KR20240021783A - 벡터 및 니코틴 작용제 병용 요법 - Google Patents

벡터 및 니코틴 작용제 병용 요법 Download PDF

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제프리 앨런 나우
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Abstract

안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애의 치료를 위한 치료제의 생체이용률 및/또는 효능을 증가시키는 방법이 제공된다. 특히, 전기 자극, 초음파 자극 및/또는 nAChRα7 작용제(예를 들어, 바레니클린, (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘, 5-{(E)-2-[(3R)-피롤리딘-3-일]비닐}피리미딘, 또는 (R,E)-5-((2-피롤리딘-3-일)비닐)피리미딘)과 같은 약물의 투여는 눈물 생성이 증가시킨다. 제공되는 일차 치료제는 치료 유전자 산물(예를 들어, 생물학적 약물)을 발현하는 재조합 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 관련 조성물의 사용 방법 또한 제공된다.

Description

벡터 및 니코틴 작용제 병용 요법
관련 출원
본 출원은 2021년 5월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/185,897호의 이익을 주장한다. 이의 전체 내용은 본 참조문헌으로 본원에 포함된다.
서열 목록의 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록울 포함하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다. 2022년 4월 29일자로 생성된 전술한 ASCII 사본은, OYST_016_02WO_SeqList_ST25로 명명되며, 그 크기는 72,423 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 대체적으로 안구 표면 및 각막 장애의 의학적 치료, 특히 눈물 생성을 증가시키는 제제의 병용 투여에 의한 치료 개선에 관한 것이다.
안구건조증; 세균성, 진균성 및 바이러스성 각막염; 신경 영양성 각막병증, 안검염, 쇼그렌 증후군; 알레르기성, 버널성, 바이러스성 및 세균성 결막염; 녹내장; 각막 신생혈관 형성; 익상편; 각막 이영양증(원추 각막, Fuch 이영양증(Fuch's dystrophy), 격자 이영양증(lattice dystrophy) 및 지도-점-지문 이영양증(map-dot-fingerprint dystrophy)) 및 다른 안구 표면 및 각막 장애의 의학적 치료가 알려져 있다. 또한, 녹내장, 노안, 근시 및 다른 전방(anterior chamber) 질환의 의학적 치료가 알려져 있다. 이러한 의학적 치료는 국소 점안액, 소분자 약물, 생물학적 약물 등을 포함한다.
눈 장애의 치료를 위해 사용되는 치료제는 다음을 포함한다: 시클로스포린(RESTASIS, ZYCLORIN 또는 CYCLOKAT으로 시판됨); 리피테그라스트(XIIDRA); 면역조절제(보클로스포린, 타크로리무스, 피메크로리무스); 야누스 키나아제(JAK) 3 억제제(타소티닙); 분비촉진제 또는 점막보호제(디쿠아포솔, 레바미피드, 에카베트); 이당류 보호제(트레할로스); 비스테로이드성 항염증제(브롬페낙); 스테로이드(덱사메타손, EGP-437, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 플루오로메톨론 및 로테프레드놀 함유 제제); 스테로이드 절감 약물(미코페놀레이트, 아자티오프린, 시클로포스파미드); 지방산(오메가-3 지방산, 레졸빈 E1); 광범위한 항균제(플루오로퀴놀론), 항바이러스제 또는 항진균제; 항생제(테트라시클린 및 이의 유도체(독시시클린), 마크로라이드 항생제(아지스로마이신); 자가혈청; 합성 윤활제; 국소 비타민 A; 비만세포 안정제(예를 들어, 네도크로밀, 로독사미드), 항히스타민제(예를 들어, 에메다스틴, 로라티딘, 클로르페나민), 또는 비만세포 안정제/항히스타민 복합제(예를 들어, 올로파타딘); 윤활제(히알루로네이트, 카르멜로스, 히프로멜로스, 폴리비닐 알코올, 파라핀 또는 지질 또는 삼투압 방지제(예를 들어, 글리세린 및 L-카르니틴), N-아세틸시스테인을 함유한 윤활제); 연화제(바셀린, 미네랄 오일, 라놀린, 피마자유)를 함유한 연고. 또한, 녹내장과 같은 전방 질환은 프로스타글란딘 유사체, 베타 차단제, 알파 작용제, 탄산탈수효소 억제제, 및 로(rho) 키나아제 억제제로 치료된다.
원칙적으로는, 바이러스 벡터와 같은 벡터를 이용하여 눈에 치료제를 전달하는 것이 가능하다. 백신, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터는 눈물샘 세포 및/또는 눈물샘 조직의 일차 배양물을 형질도입하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, Rocha 등, IOVS 52:9567-72 (2011); Nominato 등, IOVS 59:6036-44 (2018)).
안구 표면 장애 및 전방 장애의 의학적 치료의 개선이 바람직할 것이다.
본 개시는 대상체에서 눈물 생성을 증가시킴으로써 안구 표면 및 각막 장애의 의학적 치료를 개선하기 위한 병용 요법 및 방법을 제공한다. 하나 이상의 일차 치료제의 생체이용률 및/또는 효능은 전기 자극, 초음파 자극 및/또는 약물의 투여에 의해 눈물 생성이 증가되는 경우 개선될 수 있다. 예를 들어, 일차 치료제의 안구 표면으로의 전달량, 분포 및/또는 속도가 개선될 수 있다. 증가된 눈물 생성은 눈에 인접한 조직에서 재조합적으로 발현되는 단백질(들), 항체 또는 단편 항체(예를 들어, Fab) 또는 핵산과 같은 유전자 산물(들)의 눈으로의 전달을 개선하는 데 특히 효과적이다.
따라서, 본 개시는 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계에 의해 일차 치료제의 생체이용률을 증가시키는 방법을 제공한다. 눈물 생성을 증가시키는 치료로는 전기 자극, 초음파 자극, 소분자 약물, 생물학적 약물 등이 있으나 이에 국한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 소분자 약물은 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) 작용제이다.
다양한 일차 치료제, 및 일차 치료제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터가 본 개시의 방법에 사용될 수 있다. 일차 치료제는 제한 없이, 소분자 약물 또는 생물학적 약물(예를 들어, 단백질 또는 핵산)일 수 있다.
본 개시는 바이러스 벡터(예를 들어, 백신, 아데노바이러스 또는 아데노 연관 바이러스) 및 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제를 투여하는 단계에 의해 대상체의 눈의 눈물막에 유전자 생성물을 전달하는 방법을 추가로 제공한다. 바이러스 벡터는 대상체에 주사하거나 대상체의 눈 근처(예를 들어 눈물샘)에 대한 국소 투여에 적합한 조성물로 제공된다. 바이러스 벡터의 이러한 구성은 눈물샘에 직접 주입될 수 있다. 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제는 유효량으로 국소 비강 투여를 통해 투여된다. 바이러스 벡터는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. nAChR 작용제는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 제공될 수 있다.
다양한 구현예에서, 유전자 산물은 치료 단백질, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, Fab), 또는 수용체 미끼(예를 들어, 가용성 수용체 또는 "트랩" 분자)이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF), 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF), RNase(예를 들어, 란피라나제), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 시알산 결합 Ig-유사 렉틴 8(SIGLEC-8), 종양 괴사 인자(TNF-α), 표피 성장 인자(EGF), 인터루킨-1(IL-1) 또는 인터루킨-2(IL-2), 및 인터루킨-6(IL-6)이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 항체 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 IgE에 대한 수용체 미끼(receptor decoy)이다.
바이러스 벡터로서 아데노 연관 바이러스(AAV)를 사용하는 구현예에서, AAV는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 9(AAV9)일 수 있다. 표적 조직(예를 들어, 눈물샘)을 효과적으로 형질도입하는 혈청형과 같은 다양한 다른 혈청형 또는 이의 하이브리드가 사용될 수 있다.
바이러스 벡터는 다양한 농도, 예컨대 밀리리터당 약 1 × 107 게놈 카피(GC/mL), 약 5 × 107 GC/mL, 약 1 × 108 GC/mL, 약 5 × 108 GC/mL, 약 1 × 109 GC/mL, 약 5 × 109 GC/mL, 약 1 × 1010 GC/mL, 약 5 × 1010 GC/mL, 약 1 × 1011 GC/mL, 약 5 × 1011 GC/mL, 약 1 × 1012 GC/mL, 약 5 × 1012 GC/mL, 6.2 × 1012 GC/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)로 제공될 수 있다. 약 100 μL의 조성물이 투여될 수 있거나 다른 용량이 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, nAChR 작용제는 바레니클린(varenicline) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염(예를 들어, 타르타르산염, 염)이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 심파니클린으로도 알려진 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘, 5-{(E)-2-[(3R)-피롤리딘-3-일]비닐}피리미딘, 또는 (R,E)-5-((2-피롤리딘-3-일)비닐)피리미딘, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염(예를 들어, 헤미-갈락타레이트 또는 모노-시트레이트 염)이다. nAChR 작용제의 국소 비강 투여는 비강내 스프레이 또는 다른 적합한 경로를 통해 이루어질 수 있다.
유리하게는, 방법은, 바이러스 벡터 단독 투여와 비교하여 치료제 투여 후 사전 결정된 시간 내에, 눈물막에서의 유전자 산물의 발현; 대상체의 눈 각막 상 또는 각막에서의 유전자 산물의 발현; 및/또는 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래한다. 사전 결정된 시간은 약 5분, 약 1시간, 약 1일, 약 1주, 또는 대조군(예를 들어, 바이러스 벡터 단독)과 비교하여 눈물막으로의 유전자 산물 전달의 증가된 양 또는 전달 속도를 검출하는 데 적합한 임의의 기간일 수 있다.
본 개시는 대상체 눈의 안구 표면에 유전자 산물을 전달하는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법의 변형 및 구현예에는 유전자 산물을 눈물막에 전달하기 위해 전술한 것들이 포함된다. 유리하게는, 방법은, 바이러스 벡터 단독 투여와 비교하여 사전 결정된 시간(예를 들어, 약 5분, 약 1시간, 약 1일, 또는 약 1주) 내에, 안구 표면 상에서의 유전자 산물의 발현; 및/또는 안구 표면으로 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 사용하기 위한 바이러스 벡터, 약학적 제형, 키트 및 조성물이 추가로 제공된다.
본 개시의 추가적인 구현예, 특징부 및 장점은 다음의 상세한 설명과 본 개시의 실시예를 통해 명백해질 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 일차 치료제의 유효량을 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 포함한다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 바레니클린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 국소 비강 투여는 비강내 스프레이를 통해 이루어진다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제는 눈물샘 중 하나 또는 둘 모두 내로의 눈물샘 내 주사 또는 국소 투여를 통해 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후 7일차로부터 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 전방 사골 신경의 효과적인 전기 자극이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘, 눈물관, 각막, 각막 상피, 윤부 줄기 세포, 결막, 눈물점 및 눈물 소관 중 하나 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 각막이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 눈물막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 각막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 5분이다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 1시간이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 일차 치료제는 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 치료 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF)이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 약 50 μL 내지 약 100 μL의 조성물이 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서의 유전자 산물의 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 눈의 각막에서의 유전자 산물의 발현을 초래한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 5분이다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 1시간이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애는 신경영양성 각막염, 안구 표면의 화학적 화상, 각막 상처, 각막 궤양, 지속적인 상피 결함, 안구 건조증, 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염, 삼차 신경 및/또는 눈의 수두 대상포진 바이러스 감염, 또는 각막 신경의 당뇨병 합병증이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 적어도 한쪽 눈의 안구 표면에 유전자 산물을 전달하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계; 및
b. 국소 비강 투여를 통해 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 유전자 산물은 치료 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF)이다
본원에 기술된 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 약 50 μL 내지 약 100 μL이 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후 7일차로부터 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서의 유전자 산물의 발현을 초래한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 눈의 각막에서의 유전자 산물의 발현을 초래한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 5분이다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 1시간이다. 일부 구현예에서, 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 안구 표면에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 5분이다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 1시간이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 국소 비강 투여를 통해 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 눈물샘 내 주사를 통해 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애는 신경영양성 각막염, 안구 표면의 화학적 화상, 각막 상처, 각막 궤양, 지속적인 상피 결함, 안구 건조증, 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염, 삼차 신경 및/또는 눈의 수두 대상포진 바이러스 감염, 또는 각막 신경의 당뇨병 합병증이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료를 제공하며, 방법은:
a. 상기 일차 치료제의 유효량을 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 해당 용도를 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 제공하며, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 포함한다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 포함하되, 일차 치료제는 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 안구 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 키트를 제공하며, 키트는:
(a) 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물; 및
(b) 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제를 포함하는 제2 조성물을 포함하며,
이를 필요로 하는 대상체에서 본원에 기술된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 지침을 포함한다.
도 1a는 인간 대상체의 눈물샘에 바이러스 벡터를 전달하는 예를 도시한다.
도 1b는 인간 대상체의 눈물샘에 바이러스 벡터를 전달하는 예를 도시한다.
도 2는 눈물샘 세포가 발현된 단백질을 눈물막으로 분비하고, 신경 자극제의 비강 투여에 의한 부교감 신경 경로의 자극을 통해 눈물 유도를 하는 눈물샘 생리학을 도시한다.
도 3은 대상체가 증상의 심각도를 기록하기 위해 안구 건조증 검사에 사용되는 시각적 아날로그 척도의 예를 나타낸다.
도 4는 NEI/Industry Workshop 척도에 기초한 각막 표면의 분할에 대한 등급 도면을 나타낸다.
도 5a는 조절 요소 및 인간 신경 성장 인자(hNGF) 전이유전자를 포함하는 재조합 AAV(rAAV) 발현 카세트를 암호화하는 예시적인 벡터를 나타낸다.
도 5b는 조절 요소 및 인간 신경교세포-유래 신경영양인자(hGDNF) 전이유전자를 포함하는 재조합 AAV 발현 카세트를 암호화하는 예시적인 벡터를 나타낸다.
도 6a-6k는 항-eGFP 항체로 염색된 눈물샘 조직의 이미지이다. 눈물샘내 주사로 eGFP 전이유전자가 있는 발현 카세트를 함유하는 rAAV 비리온을 눈물샘에 투여하였다. 눈물샘 조직을 항-eGFP 항체로 염색하여 Egfp 발현을 평가하였다. 흑색 화살표는 eGFP 발현을 나타내는 염색을 나타낸다.
도 7a-7e는 항-hNGF 항체로 염색된 눈물샘 조직의 이미지이다. 눈물샘내 주사로 hNGF 전이유전자가 있는 발현 카세트를 전달하도록 조작된 rAAV 비리온(AAV9 혈청형)을 눈물샘에 투여하였다. 눈물샘 조직을 항-hNGF 항체로 염색하여 hNGF 발현을 평가하였다. 흑색 화살표는 hNGF 발현을 나타내는 염색을 나타낸다.
도 8은 AAV.hNGF 및 바레니클린으로 치료된 동물의 눈물막 내 hNGF의 농도를 나타내는 도표이다. AAV2.hNGF, AAV5.hNGF 또는 AAV9.hNGF의 눈물샘내 투여 후 지정된 일차에 더치-벨트 토끼로부터 눈물막을 수집하기 위해 쉬르머(Schirmer) 눈물 스트립을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 21일, 28일, 41일차에 눈물 유도제인 바레니클린을 비강내 투여한 후 눈물막을 채취하였다. 대조군 동물에게는 AAV 주사를 투여하지 않았다.
도 9는 역말단 반복(ITR), CAG 프로모터, 및 신경 성장 인자(NGF) 전이유전자 폴리뉴클레오티드 요소를 갖는 서열번호 25의 rAAV 발현 카세트를 함유하는 예시적인 플라스미드를 나타낸다.
도 10a-10c는 돼지 눈물막 중 hNFGβ의 농도(pg/mL)를 나타내는 플롯이다. 인간 신경 성장 인자를 암호화하는 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV)(AAV-hNGFβ)로 형질도입한 후 7일, 14일, 21일, 28일, 35일차에 돼지의 왼쪽 눈(n=4)에서 눈물을 채취하였다. AAV2-hNGFβ(도 10a) 및 AAV5-hNGFβ(도 10b)는 형질도입 후 7일차 MSD 분석의 표준 곡선 범위 내에서 검출 가능한 수준의 hNGFβ를 가졌다. AAV9-hNGFβ(도 10c)는 형질도입 후 7일차 MSD 분석의 상한치에 대해 정량 수준 초과의 hNGFβ의 눈물 수준을 가졌다.
도 11은 AAV 플라스미드의 ITR 사이의 요소를 도시하는 개략도를 나타낸다. 플라스미드는 CMV 프로모터의 조절 하에 이의 N-말단에서 분비 신호에 연결된 EGFP("secEGFP")를 암호화한다. 우드척 간염 바이러스 번역 후 조절 요소(WPRE)는 전이유전자 발현을 증가시키는 역할을 하며 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(pA) 신호에 근접한다.
도 12는 AAV-secEGFP(AAV2 또는 AAV9 혈청형)를 주입받고 103일차에 수확하여 파라핀에 고정시킨 돼지 눈물샘의 이미지를 제공한다. 5 μM 섹션의 IHC는 항-GFP 항체 및 DAPI(핵) 대조염색을 사용하여 수행되었다. 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 100X 배율로 캡처되었다. 음성 대조군 동물에게는 주사를 투여하지 않았다.
도 13은 AAV9-secEGFP를 주입받고 103일차에 수확하여 파라핀에 고정시킨 돼지 눈물샘의 이미지를 제공한다. 5 μM 섹션의 IHC는 항-GFP 항체 및 DAPI(핵) 대조염색을 사용하여 수행되었다. 눈물샘 선상 세포 외에도, 연성 상피 세포는 AAV9에 의해 전달되는 것으로 보인다(백색 화살표).
도 14는 AAV를 주입받고 103일차에 수확하여 파라핀에 고정시킨 돼지 눈물샘의 이미지를 제공한다. 100x에서의 5 μM 파라핀 섹션의 H&E 염색은 염증성 침윤, 거대 또는 미세 이상을 나타내지 않는다.
본 발명자들은 대상체의 눈물 생성 증가가 안구 표면 장애 또는 전방 장애, 예컨대 제한 없이, 안구건조증; 세균성, 진균성 및 바이러스성 각막염; 신경 영양성 각막염, 안검염, 쇼그렌 증후군; 알레르기성, 바이러스성, 및 세균성 결막염; 녹내장; 각막 신생혈관 형성; 익상편; 각막 이영양증(원추 각막, Fuch 이영양증, 격자 이영양증 및 지도-점-지문 이영양증) 및 다른 안구 표면 및 각막 장애의 치료에 사용되는 다양한 제제를 사용한 의학적 치료를 개선한다는 것을 인식하였다. 또한, 발명자들은 눈 주변 조직에서 단백질(들) 및/또는 핵산(들)과 같은 유전자 산물(들)을 재조합적으로 발현하는 것이 가능하고, 눈물 생성을 자극함으로써 주변 조직으로부터 눈으로 유전자 산물(들)을 전달하는 것이 개선될 수 있다는 것을 인식하였다.
눈의 의학적 치료는 소분자 및 생물학적 약물(본 명세서에서는 눈물 생성을 자극하는 제제와 구별하기 위해 "치료제" 또는 "일차 치료제"로 지칭함)을 포함하는 새로운 치료제의 개발에 의해 지속적으로 개선되고 있다. 이전에는 안구건조증, 각막염 등의 질환이 눈을 촉촉하게 해주는 인공 눈물(국소 안약)로만 치료가 가능했지만, 현재는 안구 표면 질환이나 전방 질환에 대한 다양한 의학적 치료법이 개발되고 있다.
본원에 기술된 일차 치료제, 또는 다른 것들은 본 개시의 구현예에서, 예를 들어, 안구건조증; 세균성, 진균성 및 바이러스성 각막염; 신경 영양성 각막염, 안검염, 쇼그렌 증후군; 알레르기성, 바이러스성, 및 세균성 결막염; 녹내장; 각막 신생혈관 형성; 익상편; 각막 이영양증(원추 각막, Fuch 이영양증, 격자 이영양증, 각막 미란 증후군, 및 지도-점-지문 이영양증) 및 다른 안구 표면 및 각막 장애의 치료에 사용된다.
본 개시는 대상체에서 눈물 생성을 증가시킴으로써 안구 표면 장애 또는 전방 장애의 의학적 치료를 개선하기 위한 병용 요법 및 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 "대상체"는 마우스, 토끼, 비인간 영장류(NHP), 및 인간을 포함하는 임의의 포유류를 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 또는 NHP이다. 또한 "개체" 또는 "환자"는 "대상체"와 같은 의미로 사용될 수 있다. 하나 이상의 일차 치료제의 생체이용률 및/또는 효능은 눈물 생성이 전기 자극, 초음파 자극 및/또는 약물의 투여에 의해 증가하는 경우, 개선된다. 본원에서 사용되는 용어 "생체이용률"은 (예를 들어, 눈물막에서) 안구 표면으로의 전달량, 분포 및/또는 속도, 즉, 대상체의 질환 산태에 대한 효과와 무관한 제제의 약동학적 특성을 의미한다. 예를 들어, 일차 치료제의 전달 양, 분포 및/또는 속도가 개선될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "양"은 절대량(예를 들어, 단백질 또는 rAAV 입자의 절대량) 또는 농도(예를 들어, 용액 내 단백질의 농도)를 의미하며, 주어진 경우에 언급된 양이 절대량, 농도, 또는 둘 모두를 지칭하는지의 여부는 본원에 제공된 문맥에 기초하여 숙련된 기술자에게는 명확할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "효능"은 대상체에서의 질환 상태에 대한 관찰된 효과를 의미한다. 예를 들어, 안구건조증 치료의 효능은 하나 이상의 안구건조증 증상의 감소를 의미한다. 증가된 눈물 생성은 눈에 인접한 조직에서 재조합적으로 발현되는 단백질(들) 또는 핵산과 같은 유전자 산물(들)의 눈으로의 전달을 개선하는 데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시는 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계에 의해 일차 치료제의 생체이용률 및/또는 효능을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 전기 자극이다.
본원에서 사용되는 "투여하다", "투여하는", "투여" 등은 약리학적으로 유용한 방식으로 (예를 들어, 대상체의 질병, 장애 또는 병태를 치료하기 위해) 본원에 기술된 물질을 대상체에게 제공하는 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 유전자 산물의 발현을 위해 바이러스 벡터(예를 들어, 백신, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스)를 투여하는 단계에 의해 대상체의 눈의 눈물막에 유전자 산물을 전달하는 방법, 및 눈물 생성을 증가시키고 이에 따라 유전자 산물의 생체이용률 및/또는 효능을 증가시키는 치료를 제공한다.
눈물 생성을 증가시키는 치료
전기 자극
눈물 생성을 증가시키는 하나의 치료는 전기 자극이다. 예를 들어, 전방 사골 신경의 전기 자극은 수성 눈물 부피를 증가시키고, 눈물 삼투압을 감소시키고, 지질을 추가하고, 정상 눈물 단백질의 농도를 증가시킬 수 있다. 전방 사골 신경은 비강 점막 아래에 이식된 신경 자극기를 사용하거나 https://media.allergan.com에서 제공하는 Professional Information Guide에 따라 사용되는 TrueTear® 비강 내 눈물 신경 자극기와 같은 비강 내 자극기를 사용하여 자극될 수 있다. 비강 자극기는 비강 골대로부터 최대 약 28mm 깊이에서 코 안쪽에 접촉한 다음 전기 자극을 제공하도록 트리거될 수 있다. 예시적인 자극 방법은 Brinton 등, Investigative Ophthalmology & Visual Science(이하, IOVS) 58(4):2341-38에 제공된다.
진동 자극
일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 진동 에너지이다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 iTEAR®(100)를 사용하여 활성화되는 진동 에너지이다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 진동성 자극이다. 일부 구현예에서, 진동 에너지 또는 진동성 자극은 외부 비강 신경을 활성화시켜 눈물 생성을 증가시킨다.
초음파 자극
눈물 생성을 증가시키는 또 다른 치료는 초음파 자극이다. 예를 들어, 음파는 환자의 눈의 눈꺼풀에 또는 눈꺼풀을 통해 눈의 다른 구조에 또는 안면 부위의 구조를 통해 안전하게 인가되어 눈물 생성을 자극할 수 있다(예를 들어, US2018/0104514에 기술?? 바와 같음). 일부 구현예에서, 초음파는, 예를 들어, 눈물샘에 바이러스 또는 비-바이러스성 벡터를 투여한 후, 눈 내의 눈물샘에 의한 눈물샘 생성을 자극하기 위해 사용된다. 예를 들어, 약 100 Hz-300 Hz의 직접적인 피부 진동에 노출되는 경우, 진동으로 인해 한쪽 면만 자극될 때, 양측에 눈물이 형성된다.
일부 구현예에서, 초음파 자극은 안구건조증 질환을 치료하기 위해 개발된 iTear 시스템(Olympic Ophthalmics)과 같은 신경조절 장치로 투여된다.
눈물-자극 약물
눈물 생성을 증가시키는 또 다른 치료는 눈물 자극 약물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다. 본원에서 사용되는 용어 "눈물 생성을 증가시키는 치료"는 인공 눈물(국소 점안액이라고도 함)을 배제하고, 대상체의 눈물샘에 의한 눈물 생성을 증가시키는 치료만을 지칭한다.
눈물 자극 약물에는 콜린제(필로카르핀, 세비멜린) 뿐만 아니라 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제가 포함된다.
니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제
본 개시의 방법에 사용하기에 적합한 추가의 예시적인 눈물-자극 약물은 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. nAChR은 니코틴과 아세틸콜린(양성자 형태의 니코틴과 유사)에 대해 높은 친화력과 선택성을 가지며 알파 및 베타 하위유닛의 조합으로 구성된 펜타메릭 리간드-관문 이온 채널의 일 부류이다. nAChR 하위유형의 예는 알파3베타4, 알파4베타2, 알파3알파5베타4 및 알파4알파6베타2가 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 비강 반사를 유발하는 데 관여하는 중요한 nAChR 수용체 하위유형은 비강 점막의 삼차 신경 말단 상에 위치한 알파4베타2 서브유형이다.
nAChR 작용제의 투여는 수용체를 둔감하게 만들 수 있다. 수용체 탈감작(receptor desensitization)은 보다 높은 작용제 농도에서도 작용제에 대한 반응을 감소시켜 치료의 효능을 더욱 감소시킨다. 예를 들어, 작용제에 대한 nAChR 수용체의 단기적인 둔감화는 작용제의 투여 후 24시간 동안 발생할 수 있다. 수용체 둔감화의 잠재성은 작용제에 대한 효과적인 반응을 보존하기 위해 일정 기간 동안 투여 빈도를 잠재적으로 제한할 수 있다.
nAChR 작용제는 아세틸콜린(ACh)에 대한 해당 수용체에서의 반응과 비교하여 반응을 생성하기 위해 주어진 수용체를 활성화시키는 능력에 의해 결정되는 전체 또는 부분 작용제로 특성화될 수 있다. 대체적으로, nAChR 작용제는 ACh와 같거나 더 큰 주어진 수용체에 결합할 때 반응을 유발하는 경우 완전 작용제이다. nAChR 작용제는 ACh에서 생성된 반응에 비해 수용체에 결합할 때 더 낮은 반응을 유발하는 경우 부분 작용제이다.
수용체 활성화가 결정될 수 있는 nAChR 작용제 반응은, 예를 들어, 적절한 세포 기반 분석을 사용하여 생성될 수 있다. 특정 nAChR 수용체 하위유형을 발현하고 nAChR 작용제에 결합되고 활성화될 때 전류 반응을 생성하도록 설계된 세포는 화합물의 작용제 프로파일 및 이렇게 결정된 수용체 활성화량을 특성화하는 데 사용할 수 있다. 일반 프로토콜의 예는 아래에 설명되어 있다.
특정 인간 nAChR 하위유형을 발현하는 세포는 먼저 ACh에 노출된다. ACh는 수용체와 결합하고 활성화하여 전류를 유발한다. ACh의 농도는 수용체의 최대 반응(예를 들어, 1280 마이크로몰 ACh)을 유도하도록 선택된다. 이 전류는 ACh 응답으로 기록되며, 100% nAChR 작용제 반응으로서 기능하며, 다른 nAChR 작용제에 대한 반응에 대한 비교 대상의 역할을 한다. 세척 후, 세포는 다양한 농도(예를 들어, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 및 300 마이크로몰)의 nAChR 작용제에 노출된다. nAChR 작용제에 노출되어 유발되는 전류는 각 nAChR 농도에 대해 측정되고 기록된다. 그런 다음, 해당 nAChR 작용제 반응 데이터는 최대 ACh 유발 전류에 대한 유니티로 정규화되고 nAChR 작용제 농도의 로그 함수로 표시된다. 이어서, nAChR 작용제 반응은 ACh 반응의 백분율로 계산된다.
일부 경우에, nAChR 작용제의 상대적 작용제 활성을 측정하는 방법은 ACh 반응이 1 또는 그 이상의 밀리몰 ACh 용액으로부터 유발되는 조건들을 포함한다.
동일한 수용체 유형에서 결정된 최대 ACh 반응과 같거나 더 큰 반응을 유발하는 nAChR 작용제는 완전 작용제이다. 일부 경우에, ACh 반응의 100% 미만의 반응을 유발하는 nAChR 작용제는 실험적 변동성을 고려하여 여전히 완전한 작용제로 특성화될 수 있다. 예를 들어, 검정 또는 측정 방법 간의 변동성과 통계적 오류가 반응 결과의 차이를 설명할 수 있다. 일부 경우, ACh 반응의 80% 내지 120%를 유발하는 nAChR 작용제가 완전 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 99% 이상을 유발하는 nAChR 작용제가 완전 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 95% 이상을 유발하는 nAChR 작용제가 완전 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 90% 이상을 유발하는 nAChR 작용제가 완전 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 85% 이상을 유발하는 nAChR 작용제가 완전 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 80% 이상을 유발하는 nAChR 작용제가 완전 작용제로 간주된다.
실험적 가변성을 고려 시, nAChR 작용제가 ACh 반응의 100% 미만을 유발하는 경우, 대체적으로 해당 작용제는 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 95% 미만을 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 90% 미만을 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 85% 미만을 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 80% 미만을 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다.
일부 경우, ACh 반응의 5% 내지 95%를 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 5% 내지 90%를 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 5% 내지 85%를 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 5% 내지 80%를 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다.
일부 경우, ACh 반응의 10% 내지 95%를 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 10% 내지 90%를 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 10% 내지 85%를 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 10% 내지 80%를 유발하는 nAChR 작용제가 부분 작용제로 간주된다.
