KR20230174058A - 미세 채널을 포함하는 마이크로 유체칩 및 이를 이용한 나노 입자의 제조방법 - Google Patents

미세 채널을 포함하는 마이크로 유체칩 및 이를 이용한 나노 입자의 제조방법 Download PDF

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KR20230174058A
KR20230174058A KR1020220075086A KR20220075086A KR20230174058A KR 20230174058 A KR20230174058 A KR 20230174058A KR 1020220075086 A KR1020220075086 A KR 1020220075086A KR 20220075086 A KR20220075086 A KR 20220075086A KR 20230174058 A KR20230174058 A KR 20230174058A
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안국영
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가톨릭대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 기재상에 형성된 제1 주입구, 제2 주입구, 배출구 및 섬유형 마이크로 채널부를 포함하고, 상기 제1 주입구를 통해 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 주입구를 통해 제2 용액이 주입되며, 상기 제1 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점과 제1 채널을 통해 연결되고, 상기 제2 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제2 지점과 제2 채널을 통해 연결되며, 상기 배출구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점과 제3 채널을 통해 연결되되, 상기 제1 주입구를 통해 주입된 제1 용액 및 제2 주입구를 통해 주입된 제2 용액은, 상기 제3 채널을 통해 배출되고, 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점 내지 제3 지점은 각각 서로 다른 지점인 것인, 마이크로 유체칩 및 이를 이용한 나노 입자의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

미세 채널을 포함하는 마이크로 유체칩 및 이를 이용한 나노 입자의 제조방법{MICROFLUIDIC CHIP COMPRISING MICROCHANNELS AND METHOD FOR PREPARING LIPID NANOPARTICLE USING THE SAME}
본 발명은 섬유형 마이크로 채널부를 포함하는 마이크로 유체칩 및 이를 이용한 나노 입자의 제조방법에 관한 것이다.
지질(Lipid)은 생체 내 물질 중 지방, 왁스, 콜레스테롤 등 소수성 물질을 지칭하는 것으로, 최근 치료 분자의 운반, 특히 핵산의 운반을 위한 담체로서 그 잠재적 유용성이 대두되고 있다.
지질은 복합체를 피막 형성할 수 있는 리포좀을 형성하거나, 또는 핵산 분자를 담지하여 투여될 수 있는 약물 등 치료 분자의 운반을 용이하게 하는 역할을 하기도 한다. 이를 위해, 지질을 이용한 약학 조성물은 약학 활성성분을 안정적으로 담지하면서도 체내 흡수 및 이동이 용이하도록 그 크기가 작아야 한다.
최근에는 지질을 나노 스케일의 크기로 제조하기 위한 다양한 방법에 제시되고 있으며, 이 중 마이크로 유체칩을 이용한 지질 나노 입자 제조방법이 주목받고 있다.
마이크로 유체칩은 미세환경에서 편리성, 친환경, 저동력, 저비용 등의 장점을 가지며, 시약의 부피를 최소화하여 마이크로 유체칩의 유체 흐름을 조절하고, 부피에 대한 표면적의 비율이 높은 특성 등으로 약물의 효율적인 전달을 위한 방법으로 개발되고 있다.
또한, 마이크로 유체칩은 마이크로 리터에서 피코 리터 단위 부피까지의 효과적인 혼합 및 빠른 혼합이 가능하고, 미세유체 시스템을 크기, 모양, 형태 및 고유한 목적을 고려하여 다양한 제어가 가능한 선택적인 방식으로 나노입자를 합성하는 데 적합한 특성도 가진다. 특히 미세유체를 통해 다양한 약물의 함입이 가능하므로, 지질 나노 입자의 정밀 제어를 통해 다량 생산이 가능한 장점도 있다.
지질 나노 입자를 이용한 약물 전달 시스템은 기존 치료법보다 침습적이고 더 효과적인 화학 요법을 제공할 것으로 예상된다. 지질 나노 입자 기반 약물 전달 시스템에서는 입자의 크기가 생물학적 분포에 중요한 역할을 한다. 또한 최근 코로나 바이러스 백신을 위한 짧은 간섭 RNA 및 mRNA를 봉입한 지질 나노 입자에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
크기 조절이 가능한 지질 나노 입자를 생산하기 위한 효과적인 방법 중 하나로 유기용매 주입법을 들 수 있다. 구체적으로, 다른 용제에 비해 독성이 비교적 낮은 에탄올과 수용액을 미세유체 장치에 도입하고, 이들이 서로 혼합됨으로써 지질 분자의 자가 조립(self-assembly)에 의해 지질 나노 입자를 형성하게 된다.
지질을 포함하는 에탄올 용액과 수용액이 미세유체 장치 안에서 잘 혼합되기 위해서 다양한 방법이 연구되어 왔다. 효과적인 혼합을 위한 구조는 헤링본, 분기, T-정션 및 베이플 등이 일반적으로 가장 많이 쓰이며, 대부분 리소그래피 방식을 이용하여 제작한다.
다만, 이와 같은 미세 유체칩을 이용한 방식은 나노 수준의 입자 생성이 가능하며 약물 봉입 효율이 높지만, 복잡한 제조 공정과 값 비싼 제조 장비의 필요성은 단점으로 지적되어, 간편하고 대량생산에 적합한 지질 나노 입자의 제조방법은 아직 미비한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1468001호 (2014.11.26.) 대한민국 공개특허 제10-2019-0088337호 (2019.07.26.)
본 발명의 목적은 미세 채널 내 서로 다른 유체가 효율적으로 혼합될 수 있도록 다수의 이음부를 포함함에 따라, 연속적이고 짧은 시간에 대량의 나노 입자를 생산할 수 있는 마이크로 유체칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로 유체칩을 이용한 나노 입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예는, 기재상에 형성된 제1 주입구, 제2 주입구, 배출구 및 섬유형 마이크로 채널부를 포함하고, 상기 제1 주입구를 통해 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 주입구를 통해 제2 용액이 주입되며, 상기 제1 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점과 제1 채널을 통해 연결되고, 상기 제2 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제2 지점과 제2 채널을 통해 연결되며, 상기 배출구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점과 제3 채널을 통해 연결되되, 상기 제1 주입구를 통해 주입된 제1 용액 및 제2 주입구를 통해 주입된 제2 용액은, 상기 제3 채널을 통해 배출되고, 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점 내지 제3 지점은 각각 서로 다른 지점인 것인, 마이크로 유체칩을 제공한다.
상기 섬유형 마이크로 채널부는 복수개의 마이크로 채널이 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수 연결부위를 형성하는 3차원의 네트워크 구조일 수 있다.
상기 마이크로 채널의 평균 직경은 1 ㎛ 내지 20 ㎛일 수 있다.
상기 마이크로 채널 간의 연결부위의 평균 직경은 0.5 ㎛ 내지 10 ㎛일 수 있다.
상기 제1 용액은 인지질을 포함하고, 상기 제2 용액은 버퍼 용액을 포함하며, 상기 제1 용액과 제2 용액은 상기 섬유형 마이크로 채널부에서 합류하여 나노 입자를 형성하고, 상기 나노 입자는 상기 제3 채널을 통해 배출될 수 있다.
