KR20240004540A - 세포내 전달 조성물 - Google Patents

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KR20240004540A
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릴라흐 첸 젤츠버그
로지 라비트 우잔 게타
아얄라 루코비츠
요시 갓프리드
로템 파이겐보임-오르나이
모띠 하킴
야이르 사피르
일라나 만델
테힐라 벤-모셰
아비도르 슐만
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Abstract

폴리에틸렌이민을 포함하는 단백질 담체, 세포내 표적과 상호작용하는 페이로드 및 링커를 포함하는 단백질 접합체가 제공된다. 단백질 접합체를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 단백질 접합체의 사용 방법 및 생산 방법이 또한 제공된다.

Description

세포내 전달 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은, 2021년 4월 20일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/177,144호의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 모두 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 단백질의 세포내 전달 분야이다.
특히 종양학 분야에서 새롭고 강력한 치료 표적을 탐색할 때, 세포내 표적, 특히 "약물치료 불가능한(undruggable)" 것으로 간주되는 표적을 표적화하는 것은 매우 어렵다. 이러한 표적은 소분자 약물에 의해서 표적화될 수 없는데, 그 이유는 주로 필요한 치료 개입이 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 것을 포함하기 때문이고, 여기서 소분자 약물은 효능 및/또는 충분한 선택성을 나타낼 수 없다. 이러한 표적 및 생물학적 과정은 생물학적 작용제, 예를 들어, 모노클로날 항체, 수용체, 인터루킨 및 이들의 유도체 및 조합에 의해 고전적이고 효율적으로 다루어지지만, 이러한 작용제는 살아있는 세포, 특히 세포질, 핵, ER 등과 같이 임상적으로 관련된 세포 구획에 쉽게 들어갈 수 없다. 이는 외부 세포막이 단백질 기반 분자에 대해 불침투성이기 때문이다.
단백질 기반 분자가 자연적 세포내이입 기반 메커니즘에 의해 살아있는 세포에 내재화되는 경우, 이 단백질 기반 분자는 엔도솜 경로로 들어가는데, 이것은 리소솜 분해로 이어진다. 따라서, 이 경로는 자연적으로 리소솜 장애의 치료나 항체-약물 접합체(ADC)에만 관련된다. 전자의 경우, 치료적 단백질 기반 작용제는 엔도솜 또는 리소솜에서 활성을 발휘하는 것을 목표로 하며 일반적으로 엔도솜/리소솜의 조건을 견디도록 설계되거나 자연적으로 적합하다. 후자의 경우, 항체는 소분자 약물을 특정 세포에 표적화/전달하기 위해 순전히 사용되며, 항체 담체의 리소솜 분해는 소분자 약물, 일반적으로 세포 독소를 방출한다.
그러나, 단백질 자체가 단지 표적화 모이어티가 아니라 치료적이라면, 본 발명의 기술은 "엔도솜 탈출"로 알려진 것을 추가로 가능하게 해야 한다. 이러한 중요한 단계는 이러한 세포 기구에 의한 치료제의 이화작용을 피하기 위해서, 엔도솜 경로의 여러 단계의 소포, 즉 초기 또는 후기 엔도솜 및 리소솜의 소포로부터 치료적 생물학적 제제를 유리한다.
엔도솜으로부터의 성공적인 탈출 후, 치료제는 세포의 세포질로 방출된다. 그러나, 세포질은 혼잡한 환경이며 현재 사용되는 대부분의 생물학적 치료제, 예를 들어, 모노클로날 항체 및 이의 유도체에 적합하지 않다. 치료적 생물학적 제제는 이의 치료 표적에 위치하여 이와 결속하거나, 대안적으로 표적 세포내 소기관, 예컨대, 핵, 소포체(ER), 미토콘드리아 등에 도달하기 위해서 세포질에 효율적으로 분산되어야 한다.
단백질-단백질 상호작용을 차단하기 위해 설계되고 임상적으로 사용되거나 효능제로 사용될 수 있는 가장 강력한 생물학적 작용제는 항체, 주로 모노클로날 항체 또는 이의 유도체, 예컨대, Fab, scFv 및 이들의 조합을 기반으로 한다. 이러한 모든 작용제는 구조적으로 또는 기능적으로 쇄내 또는 쇄간 이황화 결합에 의존한다. 이러한 이황화 결합은 세포질의 환원 환경에서 불안정하다. 이러한 환원 환경은 고농도의 환원제(이들 중 가장 두드러진 것은 글루타티온임)의 결과로 이러한 치료제의 이황화 가교의 환원을 유발하여 이의 구조를 잃고, 따라서 이의 표적과 결합하는 능력을 잃게 만든다. 따라서 효율적인 세포내 전달 기술은 세포질 안정적인 작용제를 활용하거나 이러한 환원 환경으로부터 전달된 작용제를 보호하는 몇 가지 방법을 제공해야 한다.
이 외에도, 세포내 전달 기술은 생체 전체의 다양한 기관 및 조직에 치료적 페이로드를 효율적으로 전달할 수 있도록 적절한 약동학적 및 약력학적 거동을 가져야 한다.
고전적이고 가장 많이 연구된 세포내 전달 기술 중 하나는 페이로드의 향상된 양전하의 사용을 포함한다. 가장 고전적인 접근법은 바이러스에 의해서 사용되는 세포내 흡수 메커니즘에 대한 이해로부터 발전하였다. 후자는 유명한 HIV-유래 TAT 펩티드(RKKRRQRRR(서열번호 16))와 같은 아르기닌 및 리신이 풍부한 양으로 하전된 펩티드를 사용한다. 이러한 접근법은 다양한 페이로드에 융합되거나 화학적으로 접합되거나 다양한 나노입자를 장식하는 데 사용되는 상이한 전하, 아미노산 서열, 추가 변형 및 구조(선형, 고리형 등)를 갖는 수많은 세포-침투성 펩티드(CPP)를 생성하였다. CPP는 세포내로 내재화되는 능력을 나타내지만, 이의 엔도솜 탈출 효율은 여전히 논란의 여지가 있으며, 실제 의약품 응용에 사용하기에는 전반적인 효율성이 불충분한 것으로 여겨진다.
표준 CPP를 넘어 세포의 세포질에 단백질 기반 치료제를 전달하고 생체분포 및 약력학을 개선하는 보다 효율적인 방법이 상당히 필요하다.
본 발명은 폴리에틸렌이민을 포함하는 단백질 담체, 세포내 표적과 상호작용하는 페이로드 및 이들을 연결하는 링커를 포함하는 단백질 접합체를 제공한다. 단백질 접합체를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 단백질 접합체의 사용 방법 및 생산 방법이 또한 제공된다.
제1 양태에 따르면,
a. 복수의 폴리에틸렌이민(PEI) 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체;
b. 세포내 표적과 상호작용하는 페이로드; 및
c. 공유 결합을 통해서 단백질 담체 및 페이로드에 결합된 링커를 포함하는 단백질 접합체가 제공되며;
여기서 페이로드는, 절단되는 경우 세포내 표적과의 상호작용을 감소시키는 이황화 결합이 없고, 단백질 접합체는 융합 단백질이 아니다.
또 다른 양태에 따르면,
a. 복수의 폴리에틸렌이민(PEI) 모이어티에 공유 결합되고 적어도 8 mV의 양의(positive) 제타 전위를 특징으로 하는 HSA;
b. 단일 도메인 항체; 및
c. 공유 결합을 통해서 HSA 및 단일 도메인 항체에 결합된 링커를 포함하는 단백질 접합체가 제공되며;
여기서 단백질 접합체는 융합 단백질이 아니다.
또 다른 양태에 따르면, 세포내 표적에 결합할 수 있는 단백질 접합체의 생산 방법이 제공되며, 이 방법은,
a. 세포내 표적에 결합하고, 절단되는 경우 세포내 표적에 대한 결합을 감소시키는 이황화 결합이 없는 페이로드를 제공하는 것;
b. 복수의 PEI 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체를 제공하는 것;
c. 선택된 페이로드를 링커를 통해서 선택된 단백질 담체에 공유 연결시켜 단백질 접합체를 생산하는 것;
d. 인간 혈액, 혈장 또는 혈청에서 링커의 안정성을 결정하는 것; 및
e. 인간 혈액, 혈장 또는 혈청에서 안정적인 링커를 포함하는 단백질 접합체를 선택하는 것을 포함하며;
이에 의해서 세포내 표적에 결합할 수 있는 단백질 접합체를 생산한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생산된 단백질 접합체가 제공된다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 단백질 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에 따르면, 세포내 표적에 결합하는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포내 표적을 발현하는 세포를 본 발명의 단백질 접합체 또는 본 발명의 약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 생물학적 페이로드는 세포내 표적에 결합하며, 이에 의해서 세포내 표적에 결합한다.
또 다른 양태에 따르면, 세포내 표적에 결합하는 방법이 제공되며, 이 방법은,
a. 본 발명의 방법에 의해서 세포내 표적에 결합할 수 있는 단백질 접합체를 생산하는 것; 및
b. 세포내 표적을 발현하는 세포를 생산된 단백질 접합체와 접촉시키는 것을 포함하며;
이에 의해서 세포내 표적에 결합한다.
일부 실시형태에 따르면, PEI는 2000 달톤 미만의 분자량을 갖는 선형 PEI 또는 분지형 PEI이다.
일부 실시형태에 따르면, 복수의 PEI 모이어티는 3 내지 90개의 분자를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 페이로드는 세포내 표적에 결합하는 항원 결합 분자이다.
일부 실시형태에 따르면, 항원 결합 분자는 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 가변 중 동종이량체(VHH: variable heavy homodimer), 나노바디, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin) 및 항체 모방 단백질로부터 선택된다.
일부 실시형태에 따르면, 항원 결합 분자는 VHH 및 DARPin으로부터 선택된다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 담체는 혈장 내인성 단백질이다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 담체는 적어도 60 KDa 크기이다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 담체는 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, IgG, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)로부터 선택된다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 담체는 HSA이다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 담체는 HSA이고, 상기 단백질 담체는 3 내지 10개의 PEI 분자를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 생체적합성 중합체를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 생물학적-절단 가능한 결합(bio-cleavable bond)을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 생물학적-절단 가능한 결합은 이황화 결합을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 혈액에서 적어도 24시간 동안 실질적으로 안정적이다.
일부 실시형태에 따르면, 안정적이라는 것은 24시간 후에 혈액에서 25% 미만의 절단을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 생물학적 절단 가능한 결합은 입체 장애형이다.
일부 실시형태에 따르면, HSA는 시스테인 34(C34)를 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 이황화 결합을 통해서 HSA에 결합된다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 HSA의 C34에 결합된다.
일부 실시형태에 따르면, 이황화 결합은 C34에 근접하다.
일부 실시형태에 따르면, 근접한은 C34로부터 5 내지 15 옹스트롬 범위의 거리이다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 펩티드 링커이다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 서열번호 4 내지 15로부터 선택된다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 담체는 DNA가 없다.
일부 실시형태에 따르면, 생물학적 페이로드는 세포 표면 단백질에 결합하지 않는다.
일부 실시형태에 따르면, 복수의 PEI 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체는 적어도 8 mV의 양의 제타 전위를 특징으로 한다.
일부 실시형태에 따르면, HSA는 3 내지 10개의 PEI 분자를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 접합체는 검출 가능한 태그를 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 태그는 생물학적 페이로드에 접합된다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 접합체는 혈액-안정적인 접합체이다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 접합체는 세포-침투성 접합체이다.
일부 실시형태에 따르면, 결정은 단백질 접합체의 형성 이전에 또는 상기 단백질 접합체의 형성 이후에 수행된다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 세포내 표적에 대한 생물학적 페이로드의 결합을 확인하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 복수의 PEI 모이어티에 결합된 단백질 담체는 적어도 8 mV의 양의 제타 전위를 특징으로 한다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 담체는 HSA를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 단백질 담체는 적어도 3개의 PEI 분자에 결합된다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 선택된 단백질 접합체를 세포에 접촉시키는 것, 및 생물학적 페이로드가 세포의 세포질에 유입되는 것을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 안정적이라는 것은 24시간 후에 혈액에서 25% 미만의 절단을 포함하고, 불안정적이라는 것은 24시간 후에 세포질 조건에서 적어도 50%의 절단을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 생체적합성 중합체를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 공유 연결은 클릭 반응을 통해서 일어난다.
일부 실시형태에 따르면, 페이로드는 제1 반응성 기를 포함하는 링커에 공유 결합되고; 단백질 담체는 상기 제1 반응성 기에 대해 반응성을 갖는 제2 반응성 기를 포함하는 링커에 공유 결합된다.
일부 실시형태에 따르면, 공유 연결은 제1 반응성 기와 제2 반응성 기의 반응을 통해서 일어나며, 이에 의해서 페이로드와 단백질 담체를 공유 연결한다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 생물학적-절단 가능한 결합을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 공유 연결은 이황화 결합 형성을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, (i) 페이로드는 단백질 담체의 시스테인과 이황화 결합을 생성할 수 있는 링커에 공유 결합되거나; (ii) 단백질 담체는 페이로드의 시스테인과 이황화 결합을 생성할 수 있는 링커와 공유 결합되고, 결합은 선택적으로 이황화 결합을 통해서 일어난다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 세포질 조건에서 링커의 안정성을 결정하는 것, 및 세포질 조건에서 불안정적인 링커를 포함하는 단백질 접합체를 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 약학적 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 세포내 표적을 검출하는 방법이며, 단백질 접합체는 검출 가능한 태그를 포함하고, 방법은 검출 가능한 태그를 검출하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 세포내 표적을 조절하는 방법이고, 페이로드는 세포내 표적의 효능제 또는 길항제이다.
일부 실시형태에 따르면, 세포는 대상체에 존재하고, 여기서 접촉은 단백질 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 방법은 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법이며, 병태는 세포내 표적의 조절에 의해서 치료될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 병태는 암이고, 세포내 표적은 발암성이고, 생물학적 페이로드는 길항제이다.
일부 실시형태에 따르면, 접촉시키는 것은, 단백질 접합체가 세포로 침투하는 것을 유도하도록 설계된 담체 단백질 이외의 작용제의 존재 하에서 일어나지 않는다.
추가의 실시형태 및 본 발명의 적용가능성의 전체 범위는 이하에 주어진 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내면서, 단지 예시로서 주어지는 것으로 이해되어야 하는데, 이는, 본 발명의 사상 및 범주 내의 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.
도 1: 다양한 변형 수준에서 비변형 마우스 IgG 및 PEI-변형된 마우스 IgG의 MALDI-ToF 스펙트럼.
도 2: PEI-변형된 마우스 IgG 또는 비변형 마우스 IgG의 A375 세포(청색 - 핵, 녹색 - 염색된 마우스 IgG) 내로의 내재화에 대한 현미경 사진. 천연 IgG는 변형되지 않으며, 다른 모든 패널은 PEI를 갖는 증가하는 수준의 변형을 나타낸다. 각각의 패널 모서리의 숫자는 IgG 분자당 PEI 분자의 평균 수를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b: (3a) HEK 세포(60 μg/mL) 및 (3b) A375 세포(5 μg/mL) 내로의 PEI-변형된 GFP(GFP 분자당 평균 6.5 PEI)의 내재화의 현미경 사진.
도 4a 및 도 4b: PEI-양이온화된 담체 단백질이 치료제(이 예에서는 항체)에 화학적으로 연결되는 담체 및 페이로드 방법론의 도식적 표현, 여기서 링커는 이상적으로는 이의 CDR에서 떨어져 있는 Fc 영역에 접합된다. 링커는 (4a) 세포질에서 환원 및 절단되어 자유로운 세포질 수송을 가능하게 하는 양이온화된 담체로부터 치료적 페이로드를 방출할 수 있는 이황화 결합을 포함할 수 있거나 (4b) 절단 가능한 모이어티가 결여될 수 있다.
도 5a 내지 도 5m: (5a, 5c) (5a) 1 μM 또는 (5c) 3 μM의 다양한 작용제로 처리된 A375 세포에서 적색 아넥신 V 형광에 의해서 측정된 바와 같은 아폽토시스의 선 그래프. (5b, 5d) (5b) 5a 및 (5d) 5c에서 세포 역가당 적색 형광의 막대 그래프 정량화 및 정규화. (5e 내지 5l) (5e) 1C5-Hel20-LC; (5f) 1C5-Hel20-LC-S-S-HSA-PEI×3.5; (5g) 1C5-Hel20-LC-HSA-PEI×3.5; (5h) 1C5-Hel20-LC-S-S-PEG12-CO-NH-PEI600, (5i) 1C5-Hel20-LC-PEG8-CO-NH-PEI600, (5j) 1C5-Hel20-LC-S-S-PEG12-CO-NH-PEI1800; (5k) 1C5-Hel20-LC-PEG8-CO-NH-PEI1800; (5l) 1C5-Hel20-LC-r-CO-NH-PEI1800과의 2시간 인큐베이션 후 항-VHH 항체로 염색된 A375의 공초점 현미경 영상. 항-VHH 항체 - 적색; 핵 염색 - 청색. (5m) 다양한 작용제로 처리된 A375 세포에서 시간 경과에 따른 카스파제 3/7 양성 세포 아폽토시스 사건의 선 그래프.
도 6: 배지에서 IgG 수준의 특정 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 다양한 변형 수준에서 PEI-변형된 IgG(초기 배지 농도 2 μg/mL)의 세포 흡수 효율의 막대 차트.
도 7: PEI-변형된 IgG(4.5 PEI)의 카베올린-매개 세포내이입 내재화의 특이적 저해를 나타낸 히스토그램. NC - 변형되지 않은 IgG.
도 8: 5 μg/mL의 PEI-변형된 IgG(3×PEI, 좌측 패널; 4.5×PEI, 중간 패널 및 7×PEI, 우측 패널)와 함께 인큐베이션(5시간)시킨 후 HEK293 세포에서 발현된 엔도솜 마커(상부 패널) 또는 리소솜 마커(하부 패널)의 염색 현미경사진. 엔도솜 및 리소솜 마커는 녹색으로 나타나고, PEI-변형된 IgG는 적색으로 나타나고, 핵은 청색으로 염색된다.
도 9: 10 μg/mL의 PEI-변형된 IgG와 2×104개의 HeLa 세포의 밤새 인큐베이션 후 pH 감응성 염료(5(6)-카르복시나프토플루오레세인, 적색)로 표지된 PEI-변형된 IgG(4.5×PEI)의 실시간 영상 공초점 현미경을 사용한 엔도솜 탈출 모니터링의 현미경사진. 녹색 - 튜불린 염색, 청색 - 핵 염색.
도 10: 항-CD247 PEI-변형된 mAb(4.5×PEI)의 내재화 후 IFNγ 분비의 용량 의존적 증가에 의해 반영된 CD3 세포 활성화의 막대 차트. 평가된 농도 범위에서 내재화된 PEI-변형된 마우스 IgG에 대해 IFNγ 수준의 변화는 관찰되지 않았다.
도 11: PEI-변형된 HSA(7×PEI)에 대한 PEG-기반 이황화물 함유 링커에 의해 접합된 GFP와 A375 세포의 인큐베이션 후 GFP의 세포내 프로파일을 나타낸 현미경사진. 공초점 현미경(녹색 - GFP, 청색 - 핵)에 의해서 관찰된 바와 같이 세포는 인큐베이션 후 24시간(좌측) 및 48시간(우측)에 분산된 GFP 프로파일을 나타낸다.
도 12: 형광 표지된(AlexaFluor 647) 항-인간 IgG 항체를 사용한 공초점 현미경에 의해서 검출된 바와 같은, A375 세포와 밤새 인큐베이션시킨 후 이황화-결합 함유 PEG 링커를 통해서 PEI-변형된 HSA(11×PEI)에 접합된 항-TNFα 항체의 현미경사진.
도 13a 내지 도 13d: 본 발명의 예시적인 단백질 접합체의 도식적 표현. 도 13a는 PEG 링커를 통해 2개의 VHH 분자에 결합된 PEI 변형된 담체를 나타낸다. 도 13b 내지 도 13d는 예시적인 단백질 접합체를 개략적으로 나타내며, 여기서 PEG-기반 링커는 S-S 결합을 통해 담체에 공유 결합된다. PEG-기반 링커는 (13b) 이황화 결합(C1)을 통해, (13c) 말레이미드와 시스테인의 접합 생성물(C2)을 통해 또는 (13d) 디벤질 사이클로옥틴(DBCO)과 아지드의 클릭 반응(C3)에 의해 VHH 분자의 시스테인에 추가로 접합된다.
도 14: A375 세포의 존재 또는 이의 부재 하에서 HSA당 평균 3.5 또는 8개의 PEI 분자를 갖는 PEI 변형된 HSA에 접합된 항-비멘틴 VHH의 배지 수준에 대한 막대그래프.
도 15a 내지 도 15c: PEI-변형된 HSA에 가역적으로 접합된 항-비멘틴 VHH와 24시간 인큐베이션 후 (15a) VHH 및 (15b) 비멘틴에 대해 염색된 A375 세포의 공초점 현미경 영상의 현미경 사진 및 (15c) 둘 다의 병합. 핵은 청색으로 염색되어 있다.
도 16a 및 도 16b: (16a) PEI-변형된 HSA에 가역적으로 접합된 항-비멘틴 VHH 또는 (16b) 비접합된 항-비멘틴과 24시간 인큐베이션 후 VHH(녹색)에 대해 염색된 A375 세포의 공초점 현미경 영상의 현미경 사진. 핵은 청색으로 염색되어 있다.
도 17: 티미딘 세포 주기 동기화 후 S, G2 및 M 세포 주기 단계에서 HPV-양성 HeLa FUCCI 세포의 백분율을 나타낸 선 그래프. 세포를 평균 3.5개의 PEI로 변형된 HSA에 접합된 항-E7 VHH 및 다양한 대조군 처리로 처리하였다. 대조군은 치료 없음(wo), 비변형 VHH 항-E7, 비변형 HSA에 접합된 항-E7 VHH, 관련 없는(irrelevant) VHH에 접합된 변형된 HSA(항-비멘틴), 변형된 HSA 담체 단독 및 세포 주기 저해제(DP, CDK4/6 저해제)였다.
도 18: HPV-양성 HeLa FUCCI 세포에 대한 상이한 처리 효과의 현미경 사진. 평균 3.5개의 PEI로 변형된 HSA에 접합된 관련 없는 VHH(항-비멘틴)로 처리된 세포는 미처리 세포(좌측 영상)와 동일한 프로파일을 나타낸 반면, 동일한 HSA 담체에 접합된 항-E7 VHH는 CDK4/6 저해제의 처리 후에 관찰된 것(우측 영상)과 유사하게, 극적인 세포 사멸을 초래하였다.
도 19: 폐 선암종 세포 내로 내재화된 PEI-변형된 HSA 담체에 접합된 항-K-RAS His-태그 DARPin K27 단백질의 대표적인 현미경 사진. DARPin은 항-His 태그 항체로 염색한 후 K-RAS 부위(세포막 내부)에 국재화한다.
도 20: 아폽토시스의 선 그래프. PEI-변형된 HSA 담체에 접합된 항-KRAS DARPin K27을 SU8686 세포에 내재화하고 연속 Incucyte 시스템을 사용하는 아넥신 V를 사용하여 아폽토시스 상태를 평가하였다. 8개의 PEI 분자로 변형된 담체(담체-I)에 접합된 DARPin에 노출된 세포는 높은 수준의 아폽토시스를 나타낸 반면, 3.5개의 PEI 분자를 갖는 담체(담체 II)에 접합된 DARPin에 노출된 세포는 또한 명확한 아폽토시스를 나타내지만 더 낮은 정도이다. 미처리 세포, 비변형 DARPin에 노출된 세포 및 8개의 PEI를 갖는 HSA 담체에 노출된 세포는 모두 기준선 아폽토시스를 나타낸다.
도 21a 및 도 21b: 핵에서 GFP를 구성적으로 발현하는 HeLa 세포의 (21a) 증식 및 (21b) 아폽토시스에 대한 PEI-변형된 HSA 담체에 접합된 항-KRAS DARPin K27의 효과를 나타낸 선 그래프. 양성 대조군으로서 pan-RAS 저해제를 사용하였고, 음성 대조군으로서 처리제를 사용하지 않았다. 세포를 또한 비변형 DARPin K27, PEI-변형된 HSA 담체 단독, 비변형 HSA 담체에 접합된 DARPin K27 및 PEI-변형된 HSA 담체에 접합된 항-비멘틴 VHH(관련 없는 VHH)로 처리하였다.
도 22: 핵에서 GFP를 구성적으로 발현하는 HeLa 세포의 아폽토시스에 대한 PEI-변형된 HSA 담체에 접합된 항-KRAS DARPin K27의 효과를 나타낸 현미경 사진.
도 23: 반응에서 일정한 몰 과량의 PEI를 사용하고 카르보디이미드 커플링제인 EDC의 수준을 조정함으로써 변형 수준을 제어하는 다양한 수준의 PEI(600 Da)로 변형된 HSA의 질량 분석법(MALDI-ToF) 스펙트럼. HSA에 대한 PEI 분자의 평균 수준은 검정색으로 제공된다.
도 24: 다양한 수준의 PEI 변형을 갖는 HSA 담체에 접합된 VHH의 인큐베이션 48시간 후 A375 세포 내부의 항-비멘틴 VHH의 공초점 현미경 영상. HSA 담체에 대한 PEI 분자의 평균 수를 각각의 박스에 표시한다. 세포내 VHH는 항-VHH 항체를 사용하여 시각화된다.
도 25a 내지 도 25d: (25a 및 25b) (25a) PEI 변형된 담체를 함유하는 작용제 및 (25b) 담체 없이 PEI 변형된 VHH를 함유하는 작용제에 대한 시간 경과에 따른 작용제 농도의 선 그래프. (25c) 담체 혈장 노출의 막대 그래프. (25d) 소변에서 담체 수준의 박스 플롯.
도 26: 10 mg/Kg(VHH 중량 기준)의 유리 VHH, 및 두 가지 수준(3.5개 및 8개의 분자)에서 PEI 변형이 있거나 변형이 없는 담체에 접합된 VHH를 주사한 후 5분 후 마우스 혈장 내 VHH(진한 회색 및 박스) 및 VHH-담체(밝은 회색) 수준의 막대 그래프.
도 27: HSA-특이적 ELISA에 의해 측정된 주사 후 24시간에서의 HSA 혈장 수준의 막대 그래프.
도 28: 주사 24시간 후, 10 mg/Kg의 비변형 VHH, 또는 PEI가 없는, 3.5개 분자의 PEI 및 8개 분자의 PEI를 갖는 담체에 접합된 VHH로 처리된 마우스의 간의 VHH 수준의 막대 그래프. VHH 수준을 ELISA로 정량화하였다.
도 29: 비변형 VHH(VHH), 비변형 HSA에 접합된 VHH(VHH-담체), PEI(×3.5)-변형된 HSA에 접합된 VHH(VHH-담체 3PEI) 및 PEI (×8)-변형된 HSA에 접합된 VHH(VHH-담체 8PEI)의 면역형광 분석의 현미경 사진. 토끼 항-VHH 항체에 이어서 형광 항-토끼 항체를 사용하여 염색을 수행하였다.
도 30: ELISA에 의해 측정된, 마우스의 혈장, 인간 및 원숭이의 혈청 내 VHH-HSA 접합체의 상대적 안정성의 막대 그래프. 글루타티온 처리를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 31: HSA-특이적 ELISA로 분석한 비변형 HSA에 접합된 VHH, 및 HSA-PEI×3.5 및 HSA-PEI×8에 접합된 VHH로 주사된 동물의 기관 내 HSA 수준의 막대 그래프.
도 32a 내지 도 32c: 항-HSA-FITC 항체로 염색된, (32a) 비변형 VHH, (32b)비변형 HSA에 접합된 VHH 및 (32c) HSA-PEI×8에 접합된 VHH가 주사된 마우스로부터의 비장의 동결절편 현미경 사진.
도 33: 2개의 상이한 페이로드-담체 접합체 설계의 도식적 표현. 접합체 A와 B는 이황화 결합 위치가 상이하다. PEG는 개략적으로 표현되며 도시된 것보다 길 수 있다.
도 34: PBS, 및 마우스 및 인간 혈장에서 이황화 결합을 사용하여 HSA의 Cys34에 연결된 HSA-PEG-비오틴 접합체의 안정성의 막대 그래프.
도 35: 세포질-유사 조건(10 mM GSH) 하에서 이황화 결합을 통해 HSA의 Cys34에 연결된 HSA-PEG-비오틴 접합체의 안정성의 막대 그래프.
도 36: 본 발명의 예시적인 단백질 접합체의 합성을 위해 활용된 예시적인 접합 전략의 도식적 표현.