상대적으로 높은 농도의 작용제에서 낮은 수준의 전기 활성을 생성하는 nAChR 작용제는 약한 부분 작용제로 기술될 수 있다. 일부 경우, ACh 반응의 30% 이하를 유발하는 nAChR 작용제가 약한 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 25% 이하를 유발하는 nAChR 작용제가 약한 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, ACh 반응의 20% 이하를 유발하는 nAChR 작용제가 약한 부분 작용제로 간주된다. 일부 경우, nAChR 작용제의 상대적으로 높은 농도는 적어도 100 마이크로몰이다. 일부 경우, nAChR 작용제의 상대적으로 높은 농도는 적어도 200 마이크로몰이다. 일부 경우, nAChR 작용제의 상대적으로 높은 농도는 적어도 300 마이크로몰 또는 초과이다. 예를 들어, 최대 Ach 유발 전류의 25%를 유발하는 300 마이크로몰 농도의 nAChR 작용제는 약한 부분 작용제로 간주된다.
일부 구현예에서, nAChR 작용제는 완전 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 부분 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 약한 부분 작용제이다.
일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 알파3베타4, 알파3알파5베타4, 알파4베타2, 및 알파4알파6베타2로부터 선택되는 nAChR 하위유형 중 적어도 하나의 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 알파3베타4, 알파3알파5베타4, 알파4베타2, 및 알파4알파6베타2로부터 선택되는 nAChR 하위유형 중 적어도 2개의 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 알파3베타4, 알파3알파5베타4, 알파4베타2, 및 알파4알파6베타2로부터 선택되는 nAChR 하위유형 중 적어도 3개의 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파3베타4의 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파3알파5베타4의 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파4베타2의 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파4알파6베타2의 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파7의 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파7의 작용제가 아니다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파7의 완전 작용제가 아니다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 전술한 하위유형의 완전 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 전술한 하위유형의 부분 작용제이다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 전술한 하위유형의 약한 부분 작용제이다.
용어 "알파7" 또는 "α7" nAChR은 동종채 알파7 하위유형을 지칭하며, 여기에서 nAChR의 오량체 하위유형은 전적으로 알파7 하위유형으로 구성된다. 따라서, nAChR 알파7과 결합하고 이를 활성화하는 nAChR 작용제는 nAChR 동종체 알파7 수용체와 결합하고 이를 활성화시키는 작용제이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 알파7 수용체 작용제가 아니다.
일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 알파3베타4, 알파3알파5베타4, 알파4베타2, 및 알파4알파6베타2로부터 선택되는 nAChR 하위유형 중 적어도 하나에 선택적으로 결합한다. 본원에서 사용되는 "선택적으로 결합한다" 또는 "~에 대해 선택적이다"는 화합물이 적어도 하나의 기준 nAChR 하위유형에 대한 해당 nAChR 하위유형에 대해 더 높은 친화성 및/또는 더 낮은 반-최대 유효 농도(EC50)를 갖는다는 것을 의미한다. 선택성은 EC50 값에서 적어도 5배의 친화도 차이, EC50 값에서 적어도 10배의 친화도 차이, EC50 값에서 적어도 20배의 친화도 차이, 또는 EC50 값에서 적어도 50배의 친화도 차이와 연관될 수 있다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파3베타4에 선택적으로 결합한다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파3알파5베타4에 선택적으로 결합한다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파4베타2에 선택적으로 결합한다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파4알파6베타2에 선택적으로 결합한다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파7에 선택적으로 결합한다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 nAChR 하위유형 알파7에 선택적으로 결합하지 않는다.
본 개시에서 고려되는 nAChR 작용제는 바레니클린, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 화합물 1, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 바레니클린이 아니다.
바레니클린은 nAChR 하위유형 알파7의 완전 작용제 및 알파3베타4, 알파4베타2, 알파6베타2, 알파3알파5베타4, 및 알파4알파6베타2 하위유형의 부분 작용제로 특징 지어진다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 바레니클린의 약학적으로 허용가능한 염은 바레니클린 타르타르산염을 포함한다. 바레니클린에 대한 추가적인 관련 정보는, 예를 들어, 미국 특허 제9,504,644호, 미국 특허 제9,504,645호, 미국 특허 제9,532,944호, 미국 특허 제9,597,284호, 및 미국 특허 제10,456,386호에서 찾을 수 있다.
본원에서 인용되는, 화합물 1은 다음의 구조를 지칭한다:
.
화합물 1의 대안적인 구조적 표현은 다음과 같다:
.
화합물 1은 또는 이의 화학적 명칭으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 화합물 1은 또한 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘, 또는 심파니클린, 5-{(E)-2-[(3R)-피롤리딘-3-일]비닐}피리미딘 및 (R,E)-5-((2-피롤리딘-3-일)비닐)피리미딘을 포함하는 이의 변이체로 지칭된다.
화합물 1은 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4 및 알파4알파6베타2의 완전 작용제이다. 화합물 1은 nAChR 하위유형 알파4베타2 및 알파3베타4의 완전 작용제이다.
화합물 1은 알파3베타2의 부분 작용제이다.
화합물 1은 알파7의 약한 부분 작용제이다. 일례에서, 화합물 1 시트레이트의 300 마이크로몰 농도는 최대 ACh-유발 전류의 25%만을 유발하였다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 화합물 1, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 화합물 1의 약학적으로 허용가능한 염은 갈락타레이트(예를 들어, 헤미-갈락타레이트 이수화물) 및 시트레이트(예를 들어, 모노시트레이트)를 포함한다. 화합물 1에 대한 특허 관련 정보는 미국 특허 제7,098,331호, 미국 특허 제7,714,001호, 미국 특허 제8,063,068호, 미국 특허 제8,067,443호, 미국 특허 제8,604,191호, 미국 특허 제9,145,396호, 미국 특허 제9,981,949호, 미국 특허 제8,633,222호 및 PCT 공개 WO2017/177024호에서 찾을 수 있다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘 헤미갈락타레이트 이수화물이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘 모노-시트레이트이다.
양성 알로스테릭 조절제
일부 구현예에서, nAChR 작용제는 양성 알로스테릭 조절제(PAM), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 투여된다. PAM은 nAChR 상의 알로스테릭 부위에 결합할 수 있고, 생리학적 리간드, 아세틸콜린(ACh), 또는 본원에 기술된 다른 nAChR 작용제의 존재 하에서 수용체의 활성을 양성적으로 알로스테릭화로 조절하고/하거나 알로스테릭 결합 부위를 통해 수용체의 작용제 또는 길항제로서 단독으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM은 nAChR의 작용제 및/또는 길항제로서 단독으로 작용하지 않는다. 본원에 기술된 방법은, nAChR 작용제의 효능이 nAChR 작용제와 nAChR PAM을 결합시킴으로써 놀라울 정도로 개선될 수 있다는 것을 제공한다. 이러한 조합은 안구건조증, 안구 불편감 또는 눈물 생성 증가의 치료를 위한 nAChR 작용제의 효능을 개선하는 데 매우 효과적이며, 이는 nAChR 작용제 단독 투여와 비교했을 때 매우 효율적이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, PAM은 17-베타-에스트라디올, Br-PBTC, 이버멕틴, 갈란타민, 제니스테인, 5-하이드록시인돌, 4BP-TQS, A-86774, CCMI, 레바미솔, 모란텔, LY-2087101, 메카밀아민, 멘톨, NS206, NS1738, NS9283, PNU-120596, R05126946, TBS-345, dFBR, 및 HEPES, 또는 전술한 것 중 어느 하나의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 코드명에 의해 표현되는 화학명은 이하에서 인용되며, 이는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, PAM은 (R)-7-브로모-N-(피페리딘-3-일)벤조[b]티오펜-2-카르복사미드 (Br-PBTC) 또는 3-[3-(3-피리디닐)-1,2,4-옥사디아졸-5-일]벤조니트릴 (NS9283), 또는 전술한 어느 하나의 약학적으로 허용가능한 염이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, PAM은 (R)-7-브로모-N-(피페리딘-3-일)벤조[b]티오펜-2-카르복사미드 (Br-PBTC), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, PAM은 3-[3-(3-피리디닐)-1,2,4-옥사디아졸-5-일]벤조니트릴 (NS9283), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일차 치료제
다양한 구현예에서, 본 개시의 방법은 일차 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시의 방법은 눈에서의 분포가 확산 속도 또는 다른 생물리학적 파라미터에 의해 제한되는 일차 치료제와 함께 사용하기에 매우 적합하다. 이러한 일차 치료제는 입체 효과에 의해 확산이 제한될 수 있는 거대 분자(단백질 등)를 포함할 수 있다. 그러나, 저분자 약물의 생체이용률 및/또는 효능은, 특히 눈 내의 특정 조직 및/또는 분자에 결합하는 경우, 해당 저분자 약물의 분포를 지연시킬 때 개선될 수 있다. 다른 경우, 본 개시의 방법은 특정 분비샘(예를 들어, 눈물샘)에 전달되거나, 이식되거나, 또는 (예를 들어, 벡터로) 발현되는 일차 치료제의 방출을 증가시킨다. 따라서, 일차 치료제의 눈으로의 전달 및 안구 표면에 걸친 분포 둘 모두가 증가할 수 있다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 생물학적 약물이다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 소분자 약물이다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)이다. RNA는 리보자임, 간섭 RNA, 작은 헤어핀 RNA, 아고미르 및 안타고미르가 포함한다. DNA는 플라스미드 DNA 및 다른 형태의 DNA를 포함한다. 핵산은 네이키드 폴리뉴클레오티드로서 전달되거나 비-바이러스 벡터에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 핵산 벡터, 예컨대 비-바이러스 벡터(리포좀, 나노입자 등) 또는 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용되는 일차 치료제는 다음을 포함한다: 시클로스포린(RESTASIS, ZYCLORIN 또는 CYCLOKAT으로 시판됨); 리피테그라스트(XIIDRA); 면역조절제(보클로스포린, 타크로리무스, 피메크로리무스); 야누스 키나아제(JAK)3 억제제(타소티닙); 분비촉진제 또는 점막보호제(디쿠아포솔, 레바미피드, 에카베트); 이당류 보호제(트레할로스); 비스테로이드성 항염증제(브롬페낙); 스테로이드(덱사메타손, EGP-437, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 플루오로메톨론, 로트막스 및 로테프레드놀 함유 제제); 스테로이드 절감 약물(미코페놀레이트, 아자티오프린, 시클로포스파미드); 지방산(오메가-3 지방산, 레졸빈 E1); 광범위한 항균제(플루오로퀴놀론), 항바이러스제 또는 항진균제; 항생제(테트라시클린 및 이의 유도체(독시시클린), 마크로라이드 항생제(아지스로마이신); 자가혈청; 국소 비타민 A; 및 비만세포 안정제(예를 들어, 네도크로밀, 로독사미드), 항히스타민제(예를 들어, 에메다스틴, 로라티딘, 클로르페나민), 또는 비만세포 안정제/항히스타민 복합제(예를 들어, 올로파타딘).
일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용되는 일차 치료제는 프로스타글란딘 유사체, 베타 차단제, 알파 작용제, 탄산탈수효소 억제제 또는 로 키나제 억제제이다.
본 개시의 방법에 사용되는 다른 예시적인 치료제는 다음을 포함한다: 국소 알부민; 신경 성장 인자; 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1); 성장 인자(간세포 성장 인자, 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF)-베타); 피브로넥틴; 인터루킨-1(IL-1) 경로 억제제, 예를 들어 아나킨라 또는 EBI-005를 포함하지만 이에 국한되지 않는 전염증성 사이토카인 경로의 억제제; IL-6R 길항제와 같은 IL-6 경로 억제제; 에타네르셉트(Enbrel), 인플릭시맙(Remicade), 아달리무맙(Humira), 세르톨리주맙 페골(Cimzia), 골리무맙(Simponi) 및 ESBA105와 같은 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 억제제; IL-12 또는 IL-23, IFN-g 및 IL-17 및 이의 수용체를 포함하는 다른 전염증성 사이토카인 경로의 억제제; IL-4 및 IL-13과 같은 항염증성 사이토카인; 금속단백분해효소 조직 억제제(TIMP)와 같은 매트릭스 금속단백분해효소 억제제; 케모카인 수용체 2(CCR2)에 대한 길항제와 같은 전염증성 케모카인 경로의 억제제; 항시트룰린화 단백질 자가항체(ACPA)에 대한 면역 글로불린 및 항체; 실크 단백질 및 피브로인 유도체(예를 들어, SilkTech Biopharmaceuticals의 SDP-4); FK506 결합 단백질(FK506BP) 또는 이의 유도체(예를 들어, PEP-1-FK506BP); 항-CD4 단클론 항체와 같은 T 세포를 표적화하는 생물학제(Arthritis Rheum. 2004 Sep;50(9):2903-10); 리툭시맙, 벨리무맙 및 에프라투주맙과 같은 B 세포를 표적화하는 생물학제; 프로테오글리칸 4(prg4) 또는 이의 윤활 단편과 같은 뮤신 계열 단백질; 히알루로난 신타아제(HA 신타아제); 라크리틴 및 그 유도체; 단백질 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1) 및 세포간 접착 분자-1(ICAM-1)의 길항제; 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 상응하는 VEGF 수용체(VEGFR)의 길항제(예를 들어, 애플리버셉트, 라니비주맙, 베바시주맙 및 MP0112)와 같은 항혈관신생제; 엘라스틴 유사 펩티드; SLURP1 폴리펩티드 또는 이의 유도체; 갈렉틴 및 이의 조절물질.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 재조합 인간 신경 성장 인자(rhNGF)이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 사용하여 눈물샘에서 rhNGF를 발현시키는 방법, 및 눈물 생성을 증가시키는 제제(예를 들어, 전기 자극; 또는 nAChR 작용제, 예컨대 바레니클린, (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘, 5-{(E)-2-[(3R)-피롤리딘-3-일]비닐}피리미딘, 또는 (R,E)-5-((2-피롤리딘-3-일)비닐)피리미딘, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염)를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 티모신 베타 4(Tβ4)이다. Tβ4는 혈소판, 대식세포 및 다형핵세포의 주요 구성 단백질로서, G-액틴 결합 분자 및 액틴 중합화의 조절자로 작용하는 43-아미노산 펩티드(서열 SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES; 서열번호 26을 가짐)이다. II상 임상시험에서 0.1% Tβ4 안과 제형을 28일 동안 투여한 결과, 안구건조증 환자의 안구 불편감과 각막 염색에 상당히 긍정적인 효과가 나타났다. Sosne G, Ousler GW (2015) Clin Ophthalmol. 20:877-84.
본 개시의 방법에 사용되는 다른 예시적인 일차 치료제는 다음을 포함한다: 인테그린 α4β1(VLA-4)의 조절제.
일차 치료제는 수용액, 겔, 또는 현탁액 중 안구 주위 조직으로의 주사, 또는 분비샘(예를 들어, 눈물샘)으로의 주사에 의한 국소 투여와 같지만, 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 적절한 방법에 의해 눈에 투여될 수 있다.
본 개시는 유전자 산물(예를 들어, 단백질 또는 핵산)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위해 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 일차 치료제로서 투여하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "일차 치료제"는 눈에 치료 효과를 가질 수 있는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 유사하게 전술한 바와 같이, 일차 치료제는, 예를 들어, 효과적인 양으로 안구 표면에 그리고 안구 표면을 가로질러 발현되고 분포될 때 원하는 생물학적 효과를 갖는 유전자 산물의 대상체의 조직으로부터 발현을 유발함으로써 간접적으로 그 효과를 발휘할 수 있다. 본원에서 사용되는 "유효량"은 본원에 기술된 안구 병태의 증상 및/또는 징후를 감소시키기에 충분한 rAAV, 치료제, 또는 조성물의 양 또는 투여량을 의미한다.
당업계에 공지된 단백질 및 핵산 기반 일차 치료제는 유전적 벡터로 전환될 수 있으며, 이에 따라 안구 표면 및/또는 각막으로 전달하기 위해 인 시츄로 발현될 수 있다. 따라서, 예를 들어 제한 없이, 본 개시의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 다음을 포함할 수 있다: 하나 이상의 알부민을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 신경 성장 인자; 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1); 성장 인자(간세포 성장 인자, 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF)-베타); 피브로넥틴; 인터루킨-1(IL-1) 경로 억제제; 예를 들어 아나킨라 또는 EBI-005를 포함하지만 이에 국한되지 않는 전염증성 사이토카인 경로의 억제제; IL-6R 길항제와 같은 IL-6 경로 억제제; 에타네르셉트(Enbrel), 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙 및 ESBA105와 같은 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 억제제; IL-12 또는 IL-23, IFN-g 및 IL-17 및 이의 수용체를 포함하는 다른 전염증성 사이토카인 경로의 억제제; IL-4 및 IL-13과 같은 항염증성 사이토카인; 금속단백분해효소 조직 억제제(TIMP)와 같은 매트릭스 금속단백분해효소 억제제; 케모카인 수용체 2(CCR2)에 대한 길항제와 같은 전염증성 케모카인 경로의 억제제; 항시트룰린화 단백질 자가항체(ACPA)에 대한 면역 글로불린 및 항체; 실크 단백질 및 피브로인 유도체(예를 들어, SilkTech Biopharmaceuticals의 SDP-4); FK506 결합 단백질(FK506BP) 또는 이의 유도체(예를 들어, PEP-1-FK506BP); 항-CD4 단클론 항체와 같은 T 세포를 표적화하는 생물학제(Arthritis Rheum. 2004 Sep;50(9):2903-10); 리툭시맙, 벨리무맙 및 에프라투주맙과 같은 B 세포를 표적화하는 생물학제; 프로테오글리칸 4(prg4) 또는 이의 윤활 단편과 같은 뮤신 계열 단백질; 히알루로난 신타아제(HA 신타아제); 라크리틴 및 그 유도체; 단백질 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1) 및 세포간 접착 분자-1(ICAM-1)의 길항제; 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 상응하는 VEGF 수용체(VEGFR)의 길항제(예를 들어, 애플리버셉트, 라니비주맙, 베바시주맙 및 MP0112)와 같은 항혈관신생제; 엘라스틴 유사 펩티드; SLURP1 폴리펩티드 또는 이의 유도체; 갈렉틴 및 이의 조절물질.
일부 구현예에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 재조합 인간 신경 성장 인자(rhNGF)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 치료 단백질, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, Fab), 또는 수용체 미끼(예를 들어, 용해성 수용체, 또는 "포획" 분자)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 신경 성장 인자(NGF), 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF), RNase(예를 들어, 란피라나제), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 시알산-결합 Ig-유사 렉틴 8(SIGLEC-8), 종양 괴사 인자(TNF-α), 표피 성장 인자(EGF), 인터루킨-1(IL-1), 또는 인터루킨-2(IL-2), 및 인터루킨-6(IL-6)을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 효소이다. 일부 구현예에서, 치료 항체는 다양한 신규 항원 수용체(VNAR) 항체이다. 일부 구현예에서, 치료 항체는 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR) 항체이다. 일부 구현예에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 에타너셉트, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙 또는 ESBA105를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 IgE에 대한 수용체 미끼를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 티모신 베타4(Tβ4)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
바이러스 벡터
폴리뉴클레오티드 벡터의 치료적 사용은 본 개시의 방법에 의해 개선될 수 있다. 본원에 기술된 성장 인자 및 단클론 항체를 포함하는 단백질 약물(생물학적 제제)은 선택적으로 폴리뉴클레오티드 벡터(예를 들어, 비-바이러스 또는 바이러스 벡터)로 눈에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 눈물샘으로 전달된다. 백신, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 벡터는 눈물샘 세포 및/또는 눈물샘 조직의 일차 배양물을 형질도입한다. 이들 및 다른 바이러스 벡터는 적절한 프로모터 또는 강화 요소의 선택, 선택된 조직을 형질도입하는 혈청형의 선택, 또는 바이러스의 가성형에 의해 눈에 인접하거나 유동적으로 연결된 조직에서 발현하도록 조작될 수 있다.
눈물샘으로의 주사에 의해 단백질 산물을 암호화하는 전이유전자의 바이러스 벡터 기반 전달(즉, 눈물샘 내 전달 또는 눈물샘 내 투여)은 안구 질환 및 증상 치료에 유리할 수 있다. 눈물샘에서 생성되고 대상체의 눈물액에서 분비되는 단백질은 번역 후 변형(PTM)(단백질 생합성에 따른 단백질의 공유 결합 및 일반적으로 효소 변형)으로 인해 개선될 수 있으며, 이에 따라 단백질은 mRNA를 폴리펩티드 사슬로 번역하는 리보솜에 의해 합성되고, 폴리펩티드 사슬은 PTM을 거쳐 성숙한 단백질 생성물을 형성할 수 있다. PTM은 대장균과 같은 박테리아에서 종종 만들어지는 재조합 인간 단백질의 국소 전달에는 없는 세포 신호 전달에 중요한 특성을 부여할 수 있다. 또한, 보조인자, 샤페론, 효소 또는 다른 단백질을 함유할 수 있는 천연 눈물막 성분과 함께 분비되는 경우, 눈물액을 통한 투여는 국소 투여 단백질의 단독 투여만으로는 달성할 수 없는 생물학적 활성을 부여할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 캡시드 또는 바이러스 외피에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드를 가지며 표적 세포를 형질도입하기에 충분한 하나 이상의 바이러스 단백질을 갖는 바이러스 입자를 지칭한다. 바이러스 벡터라는 용어는 복제 및 비복제 벡터 및 통합 및 비통합 벡터를 포함한다. 눈을 둘러싼 조직의 세포를 형질도입할 수 있는 모든 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 형질도입이 안구 표면에 유전자 산물의 발현을 유도하는 경우, 국소적으로 또는 전신적으로 대상체의 세포를 형질도입할 수 있다. 안구 표면으로의 전달에는 세포에서 안구 표면으로의 직접 분비, 안구 표면으로의 유전자 산물의 트랜스시토시스(transcytosis) 또는 순환계를 통한 안구 표면으로의 국소화가 포함될 수 있다. 구체적으로, 본 개시의 방법은 바이러스 벡터를 눈물샘에 투여하는 단계를 포함한다. 눈물샘은 눈으로 분비되는 눈물을 생산하는 생리적 기능이라는 점에서 눈과 유동적으로 연결되어 있다.
"눈물샘"은 눈물막의 수성층을 분비하는 한 쌍의 아몬드 모양의 외분비선(각 눈마다 하나씩임)의 서로 다른, 또는 둘 모두를 지칭한다. 눈물샘은 각 안와의 상부 측면 영역, 전두골에 의해 형성된 안와의 눈물샘 포사에 위치한다. 눈물샘에 대한 바이러스 벡터의 투여는 안구 표면으로의 국소 투여, 눈물샘으로의 직접 주입, 및/또는 눈물샘으로의 국소 투여에 의해 달성될 수 있다. 눈물샘은 외과적으로 접근하거나 눈꺼풀을 조작하여 접근할 수 있다. 눈꺼풀의 조작은 (예를 들어, 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 사용하는 조직의 세척에 의해) 국소적 투여를 위한 조직에 대한 접근을 제공한다. 눈물샘으로의 직접 주입은 눈물샘 위로 피부를 관통하거나(도 1a) 눈꺼풀을 조작하여 눈물샘에 접근시킴으로써(도 1b) 수행될 수 있다. 눈물샘은 부분적으로 단백질을 발현하고 눈물막으로 분비하는 눈물샘 세포로 구성되어 있다(도 2). 일부 구현예에서, rAAV는 도 1a에 예시된 바와 같은 직접 주입에 의해 눈물샘에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV는 도 1b에 예시된 바와 같이 눈꺼풀을 조작함으로써 눈물샘에 투여된다.
다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스), 백신 바이러스, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스(AAV)이다. 표준 분자 생물학 기술은 벡터로 사용하기에 적합한 이러한 각 바이러스의 재조합 형태를 생성하기 위해 존재한다. 바이러스 벡터는 가성형화된 벡터(예를 들어, VSV, G 또는 다른 바이러스로부터의 Env 단백질을 갖는 렌티바이러스 벡터)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. AAV 벡터는 자기 상보적 및 비-자기 상보적 벡터를 포함한다. 하나 이상의 AAV 벡터가 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 경우, 분할 벡터 시스템이 큰 유전자를 세포에 전달하는 데 사용된다. 예를 들어, 종래의 AAV 벡터의 ~4.5kb 패키징 한계로 인해, 약 4 kb 내지 약 10 kb의 유전자는 형질도입된 세포 내의 재조합이 전체 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 구성된 2개의 AAV 벡터로 분할될 수 있다. 3개 이상의 AAV 벡터가 더 큰 유전자에 사용될 수 있다. 본원에서 용어 "유전자"는 직접(유전자 산물이 RNA인 경우) 또는 메신저 RNA 중간체(유전자 산물이 단백질인 경우)를 통해 유전자 산물을 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "유전자 산물"은 벡터가 세포 내로 형질도입될 때 유전자로부터 발현되는 목적하는 산물을 지칭한다. 다양한 구현예에서, 유전자 산물은 치료 단백질, 항체 또는 항체 단편, 또는 수용체 미끼이다. 본원에서 사용되는 용어 "치료적"은 유전자 산물이 충분한 기간 동안 효과적인 농도로 안구 표면 상에 존재할 때 눈에 치료 효과를 일으킬 수 있다는 것을 의미한다.
본 개시의 방법에 유용한 유전자 산물은 형질도입된 세포에 의해 분비되어 안구 표면 및/또는 눈의 눈물막으로 전달될 수 있도록 한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 RNA이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 치료 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF), 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF), RNase(예를 들어, 란피라나제), 또는 시알산-결합 Ig-유사 렉틴 8(SIGLEC-8)이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을, 전장 단백질 유전자 산물 또는 단백질 유전자 산물의 일부로서 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론 항체 또는 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일-도메인 항체(sdAb)(즉, 나노바디)이다.
따라서, 예를 들어 제한 없이, 본 개시의 바이러스 벡터는 다음을 포함할 수 있다: 하나 이상의 알부민을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 신경 성장 인자; 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1); 성장 인자(간세포 성장 인자, 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF)-베타); 피브로넥틴; 인터루킨-1(IL-1) 경로 억제제; 예를 들어 아나킨라 또는 EBI-005를 포함하지만 이에 국한되지 않는 전염증성 사이토카인 경로의 억제제; IL-6R 길항제와 같은 IL-6 경로 억제제; 에타네르셉트(Enbrel), 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙 및 ESBA105와 같은 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 억제제; IL-12 또는 IL-23, IFN-g 및 IL-17 및 이의 수용체를 포함하는 다른 전염증성 사이토카인 경로의 억제제; IL-4 및 IL-13과 같은 항염증성 사이토카인; 금속단백분해효소 조직 억제제(TIMP)와 같은 매트릭스 금속단백분해효소 억제제; 케모카인 수용체 2(CCR2)에 대한 길항제와 같은 전염증성 케모카인 경로의 억제제; 항시트룰린화 단백질 자가항체(ACPA)에 대한 면역 글로불린 및 항체; 실크 단백질 및 피브로인 유도체(예를 들어, SilkTech Biopharmaceuticals의 SDP-4); FK506 결합 단백질(FK506BP) 또는 이의 유도체(예를 들어, PEP-1-FK506BP); 항-CD4 단클론 항체와 같은 T 세포를 표적화하는 생물학제(Arthritis Rheum. 2004 Sep;50(9):2903-10); 리툭시맙, 벨리무맙 및 에프라투주맙과 같은 B 세포를 표적화하는 생물학제; 프로테오글리칸 4(prg4) 또는 이의 윤활 단편과 같은 뮤신 계열 단백질; 히알루로난 신타아제(HA 신타아제); 라크리틴 및 그 유도체; 단백질 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1) 및 세포간 접착 분자-1(ICAM-1)의 길항제; 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 상응하는 VEGF 수용체(VEGFR)의 길항제(예를 들어, 애플리버셉트, 라니비주맙, 베바시주맙 및 MP0112)와 같은 항혈관신생제; 엘라스틴 유사 펩티드; SLURP1 폴리펩티드 또는 이의 유도체; 갈렉틴 및 이의 조절물질.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 재조합 인간 신경 성장 인자(rhNGF)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 치료 단백질, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, Fab), 또는 수용체 미끼(예를 들어, 용해성 수용체, 또는 "포획" 분자)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 신경 성장 인자(NGF), 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF), RNase(예를 들어, 란피라나제), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 시알산-결합 Ig-유사 렉틴 8(SIGLEC-8), 종양 괴사 인자(TNF-α), 표피 성장 인자(EGF), 인터루킨-1(IL-1), 또는 인터루킨-2(IL-2), 및 인터루킨-6(IL-6)을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 에타너셉트, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 또는 골리무맙을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 IgE에 대한 수용체 미끼를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 티모신 베타4(Tβ4)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
발현 카세트
일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 재조합 AAV 벡터(rAAV)이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV는 발현 카세트 및 캡시드 단백질을 포함한다.
본 개시의 rAAV 비리온은 발현 카세트를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "발현 카세트"는 관심 단백질 또는 전이유전자, 예를 들어, 역말단 반복에 의해 측면에 있는 신경영양 인자를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 발현 카세트는 다른 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 프로모터, 조절 요소(예를 들어, 하나 이상의 프로모터 또는 인핸서), 번역 개시 서열, 암호화 서열, 및 종결 서열을 추가로 포함할 수 있다. 조절 요소는 전이유전자에 작동가능하게 연결되어 발현을 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 발현 카세트는 전이유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이유전자 산물은 안구 질환 또는 장애를 치료할 수 있는 단백질이다. 예를 들어, 전이유전자는 눈의 유지 또는 항상성을 담당하는 단백질, 예를 들어, 신경영양 인자일 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 적어도 하나의 눈 및/또는 눈물샘에서 전이유전자의 증가된 발현을 제공한다. 일부 구현예에서, 전이유전자의 발현은 미치료 대상체, 또는 치료된 대상체의 반대측 눈에서 본래 발현된 유전자의 발현과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 증가할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자의 발현은 미치료 대상체, 또는 치료된 대상체의 반대측 눈에서 본래 발현된 유전자의 발현과 비교하여 1배, 2배, 3배, 4배, 또는 5배 증가할 수 있다. 일부 구현예에서, 신경영양 인자의 발현은 미치료 대상체, 또는 치료된 대상체의 반대측 눈에서의 신경 영양인자의 발현과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 증가한다. 일부 구현예에서, 신경영양 인자의 발현은 미치료 대상체, 또는 치료된 대상체의 반대측 눈에서 신경영양 인자의 발현과 비교하여 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 또는 9배 증가할 수 있다. 전이유전자는 치료된 눈에서 임의의 검출가능한 수준으로 발현될 수 있는 반면, 전이유전자는 미치료 대상체, 또는 치료된 대상체의 반대측 눈에서는 발현되지 않거나, 검출할 수 없는 수준으로 발현될 수 있다. 달리 말하면, rAAV 비리온이 투여된 눈 또는 눈물샘은 전이유전자의 내인성(즉, 원시적) 발현만을 갖는 눈 또는 눈물샘 또는 전이유전자의 내인성(즉, 원시적) 발현의 분비가 낮거나 손상된 눈에서보다 전이유전자를 더 풍부하게 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이유전자는 신경영양 인자이다. 일부 구현예에서, 신경영양 인자는 신경 성장 인자(NGF) 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 본원에서 사용되는 "NGF", "NGFβ" 또는 "신경 성장 인자 베타"는 신경 성장 인자를 지칭하며, 이는 신경 성장 인자를 균질화하고 신경 성장 자극 활성을 수행하는 단백질을 암호화하는 유전자이다. NGF는 또한 뉴런의 조절 및 분화에 관여한다. 본원에서 사용되는 용어 "NGF 단백질"은 임의의 종으로부터의 NGF 단백질을 지칭한다. 용어 "기능적 변이체"는 서열 치환, 삽입, 결실, 및/또는 N- 또는 C-말단 절단을 갖는 변이체를 의미하며, 여기에서 기능적 변이체는 기준 단백질의 하나 이상의 기능, 예를 들어, 본래의 NGF 단백질을 유지한다. NGF는 주로 신경 세포의 성장, 유지, 증식 및 생존에 관여하는 26 kDa 폴리펩티드이다. 각막에서, NGF는 수용체 trkANGFR 및 p75NTR과 결합하여 각막과 결막의 치유와 관련된 신호 전달 경로를 유도한다(Micera 등, Exp Eye Res. 83:747-57 (2006)). 일부 구현예에서, NGF 단백질은 서열번호 1을 포함한다. 일부 구현예에서, NGF 단백질은 서열번호 1에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, NGF 단백질은 서열번호 1에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 공유한다. 일부 구현예에서, NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2를 포함한다. 일부 구현예에서, NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 공유하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17를 포함한다. 일부 구현예에서, NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 공유하는 서열에 의해 암호화된다.
