KR20240009589A

KR20240009589A - Syk 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 염증 억제 및 면역 조절용 조성물

Info

Publication number: KR20240009589A
Application number: KR1020220086638A
Authority: KR
Inventors: 김명옥
Original assignee: 경상국립대학교산학협력단
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2024-01-23
Also published as: WO2024014620A1

Abstract

본 발명은 Syk 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 염증 억제 및 면역 조절용 조성물에 관한 것으로, 상기 Syk 저해제, 구체적으로 BAY61-3606은 LPS에 의해 상향 조절된 Syk, Iba-1, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1α, IL-6) 및 염증관련 인자(NF-κB, Cox-2, iNOS)의 발현을 유의미하게 감소시키고, LPS 처리된 마우스 뇌와 HT22 세포에서 시토크롬 C와 Bim(BCL-2 상호작용 세포사 매개체)의 발현을 조절함으로써 미세아교-매개 신경세포 사멸을 유의미하게 억제하였으며, LPS 처리한 마우스의 뇌 및 HT22 세포에서 시냅스 마커인 SNAP25(synaptosomal-associated protein, 25kDa), Syp(synaptophysin) 및 PSD95(postsynaptic density protein-95)의 발현을 회복하고, 기억 및 인지기능 장애 관련 Y-미로 테스트와 수동 회피 테스트에서 LPS로 인한 인지 및 기억 장애를 억제하는 효과가 있으므로, Syk 저해제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Syk 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 염증 억제 및 면역 조절용 조성물{Composition for inhibiting inflammation of neurodegenerative brain diseases and immune regulation comprising spleen tyrosine kinase inhibitor as effective component}

본 발명은 Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 염증 억제 및 면역 조절용 조성물에 관한 것이다.

퇴행성 뇌질환 환자의 뇌에서 공통으로 발견되는 병리학적 특징으로는 신경세포의 사멸과 특정단백질의 비정상적 응집이 있다. 아밀로이드 베타(amyloid β), 노인반(senile plaque), 신경섬유농축제(neurofibrillary tangle), 알파 시뉴클린(α-synuclein) 또는 루이소체(lewy body) 등의 단백질의 비정상적 응집이 그 자체로 신경세포의 사멸을 유도하거나, 미세아교세포를 활성화해 염증반응을 일으킴으로써 파킨슨병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(Olivopontocerebellar atrophy; OPCA), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 선조체-흑질 퇴행증 (Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증 (Cortico-basal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨스-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam), 픽병(Pick's disease) 등의 퇴행성 뇌질환의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

한편, Syk(spleen tyrosine kinase)는 다양한 신호 전달의 중요한 조절자이며, 대식세포의 적응 면역 및 식세포 활동에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그 중 선택적 Syk 억제제인 BAY61-3606은 대식세포 활성화 조절을 통해 패혈증 및 급성 신장 손상을 포함한 다양한 염증 매개 병리학적 모델을 억제하는 효과가 있다.

