)은 비공유 결합에 의해 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)에 결합하는 발색단-결합 도메인이다. CIB1은 청색광-의존적 방식으로 Cry2와 상호작용한다. 따라서, 유도성 발현 시스템을 만들기 위해, PHR을 p65의 전사 활성화 도메인과 융합시키고, CIB1을 TetR의 DNA 결합, 이량체화 및 테트라사이클린-결합 도메인과 융합시켰다(잔기 1-206). 따라서, 리포터 유전자는 청색광 조명에 의해 켜질 수 있는 반면, 끄는 것은 청색광의 부재 또는 테트라사이클린 첨가에 의한 두 가지 방식으로 달성될 수 있다. 한편, 테트라사이클린 불감성 돌연변이인 H100Y는 이것이 순전히 조명에 의존하도록 확립되었다. 동일한 키메라 구조를 적용하지만, TetR을 rtTA로 대체하는 경우, 리포터 유전자는 청색광 조명 또는 테트라사이클린으로 켜질 수 있고, 청색광의 부재 또는 테트라사이클린의 제거에 의해 꺼질 수 있다. 일반적으로, 광-전환 가능한 트랜스진 시스템의 두 가지 이점은 다른 모든 시스템을 압도한다. 하나는 이들의 빠른 온/오프 사이클이다. 일주기 리듬의 특성으로 인해, 상기 언급된 2개의 단백질-단백질 상호작용은 동적이며, 이는 빠른 반응 및 회전율을 초래한다. 1-2분 동안의 짧은 광 펄스로도 루시퍼라제 발현을 유도하기에 충분하며, 이는 1.1 h 후에 피크에 도달하고 3 h 후에 배경 수준으로 감소하는 것으로 나타났다. 다른 이점은 정확한 공간 유도이다. 제한된 영역 또는 세포 집단 내의 조명은 고급 조명 공급원으로 실현될 수 있으며, 이에 의해 리포터 발현은 관심 특정 세포 또는 세포하 영역에서 선택적으로 유도될 수 있다. 이러한 독특한 특징은 미래의 세포-세포 거동 연구를 크게 촉진할 뿐만 아니라 임상 유전자 요법에 대한 광대한 잠재력을 제공할 것이다.
4.
타목시펜 제어된 시스템
가장 잘 특성화된 "가역적 스위치" 모델 중 하나인 타목시펜 유도성 시스템은 다수의 유익한 특징을 갖는다(예를 들어, Whitfield et al. (2015) Cold Spring Harb Protoc. 2015(3):227-234에 의해 검토됨). 이 시스템에서, 포유동물 에스트로겐 수용체의 호르몬-결합 도메인은 이종성 조절 도메인으로 사용된다. 리간드 결합시, 수용체는 이의 억제 복합체로부터 방출되고 융합 단백질은 기능적이 된다. 예를 들어, 에스트로겐 수용체(ER)의 리간드-결합 도메인(LBD)은 트랜스진과 융합될 수 있고, 이의 생성물은 항-에스트로겐 타목시펜 또는 이의 유도체 4-OH 타목시펜(4-OH-TAM)에 의해 활성화될 수 있는 키메라 단백질이다.
이 시스템은 게놈을 변형시키는 조절 가능한 재조합효소를 생성하기 위해 재조합효소와 함께 사용되었다. 예를 들어, 단일 또는 2개의 플라스미드 시스템이 유도성 유전자 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 첫 번째 성공적인 사례는 마우스 배아 세포에서 이루어졌다. 2개의 플라스미드를 함께 트랜스펙션시켰다. 하나는 Cre-ER 구성적 발현 플라스미드였고, 다른 하나는 LoxP에 의해 플랭킹된 유전자 트랩 서열에 이어, β-갈락토시다제(LacZ) 오픈 리딩 프레임을 함유하였다. 결과적으로, LacZ의 발현은 Cre-loxP-매개 재조합이 촉발되고 유전자 트랩 서열이 제거될 때만 회복될 수 있었다. 이러한 수단에 의해, 리포터 유전자는 미분화된 배아 줄기 세포 및 배아체 뿐만 아니라 10일령 키메라 태아의 모든 조직 또는 특정 분화된 성인 조직에서도 유도될 수 있었다. 또 다른 예에서, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포에서 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 발현을 유도하고 플라스미드 작제를 단순화하기 위해, LoxP 부위에 의해 플랭킹된 Cre-ER cDNA를 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터와 EGFP 인코딩 서열 사이에 삽입하였다. 이 시스템에서, Cre-ER은 4-OH-TAM 없이 EGFP의 전사를 차단하는 유전자 트랩으로서 기능한다. 4-OH-TAM에 의한 재조합효소 활성의 점화는 Cre-ER 카세트를 녹이고 PGK 프로모터에 의해 유도되는 EGFP 발현을 회복시킨다. 내인성 스테로이드에 의해 발휘되는 효과를 배제하기 위해, 3개의 별개의 ER이 주로 활용된다: (1) G525R 돌연변이를 갖는 마우스 ERTM, (2) G521R 돌연변이를 갖는 인간 ERT 및 (3) 3개의 돌연변이 G400V/M543/L544A를 함유하는 인간 ERT2.
5.
리보스위치-조절 가능한 발현 시스템
리보스위치-조절 가능한 발현 시스템은 망치머리형 리보자임(압타자임)과 연결된 박테리아-유래 RNA 압타머를 이용한다. 압타머는 전체 장치에 대한 분자 센서 및 변환기로서 작용하는 반면, 리보자임은 입체형태 변화 및 mRNA 절단을 통해 신호에 반응한다. 예를 들어, 그람-양성 박테리아의 압타자임은 과도한 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)를 직접 감지하고 glms 유전자의 mRNA를 절단할 수 있으며, 이의 단백질 생성물은 프룩토스-6-포스페이트(Fru6P) 및 글루타민을 GlcN6P로 전환시키는 효소이다. 테트라사이클린, 테오필린, 구아닌 등에 반응하는 이러한 압타자임은 관심 유전자를 녹다운하고 과발현하도록 조작되었다(예를 들어, 문헌[Yokobayashi et al. (2019) Curr Opin Chem Biol 52:72-78]에 의해 검토됨).
6.
ASO(안티센스 올리고뉴클레오티드) 조절된 발현 시스템
ASO는 DNA 또는 RNA에 결합할 수 있다. ASO는 RISC 복합체를 활성화하고 mRNA를 분해하기 위해 RNA 수준에서 작용하거나, 시스-작용 요소의 인식을 방해하는 효과적인 유전자 조절을 입증하였다. ASO는 세포를 효율적으로 트랜스펙션하는 지질 나노입자로 통상적으로 제형화된다. ASO는 "녹-다운" 적용, 어느 쪽이든 기능 획득(즉, 우성 음성), 전사체, 또는 동형접합 열성 질환에 사용된다. ASO가 돌연변이체 대립유전자로부터의 전사체에 특이적이지 않은 우성 음성 돌연변이에 의해 야기된 질병, 예를 들어, 헌팅턴병 및 다른 폴리-글루타민 확장 질병에서, 정상 세포 기능의 회복은 외인성 ASO에 대한 서열 상보성을 감소시키는 대체 동의 코돈을 갖는 벡터-전달된 트랜스진을 사용한 유전자 대체를 사용하여 달성될 수 있다. 따라서, ASO는 내인성 대립유전자로부터 전사체를 고갈시키지만 벡터-유도된 전사체는 영향을 받지 않는다.
도 14에 예시된 바와 같이, ASO는 유전자 발현을 음성 또는 양성으로 조절하기 위해 스플라이싱을 조절할 수 있다(또한 문헌[Havens and Hastings (2016) Nucleic Acids Research 44:6549-6563] 참조). 도 11의 실시예 I은 ASO(안티센스 올리고뉴클레오티드 ASO 또는 AON)가 전사후 유전자 발현을 음성으로 조절할 수 있음을 보여준다. ASO 없이, 일차 전사체는 번역 가능한 mRNA로 스플라이싱된다. 인트론의 3' 말단/엑손 2의 5' 말단에서 스플라이스 수용자에 상보적인 ASO(적색 선)의 첨가는 스플라이싱을 방해한다. 따라서, ASO의 존재 하에, 인트론은 전사체에 남아 있다. 인트론을 포함하는 이러한 처리되지 않은 RNA는 번역될 수 없거나 번역시 비-기능성 단백질을 생산한다.
도 11의 실시예 II는 또한 ASO가 전사후 유전자 발현에 양성적인 영향을 미칠 수 있음을 예시한다. 일차 전사체(좌측)는 4개의 엑손을 함유한다: 엑손 1, 엑손 3, 및 엑손 4는 치료 단백질을 인코딩하고, 엑손 2는 넌센스 돌연변이(들) 또는 프레임외 돌연변이(OOF)를 함유한다. 이러한 엑손 2는 임의의 트랜스진으로 조작될 수 있다. ASO 없이, 전사체는 4개의 엑손을 포함하는 성숙한 mRNA, 즉, 넌센스 돌연변이(들) 또는 OOF 돌연변이를 갖는 엑손 2가 남아 있도록 처리된다. 따라서, 생성된 mRNA는 트렁케이션된 또는 비-기능성 단백질로 번역된다. 대조적으로, ASO의 첨가는 스플라이싱을 방해하고, 성숙한 mRNA는 엑손 1, 엑손 3, 및 엑손 4로 구성되며, 즉, 넌센스 돌연변이(들) 또는 OOF 돌연변이를 갖는 엑손 2가 스플라이싱된다. 따라서, 디폴트 상태(ASO 없음)에서, 치료 단백질은 생산되지 않는다. ASO의 첨가시에만, 치료 단백질이 생산되어, 양성 조절을 초래한다.
이러한 접근법은 구성적으로 활성인 트랜스진 발현의 녹-다운, 즉, 디폴트 온을 허용한다. 일부 구체예에서, 디폴트 온 상태가 바람직하다. 다른 구체예에서, 디폴트 오프 조건이 바람직하다.
혈우병 A에 대한 예시적인 박동성 유전자 발현
특정 양태에서, 본원에 제공된 벡터(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터), 세포, 약학적 조성물, 및 방법은 혈우병 A에 걸린 대상체에 대한 유전자 요법을 위해 박동성 유전자 발현을 사용한다. 일부 구체예에서, ASO 조절된 발현 시스템은 혈우병 A에 걸린 대상체에서 인간 응고 인자 VIII(FVIII)를 인코딩하는 유전자를 간세포에 형질도입하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 박동성 유전자 발현(FVIII을 인코딩하는 트랜스진은 특정 간격으로 켜지고 꺼짐)을 사용하여 생산된 FVIII의 양을 조절한다(실시예 11 참조). FVIII 또는 이의 활성 단편(예를 들어, B-도메인 결실됨)을 인코딩하는 트랜스진의 전달 및 조절, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 아직 해결책이 없는 오랜 의학적 요구를 해결한다.
2020년에 FDA는 혈우병 A(HemA)에 대한 치료제로서 발록토코진 록사파보벡(Valoctocogene Roxaparvovec)(또는 BMN270)에 대한 Biomarin 생물학적 제제 라이센스 신청(BLA)을 승인하지 않았다. 재조합 아데노-관련 바이러스 타입 5(rAAV5)는 인간 응고 인자 VIII(FVIII)에 대한 유전자의 유도체를 HemA 환자의 간에 전달하였다. 더 높은 용량에서, FVIII는 치료된 환자를 효과적으로 "치료"하는 생리학적 수준 이상의 수준으로 발현되고 환자의 순환으로 분비되었다. 그러나, 장기적인 발현 수준은 3년 추적 동안 매년 0.5 내지 0.33씩 감소하였다. FVIII 발현은 임상적으로 유익한 수준으로 유지되었지만, FDA는 발현이 동일한 속도로 계속 감소할 경우 환자가 그들의 혈우병 표현형으로 되돌아갈 것이라는 우려를 표명하였다. 감소하는 발현 패턴에 대한 명확한 설명은 없다: 혈우병 B에 대한 이전의 임상 연구는 FIX 발현의 손실이 주로 처리된 AAV 캡시드 항원에 의해 유발된 급성 염증에 기인한 것임을 입증하였다. 그러나, 예방적 스테로이드 치료는 캡시드 면역 반응을 약화시키거나 제거하였고, 현재 간 관련 rAAV 치료에 일상적으로 사용된다. FVIII 발현의 손실을 설명하는 여러 가지 가능한 설명이 본원에서 고려된다.
FVIII는 미생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 생산하기 어려운 재조합 단백질이었다. FVIII의 "B-도메인" 결실된 버전의 개발은 오픈-리딩 프레임의 크기를 감소시키고 발현 수준을 개선시켰다. 그러나, FVIII 발현 수준은 여전히 다른 단백질보다 실질적으로 낮았다. 이러한 낮은 수준을 극복하기 위해, Biomarin은 임상 연구에서 벡터 용량을 증가시켰다. 환자를 kg 당 6E+13 벡터 입자(벡터 게놈 또는 vg로 지칭됨)로 치료하였다. 큰 동물 모델에 기반하여, 소수의 간세포는 rAAV5-FVIII로 흡수(형질도입)되고, 세포 당 많은 수의 vg로 인해, 비교적 많은 양의 FVIII를 발현한다. FVIII 발현에 대한 대사 요구는 간세포 단백질 발현에 대한 정상 요건을 방해할 가능성이 있다. 단백질 폴딩 및 분비에 정상적으로 관여하는 간세포 세포 구획은 FVIII로 혼잡해질 수 있다. FVIII 생산을 일으키는 내피 세포는 이러한 활성에 특화되어 고도로 조절된 천연 FVIII 프로모터의 전사 제어 하에 단일 X 염색체 상의 대립유전자로부터 FVIII를 생산할 가능성이 있다.
따라서, FVIII를 인코딩하는 트랜스진의 발현의 점진적인 감소를 방지하기 위해, 트랜스진은 규칙적인 간격으로 켜지고 꺼져 장기적인 효능을 달성한다. 펄스의 타이밍은 FVIII 단백질의 혈청 수준 및 반감기에 기반하여 결정된다(상세한 내용은 실시예 11 참조). 혈우병 A 예방 또는 치료를 위한 FVIII의 경우, 이상적인 상태는 일시적으로 활성화될 때까지 꺼진 상태이다. ASO는 일차 전사체에서 시스-작용 요소를 간섭함으로써 음성 또는 양성 효과를 유도하여 박동성 유전자 발현의 조절에 유연성을 제공하는데 사용될 수 있다.
바이러스 벡터
특정 양태에서, 본원에 기재된 핵산 벡터(예를 들어, 본 개시의 GSH 유전자좌의 적어도 일부를 포함하는 것들, 본 개시의 GSH 유전자좌로의 통합을 위한 이들 핵산 벡터 등)를 포함하는 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 바이러스 벡터는 rAd, AAV, rHSV, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스 벡터, HSV 유형 1(HSV-1)-AAV 하이브리드 벡터, 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS), 및 이의 변이체로부터 선택된다.
구체적으로, 바이러스 벡터는 세포 내로의 전달을 위해 외래 DNA의 단편이 삽입될 수 있는 바이러스 또는 바이러스 염색체 물질을 지칭한다. 이의 수명 주기에 DNA 단계를 포함하는 임의의 바이러스는 대상 방법 및 조성물에서 바이러스 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스일 수 있다. 또한, 수명 주기에서 DNA 단계를 갖는 RNA 바이러스, 예를 들어, DNA로 역전사되는 레트로바이러스, 예를 들어, MMLV, 렌티바이러스가 적합하다. 바이러스는 통합 바이러스 또는 비통합 바이러스일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용하기 위해 포함되는 바이러스 벡터는 검토 문헌[Hendrie, Paul C., and David W . Russell. "Gene targeting with viral vectors." Molecular Therapy 12.1 (2005): 9-17 and Perez-Pinera, "Advances in targeted genome editing." Current opinion in chemical biology 16.3 (2012): 268-277]에 논의된다.
아데노-관련 바이러스("AAV") 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 핵산 벡터 조성물로서 사용하기 위해 포함되며, 생체내 및 생체외 유전자 치료 절차에 유용하다(예를 들어, 문헌[West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Pat. No. 4,797,368; W O 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J . Clin. Invest. 94:1351 (1994)]을 참조한다). 재조합 AAV 벡터의 작제는 미국 특허 번호 5,173,414; 문헌 [Tratschin et al, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); and Samulski et al., J . Virol. 63:03822-3828 (1989)]을 포함하는 많은 공개 문헌에 기재된다. 적어도 6개의 바이러스 벡터 접근법이 현재 임상 시험에서 유전자 전달에 이용 가능하며, 이는 형질도입제를 생산하기 위해 헬퍼 세포주에 삽입된 유전자에 의한 결함 벡터의 보완을 포함하는 접근법을 이용한다.
바람직한 구체예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스이다. 아데노-관련 바이러스, 또는 "AAV"는 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 의미한다. 상기 용어는 달리 필요한 경우를 제외하고, 모든 서브타입 및 자연 발생 및 재조합 형태 둘 모두, 예를 들어, AAV 유형 1(AAV-1), AAV 유형 2(AAV-2), AAV 유형 3(AAV-3), AAV 유형. 4(AAV-4), AAV 유형 5(AAV-5), AAV 유형 6(AAV-6), AAV 유형 7(AAV-7), AAV 유형 8(AAV-8), AAV 유형 9(AAV-9), AAV 유형 10(AAV-10), AAV 유형 11(AAV-11), AAV 유형 12(AAV-12), AAV 유형 13(AAV-13), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV , 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 하이브리드 AAV(즉, 하나의 AAV 서브타입의 캡시드 단백질 및 또 다른 서브타입의 게놈 물질을 포함하는 AAV), 돌연변이체 AAV 캡시드 단백질 또는 키메라 AAV 캡시드를 포함하는 AAV(즉, AAV의 2개 이상의 상이한 혈청형, 예를 들어, AAV-DJ, AAV-LK3, AAV-LK19로부터 유래된 영역 또는 도메인 또는 개별 아미노산을 갖는 캡시드 단백질)를 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하고, "소 AAV"는 소 포유동물을 감염시키는 AAV, 기타 등등을 지칭한다.
재조합 AAV 벡터 또는 rAAV 벡터는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열(즉, AAV에 이종성인 폴리뉴클레오티드), 전형적으로 세포 내로 통합될 관심 핵산 서열(예를 들어, 비-GSH 핵산)을 포함하는 AAV 바이러스 또는 AAV 바이러스 염색체 물질을 의미한다. 일반적으로, 이종성 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나, 및 일반적으로 2개의 AAV 역전된 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된다. 일부 예에서, 재조합 바이러스 벡터는 또한 재조합 바이러스 벡터 물질의 패키징에 중요한 바이러스 유전자를 포함한다. "패키징"은 바이러스 입자, 예를 들어, AAV 바이러스 입자의 조립 및 캡시드화를 유도하는 일련의 세포내 이벤트를 의미한다. AAV 패키징(즉, "패키징 유전자")에 중요한 핵산 서열의 예는 각각 아데노-관련 바이러스의 복제 및 캡시드화 단백질을 인코딩하는 AAV "rep" 및 "cap" 유전자를 포함한다. 용어 rAAV 벡터는 rAAV 벡터 입자 및 rAAV 벡터 플라스미드 둘 모두를 포함한다.
바이러스 입자는 바이러스-기반 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 바이러스 게놈(야생형 바이러스에서와 같이), 또는 예를 들어, 대상체 표적화 벡터(재조합 바이러스에서와 같이)를 캡시드화하는 캡시드를 포함하는 바이러스의 단일 유닛을 지칭한다. AAV 바이러스 입자는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질(전형적으로 야생형 AAV의 캡시드 단백질 모두) 및 캡시드화된 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포에 전달될 트랜스진과 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 rAAV 벡터 입자 또는 단순히 rAAV 벡터로 지칭된다. 따라서, rAAV 입자의 생산은 반드시 rAAV 벡터의 생산을 포함하는데, 이는 이러한 벡터가 rAAV 입자 내에 함유되기 때문이다.
일부 구체예에서, 재조합 아데노-관련 바이러스("rAAV") 벡터는 트랜스진 발현 카세트에 플랭킹되는 AAV 145 bp 역 말단 반복부만을 보유하는 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈으로의 통합으로 인한 효율적인 유전자 전달 및 안정적인 트랜스진 전달은 이 벡터 시스템의 주요 특징이다. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 및 AAVrh.10을 포함하는 모든 AAV 혈청형 및 임의의 신규한 AAV 혈청형이 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
복제-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 또한 본원에서 사용하기 위해 포함되며, 높은 역가로 생산될 수 있고, 다수의 다양한 세포 유형을 쉽게 감염시킬 수 있다. 임상 시험에서 Ad 벡터의 사용의 예는 근육내 주사에 의한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 요법을 포함하였다(Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 사용의 추가 예는 문헌 [Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)]을 포함한다.
레트로바이러스 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 핵산 벡터 조성물로서 사용하기 위해 포함된다. pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar et al, Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al, PNAS 94:22 12133-12138 (1997)).
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 적합한 벡터는 문헌[Picanco-Castro. "Advances in lentiviral vectors: a patent review." Recent patents on DNA & gene sequences 6.2 (2012): 82-90]에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스의 지향성은 외래 외피 단백질을 혼입시켜 표적 세포의 잠재적인 표적 집단을 확장시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하거나 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생산하는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 용량을 갖는 시스-작용 긴 말단 반복부(LTR)를 포함한다. 최소 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 이후 치료 유전자를 표적 세포에 통합하여 영구적인 트랜스진 발현을 제공하는데 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이들의 조합에 기반한 것들을 포함한다(예를 들어, 문헌[Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59' (1990); Wilson et al, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700] 참조). 본원에서 사용하기 위한 다른 레트로바이러스 벡터는 문헌[Sweeney, Nathan Paul, et al. "Delivery of large transgene cassettes by foamy virus vector." Scientific reports 7 (2017) 8085]에 개시된 바와 같은 포말 바이러스를 포함한다.
렌티바이러스 전달 벡터는 일반적으로 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,994,136; 6,165,782; 및 6,428,953, 미국 출원 2014/0315294 및 문헌 [Merten et al "Production of lentiviral vectors." Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 3 (2016): 16017 and Merten, et al. "Large-scale manufacture and characterization of a lentiviral vector produced for clinical ex vivo gene therapy application." Human gene therapy 22.3 (2010): 343-356]에 기술된 것을 참조하며, 상기 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스는 인테그라제 결핍 렌티바이러스 벡터(IDLV)이다. IDLV는, 예를 들어, 문헌[Leavitt et al. (1996) J . Virol. 70(2):72l-728; Philippe et al. (2006) Proc. Nat II Acad. ScL USA 103(47): 17684-17689; and WO 06/010834]에 개시된 바와 같은 천연 렌티바이러스 인테그라제 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 기술된 바와 같이 생산될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용하기 위한 렌티바이러스는 특허 6,207,455, 5,994,136, 7,250,299, 6,235,522, 6,312,682, 6,485,965, 5,817,491; 5,591,624에 개시된다.
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 적합한 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터(IDLV)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11382-1 1388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; U.S. Patent Publication No 2009/054985]을 참조한다. 특정 구체예에서, IDLV는 문헌 [Leavitt et al. (1996) J. Virol. 70(2):72l-728]에 기술된 바와 같은 인테그라제 단백질의 위치 64에서 돌연변이(D64V)를 포함하는 HIV 렌티바이러스 벡터이다. 본원에서 사용하기에 적합한 추가적인 IDLV 벡터는 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 출원 번호 12/288,847에 기재되어 있다.
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 적합한 벡터는 US 2013/0136,768에 개시된 바와 같은 재조합 HCMV 및 RHCMV 벡터를 포함한다.
조혈 줄기 세포, 예를 들어, CD34+ 세포로의 관심 핵산의 도입에 본원에서 유용한 핵산 벡터는 아데노바이러스 타입 35를 포함한다. 면역 세포(예를 들어, T-세포)로의 관심 핵산의 도입에 본원에서 유용한 핵산 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463- 8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222]을 참조한다.
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 적합한 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)을 포함하며, 이는 문헌 [Felberbaum, "The baculovirus expression vector system: a commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors." Biotechnology journal 10.5 (2015): 702-714]에 논의된다.
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 적합한 벡터는 예를 들어, 문헌 [Heister, Thomas, et al. "Herpes simplex virus type l/adeno-associated virus hybrid vectors mediate site-specific integration at the adeno-associated virus preintegration site, AAVS1, on human chromosome 19." Journal of virology 76.14 (2002): 7163-7173, and 5,965,441]에 개시된 바와 같은 HSV 타입 1 (HSV-l)-AAV 하이브리드 벡터를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,218,186에 개시된 다른 하이브리드 벡터가 사용될 수 있다.
하나 이상의 핵산 벡터 및/또는 바이러스 벡터를 포함하는 세포
특정 양태에서, 본 개시의 적어도 하나의 핵산 벡터 또는 본 개시의 적어도 하나의 바이러스 벡터를 포함하는 세포가 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 세포는 세포주 또는 일차 세포로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포이고, 선택적으로 포유동물 세포가 인간 세포 또는 설치류 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 곤충 세포이고; 곤충 세포는 나비목(lepidoptera) 종으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 나비목 종은 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 스포돕테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis), 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua), 또는 트리코플러스시아 니(Trichoplusia ni)이다. 일부 구체예에서, 곤충 세포는 Sf9이다.
일부 구체예에서, 세포는 조혈 세포, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 적혈구 계통 세포, 거핵세포, 적혈구 전구 세포(EPC), CD34+ 세포, CD44+ 세포, 적혈구, CD36+ 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 세포, 장 세포, 장 줄기 세포, 장 상피 세포, 내피 세포, 장내분비 세포, 폐 세포, 폐 전구 세포, 장세포, 간 세포(예를 들어, 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포(KC), 간 시누소이드 내피 세포(LSEC), 간 전구 세포), 줄기 세포, 전구 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 피부 섬유모세포, 대식세포, 뇌 미세혈관 내피 세포(BMVEC), 신경 줄기 세포, 근육 위성 세포, 상피 세포, 기도 상피 세포, 근육 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 림프 전구 세포, B 림프모구 세포, B 세포, T 세포, 호염기성 풍토성 버킷 림프종(EBL), 다색 적혈구모세포, 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 배아 줄기 세포, P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포, 각질세포, 췌장 β-세포, K 세포, L 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, MDCK 세포, Vero 세포, CHO, BHK1, NS0, Sp2/0, HeLa, A549, 및 정염성 적혈모구로부터 선택된다.
하나 이상의 GSH 유전자좌에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 갖는 세포
바이러스 벡터는 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 요법 절차의 검토를 위해 문헌 [Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 5 l(l):3 1-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); and Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참조한다.
따라서, 특정 양태에서, 세포의 게놈에서 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 세포가 본원에 제공되고, 여기서 GSH는 표 3으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, GSH 핵산은 번역되지 않은 서열 또는 인트론을 포함한다. 일부 구체예에서, GSH는 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 및 SYNTX-GSH4로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 본원에 기재된 하나 이상의 GSH 유전자좌로 통합된다.
세포는 본원에 기재된 핵산 벡터 중 적어도 어느 하나를 통합할 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 일부 구체예에서, 핵산 벡터 중 어느 하나는 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 어느 하나에 의해 세포에 전달된다.
특정 구체예에서, 세포는 정방향으로 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 역 배향으로 GSH에 통합된다.
특정 구체예에서, 세포는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 (a) 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나, (b) 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 프로모터는 하기로부터 선택된다: (a) 작동 가능하게 연결된 핵산에 이종성인 프로모터; (b) 핵산의 조직-특이적 발현을 촉진하는 프로모터; (c) 핵산의 구성적 발현을 촉진하는 프로모터; (d) 유도성 프로모터; (e) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터; (f) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터; 및 (g) 곤충 세포 프로모터.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터는 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 제제는 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산의 조직-특이적 발현을 촉진하는 프로모터는 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 신경 세포, 기도 상피 세포, 또는 간 전구 세포에서 조직-특이적 발현을 촉진하는 프로모터이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산에 작동 가능하게 연결되는 프로모터는 CMV 프로모터, β-글로빈 프로모터, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, 비스코트-알드리치(Wiskott-Aldrich) 프로모터, PKLR 프로모터, 다면체(polh) 프로모터, 및 즉시 초기 1 유전자(IE-1) 프로모터로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 세포는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 코딩 RNA를 인코딩하는 서열은 표적 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구체예에서, 코딩 RNA를 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 코딩 RNA를 인코딩하고 하기를 인코딩하는 서열을 포함한다: (a) 단백질 또는 이의 단편, 바람직하게는 인간 단백질 또는 이의 단편; (b) 치료 단백질 또는 이의 단편, 항원-결합 단백질, 또는 펩티드; (c) 자살 유전자, 선택적으로 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK); (d) 바이러스 단백질 또는 이의 단편; (e) 뉴클레아제, 선택적으로 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, megaTAL, 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체); (f) 마커, 예를 들어, 루시퍼라제 또는 GFP; 및/또는 (g) 약물 내성 단백질, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 네오마이신 내성.
바이러스 단백질 또는 이의 단편은 구조적 단백질(예를 들어, VP1, VP2, VP3) 또는 비-구조 단백질(예를 들어, Rep 단백질)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편은 (a) 파보바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 VP1, VP2, VP3, NS1, 또는 Rep; (b) 레트로바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 외피 단백질, gag, pol, 또는 VSV-G; (c) 아데노바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, 또는 구조적 단백질(예를 들어, A, B, C); 및/또는 (d) 헤르페스 심플렉스 바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 ICP27, ICP4, 또는 pac를 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는 바이러스의 표면 단백질인 바이러스 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 바이러스의 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩한다. 일부 구체예에서, (a) 표면 단백질 또는 이의 단편은 숙주에서 면역 반응을 유발하는 면역원성 표면 단백질이고/거나 (b) 표면 단백질 또는 이의 단편은 신호 펩티드를 추가로 포함하고/거나 (c) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 유전자는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고/거나 (d) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산은 자살 유전자를 추가로 포함한다. 이러한 핵산을 포함하는 세포는 백신으로서 사용하기 위해 시험관내에서 재조합 바이러스 단백질을 생산하는데 유용할 뿐만 아니라, 생체내 면역화를 위해 생체내에서 바이러스 단백질의 발현을 위해 대상체에 이식하는데에도 유용하다. 바이러스 단백질의 생체내 생산은 유도성 프로모터 하에 있을 수 있어, 생체내 생산된 면역원의 양 뿐만 아니라 생산 기간은 유도성 프로모터를 조절하는 신호 또는 제제를 사용하여 미세-조정될 수 있다(예를 들어, 본원에 기재된 박동성 발현 시스템에 대한 섹션 참조).
일부 구체예에서, 시험관내 또는 생체내 면역화를 위한 백신을 생산하기 위한 이러한 세포는 바이러스 표면 단백질을 발현하며, 여기서 표면 단백질은 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스의 표면 단백질이다. 일부 구체예에서, 표면 단백질은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질이다.
일부 구체예에서, 세포는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 폴리펩티드 또는 이의 단편은 치료용 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 헤모글로빈 유전자(HBA1, HBA2, HBB, HBG1, HBG2, HBD, HBE1, 및/또는 HBZ), 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP), 응고 인자 VIII, 응고 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, 디스트로핀 또는 절두된 디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 유트로핀 또는 트렁케이션된 유트로핀, 마이크로-유트로핀, 우세린(USH2A), GBA1, 프리프로인슐린, 인슐린, GIP, GLP-1, CEP290, ATPB1, ATPB11, ABCB4, CPS1, ATP7B, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, KIND1, INS, F8 또는 이의 단편(예를 들어, B-도메인 결실된 폴리펩티드(예를 들어, VIII SQ, p-VIII)를 인코딩하는 단편), IRGM, NOD2, ATG2B, ATG9, ATG5, ATG7, ATG16L1, BECN1, EI24/PIG8, TECPR2, WDR45/WIP14, CHMP2B, CHMP4B, 디네인(Dynein), EPG5, HspB8, LAMP2, LC3b UVRAG, VCP/p97, ZFYVE26, PARK2/Parkin, PARK6/PINK1, SQSTM1/p62, SMURF, AMPK, ULK1, RPE65, CHM, RPGR, PDE6B, CHM, RPGR, PDE6B, CNGA3, GUCY2D, RS1, ABCA4, MYO7A, HFE, 헵시딘, (예를 들어, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-1β 수용체의) 가용성 형태를 인코딩하는 유전자, 및 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(CFTR)로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 자살 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 항원-결합 단백질을 인코딩한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG (CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, CCR5, 또는 병원체(예를 들어, 박테리아 독소, 바이러스 캡시드 단백질 등)에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 세포가 본원에서 추가로 고려되며, 여기서 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 비-코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 비-코딩 RNA는 lncRNA, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, snoRNA, snRNA, scaRNA, 및/또는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 비-코딩 RNA는 DMT-1, 페로포틴, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-1β 수용체, 돌연변이된 단백질(예를 들어, 돌연변이된 HFE, CFTR)을 인코딩하는 유전자로부터 선택되는 유전자를 표적으로 한다.
일부 구체예에서, 세포는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 증가시키거나 회복시킨다. 일부 구체예에서, 세포는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거한다.
일부 구체예에서, 세포는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하고, 적어도 하나의 비-GSH 핵산은 (a) 전사 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 전사 종결 서열, 비번역 영역(5' 또는 3' UTR), 근위 프로모터 요소, 유전자좌 제어 영역(예를 들어, β-글로빈 LCR 또는 β-글로빈 LCR의 DNase 과민성 부위(HS), 폴리아데닐화 신호 서열) 및/또는 (b) 번역 조절 요소(예를 들어, 코자크(Kozak) 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소)를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는 세포주 또는 일차 세포로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포이고, 선택적으로 여기서 포유동물 세포는 인간 세포 또는 설치류 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 곤충 세포이고; 곤충 세포는 나비목 종으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 나비목 종은 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리토랄리스, 스포돕테라 엑시구아, 또는 트리코플러스시아 니이다. 일부 구체예에서, 곤충 세포는 Sf9이다.
일부 구체예에서, 세포는 조혈 세포, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 적혈구 계통 세포, 거핵세포, 적혈구 전구 세포(EPC), CD34+ 세포, CD44+ 세포, 적혈구, CD36+ 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 세포, 장 세포, 장 줄기 세포, 장 상피 세포, 내피 세포, 장내분비 세포, 폐 세포, 폐 전구 세포, 장세포, 간 세포(예를 들어, 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포(KC), 간 시누소이드 내피 세포(LSEC), 간 전구 세포), 줄기 세포, 전구 세포, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC), 피부 섬유모세포, 대식세포, 뇌 미세혈관 내피 세포(BMVEC), 신경 줄기 세포, 근육 위성 세포, 상피 세포, 기도 상피 세포, 근육 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 림프 전구 세포, B 림프모구 세포, B 세포, T 세포, 호염기성 풍토성 버킷 림프종(EBL), 다색 적혈구모세포, 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 배아 줄기 세포, P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포, 각질세포, 췌장 β-세포, K 세포, L 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, MDCK 세포, Vero 세포, CHO, BHK1, NS0, Sp2/0, HeLa, A549, 및 정염성 적혈모구로부터 선택된다.
본 개시의 핵산 벡터 또는 바이러스 벡터를 포함하는 세포의 추가적인 설명; 또는 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 세포가 하기에 제공된다.
세포
본 개시의 핵산, 핵산 벡터, 또는 바이러스 벡터를 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 본 발명의 추가 목적은 본 발명에 따른 핵산, 핵산 벡터 및/또는 바이러스 벡터에 의해 트랜스펙션, 감염, 형질도입 또는 형질전환된 세포에 관한 것이다. 용어 "형질전환"은 세포에 "외래"(즉, 외부 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 도입하여, 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현시켜 요망되는 물질, 전형적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 효소를 생산할 것임을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 세포는 "형질전환"되었다.
본 발명의 핵산 또는 핵산 벡터는 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 위한 적합한 조건 하의 세포 및 양립가능한 벡터를 의미한다.
일반적인 발현 시스템은 E. 콜라이 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 세포 및 배큘로바이러스 벡터, 및 포유동물 세포 및 벡터를 포함한다. 세포의 다른 예는 비제한적으로 원핵 세포(예를 들어, 박테리아) 및 진핵 세포(예를 들어, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)를 포함한다. 특정 예는 E. 콜라이, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 포유동물 세포주(예를 들어, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등) 뿐만 아니라 일차 또는 확립된 포유동물 세포 배양물(예를 들어, 림프모세포, 섬유모세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경계 세포, 지방세포 등으로부터 생산됨)을 포함한다. 예는 또한 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(이하 "DHFR 유전자"로 지칭됨)에 결함이 있는 CHO 세포(Urlaub G et al (1980), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL 1662, 이하 "YB2/0 세포"로 지칭됨) 등을 포함한다. YB2/0 세포가 바람직한데, 키메라 또는 인간화 항체의 ADCC 활성이 이 세포에서 발현될 때 향상되기 때문이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 시험관내 또는 생체외에서 본원에 기술된 바와 같은 재조합 핵산, 핵산 벡터 또는 바이러스 벡터를 적격 세포 내에 도입하는 단계, (ii) 수득된 재조합 세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양하는 단계, 및 (iii) 선택적으로, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체) 또는 폴리펩티드(예를 들어, 인슐린)를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선택하는 단계로 구성된 단계를 포함한다. 이러한 재조합 세포는 본원에 기재된 다양한 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포는 본원에 개시된 벡터를 함유할 수 있고, 핵산(예를 들어, mRNA, 단백질)에 의해 인코딩된 발현 생성물을 생산할 수 있는 임의의 유형의 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 부착성 세포 또는 현탁된 세포, 즉, 현탁액에서 성장하는 세포이다. 다양한 양태에서 세포는 배양된 세포 또는 일차 세포, 즉, 유기체, 예를 들어, 인간으로부터 직접 분리된 일차 세포이다. 세포는 임의의 세포 유형일 수 있고, 임의의 유형의 조직으로부터 기원할 수 있고, 임의의 발달 단계일 수 있다.
특정 양태에서, 항원-결합 단백질은 글리코실화된 단백질이고, 세포는 글리코실화-적격 세포이다. 다양한 양태에서, 글리코실화-적격 세포는 효모 세포, 사상 진균 세포, 원생동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 진핵 세포이다. 이러한 세포는 당 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013)]을 참조한다. 다양한 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 다양한 양태에서, 포유동물 세포는 비인간 포유동물 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 및 이의 유도체(예를 들어, CHO-K1, CHO pro-3), 마우스 골수종 세포(예를 들어, NS0, GS-NS0, Sp2/0) 세포, 디하이드로폴레이트리덕타제(DHFR) 활성이 결핍되도록 조작된 세포(예를 들어, DUKX-X11, DG44), 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포 또는 이의 유도체(예를 들어, HEK293T, HEK293-EBNA), 녹색 아프리카 원숭이 신장 세포(예를 들어, COS 세포, VERO 세포), 인간 자궁경부암 세포(예를 들어, HeLa), 인간 골육종 상피 세포 U2-OS, 선암성 인간 폐포 기저 상피 세포 A549, 인간 섬유육종 세포 HT1080, 마우스 뇌종양 세포 CAD, 배아 암종 세포 P19, 마우스 배 섬유아세포 세포 NIH 3T3, 마우스 섬유모세포 L929, 마우스 신경모세포종 세포 N2a, 인간 유방암 세포 MCF-7, 망막모세포종 세포 Y79, 인간 망막모세포종 세포 SO-Rb50, 인간 간암 세포 Hep G2, 마우스 B 골수종 세포 J558L, 또는 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포(Gaillet et al. 2007; Khan, Adv Pharm Bull 3(2): 257-26 3 (2013))이다.
일부 구체예에서, 벡터를 증폭 또는 복제할 목적으로, 세포는 일부 양태에서 원핵 세포, 예를 들어, 박테리아 세포이다.