상기 인지질은 디올레일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 버퍼 용액은 탈이온수, 인산완충용액, 인산완충식염수인 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 기재는 불소 함유 폴리머를 포함하고, 상기 불소 함유 폴리머는 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene) 폴리에테르 에테르 케톤(Polyether ether ketone) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는, 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구를 포함하는 제1 기재; 및 섬유형 마이크로 채널부를 포함하는 제2 기재를 포함하고, 상기 제1 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점과 제1 채널을 통해 연결되고, 상기 제2 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제2 지점과 제2 채널을 통해 연결되며, 상기 배출구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점과 제3 채널을 통해 연결되되, 상기 제1 주입구를 통해 주입된 제1 용액 및 제2 주입구를 통해 주입된 제2 용액은, 상기 제3 채널을 통해 배출되고, 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점 내지 제3 지점은 각각 서로 다른 지점인 것인, 마이크로 유체칩을 제공한다.
상기 마이크로 유체칩은 베이스 기재를 더 포함하고, 상기 제1 기재의 어느 한 면과 상기 제2 기재의 어느 한 면은 서로 맞닿도록 구비될 때, 상기 제2 기재의 상기 제1 기재와 맞닿지 않은 타면이 상기 베이스 기재의 어느 한 면과 맞닿도록 형성될 수 있다.
상기 제1 기재, 제2 기재 및 베이스 기재 중 적어도 어느 하나의 기재는 불소 함유 폴리머를 포함하고, 상기 불소 함유 폴리머는 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene) 폴리에테르 에테르 케톤(Polyether ether ketone) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예는, (1) 복수개의 마이크로 채널이 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수 연결부위를 형성하는 3차원 네트워크 구조의 섬유형 마이크로 채널부를 제조하는 단계; (2) 기재상에 제1 주입구, 제2 주입구, 배출구 및 상기 (1) 단계에서 제조된 섬유형 마이크로 채널부와 상기 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구를 각각 연결하는 통로인 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널을 형성하는 단계; (3) 상기 제1 주입구를 통해 제1 용액을 주입하고, 상기 제2 주입구를 통해 제2 용액을 주입하여 상기 섬유형 마이크로 채널부에서 상기 제1 용액 및 제2 용액이 혼합되어 나노 입자를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 제1 용액은 인지질을 포함하고, 상기 제2 용액은 버퍼 용액을 포함하는 것인, 나노 입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 마이크로 유체칩에 섬유형 마이크로 채널부를 포함하고, 상기 구조체는 복수개의 마이크로 채널이 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수의 연결부위를 형성하는 3차원의 네트워크 구조를 형성함으로써, 나노 입자 형성을 위한 용액이 효과적으로 혼합되어 짧은 시간에 다량의 나노 입자를 생성할 수 있다.
또한 상기 마이크로 채널의 입경을 조절하여 이로부터 다양한 입경의 나노 입자를 효과적으로 생성할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩에 포함된 섬유형 마이크로 채널부의 단면 및 표면, 그리고 상기 섬유형 마이크로 채널부를 형성하기 위한 파이버 매트릭스의 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 채널 형성을 위해 사용된 파이버 매트릭스 구성 섬유의 평균 직경과 마이크로 채널 간 연결 부위(Micro-orifice)의 평균 크기의 관계를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 비교 제조예 1에 따른 섬유형 마이크로 채널부를 포함하지 않은 마이크로 유체칩(A)과, 본 발명의 일 실시예에 따른 섬유형 마이크로 채널부를 포함하는 마이크로 유체칩(B)에서의 지질 나노 입자 형성 과정을 나타낸 모식도 및 형광염료 주입 전자현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 마이크로 유체칩의 제2 용액의 유속에 따라 생성되는 지질 나노 입자의 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조된 지질 나노 입자의 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 7A는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조된 지질 나노 입자를 각각 NIH/3T3, HepG2 및 HeLa 세포가 있는 메디아(media)에 넣어준 후 각 세포의 함입량 및 함입효율을 나타낸 것이다.
도 7B는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조된 파이렌(Pyene) 형광 물질 함입 지질 나노 입자를 함입한 HeLa 세포를 공초점 현미경(confocal Microscope, LSM710, Carl Zeiss)으로 관찰한 이미지를 나타낸 것이다.
도 8A는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조된 독소루비신(Doxorubicin, DOX) 함입 지질 나노 입자를 각각 NIH/3T3, HepG2 및 HeLa 세포가 있는 메디아(media)에 넣어준 후 각 세포의 사멸율을 나타낸 것이다.
도 8B는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조된 독소루비신(Doxorubicin, DOX) 함입 지질 나노 입자를 함입한 각 NIH/3T3, HepG2 및 HeLa 세포를 LIVE/DEADTM로 염색한 후 이를 형광현미경 (Fluorescence microscope, IX71, OLYMPUS Co. Ltd.)으로 관찰한 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩의 (1) 주입구, 배출구 및 채널이 형성된 기재층에 대한 실제 이미지 및 광학 현미경 이미지, (2) 섬유형 마이크로 채널부를 포함하는 기재층에 대한 실제 이미지 및 주사전자현미경(SEM) 이미지, (3) 이를 포함하는 마이크로 유체칩의 실제 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩에 포함된 기재층의 소재에 대한 유기 용매 팽윤 저항성을 측정한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩에 포함된 기재층의 친수성 개질 비율에 따른 물과의 접촉각을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 마이크로 입자의 입경과 연속상의 유속과의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 마이크로 입자의 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 나노 입자와, 호모게나이져를 이용하여 제조된 나노 입자의 약물 봉입 거동을 비교한 그래프이고, 도 15A 및 도 15B는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 나노 입자와, 호모게나이져를 이용하여 제조된 나노 입자의 약물 방출 거동을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
도면에서 여러 층 및 영역을 명확하게 표현하기 위하여 두께를 확대하여 나타내었으며, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "위에" 있다고 할 때, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 어떤 부분이 다른 부분 "바로 위에" 있다고 할 때에는 중간에 다른 부분이 없는 것을 뜻한다.
본 명세서에 기재된 용어 "나노"란 나노 스케일을 의미하며, 1 ㎛ 이하의 크기를 포함한다.
이하 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩에 관하여 설명한다.
본 발명은 연속적이고 짧은 시간에 대량의 나노 입자를 생산할 수 있는 마이크로 유체칩에 관한 것이다.
일 구현예에 따른 마이크로 유체칩은 기재상에 형성된 제1 주입구, 제2 주입구, 배출구 및 섬유형 마이크로 채널부를 포함하고, 상기 제1 주입구를 통해 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 주입구를 통해 제2 용액이 주입되며, 상기 제1 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점과 제1 채널을 통해 연결되고, 상기 제2 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제2 지점과 제2 채널을 통해 연결되며, 상기 배출구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점과 제3 채널을 통해 연결되되, 상기 제1 주입구를 통해 주입된 제1 용액 및 제2 주입구를 통해 주입된 제2 용액은, 상기 제3 채널을 통해 배출되고, 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점 내지 제3 지점은 각각 서로 다른 지점인 것일 수 있다.
