KR20240001933A - 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 펩타이드는 큰물벼룩(Daphnia magna) 단위무성생식 알에 대해서 높은 결합능을 가지며, 분자량이 낮아 기능화가 쉽고, 제조공정이 다소 간단한 장점을 가지고 있다. 또한, 독성환경이 최소화 된 조건에서의 표적 특이적 결합능력을 갖춘 바이오 신소재로써, 생태독성 평가용 바이오마커로 응용될 수 있으며 표적 물질의 검출 및 진단 기술 개발은 물론 다양한 in vivo에서의 리간드 혹은 항체 발굴 등에 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 큰물벼룩(Daphnia magna) 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 포함하는 큰물벼룩 부화 억제용 조성물에 관한 것이다.
물벼룩은 담수 생태계에 서식하는 대표적 수서 무척추동물로 조류(algae)를 섭취하는 1차 소비자임과 동시에 어류의 피식자로서 먹이사슬에서 매우 중요한 역할을 하므로 화학물질의 생태독성평가에 빈번하게 사용되는 생물종이다. 현재 경제협력개발기구(OECD), 국제표준화기구(ISO) 등 국제기관에서는 큰물벼룩(Daphnia magna)을 표준시험종으로 추천하고 있으며, 우리나라 환경부의 ‘수질 및 수생태계 보전에 관한 법률 시행규칙’에 근거하여 수질오염물질의 배출허용기준7)과 폐수종말처리시설의 방류수 수질기준에서 생태독성을 평가하도록 기준이 마련되어 있는데, 이 때 수질오염공정시험기준에 따라 큰물벼룩(Daphnia magna)을 독성시험에 사용하도록 제시하고 있다.
큰물벼룩(Daphnia magna)는 이지목 (anomopoda) 엽각아강 (phyllopoda)에 속하는 동물성 플랑크톤으로써, 수명은 대략 50일~60일 가량이며 어른 물벼룩은 보통 참깨 정도의 크기이며 최대 5㎜까지 자란다. 또한, 박테리아, 조류 및 어류(알) 등의 다른 생물에 비해 생애주기가 짧아 번식이 쉽고, 독성에 대한 민감도가 높으며 실험이 간단하고 비용이 저렴하여 전 세계적으로 사용되는 생태독성 시험종이다.
큰물벼룩은 환경상태에 따라 단위무성생식과 수정생식을 진행하는데, 환경상태의 이상을 감지할 경우에만 수정생식을 진행하고, 독성환경이 없을 경우, 즉 환경상태에 이상이 감지되지 않을 경우 단위무성생식을 진행하므로 이를 활용한 독성 환경 판단이 가능하다.
현재까지 생화학적 및 분자 수준에서 유독물질의 작용 기전을 연구한 예시가 몇 있고, 독성과 관련된 주요 유전자인 엑디손 수용체 (ecdysone receptor; EcR)를 동정하여 바이오마커로써의 응용 가능성을 보여준 연구가 있다 (Yasuhiko K. et al., 2007). 이러한 유전자들은 넓은 범위의 독성물질에 의해 활성화되고, 그 크기 역시 약 200-400mer로 큰 단백질이어서 대량 생산이 쉽지 않고, 시간에 따른 안정성 등의 문제가 존재한다.
따라서, 본 발명자들은 물벼룩의 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 작은 크기의 펩타이드를 phage display를 이용하여 스크리닝하였으며, 동일 표적을 live cell과 열변형한 dead cell로 구분하여, live cell에만 특이적으로 결합하는 펩타이드를 발굴하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 큰물벼룩(Daphnia magna) 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 큰물벼룩(Daphnia magna) 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 암호화하는 폴리펩타이드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 큰물벼룩(Daphnia magna) 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 큰물벼룩 부화 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 큰물벼룩(Daphnia magna) 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 큰물벼룩을 포함하는 생태독성 평가용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 큰물벼룩(Daphnia magna) 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이어서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 큰물벼룩 부화 억제용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 펩타이드 및 큰물벼룩을 포함하는 생태독성 평가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 큰물벼룩(Daphnia magna) 단위무성생식 알에 대해서 높은 결합능을 가지며, 분자량이 낮아 기능화가 쉽고, 제조공정이 다소 간단한 장점을 가지고 있다. 또한, 독성환경이 최소화 된 조건에서의 표적 특이적 결합능력을 갖춘 바이오 신소재로써, 생태독성 평가용 바이오마커로 응용될 수 있으며 표적 물질의 검출 및 진단 기술 개발은 물론 다양한 in vivo에서의 리간드 혹은 항체 발굴 등에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, phage display library를 이용한 펩타이드 선별 과정을 간단히 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 대조군 및 큰물벼룩 단위무성생식 알(dead cell 및 live cell)에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드의 서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 큰물벼룩 단위무성생식 알에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드 처리에 따른 큰물벼룩 부화율 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 대조군 및 큰물벼룩 단위무성생식 알(dead cell 및 live cell)에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드의 서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 큰물벼룩 단위무성생식 알에 대해 특이적으로 결합하는 펩타이드 처리에 따른 큰물벼룩 부화율 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 큰물벼룩(Daphnia magna) 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 용어 “큰물벼룩(Daphnia magna)”은 짧은 생활사를 가지고 있으며, 번식력이 좋고, 담수 먹이연쇄에서 중요한 위치를 차지하고 있는 동물성 플랑크톤 집단을 대표한다. 또한 크기가 작아 취급하기 편리하고 실내사육도 용이할 뿐만 아니라, 다른 무척추동물에 비해 화학물질에 대한 독성 민감도가 높기 때문에 생태독성 시험에 적합하여 많이 이용된다.