또한, 본원에 기재된 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포의 집단이 본 개시내용에 의해 제공된다. 일부 양태에서, 세포의 집단은 임의의 벡터를 포함하지 않는 적어도 하나의 다른 세포에 더하여, 기재된 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 이종 집단이다. 대안적으로, 일부 양태에서, 세포의 집단은 실질적으로 균질한 집단이고, 여기서 집단은 주로 벡터를 포함하는(예를 들어, 필수적 요수로 하여 구성된) 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 집단은 세포의 클론 집단이며, 여기서 집단의 모든 세포는 벡터를 포함하는 단일 세포의 클론이어서, 집단의 모든 세포는 벡터를 포함한다. 본 개시의 다양한 구체예에서, 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 클론 집단이다.
특정 양태에서, 세포는 대상체에 대해 자가 또는 동종이계인 인간 세포이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 핵산은 바이러스 벡터를 통해 형질도입되거나 다른 적합한 방법(예를 들어, 전기천공 등)으로 형질전환된다. 이러한 세포는 질병 또는 병태, 예를 들어, 암의 장기간 치료를 위해 대상체에게 전이(예를 들어, 그래프트, 이식 등)된다.
트랜스제닉 유기체
특정 양태에서, 세포의 게놈에서 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 트랜스제닉 유기체가 본원에 제공되고, 여기서 GSH는 표 3으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, GSH는 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 및 SYNTX-GSH4로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 본 개시의 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 및/또는 세포 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 본 개시의 세포를 포함한다.
트랜스제닉 유기체는 단세포 및 다세포 유기체를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 이러한 유기체는 동물, 식물, 진균, 박테리아, 원생생물, 어류 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 포유동물 또는 식물이다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 진균(예를 들어, 효모), 박테리아, 또는 프로테스트(protest)이다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 어류이다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 설치류(예를 들어, 마우스, 래트)이다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 설치류 또는 식물이며, 선택적으로 설치류는 마우스이다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 포유동물 또는 식물이며, 선택적으로 여기서 포유동물은 설치류(예를 들어, 마우스, 래트), 염소, 양, 닭, 라마, 또는 토끼이다.
트랜스제닉 유기체를 생성하기 위한 유기체의 생식선의 유전자 변형은 본원에 기재된 방법 뿐만 아니라 당 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 본 개시의 핵산 벡터 및 바이러스 벡터 중 어느 하나를 도입함으로써 달성될 수 있다.
약학적 조성물
특정 양태에서, 본 개시의 핵산 벡터 중 어느 하나, 본 개시의 바이러스 벡터 중 어느 하나, 및/또는 본 개시의 세포 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 및 세포의 임의의 조합이 본원에서 고려되며, 이러한 조합은 강력한 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
약학적 조성물은 담체 및/또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는 약학적 투여와 양립 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비양립성인 경우를 제외하고, 조성물에서의 이들의 사용이 고려된다. 양립성을 결정하기 위해, 삼투질농도, 점도, 및/또는 바시티(baricity)와 같은 다양한 관련 인자가 고려될 수 있다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비강내(예를 들어, 흡입), 경피, 경점막, 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 경막외, 척수내, 흉골내, 관절내, 활액내, 종양내, 척추강내, 동맥내, 심장내, 근육내, 폐내, 및 직장 투여를 포함한다. 특정 구체예에서, 골수로의 직접 주사가 고려된다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조절용 제제, 예컨대, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 소듐 하이드록사이드와 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 비경구용 제조물은 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 포함될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 조성물은 멸균 주사용 용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 예를 들어, 링거 용액 및 락테이트 링거 용액은 IV 치료제를 제형화하기 위해 USP 승인되었고, 이러한 용액은 일부 구체예에서 사용된다. 특정 구체예에서, 생물학적 활성을 유지하기 위한 부형제 및 벡터 양립성은 적합한 방법에 따라 확립된다. 골수로의 정맥내 투여 또는 주사를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성화제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 억제는 본원에 기재된 바이러스 조성물의 무결성/활성에 영향을 미치지 않는 정도로 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다.
멸균 주사 가능한 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질과 위에서 열거한 성분으로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 통합함으로써 제조된다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본원에 기재된 바이러스 벡터 또는 핵산 벡터는 적합한 추진제, 예를 들어, 이산화탄소와 같은 가스를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 투여를 위해, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여를 위해, 세제, 담즙산염, 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다.
핵산 벡터의 전달
핵산을 세포에 전달하기 위한 다양한 기술 및 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 5'- 및 3' GSH-특이적 상동성 아암을 포함하는 핵산 벡터 또는 GSH의 일부를 포함하는 비-바이러스 벡터를 포함하는, 본원에 기재된 핵산 벡터의 전달에 사용하기 위해 포함된다. 예를 들어, 핵산은 지질 나노입자(LNP), 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 리포플렉스, 또는 코어-쉘 나노입자로 제형화될 수 있다. 전형적으로, LNP는 핵산 분자, 하나 이상의 이온화 가능한 또는 양이온성 지질(또는 이의 염), 하나 이상의 비이온성 또는 중성 지질(예를 들어, 인지질), 응집을 방지하는 분자(예를 들어, PEG 또는 PEG-지질 컨쥬게이트), 및 선택적으로 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)로 구성된다. 예시적인 지질 나노입자 및 이를 제조하기 위한 방법은, 예를 들어, WO2015/074085, WO2016081029, WO2015/199952, WO2017/117528, WO2017/075531, WO2017/004143, WO2012/040184, WO2012/061259, WO2011/149733, WO2013/158579, WO2014/130607, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086354, WO2013/086373, WO2014/008334, WO2011/075656, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054384, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/048536, WO2009/082607, WO2012/016184, WO2014/152211, WO2017/049074, WO1996/040964, WO1999/018933, WO2009/086558, WO2010/129687, WO2010/147992, WO2010/042877, WO2009/108235, WO2014/081887, W02005/120461, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2015/011633, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2016/197133, WO2015/011633, WO2013/126803, WO2012/000104, WO2011/141705, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2005/120152, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/074546, WO2005/121348, WO2006/069782, WO2009/027337, WO2012/030901, WO2012/031043, WO2012/031046, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/040429, WO2014/043544, WO2016/130963, WO2017/181026, 및 WO2013/089151에 기술되어 있으며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 핵산 이외에, 하기 몰비의 지질을 포함한다: 50% 양이온성 지질, 10% 비이온성 지질(예를 들어, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)과 같은 인지질), 38.5% 콜레스테롤 및 1.5% PEG-지질(예를 들어, 2-[2-(w-메톡시(폴리에틸렌글리콜2000)에톡시]-N,N-디테트라데실아세트아미드(PEG2000-DMA)).
핵산을 세포에 전달하기 위한 또 다른 방법은 핵산을 세포에 의해 내재화된 리간드와 컨쥬게이션시키는 것이다. 예를 들어, 리간드는 세포 표면 상의 수용체에 결합하고 세포내이입을 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산에서 뉴클레오티드에 공유적으로 연결될 수 있다. 핵산을 세포로 전달하기 위한 예시적인 컨쥬게이트는 예를 들어, WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515, WO2017/177326에 기재되어 있으며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
핵산은 또한 전기천공에 의해 세포에 전달될 수 있다. 일반적으로, 전기천공은 펄스 전류를 사용하여 세포의 투과성을 증가시키고, 이에 의해 핵산이 원형질막을 가로질러 이동할 수 있게 한다. 전기천공 기술은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 핵산을 생체내 및 임상적으로 전달하는데 사용된다. 예를 들어, 문헌[Andre et al., Curr Gene Ther. 2010 10:267-280; Chiarella et al, Curr Gene Ther. 2010 10:281-286; Hojman, Curr Gene Ther. 2010 10: 128-138]을 참조하고; 이들 모두의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 전기천공 장치는 비제한적으로 BTX® Instruments(Holliston, MA)(예를 들어, AgilePulse In Vivo System) 및 Inovio(Blue Bell, PA)(예를 들어, Inovio SP-5P 근육내 전달 장치 또는 CELLECTRA® 3000 피내 전달 장치)를 포함하는 전세계 많은 회사에 의해 판매된다. 전기천공은 핵산 벡터의 투여 후, 전 및/또는 동안 사용될 수 있다. 전기천공을 이용하여 핵산을 전달하기 위한 추가의 예시적인 방법 및 장치는, 예를 들어, US Pat. 미국 특허 번호 5,273,525, 번호 6,520,950, 번호 6,654,636 및 번호 6,972,013에 기술되어 있으며, 이들 모두의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
핵산은 또한 트랜스펙션에 의해 세포에 전달될 수 있다. 유용한 트랜스펙션 방법은 지질-매개된 트랜스펙션, 양이온성 폴리머-매개된 트랜스펙션, 또는 칼슘 포스페이트 침전을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 트랜스펙션 시약은 당 분야에 잘 알려져 있으며, TurboFect Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject Reagent (Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P Protein Transfection Reagent (New England Biolabs), CHARIOT™ Protein Delivery Reagent (Active Motif), PROTEOJUICE™ Protein Transfection Reagent (EMD Millipore), 293fectin, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific), FIPOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), FIPOFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CEFFFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OFIGOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), FIPOFECTACE™, FUGENE™ (Roche, Basel, Switzerland), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFECTAM™ (Transfectam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™ (Promega), TFX-20™ (Promega), TFX-50™ (Promega), TRANSFECTIN™ (Bio-Rad, Hercules, Calif.), SIFENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Valencia, Calif.), DC-chol (Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™ (Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Lafayette, Colo), DHARMAFECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMAFECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, St. Louis, Mo.), 및 ESCORT™ IV (Sigma Chemical Co.)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 핵산은 또한 당업자에게 공지된 미세유체학 방법을 통해 세포에 전달될 수 있다.
생체내 또는 생체외에서 핵산의 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션(미국 특허 번호 5,049,386; 4,946,787 및 Transfectam™ 및 Lipofectin™과 같은 상업적으로 이용 가능한 시약 참조), 미세주사, 바이오리스틱, 바이로솜, 리포솜(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994) ; Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; US Pat. No. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조), 면역리포솜, 폴리케이션(polycation) 또는 지질핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 바이러스 벡터 시스템(예를 들어, WO2007/014275에 기재된 바와 같은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데도-관련 바이러스, 백시니아 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터) 및 DNA의 제제-증진된 흡수를 포함한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용한 소노포레이션은 또한 핵산의 전달에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등)는 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하나 이에 제한되지 않는 혈액 또는 조직 세포와 궁극적인 접촉으로 분자를 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 의한 것이다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 이용 가능하고 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특정 조성물을 투여하기 위해 하나 초과의 경로가 사용될 수 있지만, 특정 경로는 다른 경로보다 종종 보다 즉각적이고 보다 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 핵산 벡터 조성물을 조혈 줄기 세포에 도입하기 위한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,928,638에 개시된다.
본원에 개시된 바와 같은 핵산 벡터 조성물은 진단, 연구, 또는 유전자 요법(예를 들어, 트랜스펙션된 세포의 숙주 유기체로의 재주입을 통해)을 위한 생체외 세포 트랜스펙션에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 대상체 유기체로부터 분리되고, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 벡터 조성물로 트랜스펙션되고, 대상체 유기체(예를 들어, 환자 또는 대상체)에 다시 재주입된다. 생체외 트랜스펙션에 적합한 다양한 세포 유형은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)] 및 환자로부터 세포를 분리하고 배양하는 방법의 논의에 대해 여기에 인용된 참고 문헌 참조).
일부 구체예에서, 줄기 세포는 세포 트랜스펙션 및 유전자 요법을 위한 생체외 절차에 사용된다. 줄기 세포를 사용하는 이점은 이들이 시험관내에서 다른 세포 유형으로 분화될 수 있거나, 이들이 골수에 생착될 포유동물(예를 들어, 세포의 공여자)에 도입될 수 있다는 것이다. GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인을 사용하여 시험관내에서 CD34+ 세포를 임상적으로 중요한 면역 세포 유형으로 분화시키는 방법이 공지되어 있다(문헌[Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693-1702 (1992)] 참조).
줄기 세포는 공지된 방법을 사용하여 형질도입 및 분화를 위해 분리된다. 예를 들어, 줄기 세포는 CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+(panb 세포), GR-1(과립구), 및 lad(분화된 항원 제시 세포)와 같은 원치 않는 세포에 결합하는 항체로 골수 세포를 패닝함으로써 골수 세포로부터 분리된다(문헌 [Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)] 참조). 일부 구체예에서, 사용되는 세포는 난모세포이다. 다른 구체예에서, 모델 유기체로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다. 이들은 제노푸스, 곤충 세포(예를 들어, 드로소필리아) 및 선충 세포로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다.
키트
특정 양태에서, 본 개시의 핵산 벡터 중 어느 하나, 본 개시의 바이러스 벡터 중 어느 하나, 본 개시의 세포 중 어느 하나, 및/또는 본 개시의 약학적 조성물 중 어느 하나 중 어느 하나를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 확인된 표적 GSH로의 유전자 또는 핵산 서열의 삽입을 위한 키트, 뿐만 아니라 유전자 또는 핵산 서열의 통합을 결정하기 위한 프라이머 세트가 제공된다.
일부 구체예에서, 키트는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 벡터 조성물, 및 프라이머 쌍을 포함하여 벡터의 3' GSH-특이적 상동성 아암과 5' GSH-특이적 상동성 아암 사이에 위치한 제한 부위 사이에 위치한 핵산의 상동성 재조합에 의해 통합을 결정한다. 일부 구체예에서, 키트는 통합 부위에 걸쳐 있는 프라이머 쌍을 포함하고, 여기서 프라이머 쌍은 적어도 GSH 5' 프라이머 및 적어도 하나의 GSH 3' 프라이머를 포함하고, 여기서 GSH는 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 확인되고, 여기서 적어도 하나의 GSH 5' 프라이머는 통합 부위의 업스트림의 GSH의 영역에 결합하고, 적어도 하나의 GSH 3' 프라이머는 통합 부위의 다운스트림의 GSH의 영역에 적어도 결합한다. 이러한 프라이머 쌍은 음성 대조군으로서 작용하고, 통합이 발생하지 않은 경우 짧은 PCR 생성물을 생산하고, 핵산 삽입이 발생했을 때 삽입된 핵산을 포함하지 않거나 삽입된 핵산이 혼입된 긴 PCR 생성물을 생산하는 것으로 기능할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 GSH 벡터에 포함된 GSH-특이적 단일 가이드 및 RNA 가이드된 핵산 서열; 및 (b) GSH 벡터를 포함하는 GSH 녹-인 벡터를 포함할 수 있으며, 여기서 (a) 또는 (b)의 서열 중 하나 이상이 본원에 기재된 바와 같은 벡터 상에 포함된다. 일부 구체예에서, GSH 벡터는 GSH-CRISPR-Cas 벡터 또는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 편집 유전자를 포함하는 다른 GSH-유전자 편집 벡터이다. 일부 구체예에서, GSH CRISPR-Cas 벡터는 GSH-sgRNA 핵산 서열 및 Cas9 핵산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 키트는 GSH 5' 상동성 아암 및 GSH 3' 상동성 아암을 포함하는 GSH 녹인(knockin) 공여자 벡터를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 GSH 5' 상동성 아암 및 GSH 3' 상동성 아암은 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 확인된 게놈 세이프 하버(GSH)의 서열에 대해 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 상보적이고, 여기서 GSH 5' 및 3' 상동성 아암은 상동성 재조합에 의해 GSH 5' 상동성 아암과 GSH 3' 상동성 아암 사이에 위치한 핵산 서열이 게놈 세이프 하버 내에 위치한 유전자좌에 삽입되는 것을 허용(즉, 가이드)한다. 예시적 예로서, 일부 구체예에서, GSH Cas9 녹인 공여자 벡터는 SYNTX-GSH1 5' 상동성 아암 및 SYNTX-GSH1 3' 상동성 아암을 포함하는 SYNTX-GSH1 Cas9 녹인 공여자 벡터이고, 여기서 SYNTX-GSH1 5' 상동성 아암 및 SYNTX-GSH1 3' 상동성 아암은 SYNTX-GSH1 게놈 세이프 하버 유전자좌에 대해 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78 %, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 상보적이고, 여기서 SYNTX-GSH1 5' 및 3' 상동성 아암은 상동성 재조합에 의해 GSH 5' 상동성 아암과 GSH 3' 상동성 아암 사이에 위치한 핵산 서열이 SYNTX-GSH1 게놈 세이프 하버 내의 유전자좌에 삽입되는 것을 가이드한다.
일부 구체예에서, 키트는 GSH Cas9 녹 인 공여자 벡터인 GSH 벡터를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 적어도 하나의 GSH 5' 프라이머 및 적어도 하나의 GSH 3' 프라이머를 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 GSH 5' 프라이머는 통합 부위의 업스트림의 GSH의 영역에 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 상보적이며, 적어도 하나의 GSH 3' 프라이머는 통합 부위의 다운스트림의 GHS 영역에 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 상보적이다.
일부 구체예에서, 키트는 2개의 프라이머 쌍을 포함할 수 있고, 각각의 프라이머 쌍은 양성 대조군으로서 기능한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 키트는 (a) 통합 부위의 업스트림의 GSH 영역에 결합하는 정방향 GSH 5' 프라이머, 및 GSH 서열의 통합 부위에 삽입된 핵산의 서열에 결합하는 역 GSH 5' 프라이머를 포함하는 적어도 2개의 GSH 5' 프라이머, 및 (b) GSH 서열의 통합 부위에 삽입된 핵산의 3' 말단에 위치한 서열에 결합하는 전방향 GSH 3' 프라이머, 및 통합 부위의 다운스트림의 GSH 영역에 결합하는 역 GSH 3' 프라이머를 포함하는 적어도 2개의 GSH 3' 프라이머를 포함한다. 이러한 구체예에서, 프라이머 쌍은 포지티브로서 작용하는 기능을 할 수 있고, 통합이 발생한 경우에만 PCR 생성물을 생산하고, 통합이 발생하지 않은 경우에는 PCT 생성물이 생산되지 않는다.
일부 구체예에서, 키트는 다음을 포함하는 적어도 2개의 GSH 5' 프라이머를 포함할 수 있다; 통합 부위의 업스트림의 GSH 영역에 적어도 80% 상보적인 정방향 GSH 5' 프라이머, 및 GSH 서열의 통합 부위에서 삽입된 핵산의 서열에 대해 적어도, 약, 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 상보적인 역방향 GSH 5' 프라이머.
일부 구체예에서, 키트는 하기를 포함하는 적어도 2개의 GSH 3' 프라이머를 추가로 포함할 수 있다: GSH 서열의 통합 부위에 삽입된 핵산의 3' 말단에 위치한 서열에 대해 적어도, 약 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 상보적인 전방향 GSH 3' 프라이머, 및 통합 부위의 다운스트림의 GSH 영역에 상보적인 적어도, 약 또는 최대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 상보적인 역방향 GSH 3' 프라이머.
일부 구체예에서, 키트는 본원에 기재된 핵산 벡터 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 본원에 기재된 세포 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 본 개시의 약학적 조성물 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 세포 및 약학적 조성물의 임의의 조합을 포함한다.
핵산, 바이러스 벡터, 세포 및/또는 약학적 조성물은 적합한 용기에 패키징될 수 있다. 키트는 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하기 위해 추가 성분을 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용에 포함되는 키트는 또한 키트의 사용을 개시하거나 설명하는 지침 자료를 포함할 수 있다.
생물학적 제제의 제조에서 GSH의 용도
생물학적 제제를 제조하기 위한 본원에서 확인된 GSH 유전자좌의 용도가 본원에 제공된다. 특히, 본원에서 확인된 GSH 유전자좌는 세포에 생물학적 제제를 발현하는 유전자의 안정한 통합을 제공함으로써 생물학적 제제의 대규모 제조를 가능하게 하는 데 특히 유용하다.
항체, 펩티드 및 재조합 단백질을 포함하는 단백질 기반 치료제는 제약 산업에서 개발 중인 대부분의 신제품을 나타낸다(Ho & Chien 2014, PMID: 24186148). 이러한 생성물은 비포유동물(박테리아, 효모, 식물 및 곤충 세포), 및 포유동물 시스템(설치류 및 인간 유래 세포)을 포함하는 다양한 플랫폼에서 생산된다. 포유동물 발현 시스템은 일반적으로 생물약제를 제조하기 위한 바람직한 플랫폼인데, 이는 이들 세포 또는 세포주가 인간에서 발견되는 것과 유사한 번역-후 변형을 갖는 크고 복잡한 단백질을 생산할 수 있기 때문이다. 생물학적 제제 제조에 사용되는 다양한 포유동물 세포주 중에서, 인간-유래 세포주는 치료용 당단백질 생산을 위한 기질로서 매력적인데, 이는 이들의 글리코실화 기구가 설치류 유래 세포주(예를 들어, CHO, BHK1, NS0, Sp2/0)와 같은 상이한 세포로부터 유래된 부산물에서 발견되는 면역원성의 위험을 제거하기 때문이다. 이러한 비인간 세포주는 갈락토스-α1,3-갈락토스(α-갈락토스) 및 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)과 같은 면역원성 글리칸을 생성할 수 있는 상이한 번역 후 변형 경로를 갖는다(Butler and Spearman 2014, PMID: 25005678). 인간 집단에서 이러한 N-글리칸 둘 모두에 대한 순환 항체의 유행이 있기 때문에, 이러한 비-인간 세포주는 허용되는 글리코실화 프로파일을 갖는 클론에 대해 스크리닝될 필요가 있다(Dumont, J. et al PMID: 26383226).
차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포는 치료용 단백질의 생산에 통상적으로 사용되는 이수성 세포이다. CHO 세포 염색체는 구조적 이상을 갖고 세포 증식 동안 구조 및 수의 변화를 겪는다. 증식 동안, 이들은 DNA 복제 및 복구의 오류, 및 염색체 분리의 오류로 인한 돌연변이, 결실, 복제, 및 다른 구조적 변경과 같은 게놈 변화를 지속적으로 겪는다. 결과적으로, 이러한 세포는 HEK293, MDCK, 및 Vero 세포와 같은 다른 통상적으로 사용되는 세포주와 함께 광범위한 염색체 수 분포를 갖는다. 따라서, 이러한 세포주는 게놈 및 후성유전체 변이 또는 세포 표현형 또는 생산성에 대한 변화의 형태로 이질성과 관련이 있다.
생물학적 제제의 생산에 영향을 미칠 수 있는 이러한 이질성은 생물학적 제제를 발현하는 트랜스진의 무작위 통합에 의해 악화된다. 인간 세포주 생성을 위한 현재 공정은 관심 유전자의 게놈으로의 무작위 통합에 기반하여, 클론 변이로 지칭되는 높은 게놈 및 표현형 변동성을 갖는 재조합 클론을 생성한다. 이러한 가변성은 생성물의 예측 값에 영향을 미치고, 공정 간소화, 및 비용 효율적인 치료용 당단백질 생산의 달성을 제한한다.
또한, 무작위로 통합된 트랜스진의 발현은 예측할 수 없고, 후성적 효과로 인해 시간 경과에 따라 불안정한 경향이 있다. 또한, 무작위 통합은 종종 세포 당 다수의 통합체를 생성하고, 이는 숙주 세포 유전자의 파괴 또는 활성화를 초래할 수 있다. 생물약제학 산업은 재조합 단백질, 특히 모노클로날 항체의 수율 및 품질을 개선하기 위해 상당한 자원을 할애한다. 이 과정은 종종 안정한 세포의 이종 집단으로부터 고-수율 세포 클론의 선택으로 시작된다. 클론 변이는 숙주 세포 게놈의 가소성 및 후성적 각인에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. 이는 재발성 염색체 재배열, 높은 돌연변이율 및 게놈 불안정성(Vcelar et al. 2018 PMID: 29328552) 뿐만 아니라 트랜스진 발현에 부정적인 영향을 미치는 비필수 유전자의 발현 억제에 반영된다. 게놈 변이는 또한 벡터의 무작위 통합으로 인해 발생하며, 이는 "위치 효과"로 공지되어 있고 주변 게놈 환경의 중요성을 강조하는 상이한 게놈 유전자좌의 다중 카피로 삽입될 수 있다(Wilson, C. et al 1990 PMID: 2275824). 또한, 후성적 조절은 또한 트랜스진의 발현에 영향을 미칠 수 있고, 산소 및 영양 수준과 같은 환경 조건 또는 생산 공정 동안 독성 부산물의 축적에 의해 영향을 받을 수 있다. 클론 이질성은 원하는 성능을 갖는 세포주를 찾기 위해 시간 소모적이고 노동 집약적인 스크리닝을 필요로 한다. 클론 선택 과정은 고처리량 스크리닝을 이용한 단일-세포 클로닝을 포함할 수 있다; 그러나, 이는 본질적으로 무작위 과정이다.
대조적으로, GSH 유전자좌는 예측 가능한 발현을 위해 안정적으로 사용될 수 있다. 첫째, 이는 트랜스진의 무작위 통합에 의해 유도된 게놈 이질성을 제거한다. 이는 고충실도 상동성 재조합 및/또는 뉴클레아제-개시 재조합(예를 들어, CRISPR)에 의해 매개된다. 둘째, 트랜스진은 안정한 통합 뿐만 아니라 안정한 발현을 가능하게 하는 게놈 위치에 삽입된다. 생물학적 제제를 생산하도록 선택되는 세포에서 중요한 유전자를 파괴하는 트랜스진에 대한 우려는 없다. 이 안정적인 발현은 또한 예측 가능하다. GSH는 공지된 전사 환경을 제공하기 때문에, 예를 들어, 근처에 억제성(예를 들어, 이색성) 환경에 의한 트랜스진의 "위치 효과" 또는 침묵은 없다. 따라서, GSH 유전자좌에서의 트랜스진 삽입은 세포 주기 항상성에 영향을 미치지 않고 높은 바이오-산물 수율을 가능하게 한다.
따라서, 생물학적 제제 제조 방법으로서, (a) (i) 본원에 기재된 핵산 벡터 중 어느 하나를 포함하는 세포, (ii) 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 어느 하나를 포함하는 세포 또는 (iii) 본원에 기재된 세포 중 어느 하나를 배양하는 단계; 및 발현된 생물학적 제제를 회수하는 단계; 또는 (b) 본원에서 고려되는 트랜스제닉 유기체 중 어느 하나로부터 발현된 생물학적 제제를 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 생물학적 제제는 항원-결합 단백질이다. 일부 구체예에서, 생물학적 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG (CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 생물학적 제제는 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, 또는 CCR5에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 생물학적 제제는 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 생물학적 제제는 치료 단백질이며, 선택적으로 치료 단백질은 인슐린이다.
항원-결합 단백질
본 개시의 항원-결합 단백질은 당 분야에 공지된 많은 형태의 항원-결합 단백질 중 어느 하나를 취할 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 개시의 항원-결합 단백질은 항체, 또는 항원-결합 항체 단편, 조작된 항체 단백질 생성물(예를 들어, 항체의 단편을 포함하는 것들), 리간드-결합 또는 수용체-결합 단백질 또는 이의 단편, 또는 융합 단백질의 형태를 취한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 중쇄 및 경쇄를 포함하고 가변 및 불변 영역을 포함하는 통상적인 면역글로불린 포맷을 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항체는 각각의 쌍이 하나의 "경쇄"(전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 하나의 "중쇄"(전형적으로 약 50-70 kDa의 분자량을 가짐)를 갖는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬의 "Y-형상" 구조인 IgG일 수 있다. 항체는 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. IgG 형식에서, 가변 영역은 일반적으로 약 100-110개 이상의 아미노산이고, 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 주로 항원 인식을 담당하고, 상이한 항원에 결합하는 다른 항체 사이에서 실질적으로 다양하다. 불변 영역은 항체가 면역 시스템의 세포 및 분자를 동원할 수 있게 한다. 가변 영역은 각각의 경쇄 및 중쇄의 N-말단 영역으로 구성되는 반면, 불변 영역은 각각의 중쇄 및 경쇄의 C-말단 부분으로 구성된다. (Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).
항체의 CDR의 일반적인 구조 및 특성은 당 분야에 기술되어 있다. 간략하게, 항체 스캐폴드에서, CDR은 항원 결합 및 인식을 주로 담당하는 영역을 구성하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 내에 매립된다. 가변 영역은 전형적으로 프레임워크 영역(프레임워크 영역 1-4로 지정됨, FR1, FR2, FR3, 및 FR4 (Kabat et al., 1991); 또한 [Chothia and Lesk, 1987] 상기 참조) 내에 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; 또한 [Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883] 참조).
CDR은 3개가 경쇄 가변 영역(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)의 결합 특성을 구성하고 3개는 중쇄 가변 영역(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)의 결합 특성을 구성하는 상보성 결정 영역(CDR)을 지칭한다. CDR은 항체 분자의 기능적 활성에 기여하고, 스캐폴딩 또는 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산 서열에 의해 분리된다. 정확한 규정적 CDR 경계 및 길이가 상이한 분류 및 넘버링 시스템으로 처리된다. 따라서, CDR은 Kabat, Chothia, 접촉 또는 임의의 다른 경계 정의에 의해 지칭될 수 있다. 상이한 경계에도 불구하고, 이들 시스템 각각은 가변 서열 내에서 소위 "초가변 영역"을 구성하는 부분에서 어느 정도 중첩된다. 따라서, 이러한 시스템에 따른 CDR 정의는 인접한 프레임워크 영역과 관련하여 길이 및 경계 영역이 상이할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat, Chothia, and/or MacCallum et al., (Kabat et al., in “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901; and MacCallum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732]을 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로 포함된다.
항체는 당 분야에 공지된 임의의 불변 영역을 포함할 수 있다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 입실론으로 분류되고, 항체의 이소타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의된다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 서브클래스를 갖는다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하나 이에 제한되지 않는 서브클래스를 갖는다. 본 개시의 구체예는 항체의 이러한 모든 부류 또는 이소타입을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파- 또는 람다-타입 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파- 또는 람다-타입 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어, 알파-, 델타-, 입실론-, 감마-, 또는 뮤-타입 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 알파-, 델타-, 입실론-, 감마-, 또는 뮤-타입 중쇄 불변 영역일 수 있다. 따라서, 다양한 구체예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 어느 하나를 포함하는 아이소타입 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM의 항체이다. 다양한 양태에서, 항체는 반감기/안정성을 개선시키거나 항체를 발현/제조성에 보다 적합하게 만들기 위해, 자연 발생 대응물에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 다양한 예에서, 항체는 자연 발생 대응물에 존재하는 C-말단 Lys 잔기가 제거되거나 클립핑된 불변 영역을 포함한다.
항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 포유동물, 예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 말, 닭, 햄스터, 인간 등에 의해 생산된 자연 발생 항체와 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 이와 관련하여, 항체는 포유동물 항체, 예를 들어, 마우스 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 말 항체, 닭 항체, 햄스터 항체, 인간 항체 등으로 간주될 수 있다. 특정 양태에서, 항원-결합 단백질은 인간 항체와 같은 항체이다. 특정 양태에서, 항원-결합 단백질은 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 용어 "키메라 항체"는 2개 이상의 상이한 항체로부터의 도메인을 함유하는 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 예를 들어, 한 종으로부터의 불변 도메인 및 제2 종으로부터의 가변 도메인을 함유할 수 있거나, 보다 일반적으로 적어도 2개의 종으로부터의 아미노산 서열의 스트레치를 함유할 수 있다. 키메라 항체는 또한 동일한 종 내에 2개 이상의 상이한 항체의 도메인을 함유할 수 있다. 항체와 관련하여 사용될 때 용어 "인간화된"은 원래의 공급원 항체보다 진정한 인간 항체와 더욱 유사한 구조 및 면역학적 기능을 갖도록 조작된 비-인간 공급원으로부터의 적어도 CDR 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 인간화는 마우스 항체와 같은 비-인간 항체로부터의 CDR을 인간 항체에 이식하는 것을 포함할 수 있다. 인간화는 또한 비-인간 서열을 인간 서열과 더욱 유사하게 만들기 위해 아미노산 치환을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 인간 항체 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 서열 정보를 포함하는 정보는 Uniprot 데이터베이스 뿐만 아니라 항체 공학 및 생산 분야의 사람들에게 잘 알려진 다른 데이터베이스를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, IgG2 불변 영역은 본원에 참조로 포함되는 Uniprot 번호 P01859로서 Uniprot 데이터베이스로부터 이용 가능하다.
항체는 예를 들어, 파파인 및 펩신과 같은 효소에 의해 단편으로 절단될 수 있다. 파파인은 항체를 절단하여 2개의 Fab' 단편 및 단일 Fc 단편을 생산한다. 펩신은 항체를 절단하여 F(ab')2 단편 및 pFc' 단편을 생산한다. 본 개시의 다양한 양태에서, 본 개시의 항원-결합 단백질은 항체의 항원-결합 단편(일명, 항원-결합 항체 단편, 항원-결합 단편, 항원-결합 부분)이다. 다양한 예에서, 항원-결합 항체 단편은 Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편이다.
항체의 구조는 적어도 약 12-150 kDa의 분자량 범위에 걸쳐 있고 단량체(n = 1)에서 이량체(n = 2), 삼량체(n = 3), 사량체(n = 4), 및 잠재적으로 더 높은 범위의 결합가(n)를 갖는 점점 더 다양한 대체 항체 형식을 만들기 위해 활용되어 왔다; 이러한 대안적인 항체 형식은 본원에서 "항체 단백질 생성물"로 지칭된다. 항체 단백질 생성물은 전체 항체 구조에 기반한 것들 및 전체 항원-결합 능력을 보유하는 항체 단편을 모방하는 것들, 예를 들어, scFv, Fab 및 VHH/VH(하기 논의됨)를 포함한다. 이의 완전한 항원 결합 부위를 보유하는 가장 작은 항원-결합 단편은 완전히 가변(V) 영역으로 구성된 Fv 단편이다. 가용성, 가요성 아미노산 펩티드 링커를 사용하여 분자의 안정화를 위해 V 영역을 scFv(단일 사슬 단편 가변) 단편에 연결하는데 사용되거나, 불변(C) 도메인을 V 영역에 첨가하여 Fab' 단편을 생성한다. ScFv 및 Fab' 단편 둘 모두는 숙주 세포, 예를 들어, 원핵 숙주 세포에서 용이하게 생산될 수 있다. 다른 항체 단백질 생성물은 디설파이드-결합 안정화된 scFv(ds-scFv), 단일 사슬 Fab'(scFab'), 뿐만 아니라 올리고머화 도메인에 연결된 scFv로 구성된 상이한 형식을 포함하는 디-, 트리- 및 테트라-바디, 또는 미니바디(miniAb)와 같은 디- 및 멀티머 항체 형식을 포함한다. 가장 작은 단편은 카멜리드 중쇄 Ab 뿐만 아니라 단일 도메인 Ab(sdAb)의 VHH/VH이다. 신규한 항체 형식을 생성하기 위해 가장 빈번하게 사용되는 빌딩 블록은 단일-쇄 가변(V)-도메인 항체 단편(scFv)이며, 이는 ~15 아미노산 잔기의 펩티드 링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄(VH 및 VL 도메인)로부터의 V 도메인을 포함한다. 펩티바디 또는 펩티드-Fc 융합은 또 다른 항체 단백질 생성물이다. 펩티바디의 구조는 Fc 도메인 상에 그래프트된 생물학적 활성 펩티드로 구성된다. 펩티바디는 당 분야에 잘 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012)]을 참조한다.
다른 항체 단백질 생성물은 단일 사슬 항체(SCA); 디아바디; 트라이바디; 테트라바디 등을 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용의 항원-결합 단백질은 이들 항체 단백질 생성물 중 어느 하나를 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 이로 구성된다.
다양한 양태에서, 본 개시내용의 항원-결합 단백질은 scFv, Fab', F(ab')2, VHH/VH, Fv 단편, ds-scFv, scFab', 절반 항체-scFv, 이종이량체 Fab/scFv-Fc, 이종이량체 scFv-Fc, 이종이량체 IgG(CrossMab), 탠덤 scFv, 탠덤 바이파라토프 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 이량체 항체, 멀티머 항체(예를 들어, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디), miniAb, 카멜리드 중쇄 항체의 펩티바디 VHH/VH, sdAb, 디아바디(단일-사슬 디아바디, 동종이량체 디아바디, 이종이량체 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), 자가-이량체화되는 디아바디), 트리아바디, 테트라바디 중 어느 하나를 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나 이들로 구성된다. 당업자는 임의의 이중특이적 항원-결합 단백질 형식이 바이파라토프 항원-결합 단백질 형식을 생성하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 이중-친화성 재표적화 항체(DART)이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질은 이중특이적 T-세포 인게이저(BiTE)이다.
예시적인 생물학적 제제
예시적인 항원-결합 단백질은 예를 들어, CD40, Toll-유사 수용체(TLR), OX40, GITR, CD27, 또는 4-1BB에 결합하는 항체, T-세포 이중특이적 항체, 항-IL-2 수용체 항체, 항-CD3 항체, OKT3(무로모나브), 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 비실리주맙, 항-CD4 항체, 클레놀릭시맙, 켈릭시맙, 자놀리무맙, 항-CD11a 항체, 에팔리주맙, 항-CD18 항체, 에를리주맙, 로벨리주맙 항-CD20 항체, 아푸투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 파스콜리주맙, 리툭시맙, 항-CD23 항체, 루미릭시맙, 항-CD40 항체, 테넬릭시맙, 토랄리주맙, 항-CD40L 항체, 루플리주맙, 항-CD62L 항체, 아셀리주맙 항-CD80 항체, 갈릭시맙, 항-CD147 항체, 가빌리모맙, B-림프구 자극제(BLyS) 억제 항체, 벨리무맙, CTLA4-Ig 융합 단백질, 아바타셉트, 벨라타셉트, 항-CTLA4 항체, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 항-에오탁신 1 항체, 베르틸리무맙, 항-α4-인테그린 항체, 나탈리주맙, 항-IL-6R 항체, 토실리주맙, 항-LFA-1 항체, 오둘리모맙, 항-CD25 항체, 바실릭시맙, 다클리주맙, 이놀리모맙, 항-CD5 항체, 졸리모맙, 항-CD2 항체, 시플리주맙, 네렐리모맙, 파라리모맙, 아틀리주맙, 아토롤리무맙, 세델리주맙, 돌리모맙 아리톡스, 돌릭시주맙, 폰톨리주맙, 간테네루맙, 고밀릭시맙, 레브릴리주맙, 마실리모맙, 모롤리무맙, 펙셀리주맙, 레슬리주맙, 로벨리주맙, 탈리주맙, 텔리모맙, 아리톡스, 바팔릭시맙, 베팔리모맙, 아플리버셉트, 알레파셉트, 릴로나셉트, IL-1 수용체 길항제, 아나킨라, 항-IL-5 항체, 메폴리주맙, IgE 억제제, 오말리주맙, 탈리주맙, IL12 억제제, IL23 억제제, 우스테키누맙 등에 결합하는 항체를 포함한다.
예시적인 생물학적 제제는 본원에 기재된 바와 같은 치료 단백질 또는 이의 단편 또는 당 분야에 공지된 것들 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 제제는 헤모글로빈 유전자(HBA1, HBA2, HBB, HBG1, HBG2, HBD, HBE1, 및/또는 HBZ), 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP), 응고 인자 VIII, 응고 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, 디스트로핀 또는 트렁케이션된 디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 유트로핀 또는 트렁케이션된 유트로핀, 마이크로-유트로핀, 우세린(USH2A), GBA1, 프리프로인슐린, 인슐린, GIP, GLP-1, CEP290, ATPB1, ATPB11, ABCB4, CPS1, ATP7B, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, KIND1, INS, F8 또는 이의 단편(예를 들어, B-도메인 결실된 폴리펩티드(예를 들어, VIII SQ, p-VIII)를 인코딩하는 단편), IRGM, NOD2, ATG2B, ATG9, ATG5, ATG7, ATG16L1, BECN1, EI24/PIG8, TECPR2, WDR45/WIP14, CHMP2B, CHMP4B, 디네인, EPG5, HspB8, LAMP2, LC3b UVRAG, VCP/p97, ZFYVE26, PARK2/Parkin, PARK6/PINK1, SQSTM1/p62, SMURF, AMPK, ULK1, RPE65, CHM, RPGR, PDE6B, CNGA3, GUCY2D, RS1, ABCA4, MYO7A, HFE, 헵시딘, 가용성 형태를 인코딩하는 유전자(예를 들어, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-1β 수용체의 유전자), 및 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(CFTR)를 인코딩하는 유전자로부터 선택되는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편으로부터 선택되는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
FDA-승인된 생물학적 제제의 전체 목록은 World Wide Web에서 fda.gov/vaccines-blood-biologics/development-approval-process-cber/biological-approvals-year; 및 The Purple Book(World Wide Web at purplebooksearch.fda.gov/)에서 입수 가능하다. 본원에 사용되는 생물학적 제제는 바이오시밀러를 포함한다.