통상적으로 크기 조절이 가능한 지질 입자는, 비교적 독성이 낮은 에탄올 등의 용매를 이용한 '유기용매 주입법'을 통해 주로 생산되고 있으나, 상기의 방법을 이용하여 나노미터 수준의 지질 입자를 생산하기 위해서는 복잡한 제조 공정과 높은 제조 단가 등이 문제가 되었다.
이에 대하여 본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 마이크로미터 단위의 직경을 가지는 복수개의 미세 채널이 서로 얽혀 상기 미세 채널 간의 다수 연결부위를 형성하는 3차원의 네트워크 구조인 '섬유형 마이크로 채널부'가 형성된 마이크로 유체칩에 서로 다른 성질의 용액을 주입함으로써, 나노 크기의 지질 입자를 짧은 시간에 연속적이고 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.
구체적으로 상기 기재는 제1 주입구, 제2 주입구, 섬유형 마이크로 채널부 및 배출구를 포함한다.
상기 제1 주입구를 통해 제1 용액이 주입될 수 있고, 제2 주입구를 통해 제2 용액이 주입될 수 있다. 이때, 상기 기재에 포함된 제1 주입구와 제2 주입구는 서로 다른 성질의 용액이 주입될 수 있는 것으로, 상기 제1 주입구와 제2 주입구는 서로 동일하지 않을 수 있다.
상기 제1 용액은 제1 주입구를 통해 주입된 후, 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점과 연결된 제1 채널을 통해 섬유형 마이크로 채널부 내부로 유입될 수 있다. 또한, 제2 용액은 제2 주입구를 통해 주입된 후, 섬유형 마이크로 채널부의 제2 지점과 연결된 제2 채널을 통해 섬유형 마이크로 채널부 내부로 유입될 수 있다. 즉, 상기 제1 채널 및 제2 채널은 각각 상기 제1 주입구 및 제2 주입구를 통해 주입된 용액이 기재내에서 섬유형 마이크로 채널부까지 이동하는 통로를 의미한다. 이때, 상기 섬유형 마이크로 채널부와 상기 제1 채널 또는 제2 채널이 만나는 부분인 상기 제1 지점 및 제2 지점은 서로 동일하지 않을 수 있다.
상기 제1 채널은 상기 제1 주입구로부터 일정 거리만큼 이격된 지점에 형성된 분기부로부터 n개(단, n은 2 이상의 정수임)의 제1 서브채널로 분기되어 구비될 수 있고, 상기 제2 채널 역시 상기 제2 주입구로부터 일정 거리만큼 이격된 지점에 형성된 분기부로부터 m개(단, m은 2 이상의 정수임)의 제2 서브채널로 분기되어 구비될 수 있다. 즉, 상기 제1 채널이 분기부로부터 n개의 제1 서브채널로 분기되는 경우, 각 서브채널은 상기 섬유형 마이크로 채널부의 서로 다른 n개의 제1 서브지점과 접하도록 구비될 수 있다. 또한, 상기 제2 채널이 분기부로부터 m개의 제2 서브채널로 분기되는 경우, 각 서브채널은 상기 섬유형 마이크로 채널부의 서로 다른 m개의 제2 서브지점과 접하도록 구비될 수 있다. 이 경우, 각각의 제1 서브지점 및 제2 서브지점은 서로 상이할 수 있다.
상기 제1 용액은 상기 제1 주입구를 통해 불연속적인 유체의 흐름 특성을 가질 수 있는, 이른바 ‘불연속상’으로 주입될 수 있고, 상기 제2 용액은 상기 제2 주입구를 통해 연속적인 유체의 흐름 특성을 가질 수 있는, 이른바 '연속상’으로 주입될 수 있다.
제1 주입구로부터 제1 채널을 따라 유입된 제1 용액과 제2 주입구로부터 제2 채널을 따라 유입된 제2 용액은 상기 섬유형 마이크로 채널부의 서로 다른 지점에서 섬유형 마이크로 채널부를 이루는 복수개의 마이크로 채널로 유입되며, 섬유형 마이크로 채널부의 각 마이크로 채널들이 연결되는 부위에서 상기 제1 용액과 제2 용액이 혼합됨으로써 나노 입자를 형성하게 된다. 후술하는 바와 같이, 상기 제1 용액은 인지질을 포함하고, 상기 제2 용액은 버퍼 용액을 포함하므로, 상기 제1 용액이 제2 용액과 마이크로 채널 연결부위에서 접촉하는 과정에서, 인지질의 소수성 영역은 지질 입자의 내부로 향하게 되고, 인지질의 친수성 부분은 지질 입자의 외부로 향하게 되는 자기 조립(Self-asssembly) 현상에 의해 나노 입자가 형성되는 것으로 이해될 수 있다.
상기 섬유형 마이크로 채널부는 마이크로미터(㎛) 단위의 직경을 가지는 복수개의 미세 채널이 서로 얽혀 상기 미세 채널 간의 다수 연결부위를 형성하는 3차원의 네트워크 구조를 의미할 수 있다. 상기 섬유형 마이크로 채널부는 후술할 전기방사에 의한 파이버 매트릭스를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 특정 용제에 용해될 수 있는 고분자 성분으로 파이버 매트릭스를 제조하고 이를 마이크로 유체칩 내부에 위치시킨 후, 용제로 상기 파이버 매트릭스를 녹여내고 난 후의 공동(void)을 의미할 수 있다. 따라서, 상기 섬유형 마이크로 채널부는 상기 제1 용액과 제2 용액이 마이크로 채널의 연결부위에서 더욱 잘 혼합될 수 있는 물리적 공간을 제공함에 따라, 이를 포함한 마이크로 유체칩을 이용하여 나노 입자의 연속적인 대량생산에 효과적일 수 있다.
상기 섬유형 마이크로 채널부를 구성하는 각각의 마이크로 채널의 평균 직경은 1 ㎛ 내지 20 ㎛일 수 있고, 예를 들어 1 ㎛ 이상, 2 ㎛ 이상, 3 ㎛ 이상, 4 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 6 ㎛ 이상, 7 ㎛ 이상, 8 ㎛ 이상, 9 ㎛ 이상일 수 있고, 20 ㎛ 이하, 19 ㎛ 이하, 18 ㎛ 이하, 17 ㎛ 이하, 16 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이하, 14 ㎛ 이하, 13 ㎛ 이하, 12 ㎛ 이하, 11 ㎛ 이하일 수 있다. 만일 상기 마이크로 채널의 평균 직경이 1 ㎛ 미만인 경우, 나노 입자를 연속적으로 제조하기 위해 섬유형 마이크로 채널부 내 유체의 일정 유속을 조절하기 위해 용액 주입 압력을 과도하게 증가시켜야 되는 문제가 있고, 20 ㎛를 초과하는 경우 섬유형 마이크로 채널부 내 조밀한 3차원 네트워크 구조가 형성되지 않아 나노 입자를 효과적으로 제조할 수 없는 문제가 있다.