코돈 최적화된 NGF
ATGAGCATGCTGTTTTACACCCTGATCACCGCCTTCCTGATCGGCATCCAGGCCGAGCCCCACAGCGAGAGCAACGTGCCCGCTGGACACACAATCCCTCAGGCCCACTGGACAAAACTGCAGCATAGCCTGGATACAGCCCTGAGAAGGGCCAGAAGCGCCCCTGCCGCCGCCATCGCCGCTAGAGTGGCCGGCCAGACAAGAAATATCACCGTGGACCCCCGGCTGTTCAAGAAAAGAAGACTGCGGTCTCCTAGAGTGCTCTTTTCAACACAGCCTCCTCGGGAAGCCGCTGATACCCAGGACCTGGACTTCGAGGTGGGAGGCGCCGCTCCTTTCAATAGAACCCACAGATCCAAGAGAAGCTCTAGCCACCCTATCTTCCACCGGGGCGAGTTCAGCGTGTGCGACAGCGTTTCTGTGTGGGTGGGAGATAAGACCACCGCAACCGATATCAAGGGCAAGGAAGTGATGGTGCTGGGCGAAGTGAACATCAACAACAGCGTCTTTAAGCAGTACTTCTTCGAGACAAAGTGCCGGGACCCAAACCCCGTGGACAGCGGCTGCAGAGGCATTGACTCCAAGCACTGGAACTCCTACTGCACCACAACACACACCTTCGTGAAGGCCCTGACCATGGACGGCAAACAAGCTGCCTGGCGGTTCATCAGAATCGACACCGCCTGTGTCTGTGTGCTGAGCAGAAAGGCCGTGCGCCGGGCCTAG (서열번호 17)
일부 구현예에서, NGF 단백질은 인간 NGF 단백질이다.
일부 구현예에서, 신경영양 인자는 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF) 단백질이다. 본원에서 사용되는 용어 "GDNF 단백질"은 임의의 종으로부터의 GDNF 단백질을 지칭한다. 용어 "기능적 변이체"는 서열 치환, 삽입, 결실, 및/또는 N- 또는 C-말단 절단을 갖는 변이체를 의미하며, 여기에서 기능적 변이체는 기준 단백질의 하나 이상의 기능, 예를 들어, 본래의 GDNF 단백질을 유지한다. GDNF는 수용체 GFRα-1에 작용하는 GDNF에 의해 다양한 신경 시스템의 성장, 유지 및 분화를 지원하는 21k Da 단백질이다(Qi 등, Br J Ophthalmol. 92:1269-74 (2008)). 일부 구현예에서, GDNF 단백질은 서열번호 3을 포함한다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질은 서열번호 3에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질은 서열번호 3에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 공유한다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4를 포함한다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질은 서열번호 4에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 공유하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18를 포함한다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 공유하는 서열에 의해 암호화된다.
코돈 최적화된 GDNF
ATGAACTGTGGGACGTTGTGGCCGTGTGCCTGGTCCTCCTGCACACCGCCTCCGCCTTTCCACTGCCTGCTGGAAAGCGGCCTCCTGAGGCCCCTGCTGAAGATAGAAGCCTGGGCAGAAGAAGAGCCCCCTTCGCCCTGAGCTCTGATAGCAACATGCCTGAGGACTACCCCGACCAGTTCGACGACGTGATGGACTTTATCCAGGCCACCATCAAGAGACTGAAACGGAGCCCTGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCCTAGACGGGAAAGAAATAGACAGGCCGCAGCTGCCAACCCCGAGAACAGCAGAGGCAAAGGCCGGAGAGGCCAGAGGGGAAAAAACAGAGGATGTGTGCTGACCGCCATCCATCTGAACGTGACAGATCTGGGCCTGGGCTATGAGACCAAGGAAGAGCTGATCTTCAGATACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACAACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGTCCCGGAATCGGCGGCTGGTGTCTGACAAGGTGGGCCAAGCTTGCTGCAGACCAATTGCCTTCGACGATGATCTGTCTTTCCTGGATGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGAAAGCACAGCGCCAAGCGCTGCGGCTGTATCTAG (서열번호 18)
일부 구현예에서, GDNF는 인간 GDNF이다.
[표 1] 신경영양 인자의 서열
일부 구현예에서, 본 개시의 발현 카세트는 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소의 결합을 유도하고 이에 따라 RNA 합성, 즉 전사를 유도하기에 충분한 최소 서열을 촉진하는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터는 전이유전자, 예를 들어, 신경영양 인자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 전이유전자의 전사는 그것이 작동가능하게 연결된 프로모터에 의해 개시되고 조절될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 RNA 합성이 프로모터에서 개시되면 전이유전자를 발현하게 된다. 프로모터 및 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드 발현은 유비쿼터스일 수 있이며, 이는 광범위한 세포, 조직 및 종 또는 세포 유형 특이적, 조직-특이적, 또는 종 특이적 세포에서 강하게 활성임을 의미한다. 프로모터는 지속적으로 활성을 의미하는 "구성적" 프로모터일 수 있거나, 또는 프로모터가 생물학적 또는 비생물적 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성화 또는 비활성화될 수 있음을 의미하는 "유도적" 프로모터일 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터에는 프로모터 서열과 인접할 수도 있고 인접하지 않을 수도 있는 인핸서 서열이 포함된다. 인핸서 서열은 프로모터-의존성 유전자 발현에 영향을 미치며, 본래 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다.
임의의 적절한 프로모터 영역 또는 그 안에 있는 프로모터 서열은, 프로모터 영역이 적어도 하나의 눈 및/또는 GNDF 단백질에서 NGF 또는 GNDF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 촉진하는 한, 서브 펙트 폴리뉴클레오티드 카세트에 사용될 수 있다.
눈물샘. 일부 구현예에서, 프로모터는 포유류의 눈 및/또는 눈물샘에서 유전자의 발현을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 세포형 특이적 프로모터를 포함한다. 프로모터는 눈의 세포 및/또는 눈물샘의 세포에서의 전사를 특이적으로 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 5를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 5에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터 서열(서열번호 5)에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유한다.
CAG 프로모터
ataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctactcgaggccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagcgggatcagccaccgcggtggcggcctagagtcgacgaggaactgaaaaaccagaaagttaactg (서열번호 5)
일부 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 16을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 16에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터 서열(서열번호 16)에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유한다.
CMV 프로모터
ctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaat (서열번호 16)
일부 구현예에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적합한 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬 폴리 A 신호(bGH폴리A) 및 짧은 폴리 A 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 서열번호 21을 포함한다. 선택적으로, 본 개시의 rAAV 벡터는 우드척 전사 후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 서열번호 22를 포함하는 WPRE를 포함한다.
>bGH폴리A 서열
cgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg (서열번호 21)
WPRE 서열
tcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctccctatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtc (서열번호 22)
일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 23을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 23에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 23에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
GDNF를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 카세트
gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacggatctttacaaattcaagccaggtgatttcaacaaattttgctgacgatttaggcgcactatcccctaaactacaaattagaaaatagcgttccttgacactagtctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaataagctttctcaggggagatctcgtttagtgaaccgtcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgaggtgaggtgtggcaggcttgagatccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcattacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaagtttaaacgccgccgccatgaagctgtgggacgttgtggccgtgtgcctggtcctcctgcacaccgcctccgcctttccactgcctgctggaaagcggcctcctgaggcccctgctgaagatagaagcctgggcagaagaagagcccccttcgccctgagctctgatagcaacatgcctgaggactaccccgaccagttcgacgacgtgatggactttatccaggccaccatcaagagactgaaacggagccctgacaagcagatggccgtgctgcctagacgggaaagaaatagacaggccgcagctgccaaccccgagaacagcagaggcaaaggccggagaggccagaggggaaaaaacagaggatgtgtgctgaccgccatccatctgaacgtgacagatctgggcctgggctatgagaccaaggaagagctgatcttcagatactgcagcggcagctgcgacgccgccgagacaacctacgacaagatcctgaagaacctgtcccggaatcggcggctggtgtctgacaaggtgggccaagcttgctgcagaccaattgccttcgacgatgatctgtctttcctggatgacaacctggtgtaccacatcctgagaaagcacagcgccaagcgctgcggctgtatctagtcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctccctatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtccgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggagcgctggctagaattacctaccggcctccaccataccttcgatattcgcgcccactctcccattaatccgcacaagtggatgtgatgcgattgcccgctaagatagttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggc ggcctcagtgagcgagcgagcgcgc (서열번호 23)
일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 24를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 24에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 24에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
NGF를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 카세트
gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacggatctttacaaattcaagccaggtgatttcaacaaattttgctgacgatttaggcgcactatcccctaaactacaaattagaaaatagcgttccttgacactagtctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaataagctttctcaggggagatctcgtttagtgaaccgtcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgaggtgaggtgtggcaggcttgagatccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcattacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaagtttaaacgccgccgccatgagcatgctgttttacaccctgatcaccgccttcctgatcggcatccaggccgagccccacagcgagagcaacgtgcccgctggacacacaatccctcaggcccactggacaaaactgcagcatagcctggatacagccctgagaagggccagaagcgcccctgccgccgccatcgccgctagagtggccggccagacaagaaatatcaccgtggacccccggctgttcaagaaaagaagactgcggtctcctagagtgctcttttcaacacagcctcctcgggaagccgctgatacccaggacctggacttcgaggtgggaggcgccgctcctttcaatagaacccacagatccaagagaagctctagccaccctatcttccaccggggcgagttcagcgtgtgcgacagcgtttctgtgtgggtgggagataagaccaccgcaaccgatatcaagggcaaggaagtgatggtgctgggcgaagtgaacatcaacaacagcgtctttaagcagtacttcttcgagacaaagtgccgggacccaaaccccgtggacagcggctgcagaggcattgactccaagcactggaactcctactgcaccacaacacacaccttcgtgaaggccctgaccatggacggcaaacaagctgcctggcggttcatcagaatcgacaccgcctgtgtctgtgtgctgagcagaaaggccgtgcgccgggcctagtcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctccctatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtccgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggagcgctggctagaattacctaccggcctccaccataccttcgatattcgcgcccactctcccattaatccgcacaagtggatgtgatgcgattgcccgctaagatagttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccg ggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc (서열번호 24)
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 도 9의 플라스미드로 도시된 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 25에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
[표 2] pAAV-CMVE-NGF 서열
재조합 AAV 비리온
본 개시의 일부 구현예에서, 대상체 발현 카세트는 예를 들어, 안구 장애를 치료하기 위해, 대상체의 적어도 하나의 눈 및/또는 눈물샘에 신경 영양 인자를 전달하기 위해 사용된다. 따라서, 본 개시의 일부 구현예에서, 대상체의 적어도 하나의 눈 및/또는 눈물샘에서 신경영양 인자의 발현을 제공하는 조성물은 유전자 전달 벡터이고, 여기에서 유전자 전달 벡터는 본 개시의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 전달 벡터는 rAAV 비리온이다. 이러한 구현예에서, 대상체 발현 카세트는 AAV 역말단 반복 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 기능적 AAV 역말단 반복(ITR) 서열에 의해 5' 및 3' 말단 상에 측면에 위치한다. "기능적 AAV ITR 서열"은 ITR 서열이 AAV 비리온의 구조, 복제 및 패키징을 위해 의도된 대로 기능한다는 것을 의미한다. 따라서, 본 개시의 유전자 전달 벡터에 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없고, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있거나, AAV ITR은 다양한 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 어느 하나로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1으로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV3으로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV4로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV5로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV6으로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV7로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV9로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV10으로부터 유도될 수 있다. 특정 rAAV 비리온에는 야생형 REP 및 CAP 유전자가 전체 또는 부분적으로 삭제되어 있지만 기능성 측면 ITR 서열은 유지되어 있다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 19를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 19에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 19에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 공유한다.
예시적인 5' ITR 서열
gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcg agcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaac (서열번호 19)
일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 20을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 20에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 20에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 공유한다.
예시적인 3' ITR 서열
gttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaa aggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc (서열번호 20)
이러한 구현예에서, rAAV 비리온은 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 등을 포함하여 당업계에 공지되어 있거나 장래에 발견된 임의의 아데노 관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 예를 들어, AAV 캡시드는 야생형(또는 "천연") 캡시드일 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV1로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV2로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV3로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV4로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV5로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV6로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV7로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV8로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV9로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV10로부터 유래된 AAV 캡시드를 포함한다. 특정 관심 AAV 캡시드는 AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9를 포함한다(표 3).
그러나, ITR과 마찬가지로, 캡시드는 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없지만, 캡시드가 눈 및/또는 눈물샘의 세포를 형질도입할 수 있는 한, 오히려 VP1, VP2 또는 VP3 서열에서 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 다시 말해, AAV 캡시드는 변형 AAV 캡시드일 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 하나의 AAV의 캡시드(cap) 유전자 및 상이한 AAV로부터의 rep 유전자 및 ITR을 사용하여 생성된 "가성형화된" AAV, 예를 들어, AAV2로부터의 rep 및 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9로부터의 cap을 사용하여 AAV2에 기초한 벡터를 함유하는 플라스미드와 함께 생성된 가성형화된 AAV2이다. 예를 들어, rAAV 비리온은 rAAV2/1, rAAV2/3, rAAV2/4, rAAV2/5, rAAV2/6, rAAV2/7, rAAV2/8, rAAV2/9 등일 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV2/1이다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV2/3이다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV2/4이다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV2/5이다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV2/6이다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV2/7이다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV2/8이다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV2/9이다.
일부 구현예에서, rAAV는 복제 결함이며, 여기에서 rAAV 비리온은 이의 게놈을 독립적으로 더 추가로 복제하고 패키징할 수 없다. 예를 들어, 눈 및/또는 눈물샘이 rAAV 비리온으로 형질도입될 때, 유전자는 형질도입된 눈 및/또는 눈물샘에서 발현되지만, 형질도입된 눈 및/또는 눈물샘에는 AAV rep 및 cap 유전자 및 보조 기능 유전자가 결여되어 있기 때문에, rAAV는 복제할 수 없다.
본원에 기술된 바와 같은 발현 카세트를 캡슐화하는 본 개시의 rAAV 비리온은 헬퍼-프리 생산을 이용하여 제조할 수 있다. rAAV는 복제 결핍 바이러스이며 일반적으로 감염성 rAAV 비리온을 포장하기 위해 숙주 세포에 아데노바이러스와 같은 살아있는 헬퍼 바이러스로부터의 성분을 필요로 한다, rAAV 헬퍼 프리 생산 시스템을 사용하면 살아있는 헬퍼 바이러스를 사용하지 않고도 감염성 rAAV 비리온을 생산할 수 있다. 헬퍼 프리 시스템에서는 숙주 포장 세포주가 3개의 플라스미드로 공동 형질감염된다. 제1 플라스미드는 rAAV 비리온의 포장에 필요한 아데노바이러스 유전자 산물(즉, E2A, E4 및 VA RNA 유전자)을 포함한다. 제2 플라스미드는 필요한 AAV 유전자(즉, REP 및 CAP 유전자)를 포함한다. 제3 플라스미드는 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 ITR이 측면에 있는 프로모터를 포함한다. 호스트 포장 세포주는, 예를 들어, AAV-293 숙주 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 플라스미드에 의해 공급되지 않는 감염성 rAAV 비리온을 포장하는 데 필요한 추가 성분을 함유한다. 일부 구현예에서, CAP 유전자는, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 AAV 캡시드 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 본원에 기술된 바와 같은 프로모터 서열이다. 일부 구현예에서, 프로모터 서열은 CAG 서열이다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 신경영양 인자이다. 일부 구현예에서, 신경영양 인자는 NGF이다. 일부 구현예에서, 신경영양 인자는 GDNF이다.
눈 및/또는 눈물샘을 감염시키는 것으로 밝혀진 AAV 혈청형은 AAV2, AAV5, AAV 5w8 및 AAV9를 포함한다(Rocha 등, 전술함). 일부 구현예에서, 눈 및/또는 눈물샘을 감염시키는 데 사용되는 AAV 혈청형은 AAV2이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 6을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 6에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV2 VP1 단백질(서열번호 6)에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, AAV2 VP1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 7을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV2 VP1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 7에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV2 VP1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 7에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 8을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 8에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV2 VP3 단백질(서열번호 8)에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, AAV2 VP3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 9를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 9에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV2 VP3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 9에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 눈 및/또는 눈물샘을 감염시키는 데 사용되는 AAV 혈청형은 AAV5이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 10을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 10에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질(서열번호 10)에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, AAV5 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 11을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 11에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV5 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 11에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 눈 및/또는 눈물샘을 감염시키는 데 사용되는 AAV 혈청형은 AAV8이다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 12를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 12에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV8 캡시드 단백질(서열번호 12)에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, AAV8 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 13에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV8 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 13에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 눈 및/또는 눈물샘을 감염시키는 데 사용되는 AAV 혈청형은 AAV9이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 14를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 14에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질(서열번호 14)에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 15를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 대해 적어도 95%, 98%, 또는 100%의 동일성을 공유한다.
[표 3] AAV 캡시드 서열
일부 구현예에서, AAV 벡터는 표적 조직(예를 들어, 눈물샘)에서의 높은 형질도입 효율을 위해 선택된 혈청형을 갖는다. 공지된 AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, rh10, rh20, rh74 등을 포함한다. 또한, 점 돌연변이, 삽입, 및/또는 결실을 갖는 다양한 재조합 캡시드 단백질이 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, rh10, rh20, 또는 rh74의 AAV 벡터이다. 유사하게, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, rh10, rh20, 또는 rh74의 캡시드 단백질과 상동체인 캡시드 단백질(VP1, VP2, 및/또는 VP3)을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV9의 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 AAV2의 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 AAV5의 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 AAV8의 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 AAV9의 AAV 벡터이다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 하이브리드 AAV 벡터(즉, AAV의 한 혈청형의 서열과 상동성이지만 AAV의 다른 혈청형의 이들과 상동적인 캡시드 단백질을 포함하는 역말단 반복(ITR) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 게놈을 갖는 AAV 벡터)이다. 하이브리드 AAV는 ITR 다음에 캡시드가 뒤따르도록 설계된다(예를 들어, AAV2/9는 AAV2의 ITR과 AAV9의 캡시드를 갖는 AAV를 지칭한다). 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2/5 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2/8 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2/9 벡터이다.
본 개시의 AAV 벡터는 발현 카세트의 측면에 있는 2개의 ITR을 포함한다. 발현 카세트는 프로모터 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는, AAV 프로모터, 예컨대 p5, p19 또는 p40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 아데노바이러스 메이저 후기 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 유두종 바이러스 프로모터, 폴리오마 바이러스 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 프로모터, 육종 바이러스 프로모터, SV40 프로모터, 다른 바이러스 프로모터, 액틴 프로모터, 아밀라제 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 칼리크레인 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 열 충격 프로모터, 내인성 프로모터, 라파마이신 또는 다른 소분자에 의해 조절되는 프로모터, 다른 세포 프로모터, 및 당업자에게 공지된 다른 프로모터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 AAV 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터이다.
AAV 벡터의 제조에 있어서의 예시적인 방법들은 다음의 문헌에 제공된다: Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 25(3):489-99 (2008); Wu 등, Mol. Ther. 4(3):316-27 (2006); Burger 등, Mol. Ther. 10(2):302-17 (2004); Grimm D, Kay MA. Curr Gene Ther. 3(4):281-304 (2003); Deyle DR, Russell DW. Curr OpinMol Ther. 11(4):442-447 (2009); McCarty 등, Gene Ther. 8(16): 1248-54 (2001); 및 Duan 등, Mol Ther. 4(4):383-91 (2001).
본 개시의 바이러스 벡터는 대체적으로 약학적 조성물로서 대상체에게 전달된다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 용매(예를 들어, 물) 및 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대략 중성 pH(pH 5, 6, 7, 8, 또는 9)의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 포스페이트 완충 식염수(예를 들어, pH가 약 7인 PBS)를 포함한다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 염의 농도는 약학적 조성물이 표적 조직에 대해 등장성이거나, 또는 거의 등장성이 되도록 선택될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 밀리리터당 약 1 × 108 게놈 카피(GC/mL), 약 5 × 108 GC/mL, 약 1 × 109 GC/mL, 약 5 × 109 GC/mL, 약 1 × 1010 GC/mL, 약 5 × 1010 GC/mL, 약 1 × 1011 GC/mL, 약 5 × 1011 GC/mL, 약 1 × 1012 GC/mL, 약 5 × 1012 GC/mL, 약 5 × 1013 GC/mL, 또는 약 1 × 1014 GC/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 밀리리터당 약 1 × 108 게놈 카피(GC/mL), 약 5 × 108 GC/mL 내지 약 1 × 109 GC/mL, 약 1 × 109 GC/mL 내지 약 5 × 109 GC/mL, 약 5 × 109 GC/mL 내지 약 1 × 1010 GC/mL, 약 1 × 1010 GC/mL 내지 약 5 × 1010 GC/mL, 약 5 × 1010 GC/mL 내지 약 1 × 1011 GC/mL, 약 1 × 1011 GC/mL 내지 약 5 × 1011 GC/mL, 약 5 × 1011 GC/mL 내지 약 1 × 1012 GC/mL, 약 1 × 1012 GC/mL 내지 약 5 × 1012 GC/mL, 약 5 × 1012 GC/mL 내지 약 5 × 1013 GC/mL, 또는 약 5 × 1013 GC/mL 내지 약 1 × 1014 GC/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함한다. 다양한 추가의 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 약 5 × 108 GC/mL 내지 약 5 × 109 GC/mL, 약 5 × 109 GC/mL 내지 약 5 × 1010 GC/mL, 약 5 × 1010 GC/mL 내지 약 5 × 1011 GC/mL, 약 5 × 1011 GC/mL 내지 약 5 × 1012 GC/mL, 또는 약 5 × 1012 GC/mL 내지 약 1 × 1014 GC/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함한다. 또 다른 추가의 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 약 5 × 108 GC/mL 내지 약 5 × 1010 GC/mL, 약 5 × 1010 GC/mL 내지 약 5 × 1012 GC/mL, 또는 약 5 × 1012 GC/mL 내지 약 1 × 1014 GC/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함한다.
본 개시의 일부 약학적 조성물은 약 1 × 1012 GC/mL 내지 약 6.2 × 1012 GC/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함한다. 본 개시의 일부 약학적 조성물은 약 1 × 1012 GC/mL 또는 약 6.2 × 1012 GC/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 약 10 μL, 약 20 μL, 약 30 μL, 약 40 μL, 약 50 μL, 약 60 μL, 약 70 μL, 약 80 μL, 약 90 μL, 약 100 μL, 110 μL, 약 120 μL, 약 130 μL, 약 140 μL, 약 150 μL, 약 160 μL, 약 170 μL, 약 180 μL, 약 190 μL, 또는 약 200 μL의 총 부피로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 약 10 μL 내지 약 20 μL, 약 20 μL 내지 약 30 μL, 약 30 μL 내지 약 40 μL, 약 40 μL 내지 약 50 μL, 약 50 μL 내지 약 60 μL, 약 60 μL 내지 약 70 μL, 약 70 μL 내지 약 80 μL, 약 80 μL 내지 약 90 μL, 약 90 μL 내지 약 100 μL, 약 100 μL 내지 110 μL, 110 μL 내지 약 120 μL, 약 120 μL 내지 약 130 μL, 약 130 μL 내지 약 140 μL, 약 140 μL 내지 약 150 μL, 약 150 μL 내지 약 160 μL, 약 160 μL 내지 약 170 μL, 약 170 μL 내지 약 180 μL, 약 180 μL 내지 약 190 μL, 또는 약 190 μL 내지 약 200 μL의 총 부피로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물의 약 100 μL이 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물의 약 50 μL이 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물의 약 50 μL 내지 약 100 μL이 투여된다.
밀리리터당 게놈 카피는 바이러스의 폴리뉴클레오티드 게놈 농도가 알려진 기준 샘플로 생성된 표준 곡선을 사용하여 정량적 중합효소 변화 반응(qPCR)에 의해 측정될 수 있다. AAV의 경우, 사용되는 기준 샘플은 종종 AAV 벡터의 생성에 사용되는 전달 플라스미드이지만, 다른 기준 샘플이 사용될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 바이러스 벡터의 농도는 세포주 상의 벡터를 적정시킴으로써 측정될 수 있다. 바이러스 역가는 일반적으로 단위 부피당 바이러스 입자(vp)로 발현된다(예를 들어, vp/mL). 다양한 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 밀리리터당 약 1 × 108 바이러스 입자(vp/mL), 약 5 × 108 vp/mL, 약 1 × 109 vp/mL, 약 5 × 109 vp/mL, 약 1 × 1010 vp/mL, 약 5 × 1010 vp/mL, 약 1 × 1011 vp/mL, 약 5 × 1011 vp/mL, 약 1 × 1012 vp/mL, 약 5 × 1012 vp/mL, 약 5 × 1013 vp/mL, 또는 약 1 × 1014 vp/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 밀리리터당 약 1 × 108 바이러스 입자(vp/mL) 내지 약 5 × 108 vp/mL, 약 5 × 108 vp/mL 내지 약 1 × 109 vp/mL, 약 1 × 109 vp/mL 내지 약 5 × 109 vp/mL, 약 5 × 109 vp/mL 내지 약 1 × 1010 vp/mL, 약 1 × 1010 vp/mL 내지 약 5 × 1010 vp/mL, 약 5 × 1010 vp/mL 내지 약 1 × 1011 vp/mL, 약 1 × 1011 vp/mL 내지 약 5 × 1011 vp/mL, 약 5 × 1011 vp/mL 내지 약 1 × 1012 vp/mL, 약 1 × 1012 vp/mL 내지 약 5 × 1012 vp/mL, 약 5 × 1012 vp/mL 내지 약 5 × 1013 vp/mL, 또는 약 5 × 1013 vp/mL 내지 약 1 × 1014 vp/mL의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 포함할 수 있다.
사용 방법
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은: a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및 b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘, 눈물관, 각막, 각막 상피, 윤부 줄기 세포, 결막, 눈물점 또는 눈물 소관이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘, 눈물관, 각막, 각막 상피, 윤부 줄기 세포, 결막, 눈물점 또는 눈물 소관 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 각막이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 각막 상피이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 윤부 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 결막이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물점이다. 일부 구현예에서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘 소관이다.
일부 구현예에서, 눈 내의 세포는 일차 치료제에 의해 형질도입된다. 일부 구현예에서, 눈물샘 세포, 윤부 세포, 및 근상피 세포는 일차 치료제에 의해 형질도입된다. 일부 구현예에서, 눈물샘 세포는 일차 치료제에 의해 형질도입된다. 일부 구현예에서, 윤부 세포는 일차 치료제에 의해 형질도입된다. 일부 구현예에서, 근상피 세포는 일차 치료제에 의해 형질도입된다.
본 개시의 방법 및 조성물은 안구 병태를 갖는 대상체의 안구 표면을 지지, 유지 및/또는 복구할 수 있다. 안구 병태는, 예를 들어, 신경영양성 각막염, 안구 표면의 화학적 화상, 각막 상처, 각막 궤양, 지속적인 상피 결함, 안구 건조증, 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염, 삼차 신경 및/또는 눈의 수두 대상포진 바이러스 감염, 및 각막 신경의 당뇨병 합병증일 수 있다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 신경영양성 각막염이다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 안구 표면의 화학적 화상이다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 각막 상처이다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 각막 궤양이다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 지속적인 상피 결함이다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 안구건조증이다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염이다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 삼차 신경 및/또는 눈의 수두 대상포진 바이러스 감염이다. 일부 구현예에서, 안구 병태는 각막 신경의 당뇨병 합병증이다.
신경영양성 각막염 또는 신경영양성 각막병증은 각막의 상피 각막병증, 궤양 및 천공으로 나타난다. 신경영양성 각막염은 각막 신경 분포 장애로 인해 깜박임이 손상되고 눈물 생성이 감소하여 발생하는 각막 상피의 퇴행성 질환이다. 이의 증상은 각막 민감도의 감소 또는 전체 상실을 포함한다. 신경영양성 각막염은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 시력 검사, 하부 구개뇌 결막의 로즈 벵골 염색, 눈물 점액 점도, 눈물 분해 시간, 플루오레세인 염색, 치유되지 않는 각막 결손의 관찰, 데세메트(Descemet) 막 내의 부종 및 부종 기질의 관찰, 각막 궤양, 각막 천공 및 각막 기질 용융 관찰을 통해 진단되고 진행도가 결정된다(Sacchetti 등, Clin Ophthalmol.; 8: 571-579 (2014)).
일부 구현예에서, 본 개시는 안구 표면의 화학적 화상을 갖는 대상체에서 안구 표면을 유지 및/또는 복구하는 방법을 제공한다. 안구 표면의 화학적 화상은 일반적으로 심한 통증, 유현증 및 안검 경련의 갑작스러운 시작으로 나타난다. 안구 표면의 화학적 화상은 완전한 눈 검사를 통해 진단될 수 있다. 급성 안구 주위 부상 징후에는 안와 주위 부종과 홍반, 심부 피부, 속눈썹과 눈썹 손실이 포함된다. 다른 징후로는 각막 및 결막 상피 결손, 화학증, 결막 염증, 변부 허혈(limbal ischemia), 각막 혼탁, 멸균 궤양, 부종, 때로는 천공이 있다. 높은 안압은 또한 섬유주 그물망의 손상 및/또는 염증으로 인한 증상일 수 있다(Eslani 등, J Ophthalmol.; 2014:196827 (2014)).