제조 방법
또한 생물학적 제제를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 세포 배양 배지에서 생물학적 제제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양 배지로부터 분비된 생물학적 제제를 수확하는 단계를 포함한다. 숙주 세포는 본원에 기재된 임의의 숙주 세포일 수 있다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포, NS0 세포, COS 세포, VERO 세포 및 BHK 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 다양한 양태에서, 숙주 세포를 배양하는 단계는 숙주 세포의 성장 및 확장을 지지하기 위해 성장 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다양한 양태에서, 성장 배지는 적시에 세포 밀도, 배양 생존력 및 생산성을 증가시킨다. 다양한 양태에서, 성장 배지는 성장 인자, 호르몬 및 부착 인자의 공급원으로서 아미노산, 비타민, 무기 염, 글루코스 및 혈청을 포함한다. 다양한 양태에서, 성장 배지는 아미노산, 비타민, 미량 원소, 무기 염, 지질 및 인슐린 또는 인슐린-유사 성장 인자로 구성된 완전히 화학적으로 규정된 배지이다. 영양소 이외에, 성장 배지는 또한 pH 및 삼투압을 유지하는데 도움을 준다. 여러 성장 배지가 상업적으로 이용 가능하며 당 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Arora, "Cell Culture Media: A Review" Mater Methods 3:175 (2013)]을 참조한다.
다양한 양태에서, 방법은 공급 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 공급 배지에서 유가식(fed-batch) 방식으로 배양하는 것을 포함한다. 재조합 단백질 생산 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Li et al., "Cell culture processes for monoclonal antibody production" MAbs 2(5): 466-477 (2010)]을 참조한다.
생물학적 제제를 제조하는 방법은 세포 배양물 또는 이의 상청액으로부터 단백질을 정제하고 바람직하게는 정제된 단백질을 회수하기 위한 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 방법은 하나 이상의 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 히스티딘(His) 태그에 대한 니켈 수지), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지를 사용하여 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
다양한 구체예에서, 방법은 정제된 단백질 등을 제형화함으로써 정제된 단백질을 포함하는 제형을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 단계는 문헌[Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing, eds. Jameel and Hershenson, John Wiley & Sons, Inc. (Hoboken, NJ), 2010]에 기술되어 있다.
다양한 양태에서, 생물학적 제제는 융합 단백질이다. 예를 들어, 생물학적 제제는 폴리펩티드(예를 들어, Fc 도메인)에 연결된 항원-결합 단백질일 수 있다. 따라서, 본 개시는 융합 단백질을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 다양한 구체예에서, 방법은 세포 배양 배지에서 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양 배지로부터 융합 단백질을 수확하는 단계를 포함한다.
바이러스 벡터의 제조에서 GSH의 용도
재조합 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)는 치료법 및 연구에서 중요한 도구이다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터는 생체내 유전자 전달을 위해 임상적으로 검증된 도구이다. AAV 벡터의 적용은 많은 유전자 질환에 대한 큰 잠재력을 제공하지만, 현재의 벡터 생산 방법은 인간 시험 뿐만 아니라 기초 생물학, 독성학, 및 효능의 전임상 연구, 특히 다량의 고품질 벡터를 필요로 하는 특정 유전 질환과 관련된 연구에 대한 요구를 충족시키기 위해 여전히 개선의 여지가 있다. 예를 들어, 근이영양증에 대한 유전자 요법은 신체에서 가장 큰 기관인 근육에서 전신 유전자 전달을 필요로 한다. 겸상 적혈구 빈혈 또는 낭포성 섬유증과 같은 대규모 집단에 영향을 미치는 다른 유전자 질환은 재조합 벡터의 대규모 제조를 필요로 할 것이다.
AAV 생산을 위해 가장 많이 사용되는 방법 중 하나는 인간 배아 신장 유래 세포(HEK293) 플랫폼이다. 벡터 생산의 가장 널리 사용되는 프로토콜은 HEK293 세포와 같은 숙주 세포에서 모든 시스 및 트랜스 성분(아데노바이러스로부터 분리된 헬퍼 유전자와 함께 벡터 플라스미드 및 패키징 플라스미드)을 사용한 헬퍼-바이러스-비함유 일시적 트랜스펙션 방법에 기반한다. 일시적인-트랜스펙션 방법은 벡터 플라스미드 작제에서 간단하고 아데노바이러스가 없는 고역가 AAV 벡터를 생성하지만, 확장성이 제한되고 임상 연구를 제공하는데 비용 효율적이지 않다.
두 번째 전략은 AAV 벡터 및 Rep 및 Cap 유전자를 세포 내로 가져오기 위해 rHSV 벡터를 이용하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(rHSV)-기반 AAV 생산 시스템이다.
세 번째 방법은 AAV Rep/cap 유전자 및 관심 유전자를 안정적으로 보유하는 HeLa 또는 A549로부터 유래된 AAV 생산자 세포주에 기반한다. AAV 벡터 카세트는 숙주 게놈에 안정적으로 통합되거나(Clark et al., 1995, PMID: 8590738), 카세트를 함유하는 아데노바이러스에 의해 도입되었다. 연속 배양에서 안정한 세포주는 계대 수가 증가함에 따라 유전적 불안정성을 겪는다. 무작위로 통합된 바이러스 유전자는 세포 불안정성을 증가시켜, 벡터 생산성에 시기 부적절하게 영향을 미치는 안정한 세포 증식의 능력을 감소시킬 수 있다. 고-생산 및 안정한 세포 클론의 선택은 비용이 많이 들고 수개월이 걸릴 수 있다. 또한, 세포 증식은 재조합 단백질 항상성, 번역-후 변형 및 분비를 변경할 수 있다.
안정한 세포주를 생산하는 AAV 벡터를 생성하기 위한 GSH의 사용(예를 들어, GSH 유전자좌에서 바이러스 캡시드 및/또는 재조합 단백질(예를 들어, gag, pol, rep 등)을 인코딩하는 유전자의 통합)은 높은 벡터 생산성에 도달하기 위해 의도된 계대에 걸쳐 생산 세포의 질을 보장한다. 또한, GSH의 사용은 증식 동안 세포 단백질 항상성의 교란을 최소화하여 상이한 생산 배치에 걸쳐 생성물 재현성을 증가시킨다. 유사한 근거가 아데노 바이러스-유래 벡터, 레트로바이러스 및 렌티바이러스-유래 벡터, 헤르페스 바이러스-유래 벡터 및 알파바이러스-유래 벡터, 예를 들어, 셈리키 삼림 바이러스(SFV) 벡터와 같은 다른 바이러스 벡터의 제조에 적용될 수 있으며, 여기서 벡터 생산에 필요한 하나 또는 더 많은 성분이 정의된 GSH 유전자좌에 삽입된다. 이러한 성분의 발현은 벡터 성분의 증폭 및 후속 트랜스진 패키징이 시작되기 전에 원하지 않는 조기 발현을 완화시켜 특정 수의 숙주 세포에 도달하기 위해 (예를 들어, 유도성 프로모터 또는 초기 대 후기 프로모터를 사용하여) 조절될 수 있다. 포유동물 세포주에서 벡터 제조 공정은 세포 안정성, 생산성, 재현성, 및 생성물 안전성을 증가시킴으로써 GSH의 사용으로부터 상당한 이익을 얻을 수 있고, 제조 및 품질 관리와 관련된 비용을 감소시키면서 환자 이익에 직접 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 무작위로 생성된 생산자 세포주와 대조적으로, rAAV 생산을 위한 GSH로의 지시된 재조합은 공정을 수개월 또는 심지어 수년까지 가속화할 것이다.
따라서, 특정 양태에서, 본원에서 제공되는 것은 바이러스 벡터를 제조하는 방법이다. 예를 들어, 바이러스 어셈블리에 필요한 핵산 서열, 예를 들어, 하나 이상의 바이러스 구조 단백질(gag, VP1, VP2, VP3 등) 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위한 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에서 GSH 유전자좌로 통합될 수 있다. 이러한 세포에는 선택적으로 GSH 부위에서의 통합을 위한 비-GSH 핵산을 추가로 포함하는 적어도 하나의 기능 바이러스 복제 기점을 포함하는 핵산이 제공될 수 있고, 바이러스 벡터를 생산할 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 방법은 (1) (i) 선택적으로 표적 세포에서 발현을 위한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 추가로 포함하는, 적어도 하나의 기능성 바이러스 복제 기점을 포함하는 핵산 서열(예를 들어, 적어도 하나의 ITR 뉴클레오티드 서열), (ii) 숙주 세포에서 발현을 위한 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 바이러스 구조 단백질(예를 들어, 캡시드 단백질, 예를 들어, gag, VP1, VP2, VP3, 이의 변이체)을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 핵산 서열, 및 (iii) 숙주 세포에서의 발현을 위한 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 바이러스 복제 단백질(예를 들어, Rep, pol)을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 핵산 서열로서, 선택적으로 여기서 적어도 하나의 복제 단백질은 (a) 숙주 세포에서의 발현을 위한 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 복제 단백질을 인코딩하는 Rep52 또는 Rep40 코딩 서열 또는 이의 단편 및/또는 (b) 숙주 세포에서의 발현을 위한 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Rep78 또는 Rep68을 포함하는, 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, (i), (ii) 및 (iii) 중 적어도 하나는 숙주 세포 게놈에서 표 3으로부터 선택된 적어도 하나의 GSH에 안정적으로 통합되고, 적어도 하나의 벡터는, 존재하는 경우, 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되지 않은 (i), (ii) 및 (iii)의 나머지를 포함하는, 단계; 및 (2) 재조합 바이러스 벡터가 생산되도록 하는 조건 하에 숙주 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, (ii) 또는 (iii)은 GSH에 통합된다. 일부 구체예에서, (ii) 또는 (iii)은 GSH에 통합된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 기능성 바이러스 복제 기점(예를 들어, 적어도 하나의 ITR 뉴클레오티드 서열)은 (a) 디펜도파보바이러스 ITR, 및/또는 (b) AAV ITR, 선택적으로 AAV2 ITR을 포함한다.
특정 구체예에서, ITR은 야생형 ITR과 구조적으로 유사한 Rep 결합 요소 및 trs를 갖는 말단 회문이다. ITR은 AAV1-AAV13 및 AAVrh.10 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, ITR은 AAV2 RBE 및 trs를 갖는다. 일부 구체예에서, ITR은 상이한 AAV의 키메라이다. 일부 구체예에서, ITR 및 Rep 단백질은 AAV5로부터 비롯된다. 일부 구체예에서, ITR은 합성이고, RBE 모티프 및 trs GGTTGG, AGTTGG, AGTTGA, … RRTTRR를 포함한다. B/B' 및 C/C' 스템으로 구성된 말단 회문의 전형적인 T-형상 구조는 또한 폴딩 예측(URL (http) unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form에서 입수 가능)에 기반하여 전체 이차 구조를 유지하는 치환 및 삽입으로 합성적으로 변형될 수 있다. ITR 이차 구조의 안정성은 Gibbs 자유 에너지 델타 G로 지정되며, 더 낮은 값, 즉, 더 음의 값은 더 큰 안정성을 나타낸다. 전장, 145nt ITR은 계산된 ΔG = -69.91 kcal/mol을 갖는다. B 및 C 스템: GCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCG는 ΔG = -22.44 kcal/mol을 갖는다. ΔG = -15 kcal/mol 내지 -30 kcal/mol의 구조를 초래하는 치환 및 삽입은 기능적으로 동등하며 야생형 디펜도파보바이러스 ITR과 구별되지 않는다.
일부 구체예에서, 숙주 세포에서의 발현을 위한 적어도 하나의 발현 조절 서열은 (a) 프로모터, 및/또는 (b) 코자크-유사 발현 조절 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 프로모터는 (a) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터, (b) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터, (c) 곤충 세포 프로모터, 또는 (d) 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 동물 DNA 바이러스는 사이토메갈로바이러스(CMV), 디펜도파보바이러스, 또는 AAV이다. 일부 구체예에서, 곤충 바이러스 프로모터는 레피도프테란 바이러스 또는 배큘로바이러스로부터 유래되고, 선택적으로 배큘로바이러스는 오토그라파 캘리포니카 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV)이다. 일부 구체예에서, 프로모터는 폴리헤드린(polh) 또는 즉시 초기 1 유전자(IE-1) 프로모터이다.
일부 구체예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구체예에서, 유도성 프로모터는 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 제제는 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 방법은 (a) AAV 복제 단백질, 선택적으로 Rep52 및/또는 Rep78인 바이러스 복제 단백질; 및 또는 (b) AAV 캡시드 단백질인 바이러스 구조 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, AAV 복제 단백질 또는 AAV 캡시드 단백질은 AAV2의 것이다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 또는 곤충 세포이다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이고; 포유동물 세포는 인간 세포 또는 설치류 세포이다. 일부 구체예에서, 포유동물 세포는 HEK293, HEK293T, HeLa, 및 A549로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 곤충 세포이고; 곤충 세포는 나비목 종으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 나비목의 종은 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리토랄리스, 스포돕테라 엑시구아, 또는 트리코플러스시아 니이다. 일부 구체예에서, 곤충 세포는 Sf9이다.
일부 구체예에서, 바이러스 벡터는 아데노 바이러스-유래 벡터(예를 들어, AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스-유래 벡터(예를 들어, 렌티바이러스), 헤르페스 바이러스-유래 벡터, 및 알파바이러스-유래 벡터(예를 들어, 셈리키 삼림 바이러스 (SFV) 벡터)로부터 선택된다.
바이러스 벡터를 제조하는 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 또는 모든 바이러스 벡터 뿐만 아니라 당 분야에 공지된 바이러스 벡터를 제조하는데 사용하기 위한 것으로 본원에서 고려된다.
감염에 대한 백신 제조에서의 GSH의 용도
특정 양태에서, 감염(예를 들어, 박테리아 감염, 진균 감염, 바이러스 감염)에 대해 대상체를 면역화시키기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 및 GSH 유전자좌로 통합된 비-GSH 핵산을 포함하는 세포) 및 방법은 예를 들어, 대상체에게 하나 이상의 용량으로 투여하여 면역 반응을 유도하고/거나 면역원성 단백질에 대한 항체를 생산함으로써 백신으로 사용될 수 있는, 재조합 단백질, 예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 진균의 면역원성 표면 단백질의 생산을 촉진한다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 도입되면 감염으로부터 대상체를 보호할 수 있는, 바이러스, 박테리아 또는 진균의 하나 이상의 표면 단백질; 또는 박테리아 또는 진균에 의해 생산된 독소(예를 들어, 파상풍 독소, 디프테리아 독소, 보툴리눔 독소, 슈도모나스 외독소 A)에 대한 항원-결합 단백질을 생산한다. 일부 구체예에서, 이러한 항원-결합 단백질은 시험관내에서 생산되고 대상체에게 투여된다. 다른 구체예에서, 이러한 항원-결합 단백질을 포함하는 세포(예를 들어, 상기 단백질을 인코딩하는 유전자는 본원에 기재된 GSH 유전자좌에 통합될 수 있음)는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 유전자는 조직-특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터 하에 있다.
일부 구체예에서, 세포는 본 개시의 GSH 유전자좌에 바이러스, 박테리아, 또는 진균의 표면 단백질을 인코딩하는 핵산을 통합하도록 조작될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표면 단백질은 바이러스의 것이다. 이러한 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 약학적 조성물은 생체내 면역화를 위한 면역원성 바이러스 단백질의 공급원으로서 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 대상체에 자가 조직이다. 기타 구체예에서, 세포는 대상체에 동종이계이다. 이러한 세포는 생체내 면역화에서 이의 사용 후, 이러한 세포가 자살 유전자를 켜서 제거될 수 있도록 자살 유전자(예를 들어, GSH에 통합됨)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, (a) 표면 단백질 또는 이의 단편은 숙주에서 면역 반응을 유발하는 면역원성 표면 단백질이고/거나 (b) 표면 단백질 또는 이의 단편은 신호 펩티드를 추가로 포함하고/거나 (c) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고/거나 (d) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산은 자살 유전자를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 바이러스 단백질의 생체내 생산은 유도성 프로모터 하에 있을 수 있어, 생체내 생산된 면역원의 양 뿐만 아니라 생산 기간이 유도성 프로모터를 조절하는 신호 또는 제제를 사용하여 미세-조정될 수 있다(예를 들어, 본원에 기재된 박동 발현 시스템에 대한 섹션 참조).
일부 구체예에서, 시험관내 또는 생체내 면역화를 위한 백신을 생산하기 위한 이러한 세포는 바이러스 표면 단백질을 발현하며, 여기서 표면 단백질은 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카,바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스의 표면 단백질이다. 일부 구체예에서, 표면 단백질은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질이다.
질병의 예방 또는 치료(예를 들어, 유전자 요법)에서의 GSH의 용도
특정 양태에서, 유효량의 본 개시내용의 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 세포 및/또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질병을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 본 개시의 임의의 질병을 예방 또는 치료하는데 적합한 것으로 본원에서 고려된다(예를 들어, 예시적인 질병 참조).
일부 구체예에서, 질환은 감염, 내피 기능장애, 낭포성 섬유증, 심혈관 질환, 신장 질환, 암, 헤모글로빈병증, 빈혈, 혈우병(예를 들어, 혈우병 A), 골수증식성 장애, 응고병증, 겸상 적혈구 질환, 알파-지중해빈혈, 베타-지중해빈혈, 판코니 빈혈, 가족성 간내 담즙정체, 피부 유전 질환(예를 들어, 수포성 표피박리증), 안과 유전 질환(예를 들어, 유전성 망막 이영양증, 예를 들어, 레버 선천성 흑암증(LCA), 색소성 망막염(RP), 맥락막증, 무색소증 , 망막분열증, 스타가르트병, 어셔 증후군 타입 1B), 파브리병, 고쉐병, 니만-피크, 니만-피크 A, 니만-피크 B, GM1 강글리오시드증, 점액다당증(MPS) I(헐러, 샤이에, 헐러/샤이에), MPS II(헌터), MPS VI(마로토-라미), 혈액암, 혈색소증, 유전성 혈색소증, 청소년 혈색소증, 간경변, 간세포 암종, 췌장염, 진성 당뇨병, 심근병증, 관절염, 성선기능저하증, 심장병, 심장마비, 갑상선 기능저하증, 포도당 불내증, 관절병증, 간 섬유증, 윌슨병, 궤양성 대장염, 크론병, 테이-삭스병, 신경퇴행성 장애, 척수 근위축증 타입 1, 헌팅턴병, 카나반병, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 청소년 만성 관절염, 건선, 및 강직성 척추염, 및 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 운동실조증), 염증성 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 만성 폐쇄성 폐 질환/COPD, 폐 섬유증, 쇼그렌병, 고혈당 장애, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 인슐린-저항성 당뇨병(예를 들어, 멘덴홀 증후군, 베르너 증후군, 요정증, 및 지방위축성 당뇨병), 이상지질혈증, 고지혈증, 저밀도 지단백질 상승(LDL), 고밀도 지단백질 저하(HDL), 트리글리세리드 상승, 대사 증후군, 간 질환, 신장 질환, 심혈관 질환, 허혈, 뇌졸중, 재관류 동안의 합병증, 근육 변성, 위축, 노화 증상(예를 들어, 근육 위축, 노쇠, 대사 장애, 저등급 염증, 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 연령-관련 치매 및 산발형 알츠하이머병, 전암 상태, 및 우울증을 포함하는 정신병), 척수 손상, 동맥경화증, 감염성 질환(예를 들어, 박테리아, 진균, 바이러스), AIDS, 결핵, 배아형성의 결함, 불임, 리소좀 축적병, 활성화제 결핍/GM2 강글리오시드증, 알파-만노시드증, 아스파르틸글루코아민뇨증, 콜레스테릴 에스테르 축적병, 만성 헥소사미니다제 A 결핍, 시스틴증, 다논병, 파아버병, 푸코시드증, 갈락토시알산증, 고쉐병(타입 I, II 및 III), GM1 강글리오시드증, (영아, 영아 후기/소아 및 성인/만성), 헌터 증후군(MPS II), I-세포병/점액지질증 II, 영아 유리 시알산 축적병(ISSD), 청소년 헥소사미니다제 A 결핍, 크라베병, 리소좀 산 리파제 결핍, 이염성 백질디스트로피, 헐러 증후군, 샤이에 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 산필리포 증후군, 모르퀴오 타입 A 및 B, 마로토-라미, 슬라이 증후군, 점액지질증, 다발성 설페이트 결핍, 신경세포 세로이드 리포푸시노스, CLN6 질환, 얀스키-비엘쇼스키병, 폼페병, 피크노디소스토시스, 샌드호프병, 쉰들러병, 및 월만병으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 감염은 박테리아 감염, 진균 감염, 또는 바이러스 감염이다.
일부 구체예에서, 감염은 바이러스 감염이며; 바이러스 감염은 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카,바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스에 의한 것이다. 일부 구체예에서, 바이러스 감염은 SARS-CoV-2에 의한 것이다.
일부 구체예에서, 핵산 벡터, 세포, 및/또는 약학적 조성물은 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 정맥내, 경막외, 척수내, 흉골내, 관절내, 활액내, 척추강내, 종양내, 동맥내, 심장내, 근육내, 비강내, 폐내, 피부 이식편, 또는 경구 투여를 통해 대상체에 투여된다.
일부 구체예에서, 세포는 대상체에 대해 자가 조직 또는 동종이계이다.
특정 양태에서, 세포에서 단백질의 수준 및/또는 활성을 조절하는 방법이 본원에 추가로 제공되며, 방법은 본 개시내용의 핵산 벡터, 바이러스 벡터 및/또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 도입하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 단백질의 수준 및/또는 활성은 증가된다. 다른 구체예에서, 수준 및/또는 활성은 감소되거나 제거된다.
치료를 위해 시험관내 또는 생체외에서 형질도입된 세포를 사용하는 이점이 존재한다. 첫째, 표적 세포 게놈의 GSH 유전자좌에서 트랜스진의 성공적인 통합은 이들을 환자에게 투여하기 전에 검증될 수 있다. 둘째, 형질도입된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 재조합 비리온 없이 투여될 수 있다. 이는 면역 반응을 촉발시키거나 재조합 비리온을 불활성화시키는 중화 항체를 유도하는 것에 대한 우려를 제거한다. 따라서, 형질도입된 세포는 안전하게 재투여될 수 있거나 임의의 부작용 없이 용량이 적정될 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 필요로 하는 대상체에게 (a) CFTR 또는 이의 단편, (b) CFTR의 내인성 돌연변이체 형태를 표적화하는 적어도 하나의 비코딩 RNA(예를 들어, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, gRNA, 안티센스 RNA), (c) CFTR의 내인성 돌연변이체 형태를 표적화하는 CRISPR/Cas 시스템; 및/또는 (d) (a) 내지 (c)에 열거된 핵산 중 어느 하나의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 바이러스 벡터는 본 개시내용의 GSH에 통합되도록 GSH 서열에 의해 플랭킹된 상기 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 바이러스 벡터 또는 상기 핵산을 포함하는 핵산 벡터는 시험관내에서 세포로 형질도입되고, 형질도입된 세포는 대상체에게 투여된다. 바람직한 구체예에서, 세포는 대상체에 대해 자가 조직이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 또는 약학적 조성물은 비강내 또는 폐내 투여를 통해 폐에 전달된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 또는 약학적 조성물은 (a) CFTR 또는 이의 단편의 발현을 증가시키고/거나; (b) 세포에서 CFTR의 내인성 돌연변이체 형태의 발현을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 또는 약학적 조성물은 낭포성 섬유증을 예방하거나 치료한다.
당업자는 임의의 돌연변이 형태의 내인성 단백질을 갖는 대상체가 (a) 야생형 단백질 또는 이의 기능적 등가물(예를 들어, 단편), (b) 돌연변이체 단백질을 인코딩하는 내인성 핵산을 표적화하는 적어도 하나의 비-코딩 RNA, (c) 돌연변이체 단백질을 인코딩하는 내인성 핵산을 표적화하는 CRISPR/Cas 시스템, 및/또는 (d) (a) 내지 (c)에 열거된 임의의 핵산의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 벡터 또는 바이러스 벡터를 도입함으로써 많은 이점을 얻을 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 이러한 방법은 돌연변이체 단백질을 야생형 단백질 또는 이의 기능적 등가물로 대체함으로써 이익을 얻을 임의의 질병으로 고통받는 대상체에 적용될 수 있다.
일부 구체예에서, 질병을 예방 또는 치료하는 방법은 적어도 하나의 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 또는 세포를 재투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 추가 양의 재투여는 초기 유효량의 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 또는 세포를 투여한 후 치료에서 약독화 후에 수행된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 추가 양은 초기 유효량과 동일하다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 추가 양은 초기 유효량보다 많다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 추가 양은 초기 유효량보다 적다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 추가 양은 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 또는 세포의 내인성 유전자 및/또는 핵산의 발현에 기반하여 증가되거나 감소된다. 내인성 유전자는 발현이 예를 들어, 질병의 진단 및/또는 예후를 나타내거나 이와 관련된 바이오마커 유전자를 포함한다.
특정 양태에서, 질병을 예방 또는 치료하는 방법은 대상체에게 핵산의 발현을 조절하는 제제를 투여하거나 세포를 이와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 제제는 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 방법은 제제를 간격을 두고 1회 이상 재투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제제의 재투여는 핵산의 박동성 발현을 초래한다. 일부 구체예에서, 간격 사이의 시간 및/또는 제제의 양은 핵산으로부터 발현된 단백질의 혈청 농도 및/또는 반감기에 기반하여 증가하거나 감소한다.
예시적인 질병
피부 유전 장애에 대한 유전자 요법에서의 GSH의 사용 - 수포성 표피박리증(EB)
특정 양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 EB와 같은 다양한 피부 장애를 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
인간 표피는 주로 별개의 중층화된 세포 층으로 조직된 각질세포로 구성된다. 표피 기저막에 대한 기저 각질세포의 부착은 상피 중간 필라멘트 네트워크를 진피 고정 원섬유에 연결하는 다중단백질 복합체인 헤미데스모솜(HD)에 의해 매개된다. 헤미데스모솜은 여러 세포질 및 막횡단 단백질의 클러스터링에 의해 형성된다. HD1/플렉틴 및 수포 천포창 항원 1(BP230)을 포함하는 세포질 HD 플라크 성분은 원형질막의 세포질 표면에서 세포골격의 요소에 대한 링커로서 작용한다. α6β4 인테그린 및 수포 천포창 항원 2(BP180)를 포함하는 HD의 막횡단 구성요소는 세포 내부를 세포외 기질 단백질에 연결하는 세포 수용체로서 작용한다. 헤미데스모솜-매개 부착은 각각 LAMA3, LAMB3, 및 LAMC2로 공지된 3개의 상이한 유전자에 의해 인코딩되는 별개의 폴리펩티드, α3, β3, 및 γ2에 의해 형성된 주요 기초 라미나 성분인 라미닌-5에 대한 α6β4 인테그린의 결합에 의존한다. 라미닌-5는 표피 각질세포의 기저 표면 상의 α6β4 인테그린과 물리적으로 상호작용하여 HD 형성을 촉진할 뿐만 아니라 피부 고정 원섬유에서 타입 VII 콜라겐의 아미노-말단 NC-1 도메인과도 상호작용하여 기저막 영역 완전성을 향상시킨다. 피부의 완전성을 유지하는데 있어서 이들 단백질의 관련성은 수포성 표피박리증(EB) 환자에게 존재하는 체세포 돌연변이의 확인에 의해 입증되었다.
다양한 유전자(예를 들어, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, 및 KIND1)에서 적어도 16개의 유전자 돌연변이는 다양한 유형의 EB와 관련이 있다. 각질세포는 진피-표피 접합부를 유지하는데 관여하는 단백질의 합성을 담당하기 때문에, 이 질병을 예방하거나 치료하기 위한 유전자 치료적 개입은 이들 세포의 유전자 변형을 필요로 한다.
각질세포는 진피-표피 접합부를 유지하는데 관여하는 단백질의 합성을 담당하기 때문에, 이 질병을 치료하기 위한 유전자 치료적 개입은 이들 세포의 유전자 변형을 필요로 할 것이다. 따라서, EB와 같은 피부 장애에 대한 각질세포의 변형은 표피 줄기 세포, 즉, 홀로클론-형성 세포의 게놈(예를 들어, 본 개시의 GSH 유전자좌)으로의 트랜스진의 안정한 통합을 필요로 한다. P63-양성 각질세포 유래 줄기 세포 홀로클론은 최대 증식 능력을 가지며 상피 줄기 세포로 간주된다. GSH 유전자좌의 사용은 분화 과정에 영향을 미치지 않고 피부 동종이식편을 재생시키기 위한 최대 증식 능력을 허용하지 않으면서, 각질세포의 분화 전반에 걸쳐 안정하고 지속적인 트랜스진 발현을 가능하게 한다. 이 방법은 EB 환자에게 상당히 이익이 될 수 있다.
따라서, 특정 양태에서, 수포성 표피박리증을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 여기서 KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2 및/또는 KIND1을 인코딩하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/ 세포가 대상체에 투여되는, 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 세포는 표피 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 표피 줄기 세포는 홀로클론-형성 세포이다. 일부 구체예에서, 홀로클론-형성 세포는 P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 각질세포이다. 일부 구체예에서, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, 및/또는 KIND1을 인코딩하는 핵산은 조직-특이적 프로모터, 선택적으로 표피 줄기 세포, 홀로클론-형성 세포, P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포 및/또는 각질세포에 대한 조직-특이적 프로모터 하에 있다. 이러한 일부 구체예에서, 변형된 표피 줄기 세포, P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포, 또는 각질세포는 피부 이식편으로서 피부 표면에 적용된다.
장 내분비 K 및 L 세포에서 프리-프로-인슐린을 발현시키기 위한 GSH의 용도 - 타입 I 당뇨병
특정 양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 타입 I 당뇨병과 같은 비정상적인 수준의 인슐린을 갖는 질환을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
소장, 특히 십이지장 및 공장의 장내분비 세포는 타입 1 당뇨병 환자를 치료하기 위한 인슐린 유전자 전달 전략에 대한 매력적인 표적으로 보인다. K 세포 및 L 세포는 내강의 영양소, 특히 글루코스에 반응하여 GIP 및 GLP-1을 혈액으로 분비하여 글루코스-유도된 인슐린 반응을 강화시키도록 선천적으로 특화된다. 정상 개체에서, 식후 GIP, GLP-1 및 인슐린에 대해 달성된 동역학 및 혈장 농도는 매우 유사하고(Orskov et al., 1996, Fujita et al., 2004) 타입 1 당뇨병 환자의 GIP 및 GLP-1도 마찬가지이다(Vilsbøll et al., 2003). 또한, K 세포 및 L 세포는 성숙한 인슐린으로의 프로인슐린 처리를 허용하는 PC1/3 및 PC2 펩티다제를 합성한다. 마지막으로, K 세포 및 L 세포는 타입 1 당뇨병 환자의 면역계에 의해 파괴되지 않는다(Vilsbøll et al., 2003).
위장 장내분비 K 세포 및 L 세포는 각각 글루코스-의존성 인슐린분비 촉진 펩티드(GIP) 및 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1)을 방출한다. 이들의 공통된 발달 기원으로 인해, 췌장 β-세포, K 세포 및 L 세포는 (i) 프로인슐린의 인슐린으로의 전환에 필요한 PC1/3 및 PC2 펩티다제의 발현, (ii) GLUT-2 글루코스 수송체의 존재, (iii) 호르몬 분비를 위한 글루코스 의존성 기전, 이의 각각의 호르몬을 저장하고 쉽게 분비할 수 있는 과립을 포함한다(Spooner et al., 1970, Baggio & Drucker 2007). 그럼에도 불구하고, 위장 장내분비 세포는 타입 1 당뇨병 환자에서 관찰되는 췌장 β-세포의 자가면역-매개 파괴에 민감하지 않다(Vilsbøll et al., 2003). 흥미롭게도, 건강한 개체에서, 혈장 GIP 및 GLP-1 수준은 식사 후 혈장 인슐린 수준의 변화와 동역학적으로 일치한다(Fujita et al., 2004). 따라서, (예를 들어, 프리프로인슐린 단백질 또는 이의 전사체 변이체를 인코딩하는 인슐린 유전자, INS, 예를 들어, NP_000198.1, NP_001172026.1, NP_001172027.1, 및/또는 NP_001278826.1을 도입함으로써) 프리프로인슐린 유전자를 발현하도록 타입 1 당뇨병 환자의 위장 장내분비 세포를 조작하여 식후 혈당이 정상화될 것이다.
고셔 질환에 대한 유전자 요법 적용에서 GSH의 사용
특정 양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 고쉐병을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
고쉐병(GD, OMIM #230800, ORPHA355)은 가장 흔한 스핑고지질증이다. GD는 염색체 1(1q21)에 위치한 GBA1 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 드문 상염색체 열성 유전 질환이다. 이는 글루코실세라미드(GlcCer)를 세라미드 및 글루코스로 가수분해하는 리소좀 효소, 글루코세레브로시다제(GCase, 글루코실세라미다제 또는 산 β-글루코시다제라고도 함)의 활성을 현저하게 감소시킨다. 300개 초과의 GBA 돌연변이가 GBA1유전자에 기술되었다(PMID: 18338393). 질환 표현형은 가변적이지만, 3개의 임상 형태가 확인되었다: 타입 1은 가장 흔하고 전형적으로 신경학적 손상을 일으키지 않는 반면, 타입 2 및 3은 신경학적 손상을 특징으로 한다. 그러나, 이러한 구별은 절대적이지 않으며, 신경병성 GD는 경증 말단의 타입 1의 추체외 증후군으로부터 타입 2의 중증 말단의 태아수종까지의 범위의 표현형 연속체를 나타낸다는 것이 점차 인식되고 있다.
GBA1 유전자의 돌연변이는 GCase 활성의 현저한 감소를 초래한다. 이러한 결핍의 결과는 일반적으로 대식세포에서 GCase 기질, GlcCer의 축적에 기인하여, 이들의 고셔 세포로의 형질전환을 유도한다. 고셔 세포는 주로 골수, 비장, 및 간을 침윤하지만, 이들은 또한 뇌와 같은 다른 기관에도 침투하며 질환 증상의 주요 인자로 간주된다. 단핵구/대식세포 계통은 GlcCer의 공급원인 다량의 글리코스핑고리피드를 함유하는 적혈구 및 백혈구를 제거하는 이들의 역할 때문에 우선적으로 변경된다. 신경학적 관여의 병태생리학적 기전은 여전히 잘 설명되지 않았고; 뉴런에서 GlcCer 전환은 낮고, 이의 축적은 잔류 GCase 활성이 급격히 감소할 때, 즉, 일부 유형의 GBA1 돌연변이로만 유의해진다. 뇌에 침윤하는 고셔 세포는 신경학적 합병증으로 이어지는 염증 유도성 상태를 설정할 수 있을 것 같다. 다수의 사이토카인, 케모카인 및 다른 분자 - IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα(종양 괴사 인자), M-CSF(대식세포-콜로니 자극 인자), MIP-1β, IL-18, IL-10, TGFβ, CCL-18, 키토트리오시다제, CD14, 및 CD163은 고셔 환자의 혈장에 증가된 양으로 존재하며, 혈액 및 조직 합병증과 관련이 있을 수 있다.
유전자 대체 요법은, 예를 들어, 자가 CD34+ 줄기 세포에서 GBA1 유전자의 생체외 교정에 의해 인간 GBA 발현 및 기능을 복구하기 위한 치료적 대안을 제공한다. 본 개시의 게놈 세이프 하버 유전자좌(GSH)에 교정된 GBA1 유전자의 삽입 후, 양성 CD34+ 세포 클론은 세포 항상성을 변경하지 않으면서 분리되고 증폭될 수 있다. 조작된 세포(예를 들어, 본 개시의 핵산 벡터를 포함하는 세포 또는 바이러스 벡터로 형질도입됨)는 다시 환자에 주입될 수 있는데, 여기서 이들은 골수에 다시 이식될 수 있고, 교정된 GBA 발현을 갖는 안정한 클론 유래된 세포 계통을 제공할 수 있으며, 교정된 GBA 발현은 글리코실세라미드를 세라미드로 프로세싱하여 교정된 세포의 리소좀에서 독성 부산물의 축적을 감소시킬 수 있다. CD34+ 줄기 세포에 GBA 유전자를 삽입하기 위한 GSH 유전자좌의 사용은 GD 신경 합병증을 최소화할 수 있는 생리학적 단백질 발현 수준을 가지면서, 중증 GD 병리의 주요 동인인 단핵구 및 대식세포를 포함하는 다수의 세포 계통으로의 안전한 분화를 가능하게 한다.
안구 유전 질환에 대한 유전자 요법에서의 GSH의 용도:
특정 양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 유전성 망막 이영양증(IRD)과 같은 안구 질환을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
유전성 망막 이영양증(IRD)은 진행성 망막 변성을 유발하는 유전적 결함과 관련된 희귀 장애의 군을 포함한다. 환자는 초기 내지 중년에 시작되는 중증의 양측성 및 비가역적 시력 상실을 갖는다. 가장 흔한 IRD와 관련된 유전자 결함은 200개를 초과한다. 환자로부터의 분화된 체세포를 다능성 줄기 세포로 전환시키는 능력은 다중 IRD를 치료하기 위한 새로운 도구를 제공한다. 이러한 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된 세포는 현재 잠재적인 약리학적 제제 및 유전자 요법의 치료 및 독성 효과를 스크리닝하고 시험하는데 사용되고 있다. 더 중요하게는, iPSC는 또한 자가 세포 요법을 위해 쉽게 접근 가능한 조직 공급원을 제공하는데 사용될 수 있다. 현재까지, iPSC 기술의 가장 큰 잠재적인 이점은 망막 질환의 치료에 있다.
망막은 눈 내의 복잡한 신경혈관 조직이다. 이는 망막 및 맥락막 순환에 의해 영양을 공급받는 뉴런의 네트워크를 함유한다. 간상체 및 원추체 광수용체라고 하는 특수화된 뉴런 세포는 눈으로 들어오는 빛을 포획한다. 광수용체 내의 광변환 및 망막 내의 양극성, 무축삭, 수평 및 신경절 세포에 의한 하류 신경 처리를 통해, 광 신호는 시각적 감각을 가능하게 하기 위해 뇌의 일차 및 이차 시각 피질로 전달된다(Chen et al., 2019 PMCID: PMC4470196). 이러한 특수화된 뉴런 세포의 기능은 뮐러 아교 세포 및 망막 색소 상피(RPE)에 의해 지원된다.
환자-특이적 망막 세포(예를 들어, 대상체 자가)를 수득하기 위한 대안적인 방법은 망막 계통으로의 분화를 위한 환자-유래된 성체 줄기 세포를 사용하는 것이다. 피부 섬유모세포는 환자로부터 관례적으로 분리되며, 야마나카(Yamanaka) 인자의 일시적인 발현에 의해 만능 줄기 세포(iPSC)로 형질전환될 수 있다. 교정된 자가 세포를 이식하기 위한 세포 및 유전자 요법의 조합은 다수의 유전적 망막병증을 다룰 가능성이 있다. 자가 iPSC는 유전자 요법 벡터로 형질도입되어 특정 게놈 세이프 하버 유전자좌에 기능성 유전자를 삽입할 수 있다.
GSH의 사용은 불완전한 분화, 표적화된 세포의 클론 확장, 또는 트랜스진 발현에의 영향과 같은 비요망되는 효과 없이, 요망되는 최종 세포 유형(예를 들어, RPE, 광수용체)으로의 안전하고 예측 가능한 iPSC 분화를 가능하게 하는 데 중요하다. 궁극적으로, 특성화된 GSH의 사용은 유전성 망막 이영양증에 대한 장기간 및 환자-특이적 치료적 치료의 생성을 위한 중요한 도구를 제공한다.