상기 마이크로 채널은 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수의 연결부위를 제공하며, 이러한 연결부위를 통해 상기 제1 용액 및 제2 용액이 혼합될 수 있는 환경을 조성하게 된다. 상기 마이크로 채널 간의 연결부위의 평균 직경은 0.5 ㎛ 내지 10 ㎛일 수 있고, 예를 들어 0.5 ㎛ 이상, 1.0 ㎛ 이상, 1.5 ㎛ 이상, 2.0 ㎛ 이상, 2.5 ㎛ 이상, 3.0 ㎛ 이상, 3.5 ㎛ 이상, 4.0 ㎛ 이상, 4.5 ㎛ 이상일 수 있고, 10 ㎛ 이하, 9.5 ㎛ 이하, 9.0 ㎛ 이하, 8.5 ㎛ 이하, 8.0 ㎛ 이하, 7.5 ㎛ 이하, 7.0 ㎛ 이하, 6.5 ㎛ 이하, 6.0 ㎛ 이하, 5.5 ㎛ 이하일 수 있다. 상기 마이크로 채널은, 예를 들어, 2개의 마이크로 채널이 서로 한 지점에서 교차할 수 있고, 2개 이상의 마이크로 채널이 서로 한 지점에서 연결되는 구조를 포함할 수 있으며, 상기 마이크로 채널이 교차 또는 접하는 지점에서 마이크로 채널의 연결부위가 존재하게 된다. 상기 마이크로 채널 간의 연결부위는 마이크로 채널부 표면의 전자현미경(SEM) 이미지를 통해 각 마이크로 채널이 겹쳐 생긴 연결부위를 선정하고, 이를 계측 소프트웨어(ImageJ software, National Institutes of Health, Bethesda, USA) 등을 통해 측정할 수 있다.
상기 제1 용액과 제2 용액은 각각 제1 주입구 및 제2 주입구를 통해 기재 내부로 유입되고 섬유형 마이크로 채널부에서 합류함으로써 나노 입자를 형성하고, 상기 입자와 함께 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점과 연결된 제3 채널을 통해 배출구로 배출될 수 있다. 이때, 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점은, 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점 및 제2 지점과 서로 동일하지 않을 수 있다. 만일, 제1 채널이 제1 서브채널로 분기되거나, 제2 채널이 제2 서브채널로 분기되어 섬유형 마이크로 채널부와 접하는 경우의 제1 서브지점 또는 제2 서브지점은 상기 제3 지점과 상이한 지점일 수 있다. 또한, 상기 제3 채널은 기재 내의 상기 제1 채널과 제2 채널과 서로 동일하지 않을 수 있다. 또한, 상기 제1 채널과 제2 채널이 각각 n개 및 m개의 서브채널로 구비될 수 있는 것과는 달리, 마이크로 구조체 내에서 제1 용액과 제2 용액이 혼합될 확률을 향상시키기 위해, 상기 배출구는 다수의 서브 배출구로 구비되지 않는 것이 바람직하다.
상기 제1 채널 내지 제3 채널은 다양한 길이, 단면의 장경 및 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 채널 및 제2 채널은 각각 기재의 제1 주입구 및 제2 주입구로부터 섬유형 마이크로 채널부와 접하는 지점까지의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 채널은 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점으로부터 배출구까지의 길이에 상응하는 길이를 가질 수 있다. 상기 제1 채널 내지 제3 채널의 단면은 정사각형, 직사각형, 삼각형 또는 원형일 수 있고, 바람직하게는 단면의 장경인 대각선의 길이가 50 내지 1,000 ㎛인 직사각형 형상일 수 있다. 상기 채널의 장경이 50 ㎛ 미만인 경우 각 채널을 통해 이동하는 용액의 유속이 과도하게 느려지거나, 적정 유속을 만족시키기 위해 용액 주입 압력을 높임에 따라 마이크로 유체칩의 안정성에 문제가 있을 수 있다. 상기 채널의 장경이 1,000 ㎛을 초과하는 경우, 나노 입자의 형성 효율이 줄어들 수 있으므로, 상기 범위 내에서 적절히 조절한다.
상기 제1 채널 내지 제3 채널은 다양한 방법을 통해 형성될 수 있고, 예를 들어 기재의 표면을 음각 처리하여 형성하거나, 기재와 다른 종류의 소재를 사용하여 각 채널을 먼저 형성하고, 상기 형성된 채널에 기재를 구성하는 소재를 도포한 뒤 상기 채널 형성부를 제거함으로써 제조할 수 있다.
상기 기재는 다양한 소재로 구현될 수 있다. 예를 들어 유리, 석영, 플라스틱, 실리콘 등을 사용할 수 있고, 마이크로 유체칩의 기계적 강도 및 물리적 내구성을 확보할 수 있는 소재라면 그 종류에 구애되지 않을 수 있으며, 구체적으로 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 폴리(스타이렌-부타디엔-스타이렌) 블록 공중합체(SBS), 폴리 (스타이렌-에틸렌-부타디엔-스타이렌) 블록 공중합체(SEBS), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene oxide), 폴리부타디엔(polybutadiene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리우레탄아크릴레이트(PUA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리카보네이트(PC), 폴리에틸렌(PE) 등의 플라스틱을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실리콘 계열의 고분자인 폴리디메틸실록산(PDMS)을 이용할 수 있다.
또한, 상기 기재로 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether, PFPE), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE) 또는 폴리에테르 에테르 케톤(Polyether ether ketone) 등의 불소 함유 폴리머 소재를 이용할 수 있다. 특히, 퍼플루오로폴리에테르 소재는 유기 용매에 대한 팽윤 저항성이 뛰어나며, 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩에 투입되는 용액 중 유기 용매에 대한 강한 물리적 안정성을 부여할 수 있다. 또한, 상기 퍼플루오로폴리에테르 소재는 폴리에틸렌글리콜다이아크릴레이트(Polyethylene Glycol Diacrylate,　PEGDA) 등의 친수성 고분자로 개질되어 사용될 수 있으며, 이를 통해 유중수(Water-in-oil)형 에멀젼을 제조하고, 용매 증발법 등을 거쳐 나노 입자를 제조할 수도 있다.
상기 기재는 목적하는 바에 따라 다양한 형상을 가질 수 있고, 예를 들어 상부 또는 하부의 단면이 정사각형, 직사각형, 원형, 타원형 등의 형상으로 구현될 수 있으며, 기재에 포함되는 채널의 길이 및 폭 등을 고려하여 상부 또는 하부의 단면이 직사각형 형상의 플레이트인 것이 바람직할 수 있다.
상기 기재의 상부 또는 하부의 단면이 직사각형 형상으로 구현되는 경우, 장변의 길이는 2 내지 20 cm일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 10 cm 일 수 있다. 상기 장변의 길이가 2 cm 미만인 경우 마이크로 유체칩의 크기가 줄어들어 나노 입자를 대량 생산하는데 한계가 있으며, 20 cm를 초과하는 경우 섬유형 마이크로 채널부 내 유체의 일정 유속을 조절하기 위해 용액 주입 압력을 과도하게 증가시켜야 되는 문제점이 있다.