일부 구현예에서, 본 개시는 각막 상처를 갖는 대상체에서 안구 표면을 유지 및/또는 복구하는 방법을 제공한다. 각막 상처는 일반적으로 눈의 통증, 눈물, 빛에 대한 민감성 및 이물감의 증상을 나타낸다. 진단은 눈 검사, 시력 상실 평가, 각막 침윤 또는 궤양 식별, 저혈압 또는 균사 식별, 관통 눈 손상의 증거, 안구 구조의 이물질 존재, 불규칙한 동공 식별 및 안구 내용물의 확장 중 하나 이상을 사용하여 수행된다. 또한, 플루오레세인 염색은 각막 찰과상을 식별하는 데 도움이 될 수 있다(Wipperman 등, Am Fam Physician.; 87(2): 114-120 (2013)).
일부 구현예에서, 본 개시는 각막 궤양을 갖는 대상체에서 안구 표면을 유지 및/또는 복구하는 방법을 제공한다. 각막 궤양은 안구 표면이 손상된 후 정상적인 2주 이내에 각막 상피가 치유되지 않을 경우, 안구 표면이 손상된 후 정상적인 2주 이내에 각막 상피가 치유되지 않을 경우 발생한다. 진단은 본원에 기술된 바와 같은 시력 검사를 사용하여 수행된다.
지속적인 상피 결함은 안구 표면의 손상 후 정상적인 2주 이내에 각막 상피의 치유에 실패할 경우 발생한다. 진단은 본원에 기술된 바와 같은 시력 검사를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 안구건조증을 갖는 대상체에서 안구 표면을 유지 및/또는 복구하는 방법을 제공한다. 안구건조증은 흐릿한 시야, 눈 자극, 거칠거나 이물감, 작열감, 찢어짐, 광선 공포증, 따끔거림 또는 간헐적인 날카로운 통증을 나타낸다. 안구건조증은 본원에 기술된 바와 같은 눈 검사, 눈물 생성을 평가하기 위한 쉬르머 검사 또는 눈물 기능 지수 분석, 각막 상피 결함을 확인하기 위한 플루오레세인 염색, 로즈 벵골 염색, 리사민 그린 염색, 눈물 분해 시간, 기능적 시력 검사, 및 눈물 반월상 평가 중 하나 이상을 사용하여 진단될 수 있다(Zeev 등, Clin Ophthalmol.; 8: 581-590 (2014)).
일부 구현예에서, 본 개시는 단순 포진 바이러스 감염을 갖는 대상체에서 안구 표면을 유지 및/또는 복구하는 방법을 제공한다. 단순 헤르페스 각막염으로도 알려진 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염은 충혈, 분비물, 눈물, 자극, 가려움증, 통증, 광선 공포증 및/또는 단속 병변을 형성하는 거친 과립 반점 등의 증상을 나타낸다. 진단은 본원에 기술된 바와 같은 눈 검사, 슬릿 램프 검사, 리사민 그린 염색, 로즈 벵골 염색, PCR, 면역형광 항체 분석, 및 ELISA 검정(Azher 등, Clin Ophthalmol. 11: 185-191 (2017)) 중 하나 이상을 사용하요 수행된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 수두 대상포진 바이러스 감염을 갖는 대상체에서 안구 표면을 유지 및/또는 복구하는 방법을 제공한다. 삼차신경의 수두 대상포진 바이러스 감염, 또는 대상포진 안구는 각막 합병증을 일으켜 시력 저하, 통증 및 빛에 대한 민감성을 다양하게 나타낸다. 진단에는 슬릿 램프 검사, 로즈 벵갈 염색 및 플루오레세인 염색을 사용하는 점상 상피 각막염, 융기된 수지상 판, 과립상 침윤 또는 다른 불규칙성의 식별을 포함한다(Shaikh 등, Am Fam Physician. 66(9): 1723-1730 (2002)).
본 개시는 각막 신경의 당뇨병 합병증을 갖는 대상체에서 안구 표면을 유지 및/또는 복구하는 방법을 제공한다. 각막 신경의 당뇨병성 합병증은 각막 두께 증가, 상피 결손, 상피 취약성 및 재발성 미란, 궤양, 부종, 표재성 반점 각막염, 지연 및 불완전한 상처 복구, 내피 변화, 낮은 눈물 분비, 안구 건조 증후군 및 각막 민감도 감소를 포함하는 각막 변형을 동반한다(Ljubimov 등 Vision Res.; 139: 138-152 (2017)).
대상체는, 예를 들어, 본원에 기술된 증상 또는 안구 장애 중 어느 하나를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여 전의 안구 병태의 증상과 비교하여 안구 병태의 하나 이상의 증상이 감소되는 결과를 초래한다. 본원에서 사용되는 "증상"은 본원에 기술된 것을 포함하여, 주어진 안구 상병와 연관된 임의의 진단 기준 또는 증상을 포함한다. 일부 구현예에서, 증상은 본 개시의 조성물의 투여에 따라 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 안구 병태의 하나 이상의 증상은 미치료 대조군에서의 안구 병태의 증상과 비교하여 감소된다. 일부 구현예에서, 안구 병태의 하나 이상의 증상은 반대쪽 눈에서의 안구 병태의 증상과 비교하여 감소된다. "반대쪽 눈"이란 본 개시에 따른 조성물로 치료된 눈이 아닌 대상체의 반대쪽 눈을 의미한다. 반대쪽 눈은 대상체가 양쪽 눈에 질병을 앓고 있거나, 모델 동물의 경우 양쪽 눈의 치료로 이어지는 실험 프로토콜을 받는 한, 해당 치료에 대한 대조군으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료를 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
일부 구현예에서, 사용을 위한 일차 치료제는 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 가진 대상체의 치료에 사용하기 위한, 또는 사용에 적합한, 일차 치료제를 제공한다. 일부 구현예에서, 사용을 위한 일차 치료제는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 사용을 위한 일차 치료제는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 가진 대상체의 치료에 사용하기 위한, 또는 사용에 적합한, 눈물 생성을 증가시키는 치료를 제공한다. 일부 구현예에서, 사용을 위해 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 작용제이다. 일부 구현예에서, 사용을 위해 눈물 생성을 증가시키는 치료는 바레니클린이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료를 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계로서, 일차 치료제는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터이고, 일차 치료제는 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여되는, 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계로서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 작용제이고, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료를 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계로서, 일차 치료제는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터이고, 일차 치료제는 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여되는, 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계로서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 바레니시클, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이고, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 신경영양 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 신경영양 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 신경영양 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 신경영양 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 2에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 17에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 1에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 4에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 18에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 3에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 2에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 17에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 1에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 4에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 18에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 3에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV2 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 2에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 17에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 1에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 4에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 18에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 3에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV5 캡시드 및 AAV 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 2에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 17에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 1에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 NGF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 4에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 18에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 서열번호 3에 대해 적어도 95%의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 GDNF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV9 캡시드 및 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 여기에서 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV 캡시드 및 서열번호 23을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 AAV 캡시드 및 서열번호 24를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
(a) 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계로서, 상기 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 상기 발현 카세트는 신경영양 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단계; 및
(b) 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
(a) 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계로서, 상기 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 상기 발현 카세트는 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단계; 및
(b) 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
(a) 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계로서, 상기 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 상기 발현 카세트는 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단계; 및
(b) 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계로서, 상기 치료는 유효량의 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
(a) 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계로서, 상기 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 상기 발현 카세트는 NGF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단계; 및
(b) 바레니시클, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
(a) 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계로서, 상기 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 상기 발현 카세트는 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단계; 및
(b) 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
(a) 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계로서, 상기 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 상기 발현 카세트는 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단계; 및
(b) 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계로서, 상기 치료는 유효량의 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
(a) 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계로서, 상기 일차 치료제는 발현 카세트를 포함하는 rAAV이고, 상기 발현 카세트는 GDNF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단계; 및
(b) 바레니시클, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하며,
여기에서, 상기 방법은 대조군 치료의 투여와 비교하여 눈물막 내 일차 치료제의 발현의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 유전자 산물을 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하며,
여기에서, 상기 방법은 대조군 치료의 투여와 비교하여 눈물막 내 유전자 산물의 발현의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 안구건조증; 세균성, 진균성 및 바이러스성 각막염; 신경 영양성 각막병증, 안검염, 쇼그렌 증후군; 알레르기성, 봄철(vernal), 바이러스성 및 세균성 결막염; 녹내장; 각막 신생혈관 형성; 익상편(pterygium); 각막 이영양증(원추 각막, Fuch 이영양증, 격자 이영양증 및 지도-점-지문 이영양증) 및 다른 안구 표면 및 각막 장애대상체를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하며,
여기에서, 방법은 대조군 치료의 투여와 비교하여 눈물막 내 일차 치료제의 발현의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하며,
여기에서, 방법은 대조군 치료의 투여와 비교하여 눈물막 내 일차 치료제의 발현의 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배 또는 약 10배의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 유전자 산물을 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하며,
여기에서, 방법은 대조군 치료의 투여와 비교하여 눈물막 내 유전자 산물의 발현의 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배 또는 약 10배의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 안구건조증; 세균성, 진균성 및 바이러스성 각막염; 신경 영양성 각막병증, 안검염, 쇼그렌 증후군; 알레르기성, 봄철, 바이러스성 및 세균성 결막염; 녹내장; 각막 신생혈관 형성; 익상편; 각막 이영양증(원추 각막, Fuch 이영양증, 격자 이영양증 및 지도-점-지문 이영양증) 및 다른 안구 표면 및 각막 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 유전자 산물을 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하며,
여기에서, 방법은 대조군 치료의 투여와 비교하여 눈물막 내 유전자 산물의 발현의 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배 또는 약 10배의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 안구건조증; 세균성, 진균성 및 바이러스성 각막염; 신경 영양성 각막병증, 안검염, 쇼그렌 증후군; 알레르기성, 봄철, 바이러스성 및 세균성 결막염; 녹내장; 각막 신생혈관 형성; 익상편; 각막 이영양증(원추 각막, Fuch 이영양증, 격자 이영양증 및 지도-점-지문 이영양증) 및 다른 안구 표면 및 각막 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하며,
여기에서, 방법은 대조군 치료의 투여와 비교하여 눈물막 내 일차 치료제의 발현의 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배 또는 약 10배의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 치료는 일차 치료제의 단독 투여이다. 일부 구현예에서, 대조군 치료는 대조군 용액(예를 들어, 인산염 완충 식염수)이다. 일구 구현예에서, 대조군 치료에는 투여가 없다.
효과적인 치료의 지표
삼차신경 부교감신경 경로의 특성화 및 본원에 기술된 방법에 대한 이의 중요성이 여기에서 간략하게 논의된다. 삼차신경은 안신경, 상악신경, 하악신경으로 구성되어 있다. 삼차 신경의 눈 분지 및 상악 분지는 구심성 경로를 형성한다. 비강 점막 상피 및 통각 신경에는 코 안의 반사 작용의 구심성 사지를 개시하는 수용체가 늘어서 있다. 반사의 원심성 경로는 안면 신경(중간간)을 따라 상부 타액핵으로부터 원심 신경절로 이동하고, 거기에서 구개개 신경절을 통해 더 큰 표재성 페트로살 신경을 통해 눈물샘 기능 유닛(눈물샘, 마이봄샘 및 잔 세포)의 분비선으로 진행된다. Wong 등,. Neuroscience Letters 649: 14-19 (2017)을 참조한다. 건강한 눈물막 조성은 복잡하며 표재성 지질층, 중간 점액층, 심층 점액층으로 구성된다. 이러한 층의 각 구성 요소는 서로 다른 땀샘으로부터 비롯된다: 마이봄샘(지질층), 눈물샘(수성층), 잔세포(점액층). 동물에서의 신경 해부학 연구는 삼차 부교감 신경 경로가 이러한 각 분비샘을 신경 자극한다는 것을 나타낸다. 본 개시는 눈물막 성분을 배설하기 위한 수단으로서 삼차-부교감 신경 경로를 자극하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 비강 반사를 활성화하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 삼차 신경을 활성화시키는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 전방 사골 신경을 활성화시키는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 눈물막 항상성을 개선하는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 눈물막 항상성을 재확립하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 눈물막 항상성이 결여되어 있거나 손상된 눈물막 항상성을 갖는다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 방법으로 치료 전, 치료 중 및 치료 후에 대상체의 상태를 평가하기 위한 다양한 검사가 이용 가능하다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 효과적인 치료는 a) 시각적 아날로그 척도에 대한 안구 건조증 점수 테스트, b) 쉬르머 테스트, c) 각막 플루오레세인 염색 테스트, 및 d) 안구 표면 질환 지수 테스트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 테스트에 의해 표시된다. 안구 질환의 징후 및 증상을 평가하기 위한 검사는 대상체의 시험 점수를 얻기 위해 표준화되거나 재현 가능한 조건에서 시행될 수 있다. 이러한 조건에는 대상체에게 불리한 도전을 하기 위해 인위적으로 조성된 환경에 대상체를 노출시키거나 환경(온도, 습도, 공기 흐름)을 모니터링하고 주의 깊게 통제하는 것이 포함된다.
다음의 섹션에서는 시각적 아날로그 척도의 안구 건조증 점수 검사, 쉬르머 검사, 각막 플루오레세인 염색 검사 및 안구 표면 질환 지수 검사에 대한 자세한 내용을 제공한다.
안구 건조증 점수 검사
시각적 아날로그 척도의 안구 건조증 점수 검사는 대상체의 안구 건조증, 눈물 수준 또는 안구 불편감을 평가하는 데 사용할 수 있다. 이러한 시험은 시각적 아날로그 척도를 사용하며, 0의 한 끝점에는 "불편함 없음"으로 표시되고 100의 다른 끝점에는 "최대 불편함"으로 표시되는 100 mm의 수평 라인으로 구성된다. 도 3은 시각적 아날로그 척도(실제 스케일로 표시되지 않음)의 예를 나타낸다. 대상체는 안구 건조로 인한 안구 증상을 수평선에 수직 표시를 하여 불편함 정도를 나타내도록 요청받는다. 그런 다음 대상체의 반응이 100mm 척도에서 어디에 있는지 식별하여 안구 건조증 점수를 얻는다.
mm 단위로 측정된 안구 건조증 점수는 안구 증상의 심각성과 대상체에 대한 특정 치료의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있다. 이러한 검사는 대상체에게 5분마다 시행할 수 있다는 장점이 있으며, 이를 통해 시험 관리자는 시간 경과에 따른 대상체의 증상 변화를 면밀히 모니터링할 수 있다. 숫자가 높을수록 안구 증상에 대한 불편함이 더 크고, 숫자가 낮을수록 불편 정도가 상대적으로 낮다는 것을 의미한다. 안구 건조증 점수의 감소는 해당 치료가 안구 건조증 치료, 눈물 생성 증가 또는 안구 불편감 개선에 효과적이라는 증거이다. 시간이 지남에 따라 안구 건조증 점수가 감소하는 것은 안구 증상이 감소하거나 완화되었다는 증거이며 일반적으로 대상체의 상태가 개선되었음을 나타낸다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 효과적인 치료는 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소에 의해 나타나며, 여기에서 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 제1 투여량, 또는 선택적으로 1회 이상의 후속 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량, 또는 선택적으로 1회 이상의 후속 투여량을 대상체에게 투여한 후에 결정되며, 여기에서 대상체의 안구 건조증 점수는, a) 일차 치료제의 제1 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 전 대상체의 안구 건조증 점수; b) 대조군을 투여한 대상체의 안구 건조증 점수; 또는 c) 비교 화합물을 투여한 대상체의 안구 건조증 점수와 비교된다.
본원에서 사용되는 용어 "통계적으로 유의한"은 둘 이상의 군 사이에서 관찰된 차이를 평가하기 위해 생성된 연구 설계 및 데이터 유형에 기초하여 당업자에 의해 선택된 분석 방법을 의미하며, 여기에서 해당 분석은 차이가 무작위적이지 않은지 또는 순전히 우연에 기인하는 것인지를 결정한다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수는 일차 치료제의 제1 투여량 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량을 투여하기 전의 대상체의 안구 건조증 점수와 비교된다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수는 대조군을 투여받은 대상체의 안구 건조증 점수와 비교된다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수는 비교 화합물을 투여받은 대상체의 안구 건조증 점수와 비교된다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수는 반대쪽 눈에서의 안구 건조증 점수와 비교된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소가 관찰된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 또는 350%이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되며, 여기에서 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 또는 350%이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 적어도 3 mm, 적어도 5 mm, 적어도 10 mm, 적어도 15 mm, 적어도 20 mm, 적어도 25 mm, 적어도 30 mm, 적어도 35 mm, 적어도 40 mm, 적어도 45 mm, 또는 적어도 50mm이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되며, 여기에서 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 적어도 3 mm, 적어도 5 mm, 적어도 10 mm, 적어도 15 mm, 적어도 20 mm, 적어도 25 mm, 적어도 30 mm, 적어도 35 mm, 적어도 40 mm, 적어도 45 mm, 또는 적어도 50mm이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 3 mm 내지 10 mm, 3 mm 내지 20 mm, 3 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 30 mm, 3 mm 내지 35 mm, 3 mm 내지 40 mm, 3 mm 내지 45 mm, 3 mm 내지 50 mm, 5 mm 내지 10 mm, 5 mm 내지 20 mm, 5 mm 내지 25 mm, 5 mm 내지 30 mm, 5 mm 내지 35 mm, 5 mm 내지 40 mm, 5 mm 내지 45 mm, 5 mm 내지 50 mm, 10 mm 내지 15 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 25 mm, 10 mm 내지 30 mm, 10 mm 내지 35 mm, 10 mm 내지 40 mm, 10 mm 내지 45 mm, 10 mm 내지 50 mm, 15 mm 내지 20 mm, 20 mm 내지 30 mm, 25 mm 내지 35 mm, 30 mm 내지 40 mm, 30 mm 내지 45 mm, 또는 30 mm 내지 50 mm이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 0.05 이하, 0.01 이하, 0.005 이하, 또는 0.001 이하의 p 값으로 특성화된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 0.05 이하의 p 값으로 특성화된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 0.01 이하의 p 값으로 특성화된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내, 10분 이내, 15분 이내, 20분 이내, 30분 이내, 45분 이내 또는 60분 이내이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여 후 5분 또는 10분 이내이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 1일 이내, 2일 이내, 3일 이내, 4일 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 5개월 또는 6개월 이내이다.
일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 감소는 본원에 기술된 방법 또는 조성물 중 어느 하나를 사용한 치료 후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월 또는 1년 동안 지속된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 통계적으로 유의미한 감소는 1차 치료제의 제1 투여량을 투여한 후 결정된 대상체의 안구 건조증 점수에 기초한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 통계적으로 유의미한 감소는 1차 치료제의 1회 이상의 후속 투여량, 및 선택적으로 눈물 생성을 증가시키는 치료의 1차 또는 1회 이상의 후속 투여량을 투여한 후 측정된 대상체의 안구 건조증 점수에 기초한다.
쉬르머 점수 검사(SCHIRMER SCORE TEST)
안구 건조증은 눈물의 양과 눈물 생성에 영향을 미친다. 쉬르머 검사는 눈물 생성을 평가하고 대상체의 안구 건조증, 불충분한 눈물 또는 안구 불편감의 심각성을 평가하는 데 사용할 수 있다. 이 검사는 각 눈에서 생성되는 눈물의 양을 측정한다. 이 검사는 일반적으로 먼저 대상체의 한쪽 또는 양쪽 눈에 마취제를 넣는 단계를 포함한다. 이 점안액은 검사 스트립에 반응하여 눈물이 나는 것을 방지한다. 그런 다음, 검사 관리자는 한쪽 또는 양쪽 아래 눈꺼풀 안에 여과지 조각을 넣고 피험자는 눈을 감는다. 5분 후 검사 관리자는 여과지를 제거하고 눈물이 용지에서 얼마나 멀리 이동했는지를 평가한다. 쉬르머 검사는 한쪽 또는 양쪽 눈에서 수행될 수 있다.
일반적으로, 종이에 묻은 수분의 양이 적을수록 눈물이 적게 생성되는 것이다. 건강한 눈의 경우 각 종이 조각에는 일반적으로 10 mm 이상의 수분이 포함되어 있다. 수분 10 mm 미만의 쉬르머 점수는 안구 건조증, 비정상적으로 낮은 눈물 또는 안구 불편감을 포함하는 이에 이어지는 병태 중 하나 이상을 나타낼 수 있다.
쉬르머 검사는 대상체에 대한 특정 치료의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 일정 기간 동안 대상체 증상의 중증도의 변화를 모니터링하기 위해 여러 번 투입될 수 있다. 안구 건조증, 불충분한 눈물 또는 안구 불편감으로 치료를 받고 있는 대상체에서 시간이 지남에 따라 쉬르머 점수가 증가하는 것은 눈물 부피 또는 눈물 생성이 증가했다는 증거이며, 이는 일반적으로 대상체의 병태가 개선되었음을 나타낸다. 시간이 지남에 따라 쉬르머 점수가 증가하면 해당 치료가 안구 건조증 치료, 눈물 분비 증가 또는 안구 불편감 개선에 효과적이라는 증거이다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 효과적인 치료는 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가에 의해 나타나며, 여기에서 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 일차 치료제의 제1 투여량, 또는 선택적으로 1회 이상의 후속 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량, 또는 선택적으로 1회 이상의 후속 투여량을 대상체에게 투여한 후에 결정되며, 여기에서 대상체의 쉬르머 점수는, a) 일차 치료제의 제1 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 전 대상체의 쉬르머 점수; b) 대조군을 투여한 대상체의 쉬르머 점수; 또는 c) 비교 화합물을 투여한 대상체의 쉬르머 점수와 비교된다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수는 일차 치료제의 제1 투여량 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량을 투여하기 전의 대상체의 쉬르머 점수와 비교된다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수는 대조군을 투여받은 대상체의 쉬르머 점수와 비교된다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수는 비교 화합물을 투여받은 대상체의 쉬르머 점수와 비교된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되며,
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 또는 350%이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 증가는 적어도 100%, 200%, 또는 300%이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되며, 여기에서 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 또는 350%이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 적어도 3 mm, 적어도 5 mm, 적어도 10 mm, 적어도 15 mm, 적어도 20 mm, 적어도 25 mm, 적어도 30 mm, 적어도 35 mm, 적어도 40 mm, 적어도 45 mm, 또는 적어도 50 mm이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 3 mm 내지 5 mm, 3 mm 내지 10 mm, 3 mm 내지 15 mm, 3 mm 내지 20 mm, 3 mm 내지 25 mm, 3 mm 내지 30 mm, 5 mm 내지 10 mm, 5 mm 내지 15 mm, 5 mm 내지 20 mm, 5 mm 내지 25 mm, 5 mm 내지 30 mm, 10 mm 내지 15 mm, 10 mm 내지 20 mm, 10 mm 내지 25 mm, 10 mm 내지 30 mm, 15 mm 내지 20 mm, 15 mm 내지 25 mm, 15 mm 내지 30 mm, 20 mm 내지 25 mm, 또는 20 mm 내지 30 mm이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되며, 여기에서 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 적어도 3 mm, 적어도 5 mm, 적어도 10 mm, 적어도 15 mm, 적어도 20 mm, 적어도 25 mm, 적어도 30 mm, 적어도 35 mm, 적어도 40 mm, 적어도 45 mm, 또는 적어도 50 mm이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 0.05 이하, 0.01 이하, 0.005 이하, 또는 0.001 이하의 p 값으로 특성화된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내, 10분 이내, 15분 이내, 20분 이내, 30분 이내, 45분 이내 또는 60분 이내이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여 후 5분 또는 10분 이내이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 1일 이내, 2일 이내, 3일 이내, 4일 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 5개월 또는 6개월 이내이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의한 증가는, 본원에 개시된 방법 또는 조성물에 따른 치료 직후 측정할 경우, 1분, 2분, 5분 이내, 또는 본원에 개시된 방법 또는 조성물에 따른 치료 이후 지속적으로 측정할 경우, 1일 이내, 2일 이내, 3일 이내, 4일 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 5개월 이내 또는 6개월 이내에 발생한다.
일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 증가는 본원에 기술된 방법 또는 조성물 중 어느 하나를 사용한 치료 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월 또는 1년 동안 지속된다.
일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 증가는 본원에 기술된 방법 또는 조성물 중 어느 하나를 사용한 치료 후 적어도 1분, 2분, 3분, 또는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월 또는 1년 동안 지속된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 쉬르머 점수의 통계적으로 유의미한 증가는 1차 치료제의 제1 투여량을 투여한 후 결정된 대상체의 쉬르머 점수에 기초한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 통계적으로 유의미한 증가는 1차 치료제의 1회 이상의 후속 투여량, 및 선택적으로 눈물 생성을 증가시키는 치료의 1차 또는 1회 이상의 후속 투여량을 투여한 후 측정된 대상체의 쉬르머 점수에 기초한다.
각막 플루오레세인 염색 검사
각막 표면의 변화는 눈물의 흐름이 불충분하고 과도한 건조함, 안구 건조증 및 안구 불편감과 연관된다. 각막 표면의 변화에는 표면 상피 세포를 보호하는 점액 코팅의 파괴 및/또는 상피 세포벽의 손상이 포함될 수 있다.
각막 플루오레세인 염색 검사는 각막 표면 건강을 결정하기 위한 진단 검사로서, 각막 표면의 손상 부위를 나타낼 수 있다. 정상적인 각막 표면은 눈물막에 주입된 수용성 염료를 흡수하지 않는다. 그러나 손상된 상피 세포는 수용성 염료가 표면 세포로 확산되도록 한다. 손상된 상피 세포를 염색하는 플루오레세인은 각막 표면의 건조로 인한 손상을 나타내는 각막 표면에 시각화될 수 있다.
각막 플루오레세인 염색 검사를 시행하기 위해 플루오레세인을 한쪽 또는 양쪽 눈에 도포한다. 플루오레세인은 표면 세포 사이의 영역을 침투하여 염색할 수 있다. 실명된 세포 및 실명된 표면 조직(필라멘트)의 가닥은 이러한 염색으로 시각화될 수 있다. 그런 다음 검사 관리자는 관찰된 손상의 심각도를 평가하기 위해 개발된 각막 표면 채점 시스템을 사용한다. 이러한 채점 시스템은 시간 경과에 따른 안구 건조증 치료를 모니터링하는 데 유용하다. 도 4는 채점 시스템에 사용된 NEI/Industry Workshop Scale을 나타낸다. 다른 동등한 표준화된 채점 시스템이 사용될 수 있다. 검사 관리자는 손상된 각막 표면 영역을 등급화하고 각막 표면의 손상 정도를 반영하여 각막 점수를 계산한다.
검사 관리자는 대상체에 대한 특정 치료의 효과를 평가하기 위해 각막 점수를 사용할 수 있다. 이러한 검사는 일정 기간 동안 대상체의 안구 표면의 심각도 변화를 모니터링하기 위해 여러 번 시행될 수 있다. 일반적으로, 높은 점수는 각막 표면에 대한 더 심한 수준의 손상을 나타내고, 낮은 점수는 각막 표면에 대한 더 낮은 수준의 손상을 나타낸다. 시간이 지남에 따라 각막 점수가 감소하는 것은 각막 표면의 손상이 감소했다는 증거이다. 각막 점수의 감소는 대체적으로 대상체의 상태가 개선되었음을 나타낸다. 시간 경과에 따른 각막 점수의 감소는 또한 해당 치료가 안구 건조증 치료, 눈물 생성 증가 또는 안구 불편감 개선에 효과적이라는 증거이다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 효과적인 치료는 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소에 의해 나타나며, 여기에서 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 제1 투여량, 또는 선택적으로 1회 이상의 후속 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량, 또는 선택적으로 1회 이상의 후속 투여량을 대상체에게 투여한 후에 결정되며, 여기에서 대상체의 각막 점수는, a) 일차 치료제의 제1 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 전 대상체의 각막 점수; b) 대조군을 투여한 대상체의 각막 점수; 또는 c) 비교 화합물을 투여한 대상체의 각막 점수와 비교된다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수는 일차 치료제의 제1 투여량 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량을 투여하기 전의 대상체의 각막 점수와 비교된다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수는 대조군을 투여받은 대상체의 각막 점수와 비교된다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수는 비교 화합물을 투여받은 대상체의 각막 점수와 비교된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소가 관찰된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 또는 350%이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되며, 여기에서 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 또는 350%이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소는 0.05 이하, 0.01 이하, 0.005 이하, 또는 0.001 이하의 p 값으로 특성화된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내, 10분 이내, 15분 이내, 20분 이내, 30분 이내, 45분 이내 또는 60분 이내이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여 후 5분 또는 10분 이내이다.
일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수의 감소는 본원에 기술된 방법 또는 조성물 중 어느 하나를 사용한 치료 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월 또는 1년 동안 지속된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 1일 이내, 2일 이내, 3일 이내, 4일 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 5개월 또는 6개월 이내이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 각막 점수의 통계적으로 유의미한 감소는 1차 치료제의 제1 투여량을 투여한 후 결정된 대상체의 각막 점수에 기초한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 통계적으로 유의미한 감소는 1차 치료제의 1회 이상의 후속 투여량, 및 선택적으로 눈물 생성을 증가시키는 치료의 1차 또는 1회 이상의 후속 투여량을 투여한 후 측정된 대상체의 각막 점수에 기초한다.
안구 표면 질환 지수 검사
안구 건조증, 눈물 분비 증가, 안구 불편감 개선 치료를 받은 대상체는 설문지를 통해 자신의 상태를 진단하고 안구 건조증 증상의 심각성을 판단하는 데 사용되는 중요한 정보를 제공할 수 있다. 잘 설계된 설문지는 재현성을 검증할 수 있으며 반응형 답변을 이끌어내는 관련 질문으로 구성되어야 한다. 안구 건조증 설문지의 한 가지 예는 안구 건조증 환자에 대한 12개의 질문으로 구성된 설문조사인 안구 표면 질환 지수(Ocular Surface Disease Index, OSDI)로서, 이는 증상 빈도를 직접 평가하는 데 신뢰할 수 있고 유효한 도구인 것으로 입증되었다. 평가되는 안구 증상에는 작열감/따끔거림, 가려움증, 이물감, 눈의 불편함, 안구 건조, 광선 공포증 및 통증이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 대부분의 사람들은 설문지에 익숙하며 설문지가 의료 제공자가 정보를 수집하는 효율적인 방법이라는 것을 이해한다. 설문지는 또한 응답자에게 의도치 않게 영향을 미칠 수 있는 언어적 또는 시각적 단서가 없기 때문에 편견을 줄인다. 검사 관리자는 대상체로부터 응답을 수집하고 질문에 대한 대상체의 답변을 기반으로 OSDI를 계산한다.