따라서, IRD를 앓고 있는 환자에서 단백질 결핍을 인코딩하는 핵산은 본 개시의 GSH 유전자좌에 통합된다. 일부 구체예에서, 핵산은 RPE65를 인코딩한다. RPE65에 대한 유전자 요법은 유아기에 시작되는 중증 시력 상실을 나타낼 수 있는 레버 선천성 흑암(LCA) 또는 색소성 망막염(RP)에 대해 FDA 승인을 받았다. 일부 구체예에서, 핵산은 망막의 X-관련 진행성 변성인 맥락막충혈을 치료하는 CHM을 인코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 X-연결 RP를 치료하는 RPGR을 인코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 RP를 치료하는 PDE6B를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 색맹을 치료하는 CNGA3을 인코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 LCA를 치료하는 GUCY2D를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 망막 층의 조기 발병 분할을 특징으로 하는 질병인 X-관련 망막 분열증을 치료하는 RS1을 인코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 가장 흔한 망막 이영양증인 스타가르트 질환을 치료하는 ABCA4를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 어셔 증후군 타입 1B를 치료하는 MYO7A를 인코딩한다. 이 질환에 걸린 환자는 선천성 청력 상실, RP로 인한 조기 시력 상실, 및 전정 기능장애를 갖는다.
혈색소침착증에 대한 유전자 요법에서의 GSH의 용도
특정 양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 혈색소침착증을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
유전성 혈색소침착증(HH)은 상염색체 열성 유전 질환이며, 백인에서 가장 널리 퍼진 유전 질환이다(Centers for Disease Control and Preventions; world wide web at cdc.gov). 미국에서 약 100만 명이 유전성 혈색소침착증을 앓고 있으며, 이는 낭포성 섬유증 및 근이영양증의 유병률을 합친 것을 능가한다(Bacon, Powell et al. 1999). HH는 철 흡수의 조절장애를 특징으로 한다. HH 환자에서, 철 흡수는 결함이 있고, 신체는 철을 과도하게 흡수한다. 높은 수준의 세포내 철 침착은 유전독성 산소 라디칼의 형성 및 리포과산화를 유도하며, 이는 많은 기관에 만성 손상을 초래하는 염증유도성 반응을 확립시킨다. 질병의 임상 특징은 간, 심장 및 췌장의 실질 세포에서 수십 년 동안 철이 지속적으로 축적된 결과 발생한다. 가장 진행된 형태에서, HH는 간경변, 간세포암, 당뇨병, 생식선기능저하증, 심근병증, 관절염, 및 피부 색소침착으로 나타난다. 장 융모의 장세포는 장 내강으로부터 철의 정점 흡수를 매개하고; 이후, 철은 세포로부터 순환계로 방출된다. 정점의 2가 금속 수송체-1(DMT1)은 내강으로부터 세포로 철을 수송하는 반면, 기저외측 막 결합 수송체인 페로포틴은 장세포로부터 순환계로 철을 수송한다(Ezquer, Nunez et al. 2006). HH 환자는 증가된 경상피 철 흡수를 나타내며, 이는 신체 철 축적 및 후속 만성 합병증(간경변, 간세포 암종, 췌장염, 심근병증, 관절염 및 당뇨병)을 초래한다.
유전성 혈색소침착증의 가장 흔한 원인은 염색체 6에서 확인된 인간 항상성 철 조절인자(HFE) 유전자의 돌연변이이다. HFE의 돌연변이는 HH 사례의 거의 90%를 차지한다. HFE 유전자는 주요 조직적합성 복합체 MHC 클래스 I-유사 분자를 인코딩한다. HFE는 β2-마이크로글로불린에 결합하며, 이는 원형질막으로의 이의 국소화를 결정한다(Waheed, Parkkila et al. 1997). HH와 관련된 HFE에 대해 기재된 주요 돌연변이는 프로세싱되지 않은 HFE 단백질의 위치 282에서 시스테인 아미노산에 대한 티로신 치환(C282Y)을 초래하는 엑손 4에서의 단일 뉴클레오티드 변화이다(Feder, Gnirke et al. 1996). 이러한 돌연변이는 골지체에서 이의 적절한 번역-후 프로세싱에 영향을 미치고, β2-마이크로글로불린과의 상호작용을 방해하고, 세포막에서 이의 후속 위치화를 방해한다. (Feder, Tsuchihashi et al. 1997, Waheed, Parkkila et al. 1997). 아스파르트산 모이어티가 HFE 단백질의 위치 63에서 히스티딘을 대체하는(H63D) HFE 유전자의 제2 돌연변이가 또한 보고되었다(Gochee, Powell et al. 2002). 이어서, 돌연변이되고 언폴딩된 HFE 단백질은 ER-골지 네트워크에 축적되어, 언폴딩된 단백질 반응(UPR)의 활성화를 유도하여, 염증 유도성 프로그램 및 질병의 후속 결과를 악화시킨다(de Almeida and de Sousa 2008, Liu, Lee et al. 2011). HFE는 장 세포에서 철 유입 및 철 유출 기구 둘 모두의 활성을 조정하고, 이는 간에서 헵시딘 유전자의 전사 조절에 관여하는 다중-단백질 복합체의 일부이다. HFE 기능의 손실은 또한 철 흡수의 음성 조절인자인 헵시딘 발현의 급격한 감소와 관련이 있다. HFE 또는 헵시딘의 결핍은 결과적으로 식이 철의 증가된 혼입 및 다양한 기관에서의 축적을 초래한다.
질병의 또 다른 더 심각한 형태는 청소년 혈색소침착증(JH)이다. 이러한 유형의 혈색소침착증은 유전되며 II형 혈색소침착증으로 기술된다. II형 혈색소침착증은 영향을 받는 유전자에 따라 IIa형 또는 IIb형으로 분류된다. IIa형 및 IIb형에서, 조기 철 과부하 발병은 30세 이전에 발생한다. 결과는 심각한 심장 질환 또는 심장 마비, 갑상선 기능 저하증, 월경이 거의 또는 전혀 없음 또는 생식샘기능저하증이다. 혈색소침착증 IIa형은 염색체 19에서 헵시딘 유전자의 상염색체 열성 돌연변이의 결과이다.
청소년 혈색소침착증은 일반적으로 생후 10세 내지 30세에 발생하는 중증 철 과부하의 발병을 특징으로 한다. 남성과 여성은 동등하게 영향을 받는다. 두드러진 임상 특징은 저생식샘자극호르몬 생식샘기능저하증(hypogonadotropic hypogonadism), 심근병증, 글루코스 불내증 및 당뇨병, 관절병증, 및 간 섬유증 또는 간경변을 포함한다. 간세포암이 때때로 보고되었으며, 한편 심장 침범은 이환율 및 사망률의 주요 원인이다.
흥미롭게도, 이 질병에 대해 유일하게 허용되는 치료법은 강한 대체법이고, 적혈구에서 헴 분자와의 비공유적 조정을 통해 주로 운반되는 철 부하를 감소시키기 위한 주기적인 출혈(정맥절개술)을 포함한다. 현재, 혈청 페리틴 수준이 50 ng/mL 미만으로 감소하고 트랜스페린 포화도가 30% 미만의 값으로 떨어질 때까지(2년 내지 3년 필요) 초기에 각각 200-250 mg의 철을 함유하는 1 또는 2 유닛의 혈액(500-1000 mL)을 매주 제거한다. 덜 공격적인 출혈이나, 평생 지속 요법은 트랜스페린 포화도 값을 50% 미만으로 유지하고 혈청 페리틴 수준을 100 ng/mL 미만으로 유지하기 위해 필수적이다(Wojcik, Speechley et al. 2002).
다양한 병인의 혈색소침착증에 대한 요법은 장 상피 세포에 의한 정점의 철 흡수를 현저하게 억제하는 장세포에서의 siRNA의 사용에 의한 DMT1 단백질 합성의 억제이다(Ezquer, Nunez et al. 2006). 2가 금속 수송체 DMT-1은 최근에 또한 구리 이온을 수송하는 것으로 나타났으며(Arredondo et al., 2003), 따라서 DMT-1 유전자 발현의 억제는 세포로부터의 구리 유출이 감소되는 상태인 윌슨병에서 간 손상을 감소시키는데 가치가 있다. HH 환자의 장세포에서 제어되지 않은 철 흡수의 감소는 것은 여러 영향을 받은 기관에서 철 축적을 제한할 것이다.
철 부하를 제어하기 위한 또 다른 접근법은 기저측 철 유출을 감소시키기 위한 장세포에서 페로포틴 유전자 발현의 억제를 통한 것이다. 이 경우, 흡수된 철은 장세포 내부 축적만 될 것이다. 또한, 철의 축적은 이중 억제 효과를 발생시키는, IRE/IRP 기전에 의한 정점의 DMT-1 수송체 유전자의 발현의 감소로 이어진다. 또한, 임의의 축적된 철은 장세포의 정상적인 박리에 의해 장 내강으로 손실될 것이다.
야생형 HFE가 장세포에서 본원에 기재된 GSH 유전자좌에 통합된 본 개시내용의 방법 및 조성물, 예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포는 HFE 활성을 회복시킬 수 있고, 또한, DMT-1 및 페로포틴의 발현을 긍정적으로 조절하여, 광범위한 치료 효과를 갖는다. 야생형 HFE 및 siRNA를 공동-발현하고/거나 침묵 DMT-1에 공동-투여하는 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 사용하는 조합 전략은 또한 임상 이익을 향상시킬 수 있다.
펩티드 헵시딘은 철 대사의 주요 조절인자이다. 이는 주로 간에서 합성되고 20-25개 아미노산 펩티드로서 분비된다. 헵시딘 유전자의 돌연변이는 청소년 혈색소침착증의 원인이 된다(Roetto, Papanikolaou et al. 2003). HFE는 간에서 헵시딘의 발현을 조절한다. 헵시딘은 세망내피 대식세포 및 철의 장 흡수를 매개하는 장세포로부터의 철 방출을 부정적으로 조절한다(Nemeth, Tuttle et al. 2004, Nemeth, Roetto et al. 2005, Rivera, Liu et al. 2005). 간에서 본 개시의 GSH 유전자좌로의 헵시딘을 발현하는 핵산의 안정한 통합은 신체에 의한 철의 흡수를 감소시키고 철 과부하와 관련된 독성을 감소시켜, 모든 형태의 혈색소침착증을 예방할 수 있다.
특정 양태에서, (a) 헵시딘 또는 이의 단편, 및/또는 항상성 철 조절인자(HFE) 또는 이의 단편; (b) DMT-1, 페로포틴, 및/또는 HFE의 내인성 돌연변이체 형태를 표적화하는 적어도 하나의 비-코딩 RNA(예를 들어, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, gRNA, 안티센스 RNA); (c) DMT-1, 페로포틴, 및/또는 HFE의 내인성 돌연변이체 형태를 표적화하는 CRISPR/Cas 시스템; 및/또는 (d) (a) 내지 (c)에 열거된 핵산 중 어느 하나의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)을 사용하여 질병을 예방하거나 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 단편은 생물학적 활성 단편이다.
일부 구체예에서, 대상체에는 다음을 인코딩하는 핵산을 포함하는 적어도 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포(예를 들어, 간세포, 장세포))이 투여된다.
a) (예를 들어, 간세포에서) 헵시딘 또는 이의 단편;
b) (예를 들어, 간세포 또는 장세포에서) HFE 또는 이의 단편;
c) (예를 들어, 간세포 또는 장세포에서) HFE의 내인성 돌연변이체 형태를 표적화하는 적어도 하나의 비코딩 RNA(예를 들어, piRNA, miRNA, shRNA, gRNA, siRNA, 안티센스 RNA);
d) (예를 들어, 장세포에서) DMT-1을 표적화하는 적어도 하나의 비-코딩 RNA(예를 들어, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, gRNA, 안티센스 RNA);
e) (예를 들어, 장세포에서) 페로포틴을 표적화하는 적어도 하나의 비-코딩 RNA(예를 들어, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, gRNA, 안티센스 RNA); 또는
f) a) 내지 e) 중 어느 하나의 둘 이상의 조합.
일부 구체예에서, 방법은 b) 내지 e) 중 어느 하나의 둘 이상의 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 재조합 비리온 또는 약학적 조성물은 a) 세포에서 HFE 또는 이의 단편, 및/또는 헵시딘 또는 이의 단편의 발현을 증가시키고/거나; b) 세포에서 DMT-1, 페로포틴, 및/또는 HFE의 내인성 돌연변이체 형태의 발현을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 혈색소증, 유전성 혈색소침착증, 청소년 혈색소침착증, 및/또는 윌슨병을 예방하거나 치료한다.
염증성 장질환(IBD)
염증성 장 질환(IBD)은 인간 소화관의 만성 염증과 관련된 일련의 장애를 포함한다. IBD의 가장 흔한 형태는 궤양성 대장염 및 크론병이다. 이들은 만성 재발성 장 염증을 특징으로 하는 복잡한 다인성 장애이다. 병인은 크게 알려져 있지 않지만, 최근 연구는 유전적 요인, 환경, 미생물총, 및 자가면역 반응이 발병에 기여하는 요인임을 시사하였다(Hendrickson, Gokhale et al. 2002). 미국에서 약 300만 명이 IBD로 진단되었고(world wide web의 cdc.gov/ibd/data-statistics.htm), 매년 70,000명의 새로운 사례의 크론병 또는 궤양성 대장염이 진단된다. 현재 이러한 고통스러운 장애에 대한 치료법은 없으며, 치료는 63억 달러로 추정되는 연간 재정적 건강 관리 부담을 나타낸다(Limanskiy, Vyas et al. 2019). IBD와 관련된 다인자 요소는 NFkB 경로에 의해 활성화된 유전자에 의해 근본적으로 매개되는 염증 유도성 프로그램의 활성화에 수렴된다. IBD 병리생물학을 매개하는 IBD 동안 유도된 주요 염증 유도성 사이토카인은 TNFα, IL-1β, IL-12 및 IL-6이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 TNFα 수용체의 가용성 형태, IL-6 수용체의 가용성 형태, IL-12 수용체의 가용성 형태 및/또는 IL-1β 수용체의 가용성 형태를 발현하는데 사용된다. 상기 수용체의 이러한 가용성 형태는 이들이 리간드(예를 들어, 염증 유도성 사이토카인)를 특이적으로 중화시키는 소장 고유판으로 분비될 수 있다.
막-결합된 수용체의 가용성 형태는 수용체의 가용성 분비 형태를 인코딩하는 유전자를 전달함으로써 발현될 수 있다. 예를 들어, TNFα의 17-kDa 가용성 모이어티는 TNFα-전환 효소(TACE; ADAM-17)에 의한 26-kDa 타입 II 막횡단 이소형의 단백질분해 절단 후 세포로부터 방출되는 것으로 알려져 있다(Kriegler et al. (1988) Cell 53:45-53). 따라서, 단일 펩티드(예를 들어, IL-2 신호 펩티드; 예를 들어, 문헌[Ardestani et al. (2013) Cancer Res. 73:3938-3950] 참조)에 융합된 17-kDa 모이어티(또는 세포외 도메인의 임의의 요망되는 부분, 예를 들어, 길항/중화될 리간드와 상호작용하는 부분)를 인코딩하는 유전자를 포함하는 본 개시의 재조합 비리온은 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, IBD 또는 다른 염증성 장애를 앓고 있는 대상체)에게 생체내 전달되어 상기 대상체에서 가용성 형태의 TNFα를 발현시킬 수 있다. 대안적으로, 자가 또는 동종이계 세포는 막 단백질의 분비된 가용성 형태를 인코딩하는 유전자를 포함하는 이러한 비리온으로 시험관내 또는 생체외에서 형질도입될 수 있고, 상기 세포는 대상체를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달될 수 있다. 임의의 막 결합 단백질에 대해 유사한 전략이 사용될 수 있다.
특정 양태에서, (a) TNFα 수용체의 가용성 형태, IL-6 수용체의 가용성 형태, IL-12 수용체의 가용성 형태, 및/또는 IL-1β 수용체의 가용성 형태; (b) TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 및/또는 IL-1β 수용체를 표적화하는 적어도 하나의 비코딩 RNA(예를 들어, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, gRNA, 안티센스 RNA); (c) TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 및/또는 IL-1β 수용체를 표적화하는 CRISPR/Cas 시스템; 및/또는 (d) (a) 내지 (c)에 열거된 핵산 중 어느 하나의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물 및/또는 세포)이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물 및/또는 세포)은 a) 세포에서 TNFα 수용체의 가용성 형태, IL-6 수용체의 가용성 형태, IL-12 수용체의 가용성 형태, 또는 IL-1β 수용체의 가용성 형태의 발현을 증가시키고/거나; b) 세포에서 TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-1β 수용체의 발현을 감소시킨다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선 관절염, 청소년 만성 관절염, 건선, 및/또는 강직성 척추염을 예방하거나 치료한다.
따라서, 상기 치료 유전자 및/또는 제제를 포함하는 본 개시의 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 대상체에서 만성 염증을 조절하고, T 세포, NK 세포, 및 다른 이펙터 면역 세포의 활성화를 감소시킴으로써 치료학적 이점을 제공하고, 손상된 상피 장벽의 후속 복구를 가능하게 한다. 치료적 이점은 본원에 제공된 조합 전략에 의해 추가로 향상될 수 있다.
자가포식-관련 질환
본원에 기재된 GSH 유전자좌를 이용하는 본 개시의 방법 및 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 자가포식-리소좀 경로의 중요한 성분을 조절하는데 사용될 수 있다. 자가포식은 분화 및 발달, 세포 및 조직 항상성, 단백질 및 세포내소기관 질 제어, 대사, 면역, 및 노화 및 다양한 질병에 대한 보호에서 중요한 역할을 한다. 거대-자가포식 형태의 자가포식(이하 자가포식이라고 함)은 세포 생물에너지(세포질 성분을 재순환시킴으로써) 및 세포질 질(단백질 응집체, 손상된 세포내소기관, 지질 소적, 및 세포내 병원체를 제거함으로써)을 제어하는 진화적으로 보존된 리소좀 분해 경로이다(Levine, Packer et al. 2015). 또한, 리소좀 분해와 독립적으로, 자가포식 기구는 포식작용, 아폽토틱 시체 제거, 분비, 세포외유출, 항원 제시, 및 염증 신호전달의 조절의 과정에 배치될 수 있다. 광범위한 세포 기능의 결과로서, 자가포식 경로는 노화 및 특정 암, 감염, 신경변성 장애, 대사 질환, 염증성 질환, 및 근육 질환에 대한 보호에서 중요한 역할을 한다(Levine, Packer et al. 2015).
다수의 질병은 미스폴딩된-단백질 응집체, 핵산 및/또는 미토콘드리아와 같은 손상된 세포내소기관의 조각과 같은 바람직하지 않은 잠재적인 세포독성 세포 파편의 축적과 관련이 있다. 자가포식은 또한 지질을 분해하여, 지방산의 이화작용 이용을 가능하게 하고, 신경절증, 예를 들어, GM1, 테이-삭스병과 같은 지방산 대사 질환에 중대한 영향을 미친다. 리소좀 축적 장애와 같은 여러 드문 상염색체 장애는 축적된 "세포 쓰레기"를 분해하지 못하는 것과 관련이 있으며, 이는 일반적으로 조직 손상 및 암과 같은 다수의 파괴적인 결과를 갖는 낮은 수준이지만 만성 염증 프로그램의 개시를 초래한다.
손상 관련 분자 패턴(DAMP)으로 알려진 축적된 세포질 물질은 염증소체 단백질의 TLR 1-10, cGAS, IFI16, RIG-I, MDA5, NLRP 계열을 포함하는 수많은 패턴 인식 수용체(PRR)의 리간드로 간주된다. 외래 및 자가-분자의 감지시, PRR은 NFkB 신호전달 경로, IFN-I 경로, IFN-II 경로, IFN-III 경로 및 AMPK, Beclin-I, PI3K 경로를 포함하는 자가포식 경로의 활성화와 같은 기본적인 세포 과정을 실행하는 자가분비 및 측분비 능력을 갖춘 다중 신호전달 캐스케이드를 유도한다. 영양 결핍 상태 또는 운동과 같은 자가포식 프로그램을 개시하기 위한 다양한 이벤트가 제안되었다. 혈당 조절 약물인 Metformin과 같은 AMPK 활성화제는 자가포식을 활성화시키고 실험 동물의 수명을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 자가포식의 활성화에서 첫 번째 분자 이벤트는 단백질의 Atg 패밀리와 같은 단백질의 회합을 촉발하는 다양한 캐스케이드 이벤트에 의한 세포내, 세포질, 이중 막 구조(자가포식소체)의 형성이다. 자가포식소체는 세포에 존재하는 DAMP 및/또는 PAMP를 둘러싸는데, 이러한 현상은 막 핵형성 단계로 알려져 있다. 자가포식 경로의 다음 단계는 자가포식소체의 연장 및 폐쇄이다. 마지막으로, 이 성숙되고 완전히 형성된 자가포식소체는 낮은 pH 환경에서 광범위하게 작용하는 뉴클레아제 및 프로테아제를 함유하는 리소좀과 융합하여 자가리소좀을 형성하는데, 여기서 카고는 가용성 및 비독성의 구성 성분으로 분해되어 DAMP의 세포질 풍부성을 감소시킨다.
간, 중추 신경계(CNS) 또는 장을 포함하는 특정 조직에서 자가포식의 유도는 수많은 다양한 만성 장애로 고통받는 환자에게 크게 도움이 될 수 있다. 따라서, IRGM, NOD2, ATG2B, ATG9, ATG5, ATG7, ATG16L1, BECN1, EI24/PIG8, TECPR2, WDR45/WIP14, CHMP2B, CHMP4B, 디네인, EPG5, HspB8, LAMP2, LC3b UVRAG, VCP/p97, ZFYVE26, PARK2/Parkin, PARK6/PINK1, SQSTM1/p62, SMURF, AMPK, 및 ULK1로부터 선택되는 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 세포에서 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 자가포식을 조절한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 자가포식-관련 질환을 예방하거나 치료한다.
일부 구체예에서, 자가포식-관련 질환은 암, 신경변성 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 운동실조증), 염증성 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 만성 폐쇄성 폐 질환/COPD, 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 쇼그렌병, 고혈당 장애, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 인슐린-저항성 당뇨병(예를 들어, 멘덴홀 증후군, 베르너 증후군, 요정증, 및 지방위축성 당뇨병), 이상지질혈증, 고지혈증, 상승된 저밀도 지단백질(LDL), 저하된 고밀도 지단백질(HDL), 상승된 트리글리세리드, 대사 증후군, 간 질환, 신장 질환, 심혈관 질환, 허혈, 뇌졸중, 재관류 동안의 합병증, 근육 변성, 위축, 노화 증상(예를 들어, 근육 위축, 노쇠, 대사 장애, 저등급 염증, 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 연령-관련 치매 및 산발형 알츠하이머병, 전암 상태, 및 우울증을 포함하는 정신병적 상태), 척수 손상, 동맥경화증, 감염성 질환(예를 들어, 박테리아, 진균, 바이러스), AIDS, 결핵, 배아형성의 결함, 불임, 리소좀 축적병, 활성화제 결핍/GM2 강글리오시드증, 알파-만노시드증, 아스파르틸글루코아민뇨증, 콜레스테릴 에스테르 축적병, 만성 헥소사미니다제 A 결핍, 시스틴증, 다논병, 파브리병, 파아버병, 푸코시드증, 갈락토시알증 (타입 I, II 및 III), GM1 강글리오시드증, (영아, 영아 후기/소아 및 성인/만성), 헌터 증후군(MPS II), I-세포병/점액지질증 II, 유아 유리 시알산 축적병(ISSD), 청소년 헥소사미니다제 A 결핍, 크라베병, 리소좀 산 리파제 결핍, 이염성 백질디스트로피, 헐러 증후군, 샤이에 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 산필리포 증후군, 모르퀴오 타입 A 및 B, 마로토-라미, 슬라이 증후군, 점액지질증, 다중 설페이트 결핍, 니만-피크 질환, 신경세포 세로이드 리포푸시노스, CLN6 질환, 얀스키-비엘쇼스키병, 폼페병, 피크노디소스토시스, 샌드호프병, 쉰들러병, 테이-삭스병, 및 월만병으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "자가포식-관련 질환"은 자가포식 또는 세포 자가-분해의 파괴로부터 발생하는 질환을 나타낸다. 자가포식 기능장애는 수많은 다른 질병 상태 및/또는 병태 중에서 암, 신경변성, 미생물 감염 및 노화와 관련이 있다. 자가포식은 세포에 대한 보호 과정으로서 주요 역할을 수행하지만, 이는 또한 세포 사멸에도 역할을 수행한다. 자가포식을 통해 매개되는 질병 상태 및/또는 병태(이는 질병 상태 또는 병태가 치료할 환자 또는 대상체에서 자가포식의 증가 또는 감소의 함수로서 그 자체를 나타낼 수 있고, 치료 또는 예방은 환자 또는 대상체에서 자가포식의 억제제 또는 작용제의 투여를 필요로 한다는 사실을 나타냄)는 예를 들어, 암의 전이를 포함하는 암, 리소좀 축적병(이하 논의됨), 신경변성(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병; 기타 운동실조 포함), 면역 반응(T 세포 성숙, B 세포 및 T 세포 항상성, 손상 염증에 대항) 및 만성 염증성 질환(자가포식에 결함이 있을 때 과도한 사이토카인을 촉진할 수 있음), 예를 들어, 크론병을 포함하는 염증성 장 질환, 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 만성 폐쇄성 폐질환/COPD, 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 쇼그렌병; 지질 대사 섬 기능 및/또는 구조에 영향을 미치는 고혈당 장애, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병을 포함하며, 과도한 자가포식은 췌장 b-세포 사멸 및 중증 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 인슐린-저항성 당뇨병(예를 들어, 멘델홀 증후군, 베르너 증후군, 요정증, 및 지방 위축성 당뇨병) 및 이상지질혈증(예를 들어, 비만 대상체에 의해 발현되는 고지혈증, 상승된 저밀도 지단백질(LDL), 억압된 고밀도 지단백질(HDL), 및 상승된 트리글리세리드) 및 대사 증후군, 간 질환(과도한 세포 독립체-소포체의 자가포식 제거), 신장 질환(플라크에서의 아폽토시스, 사구체 질환), 심혈관 질환(특히, 허혈, 뇌졸중, 압력 과부하 및 재관류 동안의 합병증 포함), 근육 변성 및 위축, 노화의 증상(근육 위축, 허약, 대사 장애, 낮은 등급의 염증, 죽상동맥경화증 및 관련 병태, 예컨대 뇌졸증, 연령-관련 치매 및 산발적 형태의 알츠하이머병을 포함하는 중추 및 말초 심장 및 신경학적 징후를 포함하는 노화-관련 증상 및 만성 질환, 전-암성 상태 및 우울증을 포함하는 정신과적 질환의 발병 또는 중증도 또는 빈도의 개선 또는 지연 포함), 뇌졸중 및 척수 손상, 동맥경화증, 특히, AIDS 및 결핵을 포함하는 박테리아, 진균, 세포 및 바이러스(감염성 질환과 관련된 이차 질환 상태 또는 병태 포함)를 포함하는 감염성 질환(미생물 감염, 미생물 제거, 미생물 생성물에 대한 보호 염증 반응 제공, 미생물 성장의 향상을 위한 미생물에 의한 숙주의 자가포식의 적응 제한, 선천 면역의 조절), 발달(적혈구 분화 포함), 배발생/생식력/불임(배아 이식 및 태반을 통한 영양소 공급 종결 후 신생아 생존, 프로그래밍된 세포 사멸 동안 죽은 세포의 제거) 및 노화(증가된 자가포식은 건강을 향상시키고 수명을 연장시키기 위해 손상된 세포내소기관 또는 응집된 거대분자의 제거를 초래하지만, 어린이/청소년에서 증가된 수준의 자가포식은 근육 및 기관 소모로 이어져 노화/조로증을 유발할 수 있음)로 이어질 수 있다.
용어 "리소좀 축적 장애"는 리소좀 축적의 결함으로 인해 발생하는 질병 상태 또는 병태를 지칭한다. 이러한 질병 상태 또는 병태는 일반적으로 리소좀이 오작동할 때 발생한다. 리소좀 축적 장애는 일반적으로 지질, 당단백질 또는 점액다당류의 대사에 필요한 효소의 결핍의 결과로서 리소좀 기능장애에 의해 야기된다. 리소좀 축적 장애의 발생은 (총괄적으로) 약 1:5,000 내지 1:10,000의 발생률로 발생한다. 리소좀은 원치 않는 물질을 세포가 이용할 수 있는 물질로 처리하기 때문에 일반적으로 세포의 재활용 센터로 지칭된다. 리소좀은 고도로 특수화된 효소를 통해 이러한 원치 않는 물질을 분해한다. 리소좀 장애는 일반적으로 특정 효소가 너무 적은 양으로 존재하거나 전혀 없을 때 촉발된다. 이러한 일이 발생하면, 물질이 세포에 축적된다. 다시 말해서, 리소좀이 정상적으로 기능하지 않을 때, 분해 및 재활용을 위해 예정된 과잉 생성물은 세포에 저장된다. 리소좀 축적 장애는 유전 질환이지만, 이들은 본원에 기재된 바와 같은 자가포식 조절제(오토스타틴)를 사용하여 치료될 수 있다. 이러한 질병 모두는 공통의 생화학적 특성, 즉, 모든 리소좀 장애가 리소좀 내부의 물질의 비정상적 축적으로부터 기원한다는 점을 공유한다. 리소좀 축적병은 대부분 출생 후 몇 개월 또는 몇 년 이내에 많은 어린 시절의 결과로 종종 사망하는 어린이에게 영향을 미친다. 많은 다른 어린이들이 이들의 특정 장애의 다양한 증상으로 수년간 고통을 받은 후 이 질병으로 사망한다.
리소좀 축적병의 예는 예를 들어, 활성화제 결핍/GM2 강글리오시드증, 알파-만노시드증, 아스파르틸글루코아민뇨증, 콜레스테릴 에스테르 축적병, 만성 헥소사미니다제 A 결핍, 시스틴증, 다논병, 파브리병, 파아버병, 푸코시드증, 갈락토시알산증, 고쉐병(타입 I, II 및 III), GM1 강글리오시드증(영아, 영아 후기/소아 및 성인/만성 포함), 헌터 증후군(MPS II), I-세포병/점액지질증 II, 유아 유리 시알산 축적병(ISSD), 청소년 헥소사미니다제 A 결핍, 크라베병, 리소좀산 리파제 결핍, 이염성 백질디스트로피, 헐러 증후군, 샤이에 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 산필리포 증후군, 모르퀴오 타입 A 및 B, 마로토-라미, 슬라이 증후군, 점액지질증, 다중 설페이트 결핍, 니만-피크병, 신경세포 세로이드 리포푸시노스, CLN6 질환, 얀스키-비엘쇼스키병, 폼페병, 피크노디소스토시스, 샌드호프병, 쉰들러병, 테이-삭스 및 월만병을 포함한다.
감염
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 박테리아 감염, 박테리아 패혈성 쇼크, 진균 감염, 및/또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 바이러스 감염, 예컨대, 호흡기 바이러스 감염, 예컨대, 코로나바이러스 감염(예를 들어, MERS(중동 호흡기 증후군) 감염, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)) 감염, 예컨대, SARS-CoV-2 감염), 인플루엔자 감염, 및/또는 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 본원에 기재된 방법 및 고체 투여 형태는 코로나바이러스 감염(예를 들어, MERS 감염, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 감염, 예컨대, SARS-CoV-2 감염)의 치료를 위한 것이다. 일부 구체예에서, COVID-19를 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 감염은 바이러스 감염이며; 바이러스 감염은 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카,바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스에 의한 것이다. 일부 구체예에서, 바이러스 감염은 SARS-CoV-2에 의한 것이다.
염증성 장애
본원에 기재된 방법 및/또는 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물 및/또는 세포)은, 예를 들어, 자가면역 질환, 예컨대, 만성 염증성 장 질환, 전신 홍반 루푸스, 건선, 머클-웰 증후군, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 또는 하시모토병; 알레르기 질환, 예컨대, 음식 알레르기, 꽃가루병, 또는 천식; 감염성 질환, 예를 들어, 클로스트리디움 디피실리에 의한 감염; 염증성 질환, 예컨대, TNF-매개 염증성 질환(예를 들어, 위장관의 염증성 질환, 예컨대, 낭염, 심혈관 염증성 질환, 예컨대, 죽상동맥경화증, 또는 염증성 폐 질환, 예컨대, 만성 폐쇄성 폐 질환)을 예방하거나 치료하기 위해(이의 유해한 효과를 부분적으로 또는 완전히 감소시키기 위해) 사용될 수 있으며; 장기 이식 또는 조직 거부가 발생할 수 있는 다른 상황에서 거부를 억제하기 위한 약학적 조성물; 면역 기능을 개선하기 위한 약학적 조성물; 또는 면역 세포의 증식 또는 기능을 억제하기 위한 약학적 조성물에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 염증의 치료 또는 예방에 유용하다. 특정 구체예에서, 신체의 임의의 조직 및 기관의 염증은 하기 논의되는 바와 같이, 근골격 염증, 혈관 염증, 신경 염증, 소화계 염증, 안구 염증, 생식계 염증, 및 다른 염증을 포함한다.
근골격계의 면역 장애는 손, 손목, 팔꿈치, 어깨, 턱, 척추, 목, 고관절, 발목, 및 발의 관절을 포함하는 골격 관절에 영향을 미치는 상태, 및 힘줄과 같이 근육을 뼈에 연결하는 조직에 영향을 미치는 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 이러한 면역 장애의 예는 비제한적으로, 관절염(예를 들어, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 급성 및 만성 감염성 관절염, 통풍 및 가성통풍 관련 관절염, 및 청소년 특발성 관절염), 건염, 활액염, 건활액염, 활액낭염, 섬유증(섬유근육통), 상과염, 근염, 및 골염(예를 들어, 파제트병, 치골골염, 및 낭포성 골염 포함)을 포함한다.
안구 면역 장애는 눈꺼풀을 포함하는 눈의 임의의 구조에 영향을 미치는 면역 장애를 지칭한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 안구 면역 장애의 예는 비제한적으로, 안검염, 안검이완증, 결막염, 누선염, 각막염, 건성 각결막염(건조증), 공막염, 속눈썹증, 및 포도막염을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 신경계 면역 장애의 예는 비제한적으로, 뇌염, 길랑-바레 증후군, 수막염, 신경근긴장증, 기면증, 다발성 경화증, 척수염 및 정신분열증을 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 혈관계 또는 림프계의 염증의 예는 비제한적으로, 관절경화증, 관절염, 정맥염, 혈관염, 및 림프관염을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 약학적 조성물로 치료될 수 있는 소화계 면역 장애의 예는 비제한적으로, 담관염, 담낭염, 장염, 장결장염, 위염, 위장염, 염증성 장 질환, 회장염, 및 직장염을 포함한다. 염증성 장 질환은, 예를 들어, 관련 병태의 그룹의 특정 당 분야에서 인정되는 형태를 포함한다. 염증성 장 질환의 여러 주요 형태가 알려져 있으며, 크론병(국소 장 질환, 예를 들어, 불활성 및 활성 형태) 및 궤양성 대장염(예를 들어, 불활성 및 활성 형태)이 이들 장애 중 가장 흔하다. 또한, 염증성 장 질환은 과민성 장 증후군, 현미경적 대장염, 림프구-형질구성 장염, 셀리악병, 콜라겐성 대장염, 림프구성 대장염 및 호산구성 장염을 포함한다. 다른 덜 흔한 형태의 IBD는 불확정 대장염, 위막성 대장염(괴사성 대장염), 허혈성 염증성 장 질환, 베체트병, 사르코이드증, 경피증, IBD-관련 이형성, 형성이상 관련 종괴 또는 병변, 및 원발성 경화성 담관염을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 약학적 조성물로 치료될 수 있는 생식계 면역 장애의 예는 비제한적으로, 자궁경부염, 융모양막염, 자궁내막염, 부고환염, 배꼽염, 난소염, 고환염, 난관염, 자궁관-난소 농양, 요도염, 질염, 외음부염, 및 외음부통을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 염증 성분을 갖는 자가면역 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환은 비제한적으로, 급성 파종성 보편적 탈모증, 베체트병, 샤가스병, 만성 피로 증후군, 자율신경장애, 뇌척수염, 강직성 척추염, 재생불량성 빈혈, 화농성 한선염, 자가면역 간염, 자가면역 난소염, 셀리악병, 크론병, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 거대 세포 동맥염, 굿파스처 증후군, 그레이브병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 헤노흐-쉔라인 자반병, 가와사키병, 홍반 루푸스, 현미경적 대장염, 현미경적 다발동맥염, 혼합 결합 조직 질환, 머클-웰 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 간대성 근간대성 증후군, 시신경염, 오디 갑상샘염(ord's thyroiditis), 천포창, 결절성 다발동맥염, 다발근육통, 류마티스 관절염, 라이터 증후군, 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염, 베게너 육아종증, 온난 자가면역, 용혈성 빈혈, 간질성 방광염, 라임병, 모르페아, 건선, 사르코이드증, 경피증, 궤양성 대장염, 및 백반증을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 염증 성분을 갖는 T-세포 매개된 과민성 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환은 비제한적으로, 접촉 과민증, 접촉 피부염(포이즌 아이비로 인한 피부염 포함), 두드러기, 피부 알레르기, 호흡기 알레르기(건초열, 알레르기성 비염, 집먼지진드기 알레르기) 및 글루텐-민감성 장병증(셀리악병)을 포함한다.
방법 및 약학적 조성물로 치료될 수 있는 다른 면역 장애는 예를 들어, 맹장염, 피부염, 피부근염, 심내막염, 섬유염, 치은염, 설염, 간염, 화농성 한선염, 홍채염, 후두염, 유방염, 심근염, 신염, 중이염, 췌장염, 이하선염, 심낭염, 복막염, 인두염, 흉막염, 폐렴, 전립선염, 신우신염, 및 구내염, 이식 거부(기관, 예컨대, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장(예를 들어, 섬 세포), 골수, 각막, 소장, 피부 동종이식(allograft), 피부 동종이식(homograft), 및 심장 판막 이종이식, 혈청병(sewrum sickness), 및 이식편 대 숙주 질환 포함), 급성 췌장염, 만성 췌장염, 급성 호흡 곤란 증후군, 섹사리 증후군(Sexary's syndrome), 선천성 부신 증식, 비화농성 갑상선염, 암과 관련된 고칼슘혈증, 천포창, 포진 수포성 피부염, 중증 다형 홍반, 박리성 피부염, 지루성 피부염, 계절성 또는 통년성 알레르기 비염, 기관지 천식, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 약물 과민 반응, 알레르기 결막염, 각막염, 눈 대상포진, 홍채염 및 홍채세포체염(oiridocyclitis), 맥락망막염, 시신경염, 증상성 사이코이드증, 전격성 또는 파종성 폐결핵 화학요법, 성인에서 특발성 혈소판 감소성 자반증, 성인에서 이차성 혈소판 감소증, 후천성(자가면역) 용혈성 빈혈, 국소 장염, 자가면역 혈관염, 다발성 경화증, 만성 폐쇄성 폐질환, 고형 장기 이식 거부, 패혈증을 포함한다. 바람직한 치료는 이식 거부, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 다발성 경화증, 타입 1 당뇨병, 천식, 염증성 장 질환, 전신성 홍반 루푸스, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 염증 동반 감염성 질환(예를 들어, 패혈증)의 치료를 포함한다.