또한, 상기 펩타이드는 살아있는 세포(live cell)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 알은 큰물벼룩의 단위무성생식(parthenogenesis)에 의해 생산된 알인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "아미노산"이란 자연적으로 펩타이드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 상기 펩타이드는 D-아미노산을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 한편, 본 명세서 내에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 약어로 기재하였다.
본 발명에서 용어, “펩타이드”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 말한다.
또한, 상기 펩타이드는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 등 번역 후 변형(post-translational modification)에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩타이드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
상기 실질적으로 동일한 펩타이드란 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 in vivo 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 예컨대 직접 합성하거나 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다. 본 발명에서는 바람직하게 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis) 방법을 이용하여 펩타이드를 합성하였으나, 전술한 바와 같이 펩타이드 합성 방법 및 조건이 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산서열로 표시되는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기 서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
이어서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 큰물벼룩 번식 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 큰물벼룩 번식 억제용 조성물은 상술한 펩타이드를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 펩타이드와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 상기 조성물은 큰물벼룩 단위무성생식 알의 부화율을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 본 발명은 상기 펩타이드 및 큰물벼룩을 포함하는 생태독성 평가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 생태독성 평가용 조성물은 상술한 펩타이드를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 펩타이드와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 상기 생태독성은 수질 독성(또는 수서 독성)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 생태독성은 당업자에게 알려진 일반적인 방법으로 평가될 수 있으며, 바람직하게는 Daphnia magna Reproduction Test (OECD TG 211)를 통해 평가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “Daphnia magna Reproduction Test”는 화학 물질이 Daphnia magna Straus의 생식 능력에 미치는 영향을 평가하는 OECD 검증 시험으로 큰물벼룩을 21일동안 시험물질에 노출하여 생식능력에 미치는 영향을 파악하여 NOEC, LOEC 또는 EC50를 산출하여 생태독성을 평가할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 큰물벼룩(
Daphnia magna
)의 배양
큰물벼룩(Daphnia magna)은 ㈜에버그린탑을 통해 구입하였다. 큰물벼룩(Daphnia magna)을 20 ± 1 ℃, 800 lux 및 16:8 명암 주기의 조건 하에서 1.8 L의 배양 배지에 배양하여 준비하였다. 이 때 배양 배지는 ‘수질오염공정시험기준 생물분야 ES 04704.1. 물벼룩을 이용한 급성 독성 시험법’에 기반하여 제조하였으며, 이는 0.12 g/L MgSO4, 0.192 g/L NaHCO3, 0.008 g/L KCl, 0.2465 g/L CaSO4·7H2O를 증류수에 첨가하여 준비하였다. 해당 배양 배지는 pH 8.2 ± 0.2로 조절하고, 사용 전에 최소 24시간 공기를 통하게 하여 완성하였다. 배양 배지는 2일마다 새로운 배양 배지로 교체해주었으며, 교체 간격에 맞춰 ㈜에버그린탑에서 구입한 ECOGREEN-C (ETF-C, 식물성 플랑크톤, Chlorella vulgaris)와 ECOGREEN-Y (ETF-Y, 복합사료, YCT)를 먹이로 제공해주었다. 배양 과정에서 큰물벼룩의 수는 2 L의 유리 배양기에 30-50개의 개체수를 유지하였다.