OSDI 점수는 안구 증상의 심각성과 대상체에 대한 특정 치료의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있다. 수치가 높을수록 안구 건조증의 중증도가 높다는 것을 나타낸다. 시간이 지남에 따라 OSDI 점수가 감소하는 것은 안구 증상이 감소하거나 완화되었다는 증거이며 일반적으로 대상체의 상태가 개선되었음을 나타낸다. OSDI 점수의 감소는 또한 해당 치료가 안구 건조증 치료, 눈물 생성 증가 또는 안구 불편감 개선에 효과적이라는 증거이다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 효과적인 치료는 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소에 의해 나타나며, 여기에서 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 제1 투여량, 또는 선택적으로 1회 이상의 후속 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량, 또는 선택적으로 1회 이상의 후속 투여량을 대상체에게 투여한 후에 결정되며, 여기에서 대상체의 OSDI 점수는, a) 일차 치료제의 제1 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 전 대상체의 OSDI 점수; b) 대조군을 투여한 대상체의 OSDI 점수; 또는 c) 비교 화합물을 투여한 대상체의 OSDI 점수와 비교된다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수는 일차 치료제의 제1 투여량 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량을 투여하기 전의 대상체의 OSDI 점수와 비교된다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수는 대조군을 투여받은 대상체의 OSDI 점수와 비교된다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수는 비교 화합물을 투여받은 대상체의 OSDI 점수와 비교된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소가 관찰된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 또는 350%이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여받은 대상체에서는 대조군과 비교하여 해당 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되며, 여기에서 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 또는 350%이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소는 0.05 이하, 0.01 이하, 0.005 이하, 또는 0.001 이하의 p 값으로 특성화된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내, 10분 이내, 15분 이내, 20분 이내, 30분 이내, 45분 이내 또는 60분 이내이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여 후 5분 또는 10분 이내이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의한 감소는 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 1일 이내, 2일 이내, 3일 이내, 4일 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 5개월 또는 6개월 이내이다.
일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수의 감소는 본원에 기술된 방법 또는 조성물 중 어느 하나를 사용한 치료 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월 또는 1년 동안 지속된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 OSDI 점수의 통계적으로 유의미한 감소는 1차 치료제의 제1 투여량을 투여한 후 결정된 대상체의 OSDI 점수에 기초한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 통계적으로 유의미한 감소는 1차 치료제의 1회 이상의 후속 투여량, 및 선택적으로 눈물 생성을 증가시키는 치료의 1차 또는 1회 이상의 후속 투여량을 투여한 후 측정된 대상체의 OSDI 점수에 기초한다.
시간 경과에 따른 효과적인 치료 유지
본 개시는 대상체의 점수에서 통계적으로 유의한 개선이 유지되는 기간에 걸친 효과적인 치료를 제공한다. 본 개시에서 사용되는 용어 "유지되는"은 대상체의 점수(EDS, 쉬르머, 각막, 또는 OSDI)에서 통계적으로 유의한 개선의 유지와 관련되며, 시간이 지남에 따라 특정 임계치 이하로 감소하지 않는 통계적으로 유의한 개선을 의미한다. 통계적으로 유의한 개선은 나중에 대상체의 점수가 변경되더라도 유지될 수 있다. 일차 치료제의 제1 투여 후 개선, 그리고 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여는 추가 투여 없이 또는 한 번 이상의 후속 투여 후에 유지될 수 있다.
예를 들어, 안구 건조증 점수가 "10% 이내로 유지"된다는 것은 대상체의 안구 건조증 점수의 감소가 지정된 시간 동안 10% 이상 감소하지 않는다는 것을 의미한다. 대상체의 안구 건조증 점수의 추가 개선은 또한 통계적으로 유의한 개선의 유지로 간주된다(예를 들어, 지정된 시간 동안 안구 건조증 점수가 15% 추가로 개선되면 "10% 이내 유지"로 간주됨).
또 다른 예로, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량을 취한 후 30분 후에 대상체의 안구 건조증 점수가 통계적으로 유의하게 감소(개선)되고, 이후 시점에서 대상체의 점수가 동일하거나 더 낮은 경우(대상체에 대한 이점을 나타냄), 통계적으로 유의한 개선이 유지된다고 할 수 있다. 대안적으로, 대상체의 안구 건조증 점수가 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량을 취한 후 30분 후에서의 대상체의 안구 건조증 점수보다 더 클 경우, 대상체는 여전히 치료 혜택을 받을 수 있고, 나중에 결정된 점수는 제1 투여량의 이전 투여 또는 치료 전 기준 점수와 비교하여 여전히 통계적으로 유의미한 개선일 수 있다.
또 다른 예로, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량을 취한 후 1주일 후에 대상체의 안구 건조증 점수가 통계적으로 유의하게 감소(개선)되고, 이후 시점에서 대상체의 점수가 동일하거나 더 낮은 경우(대상체에 대한 이점을 나타냄), 통계적으로 유의한 개선이 유지된다고 할 수 있다. 대안적으로, 대상체의 안구 건조증 점수가 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량을 취한 후 1주일 후에서의 대상체의 안구 건조증 점수보다 더 클 경우, 대상체는 여전히 치료 혜택을 받을 수 있고, 나중에 결정된 점수는 제1 투여량의 이전 투여 또는 치료 전 기준 점수와 비교하여 여전히 통계적으로 유의미한 개선일 수 있다.
개선을 구성하는 것은 측정되는 점수에 따라 상이하다. 예를 들어, 안구 건조증 점수, 각막 점수 및 OSDI 점수의 개선은 해당 점수의 수치 값의 감소이다. 쉬르머 검사의 경우, 개선은 대체적으로 쉬르머 점수의 수치 값의 증가이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 점수(예를 들어, EDS, 쉬르머, 각막, 또는 OSDI)의 통계적으로 유의한 개선의 유지는 통계적으로 유의한 개선이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 이상 감소하지 않음을 의미한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 점수(예를 들어, EDS, 쉬르머, 각막, 또는 OSDI)의 통계적으로 유의한 개선은 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 1일, 적어도 1주일, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 유지된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 점수에 있어서의 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여로부터 적어도 30분 동안 유지되고, 여기에서 통계적으로 유의한 개선은 30% 이상 감소하지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체의 점수에 있어서의 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여로부터 적어도 1주일 동안 유지되고, 여기에서 통계적으로 유의한 개선은 30% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 점수(예를 들어, EDS, 쉬르머, 각막, 또는 OSDI)의 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 1일, 적어도 1주일, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 유지되고, 여기에서 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 점수와 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 점수(예를 들어, EDS, 쉬르머, 각막, 또는 OSDI)의 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 1일, 적어도 1주일, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 유지되고, 여기에서 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 상응하는 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수와 비교하여 20% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 점수(예를 들어, EDS, 쉬르머, 각막, 또는 OSDI)의 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분 동안 유지되고, 여기에서 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 점수와 비교하여 10%, 20%, 또는 30% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 점수(예를 들어, EDS, 쉬르머, 각막, 또는 OSDI)의 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 4주 동안 유지되고, 여기에서 통계적으로 유의한 개선은 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 1주 이내의 대상체의 점수와 비교하여 10%, 20%, 또는 30% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 1일, 적어도 1주일, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월에서의 대상체의 쉬르머 점수는 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 상응하는 쉬르머 점수와 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 1일, 적어도 1주일, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월에서의 대상체의 쉬르머 점수는 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 상응하는 쉬르머 점수와 비교하여 30% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분에서의 대상체의 쉬르머 점수는 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 상응하는 쉬르머 점수와 비교하여 30%, 20%, 또는 10% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 4주에서의 대상체의 쉬르머 점수는 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 1주 이내의 대상체의 상응하는 쉬르머 점수와 비교하여 30%, 20%, 또는 10% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 1일, 적어도 1주일, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월에서의 대상체의 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수는 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 상응하는 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수와 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 1일, 적어도 1주일, 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월에서의 대상체의 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수는 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 상응하는 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수와 비교하여 30% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 30분에서의 대상체의 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수는 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 5분 이내의 대상체의 상응하는 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수와 비교하여 30%, 20%, 또는 10% 이상 감소하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 적어도 4주에서의 대상체의 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수는 일차 치료제의 제1 투여량, 및, 선택적으로, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량의 투여 후 1주 이내의 대상체의 상응하는 안구 건조증 점수, 각막 점수, 또는 OSDI 점수와 비교하여 30%, 20%, 또는 10% 이상 감소하지 않는다.
습도
용어 "습도"는 상대 습도를 의미할 수 있으며, 이는 주어진 온도에서 물의 평형 증기압에 대한 수증기의 분압의 비율이다. 상대 습도는 관심 시스템의 온도와 압력에 따라 상이하다. 저온에서 높은 상대 습도를 얻기 위해서는 더 적은 수증기가 필요하며; 따뜻하거나 뜨거운 공기에서 높은 상대 습도를 얻기 위해서는 더 많은 수증기가 필요하다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체는, 대상체의 점수(안구 건조증, 쉬르머, 각막, OSDI 점수)의 결정 간의 감소된 상대 습도를 갖는 환경에 존재한다.
특정 검사에서 대상체의 점수가 결정되는 동안, 대상체는 대상체에게 불리한 도전을 야기하는 인위적으로 조성된 환경에 존재하거나 노출될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 불리한 조건을 생성하도록 온도, 습도, 공기 흐름이 모니터링되고 제어되는 방에 있을 수 있다. 예를 들어, 대상체는 건조한 고글을 착용할 수 있으며 이의 낮은 상대 습도로 인해 눈은 낮은 상대 습도에 의해 도전을 받을 수 있다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 결정 사이에, 대상체의 쉬르머 점수의 결정 사이에, 대상체의 각막 점수의 결정 사이에, 그리고 대상체의 OSDI 점수의 결정 사이에, 대상체는 습도가 감소된 환경에 존재한다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체의 안구 건조증 점수의 결정 사이에, 대상체의 쉬르머 점수의 결정 사이에, 대상체의 각막 점수의 결정 사이에, 그리고 대상체의 OSDI 점수의 결정 사이에, 대상체는 습도가 감소된 환경 및 실온보다 낮거나 높은 온도의 환경에 존재한다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 실온에서의 감소된 상대 습도는 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5%의 미만이다. 실온은 섭씨 15도(화씨 59도) 내지 섭씨 25도(화씨 77도) 사이이다.
투여 시기 및 투여 방법
대상체에게 투여되는 투여 일정은 각 투여량의 유효 기간, 해당 약물의 약동학 프로파일 및 해당 투여량이 신체에 미치는 영향을 포함한 다양한 고려 사항에 따라 달라진다. 예를 들어, 환자의 상태가 호전되지 않는 경우, 의료 제공자의 재량에 따라, 일차 치료제의 투여, 또는 눈물 생성을 증가시키는 치료는 대상체의 질병 또는 상태의 증상을 개선하거나 그렇지 않으면 이를 조절 또는 제한하기 위해, 빈도를 증가시키거나 만성적으로 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 대상체의 병태가 개선되는 경우, 의료 제공자의 재량에 따라, 대상체의 효과적인 치료를 유지하면서 일차 치료제의 투여량, 또는 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량의 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 대상체에 대한 1회 이상의 투여량의 투여 사이의 시간이 연장되거나, 또는 하나 이상의 투여량이 투여되는 일수 사이의 시간이 연장된다. 비제한적인 예로서, 1회 이상의 투여량의 일일 투여는 격일마다 또는 일주일에 한 번 1회 이상의 투여량을 투여하는 것으로 변형된다.
본원에서 사용되는 용어 "투여량"은 일차 치료제의 투여량, 또는 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량을 의미할 수 있다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 투여량은 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 바이러스 벡터의 투여량이다. 이러한 경우, 유전자 산물의 적절한 투여량(예를 들어, 유효량)의 전달은 일정 기간 동안 유전자 산물의 치료적 유효량의 발현을 허용하는 표적 부위에 바이러스 벡터의 적절한 양/역가를 투여함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 눈물샘에 투여된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 국소 투여에 의해 눈물샘에 투여된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 직접 주사에 의해 눈물샘에 투여된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 일정 기간(예를 들어, 약 1일, 약 2일, 약 4일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 9개월, 약 12개월 또는 그 이상) 동안 유전자 산물의 안정적인 생성을 초래한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 1주 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 2주 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 3주 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 4주 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 1개월 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 2개월 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 3개월 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 4개월 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 5개월 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 6개월 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 9개월 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 투여량은 약 12개월 동안 유전자 산물의 안정적인 생산을 초래한다.
일부 구현예에서, 방법은 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계에 의해 유전자 산물의 치료적 유효량을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계에 의해 유전자 산물의 유효량을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 일차 치료제의 제1 투여량 및 1회 이상의 후속 투여량을 전달하는 단계를 포함한다. 1회 이상의 후속 투여량은 제1 투여량 후 일정 기간 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 투여량과 다음의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 적어도 1일, 적어도 3일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 최소 9개월, 최소 12개월 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 제1 투여량과 다음의 후속 투여 사이의 이러한 기간은 1-7일, 1-4주, 2-6주, 4-8주, 1-3개월, 2-4개월, 3-6개월, 4-12개월, 6-24개월이다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 적어도 1일, 적어도 3일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 최소 9개월, 최소 12개월 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 1-7일, 1-4주, 2-6주, 4-8주, 1-3개월, 2-4개월, 3-6개월, 4-12개월, 6-24개월이다.
일부 구현예에서, 일차 치료제는 반복 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 2회 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 3회 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 4회 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 5회 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 6회 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 7회 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 8회 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 9회 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 일차 치료제는 10회 투여량으로 투여된다.
일부 구현예에서, 투여량은 일차 치료제의 농도와 동일하다. 일부 구현예에서, 투여량은 일차 치료제의 농도와 상이하다. 일부 구현예에서, 반복 투여량은 동일한 눈 또는 눈물샘에 투여된다. 일부 구현예에서, 반복 투여량은 적어도 동일한 눈 또는 눈물샘에 투여된다.
일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여와 별개의 일정에 따라 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 다중 투여 사이의 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 제1 투여량 후 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 1년 또는 그 이상 동안 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 2-52주, 2-40주, 2-36주, 2-24주, 2-12주, 2-8주, 4-52주, 4-40주, 4-36주, 4-24주, 4-12주, 4-8주, 5-52주, 5-40주, 5-36주, 5-24주, 5-12주, 5-8주, 6-52주, 6-40주, 6-36주, 6-24주, 6-12주, 또는 6-8주 동안 투여된다.
일부 구현예에서, 방법은 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 눈물 생성을 증가시키는 치료의 유효량을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량 및 1회 이상의 후속 투여량을 전달하는 단계를 포함한다. 1회 이상의 후속 투여량은 제1 투여량 후 일정 기간 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 투여량과 다음의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 적어도 1일, 적어도 3일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 최소 9개월, 최소 12개월 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 제1 투여량과 다음의 후속 투여 사이의 이러한 기간은 1-7일, 1-4주, 2-6주, 4-8주, 1-3개월, 2-4개월, 3-6개월, 4-12개월, 6-24개월이다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 적어도 1일, 적어도 3일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월, 최소 9개월, 최소 12개월 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 1-7일, 1-4주, 2-6주, 4-8주, 1-3개월, 2-4개월, 3-6개월, 4-12개월, 6-24개월이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제 및/또는 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량은, 이를 필요로 하는 대상체에 대해, 일차 치료제의 투여 제1일 후 매일 1회 내지 4회, 일차 치료제의 투여 제1일 후 매일 1회, 일차 치료제의 투여 제1일 후 매일 2회, 또는 일차 치료제의 투여 제1일 후 매일 3회 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 투여 사이의 시간은 증가한다. 예를 들어, 4시간마다의 투여량은 8시간 또는 12시간마다의 투여량의 투여하는 것으로 조정된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 투여량 당 일차 치료제의 총량, 또는 눈물 생성을 증가시키는 치료의 총량은 시간이 지남에 따라 감소한다. 예를 들어, 2000 마이크로그램의 투여량은 1000 마이크로그램으로 감소되고, 여기에서 감소된 투여량의 투여는 대상체에 대한 효과적인 치료를 유지한다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 감소된 투여량은 일차 치료제의 투여의 감소, 또는 눈물 생성을 증가시키는 치료의 감소로 제공된다. 예를 들어, 비강내 스프레이로 투여하는 경우, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 2회 투여 또는 스프레이를 포함하는 투여량은 단 한 번의 스프레이의 투여로 감소된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 투여량은 각각의 콧구멍으로의 눈물 생성을 증가시키는 치료의 다수의 투여를 포함한다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 투여량은 하나의 콧구멍으로의 눈물 생성을 증가시키는 치료의 다수의 투여를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 투여량은 각각의 콧구멍으로의 눈물 생성을 증가시키는 치료의 단일 투여를 포함한다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 투여량은 하나의 콧구멍으로의 눈물 생성을 증가시키는 치료의 단일 투여를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 투여량당 하나의 콧구멍에 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 투여량당 콧구멍 둘 모두에 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제, 또는 눈물 생성을 증가시키는 치료는 적어도 28일 동안 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제는 눈물 생성을 증가시키는 치료와 동시에 또는 일정 간격을 두고 1회 이상 투여된다. 그런 다음 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여는 계속될 수 있다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 적어도 1개월 이상 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 또는 적어도 1년 또는 동안 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 2-52주, 2-40주, 2-36주, 2-24주, 2-12주, 2-8주, 4-52주, 4-40주, 4-36주, 4-24주, 4-12주, 4-8주, 5-52주, 5-40주, 5-36주, 5-24주, 5-12주, 5-8주, 6-52주, 6-40주, 6-36주, 6-24주, 6-12주, 또는 6-8주 동안 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량 및 1회 이상의 후속 투여량을 포함한다. 1회 이상의 후속 투여량은 제1 투여량 후 일정 기간 후에 투여된다. 제1 투여량과 다음의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간 또는 적어도 8시간이다. 제1 투여량과 다음의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 1-3시간, 2-4시간, 3-6시간 또는 4-8시간이다. 1회 이상의 후속 투여량 사이의 기간은 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간 또는 적어도 8시간이다. 1회 이상의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 1-3시간, 2-4시간, 3-6시간 또는 4-8시간이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후 이를 필요로 하는 대상체에 대해 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 전 이를 필요로 하는 대상체에 대해 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료, 및 일차 치료제는 이를 필요로 하는 대상체에 대해 동시에 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 눈물 생성을 증가시키는 치료의 유효량의 투여량, 및 일차 치료제의 유효량의 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여된 일차 치료제의 각각의 투여량에 대해, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량은 일차 치료제 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 투여된 일차 치료제의 각각의 투여량에 대해, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량은 일차 치료제 이후에 투여된다. 일부 구현예에서, 투여된 일차 치료제의 각각의 투여량에 대해, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량은 일차 치료제와 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 투여된 일차 치료제의 각각의 투여량에 대해, 눈물 생성을 증가시키는 치료의 다회 투여량은 일차 치료제의 투여 이후의 기간에 걸쳐 투여된다.
대상체에게 일정 기간에 걸쳐 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료 중 하나 또는 둘 모두를 다회 투여하는 만성 치료 과정에 걸쳐, 대상체는 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량보다 더 많은 투여량의 일차 치료제를 투여받을 수 있거나, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 대상체에게 투여되는 일차 치료제의 투여량과 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량의 비율이 반드시 1:1일 필요는 없다. 이러한 비율은 대상체에게 처방된 투여 요법에 따라 상이하다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 일차 치료제의 투여량과 눈물 생성을 증가시키는 치료의 투여량의 비율은 치료 과정에 걸쳐 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1 :8, 1:9, 또는 1:10이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량, 및 1회 이상의 후속 투여량, 및 일차 치료제의 유효량의 제1 투여량 및 1회 이상의 후속 투여량을 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 일차 치료제의 투여량과 눈물 생성을 증가시키는 치료의 유효량의 투여량 사이의 기간은 5분 미만, 5 내지 60분, 30 내지 90분, 1 내지 3시간, 1 내지 8시간, 1 내지 12시간, 1 내지 24시간, 8 내지 12시간, 8 내지 24시간, 12 내지 24시간, 1 내지 3일, 1 내지 7일, 1 내지 14일, 1 내지 28일, 3 내지 7일, 3 내지 14일, 3 내지 28일, 7 내지 14일, 또는 7 내지 28일이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 방법은 일차 치료제의 제1 투여량, 및 1회 이상의 후속 투여량, 및 눈물 생성을 증가시키는 치료의 제1 투여량 및 1회 이상의 후속 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 1회 이상의 후속 투여량은 제1 투여량 후 일정 기간 후에 투여된다. 제1 투여량과 다음의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간 또는 적어도 8시간이다. 제1 투여량과 다음의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 1-3시간, 2-4시간, 3-6시간 또는 4-8시간이다. 1회 이상의 후속 투여량 사이의 기간은 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간 또는 적어도 8시간이다. 1회 이상의 후속 투여량 사이의 이러한 기간은 1-3시간, 2-4시간, 3-6시간 또는 4-8시간이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료, 및 일차 치료제는 이를 필요로 하는 대상체에 대해 별도의 투여 형태로 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료, 및 일차 치료제는 이를 필요로 하는 대상체에 대해 조합된 투여 형태로 투여된다.
일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여에 후속하여 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여에 후속하여 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일차로부터 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여에 후속하여 4일차로부터 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여에 후속하여 5일차로부터 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여에 후속하여 6일차로부터 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후 7일차로부터 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여에 후속하여 8일차로부터 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여에 후속하여 9일차로부터 투여된다. 일부 구현예에서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여에 후속하여 10일차로부터 투여된다.
눈물 자극제의 투여량 및 투여 부피
본원에 기술된 일부 구현예에서, 본원에 기술된 투여량은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여된다. 치료적 치료에 효과적인 투여량은 질환 또는 병태의 중증도와 경과, 이전 요법, 환자의 건강, 상태, 체중 및 약물에 대한 반응 및 치료 의료 제공자의 판단에 따라 상이하다. 치료적 유효량은 투여량 증량 임상 시험을 포함하되 이에 국한되지 않는 방법에 의해 선택적으로 결정된다.
예방적 적용에서, 본원에 기술된 약학적 제형은 특정 질환, 장애 또는 병태에 민감하거나 그렇지 않으면 위험이 있는 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량 또는 투여량"으로 정의됩된다. 이러한 용도에서, 해당 양은 질환, 장애, 또는 병태의 중증도와 경과, 이전 요법, 환자의 건강, 상태, 체중 및 약물에 대한 반응 및 치료 의료 제공자의 판단에 따라 상이하다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 nAChR 작용제의 투여량당 양은 5-4000 마이크로그램, 5-1000 마이크로그램, 10-2000 마이크로그램, 10-700 마이크로그램, 100-700 마이크로그램, 100-600 마이크로그램, 100-500 마이크로그램, 200-700 마이크로그램, 200-600 마이크로그램, 200-500 마이크로그램, 300-600 마이크로그램, 300-500 마이크로그램, 900-4000 마이크로그램, 900-3000 마이크로그램, 900-2500 마이크로그램, 900-2000 마이크로그램, 1000-4000 마이크로그램, 1000-2500 마이크로그램, 1000-2000 마이크로그램, 1250-4000 마이크로그램, 1250-2500 마이크로그램, 1250-2000 마이크로그램, 1500-4000 마이크로그램, 1500-3000 마이크로그램, 1500-2500 마이크로그램, 1500-2000 마이크로그램, 1800-4000 마이크로그램, 1800-3000 마이크로그램, 1800-2500 마이크로그램, 1800-2250 마이크로그램, 2000-4000 마이크로그램, 2000-3000 마이크로그램, 또는 2000-2500 마이크로그램, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 nAChR 작용제의 투여량당 양은 900-2500 마이크로그램, 1000-2500 마이크로그램, 1500-3000 마이크로그램, 1800-2500 마이크로그램, 1800-2250 마이크로그램, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 베라니클린 또는 화합물 1의 투여량당 양은 900-2500 마이크로그램, 1000-2500 마이크로그램, 1500-3000 마이크로그램, 1800-2500 마이크로그램, 1800-2250 마이크로그램, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 베라니클린의 투여량당 양은 5-15 마이크로그램, 50-65 마이크로그램, 100-125 마이크로그램, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 화합물 1의 투여량당 양은 150-300 마이크로그램, 900-1200 마이크로그램, 2100-2400 마이크로그램, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제의 약학적으로 허용가능한 염이 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제의 유리 염기가 투여된다.
대상체에게 투여되는 약학적 제형의 부피는 투여 경로 및 전달 장치의 유형을 포함한 다양한 요인에 따라 달라진다. 비강내 투여의 경우, 약학적 제형의 부피는 해당 약물의 유효량을 비강에 전달하기에 충분해야 한다. 부피가 너무 적으면 약물이 비강에 도달하지 못할 수 있다. 반면, 그 부피가 너무 커서 비실용적이거나, 불편하거나, 대상체에게 투여하기가 너무 어려워서는 안 된다. 또한, 부피가 너무 크면 약학적 제형이 전달을 의도하지 않은 신체 부위로 전달될 수 있다. 이로 인해 약학적 제형의 낭비 또는 조직의 자극이 야기될 수 있다. 예를 들어, 투여 부피를 200 마이크로리터에서 100마이크로리터로 감소시키면 점안 후 비루를 감소시켜 목구멍 상부/연구개 자극 발생률을 줄일 수 있다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 투여량당 약학적 제형의 총 부피는 50-250 마이크로리터, 75-125 마이크로리터, 150-250 마이크로리터, 또는 175-225 마이크로리터이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 투여량당 약학적 제형의 총 부피는 50 마이크로리터, 약 75 마이크로리터, 약 100 마이크로리터, 약 125 마이크로리터, 약 150 마이크로리터, 약 175 마이크로리터, 약 200 마이크로리터, 약 225 마이크로리터, 또는 약 250 마이크로리터이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 콧구멍당 약학적 제형의 총 부피는 50-250 마이크로리터, 75-125 마이크로리터, 150-250 마이크로리터, 또는 175-225 마이크로리터이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 콧구멍당 약학적 제형의 총 부피는 약 50 마이크로리터, 약 75 마이크로리터, 약 100 마이크로리터, 약 125 마이크로리터, 약 150 마이크로리터, 약 175 마이크로리터, 약 200 마이크로리터, 약 225 마이크로리터, 또는 약 250 마이크로리터이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은, 1 mg/mL 내지 40 mg/mL, 1 mg/mL 내지 30 mg/mL, 1 mg/mL 내지 20 mg/mL, 1 mg/mL 내지 10 mg/mL, 1 mg/mL 내지 5 mg/mL, 2 mg/mL 내지 40 mg/mL, 2 mg/mL 내지 30 mg/mL, 2 mg/mL 내지 20 mg/mL, 2 mg/mL 내지 10 mg/mL, 2 mg/mL 내지 5 mg/mL, 5 mg/mL 내지 40 mg/mL, 5 mg/mL 내지 30 mg/mL, 5 mg/mL 내지 20 mg/mL, 5 mg/mL 내지 10 mg/mL, 또는 5 mg/mL 내지 15 mg/mL의 nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양을 포함하는 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 여기에서 투여량당 nAChR 작용제의 농도는, 0.01%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.01%(w/v) 내지 1.0%(w/v), 0.01%(w/v) 내지 1.5%(w/v), 0.01%(w/v) 내지 2.0%(w/v), 0.01%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 0.01%(w/v) 내지 3.0%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 1.0%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 1.5%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 2.0%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 3.0%(w/v), 1.0%(w/v) 내지 1.5%(w/v), 1.0%(w/v) 내지 2.0%(w/v), 1.0%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 1.0%(w/v) 내지 3.0%(w/v), 1.5%(w/v) 내지 2.0%(w/v), 1.5%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 1.5%(w/v) 내지 3.0%(w/v), 2.0%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 또는 2.0%(w/v) 내지 3.0%(w/v), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, 바레니실린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 여기에서 투여량당 바레니시클의 농도는 약 0.058%(w/v), 또는 약 0.12%(w/v), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, 바레니실린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 여기에서 투여량당 바레니시클의 농도는 약 0.06%(w/v) 미만, 또는 0.15%(w/v) 미만, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, 바레니실린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 여기에서 투여량당 바레니시클의 농도는 약 0.058%(w/v), 또는 약 0.12%(w/v), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이고; 여기에서 투여량당 부피는 약 50 마이크로리터이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, 바레니실린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 여기에서 투여량당 바레니시클의 농도는 약 0.06%(w/v) 미만, 또는 0.15%(w/v) 미만, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이고; 여기에서 투여량당 부피는 약 50 마이크로리터이다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, 바레니실린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 여기에서 투여량당 바레니시클의 농도는 약 0.058%(w/v), 또는 약 0.12%(w/v), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이고; 여기에서 투여량당 부피는 약 100 마이크로리터이다. 본원의 일부 구현예에서, 100 마이크로리터 투여량은 2개의 50 마이크로리터 스프레이로서 전달된다. 본원의 일부 구현예에서, 100 마이크로리터 투여량은 단일 100 마이크로리터 스프레이로서 전달된다.
본원에 기술된 일부 구현에에서, 바레니실린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비강내 투여를 위한 약학적 제형으로 투여되고, 여기에서 투여량당 바레니시클의 농도는 약 0.06%(w/v) 미만, 또는 0.15%(w/v) 미만, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양이고; 여기에서 투여량당 부피는 약 100 마이크로리터이다. 본원의 일부 구현예에서, 100 마이크로리터 투여량은 2개의 50 마이크로리터 스프레이로서 전달된다. 본원의 일부 구현예에서, 100 마이크로리터 투여량은 단일 100 마이크로리터 스프레이로서 전달된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR 작용제는 약학적으로 허용가능한 염이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, nAChR은 화합물 1 갈락타레이트(예를 들어, 헤미-갈락타레이트 이수화물) 또는 화합물 1 시트레이트(예를 들어, 모노시트레이트 염)이다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 화합물 1은 유리 염기이다. 본원에 기술된 일부 양태에서, nAChR 작용제는 바레니클린 타르트레이트이다.
이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 nAChR 작용제 유리 염기의 양 및 상응하는 염의 양은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 약학적 제형의 nAChR 작용제 농도 및 약학적 제형의 부피에 기초하여 계산될 수 있다. 다음의 예는 약학적 제형의 농도와 부피 사이의 관계, 및 대상체에게 투여된 nAChR 작용제 염 및 유리 염기의 양을 예시한다.
예를 들어, 2.0% 화합물 1 헤미-갈락타레이트 이수화물 용액은 용액 1 mL당 염 20 mg에 해당한다. 2.0% 화합물 1 헤미-갈락타레이트 이수화물 용액은 1.1% 화합물 1 유리 염기 용액에 해당한다. 1.1%의 유리 염기 용액은 화합물 1 유리 염기 11.1mg/mL에 해당한다.