도 37a 내지 도 37f: 마우스 혈장, 인간 혈장 및 PBS에서 세포질-유사 조건(10 mM GSH) 하에서 (37a) HSA-PEG4-dm-S-S-VHH, (37c) HSA-S-S-α-메틸-PEG11-트리아졸-PEG4-VHH(S2), (37d) VHH-GGGGSGGGGSGGGGLC(서열번호 4)-S-S-HSA의 안정성의 막대 그래프, (37e) VHH-GGGGSGGGGSGGGLGC(서열번호 5)-S-S-HSA 및 (37f) VHH-GGGGSGGGGSGGGGLC(서열번호 4)-S-S-HSA, VHH-GGGGSGGGGSGGGLGC(서열번호 5)-S-S-HSA와 비가역적 링커 작제물 HSA-PEG11-VHH의 비교. (37b) 마우스 혈장에서 비가역적 링커 작제물인 HSA-PEG11-VHH와 비교한 HSA-PEG4-dm-S-S-VHH의 안정성의 막대 그래프.
도 38a 내지 도 38c. PK 결과: (38a) 2세대 링커(C1 및 C2); (38b) 3세대 링커(S1, S2, S3A-B). S-S 결합이 VHH의 C 말단 시스테인에 있는 VHH αE7-S-S-dm-PEG4-NH-HSA(S1)를 제외하고 모든 가역적인 접합체에서 S-S 결합은 HSA C34 시스테인 상에 존재한다. Balb-c 마우스에 시험된 접합체 60 nmol/Kg을 주사하였다. 혈장 샘플을 주사 후 0.08/0.5/2/6/24/48/72/96시간에 수집하였다. 혈장 내 시험된 접합체의 양을 2면 ELISA(항 VHH/항 HSA)에 의해 결정하였다. (38c) 2면 ELISA 대 HSA ELISA에 의해서 결정된 S3A의 PK. 모든 접합체의 PK를 두 ELISA 방법으로 결정하였고 동일한 결과를 제공하였다(데이터 나타내지 않음).
도 39: 세포질-유사 조건(10 mM GSH) 및 인간 혈장에서 VHH αE7-(G4S)3-C-HSA(S3C) 대 VHH αE7-G4S-G4S-G4L-C-HSA(S3A)의 안정성의 막대 그래프.
도 40a 내지 도 40f. VHH-αE7과 24시간 인큐베이션 후 Hela-GFP 세포의 공초점 현미경 영상. VHH를 상이한 링커 전략을 사용하여 HSA 담체에 접합하였다. (40a) 처리 없음; (40b) S4-PEI×3.5; (40c) S2-PEI×3.5; (40d) S1-PEI×3.5 (40e) S3A-PEI×3.5 (40f) S3B-PEI×3.5. 항 VHH 면역형광 염색(적색). 핵 염색(녹색).
도 41: 세포질 유사 조건(10 mM GSH), 마우스 혈장 및 PBS 하에서 VHH 항 BRAF 1C5-Hel20-LC-HSA-PEI×3.5(S5C)의 안정성의 막대 그래프.
도 42a 내지 도 42d. A375 세포를 96개의 플레이트 웰에 24시간 동안 시딩하여 세포 부착을 허용하였다(1500개 세포/웰). BRAF 저해제인 PF-04880594를 10 μM로 첨가한 것을 제외하고는, 각각의 웰에 시험된 작용제의 샘플을 원하는 농도(42a 및 42b) 1 μM; (42c 및 42d) 3 μM로 첨가하였다. (42a, 42c) IncuCyte®에서 모니터링된, 아폽토시스 세포를 식별하는 일반적으로 사용되는 형광 염료인 아넥신 V 적색 시약으로부터 얻은 적색 영역. (42b, 42d) 적색 영역을 온전한 세포에 상응하는 CellTiter-Glo로 얻은 값으로 정규화하였다.
도 43a 내지 43l: 상이한 담체에 접합된 VHH 항-E7과 24시간 인큐베이션 후 A375 세포의 공초점 현미경 영상. (43a 및 43b) 처리 없음; (43c 및 43d) VHH-αE7-S-S-PEG4-C(O)-NH-HSA-PEI×3.5; (43e 및 43f) VHH-αE7-S-S-PEG4-C(O)-NH-Darpin-PEI×2.4; (43g 및 43h) VHH-αE7-S-S-PEG4-C(O)-NH-IgG-PEI×27; (43i 및 43j) VHH-αE7-S-S-PEG4-C(O)-NH-피브리노겐-PEI×90; (43k 및 43l) VHH-αE7-S-S-PEG4-C(O)-NH-GFP-PEI×1.6. 항-VHH 항체를 사용한 VHH에 대한 면역형광 염색 - 적색; 핵 염색 - 청색.
도 44a 내지 44f. 상이한 PEI 변형된 담체와 24시간 인큐베이션 후 A375 세포의 공초점 현미경 영상. (44a) 처리 없음; (44b) HSA-PEI×4.5; (44c) K-27 DARPin-PEI×2.4; (44d) IgG-PEI×27, (44e) 피브리노겐-PEI×90, (44f) GFP-PEI×1.6. 항-HSA-PEI 항체를 사용한 면역형광 염색 - 녹색; 핵 염색 - 청색.
도 45a 및 도 45b. Hela-GFP 세포를 96개의 플레이트 웰에 24시간 동안 시딩하여 부착된 세포를 1500개 세포/웰로 생산하였다. 각각의 웰에 시험된 작용제의 샘플을 원하는 농도로 첨가한 후 아넥신 V 적색 시약을 첨가하여 아폽토시스 세포를 확인하였다. IncuCyte®에서 세포 아폽토시스를 모니터링하였다. 추가 대조군 샘플을 시험하였지만, 모두 처리가 없는 신호(세포 단독)와 동등한 동일한 신호를 제공하였기 때문에 표시되지 않았다. 추가 대조군 샘플은 1C5, 1C5-flex-pep-LC; 1C5-Hel20-LC이고, 모두 담체에 접합되지 않은 것이다. (45a) 시간 경과에 따른 세포 사멸의 선 그래프. (45b) 140시간의 최종 시점에 세포 생존력의 막대 그래프.
본 발명은, 일부 실시형태에서, 세포 침투성 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체; 페이로드; 및 공유 결합을 통해서 단백질 담체 및 페이로드에 결합된 링커를 포함하는 단백질 접합체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 단백질 담체는 긴 혈청 반감기를 갖는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 혈액에서 발견되는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 적어도 60 kDa의 분자량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 적어도 65 kDa의 분자량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 적어도 70 kDa의 분자량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 또는 70 kDa 미만의 분자량을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 최대 7의 등전점을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 인간 단백질이다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 알부민이다. 일부 실시형태에서, 알부민은 혈청 알부민이다. 일부 실시형태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
일부 실시형태에서, 단백질 담체는 하나 이상의 세포 침투성 모이어티에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 단일 세포 침투성 모이어티에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 복수의 세포 침투성 모이어티에 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, 세포 침투성 모이어티는 세포-내재화 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 침투성 모이어티는 본 발명의 단백질 접합체를 세포 내로 내재화시키도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 세포 침투성 모이어티는 본 발명의 단백질 접합체의 세포 내재화를 유도 또는 향상시키도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 세포 침투성 모이어티는 대조군(예를 들어, 세포 침투성 모이어티가 없는 단백질 접합체)에 비해서, 본 발명의 단백질 접합체의 세포 침투 또는 내재화를 향상시키도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 향상은 대조군에 비해서 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 1000%, 적어도 10000%, 적어도 100000%(이들 사이의 임의의 범위 포함)만큼이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 세포 침투성 모이어티는 알킬 아민, 양이온성 중합체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 침투성 모이어티는 양이온성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 침투성 모이어티는 알킬 아민을 포함한다.
일부 실시형태에서, 양이온성 중합체는 복수의 아민 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 중합체는 1차 아민 기, 2차 아민 기, 3차 아민 기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 중합체는 양이온성 중합체의 아민 기의 pKa 값보다 낮은 pH 값을 갖는 용액 내에서 이온화(양성 이온화)를 겪을 수 있다. 일부 실시형태에서, 양이온성 중합체는 양이온성 중합체의 아민 기의 pKa 값보다 낮은 pH 값을 갖는 용액 내에서 양성자화를 겪을 수 있다.
일부 실시형태에서, 양이온성 중합체 중 적어도 50 중량%는 양이온성 중합체의 아민 기의 pKa 값보다 낮은 pH 값을 갖는 용액 내에서 양으로 하전(또는 양성자화)된다. 일부 실시형태에서, 양이온성 중합체는 용액 내에서 양성자화를 겪어서, 복수의 양성 표면 전하를 생성하며, 여기서 용액은 본원에 기재된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 양이온성 중합체는 폴리아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리아민은 1차 아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리아민은 2차 아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리아민은 3차 아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리아민은 1차, 2차 및 3차 아민을 포함한다. 폴리아민은 당업계에 널리 알려져 있고, 예를 들자면 예를 들어, 폴리에틸렌이민 및 폴리프로파일렌이민을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, PEI는 선형 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEI는 분지형 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEI(예를 들어, 분지형 또는 선형 PEI)는 5000 Da 미만, 4000 Da 미만, 3000 Da 미만, 2000 Da 미만, 1500 Da 미만, 1000 Da 미만, 800 Da 미만(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 수평균 분자량(Mn)을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 세포 침투성 모이어티는 100 내지 2000 Da, 200 내지 5000 Da, 200 내지 3000 Da, 500 내지 5000 Da, 500 내지 2000 Da, 500 내지 3000 Da, 100 내지 300 Da, 300 내지 400 Da, 400 내지 500 Da, 500 내지 600 Da, 600 내지 700 Da, 700 내지 1000Da(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 MW(예를 들어, 평균 분자량)를 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, PEI는 100 내지 2000 Da, 200 내지 5000 Da, 200 내지 3000 Da, 500 내지 5000 Da, 500 내지 2000 Da, 500 내지 3000 Da, 100 내지 300 Da, 300 내지 400 Da, 400 내지 500 Da, 500 내지 600 Da, 600 내지 700 Da, 700 내지 1000Da(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 Mn을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 세포 침투성 모이어티는 500 내지 700 Da, 또는 500 내지 2000 Da의 Mn을 특징으로 하는 분지형 PEI를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 담체는 이에 공유 결합된 복수의 세포 침투성 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 침투성 모이어티는 2 내지 100, 3 내지 100, 3 내지 90, 4 내지 100, 4 내지 90, 4 내지 10, 4 내지 40, 4 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 40, 40 내지 60, 60 내지 100, 6 내지 100, 6 내지 20, 6 내지 40, 6 내지 50, 4 내지 15, 3 내지 15, 3 내지 10, 3 내지 8, 4 내지 8, 6 내지 10(이들 사이의 임의의 범위 포함)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 담체는 이에 공유 결합된 복수의 PEI 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 이에 공유 결합된 3 내지 10개의 PEI 분자, 3 내지 5개의 PEI 분자, 5 내지 8개의 PEI 분자, 8 내지 10개의 PEI 분자, 10 내지 15개의 PEI 분자, 15 내지 20개의 PEI 분자(이들 사이의 임의의 범위 포함)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 담체는 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80 KDa의 크기를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 적어도 50 KDa의 크기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 적어도 60 KDa의 크기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 적어도 65 KDa의 크기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 담체는 혈액 내인성 단백질이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 혈액에서 자연적으로 발견된다. 일부 실시형태에서, 혈액은 혈장이다. 일부 실시형태에서, 혈액은 포유동물 혈액이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 혈액 내인성 단백질은 알부민이다. 일부 실시형태에서, 혈액 내인성 단백질은 글로불린이다. 일부 실시형태에서, 혈액 내인성 단백질은 피브리노겐이다. 일부 실시형태에서, 글로불린은 면역글로불린(Ig)이다. 일부 실시형태에서, Ig는 IgG이다. 일부 실시형태에서, Ig는 IgA이다. 일부 실시형태에서, Ig는 IgM이다. 일부 실시형태에서, 혈액 내인성 단백질은 HSA, 피브리노겐, 및 IgG로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 혈액 내인성 단백질은 응고성 단백질이다. 혈액 내인성 단백질은 당업계에 널리 알려져 있고, 몇 개만 예를 들면, 예를 들어, 프리알부민(트랜스티레틴), 알파 1 항트립신, 알파-1-산 당단백질, 알파-1-태아단백질, 알파2-마크로글로불린, 감마 글로불린, 베타-2 마이크로글로불린, 합토글로빈, 세룰로플라스민, 보체 성분 3, 보체 성분 4, C-반응성 단백질(CRP), 지질단백질(킬로미크론, VLDL, LDL, HDL), 트랜스페린, 프로트롬빈 및 말토스 결합 단백질(MBP) 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, IgG, 형광 단백질(GFP) 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 형광 단백질은 녹색(GFP), 적색(RFP), 청색(BFP) 및 황색(YFP)으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 형광 단백질은 GFP이다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 HSA이다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 피브리노겐이다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 IgG이다.
일부 실시형태에서, 단백질 담체는 HSA이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체는 PEI 변형된 HSA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 링커를 통해서 단백질 담체에 결합된 페이로드를 포함하며, 여기서 링커는 본원에 기재된 바와 같고, 단백질 담체는 3 내지 20, 3.5 내지 20, 3 내지 10, 3.5 내지 10, 3 내지 8, 3.5 내지 8, 3 내지 5, 5 내지 8, 8 내지 10, 10 내지 15, 3 내지 10, 3 내지 15, 4 내지 20, 4 내지 10, 3.5 내지 6, 3.5 내지 15, 3.5 내지 8, 3.5 내지 12, 3 내지 12, 3 내지 17, 3.5 내지 17, 3.5 내지 15, 4 내지 8, 6 내지 10개의 PEI 분자(이들 사이의 임의의 범위 포함)에 공유 결합된(또는 이에 의해서 변형된) HSA이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 PEI 분자의 수는 평균 값을 나타낸다. 일부 실시형태에서, PEI 분자는 100 내지 2000 Da, 200 내지 5000 Da, 200 내지 3000 Da, 500 내지 5000 Da, 500 내지 2000 Da, 500 내지 3000 Da, 100 내지 300 Da, 300 내지 400 Da, 400 내지 500 Da, 500 내지 600 Da, 600 내지 700 Da, 700 내지 1000Da(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 평균 MW를 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 접합체는 페이로드를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "페이로드"는 표적 세포의 세포질로 전달될 임의의 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적과 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적을 조절한다. 일부 실시형태에서, 세포내는 세포질이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는, 절단되는 경우 세포내 표적과 상호작용을 감소시키는 이황화 결합이 없다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 이황화 결합이 없다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 분자이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 생물학적 페이로드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 생물학적 분자이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 유기물이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 치료적 분자이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 검출 가능한 분자이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 표적에 결합할 수 있는 분자이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 생물학적 제제이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 약물이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 또는 단백질은 단리된 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 또는 단백질은 펩티드 또는 단백질 모이어티이다. 단백질은 완전한 단백질일 필요는 없지만 단백질의 부분 또는 단편일 수 있음이 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 단일 아미노산 사슬이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 복수의 아미노산 사슬이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 생물활성 분자이다. 일부 실시형태에서, 생물활성 분자는 생물활성제이다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 DNA이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 RNA이다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 아답터이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 프라이머이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 조절성 RNA이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 플라스미드이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 발현 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 표적 세포에서 발현하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 유전자 요법이다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 일부 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임은 치료적 단백질을 암호화한다. 핵산 분자를 화학 및 아미노산 링커를 접합하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있고 임의의 이러한 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 핵 국재화 신호(NLS)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 단백질 및 핵산 분자로부터 선택된다.
용어 "핵산"은 당업계에 널리 알려져 있다. 본원에서 사용되는 "핵산"은 일반적으로 핵염기를 포함하는, DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 유사체의 분자(즉, 가닥)를 지칭할 것이다. 핵염기는 예를 들어, DNA에서 발견되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 염기(예를 들어, 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 시토신 "C") 또는 RNA(예를 들어, A, G, 우라실 "U" 또는 C)를 포함한다.
용어 "핵산 분자"는 단일-가닥 RNA(ssRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 단일-가닥 DNA(ssDNA), 이중-가닥 DNA(dsDNA), 작은 RNA, 예컨대, miRNA, siRNA 및 다른 짧은 간섭 핵산, snoRNAs, snRNAs, tRNA, piRNA, tnRNA, 작은 rRNA, hnRNA, lncRNA, 순환 핵산, 게놈 DNA 또는 RNA의 단편, 절단된 핵산, 리보자임, 바이러스 RNA 또는 DNA, 감염 기원의 핵산, 증폭 산물, 변형된 핵산, 플라스미드 또는 세포소기관 핵산 및 인공 핵산, 예컨대, 올리고뉴클레오티드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 짧은(예를 들어, 100개 이하의 염기), 화학적으로 합성된 단일-가닥 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 예컨대, 결찰 반응에 의해서 핵산 분자의 5' 또는 3' 단부에 부착된다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 유전자 산물의 전사 및/또는 번역을 포함하는 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 따라서, 핵산 분자의 발현은 핵산 단편의 전사(예를 들어, mRNA 또는 다른 기능성 RNA를 초래하는 전사) 및/또는 RNA의 전구체 또는 성숙 단백질(폴리펩티드)로의 번역을 지칭할 수 있다.
세포 내에서 유전자를 발현시키는 것은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 본원에서 이의 전달은 본 발명의 방법에 의해 또는 본 발명의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내에 있다. 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 폭스바이러스 벡터일 수 있다. 프로모터는 포유동물 세포에서 활성일 수 있다. 프로모터는 바이러스 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 또는 오픈 리딩 프레임은 프로모터 또는 다른 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 본 발명의 방법에 의해서 벡터가 숙주 세포 내에 도입될 때 숙주 세포에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 요소 또는 요소들에 연결됨을 의미하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 조절 요소 또는 프로모터는 표적 세포에서 활성이다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제 즉, RNA 폴리머라제 II에 대한 개시 부위 주위에 클러스터링된 전사 제어 모듈 그룹을 지칭한다. 프로모터는 별개의 기능성 모듈로 구성되며, 각각은 대략 7 내지 -20 bp의 DNA로 이루어지고, 전사 활성인자 또는 저해인자 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 함유한다.
일부 실시형태에서, 핵산 서열은 RNA 폴리머라제 II(RNAP II 및 Pol II)에 의해 전사된다. RNAP II는 진핵생물 세포에서 발견되는 효소이다. 이는 DNA의 전사를 촉매화하여 mRNA의 전구체 및 대부분의 snRNA 및 microRNA를 합성한다.
일부 실시형태에서, 포유동물 발현 벡터는 Invitrogen으로부터 입수 가능한 pcDNA3, pcDNA3.1(±), pGL3, pZeoSV2(±), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, Promega로부터 입수 가능한 pCI, Strategene으로부터 입수 가능한 pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV, Clontech로부터 입수 가능한 pTRES, 및 이들의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 레트로바이러스와 같은 진핵생물 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터가 본 발명에 의해 사용된다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소 유두종 바이러스로부터 유래된 벡터는 pBV-1MTHA를 포함하고, 엡스타인 바(Epstein Bar) 바이러스로부터 유래된 벡터는 pHEBO, 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵생물 세포에서 발현에 효과적인 것으로 제시된 다른 프로모터의 지시 하에 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 측면 감염 및 표적화 특이성과 같은 이점을 제공하는 재조합 바이러스 벡터가 생체내 발현을 위해 사용된다. 일 실시형태에서, 측면 감염은 예를 들어, 레트로바이러스의 수명 주기에 내재되어 있고 단일 감염된 세포가 갈라져 나와 이웃 세포를 감염시키는 많은 자손 비리온을 생산하는 과정이다. 일 실시형태에서, 결과는 넓은 면적이 빠르게 감염되고, 대부분이 원래 바이러스 입자에 의해 초기에 감염되지 않았다는 것이다. 일 실시형태에서, 측면으로 번질 수 없는 바이러스 벡터가 생산된다. 일 실시형태에서, 이러한 특성은 원하는 목적이 명시된 유전자를 국재화된 수의 표적화된 세포에만 도입하는 것인 경우 유용할 수 있다.
용어 "생물활성"은 세포 또는 조직에 효과를 발휘하는 분자 또는 작용제를 지칭한다. 생물활성제의 유형의 대표적인 예는 치료제, 비타민, 전해질, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 탄수화물, 지질, 다당류, 핵산, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 당단백질, 지질단백질, 당지질, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 성장 인자, 분화 인자, 호르몬, 신경전달물질, 프로스타글란딘, 면역글로불린, 사이토카인 및 항원을 포함한다. 이들 분자의 다양한 조합이 사용될 수 있다. 사이토카인의 예는 대식세포 유래 케모카인, 대식세포 염증성 단백질, 인터루킨, 종양 괴사 인자를 포함한다. 단백질의 예는 섬유질 단백질(예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴) 및 접착 단백질(예를 들어, 액틴, 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 카드헤린, 셀렉틴, 세포내 접착 분자 및 인테그린)을 포함한다. 다양한 경우에, 생물활성제는 피브로넥틴, 라미닌, 트롬보스폰딘, 테나신 C, 렙틴, 백혈병 저해 인자, RGD 펩티드, 항-TNF, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 트롬보스폰딘, 골형성 단백질-1, 골 형성 단백질, 오스테오넥틴, 소마토메딘-유사 펩티드, 오스테오칼신, 인터페론 및 인터루킨으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물활성제는 성장 인자, 분화 인자 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "단리된 펩티드"는 탄수화물, 지질 또는 자연에서 펩티드와 회합되는 다른 단백질성 불순물과 같은 오염 세포 성분이 본질적으로 없는 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단리된 펩티드의 제제는 고도로 정제된 형태, 즉, 적어도 약 80% 순수, 적어도 약 90% 순수, 적어도 약 95% 순수, 95% 초과 순수, 또는 99% 초과 순수한 펩티드를 함유한다.
본원에서 사용되는, "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하도록 상호교환 가능하게 사용된다. 다른 실시형태에서, 본원에서 사용되는 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 자연적 펩티드, 펩티도미메틱(전형적으로 비(non)펩티드 결합 또는 다른 합성 변형을 포함) 및 펩티드 유사체 펩토이드 및 세미펩토이드 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 기재된 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 그들을 체내에 있는 동안 더 안정하게 하거나 세포 내로 더 잘 침투할 수 있도록 하는 변형을 갖는다. 일 실시형태에서, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 세포질 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포질 표적에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 특이적은 임의의 다른 표적에 유의하게 결합하지 않는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 결합 분자이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 이의 표적에 혼성화한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 이의 표적에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 표적에 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 항체의 구조는 잘 알려져 있고, 당업자는 단지 이의 CDR 서열만으로 항체가 무슨 표적에 결합하는지 알 수 없지만, 항체의 일반적인 구조 및 이의 항원 결합 영역은 당업자에 의해 인식될 수 있다.
본원에서 사용된 "항체"라는 용어는, 내부 표면 형태를 갖는 3-차원 결합 공간과, 항원의 항원 결정기의 특징부에 상보적인 전하 분포를 갖는 폴리펩티드 사슬의 폴딩으로부터 형성된 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 그룹을 말한다. 항체는 전형적으로 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하는 사량체성 형태를 가지며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" 및 하나의 "중쇄"를 갖는다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 항체는 올리고클로날, 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 낙타화, CDR-이식, 다중특이적, 이중특이적, 촉매적, 인간화, 완전 인간, 항-개체특이형(anti-idiotypic) 항체 및 가용성 또는 결합된 형태로 표지될 수 있는 항체뿐만 단독으로 또는 다른 아미노산 서열과 조합하여, 에피토프-결합 단편을 포함하는 항체의 단편, 변이체 또는 유도체일 수 있다. 항체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 용어 항체는 또한 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 단일 가닥 항체(svFC), 이량체성 가변 영역(디아바디(Diabody)) 및 디설파이드-결합 가변 영역(dsFv)을 포함하나 이에 제한되지 않는 결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성 단편, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 항체 단편은 Fc 영역 또는 이의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 또 다른 면역글로불린 도메인에 융합될 수 있거나 또는 융합될 수 없다. 당업자는 scFv- Fc 융합, 가변 영역(예를 들어, VL 및 VH)~ Fc 융합 및 scFv-scFv-Fc 융합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 융합 생성물이 생성될 수 있음을 추가로 이해할 것이다.
면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 단일 쇄 항체(ScFv)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 낙타과 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 상어 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 VHH이다. 일부 실시형태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 중쇄 단독 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 항체 모방이다. 일부 실시형태에서, 결합 분자 또는 항체 모방체는 DARPin이다. CDR이 존재하는 항체와 상관없이, 항체 단편, ScFv, 나노바디, VHH, 단일 도메인 항체, DARPin 등은 이들의 비-가변 영역에 의해 구조적으로 인식될 수 있다. 따라서, 특정 표적에 제한되지 않고, 본 발명의 조성물은 페이로드로서 이들 분자를 포함하는 것으로 알려져 있을 수 있다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 C-말단 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 페이로드의 C-말단에 근접한 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 근접한은 말단의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산 이내이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 C-말단 태그이다. 일부 실시형태에서, 태그는 시스테인 아미노산에 대해 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 태그는 시스테인 아미노산에 대해 N-말단이다. 일부 실시형태에서, 태그와 시스테인 아미노산은 인접하다. 일부 실시형태에서, 시스테인 아미노산은 태그 내에 있다. 일부 실시형태에서, 태그는 GGGGSC(서열번호 9)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 C-말단 서열번호 9를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 링커를 통해서 단백질 담체에 결합된 페이로드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 융합 단백질이 아니다. 당업자는 페이로드와 담체가 별도의 링커에 의해서 서로 접합된다는 것을 이해할 것이다. 링커는 담체의 일부가 아니고, 또한 페이로드의 일부가 아니지만 오히려 서로에 부착되어(접합되어) 이들을 연결한다.
일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 링커를 통해서 단백질 담체에 결합된 페이로드를 포함하고, 여기서 링커는 본원에 기재되어 있고, 단백질 담체는(예를 들어, HSA)이고, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 8.5, 적어도 9, 적어도 9.5, 적어도 10, 적어도 12 mV, 또는 8 내지 40, 8.5 내지 40, 8 내지 20, 8.5 내지 20, 10 내지 40, 10 내지 20, 10 내지 30 mV(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 양의 제타 전위 값을 특징으로 하는 단백질 담체를 얻기에 충분한 복수의 PEI 분자에 공유 결합된다. 당업자는 접합체의 실제 제타 전위 값은 단백질 담체, 페이로드 또는 둘 다의 MW 및/또는 크기에 따라서 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 및 세포 침투성 모이어티는 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 8.5, 적어도 9, 적어도 9.5, 적어도 10, 적어도 12 mV 또는 8 내지 40, 8.5 내지 40, 8 내지 20, 8.5 내지 20, 10 내지 40, 10 내지 20, 10 내지 30 mV(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 양의 제타 전위 값을 특징으로 한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 접합체는 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 8.5, 적어도 9, 적어도 9.5, 적어도 10, 적어도 12 mV, 또는 8 내지 40, 8.5 내지 40, 8 내지 20, 8.5 내지 20, 10 내지 40, 10 내지 20, 10 내지 30 mV(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 양의 제타 전위 값을 특징으로 한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
제타 전위는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해서 측정될 수 있다. 본원에서는 다음 프로토콜이 사용되며 분자가 본원에 언급된 범위의 제타 전위를 포함하는지 결정하기 위한 표준으로 간주될 수 있다. Zeta Sizer Ultra(Malvern Instruments)를 사용하여 제타 전위 측정을 수행하였다. 샘플의 완충액을 1 mg/mL 단백질 농도로 1 mM NaCl로 교환하였다. 각각의 샘플로부터의 20 μL를 제타 셀(DTS1070)에 로딩하고, 각각의 샘플에 대해 5회 반복하여 측정하고 각각의 반복에 대해 mV 단위의 평균 제타 전위를 얻었다. 5개 측정의 평균을 표준편차와 함께 보고한다. 측정은 다음 조건에서 수행되었다: 온도 25℃; 각각의 반복에 대한 실행 수 10 내지 40; 평형 시간: 60초, 하위 실행 후 일시 중지 없음; 반복 사이에 60초 중지; 전압은 자동으로 선택되었으며 데이터 처리에는 단일 모드 분석 방법이 사용되었다. 일부 실시형태에서, 제타 전위는 약 1 mM 염에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 염은 NaCl이다. 일부 실시형태에서, 제타 전위는 약 1 mg/mL의 단백질 농도에서 측정된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 링커를 통해서 페이로드에 공유 결합된 단백질 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 링커에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 담체는 링커에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 공유 결합은 펩티드 결합이 아니다. 일부 실시형태에서, 링커와 페이로드 사이의 결합 및 링커와 담체 사이의 결합 중 적어도 하나는 펩티드 결합이 아니다. 일부 실시형태에서, 담체, 링커 및 페이로드는 단일 아미노산 사슬에 포함되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 링커를 통해서 페이로드에 공유 결합된 단백질 담체를 포함하며, 여기서 링커는 적어도 하나의 절단 가능한 결합을 포함하는 합성 링커이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 링커를 통해서 페이로드에 공유 결합된 단백질 담체를 포함하며, 여기서 링커는 절단 가능한 결합이 없는 합성 링커이다. 일부 실시형태에서, 담체 및 페이로드는 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다. 일부 실시형태에서, 링커 및 담체는 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다. 일부 실시형태에서, 링커는 펩티드 링커이고, 담체가 기반이 되는 단백질의 아미노산 서열에 존재하지 않는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 펩티드 링커이고, 페이로드가 기반이 되는 단백질의 아미노산 서열에 존재하지 않는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 및 페이로드는 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 자연 발생 분자가 아니다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 인공적이다. 일부 실시형태에서, 링커는 자연 발생이 아니다. 일부 실시형태에서, 링커는 인공적이다. 일부 실시형태에서, 담체는 자연 발생 단백질 또는 이의 단편이다.