또한, 상기 기재의 상부 또는 하부의 단면이 직사각형 형상으로 구현되는 경우, 기재의 두께는 0.3 내지 2 cm일 수 있으며, 기재의 두께가 0.3 cm 미만인 경우 마이크로 유체칩의 물리적, 기계적 특성이 줄어들 수 있으며, 2 cm를 초과하는 경우 나노 입자의 대량 생산을 위한 마이크로 유체칩의 집적화에 불리할 수 있으므로, 기재의 두께는 상기 범위에서 적절히 조절하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 제1 용액은 유기용매 및 인지질을 포함할 수 있다.
상기 유기용매는 제1 용액에 포함되는 인지질을 균일하게 분산할 수 있는 것이라면 그 종류에 한정되지 않을 수 있고, 예를 들어 에탄올, 클로로포름, 에테르 또는 헥산일 수 있고, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다.
상기 인지질은 디올레일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 제1 용액은 콜레스테롤을 더 포함할 수 있으며, 상기 콜레스테롤은 일 구현예에 따른 마이크로 유체칩을 통해 형성되는 나노 입자의 구조를 더욱 안정화시킬 수 있는 것이며, 예를 들어 상기 제1 용액에 포함되는 인지질의 총 중량의 약 30 중량% 이하로 포함될 수 있다.
상기 제1 용액은 단백질, 핵산, 펩티드, 지방질, 당지질, 미네랄, 당, 나노 입자, 생물학적 제재, 약물, 화학물질 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 용액은 파이렌 등의 형광 유기 물질을 포함할 수 있으며, 이를 통해 일 실시예의 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 지질 나노 입자의 세포 내 함입 효율 등을 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 용액은 독소루비신 등의 항암 약물 등을 포함할 수 있으며, 이를 통해 실시예의 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 나노 입자을 통한 세포 사멸을 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제2 용액은 버퍼 용액을 포함할 수 있고, 상기 버퍼 용액은 탈이온수, 인산완충용액, 인산완충식염수인 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는, 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구를 포함하는 제1 기재; 및 섬유형 마이크로 채널부를 포함하는 제2 기재를 포함하고, 상기 제1 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점과 제1 채널을 통해 연결되고, 상기 제2 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제2 지점과 제2 채널을 통해 연결되며, 상기 배출구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점과 제3 채널을 통해 연결되되, 상기 제1 주입구를 통해 주입된 제1 용액 및 제2 주입구를 통해 주입된 제2 용액은, 상기 제3 채널을 통해 배출되고, 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점 내지 제3 지점은 각각 서로 다른 지점인 것인, 마이크로 유체칩을 제공한다.
도 1은 일 구현예에 따른 마이크로 유체칩의 개략적인 구성을 나타낸 모식도이다. 도 1을 참조하면, 일 실시예에 따른 마이크로 유체칩(400)은 제1 기재(100) 및 제2 기재(200)를 포함하고, 제2 기재(200)는 섬유형 마이크로 채널부(210)을 포함한다.
제1 기재(100)는 제1 주입구(111), 제2 주입구(121) 및 배출구(131)를 포함하고, 제1 주입구(111)로부터 연결되는 제1 채널(112)은 제2 기재(200)에 포함된 섬유형 마이크로 채널부(210)의 제1 지점과 연결되고, 제2 주입구(121)로부터 연결되는 제2 채널(122)은 섬유형 마이크로 채널부(210)의 제2 지점과 연결될 수 있다. 이때, 상기 제1 채널(112)은 제1 주입구(111)로부터 일정 거리만큼 이격된 지점에서부터 2개의 제1 서브채널로 분기되고, 섬유형 마이크로 채널부(210)과 2개의 제1 서브채널의 형태로 연결될 수 있다.
제1 기재(100)의 배출구(131)는 섬유형 마이크로 채널부(210)의 제3 지점과 제3 채널(132)를 통해 연결되며, 제1 주입구(111)를 통해 주입된 제1 용액(113) 및 제2 주입구(121)을 통해 주입된 제2 용액(123)은 섬유형 마이크로 채널부(210)에서 혼합되어 나노 입자를 형성하고, 상기 제3 채널(132)를 통해 형성된 나노 입자와 함께 배출튜빙(133)을 따라 배출될 수 있다.
일 실시예에서, 마이크로 유체칩(400)의 물리적 안정성을 확보하기 위해 베이스 기재(300)를 더 포함할 수 있다.
이때, 제1 기재(100)의 어느 한 면과 제2 기재(200)의 어느 한 면이 서로 맞닿도록 구비될 때, 상기 제2 기재(200)의 제1 기재(100)와 맞닿지 않은 타면이 베이스 기재(300)의 어느 한 면과 맞닿도록 구비될 수 있다.
상기 마이크로 유체칩(400)에서 제1 용액 및 제2 용액의 종류, 나노 입자의 생성 원리, 섬유형 마이크로 채널부의 형상 등에 대한 설명은 상기한 바와 동일하므로 반복적인 설명은 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, (1) 복수개의 마이크로 채널이 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수 연결부위를 형성하는 3차원 네트워크 구조의 섬유형 마이크로 채널부를 제조하는 단계; (2) 기재상에 제1 주입구, 제2 주입구, 배출구 및 상기 (1) 단계에서 제조된 섬유형 마이크로 채널부와 상기 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구를 각각 연결하는 통로인 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널을 형성하는 단계; (3) 상기 제1 주입구를 통해 제1 용액을 주입하고, 상기 제2 주입구를 통해 제2 용액을 주입하여 상기 섬유형 마이크로 채널부에서 상기 제1 용액 및 제2 용액이 혼합되어 나노 입자를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 제1 용액은 인지질을 포함하고, 상기 제2 용액은 버퍼 용액을 포함하는 것인, 나노 입자의 제조방법을 제공한다.
먼저 마이크로 유체칩에 포함되는 섬유형 마이크로 채널부를 제조하는 단계(이하, 단계 (1)이라 한다)이다.
일 실시예에 따른 나노 입자의 제조방법은, 특정 용제에 용해될 수 있는 소재를 이용하여 전기방사를 통해 파이버 매트릭스(fiber matrix)를 제조하고, 이를 녹여내어 복수개의 마이크로 채널이 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수의 연결부위를 형성하는 3차원의 네트워크 구조를 형성하는 것일 수 있다.
우선 고분자 용액을 전기방사하여 파이버 매트릭스를 제조한다.
상기 고분자 용액은 파이버 매트릭스 형성용 고분자를 유기 용매에 용해시켜 제조할 수 있다. 상기 파이버 매트릭스 형성용 고분자는, 후술할 단계에서 특정 용제에 의해 용해되어 섬유형 마이크로 채널부를 형성할 수 있는 것이라면 그 종류에 구애받지 않을 수 있으며, 예를 들어 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체와 같은 합성고분자, 또는 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등의 천연고분자 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 중합체일 수 있으며, 바람직하게는 폴리카프로락톤일 수 있다. 상기 유기용매는 클로로포름, 1,4-디옥산, 디클로로메텐, 아세톤, 트리플루오로에탄올, 헥사플루오로프로판올 또는 이들의 조합로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 고분자 용액의 농도는 5 % 내지 20 %일 수 있고, 예를 들어 7.5 % 내지 20 %, 10 % 내지 20 %, 12.5 % 내지 20 %, 15 % 내지 20 %, 17.5 % 내지 20 %일 수 있으며, 바람직하게는 10 % 내지 17.5 %일 수 있다. 상기 고분자 용액의 농도가 5 % 미만인 경우, 고분자 섬유의 평균 직경이 과도하게 줄어들 수 있고, 20 %를 초과하는 경우 고분자 용액의 방사가 원활하게 이루어지지 않아 파이버 매트릭스 내 고분자 섬유의 균일도가 감소할 수 있다.