퇴행성 뇌질환 관련 선행기술로는 한국등록특허 제1754451호에 PCAF 저해제(P300/CBP-associated factor's inhibitor)를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1723514호에는 SNO-OGT 억제제를 포함하는 알츠하이머병, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 Syk 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 염증 억제 및 면역 조절용 조성물에 관해 전혀 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 염증 억제 및 면역 조절용 조성물을 제공하고, 상기 Syk 저해제, 구체적으로 BAY61-3606(이하, BAY61 병행 표기)은 LPS에 의해 상향 조절된 Syk, Iba-1, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1α, IL-6) 및 염증관련 인자(NF-κB, Cox-2, iNOS)의 발현을 유의미하게 감소시키고, LPS 처리된 마우스 뇌와 HT22 세포에서 시토크롬 C와 Bim(BCL-2 상호작용 세포사 매개체)의 발현을 조절함으로써 미세아교-매개 신경세포 사멸을 유의미하게 억제하였으며, LPS 처리한 마우스의 뇌 및 HT22 세포에서 시냅스 마커인 SNAP25(synaptosomal-associated protein, 25kDa), Syp(synaptophysin) 및 PSD95(postsynaptic density protein-95)의 발현을 회복하고, 기억 및 인지기능 장애 관련 Y-미로 테스트와 수동 회피 테스트에서 LPS로 인한 인지 및 기억 장애를 억제할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계;를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 Syk 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 염증 억제 및 면역 조절용 조성물에 관한 것으로, 상기 Syk 저해제, 구체적으로 BAY61-3606은 LPS에 의해 상향 조절된 Syk, Iba-1, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1α, IL-6) 및 염증관련 인자(NF-κB, Cox-2, iNOS)의 발현을 유의미하게 감소시키고, LPS 처리된 마우스 뇌와 HT22 세포에서 시토크롬 C와 Bim(BCL-2 상호작용 세포사 매개체)의 발현을 조절함으로써 미세아교-매개 신경세포 사멸을 유의미하게 억제하였으며, LPS 처리한 마우스의 뇌 및 HT22 세포에서 시냅스 마커인 SNAP25(synaptosomal-associated protein, 25kDa), Syp(synaptophysin) 및 PSD95(postsynaptic density protein-95)의 발현을 회복하고, 기억 및 인지기능 장애 관련 Y-미로 테스트와 수동 회피 테스트에서 LPS로 인한 인지 및 기억 장애를 억제하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 동물실험 일정 개략도이다.
도 2는 LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk가 미세아교세포의 활성화 인자(Iba-1) 및 염증 매개 인자(TNFα)의 발현에 미치는 효과를 확인한 결과이다. (A) 및 (C)는 피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus)에서 Syk, Iba-1 및 TNFα의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인하고 이를 정량한 결과이고, (B) 및 (D)는 피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus)에서 Iba-1 발현을 확인한 면역형광 이미지 및 이를 정량한 결과이다(Scale bars, 100㎛). BAY61(BAY61-3606)은 Syk 억제제이다. *, **, ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.005, ***은 p<0.0001이다.
도 3은 LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk 억제제(BAY61) 투여에 의한 염증완화 효과를 확인한 결과이다. (A) 및 (C)는 피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus)에서 NF-κB의 인산화 정도, iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하고 이를 정량한 결과이고, (B) 및 (D)는 피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus)에서 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 변화를 확인한 면역형광 이미지 및 이를 정량한 결과이다(Scale bars, 100㎛). *, **, ***, ****은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.005, ***은 p<0.0001, ****은 p<0.00001이다.
도 4는 LPS로 염증을 유발시킨 BV2 미세아교세포에서, Syk 억제제(BAY61) 투여에 의한 미세아교세포의 활성화 인자(Iba-1) 및 염증 매개 인자(TNFα, IL-1β, IL-6)의 발현 변화를 확인한 결과이다. (A)는 Syk, Iba-1, TNFα 및 IL-1β의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인하고 이를 정량한 결과이고, (B)는 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현을 확인한 결과이다. *, **, ***, ****은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.005, ***은 p<0.0001, ****은 p<0.00001이다.