일부 실시형태에서, 링커는 단백질 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 아미노산 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 강성 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 가요성 링커이다. 일부 실시형태에서, 강성 링커는 알파-나선형 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 링커는 C-말단 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 링커의 C-말단에 근접한 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 근접한은 말단의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산 이내이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단 시스테인을 포함하고, 페이로드는 C-말단 시스테인을 포함한다. 당업자는 시스테인의 측쇄가 절단 가능한 이황화 결합을 생성하는 데 사용될 수 있는 황 원자를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 시스테인은 HSA의 시스테인 34와 이황화 결합을 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 알파-나선형 펩티드는 AAASAEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSG(서열번호 6)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 알파-나선형 펩티드는 AAASAEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSGLC(서열번호 10)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 알파-나선형 펩티드는 AAASAEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSGL(서열번호 14)을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 가요성 링커는 GGGGS 링커이다. 일부 실시형태에서, 가요성 링커는 1내지 5개의 GGGGS 반복부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 1 내지 5개는 1 내지 3개이다. 일부 실시형태에서, 1 내지 5개는 1개이다. 일부 실시형태에서, 1 내지 5개는 2개이다. 일부 실시형태에서, 1 내지 5개는 3개이다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGLC(서열번호 4)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGLGC(서열번호 5)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGLG(서열번호 7)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSC(서열번호 8)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 12)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGGSC(서열번호 9)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGGS(서열번호 13)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGLGC(서열번호 11)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGLG(서열번호 15)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 서열번호 4 내지 15로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 생물학적 유체(예를 들어, 인간 혈액, 혈장 또는 혈청)에서 적어도 2, 적어도 10, 적어도 24, 적어도 48시간(이들 사이의 임의의 범위 포함) 동안 실질적으로 안정적이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 혈액 내에서 실질적으로 안정적이다. 일부 실시형태에서, 혈액은 인간 혈액이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 인간 혈액에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 36, 48 또는 72시간 동안 실질적으로 안정적이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 세포질 조건에 대한 노출 하에서 불안정적이다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한은 생물학적-절단 가능한이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 페이로드를 시토졸로 방출하도록, 세포질 조건에 대한 노출 하에서 절단 가능하다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커 및/또는 단백질 접합체는 세포질 조건 하에서 실질적으로 안정적이며, 여기서 실질적으로 안정적이라는 것은 본원에 기재된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 생물학적 절단 가능한 결합(예를 들어, 세포질 조건에 대한 단백질 접합체의 노출 하에서 절단 가능한 결합)이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 링커는 생물학적 절단 가능한 결합이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 링커는 생물학적 절단 가능하지 않은 결합(예를 들어, 아미드 결합, 클릭 반응 생성물, 티오에테르 결합 등)을 통해서 단백질 담체 및/또는 페이로드에 부착된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 생물학적 절단 가능한 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 담체 및/또는 페이로드는 생물학적 절단 가능한 결합을 통해서 링커에 결합된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 생물학적 절단 가능한 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 절단 가능한 결합은 생물학적 유체(예를 들어, 인간 혈액, 혈장 또는 혈청)에서 적어도 2시간, 적어도 10시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간(이들 사이의 임의의 범위 포함) 동안 실질적으로 안정적이다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한은 세포질에서 절단 가능하다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한은 혈청 또는 혈액에서 절단 가능하지 않다. 일부 실시형태에서, 절단 가능하지 않은은 실질적으로 절단 가능하지 않다. 일부 실시형태에서, 세포질에서 생물학적 절단 가능한은 혈액에서보다 세포질에서 상당히 더 절단된다.
일부 실시형태에서, 생물학적 절단 가능한 결합은 세포질 조건에 대한 노출 하에서 절단 가능하다. 일부 실시형태에서, 생물학적 절단 가능한 결합은 세포질 조건(예를 들어, 세포내 구획, 특히 산성 pH 조건 및/또는 글루타티온과 같은 환원제 포함)에 대한 노출 하에서 환원 가능하다.
생물학적 절단 가능한 결합은 당업계에 널리 알려져 있고, 세포에 유입 후 선택적으로 절단되는(세포내 절단) 결합을 지칭한다. 세포 내에서 약물의 방출을 위한 바람직한 연결부는 리소솜에서 발견되는 것과 같은 산성 조건에서 절단 가능하다. 일례는 이황화 결합이다. 이황화 결합은 글루타티온에 의해 세포에 유입될 때 절단되는 것으로 가정된다.
일부 실시형태에서, 생물학적 절단 가능한 결합은 이황화 결합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 절단 가능한 결합은 복수의 이황화 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 절단 가능한 결합은 입체 장애형이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 절단 가능한 결합은 입체 장애형 이황화 결합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 체액이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 혈액, 혈청, 혈장, 위액, 장액, 타액, 담즙, 종양액, 모유, 소변, 간질액, 뇌척수액 및 대변 중 적어도 하나로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 혈액이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 혈청이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 혈장이다.
일부 실시형태에서, 입체 장애형 이황화 결합은 이에 인접한 측기 또는 벌키(bulky) 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 측기 또는 벌키 모이어티는 이황화 결합의 적어도 하나의 황에 근접하게 위치된다. 일부 실시형태에서, 인접한 또는 근접한은 0 내지 10, 0 내지 2, 2 내지 5, 5 내지 10개의 원자 결합(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 거리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 사용되는 용어 "원자 결합"은 탄소-탄소(C-C) 결합 길이, 예를 들어, 단일 C-C 결합 길이를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 입체 장애형 이황화 결합은 이에 인접한 측기 또는 벌키 모이어티를 포함한다(예를 들어, 이황화 결합의 황 원자로부터 1 내지 15 Å, 1 내지 3 Å, 3 내지 5 Å, 5 내지 10 Å, 10 내지 15 Å 범위(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 거리에 위치함).
일부 실시형태에서, 측기 또는 벌키 모이어티는 알킬(예를 들어, 1차, 2차 또는 3차 C1-C10 알킬, 선택적으로 불포화 결합 및/또는 치환체 포함), 방향족 고리, 입체 장애형 측쇄를 포함하는 아미노산(예를 들어, 류신, 발린, 이소류신, 페닐알라닌, 히스티딘, 티로신 및 트립토판) 또는 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 측기 또는 벌키 모이어티는 이황화 결합에 인접한 메틸렌기에 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, 이황화 결합은 본 발명의 페이로드 및/또는 단백질 담체에 인접하게 위치되고, 여기서 인접한은 본원에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 페이로드 및/또는 단백질 담체는 이황화 결합을 통해서 링커에 결합된다. 일부 실시형태에서, 이황화 결합은 단백질 담체에 근접 또는 인접하다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 담체(예를 들어, HSA)는 이황화 결합을 통해서 링커에 결합된다. 일부 실시형태에서, HSA는 다음의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함한다: DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(서열번호 1). 서열번호 1은 신호 펩티드가 없는 HSA의 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, HSA는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩티드는 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR(서열번호 17)을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, HSA는 HSA의 단편이다. 일부 실시형태에서, 단편은 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%의 HSA를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 단편은 HSA로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개의 아미노산을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 순차적인 아미노산이다. 일부 실시형태에서, HSA는 HSA의 동족체이다. 일부 실시형태에서, HSA의 동족체는 서열번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, HSA는 서열번호 1과 적어도 70% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, HSA는 서열번호 1 또는 이의 단편 또는 동족체로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 상동성은 서열 동일성이다. 일부 실시형태에서, HSA는 서열번호 1과 적어도 70% 상동성인 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, HSA는 서열번호 1로 이루어진다. 일부 실시형태에서, HSA는 유리 시스테인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유리 시스테인은 시스테인 C34이다. 일부 실시형태에서, 유리 시스테인은 단지 단일의 유리 시스테인이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 이황화 결합을 통해서 HSA의 C34에 결합된다.
일부 실시형태에서, 피브리노겐은 피브리노겐 알파 사슬(FGA)이다. 일부 실시형태에서, FGA는 다음의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함한다: ADSGEGDFLAEGGGVRGPRVVERHQSACKDSDWPFCSDEDWNYKCPSGCRMKGLIDEVNQDFTNRINKLKNSLFEYQKNNKDSHSLTTNIMEILRGDFSSANNRDNTYNRVSEDLRSRIEVLKRKVIEKVQHIQLLQKNVRAQLVDMKRLEVDIDIKIRSCRGSCSRALAREVDLKDYEDQQKQLEQVIAKDLLPSRDRQHLPLIKMKPVPDLVPGNFKSQLQKVPPEWKALTDMPQMRMELERPGGNEITRGGSTSYGTGSETESPRNPSSAGSWNSGSSGPGSTGNRNPGSSGTGGTATWKPGSSGPGSTGSWNSGSSGTGSTGNQNPGSPRPGSTGTWNPGSSERGSAGHWTSESSVSGSTGQWHSESGSFRPDSPGSGNARPNNPDWGTFEEVSGNVSPGTRREYHTEKLVTSKGDKELRTGKEKVTSGSTTTTRRSCSKTVTKTVIGPDGHKEVTKEVVTSEDGSDCPEAMDLGTLSGIGTLDGFRHRHPDEAAFFDTASTGKTFPGFFSPMLGEFVSETESRGSESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRGKSSSYSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVRDCDDVLQTHPSGTQSGIFNIKLPGSSKIFSVYCDQETSLGGWLLIQQRMDGSLNFNRTWQDYKRGFGSLNDEGEGEFWLGNDYLHLLTQRGSVLRVELEDWAGNEAYAEYHFRVGSEAEGYALQVSSYEGTAGDALIEGSVEEGAEYTSHNNMQFSTFDRDADQWEENCAEVYGGGWWYNNCQAANLNGIYYPGGSYDPRNNSPYEIENGVVWVSFRGADYSLRAVRMKIRPLVTQ(서열번호 2). 서열번호 2는 신호 펩티드가 없는 피브리노겐의 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, 피브리노겐은 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩티드는 MFSMRIVCLVLSVVGTAWT(서열번호 3)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGA는 FGA의 단편이다. 일부 실시형태에서, 단편은 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%의 FGA를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 단편은 FGA로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 또는 850개의 아미노산을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 순차적인 아미노산이다. 일부 실시형태에서, FGA는 FGA의 동족체이다. 일부 실시형태에서, 상동성은 서열 동일성이다. 일부 실시형태에서, FGA의 동족체는 서열번호 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, FGA는 서열번호 2 또는 이의 단편 또는 동족체로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGA는 서열번호 2와 적어도 70% 상동성인 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGA는 서열번호 2로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 피브리노겐은 피브리노겐 베타 사슬(FGB)이다. 일부 실시형태에서, FGB는 다음의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함한다: QGVNDNEEGFFSARGHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYRARPAKAAATQKKVERKAPDAGGCLHADPDLGVLCPTGCQLQEALLQQERPIRNSVDELNNNVEAVSQTSSSSFQYMYLLKDLWQKRQKQVKDNENVVNEYSSELEKHQLYIDETVNSNIPTNLRVLRSILENLRSKIQKLESDVSAQMEYCRTPCTVSCNIPVVSGKECEEIIRKGGETSEMYLIQPDSSVKPYRVYCDMNTENGGWTVIQNRQDGSVDFGRKWDPYKQGFGNVATNTDGKNYCGLPGEYWLGNDKISQLTRMGPTELLIEMEDWKGDKVKAHYGGFTVQNEANKYQISVNKYRGTAGNALMDGASQLMGENRTMTIHNGMFFSTYDRDNDGWLTSDPRKQCSKEDGGGWWYNRCHAANPNGRYYWGGQYTWDMAKHGTDDGVVWMNWKGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQ(서열번호 19). 서열번호 19는 신호 펩티드가 없는 피브리노겐의 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, 피브리노겐은 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩티드는 MKRMVSWSFHKLKTMKHLLLLLLCVFLVKS(서열번호 18)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGB는 FGB의 단편이다. 일부 실시형태에서, 단편은 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%의 FGB를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 단편은 FGB로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 480개의 아미노산을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 순차적인 아미노산이다. 일부 실시형태에서, FGB는 FGB의 동족체이다. 일부 실시형태에서, 상동성은 서열 동일성이다. 일부 실시형태에서, FGB의 동족체는 서열번호 19와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, FGB는 서열번호 19 또는 이의 단편 또는 동족체로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGB는 서열번호 19와 적어도 70% 상동성인 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGB는 서열번호 19로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 피브리노겐은 피브리노겐 감마 사슬(FGG)이다. 일부 실시형태에서, FGG는 하기의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함한다: YVATRDNCCILDERFGSYCPTTCGIADFLSTYQTKVDKDLQSLEDILHQVENKTSEVKQLIKAIQLTYNPDESSKPNMIDAATLKSRKMLEEIMKYEASILTHDSSIRYLQEIYNSNNQKIVNLKEKVAQLEAQCQEPCKDTVQIHDITGKDCQDIANKGAKQSGLYFIKPLKANQQFLVYCEIDGSGNGWTVFQKRLDGSVDFKKNWIQYKEGFGHLSPTGTTEFWLGNEKIHLISTQSAIPYALRVELEDWNGRTSTADYAMFKVGPEADKYRLTYAYFAGGDAGDAFDGFDFGDDPSDKFFTSHNGMQFSTWDNDNDKFEGNCAEQDGSGWWMNKCHAGHLNGVYYQGGTYSKASTPNGYDNGIIWATWKTRWYSMKKTTMKIIPFNRLTIGEGQQHHLGGAKQVRPEHPAETEYDSLYPEDDL(서열번호 21). 서열번호 21은 신호 펩티드가 없는 피브리노겐의 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, 피브리노겐은 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩티드는 MSWSLHPRNLILYFYALLFLSSTCVA(서열번호 20)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGG는 FGG의 단편이다. 일부 실시형태에서, 단편은 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%의 FGG를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 단편은 FGG로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 480개의 아미노산을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 순차적인 아미노산이다. 일부 실시형태에서, FGG는 FGG의 동족체이다. 일부 실시형태에서, 상동성은 서열 동일성이다. 일부 실시형태에서, FGG의 동족체는 서열번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, FGG는 서열번호 21 또는 이의 단편 또는 동족체로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGG는 서열번호 21과 적어도 70% 상동성인 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, FGG는 서열번호 21로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 피브리노겐은 피브리노겐의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 FGA, FGB 및 FGG 중 적어도 둘의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 FGA, FGB 및 FGG 중 3개 모두의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, FGA, FGB 및 FGG는 인간 혈액에서 발견되는 바와 같은 비율이다. 일부 실시형태에서, 혈액은 혈장이다. 인간 혈장으로부터의 피브리노겐은 예컨대, Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 341578로부터 상업적으로 입수 가능하다. 일부 실시형태에서, 피브리노겐은 유리 시스테인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 피브리노겐은 유리 리신을 포함한다. 피브리노겐에 대한 접합은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해서 수행될 수 있다. 접합은 무작위로 또는 본원에 기재된 바와 같은 특이적 부위에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, IgG는 IgG의 Fc 부분이다. 일부 실시형태에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, IgG는 IgG1이다. 일부 실시형태에서, IgG는 포유동물 IgG이다. 일부 실시형태에서, IgG는 인간 IgG이다. 일부 실시형태에서, IgG는 마우스 IgG이다. 일부 실시형태에서, IgG는 IgG의 중쇄의 불변 영역이다. 일부 실시형태에서, IgG는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG는 단백질 복합체이다. 일부 실시형태에서, IgG는 폴리클로날이다. 일부 실시형태에서, IgG는 모노클로날이다. 일부 실시형태에서, IgG는 비-인간 종에 대해서 상승되는 IgG이다. 일부 실시형태에서, 종은 염소 또는 양이다. 일부 실시형태에서, IgG는 비-인간 종의 IgG의 중쇄에 대한 것이다. 상업적인 마우스 IgG는 구매할 수 있으며, 예컨대, Sigma-Aldrich의 항-염소/양 IgG 항체, 마우스 모노클로날(클론 GT-34)이다. 일부 실시형태에서, IgG는 유리 시스테인을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG는 유리 리신을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG는 C-말단 시스테인을 포함한다. IgG에 대한 접합은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해서 수행될 수 있다. 접합은 무작위로 또는 본원에 기재된 바와 같은 특이적 부위에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 선형 또는 분지형 사슬이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 하나 이상의 상기 사슬을 선택적으로 포함하는 골격이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 스페이서(예를 들어, 자연 및/또는 비자연 아미노산, 알킬, 아미드 결합, 에스테르 결합, 티오에스테르 결합, 우레아 결합, 이들의 임의의 유도체 또는 조합 포함)이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 생체적합성 중합체 또는 생체적합성 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체적합성 중합체는 적어도 부분적으로 생체분해성이다. 일부 실시형태에서, 생체적합성 중합체는 폴리글리콜 에테르, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리아미노산, 펩티드 및/또는 이들의 유도체 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리글리콜 에테르는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 100 내지 5000 Da(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 Mn을 특징으로 하는 PEG를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생체적합성 모이어티는 아미드, 에스테르, 글리콜, 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리아미노산 또는 이의 유도체는 2 내지 50개의 아미노산, 4 내지 50개, 5 내지 50개, 5 내지 50개, 4 내지 20개, 4 내지 30개, 4 내지 40개, 5 내지 20개, 5 내지 30개, 5 내지 40개, 6 내지 50개, 6 내지 30개, 6 내지 40개, 6 내지 20개, 8 내지 50개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 8 내지 40개(이들 사이의 임의의 범위 포함)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 천연 펩티드, 펩티드 유도체, 예컨대, 베타 펩티드, 펩티드모방체(전형적으로 비펩티드 결합 또는 다른 합성 변형 포함) 및 펩티드 유사체 펩토이드 및 세미펩토이드 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "유도체" 또는 "화학적 유도체"는 측쇄 또는 펩티드 내의 임의의 작용기 상에서의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드의 임의의 화학적 유도체를 포함한다. 이러한 유도체화된 분자에는 예를 들어, 하나 이상의 보호기(예를 들어, 측쇄 보호기(들) 및/또는 N-말단 보호기)를 보유하는 펩티드 및/또는 유리 아미노기가 유도체화되어 아민 히드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐기, 카르보벤족시기, t-부틸옥시카르보닐기, 아세틸기 또는 포르밀기를 형성한 펩티드를 포함한다. 유리 카르복실기는 유도체화되어 이의 아미드, 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 유형의 에스테르 또는 히드라지드를 형성할 수 있다. 유리 히드록기는 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 유도체화되어 N-im-벤질히스티딘을 형성할 수 있다. 또한 화학적 유도체에는 20개의 표준 아미노산 잔기 중 하나 이상의 자연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린 대신 치환될 수 있고; 5-히드록시리신이 리신 대신 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘이 히스티딘 대신 치환될 수 있고; 호모세린이 세린 대신 치환될 수 있고; Dab, Daa 및/또는 오르니틴(O)이 리신 대신 치환될 수 있다.
또한, 펩티드 유도체는 말단-NH2 아실화, 아세틸화 또는 티오글리콜산 아미드화를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 화학적 변형에 의해서 그리고 예를 들어, 암모니아, 메틸아민 등을 사용한 말단 및/또는 측쇄 카르복시 기의 아미드화에 의해서 본 발명의 펩티드의 자연 서열과 상이할 수 있다. 펩티드는 임의의 배위를 갖는 선형, 고리형 또는 분지형 등일 수 있으며, 이것은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 스페이서(예를 들어, 자연 및/또는 비자연 아미노산, 알킬, 아미드 결합, 에스테르 결합, 이황화 결합, 티오에스테르 결합, 우레아 결합, 이들의 임의의 유도체 또는 조합 포함)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 이황화 결합을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 클릭 반응 생성물(예를 들어, 공유 연결, 예컨대, 고리화 반응 생성물 및/또는 클릭 반응을 통해 형성된 석신이미드-티오에테르 모이어티)을 포함한다.
클릭 반응은 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 말레이미드와 티올의 마이클 첨가(석신이미드-티오에테르의 형성을 초래함); 아지드 알킨 고리첨가; 딜스-앨더(Diels-Alder) 반응(예를 들어 직접 및/또는 역전자 수요 딜스 앨더); 디벤질 사이클로옥틴 1,3-니트론(또는 아지드) 고리첨가; 알켄 테트라졸 광클릭 반응 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 하기 화학식 A로 표현되고:
, 상기 식에서, PC는 본 발명의 단백질 담체를 나타내고; BP는 본 발명의 생물학적 페이로드(즉, 페이로드)를 나타내고; 각각의 r 및 m은 독립적으로 0 내지 10(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; 각각의 R3은 독립적으로 치환체 또는 H를 나타내고; Het는 O, N, NH 및 S로부터 각각 독립적으로 선택된 헤테로원자를 나타내고; 각각의 A는 독립적으로 (i) 생체적합성 모이어티 또는 생체적합성 중합체; 및/또는 (ii) 하나 이상의 링커 - 각각의 링커는 독립적으로 헤테로원자(예를 들어, O, N, NH, 또는 S), 카르보닐 유도체(예를 들어, -C(O)NH-, -C(O)O-, -C(O)-, -C(O)S-, -C(NH)NH-, -C(NH)O-, -C(NH)S-), C1-C10 알킬, C1-C10 아미노알킬, C1-C10 알콕시, C1-C10 메르캅토알킬, 또는 클릭 반응 생성물(이들의 임의의 조합 포함) 중 임의의 것을 포함함 - 를 나타내거나, A는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 r 또는 m은 1 내지 10, 1 내지 3, 1 내지 5, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 10(이들 사이의 임의의 범위 포함)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 하기 화학식 B:
, 또는 하기 화학식 C로 표현되고:
상기 식에서, PC는 본 발명의 단백질 담체를 나타내고; BP는 본 발명의 생물학적 페이로드를 나타내고; 각각의 r 및 m은 독립적으로 0 내지 10(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; p는 0 내지 100(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; Pol은 생체적합성 모이어티 또는 생체적합성 중합체를 나타내고; 각각의 R3은 독립적으로 치환체 또는 H를 나타내고; Het는 O, N, NH 및 S로부터 각각 독립적으로 선택된 헤테로원자를 나타내고; 각각의 A는 독립적으로 하나 이상의 링커 - 각각의 링커는 독립적으로 헤테로원자(예를 들어, O, N, NH, 또는 S), 카르보닐 유도체(예를 들어, -C(O)NH-, -C(O)O-, -C(O)-, -C(O)S-, -C(NH)NH-, -C(NH)O-, -C(NH)S-), C1-C10 알킬, C1-C10 아미노알킬, C1-C10 알콕시, C1-C10 메르캅토알킬, 또는 클릭 반응 생성물(이들의 임의의 조합 포함) 중 임의의 것을 포함함 - 를 나타내거나, A는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 화학식 A 내지 화학식 C 중 어느 하나로 표현되며, 여기서 링커는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 5, 적어도 100, 적어도 300, 적어도 500, 5 내지 500, 5 내지 100, 10 내지 100, 5 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 500개의 원자 결합(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 p는 1 내지 100, 1 내지 20, 10 내지 100, 2 내지 20, 3 내지 20, 3 내지 15, 10 내지 20, 20 내지 50, 50 내지 100, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 15 또는 20(이들 사이의 임의의 범위 포함)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 하기 화학식 1로 표현되고:
, 상기 식에서, PC, BP 및 Pol은 본원에 기재된 바와 같고; 각각의 r 및 m은 독립적으로 0 내지 10(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; l은 독립적으로 1 내지 10(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; p는 2 내지 100(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; 각각의 R은 독립적으로 벌키 모이어티 또는 H를 나타내고; 각각의 A는 독립적으로 하나 이상의 링커 - 각각의 링커는 독립적으로 헤테로원자(예를 들어, O, N, NR3, 또는 S), 카르보닐 유도체(예를 들어, -C(O)NH-, -C(O)O-, -C(O)-, -C(O)S-, -C(NR3)NR3-, -C(NR3)O-, -C(NR3)S-), C1-C10 알킬, C1-C10 아미노알킬, C1-C10 알콕시, C1-C10 메르캅토알킬, 또는 클릭 반응 생성물(이들의 임의의 조합 포함) 중 임의의 것을 포함함 - 를 나타내거나, A는 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 하기 화학식으로 표현되고:
, 상기 식에서, PC, BP, Het, A, Pol 및 p는 본원에 기재된 바와 같고; 각각의 r, r', m 및 m'는 독립적으로 0 내지 10(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; 각각의 R3 및 R3'는 독립적으로 하나 이상의 벌키 모이어티, 하나 이상의 치환체, 또는 H를 나타내고; X1은 헤테로원자(예를 들어, O, N, NR3, 또는 S), 카르보닐 유도체(예를 들어, -C(O)NH-, -C(O)O-, -C(O)-, -C(O)S-, -C(NR3)NR3-, -C(NR3)O-, -C(NR3)S-), 또는 클릭 반응 생성물(이들의 임의의 조합 포함)을 나타내고, Het가 S인 경우, 적어도 하나의 X1은 S이다. 일부 실시형태에서, Het 및 X1 둘 다가 S인 경우, 적어도 하나의 R3은 하나 이상의 벌키 모이어티이고; m' 및 r' 중 적어도 하나는 0이 아니다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 하기 화학식으로 표현되고:
, 상기 식에서 PC, BP, Het, A, Pol, R3, r, m 및 p는 원자가에 의해 허용 가능한 바와 같이 본원에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, Het 및 X1 둘 다가 S인 경우, 적어도 하나의 R3은 하나 이상의 벌키 모이어티이고; m' 및 r' 중 적어도 하나는 0이 아니다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 하기 화학식 A로 표현되고:
, 상기 식에서, Het는 S 또는 NH를 포함하며, X는 카르보닐 유도체, 클릭 반응 생성물을 나타내거나 결합이고; Pep는 펩티드를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 BP의 C-말단에 결합된다. 일부 실시형태에서, Het는 S이고, 펩티드는 시스테인(예를 들어, C-말단 시스테인)을 통해 PC에 결합된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 하기 화학식 중 어느 하나로 표현되고:
,
상기 식에서, PC, BP 및 Pol은 본원에 기재된 바와 같고; 각각의 j, k, r, o, n 및 m은 독립적으로 0 내지 10(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; l은 독립적으로 1 내지 10(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; p는 2 내지 100(이들 사이의 임의의 범위 포함) 범위의 정수를 나타내고; 각각의 R은 독립적으로 벌키 모이어티 또는 H를 나타내고; 각각의 X는 독립적으로 헤테로원자(예를 들어, O, N, NH, 또는 S), 카르보닐 유도체(예를 들어, -C(O)NH-, -C(O)O-, -C(O)-, -C(O)S-, -C(NH)NH-, -C(NH)O-, -C(NH)S-), 스페이서(예를 들어, C1-C10 알킬, C1-C10 아미노알킬, C1-C10 알콕시, C1-C10 메르캅토알킬, 또는 클릭 반응 생성물) 또는 이들의 조합을 나타내거나, X는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 R은 메틸이다. 일부 실시형태에서, Pol은 펩티드, 아미노산 또는 이의 탈수 유도체, PEG, 또는 -CH2-CH2-O-를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 아미노산의 탈수 유도체는 를 포함하고, 상기 식에서 파선 결합(wavy bond)은 링커 또는 후속 단량체에 대한 부착 지점을 나타내고, R은 아미노산 측쇄를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 클릭 반응 생성물은 클릭 반응을 통해 형성된 모이어티를 포함하며, 여기서 클릭 반응은 상기에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 클릭 반응 생성물은 말레이미드와 티올의 마이클 첨가(석신이미드-티오에테르의 형성을 초래함); 아지드 알킨 고리첨가; 딜스-앨더 반응(예를 들어 직접 및/또는 역전자 수요 딜스 앨더); 디벤질 사이클로옥틴 1,3-니트론(또는 아지드) 고리첨가; 알켄 테트라졸 광클릭 반응, 또는 이들의 조합 중 임의의 것에 의해서 형성된 생성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 하기 화학식 1A에 표현되고:
,
상기 식에서, R, n, k, l, p, m, Pol, 및 r은 본원에 기재된 바와 같고, 각각의 X는 독립적으로 헤테로원자(예를 들어, O, N, NH, 또는 S), 스페이서(예를 들어, C1-C10 알킬, C1-C10 아미노알킬, C1-C10 알콕시, C1-C10 메르캅토알킬, 또는 클릭 반응 생성물) 또는 이들의 조합을 나타내거나, X는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, Pol은 아미노산 또는 이의 탈수 유도체, 또는 -CH2-CH2-O-를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 이황화 결합을 통해 HSA에 결합된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 링커는 본 발명의 페이로드의 아미노 기 또는 티올 기에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 각각의 HSA는 단일 생물학적 페이로드에 결합된다. 일부 실시형태에서, 각각의 HSA는 복수의 페이로드에 결합된다. 본 발명의 예시적인 단백질 접합체는 도 4a 내지 도 4b 및 도 13a 내지 도 13d 및 하기 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
Figure pct00012
Figure pct00013
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 생물학적 유체에서 적어도 2시간, 적어도 10시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간(이들 사이의 임의의 범위 포함) 동안 실질적으로 안정적이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체의 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%(이들 사이의 임의의 범위 포함)는 이들 사이의 임의의 범위를 포함하여 실질적으로 안정적이다.