신경변성 및 신경염증성 장애
본원에 기재된 방법 및/또는 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 신경변성 및 신경계 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 신경변성 및/또는 신경계 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 프라이온 질환, 헌팅턴병, 운동 뉴런 질환(MND), 척수소뇌 운동실조, 척수 근위축, 근긴장이상, 특발성 두개내 고혈압, 간질, 신경계 질환, 중추성 신경계 질환, 운동 장애, 다발성 경화증, 뇌병증, 말초 신경병증, 수술 후 인지 기능장애, 전두측두엽 치매, 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 혈관성 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 다발성 경화증, 프리온 질환, 피크병, 피질기저 변성, 파킨슨병, 루이소체 치매, 진행성 핵상 마비, 치매 푸길리스티카(만성 외상성 뇌병증), 전두측두엽 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨증, 리티코-보디그(Lytico-Bodig) 질환, 매듭-우세 치매, 신경절교종, 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 중독뇌병, 결절성 경화증, 할러포르덴-스파츠병, 리포푸시노증, 은친화 과립성 질환, 및 전측두엽 변성이다.
본원에 기재된 방법 및/또는 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은, 예를 들어, 염증을 완화시키는 하나 이상의 사이토카인을 인코딩하는 유전자를 포함하는 핵산을 전달하기 위한 본 개시의 개시내용의 재조합 비리온을 사용하여 신경염증 및/또는 신경염증 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 신경염증성 질환은 비제한적으로, 자가면역 질환, 염증성 질환, 신경변성 질환, 신경근육 질환, 또는 정신병을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 뇌 염증, 말초 신경 염증, 신경 염증, 척수 염증, 안구 염증, 및/또는 다른 염증을 포함하는 중추 신경계의 염증의 치료 또는 예방에 유용하다.
본원에 기재된 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 신경염증 또는 신경염증 장애와 관련된 장애의 예는 비제한적으로, 뇌염(뇌의 염증), 뇌척수염(뇌 및 척수의 염증), 수막염(뇌 및 척수를 둘러싸는 막의 염증), 길랑-바레 증후군, 신경근긴장증, 기면증, 다발성 경화증, 척수염, 정신분열증, 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 급성 시신경염(AON), 횡단 척수염, 시신경척수염(NMO), 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 전두측두엽 치매, 시신경염, 시신경척수염 스펙트럼 장애(NMOSD), 자가면역 뇌염, 항-NMDA 수용체 뇌염, 라스무센 뇌염, 소아 급성 괴사성 뇌병증(ANEC), 활모양강직-근육간대경련-실조증후군, 외상성 뇌 손상, 헌팅턴병, 우울증, 불안, 편두통, 중증 근무력증, 급성 허혈성 뇌졸중, 간질, 활막염, 전두측두엽 치매, 진행성 비유창성 실어증, 의미 치매, 노딩 증후군, 뇌 허혈, 신경병증 통증, 자폐 스펙트럼 장애, 섬유근육통 증후군, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전신 홍반성 루푸스, 프리온 질환, 운동 뉴런 질환(MND), 척수소뇌 운동실조, 척수 근육 위축, 근긴장 이상, 특발성 두개내 고혈압, 신경계 질환, 중추 신경계 질환, 운동 장애, 뇌병증, 말초 신경병증, 또는 수술 후 인지 기능 장애를 포함한다.
암
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 방법 및/또는 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물 및/또는 세포)은 예를 들어, 종양 억제제를 인코딩하는 핵산의 본 개시의 GSH 유전자좌에서의 통합을 포함할 수 있다. 유사하게, 본원에 제공된 방법 및/또는 적어도 하나의 조성물(예를 들어, 핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포)은 예를 들어, 종양유전자를 하향조절하는 비코딩 RNA(예를 들어, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, gRNA, 안티센스 RNA)를 인코딩하는 핵산의 통합을 포함할 수 있다.
암, 종양, 또는 과증식성 장애는 제어되지 않은 증식, 불멸성, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식 속도, 및 특정 특징적인 형태적 특징과 같은 암-유발 세포의 전형적인 특징을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 암 세포는 종종 종양의 형태이지만, 이러한 세포는 동물 내에 단독으로 존재할 수 있거나, 백혈병 세포와 같은 비종양유발성 암 세포일 수 있다. 암은 비제한적으로, B 세포 암(예를 들어, 다발성 골수종, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 변연부 림프종, 버킷 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 모발 세포 백혈병, 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종, 원발성 안내 림프종, 중쇄 질환, 예를 들어, 알파 사슬 질환, 감마 사슬 질환, 및 뮤 사슬 질환, 양성 단클론성 감마병증, 및 면역세포 아밀로이드증), T 세포 암(예를 들어, T-림프모구 림프종/백혈병, 비호지킨 림프종, 말초 T-세포 림프종, 피부 T-세포 림프종(예를 들어, 균상식육종, 세자리 증후군), 성인 T-세포 백혈병/림프종, 혈관면역모세포 T-세포 림프종, 림프절외 자연 살해/T-세포 림프종, 장병증-관련 장 T-세포 림프종(EATL), 역형성 대세포 림프종(ALCL), 호지킨 림프종), 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계 암, 말초신경계암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두 암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 맹장 암, 타액선암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액 조직의 암, 및 기타 등등을 포함한다. 본 발명에 포함되는 방법에 적용 가능한 암 유형의 다른 비제한적인 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 활막내피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질암종, 기관지암종, 신장 세포 암종, 간암(hepatoma), 담관 암종, 간암(liver cancer), 융모막암종, 정액종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 골암, 뇌종양, 고환암, 폐암, 소세포 폐 암종(SCLC), 방광 암종, 상피 암종, 신경 교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청각 신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들어, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병(골수모구, 전골수구성, 골수단핵구, 단핵구 및 적혈구백혈병); 만성 백혈병(만성 골수성(과립성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성 적혈구증가증, 림프종(호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄 질환을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 본질적으로 상피성이며, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인과암, 신장암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 피부암을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 구체예에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암, 또는 결장암이다. 또 다른 구체예에서, 상피암은 비-소세포 폐암, 비유두상 신장 세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들어, 장액 난소 암종), 또는 유방 암종이다. 상피암은 비제한적으로 장액성, 자궁내막양, 점액성, 투명 세포, 브레너(Brenner), 또는 미분화를 포함하는 다양한 다른 방식으로 특징으로 할 수 있다.
가족성 간내 담즙정체
본원에 기재된 방법 및/또는 조성물은 각각 PFIC 타입 1, 2 및 3을 초래하는 ATPB1, ATPB11 및 ABCB4 유전자의 돌연변이와 관련된 유전 질환인 가족성 간내 담즙정체(PFIC)를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 이 드문 상염색체 열성 질환은 간에서의 도관 증식 및 상승된 감마-글루타밀트랜스펩티다제(GGT) 활성을 갖는 진행성 간내 담즙정체를 특징으로 하는 담즙 분비 경로의 붕괴를 유발한다. ABCB4 돌연변이는 질병의 가장 흔한 형태이다. ABCB4 유전자는 염색체 7q21.1에 위치하고, PFIC3 초래와 관련된 지질 플롭파제 MDR3 단백질을 인코딩한다. MDR3은 주로 간의 세관 막에서 발현되고 인지질 전위자, 즉, 포스파티딜콜린(PC)으로 작용한다. MDR3은 담즙산염의 세제 활성으로부터 간세포막을 보호한다. PFIC3 결함은 담즙으로의 포스파티딜콜린(PC)의 감소된 분비를 특징으로 하며, 따라서, 담즙 분비 수송 시스템을 손상시킨다(Davit-Spraul, et al., PMID: 20422496). 감소된 PC 분비는 간에서 독성을 유발하고, 이는 간내 간경변으로 추가로 진행되는 간세포의 동시 파괴와 함께 염증 유도성 프로그램의 활성화를 초래한다. 덜 널리 퍼진 다른 형태의 질병은 유사한 결과를 초래하는 ATPB1 및 ATPB11 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 따라서, ATPB1, ATPB11, 및/또는 ABCB4에 대한 유전자 요법은 가족성 간내 담즙정체를 예방 및/또는 치료하는데 유용하다.
윌슨병
본원에 기재된 방법 및/또는 조성물은 윌슨병(WD)을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. WD는 구리-수송 P-타입 ATPase를 인코딩하는 ATP7B 유전자의 돌연변이와 관련된 단일유전자의 상염색체 열성 유전 질환이다. ATP7B에서 600개 초과의 병원성 변이체가 확인되었으며, 단일-뉴클레오티드 미스센스 및 넌센스 돌연변이가 가장 흔하고, 삽입/결실, 및 드물게 스플라이스 부위 돌연변이가 뒤따른다. ATP7B는 간에서 가장 높게 발현되지만, 신장, 태반, 유선, 뇌, 및 폐에서도 발견된다. ATPB7 파괴는 세포내 구리 수준을 증가시킨다. 구리의 인간 식이 섭취량은 약 1.5-2.5 mg/일이며, 이는 위와 십이지장에서 흡수되고, 순환하는 알부민에 결합되고, 조절 및 배설을 위해 간으로 수송된다. 항산화제 단백질 1(ATOX1)은 구리-의존성 단백질-단백질 상호작용에 의해 ATPB7에 구리를 전달한다. 간세포 내에서, ATP7B는 트랜스-골지 네트워크(TGN) 또는 세포질 소포에서 2개의 중요한 기능을 수행한다. TGN에서, ATP7B는 6개의 구리 분자를 아포세룰로플라스민으로 패키징함으로써 세룰로플라스민을 활성화시키고, 이는 이후 혈장으로 분비된다. 세포질에서, ATP7B는 과량의 구리를 소포로 격리시키고, 엑소사이토시스를 통해 정점의 세관 막을 가로질러 담즙내로 배출된다(Bull et al., 1993; Tanzi et al., 1993; Yamaguchi et al., 1999; Cater et al., 2007). 구리의 합성 및 배설 둘 모두에서 ATP7B 수송체의 이원적 역할로 인해, 이의 기능의 결함은 구리 축적을 유발하여 산화 스트레스 및 자유 라디칼 형성 뿐만 아니라 산화 스트레스와 독립적으로 발생하는 미토콘드리아 기능장애를 야기한다. 조합된 효과는 간 및 뇌 조직 뿐만 아니라 다른 기관에서 염증 유도성 상태 및 후속 세포 사멸을 유도한다.
리소좀 축적 장애
본원에 기재된 방법 및/또는 조성물은 리소좀 축적병(LSD)을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 이들은 효소 결핍의 결과로 신체 세포에서 다양한 독성 물질이 비정상적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 유전성 대사 질환이다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 일부 경우에 뇌 백질의 변화를 포함하여, 다수의 기관에 영향을 미치는 중증 고암모니아혈증이 우세한 파괴적인 대사 질환을 특징으로 하는 희귀한 상염색체 열성 장애인 카르바모일 포스페이트 신테타제 1 결핍(CPS1D)을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. CPS1은 인간에서 질소 폐기를 위한 주요 경로인 우레아 사이클의 첫 번째 및 속도-제한 단계를 촉매화하기 때문에 간 우레아 생성에서 가장 중요한 역할을 한다. CPS1 결핍은 요소 순환 장애 및 암모니아 축적을 초래한다. 따라서, CPS1 결핍 환자에서 현저한 고암모니아혈증 및 요소 회로의 감소된 하류 생산이 관찰될 수 있다. 과잉의 암모니아는 중추 신경계에 들어갈 수 있고 뇌에 독성 효과를 발휘할 수 있다. 암모니아의 축적은 독성을 유발하고 세포 사멸을 초래한다.
혈액 질환
특정 양태에서, 하기 기재된 혈액 질환 이외에, 본원에 기재된 방법 및/또는 조성물은 내피 기능장애, 낭포성 섬유증, 심혈관 질환, 말초 혈관 질환, 뇌졸중, 심장 질환(예를 들어, 선천성 심장 질환을 포함함), 당뇨병, 인슐린 저항성, 만성 신부전, 죽상동맥경화증, 종양 성장(예를 들어, 내피 세포의 것을 포함함), 전이, 고혈압(예를 들어, 폐동맥 고혈압, 다른 형태의 폐 고혈압), 죽상동맥경화증, 재협착, C형 간염, 간경변, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 대사 증후군, 신장 질환, 염증, 및 정맥 혈전증과 같은 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 혈액 질환은 하기 중 어느 하나를 포함한다: 헤모글로빈병증(예를 들어, 겸상 적혈구 질환, 지중해빈혈, 메트헤모글로빈혈증), 빈혈(철-결핍 빈혈, 거대적아구성 빈혈, 용혈성 빈혈, 골수이형성 증후군, 골수섬유증, 호중구감소증, 무과립구증, 글란츠만 혈소판기능저하증, 혈소판감소증, 비스코트-올드리치 증후군, 골수증식성 장애(예를 들어, 진성적혈구증가증, 적혈구증, 백혈구증가증, 혈소판증가증), 응고병증, 혈액암, 혈색소증, 무비증, 비장과다증(예를 들어, 고쉐병), 혈구탐식성 림프조직구증가증, 템피 증후군 및 AIDS.
일부 구체예에서, 예시적인 용혈성 빈혈은 다음을 포함한다: 유전성 구상적혈구증가증, 유전성 타원적혈구증, 선천성 적혈구형성 이상 빈혈, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 결핍증(G6PD), 피루베이트 키나제 결핍증, 자가면역 용혈성 빈혈(예를 들어, 특발성 빈혈, 전신성 홍반 루푸스(SLE), 에반스 증후군, 한랭 응집소 질환, 발작성 한랭 헤모글로빈뇨증, 감염성 단핵구증), 동종면역 용혈성 빈혈(예를 들어, 신생아의 용혈성 질환, 예를 들어, Rh 질환, 신생아의 ABO 용혈성 질환, 신생아의 항-Kell 용혈성 질환, 신생아의 레서스 c 용혈성 질환, 신생아의 레서스 E 용혈성 질환), 발작성 야간 혈색소뇨증, 미세혈관병증성 용혈성 빈혈, 판코니 빈혈, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 및 후천성 순수 적혈구 무형성증.
일부 구체예에서, 예시적인 응고병증은 혈소판증가증, 파종성 혈관내 응고, 혈우병(예를 들어, 혈우병 A, 혈우병 B, 혈우병 C), 폰 빌레브란트병, 및 항인지질 증후군을 포함한다.
일부 구체예에서, 예시적인 혈액암은 하기를 포함한다: 호지킨병, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 역형성 대세포 림프종, 비장 변연부 림프종, T-세포 림프종(예를 들어, 간비장 T-세포 림프종, 혈관면역모세포 T-세포 림프종, 피부 T-세포 림프종), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 거핵모세포 백혈병, 만성 특발성 골수섬유증, 만성 골수성 백혈병(CML), T-세포 전림프구성 백혈병, B-세포 전림프구성 백혈병, 만성 호중구 백혈병, 모발 세포 백혈병, T-세포 대 과립 림프구 백혈병, AIDS-관련 림프종, 세자리 증후군, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 만성 골수증식성 신생물, 랑게르한스 세포 조직구증식증, 골수이형성 증후군 및 공격성 NK-세포 백혈병.
본원에서 사용되는 헤모글로빈병증은 혈액에서 비정상적인 헤모글로빈 분자의 존재를 수반하는 임의의 장애를 포함한다. 헤모글로빈병증의 예는 비제한적으로, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 적혈구 질환(SCD), 겸상 적혈구 빈혈, 및 지중해빈혈을 포함한다. 또한 비정상 헤모글로빈의 조합이 혈액에 존재하는 혈색소병증(예를 들어, 겸상 적혈구/Hb-C 질환)이 포함된다.
본원에서 사용되는 지중해빈혈은 헤모글로빈의 결함적 생산을 특징으로 하는 유전성 장애를 지칭한다. 지중해빈혈의 예는 α- 및 β- 지중해빈혈을 포함한다. β-지중해빈혈은 베타 글로빈 사슬의 돌연변이에 의해 유발되며, 주요 또는 부 형태로 발생할 수 있다. 주요 형태의 β-지중해빈혈에서, 소아는 출생 시 정상이지만, 생후 1년 동안 빈혈이 발생한다. 온화한 형태의 β-지중해빈혈은 작은 적혈구를 생산하고, β-지중해빈혈은 글로빈 사슬로부터의 유전자 또는 유전자들의 결실에 의해 야기되고, α-지중해빈혈은 전형적으로 HBA1 및 HBA2 유전자를 포함하는 결실로부터 발생한다. 이들 유전자 둘 모두는 헤모글로빈의 성분(서브유닛)인 α-글로빈을 인코딩한다. 각 세포 게놈에는 HBA1 유전자의 2개 복사체 및 HBA2 유전자의 2개 복사체가 존재한다. 결과적으로, α-글로빈을 생산하는 4개의 대립유전자가 존재한다. 다른 유형의 지중해빈혈은 이러한 대립유전자의 일부 또는 전부의 손실로 인해 발생한다. 지중해빈혈의 가장 심각한 형태인 Hb Bart 증후군은 4개의 α-글로빈 대립유전자 모두의 손실로부터 발생한다. HbH 질환은 4개의 α-글로빈 대립유전자 중 3개의 손실에 의해 야기된다. 이러한 두 조건에서, α-글로빈의 부족은 세포가 정상 헤모글로빈을 만드는 것을 방지한다. 대신, 세포는 헤모글로빈 Bart(Hb Bart) 또는 헤모글로빈 H(HbH)로 불리는 비정상적인 형태의 헤모글로빈을 생산한다. 이러한 비정상적인 헤모글로빈 분자는 산소를 신체의 조직으로 효과적으로 운반할 수 없다. 정상 헤모글로빈에 대한 Hb Bart 또는 HbH의 치환은 지중해빈혈과 관련된 빈혈 및 다른 심각한 건강 문제를 야기한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 겸상 적혈구 질환은 글로빈 유전자의 돌연변이로부터 발생하고 저산소 상태 하에 전형적인 양면오목 형태로부터 모세혈관을 통과할 수 없어 저산소증을 악화시키는 비정상으로 단단한 겸상 형상으로 전환되는 적혈구를 특징으로 하는 상염색체 열성 유전 혈액 장애의 그룹을 지칭한다. 이들은 글루탐산이 펩티드의 아미노산 위치 6에서 발린으로 치환된 β-글로빈 사슬 변이체를 코딩하는 β-유전자의 존재에 의해 정의되고, 돌연변이 매트를 갖는 제2 β-유전자는 HbS의 결정화를 허용하여 임상 표현형을 초래한다. 겸상 적혈구 빈혈은 HbS를 유발하는 돌연변이에 대해 동형접합성인 환자에서 특정 형태의 겸상 적혈구 질환을 지칭한다. 겸상 적혈구 질환의 다른 일반적인 형태는 HbS/β-지중해빈혈, HbS/HbC 및 HbS/HbD를 포함한다.
특정 구체예에서, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 적혈구 질환(SCD), 겸상 적혈구 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 주요 지중해빈혈, 중간 지중해빈혈, α-지중해빈혈, 및 헤모글로빈 H 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 헤모글로빈병증을 치료, 예방 또는 완화시키기 위한 방법 및 조성물은 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 헤모글로빈병증은 β-지중해빈혈이다. 일부 구체예에서, 헤모글로빈병증은 겸상 적혈구 빈혈이다. 다양한 구체예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 유전자 요법을 필요로 하는 대상체의 세포, 조직, 또는 기관에 직접 주사에 의해 생체내 투여된다. 다양한 다른 구체예에서, 세포는 본원에 기재된 재조합 비리온으로 시험관내 또는 생체외에서 형질도입된다. 이후, 세포는, 예를 들어, 본원에 개시된 약학적 제형 내에서 유전자 요법을 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
상기 기재된 바와 같이, 대상체에서 헤모글로빈병증을 예방 또는 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 다양한 구체예에서, 방법은 본원에 기재된 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 상기 세포의 집단(예를 들어, HSC, CD34+ 또는 CD36 세포, 적혈구 계통 세포, 배아 줄기 세포, 또는 iPSC)을 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 치료 또는 예방을 위해, 투여되는 양은 요망되는 임상 이익을 생성하는데 효과적인 양일 수 있다. 유효량은 하나 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 유효량은 볼루스로 또는 연속 관류에 의해 제공될 수 있다. 유효량은 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 치료 또는 예방의 관점에서, 유효량은 질병의 진행을 완화시키거나, 개선하거나, 안정화시키거나, 역전시키거나 늦추거나, 달리 질병의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 유효량은 일반적으로 사례별로 의사에 의해 결정되며 당업자의 통상적인 기술 범위 내에 있다. 유효량을 달성하기 위해 적절한 투여량을 결정할 때 여러 인자가 전형적으로 고려된다. 이러한 인자는 대상체의 연령, 성별 및 체중, 치료되는 질환, 질환의 중증도를 포함한다.
혈우병 A
혈우병 A는 혈액이 정상적으로 응고되지 않는 유전성 출혈 장애이다. 혈우병 A 환자는 부상, 수술 또는 치과 시술 후 정상인보다 출혈량이 많다. 이 장애는 중증, 중등도 또는 경증일 수 있다. 심한 경우에는 경미한 손상 후 또는 손상이 없는 경우에도 심한 출혈이 발생한다(자연 출혈). 관절, 근육, 뇌 또는 장기로의 출혈은 통증 및 기타 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 경증 형태에서는 자발적 출혈은 없으며, 장애는 단지 수술 또는 심각한 손상 후에 진단될 수 있다. 혈우병 A는 인자 VIII라고 불리는 낮은 수준의 단백질에 의해 발생한다. 인자 VIII는 혈전을 형성하는 데 필요하다. 장애는 X-연관 열성 방식으로 유전되며 F8 유전자의 변화(돌연변이)에 의해 유발된다. 혈우병 A의 진단은 임상 증상 및 혈액 내 응고 인자의 양을 측정하기 위한 특정 실험실 시험을 통해 이루어진다. 주요 예방 또는 치료는 대체 요법이며, 이 동안 응고 인자 VIII를 정맥에 서서히 적하하거나 주사한다. 혈우병 A는 주로 남성에게 영향을 미친다. 예방 또는 치료를 통해 이 장애가 있는 대부분의 사람들은 잘 지낸다. 중증 혈우병 A를 갖는 일부 사람들은 다른 건강 상태의 존재 및 장애의 드문 합병증으로 인해 수명이 단축될 수 있다.
혈우병 A를 앓고 있는 환자는 인간에서 치료적 이점을 제공하는데 필요한 활성을 보유하는, 전장 인자 VIII(FVIII) 또는 B-도메인-결실된 FVIII(예를 들어, FVIII-SQ, p-VIII, p-VIII-LMW; Sandberg et al. (2001) Thromb Haemost 85:93-100)을 인코딩하는 F8 트랜스진을 도입하는 유전자 요법으로부터의 이점을 고수한다(Rangarajan et al. (2017) N Engl J Med 377:2519-30). 본 개시의 재조합 비리온, 약학적 조성물, 및 방법은 부분적으로 AAV와 비교하여 더 큰 유전자를 패키징하는 재조합 비리온의 능력, 낮은 면역원성, 및 박동성 유전자 조절로 인해 혈우병 A를 앓는 환자를 위한 개선된 바이러스 벡터 및 예방/치료 방법을 제공한다(실시예 9 및 섹션 "박동성 유전자 발현 또는 유도성 유전자 발현" 참조).
일부 구체예에서, 치료되는 질환은 표 4에 제시된 것들로부터 선택된 질환을 포함한다.
표 4
일부 구체예에서, 본원에 개시된 세포 중 하나 이상을 투여한 후, 대상체의 말초 혈액을 수집하고 헤모글로빈 수준을 측정한다. 치료적으로 관련된 수준의 헤모글로빈은 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터로 형질도입된 세포의 투여 후에 생산된다. 치료적으로 관련된 헤모글로빈 수준은 (1) 빈혈을 개선시키기에, (2) 정상 헤모글로빈을 함유하는 적혈구를 생산하는 대상체의 능력을 개선 또는 회복시키기에, (3) 대상체에서 비효율적인 적혈구 생성을 개선 또는 교정하기에, (4) 골수외 조혈(예를 들어, 비장 및 간 골수외 조혈)을 개선 또는 교정하기에 및/또는 (S), 예를 들어, 말초 조직 및 기관에서 철 축적을 감소시키기에 충분한 헤모글로빈의 수준이다. 치료적으로 관련된 헤모글로빈 수준은 적어도 약 7 g/dL Hb, 적어도 약 7.5 g/dL Hb, 적어도 약 8 g/dL Hb, 적어도 약 8.5 g/dL Hb, 적어도 약 9 g/dL일 Hb, 적어도 약 9.5 g/dL Hb, 적어도 약 10 g/dL Hb, 적어도 약 10.5 g/dL Hb, 적어도 약 11 g/dL Hb, 적어도 약 11.5 g/dL Hb, 적어도 약 12 g/dL Hb, 적어도 약 12.5 g/dL Hb, 적어도 약 13 g/dL Hb, 적어도 약 13.5 g/dL Hb, 적어도 약 14 g/dL Hb, 적어도 약 14.5 g/dL Hb 또는 적어도 약 15 g/dL Hb일 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 치료적으로 관련된 헤모글로빈 수준은 약 7 g/dL Hb 내지 약 7.5 g/dL Hb, 약 7.5 g/dL Hb 내지 약 8 g/dL Hb, 약 8 g/dL Hb 내지 약 8.5 g/dL Hb, 약 8.5 g/dL Hb 내지 약 9 g/dL Hb, 약 9 g/dL Hb 내지 약 9.5 g/dL Hb, 약 9.5 g/dL Hb 내지 약 10 g/dL Hb, 약 10 g/dL Hb 내지 약 10.5 g/dL Hb, 약 10.5 g/dL Hb 내지 약 11 g/dL Hb, 약 11 g/dL Hb 내지 약 11.5 g/dL Hb, 약 11.5 g/dL Hb 내지 약 12 g/dL Hb, 약 12 g/dL Hb 내지 약 12.5 g/dL Hb, 약 12.5 g/dL Hb 내지 약 13 g/dL Hb, 약 13 g/dL Hb 내지 약 13.5 g/dL Hb, 약 13.5 g/dL Hb 내지 약 14 g/dL Hb, 약 14 g/dL Hb 내지 약 14.5 g/dL Hb, 약 14.5 g/dL Hb 내지 약 15 g/dL Hb, 약 7 g/dL Hb 내지 약 8 g/dL Hb, 약 8 g/dL Hb 내지 약 9 g/dL Hb, 약 9 g/dL Hb 내지 약 10 g/dL Hb, 약 10 g/dL Hb 내지 약 11 g/dL Hb, 약 11 g/dL Hb 내지 약 12 g/dL Hb, 약 12 g/dL Hb 내지 약 13 g/dL Hb, 약 13 g/dL Hb 내지 약 14 g/dL Hb, 약 14 g/dL Hb 내지 약 15 g/dL Hb, 약 7 g/dL Hb 내지 약 9 g/dL Hb, 약 9 g/dL Hb 내지 약 11 g/dL Hb, 약 11 g/dL Hb 내지 약 13 g/dL Hb, 또는 약 13 g/dL Hb 내지 약 15 g/dL Hb일 수 있다. 특정 구체예에서, 치료적으로 관련된 헤모글로빈 수준은 대상체에서 적어도 3일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 4개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월(또는 1년), 적어도 약 24개월(또는 2년) 동안 유지된다. 특정 구체예에서, 치료적으로 관련된 헤모글로빈 수준은 대상체에서 최대 약 6개월, 최대 약 12개월(또는 1년), 최대 약 24개월(또는 2년) 동안 유지된다. 특정 구체예에서, 치료적으로 관련된 헤모글로빈 수준은 대상체에서 약 3일, 약 1주, 약 2주, 약 1개월, 약 2개월, 약 4개월, 약 6개월, 약 12개월(또는 1년), 약 24개월(또는 2년) 동안 유지된다. 특정 구체예에서, 치료적으로 관련된 헤모글로빈 수준은 약 6개월 내지 약 12개월(예를 들어, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 10개월, 약 10개월 내지 약 12개월), 약 12개월 내지 약 18개월(예를 들어, 약 12개월 내지 약 14개월, 약 14개월 내지 약 16개월, 또는 약 16개월 내지 약 18개월), 또는 약 18개월 내지 약 24개월(예를 들어, 약 18개월 내지 약 20개월, 약 20개월 내지 약 22개월, 또는 약 22개월 내지 약 24개월) 동안 대상체에서 유지된다.
특정 구체예에서, 세포는 세포와 함께 투여되는 대상체에 대해 자가이다. 일부 구체예에서, 세포는 골수 또는 말초 순환에서 이동된 세포로부터 유래되며, 세포와 함께 투여되는 대상체에 대해 자가이다. 다른 구체예에서, 세포는 세포와 함께 투여되는 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 구체예에서, 세포는 세포와 함께 투여되는 대상체에 대해 자가의 골수로부터의 것이다.
본 개시는 또한 대상체에서 백혈구 또는 백혈구와 비교하여 적혈구 또는 적혈구의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 대상체에게 본원에 기술된 유효량의 적어도 하나의 조성물(핵산 벡터, 바이러스 벡터, 약학적 조성물, 및/또는 세포(예를 들어, HSC, CD34+ 또는 CD36 세포, 적혈구 계통 세포, 배아 줄기 세포 또는 iPSC)을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조혈 줄기 세포의 적혈구 자손 세포의 비율은 대상체에서 조혈 줄기 세포의 백혈구 자손 세포와 비교하여 증가된다.
투여될 세포의 양은 대상체 및/또는 예방 또는 치료되는 질병에 따라 달라질 것이다. 일부 구체예에서, 약 1 x 104 내지 약 1 x 105개 세포/kg, 약 1 x 105 내지 약 1 x 106개 세포/kg, 약 1 x 106 내지 약 1 x 107개 세포/kg, 약 1 x 107 내지 약 1 x 108개 세포/kg, 약 1 x 108 내지 약 1 x 109개 세포/kg, 또는 약 1 x 109 내지 약 1 x 1010개 세포/kg의 본원에 개시된 세포가 대상체에게 투여된다. 필요에 따라, 대상체는 다중 용량의 세포를 필요로 할 수 있다. 유효 용량으로 간주될 것의 정확한 결정은 대상체의 크기, 연령, 성별, 체중, 및 특정 대상체의 상태를 포함하는 각 대상체에 대한 개별 인자에 기초할 수 있다. 투여량은 본 개시 및 당 분야의 지식으로부터 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
임의의 특정 이론에 구속됨이 없이, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 의해 제공되는 중요한 이점은 본 개시의 GSH 유전자좌를 이용함으로써 임의의 질병(예를 들어, 혈색소병증, 낭포성 섬유증, 혈색소침착증)을 앓고 있는 대상체를 치료하거나 대상체 예를 들어, 이러한 질환이 발병할 위험이 있는 대상체에서 임의의 질병을 예방하는 효율적인 방법이다. 발병 위험이 있는 대상체는 이들이 보유하는 특정 유전적 돌연변이, 및/또는 환경적 또는 물리적 요인(예를 들어, 대상체의 성별, 연령)에 의해 확인될 수 있다. 매우 효율적이고 안전한 유전자 요법은 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용함으로써 달성된다. 예를 들어, GSH로의 핵산(예를 들어, 치료용 핵산)의 표적화된 통합은 세포에서 세포 유전자의 유해한 돌연변이, 형질전환, 또는 종양유전자 활성화의 기회를 감소시킨다.
예시적인 구체예
1.
게놈 세이프 하버(GSH) 유전자좌를 확인하는 방법으로서,
(a) 세포의 게놈으로 적어도 하나의 마커 유전자의 무작위 삽입을 유도하는 단계;
(b) 마커 유전자 발현의 안정성 및/또는 수준을 결정하는 단계; 및
(c) 삽입된 마커 유전자가 안정한 및/또는 높은 수준의 발현을 나타내는 게놈 유전자좌를 GSH로서 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
2.
구체예 1에 있어서,
(a) 삽입된 마커 유전자가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 게놈 유전자좌를 확인하는 단계; 및/또는
(b) 삽입된 마커가 세포의 분화 능력(예를 들어, 만능성, 다능성)에 영향을 미치지 않는 게놈 유전자좌를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3.
구체예 1 또는 2에 있어서, 세포가 세포주, 일차 세포, 줄기 세포, 또는 전구 세포로부터 선택되고, 선택적으로 세포가 줄기 세포 또는 전구 세포인 방법.
4.
구체예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 세포가 배아 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 및 간 전구 세포로부터 선택되는 방법.
5.
구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 세포가 포유동물 세포이고, 선택적으로 포유동물 세포가 마우스 세포, 개 세포, 돼지 세포, 비인간 영장류(NHP) 세포, 또는 인간 세포인 방법.
6.
구체예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 무작위 삽입이
(a) 마커 유전자를 포함하는 핵산 분자로 세포를 트랜스펙션시키는 단계로서, 선택적으로 핵산이 플라스미드인 단계; 또는
(b) 마커 유전자를 포함하는 통합 바이러스로 세포를 형질도입시키는 단계에 의해 유도되는 방법.
7.
구체예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 무작위 삽입이 마커 유전자를 포함하는 통합 바이러스로 세포를 형질도입시키는 단계에 의해 유도되고; 통합 바이러스가 레트로바이러스이고, 선택적으로 레트로바이러스가 감마 레트로바이러스인 방법.
8.
구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자가 스크리닝 가능한 마커 및/또는 선택 가능한 마커를 포함하고, 선택적으로
(a) 스크리닝 가능한 마커 유전자가 녹색 형광 단백질(GFP), 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 및/또는 베타-글루쿠로니다제를 인코딩하고/거나;
(b) 선택 가능한 마커 유전자가 항생제 내성 유전자이고, 선택적으로 항생제 내성 유전자가 블라스티시딘 S-데아미나제 또는 아미노 3'-글리코실 포스포트랜스퍼라제(네오마이신 내성 유전자)를 인코딩하는 방법.
9.
구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 마커 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않은 방법.
10.
구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 마커 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로 프로모터가 조직-특이적 프로모터인 방법.
11.
구체예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, GSH가 인트론, 엑손, 또는 유전자간 서열인 방법.
12.
GSH 유전자좌를 확인하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) 후생동물 종의 게놈에서 내인성 바이러스 요소(EVE)의 존재 및 위치를 결정하는 단계;
(b) EVE에 근접한 유전자간 또는 인트론 경계를 결정하는 단계; 및
(c) GSH 유전자좌로서 EVE를 포함하는 유전자간 또는 인트론 유전자좌를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
13.
구체예 12에 있어서,
(a) EVE의 존재 및 위치가 바이러스 요소에 상동성인 서열에 대해 인 실리코(in silico) 검색에 의해 결정되고/거나;
(b) EVE에 근접한 유전자간 또는 인트론 경계가 EVE에 플랭킹된 서열 및 유전자간 또는 인트론 경계가 알려진 하나 이상의 종의 이종상동성 서열을 정렬함으로써 결정되는 방법.
14.
이종상동성 유기체에서 GSH 유전자좌를 확인하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) 구체예 1-13 중 어느 하나의 방법에 따라 종 A에서 GSH 유전자좌를 확인하는 단계;
(b) (i) 종 A에서 GSH 유전자좌에 근접한 적어도 하나의 시스-작용 요소 및 (ii) 종 B에서 상응하는 시스-작용 요소(들)의 위치를 결정하는 단계; 및
(c) 종 B에서 유전자좌를 GSH 유전자좌로서 확인하는 단계로서, 종 B에서 상기 유전자좌와 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리가 종 A에서 GSH 유전자좌와 상응하는 시스-작용 요소(들) 사이의 거리에 실질적으로 비례하는 단계를 포함하는 방법.
15.
구체예 14에 있어서, 적어도 하나의 시스-작용 요소가 스플라이싱 공여자 부위, 스플라이싱 수용자 부위, 폴리피리미딘 트랙, 폴리아데닐화 신호, 인핸서, 프로모터, 종결자, 스플라이싱 조절 요소, 인트론 스플라이싱 인핸서, 및 인트론 스플라이싱 사일런서로부터 선택되는 방법.
16.
구체예 14 또는 15에 있어서, 적어도 하나의 시스-작용 요소가 2개 이상의 시스-작용 요소를 포함하는 방법.
17.
구체예 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 시스-작용 요소가 2개의 시스-작용 요소를 포함하고; 제1 시스-작용 요소가 GSH 유전자좌의 상류(즉, 5'측)에 위치하고, 제2 시스-작용 요소가 GSH 유전자좌의 하류(즉, 3'측)에 위치하는 방법.
18.
구체예 17에 있어서, 종 B에서 2개의 시스-작용 요소 사이의 거리에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소와 GSH 유전자좌 사이의 거리가 종 A에서 2개의 시스-작용 요소 사이의 거리에 대한 상응하는 시스-작용 요소와 GSH 유전자좌 사이의 거리에 실질적으로 비례하는 방법.
19.
구체예 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 종 B에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리가 종 A에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리의 20% 이상 내지 500% 이하인 방법.
20.
구체예 14 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 종 B에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리가 종 A에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리의 80% 이상 내지 250% 이하인 방법.
21.
구체예 12 내지 20 중 어느 하나에 있어서, GSH 유전자좌가 포유동물 게놈에 있고, 선택적으로 포유동물 게놈이 마우스 게놈, 개 게놈, 돼지 게놈, NHP 게놈, 또는 인간 게놈인 방법.
22.
구체예 12 내지 21 중 어느 하나에 있어서, EVE 또는 바이러스 요소가
(a) 프로바이러스 또는 바이러스 게놈의 단편을 포함하고/거나;
(b) 바이러스 핵산, 바이러스 DNA, 또는 바이러스 RNA의 DNA 카피를 포함하고/거나;
(c) 구조적 또는 비-구조적 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 방법.
23.
구체예 12 내지 22 중 어느 하나에 있어서, EVE가 레트로바이러스, 비-레트로바이러스, 파보바이러스, 또는 써코바이러스로부터의 바이러스 핵산을 포함하는 방법.
24.
구체예 23에 있어서,
(a) 파보바이러스가 B19, 마우스의 미세 바이러스(mvm), RA-1, AAV, 부파바이러스, 호코바이러스, 보카바이러스, 및 표 1A-1D에 열거된 파보바이러스 중 어느 하나로부터 선택되고, 선택적으로 파보바이러스는 AAV이고; 및/또는
(b) 써코바이러스가 돼지 써코바이러스(PCV)(예를 들어, PCV-1, PCV-2)인 방법.
25.
구체예 14 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 후생동물 종이 고래류, 박쥐목, 토끼목, 및 캥거루과로부터 선택되는 방법.
26.
구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 구체예 12-25 중 어느 하나의 방법을 추가로 포함하는 방법.
27.
구체예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 시험관내, 생체외, 및/또는 생체내 검정을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
28.
구체예 27에 있어서, 적어도 하나의 시험관내, 생체외, 및/또는 생체내 검정이
(a) 세포(예를 들어, 인간 세포)의 유전자좌로의 마커 유전자의 새로운 표적화된 삽입 및 (i) 세포 생존력, (ii) 삽입 효율 및/또는 (iii) 마커 유전자 발현의 결정;
(b) 전구 세포 또는 줄기 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 시험관내 분화 및 (i) 모든 발달 계통에서의 마커 유전자 발현, 및/또는 (ii) 마커 유전자의 삽입이 상기 전구 세포 또는 줄기 세포의 분화에 영향을 미치는지 여부의 결정;
(c) 전구 세포 또는 줄기 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 세포를 면역-고갈된 마우스에 생착 및 생체내 모든 발달 계통에서 마커 유전자 발현의 평가;
(d) 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 전체 세포 전사 프로파일의 결정(예를 들어, RNAseq 또는 마이크로어레이 사용); 및
(e) 마우스의 게놈 DNA가 유전자좌에 삽입된 마커 유전자를 갖고, 선택적으로 마커 유전자가 조직 특이적 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 트랜스제닉 녹-인 마우스의 생성으로부터 선택되는 방법.
29.
구체예 28에 있어서, 전구 세포 또는 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 및 간 전구 세포로부터 선택되는 방법.
30.
구체예 1 내지 29 중 어느 하나의 방법에서 확인된 GSH 핵산의 적어도 일부를 포함하는 핵산 벡터.
31.
구체예 30에 있어서, GSH 핵산이 비번역 서열 또는 인트론을 포함하는 핵산 벡터.
32.
구체예 30 또는 31에 있어서, GSH가 표 3에 열거된 GSH 또는 이의 단편 중 어느 하나의 서열과 적어도 65% 동일한 서열을 포함하는 핵산 벡터.