<실시예 2> 큰물벼룩 단위무성생식 알의 분리 및 준비
큰물벼룩 단위무성생식 알의 분리에 있어 2주령의 큰물벼룩 성체를 준비하였다. 실험에 있어 모든 단위무성생식 알은 동일 유리 배양기의 동일 주령의 성체에서 분리하였다. 일회용 10 ml serological pipette과 Pasteur pipette을 이용하여 큰물벼룩 성체를 배양 배지가 5 mL 채워진 petri dish(SPL, Korea, Cat#10035)에 옮겼다. Petri dish 외부 주변은 얼음을 채워 외부 온도에 의한 영향을 최소화하였다. Stereo microscope에서 microdissection forceps를 이용하여 큰물벼룩 성체의 abdomen을 갈라 carapace에 위치한 단위무성생식 알을 깨지지 않게 주의하며 분리해냈다. 분리된 단위무성생식 알은 Pasteur pipette을 이용하여 배지가 충분히 채워진 petri dish(SPL, Korea, Cat#10060)에 옮겼다. Petri dish는 외부 주변에 얼음을 채워 외부 온도에 의한 영향을 최소화하였다. 자연 상태의 자연스러운 항원을 제시하고자 단위무성생식 알을 pipette을 이용하여 배양 배지 5 ml로 5회, 3차 증류수 5 ml로 5회 세척해주어 준비하였다.
<실시예 3> Phage display를 이용한 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 선별
phage display를 이용하여 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하였으며, 선별과정은 다음과 같다(도 1 참조). 먼저 대조군으로 사용될 1.7 ml 마이크로센트리퓨즈 튜브를 배양 배지 1 ml로 3번, 3차 증류수 1ml로 3번 세척해주었다. 또 다른 마이크로센트리퓨즈 튜브 역시 동일한 세척 과정을 거친 후, 실시예 2에서 분리 및 준비된 큰물벼룩 단위무성생식 알을 음성대조군으로 사용하고자 마이크로센트리퓨즈 튜브에 3차 증류수 1 ml, 큰물벼룩의 단위무성생식 알을 20알을 넣고 heat block을 이용하여 100 ℃에서 10분간 끓여주었다. 표적 물질인 큰물벼룩 단위무성생식 알은 동일한 세척 과정을 거친 마이크로센트리퓨즈 튜브에 1 ml의 3차 증류수와 함께 20알을 넣어주었다. Phage library를 최종 농도 109 PFU/ml (Plaque forming units/ml)로 전체 반응 부피를 1.5 ml 제작하였다. 각 표적 물질에 1.1 ml의 phage library를 상온에서 45 분간 반응시켰다. 각각의 표적들과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하고, 결합이 약하거나 결합하지 않은 펩타이드를 제거하기 위하여 상층액과 큰물벼룩 단위무성생식 알들을 petri dish에 옮겨 TBST 1 ml로 총 5회 세척하여 제거하였다. Elution buffer(0.2 M Glycine-HCl, pH2.2) 1 ml씩 각 petri dish에 넣어 15 분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 10 ㎕ tip을 이용하여 단위무성생식 알들을 잘 짖이겨 용출과정을 수행하였고, 분리된 특이적 펩타이드를 포함한 phage library를 포함하는 반응액을 회수하여 1 M Tris-HCl(pH 9.1) buffer를 150 ㎕를 넣어 중화시켜주었다. 분리된 library phage 500 ㎕를 Kit의 phage 감염을 위한 재조합 및 구성되어 있는 E. coli ER2738에 접종시켜 20 ml의 LB배양액에 혼합하여 37 ℃에서 4.5 시간동안 배양하여 증폭시켜주었다. 반응액을 4 ℃에서 12,000 g로 원심분리하여 상층액의 80%를 회수하여 20% PEG/2.5 M NaCl을 혼합하여 4 ℃에서 15 시간 동안 반응시켜 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage를 침전시킨 뒤, 4 ℃에서 12,000 g로 원심분리하여 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage만을 침전시켜 회수하였다. 이후, 일련의 phage display library 결합 과정은 총 4회까지 진행하였으며, phage display library 라운드가 진행될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적 물질인 큰물벼룩 단위생식 무성알과 대조군들의 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 펩타이드를 얻고자 하였다.
<실시예 4> 선별된 library phage 내의 전체 DNA 추출
특이적 펩타이드 선별을 위하여 1, 2, 3, 4 라운드 각각에 해당되는 library phage를 20개 회수하였으며, 회수한 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage 내에서 phage DNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다.