본원에서 사용되는, 용어 "안정적인"은 본 발명의 단백질 접합체 또는 링커가 이의 화학적 온전성을 유지하는(예를 들어, 절단이 없음) 능력을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체의 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%는 양의 제타 전위를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체의 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%는 음의 제타 전위를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 담체는 적어도 1 mV, 적어도 5 mV, 적어도 10 mV, 적어도 15 mV, 적어도 20 mV, 적어도 30 mV(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 평균 양의 제타 전위를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 담체는 적어도 5 mV, 적어도 6 mV, 적어도 7 mV, 적어도 8 mV, 적어도 9 mV, 적어도 10 mV, 적어도 15 mV(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 평균 양의 제타 전위를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체는 5 내지 50 mV, 6 내지 50 mV, 7 내지 50 mV, 8 내지 50 mV, 8 내지 40 mV, 8 내지 30 mV, 8 내지 20 mV, 10 내지 50 ㎷, 10 내지 40 mV, 10 내지 30 mV, 10 내지 20 mV, 20 내지 50 mV, 30 내지 50 mV(이들 사이의 임의의 범위 포함)의 평균 양의 제타 전위를 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 치환체는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, -NO2, -CN, -OH, -NH2, 카르보닐, -CONH2, -CONR'2, -CNNR2, -CSNR2, -CONH-OH, -CONH-NH2, -NHCOR', -NHCSR', -NHCNR', -NC(=O)OR', -NC(=O)NR', -NC(=S)OR', -NC(=S)NR', -SO2R', -SOR', -SR', -SO2OR', -SO2N(R')2, -NHNR'2, -NNR', -NH(C1-C6 알킬), -N(C1-C6 알킬)2, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알콕시, 히드록시(C1-C6 알킬), 히드록시(C1-C6 알콕시), 알콕시(C1-C6 알킬), 알콕시(C1-C6 알콕시), 아미노(C1-C6 알킬), -CONH(C1-C6 알킬), -CON(C1-C6 알킬)2, -CO2H, -CO2R', -OCOR', -OCOR', -OC(=O)OR', -OC(=O)NR', -OC(=S)OR', -OC(=S)NR'로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 포함하고, 각각의 R'는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴 헤테로원자, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
키트
또 다른 양태에서, 제1 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체 및 페이로드를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 제1 모이어티는 페이로드에 대한 반응성을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 제2 모이어티에 공유 결합되며, 여기서 제1 모이어티 및 제2 모이어티는 (예를 들어, 클릭 반응을 통한) 서로에 대한 반응성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 제1 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체는 하기 화학식 2:
,
또는 하기 화학식 2A로 표현되고:
, 상기 식에서, R, n, j, l, p, m, 및 r은 본원에 기재된 바와 같고, A는 O, NR, 및 S로부터 선택된 헤테로원자이거나 이를 포함하고, R1은 제1 모이어티를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 제2 모이어티에 공유 결합된 페이로드는 하기 화학식 3:
,
또는 하기 화학식 4로 표현되고:
, 상기 식에서, R, X, j, k, l, n, m, 및 p는 본원에 기재된 바와 같고, A는 A는 O, NR, 및 S로부터 선택된 헤테로원자이거나 이를 포함하고, R2는 제2 모이어티를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 제1 모이어티 또는 제2 모이어티는 1,3-니트론, 아지드, 디엔, 테트라진, 활성 에스테르(예를 들어, 티오-에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, N-히드록시석신이미드 에스테르), 아실 할라이드, 클로로포르메이트, 무수물, 알데히드, 에폭시드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 카르보네이트, 설포닐 클로라이드, 아이오도아세트아미드, 아실 아지드, 이미도에스테르, 비닐 설폰, 오르토-피리딜-디설파이드 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 모이어티 또는 제2 모이어티는 친핵성 기(예를 들어, 아민, 티올, 포스핀, 히드록실), 디에노파일(dienophile), 알켄, 알킨(예를 들어, 아세틸렌, 디벤질 사이클로옥틴 등), 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 키트는 HSA(예를 들어, 이의 시스테인 또는 리신)에 대한 반응성을 갖는 작용기를 포함하는 링커에 공유 결합된 페이로드; 및 HSA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 키트는 페이로드(예를 들어, 이의 시스테인 또는 리신)에 대한 반응성을 갖는 작용기를 포함하는 링커에 공유 결합된 HSA; 및 페이로드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용기는 아이오도아세트아미드, 활성 에스테르, 오르토-피리딜디설파이드, 말레이미드, 또는 이들의 조합 중 임의의 것이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 접합체는 혈액-안정적인 접합체이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 세포-침투성 접합체이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 세포 막 통과 접합체이다. 일부 실시형태에서, 접합체 세포에 유입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합체는 엔도솜을 탈출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합체는 페이로드를 세포내에 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포내 전달은 세포질 전달이다. 일부 실시형태에서, 세포내 전달은 페이로드로부터의 담체의 해리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합체는 세포질에서 해리되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 해리는 페이로드로부터의 담체의 해리이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 세포내 표적을 조절하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 세포내 표적 영향을 미치는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 세포내 표적과 상호작용하는 데 사용하기 위한 것이다.
방법
또 다른 양태에서, 단백질 접합체의 생산 방법이 제공되며, 이 방법은 세포내 표적에 결합하는 생물학적 작용제를 제공하는 것; 세포 침투성 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체를 제공하는 것; 상기 선택된 생물학적 작용제를 링커를 통해서 상기 선택된 단백질 담체에 공유 연결시켜 단백질 접합체를 생산하는 것; 인간 혈액, 혈장 또는 혈청에서 상기 링커의 안정성을 결정하는 것; 및 상기 인간 혈액, 혈장 또는 혈청에서 안정적인 링커를 포함하는 단백질 접합체를 선택하는 것을 포함하며; 이에 의해서 세포내 표적에 결합할 수 있는 단백질 접합체를 생산한다.
일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 세포내 표적에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 세포의 세포질에 유입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 생물학적 작용제를 세포내 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 생물학적 작용제를 세포내 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 세포내 표적을 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 세포내 표적을 조절하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 작용제는 이황화 결합이 없다. 일부 실시형태에서, 생물학적 작용제는 생물학적 작용제의 구조에 필요한 이황화 결합이 없다. 일부 실시형태에서, 생물학적 작용제는 생물학적 작용제의 기능에 필요한 이황화 결합이 없다. 일부 실시형태에서, 생물학적 작용제는 생물학적 작용제의 결합에 필요한 이황화 결합이 없다. 일부 실시형태에서, 생물학적 작용제는, 절단되는 경우 결합을 약화시키는 이황화 결합이 없다. 일부 실시형태에서, 결합은 세포내 표적에 대한 결합이다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적에 결합한다고 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적에 결합한다고 입증되어 있다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적에 결합한다고 확인되어 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 페이로드가 세포내 표적에 결합하는 것을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 생물학적 작용제이다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포 내로의 전달을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 내는 세포의 세포질 내이다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포 내부에서 생물학적 작용제의 기능을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 내부는 세포의 세포질 내이다. 일부 실시형태에서, 기능은 결합이다. 일부 실시형태에서, 기능은 조절이다.
일부 실시형태에서, 링커는 절단 가능한 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합은 생물학적 절단 가능하다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포질 조건에서 불안정한 단백질 접합체를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포질 조건에서 링커의 안정성을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포질 조건은 세포 내이다. 일부 실시형태에서, 세포질 조건은 글루타티온(GSH)의 존재 하이다. 일부 실시형태에서, 불안정한이라는 것은 혈액, 혈장 또는 혈청에서보다 덜 안정적인 것이다.
일부 실시형태에서, 안정적이라는 것은 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50% 미만의 해리를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 안정적이라는 것은 적어도 4, 6, 12, 18, 24, 48, 72 또는 96시간 동안 안정적인 것이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 안정적이라는 것은 96시간 후에 20% 미만의 해리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 해리는 페이로드(예를 들어, 생물학적 작용제)로부터의 담체의 해리이다. 일부 실시형태에서, 불안정한이라는 것은 안정적이지 않은 임의의 상태이다. 일부 실시형태에서, 불안정한이라는 것은 안정적인 조건에서보다 더 큰 해리를 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커는 상기 페이로드(예를 들어, 생물학적 작용제)의 활성 부위로부터 멀리에 연결된다. 일부 실시형태에서, 멀리는 원위이다. 일부 실시형태에서, 멀리는 근접한 것이 아니다. 일부 실시형태에서, 멀리는 적어도 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60,70, 80, 90 또는 100개 아미노산 멀리이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 멀리는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70 옹스트롬이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 당업자는 VHH의 C-말단이 마지막 CDR의 단부로부터 약 40 내지 50 옹스트롬 거리에 존재한다는 것을 알고 있을 것이다. 일부 실시형태에서, 멀리는 적어도 40 옹스트롬이다. 일부 실시형태에서, 멀리는 적어도 50 옹스트롬이다. 일부 실시형태에서, 연결은 작용제의 말단에 존재한다. 일부 실시형태에서, 말단은 N-말단이다. 일부 실시형태에서, 말단은 C-말단이다.
일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 치료제이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 생물학적 치료제이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 생물학적 제제이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 세포내 표적에 대한 작용제이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 세포내 표적을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 세포내 표적을 조절한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체의 합성 방법이 존재한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 발명의 키트를 제공하는 것 및 (예를 들어, 선택적으로 금속계 촉매 및/또는 UV-, 열-방사선을 포함하는 적합한 조건 하에서) 제1 모이어티 및 제2 모이어티를 반응시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 접합체의 합성 방법은, (i) 제1 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체, 및 제2 모이어티에 공유 결합된 페이로드를 제공하는 것 - 제1 모이어티 및 제2 모이어티는 서로에 대해서 반응성을 가짐(예를 들어, 클릭 반응을 통해서, 티오-말레이미드 연결 형성을 통해서, 아민을 통해서 활성 에스테르 커플링에 대해서, 예컨대, SPDP 또는 니트로-SPDP와 티올의 반응에 의한 S-S 결합 형성을 통해서) -; 및 (ii) 제1 모이어티와 제2 모이어티 간의 반응에 적합한 조건 하에서 단백질 담체 및 페이로드를 제공하며, 이에 의해서 본 발명의 단백질 접합체를 합성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 모이어티 및 제2 모이어티는 본원에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 반응은 클릭 반응을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 페이로드(예를 들어, 이의 시스테인 또는 리신)에 대한 반응성을 갖는 작용기를 포함하는 링커에 공유 결합된 단백질 담체 및 페이로드를 제공하는 것; (ii)작용기와 페이로드를 반응시키며, 이에 의해서 본 발명의 단백질 접합체를 합성하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 단백질 담체(예를 들어, 이의 시스테인 또는 리신)에 대한 반응성을 갖는 작용기를 포함하는 링커에 공유 결합된 페이로드 및 단백질 담체를 제공하는 것; (ii)작용기와 단백질 담체를 반응시키며, 이에 의해서 본 발명의 단백질 접합체를 합성하는 것을 포함한다. 예시적인 합성 반응식은 도 36에 제시되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 단백질 접합체가 제공된다.
조성물
또 다른 양태에서, 본 발명의 단백질 접합체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 아주반트를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "담체", "부형제", 또는 "아주반트"는 활성제가 아닌 약학적 조성물의 임의의 성분을 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 비독성, 불활성 고체, 반고체 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 임의의 유형의 제형 보조제, 또는 단순히 염수와 같은 멸균 수성 매질을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스, 글리콜, 예컨대, 프로파일렌 글리콜, 폴리올, 예컨대, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트, 무발열원수; 등장성 식염수, 링거액; 에틸알코올 및 인산염 완충 용액뿐만 아니라 약학적 제형에 사용되는 기타 비독성 상용성 물질이다. 본원에서 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예에는 당, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 황산칼슘, 폴리올, 무발열원수, 등장성 식염수, 포스페이트 완충 용액뿐만 아니라 다른 약학적 제형에 사용되는 다른 비독성의 약학적으로 상용성인 물질이 포함된다. 습윤제 및 나트륨 라우릴 설페이트와 같은 윤활제뿐만 아니라 부형제, 안정화제, 산화방지제, 및 방부제가 또한 존재할 수 있다. 임의의 비독성, 불활성, 및 효과적인 담체가 본원에서 고려되는 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다.
담체는, 총계로, 본원에 제시된 약학적 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 99.99999 중량%를 구성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 단백질 접합체를 포함한다. "치료적 유효량"이라는 용어는, 포유동물에서 질병 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 약물의 양을 말한다. "치료적 유효량"이라는 용어는 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 얻는 데 필요한 투여량과 시기 동안 효과적인 양이다. 정확한 투여 형태 및 투여법은 환자의 상태에 따라 의사가 결정할 것이다.
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제형화된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 치료를 위해서 유리 형태로 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로서 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 대상체, 예를 들어, 인간에게 투여 시 직접적으로 또는 간접적으로 본 발명의 화합물을 제공할 수 있는 본 발명의 화합물의 임의의 비독성 염 또는 이의 저해적으로 활성인 대사산물 또는 잔류물을 지칭한다. 예를 들어, "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 연방 정부 또는 주정부의 규제 기간에 의해 허가되거나 미국 약전 또는 동물 및 더 특히 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거됨을 의미할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 약학적으로 허용 가능한 염을 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19]에 상세하게 기재한다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 것을 포함한다. 이러한 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 동일계에서 제조될 수 있다. 산 부가 염은 1) 유리-염기 형태의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기 산과 반응시키고, 2) 이렇게 형성된 염을 단리시킴으로써 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염의 비제한적인 예는 아세테이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이카르보네이트, 카르보네이트, 할라이드(예컨대, 브로마이드, 클로라이드, 아이오다이드, 플루오라이드), 바이타르트레이트, 시트레이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 데카노에이트, 에데테이트, 푸마레이트, 글루코네이트 및 락테이트 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
약학적으로 허용 가능한 무독성 산 부가 염의 추가 예는 무기산, 예컨대, 염산, 브로민화수소산, 인산, 황산 및 과염소산 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 석신산 또는 말론산을 사용하여 또는 이온 교환과 같은 당업계에 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노 기의 염이다.
다른 약학적으로 허용 가능한 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설페이트, 시트레이트, 사이클로펜타디엔 프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설페이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로아이오다이드, 2-히드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운도카노에이트, 발레르에이트 염 등을 포함한다.
염기 부가 염은 1) 산 형태의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기 염기와 반응시키고, 2) 이렇게 형성된 염을 단리시킴으로써 제조될 수 있다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속(예를 들어, 나트륨, 리튬 및 칼륨), 알칼리 토금속(예를 들어, 마그네슘 및 칼슘), 암모늄 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 화합물의 임의의 염기성 질소-함유 기의 4차화를 구상한다. 이러한 4차화를 통해 수용성, 유용성 또는 분산성 제품을 얻을 수 있다.
추가의 약학적으로 허용 가능한 염은 적절한 경우 반대이온, 예컨대, 할라이드, 히드록시드, 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급알킬 설포네이트 아릴 설포네이트를 사용하여 형성된 무독성 암모늄, 4급 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다. 그 자체로는 약학적으로 허용 가능하지 않은 다른 산 및 염기가 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 산 또는 염기 부가 염을 얻는 데 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 용어 "하나 이상"은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중에서 선택된 임의의 수치 값을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 헤테로원자는 N, O, NH 또는 S 중 임의의 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 화합물은 키랄 화합물(즉, 비대칭 탄소 원자를 가짐)이다. 일부 실시형태에서, 부분입체이성질체, 기하 이성질체 및 개별 이성질체가 본 발명의 범주에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 키랄 화합물은 라세미 혼합물의 형태이다. 일부 실시형태에서, 키랄 화합물은 R 배위를 갖는 비대칭 탄소 원자를 갖는 단일 거울상이성질체의 형태이다. 일부 실시형태에서, 키랄 화합물은 상기에 기재된 바와 같은 S 배위를 갖는 비대칭 탄소 원자를 갖는 단일 거울상이성질체의 형태이다.
일부 실시형태에서, 키랄 화합물은 70% 초과의 거울상이성질체 순도를 갖는 단일 거울상이성질체의 형태이다. 일부 실시형태에서, 키랄 화합물은 80% 초과의 거울상이성질체 순도를 갖는 단일 거울상이성질체의 형태이다. 일부 실시형태에서, 키랄 화합물은 90% 초과의 거울상이성질체 순도를 갖는 단일 거울상이성질체의 형태이다. 일부 실시형태에서, 키랄 화합물은 95% 초과의 거울상이성질체 순도를 갖는 단일 거울상이성질체의 형태이다.
일부 실시형태에서, 불포화 결합을 포함하는 본 발명의 화합물은 트랜스- 또는 시스-이성질체 형태이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 상기에 기재된 바와 같은 시스-이성질체와 트랜스-이성질체의 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 화합물은 수화된 형태를 포함하여 용매화된 형태뿐만 아니라 비용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 비용매화된 형태와 동등하며 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 특정 화합물은 다중 결정질 또는 무정형 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태는 본 발명에 의해 고려되는 용도에 대해서 동등하며 본 발명의 범주 내에 포함되도록 의도된다.
용어 "용매화물"은 용질(본원에 기재된 접합체) 및 용질의 생물학적 활성을 방해하지 않는 용매에 의해 형성되는 가변 화학량론(예를 들어, 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-, 헥사- 등)의 복합체를 지칭한다. 적합한 용매는 예를 들어, 에탄올, 아세트산 등을 포함한다.
용어 "수화물"은 상기에 정의된 바와 같은 용매화물을 지칭하며, 여기서 용매는 물이다.
달리 제시되지 않는 한, 본원에 도시된 구조는 또한 그 구조의 모든 이성질체(예를 들어, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하, 입체배좌 및 회전) 형태를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 각각의 비대칭 중심에 대한 R 및 S 배위, (Z) 및 (E) 이중 결합 이성질체, (Z) 및 (E) 입체배좌 이성질체가 본 발명에 포함된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 치환체는 임의의 회전 가능한 결합 주위를 자유롭게 회전할 수 있다. 따라서, 본 화합물의 단일 입체화학 이성질체뿐만 아니라 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하, 입체배좌 및 회전 혼합물이 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
달리 제시하지 않는 한, 본 발명의 화합물의 모든 호변이성질체 형태는 본 발명의 범위 내에 있다.
추가로, 달리 제시하지 않는 한, 본원에 도시된 구조는 또한 하나 이상의 동위원소가 풍부한 원자의 존재만 상이한 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 중수소 또는 삼중수소에 의한 수소의 대체, 또는 18F에 의한 수소의 대체, 또는 13C- 또는 14C-풍부 탄소에 의한 탄소의 대체를 제외하고 본 구조를 갖는 화합물은 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 화합물은 예를 들어, 영상화 프로브로서 유용하다.
사용 방법
또 다른 양태에서, 세포내 표적에 결합하는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포내 표적을 발현하는 세포를 본 발명의 단백질 접합체 또는 본 발명의 약학적 조성물과 접촉시키고, 이에 의해서 세포내 표적에 결합시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포내 표적을 조절하는 방법이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적을 조절한다. 일부 실시형태에서, 변형은 효능작용성이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 세포내 표적의 효능제이다. 일부 실시형태에서, 변형은 길항작용성이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 길항제이다. 조절하는(즉, 길항작용하거나 효능작용하는) 분자는 당업계에 널리 알려져 있고, 임의의 이러한 분자가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 표적은 세포내 표적에 특이적이다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포내 표적을 검출하는 방법이다. 일부 실시형태에서, 단백질 접합체는 검출 가능한 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 검출 가능한 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 방법은 단백질 접합체를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 검출 가능한 태그를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 태그는 형광 태그이다. 검출 가능한 태그 및 모이어티는 당업계에 널리 알려져 있고, 비제한적인 예는 형광단(예를 들어, GFP, RFP, YFP, 루시퍼라제 등), 방사성 태그 및 착색 태그)을 포함한다. 이러한 알려진 태그가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 대상체 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환 또는 병태를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 세포내 표적을 접촉함으로써 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 세포내 표적을 조절함으로써 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 세포내 표적을 효능작용함으로써 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 세포내 표적을 길항작용함으로써 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 세포내 표적의 조절을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 치료를 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이를 필요로 하는 대상체이다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체에게 본 발명의 단백질 접합체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "투여하는", "투여" 및 유사 용어는 건전한 의료 관행에서, 치료 효과를 제공하는 방식으로 활성제를 함유하는 조성물을 대상체에 전달하는 임의의 방법을 지칭한다. 본 발명 요지의 일 양태는 본 발명 요지의 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 정맥내 투여하는 것을 제공한다. 다른 적합한 투여 경로는 비경구, 피하, 경구, 근육내, 종양내 또는 복막내를 포함할 수 있다.
투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강, 및 체중, 존재하는 경우 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과의 성질에 좌우될 것이다.
일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 암이다. 일부 실시형태에서, 세포내 표적은 종양유전자이고, 페이로드는 길항제이다. 일부 실시형태에서, 세포내 표적은 종양 억제인자이고 페이로드는 효능제이다.
일부 실시형태에서, 접촉시키는 것은, 단백질 접합체의 세포 내로의 침투를 유도하도록 설계된 작용제의 존재 하에서 일어나지 않는다. 일부 실시형태에서, 침투를 유도하도록 설계된 작용제는 담체 단백질 이외의 작용제이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법과 다른 세포 침투를 유도하는 또 다른 방법은 사용되지 않는다.
본원에서 사용되는, 용어 "알킬"은 직쇄형 및 분지쇄형 기를 포함하고 일반적으로 1 내지 30개, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 탄화수소를 기술한다. 본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 또한 포화 또는 불포화 탄화수소를 포함하며, 따라서 이 용어는 알케닐 및 알키닐을 추가로 포함한다.
용어 "알케닐"은 적어도 2개의 탄소 원자 및 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 불포화 알킬을 기술한다. 알케닐은 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 치환체에 의해 치환되거나 비치환될 수 있다.
본원에 정의된 용어 "알키닐"은 적어도 2개의 탄소 원자 및 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 알킬이다. 알키닐은 상기에 기재된 바와 같이 하나 이상의 치환체로 치환 또는 비치환될 수 있다.
"사이클로알킬"이라는 용어는 하나 이상의 고리가 완전히 공액된 파이-전자 시스템을 갖지 않는 전체-탄소 모노사이클릭 또는 융합된 고리(즉, 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 기술한다. 사이클로알킬 기는 본원에 제시된 바와 같이 치환되거나 비치환될 수 있다.
용어 "아릴"은 완전히 공액된 파이-전자 시스템을 갖는 전체-탄소 모노사이클릭 또는 융합된 고리 폴리사이클릭(즉, 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 기술한다. 아릴 기는 본원에 제시된 바와 같이 치환되거나 비치 환될 수 있다.
용어 "알콕시"는 본원에 정의된 바와 같이 -O-알킬 및 -O-사이클로알킬 기를 모두 기술한다. 용어 "아릴옥시"는 본원에 정의된 바와 같이 -O-아릴을 기술한다.
본원의 일반식에서 알킬, 사이클로알킬 및 아릴기는 각각 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있으며, 이에 의해 각각의 치환체는 독립적으로 예를 들어, 치환된 기 및 분자 내 이의 위치에 따라, 할라이드, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 니트로, 아미노, 히드록실, 티올, 티오알콕시, 카르복시, 아미드, 아릴 및 아릴옥시일 수 있다. 추가의 치환체도 고려된다.
용어 "할라이드", "할로겐" 또는 "할로"는 불소, 염소, 브로민 또는 아이오딘을 기술한다. 용어 "할로알킬"은 하나 이상의 할라이드(들)에 의해 추가로 치환된, 본원에 정의된 바와 같은 알킬 기를 기술한다. "할로알콕시"라는 용어는 하나 이상의 할라이드(들)에 의해 추가로 치환된 본원에 정의된 바와 같은 알콕시 기를 기술한다. 용어 "히드록실" 또는 "히드록시"는 -OH 기를 기술한다. 용어 "메르캅토" 또는 "티올"은 -SH 기를 기술한다. 용어 "티오알콕시"는 본원에 정의된 바와 같이 -S-알킬 기 및 -S-사이클로알킬 기를 모두 기술한다. 용어 "티오아릴옥시"는 본원에 정의된 바와 같이 -S-아릴 및 -S-헤테로아릴 기를 모두 기술한다. 용어 "아미노"는 -NR'R'' 기 또는 이의 염을 기술하며, R' 및 R''는 본원에 기재된 바와 같다.
용어 "헤테로사이클릴"은 고리(들)에 질소, 산소 및 황과 같은 하나 이상의 원자를 갖는 모노사이클릭 또는 융합된 고리 기를 기술한다. 고리는 또한 하나 이상의 이중 결합을 가질 수 있다. 그러나 고리에는 완전히 공액된 파이-전자 시스템이 없다. 대표적인 예는 피페리딘, 피페라진, 테트라히드로푸란, 테트라히드로피란, 모르폴리노 등이다.
용어 "카르복시"는 -C(O)OR' 기 또는 이의 카르복실레이트 염 - 여기서 R'는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합됨) 또는 헤테로사이클릴(고리 탄소를 통해 결합됨)은 본원에 정의된 바와 같음 - 또는 "카르복실레이트"를 기술한다.
용어 "카르보닐"은 -C(=O)-R' 기를 기술하며, 여기서 R'는 상기에 정의된 바와 같다. 상기 용어는 또한 이의 티오-유도체(티오카르복시 및 티오카르보닐)를 포함한다.
용어 "티오카르보닐"은 -C(S)R' 기를 기술하며, 여기서 R'는 상기에 정의된 바와 같다. "티오카르복시" 기는 -C(S)OR' 기를 기술하며, 여기서 R'는 본원에 정의된 바와 같다. "설피닐" 기는 -S(O)R' 기를 기술하며, 여기서 R'는 본원에 정의된 바와 같다. "설포닐" 또는 "설포네이트" 기는 -S(O)2R' 기를 기술하며, 여기서 R'는 본원에 정의된 바와 같다.
"카르바밀" 또는 "카르바메이트" 기는 -OC(=O)-NR'R" 기를 기술하며, 여기서 R'는 본원에 정의된 바와 같고 R"는 R'에 대해 정의된 바와 같다. "니트로" 기는 -NO2 기를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "아미드"는 C-아미드 및 N-아미드를 포함한다. 용어 "C-아미드"는 -C(O)NR'R" 단부 기 또는 -C(O)NR'-연결 기를 기술하며, 이러한 어구는 상기에 정의한 바와 같고, 여기서 R' 및 R"은 본원에 정의된 바와 같다. 용어 "N-아미드"는 -NR'C(O)R' 단부 기 또는 -NR'C(O)- 연결 기를 기술하며, 이러한 어구는 상기에 정의한 바와 같고, 여기서 R' 및 R"은 본원에 정의된 바와 같다.
"시아노" 또는 "니트릴" 기는 -CN 기를 지칭한다. 용어 "아조" 또는 "디아조"는 -N=NR' 단부 기 또는 -N=N- 연결 기를 기술하며, 이러한 어구는 상기에 정의되어 있고, R'은 상기에 정의된 바와 같다. 용어 "구아니딘"은 -R'NC(N)NR"R"' 단부 기 또는 -R'NC(N) NR"- 연결 기를 기술하며, 이러한 어구는 상기에 정의된 바와 같고, 여기서 R', R" 및 R'"는 본원에 정의된 바와 같다. 본원에서 사용되는 용어 "아지드"는 -N3 기를 지칭한다. 용어 "설폰아미드"는 -S(O)2NR'R'' 기를 지칭하며, 여기서 R' 및 R"는 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "포스포닐" 또는 "포스포네이트"는 -OP(O)-(OR')2 기를 기술하며, 여기서 R'는 상기에 정의된 바와 같다. 용어 "포스피닐"은 -PR'R" 기를 기술하며, 여기서 R' 및 R"는 상기에 정의된 바와 같다. 용어 "알킬아릴"은 본원에 기재된 바와 같은 아릴에 의해 치환된, 본원에 정의된 바와 같은 알킬을 기술한다. 예시적인 알킬아릴은 벤질이다.