33.
구체예 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, GSH가 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 또는 SYNTX-GSH4의 게놈 DNA 또는 이의 단편의 서열과 적어도 65% 동일한 서열을 포함하는 핵산 벡터.
34.
구체예 30 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산, 예를 들어, GSH에 이종성인 서열을 갖는 핵산, 예를 들어, GSH 유전자좌에 천연적으로 존재하지 않는 핵산 서열, 예를 들어, 트랜스진을 추가로 포함하는 핵산 벡터.
35.
구체예 34에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 GSH 5' 상동성 아암 및/또는 GSH 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹되고, 여기서 상동성 아암이 표적 GSH 핵산과 적어도 약 65% 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 벡터.
36.
구체예 35에 있어서, GSH 상동성 아암이 10 내지 5000개 염기쌍 길이이고, 선택적으로 GSH 상동성 아암이 100-1500개 염기쌍 길이인 핵산 벡터.
37.
구체예 35에 있어서, GSH 상동성 아암이 적어도 30개 염기쌍 길이인 핵산 벡터.
38.
구체예 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, GSH 상동성 아암이 세포의 게놈에서 GSH 유전자좌로의 상동성-의존적 통합을 매개하기에 충분한 길이인 핵산 벡터.
39.
구체예 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 정방향으로 GSH에 통합되기 위한 배향인 핵산 벡터.
40.
구체예 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 역방향으로 GSH에 통합되기 위한 배향인 핵산 벡터.
41.
구체예 34 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 (a) 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나, (b) 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는 핵산 벡터.
42.
구체예 41에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 프로모터가
(a) 작동 가능하게 연결된 핵산에 이종성인 프로모터;
(b) 핵산의 조직-특이적 발현을 촉진하는 프로모터;
(c) 핵산의 구성적 발현을 촉진하는 프로모터;
(d) 유도성 프로모터;
(e) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터;
(f) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터; 및
(g) 곤충 세포 프로모터로부터 선택되는 핵산 벡터.
43.
구체예 42에 있어서, 유도성 프로모터가 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절되는 핵산 벡터.
44.
구체예 43에 있어서, 제제가 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택되는 핵산 벡터.
45.
구체예 42에 있어서, 프로모터가 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 뉴런 세포, 기도 상피 세포, 또는 간 전구 세포에서 조직-특이적 발현을 촉진하는 핵산 벡터.
46.
구체예 41 또는 42에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터, β-글로빈 프로모터, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, Wiskott-Aldrich 프로모터, PKLR 프로모터, 다면체(polh) 프로모터, 및 즉시 초기 1 유전자 (IE-1) 프로모터로부터 선택되는 핵산 벡터.
47.
구체예 34 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 벡터.
48.
구체예 47에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 서열이 표적 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화되는 핵산 벡터.
49.
구체예 47 또는 48에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는 핵산 벡터.
50.
구체예 34 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이
(a) 단백질 또는 이의 단편, 바람직하게는 인간 단백질 또는 이의 단편;
(b) 치료 단백질 또는 이의 단편, 항원-결합 단백질, 또는 펩티드;
(c) 자살 유전자, 선택적으로 단순 포진 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK);
(d) 바이러스 단백질 또는 이의 단편;
(e) 뉴클레아제, 선택적으로 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, megaTAL, 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체);
(f) 마커, 예를 들어, 루시퍼라제 또는 GFP; 및/또는
(g) 약물 내성 단백질, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 네오마이신 내성을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 벡터.
51.
구체예 50에 있어서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편이 구조적 단백질(예를 들어, VP1, VP2, VP3) 또는 비-구조적 단백질(예를 들어, Rep 단백질)을 포함하는 핵산 벡터.
52.
구체예 50 또는 51에 있어서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편이
(a) 파보바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 VP1, VP2, VP3, NS1, 또는 Rep;
(b) 레트로바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 외피 단백질, gag, pol, 또는 VSV-G;
(c) 아데노바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, 또는 구조적 단백질(예를 들어, A, B, C); 및/또는
(d) 단순 포진 바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 ICP27, ICP4, 또는 pac를 포함하는 핵산 벡터.
53.
구체예 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 바이러스의 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 벡터.
54.
구체예 53에 있어서, (a) 표면 단백질 또는 이의 단편이 숙주에서 면역 반응을 유발하는 면역원성 표면 단백질이고/거나, (b) 표면 단백질 또는 이의 단편이 신호 펩티드를 추가로 포함하고/거나, (c) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 유전자가 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고/거나, (d) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산이 자살 유전자를 추가로 포함하는 핵산 벡터.
55.
구체예 53 또는 54에 있어서, 표면 단백질이 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스의 것인 핵산 벡터.
56.
구체예 53 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 표면 단백질이 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질인 핵산 벡터.
57.
구체예 50에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 헤모글로빈 유전자(HBA1, HBA2, HBB, HBG1, HBG2, HBD, HBE1, 및/또는 HBZ), 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP), 응고 인자 VIII, 응고 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, 디스트로핀 또는 트렁케이션된 디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 유트로핀 또는 트렁케이션된 유트로핀, 마이크로-유트로핀, 우세린(USH2A), GBA1, 프리프로인슐린, 인슐린, GIP, GLP-1, CEP290, ATPB1, ATPB11, ABCB4, CPS1, ATP7B, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, KIND1, INS, F8 또는 이의 단편(예를 들어, B-도메인 결실된 폴리펩티드(예를 들어, VIII SQ, p-VIII)를 인코딩하는 단편), IRGM, NOD2, ATG2B, ATG9, ATG5, ATG7, ATG16L1, BECN1, EI24/PIG8, TECPR2, WDR45/WIP14, CHMP2B, CHMP4B, 다이네인, EPG5, HspB8, LAMP2, LC3b UVRAG, VCP/p97, ZFYVE26, PARK2/파킨, PARK6/PINK1, SQSTM1/p62, SMURF, AMPK, ULK1, RPE65, CHM, RPGR, PDE6B, CNGA3, GUCY2D, RS1, ABCA4, MYO7A, HFE, 헵시딘, (예를 들어, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-1β 수용체의) 가용성 형태를 인코딩하는 유전자, 및 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(CFTR)로부터 선택되는 핵산 벡터.
58.
구체예 50에 있어서, 항원-결합 단백질이 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG(CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택되는 핵산 벡터.
59.
구체예 50 또는 51에 있어서, 항원-결합 단백질이 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, CCR5, 또는 병원체(예를 들어, 박테리아 독소, 바이러스 캡시드 단백질 등)에 특이적으로 결합하는 핵산 벡터.
60.
구체예 50, 58, 및 59 중 어느 하나에 있어서, 항원-결합 단백질이 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 핵산 벡터.
61.
구체예 34 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 비-코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하고, 선택적으로 비-코딩 RNA가 안티센스 폴리뉴클레오티드, lncRNA, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, snoRNA, snRNA, scaRNA, 및/또는 가이드 RNA를 포함하는 핵산 벡터.
62.
구체예 61에 있어서, 비-코딩 RNA가 DMT-1, 페로포틴, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-1β 수용체, 및 돌연변이된 단백질(예를 들어, 돌연변이된 HFE, CFTR)을 인코딩하는 유전자로부터 선택된 유전자를 표적화하는 핵산 벡터.
63.
구체예 34 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 증가시키거나 회복시키는 핵산 벡터.
64.
구체예 34 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 핵산 벡터.
65.
구체예 30-64 중 어느 하나에 있어서,
(a) 전사 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 전사 종결 서열, 비번역 영역(5' 또는 3' UTR), 근위 프로모터 요소, 유전자좌 제어 영역(예를 들어, β-글로빈 LCR 또는 β-글로빈 LCR의 DNase 과민성 부위(HS)), 폴리아데닐화 신호 서열), 및/또는
(b) 번역 조절 요소(예를 들어, Kozak 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소)를 추가로 포함하는 핵산 벡터.
66.
구체예 30 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 핵산 벡터가 플라스미드, 미니써클, 코스미드, 인공 염색체(예를 들어, BAC), 선형 공유 폐쇄(LCC) DNA 벡터(예를 들어, 미니써클, 미니벡터 및 미니노트), 선형 공유 폐쇄(LCC) 벡터(예를 들어, MIDGE, MiLV, 미니스터링, 미니플라스미드), 미니-인트론 플라스미드, pDNA 발현 벡터, 또는 이의 변이체로부터 선택되는 핵산 벡터.
67.
구체예 1 내지 29 중 어느 하나의 방법에서 확인된 GSH 핵산의 적어도 일부; 구체예 30-66 중 어느 하나의 핵산 벡터에서 GSH의 적어도 일부; 표 3에 열거된 GSH 중 어느 하나의 적어도 일부; 및/또는 구체예 30-66 중 어느 하나의 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 벡터.
68.
구체예 67에 있어서, 바이러스 벡터가 rAd, AAV, rHSV, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스 벡터, HSV 타입 1(HSV-1)-AAV 하이브리드 벡터, 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS), 및 이들의 변이체로부터 선택되는 바이러스 벡터.
69.
구체예 30 내지 66 중 어느 하나의 핵산 벡터, 또는 구체예 67 또는 68의 바이러스 벡터를 포함하는 세포.
70.
구체예 69에 있어서, 세포가 세포주 또는 일차 세포로부터 선택되는 세포.
71.
구체예 69-70에 있어서, 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포이고, 선택적으로 포유동물 세포가 인간 세포 또는 설치류 세포인 세포.
72.
구체예 69 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 세포가 곤충 세포이고; 곤충 세포가 나비목(lepidoptera) 종으로부터 유래되는 세포.
73.
구체예 72에 있어서, 나비목의 종이 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 스포돕테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis), 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)인 세포.
74.
구체예 69 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 곤충 세포가 Sf9인 세포.
75.
구체예 69 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 세포가 조혈 세포, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 적혈구 계통 세포, 거핵구, 적혈구 전구 세포(EPC), CD34+ 세포, CD44+ 세포, 적혈구, CD36+ 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 세포, 장 세포, 장 줄기 세포, 장 상피 세포, 내피 세포, 장내분비 세포, 폐 세포, 폐 전구 세포, 장세포, 간 세포(예를 들어, 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포(KC), 간 시누소이드 내피 세포(LSEC), 간 전구 세포), 줄기 세포, 전구 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 피부 섬유모세포, 대식세포, 뇌 미세혈관 내피 세포(BMVEC), 신경 줄기 세포, 근육 위성 세포, 상피 세포, 기도 상피 세포, 근육 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 림프 전구 세포, B 림프모구 세포, B 세포, T 세포, 호염기성 풍토성 버킷 림프종(EBL), 다색 적혈구모세포, 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 배아 줄기 세포, P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포, 각질세포, 췌장 β-세포, K 세포, L 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, MDCK 세포, Vero 세포, CHO, BHK1, NS0, Sp2/0, HeLa, A549, 및 정염성 적혈구모세포로부터 선택되는 세포.
76.
세포의 게놈에서 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 세포로서, 여기서 GSH가 표 3으로부터 선택되는, 세포.
77.
구체예 76에 있어서, GSH 핵산이 비번역 서열 또는 인트론을 포함하는 세포.
78.
구체예 76 또는 77에 있어서, GSH가 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 및 SYNTX-GSH4로부터 선택되는 세포.
79.
구체예 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 정방향으로 GSH에 통합되는 세포.
80.
구체예 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 역방향으로 GSH에 통합되는 세포.
81.
구체예 76 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 (a) 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나, (b) 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는 세포.
82.
구체예 81에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 프로모터가
(a) 작동 가능하게 연결된 핵산에 이종성인 프로모터;
(b) 핵산의 조직-특이적 발현을 촉진하는 프로모터;
(c) 핵산의 구성적 발현을 촉진하는 프로모터;
(d) 유도성 프로모터;
(e) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터;
(f) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터; 및
(g) 곤충 세포 프로모터로부터 선택되는 세포.
83.
구체예 82에 있어서, 유도성 프로모터가 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절되는 세포.
84.
구체예 83에 있어서, 제제가 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택되는 세포.
85.
구체예 82에 있어서, 프로모터가 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 뉴런 세포, 기도 상피 세포, 또는 간 전구 세포에서 조직-특이적 발현을 촉진하는 세포.
86.
구체예 81 또는 82에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터, β-글로빈 프로모터, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, Wiskott-Aldrich 프로모터, PKLR 프로모터, 다면체(polh) 프로모터, 및 즉시 초기 1 유전자 (IE-1) 프로모터로부터 선택되는 세포.
87.
구체예 52 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 세포.
88.
구체예 87에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 서열이 표적 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화되는 세포.
89.
구체예 87 또는 88에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는 세포.
90.
구체예 76 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이
(a) 단백질 또는 이의 단편, 바람직하게는 인간 단백질 또는 이의 단편;
(b) 치료 단백질 또는 이의 단편, 항원-결합 단백질, 또는 펩티드;
(c) 자살 유전자, 선택적으로 단순 포진 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK);
(d) 바이러스 단백질 또는 이의 단편;
(e) 뉴클레아제, 선택적으로 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, megaTAL, 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체);
(f) 마커, 예를 들어, 루시퍼라제 또는 GFP; 및/또는
(g) 약물 내성 단백질, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 네오마이신 내성을 인코딩하는 서열을 포함하는 세포.
91.
구체예 90에 있어서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편이 구조적 단백질(예를 들어, VP1, VP2, VP3) 또는 비-구조적 단백질(예를 들어, Rep 단백질)을 포함하는 세포.
92.
구체예 90 또는 91에 있어서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편이
(a) 파보바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 VP1, VP2, VP3, NS1, 또는 Rep;
(b) 레트로바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 외피 단백질, gag, pol, 또는 VSV-G;
(c) 아데노바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, 또는 구조적 단백질(예를 들어, A, B, C); 및/또는
(d) 단순 포진 바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 ICP27, ICP4, 또는 pac를 포함하는 세포.
93.
구체예 90 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자가 바이러스의 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 세포.
94.
구체예 93에 있어서, (a) 표면 단백질이 면역 반응을 유발하는 면역원성 표면 단백질 또는 이의 단편이고/거나, (b) 표면 단백질 또는 이의 단편이 신호 펩티드를 추가로 포함하고/거나, (c) 유전자가 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고/거나, (d) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산이 자살 유전자를 추가로 포함하는 세포.
95.
구체예 93 또는 94에 있어서, 표면 단백질이 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스의 것인 세포.
96.
구체예 93 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 표면 단백질이 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질인 세포.
97.
구체예 90에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 헤모글로빈 유전자(HBA1, HBA2, HBB, HBG1, HBG2, HBD, HBE1, 및/또는 HBZ), 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP), 응고 인자 VIII, 응고 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, 디스트로핀 또는 트렁케이션된 디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 유트로핀 또는 트렁케이션된 유트로핀, 마이크로-유트로핀, 우세린(USH2A), GBA1, 프리프로인슐린, 인슐린, GIP, GLP-1, CEP290, ATPB1, ATPB11, ABCB4, CPS1, ATP7B, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, KIND1, INS, F8 또는 이의 단편(예를 들어, B-도메인 결실된 폴리펩티드(예를 들어, VIII SQ, p-VIII)를 인코딩하는 단편), IRGM, NOD2, ATG2B, ATG9, ATG5, ATG7, ATG16L1, BECN1, EI24/PIG8, TECPR2, WDR45/WIP14, CHMP2B, CHMP4B, 다이네인, EPG5, HspB8, LAMP2, LC3b UVRAG, VCP/p97, ZFYVE26, PARK2/파킨, PARK6/PINK1, SQSTM1/p62, SMURF, AMPK, ULK1, RPE65, CHM, RPGR, PDE6B, CNGA3, GUCY2D, RS1, ABCA4, MYO7A, HFE, 헵시딘, (예를 들어, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-1β 수용체의) 가용성 형태를 인코딩하는 유전자, 및 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(CFTR)로부터 선택되는 세포.
98.
구체예 90에 있어서, 항원-결합 단백질이 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG(CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택되는 세포.
99.
구체예 90 또는 91에 있어서, 항원-결합 단백질이 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, CCR5, 또는 병원체(예를 들어, 박테리아 독소, 바이러스 캡시드 단백질 등)에 특이적으로 결합하는 세포.
100.
구체예 90, 98, 및 99 중 어느 하나에 있어서, 항원-결합 단백질이 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 세포.
101.
구체예 76 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 비-코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하고, 선택적으로 비-코딩 RNA가 lncRNA, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, snoRNA, snRNA, scaRNA, 및/또는 가이드 RNA를 포함하는 세포.
102.
구체예 101에 있어서, 비-코딩 RNA가 DMT-1, 페로포틴, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-1β 수용체, 돌연변이된 단백질(예를 들어, 돌연변이된 HFE, CFTR)을 인코딩하는 유전자로부터 선택된 유전자를 표적화하는 세포.
103.
구체예 76 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 증가시키거나 회복시키는 세포.
104.
구체예 76 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 세포.
105.
구체예 76 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이
(a) 전사 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 전사 종결 서열, 비번역 영역(5' 또는 3' UTR), 근위 프로모터 요소, 유전자좌 제어 영역(예를 들어, β-글로빈 LCR 또는 β-글로빈 LCR의 DNase 과민성 부위(HS)), 폴리아데닐화 신호 서열), 및/또는
(b) 번역 조절 요소(예를 들어, Kozak 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소)를 추가로 포함하는 세포.
106.
구체예 76 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 세포가 세포주 또는 일차 세포로부터 선택되는 세포.
107.
구체예 76 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포이고, 선택적으로 포유동물 세포가 인간 세포 또는 설치류 세포인 세포.
108.
구체예 76 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 세포가 곤충 세포이고; 곤충 세포가 나비목 종으로부터 유래되는 세포.
109.
구체예 108에 있어서, 나비목의 종이 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리토랄리스, 스포돕테라 엑시구아 또는 트리코플루시아 니인 세포.
110.
구체예 107 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 곤충 세포가 Sf9인 세포.
111.
구체예 76 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 세포가 조혈 세포, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 적혈구 계통 세포, 거핵구, 적혈구 전구 세포(EPC), CD34+ 세포, CD44+ 세포, 적혈구, CD36+ 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 세포, 장 세포, 장 줄기 세포, 장 상피 세포, 내피 세포, 장내분비 세포, 폐 세포, 폐 전구 세포, 장세포, 간 세포(예를 들어, 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포(KC), 간 시누소이드 내피 세포(LSEC), 간 전구 세포), 줄기 세포, 전구 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 피부 섬유모세포, 대식세포, 뇌 미세혈관 내피 세포(BMVEC), 신경 줄기 세포, 근육 위성 세포, 상피 세포, 기도 상피 세포, 근육 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 림프 전구 세포, B 림프모구 세포, B 세포, T 세포, 호염기성 풍토성 버킷 림프종(EBL), 다색 적혈구모세포, 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 배아 줄기 세포, P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포, 각질세포, 췌장 β-세포, K 세포, L 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, MDCK 세포, Vero 세포, CHO, BHK1, NS0, Sp2/0, HeLa, A549, 및 정염성 적혈구모세포로부터 선택되는 세포.
112.
구체예 30 내지 66 중 어느 하나의 핵산 벡터, 구체예 67 또는 68의 바이러스 벡터, 및/또는 구체예 69-111 중 어느 하나의 세포를 포함하는 약학적 조성물.
113.
세포의 게놈에서 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 트랜스제닉 유기체로서, 여기서 GSH가 표 3으로부터 선택되는, 트랜스제닉 유기체.
114.
구체예 113에 있어서, GSH가 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 및 SYNTX-GSH4로부터 선택되는 트랜스제닉 유기체.
115.
구체예 69-114 중 어느 하나의 세포를 포함하는 트랜스제닉 유기체.
116.
구체예 115에 있어서, 유기체가 포유동물 또는 식물이고, 선택적으로 포유동물이 설치류(예를 들어, 마우스, 래트), 염소, 양, 닭, 라마, 또는 토끼인 트랜스제닉 유기체.
117.
적어도 하나의 비-GSH 핵산을 세포의 GSH 유전자좌에 삽입하는 방법으로서, 상기 방법이 구체예 30 내지 66 중 어느 하나의 핵산 벡터, 구체예 67 또는 68의 바이러스 벡터, 또는 구체예 112의 약학적 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하고, 이에 의해 게놈에서 비-GSH 핵산에 플랭킹된 GSH 5' 상동성 아암 및 GSH 3' 상동성 아암과 GSH 유전자좌의 상동성 재조합이 비-GSH 핵산을 GSH 유전자좌에 통합시키는, 방법.
118.
구체예 117에 있어서, 비-GSH 핵산이 정방향으로 GSH에 통합되는 방법.
119.
구체예 117에 있어서, 비-GSH 핵산이 역방향으로 GSH에 통합되는 방법.
120.
유효량의 구체예 30-66 중 어느 하나의 핵산 벡터, 구체예 67 또는 68의 바이러스 벡터, 구체예 69-111 중 어느 하나의 세포, 및/또는 구체예 112의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
121.
구체예 120에 있어서, 질병이 감염, 내피 기능장애, 낭포성 섬유증, 심혈관 질환, 신장 질환, 암, 혈색소병증, 빈혈, 혈우병(예를 들어, 혈우병 A), 골수증식성 장애, 응고병증, 겸상 적혈구 질환, 알파-지중해빈혈, 베타-지중해빈혈, 판코니 빈혈, 가족성 간내 담즙정체, 피부 유전 질환(예를 들어, 수포성 표피박리증), 안구 유전 질환(예를 들어, 유전성 망막 이영양증, 예를 들어, 레버 선천성 흑암시(LCA), 색소성 망막염(RP), 범맥락막위축, 완전색맹, 망막층간분리증, 스타가르트병, 어셔 증후군 타입 1B), 파브리병, 고쉐병, 니만-피크병 A, 니만-피크병 B, GM1 강글리오시드증, 점액다당류증(MPS) I(헐러, 샤이에, 헐러/샤이에), MPS II(헌터), MPS VI(마로토-라미), 혈액암, 혈색소증, 유전성 혈색소증, 소아 혈색소증, 경화증, 간세포 암종, 췌장염, 당뇨병, 심근병증, 관절염, 생식샘 기능저하증, 심장병, 심장마비, 갑상선 기능저하증, 포도당 불내증, 관절병증, 간 섬유증, 윌슨병, 궤양성 대장염, 크론병, 테이-삭스병, 신경퇴행성 장애, 척수 근위축증 타입 1, 헌팅턴병, 카나반병, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 청소년 만성 관절염, 건선, 및 강직성 척추염, 및 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 운동실조), 염증성 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 만성 폐쇄성 폐 질환/COPD, 폐 섬유증, 쇼그렌병, 고혈당 장애, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 인슐린-저항 당뇨병(예를 들어, 멘덴홀 증후군, 베르너 증후군, 요정증, 및 지방위축성 당뇨병), 이상지질혈증, 고지혈증, 저밀도 지단백질 상승(LDL), 고밀도 지단백질 저하(HDL), 트리글리세리드 상승, 대사 증후군, 간 질환, 신장 질환, 심혈관 질환, 허혈, 뇌졸중, 재관류 동안의 합병증, 근육 변성, 위축, 노화 증상(예를 들어, 근육 위축 , 노쇠, 대사 장애, 저등급 염증, 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 연령-관련 치매 및 산발형 알츠하이머병, 전암 상태, 및 우울증을 포함하는 정신병적 상태), 척수 손상, 동맥경화증, 감염성 질환(예를 들어, 박테리아, 진균, 바이러스), AIDS, 결핵, 배아형성의 결함, 불임, 리소좀 축적병, 활성화제 결핍/GM2 강글리오시드증, 알파-만노시드증, 아스파르틸글루코아민뇨증(aspartylglucoaminuria), 콜레스테릴 에스테르 축적병, 만성 헥소사미니다제 A 결핍, 시스틴증, 다논병, 파아버병, 푸코시드증, 갈락토시알산증, 고쉐병(타입 I, II 및 III), GM1 강글리오시드증(영아, 영아 후기/소아 및 성인/만성), 헌터 증후군(MPS II), I-세포병/점액지질증 II, 영아 유리 시알산 축적병(ISSD), 청소년 헥소사미니다제 A 결핍, 크라베병, 리소좀 산 리파제 결핍, 이염성 백질디스트로피, 헐러 증후군, 샤이에 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 산필리포 증후군, 모르퀴오 타입 A 및 B, 마로토-라미, Sly 증후군, 점액지질증, 복합 설페이트 결핍, 신경 세로이드 리포푸신증, CLN6 질환, 얀스키-빌쇼스키병, 폼페병, 피크노디소스토시스, 샌드호프병, 쉰들러병, 및 월만병으로부터 선택되는 방법.
122.
구체예 121에 있어서, 감염이 박테리아 감염, 진균 감염, 또는 바이러스 감염인 방법.
123.
구체예 121 또는 122에 있어서, 감염이 바이러스 감염이고; 바이러스 감염이 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스에 의한 것인 방법.
124.
구체예 122 또는 123에 있어서, 바이러스 감염이 SARS-CoV-2에 의한 것인 방법.
125.
구체예 120 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 핵산 벡터, 세포, 및/또는 약학적 조성물이 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 정맥내, 경막외, 척수내, 흉골내, 관절내, 윤활막내, 경막내, 종양내, 동맥내, 심장내, 근육내, 비강내, 폐내, 피부 이식편, 또는 경구 투여를 통해 대상체에게 투여되는 방법.
126.
구체예 120 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가 또는 동종이계인 방법.
127.
세포에서 단백질의 수준 및/또는 활성을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이 구체예 30 내지 66 중 어느 하나의 핵산 벡터, 구체예 67 또는 68의 바이러스 벡터, 및/또는 구체예 112의 약학적 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 방법.
128.
구체예 127에 있어서, 수준 및/또는 활성이 증가되는 방법.
129.
구체예 128에 있어서, 수준 및/또는 활성이 감소되거나 제거되는 방법.
130.
생물학적 제제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) (i) 구체예 30-66 중 어느 하나의 핵산 벡터를 포함하는 세포, (ii) 구체예 67 또는 68의 바이러스 벡터를 포함하는 세포, 또는 (iii) 구체예 69-111 중 어느 하나의 세포를 배양하고; 발현된 생물학적 제제를 회수하는 단계; 또는
(b) 구체예 115 또는 116의 트랜스제닉 유기체로부터 발현된 생물학적 제제를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
131.
구체예 130에 있어서, 생물학적 제제가 항원-결합 단백질인 방법.
132.
구체예 130 또는 131에 있어서, 생물학적 제제가 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG(CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택되는 방법.
133.
구체예 130 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 제제가 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, 또는 CCR5에 특이적으로 결합하는 방법.
134.
구체예 130 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 제제가 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 방법.
135.
구체예 130 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 제제가 치료 단백질이고, 선택적으로 치료 단백질이 인슐린인 방법.
136.
바이러스 벡터(예를 들어, 유전자 요법 또는 백신)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
(1)
(i) 적어도 하나의 기능성 바이러스 복제 기점(예를 들어, 적어도 하나의 ITR 뉴클레오티드 서열)을 포함하고,
선택적으로 표적 세포에서의 발현을 위해 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 추가로 포함하는 핵산 서열,
(ii) 숙주 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된, 하나 이상의 바이러스 구조적 단백질(예를 들어, 캡시드 단백질, 예를 들어 gag, VP1, VP2, VP3, 이들의 변이체)을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 핵산 서열, 및
(iii) 숙주 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 복제 단백질(예를 들어, Rep, pol)을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 핵산 서열로서,
선택적으로, 적어도 하나의 복제 단백질이 (a) 숙주 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된, 기능성 복제 단백질을 인코딩하는 Rep52 또는 Rep40 코딩 서열 또는 이의 단편, 및/또는 b) 숙주 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 Rep78 또는 Rep68 코딩 서열을 포함하는, 핵산 서열을 포함하는
숙주 세포를 제공하는 단계로서,
여기서 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 하나는 숙주 세포 게놈에서 표 3으로부터 선택된 적어도 하나의 GSH에 안정적으로 통합되고, 적어도 하나의 벡터는, 존재하는 경우, 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되지 않은 (i), (ii), 및 (iii)의 나머지를 포함하는, 단계; 및
(2) 재조합 바이러스 벡터가 생산되도록 하는 조건 하에 숙주 세포를 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
137.
구체예 136에 있어서, (ii) 또는 (iii)이 GSH에 통합되는 방법.
138.
구체예 136에 있어서, (ii) 및 (iii)이 GSH에 통합되는 방법.
139.
구체예 136 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 기능성 바이러스 복제 기점(예를 들어, 적어도 하나의 ITR 뉴클레오티드 서열)이
(a) 디펜도파보바이러스 ITR, 및/또는
(b) AAV ITR, 선택적으로 AAV2 ITR을 포함하는 방법.
140.
구체예 136 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포에서의 발현을 위한 적어도 하나의 발현 제어 서열이
(a) 프로모터, 및/또는
(b) Kozak-유사 발현 제어 서열을 포함하는 방법.
141.
구체예 140에 있어서, 프로모터가
(a) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터,
(b) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터,
(c) 곤충 세포 프로모터, 또는
(d) 유도성 프로모터를 포함하는 방법.
142.
구체예 141에 있어서, 동물 DNA 바이러스가 사이토메갈로바이러스(CMV), 디펜도파보바이러스, 또는 AAV인 방법.
143.
구체예 141에 있어서, 곤충 바이러스가 나비목 바이러스 또는 배큘로바이러스이고, 선택적으로 배큘로바이러스가 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV)인 방법.
144.
구체예 140 또는 141에 있어서, 프로모터가 다면체(polh) 또는 즉시 초기 1 유전자(IE-1) 프로모터인 방법.
145.
구체예 140 또는 141에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터인 방법.
146.
구체예 145에 있어서, 유도성 프로모터가 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절되는 방법.
147.
구체예 146에 있어서, 제제가 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택되는 방법.
148.
구체예 136-147 중 어느 하나에 있어서,
(a) 바이러스 복제 단백질이 AAV 복제 단백질, 선택적으로 Rep52 및/또는 Rep78 단백질이고/거나;
(b) 바이러스 구조적 단백질이 AAV 캡시드 단백질인 방법.
149.
구체예 148에 있어서, AAV가 AAV2인 방법.
150.
구체예 136 내지 149 중 어느 하나에 있어서, 방법이 구체예 67 또는 68의 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
151.
구체예 136 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포 또는 곤충 세포인 방법.
152.
구체예 151에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포이고; 포유동물 세포가 인간 세포 또는 설치류 세포인 방법.
153.
구체예 151 또는 152에 있어서, 포유동물 세포가 HEK293, HEK293T, HeLa, 및 A549로부터 선택되는 방법.
154.
구체예 151에 있어서, 숙주 세포가 곤충 세포이고; 곤충 세포가 나비목 종으로부터 유래되는 방법.
155.
구체예 154에 있어서, 나비목의 종이 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리토랄리스, 스포돕테라 엑시구아 또는 트리코플루시아 니인 방법.
156.
구체예 151, 154, 및 155 중 어느 하나에 있어서, 곤충 세포가 Sf9인 방법.
157.
구체예 136 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노 바이러스-유래 벡터(예를 들어, AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스-유래 벡터(예를 들어, 렌티바이러스), 헤르페스 바이러스-유래 벡터, 및 알파바이러스-유래 벡터(예를 들어, 셈리키 삼림 바이러스(SFV) 벡터)로부터 선택되는 방법.
158.
구체예 30 내지 66 중 어느 하나의 핵산 벡터, 구체예 67 또는 68의 바이러스 벡터, 구체예 69-111 중 어느 하나의 세포, 및/또는 구체예 112의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
실시예
실시예 1: EVE의 존재 및 위치를 결정함으로써 GSH 유전자좌의 확인
게놈 스크리닝
44종의 염색체 어셈블리 및 전체 게놈 샷건 어셈블리(Katzourakis and Gifford (2010) PLOS Genetics 6(11):e1001191의 표 S1)를 tBLASTn 및 총 길이 <100 Kb인 게놈을 갖는 포유동물 바이러스 그룹에서 유래된 대표적인 펩티드 서열의 라이브러리(2009년 국제 바이러스 분류 위원회(ICTV) 마스터 종 목록에서 선택됨)를 사용하여 인 실리코 스크리닝하였다. 바이러스 펩티드와 높은-동일성(즉, e-값, 0.0001) 일치에 걸친 숙주 게놈 서열을 추출하고, Blast 및 수동 편집을 사용하여 추정 바이러스 ORF를 추론하였다. 이후, 추정 EVE 펩티드를 사용하여 상호 tBLASTn 검색에서 Genbank 비중복(nr) 데이터베이스를 스크리닝하였다. 레트로바이러스에 대한 일치, 바이러스 클로닝 벡터, 및 숙주 유전자좌에 대한 비-특이적 일치를 필터링하고 폐기하였다. 나머지 서열은 Genbank 및 PFAM 데이터베이스에서 바이러스 단백질과 명확하게 일치하는 경우 바이러스로 간주되었다. 이러한 요소에 대한 유전 구조는 추정 EVE 펩티드 서열을 ICTV에 의해 인식되는 가장 밀접하게 관련된 바이러스 속을 나타내는 바이러스 유형 종의 뉴클레오티드 서열과 비교함으로써 결정되었다. 바이러스 및 게놈 영역 사이의 경계는 바이러스 펩티드, 숙주 종의 게놈, 및 밀접하게 관련된 숙주 종에 대한 서열 플랭킹 일치 분석에 의해 확인되었다. 바이러스 삽입 측면에 있는 서열은 (i) 이들이 관련 숙주 종에서 빈 삽입 부위로서 존재했거나; (ii) 숙주 단백질과 매우 유의한 유사성(즉, e-값 < 1x10-9)을 개시했거나; (iii) 비-바이러스이고 고도로 반복적(숙주 게놈 당 >50개 카피)인 경우 게놈으로 간주되었다. 삽입은 >100 bp의 게놈 플랭킹 서열이 바이러스 일치의 어느 한쪽에서 확인될 수 있을 때 내인성으로 간주되었다. 숙주 자매 분류군에서 >100 bp의 명확한(즉, >80% 뉴클레오티드 동일성) 플랭킹 서열이 확인된 삽입은 이종상동성 삽입으로 간주되었다. PERL 스크립트를 사용하여 BLAST 검색 및 서열 추출을 자동화하였다.
계통발생학적 분석
Blast를 사용하여 추론된 추정 EVE 서열을 MUSCLE 및 MAAFT를 사용하여 밀접하게 관련된 바이러스와 정렬하고, 수동으로 편집하였다(Edgar (2004) Nucleic Acids Res 32:1792-1797). 최대 우도(ML) 계통발생은 RAXML(Stamatakis (2006) Bioinformatics 22:2688-2690)을 사용한 아미노산 서열 정렬을 사용하여 추정되었고, 각각의 경우에 ProtTest(Abascal et al. (2005) Bioinformatics 21:2104-2105)에 의해 결정된 바와 같이 가장 적합한 대체 모델을 구현하였다. ML 트리에 대한 지원은 1000개의 비모수 부트스트랩 반복을 통해 평가되었다. 데이터세트에 대한 가장 적합한 모델은 다음과 같다: 파보바이러스과: 디펜도바이러스 NS1 유전자(JTT+C, 17개 분류군에 걸쳐 332개 아미노산), 파보바이러스과: 파보바이러스 NS1 유전자, (JTT+C, 13개 분류군에 걸쳐 293개 아미노산), 써코바이러스과: Rep 유전자(Blosum62+C+F, 14개 분류군에 걸쳐 235개 아미노산), 헤파드나바이러스과: 폴리머라제 유전자(JTT+C+F, 9개 분류군에 걸쳐 661개 아미노산), 오르토믹소바이러스과: GP 유전자(WAG+C+F, 5개 분류군에 걸쳐 482개 아미노산 분류군), 레오바이러스과: VP5 유전자(Dayhoff+C+F, 4개 분류군에 걸쳐 171개 아미노산), 부니아바이러스과: 플레보바이러스 NP 유전자(LG+C, 12개 분류군에 걸쳐 247개 아미노산), 부니아바이러스과: 나이로바이러스 NP 유전자(LG+C, 5개 분류군에 걸쳐 446개 아미노산), 플라비바이러스과: 대부분 NS3 유전자(LG+C+F, 8개 분류군에 걸쳐 1846개 아미노산), 필로바이러스과: NP 유전자(JTT+C, 29개 분류군에 걸쳐 369개 아미노산), 필로바이러스과: L 유전자(LG+C+F, 9개 분류군에 걸쳐 517개 아미노산), 보르나바이러스과: NP 유전자(JTT+C, 73개 분류군에 걸쳐 147개 아미노산), 보르나바이러스과: L 유전자(JTT+C+F, 12개 분류군에 걸쳐 1243개 아미노산), 랍도바이러스과: NP 유전자(LG+C, 34개 분류군에 걸쳐 220개 아미노산), 랍도바이러스과: L 유전자(LG+C+F, 26개 분류군에 걸쳐 383개 아미노산).
실시예 2: 이종상동성 유기체에서 GSH 유전자좌를 확인하는 방법
시스-작용 요소(유사한 크기의 인트론)에 대한 위치
숙주(여기서 EVE는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나를 사용하여 확인됨)와 비-숙주 종 사이에 서열 상동성이 결여된 경우, 비-숙주 종에서 EVE 삽입의 위치는 부정확하게 결정된다. EVE 삽입의 상대 위치를 이용하여 근사가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 숙주 및 비-숙주 각각은 이종상동성 숙주 및 밀접하게 관련된 비-숙주 게놈 서열에 기반하여 1200개의 뉴클레오티드 (nt)-인트론을 갖는다. 숙주 종에서, EVE는 스플라이스 공여자 부위로부터 800nt 및 스플라이스 수용자 부위로부터 400nt인 위치에서 인트론에 삽입된다. 서열 동일성이 결여된 경우, 예를 들어, ≤60% 동일성인 경우, 예를 들어, 스플라이스 공여자 부위로부터 800nt 및 스플라이스 수용자 부위로부터 400nt인 비-숙주 인트론에 GSH가 있는 것으로 본원에서 지정된다. 다른 시스 작용 요소 및 모티프가 GSH 유전자좌의 위치를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
시스-작용 요소(상이한 크기의 인트론)로부터의 비례 거리
숙주 종 인트론에 서열 동일성이 결여되고 길이가 비-숙주 인트론과 상이한 경우, EVE 삽입 부위 및 유전적 랜드마크, 예를 들어, 시스-작용 요소(예를 들어, 스플라이싱 공여자 부위 또는 스플라이싱 수용자 부위)의 비례 거리가 사용된다. 예를 들어, 숙주 종은 1200 nt-길이인 인트론을 갖지만, 이제 이종상동성 비-숙주 인트론은 2400 nt-길이이므로, 비례 거리가 사용된다. 숙주 종에서, 스플라이싱 공여자 부위로부터 800에 삽입된 EVE는 인트론 크기의 2/3(800/1200)에 위치한다. 비-숙주 인트론에서 2/3의 비례 거리는 스플라이싱 공여자 부위로부터 1600 nt이다. 따라서, 비-숙주 종에서 GSH 유전자좌는 스플라이싱 공여자 부위로부터 1600 nt이고 스플라이싱 수용자 부위로부터 800 nt이다.
실시예 3: 신규한 GSH 유전자좌의 특성화
마커 유전자 발현 및 세포 분화에 대한 상이한 GSH의 영향 평가
인간 일차 CD34+ HSC를 사용하여 상이한 추정 GSH로의 트랜스제네시스의 영향을 평가하였다. CRISPR/Cas9 매개 유전자 삽입을 위한 상동성 아암 및 가이드 RNA를 온라인 가이드 RNA 예측 소프트웨어(ChopChop, Broad, IDT)를 사용하여 설계하고 합성하였다. 리포터 유전자를 추정 GSH 유전자좌에 삽입하고, 형질전환된 세포를 사이토카인이 보충된 메틸셀룰로스에 시딩하거나(CFU 검정) 사이토카인이 보충된 액체 배지에서 유지하여 적혈구 전구 세포로의 분화를 촉진하였다(적혈구 분화).