도 5는 LPS로 염증을 유발시킨 BV2 미세아교세포에서, Syk 억제제(BAY61) 투여에 의한 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 변화를 확인한 결과(A), mRNA 발현 변화를 확인한 결과(B) 및 아질산염 생성 정도를 확인한 결과(C)이다. *, ***, ****은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, ***은 p<0.0001, ****은 p<0.00001이다. ##은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.005이다.
도 6은 LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk 억제제(BAY61) 투여에 의한 신경세포 사멸 완화 효과를 확인한 결과이다. (A)는 피질 및 해마 영역[Cornu ammonis(CA)1, CA3 및 Dentate gyrus(DG)]의 신경세포 밀도를 확인한 니슬(Nissl) 염색 이미지(Scale bars, 50㎛)이고, (B)는 니슬(Nissl) 양성 신경세포를 정량한 결과이다. (C)는 피질과 해마에서 시토크롬 C 및 Bim의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 이미지이고, (D)는 이를 정량한 결과이다. *, **, ***, ****은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.005, ***은 p<0.0001, ****은 p<0.00001이다.
도 7은 Syk 억제제(BAY61)의 신경독 매개 신경변성 완화 효과를 확인한 결과이다. (A)는 미세아교세포 조절 배지에 대한 실험 계획을 나타낸 그림 및 해마 신경세포주인 HT22에서 미세아교세포 조절 배지의 세포 독성을 확인한 결과이고, (B)는 LPS 처리된 미세아교세포의 조절 배지(LCM); 또는 BAY61와 LPS가 함께 처리된 미세아교세포의 조절 배지[(L+BAY61)CM];를 처리한 HT22의 시토크롬 C 및 Bim의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인하고, 이를 정량한 결과이다. (C)는 미세아교세포(BV2) 및 해마 신경세포주(HT22)의 트랜스웰 기반 공동배양 시스템의 실험 계획을 나타낸 그림 및 BV2를 포함하는 트랜스웰 투과성 지지체 및 HT22 배지에서 아질산염을 측정한 결과이다. (D)는 트랜스웰 기반 공동배양 시스템에 의해 배양된 HT22의 시토크롬 C 및 Bim의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인하고, 이를 정량한 결과이다. *, **, ***, ****은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.005, ***은 p<0.0001, ****은 p<0.00001이다. ##은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.005이다.
도 8은 LPS로 신경염증이 유발된 동물모델의 피질(A) 및 해마(B)에서, Syk 억제제(BAY61) 투여에 의한 SNAP25(synaptosome-associated protein, 25kDa), Syp(synaptophysin) 및 PSD95(postsynaptic density protein-95)의 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하고, 이를 정량한 결과이다. *, **, ***, ****은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.005, ***은 p<0.0001, ****은 p<0.00001이다.
도 9는 LPS로 신경염증이 유발된 동물모델의 피질(A) 및 해마(B)에서, Syk 억제제(BAY61) 투여에 의한 PSD95 단백질 발현 변화를 확인한 면역형광 이미지(Scale bars, 25㎛) 및 이를 정량한 결과이다. **, ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, **은 p<0.005, ***은 p<0.0001이다.
도 10은 LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk 억제제(BAY61) 투여에 의한 단기 공간 작업 기억 회복 효과를 Y-미로 테스트로 확인한 결과이다. (A)는 Y-미로 통로 총 입장 횟수(total entry)이고, (B)는 자발적 변경 행동력(Spontaneous alteration)을 자동 비디오 추적 시스템으로 측정한 결과이다. *, **은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.005이다.
도 11은 LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk 억제제(BAY61) 투여에 의한 학습 기억 회복 효과를 수동 회피 테스트로 확인한 결과이다. 시험 결과는 밝은 방에서 어두운 방을 통과할 때 진입대기 시간(Entry latency)으로 나타냈다. ****은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, ****은 p<0.00001이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 Syk 저해제는 Syk의 발현 또는 작용을 저해할 수 있는 물질은 어느 것이라도 사용할 수 있고, 바람직하게는 하기 화학식 1의 화합물(BAY61-3606)인 것이지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington disease) 및 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 중에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 파킨슨병인 것이지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 퇴행성 뇌질환은 신경염증(Neuroinflammation) 또는 세포사멸(Apoptotic cell death)에 의한 것이 특징이다.