용어 "헤테로아릴"은 고리(들)에 예를 들어 질소, 산소 및 황과 같은 하나 이상의 원자를 갖고, 추가로 완전히 공액된 파이-전자 시스템을 갖는 모노사이클릭 또는 융합된 고리(즉, 인접한 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 기술한다. 본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴"은, 방향족 고리를 형성하는 적어도 하나의 원자가 헤테로원자인 방향족 고리를 지칭한다. 헤테로아릴 고리는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 9개 초과의 원자에 의해 형성될 수 있다. 헤테로아릴 기는 선택적으로 치환될 수 있다. 헤테로아릴 기의 예에는, 예를 들면, 고리 형성 탄소 원자 중 하나를 통해 연결된, 1개의 산소 또는 황 원자, 또는 2개의 산소 원자, 또는 2개의 황 원자 또는 최대 4개의 질소 원자, 또는 1개의 산소 또는 황 원자와 최대 2개의 질소 원자의 조합을 함유하는 방향족 C3-8 헤테로사이클릭 기, 및 이것들의 치환된 그리고 벤조- 및 피리도-융합 유도체를 포함하지만 이것들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디날, 피라지닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐 또는 퀴녹살리닐로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 헤테로아릴 기는 피롤릴, 푸라닐(푸릴), 티오페닐(티에닐), 이미다졸릴, 피라졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,3-옥사졸릴(옥사졸릴), 1,2-옥사졸릴(이속사졸릴), 옥사디아졸릴, 1,3-티아졸릴(티아졸릴), 1,2-티아졸릴(이소티아졸릴), 테트라졸릴, 피리디닐(피리딜) 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 1,2,3-트리아지닐, 1,2,4-트리아지닐, 1,3,5-트리아지닐, 1,2,4,5-테트라지닐, 인다졸릴, 인돌릴, 벤조티오페닐, 벤조푸라닐, 벤조티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조디옥솔릴, 아크리디닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 프탈라지닐, 티에노티오페닐, 1,8-나프티리디닐, 기타 나프티리디닐, 프테리디닐 또는 페노티아지닐로부터 선택된다. 상기 헤테로아릴 기가 하나 초과의 고리를 포함하는 경우에, 각각의 추가 고리는 포화 형태(퍼히드로 형태) 또는 부분적 불포화 형태(예를 들면, 디히드로 형태 또는 테트라히드로 형태) 또는 최대 불포화(비방향족) 형태이다. 따라서 용어 헤테로아릴은 2개의 고리가 방향족인 바이사이클릭 라디칼 및 오직 하나의 고리만이 방향족인 바이사이클릭 라디칼을 포함한다. 헤테로아릴의 그와 같은 예에는 3H-인돌리닐, 2(1H)-퀴놀리노닐, 4-옥소-1,4-디히드로퀴놀리닐, 2H-1-옥소이소퀴놀릴, 1,2-디히드로퀴놀리닐, (2H)퀴놀리닐 N-옥사이드, 3,4-디히드로퀴놀리닐, 1,2-디히드로이소퀴놀리닐, 3,4-디히드로-이소퀴놀리닐, 크로모닐, 3,4-디히드로이소퀴녹살리닐, 4-(3H)퀴나졸리노닐, 4H-크로메닐, 4-크로마노닐, 옥신돌릴, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리닐, 1,2,3,4-테트라히드로-퀴놀리닐, 1H-2,3-디히드로이소인돌릴, 2,3-디히드로벤조[f]이소인돌릴, 1,2,3,4-테트라히드로벤조-[g]이소퀴놀리닐, 1,2,3,4-테트라히드로-벤조[g]이소퀴놀리닐, 크로마닐, 이소크로마노닐, 2,3-디히드로크로모닐, 1,4-벤조-디옥사닐, 1,2,3,4-테트라히드로-퀴녹살리닐, 5,6-디히드로-퀴놀릴, 5,6-디히드로이소-퀴놀릴, 5,6-디히드로퀴녹살리닐, 5,6-디히드로퀴나졸리닐, 4,5-디히드로-1H-벤즈이미다졸릴, 4,5-디히드로-벤즈옥사졸릴, 1,4-나프토퀴놀릴, 5,6,7,8-테트라히드로-퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라히드로-이소퀴놀릴, 5,6,7,8-테트라히드로퀴녹살리닐, 5,6,7,8-테트라히드로퀴나졸릴, 4,5,6,7-테트라히드로-1H-벤즈이미다졸릴, 4,5,6,7-테트라히드로-벤즈옥사졸릴, 1H-4-옥사-1,5-디아자-나프탈렌-2-오닐, 1,3-디히드로이미디졸로-[4,5]-피리딘-2-오닐, 2,3-디히드로-1,4-디나프토-퀴노닐, 2,3-디히드로-1H-피롤[3,4-b]퀴놀리닐, 1,2,3,4-테트라히드로벤조[b]-[1,7]나프티리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로벤즈[b][1,6]-나프티리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로-9H-피리도[3,4-b]인돌릴, 1,2,3,4-테트라히드로-9H-피리도[4,3-b]인돌릴, 2,3-디히드로-1H-피롤로-[3,4-b]인돌릴, 1H-2,3,4,5-테트라히드로-아제피노[3,4-b]인돌릴, 1H-2,3,4,5-테트라히드로아제피노-[4,3-b]인돌릴, 1H-2,3,4,5-테트라히드로-아제피노[4,5-b]인돌릴, 5,6,7,8-테트라히드로[1,7]나프티리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로-[2,7]-나프티리딜, 2,3-디히드로[1,4]디옥시노[2,3-b]피리딜, 2,3-디히드로[1,4]-디옥시노[2,3-b]피리딜, 3,4-디히드로-2H-1-옥사[4,6]디아자나프탈레닐, 4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조 -[4,5-c]피리딜, 6,7-디히드로[5,8]디아자나프탈레닐, 1,2,3,4-테트라히드로[1,5]-나프티리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로[1,6]나프티리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로[1,7]나프티리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로-[1,8]나프티리디닐 또는 1,2,3,4-테트라히드로[2, 6]나프티리디닐이 포함된다. 일부 실시형태에서, 헤테로아릴 기는 선택적으로 치환된다. 일 실시형태에서, 하나 초과의 치환체는 할로, 히드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 알킬아미도, 아실, C1-6-알킬, C1-6-할로알킬, C1-6-히드록시알킬, C1-6-아미노알킬, C1-6-알킬아미노, 알킬설페닐, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 설파모일, 또는 트리플루오로메틸로부터 각각 독립적으로 선택된다.
헤테로아릴 기의 예에는 푸란, 벤조푸란, 티오펜, 벤조티오펜, 피롤, 피리딘, 인돌, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 이속사졸, 벤즈이속사졸, 티아졸, 벤조티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 피라졸, 인다졸, 테트라졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 피리다진, 피리미딘, 퓨린 및 피라진, 푸라잔, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 트리아졸, 벤조트리아졸, 프테리딘, 페녹사졸, 옥사디아졸, 벤조피라졸, 퀴놀리진, 신놀린, 프탈라진, 퀴나졸린 및 퀴녹살린의 치환되지 않고 일- 또는 이-치환된 유도체가 포함되지만 이것들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 치환체는 할로, 히드록시, 시아노, O-C1-6-알킬, C1-6-알킬, 히드록시-C1-6-알킬 및 아미노-C1-6-알킬이다.
본원에서 사용되는, 용어 "할로" 및 "할라이드"는 본원에서 상호교환가능하게 지칭되고, 할로겐의 원자, 즉 불소, 염소, 브롬 또는 아이오다이드를 기술하며, 또한 본원에서 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드로 지칭된다.
본원에서 사용되는, 용어 "약"은 소정 값과 조합될 때 기준값의 플러스 및 마이너스 10%를 지칭한다. 예를 들어, 약 1000 나노미터(nm) 길이는 1000 nm +/- 100 nm 길이를 지칭한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 복수의 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하고 "폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩티드 및 당업자에게 알려진 이의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다. 또한, 청구범위는 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음에 유의한다. 그러한 바와 같이, 이러한 언급은 청구범위 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "오로지", "단지" 등과 같은 배타적인 용어의 사용에 대한 선행 근거(antecedent basis)로서의 역할을 하도록 의도된다.
"A, B, 및 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 관례가 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 구성은 당업자가 관례를 이해할 것이라는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다). 2개 이상의 대안적인 용어를 제시하는 사실상 임의의 이접적(disjunctive) 단어 및/또는 어구는 설명, 청구범위, 또는 도면에서든 용어들 중 하나, 용어들 중 어느 하나, 또는 용어 둘 다를 포함할 가능성을 고려하기 위해 이해되어야 함이 당업자에 의해 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A"또는 "B"또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
명료함을 위하여, 개별적인 실시형태와 관련하여 기재된 본 발명의 소정 특징이 또한 단일 실시형태에서 조합되어 제공될 수 있음이 인식되어야 한다. 역으로, 간결함을 위하여, 단일 실시형태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징이 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 속하는 실시형태의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 마치 각각 하나하나의 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 실시형태 및 이의 요소의 모든 하위조합이 또한 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 마치 각각 하나하나의 모든 그러한 하위조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본 발명의 추가적인 목적, 이점, 및 신규 특징은 제한하려는 의도가 아니라 하기 실시예의 조사 시 당업자에게 명백하게 될 것이다. 추가적으로, 상기에 기술되고 하기 청구범위 부분에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태 및 양태는 각각 하기 실시예에서 실험적 지지를 찾는다.
상기 기술되고 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태 및 양태는 하기 실시예에서 실험적 뒷받침을 발견한다.
실시예
일반적으로, 본원에 사용되는 명명법 및 본 발명에 활용되는 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물 및 재조합 DNA 기법을 포함한다. 이러한 기법은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)]; 문헌[Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)]; 문헌[Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)]; 문헌[Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York]; 문헌[Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1--4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)]; 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 제시된 바와 같은 방법; 문헌["Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)]; 문헌["Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition]; 문헌["Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)]; 문헌[Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)]; 문헌[Mishell and Shiigi (eds), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)]을 참조하며, 이들 모두는 참고로 포함된다. 다른 일반적인 참고문헌이 본 문서 전체에 걸쳐 제공된다.
실시예 1: 직접 화학적 변형
양전하는 세포내이입 경로를 통한 세포내 전달을 촉진하기 때문에, 몇몇의 작은 폴리아민 유도체를 시험하였다. GFP/IgG를 테트라에틸렌펜타민(TEPA), 트리에틸렌테트라민(TETA) 또는 폴리에틸렌이민(PEI)과 직접 접합하고, 세포 내로의 단백질 흡수를 모니터링하였다. PEI는 훨씬 우수한 것으로 밝혀졌기 때문에(데이터 나타내지 않음) 모든 추가 실험은 PEI를 사용하여 수행하였다.
PEI는 선형 또는 분지형의 긴 중합체이며, 일반적으로 분자량이 10 KDa를 초과하며, 기존 중합체 중에서 가장 높은 양이온 전하 밀도를 갖는 것을 특징으로 한다. 이로 인해서 이것은 형질주입제로서 사용되는데, 여기서 높은 양전하는 음으로 하전된 DNA 또는 RNA의 복합체를 형성하고 추가로 이러한 핵산을 세포 내로 내재화하는 데 사용된다. 이러한 고분자량 형질주입제는 시험관내 적용에서는 효율적이지만 생체내 적용에서는 덜 유용하다. 따라서 초저분자량 PEI 모이어티, 즉 600 내지 1800 Da(질량 분석법으로 측정) 범위의 분자량을 갖는 분지형 PEI 분자를 사용하였다. 이러한 초저분자량 PEI는 내재화될 단백질 페이로드에 화학적으로 그리고 공유적으로 접합될 수 있다.
주로 600 Da의 초저분자량 PEI를 IgG 및 GFP에 접합시켰다. PEI는 많은 1차 아민을 함유하기 때문에 단백질의 글루타민산 및 아스파르트산의 카르복실산 잔기뿐만 아니라 C-말단 카르복시 기에 대한 접합은 카르보디이미드 접합 화학을 사용하여 수행하였다. 반응은 과량의 PEI, 즉 3500 몰 과량에서 수행하였고, 변형 수준의 제어는 반응에서 카르보디이미드 작용제(N-(3-디메틸아미노프로파일)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(EDC))의 수준을 조절하여 달성되었다. 변형 수준은 MALDI-ToF 질량 분석법으로 결정하였다(도 1). IgG 기반 단백질의 경우, 평균 변형 수준은 IgG 분자당 PEI(600 Da) 1 내지 8.5개 분자 범위였으며, 이는 각각 25 내지 400 몰 당량 범위의 과량 수준의 EDC로 달성되었다. PEI 변형은 부위 선택적이지 않기 때문에 MALDI-ToF 스펙트럼에서 관찰된 바와 같이 분자량 모이어티의 광범위한 분포를 초래한다(도 1). 평균 변형 수준은 측정된 피크 상단의 분자량 값에서 첨가된 PEI의 중량을 제공하는 변형되지 않은 단백질의 측정된 피크 상단의 분자량 값을 뺀 값을 기준으로 계산되었다. 이 값을 변형에 사용된 단일 PEI 분자의 분자량으로 나누면 평균적으로 추가된 분자 수를 얻는다.
다음으로, PEI-변형 및 비변형 마우스 IgG를 A375 세포와 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 형질주입/내재화에 대한 추가 유도는 추가되지 않았다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 비변형 마우스 IgG는 A375 세포에 유입되지 않았다. 대조적으로, 낮은 수준의 PEI-변형(IgG 분자당 평균 3개의 PEI 분자, X3) 조차도 내재화를 가능하게 하며, 평균 변형 수준의 증가는 세포 내부에서 관찰되는 IgG 수준을 비례적으로 증가시킨다. 내재화를 측정하기 위해 유세포 분석법을 사용한 경우에도 유사한 결과가 관찰되었다(데이터 나타내지 않음).
유사한 내재화 효율 및 변형 수준의 의존성이 다른 IgG(데이터 나타내지 않음) 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함하는 다른 페이로드에 대해서 관찰되었다(도 3a 내지 및 3b).
단일 도메인 항체 및 다른 더 작은 페이로드는, 이의 크기가 혼잡한 세포질에서 더 높고 더 쉬운 분산성에 대한 이점이기 때문에 세포내 활성에 이상적이다. PEI 분자로 직접 변형되는 경우 작은 단백질 페이로드는 기능적 문제에 직면할 수 있다. 작은 단백질에서, 이러한 화학적 변형이 단백질의 기능적 도메인을 방해할 가능성이 매우 높다. 특정 부위 또는 도메인에서 치료제에 대한 링커에 대한 선택적 접합 화학을 사용함으로써, 링커 접합의 정확한 위치를 제어하여 이것을 치료제의 활성 도메인에서 멀어지게 할 수 있다.
더욱 좋은 점은 화학적 변형을 보유하는 담체 단백질을 사용하면 이러한 위험이 완전히 제거된다는 것이다. 추가적으로, 일반적으로 작은 단백질 및 특히 단일 도메인 항체는 매우 낮은 혈장 반감기 및 높은 제거율로 인해서 이를 치료 적용에 부적합하게 만드는 약동학적 문제에 확실히 직면할 것이다. 따라서 본 발명자들은 기재된 담체 단백질 시스템을 사용하여 단백질 페이로드를 전달하는 것을 선호하였다.
이러한 담체 및 페이로드 방법론의 두 가지 개략도를 도 4a 및 도 4b에 도시한다. 인지할 수 있는 바와 같이, 담체 단백질은 PEI 기를 보유하며, 막 통과 및 엔도솜 탈출을 담당한다. 이들 기는 무작위로 또는 부위 선택적으로 담체 단백질에 접합될 수 있다. 무작위 접합의 경우, 접합 수준은 상기에 기재된 바와 같이 특정 반응 조건을 선택함으로써 제어될 수 있다. 도 4a는 시토졸 절단 가능한 S-S 결합이 있는 구성을 나타낸다. 이 결합은 절단 가능하지 않은 링커를 생성하기 위해 단순히 C-C 결합 또는 O-C 결합으로 대체될 수 있음이 이해될 것이다. 절단 가능하지 않은 링커를 갖는 접합체의 대안적인 구성을 도 4b에 도시한다.
담체 단백질 자체는 바람직하게는 면역원성 문제를 피하기 위해 인간 내인성 단백질 목록으로부터 선택된다. 또한, 혈액 내에서 흔히 발견되며 자연적으로 순환 반감기가 긴 단백질이 바람직하다. 마지막으로, 치료제가 목적하는 신체 영역에 페이로드를 전달할 수 있는 단백질이 이로울 것이다. 신체의 이러한 영역에 대한 예는 종양 및 이의 미세환경뿐만 아니라 자가면역 질환 및 다수의 다른 병리학적 병태에 중요한 염증 부위를 포함할 수 있다. 따라서 인간 혈청 알부민(HSA)이 선택되었다. HSA는 반감기가 긴 순환 단백질이고, 종양 및 염증 부위로 이동하고 페이로드를 해당 부위에, 심지어 세포외 환경에만 전달하는 것으로 밝혀져 있다(전문이 참조에 의해 본원에 포함된 문헌[Liu et al. BMC Biotechnology 2012, 12:68; Kratz, F., Journal of Controlled Release 132 (2008) 171-183]; 문헌[Um et al., Bioconjugate Chem., 2019, 10.1021/acs.bioconjchem.9b00760], 문헌[Wunder A. et al., J Immunol 2003; 170:4793-4801]; 및 문헌[Yazaki P.J. et al., Nuclear Medicine and Biology, 35 (2008) 151-158] 참조).
치료제는 생물학적 제제의 폴리펩티드 사슬을 따라 단일 접합 부위에서 단일 링커에 접합된다. 이러한 접합 부위는 작용제의 활성을 방해하지 않을 위치에 존재한다. 링커는 펩티드 링커, 화학적 링커 또는 조합으로부터 선택될 수 있다. 중합체-기반 링커인 PEG를 선택하였다. 상기에 논의된 바와 같이, 세포의 세포질 내의 특정 조건에 감응성인 불안정한 결합도 포함될 수 있다.
담체의 중요성을 입증하기 위해서, 단일 도메인 항체 페이로드를 담체 없이 PEI 분자에 직접 접합시켰다. 단일 도메인 항체의 CDR과의 간섭을 최소화하기 위해서, PEI는 단일 도메인 항체의 특정 부위, 바람직하게는 가능한 한 이들 CDR로부터 멀리 부착되어야 한다. 양호한 위치는 이러한 페이로드의 C-말단이다. PEI 변형을 위해 상기에 기재된 바와 같이 VHH 또는 DARPin의 C-말단 시스테인을 활용하는 경우, PEI의 한 단위만 페이로드에 접합된다. 따라서, 단 하나의 PEI 단위로 상당한 양전하에 도달하기 위해서, 담체 변형을 위해 본 발명에 기재된 600 Da PEI 이외에 분자량이 1800 Da인 분지형 PEI를 또한 사용하였다.
가역적 또는 비가역적 이황화 결합을 사용하여 페이로드의 C 말단인 선택적 부위에서 PEI의 접합을 수행하였다. 또한 단일 도메인 항체에 대한 무작위(부위 특이적 아님) 비가역적 PEI 변형을 또한 수행하였다. 본 발명자들이 항상 다중 PEI 변형된 페이로드를 얻었다는 것에 주목해야 한다. 더욱이, 조(crude) 반응 혼합물은 항상 분리하기 힘든 다수의 생성물을 포함한다. 따라서, 특정 PEI 변형(예를 들어, 미리 결정된 PEI 변형 위치 및/또는 미리 결정된 PEI 모이어티의 수를 갖는 접합체)을 얻기 위해서, 본원에 기재된 바와 같이, 링커를 통해 PEI 변형된 담체를 페이로드에 연결함으로써 본 발명의 접합체를 합성할 필요가 있다고 가정되었다.
이러한 목적을 위해, PEI(1800 또는 600 Da)를 HS-PEG12-SPDP 또는 NHS-PEG8-MAL로 변형시켜 각각 가역적 또는 비가역적 방식으로 페이로드 접합을 위한 티올 반응성 PEI를 생성하였다. 활성화된 PEI를 항-BRAF VHH, 1C5-Hel20-LC와 반응시켜 다음 작제물을 달성하였다:
1. 1C5-Hel20-LC-S-S-PEG12-C(O)-NH-PEI1800 (S6)
2. 1C5-Hel20-LC-PEG8-C(O)-NH-PEI1800 (S7)
3. 1C5-Hel20-LC-S-S-PEG12-C(O)-NH-PEI600 (S6A)
4. 1C5-Hel20-LC-PEG8-C(O)-NH-PEI600 (S7A)
EDC의 존재 하에서 1C5-Hel20-LC와 PEI1800을 반응시켜 무작위 변형을 달성하여 1C5-Hel20-LC-r-C(O)-NH-PEI1800(S8)을 제공하였다. PEI에 직접 접합된 페이로드의 상이한 작제물을, A375 세포에 침투하여 BRAF 저해 후 아폽토시스를 유도하는 능력에 대해 평가하였다. 이들 작제물을 1C5-Hel20-LC-S-S-HSA-PEI×4.5(S5C)로 명명된 가역적 결합 및 1C5-Hel20-LC-HSA-PEI×4.5(S5D)로 명명된 비가역적 결합을 통해 본 발명의 담체에 접합된 페이로드와 비교하였다.
접합체(S5D, S6-S7A)의 화학 구조를 상기 표 1에 제시한다.
도 5a 내지 도 5d에서 볼 수 있는 바와 같이, 1 μM의 모든 작용제(도 5a 및 도 5b) 또는 3 μM(도 5c 및 도 5d)로 처리한 경우, 가역적 또는 비가역적 연결을 통해 담체에 접합된 항-BRAF VHH만 효율적인 BRAF 저해를 나타내어 확실한 아폽토시스 신호를 초래한 반면, 부위 지정(도 5a 및 도 5b)이든 무작위 변형(도 5c 및 도 5d)이든 간에 PEI로 직접 변형된 모든 VHH는 아폽토시스가 없거나 매우 제한적인 것으로 나타났다. 직접적으로 변형된 VHH의 불활성은 담체 단백질이 결여된 모든 경우에 항-VHH를 사용한 제한된 세포내 염색으로 입증되는 바와 같이 더 낮은 수준의 막 통과 및 훨씬 더 낮은 엔도솜 탈출 효율로 설명될 수 있다(도 5e 내지 도 5l). 더 낮은 탈출은 낮은 수준의 PEI 분자 수준으로 인한 것인데, 그 이유는 더 큰 PEI 변형제(1800 Da)를 사용해도 보상하기에 충분하지 않았기 때문이다. C-말단에서 비가역적으로 1800 Da PEI로 변형된 VHH 중 하나의 제타 전위는 약 +5 mV 미만으로 측정되었는데, 이는 효율적인 내재화 및 엔도솜 탈출을 위해서는 너무 낮은 것으로 보인다. 더욱이, 상기에 언급된 바와 같이, VHH의 활성 도메인에 가깝게 접합된 PEI의 간섭으로 인해서 또는 링커 자체가 다시 접혀서 PEI, CDR 또는 둘 다를 모호하게 함으로써 활성 부족이 발생할 수도 있다.
병행 실험에서, A375 세포를 검정색/투명 바닥 96-웰 플레이트에 웰당 1500개 세포로 플레이팅하였다. 24시간 후, PBS 희석된, HSA-PEI×3.5(비가역적, 말레이미드-기반 링커 사용)에 접합된 항 BRAF 1C5 VHH를 세포에 첨가하였다(3.2 μM 최종 농도). HSA-PEI×3.5(비가역적, 말레이미드-기반 링커 사용)에 접합된 2A1 VHH(항-CD28 VHH, 여기서는 관련 없는 VHH라 함)뿐만 아니라 PEI 변형된 HSA를 음성 대조군(최종 농도 24 μM)으로 사용하였다. PF-04880594(선택적 RAF 저해제, Sigma, 카탈로그 번호 PZ0294)를 양성 대조군(최종 농도 10 μM)으로 사용하였다. 카스파제 시약을 흡수 기간이 시작될 때 세포에 첨가하였다(최종 희석 1:1000). 카스파제-3/7 활성화의 동역학 프로파일을 IncuCyte® 분석기를 사용하여 4일 동안 2시간마다 라이브 세포 영상화를 사용하여 모니터링하고 정량화하였다. 검정 완료 시, 배지를 제거하고, 세포 생존율 평가를 위해서 CellTiter-Glo® Luminescent 시약(Promega)을 첨가하였다. CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 검정은 대사 활성 세포의 지표인 존재하는 ATP의 정량화를 기반으로 배양물에서 생존 가능한 세포의 수를 결정하는 방법이다.
도 5m에서 볼 수 있는 바와 같이, HSA-PEI에 접합된 1C5 VHH만이 카스파제 3/7 활성의 극적인 증가를 유도하였는데, 이는 이들 세포에서 BRAF가 성공적이고 효율적으로 저해되어 아폽토시스를 유도한다는 것을 시사한다. 관련 없는 VHH, 및 무 VHH 대조군 경우 세포의 실질적인 아폽토시스가 발생하지 않았다. BRAF 저해제는 매우 강력한 세포 살해자라는 점에 유의해야 한다. 따라서 형광 신호가 검출되기 전에 대부분의 세포가 완전히 사멸하였다(도 5a, 도 5c, 도 5m). 그러나 신호가 세포 역가로 정규화되는 경우 저해제가 매우 효과적이라는 것이 분명해졌다(도 5b, 도 5d).
실시예 2: 막 통과 효율
세포 침투성 펩티드(CPP)를 사용한 다수의 연구는 일정 수준의 세포 내재화를 나타내었지만, 대부분의 경우 세포에 대한 초기 흡수 효율은 매우 낮았는데, 그 이유는 실제로 세포에 내재화되는 분자의 일부만을 생성하기 위해서 배지에서는 높은 수준의 페이로드가 필요하기 때문이었다. 초기 내재화 단계의 효율성을 평가하기 위해서, 특정 ELISA를 사용하여 배지에서 페이로드인 PEI-변형 마우스 IgG의 수준을 시간의 함수로 측정하였다. 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 높은 수준의 PEI-변형(대략 7)에서는 거의 모든 변형된 IgG가 내재화되고(95%) 대부분의 내재화는 인큐베이션 초기 24시간 동안 발생한다(회색 막대). 낮은 수준의 변형(대략 4.5 및 3)에서도, 내재화 단계는 매우 효율적인데, 이는 5일 인큐베이션 후 전체 페이로드의 약 75%의 전체적인 흡수를 나타내고(도 6, 가장 어두운 회색 및 가장 밝은 회색 막대), 고도로 변형된 IgG와 유사한 동역학을 따른다. 불완전하고 더 느린 흡수는 평균 변형 수준보다 훨씬 덜 변형된 IgG와 관련이 있을 가능성이 있다. PEI-변형은 변형된 모이어티가 다소 광범위하게 분포하며(도 1 참조), 변형되지 않거나 변형이 적은 분자(3개 미만)는 5일 후에도 여전히 배지에 존재할 가능성이 있다. 이러한 세포-막 통과 효율은 0.2 내지 40 μg/mL의 IgG 범위의 다양한 초기 배지 농도에서 관찰되었다.
실시예 3: PEI-변형된 단백질이 활용하는 세포내이입 경로
양이온화된 모이어티는 자연적 세포내이입 메커니즘을 사용하여 내재화된다고 생각된다. 두 가지 관련 세포내이입 메커니즘은 카베올린-매개 및 클라트린-매개 세포내이입이다. 내재화의 정확한 메커니즘은 알려진 특정 세포내이입 저해제의 존재 하에서 PEI-변형된 IgG의 내재화를 수행함으로써 밝혀졌다. A375 세포를 클라트린 저해제(아만타딘 또는 클로르프로마진) 또는 카베올린 저해제(제니스테인)의 존재 하에 PEI-변형된 마우스 IgG(4.5 PEI)와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 카베올린 저해제로 알려진 제니스테인은 실제로 PEI-변형된 IgG의 내재화를 저해하였다(도 7). 매우 흥미롭게도, 클라트린 저해제로 알려진 클로르프로마진을 첨가하면 내재화가 증가하였다. 이는 클라트린-매개 세포내이입의 저해가 세포에서 카베올린 매개 세포내이입의 보상적 증가를 초래하기 때문에 카베올린-매개 세포내이입이 PEI-변형된 페이로드에 의해 내재화를 위해 이용된다는 것을 확증한다.
실시예 4: 엔도솜 탈출
상기에 기재된 바와 같이, 아마도 생물학적 치료제의 세포내 전달에서 가장 어려운 장애물은 치료제의 이화작용을 피하기 위한 엔도솜 탈출일 것이다. PEI-변형된 단백질이 엔도솜으로부터 탈출할 수 있는지 여부를 평가하기 위해서, 공초점 현미경 및 엔도솜 및 리소솜 마커의 대비염색을 사용하여 내재화를 추적하였다. PEI-변형된 IgG를 형광 엔도솜/리소솜 마커를 발현하는 HEK293 세포와 함께 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 공초점 현미경으로 분석하였다. 엔도솜 및 리소솜에 녹색 형광 마커(Cell light Endosome, Molecular Probes, 카탈로그 번호 C10586 또는 Cell light Lysosome, Molecular Probes, 카탈로그 번호 C10596)를 형질주입하였고, IgG를 적색 형광 항-마우스 항체로 염색하였다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 내재화된 IgG와 초기 엔도솜 또는 리소솜 소포 사이의 주요 공동-국재화는 관찰되지 않았다. 이는 실제로 PEI-변형된 페이로드가 엔도솜을 성공적으로 탈출했음을 나타내었다. 이러한 실험을 엔도솜/리소솜 마커인 EEA1, 트랜스페린 및 칼세인을 사용하여 반복하였고, 동일한 결과가 관찰되었다(데이터 나타내지 않음). 초기 엔도솜에서도 공동-국재화가 관찰되지 않는다는 점에 유의해야 하는데, 이는 PEI-변형된 단백질의 엔도솜 탈출이 엔도솜 경로의 시작 시에 빠르게 발생한다는 것을 시사한다.