E. coli ER2738을 하룻밤 동안 배양 한 후, 1 ml의 LB 배양액에 1:100의 비율로 접종한 뒤 37 ℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 14,000 rpm으로 1 분간 원심분리하여 숙주인 E. coli를 제거해준 뒤 phage가 포함된 상층액 500 ㎕와 20% PEG/2.5 M NaCl buffer 200 ㎕와 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 반응액을 14,000 rpm으로 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 phage만을 분리하였다. 원심분리를 통해 얻은 phage는 ethanol을 이용하여 외막 단백질을 제거하고 순수한 phage DNA만을 획득하는 세척 과정을 수행하였다. 획득한 DNA에 Iodide buffer 100 ㎕를 첨가하여 혼합해주고 200 ㎕ ethanol을 첨가해 15분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응액을 14,000 rpm으로 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 500 ㎕ 70% ethanol로 펩타이드를 세척해준 다음, 한 번 더 원심분리하여 상층액을 완전히 제거해 준 뒤, 37 ℃에서 5 분간 건조시켜 ethanol을 완전히 휘발시켰다. 이후 정제된 DNA에 30㎕ TE buffer를 혼합해주었다.
<실시예 5> 선별된 library phage의 펩타이드를 구성하는 유전자 DNA 증폭 및 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 확인
실시예 4에서 얻어진 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 library phage의 DNA를 증폭하여 phage 말단을 구성하는 펩타이드 부분을 분석하기 위하여, 프라이머(primer) 한 쌍을 바이오니아(Bioneer, Korea)로부터 합성하였다(표 1). 상기의 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 DNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭하였으며, 반응 조성은 주형 DNA 1㎕, 10 X PCR 완충용액 5 ㎕, dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 pM 역방향 프라이머 1 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.2 ㎕ (1 unit/㎕)와 37.8 ㎕의 증류수로 구성하였다. 주형 DNA의 증폭을 위한 반응 조건은 95 ℃에서 5 분간 변성시키고, 95 ℃에서 30 초, 53.5 ℃에서 30 초, 그리고 72 ℃에서 1 분 30 초간 반응을 34주기 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 0.7% 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 증폭 산물을 확인 한 뒤, PCR 정제 키트 (GeneAll, Korea)를 이용하여 정제하여 증류수 30 ㎕에 회수하였다.
| 프라이머 서열 (5‘ -> 3’) | |
| Phage-F | CCG ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT |
| Phage-R | CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG |
상기 유전자들은 모두 GeneAll PCR DNA purification kit로 정제한 후 사용하였다.
<실시예 6> 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열 분석
다프니아 마그나 단위생식 무성 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 찾기 위하여 실시예 3과 4를 통해 획득한 특이적 결합력을 보이는 펩타이드를 가지는 phage의 DNA를 선별 및 추출하여 실시예 5에서 증폭 회수한 DNA로 서열 분석 (Bioneer, Korea)을 수행하였다.
도 2는 큰물벼룩 무성단위생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 서열 분석을 나타낸 도이다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 서열 분석을 각 표적물질(대조군, dead cell(음성대조군) 및 live cell)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로하는 펩타이드를 확인하였으며, 라운드간 반복되는 서열들은 따로 색상을 통해 표시하였다 (도 2 참조). 구체적으로 큰물벼룩 단위무성생식 알(live cell)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드(서열번호 1 및 서열번호 2), 대조군 펩타이드(서열번호 3) 및 열변형된 큰물벼룩 단위무성생식 알(dead cell)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드(서열번호 4)를 확인하였다.
<실시예 7> 선별된 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 처리에 따른 단위무성생식 알 부화 여부 확인
실시예 2에서와 동일하게 분리된 큰물벼룩 단위무성생식 알은 8알씩 50 ml의 플라스틱 배양기에 분주하였다. 각 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 상기 실시예 6에서 선별된 4종의 펩타이드(서열번호 1 내지 4)로부터 최종 처리에 필요한 농도를 확인한 후, 3 mg/L의 농도로 희석하여 처리였다. 각각의 펩타이드가 처리된 큰물벼룩 단위무성생식 알은 20 ± 1 ℃, 800 lux 및 16:8 명암 주기의 조건 하에서 배양하였다. 이 때 배양 배지는 3차 증류수로 최종 부피는 50 ml로 설정하였다. 알의 부화 여부는 48 시간에서 96 시간 내에 확인할 수 있으며, 최대 1주 안에 부화한다. 96 시간 이후 부화한 단위무성생식 알의 개수와 부화하지 못 한 단위무성생식 알의 개수를 파악하며 평균 부화율을 계산하였다 (도 3 참조).