상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물의 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 중에서 선택된 1종 이상의 담체를 더 함유할 수 있으며, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제 중에서 선택된 1종 이상의 보조제를 더 함유할 수 있다.

상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구의 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 총 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

상기 Syk 저해제는 Syk의 발현 또는 작용을 저해할 수 있는 물질은 어느 것이라도 사용할 수 있고, 바람직하게는 하기 화학식 1의 화합물인 것이지만, 이에 제한되지 않는다.

[화학식 1]

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

[재료 및 방법]

1. 실험용 마우스

7주령 수컷 C57BL/6 마우스는 샘타코 바이오(Osan, Korea)에서 구입하였다. 마우스는 실온(23±2℃)에서 12시간 밤/낮의 주기로, 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 환경에서 일주일간 순응시켰다. 실험 그룹은 하기 표 1에 개시된 바와 같이 구분하였으며, LPS(L2630, Sigma Aldrich, USA) 및 BAY61-3606(11423, Cayman, USA)은 복강 내 주사로 처리하였다. 실험 일정의 전체 개략도는 도 1에 개시된 바와 같다.

구분	처리 기간	처리 시료	그룹 당 마리 수
Control 그룹	9일	식염수	4
LPS 그룹	9일	LPS: 0.25mg/kg	4
LPS+BAY61 그룹	9일	LPS: 0.25mg/kg BAY61-3606: 10mg/kg	4
BAY61 그룹	9일	BAY61-3606: 10mg/kg	4

2. Y-미로 및 수동 회피 테스트

Y-미로 테스트 측정 장비는 세 개의 가지로 구성되어 있다. 실험동물을 장비의 한쪽 팔(arm) 끝에 넣고 8분 동안 미로 주변을 자유롭게 움직일 수 있게 하였다. 그 후, 미로는 방향 편향을 피하기 위해 70%(v/v) 에탄올로 소독하였다. Y-미로 통로 총 입장 횟수(total entry), 자발적 변경 행동력(Spontaneous alteration) 및 평균 구역 속도는 SMART V3.0 (Harvard apparatus, USA)으로 기록하였다.

수동 회피 테스트는 수동 회피 상자를 이용하여 진행하였다. 수동 회피 상자는 어두운 방과 밝은 방으로 나누어져 있으며, 밝은 방에 실험동물을 넣으면 어두운 방으로 실험동물이 이동하는 습성을 이용하였다. 실험 첫날 3분 동안 어두운 방이 닫힌 조건에서 밝은 방에서 자유롭게 탐색하도록 하였다. 2일 차에 마우스를 밝은 방에 넣고, 30초 후 어두운 방의 문이 열리면 마우스가 어두운 방으로 이동하는데, 마우스가 어두운 방을 통과할 때 문을 닫고 그리드 바닥(grid floor)에서 파생된 전기 충격을 주었다(0.2mA, 2초). 24시간 동안 마우스를 안정화시킨 후, 전기 충격을 가한 것을 제외하고는 2일 차와 동일한 조건에서, 밝은 방에 마우스를 다시 넣고 5분의 컷오프 시간으로 암실을 통과할 때 진입대기 시간(Entry latency)을 측정하였다.

3. 조직 처리

실험 종료 후, 차가운 PBS 및 4%(v/v) 포름알데히드로 마우스를 경심관류하고, 4%(v/v) 포름알데히드 및 20%(w/v) 자당으로 24시간 동안 순차적으로 후고정시켰다. 그 후 뇌를 OCT(optimal cutting temperature compound) 복합체 (Sakura, Torrance, CA, USA)에 고정한 다음 액체 질소에서 동결시켰다.

염색 및 면역형광 실험을 위해, 동결시킨 뇌 조각을 20㎛로 절단한 다음 슬라이드에 고정하고, 이를 영하 70℃에서 보관하였고, 염색 및 면역형광 전에 사용할 때마다 실온에서 밤새 배양하였다.

4. 니슬 염색(Nissl staining)

니슬 염색을 위해, 뇌 절편을 자일렌으로 탈수하고, 100% 에탄올에서 재수화한 후, 슬라이드를 0.1%(w/v) 크레실 바이올렛과 함께 15분 동안 배양하였고, 이후 70% 에탄올(v/v)로 세척한 다음 D.P.X 장착제(D.P.X mounting medium)로 장착한 후, 슬라이드를 커버 슬립으로 덮고 니슬 양성 세포를 광학 현미경(Axioskpo2 plus, Zen, Zeiss, Germany)으로 관찰하였다. 관찰 결과는 이미지 J 소프트웨어로 분석하였다.

5. 면역형광

구연산염 완충액 기반 열 유도 항원 회복은 뇌 해마 슬라이스를 90~100℃에서 20분 동안 반응시켜 수행하였다. 그 후 10분 동안 건조하고, 슬라이드를 0.1%(v/v) 트윈 20을 포함한 PBS(PBST)로 세척한 다음, 5%(v/v) 정상 염소 혈청 및 0.1%(v/v) TritonX-100을 포함한 PBST에 1시간 동안 보관하였다. 1시간 후, 슬라이드를 밤새 4℃에서 1차 항체들과 반응시키고, 다음날, 실온에 1시간 동안 노출시킨 뒤, PBST로 세척한 다음 Alexa fluor 488이 결합된 염소-항 마우스 또는 Alexa fluor 594가 결합된 2차 항체(Thermo Fisher Scientific, USA)로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 슬라이드를 실온에서 90분 동안 세척한 다음 핵 염색을 위하여, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 10분 동안 처리하였다. 관심 표적 단백질은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(FV 1000MPE, Fluoview, Olympus, Japan)에 의해 검출되었다.