전기방사는 상기 고분자 용액을 쉬린지(syringe)에 주입한 뒤 상기 쉬린지를 수평방사의 형태로 하여 파이버 매트릭스를 제조할 수 있다. 집전판과 니들 컬렉터는 간격을 두고 서로 마주보며 배치될 수 있고, 상기 쉬린지를 통해 고분자 용액이 공급된다. 이때, 상기 집전판과 니들 컬렉터 사이의 전기에너지 차이, 즉 전압 차이에 의해 고분자 용액이 제트를 형성하여 이송되며, 형성된 제트는 전기장에 의하여 휘핑 및 스트레칭되면서 더욱 가늘어지고 용매는 기화되어 고체상의 파이버들이 3차원의 네트워크를 형성하는 매트릭스 형태를 이루며 집적된다.
상기 집전판과 니들 컬렉터 사이의 거리는 10 내지 20 cm일 수 있다. 상기 집전판과 니들 컬렉터 사이의 거리가 10 cm 미만인 경우, 방사 거리가 짧아 용매가 충분히 증발되지 않기에 파이버 매트릭스를 구성하는 고분자 섬유 가닥의 두께가 불균일할 수 있고, 20 cm를 초과하는 경우 파이버 매트릭스가 집전판 또는 니들 컬렉터 표면에만 형성되어 파이버 매트릭스의 수득률이 저하될 수 있다.
전기방사시 고분자 용액의 공급 유량은 0.05 ㎕/min 내지 0.15 ㎕/min이고, 구체적으로 0.06 ㎕/min 내지 0.1㎕/min일 수 있다. 상기 고분자 용액의 공급 유량이 0.05 ㎕/min 미만인 경우 파이버 매트릭스의 수득률이 낮아 생산 소요시간이 증가할 수 있고, 0.15 ㎕/min를 초과하는 경우 파이버 매트릭스 제조 과정 중에 불균일한 드롭렛(droplet)이 발생할 수 있다.
전기방사시 전압은 5 kV 내지 20 kV이고, 구체적으로 9 kV 내지 11 kV일 수 있다. 전기방사시 전압이 5 kV 미만인 경우, 고분자 용액에 정전기적 반발력이 표면장력보다 작아 고분자 파이버가 형성되지 않고 고분자 용액 방울이 튈 수 있고, 20 kV를 초과하는 경우 높은 전위로 대전된 고분자 용액이 빠르게 방사되어 집전판 또는 니들 컬렉터의 표면에만 달라붙을 수 있다.
전기방사 시간은 100 내지 500 분일 수 있고, 구체적으로 300 내지 500 분일 수 있다. 전기방사 시간이 100 분 미만일 경우 파이버 매트릭스를 구성하는 고분자 섬유의 두께 균일도가 저하되거나, 또는 생성되는 파이버 매트릭스의 직경이 매우 작아 마이크로 유체칩의 섬유형 마이크로 채널로 사용될 수 있는 채널의 수가 줄어들어 마이크로 유체칩 내부에서 유체의 흐름이 저하될 수 있고, 500 분을 초과하는 경우 파이버 매트릭스의 직경이 커지게 되며, 섬유형 마이크로 채널을 형성하기 위해 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 등의 고분자를 적용하여 경화하는 경우 파이버 매트릭스로부터 형성될 수 있는 마이크로 채널 사이에 폴리디메틸실록세인이 거의 존재하지 않게 되어 마이크로 채널들이 합쳐지거나, 또는 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) 등의 유기 용매로 섬유형 마이크로 채널부를 형성하는 과정에서 채널부 자체가 탈락될 수 있다.
상기의 전기방사 조건을 통해 제조되는 파이버 매트릭스를 구성하는 고분자 섬유의 평균 직경은 1 ㎛ 내지 20 ㎛일 수 있고, 예를 들어 1 ㎛ 이상, 2 ㎛ 이상, 3 ㎛ 이상, 4 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 6 ㎛ 이상, 7 ㎛ 이상, 8 ㎛ 이상, 9 ㎛ 이상일 수 있고, 20 ㎛ 이하, 19 ㎛ 이하, 18 ㎛ 이하, 17 ㎛ 이하, 16 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이하, 14 ㎛ 이하, 13 ㎛ 이하, 12 ㎛ 이하, 11 ㎛ 이하일 수 있다. 상기 파이버 매트릭스는 후술할 단계를 통해 제거되므로, 상기 파이버 매트릭스를 구성하는 각각의 고분자 섬유의 평균 직경은 본 발명에 따른 마이크로 유체칩의 섬유형 마이크로 채널부를 구성하는 개별 마이크로 채널의 평균 직경과 동일하게 된다.
다음으로, 상기 제조된 파이버 매트릭스를 이용하여 마이크로 유체칩에 포함되는 섬유형 마이크로 채널부를 제조한다.
일 예로, 상기 파이버 매트릭스 상에, 마이크로 유체칩의 기재를 이루는 성분을 도포하여 기재 안에 파이버 매트릭스가 포함되는 형태로 준비한다. 상기 기재를 형성할 수 있는 성분 대한 설명은 상기한 바와 동일하므로 반복적인 설명은 생략한다.
이후, 상기 파이버 매트릭스를 구성하는 고분자를 용해할 수 있는 용제를 투입하여 파이버 매트릭스를 녹여내면, 파이버 매트릭스가 존재하던 부분이 빈 공간으로 변하면서 복수개의 마이크로 채널이 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수의 연결부위를 형성하는 3차원 네트워크 구조의 섬유형 마이크로 채널부가 형성된다.
상기 파이버 매트릭스를 용해할 수 있는 용제로는, 상기 기재 성분에 물리적, 화학적 영향을 주지 않고 파이버 매트릭스를 용해할 수 있는 것이라면 그 종류에 구애받지 않으나, 예를 들어, 에탄올, 메탄올, 디클로로메탄 (MC), 디메틸포름아미드 (DMF), 및 N-메틸피롤리돈 (NMP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄일 수 있다.
두번째 단계는, 상기 섬유형 마이크로 채널부가 형성된 기재 상에, 제1 주입구, 제2 주입구, 배출구 및 기 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구를 각각 연결하는 통로인 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널을 형성하는 단계이다.
상기 제1 채널 내지 제3 채널은 다양한 방법을 통해 형성될 수 있고, 예를 들어 기재의 표면을 상기 채널의 형상에 따라 음각 처리하여 형성하거나, 기재와 다른 종류의 소재를 사용하여 각 채널을 먼저 형성하고, 상기 형성된 채널에 기재를 구성하는 소재를 도포한 뒤 상기 채널 형성부를 제거함으로써 제조할 수 있다.