그 결과, SPSSAYPRHGPDGGG 펩타이드(서열번호 1), LYALPLSHLKSHGGG 펩타이드(서열번호 2)는 큰물벼룩(Daphnia magna) 단위무성생식에 의해 생성된 알의 live cell에만 부착하여 큰물벼룩의 부화율을 현저히 낮추는 것을 확인하였다.
<실시예 8> 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 처리 후 부화한 큰물벼룩의 reproduction 능력 확인
상기 실시예 7에서 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 처리 후 부화한 큰물벼룩의 embryo들을 15마리씩 50 ml의 플라스틱 배양기에 배양하였다. 이 때 배양 배지는 실시예 1과 동일한 배양 배지를 사용하며, 2일마다 새로운 배양 배지로 교체해주었으며, 교체 간격에 맞춰 ㈜에버그린탑에서 구입한 ECOGREEN-C (ETF-C, 식물성 플랑크톤, Chlorella vulgaris)와 ECOGREEN-Y (ETF-Y, 복합사료, YCT)를 먹이로 제공해주었다. 펩타이드가 처리된 큰물벼룩 단위무성생식 알에서 부화한 embryo들은 20 ± 1 ℃, 800 lux 및 16:8 명암 주기의 조건 하에서 배양하였다. 이 때 배양 배지의 최종 부피는 50 ml로 설정하였다. 큰물벼룩의 reprodution 능력은 4주에서 5주 내에 확인할 수 있으며, 최대 8주 안에 reproductive (multi-generational) toxicity를 확인할 수 있다. Chronic life-cycle test는 큰물벼룩 성체의 reproduction에 대한 독성 화학물질의 영향을 산출하는 것을 목적으로 하는 실험으로, 이 독성 물질들은 모체에 대한 치명적인 영향을 주지 않고, egg production과 hence fecundity에 영향을 주는 것을 주요 효과로 한다. 본 발명에서 얻어진 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드(서열번호 1 및 서열번호 2)들의 주요 독성 효과는 brood chamber 내에서 egg production 및 전체적인 growth retardation에 영향을 주는 것으로 확인되었다(도 4).
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION JEONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Peptides that specifically bind to Daphnia magna parthenogenesis
eggs and their useof
<130> P-2022-072
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Daphnia magna egg specific peptide(live cell)
<400> 1
Ser Pro Ser Ser Ala Tyr Pro Arg His Gly Pro Asp Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Daphnia magna egg specific peptide(live cell)
<400> 2
Leu Tyr Ala Leu Pro Leu Ser His Leu Lys Ser His Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> microcentrifuge tube specific peptide
<400> 3
Ser Leu Asn Thr Thr Trp Val Ser Pro Met Met Lys Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Boiled Daphnia magna egg specific peptide(dead cell)
<400> 4
Thr Pro Pro Ser Ser Asn Ser Tyr Asp Trp Leu Val Ala Gly Gly
1 5 10 15
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phage primer-F
<400> 5
ccgattcctt tagtggtacc tttctat 27
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phage primer-R
<400> 6
ccctcatagt tagcgtaacg 20
Claims (8)
- 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는, 큰물벼룩(Daphnia magna) 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 살아있는 세포(live cell)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 알은 단위무성생식(parthenogenesis) 알인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
- 제1항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 펩타이드를 포함하는 큰물벼룩 번식 억제용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 조성물은 큰물벼룩 단위무성생식 알의 부화율을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 큰물벼룩 번식 억제용 조성물.
- 제1항의 펩타이드 및 큰물벼룩을 포함하는, 생태독성 평가용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 펩타이드는 생태독성 시험종인 큰물벼룩의 단위무성생식(parthenogenesis) 알에 특이적으로 결합하여 생태독성을 평가하는 것인, 생태독성 평가용 조성물.
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| KR1020220078858A KR20240001933A (ko) | 2022-06-28 | 2022-06-28 | 큰물벼룩 단위무성생식 알에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 |
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|---|---|---|---|---|
| KR101923213B1 (ko) | 2017-12-07 | 2018-11-28 | 한국화학연구원 | 아세트아미노펜 노출에 대응하는 다프니아 마그나 유전자 및 이를 이용한 생태계 환경오염 진단방법 |
-
2022
- 2022-06-28 KR KR1020220078858A patent/KR20240001933A/ko unknown
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR101923213B1 (ko) | 2017-12-07 | 2018-11-28 | 한국화학연구원 | 아세트아미노펜 노출에 대응하는 다프니아 마그나 유전자 및 이를 이용한 생태계 환경오염 진단방법 |
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