PEI-변형된 IgG와 다양한 엔도솜 및 리소솜 마커 사이에 공동-국재화가 관찰되지 않는 반면, 이들 IgG의 염색은 사실상 점상(punctate)으로 나타난다. 점상 프로파일은 일종의 소포에 내재화된 IgG가 포함되어 있음을 시사할 수 있다. PEI-변형된 단백질의 엔도솜 탈출을 추가로 확증하기 위해서, 단백질을 pH 감응성 형광 염료인 5(6)-카르복시나프토플루오레세인으로 표지하였다. 이 염료는 7 이상의 pH 값에서만 형광을 나타낸다. 초기 엔도솜의 pH는 이미 7 미만이고 엔도솜이 리소솜으로 성숙함에 따라 감소하기 때문에 엔도솜 경로의 모든 소포는 산성이다. PEI-변형된, pH-감응성의 표지된 IgG를 HeLa 세포와 함께 인큐베이션시키고, 세포를 공초점 현미경으로 분석하였다. 세포는 pH-감응성 염료의 고유한 적색 형광을 명확하게 나타내는데, 이는 PEI-변형된 단백질이 세포질과 같은 비(non)산성 구획(도 9)에 있음을 나타낸다. 이는 PEI-변형된 단백질이 엔도솜 경로를 효율적으로 탈출한다는 추가 증거이다.
마지막으로, PEI-변형된 단백질이 내재화 후 엔도솜을 효율적으로 탈출하는지 확인하기 위해 기능적 검정을 사용하였다. 이를 위해, CD3-제타 사슬로도 알려진 CD247에 대한 모노클로날 항체를 PEI로 변형하여, CD3+ 1차 세포에 내재화하였다. CD3 수용체의 세포내 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 통해 T 세포 활성화를 담당한다. 선택된 모노클로날 항-CD3 제타 사슬 항체(Sigma, Clone ZT-10, 카탈로그 번호 SAB4200446)는 CD3 제타 사슬의 ITAM 중 하나와 결합한다.
음성 대조군으로서 PEI-변형된 항-CD247 및 PEI-변형된 마우스 IgG의 내재화를 항-CD3/CD28 항체로 코팅된 비드로 사전 자극된 CD3+ 세포 내에서 수행하였다. 세포 활성화 수준의 변화에 대한 마커로서 인터페론 감마(IFNγ) 분비에 대해 배지를 모니터링하였다. 전체 항체는 구조적으로 필수적인 이황화 결합의 존재로 인해 세포질에서 안정적일 것으로 예상되지 않지만, 이 항체의 결합은 IFNγ 분비에서 최고조에 달하는 신호전달 캐스케이드를 활성화할 것이다. 따라서 소량의 초기 활성화라도 사이토카인 수준의 정량적 증가를 초래할 것이다. 따라서, 예상되는 세포질 불안정성에도 불구하고, 항체의 내재화는 관찰 가능한 IFNγ 반응을 생성할 것으로 예상된다.
CD3+ 세포에 대한 변형된 항체의 내재화를 세포내 FACS 분석에 의해 확인하였다(데이터 나타내지 않음). 항-CD247 PEI-변형된 mAb(4.5×PEI)의 내재화는 IFNγ 분비의 상승으로 측정된 바와 같이 CD3 세포의 용량 의존적 활성화를 초래하였다(도 10). PEI-변형된 마우스 IgG는 이 실험에 사용된 항체 농도 범위에서 어떠한 CD3 세포 활성화도 유발하지 않았다. 이 결과는 PEI-변형된 단백질의 엔도솜 탈출 및 표적 세포에서 생물학적 및 임상적 효과를 발휘하는 능력을 더욱 확증한다.
실시예 5: 시토졸 분산성 및 페이로드-담체 용액
PEI-변형된 단백질의 엔도솜 탈출은 기능성에 기초하여 명백히 발생하지만, 다양한 내재화된 단백질의 현미경 영상은 점상 프로파일을 나타낸다(도 2, 도 3, 도 8 및 도 9). PEI 변형은 세포막 통과 및 엔도솜 탈출에 매우 효율적이지만 동일한 변형이 PEI-변형된 단백질이 세포질에서 효율적으로 분산되는 것을 방해한다는 가설을 세웠다. 이러한 분산성 문제는 강하게 양이온화된 내재화된 단백질과 다양한 세포질 단백질(주로 세포골격 단백질, 이들의 대부분은 음으로 하전됨) 사이의 강한 정전기적 상호작용의 결과일 수 있다. 낮은 세포질 분산성은 임의의 세포내 생물학적 제제가 세포질 또는 다른 세포내 구획 또는 소기관이든 간에 세포내 표적에 도달하지 못할 수 있기 때문에 임의의 세포내 생물학적 제제의 효능에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
이러한 세포내 분산성 장애물을 극복하기 위해서, PEI로 미리 변형된 범용 담체와 치료제 사이의 링커에 이황화 결합을 혼입시켰다. 선택된 연결은 이황화 결합이 혼입된 화학적 링커였다. 이러한 불안정한 이황화 결합은 주로 글루타티온의 높은 농도로 인해서 세포질의 높은 환원 잠재력으로 인해 엔도솜 탈출 시 절단되어, 양이온화된 담체에서 치료제를 방출하고 세포의 세포질 내에서 치료제의 자유로운 이동을 가능하게 한다. 담체-페이로드 방법론의 효율성을 평가하기 위해서, GFP를 이황화 결합을 혼입한 PEG-기반 링커를 통해 PEI-양이온화 HSA에 접합시켰다. eGFP(Biorbyt, 카탈로그 번호 orb84840)를 NHS-PEG4-SPDP로 변형시켰다. PEI-변형된 HSA(11×PEI)를 또한 DTT를 사용하여 이러한 SPDP를 유리 티올로 환원시킨 후 NHS-PEG4-SPDP와 추가로 반응시켰다. SPDP-활성화 eGFP를 HSA-PEI가 없는 티올과 반응시켜 링커에 혼입된 불안정한 이황화 결합을 갖는 GFP-HSA 접합체를 생성하였다.
내재화된 PEI-변형된 GFP의 점상 프로파일(도 3)과 대조적으로, PEI-양이온화 HSA에 이황화-연결된 GFP가 세포에 내재화되었을 때 점상 없이 완전히 분산된 프로파일을 생성하였다(도 11). 내재화된 치료적 페이로드의 효율적인 분산을 확인하기 위해서, 전체 치료적 항-TNFα 모노클로날 항체(Humira®, Abbvie)를 이황화 결합을 포함하는 PEG-기반 링커를 통해 PEI-변형된 HSA에 연결하였다. GFP와 유사하게, 항체를 NHS-PEG4-SPDP로 변형시켰다. PEI-변형된 HSA(11×PEI)를 또한 DTT를 사용하여 이러한 SPDP를 유리 티올로 환원시킨 후 NHS-PEG4-SPDP와 추가로 반응시켰다. SPDP-활성화 항체를 HSA-PEI가 없는 티올과 반응시켜 링커에 혼입된 불안정한 이황화 결합을 갖는 항체-HSA 접합체를 생성하였다. 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 내재화된 모노클로날 항체는 세포질 전체에 분산되며, 이는 직접 양이온화가 세포질 내 자유 분산을 방해한다는 가설을 다시 확증하고 양이온화된 담체로부터 페이로드를 분리하는 용액의 효율성을 입증한다.
이러한 분산성은 또한 도 5f 내지 도 5g에서, 그리고 도 3과 도 11을 비교함으로써 인지할 수 있다. S-S 절단 가능한 결합을 함유하는 링커와 접합된 페이로드는 세포 전체에 더욱 균일하게 분산되었다. 그러나 이는 절단 가능한 링커가 없는 작제물이 전혀 분포하지 않았거나 기능하지 않았다는 의미는 아니다. 도 5g는 세포 내에서 절단 가능하지 않은 링커를 갖는 VHH의 분포를 명확하게 나타내며, 도 4a 내지 도 4d는 절단 가능하지 않은 링커를 갖는 접합체가 여전히 표적에 결합하여 기능할 수 있다는 것을 명확하게 나타내지만, 절단 가능한 링커를 갖는 작제물이 아폽토시스를 유도하는 데 우수하다는 점은 주목할 만하다(도 5a 및 도 5b). 따라서, 분산성이 유익하고 이것이 분산될 수 없는 표적에 도달/결합하기 어려울 수 있는 반면, 절단 가능하지 않은 링커는 여전히 완전히 기능할 수 있다.
실시예 6: 시토졸 안정성
치료제는 표적 세포의 세포질에 유입될 뿐만 아니라 생물학적 활성도 발휘해야 한다. 다른 세포내 위치(핵, ER, 미토콘드리아 등)로 운반되는 분자조차도 여전히 세포질을 통과할 것이다. 많은 생물학적 치료제는 항체 스캐폴드 또는 이의 유도체를 기반으로 한다. 종종 이러한 치료제는 특정 표적에 결합하여 해당 표적에 길항작용하거나 효능작용한다. 이들 작용제의 결합 활성은 3차 및 4차 구조에 전적으로 의존한다. 전체 IgG 또는 이의 절단된 유도체(Fab, scFv 등...)와 같은 항체 기반 분자에서, 이러한 구조는 사슬내 또는 사슬간 이황화 결합을 기반으로 하고 이에 의해 안정화된다. 그러나 상기에 언급된 바와 같이 세포질뿐만 아니라 다른 세포내 소기관 및 구획도 매우 환원적인 환경을 특징으로 한다. 주요 환원제인 글루타티온은 세포질 농도가 1 내지 11 mM 범위이다. 대조적으로, 혈장 수준은 낮은 마이크로몰 값이다. 세포질의 이러한 특징은 효율적인 세포내 치료 경로로서 이의 구조에서 이황화 결합을 활용하는 다른 생물학적 작용제뿐만 아니라 항체-기반 작용제의 사용을 방해하였다.
시험관내 실험은 글루타티온(GSH)의 세포질 수준에 대한 항체의 노출이 단 몇 시간 후에 이황화 결합의 감소를 유도한다는 것을 나타내었는데, 이는 항-경쇄 항체에 의해서 검출된 바와 같은 SDS-PAGE 웨스턴 블롯에서 다중 밴드의 출현으로 인지할 수 있다. 밤새 노출하면 아마도 3D 구조의 손실 또는 심지어는 응집 및 침강으로 인해 웨스턴 블롯에서 항체가 검출되지 않는다. 후자는 세포내 발현된 항체 및 이의 유도체의 알려진 현상이다(문헌[Kabayama, H. et al., Nature Communications 2020, (11), 336], 전문이 참조에 의해 본원에 포함된). 세포내 생물학적 작용제에 대한 이러한 임의의 효과는 생물학적 표적에 결합하고 치료 효과를 발휘하는 능력에 해로울 수 있다.
이러한 세포내 안정성 문제를 고려하여, 단일-도메인 항체를 치료적 페이로드로 선택하였다. 이러한 단일-도메인 항체는 다른 단백질과 결합할 수 있는 능력을 가진 단일-사슬 단백질-기반 분자이다. 이들의 구조는 필수 이황화-결합이 부족하여 이들을 세포질의 환원 환경에 저항성이도록 만든다. 이러한 단일-도메인 결합 단백질은 나노바디라고도 알려진 낙타과-기반 가변 중 동종이량체(VHH) 또는 상어-기반 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR)와 같은 절단된 형태의 중쇄 항체(HcAb)를 포함한다. 이러한 단일-도메인 결합 단백질의 다른 예는 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin) 및 유전자 조작된 항체 모방 단백질을 포함한다.
단일 도메인 결합 단백질, 특히 VHH는 페이로드로서 매우 적합하다. 이들의 구조적으로 필수적인 이황화-결합의 부족이 이들을 세포질 조건에서 저항성이도록 만든다. 이들은 VHH의 경우 약 15 KDa, DARPin의 경우 약 20 KDa로 매우 작으며, 이 사실이 세포질 분산성에 도움이 되는 것이다. 이들의 단일 도메인 특징은 어떠한 우발적인 세포내 가교 효과도 일으키지 않음을 나타낸다. 이들은 보다 복잡한 결합 프로파일을 가능하게 하기 위해 상이한 구조체에 2개 이상의 모이어티를 포함하도록 쉽게 조작된다. 이들은 면역원성으로 간주되지 않으며 양호한 안전성 프로파일을 갖는다. 주요 특징은 담체에 대한 부위-선택적 접합에 대한 상용성이다. 예를 들어, VHH 및 DARPin 둘 다에서, C-말단은 항원 결합 영역(CDR)에서 멀리 위치하므로, 항원-결합에 영향을 주지 않고 접합을 위해 이 부위를 활용할 수 있다. 또한, C-말단은 접합을 위해 유리 설프히드릴 기와 함께 단일 시스테인 아미노산을 포함하도록 쉽게 조작될 수 있다. 이 기는 티올-반응성 기가 있는 담체에 접합될 수 있다. C-말단 유리 설프히드릴은 담체에 직접적으로 또는 대안적으로는 링커를 통해 접합될 수 있다.
C-말단에 단일 시스테인 아미노산을 포함하는 상업적인 항-비멘틴 VHH(Q60c, QVQ)를 티올 반응성 기에 의해 추가로 변형된 PEI-변형된 HSA 담체에 접합시켰다. PEI-변형된 HSA를 2-피리딜디티오 기(NHS-PEGn-SPDP, n = 4)를 보유하는 NHS-활성화 PEG 링커에 커플링시켰다. SPDP는 VHH의 유리-티올과 쉽게 반응하여 VHH-HSA 모이어티를 생성하며, 여기서 VHH 페이로드와 HSA 담체 사이의 연결은 이황화 결합을 포함한다. 이러한 작제물의 일반적인 개략도는 도 13a에서 볼 수 있으며, 여기서 2개의 VHH를 포함하는 접합체는 이러한 접합 방법론이 담체가 하나 초과의 페이로드에 접합되는 접합체를 생성할 수 있다는 사실을 예시하기 위해서 제시된다. 담체와 페이로드 사이의 결합은 환원 조건에서 절단될 수 있으며 VHH에 대한 접합은 PEI 수준에 관계없이 유사하였다. 추가로, 모든 반응에서, 페이로드는 5 mM의 GSH로 처리한 후 효율적으로 절단되어 세포질 환원 조건을 모방하였다.
항-비멘틴-PEI-변형된 HSA 접합체의 세포 내재화 효율은 A375 세포를 접합체와 함께 인큐베이션시킬 때 배양 배지로부터 접합체가 사라지는 것에 의해서 평가하였다. VHH를 2개의 수준, 즉, HSA당 평균 3.5개의 PEI 분자 및 8개의 PEI 분자에서 PEI로 변형된 HSA에 접합하였다. PEI-변형된 IgG(도 6)에 대해 이미 인지된 바와 같이, VHH-담체 접합체는 세포에 의해 효율적으로 내재화되었고(도 14), 접합체의 거의 80%가 인큐베이션 첫 24시간 동안 내재화되었다. HSA에 접합된 VHH만을 측정하는 자체 개발 2면 ELISA를 사용하여 접합체의 수준을 측정했으며, 캡처로서 항-VHH 항체 및 검출을 위해서 항-HSA 항체를 활용하였다. 놀랍게도, 두 PEI-변형 수준 모두 매우 유사한 내재화 효율 및 동역학을 나타냈으며 8-PEI 변형에 비해 아주 약간의 이점만 존재하였다. 관찰된 수준의 감소가 분해로 인한 것이 아닌지를 확인하기 위해서 세포가 없는 세포 배지에서 이들 VHH-HSA 접합체의 수준을 평가하였다. 세포가 없는 경우 약간의 하락만 관찰되었는데(도 14), 이는 실제로 세포의 존재 하에서 VHH 수준의 극적인 감소가 VHH 내재화로 인한 것이었음을 시사한다.
엔도솜 탈출 효율뿐만 아니라 세포질 내 페이로드 VHH의 분산성을 추가로 평가하기 위해서, PEI-변형된 HSA(HSA 분자당 평균 11개의 PEI)에 접합된 항-비멘틴-VHH를 A375 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 공초점 현미경으로 세포를 분석하였다(도 15a 및 도 15b). AlexaFluor 647에 접합된 항-VHH 항체를 사용하여 완화 프로파일에서 세포 내부의 VHH의 존재를 나타내었다(도 15a). 표준 형광 표지된 항-비멘틴 항체를 사용하여 세포를 비멘틴에 대해 공동 염색하였다(도 15b). 두 영상을 주의 깊게 조사한 결과 항-VHH 염색으로 얻은 프로파일이 실제로 비멘틴 염색과 동일하다는 것이 분명하게 나타났는데, 이는 항-비멘틴 VHH가 이의 담체로부터 방출되어 세포의 세포질로 성공적으로 전달되어 이의 표적을 찾아서 결합할 수 있음을 시사한다(도 15c). 이러한 결합에 대한 추가 증거는 도 16a에서 인지할 수 있는데, 여기서 PEI-변형된 HSA에 접합된 항-비멘틴 VHH에 노출된 세포 중 하나를 클로즈업하면 항-VHH 항체 염색에 의해 시각화된 바와 같이 비멘틴 세포골격 패턴이 명확하게 나타난다. 도 16b는 담체 접합 없이 항-비멘틴 VHH에만 노출된 세포가 세포내 VHH 염색을 나타내지 않음을 나타낸다.
내재화된 항-비멘틴 VHH의 이의 비멘틴 표적(도 15a, 도 16a)에 대한 결합은 또한 VHH 작용제가 세포질 내부에서 구조적 안정성을 유지했다는 것을 입증한다. 모든 결합 생물학적 작용제의 경우에서와 같이, 표적에 결합하는 능력은 이의 구조 및 이 구조의 안정성에 결정적으로 좌우된다. 따라서 이 데이터는 본 발명의 페이로드 작용제로서 단일 도메인 결합 단백질의 선택을 뒷받침한다.
제시된 전달 시스템의 또 다른 중요한 특징은 배지 내 모든 세포가 내재화를 나타낸다는 점에서 내재화의 효율성 및 균일성이다. 이는 특히 도 15a 내지 도 15c의 영상을 포함하여 다양한 현미경 영상에서 인지할 수 있다. 문헌에 알려진 단백질의 세포내 전달에 대한 많은 시도는 세포의 일부만 단백질 내재화를 나타내는 결과를 나타내며 이는 매우 낮은 효율성을 시사한다.
실시예 7: 시험관내 기능성 PoC
세포내 전달된 생물학적 제제의 기능성의 추가 평가를 인간 유두종 바이러스(HPV)의 E7 단백질에 대한 VHH를 사용하여 수행하였다. 거의 모든 자궁경부암은 인간 유두종 바이러스(HPV) 감염과 관련이 있으며, HPV16 및 HPV18의 두 가지 유형이 사례의 70%를 차지한다. HPV의 주요 종양단백질 중 하나는 E7 단백질이다. E7은 망막모세포종 단백질(RB1)과의 상호작용을 통해 악성 표현형을 유도하고 유지한다. E7은 숙주 RB1 단백질의 기능을 방해하여 제어되지 않는 세포 증식을 자극한다. E7은 또한 HDAC1 및 HDAC2에 의해 매개되는 숙주 히스톤 탈아세틸화를 방해하여 전사 활성화를 유도할 수 있다. 이전 연구는 E7 기능의 저해가 HPV 양성 자궁경부암 세포의 성장을 저해한다는 것을 시사하였다. Li 등(문헌[Molecular Immunology, 2019, 109, 12-19])은, 단백질 자체에 대한 효율적인 세포내 전달 시스템의 부족으로 인해서 사용된 HPV 양성 세포에서 E7 단백질에 대한 VHH를 암호화하는 플라스미드의 형질주입이 E7 활성을 방해하여(E7-RB1 상호작용을 파괴하여), HPV 양성 세포의 증식을 감소시킬 수 있음을 나타내었다. 본 발명자들은 C-말단 시스테인을 첨가하여 동일한 항-E7 VHH를 발현 및 정제하고, 이를 본 발명의 세포내 담체에 접합시켰다.
HPV-양성 세포주에서 E7 저해의 세포내 효과의 크기를 확인하기 위해서, Incucyte®와 같은 라이브 세포 분석 시스템을 사용하였다. E7이 세포 주기 제어에 영향을 미치기 때문에, 형광 유비퀴틴화 기반 세포 주기 지표(FUCCI: Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)라고 불리는 특정 HPV 양성 HeLa 세포주를 사용하였다. FUCCI 리포터 시스템은 세포의 상이한 세포 주기 단계를 따르는 것을 허용한다. G1의 세포는 적색의 형광을 나타내고 S, G2 또는 M의 세포는 녹색의 형광을 나타낸다. 세포의 배지에 다양한 치료를 도입하기 전에 24시간 동안 세포를 티미딘과 동기화하였다. 세포를 절단 가능한 링커에 의해 PEI 변형된 HSA에 접합된 항-E7 VHH 및 다음 대조군으로 처리하였다: 처리 없음, 변형된 HSA, 관련 없는 VHH (항-비멘틴)에 접합된 변형된 HSA, 비변형 항-E7 VHH, 비변형 HSA에 접합된 항-E7 VHH 및 세포 주기 저해제(DP, CDK4/6 저해제). 도 17에서 인지할 수 있는 바와 같이, 모든 대조군은 세포 주기에 어떠한 영향도 미치지 않아서 미처리 세포와 유사하게 유지되는 반면, PEI-변형된 HSA(3.5 PEI)에 접합된 항-E7 VHH는 극적인 효과를 나타내어 직접 세포 주기 저해제를 사용하는 것과 유사하게 세포 주기 정지를 유발하였다. 상업적인 E7 저해제가 없기 때문에, 세포 주기 정지를 유발하는 것으로 알려진 CDK4/6 저해제인 팔보시클립 이세티오네이트(PD0332991, Sigma, 카탈로그 번호 PZ0199)를 양성 대조군으로 사용하였다. 변형된 HSA에 접합된 항-E7 VHH는 단지 다른 동역학에서만 이 저해제와 유사한 효과를 나타내었다. 또한, 도 18에서 인지할 수 있는 바와 같이, 이러한 정지는 HPV-양성 세포의 사멸로 이어졌다.
항-비멘틴과 항-E7 VHH 둘 다 세포질의 환원 환경에서 내구성을 나타내었다. 구조를 안정화하고 유지하기 위해 이황화 결합에 의존하지 않는 단일 도메인 결합 단백질의 상용성을 추가로 예시하기 위해, 본 발명자들은 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)을 결합제로 사용하였다. DARPin은 전형적으로 매우 특이적이고 높은 친화도의 표적 단백질 결합을 나타내는 유전자 조작 항체 모방 단백질이다. 이것은 자연에서 가장 일반적인 결합 단백질 클래스 중 하나인 자연 안키린 단백질로부터 유래되며, 세포 신호 전달, 조절 및 세포의 구조적 온전성과 같은 다양한 기능을 담당한다. DARPin은 몇몇의 반복 모티프로 이루어지며 분자 질량은 약 14 내지 18 KDa(킬로달톤)이다. 이것은 또한 VHH와 유사하게 구조적 온전성을 위해 이황화 결합에 의존하지 않는다는 것을 특징으로 한다.
이를 위해, K-RAS에 대한 DARPin을 선택하였다. RAS 단백질은 분자 스위치로서 신호 전달에 중요한 역할을 한다. RAS는 RAF-MEK-ERK 캐스케이드를 통한 세포 증식 및 분화, 및 PI3K 활성화를 통한 세포 생존에 관여하는 세포 형질전환에서 가장 중요한 표적이다. RAS 단백질(K-, H- 또는 N-RAS)의 돌연변이는 신호 독립적인 방식으로 세포 형질전환을 촉진하는 구성적으로 활성화된 GTP-결합 형태를 생성한다. 활성화 RAS 유전자 돌연변이는 인간 암의 30%에서 발견되며, 췌장, 결장 및 폐 선암종에서 가장 높은 빈도로 발견된다. 발암성 RAS는 종양의 조기 발병에 필수적이며 종양 생존력 유지에 필요한 것으로 나타났다. RAS 돌연변이의 가장 중심 위치는 G12D 및 G12V와 같이 글리신 12에 존재한다.
Guillard 등(전문이 참조에 의해 본원에 포함된 문헌[Guillard, S. et al. Nat. Commun. 2017, 8, 16111])은 Ras의 뉴클레오티드 교환을 저해하는 항체 모방체, DARPin K27을 생성하였다. K27은 Kd가 4 nM인 불활성 Ras GDP 형태에 우선적으로 결합하며 구조 연구는 불활성 Ras에 대한 선택성을 뒷받침한다. DARPin 암호화 벡터의 형질주입에 의한 K27의 세포내 발현은 활성 Ras의 양을 상당히 감소시키고, 하류 신호전달, 특히 인산화된 ERK의 수준을 저해하고, HCT116 세포의 연한천(soft agar)에서의 성장을 늦추는 것으로 나타났다. 이 그룹은 "...Ras가 세포 내에 존재한다는 사실로부터 장벽이 발생한다. DARPin K27은 세포에 유입되는 본질적인 능력이 없으므로 DARPin이 세포 외부에 첨가되면 Ras에 접근할 수 없다. DARPin을 세포의 세포질에 전달한다는 보고가 있었지만... 이 접근 방식을 치료적으로 실행 가능하게 하기 위해서는 효율성의 실질적인 증가가 필요하다. DARPin K27과 동일한 부위에 결합하는 소분자 저해제를 개발하는 것은 도전적일 수 있는데, 그 이유는 스캐폴드가 포켓을 한정하는 것이 아니라 넓은 표면에 걸쳐 결합하기 때문이다"라고 언급한다.
DARPin K27을 공개된 서열을 기반으로 발현시키고 평균 3.5개의 PEI 분자로 변형된 HSA 담체에 접합시켰다. 내재화 및 KRAS 결합을 공초점 현미경으로 평가하였다(도 19). K27 DARPin은 세포질에 분산되지 않고 오히려 KRAS의 주요 위치인 원형질막 내부에 국재화되었다. 흥미롭게도, 일부 세포는 내재화된 DARPin과 관련하여 점상 프로파일 및 내부 막 국재화를 모두 나타내었다. 점상은 아직 엔도솜을 탈출하지 못했거나 표적을 자유롭게 찾기 위해 담체에서 분리되지 않은 DARPin의 결과일 수 있다.
추가 시험에서, 췌장관 암종 세포(SU8686)를 HSA 담체에 접합된 항-KRAS DARPin K27과 함께 인큐베이션시켰다. 담체를 8개 또는 3.5개의 PEI 분자로 변형시켰다. 세포의 아폽토시스 상태를 전통적인 아넥신 V 검정을 사용하여 모니터링하고 Incucyte® 연속 세포 모니터링 시스템을 사용하여 시각화하였다. 절단 가능한 링커를 통해 PEI 변형된 HSA에 접합된 DARPin에 노출된 세포는 특히 높은 수준의 PEI 변형을 갖는 담체에 접합된 DARPin의 경우 아폽토시스에서 극적인 증가를 나타낸다(도 20). 이는 특히 엔도솜 탈출 과정의 강화된 내재화 및 더 빠른 동역학 때문일 가능성이 높다. 이에 반해서, 미처리 세포, 비변형 DARPin으로 처리된 세포 또는 PEI-변형된 HSA(8개 분자)로 처리된 세포 단독은 DARPin의 세포내 효과를 강조하는 기준선 수준의 아폽토시스를 나타내었다.
Guillard 등은 항-KRAS DARPin K27이 천연, 돌연변이체가 아닌 불활성 KRAS 및 주로 G12 위치에서 다양한 돌연변이를 갖는 KRAS에 결합한다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 항-KRAS DARPin K27을 HeLa 세포주의 증식 및 아폽토시스에 대한 세포내 효과에 대해 평가하였다. 이 세포주는 핵 내에서 GFP의 구성적 발현을 특징으로 하며, Incucyte®와 같은 연속 영상 모니터링 방법을 사용하여 이러한 세포를 쉽게 추적할 수 있다. 항-KRAS DARPin의 2개의 상이한 제제를 8개의 PEI 분자를 보유하는 HSA에 접합시키고, HeLa-GFP 세포에 대한 이의 효과를 다음 대조군 처리와 비교하였다: 음성 대조군으로서의 처리 없음, 양성 대조군으로서 소분자 Pan-Ras 저해제로의 처리, 비변형 DARPin으로의 처리, 비변형 HSA에 접합된 DARPin, 8개의 PEI 분자로 변형된 HSA 담체, 및 항-비멘틴 VHH, 8개의 PEI 분자로 변형된 HSA에 접합된 관련 없는 VHH로의 처리. 도 21a 및 도 21b에서 인지할 수 있는 바와 같이, 8개의 PEI 분자를 보유하는 HSA에 접합된 항-KRAS DARPin의 두 제제 모두는 HeLa-GFP 세포의 증식(도 21a) 및 아폽토시스(도 21b) 모두에 극적으로 영향을 미쳤다. 대조군 처리 중 어느 것도 이러한 매개변수에 영향을 미치지 않았다. 아폽토시스에 대한 효과는 도 22에서도 인지될 수 있는데, 여기서 PEI-변형된 HSA에 접합된 항-KRAS DARPin로 처리된 세포(아폽토시스 세포)의 적색 염색 및 세포 사멸에 따른 GFP의 손실이 명확하게 관찰된다.