세번째 단계는, 상기 기재상에 형성된 제1 주입구를 통해 제1 용액을 주입하고, 상기 제2 주입구를 통해 제2 용액을 주입하여 상기 섬유형 마이크로 채널부에서 상기 제1 용액 및 제2 용액이 혼합되어 나노 입자를 형성하는 단계이다. 이때, 상기 제1 용액 및 제2 용액의 종류 및 성분에 대한 설명은 상기한 바와 동일하므로 반복적인 설명은 생략한다.
상기 제1 용액은 0.2 내지 0.5 ㎕/min의 유속의 불연속상으로 주입될 수 있고, 바람직하게는 0.2 ㎕/min의 유속으로 주입될 수 있다. 상기 제2 용액은 1 ㎕/min 내지 5 ㎕/min의 유속의 연속상으로 주입될 수 있고, 바람직하게는 3 ㎕/min 내지 5 ㎕/min의 유속으로 주입될 수 있다. 만일 상기 제2 용액, 즉 연속상의 용액의 주입 유속이 1 ㎕/min 미만인 경우, 형성되는 입자의 크기가 과도하게 증가하거나 입자의 대량 생산이 어려울 수 있고, 5 ㎕/min를 초과하는 경우 용액이 역류할 수 있고, 입자가 생성되지 않거나 또는 생성되는 입자의 모양이 불규칙해지는 등 형성된 지질 입자의 안정성이 저하될 우려가 있으므로 상기 범위에서 적절히 조절한다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로서 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 또한, 여기에 기재되지 않은 내용은 당 기술분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것으로 그 설명을 생략한다.
제조예 1: 마이크로 유체칩의 제조
(1) 전기방사 파이버 매트릭스 제조
클로로포름(Chloroform, Sigma-Aldrich, 288306-2L) 8 g, 트리플루오로에탄올(2,2,2-Trifluoroethanol, TFE, T63002-500G) 2 g을 혼합시킨 용액에 폴리(ε-카프로락톤)(Poly(ε-caprolactone), PCL, Sigma-Aldrich, 440744-500G, Mn 70,000 ~ 90,000) 1~1.5 g을 용해시켜 17.5% 농도의 폴리카프로락톤 용액을 제조하였다.
다음으로 상기 폴리카프로락톤 용액을 통해 파이버 매트릭스를 제조하기 위해 전기방사 장치를 준비한다. 상기 전기방사 장치는 전압원, 쉬린지(syringe) 펌프, 금속 바늘, 집전판(SUS 시트, 300 mm × 300 mm)를 포함한다.
상기 폴리카프로락톤 용액을 쉬린지에 주입 후, 쉬린지를 수평방사의 형태로 하여 집전판과 금속 바늘사이를 15 cm 떨어지게 하여 쉬린지 펌프를 작동시켜 방사하였다. 이때, 상기 폴리카프로락톤 용액의 유속은 0.10 mL/min로 하며, 18G의 금속 니들을 사용하였다. 방사를 하는 동시에 9 kV의 전압을 걸어 집전판에 랜덤하게 배향되도록 집적된 3차원 구조의 파이버 매트릭스를 제조하였다. 제조된 파이버 매트릭스를 4 mm 직경의 원형의 펀치로 뚫어 원형의 파이버 매트릭스를 제조하였다.
(2) 섬유형 마이크로 채널부 포함 층의 제조
폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 엘라스토머(elastomer)와 경화제(SYLGARD 184 Base&Curing Agent, 세왕하이텍)를 10:1 중량비로 혼합하여 폴리디메틸실록세인 용액을 제조하였다.
상기 (1)에서 제조된 원형의 파이버 매트릭스를 유리판의 중심에 놓고, 상기 폴리디메틸실록세인 용액을 상기 파이버 매트릭스 위에 부은 뒤, 이를 컬쳐 플레이트로 누른 다음 더블 클립으로 압착을 시켰다. 압착을 시킨 후 이를 오븐에 60 ℃에서 5시간 동안 경화시켰다.
상기 경화가 완료된 폴리디메틸실록세인을 유리판에서 분리시킨 후 디클로로메탄(dichloromethane, DCM, Sigma-Aldrich, 270997-1L)에 1시간 동안 담가 두어 폴리카프로락톤 성분의 파이버 매트릭스를 용해시켜 제거하고, 이를 3×5 cm의 크기로 절단하였다.
(3) 용액 주입구, 배출구 포함 층의 제조 및 각 층의 결합
폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL, Mn 14,000)를 3D 프린터 베럴에서 80 ℃의 온도로 녹인 후 프린팅 속도와 고분자 주입 속도의 비율을 4:1로 하여 슬라이드 글라스 위에 도 1과 같이 제1 채널(112), 제2 채널(122) 및 제3 채널(132)의 패턴, 그리고 제1 주입구(111), 제2 주입구(121) 및 배출구(131)가 형성되도록 프린팅 하였다.
상기 채널들이 프린팅 된 슬라이드 글라스를 컬쳐 플레이트에 양면 테이프로 부착시킨 후 폴리디메틸실록세인용액을 주입시킨 후 경화시켰다.
경화된 폴리디메틸실록세인을 슬라이드 글라스와 컬쳐 플레이트에서 분리시킨 후, 디클로로메탄에 1시간 동안 담가 두어 상기 각 채널, 주입구 및 배출구를 형성한 폴리카프로락톤 부분을 제거하였다.
이후, 상기 각 채널, 주입구 및 배출구 부분이 음각으로 형성된 폴리디메틸실록세인 기재를 3×5 cm 로 절단한 뒤, 상기 (2)에서 제조된 마이크로 유체 구조체 포함 층을 일면에 부착하고, 타면에는 폴리디메틸실록세인만으로 형성된 3×5 cm의 기재를 부착하여 3개 층으로 구성한 다음, 상기 3개 층의 상부와 하부에 아크릴판을 위치시키고 볼트와 너트를 이용하여 체결하였다.
제조예 2: 마이크로 유체칩의 제조
폴리(ε-카프로락톤)(Poly(ε-caprolactone) 7.5 g을 용해시켜 15.0 % 농도의 폴리카프로락톤 용액을 제조하고, 이를 0.08 mL/min의 유속 및 집전판의 전압을 11 kV로 하여 파이버 매트릭스를 제조한 것을 제외하고 상기 제조예 1과 동일하게 하여 마이크로 유체칩을 제조하였다.
제조예 3: 마이크로 유체칩의 제조
폴리(ε-카프로락톤)(Poly(ε-caprolactone) 5 g을 용해시켜 10.0 % 농도의 폴리카프로락톤 용액을 제조하고, 이를 0.06 mL/min의 유속 및 집전판의 전압을 10 kV로 하여 파이버 매트릭스를 제조한 것을 제외하고 상기 제조예 1과 동일하게 하여 마이크로 유체칩을 제조하였다.