CFU 검정
줄기 세포 분화의 평가는 콜로니 형성 단위(CFU) 검정에 의해 수행되었으며, 여기서 줄기 세포의 색 및 형태는 현미경으로 시각화에 의해 모니터링하였다. CFU-GEMM, BFU-E, 또는 CFU-E와 같은 수임 적혈구 전구 세포의 확인은 세포 콜로니의 세포 형태 및 세포 색상과 같은 특징적인 특징의 확인에 의해 수행되었다(도 4a-도 4c). 동시에, GFP의 발현을 UV 광 하에 모니터링하였다.
적혈구 분화
적혈구 생성에 대한 2개의 상이한 본래 세포 마커(CD71 및 CD235)의 정량화는 유세포 분석에 의해 수행되었으며(도 5a 및 도 5b), 이는 전구 세포의 성공적인 수임을 나타낸다.
결과: 평가된 조건인 WT(비-편집됨), AAVS1 편집됨, SYNTX-GSH1 편집됨 및 SYNTX-GSH2 편집됨 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 도 4a-도 4c 및 도 5a-도 5b에 제시된 결과는 신규한 추정 세이프 하버 유전자좌인 SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2가 적혈구로 분화되는 일차 인간 HSC의 능력을 교란시키지 않았음을 입증한다. GFP-발현 세포의 안정성은 트랜스진 첨가 후 14일에 걸쳐 유세포 분석에 의해 모니터링되었다(도 6a-도 6b)
결과: 지시된 기간 동안, SYNTX-GSH1 유전자좌로 편집된 세포는 더 높은 백분율의 GFP 양성 세포를 나타내었고, 그 다음이 SYNTX-GSH2 유전자좌로 편집된 세포였다(도 6a-도 6b). 이러한 결과는 신규한 GSH로의 유전자 편집이 AAVS1 대조군 유전자좌로의 편집보다 더 안정하고 안전한 트랜스제네시스를 허용하였음을 입증한다. 확인된 유전자좌(SYNTX-GSH)는 이후 줄기 세포의 영구적인 트랜스제네시스를 위한 GSH로서 사용될 수 있고 상이한 생체외 유전자 요법에 사용될 수 있다.
표 5: 대표적인 GSH 유전자좌의 예시적인 특성화.
* 어구 "최상의 gRNA를 결정하기 위한 비-주형 실험"은 게놈 세이프 하버에 대한 상이한 gRNA가 1) GSH 부위가 CRISPR/Cas9를 통해 편집될 수 있음을 확인하고; 2) 더 높은 비율이 상동성-의존적 복구(HDR) 편집 비율을 개선시킬 수 있으므로 어느 gRNA가 가장 높은 비율의 이중-가닥 절단을 제공하는지를 결정하기 위해 시험되었음을 나타낸다.
실시예 4: 전체 세포 전사체에 대한 GSH로의 유전자 첨가의 영향 평가.
인간 유래 HEK293 세포를 사용하여 상이한 GSH 유전자좌에 리포터 유전자(GFP)를 삽입한 후 전체 유전자 발현을 평가하였다. HEK293 세포를 지시된 유전자좌(AAVS1, SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2)에서 이전에 기재된 바와 같이 CRISPR/Cas9 유전자 삽입에 의해 편집하였다. WT로 표시된 비-편집된 세포를 기본 유전자 발현에 대한 대조군으로 사용하였다. 간략하게, 양성 GFP 세포를 클로닝하고 처리에 필요한 세포 수에 도달할 때까지 증폭시켰다. 총 RNA를 추출하고 표준 절차에 따라 mRNA 라이브러리를 생성하는데 사용하였다. RNAseq는 각 조건에 대해 3회 수행되었다. 발현 수준을 평가하고 상이한 세포 클론 간에 비교하였다(도 7b-도 7d).
결과: 각 조건에 대해 관찰된 전사 조망은 AAVS1 유전자좌로의 유전자 삽입이 기본 조건(WT, 비-편집됨)에서 가장 멀고, 즉, 가장 파괴적이고, 그 다음이 SYNTX-GSH1로 삽입된 세포임을 분명히 보여주었다. SYNTX-GSH2로의 삽입은 WT 비-편집된 세포와 유사한 발현 패턴으로 세포 전사체의 최소 교란을 나타내며, 이는 제안된 유전자좌(SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2)가 인간 세포에서 트랜스진 통합을 위한 안전한 부위로서 거동함을 입증한다. 이 데이터는 평가된 조건(WT, AAVS1, SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2) 중에서 상위 1000개의 가장 가변적인 유전자의 차이를 정량화하는 주성분 분석(도 7c)에 의해 뒷받침되며, 이는 SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2가 AAVS 유전자좌보다 안전한 통합 유전자좌임을 나타낸다.
마지막으로, 트랜스진 발현(GFP)의 평가는 이전 결과를 확증하며, SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2가 벤치마크 AAVS1 유전자좌보다 더 높은 트랜스진 발현을 촉진한함을 입증한다.
실시예 5: 게놈 세이프 하버 유전자좌에서 편집된 HEK293 세포 - GFP 발현의 안정성
세포 계대에 걸친 GFP 발현의 안정성에 의한 GSH 성능 평가
인간 유래 HEK293 세포를 사용하여 여러 세포 계대에 걸쳐 트랜스진 발현(GFP)의 안정성에 대한 상이한 선택된 GSH로의 유전자 편집의 영향을 평가하였다. CRISPR/Cas9-매개 유전자 삽입을 위한 상동성 아암 및 가이드 RNA를 온라인 가이드 RNA 예측 소프트웨어(ChopChop and Broad)를 사용하여 설계하고 합성하였다. 리포터 유전자(GFP)를 상이한 추정 GSH 유전자좌에 삽입하였다. 비-편집된 세포를 기본 대조군(WT)으로 사용하고, AAVS1 유전자좌(대조군), SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 및 SYNTX-GSH4로의 유전자 첨가를 수행하였다. 모든 조건의 세포를 30일 배양 기간을 나타내는 12회 이상의 계대 동안 유지하였고, GFP를 UV-광 현미경을 사용하여 모니터링하였다.
결과: SYNTX-GSH1로의 유전자 첨가는 초기 계대 및 평가된 기간(P12) 동안 가장 높은 GFP 발현을 나타내었고, 그 다음이 SYNTX-GSH2 유전자좌로 편집된 세포였다. 이러한 2개의 유전자좌는 AAVS1 대조군보다 더 높고 더 안정적인 GFP 발현을 나타내었다. 다른 평가된 유전자간 유전자좌는 더 낮은 GFP 발현 수준 및 안정성을 나타내었다. 이러한 데이터는 세포 항상성의 급격한 교란을 일으키지 않고 안정적이고 높은 수준의 트랜스진 발현을 지지하지 않으면서 유전자 첨가에 대한 평가된 GSH(예를 들어, SYNTX-GSH1 및 SYNTX-GSH2)의 허용성 및 안전성을 확인한다.
또한 대표적인 GSH 유전자좌의 예시적인 특성화에 대해서는 표 5를 참조한다.
실시예 6: CD34+ 세포의 정제
개시된 방법에 사용하기 위한 CD34+ 세포는 하기 문헌에 기술된 것과 같은 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다: Hayakama et al., Busulfan produces efficient human cell engraftment in NOD/LtSz-scid IL2Rγ null mice, Stem Cells 27(1): 175-182 (2009); Ochi et al., Multicolor Staining of Globin Subtypes Reveals Impaired Globin Switching During Erythropoiesis in Human Pluripotent Stem Cells, Stem Cells Translational Medicine 3:792-800 (2014); and McIntosh et al., Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ l Kit W4l/W4l (NBSGW) Mice Support Multilineage Engraftment of Human Hematopoietic Cells, Stem Cell Reports 4: 171-180 (2015).
실시예 7: 바이러스 벡터를 사용한 적혈구 전구 세포의 시험관내 또는 생체외 형질도입
재조합 바이러스 벡터(AAV)를 사용하여 적혈구 전구 세포를 형질도입한다. 유전자형으로 교정된 세포에서 트랜스진 발현은 분화된 세포의 표현형의 구제를 용이하게 하고 임상 개선을 유도한다.
기능 획득 돌연변이에 의해 유발된 혈색소병증은 상염색체 열성 형질로 유전된다. 이형접합성 개체는 무증상이거나 약간 영향을 받는 경향이 있는 반면, 둘 모두의 대립유전자에 돌연변이를 갖는 개체는 심하게 영향을 받는다. 따라서, 단일 대립유전자를 교정하거나 대체하는 것이 임상적으로 유리하다.
베타-지중해빈혈 및 겸상 적혈구 질환(SCD) 둘 모두는 헤모글로빈 베타(HbB)를 발현하는 유전자의 상이한 돌연변이에 의해 야기되기 때문에, 유전자 대체 전략은 두 질병 모두의 환자에게 도움이 된다. HbB 발현 카세트를 전달하는 렌티바이러스 벡터(LV)를 사용한 SCD에 대한 임상 연구가 있다. b-글로빈 오픈 리딩 프레임(ORF)은 글로빈 대립유전자 유전자좌 제어 영역(LCR) 및 b-글로빈 프로모터에 의해 조절된다. LV에 맞추기 위해, 최소 LCR은 DNA 메틸화 및 이종염색질의 형성을 억제하는 3개의 DNAse 과민성 부위(HS)에 맵핑되었다. 무작위로 통합된 LV는 이종염색질로 통합되어 적혈구 전구 세포(예를 들어, 적혈구모세포)에서 b-글로빈 발현을 차단하므로, 표현형 교정이 없을 수 있다.
LCR 요소인 HS는 LV DNA의 개방된 유크로마틴 구조를 유지한다.
게놈 세이프 하버(GSH) 유전자좌로 HbB 카세트의 삽입. 포유동물 게놈의 대략 45%를 구성하는 전이유전 요소와 대조적으로, 유전성 통합 파보바이러스 게놈(또는 내인성 바이러스 요소, EVE)은 수백 종에 걸쳐 매우 적은 유전자좌에서 발생한다. EVE는 짧은 타임라인에서 배아발생, 발달, 성숙 등에 영향을 미치지 않고 지질학적 타임라인에서 진화/종분화에 영향을 미치지 않으면서 외래 DNA의 삽입을 허용하는 부위의 게놈 마커이다. 아마도 외래 DNA 삽입의 파괴적인 효과로 인해, 1억년에 걸쳐 많은 다양한 종에 축적된 EVE 유전자좌는 거의 없다. EVE를 보유하는 매우 다양한 계통발생 분류군 중 많은 종이 있음에도 불구하고, 모델 시스템, 예를 들어, 마우스에서 GSH로서 EVE의 실증적 분석을 용이하게 하는 영향을 받은 게놈 유전자좌의 수는 제한되어 있는 것으로 보인다. 포유동물 종 중에서 EVE 유전자좌의 보존은 인간 및 마우스 게놈에서 상동성 부위를 결정할 수 있게 한다. 그러나, 모든 GSH가 모든 조직 유형에서 장기적인 안정한 발현을 지원하는 것은 아닐 가능성이 높다. RNAseq 및 ATAC-seq 데이터베이스를 포함하는 인 실리코 분석을 사용하여, GSH 유전자좌는 표적 조직에서 활발히 발현되는 서브게놈 영역에 맵핑될 수 있다. 따라서, 베타-글로빈병증의 경우, 적혈구모세포가 특히 흥미롭다.
적혈구모세포에서 염색질을 능동적으로 발현하는 염색질 영역인 GSH 유전자좌를 이용하면, LV가 통합된 유크로마틴화를 보장하기 위해 LCR 요소를 사용할 필요성을 회피한다.
표적화 뉴클레아제를 이용한 상동성 지시 복구(HDR)의 과정은 재조합의 효율 및 특이성을 개선한다. 치료 유전자에 플랭킹된 "상동성 아암"은 벡터 DNA를 표적화된 유전자좌로 보낸다. 세포 DNA 복구 경로 효소, 또는 인공 과정, 예를 들어, CRISPR/Cas9 뉴클레아제에 의한 재조합은 트랜스진을 GSH로 통합한다.
b-글로빈 프로모터 이외에, 다른 프로모터가 수많은 세포 유형 및 또한 트랜스제닉 마우스 균주에서 장기적인 고수준 발현을 위해 사용되었다.
예를 들어, 헤모글로빈은 2x HbA 및 2x HbB 사슬을 포함하는 이종사량체이다. HbB의 부재 하에, HbA 사슬은 자가-회합하여 세포독성 응집체를 형성한다. 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP)은 α-글로빈 서브유닛의 응집을 방지하기 위해 전-적혈구에서 공동-발현된다. AHSP 프로모터는 적혈구 전구체에서 매우 활성이며 잘 특성화되어 있다.
또 다른 예로서, CAG 프로모터 인핸서는 닭 베타-글로빈 프로모터 및 엑손 1 및 인트론 1 및 엑손 2의 스플라이스 수용자에 융합된 사이토메갈로바이러스 인핸서로부터 조작된 합성 프로모터이다.
또 다른 예로서, MND 프로모터는 활성 조혈 세포이다
또 다른 예로서, Wiskott-Aldrich 프로모터는 조혈 세포에서 활성이다.
또 다른 예로서, PKLR 프로모터는 조혈 세포에서 활성이다.
말초 혈액 줄기 세포(PBSC)는 백혈구성분채집술에 의해 분리된다.
Hemofreeze 백에서 동결보존된 말초 혈액 세포는 37℃ 수조에서 급속 해동에 의해 회수된다. 이러한 해동된 세포를 4℃에서 4% HSA에 현탁시키고, 4℃에서 5분 동안 450 g으로 원심분리하여 2회 세척한다. 혈소판을 10% HSA에 오버레이하고 4℃에서 15분 동안 450 g으로 원심분리하여 2회 제거한다. 적혈구를 Ficoll-Hypaque(FH; 1.077 g/cm3; Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA)에 오버레이하고 4℃에서 25분 동안 400 g으로 원심분리하여 제거한다. 계면 단핵 세포(P1-, FH 세포)를 수집하고, 세척 용액에서 2회 세척하고, 4℃에서 4% HSA에 재현탁시킨다(MN 세포). 나일론-섬유 주사기(NF-S)를 사용하여 부착 세포를 제거한다. 5 g의 NF를 50 mL 일회용 주사기에 패킹한다. 단핵 세포를 추가의 50 mL 주사기로 옮기고 NF-S에 부드럽게 주입한 다음, 4℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이후, MN 세포를 NF-S의 플런저를 통해 50 mL 주사기로 수집하고, 세포를 50 mL의 원추형 튜브에 풀링한다. 이러한 풀링된 세포를 4℃에서 5분 동안 400 g으로 원심분리하고, 4℃에서 4% HSA에 재현탁시킨다(NF 세포). 이후, 세포 현탁액을 Isolex 자기 세포 분리 시스템(Isolex 50; Baxter Healthcare, Immunotherapy Division, Newbury, UK)에서 제조사의 지시에 따라 CD34+ 선택을 위해 즉시 처리한다. 간략하게, 세포를 9C5 뮤린 면역글로불린 G1(IgG1) 항-인간 CD34 항체(10 mg/1 × 108개 NF 세포)와 함께 느린 엔도버-말단 회전으로 4℃에서 15분 동안 인큐베이션한다. 감작 후, 세포를 4℃에서 4% HSA로 세척하여 임의의 과잉/비결합 항체를 제거한다. 이후 Dynabeads(Oslo, 노르웨이)를 1:10의 최종 비드/세포 비율로 세척되고 감작된 세포에 첨가한다. 4℃에서 30분 동안 혼합한 후, 세포-결합된 미소구체 및 자유 미소구체는 자석(Dynal MPC-1, Dynal, Fort Lee, NJ, USA)을 통해 벽에 부착되고 미소구체에 결합하지 임의의 자유 세포는 제거된다. 이 세척 절차를 4℃에서 4% HSA로 2회 반복한다. Dynabeads와 CD34+ 세포 사이의 결합은 4℃에서 30분 동안 PR34+ 줄기 세포 방출제에 의해 절단된다. 자유 Dynabeads는 자석을 통해 CD34+ 세포로부터 제거된다. 25℃에서 1% ACD-A 및 1% HSA를 함유하는 D-PBS를 세포 수집에 사용한다. 생성된 세포 생성물을 유세포 분석에 의해 제어한다.
대표적인 GSH 유전자좌의 예시적인 특성화에 대해서는 표 5를 참조한다.
실시예 8: 생체내에서 핵산 벡터의 발현
상기 기재된 벡터로부터 생체내 단백질 발현은 마우스에서 결정된다.
상기 기재된 바와 같이, HbB 유전자 카세트는 5' 및 3' GSH-특이적 상동성 아암(예를 들어, SYNTX-GSH1GSH 유전자좌 또는 표 3에 열거된 것들 중 어느 하나)을 포함하도록 조작된다. 일부 실험에서, 5'- 및 3' GSH-특이적 상동성 아암은 크다(각각 최대 2 Kb). 일부 실험에서, 벡터는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 인코딩하는 서열 및 GSH 유전자좌와 상동성 아암 사이의 상동성 재조합을 개시하기 위해 DNA 절단을 생성하는 gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실험에서, 핵산 벡터는 지질 나노입자(LNP)로 전달된다. 다른 실험에서, 핵산 벡터는 본원에 기재된 방법 및/또는 당 분야에 공지된 방법에 따라 바이러스 벡터로 패키징된다.
일부 실험에서, 음성 대조군은, 예를 들어, 스크램블링된 상동성 아암 서열을 갖거나 상동성 아암이 없는 대조군 벡터로 확립되어 재조합 효율을 확인하는 것이 더 적절할 수 있다. HbB 유전자 카세트를 포함하는 핵산 벡터는 프로모터, WPRE 요소, 및 pA를 추가로 포함한다.
Cas9 mRNA, 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 돌연변이된 "니카제" 엔도뉴클레아제, 클래스 II CRISPR/Cas 시스템(CPF1)과 같은 뉴클레아제 발현 단위는 트랜스로, 예를 들어, 별도의 핵산 벡터 또는 바이러스 벡터로 전달될 수 있다. 실험에서, LNP는 전달 옵션으로 사용될 수 있다. 핵으로의 수송은 당업자에게 통상적으로 공지된 방법에 따라 5' 또는 3' 효소 펩티드 서열에 융합된 핵 국소화 신호(NLS)를 사용하여 증가될 수 있다. 다른 구체예에서, NLS는 NLS가 뉴클레아제의 표면 상에 노출되고 뉴클레아제로서의 이의 기능을 방해하지 않도록 내부에 삽입될 수 있다.
뉴클레아제에 적합한 경우, 요망되는 부위에서 이중-가닥 절단(DSB)을 유도하기 위해, 하나 이상의 단일 가이드 RNA도 sgRNA 발현 벡터 또는 화학적으로 합성된 합성 sgRNA로서 트랜스로 전달된다. 본원에 기재된 바와 같이 (sgRNA = 단일 가이드-RNA 표적 서열). sgRNA는 자유롭게 이용 가능한 소프트웨어/알고리즘을 사용하여 선택될 수 있고, 예를 들어, attools.genome-engineering.org는 적합한 단일 가이드-RNA 서열을 선택하는데 사용될 수 있다.
5' GSH-특이적 상동성 아암은 대략 350 bp 길이일 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 10 내지 5000 bp 범위일 수 있다. 일부 실험에서, 3' GSH-특이적 상동성 아암은 5' GSH-특이적 상동성 아암과 동일한 길이이거나 더 길거나 더 짧을 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 대략 2000 bp 길이, 또는 50 내지 2000 bp 범위일 수 있다. 상동성 아암의 길이 및 재조합 빈도에 관한 상세한 연구는, 예를 들어, 문헌[Jian-Ping Zhang et al., Genome Biology, 2017]에 보고되어 있다.
나노입자 내의 핵산 벡터 또는 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 꼬리 정맥 주사에 의해 마우스에 투여된다. 이러한 전달 방식은 신체의 모든 기관에 대한 접근을 제공한다.
실시예 9: 바이러스 벡터의 작제
바이러스 벡터용 핵산
벡터 게놈 설계는 역 말단 반복부(ITR), 예를 들어, AAV 말단 회문의 ITR 이형태체 및 발현 또는 전사 카세트로 구성된다. 제네릭 발현 카세트는 전형적으로 인핸서 및 프로모터 요소로서 특성화되는 조절 요소로 구성된다. RNA 폴리머라제 복합체에 의해 전사된 영역은 시스 작용 조절 요소, 예를 들어, TATA-박스, 및 5' 비번역 엑손 서열, 인트론 서열, 번역된 엑손 서열, 3' 비번역 영역, 폴리-아데닐화 신호 서열로 구성된다. 전사후 요소는 번역 개시를 위한 Kozak 모티프 및 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소를 포함한다. 특정 벡터는 상업적 서비스 제공자를 사용하여 화학적으로 합성되고, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 증식을 위해 플라스미드에 라이게이션된다. 플라스미드는 다수의 클로닝 부위, 적어도 하나의 항생제 내성 유전자, 플라스미드 복제 기점, 및 배큘로바이러스 게놈으로의 재조합을 용이하게 하는 서열을 최소한으로 함유한다. 일반적으로 사용되는 두 가지 접근법은 다음과 같다: (1) 플라스미드 유전자를 배큘로바이러스 게놈(bacmid)으로 전달하기 위해 E. 콜라이가 트랜스포사제 매개 재조합을 사용하는 bacmid를 보유하는 박테리아 시스템. 재조합 bacmid를 갖는 E. 콜라이는 선택적 배지로 제조된 아가 플레이트에서의 성장에 의해 검출가능하다. "양성" 콜로니를 현탁 배양 배지에서 확장시키고, 접종 후 약 3일 후에 bacmid를 수확한다. 이후, Sf9 세포를 허용 곤충 세포에서 감염성 재조합 배큘로바이러스 입자를 생산하는 bacmid로 트랜스펙션한다. (2) 대안적으로, 벡터 DNA는 삽입체에 플랭킹된 수백 개의 염기쌍의 배큘로바이러스 DNA를 갖는 셔틀 플라스미드에 삽입된다. 셔틀 플라스미드 및 선형화된 배큘로바이러스 서브게놈 DNA로 Sf9 세포의 공동-트랜스펙션은 감염성 재조합 배큘로바이러스를 생산하는 결실된 배큘로바이러스 요소를 회복시킨다. ≤6 kb 벡터 DNA는 배큘로바이러스 게놈(ca.135kb)에 존재하며 Sf9 세포가 AAV 비-구조적 또는 Rep 단백질을 발현하지 않는 한 배큘로바이러스로서 증식된다. 이후, Rep 단백질은 ITR에 작용하여 벡터 및 배큘로바이러스 게놈의 분해를 허용하며, 여기서 벡터 게놈은 이후 배큘로바이러스 게놈을 자율적으로 복제한다(도 1b).
DNA를 포함하는 핵산
DNA는 단일-가닥 또는 자가-상보성(즉, 분자내 듀플렉스)일 수 있다. 도 9b에 예시된 바와 같이, 벡터 DNA의 Rep-매개 복제는 여러 중간체를 통해 진행된다. 이러한 복제 중간체는 단일-가닥 비리온 게놈으로 처리되지만, 생성물의 다산성(fecundity)은 단일-가닥 비리온 게놈으로의 처리를 압도할 수 있다. 이 경우, RFm으로 표시되는 분자내 듀플렉스 분자로 구성된 복제 중간체(도 9b)는 AAV 캡시드로 패키징된다. 자가-상보적 벡터 게놈의 패키징은 기능성 ITR의 존재에도 불구하고 발생한다.
DNA는 Rep 단백질-의존적 복제 기점(ori)을 가질 수 있다. ori는 말단 회문 내에서 Rep 결합 요소(RBE)로 구성될 수 있다. 역 말단 반복부(ITR)로 지칭되는 말단 회문은 2개의 내부 회문을 갖는 전체 회문 서열로 구성될 수 있다. ITR은 캡시드에서 복제 및 캡시드화에 필요한 시스-작용 모티프를 가질 수 있다.
RBE는 Rep 결합 요소 표준 GCTC를 나타내고; RBE'는 비-표준 RBE, ITR 크로스-아암의 끝에서 페어링되지 않은 TTT를 나타내고; trs는 말단 분해 부위 5’AGTTGG, GGTTGG 등을 나타낸다. Rep의 촉매적 티로신(Y156)은 trs를 절단하고 분리되기 쉬운 5' 티미딘과 공유 결합을 형성한다. trs의 돌연변이는 비효율적이거나 절단의 손실을 초래하여 자가-상보적 DNA를 생성한다. 대안적으로, 자가-상보적 비리온 게놈은 RFm의 불완전한 처리의 캡시드화로부터 발생한다.
바이러스 벡터의 DNA 복제
AAV ITR을 이용한 복제는 "롤링 헤어핀" 복제로 지칭된다. 단일-가닥 비리온 DNA로서, ITR은 숙주-세포 DNA 폴리머라제 복합체(도 9b)에 의한 DNA 연장을 위한 프라이머로서 작용하는 에너지적으로 안정한 T-형상 구조(도 9a)를 형성한다. DNA 합성은 상보적 가닥이 ITR을 통해 공유적으로 연결된 듀플렉스 중간체를 생성하는 선도 가닥, 진행 과정이다(도 9b). p5 Rep 단백질 결합은 롤링-써클 복제(RCR) 단백질과 구조적으로 관련이 있으며, ITR에 결합하여 다중-서브유닛 복합체를 형성한다. Rep 단백질의 헬리카제 활성은 ITR을 언와인드하여 말단 분해 부위(5'-GGT|TGA-3')를 갖는 단일-가닥 기포를 생성한다. 티미딘 사이의 포스포디에스테르 결합은 Rep 단백질 촉매적 티로신(AAV2 = Y156)의 하이드록실 기에 의해 공격받아 5'-티미딘을 갖는 티로신-티미딘 디에스테르를 형성한다. 세포 DNA 폴리머라제 복합체는 말단 분해 부위에서 새로 생성된 3-OH를 연장하여 주형 가닥에 대한 말단 서열을 복원시킨다(도 9b). 핵단백질 복합체의 분해는 알려지지 않은 과정을 통해 일어난다.
캡시드화
정이십면체 바이러스 캡시드로의 DNA의 캡슐화 또는 패키징은 DNA를 제한된 부피로 압축하는 배압에 의해 생성된 반발력을 극복하기 위해 에너지원을 필요로 하는 활성 공정이다. NS/Rep 단백질의 ATPase 활성은 감마 포스페이트를 가수분해함으로써 트리뉴클레오티드의 저장된 화학 에너지를 번역한다. 생성된 배압은 캡시드에 수용될 수 있는 DNA의 길이를 결정하며, 즉, ATPase/헬리카제의 원동력은, 예를 들어, 4,800개의 뉴클레오티드가 패키징되면 도달할 수 있는 최대 12 pN까지 "푸시"할 수 있다. AAV p19 Rep 단백질은 효율적인 캡시드화에 필요한 단량체성, 비-진행 헬리카제이다. Rep와 캡시드 사이의 물리적 상호작용을 뒷받침하는 데이터는 부족하지만, 배압을 극복하려면 패키징 헬리카제(들)와 캡시드 사이에 안정적인 상호작용이 형성되어야 한다. 이러한 상호작용의 성질은 알려져 있지 않으며, 핵 인자는 비-구조적 단백질과 캡시드 사이의 상호작용을 안정화하거나 매개할 수 있다.
실시예 10: 곤충 세포를 이용한 바이러스 벡터의 생산
바이러스 복제 단백질(Rep) 및/또는 바이러스 캡시드 단백질(VP1, VP2, VP3 등)을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산이 GSH 유전자좌(예를 들어, SYNTX-GSH1 유전자좌)에 통합된 Sf9 세포를 준비한다. Sf9 세포를 무혈청 곤충 세포 배양 배지(HyClone SFX-곤충 세포 배양 배지)에서 성장시키고 에를렌마이어 진탕 플라스크(Corning)에서 Wave 일회용 생물반응기(GE Healthcare)로 옮긴다. 세포 밀도 및 생존력을 Cellometer Autor 2000(Nexelcom)을 사용하여 매일 결정한다. mL 당 200만 내지 500만 개 세포의 세포 밀도를 유지하도록 부피를 조정한다. 최종 부피(10 L) 및 mL 당 250만 개 세포의 밀도에서, 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 1:10,000(v:v)으로 첨가한다(동결보존되고, 100x 농축된 세포 "플러그"). 고도로 희석된 BIIC는 감염 다중도(MOI)가 매우 낮은 Rep-VP-Bac, NS-Bac, 및 vg-Bac를 방출하고, 일차 감염 동안 실질적으로 공동-감염된 세포는 없다. 그러나, 후속 감염 사이클은 매우 높은 MOI를 달성하는 다수의 각 필수 배큘로바이러스를 방출하여 각각의 세포가 수많은 바이러스 입자에 감염되도록 한다. 세포를 4일 동안 또는 생존율이 ≤30%로 떨어질 때까지 배양물에서 유지한다.
실시예 11: 바이러스 벡터의 정제
바이러스 벡터 또는 바이러스 입자는 세포 및 세포외 분획 둘 모두로 분할된다. 최대 수의 입자를 회수하기 위해, 세포 배양 배지를 포함하는 전체 바이오매스가 처리된다. 세포내 바이러스 벡터를 방출하기 위해, Triton-X 100(x%)을 1시간 동안 계속 교반하면서 생물반응기에 첨가한다. 온도를 27℃에서 37℃로 증가시킨 후, 벤조나제(EMD Merck) 또는 터보뉴클레아제(Accelagen, Inc.)를 계속 교반하면서 생물반응기에 첨가한다(mL 당 2u). 바이오매스를 단계적 심층 필터를 사용하여 정화한 다음, 멸균 여과하고(0.2 μm) 멸균 바이오프로세싱 백에 수집한다. 바이러스 벡터는 면역-친화성 크로마토그래피 매질 및 Q-세파로스 음이온 교환을 사용하는 순차적 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 회수된다. UV 흡수, pH, 및 전도도를 표시하고 기록하는 크로마토그램을 사용하여 세척 및 용리 단계의 완료를 결정한다. 각 단계의 상대 효율은 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되며 입력 물질의 ddPCR 또는 qPCR 분석 분취량("부하"), 통과액, 세척, 및 용리에 의해 정량적으로 결정된다.
면역-친화성 크로마토그래피는 라마 및 다른 낙타과 종에서 생산된 단일-도메인 면역글로불린의 VhH 영역인 "나노바디"를 사용한다. 나노바디를 생산하기 위해, 항체 제공자는 바이러스 벡터, 즉, 비리온 게놈이 없는 어셈블링된 캡시드로 라마를 면역화시킨다. 바이러스 벡터를 VP-Bac로 감염된 Sf9 세포에서 제조하고, 세슘 클로라이드 등밀도 구배를 사용한 후, 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200)를 사용하여 정제한다. 프라임(1x)/부스트(2x) 면역화 프로토콜에 따라, 항체 서비스 제공자는 라마를 채혈하고 말초 혈액 단핵 세포 또는 유핵 혈액 세포로부터 추출된 mRNA를 분리한다. 보존된 VhH CDR 플랭킹 영역(FR1 및 FR4)에 특이적인 프라이머를 사용한 역전사는 T7Select 10-3b 파지 디스플레이 라이브러리(EMD-Millipore)를 생성하는데 사용되는 플라스미드로 클로닝되는 cDNA를 생성한다. 바이러스 벡터의 캡시드와 상호작용하는 파지를 농축시키기 위한 여러 라운드의 패닝 후, 파지 클론을 플라크로부터 분리한다. 재조합 파지로 감염된 E. 콜라이를 아가로스에 혼합하고 LB-아가 플레이트에 오버레이로 적용한다. E. 콜라이는 박테리아가 용해되고 플레이트 상에 플라크로 나타나는 "잔디(lawn)"를 확립하는 컨플루언시(confluency)로 성장한다. 바이러스 벡터에 결합하는 파지를 확인하기 위해, 니트로셀룰로스 필터를 아가 플레이트의 표면에 배치하여 단백질을 플라크로부터 필터로 옮겼다. 필터를 공유 연결된 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)(EZLink Plus Activated Peroxidase Kit, ThermoFisher)로 변형된 바이러스 벡터 캡시드와 함께 인큐베이션하고 포스페이트 완충된 염수로 세척한다. HRP 활성은 발색(Novex HRP Chromogenic Substrate, ThermoFisher) 또는 화학발광 기질(Pierce ECL Western Blotting Substrate, ThermoFisher)로 검출될 수 있다. 파지에서 cDNA의 서열을 결정하고 박테리아 발현 플라스미드에 라이게이션하고 정제를 위해 6xHis 태그와 함께 발현시킨다. 킬레이트 컬럼 - 정제된 나노바디는 크로마토그래피 매질, NHS-활성화된 세파로스 4 패스트 플로우(GE Healthcare)에 공유적으로 연결된다.
바이러스 벡터는 결합, 세척, 및 나노바디-세파로스 컬럼으로부터의 용리에 의해 정화된 Sf9 세포 용해물로부터 회수된다. 결합 효율은 컬럼 부하 및 통과를 웨스턴 블롯팅함으로써 결정된다. UV280nm 흡광도가 기준선(즉, 부하 전) 값으로 돌아올 때 세척 단계가 완료된 것으로 간주된다. 산성 pH 이동은 나노바디 - 세파로스 매질로부터 용리되는 바이러스 입자를 방출한다. 용리액을 50 nM Tris-Cl, pH 7.2에서 수집하여 용리 매질을 중화시킨다.
바이러스 벡터 입자의 농도는 충전된 입자, 즉, 벡터 게놈-함유 백분율을 추정하는데 사용될 수 있는 바이러스 벡터-특이적 ELISA 및 qPCR을 사용하여 결정된다.
실시예 12:
박동성 유전자 발현
SYNTX-GSH1 유전자좌와 상동성을 갖는 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹된, 인자 VIII(FVIII), F8 또는 B-도메인 결실된 폴리펩티드를 인코딩하는 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터는 혈우병 A에 대한 요법으로서 간세포를 형질도입하는데 사용된다. 상동성 아암은 SYNTX-GSH1 유전자좌로의 FVIII, F8, 또는 B-도메인-결실된 폴리펩티드를 인코딩하는 단편을 인코딩하는 핵산의 상동성 재조합-매개 삽입을 안정적으로 허용한다. FVIII는 항-혈우병 인자(AHF)로도 알려진 필수 혈액-응고 단백질이다. 인간에서, 인자 VIII는 F8 유전자에 의해 인코딩된다. 이 유전자의 결함은 열성 X-관련 응고 장애인 혈우병 A를 초래한다. 인자 VIII는 간 시누소이드 세포 및 신체 전체에 걸쳐 간 외부의 내피 세포에서 생산된다.
혈우병 A를 치료하기 위해 F8 유전자의 발현을 증가시키려는 시도가 이전에 있었다. 예를 들어, 인간 인자 VIII의 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV5) 벡터-매개 유전자 전달인 발록토코진 록사파보벡(BMN270으로도 알려짐)을 중증 혈우병 A 환자에서 시험하였다(ClinicalTrials.gov 식별자: NCT02576795; NCT03370913; NCT03392974; NCT03520712). 그러나, FDA는 2020년 승인을 거절하고, 장기적인 안전성 및 효능 데이터를 요청하였다. 트랜스진의 점진적인 유전자 발현을 후속하여 초래할 수 있는 증가된 투여량에 대한 우려를 완화하기 위해 장기적인 데이터가 필요할 수 있다.
FVIII는 미생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 생산하기 어려운 재조합 단백질이었다. "B-도메인"의 발달은 개선된 발현 수준을 삭제하고 오픈-리딩 프레임의 크기를 감소시켰지만, FVIII 발현 수준은 다른 단백질보다 실질적으로 낮았다. 이러한 낮은 수준을 극복하기 위해, 발록토코진 록사파보벡 바이러스 벡터의 임상 용량을 증가시켰다. 환자를 kg 당 6E+13 벡터 입자(벡터 게놈 또는 vg로 지칭됨)로 치료하였다. 큰 동물 모델에 기초하여, 소수의 간세포를 rAAV5-FVIII로 형질도입하였다. 세포 당 많은 수의 vg로 인해, 형질도입된 세포는 비교적 많은 양의 FVIII를 발현한다. FVIII 발현에 대한 대사 요구는 간세포 단백질 발현에 대한 정상 요건을 방해할 가능성이 있다. 단백질 폴딩 및 분비에 정상적으로 관여하는 간세포 세포 구획은 FVIII로 혼잡해질 수 있다. FVIII 생산을 일으키는 내피 세포는 이러한 활성에 특화되어 고도로 조절된 천연 FVIII 프로모터의 전사 제어 하에 단일 X 염색체 상의 대립유전자로부터 FVIII를 생산할 가능성이 있다.
따라서, 간세포 항상성의 교란은 염증 상태를 유도하는 세포 스트레스를 생성하는 것으로 본원에서 가정된다. 대사 및 단백질 폴딩/유출 부담은 rAAV-FVIII 벡터에 사용되는 항시적, 고활성 프로모터의 사용에 의해 악화된다. 염증 및 사이토카인 생산은 세포 회전율 또는 세포 사멸을 유발할 수 있다.
이러한 문제를 회피하고 혈우병 A 치료에 대한 오랜 필요성을 해결하기 위해, 바이러스 벡터는 (a) 유전자 F8, 또는 (b) B-도메인 결실을 갖는 유전자 F8을 포함하도록 조작되고, 이들은 상기 기재된 바와 같이, SYNTX-GSH1 유전자좌와 상동성을 갖는 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 발록토코진 록사파보벡에 대한 임상 시험에서 사용된 항시적이고 매우 활성인 프로모터와 대조적으로, 바이러스 벡터는 유도성 발현 시스템으로 제조된다.
유도성 발현 시스템은 시약이 발현을 켜거나 발현을 억제하지 않을 때까지 F8 유전자를 전사적으로 디폴트 오프 상태로 유지한다(예를 들어, 도 14 참조). 박동성 발현은 과발현 스트레스로부터 간세포를 보호한다. 펄스의 타이밍(즉, 유전자 발현을 켜는 타이밍)은 FVIII의 초기 혈청 수준(t0) 및 반감기(t1/2)로부터 결정될 수 있다. t1/2는 9 내지 14일로 추정되며, 따라서 14일(2wks) t1/2가 사용되고, 경증 혈우병은 FVIII 수준이 정상의 ≥5%인 것으로 정의된다.
트랜스진 발현 = 150%
5%로 감소하는데 68일
여기서, 발현은 매월 유도되어 FVIII의 치료 수준을 초래한다.
세포에서 t1/2를 증가시키는 광범위한 ASO 화학(안티센스 올리고 뉴클레오티드 ASO 또는 AON)이 개발되었다. 여기서, 비교적 짧은 t1/2를 갖는 ASO 화학은 ASO가 세포로부터 제거됨에 따라 감소하는 FVIII 발현의 펄스를 달성하는데 사용된다. 최적의 t1/2는 무엇보다도 형질도입된 세포 수, 프로모터 활성, 및 전사체 성숙의 동역학에 기초하여 경험적으로 결정된다.
참조에 의한 포함
본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 본원의 모든 정의를 포함하는 본 출원이 우선할 것이다.
등가물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 등가물을 인지하거나 단지 일상적인 실험을 이용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> SYNTENY THERAPEUTICS, INC.
UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS
<120> GENOMIC SAFE HARBORS
<130> SYX-00525
<140> PCT/US2022/030024
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<150> 63/190,996
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tggtggcggc ggttggggct cggcgctcgc tcgctcgctc gctgggcggg cggtgcgatg 60
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Synthetic oligonucleotide
<400> 2
gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Synthetic peptide
<400> 3
His His His His His His
1 5
<210> 4
<211> 159
<212> DNA
<213> Adeno-associated virus
<400> 4
aggaacccct agatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 60
gggcccgaaa cgggcccgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc 120
gcgcagagag ggagtggcca actccatcta ggggttcct 159
<210> 5
<211> 469
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
aggttacaga gtggtgaagg cactctgcat ttcttggttg agacagagaa aaaaagtggt 60
cagaactggg taaccctccc cccaccatat tatcacagtg atcccttttg tctttcttca 120
ggctccagcc ccaccctaca gcccctgctc cctggattca ctagagctaa cttcagtaaa 180
gtacaaagaa aatggggcca tatgactggc caaaaaaaaa atatctattc acgtggatga 240
ccagatagta tgaatggatt gaaaatttat caggaaaaaa ggatgagagg aaatgccagg 300
agatgagggc agagagcagg ccgttctggg ggagggattc tgtggggaca gggtggccta 360
ctgggtgtgc cccttttctc ttctctgtct cccttagata agaccagcag ttttgtcatc 420
ctctccctct cattccatgg tcccgcagcc ccaggcccac actgaaagc 469
Claims (158)
- 게놈 세이프 하버(GSH) 유전자좌를 확인하는 방법으로서,
(a) 세포의 게놈으로 적어도 하나의 마커 유전자의 무작위 삽입을 유도하는 단계;
(b) 마커 유전자 발현의 안정성 및/또는 수준을 결정하는 단계; 및
(c) 삽입된 마커 유전자가 안정한 및/또는 높은 수준의 발현을 나타내는 게놈 유전자좌를 GSH로서 확인하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
(a) 삽입된 마커 유전자가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 게놈 유전자좌를 확인하는 단계; 및/또는
(b) 삽입된 마커가 세포의 분화 능력(예를 들어, 만능성, 다능성)에 영향을 미치지 않는 게놈 유전자좌를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 세포주, 일차 세포, 줄기 세포, 또는 전구 세포로부터 선택되고, 선택적으로 세포가 줄기 세포 또는 전구 세포인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 배아 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 및 간 전구 세포로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포이고, 선택적으로 포유동물 세포가 마우스 세포, 개 세포, 돼지 세포, 비인간 영장류(NHP) 세포, 또는 인간 세포인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 무작위 삽입이
(a) 마커 유전자를 포함하는 핵산 분자로 세포를 트랜스펙션시키는 단계로서, 선택적으로 핵산이 플라스미드인 단계; 또는
(b) 마커 유전자를 포함하는 통합 바이러스로 세포를 형질도입시키는 단계에 의해 유도되는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 무작위 삽입이 마커 유전자를 포함하는 통합 바이러스로 세포를 형질도입시키는 단계에 의해 유도되고; 통합 바이러스가 레트로바이러스이고, 선택적으로 레트로바이러스가 감마 레트로바이러스인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자가 스크리닝 가능한 마커 및/또는 선택 가능한 마커를 포함하고, 선택적으로
(a) 스크리닝 가능한 마커 유전자가 녹색 형광 단백질(GFP), 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 및/또는 베타-글루쿠로니다제를 인코딩하고/거나;
(b) 선택 가능한 마커 유전자가 항생제 내성 유전자이고, 선택적으로 항생제 내성 유전자가 블라스티시딘 S-데아미나제 또는 아미노 3'-글리코실 포스포트랜스퍼라제(네오마이신 내성 유전자)를 인코딩하는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않은 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로 프로모터가 조직-특이적 프로모터인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, GSH가 인트론, 엑손, 또는 유전자간 서열인 방법.
- GSH 유전자좌를 확인하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) 후생동물 종의 게놈에서 내인성 바이러스 요소(EVE)의 존재 및 위치를 결정하는 단계;
(b) EVE에 근접한 유전자간 또는 인트론 경계를 결정하는 단계; 및
(c) GSH 유전자좌로서 EVE를 포함하는 유전자간 또는 인트론 유전자좌를 확인하는 단계를 포함하는 방법. - 제12항에 있어서,
(a) EVE의 존재 및 위치가 바이러스 요소에 상동성인 서열에 대해 인 실리코(in silico) 검색에 의해 결정되고/거나;
(b) EVE에 근접한 유전자간 또는 인트론 경계가 EVE에 플랭킹된 서열 및 유전자간 또는 인트론 경계가 알려진 하나 이상의 종의 이종상동성 서열을 정렬함으로써 결정되는 방법. - 이종상동성 유기체에서 GSH 유전자좌를 확인하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 따라 종 A에서 GSH 유전자좌를 확인하는 단계;
(b) (i) 종 A에서 GSH 유전자좌에 근접한 적어도 하나의 시스-작용 요소 및 (ii) 종 B에서 상응하는 시스-작용 요소(들)의 위치를 결정하는 단계; 및
(c) 종 B에서 유전자좌를 GSH 유전자좌로서 확인하는 단계로서, 종 B에서 상기 유전자좌와 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리가 종 A에서 GSH 유전자좌와 상응하는 시스-작용 요소(들) 사이의 거리에 실질적으로 비례하는 단계를 포함하는 방법. - 제14항에 있어서, 적어도 하나의 시스-작용 요소가 스플라이싱 공여자 부위, 스플라이싱 수용자 부위, 폴리피리미딘 트랙, 폴리아데닐화 신호, 인핸서, 프로모터, 종결자, 스플라이싱 조절 요소, 인트론 스플라이싱 인핸서, 및 인트론 스플라이싱 사일런서로부터 선택되는 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 적어도 하나의 시스-작용 요소가 2개 이상의 시스-작용 요소를 포함하는 방법.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 시스-작용 요소가 2개의 시스-작용 요소를 포함하고; 제1 시스-작용 요소가 GSH 유전자좌의 상류(즉, 5'측)에 위치하고, 제2 시스-작용 요소가 GSH 유전자좌의 하류(즉, 3'측)에 위치하는 방법.
- 제17항에 있어서, 종 B에서 2개의 시스-작용 요소 사이의 거리에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소와 GSH 유전자좌 사이의 거리가 종 A에서 2개의 시스-작용 요소 사이의 거리에 대한 상응하는 시스-작용 요소와 GSH 유전자좌 사이의 거리에 실질적으로 비례하는 방법.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 종 B에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리가 종 A에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리의 20% 이상 내지 500% 이하인 방법.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 종 B에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리가 종 A에서 GSH 유전자좌에 대한 적어도 하나의 시스-작용 요소 사이의 거리의 80% 이상 내지 250% 이하인 방법.
- 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, GSH 유전자좌가 포유동물 게놈에 있고, 선택적으로 포유동물 게놈이 마우스 게놈, 개 게놈, 돼지 게놈, NHP 게놈, 또는 인간 게놈인 방법.
- 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, EVE 또는 바이러스 요소가
(a) 프로바이러스 또는 바이러스 게놈의 단편을 포함하고/거나;
(b) 바이러스 핵산, 바이러스 DNA, 또는 바이러스 RNA의 DNA 카피를 포함하고/거나;
(c) 구조적 또는 비-구조적 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 방법. - 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, EVE가 레트로바이러스, 비-레트로바이러스, 파보바이러스, 또는 써코바이러스로부터의 바이러스 핵산을 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서,
(a) 파보바이러스가 B19, 마우스의 미세 바이러스(mvm), RA-1, AAV, 부파바이러스, 호코바이러스, 보카바이러스, 및 표 1A-1D에 열거된 파보바이러스 중 어느 하나로부터 선택되고, 선택적으로 파보바이러스는 AAV이고; 및/또는
(b) 써코바이러스가 돼지 써코바이러스(PCV)(예를 들어, PCV-1, PCV-2)인 방법. - 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 후생동물 종이 고래류(Cetacea), 박쥐목(Chiropetera), 토끼목(Lagomorpha), 및 캥거루과(Macropodiadae)로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제12항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 시험관내, 생체외, 및/또는 생체내 검정을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제27항에 있어서, 적어도 하나의 시험관내, 생체외, 및/또는 생체내 검정이
(a) 세포(예를 들어, 인간 세포)의 유전자좌로의 마커 유전자의 새로운 표적화된 삽입 및 (i) 세포 생존력, (ii) 삽입 효율 및/또는 (iii) 마커 유전자 발현의 결정;
(b) 전구 세포 또는 줄기 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 시험관내 분화 및 (i) 모든 발달 계통에서의 마커 유전자 발현, 및/또는 (ii) 마커 유전자의 삽입이 상기 전구 세포 또는 줄기 세포의 분화에 영향을 미치는지 여부의 결정;
(c) 전구 세포 또는 줄기 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 세포를 면역-고갈된 마우스에 생착 및 생체내 모든 발달 계통에서 마커 유전자 발현의 평가;
(d) 세포의 유전자좌로의 마커 유전자의 표적화된 삽입 및 전체 세포 전사 프로파일의 결정(예를 들어, RNAseq 또는 마이크로어레이 사용); 및
(e) 마우스의 게놈 DNA가 유전자좌에 삽입된 마커 유전자를 갖고, 선택적으로 마커 유전자가 조직 특이적 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 트랜스제닉 녹-인 마우스의 생성으로부터 선택되는 방법. - 제28항에 있어서, 전구 세포 또는 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 및 간 전구 세포로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에서 확인된 GSH 핵산의 적어도 일부를 포함하는 핵산 벡터.
- 제30항에 있어서, GSH 핵산이 비번역 서열 또는 인트론을 포함하는 핵산 벡터.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, GSH가 표 3에 열거된 GSH 또는 이의 단편 중 어느 하나의 서열과 적어도 65% 동일한 서열을 포함하는 핵산 벡터.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, GSH가 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 또는 SYNTX-GSH4의 게놈 DNA 또는 이의 단편의 서열과 적어도 65% 동일한 서열을 포함하는 핵산 벡터.
- 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산, 예를 들어, GSH에 이종성인 서열을 갖는 핵산, 예를 들어, GSH 유전자좌에 천연적으로 존재하지 않는 핵산 서열, 예를 들어, 트랜스진을 추가로 포함하는 핵산 벡터.
- 제34항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 GSH 5' 상동성 아암 및/또는 GSH 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹되고, 여기서 상동성 아암이 표적 GSH 핵산과 적어도 약 65% 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 벡터.
- 제35항에 있어서, GSH 상동성 아암이 10 내지 5000개 염기쌍 길이이고, 선택적으로 GSH 상동성 아암이 100-1500개 염기쌍 길이인 핵산 벡터.
- 제35항에 있어서, GSH 상동성 아암이 적어도 30개 염기쌍 길이인 핵산 벡터.
- 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, GSH 상동성 아암이 세포의 게놈에서 GSH 유전자좌로의 상동성-의존적 통합을 매개하기에 충분한 길이인 핵산 벡터.
- 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 정방향으로 GSH에 통합되기 위한 배향인 핵산 벡터.
- 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 역방향으로 GSH에 통합되기 위한 배향인 핵산 벡터.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 (a) 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나, (b) 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는 핵산 벡터.
- 제41항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 프로모터가
(a) 작동 가능하게 연결된 핵산에 이종성인 프로모터;
(b) 핵산의 조직-특이적 발현을 촉진하는 프로모터;
(c) 핵산의 구성적 발현을 촉진하는 프로모터;
(d) 유도성 프로모터;
(e) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터;
(f) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터; 및
(g) 곤충 세포 프로모터로부터 선택되는 핵산 벡터. - 제42항에 있어서, 유도성 프로모터가 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절되는 핵산 벡터.
- 제43항에 있어서, 제제가 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택되는 핵산 벡터.
- 제42항에 있어서, 프로모터가 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 뉴런 세포, 기도 상피 세포, 또는 간 전구 세포에서 조직-특이적 발현을 촉진하는 핵산 벡터.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터, β-글로빈 프로모터, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, Wiskott-Aldrich 프로모터, PKLR 프로모터, 다면체(polh) 프로모터, 및 즉시 초기 1 유전자 (IE-1) 프로모터로부터 선택되는 핵산 벡터.
- 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 벡터.
- 제47항에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 서열이 표적 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화되는 핵산 벡터.
- 제47항 또는 제48항에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는 핵산 벡터.
- 제34항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이
(a) 단백질 또는 이의 단편, 바람직하게는 인간 단백질 또는 이의 단편;
(b) 치료 단백질 또는 이의 단편, 항원-결합 단백질, 또는 펩티드;
(c) 자살 유전자, 선택적으로 단순 포진 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK);
(d) 바이러스 단백질 또는 이의 단편;
(e) 뉴클레아제, 선택적으로 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, megaTAL, 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체);
(f) 마커, 예를 들어, 루시퍼라제 또는 GFP; 및/또는
(g) 약물 내성 단백질, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 네오마이신 내성을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 벡터. - 제50항에 있어서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편이 구조적 단백질(예를 들어, VP1, VP2, VP3) 또는 비-구조적 단백질(예를 들어, Rep 단백질)을 포함하는 핵산 벡터.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편이
(a) 파보바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 VP1, VP2, VP3, NS1, 또는 Rep;
(b) 레트로바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 외피 단백질, gag, pol, 또는 VSV-G;
(c) 아데노바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, 또는 구조적 단백질(예를 들어, A, B, C); 및/또는
(d) 단순 포진 바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 ICP27, ICP4, 또는 pac를 포함하는 핵산 벡터. - 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 바이러스의 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 벡터.
- 제53항에 있어서, (a) 표면 단백질 또는 이의 단편이 숙주에서 면역 반응을 유발하는 면역원성 표면 단백질이고/거나, (b) 표면 단백질 또는 이의 단편이 신호 펩티드를 추가로 포함하고/거나, (c) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 유전자가 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고/거나, (d) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산이 자살 유전자를 추가로 포함하는 핵산 벡터.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, 표면 단백질이 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스의 것인 핵산 벡터.
- 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 단백질이 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질인 핵산 벡터.
- 제50항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 헤모글로빈 유전자(HBA1, HBA2, HBB, HBG1, HBG2, HBD, HBE1, 및/또는 HBZ), 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP), 응고 인자 VIII, 응고 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, 디스트로핀 또는 트렁케이션된 디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 유트로핀 또는 트렁케이션된 유트로핀, 마이크로-유트로핀, 우세린(USH2A), GBA1, 프리프로인슐린, 인슐린, GIP, GLP-1, CEP290, ATPB1, ATPB11, ABCB4, CPS1, ATP7B, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, KIND1, INS, F8 또는 이의 단편(예를 들어, B-도메인 결실된 폴리펩티드(예를 들어, VIII SQ, p-VIII)를 인코딩하는 단편), IRGM, NOD2, ATG2B, ATG9, ATG5, ATG7, ATG16L1, BECN1, EI24/PIG8, TECPR2, WDR45/WIP14, CHMP2B, CHMP4B, 다이네인, EPG5, HspB8, LAMP2, LC3b UVRAG, VCP/p97, ZFYVE26, PARK2/파킨, PARK6/PINK1, SQSTM1/p62, SMURF, AMPK, ULK1, RPE65, CHM, RPGR, PDE6B, CNGA3, GUCY2D, RS1, ABCA4, MYO7A, HFE, 헵시딘, (예를 들어, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-1β 수용체의) 가용성 형태를 인코딩하는 유전자, 및 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(CFTR)로부터 선택되는 핵산 벡터.
- 제50항에 있어서, 항원-결합 단백질이 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG(CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택되는 핵산 벡터.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 항원-결합 단백질이 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, CCR5, 또는 병원체(예를 들어, 박테리아 독소, 바이러스 캡시드 단백질 등)에 특이적으로 결합하는 핵산 벡터.
- 제50항, 제58항, 및 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질이 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 핵산 벡터.
- 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 비-코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하고, 선택적으로 비-코딩 RNA가 안티센스 폴리뉴클레오티드, lncRNA, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, snoRNA, snRNA, scaRNA, 및/또는 가이드 RNA를 포함하는 핵산 벡터.
- 제61항에 있어서, 비-코딩 RNA가 DMT-1, 페로포틴, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-1β 수용체, 및 돌연변이된 단백질(예를 들어, 돌연변이된 HFE, CFTR)을 인코딩하는 유전자로부터 선택된 유전자를 표적화하는 핵산 벡터.
- 제34항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 증가시키거나 회복시키는 핵산 벡터.
- 제34항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 핵산 벡터.
- 제30항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 전사 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 전사 종결 서열, 비번역 영역(5' 또는 3' UTR), 근위 프로모터 요소, 유전자좌 제어 영역(예를 들어, β-글로빈 LCR 또는 β-글로빈 LCR의 DNase 과민성 부위(HS)), 폴리아데닐화 신호 서열), 및/또는
(b) 번역 조절 요소(예를 들어, Kozak 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소)를 추가로 포함하는 핵산 벡터. - 제30항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 벡터가 플라스미드, 미니써클, 코스미드, 인공 염색체(예를 들어, BAC), 선형 공유 폐쇄(LCC) DNA 벡터(예를 들어, 미니써클, 미니벡터 및 미니노트), 선형 공유 폐쇄(LCC) 벡터(예를 들어, MIDGE, MiLV, 미니스터링, 미니플라스미드), 미니-인트론 플라스미드, pDNA 발현 벡터, 또는 이들의 변이체로부터 선택되는 핵산 벡터.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에서 확인된 GSH 핵산의 적어도 일부; 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터에서 GSH의 적어도 일부; 표 3에 열거된 GSH 중 어느 하나의 적어도 일부; 및/또는 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 벡터.
- 제67항에 있어서, 바이러스 벡터가 rAd, AAV, rHSV, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스 벡터, HSV 타입 1(HSV-1)-AAV 하이브리드 벡터, 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS), 및 이들의 변이체로부터 선택되는 바이러스 벡터.
- 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터, 또는 제67항 또는 제68항의 바이러스 벡터를 포함하는 세포.
- 제69항에 있어서, 세포가 세포주 또는 일차 세포로부터 선택되는 세포.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포이고, 선택적으로 포유동물 세포가 인간 세포 또는 설치류 세포인 세포.
- 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 곤충 세포이고; 곤충 세포가 나비목(lepidoptera) 종으로부터 유래되는 세포.
- 제72항에 있어서, 나비목의 종이 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 스포돕테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis), 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)인 세포.
- 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 Sf9인 세포.
- 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 조혈 세포, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 적혈구 계통 세포, 거핵구, 적혈구 전구 세포(EPC), CD34+ 세포, CD44+ 세포, 적혈구, CD36+ 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 세포, 장 세포, 장 줄기 세포, 장 상피 세포, 내피 세포, 장내분비 세포, 폐 세포, 폐 전구 세포, 장세포, 간 세포(예를 들어, 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포(KC), 간 시누소이드 내피 세포(LSEC), 간 전구 세포), 줄기 세포, 전구 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 피부 섬유모세포, 대식세포, 뇌 미세혈관 내피 세포(BMVEC), 신경 줄기 세포, 근육 위성 세포, 상피 세포, 기도 상피 세포, 근육 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 림프 전구 세포, B 림프모구 세포, B 세포, T 세포, 호염기성 풍토성 버킷 림프종(EBL), 다색 적혈구모세포, 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 배아 줄기 세포, P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포, 각질세포, 췌장 β-세포, K 세포, L 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, MDCK 세포, Vero 세포, CHO, BHK1, NS0, Sp2/0, HeLa, A549, 및 정염성 적혈구모세포로부터 선택되는 세포.
- 세포의 게놈에서 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 세포로서, 여기서 GSH가 표 3으로부터 선택되는, 세포.
- 제76항에 있어서, GSH 핵산이 비번역 서열 또는 인트론을 포함하는 세포.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, GSH가 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 및 SYNTX-GSH4로부터 선택되는 세포.
- 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 정방향으로 GSH에 통합되는 세포.
- 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 역방향으로 GSH에 통합되는 세포.
- 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 (a) 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나, (b) 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는 세포.
- 제81항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 프로모터가
(a) 작동 가능하게 연결된 핵산에 이종성인 프로모터;
(b) 핵산의 조직-특이적 발현을 촉진하는 프로모터;
(c) 핵산의 구성적 발현을 촉진하는 프로모터;
(d) 유도성 프로모터;
(e) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터;
(f) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터; 및
(g) 곤충 세포 프로모터로부터 선택되는 세포. - 제82항에 있어서, 유도성 프로모터가 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절되는 세포.
- 제83항에 있어서, 제제가 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택되는 세포.
- 제82항에 있어서, 프로모터가 조혈 줄기 세포, 조혈 CD34+ 세포, 및 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 폐 전구 세포, 근육 위성 세포, 장 K 세포, 뉴런 세포, 기도 상피 세포, 또는 간 전구 세포에서 조직-특이적 발현을 촉진하는 세포.
- 제81항 또는 제82항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터, β-글로빈 프로모터, CAG 프로모터, AHSP 프로모터, MND 프로모터, Wiskott-Aldrich 프로모터, PKLR 프로모터, 다면체(polh) 프로모터, 및 즉시 초기 1 유전자 (IE-1) 프로모터로부터 선택되는 세포.
- 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 세포.
- 제87항에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 서열이 표적 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화되는 세포.
- 제87항 또는 제88항에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는 세포.
- 제76항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 RNA를 인코딩하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이
(a) 단백질 또는 이의 단편, 바람직하게는 인간 단백질 또는 이의 단편;
(b) 치료 단백질 또는 이의 단편, 항원-결합 단백질, 또는 펩티드;
(c) 자살 유전자, 선택적으로 단순 포진 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK);
(d) 바이러스 단백질 또는 이의 단편;
(e) 뉴클레아제, 선택적으로 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, megaTAL, 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체);
(f) 마커, 예를 들어, 루시퍼라제 또는 GFP; 및/또는
(g) 약물 내성 단백질, 예를 들어, 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 네오마이신 내성을 인코딩하는 서열을 포함하는 세포. - 제90항에 있어서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편이 구조적 단백질(예를 들어, VP1, VP2, VP3) 또는 비-구조적 단백질(예를 들어, Rep 단백질)을 포함하는 세포.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 바이러스 단백질 또는 이의 단편이
(a) 파보바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 VP1, VP2, VP3, NS1, 또는 Rep;
(b) 레트로바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 외피 단백질, gag, pol, 또는 VSV-G;
(c) 아데노바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, 또는 구조적 단백질(예를 들어, A, B, C); 및/또는
(d) 단순 포진 바이러스 단백질 또는 이의 단편, 선택적으로 ICP27, ICP4, 또는 pac를 포함하는 세포. - 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자가 바이러스의 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 세포.
- 제93항에 있어서, (a) 표면 단백질이 면역 반응을 유발하는 면역원성 표면 단백질 또는 이의 단편이고/거나, (b) 표면 단백질 또는 이의 단편이 신호 펩티드를 추가로 포함하고/거나, (c) 유전자가 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고/거나, (d) 표면 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산이 자살 유전자를 추가로 포함하는 세포.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, 표면 단백질이 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스의 것인 세포.
- 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 단백질이 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질인 세포.
- 제90항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 헤모글로빈 유전자(HBA1, HBA2, HBB, HBG1, HBG2, HBD, HBE1, 및/또는 HBZ), 알파-헤모글로빈 안정화 단백질(AHSP), 응고 인자 VIII, 응고 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, 디스트로핀 또는 트렁케이션된 디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 유트로핀 또는 트렁케이션된 유트로핀, 마이크로-유트로핀, 우세린(USH2A), GBA1, 프리프로인슐린, 인슐린, GIP, GLP-1, CEP290, ATPB1, ATPB11, ABCB4, CPS1, ATP7B, KRT5, KRT14, PLEC1, Col7A1, ITGB4, ITGA6, LAMA3, LAMB3, LAMC2, KIND1, INS, F8 또는 이의 단편(예를 들어, B-도메인 결실된 폴리펩티드(예를 들어, VIII SQ, p-VIII)를 인코딩하는 단편), IRGM, NOD2, ATG2B, ATG9, ATG5, ATG7, ATG16L1, BECN1, EI24/PIG8, TECPR2, WDR45/WIP14, CHMP2B, CHMP4B, 다이네인, EPG5, HspB8, LAMP2, LC3b UVRAG, VCP/p97, ZFYVE26, PARK2/파킨, PARK6/PINK1, SQSTM1/p62, SMURF, AMPK, ULK1, RPE65, CHM, RPGR, PDE6B, CNGA3, GUCY2D, RS1, ABCA4, MYO7A, HFE, 헵시딘, (예를 들어, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-1β 수용체의) 가용성 형태를 인코딩하는 유전자, 및 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(CFTR)로부터 선택되는 세포.
- 제90항에 있어서, 항원-결합 단백질이 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG(CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택되는 세포.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 항원-결합 단백질이 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, CCR5, 또는 병원체(예를 들어, 박테리아 독소, 바이러스 캡시드 단백질 등)에 특이적으로 결합하는 세포.
- 제90항, 제98항, 및 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질이 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 세포.
- 제76항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 비-코딩 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하고, 선택적으로 비-코딩 RNA가 lncRNA, piRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, snoRNA, snRNA, scaRNA, 및/또는 가이드 RNA를 포함하는 세포.
- 제101항에 있어서, 비-코딩 RNA가 DMT-1, 페로포틴, TNFα 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-1β 수용체, 돌연변이된 단백질(예를 들어, 돌연변이된 HFE, CFTR)을 인코딩하는 유전자로부터 선택된 유전자를 표적화하는 세포.
- 제76항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 증가시키거나 회복시키는 세포.
- 제76항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이 표적 세포의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 세포.
- 제76항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-GSH 핵산이
(a) 전사 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 전사 종결 서열, 비번역 영역(5' 또는 3' UTR), 근위 프로모터 요소, 유전자좌 제어 영역(예를 들어, β-글로빈 LCR 또는 β-글로빈 LCR의 DNase 과민성 부위(HS)), 폴리아데닐화 신호 서열), 및/또는
(b) 번역 조절 요소(예를 들어, Kozak 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소)를 추가로 포함하는 세포. - 제76항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 세포주 또는 일차 세포로부터 선택되는 세포.
- 제76항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포이고, 선택적으로 포유동물 세포가 인간 세포 또는 설치류 세포인 세포.
- 제76항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 곤충 세포이고; 곤충 세포가 나비목 종으로부터 유래되는 세포.
- 제108항에 있어서, 나비목의 종이 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리토랄리스, 스포돕테라 엑시구아 또는 트리코플루시아 니인 세포.
- 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 Sf9인 세포.
- 제76항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 조혈 세포, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 적혈구 계통 세포, 거핵구, 적혈구 전구 세포(EPC), CD34+ 세포, CD44+ 세포, 적혈구, CD36+ 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 세포, 장 세포, 장 줄기 세포, 장 상피 세포, 내피 세포, 장내분비 세포, 폐 세포, 폐 전구 세포, 장세포, 간 세포(예를 들어, 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포(KC), 간 시누소이드 내피 세포(LSEC), 간 전구 세포), 줄기 세포, 전구 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 피부 섬유모세포, 대식세포, 뇌 미세혈관 내피 세포(BMVEC), 신경 줄기 세포, 근육 위성 세포, 상피 세포, 기도 상피 세포, 근육 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 림프 전구 세포, B 림프모구 세포, B 세포, T 세포, 호염기성 풍토성 버킷 림프종(EBL), 다색 적혈구모세포, 표피 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 배아 줄기 세포, P63-양성 각질세포-유래 줄기 세포, 각질세포, 췌장 β-세포, K 세포, L 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, MDCK 세포, Vero 세포, CHO, BHK1, NS0, Sp2/0, HeLa, A549, 및 정염성 적혈구모세포로부터 선택되는 세포.
- 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터, 제67항 또는 제68항의 바이러스 벡터, 및/또는 제69항 내지 제111항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 약학적 조성물.
- 세포의 게놈에서 GSH에 통합된 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 포함하는 트랜스제닉 유기체로서, 여기서 GSH가 표 3으로부터 선택되는, 트랜스제닉 유기체.
- 제113항에 있어서, GSH가 SYNTX-GSH1, SYNTX-GSH2, SYNTX-GSH3, 및 SYNTX-GSH4로부터 선택되는 트랜스제닉 유기체.
- 제69항 내지 제114항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 트랜스제닉 유기체.
- 제115항에 있어서, 유기체가 포유동물 또는 식물이고, 선택적으로 포유동물이 설치류(예를 들어, 마우스, 래트), 염소, 양, 닭, 라마, 또는 토끼인 트랜스제닉 유기체.
- 적어도 하나의 비-GSH 핵산을 세포의 GSH 유전자좌에 삽입하는 방법으로서, 상기 방법이 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터, 제67항 또는 제68항의 바이러스 벡터, 또는 제112항의 약학적 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하고, 이에 의해 게놈에서 비-GSH 핵산에 플랭킹된 GSH 5' 상동성 아암 및 GSH 3' 상동성 아암과 GSH 유전자좌의 상동성 재조합이 비-GSH 핵산을 GSH 유전자좌에 통합시키는, 방법.
- 제117항에 있어서, 비-GSH 핵산이 정방향으로 GSH에 통합되는 방법.
- 제117항에 있어서, 비-GSH 핵산이 역방향으로 GSH에 통합되는 방법.
- 유효량의 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터, 제67항 또는 제68항의 바이러스 벡터, 제69항 내지 제111항 중 어느 한 항의 세포, 및/또는 제112항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제120항에 있어서, 질병이 감염, 내피 기능장애, 낭포성 섬유증, 심혈관 질환, 신장 질환, 암, 혈색소병증, 빈혈, 혈우병(예를 들어, 혈우병 A), 골수증식성 장애, 응고병증, 겸상 적혈구 질환, 알파-지중해빈혈, 베타-지중해빈혈, 판코니 빈혈, 가족성 간내 담즙정체, 피부 유전 질환(예를 들어, 수포성 표피박리증), 안구 유전 질환(예를 들어, 유전성 망막 이영양증, 예를 들어, 레버 선천성 흑암시(LCA), 색소성 망막염(RP), 범맥락막위축, 완전색맹, 망막층간분리증, 스타가르트병, 어셔 증후군 타입 1B), 파브리병, 고쉐병, 니만-피크병 A, 니만-피크병 B, GM1 강글리오시드증, 점액다당류증(MPS) I(헐러, 샤이에, 헐러/샤이에), MPS II(헌터), MPS VI(마로토-라미), 혈액암, 혈색소증, 유전성 혈색소증, 소아 혈색소증, 경화증, 간세포 암종, 췌장염, 당뇨병, 심근병증, 관절염, 생식샘 기능저하증, 심장병, 심장마비, 갑상선 기능저하증, 포도당 불내증, 관절병증, 간 섬유증, 윌슨병, 궤양성 대장염, 크론병, 테이-삭스병, 신경퇴행성 장애, 척수 근위축증 타입 1, 헌팅턴병, 카나반병, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 청소년 만성 관절염, 건선, 및 강직성 척추염, 및 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 운동실조), 염증성 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 만성 폐쇄성 폐 질환/COPD, 폐 섬유증, 쇼그렌병, 고혈당 장애, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 인슐린-저항 당뇨병(예를 들어, 멘덴홀 증후군, 베르너 증후군, 요정증, 및 지방위축성 당뇨병), 이상지질혈증, 고지혈증, 저밀도 지단백질 상승(LDL), 고밀도 지단백질 저하(HDL), 트리글리세리드 상승, 대사 증후군, 간 질환, 신장 질환, 심혈관 질환, 허혈, 뇌졸중, 재관류 동안의 합병증, 근육 변성, 위축, 노화 증상(예를 들어, 근육 위축 , 노쇠, 대사 장애, 저등급 염증, 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 연령-관련 치매 및 산발형 알츠하이머병, 전암 상태, 및 우울증을 포함하는 정신병적 상태), 척수 손상, 동맥경화증, 감염성 질환(예를 들어, 박테리아, 진균, 바이러스), AIDS, 결핵, 배아형성의 결함, 불임, 리소좀 축적병, 활성화제 결핍/GM2 강글리오시드증, 알파-만노시드증, 아스파르틸글루코아민뇨증(aspartylglucoaminuria), 콜레스테릴 에스테르 축적병, 만성 헥소사미니다제 A 결핍, 시스틴증, 다논병, 파아버병, 푸코시드증, 갈락토시알산증, 고쉐병(타입 I, II 및 III), GM1 강글리오시드증(영아, 영아 후기/소아 및 성인/만성), 헌터 증후군(MPS II), I-세포병/점액지질증 II, 영아 유리 시알산 축적병(ISSD), 청소년 헥소사미니다제 A 결핍, 크라베병, 리소좀 산 리파제 결핍, 이염성 백질디스트로피, 헐러 증후군, 샤이에 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 산필리포 증후군, 모르퀴오 타입 A 및 B, 마로토-라미, Sly 증후군, 점액지질증, 복합 설페이트 결핍, 신경 세로이드 리포푸신증, CLN6 질환, 얀스키-빌쇼스키병, 폼페병, 피크노디소스토시스, 샌드호프병, 쉰들러병, 및 월만병으로부터 선택되는 방법.
- 제121항에 있어서, 감염이 박테리아 감염, 진균 감염, 또는 바이러스 감염인 방법.
- 제121항 또는 제122항에 있어서, 감염이 바이러스 감염이고; 바이러스 감염이 코로나바이러스(예를 들어, MERS, SARS), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 유두종바이러스, 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3, 뎅기 바이러스 혈청형 4, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 마야로 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 또는 니파 바이러스에 의한 것인 방법.
- 제122항 또는 제123항에 있어서, 바이러스 감염이 SARS-CoV-2에 의한 것인 방법.
- 제120항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 벡터, 세포, 및/또는 약학적 조성물이 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 정맥내, 경막외, 척수내, 흉골내, 관절내, 윤활막내, 경막내, 종양내, 동맥내, 심장내, 근육내, 비강내, 폐내, 피부 이식편, 또는 경구 투여를 통해 대상체에게 투여되는 방법.
- 제120항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가 또는 동종이계인 방법.
- 세포에서 단백질의 수준 및/또는 활성을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터, 제67항 또는 제68항의 바이러스 벡터, 및/또는 제112항의 약학적 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 방법.
- 제127항에 있어서, 수준 및/또는 활성이 증가되는 방법.
- 제128항에 있어서, 수준 및/또는 활성이 감소되거나 제거되는 방법.
- 생물학적 제제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) (i) 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터를 포함하는 세포, (ii) 제67항 또는 제68항의 바이러스 벡터를 포함하는 세포, 또는 (iii) 제69항 내지 제111항 중 어느 한 항의 세포를 배양하고; 발현된 생물학적 제제를 회수하는 단계; 또는
(b) 제115항 또는 제116항의 트랜스제닉 유기체로부터 발현된 생물학적 제제를 회수하는 단계를 포함하는, 방법. - 제130항에 있어서, 생물학적 제제가 항원-결합 단백질인 방법.
- 제130항 또는 제131항에 있어서, 생물학적 제제가 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 선택적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체, Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 절반 항체-scFv, 탠덤 scFv, Fab/scFv-Fc, 탠덤 Fab', 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), Fab/scFv-Fc, scFv-Fc, 이종이량체 IgG(CrossMab), DART, 및 디아바디로부터 선택되는 방법.
- 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제가 TNFα, CD20, 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6, BLyS, APRIL, IFN-감마 등), Her2, RANKL, IL-6R, GM-CSF, 또는 CCR5에 특이적으로 결합하는 방법.
- 제130항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제가 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 아나킨라, 리툭시맙, 아바타셉트, 토실리주맙, 나탈리주맙, 카나키누맙, 아타시셉트, 벨리무맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 폰톨리주맙, 트라스투주맙, 데노수맙, 사릴루맙, 렌질루맙, 김실루맙, 실툭시맙, 레론리맙, 및 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 방법.
- 제130항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제가 치료 단백질이고, 선택적으로 치료 단백질이 인슐린인 방법.
- 바이러스 벡터(예를 들어, 유전자 요법 또는 백신)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
(1) (i) 적어도 하나의 기능성 바이러스 복제 기점(예를 들어, 적어도 하나의 ITR 뉴클레오티드 서열)을 포함하고,
선택적으로 표적 세포에서의 발현을 위해 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 추가로 포함하는 핵산 서열,
(ii) 숙주 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된, 하나 이상의 바이러스 구조적 단백질(예를 들어, 캡시드 단백질, 예를 들어 gag, VP1, VP2, VP3, 이들의 변이체)을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 핵산 서열, 및
(iii) 숙주 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 복제 단백질(예를 들어, Rep, pol)을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 핵산 서열로서,
선택적으로, 적어도 하나의 복제 단백질이 (a) 숙주 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된, 기능성 복제 단백질을 인코딩하는 Rep52 또는 Rep40 코딩 서열 또는 이의 단편, 및/또는 b) 숙주 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 Rep78 또는 Rep68 코딩 서열을 포함하는, 핵산 서열을 포함하는
숙주 세포를 제공하는 단계로서,
여기서 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 하나는 숙주 세포 게놈에서 표 3으로부터 선택된 적어도 하나의 GSH에 안정적으로 통합되고, 적어도 하나의 벡터는, 존재하는 경우, 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되지 않은 (i), (ii), 및 (iii)의 나머지를 포함하는, 단계; 및
(2) 재조합 바이러스 벡터가 생산되도록 하는 조건 하에 숙주 세포를 유지시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제136항에 있어서, (ii) 또는 (iii)이 GSH에 통합되는 방법.
- 제136항에 있어서, (ii) 및 (iii)이 GSH에 통합되는 방법.
- 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 기능성 바이러스 복제 기점(예를 들어, 적어도 하나의 ITR 뉴클레오티드 서열)이
(a) 디펜도파보바이러스 ITR, 및/또는
(b) AAV ITR, 선택적으로 AAV2 ITR을 포함하는 방법. - 제136항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포에서의 발현을 위한 적어도 하나의 발현 제어 서열이
(a) 프로모터, 및/또는
(b) Kozak-유사 발현 제어 서열을 포함하는 방법. - 제140항에 있어서, 프로모터가
(a) 동물 DNA 바이러스의 즉시 초기 프로모터,
(b) 곤충 바이러스의 즉시 초기 프로모터,
(c) 곤충 세포 프로모터, 또는
(d) 유도성 프로모터를 포함하는 방법. - 제141항에 있어서, 동물 DNA 바이러스가 사이토메갈로바이러스(CMV), 디펜도파보바이러스, 또는 AAV인 방법.
- 제141항에 있어서, 곤충 바이러스가 나비목 바이러스 또는 배큘로바이러스이고, 선택적으로 배큘로바이러스가 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV)인 방법.
- 제140항 또는 제141항에 있어서, 프로모터가 다면체(polh) 또는 즉시 초기 1 유전자(IE-1) 프로모터인 방법.
- 제140항 또는 제141항에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터인 방법.
- 제145항에 있어서, 유도성 프로모터가 소분자, 대사산물, 올리고뉴클레오티드, 리보스위치, 펩티드, 펩티드모방체, 호르몬, 호르몬 유사체, 및 광으로부터 선택된 제제에 의해 조절되는 방법.
- 제146항에 있어서, 제제가 테트라사이클린, 큐메이트, 타목시펜, 에스트로겐, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 라파마이신, FKCsA, 청색광, 앱시스산(ABA), 및 리보스위치로부터 선택되는 방법.
- 제136항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 바이러스 복제 단백질이 AAV 복제 단백질, 선택적으로 Rep52 및/또는 Rep78 단백질이고/거나;
(b) 바이러스 구조적 단백질이 AAV 캡시드 단백질인 방법. - 제148항에 있어서, AAV가 AAV2인 방법.
- 제136항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 제67항 또는 제68항의 바이러스 벡터를 제조하는 방법.
- 제136항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포 또는 곤충 세포인 방법.
- 제151항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포이고; 포유동물 세포가 인간 세포 또는 설치류 세포인 방법.
- 제151항 또는 제152항에 있어서, 포유동물 세포가 HEK293, HEK293T, HeLa, 및 A549로부터 선택되는 방법.
- 제151항에 있어서, 숙주 세포가 곤충 세포이고; 곤충 세포가 나비목 종으로부터 유래되는 방법.
- 제154항에 있어서, 나비목의 종이 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리토랄리스, 스포돕테라 엑시구아 또는 트리코플루시아 니인 방법.
- 제151항, 제154항, 및 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 Sf9인 방법.
- 제136항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노 바이러스-유래 벡터(예를 들어, AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스-유래 벡터(예를 들어, 렌티바이러스), 헤르페스 바이러스-유래 벡터, 및 알파바이러스-유래 벡터(예를 들어, 셈리키 삼림 바이러스(SFV) 벡터)로부터 선택되는 방법.
- 제30항 내지 제66항 중 어느 한 항의 핵산 벡터, 제67항 또는 제68항의 바이러스 벡터, 제69항 내지 제111항 중 어느 한 항의 세포, 및/또는 제112항의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
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