실시예 8: 약동학 및 생체분포(PK 및 BD)
PEI 변형은 담체 단백질에 집중된 강한 양전하를 부여한다. 대조적으로, 혈장 성분 및 세포막은 일반적으로 음으로 하전된다. 양으로 하전된 단백질은 음으로 하전된 성분과 정전기적 결합으로 인해 "끈적끈적"한 것으로 알려져 있다. 이러한 "끈적임"은 짧은 반감기 및 생체분포 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 현상은 자연적으로 양으로 하전되고 다소 염기성인 등전점(pI)을 특징으로 하는 단백질에서 알려져 있다. PEI 변형된 단백질의 약동학 및 생체분포 프로파일은 강한 양전하에 의해 영향을 받을 수 있다. 더욱이, 이러한 부착은 투여된 양으로 하전된 단백질이 주사 부위에 "트래핑(trapping)"을 유발할 수도 있다. 이러한 효과를 피하거나 최소한 최소화하기 위해서, PEI 변형 수준의 효과를 조사하였다.
세포막을 통과하고 엔도솜 탈출을 가능하게 하는 데 여전히 효과적인 최저 수준의 PEI 변형을 확인하고 활용함으로써 본 발명의 단백질의 PK 및 생체분포가 개선될 수 있다. 이러한 변형 수준을 확인하기 위해서, 2.0, 3.6, 5.2, 6.2, 8.0 및 9.4의 평균 PEI 변형 수준을 사용하여 HSA 담체를 생산하였다. 이러한 수준은 MALDI-ToF 질량 분석법을 사용하여 생성된 변형된 HSA를 분석하여 확인하였다(도 23). 이들 담체를 항-비멘틴 VHH에 추가로 접합시켰고 이들 접합체의 내재화를 공초점 현미경을 사용하여 평가하였다(도 24). 공초점 현미경 결과에서 인지될 수 있는 바와 같이, 2.0 및 3.6개의 PEI 분자로 HSA에 접합된 VHH 조차도 세포 내부에서 뚜렷한 존재를 나타낸다. 더 높은 수준의 PEI로 변형된 담체의 사용은 세포 내부에서 명백히 더 높은 수준의 VHH를 초래하는 것으로 보이지만, 이러한 경우 내재화된 VHH의 프로파일은 더 높은 양전하로 인해서 VHH가 담체로부터 더 느리게 분리되기 때문에 더 점상이고 덜 분산된다. 3.6개 초과의 PEI/HSA로 변형된 HSA의 경우 세포 내부에서 VHH의 더 강한 염색은, 집중된 점상 프로파일로 인한 더 강한 영상화의 결과일 수 있으며 반드시 절대적인 더 높은 수준을 가리킬 필요는 없다.
공초점 현미경의 결과는 또한 특정 ELISA를 사용하여 세포 배지 내 접합체의 잔류 수준을 측정함으로써 이들 접합체의 내재화 수준과 상관관계가 있었다(도 14). PEI로 직접 변형된 IgG에서 관찰된 결과(도 6)와 달리, HSA 담체(접합된 VHH를 가짐)의 수준 및 동역학은 변형 수준에 의해 덜 영향을 받는다. 3.5개 및 8개 분자의 PEI를 사용하면 내재화가 효율적이며 그 크기 및 속도가 매우 유사하다.
이러한 결과는, 실제로 담체로서 사용될 HSA가 단 3.5개 또는 그보다 더 적은 PEI 분자로 변형될 수 있으며, 이는 순환계에서 HSA 담체의 점착성을 감소시킬 수 있음을 시사한다. PEI 변형의 이러한 감소 효과를 생체내 PK 및 생체분포 연구에서 조사한다. 2 내지 8 범위의 상이한 수준의 PEI로 변형된 HSA를 근-IR 형광 염료, 예를 들어, Vivo-Tag-750(PerkinElmer)로 추가로 표지하였다. 표지된 단백질을 Balb-C 마우스에 IV 투여하였다. 투여 후, IVIS 생체내 영상화 시스템(PerkinElmer)과 같은 라이브 영상화 시스템을 사용하여 주사된 동물을 모니터링하였다. 상이한 PEI-변형된 HSA 유도체의 분포 프로파일을 투여 후 다양한 시점에서 모니터링하였다. 동물을 다양한 시점에 희생시키고, 관류시키고, 상이한 기관을 수거하고, IVIS 시스템을 사용하여 각각의 기관의 형광 수준을 조사하였다. 종양이 이식된 동물에도 유사한 프로토콜을 사용할 수 있다.
2개의 상이한 수준(3.5 또는 8개 PEI 단위)의 PEI로 변형된 HSA의 PK 및 생체분포를 조사하였다. PEI-변형된 HSA를 B-16 흑색종 암 종양(S.C. 종양)이 있는 마우스에 주사하였다. 담체를 250 nmol/Kg의 용량으로 IV 주사하였다. 시험된 담체의 PK 및 생체분포를 항-HSA ELISA를 사용하여 평가하였다.
도 25a 및 표 2에서 인지할 수 있는 바와 같이, 8개의 PEI 변형을 갖는 담체는 강하게 양이온화된 단백질의 특징인 매우 낮은 AUC 수준 및 높은 제거율을 나타내었다. 3.5개의 PEI로 변형된 담체는 아마도 양전하가 낮기 때문에 더 높은 AUC 및 더 낮은 제거율 값으로 다소 더 양호한 PK 값을 나타내었다. 대조적으로, VHH가 이의 C-말단에서 PEI1800과 직접 접합된 경우, 혈액으로부터의 제거는 매우 빨랐다(도 25b, 표 2). 두 담체의 혈장 노출 수준은 도 25c에서 볼 수 있다. 도 25d에서 인지될 수 있는 바와 같이, 담체의 높은 제거율 및 낮은 AUC 값은 처리된 마우스의 소변에서 발견되는 매우 낮은 수준의 담체에 의해 인지될 수 있는 바와 같이 신장 제거율로 인한 것이 아니다. 이는 낮은 크기로 인한 이러한 제거를 피하기 위해 일반적으로 담체, 특히 HSA를 사용하는 주요 이유 중 하나이다.
[표 2]
Figure pct00018
실시예 9: 링커 안정성
링커의 설계 및 정확한 구조는 최종 접합체 생성물의 생체내 성능(PK 및 생체분포)에 중요하다. 링커의 초기 설계는 안정적인 아미드 결합에 의해 HSA 담체에 연결되고 이황화 결합을 통해 페이로드에 연결되는 PEG 사슬을 기반으로 하였다. 이러한 이황화 결합은 세포질의 환원 환경에서 절단되도록 설계되었다. 도 13a는 2개의 VHH에 커플링된 PEI-변형된 HSA의 초기 설계에 대한 개략적인 표현을 도시한다. 물론 VHH는 임의의 생물학적 제제로 치환될 수 있다. 이러한 설계를 항-E7 VHH 및 항-KRAS DARPin을 사용한 기능적 시험관내 연구에 사용하였다. 이러한 설계에서, PEI-변형된 HSA를 NHS-PEGn-SPDP로 추가로 변형시켰다. NHS 기는 HSA 또는 이의 PEI 변형의 1차 아미노 기와 반응하여 안정적인 아미드 결합을 생성한다. 사용된 링커는 PEG4 사슬을 포함하였다. 단일 변형에 가까운 변형 수준을 생성하도록 반응 조건을 선택하였다. 실제로, PEI-변형된 HSA의 대부분은 단일 변형을 가졌지만 일부는 2 내지 3개의 변형을 가졌다. 이들 모이어티를 이의 C-말단에 유리 시스테인을 갖는 VHH 또는 DARPin과 추가로 반응시켰다. 일부 경우에, 이러한 시스테인의 티올을 이량체 상태 또는 다른 티올 함유 분자에 대한 결합으로부터 방출시키기 위해서 TCEP와 같은 환원제를 사용한 전처리가 필요하였다. 최종 접합체는 활성 페이로드에 가까운 불안정한 이황화 결합을 갖는 것을 특징으로 한다.
이러한 초기 설계는 세포질을 모방하는 조건, 즉, 대략 10 mM의 GSH 존재 하에서 절단을 겪지만 기능적 시험관내 연구에 사용되는 세포 배양 배지에서는 안정한 것으로 나타났다.
도 13a에 도시된 구조에 따라 PEI-변형된 HSA(3.5개 및 8개 분자)에 접합되거나 단일 VHH를 갖는 항-비멘틴 VHH(QVQ, 카탈로그 번호 Q60C)를 마우스에서 PK 및 생체분포에 대해서 평가하였다. 10 mg/Kg(VHH 중량 기준)의 비변형 VHH, 비변형 HSA에 접합된 VHH 및 PEI-변형된 HSA에 접합된 VHH를 모두 마우스 꼬리 정맥에 주사하고, 주사 후 5분 및 24시간에 혈장을 채취하였다. 추가로, 생체분포를 평가하기 위해서 주사 후 24시간에 마우스로부터 다양한 조직을 수거하였다. 조직은 간, 비장, 신장, 폐, 심장 및 뇌를 포함하였다.
초기 분석은 페이로드, 즉, VHH의 검출 및 측정에 중점을 두었다. 샘플을 VHH 검출에 사용된 ELISA뿐만 아니라 온전한 담체-VHH 접합체를 측정하도록 설계된 ELISA에 의해 분석하였다. 두 방법 모두를 사용하여 주사 후 5분에 마우스 혈장을 분석한 결과 VHH 수준과 온전한 접합체 수준 사이에 양호한 상관관계가 있는 모든 군의 혈장에 VHH가 존재하는 것으로 나타났다(도 26). 이는 VHH가 이 시점에서 담체에 접합된 상태로 남아 있음을 시사한다. 주사 후 24시간에 채취한 혈장 샘플의 VHH 수준의 분석은, 이것이 변형되지 않았는지 또는 접합체의 일부인지에 관계없이 어떠한 VHH도 검출할 수 없었다. VHH에 접합되었는지에 관계없이, 담체(HSA) 수준 분석은 상당한 수준의 비변형 담체를 검출하였다(도 27). 이러한 결과는 VHH가 담체로부터 조기에 절단되었음을 시사한다. 이러한 가설은 다양한 조직에서 VHH의 ELISA(도 28) 및 면역형광 분석(도 29)의 결과에 의해 추가로 뒷받침되었다. 이러한 분석은, 분석된 상이한 기관에서 VHH의 수준 및 분포 프로파일이 담체의 PEI 수준에 관계없이 또는 VHH가 접합되지 않은 경우에도 매우 유사하다는 것을 나타내었다.
이러한 결과는 VHH 페이로드와 HSA 담체 사이의 링커가 마우스 혈장에서 충분히 안정적이지 않다는 가설을 이끌어 내었다. 따라서, 이러한 링커의 생체외 안정성 분석을 마우스, 원숭이 및 인간의 혈장에서 수행하였다. 도 13a의 일반 구조에 따른, HSA에 접합된 VHH(PEI 변형 없음)의 안정성을 마우스 혈장(Balb-C 마우스, Bioreclamation, K2EDTA, 카탈로그 번호 MSEO2PLK2YNN, 로트 번호 MSE347339), 인간 혈장(Bioreclamation, Na2EDTA, 로트 번호 HMN21123) 및 원숭이 혈청(Bioreclamation, 카탈로그 번호 CYN262432)에서 접합체와 인큐베이션시켜 분석하였다. 온전한 접합체만 측정하는 ELISA를 사용하여 접합체의 수준을 시간 경과에 따라 측정하고, PBS에서 인큐베이션시키는 경우 접합체 수준에 대해서 표준화하였다. 도 30에서 인지할 수 있는 바와 같이, 접합체는 실제로 마우스 혈장에서는 불안정하였고 원숭이 혈청에서는 그 정도가 덜하였다. 시간 경과에 따른 인간 혈장에서의 접합체 수준 감소가 마우스 혈장에서만큼 가파르지는 않았지만, 인간 혈장에서의 안정성 또한 효율적인 생체분포에 이상적이지 않다. 접합체의 안정성을 또한 세포의 세포질 내 GSH 수준을 모방하여 10 mM GSH 용액에서 평가하였다. 예상된 바와 같이 그리고 설계된 바와 같이, VHH를 담체에 접합시키는 이황화 결합은 GSH의 존재 하에서 불안정하며 실제로 모든 접합체는 5시간 이내에 절단되었다.
페이로드 VHH가 혈장에서 조기에 절단되었음을 이해하고, 수집된 다양한 기관에서 담체 자체의 수준을 분석하였다. HSA 단백질에만 관련된 ELISA를 사용하여 주사된 동물로부터의 뇌, 심장, 비장, 폐, 꼬리 및 간 추출물을 분석하였다. 비변형 HSA와 HSA-PEI×3.5 둘 다는 모든 기관에서 매우 낮은 수준으로 검출되었다(도 31). 그러나 HSA-PEI×8은 폐 및 꼬리(주사 부위)를 제외한 모든 기관에서 매우 높은 수준으로 검출되었다. 이러한 ELISA 결과는 항-HSA-FITC 항체로 염색된 비장 냉동절편에서 높은 수준의 HSA-PEI×8 단백질을 나타내는 면역형광 결과에 의해 확증되었다(도 32c). PEI 변형된 HSA는 비장에서 높은 수준으로 발견되었지만, 비변형 HSA는 훨씬 낮은 수준에서 관찰되었으며(도 32b), 실제로는 비변형 VHH 주사 후 관찰된 배경 신호와 유사한 수준이었다(도 32a). ELISA와 면역형광 둘 다의 결과는 안정적으로 접합되는 경우 PEI 변형이 실제로 IV 주사 후 상이한 기관의 세포에 담체 및 이의 카고(cargo)를 전달할 수 있음을 나타낸다.
실시예 10: 새로운 접합체 및 링커
이러한 결과에 기초하여, 접합체를 재설계하였다(도 33). 이 설계는 하나의 페이로드 단백질이 하나의 HSA 담체에 접합된 접합체를 생성하는 것을 목표로 한다. 담체에 대한 링커 접합을 위해 NHS-활성화 에스테르를 활용하는 이전 방법론은 이 요구 사항과 호환되지 않기 때문에, 대신에 HSA 단백질의 위치 34의 시스테인 아미노산을 활용하였다. 이는 HSA에 존재하는 유일한 유리 티올이므로 이 위치에 페이로드를 접합하면 일대일 접합을 생성한다.
도 34에서 인지할 수 있는 바와 같이, 비오틴이 Cys34에서 직접 이황화 결합을 통해 HSA에 연결된 비오틴-PEG-HSA 접합체는 마우스 혈장 및 인간 혈장 모두에서 매우 안정적이다.
그러나, 과도하게 보호된 절단 부위는 세포질 절단이 세포질 내 페이로드 분산에 유익하기 때문에 작동 불가능할 것이다. 따라서, 비오틴-PEG-HSA 접합체의 안정성을 글루타티온(10 mM)의 존재를 특징으로 하는 세포질-유사 조건에서 평가하였다. 놀랍게도, 비오틴-PEG-HSA는 이러한 조건 하에서 고도로 절단 가능하며, 심지어 t=0으로 지칭되는 초기 측정 지점에서도 접합체의 약 50%가 절단되는데(도 35), 이는 아마도 GSH 용액에의 접합체 첨가와, 분석 전의 이의 샘플링 및 동결 사이의 수 분 이내에 절단된다. 6시간까지, 접합체 대부분이 절단되는데, 이는 Cys34 이황화 결합이 혈장에서는 안정적이지만 세포질 환경에서 발견되는 것과 같은 환원성 절단에 매우 민감하여, 본 발명의 접합체에 사용하기에 이상적이라는 것을 시사한다.
따라서, 이황화 결합(예를 들어, 링커와 Cys34 사이) 또는 클릭 화학(예를 들어, 마이클 첨가 또는 아지드-DBCO 고리첨가)를 통한 페이로드-담체 접합을 활용하여 다양한 페이로드-담체 접합체(C1-C2, 표 1 참조)를 설계하고 제조하였다(도 13b 내지 도 13d 및 도 36).
상기에 언급된 바와 같이, 활성 도메인을 또한 방해하지 않을 부위-선택적인 방식으로 담체에 페이로드를 접합시키기 위해서, 바람직한 방법론은 바람직하게는 페이로드의 C-말단에서 단일 유리 시스테인에 대한 접합을 사용하는 것을 포함한다. 링커에 대한 담체 및 페이로드 둘 다의 접합은 유리 티올을 통해 이루어지기 때문에, 이것은 양 말단에 2개의 티올 반응성 기를 가져야 하는데, 하나는 불안정한 Cys34 이황화 결합을 생성하기 위한 SPDP 기반이고 다른 하나는 VHH 페이로드 근처에서 안정적인 결합을 유도하는 티올 반응성 기 기반이다. Cys34 티올과 제2 부위의 반응을 피하기 위해서, 일반적으로 Cys34와 반응하지 않고 페이로드 유리 티올과 반응하기 전에 탈보호 및/또는 활성화가 필요한 보호된 기를 사용한다.
제시된 링커에 대해 추가적인 최적화를 평가하였다. 이러한 최적화 중 하나는 Cys34에 입체적으로 보호된 이황화 결합을 포함하는 링커의 사용을 포함한다. 이는 활성화된 티올의 알파 위치에 있는 탄소가 1개 또는 2개의 알킬 기, 바람직하게는 메틸 기로 치환된 링커를 사용하여 달성된다.
그럼에도 불구하고, 페이로드 결합을 위해 유리 티올 상의 보호기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 티올 보호 기는 SATA라고도 알려진 S-아세틸 기이다.
그 다음, 탈보호된 티올은 추가로 활성화되어 HSA의 Cys34의 유리 티올과 효율적인 반응을 가능하게 한다. 이러한 활성화는 탈보호된 유리 티올을 2,2'-디피리딜디설파이드(알드리티올)와 반응시켜 SPDP 활성화 티올을 생성함으로써 달성될 수 있으며, 이는 이미 HSA의 Cys34와 효율적으로 반응하는 것으로 나타났다. 예시적인 접합 반응식을 도 36에 제시한다. 추가적인 예시적인 합성 경로를 하기 표 3에 제시한다.
[표 3]
Figure pct00019
Figure pct00020
한 설계에서, HSA-PEG4-디-메틸(dm)-S-S-VHH(S1)를 제조하였다(참고로, HSA에 대한 접합이 선택적이지 않아서 하나 초과의 변형이 일어날 수 있기 때문에 HSA와 VHH 사이의 몰비는 1 초과일 수 있음). 이를 위해, HSA를 NHS-PEG4-dm-SPDP로 변형시킨다. NHS 기를 HSA의 1차 아미노 기와 반응시켜 안정적인 아미드 결합을 생성한다. 사용된 링커는 PEG4 사슬을 포함하였다. 변형된 HSA 상의 dm-SPDP와 C-말단에 유리 시스테인이 있는 VHH의 이러한 반응은 낮은 반응 수율을 초래하였다. 반응 수율을 개선시키기 위해서, HSA 상의 dm-SPDP 모이어티를 dm-SPDP-NO2로 전환시켜 훨씬 더 활성화된 기를 생성하였다. 이를 위해, NHS-PEG4-SPDP로 변형된 HSA를 TCEP로 환원시켜 PEG4-dm-SH 모이어티를 갖는 HSA를 얻었고, 후자를 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)으로 추가로 활성화시켜 PEG4-dm-SPDP-NO2 모이어티로 변형된 목적하는 HSA를 제공하였다. 이들 모이어티를 이의 C-말단에 유리 시스테인을 갖는 VHH 또는 DARPin과 추가로 반응시켰다. 일부 경우에, 이러한 시스테인의 티올을 이량체 상태 또는 다른 티올 함유 분자에 대한 결합으로부터 방출시키기 위해서 TCEP와 같은 환원제를 사용한 전처리가 필요하였다.
또 다른 다른 설계인 HSA-S-S-α-메틸-PEG11-트리아졸-PEG4-VHH (S2)을 제조하였다. 이를 위해, HSA를 N3-PEG11-α-메틸-SPDP-NO2로 변형시켜, 시스테인 34에서 모노 PEG 변형을 제공하였다. 동시에, VHH를 MAL-PEG4-DBCO로 변형시켜 VHH C 말단 시스테인에서 변형된 모노 PEG를 제공하였다. 2개의 단백질을 클릭 반응에 의해서 접합시켜 목적하는 HSA-S-S-α-메틸-PEG11-트리아졸-PEG4-VHH 작제물을 제공하였다.
펩티드-기반 링커
이 설계에서, VHH 페이로드를 C-말단 단부에 추가적인 펩티드 링커를 사용하여 발현시켰다. 본 발명자들은 위치 34에서 HSA 시스테인 상에 불안정한 이황화 결합을 갖는 펩티드-기반 링커(S3A-B)를 사용하여 다양한 접합체를 합성하였다. 약술하자면, G4S-기반 펩티드로 C-말단에 발현되고 시스테인으로 종결된 VHH를 SPDP 또는 니트로-SPDP에 의해 활성화시켜 HSA의 C34 티올 기와 반응시켰다. S3A-B를 표 1에 개략적으로 제시한다.
S-S 결합의 안정성을 증가시키기 위해서, 본 발명자들은 각각 다음 서열에서와 같이, C 말단 시스테인 상의 α 또는 β 위치에 있는 입체 장애형 아미노산인 류신을 첨가하였다; GGGGSGGGGSGGGGLC(서열번호 4)("pep1"로 명명) 또는 GGGGSGGGGSGGGLGC(서열번호 5)("pep2"로 명명). 이러한 접합체는 알드리티올 또는 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)을 사용하여 C 말단 시스테인에서 VHH 활성시킨 후 HSA에 접합시켜 제조하였다. 일부 경우에, 이러한 시스테인의 티올을 이량체 상태 또는 다른 티올 함유 분자에 대한 결합으로부터 방출시키기 위해서 TCEP와 같은 환원제를 사용한 C 말단 VHH의 전처리가 필요하였다.
펩티드에서 류신 아미노산이 이러한 펩티드 링커의 안정성에 기여하는지 여부를 이해하기 위해서, VHH αE7-(G4S)3-C의 추가 작제물을 발현시키고 HSA에 접합시켜, 추가적인 펩티드 링커-기반 접합체인 VHH αE7-(G4S)3-C-HSA(S3C)를 생성하였다.
실시예 11: 생물학적 절단 가능한(가역적) 링커 및 생물학적 절단 불가능한(비가역적) 링커(S1 내지 S3C)의 안정성
S1 접합체는 활성 페이로드에 가까운 불안정한 이황화 결합을 갖는 것을 특징으로 한다. 다음 배지에서의 시험관내 연구: PBS/인간 혈장/마우스 혈장 및 GSH(10 mM)(도 37a)는 이 접합체가 PBS에서 안정적이라는 것을 나타내었다. 인간 혈장에서 접합체 농도는 96시간 후에도 감소하지 않았다. GSH(10 mM)에서 접합체 농도는 예상된 바와 같이 시간 경과에 따라 급격히 감소하였으며 마우스 혈장에서는 접합체 농도의 일부 감소가 관찰되었다(도 37a). 시간 경과에 따른 이러한 농도 감소는 비가역적 링커의 유사한 거동(도 37b) 및 생체내 PK 결과(도 38a 및 도 38b 참조)에 비추어 이황화 결합의 화학적 분해가 아니라 흡착과 같은 물리적 과정의 결과일 가능성이 높다.
S2의 시험관내 안정성 분석은 접합체가 PBS/마우스 혈장 및 인간 혈장에서 매우 안정적이라는 것을 나타내었다. 다른 HSA 접합체와는 달리, 이 링커는 또한 GSH(10 mM) 조건 하에서 더 안정적이었으며 별도의 VHH 및 HSA로의 환원은 사용된 다른 링커만큼 빠르지 않았다. 4시간 후에도 대부분의 접합체는 여전히 HSA-VHH 접합된 형태(80% 초과)인 반면, 24시간 후에는 샘플의 20%만 HSA-VHH 형태로 검출되었으며 환원 과정은 시간이 경과에 따라 계속되었다(도 37c). 이러한 결과는 시험된 다른 모든 접합체와 비교하여 이 접합체에 대해 우수한 안정성을 나타낸 PK 결과와 상관관계가 있다(도 38a 및 도 38b 참조).
펩티드-기반 링커의 시험관내 안정성을 또한 연구하였다. 결과는 이러한 접합체가 PBS/인간 혈장 및 마우스 혈장에서 안정적이라는 것을 나타내었는데, 그 이유는 임의의 조건에서 96시간 인큐베이션 동안 접합체 농도의 감소가 관찰되지 않았기 때문이다. GSH(10 mM)에서 접합체의 농도는 예상된 바와 같이 시간 경과에 따라 빠르게 감소하였다(도 37d 내지 도 37f). 마우스 혈장 내 접합체의 안정성을 비가역적 접합체(VHH 항 E7-HSA)와 추가로 비교하여, 새로운 작제물(S3A-B)이 마우스 혈장에서 비가역적 작제물만큼 안정적이라는 것을 보여주었다(도 37f).
HSA의 C34 시스테인에 불안정한 이황화 결합을 갖는 접합체 C1 및 C2를 생체내 PK 연구에서 평가하여 마우스 혈장에서 이의 실제 안정성을 결정하였다(도 38a). 다음 표 4는 상이한 링커를 갖는 상이한 접합체의 동역학적 매개변수 및 HSA 단독 및 비가역적 접합체(VHH αE7-PEG11-HSA, S4)와의 비교를 요약한다. 예상된 바와 같이, 이들 둘은 반감기 및 AUC를 포함하여 매우 유사한 PK 프로파일 및 매개변수를 갖는다. 접합체 C1 및 C2는 HSA 및 비가역적 접합체보다 낮은 반감기를 가졌지만, 이황화 결합의 안정성에 상응하는 반감기는 HSA의 C34 공동에 의해 제공되는 바와 같이, 이황화 결합이 페이로드의 C-말단에 존재하고 어떠한 장애 또는 자연적 보호도 없는 초기 작제물과 비교할 때 극적으로 개선되었다. 후자의 경우, 이 접합체는 수 분 및 수 시간 이내에 감소되었으며 주사 후 24시간에서 원래 주사된 용량의 매우 적은 양이 이들 동물의 혈액에서 검출될 수 있었다. 이는 실제로 C34의 이황화 결합 위치가 혈장에서 환원제로부터 보호를 제공한다는 것을 추가로 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00021
실제 마우스 혈장 조건 하에서 상이한 새로운 링커, 장애형 PEG 및 펩티드 링커의 안정성을 추가로 평가하기 위해서, 다음 접합체를 사용하여 PK 연구를 수행하였다: (1) S3A; (2) S3B; (3) VHH S2; (4) S1; (5) HSA. 도 38b 및 하기 표에서 인지할 수 있는 바와 같이, S3A 및 S3B의 펩티드 링커뿐만 아니라 S1의 디메틸 장애형 PEG 링커는 매우 유사한 PK 프로파일 및 PK 매개변수를 제공하였다. 모든 이들 링커는 이전 PK 연구에 사용된 더 단순한 PEG 링커에 대해 얻은 값보다 더 높은 반감기 값을 제공하였는데(도 38a), 이는 이들 링커가 불안정한 이황화 결합의 더 양호한 혈장 안정성을 제공한다는 것을 시사한다. 메틸 기(S2)로 인해 추가로 방해받은 C34 상의 이황화 결합은 더 높은 반감기 및 심지어는 HSA의 반감기에 훨씬 더 가깝다는 사실에서 입증되는 바와 같이 훨씬 더 양호한 안정성 프로파일을 제공하였다. 안정성의 이러한 개선은 다른 PK 매개변수, 특히 제거율 및 AUC에서도 분명하다(하기 표 5 참조).
[표 5]
Figure pct00022
새로운 링커(S1, S2, S3A-B)를 갖는 접합체의 혈장 반감기는 HSA의 반감기보다 약간 낮다. HSA와 비교하여 혈장 접합체 농도의 감소가 실제로 링커 절단의 결과인지 결정하기 위해서, 추가 ELISA를 수행하였다. 이 ELISA에서 4개의 새로운 접합체의 혈장 내 농도를 항 HSA ELISA(링커가 절단된 경우에도 HSA의 양을 정량화함)에 의해 평가하였다. HSA에 의한 접합체의 농도를 2면 ELISA(HSA 형태에 결합된 VHH αE7만 정량화함)에 의한 접합체 농도와 비교하였다. HSA의 PK 프로파일과 비교하여 ELISA 방법으로 측정한 S3A의 PK 프로파일을 도 38c에 나타내었다. HSA ELISA에 의한 S3A의 정량화는 HSA 단독에 대해 관찰된 것과 매우 유사한 접합체 농도를 제공하였다. 이 결과는 HSA와 비교할 때 S3A 농도의 감소가 실제로 링커 절단의 결과임을 나타낸다. 상이한 링커를 갖는 다른 접합체에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다(데이터는 나타내지 않음).