6. 세포 배양

미세아교세포주인 BV2는 5%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 마우스 해마 신경세포주인 HT22는 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다.

BV2 세포는 1mL당 2.0×10⁵개의 세포 수로 배양 접시에 접종하였고, 세포가 70% 찼을 때 100ng/mL의 LPS를 처리하였다. LPS 처리 6시간 후, RNA를 추출하였고, LPS 처리 24시간 후 단백질을 추출하였다.

세포 실험에서 LPS는 100ng/mL 처리하였고, BAY61-3606은 10nM 또는 100nM 처리하였다.

BAY61-3606 및 LPS 처리 유무에 의해 유도된 아질산염을 검출하기 위해 제조사의 프로토콜에 따라 그리스 시약을 사용하였다.

BAY61-3606 및 LPS 처리 유무에 따른 미세아교세포의 조절 배지는 HT22에 24시간 동안 처리한 후, MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] 분석을 진행하여 세포 생존율을 측정하였다.

7. 트랜스웰 공동 배양 분석(Transwell Co-culture Assay)

BV2 세포를 트랜스웰(0.4㎛ 기공)에 접종하고, HT22를 6웰 플레이트에 접종한 후, BV2를 LPS(100ng/ml)로 처리하고 BAY61-3606(10nM 또는 100nM)을 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 트랜스웰 및 6-웰 플레이트의 배지를 수집하여 아질산염을 측정하고 HT22를 수집하여 신경세포 사멸을 평가하기 위한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

8. 웨스턴 블롯 분석

마우스 조직 또는 세포를 인산가수분해효소 및 단백질분해효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼에 용해한 후, 용해물을 30분 동안 4℃에서 13000rpm으로 원심분리하였다. 단백질은 브래드 포드 분석으로 정량하였다.

SDS PAGE Gel(sodium dodecyl polyacrylamide gel)에 미리 염색해 놓은 단백질 마커(GangNam-STAIN, iNTRON Biotechonology, 서울, 한국)와 함께 30㎍의 단백질을 로딩하였고, 전기영동 후에 크기별로 분리된 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride membrane)로 옮긴 후, 5%(w/v) 탈지유로 블로킹하였다.

분석하고자 하는 각각의 단백질에 대응하는 1차 및 2차 항체를 처리하고, ECL(enhanced chemiluminescent) 시약을 이용하여 시각화하였다. β-액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었고, β-액틴으로 광학 밀도를 정규화하기 위해 이미지 J 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하였다.

9. 항체

Bim(#2933, 1:3,000), Syk(#13198, 1:3,000)은 셀 시그날링사로부터 구매하였다(Cell Signaling Technology, USA). iba-1(016-20001, 1:1,000)은 와코사로부터 구매하였다(WAKO, Japan). β-액틴(sc-47778, 1:10,000), 시토크롬 C(sc-13156, 1:3,000), SNAP25(sc-20038, 1:3,000), SYP(sc-17750, 1:3,000), PSD95(sc-71933, 1:3,000), p-NF-kB(sc-136548, 1:1,000), TNFα(sc-52746, 1:1,000)는 산타크루즈사로부터 구매하였다(Santa cruz, USA). iNOS(610432, 1:3,000)는 BD 라이프사이언스사로부터 구매하였다(BD lifescience, USA). COX-2(160126, 1:3,000)는 사이만사로부터 구매하였다(Cayman, USA).