50 μL의 2.0% 화합물 1 헤미-갈락타레이트 이수화물 용액은 약 1000 μg의 화합물 1 헤미-갈락타레이트 이수화물을 함유하며, 이는 약 554 μg의 화합물 1 유리 염기에 해당한다. 마찬가지로, 100 μL의 2.0% 화합물 1 헤미-갈락타레이트 이수화물 용액은 약 2000 μg의 화합물 1 헤미-갈락타레이트 이수화물을 함유하며, 이는 약 1108 μg의 화합물 1 유리 염기에 해당한다. 염의 양 및 상응하는 유리 염기의 양은 유사한 방식으로 다른 농도 또는 부피에 대해 계산될 수 있다.
또 다른 예에서, 2.3% 화합물 1 모노-시트레이트 용액은 용액 1 mL당 염 23.2 mg에 해당한다. 2.3% 화합물 1 모노-시트레이트 용액은 1.1% 화합물 1 유리 염기 용액에 해당한다. 1.1%의 유리 염기 용액은 화합물 1 유리 염기 11.1mg/mL에 해당한다.
50 μL의 2.3% 화합물 1 모노-시트레이트 용액은 약 1161 μg의 화합물 1 모노-시트레이트를 함유하며, 이는 약 554 μg의 화합물 1 유리 염기에 해당한다. 마찬가지로, 100 μL의 2.3% 화합물 1 모노-시트레이트 용액은 약 2322 μg의 화합물 1 모노-시트레이트를 함유하며, 이는 약 1108 μg의 화합물 1 유리 염기에 해당한다. 염의 양 및 상응하는 유리 염기의 양은 유사한 방식으로 다른 농도 또는 부피에 대해 계산될 수 있다.
또 다른 예에서, 0.10% 바레니클린 타르트레이트 용액은 용액 1 mL당 염 1.00 mg에 해당한다. 0.10% 바레니클린 타르트레이트 용액은 용액 중 0.0585% 바레니클린 유리 염기에 해당한다, 0.0585%의 유리 염기 용액은 0.584 mg/mL의 바레니클린 유리 염기에 해당한다.
50 μL의 0.10% 바레니클린 타르트레이트 용액은 약 50 μg의 바레니클린 타르트레이트를 함유하며, 이는 약 29.2 μg의 바레니클린 유리 염기에 해당한다. 마찬가지로, 100 μL의 0.10% 바레니클린 타르트레이트 용액은 약 100 μg의 바레니클린 타르트레이트를 함유하며, 이는 약 58.5 μg의 바레니클린 유리 염기에 해당한다. 염의 양 및 상응하는 유리 염기의 양은 유사한 방식으로 다른 농도 또는 부피에 대해 계산될 수 있다.
또 다른 예에서, 0.20% 바레니클린 타르트레이트 용액은 용액 1 mL당 염 2.00 mg에 해당한다. 0.20% 바레니클린 타르트레이트 용액은 용액 중 0.117% 바레니클린 유리 염기에 해당한다, 0.117%의 유리 염기 용액은 1.17 mg/mL의 바레니클린 유리 염기에 해당한다.
50 μL의 0.20% 바레니클린 타르트레이트 용액은 약 100 μg의 바레니클린 타르트레이트를 함유하며, 이는 약 58.5 μg의 바레니클린 유리 염기에 해당한다. 마찬가지로, 100 μL의 0.20% 바레니클린 타르트레이트 용액은 약 200 μg의 바레니클린 타르트레이트를 함유하며, 이는 약 117 μg의 바레니클린 유리 염기에 해당한다. 염의 양 및 상응하는 유리 염기의 양은 유사한 방식으로 다른 농도 또는 부피에 대해 계산될 수 있다.
염 형태의 상응하는 양은 자유 염기의 양에 곱셈 계수를 곱하여 계산할 수 있다. 곱셈 계수는 염 형태의 분자량을 자유 염기의 분자량으로 나눔으로써 계산된다. 예를 들어, 화학식 I 유리 염기의 화합물의 양을 모노-시트레이트 염으로 전환하기 위한 곱셈 계수는 2.096이다. 화학식 I 유리 염기의 화합물의 양을 헤미-갈락타레이트 이수화물로 전환하기 위한 곱셈 계수는 1.805이다. 바레니클린 유리 염기의 양을 바레니클린 타르트레이트로 전환하기 위한 곱셈 계수는 1.710이다.
유리 염기의 상응하는 양은 염 형태의 양에 곱셈 계수를 곱하여 계산할 수 있다. 해당 계수는 염 형태의 분자량을 유리 염기의 분자량으로 나눔으로써 계산된다. 예를 들어, 바레니클린 타르트레이트의 양을 유리 염기로 변환하기 위한 곱셈 계수는 0.5846이다. 화학식 I 모노-시트레이트의 화합물의 양을 유리 염기로 전환하기 위한 곱셈 계수는 0.477이다. 화학식 I 헤미-갈락타레이트 이수화물의 화합물의 양을 유리 염기로 전환하기 위한 곱셈 계수는 0.554이다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 대상체의 비강내에 투여된다. 본원에 기술된 약학적 제형은 액체, 현탁액, 에어로졸, 겔, 연고, 건조 분말, 크림, 페이스트, 로션, 또는 밤을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 분무 펌프, 주사기, 점적기, 병 분무기, 분무 펌프, 흡입기, 분말 스프레이 장치, 기화기, 패치, 약용 스틱, 피펫, 또는 액체의 제트에 의해 비강내로 투여된다.
일부 구현예에서, nAChR 작용제는 TYRVAYA(바레니클린 용액) 비강내 스프레이로서, 이는 각각의 0.05 mL 스프레이 중 0.03 mg의 바레니클린(0.05 mg의 바레니클린 타르트레이트와 동등함)을 전달하는 비강 스프레이이다. TYRVAYA(바레니클린 용액) 비강내 스프레이는 0.6 mg/mL 강도의 투명한 용액으로서 비강내 사용을 위해 제조되었다.
부작용
본 개시는 nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 국소 투여(비강내) 방법을 제공한다. 국소 투여는 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있는 약물의 양을 제한함으로써 잠재적인 부작용을 감소시키는 것을 포함하여, 전신 투여에 비해 장점을 갖는다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 투여된 nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 전신 생체이용성이 아니다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 방법은 바람직하지 않은 전신 부작용을 초래하지 않는다. 본원에 개시된 일부 구현예에서, 방법은 바람직하지 않은 정신활성 부작용을 초래하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체는 눈물의 과잉 생산, 기침, 인후 자극, 점안 부위 자극, 재채기, 비인두염, 코 자극, 치통, 구강 건조, 및 두통을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부작용을 경험하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 제1 투여량 또는 하나 이상의 후속 투여량 투여 후 5분 내지 60분 이내에, 대상체는 눈물의 과잉 생산, 기침, 인후 자극, 점안 부위 자극, 재채기, 비인두염, 코 자극, 치통, 구강 건조, 및 두통을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부작용을 경험하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물의 과잉 생산은 대상체의 쉬르머 점수가 20 mm를 초과하여 증가함으로써 나타난다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 눈물의 과잉 생산은 비실용적이거나 바람직하지 않은 양의 과도한 눈물로 나타난다. 예를 들어, 대상체의 눈 화장을 방해하거나 대상체가 과도한 눈물을 닦아내거나 티슈로 흡수하도록 유도하는 양으로 눈물을 흘리는 것은 비실용적이고 바람직하지 않은 효과이다.
굴절 수술
본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체는 눈의 굴절 수술을 받거나 받은 적이 있다. 굴절 수술의 예는 레이저 보조 인시츄 굴절 교정 각막 형성술(Laser-Assisted In-Situ Keratomileusis, LASIK), 난시 각막절개술(astigmatic keratotomy, AK), 광굴절 각막절제술(photorefractive keratectomy, PRK) 및 변측 이완 절개술(limbal relaxing incision, LRI)을 포함한다. 사용을 위한 방법, 용도 및 조성물의 일부 구현예에서, 굴절 수술은 레이저 보조 인시츄 굴절 교정 각막 형성술(LASIK)이다. 사용을 위한 방법, 용도 및 조성물의 일부 구현예에서, 굴절 수술은 난시 각막절개술(AK)이다. 사용을 위한 방법, 용도 및 조성물의 일부 구현예에서, 굴절 수술은 광굴절 각막절제술(PRK)이다. 사용을 위한 방법, 용도 및 조성물의 일부 구현예에서, 굴절 수술은 변측 이완 절개술(LRI)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 화합물 또는 조성물은 수술 전 및 수술 후에 둘 모두에서 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체는 2주 이내에 눈의 굴절 수술을 받았거나 2주 이내에 눈의 굴절 수술을 받을 예정이다.
라식(LASIK) 인구
일부 구현예에서, 본원에 기술된 일차 치료제 및/또는 눈물 생성을 증가시키는 치료는 수술 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 일차 치료제 및/또는 눈물 생성을 증가시키는 치료는 수술 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 일차 치료제 및/또는 눈물 생성을 증가시키는 치료는 수술 전 및 수술 후 둘 모두에서 투여된다. 본원에 기술된 일부 구현예에서, 대상체는 2주 이내에 라식 수술을 받았거나 2주 이내에 라식 수술을 받을 예정이다.
각막염
정상 눈물막은 신경 성장 인자, 표피 성장 인자, 형질전환 성장 인자-베타, 간세포 성장인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 각질세포 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자를 포함하는 다수의 생물학적 활성 성장 인자를 포함한다. 각막이 자극이나 압력을 감지하면 눈꺼풀이 닫히고 각막과 눈을 보호하기 위해 눈물이 생성된다.
신경영양성 각막염은 각막의 민감도를 감소시킨다. 신경영양성 각막염(NK)이 있는 대상체는 각막 신경을 자극하는 신경이 제대로 기능하지 못하기 때문에 각막 기능이 손상된다; 이러한 신경은 각막의 기능을 돕는 자극을 전달한다. NK에서는 이러한 신경이 제대로 기능하지 않기 때문에, 상피라고 하는 각막의 바깥층이 파괴되어 상피 결손이 발생할 수 있다. 신경영양성 각막염이 더 진행되면 각막 기질이라고 하는 내부층이 파괴되어 각막이 얇아질 수 있다. 이를 기질 '용융'이라고 한다. 진행된 기질 용융에서는 각막이 심하게 얇아질 수 있으며, 이로 인해 눈 안쪽에 구멍이 생기거나 구멍으로 인해 감염이 발생하고 잠재적으로 실명할 수도 있다. NK는 각막의 상처 치유 불량, 각막의 흉터, 시력 상실 등 다양한 합병증을 유발할 수 있다. 각막에 작용하는 신경을 손상시킬 수 있는 다양한 질환이 존재한다.
이러한 장애의 치료에 있어서, 대상체의 장애가 얼마나 진행되었는지에 따라 다양한 치료법이 사용될 수 있다. 가장 최근에는, 재조합 인간 신경 성장 인자(rhNGF)(Oxervate, Dompe)가 NK 치료제로 승인되었다. 불행히도, 해당 치료법에는 몇 가지 단점이 있는데, 그 중에는 제품이 2시간 간격으로 하루에 6번 투여되어야 한다는 사실, 8주 동안 제품이 자가 투여에 번거로울 수 있는 피펫과 함께 제공된다는 사실, 제품을 냉장 보관해야 한다는 사실, 그리고 4주 공급 비용이 $10K 이상이라는 사실을 포함한다.
본 개시는 각막염 대상체를 치료하기 위한 방법, 용도 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 각막염은 NK이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 NK를 가진 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물은 천연 눈물막을 자극한다. 일부 구현예에서, NK를 가진 대상체는 본원에 제공된 조성물을 하루 1회 또는 2회 투여한다. 일부 구현예에서, NK를 가진 대상체는 본원에 제공된 조성물을 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 또는 적어도 8주 동안 하루 1회 또는 2회 투여한다. 일부 구현예에서, NK를 가진 대상체는 본원에 제공된 조성물을 적어도 8주 동안 하루 2회 투여한다. 일부 구현예에서, NK를 가진 대상체는 본원에 제공된 조성물을 적어도 8주 동안 하루 2회 비강내로 투여한다.
C 최대 혈장 농도
본원에 기술된 방법 및 용도는 눈물 생성을 증가시키기 위해 투여되는 약물의 국소 비강내 투여를 포함한다. 개시된 방법 및 용도는 국소 비강내 투여이기 때문에, 순환계 혈장에서 눈물 생성을 증가시키기 위해 투여되는 약물(예를 들어, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염)의 농도는 전신 형태의 투여(예를 들어, 경구 제제의 섭취)로부터 달성되는 농도에 비해 낮다. nAChR 작용제의 혈장 농도가 낮으면 메스꺼움, 수면 장애, 변비, 헛배부름, 구토, 발진 및 소양증과 같은 피부 상태, 두통, 복통, 소화 불량, 위식도 역류 질환 및 구강 건조와 같은 전신 순환계에서의 nAChR 작용제와 관련된 잠재적인 바람직하지 않은 부작용을 피할 수 있다.
대상체에서 nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 혈장 농도를 특성화하는 한 가지 방법은 C최대 - nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 대상체에게 투여된 후 및 제2 투여의 투여 전 nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 도달하는 최대 또는 피크 혈청 농도를 측정하는 것이다. C최대를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. C최대의 결정을 포함하는, 화학식 I의 화합물의 약동학적 프로파일을 결정하기 위해 사용되는 프로토콜의 비제한적인 예가 실시예 3에 제공된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, C최대는 대상체에 대해 계산된다. 일부 구현예에서, C최대는 둘 이상의 대상체의 평균 C최대로부터 계산된다. 일부 구현예에서, C최대는 서브세트 모집단의 평균 C최대로부터 계산된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 5 ng/mL 미만, 4 ng/mL 미만, 3 ng/mL 미만, 또는 2 ng/mL 미만의 nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 혈장 C최대를 갖는다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 5 ng/mL 미만, 4 ng/mL 미만, 3 ng/mL 미만, 또는 2 ng/mL 미만의 nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 혈장 C최대를 갖고; 여기에서, 이를 필요로 하는 대상체에게는 10 마이크로그램 내지 150 마이크로그램, 10 마이크로그램 내지 100 마이크로그램, 10 마이크로그램 내지 50 마이크로그램, 50 마이크로그램 내지 150 마이크로그램, 50 마이크로그램 내지 100 마이크로그램, 100 마이크로그램 내지 1500 마이크로그램, 100 마이크로그램 내지 600 마이크로그램, 200 마이크로그램 내지 400 마이크로그램, 400 마이크로그램 내지 600 마이크로그램, 또는 750 마이크로그램 내지 1200 마이크로그램의 nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양을 포함하는 투여량이 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 5 ng/mL 미만, 4 ng/mL 미만, 3 ng/mL 미만, 또는 2 ng/mL 미만의 화합물 1, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 혈장 C최대를 갖고; 여기에서, 이를 필요로 하는 대상체에게는 100 마이크로그램 내지 1500 마이크로그램, 100 마이크로그램 내지 600 마이크로그램, 200 마이크로그램 내지 400 마이크로그램, 400 마이크로그램 내지 600 마이크로그램, or 750 마이크로그램 내지 1200 마이크로그램의 화합물 1, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양을 포함하는 투여량이 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 5 ng/mL 미만, 4 ng/mL 미만, 3 ng/mL 미만, 또는 2 ng/mL 미만의 화합물 1, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 혈장 C최대를 갖고; 여기에서, 이를 필요로 하는 대상체에게는 150 마이크로그램 내지 300 마이크로그램, 900 마이크로그램 내지 1200 마이크로그램, 2100 마이크로그램 내지 2400 마이크로그램의 화합물 1, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양을 포함하는 투여량이 투여된다.
본원에 기술된 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 5 ng/mL 미만, 4 ng/mL 미만, 3 ng/mL 미만, 또는 2 ng/mL 미만의 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 혈장 C최대를 갖고; 여기에서, 이를 필요로 하는 대상체에게는 5 마이크로그램 내지 15 마이크로그램, 50 마이크로그램 내지 65 마이크로그램, 100 마이크로그램 내지 125 마이크로그램의 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양을 포함하는 투여량이 투여된다.
본 개시 전반에 걸쳐, 개시된 nAChR 작용제의 양은 제형 중 존재하는 nAChR 작용제 유리 형태의 양을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "상응하는 양"은 해당 제형에 인용된 nAChR 유리 형태의 양을 얻기 위해 필요한 nAChR 작용제의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미한다. 화합물의 유리 형태와 염 형태 사이의 분자량 차이를 고려하는, 화합물 1의 약학적으로 허용가능한 염의 상응하는 양과 같은 화합물의 염의 "상응하는 양"을 계산하는 방법은, 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 175.24g의 화합물 1 유리 염기는 316.34g의 헤미-갈락타레이트 이수화물 염 또는 367.36g의 모노-시트레이트 염에 해당할 것이다. 또 다른 예에서, 211.267g의 바레니클린 유리 염기는, 361.354g의 바레니클린 타르트레이트에 해당할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 "대략"이라는 용어와 동의어로 사용된다. 예시적으로, 양과 관련된 용어 "대략"의 사용은 인용된 값들을 약간 벗어난 값들, 예를 들어, 플러스 또는 마이너스 0.1% 내지 20%, 플러스 또는 마이너스 0.1% 내지 10%, 플러스 또는 마이너스 0.1% 내지 5%, 또는 플러스 또는 마이너스 0.1% 내지 2%를 나타낸다.
본 개시 전반에 걸쳐, 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법 또는 안구 표면에 유전자 산물을 전달하는 방법의 맥락 내에서 논의되는 다양한 구현예는 또한 의약의 제조에 사용되는 화합물, 다양한 방법에 사용되는 화합물, 약학적 제형, 및 키트와 관련된 구현예에 적용될 수 있다.
바람직하게는, 일차 치료제가 이에 상응하는 유전자 산물을 운반하는 벡터의 투여에 의해 전달되는 경우, 방법은 바이러스 벡터 단독 투여에 비해, 사전 결정된 시간(예를 들어, 약 1분, 약 2분, 약 4분, 약 3분, 약 5분, 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 5일 또는 약 1주일) 내에 안구 표면에서의 유전자 산물의 발현; 및/또는 안구 표면으로 전달되는 유전자 산물의 증가된 양을 초래한다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 5분이다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 30분이다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 1시간이다. 일부 구현예에서, 사전 결정된 시간은 약 2시간이다. 본원에서 사용되는 "사전 결정된 시간"은 제1 기준 시점(예를 들어, 조성물의 투여 또는 그 이후의 임의의 시간 시점)과 제2 기준 시점(예컨대, 생물학적 샘플의 수집) 사이의 시간 간격을 의미한다. 사전 결정된 시간은 치료 효과의 동역학 또는 눈물 생성의 증가와 같은 이론적 고려에 의해 결정될 수 있거나, 사용된 분석에 대한 적절한 사전 결정된 시간을 결정하기 위한 시간 경과 실험을 수행함으로써 결정될 수 있다. 사전 결정된 시간은 안구 표면, 눈물막, 또는 다른 해부학적 위치로의 선택된 분자의 변화율 및/또는 플럭스의 계산을 가능하게 하기 위해 선택된다.
일부 구현예에서, 안구 표면 상의 유전자 산물의 발현 및/또는 양을 측정하기 위해, 수집 장치가 안구 표면으로부터 생물학적 샘플을 수집하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 수집 장치는 일차 치료제의 투여 후 사전 결정된 시간에서 샘플을 수집하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 수집 장치는 일정 기간(예를 들어, 약 1분, 약 2분, 약 4분, 약 3분, 약 5분, 약 30분, 또는 약 1시간) 동안 눈에 적용된다. 일부 구현예에서, 수집 장치는 눈의 하부 막다른 골목(cul-de-sac)으로부터 체액을 수집하기 위해 적용된다. 일부 구현예에서, 수집 장치는 눈물 반월상 연골로부터 체액을 수집하기 위해 적용된다. 일부 구현예에서, 수집 장치는 전-안구막으로부터 유체를 수집하기 위해 적용된다. 일부 구현예에서, 수집 장치는 심지이다. 일부 구현예에서, 수집 장치는 쉬르머 스트립이다. 일부 구현예에서, 수집 장치는 모세관이다.
일부 구현예에서, 안구 표면 상의 유전자 산물의 양은 대상체로부터 체액을 수집하기 위해 수집 장치가 적용된 후에 수집된 생물학적 샘플에서 유전자 산물의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 질량-분광법이 유전자 산물의 양을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 수집된 생물학적 샘플은 프로테아제 분해를 거치고, 이에 이어서 유전자 산물의 양은 LC-MS/MS 절차를 통해 정량화될 수 있다. 질량 분석법 기반 단백질 정량 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 수집된 생물학적 샘플 중의 유전자 산물의 양은 웨스턴 블롯, ELISA, 정량적 PCR, 노던 블롯, 서던 블롯, 도트 블롯, 측방 유동 분석, 생체층 간섭계, 형광 분광법, 발광 분광법, 자외선/가시광선 분광법, 분광광도법, 분석적 초원심분리 원심분리, 동적 광 산란법, 크기-배제 크로마토그래프, 이온-교환 크로마토그래프, 겔 전기영동, 모세관 전기 영동, 고성능 액상 크로마토 그래피, 역상 크로마토 그래피, 또는 다른 정량 또는 반-정량 분석 방법에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 수집된 생물학적 샘플 중의 유전자 산물의 양은 단백질 어레이에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 수집된 생물학적 샘픔 중의 유전자 산물의 양은 웨스턴 블로팅에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 수집된 생물학적 샘플 중의 유전자 산물의 양은 면역블롯 분석에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 수집된 생물학적 샘플 중의 유전자 산물의 양은 전기영동 분석법(예를 들어, Agilent Bioanalyzer 2100을 사용함)에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 수집된 생물학적 샘플 중의 유전자 산물의 양은 미세유체 기반 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 수집된 생물학적 샘플 중의 유전자 산물의 양은 멀티플렉스 비드-기반 면역형광 샌드위치 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 검정 및 분석된 유전자 산물의 비제한적인 예는 문헌[D' Souza and Tong (2014) Eye and Vision 1:6]에 기술되어 있다.
치료에 대한 대상체의 반응을 설명하기 위해 본원에서 사용되는 통계적으로 유의한 변화는 주어진 분석에서 대상체의 점수의 증가 또는 감소로부터 계산될 수 있다. 대상체 점수의 변화가 통계적으로 유의한지의 여부 및 두 데이터 세트가 서로 유의하게 다른지의 여부를 결정하는 비제한적인 예는 ANCOVA 모델을 기반으로 한 계산 및 t-검정 및 비모수 Wilcoxon 순위 합계 검정과 같은 통계적 가설 검정을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 모델 및 통계적 가설 검정이 고려된다.
약학적 조성물 및 키트
일부 구현예에서, 눈 및/또는 눈물샘의 세포를 효과적으로 형질도입시키기에 적합한 임의의 농도의 바이러스 입자는 시험관 내 또는 생체 내에서 눈 및/또는 눈물샘의 세포를 접촉시키기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 입자는 mL당 108 벡터 게놈 이상의 농도, 예를 들어, mL당 5×108 벡터 게놈; mL당 109 벡터 게놈; mL당 5×109 벡터 게놈; mL당 1010 벡터 게놈; mL당 5×1010 벡터 게놈; mL당 1011 벡터 게놈; mL당 5×1011 벡터 게놈; mL당 1012 벡터 게놈; mL당 5×1012 벡터 게놈; mL당 1013 벡터 게놈; mL당 1.5×1013 벡터 게놈; mL당 3×1013 벡터 게놈; mL당 5×1013 벡터 게놈; mL당 7.5×1013 벡터 게놈; mL당 9×1013 벡터 게놈; mL당 1014 벡터 게놈; mL당 5×1014 벡터 게놈 또는 이 이상의 농도로 제형화될 수 있으나, 일반적으로 mL당 1×1015 벡터 게놈을 넘지는 않는다. 유사하게, 원하는 효과를 부여하거나 질환을 치료하기 위해 눈 및/또는 눈물샘의 세포의 적절한 형질도입을 제공하기에 적합한 임의의 총 수의 바이러스 입자를 포유류 또는 영장류의 눈에 투여할 수 있다. 다양한 실시예에서, 적어도 107; 5×107; 108; 5×108; 109; 5×109; 1010; 5×1010; 1011; 5×1011; 1012; 5×1012; 1013; 1,5×1013; 3×1013; 5×1013; 7.5×1013; 9×1013; 1×1014 바이러스 입자, 또는 5×1014 바이러스 입자, 그러나 일반적으로 1×1015 이하의 바이러스 입자가 눈당 주사된다. 포유류 또는 영장류의 눈에 대한 벡터의 임의의 적절한 수의 투여가 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 단일 투여를 포함하고; 다른 구현예에서, 다수의 투여가 주치의에 의해 적절하다고 간주되는 기간에 걸쳐 이루어진다.
대상체 바이러스 벡터는, 제한 없이, 1×108 벡터 게놈 이상, 예를 들어, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 또는 1×1013 벡터 게놈 이상, 소정의 경우, 1×1014 벡터 게놈을 포함하지만, 일반적으로 4×1015 벡터 게놈 이하를 포함하는 임의의 적절한 단위 투여량으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는, 제한 없이, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 또는 1×1013 벡터 게놈 이상을 포함하는 임의의 적절한 단위 투여량으로 제형화될 수 있다. 일부 경우, 단위 투여량은 최대 약 5×1015 벡터 게놈, 예를 들어, 5×1014 벡터 게놈 이하, 예를 들어, 1×1013, 1×1012, 1×1011, 1×1010, 또는 1×109 벡터 게놈 이하, 소정의 경우 1×108 벡터 게놈 이하, 및 일반적으로 1×108 벡터 게놈 이상이다. 일부 경우, 단위 투여량은 최대 약 5×1015 벡터 게놈, 예를 들어, 5×1014 벡터 게놈 이하, 예를 들어, 1×1013, 1×1012, 1×1011, 1×1010, 1×109, 1×108, 또는 1×107 벡터 게놈 이하이다. 일부 경우, 단위 투여량은 1×1010 내지 1×1011 벡터 게놈이다. 일부 경우, 단위 투여량은 1×1010 내지 3×1012 벡터 게놈이다. 일부 경우, 단위 투여량은 1×109 내지 3×1013 벡터 게놈이다. 일부 경우, 단위 투여량은 1×108 내지 3×1014 벡터 게놈이다.
일부 경우, 약학적 조성물의 단위 투여량은 감염 다중성(multiplicity of infection, MOI)을 이용하여 측정될 수 있다. MOI는 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비율 또는 배수를 의미한다. 일부 경우, MOI는 1×106일 수 있다. 일부 경우, MOI는 1×105 내지 1×107일 수 있다. 일부 경우, MOI는 1×104 내지 1×108일 수 있다. 일부 경우, 본 개시의 재조합 바이러스는 적어도 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017, 및 1×1018 MOI이다. 일부 경우, 본 개시의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 MOI이다. 일부 경우, 본 개시의 재조합 바이러스는 최대 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017, 및 1×1018 MOI이다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물의 양은 약 1×108 내지 약 1×1015 재조합 바이러스, 약 1×109 내지 약 1×1014 재조합 바이러스, 약 1×1010 내지 약 1×1013 재조합 바이러스, 또는 약 1×1011 내지 약 3×1012 재조합 바이러스이다.
대상체 바이러스 벡터 조성물의 제조에 있어서, 예를 들어, 포유류 세포(예를 들어, 293 세포), 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포), 미생물 및 효모를 포함하는 임의의 rAAV 비리온을 생산하기 위한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 rAAV 비리온 게놈이 안정적으로 유지되고 포장되는 숙주 세포 또는 생산자 세포에서 AAV rep 및 cap 유전자가 안정적으로 유지되는 포장 세포일 수 있다. 예시적인 포장 및 생산자 세포는 SF-9, 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래한다. rAAV 비리온은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 정제 및 제형화된다.
본 개시의 바이러스 벡터는 대체적으로 약학적 조성물로서 대상체에게 전달된다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 용매(예를 들어, 물 등) 및 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 대략 중성 pH(pH 5, 6, 7, 8, 또는 9)의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 인산염 완충 식염수(예를 들어, 약 pH 7의 PBS)를 포함한다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 염의 농도는 약학적 조성물이 표적 조직에 대해 등장성이거나, 또는 거의 등장성이 되도록 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 의약의 제조에 있어서의 본원에 기술된 rAAV 비리온의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 눈물 생성을 증가시키는 본원에 기술된 치료의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 본원에 기술된 rAAV 비리온의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 눈물 생산을 증가시키는 본원에 기술된 치료의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 rAAV 비리온을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 기술된 rAAV 비리온, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 전달제, 또는 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 눈물 생성을 증가시키는 본원에 기술된 치료를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 눈물 생성을 증가시키는 본원에 기술된 치료, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 전달제, 또는 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 안구 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 본원에 기술된 rAAV 비리온 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 안구 질환, 장애, 또는 병태의 치료에 사용하기 위한, 또는 사용에 적용될 수 있는, 본원의 rAAV 비리온 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 안구 질환, 장애, 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 눈물 생성을 증가시키는 본원에 기술된 치료, 또는 본원에 기술된 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 안구 질환, 장애, 또는 병태의 치료에 사용하기 위한, 또는 사용에 적용될 수 있는, 눈물 생성을 증가시키는 본원에 기술된 치료, 또는 본원에 기술된 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 인산염 완충 식염수를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로(예를 들어, 눈물샘 내 또는 비강 투여)에 적합하도록 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 눈물샘으로의 투여를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 안구 표면 상으로의 투여를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비강내 투여를 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 2가지 조성물, 및 사용 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는:
(a) 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물; 및
(b) 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제를 포함하는 제2 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 키트를 제공하며, 키트는:
(a) 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물; 및
(b) 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제를 포함하는 제2 조성물을 포함하며,
이를 필요로 하는 대상체에서 본원에 기술된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 지침을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 키트의 사용에 대한 지침을 포함하는 패키지 삽입물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 본원에 기술된 질환, 장애 또는 병태의 진행을 치료하거나 지연시키기 위한 제1 조성물을 포함하는 약학적 조성물, 및 지침을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 이를 필요로 하는 대상체에서 본원에 기술된 질환, 장애 또는 병태의 진행을 치료하거나 지연시키기 위한 제1 조성물을 포함하는 약학적 조성물, 및 지침을 포함한다.
예시적인 구현예
본 개시는 다음의 구현예와 관련된다. 본 섹션 전체에 걸쳐, 용어 구현예는 "E"로 축약되고, 그 뒤에 서수가 붙는다. 를 들어, EI-1은 구현예 I-1과 동일하다.
본 개시의 일부 구현예는 구현예 I에 관한 것이며, 이는 다음과 같다:
구현예 I-1. 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 I-2. 구현예 I-1에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 포함하는, 방법.
구현예 I-3. 구현예 I-2에 있어서, nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제인, 방법.
구현예 I-4. 구현예 I-2에 있어서, nAChR 작용제는 바레니클린인, 방법.