이황화 결합 근처의 류신 아미노산 위치만 다른 펩티드 링커를 갖는 2개의 작제물(VHH αE7-G4S-G4S-G4L-C(서열번호 4), S3A 및 VHH αE7-G4S-G4S-GGGLG-C(서열번호 5), S3B)을 시험관내 및 생체내 안정성에 대해서 평가하였다. 2개의 접합체는 시험관내 및 생체내 (PK) 안정성 모두 서로 유사하고 또한 절단 불가능한 링커를 갖는 접합체(S4)와 유사함을 나타내었다. 새로운 작제물인 VHH αE7-(G4S)3-C-HSA (S3C) 안정성을 S3A와 비교하여 인간 혈장 및 10 mM GSH에서 시험관내에서 시험하였다. 도 39에서 인지할 수 있는 바와 같이, 두 작제물 모두 인간 혈장 및 글루타티온 용액 둘 다에서 매우 유사한 안정성 프로파일을 나타내는데, 이는 류신 아미노산이 접합체의 안정성에 크게 기여하지 않음을 시사한다. 10 mM GSH에서 류신 함유 링커는 다소 더 양호하게 생존한 것이 주목되었는데, 그 이유는 이 접합체의 초기 수준의 약 8%가 24시간 후에도 여전히 검출될 수 있었던 반면, 류신이 없는 접합체의 잔류 수준은 이 시점에서 검출될 수 없었기 때문이었다. 류신-함유 링커를 갖는 접합체는 48시간(대략 1%) 후에도 검출될 수 있다.
이는 류신이 안정성 측면에서 일부 이점을 제공하며 이러한 기여를 확인하기 위해서는 추가 시험이 필요할 수 있음을 시사한다. 임의의 경우에, 본 발명자들은 담체와 함께 이황화 결합에 가까운 류신을 함유하는 링커를 계속 사용할 것이다.
HSA에 연결된 VHH αE7의 4개 접합체(S1 내지 S3B) 모두를 상이한 링커 및 화학물질을 사용하여 VHH αE7을 HSA-PEI×3.5에 접합시킴으로써 PEI로 추가 변형시켰고, 이들의 흡수 능력을 공초점 현미경으로 확인하였다. Hela GFP 세포를 시딩하고, 시험된 샘플을 세포와 함께 16시간 동안 인큐베이션시킨 후, 고정 및 면역염색 과정 후 공초점 현미경으로 흡수 수준을 평가하였다. 도 40a 내지 도 40f에서 인지될 수 있는 바와 같이, 미처리 세포(도 40a)는 VHH의 존재를 나타내지 않은 반면, 새로운 링커(S1-PEI-S3B-PEI)를 통해 HSA-PEI×3.5에 접합된 VHH로 처리한 경우 세포 내부에서 VHH의 명확한 존재를 나타내었다(도 40b 내지 도 40f).
링커 길이(상이한 길이의 펩티드 링커, (G4S)n, n=0, 1, 2, 3)
상이한 VHH 및 DARPin 작용제를 G4S 단위를 기반으로 하는 가요성 펩티드 및 그 다음 말단 시스테인 아미노산과 함께 발현시켰다. 펩티드 링커의 길이는 n=0, 1, 2, 3인 (G4S)n 단위의 수에 의해 결정되었다. 단백질을 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)으로 활성화시키고, HSA에 접합시켰다.
n=1인 경우, 본 발명자들은 상이한 단백질에 대해 상이한 접합 반응 수율을 관찰하였다. VHH αE7-G4S-1C는 담체에 대한 효율적인 접합 반응을 초래하였고, K27 항-KRAS DARPin은 중간 수준의 반응 수율을 제공한 반면, HSA/HSA-PEI에 대한 VHH 항-BRAF의 접합에서는 접합 생성물이 관찰되지 않았다. 링커의 일부 확장을 초래하는 비스-MAL-PEGn의 사용을 요구하는 비가역적 접합의 경우, VHH 항-BRAF-G4S-C 작제물을 사용하여 VHH 항-BRAF-G4S-C-HSA-PEI(S5A)를 성공적으로 생성할 수 있다는 것을 주목해야 한다.
VHH 항-BRAF(1C5)는 상이한 펩티드 링커 길이로 발현되었다(하기 표 6에 제시됨). 상이한 링커 길이를 갖는 상이한 1C5 작제물을 TCEP로 처리하고, 생성된 C-말단 시스테인의 유리 티올을 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)으로 활성시킨 후 담체인 HSA-PEI에 접합시켰다. C 말단에서 류신-시스테인으로 끝나는 모든 활성화된 1C5 접합체는 펩티드 링커 길이(n=0, 1, 2, 3)에 관계없이 HSA-PEI×4.5에 대한 효율적인 접합을 나타내었다. 이러한 결과는 접합 생성물을 생성하는 데 실패한 1C5-G4S-C(류신 없음)와 HSA-PEI×4.5의 접합 반응으로부터 얻은 결과에 비추어 놀라운 것이다.
상이한 페이로드 작제물의 접합 반응의 수율을 SDS 겔에 의해서 평가하였고, 그 결과를 하기 표 6에 요약한다.
[표 6]
Figure pct00023
특정 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 본 발명의 페이로드에 대한 단백질 담체의 공유 부착을 위해 펩티드 링커가 구현되는 경우 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 8개의 아미노산을 포함하는 링커를 갖는 것이 유리할 수 있다고 가정된다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 페이로드에 대한 단백질 담체의 효율적인 접합에 필요한 링커 길이는 페이로드의 특정 크기 및/또는 서열에 따라 달라질 수 있다.
입체 장애형 아미노산이 있거나 없는 상이한 길이의 펩티드 링커
하기 C 말단 서열을 갖는 VHH 항 BRAF(1C5)를 발현시켰다:
작제물 1: 항 BRAF (1C5)-G4S-C(서열번호 9)(1C5)
작제물 2: 항 BRAF (1C5)-GGGGSGGGGSGGGGLC(서열번호 4) (1C5-flex-pep-LC)
작제물 3: 항 BRAF (1C5)-AAASAEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSGLC(서열번호 10)(1C5-Hel20-LC)
작제물 2는 항-E7 VHH(S3A)를 갖는 펩티드 링커를 갖는 상기에 기재된 작제물과 유사하다. 작제물 3은 본질적으로 VHH 페이로드와 담체의 상호작용을 피하거나 최소화하는 것으로 추정되는 강성 링커로 간주되는 알파-나선형 링커를 갖는다. 1C5 VHH는 가요성 G4S-기반 링커를 사용하여 HSA-PEI에 접합된 경우 단백질-A 기반 수지에 대한 친화력을 잃어버리는 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 특정 정전기 상호작용으로 인한 것이다. 강성 링커는 실제로 단백질-A 수지와의 이러한 상호작용을 회복시켰는데, 이는 강성 링커가 담체와의 이러한 상호작용을 감소시키고 노출된 VHH를 유지함을 시사한다. 강성 링커는 또한 담체 접합에 사용되는 말단 시스테인 근처의 류신으로 종결된다.
작제물 1(1C5)을 비가역적 PEG 링커(비스 MAL-PEG11)를 사용하여 HSA-PEI×3.5에 접합시켜 1C5-HSA-PEI×3.5(S5A)를 생성하였다. 작제물 2(1C5-flex-pep-LC) 및 3(1C5-Hel20-LC) 둘 모두를 HSA-PEI×3.5에 접합시켜 가역적 접합체 각각 1C5-flex-pep-LC-HSA-PEI×3.5(S5B) 및 1C5-Hel20-LC-HSA-PEI×3.5(S5C)를 제공하였다. 1C5-flex-pep-LC-HSA-PEI×3.5(S5B)는 마우스 혈장에서 양호한 안정성을 나타낸 E7-pep1-LC-HSA(S3A)와 유사한 작제물이다(생체내 도 38b 및 시험관내 도 37f). S5C는 강성 펩티드 링커를 통한 항 BRAF VHH의 작제물이다. 이 작제물을 시험관내 안정성에 대해 시험하였고(도 41), 마우스 혈장 조건 하에서 양호한 안정성을 나타내었다.
실시예 12: PEI 변형
담체 단백질에 매우 강하고 농축된 양전하를 부여하는 PEI 변형은 세포막의 통과를 유도하는 세포막에 대한 담체의 초기 접착을 담당한다. 그 다음 동일한 PEI 변형은 엔도솜 경로로부터 PEI-변형된 담체 및 이의 페이로드의 효율적인 탈출을 담당한다. 본원에는 상이한 수준의 PEI에 의해 변형된 다양한 캐리어가 제시되어 있다. 구체적으로 담체로서의 HSA에 대해서, 본 발명자들은 주로 두 가지 변형 수준, 즉, HSA 분자당 3.5 내지 4.5개 범위의 PEI 분자의 낮은 수준 및 7.5 내지 9.5개 범위의 더 높은 수준에 초점을 맞춘 내재화, 기능적 및 생체내 결과를 설명하였다. 이전에 본 발명자들은 두 PEI 범위, 즉, 높은 범위와 낮은 범위 모두 세포에서 내재화 및 엔도솜 탈출뿐만 아니라 기능성을 효율적으로 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 두 범위 모두 대등한 PK 및 생체분포 프로파일을 갖지만 더 낮은 범위가 더 우수하였다. 본 발명자들은 특히 세포 내에서 페이로드-담체 접합체의 기능성에 대한 더 낮은 수준의 PEI의 효과가 무엇인지 확립하고자 하였다.
강성 펩티드 링커인 1C5-Hel20-LC를 갖는 항-BRAF VHH를 n=4.5, 3, 2, 1로 HSA-PEI×n(S5C)에 접합시켰다. 상기에 기재된 바와 같이, PEI의 수준은 PEI 변형 반응에 사용되는 시약의 수준 및 비율에 의해 제어되며 최종 수준은 MALDI-ToF 질량 분석법에 의해서 변형 생성물의 이의 원래 질량에 대해서 분석함으로써 결정된다. 보고된 PEI 수준은 HSA에 첨가된 PEI 분자의 평균 수를 나타냄을 주목하고 강조해야 한다. 각각의 반응에서 HSA 단백질에 대한 PEI 변형 수준을 질량 분석법으로 평가하고, 상이한 담체를 제타 전위에 대해서 특징규명하였다(표 7).
Zeta Sizer Ultra(Malvern Instruments)를 사용하여 제타 전위 측정을 수행하였고, 샘플 완충액을 1 mg/mL 단백질 농도의 1 mM NaCl로 교환하였다. 각각의 샘플 20 μL를 제타 셀(DTS1070)에 로딩하고 각각의 샘플에 대해 5회 반복 측정하여 mV 단위의 평균 제타 전위를 얻었다.
[표 7]
Figure pct00024
1C5-Hel20-LC를 환원시키고 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)으로 활성화시킨 후 HSA-PEI×n로 접합시켜 1C5-Hel20-LC-HSA-PEI(S5C)×n 접합체를 제조하였다. 상이한 작제물에 의한 세포내 BRAF 저해를 A375 세포에서 기능적 검정에 의해서 평가하였다. 아폽토시스 세포를 확인하기 위해 IncuCyte®에서 형광을 모니터링하면서, 상이한 접합체를 아넥신 V 적색 시약의 존재 하에서 A375 세포와 함께 6일 동안 인큐베이션시켰다(도 42a, 도 42c). 이 6일의 종료 시, 시험된 웰 각각에서 살아있는 세포의 양을 평가하기 위해서 CellTiter-Glo 검정을 수행하였다. 6일 후, 아폽토시스 수준을 나타내는 동일한 시점의 적색 영역을 시험된 각각의 웰에서 살아있는 세포 양에 대해 정규화할 수 있다. 이러한 정규화된 값을 사용하여 상이한 시험된 작용제를 비교하였다(도 42b, 도 42d).
직접적인 아폽토시스 평가(도 42a, 도 42c)를 보면, 두 농도 수준 모두에서, S5C-PEI×4.5는 세포내 BRAF의 상당한 저해를 제공하였고 처리된 세포에서 높은 아폽토시스 신호를 유도하였다. 그러나, 아폽토시스 신호가 세포 수에 대해서 정규화되는 경우 PEI 수준에 비해 용량 의존성이 있음이 분명하다(도 42b, 도 42d). S5C-PEI×3 또한 감소하였지만 활성을 나타냈고, PEI×2 및 PEI×1 조차도 특히 3 μM 농도에서 제한된 효과를 나타내었다. 전체적으로, 활성 수준은 PEI 수준과 양호하게 상응하였다.
이러한 결과에서 인지할 수 있는 바와 같이, PEI 수준은 세포내 활성을 얻는 데 중요하며 HSA의 경우 담체가 2개 초과의 PEI 분자에 의해 변형되는 경우 상당한 활성이 달성될 수 있고 담체가 3개 초과의 PEI 분자에 의해서 변형되는 경우 훨씬 더 양호한 활성이 얻어지는 것으로 보인다.
또한, 도 5a에 나타난 바와 같이, 접합체 S5D(실시예 1에 언급됨)는 확실한 아폽토시스 신호로 이어지는 효율적인 BRAF 저해를 나타내었다. 따라서, 생물학적 절단 가능한 결합이 있거나 없는 접합체가 본원에 기재된 바와 같이 페이로드의 효율적인 세포 전달 및 기능을 위해 활용될 수 있다고 가정된다.
실시예 13: 추가 담체
상이한 분자량을 갖는 4개의 상이한 단백질을 담체로서 작용하는 능력에 대해 평가하였다: K27 DARPin(20 KDa; 문헌[Guillard, S. et al. Nat. Commun. 8, 16111 doi: 10.1038/ncomms16111 (2017)]), GFP(30 KDa; biorbyt, 카탈로그 번호 orb84840), IgG(150 KDa; 모노클로날 항체, 마우스 항 염소/양, Clone GT-34, Sigma) 및 피브리노겐(300 KDa; Sigma, 카탈로그 번호 341578). 후자의 2개의 단백질은 혈액에 내인성인 단백질이며, 본 발명의 주요 담체로 사용되는 HSA와 유사하다. 이를 위해, PEI를 사용하여 상이한 단백질을 변형시켰다. EDC 및 PEI의 존재 하에서 MES 완충액 pH 5에서 변형을 수행하였다. PEI 변형된 단백질을 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 과량의 시약으로부터 정제하였다. 변형 수준을 질량 분석법으로 평가하였고, 변형된 담체를 제타 전위에 대해 추가로 평가하였다. 표 8에서 인지할 수 있는 바와 같이 각각의 잠재적 담체에 대한 PEI 변형 수준을 최적화 및 제어할 수 있지만, 더 큰 담체 단백질, 즉, IgG 및 피브리노겐은 접근 가능한 PEI-변형 부위가 더 많기 때문에 더 쉽게 변형된다. 이에 반해서, DARPin과 같은 더 작은 담체는 잠재적인 변형 부위가 더 적고 이들 부위가 더 밀집해있기 때문에 더 낮은 수준의 PEI에 의해 변형된다. GFP는 비교적 낮게 변형되었지만, 이의 크기는 미래에는 훨씬 고도하게 변형될 수 있음을 시사할 것이다.
[표 8]
Figure pct00025
PEI로 변형된 후 각각의 담체 단백질의 전하 변화를 제타 전위로 측정하였다(표 9). 바람직한 담체인, 4.5 또는 8 PEI 변형을 갖는 HSA를 또한 비교를 위해 제시한다.
[표 9]
Figure pct00026
상이한 담체를 세포 내로 내재화하는 능력에 대해 시험하였다. PEI 변형된 담체를 A375 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션시키고, 세포 내에서의 이들의 존재를 항 HSA-PEI 항체(HSA-PEI로 동물을 면역시킨 후 자체 생산하였고 HSA-PEI뿐만 아니라 다른 PEI-변형된 단백질을 선택적으로 식별하는 것으로 나타남)를 사용하여 공초점 현미경에 의해서 평가하였다.
이러한 대안적인 담체에서 접합 핫-스팟을 찾으려는 시도가 수행되지 않았기 때문에, 이들을 페이로드에 접합시키기 위해서 PEI로 변형된 상이한 단백질을 NHS-PEG4-SPDP로 활성화시킨 후 VHH 항-E7의 C 말단 시스테인과 접합 반응시켜서, 상기에 기재된 대안적인 PEI-변형된 담체에 접합된 VHH 항-E7을 제공하였다. 항-E7 VHH 페이로드를 세포질의 환원 환경에 민감한 가역적 이황화 결합을 사용하여 접합시켰다. 세포 내로 페이로드를 전달하는 상이한 담체의 능력을, 접합체를 A375 세포와 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 항 VHH 항체를 사용한 면역형광 염색을 통해 평가하였다.
도 43a 내지 도 43l에서 인지될 수 있는 바와 같이, 모든 대안적인 담체는 그들의 VHH 카고를 A375 세포에 성공적으로 전달하였다. 또한 상기에 논의된 바와 같이, 더 높은 수준의 PEI 변형을 갖는 담체, 즉 IgG, 피브리노겐 및 HSA는 더 많은 VHH를 전달할 수 있었다. 본원에서 담체가 가역적 링커를 통해 접합되었기 때문에 VHH는 세포질에서 방출되고 세포질에는 사용된 특정 VHH에 대한 표적이 없기 때문에 VHH는 세포질 전체에 확산되어 담체 검출과 달리 검출이 더 어려워지는데(도 44), 이는 이미 논의된 세포질 단백질과의 정전기적 상호작용으로 인해 점상 프로파일로 나타나는 현상으로 인해 더욱 강력해진다. 이러한 이유로 인해서, 낮은 수준의 PEI를 사용하여 더 낮은 수준의 VHH를 전달하도록 관리된 DARPin 담체에 의해서 전달되는 VHH를 관찰하는 것이 다소 어렵다.
이들 결과는 다른 인간 혈액 내인성 단백질을 포함한 다른 단백질이 세포내 담체로서 역할을 할 수 있다는 것을 명확하게 나타내지만, 상기에 나타난 바와 같이 혈액 내 높은 존재비, 낮은 면역원성, 또한 유리한 PK 프로파일의 원인이 되는 유리한 물리화학적 특성 및 상기에 제시된 바와 같이 세포 내부에 페이로드를 방출하기 위해 가역적 결합이 첨가되는 경우 접합체에 대한 높은 부위 선택성 및 향상된 안정성을 제공할 수 있는 C34에서의 고유한 접합 부위로 인해서 HSA를 본 발명의 접합체의 단백질 담체로 사용하는 것이 유익할 수 있다.
실시예 14: 기능적 검정
3개의 작제물인 S5A 내지 C를 다양한 세포주인 Hela-GFP, B16, Renca 및 A375에서 세포내 BRAF를 저해하고 세포 사멸을 유도하는 기능적 능력에 대해 시험하였다. 양성 대조군으로서 PLX 4032, 베무라페닙을 함께 시험하였다. 음성 대조군으로서, 관련되지 않은 VHH인 2A1을 비가역적 PEG 링커를 사용하여 HSA-PEI×3.5에 접합시켰다. 세포 사멸을 실험 전반에 걸쳐 모니터링하였고(도 45a), 실험 종료 시점(140시간)에 세포 역가로 정량화하였다(도 45b).
도 45a 및 도 45b에서 인지될 수 있는 바와 같이, 새로운 펩티드 링커를 통해 접합된 항-BRAF VHH는 세포에서 높은 활성을 나타내었는데, 이는 이들 링커가 효과적으로 세포에 유입되어 세포내 표적에 대해서 이의 페이로드를 방출하는 접합체의 생성과 양립할 수 있음을 시사한다. HSA-PEI×3.5(S5A)에 비가역적으로 접합된 항-BRAF VHH(1C5)는 또한 가역적으로 접합된 작제물보다 낮은 수준이기는 하지만 세포에 아폽토시스를 일으켰고 그 효과는 가역적으로 접합된 작제물보다 늦은 시점에 시작되었다.
본 발명은 이의 구체적인 실시형태와 함께 기재되어 있지만, 많은 대안, 변경 및 변형이 당업자에게 명백할 것임이 자명하다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범주 내에 있는 그러한 모든 대체, 변경 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Biond Biologics Ltd. <120> INTRACELLULAR DELIVERY COMPOSITIONS <130> BDB-P-013-PCT <150> 63/177,144 <151> 2021-04-20 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe 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Pro Ala Glu Thr 405 410 415 Glu Tyr Asp Ser Leu Tyr Pro Glu Asp Asp Leu 420 425

Claims (72)

  1. 단백질 접합체로서,
    a. 복수의 폴리에틸렌이민(PEI) 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체;
    b. 세포내 표적과 상호작용하는 페이로드; 및
    c. 공유 결합을 통해서 상기 단백질 담체 및 상기 페이로드에 결합된 링커를 포함하며;
    상기 페이로드는, 절단되는 경우 상기 세포내 표적과의 상호작용을 감소시키는 이황화 결합이 없고, 상기 단백질 접합체는 융합 단백질이 아닌, 단백질 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PEI는 2000 달톤 미만의 분자량을 갖는 선형 PEI 또는 분지형 PEI인, 단백질 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 복수의 PEI 모이어티는 3 내지 90개의 분자를 포함하는, 단백질 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드는 상기 세포내 표적에 결합하는 항원 결합 분자인, 단백질 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 가변 중 동종이량체(VHH: variable heavy homodimer), 나노바디, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR), 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin) 및 항체 모방 단백질로부터 선택되는, 단백질 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 VHH 및 DARPin으로부터 선택되는, 단백질 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체는 혈장 내인성 단백질인, 단백질 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단백질 담체는 적어도 60 KDa 크기인, 단백질 접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체는 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, IgG, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)로부터 선택되는, 단백질 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단백질 담체는 HSA인, 단백질 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질 담체는 HSA이고, 상기 단백질 담체는 3 내지 10개의 PEI 분자를 포함하는, 단백질 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 생체적합성 중합체를 포함하는, 단백질 접합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는, 단백질 접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 생물학적-절단 가능한 결합(bio-cleavable bond)을 포함하는, 단백질 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 생물학적-절단 가능한 결합은 이황화 결합을 포함하는, 단백질 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 적어도 24시간 동안 혈액에서 실질적으로 안정적인, 단백질 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 안정적이라는 것은 24시간 후에 혈액에서 25% 미만의 절단을 포함하는, 단백질 접합체.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 절단 가능한 결합은 입체 장애형인, 단백질 접합체.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HSA는 시스테인 34(C34)를 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함하는, 단백질 접합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 링커는 이황화 결합을 통해서 상기 HSA에 결합된, 단백질 접합체.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 링커는 상기 HSA의 C34에 결합된, 단백질 접합체.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 이황화 결합은 상기 C34에 근접한, 단백질 접합체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 근접한은 상기 C34로부터 5 내지 15 옹스트롬 범위의 거리인, 단백질 접합체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 펩티드 링커인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 4 내지 15로부터 선택되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체는 DNA가 없는, 단백질 접합체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 페이로드는 세포 표면 단백질에 결합하지 않는, 단백질 접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PEI 모이어티에 공유 결합된 상기 단백질 담체는 적어도 8 mV의 양의(positive) 제타 전위를 특징으로 하는, 단백질 접합체.
  29. 단백질 접합체로서,
    a. 복수의 폴리에틸렌이민(PEI) 모이어티에 공유 결합되고 적어도 8 mV의 양의 제타 전위를 특징으로 하는 HSA;
    b. 단일 도메인 항체; 및
    c. 공유 결합을 통해서 상기 HSA 및 상기 단일 도메인 항체에 결합된 링커를 포함하며;
    융합 단백질이 아닌, 단백질 접합체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 HSA는 3 내지 10개의 PEI 분자를 포함하는, 단백질 접합체.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 링커는 생체적합성 중합체를 포함하는, 단백질 접합체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 단백질 접합체.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 생물학적-절단 가능한 결합을 포함하는, 단백질 접합체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 생물학적-절단 가능한 결합은 이황화 결합을 포함하는, 단백질 접합체.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 적어도 24시간 동안 혈액에서 실질적으로 안정적인, 단백질 접합체.
  36. 제35항에 있어서, 안정적이라는 것은 24시간 후에 혈액에서 25% 미만의 절단을 포함하는, 단백질 접합체.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 절단 가능한 결합은 입체 장애형인, 단백질 접합체.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HSA는 시스테인 34(C34)를 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체를 포함하는, 단백질 접합체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 링커는 이황화 결합을 통해서 상기 HSA에 결합된, 단백질 접합체.
  40. 제39항에 있어서, 상기 링커는 HSA의 상기 C34에 결합된, 단백질 접합체.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 링커는 펩티드 링커인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 4 내지 45로부터 선택되는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 태그를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 태그는 상기 생물학적 페이로드에 접합되는, 단백질 접합체.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액-안정성 접합체인, 단백질 접합체.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포-침투성 접합체인, 단백질 접합체.
  46. 세포내 표적에 결합할 수 있는 단백질 접합체의 생산 방법으로서,
    a. 상기 세포내 표적에 결합하고, 절단되는 경우 상기 세포내 표적에 대한 결합을 감소시키는 이황화 결합이 없는 페이로드를 제공하는 것;
    b. 복수의 PEI 모이어티에 공유 결합된 단백질 담체를 제공하는 것;
    c. 상기 선택된 페이로드를 링커를 통해서 상기 선택된 단백질 담체에 공유 연결시켜 단백질 접합체를 생산하는 것;
    d. 인간 혈액, 혈장 또는 혈청에서 상기 링커의 안정성을 결정하는 것; 및
    e. 상기 인간 혈액, 혈장 또는 혈청에서 안정적인 링커를 포함하는 단백질 접합체를 선택하는 것을 포함하며;
    이에 의해서 세포내 표적에 결합할 수 있는 단백질 접합체를 생산하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 결정하는 것은 상기 단백질 접합체의 형성 이전에 또는 상기 단백질 접합체의 형성 이후에 수행되는, 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 세포내 표적에 대한 상기 생물학적 페이로드의 결합을 확인하는 것을 포함하는, 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PEI 모이어티에 결합된 상기 단백질 담체는 적어도 8 mV의 양의 제타 전위를 특징으로 하는, 방법.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체는 HSA를 포함하는, 방법.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 담체는 적어도 3개의 PEI 분자에 공유 결합된, 방법.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 단백질 접합체를 세포에 접촉시키는 것, 및 상기 생물학적 페이로드가 상기 세포의 세포질에 유입되는지를 확인하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 안정적이라는 것은 24시간 후에 혈액에서 25% 미만의 절단을 포함하고, 불안정적이라는 것은 24시간 후에 상기 세포질 조건에서 적어도 50%의 절단을 포함하는, 방법.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 생체적합성 중합체를 포함하는, 방법.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공유 연결은 클릭 반응을 통해서 일어나는, 방법.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드는 제1 반응성 기를 포함하는 링커에 공유 결합되고; 상기 단백질 담체는 상기 제1 반응성 기에 대해 반응성을 갖는 제2 반응성 기를 포함하는 링커에 공유 결합되는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 공유 연결은 상기 제1 반응성 기와 상기 제2 반응성 기의 반응을 통해서 일어나며, 이에 의해서 상기 페이로드와 상기 단백질 담체를 공유 연결하는, 방법.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 생물학적-절단 가능한 결합을 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 공유 연결은 이황화 결합 형성을 포함하는, 방법.
  60. 제58항에 있어서, (i) 상기 페이로드는 상기 단백질 담체의 시스테인과 이황화 결합을 생성할 수 있는 링커에 공유 결합되거나; (ii) 상기 단백질 담체는 상기 페이로드의 시스테인과 이황화 결합을 생성할 수 있는 링커와 공유 결합되고, 결합은 선택적으로 이황화 결합을 통해서 일어나는, 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 조건에서 상기 링커의 안정성을 결정하는 것, 및 상기 세포질 조건에서 불안정적인 링커를 포함하는 단백질 접합체를 선택하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  62. 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된, 단백질 접합체.
  63. 제1항 내지 제45항 및 제62항 중 어느 한 항의 단백질 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 아주반트를 포함하는, 약학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 전신 투여용으로 제형화된 약학적 조성물.
  65. 세포내 표적에 결합하는 방법으로서, 상기 세포내 표적을 발현하는 세포를 제1항 내지 제45항 및 제62항 중 어느 한 항의 단백질 접합체 또는 제63항 또는 제64항의 약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 생물학적 페이로드는 상기 세포내 표적에 결합하며, 이에 의해서 상기 세포내 표적에 결합하는, 방법.
  66. 세포내 표적에 결합하는 방법으로서,
    a. 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 상기 세포내 표적에 결합할 수 있는 단백질 접합체를 생산하는 것; 및
    b. 상기 세포내 표적을 발현하는 세포를 상기 생산된 단백질 접합체와 접촉시키는 것을 포함하며;
    이에 의해서 상기 세포내 표적에 결합하는, 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 방법은 세포내 표적을 검출하는 방법이고, 상기 단백질 접합체는 검출 가능한 태그를 포함하고, 상기 방법은 상기 검출 가능한 태그를 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포내 표적을 조절하는 방법이고, 상기 페이로드는 상기 세포내 표적의 효능제 또는 길항제인, 방법.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 대상체에 존재하고, 상기 접촉시키는 것은 상기 단백질 접합체를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 방법은 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법이고, 상기 병태는 상기 세포내 표적의 조절에 의해서 치료될 수 있는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 병태는 암이고, 상기 세포내 표적은 발암성이고, 상기 생물학적 페이로드는 길항제인, 방법.
  72. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 것은, 상기 단백질 접합체가 상기 세포로 침투하는 것을 유도하도록 설계된 상기 담체 단백질 이외의 작용제의 존재 하에서 일어나지 않는, 방법.
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