10. RNA 분리 및 정량적 PCR

TRIzol 시약(Invitro-gen, USA)을 이용하여 조직 또는 세포에서 총 RNA를 추출한 후, 2㎍의 총 RNA로부터 상보적인 DNA를 합성하였다. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)은 LightCycler 480 시스템(Roche, Rotkreuz, Switzerland)에서 SYBR Green I(GeNet Bio, Korea)을 사용하여 수행하였고, mRNA의 상대적 발현은 비교 CT(^ΔΔCT)를 사용하여 측정하였으며, GAPDH로 정규화하고, 대조군에 대한 배수 변화로 실험값을 나타내었다.

11. 데이터 분석 및 통계

모든 데이터는 4개의 독립적인 실험의 평균±표준편차(S.E.M)로 표시하였다. 각 그룹들 간의 비교를 위하여, Tukey의 사후검정을 사용한 one-way ANOVA가 사용되었다. 계산은 Prism 8.0 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 이용하여 수행하였으며, p<0.05를 기준으로 유의한 차이(significant difference) 여부를 결정하였다.

실시예 1. LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk 억제제 투여에 의한 미세아교세포 활성 및 염증 매개 인자 발현 변화 확인

LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk 억제제 투여에 의한 미세아교세포 활성 및 염증 매개 인자 발현 변화를 확인한 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 피질 및 해마 모두에서 LPS 처리에 의해 증가된 Syk의 발현이 Syk 억제제인 BAY61 처리에 의해 감소하였고, LPS 처리에 의해 증가된 미세아교 활성 인자인 Iba-1 및 염증 매개 인자인 TNFα의 발현도 감소하였다.

또한, 도 3에 개시된 바와 같이 Syk 억제제인 BAY61은 피질 및 해마에서 LPS에 의해 증가된 NF-κB의 인산화 정도, iNOS 및 CPX-2의 단백질 발현을 감소시켰다.

이를 통해 Syk 억제제인 BAY61은 LPS에 의해 유도된 미세아교세포의 활성을 감소시키고, 염증반응을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 2. LPS로 염증을 유발시킨 BV2 미세아교세포에서, Syk 억제제 투여에 의한 미세아교세포의 활성 및 염증 매개 인자 발현 변화 확인

Syk 억제제인 BAY61이 미세아교세포인 BV2에서도 LPS에 의해 유도된 염증을 억제하는지 확인하였다. 그 결과, 도 4A에 개시된 바와 같이 LPS에 의해 유도된 Syk, Iba-1, TNFα 및 IL-1β의 단백질 발현은 BAY61 처리 용량 의존적으로 하향 조절되었다. 또한, 도 4B에 개시된 바와 같이 LPS 처리시 증가된 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현도 BAY61 처리에 의해 감소되었다.

또한, 도 5A 및 5B에 개시된 바와 같이 BAY61은 LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2 단백질 및 mRNA 발현을 효과적으로 감소시켰으며, 도 5C에 개시된 바와 같이 아질산염의 생성량도 유의미하게 억제하였다.

이를 통해 Syk는 미세아교세포의 염증 조절제임을 확인하였다.

실시예 3. LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk 억제제 투여에 의한 신경세포 사멸 완화 효과 확인

Syk의 억제가 LPS에 의해 유도된 신경세포 사멸을 개선하는지 확인하였다. 니슬(Nissl) 염색 결과, 도 6A 및 6B에 개시된 바와 같이 LPS에 의해 유도된 신경세포 밀도 감소는 BAY61 처리에 의해 회복되었다.

또한, 도 6C 및 6D에 개시된 바와 같이 피질 및 해마에서 LPS에 의해 유도된 세포사멸 관련 단백질 시토크롬 C(Cyto C) 및 Bcl-2-유사 단백질 11(Bim)의 발현이 BAY61 처리에 의해 하향 조절되었고, 이는 상기 조직학적 분석과 일치하였다.

실시예 4. Syk 억제제(BAY61)의 신경독 매개 신경변성 완화 효과 확인

Syk 억제제(BAY61) 처리에 의한 신경세포 사멸 억제 효과가 측분비 방식에 의한 미세아교세포 활성화 정도에 의존하는지 확인하기 위해, 조건 배지 및 트랜스웰 배양의 두 가지 실험을 진행하였다.