구현예 I-5. 구현예 I-2에 있어서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
구현예 I-6. 구현예 I-1 내지 I-5 중 어느 하나에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 방법.
구현예 I-7. 구현예 I-6에 있어서, 국소 비강 투여는 비강내 스프레이를 통하는, 방법.
구현예 I-8. 구현예 I-1에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 전방 사골 신경의 효과적인 전기 자극인, 방법.
구현예 I-9. 구현예 I-1 내지 I-8 중 어느 하나에 있어서, 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 눈물막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 I-10. 구현예 I-1 내지 I-9 중 어느 하나에 있어서, 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 각막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 I-11. 구현예 I-9 또는 I-10에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
구현예 I-12. 구현예 I-9 또는 I-10에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
구현예 I-13. 구현예 I-1 내지 I-12 중 어느 하나에 있어서, 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 일차 치료제는 상기 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 방법.
구현예 I-14. 구현예 I-13에 있어서, 유전자 산물은 치료 단백질인, 방법.
구현예 I-15. 구현예 I-14에 있어서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)인, 방법.
구현예 I-16. 구현예 I-13 내지 I-15 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AVV) 벡터인, 방법.
구현예 I-17. 구현예 I-13 내지 I-15 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터인, 방법.
구현예 I-18. 구현예 I-13 내지 I-15 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 방법.
구현예 I-19. 구현예 I-13 내지 I-15 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
구현예 I-20. 구현예 I-13 내지 I-16 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV인, 방법.
구현예 I-21. 구현예 I-13 내지 I-16, 또는 I-20 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
구현예 I-22. 구현예 I-13 내지 I-16, 또는 I-20 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
구현예 I-23. 구현예 I-13 내지 I-22 중 어느 하나에 있어서, 조성물의 약 100 μL이 투여되는, 방법.
구현예 I-24. 구현예 I-13 내지 I-23 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법. 구현예 I-25. 구현예 I-13 내지 I-24 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 각막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
구현예 I-26. 구현예 I-13 내지 I-25 중 어느 하나에 있어서, 방법은 AAV 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 I-27. 구현예 I-26에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
구현예 I-28. 구현예 I-26에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
구현예 I-29. 이를 필요로 하는 대상체의 적어도 한쪽 눈의 안구 표면에 유전자 산물을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
a. 상기 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계; 및
b. 국소 비강 투여를 통해 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 I-30. 구현예 I-29에 있어서, 유전자 산물은 치료 단백질인, 방법.
구현예 I-31. 구현예 I-30에 있어서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)인, 방법.
구현예 I-32. 구현예 I-29 내지 I-31 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AVV) 벡터인, 방법.
구현예 I-33. 구현예 I-29 내지 I-31 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터인, 방법.
구현예 I-34. 구현예 I-29 내지 I-31 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 방법.
구현예 I-35. 구현예 I-29 내지 I-31 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
구현예 I-36. 구현예 I-32에 있어서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV인, 방법.
구현예 I-37. 구현예 I-32 내지 I-36 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
구현예 I-38. 구현예 I-32 내지 I-36 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
구현예 I-39. 구현예 I-29 내지 I-38 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 약 100 μL이 투여되는, 방법.
구현예 I-40. 구현예 I-29 내지 I-39 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
구현예 I-41. 구현예 I-29 내지 I-40 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 각막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
구현예 I-42. 구현예 I-29 내지 I-41 중 어느 하나에 있어서, 방법은 AAV 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 I-43. 구현예 I-42에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
구현예 I-44. 구현예 I-42에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
구현예 I-45. 구현예 I-29 내지 I-44 중 어느 하나에 있어서, 방법은 AVV 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 안구 표면에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 I-46. 구현예 I-45에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
구현예 I-47. 구현예 I-45에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
구현예 I-48. 구현예 I-29 내지 I-47 중 어느 하나에 있어서, nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제인, 방법.
구현예 I-49. 구현예 I-29 내지 I-47 중 어느 하나에 있어서, nAChR 작용제는 바레니클린인, 방법.
구현예 I-50. 구현예 I-29 내지 I-48 중 어느 하나에 있어서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘인, 방법.
구현예 I-51. 구현예 I-29 내지 I-50 중 어느 하나에 있어서, nAChR 작용제는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 방법.
본 개시의 일부 구현예는 구현예 II에 관한 것이며, 이는 다음과 같다:
구현예 II-1. 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 상기 대상체의 눈 또는 상기 눈과 유체 연통하는 조직에 일차 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
구현예 II-2. 구현예 II-1에 있어서, nAChR 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 국소 비강 투여로 투여되는, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
구현예 II-3. 구현예 II-2에 있어서, 국소 비강 투여는 비강내 스프레이를 통해 이루어지는, nAChR 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
구현예 II-4. 조합된 제제로서:
a. 일차 치료제; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 포함하되;
이는 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법에서의 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 것이며, 상기 방법은 상기 대상체의 눈 또는 상기 눈과 유체 연통하는 조직에 상기 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 조합된 제제.
구현예 II-5. 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법에서의 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 일차 치료제로서, 상기 방법은 상기 대상체의 눈 또는 상기 눈과 유체 연통하는 조직에 상기 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 일차 치료제.
구현예 II-6. 구현예 II-4의 용도를 위한 조합된 제제 또는 구현예 II-5의 용도를 위한 일차 치료제에 있어서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 포함하는, 조합된 제제 또는 일차 치료제.
구현예 II-7. 구현예 II-1 내지 II-3 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 또는 구현예 II-6의 용도를 위한 조합된 제제 또는 일차 치료제에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4, 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 또는 조합된 제제 또는 일차 치료제.
구현예 II-8. 구현예 II-1 내지 II-3 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 또는 구현예 II-6의 용도를 위한 조합된 제제 또는 일차 치료제에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 바레니클린인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 또는 조합된 제제 또는 일차 치료제.
구현예 II-9. 구현예 II-1 내지 II-3 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 또는 구현예 II-6의 용도를 위한 조합된 제제 또는 일차 치료제에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 또는 조합된 제제 또는 일차 치료제.
구현예 II-10. 구현예 II-4 내지 II-9 중 어느 하나의 용도를 위한 조합된 제제 또는 일차 치료제에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 조합된 제제 또는 일차 치료제.
구현예 II-11. 구현예 II-10의 용도를 위한 조합된 제제 또는 일차 치료제에 있어서, 국부 비강 투여는 비강내 스프레이를 통해 이루어지는, 조합된 제제 또는 일차 치료제.
구현예 II-12. 구현예 II-5에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 전방 사골 신경의 효과적인 전기 자극인, 일차 치료제.
구현예 II-13. 구현예 II-1 내지 II-12 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 눈물막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-14. 구현예 II-1 내지 II-13 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 각막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-15. 구현예 II-13 또는 II-14의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-16. 구현예 II-13 또는 II-14의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-17. 구현예 II-1 내지 II-16의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 일차 치료제는 상기 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-18. 구현예 II-17의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 유전자 산물은 치료 단백질인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-19. 구현예 II-18의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-20. 구현예 II-17 내지 II-19 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-21. 구현예 II-17 내지 II-19 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-22. 구현예 II-17 내지 II-19 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-23. 구현예 II-17 내지 II-19 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-24. 구현예 II-17 내지 II-20 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-25. 구현예 II-17 내지 II-20 또는 II-24 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-26. 구현예 II-17 내지 II-20 또는 II-24 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-27. 구현예 II-17 내지 II-26 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 조성물의 약 100 μL이 투여되는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-28. 구현예 II-17 내지 II-27 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서 유전자 산물의 발현을 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-29. 구현예 II-17 내지 II-28 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 각막에서 유전자 산물의 발현을 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-30. 구현예 II-14 내지 II-16 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 일차 치료제, 또는 nAChR 작용제 또는 이의 염에 있어서, 방법은 AAV 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 일차 치료제, 또는 nAChR 작용제 또는 이의 염.
구현예 II-31. 구현예 II-30의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-32. 구현예 II-30의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 일차 치료제.
구현예 II-33. 유전자 산물을 대상체의 적어도 한쪽 눈에 전달하는 단계에 의해 상기 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 방법은 국소 비강 투여를 통해 상기 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 방법은 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
구현예 II-34. 조합된 제제로서:
a. 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물; 및
b. 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하되,
이는 유전자 산물을 대상체의 적어도 한쪽 눈의 안구 표면에 전달하는 단계에 의해 상기 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 것이며, 상기 방법은 상기 조성물의 유효량을 상기 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하고, 상기 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 국소 비강 투여를 통해 투여하는 단계를 포함하는, 조합된 제제.
구현예 II-35. 유전자 산물을 대상체의 적어도 한쪽 눈의 안구 표면에 전달하는 단계에 의해 상기 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 상기 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 방법은 상기 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 상기 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 국소 비강 투여를 통해 상기 대상체에게 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 II-36. 구현예 II-33의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 구현예 II-34의 용도를 위한 조합된 제제, 구현예 II-35의 용도를 위한 조성물로서, 유전자 산물은 치료 단백질인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-37. 구현예 II-36의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-38. 구현예 II-33 내지 II-37 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-39. 구현예 II-33 내지 II-37 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-40. 구현예 II-33 내지 II-37 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-41. 구현예 II-33 내지 II-37 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-42. 구현예 II-38의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-43. 구현예 II-38 내지 II-42 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-44. 구현예 II-38 내지 II-42 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-45. 구현예 II-33 내지 II-44 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 약 100 μL이 투여되는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-46. 구현예 II-33 내지 II-44 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서 유전자 산물의 발현을 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-47. 구현예 II-33 내지 II-46 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 각막에서 유전자 산물의 발현을 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-48. 구현예 II-33 내지 II-47 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 방법은 AAV 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-49. 구현예 II-48의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-50. 구현예 II-48의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-51. 구현예 II-33 내지 II-50 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 방법은 AAV 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 안구 표면에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-52. 구현예 II-51의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-53. 구현예 II-51의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-54. 구현예 II-33 내지 II-53 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제 또는 조성물에 있어서, nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4, 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 또는 조합된 제제 또는 조성물.
구현예 II-55. 구현예 II-33 내지 II-53 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, nAChR 작용제는 바레니클린인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
구현예 II-56. 구현예 II-33 내지 II-54 중 어느 하나의 용도를 위한 nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물에 있어서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘인, nAChR 작용제 또는 이의 염, 조합된 제제, 또는 조성물.
본 개시의 일부 구현예는 구현예 III에 관한 것이며, 이는 다음과 같다:
구현예 III-1. 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 III-2. 구현예 III-1에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 포함하는, 방법.
구현예 III-3. 구현예 III-2에 있어서, nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제인, 방법.
구현예 III-4. 구현예 III-2에 있어서, nAChR 작용제는 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
구현예 III-5. 구현예 III-2에 있어서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
구현예 III-6. 구현예 III-1 내지 III-5 중 어느 하나에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 방법.
구현예 III-7. 구현예 III-6에 있어서, 국소 비강 투여는 비강내 스프레이를 통하는, 방법.
구현예 III-8. 구현예 III-1 내지 III-7 중 어느 하나에 있어서, 일차 치료제는 눈물샘 중 하나 또는 둘 모두 내로의 눈물샘 내 주사 또는 국소 투여를 통해 투여되는, 방법.
구현예 III-9. 구현예 III-1 내지 III-8 중 어느 하나에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후에 투여되는, 방법.
구현예 III-10. 구현예 III-9에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후 7일차로부터 시작하여 투여되는, 방법.
구현예 III-11. 구현예 III-1에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 전방 사골 신경의 효과적인 전기 자극인, 방법.
구현예 III-12. 구현예 III-1 내지 III-11 중 어느 하나에 있어서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘, 눈물관, 각막, 각막 상피, 윤부 줄기 세포, 결막, 눈물점 및 눈물 소관 중 하나 또는 이의 임의의 조합인, 방법.
구현예 III-13. 구현예 III-1 내지 III-12 중 어느 하나에 있어서, 눈과 유체 연통하는 조직은 각막인, 방법.
구현예 III-14. 구현예 III-1 내지 III-12 중 어느 하나에 있어서, 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘인, 방법.
구현예 III-15. 구현예 III-1 내지 III-14 중 어느 하나에 있어서, 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 눈물막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 III-16. 구현예 III-13 내지 III-15 중 어느 하나에 있어서, 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 각막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 III-17. 구현예 III-15 또는 III-16에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
구현예 III-18. 구현예 III-15 또는 III-16에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
구현예 III-19. 구현예 III-1 내지 III-18 중 어느 하나에 있어서, 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 일차 치료제는 상기 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 방법.
구현예 III-20. 구현예 III-19에 있어서, 유전자 산물은 치료 단백질인, 방법.
구현예 III-21. 구현예 III-20에 있어서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)인, 방법.
구현예 III-22. 구현예 III-20에 있어서, 치료 단백질은 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF)인, 방법.
구현예 III-23. 구현예 III-19 내지 III-22 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AVV) 벡터인, 방법.
구현예 III-24. 구현예 III-19 내지 III-22 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터인, 방법.
구현예 III-25. 구현예 III-19 내지 III-22 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 방법.
구현예 III-26. 구현예 III-19 내지 III-22 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
구현예 III-27. 구현예 III-23에 있어서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV인, 방법.
구현예 III-28. 구현예 III-23 내지 III-27 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
구현예 III-29. 구현예 III-23 내지 III-27 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
구현예 III-30. 구현예 III-19 내지 III-29 중 어느 하나에 있어서, 조성물의 약 50 μL 내지 약 100 μL이 투여되는, 방법.
구현예 III-31. 구현예 III-19 내지 III-30 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
구현예 III-32. 구현예 III-19 내지 III-31 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 각막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
구현예 III-33. 구현예 III-19 내지 III-32 중 어느 하나에 있어서, 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 III-34. 구현예 III-33에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
구현예 III-35. 구현예 III-33에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
구현예 III-36. 구현예 III-1 내지 III-35 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애는 신경영양성 각막염, 안구 표면의 화학적 화상, 각막 상처, 각막 궤양, 지속적인 상피 결함, 안구 건조증, 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염, 삼차 신경 및/또는 눈의 수두 대상포진 바이러스 감염, 또는 각막 신경의 당뇨병 합병증인, 방법.
구현예 III-37. 이를 필요로 하는 대상체의 적어도 한쪽 눈의 안구 표면에 유전자 산물을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
a. 상기 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계; 및
b. 국소 비강 투여를 통해 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 III-38. 구현예 III-37에 있어서, 유전자 산물은 치료 단백질인, 방법.
구현예 III-39. 구현예 III-38에 있어서, 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)인, 방법.
구현예 III-40. 구현예 III-38에 있어서, 치료 단백질은 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF)인, 방법
구현예 III-41. 구현예 III-37 내지 III-40 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AVV) 벡터인, 방법.
구현예 III-42. 구현예 III-37 내지 III-40 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터인, 방법.
구현예 III-43. 구현예 III-37 내지 III-40 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 방법.
구현예 III-44. 구현예 III-37 내지 III-40 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
구현예 III-45. 구현예 III-41에 있어서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV인, 방법.
구현예 III-46. 구현예 III-41 내지 III-45 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
구현예 III-47. 구현예 III-41 내지 III-45 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
구현예 III-48. 구현예 III-37 내지 III-47 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 약 50 μL 내지 약 100 μL이 투여되는, 방법.
구현예 III-49. 구현예 III-37 내지 III-48 중 어느 하나에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후에 투여되는, 방법.
구현예 III-50. 구현예 III-49에 있어서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후 7일차로부터 시작하여 투여되는, 방법.
구현예 III-51. 구현예 III-37 내지 III-50 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
구현예 III-52. 구현예 III-37 내지 III-50 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 눈의 각막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
구현예 III-53. 구현예 III-37 내지 III-52 중 어느 하나에 있어서, 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 III-54. 구현예 III-53에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
구현예 III-55. 구현예 III-53에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
구현예 III-56. 구현예 III-37 내지 III-52 중 어느 하나에 있어서, 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 안구 표면에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
구현예 III-57. 구현예 III-56에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
구현예 III-58. 구현예 III-56에 있어서, 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
구현예 III-59. 구현예 III-37 내지 III-58 중 어느 하나에 있어서, nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제인, 방법.
구현예 III-60. 구현예 III-37 내지 III-58 중 어느 하나에 있어서, nAChR 작용제는 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
구현예 III-61. 구현예 III-37 내지 III-59 중 어느 하나에 있어서, nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
구현예 III-62. 구현예 III-37 내지 III-61 중 어느 하나에 있어서, nAChR 작용제는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 방법.
구현예 III-63. 구현예 III-37 내지 III-62 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 비강내 주사를 통해 투여되는, 방법.
구현예 III-64. 구현예 III-37 내지 III-63 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애는 신경영양성 각막염, 안구 표면의 화학적 화상, 각막 상처, 각막 궤양, 지속적인 상피 결함, 안구 건조증, 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염, 삼차 신경 및/또는 눈의 수두 대상포진 바이러스 감염, 또는 각막 신경의 당뇨병 합병증인, 방법.
구현예 III-65. 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료로서, 상기 방법은:
a. 상기 일차 치료제의 유효량을 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계; 및
b. 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 일차 치료제 및 치료.
구현예 III-66. 구현예 III-65의 용도를 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료로서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 포함하는, 일차 치료제 및 치료.
구현예 III-67. 구현예 III-66의 용도를 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료로서, nAChR 작용제는 바레니시클, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 일차 치료제 및 치료.
구현예 III-68. 구현예 III-65 내지 III-67 중 어느 하나의 용도를 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료로서, 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 일차 치료제 및 치료.
구현예 III-69. 구현예 III-65 내지 III-67 중 어느 하나의 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료로서, 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 일차 치료제는 상기 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 일차 치료제 및 치료.
구현예 III-70. 안구 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키는 치료.
구현예 III-71. 키트로서:
(a) 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물; 및
(b) 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제를 포함하는 제2 조성물을 포함하며,
이를 필요로 하는 대상체에서 본원에 기술된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 지침을 포함하는, 키트.
실시예
다음의 구체적인 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 본 개시의 나머지 부분을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 눈물샘 내 주사를 통해 rAAV에 의해 전달된 눈물샘에서의 GFP 전이유전자의 발현
본 실시예는 더치-벨트 토끼(Dutch-belted rabbits)에게 눈물샘 내 주사로 투여된 단일 용량 rAAV 비리온에 대한 9일간의 파일럿 연구를 나타낸다. 눈물샘에 주사를 통해 1회 투여된 rAAV 비리온 구현예의 패널의 효과 및 내약성을 평가한다. 패널 내의 각각의 rAAV 비리온 조성물은 두 가지 농도(1×1012 GC/mL 및 6.2×1012 GC/mL)에서 시험되었다. rAAV 비리온의 패널은 AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 갖는 구현예를 포함한다. rAAV 비리온에 의해 전달된 발현 카세트는 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP) 전이유전자를 암호화한다. 이러한 접근법은 눈물샘의 세포에 이식유전자를 전달하여 세포 내 이식유전자의 측정 가능한 CAG 프로모터 구동 발현을 초래하는 캡시드 단백질 혈청형 AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9의 타당성을 평가한다.
동물 연구는 Charles River Laboratories(CRL) 시설에서 CRL 직원 과학 인력에 의해 수행되었다.
동물 실험 시스템, 축산, 생활 모니터링
본 연구에 사용된 동물은 4개월령 내지 5개월령의 수컷 더치 벨트 토끼였으며 체중은 1.3 kg 내지 2.3 kg였다. 동물은 치료 시작 전 10일 동안 적응시켰다. 각 동물은 개별적으로 수용되었으며 정기적인 환경 조건, 섭식 일정, 및 수의학적 치료를 포함한 표준 관리 프로토콜을 사용하여 보살핌을 받았다.
rAAV 비리온 조성물 및 제형
본 연구에서, CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 eGFP 전이유전자를 암호화하는 발현 카세트를 함유하는 rAAV 비리온을 포함하는 조성물 패널이 표 4의 조건 하 눈물샘 내 주사용으로 제공된다. 각각의 조성물은 상이한 AAV 캡시드 단백질 혈청형을 갖는 rAAV 비리온을 함유한다. 조성물은 OC-100a-d로 표지되며, 각각은 상이한 AAV 캡시드 단백질 혈청형에 해당된다. 눈물샘내 주사를 위한 투여 제형은 인산염 완충 식염수 용액으로 희석하여 표 4에 기재된 목표 농도에서 깨끗한 절차를 사용하여 제조하였다.
[표 4] rAAV 조성물 요약
rAAV 조성물의 눈물샘 내 주사
동물은 연구 1일차에 눈물샘 내 주사를 통해 투여되었다. 표 5는 시험된 각 조성물에 대한 제형 농도, 투여량, 투여 빈도, 및 동물 및 눈물샘의 수에 대한 요약을 제시한다. 주사 전, 필요한 경우 마취를 유지하기 위해 마스크를 통해 덱스메데토미딘(0.25mg/kg)을 근육 주사한 후 이소플루란/산소 혼합물을 사용하여 동물을 마취시켰다. 국소 항생제를 투여 후 각 눈에 도포하였다.
[표 5] 실험 설계 요약
생분석
투여 전 1일째에 혈액을 채취하고, 8일차 및 9일차에 모든 동물의 귓바퀴 혈관에서 다시 혈액을 채취하였다. 혈장이 원심분리에 의해 분리될 때까지 혈액 샘플을 얼음 위에 두었다. 혈장 샘플을 250 μL 분취로 분리하고 후속 분석을 위해 -80℃에서 동결하였다.
8일차 및 9일차에 동물로부터 눈의 수분을 수집하기 위해 쉬르머 눈물 검사를 실시하였다. 시험 스트립을 약 1분 동안 아래 눈꺼풀 안쪽에 놓았다. 종이를 제거하여 별도의 튜브에 넣고 후속 분석을 위해 -80℃에서 동결하였다.
혈장 샘플 및 쉬르머의 시험 스트립은 Syneos 분석 실험실에서 검증된 절차를 사용하여 eGFP 및 eGFP mRNA 농도의 농도를 분석하였다. 혈장 샘플에서 분석한 결과 eGFP 단백질 또는 eGFP mRNA가 검출되지 않았으며, 이는 rAAV의 눈물샘 내 전달이 세포 용해를 유도하지 않았음을 나타낸다. 이러한 결과는 눈물샘 내 투여 경로가 rAAV를 전달하기 위해 안전하게 사용될 수 있음을 시사한다.
눈물샘 조직의 면역조직화학
동물은 펜토바르비탈 나트륨 정맥내 주사로 혈액과 눈의 수분을 채취한 후 9일차에 안락사되었다. 좌측 눈의 5개 시상 절편과 좌측 및 우측 눈물샘 절편이 Charles River 실험실 표준 수술 절차에 따라 면역조직화학(IHC)을 위해 준비되었다. 눈물샘 IHC 샘플을 eGFP에 대해 염색하고 이에 대해 현미경 평가를 실시하였다.
rAAV 조성물을 생체내에서 투여한 눈물샘 조직에서 eGFP 발현의 효율을 결정하기 위해 현미경 평가를 수행하였다. IHC 샘플에서 단리된 양성 눈물샘 세포는 GFP 발현을 나타내는 분홍색 내지 적색 세포질 염색을 가졌다(도 6a-6k; 흑색 화살표로 표시된 예시적인 염색). 6.2×1012 GC/mL(도 6a)로 AAV2 캡시드 단백질(OC-100a)을 함유하는 rAAV 조성물, 1×1012 GC/mL(도 6b) 및 6.2×1012 GC/mL(도 6c-6h)로 AAV5 캡시드 단백질을 함유하는 rAAV 조성물, 및 6.2×1012 GC/mL로 AAV9 캡시드 단백질을 함유하는 rAAV 조성물(도 6i-6k)에서 양성 eGFP 발현을 관찰하였다.
결론
이러한 실시예로부터의 결과는 rAAV 비리온이 직접 주입에 의해 눈물샘에 발현 카세트를 전달하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 또한 적어도 AAV2, AAV5 또는 AAV9 혈청형을 가진 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온을 사용하여 눈물샘 내의 세포에 발현 카세트를 전달할 수 있음을 나타낸다. 또한, 결과는 CAG 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 이식유전자를 함유하는 발현 카세트의 전달로 인해 눈물샘 세포에서 이식유전자가 발현된다는 것을 입증한다.
실시예 2. 눈물샘 내 주사를 통해 rAAV에 의해 전달된 눈물샘에서의 신경영양 인자의 발현
본 실시예는 AAV 벡터를 눈물샘 내 주사로 투여한 후 더치-벨트 토끼에게 단일 비강내 투여량으로서 투여된 바레니클린에 대한 7일간의 단일 투여량 연구를 설명한다. 두 가지 투여량 수준(100 μL 주사로 1×1012 GC/mL 또는 6.2×1012 GC/mL)에서 다양한 AAV 벡터의 내약성 및 효과를 평가한 후 대상체의 각 콧구멍에 바레니클린 비강 스프레이(50μL 스프레이로 1.2 mg/ml)를 1회 투여하였다. 구체적으로, 본 연구 설계는 두 가지 주요 목표를 갖는다:
(1) 눈물샘내 주사로 투여된, 인간 신경 성장 인자(hNGF) 또는 인간 교세포 유래 신경영양 인자(hGDNF)를 암호화하는 발현 카세트를 함유하는 혈청형 2, 5 또는 9(AAV2, AAV5, AAV9)의 아데노 연관 바이러스 벡터를 사용하는 눈물샘의 형질도입 평가. hNGF와 hGDNF 단백질은 각막 표면의 유지와 건강에 중요한 역할을 하는 호중영양 인자이다.
(2) 바레니클린 비강 스프레이로 눈물 생성 자극에 의한 안구 표면에 존재하는 단백질의 상대적 양 증가의 평가.
바레니클린은 다음과 같은 화합물이다:
.
본 연구에서는 실험용 바이러스 벡터 또는 대조군 벡터를 더치 벨트 토끼의 눈물샘에 투여하였다. AAVx.hNGF 및 AAVx.hGDNF(x는 2, 5 또는 9임) 벡터는 각각 hNGF 및 hGDNF 단백질을 암호화하는 전이유전자 인코딩을 포함한다. hNGF 및 hGDNF는 AAV 전달 전이유전자의 눈물샘내 발현에 대한 타당성을 입증하기 위한 예시적인 치료용 단백질로서, 이들의 눈물막으로의 분비는 바레니클린과 같은 눈물 유도제를 사용하여 증가될 수 있다. AAVx.nNGF 및 AAVx.hGDNF는 6.2×1011 GC/mL의 투여량으로 투여되었다. 비교를 위해 비히클 대조군이 사용되었다.
동물은 청색광과 적절한 필터를 사용하여 슬릿 램프 생체현미경을 통해 7일째에 마취 하에 평가되었다. 해당 평가는 슬릿 램프 사진으로 문서화된다.
8일차에. 동물에게 1.2 mg/ml의 바레니클린 비강 스프레이의 단일 50 μL 스프레이를 각 콧구멍에 투여하였다. 투여 직후 또는 몇 분 이내에 동물은 청색광과 적절한 필터를 사용하는 슬릿 램프 생체현미경을 통해 마취 하에 평가된다. 해당 평가는 슬릿 램프 사진으로 문서화된다.
방법
용량 투여(경로): 눈물샘내 주사, 각 눈물샘 내로 100μL. 투여 빈도: 각 눈물샘 내로의 단일 주사. 절차: 마취 하에서, 약 100 μL의 기준 아이템(PBS +0.001% F68), AAVx.hNGF(6.2×1011 GC/mL) 또는 AAVx.hNGF(6.2×1011 GC/mL)를 직접 관찰하면서 각 눈물샘에 투여하였다. 눈물샘 주사 절차는 다음과 같다: (1) 우측(OD) 상부 눈꺼풀 아래에 수직 절개가 이루어짐; (2) 뭉툭한 박리는 눈물샘이 보일 때까지 상안와 테두리까지 확장됨; (3) 눈물샘에 0.1 mL의 기준 아이템, AAVx.hNGF(6.2×1012 GC/mL) 또는 AAVx.hNGF(6.2×1012 GC/mL)를 27G 1/2-인치 멸균 바늘이 구비된 1 mL 멸균 주사기로 주사함; (4) 절개 부위를 봉합사/시아노아크릴레이트 접착제로 봉합함; 및 (5) 좌측(OS) 눈물샘에 대해 해당 절차를 반복함. 표 6은 유전자 요법 투여를 요약한다.
[표 6] rAAV의 투여
비강 스프페이 눈물 자극
투여량 투여(경로): 비강내 스프레이, 양쪽 콧구멍. 투여 빈도: 단일 투여; 각각의 콧구멍 내로 50 μL 스프레이 1회; 8일차. 절차: 동물에게 바레니클린 용액 1.2 mg/ml로 채워진 무방부제 압타르 비강 펌프를 사용하여 각각의 콧구멍 내로 50μL 스프레이를 투여함. 종료: 8일차. 표 7은 비강내 스프레이 눈물 자극을 요약한다.
[표 7] 바레니클린의 투여
a 투여량 부피를 각 동물에게 투여하고, 여기에서 총 투여량 100 μL을 각 콧구멍 사이에 균등하게 나누어 투여됨(1회 투여량당 콧구멍당 50 μL).
눈물샘 조직 중 이식유전자 mRNA 정량화
눈물샘의 필요한 섹션(0.005 g 내지 0.025g)을 즉시 RNAlater®에 넣고(완전 침지) 실온에서 보관한 후 8시간 이내에 냉장고로 옮겨 4℃의 온도를 유지하여 하룻밤 보관하였다. 다음 날, RNAlater®를 제거하고 샘플을 -80℃의 온도를 유지하도록 설정된 냉동고에 냉동 보관하였다. RT-qPCR을 이용하여 hNGF 발현에 대해 샘플을 분석하였다.
하르더(harderian)샘, 시신경, 삼차신경, 상피 세포 긁기를 통한 비강, 순막, 및 안구외 근육으로부터 채취한 샘플(0.005 g 내지 0.01 g)을 우측에서 채취하여 RNAlater(완전 침지)에 넣고 실온에서 보관한 후 8시간 이내에 냉장고로 옮겨 4℃의 온도를 유지하여 하룻밤 보관하였다. 다음 날, RNAlater®를 제거하고 샘플을 냉동고에서 냉동 보관하여 잠재적인 vg DNA 및 mRNA 분석을 위해 -80℃의 온도를 유지하였다.
면역조직화학(IHC)을 위한 조직학
형태학적 평가 및 면역조직화학 평가를 위해 좌우 눈물샘의 적절한 섹션을 채취하였다. 샘플을 4% 파라포름알데히드에 넣고 70% 에탄올에 고정시켰다. 파라핀 차단 후, 5-μm 두께의 섹션을 얻고 이를 슬라이드에 장착하였다; 각 샘플에 대해 하나의 섹션을 H&E로 염색하고 면역조직화학 염색 또한 수행하였다. hNGF의 염색은 항-hNGF 항체를 사용하여 수행하였다. 슬라이드를 관찰하고 hNGF 단백질 발현에 대해 현미경으로 캡처한 이미지를 평가하였다.