도 7A에 개시된 바와 같이 LPS 처리된 미세아교세포의 조절 배지(LCM)는 HT22 세포 사멸을 유발하였고, BAY61와 함께 처리된 조절배지[(L+BAY61)CM]를 처리한 경우, HT22의 세포 사멸 정도가 완화되었다. 또한, 세포 사멸 관련 인자인 시토크롬 C 및 Bim의 발현 변화를 확인한 결과, 도 7B에 개시된 바와 같이 LCM 처리에 의해 증가된 시토크롬 C 및 Bim의 발현이 (L+BAY61)CM 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다.

다음으로, BV2 세포를 트랜스웰 투과성 지지체에 접종하고 LPS 및 BAY61로 자극한 후, 이식된 지지체를 HT22가 포함된 플레이트에 배치한 결과, 도 7C에 개시된 바와 같이 BV2 세포의 아질산염 농도는 LPS 자극에 의해 증가하였다가 BAY61 처리시 감소하였으나, HT22가 포함된 웰에서는 아질산염 농도의 감소 효과가 나타나지 않았고, 도 7D에 개시된 바와 같이 LPS 처리된 BV2 세포와 트랜스웰 배양된 HT22 세포에서 증가된 시토크롬 C 및 Bim의 발현이 LPS 및 BAY61 처리된 BV2 세포와 트랜스웰 배양된 HT22 세포에서 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 5. LPS로 신경염증이 유발된 동물모델에서, Syk 억제제 투여에 의한 시냅스 기능 장애, 인지 및 공간 작업 기억 장애 회복 효과 확인

기억 장애는 시냅스 기능 장애에 이어 신경세포 사멸과 밀접한 관련이 있으므로, Syk의 억제가 LPS로 신경염증이 유발된 마우스에서 시냅스 및 인지 기능 장애에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 LPS로 신경염증이 유발된 마우스 피질 및 해마에서 SNAP25(synaptosome-associated protein, 25kDa), Syp(synaptophysin) 및 PSD95(postsynaptic density protein-95)의 감소된 발현이 BAY61 투여 후 정상군과 유사한 수준으로 회복되었고, 면역형광분석으로 PSD95 단백질 발현을 확인한 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 LPS로 신경염증이 유발된 마우스 피질 및 해마에서 감소된 PSD95의 발현이 BAY61 투여 후 정상군과 유사한 수준으로 회복되었다.

또한, LPS로 신경염증이 유발된 마우스에서 기억 관련 기능에 대한 Syk 억제 효과를 확인하기 위해 Y-미로 테스트 및 수동 회피 테스트를 수행하였다.

Y-미로 테스트는 단기 기억력을 측정하는 실험으로, 순차적으로 행동하는 능력을 평가할 수 있다. Y-미로 테스트 결과, 도 10A에 개시된 바와 같이 Y-미로 각 팔(arm) 총 입장 횟수가 LPS로 신경염증이 유발된 마우스에서 증가되었으나, BAY61 투여시 정상군 수준으로 회복하였고, 자동 비디오 추적 시스템으로 자발적 변경 행동력(Spontaneous alteration)을 측정한 결과, 도 10B에 개시된 바와 같이 LPS로 신경염증이 유발된 마우스에서 감소된 자발적 변경 행동력(교대 및 탐색의 비율)이 BAY61 투여시 정상군 수준으로 회복되었다. 이는 BAY61이 LPS로 신경염증이 유발된 마우스에서 발생된 공간 작업 기억 손상을 회복시킬 수 있다는 것을 의미한다.

또한, 도 11에 개시된 바와 같이 수동 회피 테스트에서 LPS로 신경염증이 유도된 마우스는 전날 전기 충격에 노출되었음에도 밝은 방에 머무는 시간이 정상군 대비 감소하였고, BAY61이 함께 투여된 마우스는 정상군과 유사한 밝은 방에 머무는 시간을 가졌다.

Claims

Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 Syk 저해제는 하기 화학식 1의 화합물인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington disease) 및 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 신경염증(Neuroinflammation) 또는 세포사멸(Apoptotic cell death)에 의한 것임을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 Syk 저해제 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
Syk(spleen tyrosine kinase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계;를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료방법.