쉬르머 검사
7일, 14일, 21일, 28일, 41일, 및 42일차에 동물로부터 눈의 수분을 수집하기 위해 쉬르머 눈물 검사를 실시하였다. 시험 스트립을 약 1분 동안 아래 눈꺼풀 안쪽에 놓았다. 종이를 제거하여 별도의 튜브에 넣고 후속 분석을 위해 -80℃에서 동결하였다. 쉬르머 검사 스트립은 21일, 28일 및 41일에 바레니클린을 비강 내 투여한 후 채취하였다. 시험 스트립을 약 1분 동안 아래 눈꺼풀 안쪽에 놓았다. 종이를 제거하여 별도의 튜브에 넣고 후속 분석을 위해 -80℃에서 동결시켰다. ELISA 검정으로 hNGF의 농도에 대해 쉬르며 검사 스트립에 흡수된 단백질 함량을 분석하였다.
결과
표 8은 눈물샘에서의 이식유전자 발현의 정량화를 나타낸다.
[표 8] 눈물샘 중 신경영양 인자의 발현
모든 비히클 대조군 동물의 조직은 bGH 유전자 발현에 대해 음성 판정을 받았으며, 이는 동물 투여, 샘플 수집, RNA 추출 및 RT-qPCR 분석에서 교차 오염이 양호하게 제어되었음을 나타낸다. rAAV 벡터 유래 hGDNF mRNA가 주사된 모든 눈물샘 조직에서 검출되었다. 군 3 내지 군 6의 경우, 일부 주입된 눈물샘 조직은 총 RNA의 pg당 1151 내지 585,401 ss 카피의 hNGF 또는 hGDNF mRNA를 가진 반면, 다른 일부는 검출 가능한 벡터 유래 mRNA가 없었다.
면역조직화학을 이용하여 hNGF 발현에 대해 눈물샘 조직을 추가로 평가하였다(도 7a-7e). 눈물샘내 주사 후, 동물을 안락사시키고 면역조직화학(IHC)을 위해 주사된 눈물샘의 섹션을 제조하였다. 눈물샘 IHC 샘플을 hNGF에 대해 염색하고 이에 대해 현미경 평가를 실시하였다. rAAV 조성물을 생체내에서 투여한 눈물샘 조직에서 hNGF 발현의 효율을 결정하기 위해 현미경 평가를 수행하였다. 도 7a 및 도 7d-7e는 AAV9 혈청형을 갖는 rAAV를 주사한 토끼의 눈물샘에서의 IHC 염색의 예시적인 예를 도시한다(예시적인 염색은 흑색 화살표로 나타냄). hNGF 염색된 조직은 hNGF 전이유전자의 강한 발현을 나타낸다. 결과는, 염색이 거의 나타나지 않아 배경으로 인한 염색으로 배제되는 음성 대조군 샘플(도 7b 및 도 7c)과 비교에 의해 확인된다. 이러한 결과는 rAAV의 눈물샘내 주사가 눈물샘 조직에서 hNGF와 같은 신경영양 인자 전이유전자를 전달하고 발현하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
7일, 14일, 21일, 28일, 41일, 및 42일차에 동물로부터 눈의 수분을 수집하기 위해 쉬르머 눈물 검사를 실시하였다. 시험 스트립을 약 1분 동안 아래 눈꺼풀 안쪽에 놓았다. 종이를 제거하여 별도의 튜브에 넣고 후속 분석을 위해 -80℃에서 동결시켰다. 쉬르머 검사 스트립은 21일, 28일 및 41일에 바레니클린을 비강 내 투여한 후 채취하였다. 시험 스트립을 약 1분 동안 아래 눈꺼풀 안쪽에 놓았다. 종이를 제거하여 별도의 튜브에 넣고 후속 분석을 위해 -80℃에서 동결시켰다. ELISA 검정으로 hNGF의 농도에 대해 쉬르며 검사 스트립에 흡수된 단백질 함량을 분석하였다.
채취된 눈물막 중 hNGF의 농도에 대해 쉬르머 검사 스트립을 분석하였다(도 8). rAAV9.hNGF의 눈물샘내 투여 후, hNGF농도는 바레니클린의 비강 내 투여가 없는 7일차 및 14일차에는 일정하였다. 21일, 28일, 41일차에, 쉬르머 스트립의 hNGF 농도는 7일차 및 14일차 채취에서 측정된 수준보다 약 3배까지 증가했으며, 이는 비강내 바레니클린이 눈물막으로의 hNGF 분비를 증가시켰음을 나타낸다. 특히, 바레니클린이 없는 42일차에서는 hNGF 농도가 크게 떨어지는 것이 관찰되었다. 쉬르머 스트립에서의 hNGF 농도는 rAAV5.hNGF 또는 rAAV2.hNGF보다 rAAV9.hNGF를 투여한 동물에서 가장 높았다.
요약하면, hNGF 및 hGDNF와 같은 신경영양 인자는 AAV2, AAV5 및 AAV9 혈청형을 포함하는 rAAV와 함께 눈물샘내 주사를 통해 전달될 때 전이유전자로서 발현되며, 여기에서 AAV9 혈청형이 가장 좋은 결과를 나타낸다. 또한, 바레니클린과 같은 눈물 유도제의 비강내 전달은 눈물막에서 발현된 전이유전자의 농도를 증가시켰다.
실시예 3. 형질도입 후 돼지 눈물 중 인간 신경 성장 인자 베타 단백질 검출
아데노 연관 바이러스 혈청형 2(n=4), 5(n=4), 및 9(n=4)를 활용하여, 인간 신경 성장 인자(AAV-hNGFβ)를 암호화하는 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV)의 단일 투여량(2e11 vg/mL)을 사용하여 (눈물샘내 주사를 통한) 눈물샘 형질도입 후 칠(7)일, 십사(14)일, 이십일(21)일, 이십팔(28)일 및 삼십오(35)일차에 12마리의 돼지(스티스 스크로파 도메스티쿠스(Stis scrofa domesticus))로부터 눈물을 채취하였다. 눈물 샘플 채취는 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일차에 마취된 동물에서 약 120초 동안 각각 오른쪽(OD) 및 왼쪽(OS) 눈의 아래 눈꺼풀 아래에 배치된 쉬르머 눈물 검사 스트립을 사용하여 수행되었다. 22-27일차에 0.03 mg의 바레니클린 용액을 각 콧구멍에 하루 2회 투여하였다(BID). 28일차 눈물 채취의 경우, 0.03 mg의 바레니클린 용액을 눈물 채취 2분 전에 비강 분무 펌프를 통해 각 콧구멍에 투여하였다. 모든 채취일에 쉬르머 눈물 검사 스트립을 유체 이동선 바로 위에서 절단한 다음 검사 스트립의 유체 포화 부분을 즉시 얼음 위의 마이크로 원심분리기에 넣었다. 채취된 샘플은 드라이아이스에 담아 검사 시설로 운송되기 전에 섭씨 -20도에서 보관되었다.
왼쪽 눈의 쉬르머 눈물 검사 스트립로부터 단백질을 추출하고 각 샘플에 대해 인간 신경 성장 인자 단백질(hNGFβ)을 검출하는 중간 규모 발견 검정을 수행하였다. 인간 NGFβ에 대한 MSD 검정의 최소 및 최대 표준 곡선 값은 각각 0.104 내지 427 pg/mL였다. 형질도입(서열번호 25의 발현 카세트를 포함함; 도 9에 도시됨)은 눈물 중 hNFGβ의 발현을 생성하였다(각각, 도 10a-10c). AAV9-hNGFβ 형질도입은 검출을 위해 샘플을 16 내지 128X로 희석해야 할 정도로 높은 발현을 생성하였다(표 8). 희석 연구로부터 유도된 AAV9-hNGFβ 형질도입 돼지로부터의 hNGFβ의 평균 계산된 눈물막 수준은 5,612.84 pg/mL였다. hNGFβ는 다른 단백질을 암호화하는 AAV 벡터를 사용하는 이전 연구에서 수집된 hNGF MSD 데이터를 기반으로 하는 비-형질도입된 돼지 눈물막에서는 검출되지 않았다는 점에 유의해야 한다. 따라서 쉬르머 스트립 눈물 샘플의 추출물에서 검출된 모든 hNGFβ 단백질은 MSD 분석 중에 용이하게 식별되었으며, 이는 AAV-hNGFβ 작제물에 의한 눈물샘의 형질도입에 기인한다. AAV2-hNGFβ에 대해 21일차에 채취된 샘플(도 10a)은 해당 분석에서 생략된 이상치(Grubb의 검정에 의해 결정 시, p < 0.05)를 포함한다. 도 10c에 도시된 바와 같이 AAV9-hNGFβ의 경우 7-35일 사이에 유의한 감소가 관찰되지 않았다. 또한, 21일차(비강 분무 없음), 28일차(비강 분무 투여) 및 35일차(비강 분무 없음)에 채취된 AAV9-hNGFβ를 투여한 동물의 샘플 간에 hNGF 단백질 수준을 비교하였다. 비강 스프레이 투여는, AAV 단독 투여에 비해, 비강 스프레이 투여 시 눈물 hNGFβ 단백질 농도를 증가시켰다(데이터 미도시).
이러한 데이터는, hNGFβ를 암호화하는 아데노바이러스 연관 벡터를 사용한 돼지 눈물샘의 형질도입이 hNGFβ의 발현, 분비 및 검출 가능한 양의 눈물막으로의 수송을 초래했음을 함께 나타낸다. 발현은 눈물샘 형질도입 후 7일 이내에 검출할 수 있었으며, 발현 수준은 사용된 AAV 혈청형에 의존하였다. AAV9는 7일 이내에 가장 높은 발현 수준을 보였고 AAV2는 가장 낮은 수준을 보였지만, 여전히 인간 신경 성장 인자 베타 단백질 검출에 사용되는 분석 분석 범위 내에 있었다. 눈물 중 AAV2 단백질 수치는 28일차까지 꾸준히 증가한 반면, AAV5는 첫 7일차 후에 감소하여 14일차에서 28일차에 걸쳐 안정 상태에 도달한 것으로 보이며, 35일차에는 추가로 감소하였다. AAV9 형질도입된 동물은 7일차에 눈물막에서 상당한 수준의 hNGF가 검출되었으며, 이는 35일째까지 일정하게 유지되었다.
[표 9] AAV9-hNGFβ 눈물 샘플의 연속 희석
실시예 4: 눈물샘 내 주사를 통해 rAAV에 의해 전달된 돼지 눈물샘에서의 EGFP 전이유전자의 발현
본 연구의 목적은 눈물샘이 돼지의 관심 단백질로 눈물막을 변형시키거나 농축하는 방법으로 활용될 수 있는지를 평가하는 것이었다. 후속적으로, 눈물샘의 눈물샘 세포에서 EGFP를 생성할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해 생체 내 연구를 수행한 후, eGFP를 암호화하는 플라스미드로 구성된 아데노바이러스 벡터를 전달한 후 눈물막으로 분비시켰다. EGFP를 암호화하는 cDNA를 눈물샘 세포에 주입하기 위해, 본 접근법은 분비된 EGFP(secEGFP)에 대한 cDNA 암호화를 포함하는 아데노 연관 바이러스(AAV)를 눈물샘에 주입하였다. secEGFP에 대해 2개의 서로 다른 혈청형(2 및 9)의 각각의 AAV를 생성하기 위해, 역말단 반복(ITR) 사이에 secEGFP 발현을 위한 필수 요소를 포함하는 AAV 전달 플라스미드를 생성하였다. ITR 사이의 DNA 서열은 제조된 AAV(도 11)로 포장되었다.
AAV의 11개 혈청형이 확인되었으며 가장 특징적인 것은 AAV2였다. AAV 가성형은 형질도입 효율을 개선하기 위해 서로 다른 혈청형의 캡시드와 게놈을 혼합하는 것으로서, 해당 혈청형은 슬래시로 표시된다. 예를 들어, AAV2/5는 혈청형 5의 캡시드에 포장된 혈청형 2를 포함하는 바이러스를 나타낸다. AAV5 및 AAV9는 쥐의 눈물샘에 루시페라아제 리포터 유전자를 전달할 수 있는 것으로 보고되었다(Rocha 등, Transduction, Tropism, and Biodistribution of AAV Vectors in the Lacrimal Gland, 2011; 52(13):9567-9572). 가성형 AAV2/5 및 AAV2/9에 대해 GFP 및 마우스 신경 성장 인자(mNGF)를 사용한 마우스 눈물샘 형질도입이 관찰되었으며, 이는 최근 사전 인쇄 서버 사이트에 보고된 바 있다(Gautier 등, AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification; bioRxiv, 2022).
설계 분석 및 방법론
분비된 EGFP(혈청형 2 및 9)에 대한 연구용 AAV를 Sirion에서 합성하고 5×1012의 스톡 농도로 제공하였다. 제조된 AAV가 세포를 형질도입시키는지를 확인하기 위해 HEK 293T 세포 및 ELISA를 사용하여 AAV를 CJ Solutions로 시험관 내 시험하였다. Texas A&M에서 8마리의 사육돼지에게 EGFP의 눈물샘 내 주사를 1회 투여하였으며, 여기에서 우측(OD; oculus dexter) 분비샘은 저용량, 좌측(OS; oculus sinister)은 고용량을 투여받았다. 첫 번째 주사 후 6주 후, AAV2 및 AAV9 고용량을 사용한 두 번째 주사를 수행하였다. 해당 연구는 35일차에 EGFP 발현을 평가하였다. 눈물샘 EGFP 수준 확인 후, 눈물샘 중 EGFP의 존재를 평가하고 잠재적인 염증이나 동맥 이상을 평가하기 위해 두 번째 주사 후 8주 후에 연구를 종료하였다. (표 10 및 11). 해당 연구에서, 비강 스프레이 투여는 3주차에서 4주차 사이에 수행되었다(표 12).
[표 10] 사육 돼지에서의 AAV2-secEGFP 및 AAV9-secEGFP의 생체 내 연구를 위한 연구 계획
[표 11] 주사된 투여량 및 AAV의 부피
vg = 바이러스 게놈
[표 12] 21차부터 28일차까지의 OC-01 비강 스프레이 투여
mcg = 마이크로그램
두 번째 AAV-secEGFP 주사 후, 82일차에 쉬르머 스트립을 통해 각 눈에서 눈물을 채취하였다. 쉬르머 눈물 검사 스트립을 하부 결막 막다른 골목에 놓고 2분 동안 그대로 두어 눈물을 채취하였다. 쉬르머 눈물 검사 스트립에서 눈물 단백질을 추출하고 눈물에서 EGFP 단백질의 존재를 검출하기 위해 중간 규모 발견(MSD) 분석을 수행하였다.
103일차에 안구 조직병리학을 위해 눈물샘을 채취하고 EGFP 면역조직화학(IHC)을 위해 샘플을 Zyagen, Inc.(캘리포니아주 샌디에이고)로 보냈다.
ELISA 결과는 제조된 AAV 혈청형이 HEK 293T 세포를 형질도입시킬 수 있고, 시험관 내에서 분비된 EGFP를 생성할 수 있음을 입증하였다. AAV 형질도입한 지 82일 후 MSD 분석 및 IHC에 의해, 눈물 샘플에서의 EGFP 발현은 eGFP의 일부 수준 > 400 pg/mL로 확인되었다(도 12). IHC는 EGFP 발현이 AAV9에 비해 AAV2에서 더 큰 눈물샘 세포 감염성이 관찰된 눈물샘 세포 내에 있음을 나타냈다. 또한, AAV9 주사된 눈물샘에 대해 연성 상피 세포의 형질도입이 관찰되었다(도 13). AAV 주사를 반복한 후 돼지 눈물샘의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 염증성 침윤, 위축 또는 부종을 나타내지 않았다(도 14).
AAV2-secEGFP 또는 AAV9-secEGFP 중 어느 하나를 주사한 돼지 눈물샘은 연성 상피세포뿐만 아니라 눈물샘 세포에서 EGFP 전이유전자 산물을 발현하였다. 눈물샘에서 발현된 EGFP가 눈물막으로 분비되는 것이 확인되었다. 또한, AAV2 또는 AAV9를 반복적으로 주사한 후 첫 번째 주사 동안, 최초 저용량 또는 고용량의 AAV를 투여받았는지의 여부에 관계없이, 모든 동물에서 안전 신호 또는 염증성 침윤이 관찰되지 않았다. 해당 연구의 결과는 눈물샘의 눈물샘 세포가 눈물막을 변형 및/또는 농축시키기 위한 유전자 치료 접근법의 표적임을 입증한다.
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본 발명의 구현예가 본원에 도시되고 설명되었으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 당업자는 이러한 구현예가 단지 예로서 제공되는 것임을 이해할 수 있을 것이다. 수많은 변형, 변경 및 치환이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게 발생할 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명의 실시에 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 이하의 특허 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하며, 이들 청구범위 및 그 등가물 범위 내의 방법 및 구조는 이에 포괄되는 것으로 의도된다.
<110> OYSTER POINT PHARMA, INC. <120> CO-THERAPY WITH VECTOR AND NICOTINIC AGONIST <130> OYST-016/02WO 328567-2518 <150> US 63/185,897 <151> 2021-05-07 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile 20 25 30 Pro Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro 100 105 110 Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe 115 120 125 His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly 130 135 140 Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu 145 150 155 160 Gly Glu 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gcagctgcga cgccgccgag acaacctacg acaagatcct 1920 gaagaacctg tcccggaatc ggcggctggt gtctgacaag gtgggccaag cttgctgcag 1980 accaattgcc ttcgacgatg atctgtcttt cctggatgac aacctggtgt accacatcct 2040 gagaaagcac agcgccaagc gctgcggctg tatctagtcc tgttaatcaa cctctggatt 2100 acaaaatttg tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt acgctgtgtg 2160 gatatgctgc tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct ttcgttttct 2220 cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtccgtc 2280 aacgtggcgt ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg ggcattgcca 2340 ccacctgtca actcctttct gggactttcg ctttccccct ccctatcgcc acggcagaac 2400 tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctag gttgctgggc actgataatt 2460 ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtccg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 2520 gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 2580 taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 2640 ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 2700 gcggtgggct ctatggagcg ctggctagaa ttacctaccg gcctccacca taccttcgat 2760 attcgcgccc actctcccat taatccgcac aagtggatgt gatgcgattg cccgctaaga 2820 tagttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc 2880 gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 2940 gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 2967 <210> 24 <211> 3054 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression cassette comprising sequence encoding NGF <400> 24 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120 gggttccttg tagttaatga ttaacggatc tttacaaatt caagccaggt gatttcaaca 180 aattttgctg acgatttagg cgcactatcc cctaaactac aaattagaaa atagcgttcc 240 ttgacactag tctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300 tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420 ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480 gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540 ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600 catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660 tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720 ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780 cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc 840 cactgcttac tggcttatcg aaataagctt tctcagggga gatctcgttt agtgaaccgt 900 cagatcctca ctctcttccg catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg 960 aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa 1020 cggtactccg ccaccgaggg acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc 1080 gagaaaggcg tctaaccagt cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag 1140 cgggtggcgg tcggggttgt ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc 1200 ggtcttgaga cggcggatgg tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg 1260 gtgagtactc cctctcaaaa gcgggcatta cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa 1320 acgaggagga tttgatattc acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca 1380 tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccaggt ccaagtttaa acgccgccgc 1440 catgagcatg ctgttttaca ccctgatcac cgccttcctg atcggcatcc aggccgagcc 1500 ccacagcgag agcaacgtgc ccgctggaca cacaatccct caggcccact ggacaaaact 1560 gcagcatagc ctggatacag ccctgagaag ggccagaagc gcccctgccg ccgccatcgc 1620 cgctagagtg gccggccaga caagaaatat caccgtggac ccccggctgt tcaagaaaag 1680 aagactgcgg tctcctagag tgctcttttc aacacagcct cctcgggaag ccgctgatac 1740 ccaggacctg gacttcgagg tgggaggcgc cgctcctttc aatagaaccc acagatccaa 1800 gagaagctct agccacccta tcttccaccg gggcgagttc agcgtgtgcg acagcgtttc 1860 tgtgtgggtg ggagataaga ccaccgcaac cgatatcaag ggcaaggaag tgatggtgct 1920 gggcgaagtg aacatcaaca acagcgtctt taagcagtac ttcttcgaga caaagtgccg 1980 ggacccaaac cccgtggaca gcggctgcag aggcattgac tccaagcact ggaactccta 2040 ctgcaccaca acacacacct tcgtgaaggc cctgaccatg gacggcaaac aagctgcctg 2100 gcggttcatc agaatcgaca ccgcctgtgt ctgtgtgctg agcagaaagg ccgtgcgccg 2160 ggcctagtcc tgttaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actgatattc 2220 ttaactatgt tgctcctttt acgctgtgtg gatatgctgc tttaatgcct ctgtatcatg 2280 ctattgcttc ccgtacggct ttcgttttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 2340 tttatgagga gttgtggccc gttgtccgtc aacgtggcgt ggtgtgctct gtgtttgctg 2400 acgcaacccc cactggctgg ggcattgcca ccacctgtca actcctttct gggactttcg 2460 ctttccccct ccctatcgcc acggcagaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 2520 caggggctag gttgctgggc actgataatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtccg 2580 actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 2640 ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 2700 ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 2760 tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggagcg ctggctagaa 2820 ttacctaccg gcctccacca taccttcgat attcgcgccc actctcccat taatccgcac 2880 aagtggatgt gatgcgattg cccgctaaga tagttaatca ttaactacaa ggaaccccta 2940 gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca 3000 aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcg 3054 <210> 25 <211> 5895 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAAV-CMVE-NGF <400> 25 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggattgacc 420 taacgaaaag tgaacttcat aatacgtgct gtcccacgca catggtagat ttggacaaaa 480 ttgaatggag tctgatcaac cttcacaccg atctagatat cgcgcgctcg ctcgctcact 540 gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 600 gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctt gtagttaatg 660 attaacggat ctttacaaat tcaagccagg tgatttcaac aaattttgct gacgatttag 720 gcgcactatc ccctaaacta caaattagaa aatagcgttc cttgacacta gtctagttat 780 taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 840 taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 900 ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 960 gactatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 1020 ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 1080 ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 1140 atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 1200 agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 1260 ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 1320 gaggtctata taagcagagc tctctggcta actagagaac ccactgctta ctggcttatc 1380 gaaataagct ttctcagggg agatctcgtt tagtgaaccg tcagatcctc actctcttcc 1440 gcatcgctgt ctgcgagggc cagctgttgg gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt 1500 ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt cggcctccga acggtactcc gccaccgagg 1560 gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag 1620 tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca gcgggtggcg gtcggggttg 1680 tttctggcgg aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg 1740 gtcgaggtga ggtgtggcag gcttgagatc cagctgttgg ggtgagtact ccctctcaaa 1800 agcgggcatt acttctgcgc taagattgtc agtttccaaa aacgaggagg atttgatatt 1860 cacctggccc gatctggcca tacacttgag tgacaatgac atccactttg cctttctctc 1920 cacaggtgtc cactcccagg tccaagttta aacgccgccg ccatgagcat gctgttttac 1980 accctgatca ccgccttcct gatcggcatc caggccgagc cccacagcga gagcaacgtg 2040 cccgctggac acacaatccc tcaggcccac tggacaaaac tgcagcatag cctggataca 2100 gccctgagaa gggccagaag cgcccctgcc gccgccatcg ccgctagagt ggccggccag 2160 acaagaaata tcaccgtgga cccccggctg ttcaagaaaa gaagactgcg gtctcctaga 2220 gtgctctttt caacacagcc tcctcgggaa gccgctgata cccaggacct ggacttcgag 2280 gtgggaggcg ccgctccttt caatagaacc cacagatcca agagaagctc tagccaccct 2340 atcttccacc ggggcgagtt cagcgtgtgc gacagcgttt ctgtgtgggt gggagataag 2400 accaccgcaa ccgatatcaa gggcaaggaa gtgatggtgc tgggcgaagt gaacatcaac 2460 aacagcgtct ttaagcagta cttcttcgag acaaagtgcc gggacccaaa ccccgtggac 2520 agcggctgca gaggcattga ctccaagcac tggaactcct actgcaccac aacacacacc 2580 ttcgtgaagg ccctgaccat ggacggcaaa caagctgcct ggcggttcat cagaatcgac 2640 accgcctgtg tctgtgtgct gagcagaaag gccgtgcgcc gggcctagtc ctgttaatca 2700 acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactgatatt cttaactatg ttgctccttt 2760 tacgctgtgt ggatatgctg ctttaatgcc tctgtatcat gctattgctt cccgtacggc 2820 tttcgttttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 2880 cgttgtccgt caacgtggcg tggtgtgctc tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggctg 2940 gggcattgcc accacctgtc aactcctttc tgggactttc gctttccccc tccctatcgc 3000 cacggcagaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggcta ggttgctggg 3060 cactgataat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc gactgtgcct tctagttgcc 3120 agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 3180 ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 3240 ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 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tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 4140 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 4200 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 4260 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 4320 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 4380 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 4440 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 4500 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 4560 gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 4620 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 4680 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 4740 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 4800 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 4860 agtaaacttg gtctgacagt tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 4920 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 4980 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 5040 gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 5100 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 5160 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 5220 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 5280 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 5340 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttccca gggatcgcag 5400 tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 5460 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 5520 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 5580 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 5640 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcatactct 5700 tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 5760 ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 5820 cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 5880 cgaggccctt tcgtc 5895 <210> 26 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu 20 25 30 Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 35 40

Claims (71)

  1. 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방(anterior chamber) 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 유효량의 일차 치료제를 눈 또는 눈과 유체 소통하는 조직에 투여하는 단계; 및
    b. 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4, 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제인, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 국소 비강 투여는 비강내 스프레이를 통하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 치료제는 눈물샘 중 하나 또는 둘 모두 내로의 눈물샘 내 주사 또는 국소 투여를 통해 투여되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후에 투여되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후 7일차로부터 시작하여 투여되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 전방 사골 신경의 효과적인 전기 자극인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘, 눈물관, 각막, 각막 상피, 윤부 줄기 세포, 결막, 눈물점, 및 눈물 소관 중 하나 또는 이의 임의의 조합인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 눈과 유체 연통하는 조직은 각막인, 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 눈과 유체 연통하는 조직은 눈물샘인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 눈물막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 일차 치료제 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 대상체의 눈의 각막에 전달되는 일차 치료제의 양의 증가를 초래하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 일차 치료제는 상기 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 유전자 산물은 치료 단백질인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 치료 단백질은 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF)인, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AVV) 벡터인, 방법.
  24. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터인, 방법.
  25. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 방법.
  26. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV인, 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
  29. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
  30. 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 약 50 μL 내지 약 100 μL이 투여되는, 방법.
  31. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
  32. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 대상체의 눈의 각막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
  33. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애는 신경영양성 각막염, 안구 표면의 화학적 화상, 각막 상처, 각막 궤양, 지속적인 상피 결함, 안구 건조증, 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염, 삼차 신경 및/또는 눈의 수두 대상포진 바이러스 감염, 또는 각막 신경의 당뇨병 합병증인, 방법.
  37. 이를 필요로 하는 대상체의 적어도 한쪽 눈의 안구 표면에 유전자 산물을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
    유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계; 및
    국소 비강 투여를 통해 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 유전자 산물은 치료 단백질인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 치료 단백질은 신경 성장 인자(NGF)인, 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 치료 단백질은 신경교세포 유래 신경영양 인자(GDNF)인, 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AVV) 벡터인, 방법.
  42. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 백신 바이러스 벡터인, 방법.
  43. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 방법.
  44. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  45. 제41항에 있어서, AAV 벡터는 혈청형 5(AAV5), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 8(AAV8), 또는 혈청형 9(AAV9)의 AAV인, 방법.
  46. 제41항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 밀리리터당 약 1 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
  47. 제41항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 밀리리터당 약 6.2 × 1012 게놈 카피(GC/mL)의 AAV 벡터를 포함하는, 방법.
  48. 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 약 50 μL 내지 약 100 μL이 투여되는, 방법.
  49. 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후에 투여되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 일차 치료제의 투여 후 7일차로부터 시작하여 투여되는, 방법.
  51. 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 대상체의 눈의 눈물막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
  52. 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 대상체의 눈의 각막에서의 유전자 산물의 발현을 초래하는, 방법.
  53. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 눈물막에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
  56. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 바이러스 벡터 단독의 투여에 비해 사전 결정된 시간 내에 안구 표면에 전달되는 유전자 산물의 양의 증가를 초래하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 사전 결정된 시간은 약 5분인, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 사전 결정된 시간은 약 1시간인, 방법.
  59. 제37항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 nAChR 하위유형 알파4베타2, 알파3베타4, 알파3알파5베타4 및/또는 알파4알파6베타2의 완전 작용제인, 방법.
  60. 제37항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 바레니클린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  61. 제37항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 (R)-5-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)피리미딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  62. 제37항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 nAChR 작용제는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 방법.
  63. 제37항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 비강내 주사를 통해 투여되는, 방법.
  64. 제37항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 안구 표면 장애, 각막 장애, 또는 전방 장애는 신경영양성 각막염, 안구 표면의 화학적 화상, 각막 상처, 각막 궤양, 지속적인 상피 결함, 안구 건조증, 삼차 신경 및/또는 눈의 단순 포진 바이러스 감염, 삼차 신경 및/또는 눈의 수두 대상포진 바이러스 감염, 또는 각막 신경의 당뇨병 합병증인, 방법.
  65. 대상체에서 안구 표면 장애, 각막 장애 또는 전방 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료로서, 상기 방법은:
    a. 상기 일차 치료제의 유효량을 눈 또는 눈과 유체 연통하는 조직에 투여하는 단계; 및
    b. 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 일차 치료제 및 치료.
  66. 제65항의 용도를 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료로서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 포함하는, 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료.
  67. 제66항의 용도를 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료로서, 상기 nAChR 작용제는 바레니시클, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료.
  68. 제65항 내지 제67장 중 어느 한 항의 용도를 위한 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료로서, 상기 눈물 생성을 증가시키는 치료는 국소 비강 투여를 통해 투여되는, 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료.
  69. 제65항 내지 제67장 중 어느 한 항의 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료로서, 상기 일차 치료제의 유효량을 투여하는 단계는 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체의 적어도 하나의 눈물샘에 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 일차 치료제는 상기 유전자 산물, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료.
  70. 안구 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 일차 치료제 및 눈물 생성을 증가시키기 위한 치료.
  71. 키트로서:
    (a) 유전자 산물 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물; 및
    (b) 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 작용제를 포함하는 제2 조성물을 포함하며,
    이를 필요로 하는 대상체에서 본원에 기술된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 지침을 포함하는, 키트.

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