제조예 4: 마이크로 유체칩의 제조
(1) 친수성 개질된 불소 함유 폴리머의 제조
퍼플루오로폴리에테르(PFPE, Fluorolink MD 700, Solvay 社) 17 g을 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA, Mn=575) 3 g 및 2-hydroxy-2-methylpropiophenone 0.8 g과 섞어 혼합한 후 진공 조건 하에서 기포를 제거한다. 이후, 상기 혼합물을 254 nm 파장의 자외선을 5 분간 조사하여 친수성 개질된 불소 함유 폴리머를 제조한다.
(2) 전기방사 파이버 매트릭스 제조
클로로포름(Chloroform, Sigma-Aldrich, 288306-2L) 39.6 g, 트리플루오로에탄올(2,2,2-Trifluoroethanol, TFE, T63002-500G) 9.9 g을 혼합시킨 용액에 폴리(ε-카프로락톤)(Poly(ε-caprolactone), PCL, Sigma-Aldrich, 440744-500G, Mn 70,000 ~ 90,000) 10.5 g을 용해시켜 17.5% 농도의 폴리카프로락톤 용액을 제조하였다.
다음으로 상기 폴리카프로락톤 용액을 통해 파이버 매트릭스를 제조하기 위해 전기방사 장치를 준비한다. 상기 전기방사 장치는 전압원, 쉬린지(syringe) 펌프, 금속 바늘, 집전판(SUS 시트, 300 mm×300 mm)를 포함한다.
상기 폴리카프로락톤 용액을 쉬린지에 주입 후, 쉬린지를 수평방사의 형태로 하여 집전판과 금속 바늘사이를 15 cm 떨어지게 하여 쉬린지 펌프를 작동시켜 방사하였다. 이때, 상기 폴리카프로락톤 용액의 유속은 0.10 mL/min로 하며, 18G의 금속 평면 니들을 사용하였다. 방사를 하는 동시에 9 kV의 전압을 걸어 집전판에 랜덤하게 배향되도록 집적된 3차원 구조의 파이버 매트릭스를 제조하였다. 제조된 파이버 매트릭스를 5 mm 직경의 원형의 펀치로 뚫어 원형의 파이버 매트릭스를 제조하였다.
(3) 섬유형 마이크로 채널부 포함 층의 제조
상기 (2)에서 제조된 원형의 파이버 매트릭스를 상기 (1)에서 제조한 친수성 개질된 불소 함유 폴리머 용액을 담그고 1시간 동안 진공 조건을 유지하여 상기 파이버 매트릭스 사이사이에 상기 폴리머 용액이 스며들 수 있도록 한다.
상기 폴리머 용액에 담지시킨 파이버 매트릭스를 유리판의 중심에 놓고, 상기 (1)에서 제조한 친수성 개질된 불소 함유 폴리머 용액을 상기 파이버 매트릭스 위에 부은 뒤, 이를 패트리 접시(60×15 mm)로 압착시킨 다음, 254 nm 파장의 자외선을 5 분간 조사하여 경화를 진행하였다.
상기 경화가 완료된 400 ㎛ 두께의 멤브레인을 유리판에서 분리시킨 후 디클로로메탄(dichloromethane, DCM, Sigma-Aldrich, 270997-1L)에 1시간 동안 담가 두어 폴리카프로락톤 성분의 파이버 매트릭스를 용해시켜 제거하고, 이를 2×2.5 cm의 크기로 절단하였다.
(4) 용액 주입구, 배출구 포함 층의 제조 및 각 층의 결합
폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL, Mn 14,000)를 FDM 방식의 3D 프린터 베럴에서 70 ℃의 온도로 녹인 후 프린팅 속도와 고분자 주입 속도의 비율을 4:1로 하여 슬라이드 글라스 위에 도 1과 같이 제1 채널(112), 제2 채널(122) 및 제3 채널(132)의 패턴, 그리고 제1 주입구(111), 제2 주입구(121) 및 배출구(131)가 형성되도록 프린팅 하였다.
상기 채널들이 프린팅 된 슬라이드 글라스를 컬쳐 플레이트에 양면 테이프로 부착시킨 후 상기 (1)에서 제조한 친수성 개질된 불소 함유 폴리머 용액을 주입시킨 후 254 nm 파장의 자외선을 5 분간 조사하여 경화를 진행하였다.
경화된 불소 함유 폴리머를 슬라이드 글라스와 컬쳐 플레이트에서 분리시킨 후, 디클로로메탄에 1시간 동안 담가 두어 상기 각 채널, 주입구 및 배출구를 형성한 폴리카프로락톤 부분을 제거하였다.
이후, 상기 각 채널, 주입구 및 배출구 부분이 음각으로 형성된 친수성 개질된 불소 함유 폴리머 기재를 2×3 cm 로 절단한 뒤, 상기 (3)에서 제조된 마이크로 유체 구조체 포함 층을 일면에 부착하고, 타면에는 친수성 개질된 불소 함유 폴리머만으로 형성된 3×5 cm의 기재를 부착하여 3개 층으로 구성한 다음, 상기 3개 층의 상부와 하부에 아크릴판을 위치시키고 볼트와 너트를 이용하여 체결하였다.
비교 제조예 1: 마이크로 유체칩의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 마이크로 유체칩에서, 섬유형 마이크로 채널부를 포함하는 층을 적용하지 않고 마이크로 유체칩을 제조하였다.
구체적으로, 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL, Mn 14,000)를 3D 프린터 베럴에서 80 ℃의 온도로 녹인 후 프린팅 속도와 고분자 주입 속도의 비율을 4:1로 하여 슬라이드 글라스 위에 도 1과 같이 제1 채널(112), 제2 채널(122) 및 제3 채널(132)의 패턴, 그리고 제1 주입구(111), 제2 주입구(121) 및 배출구(131)가 형성되도록 프린팅 하였다.
상기 채널들이 프린팅 된 슬라이드 글라스를 컬쳐 플레이트에 양면 테이프로 부착시킨 후 폴리디메틸실록세인용액을 주입시킨 후 경화시켰다.
경화된 폴리디메틸실록세인을 슬라이드 글라스와 컬쳐 플레이트에서 분리시킨 후, 디클로로메탄에 1시간 동안 담가 두어 상기 각 채널, 주입구 및 배출구를 형성한 폴리카프로락톤 부분을 제거하였다.
이후, 상기 각 채널, 주입구 및 배출구 부분이 음각으로 형성된 폴리디메틸실록세인 기재를 3×5 cm 로 절단하고, 음각으로 형성되지 않은 면에 폴리디메틸실록세인만으로 형성된 3×5 cm의 기재를 부착하여 2개 층으로 구성한 다음, 상기 2개 층의 상부와 하부에 아크릴판을 위치시키고 볼트와 너트를 이용하여 체결하였다.
실시예 1: 지질 나노 입자의 제조
(1) 제1 용액의 제조
디팔미토일포스파티딜콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)(CAS No. 63-89-8, Avanti社) 20 mg 및 콜레스테롤(CAS No. 57-88-5, Avanti社) 10 mg을 에탄올 용매(000E0236-18L, Samchun pure chemicals) 10 mL에 용해시켜, 제1 용액을 준비한다.
(2) 지질 나노 입자의 제조
상기 제조예 1에서 제조한 마이크로 유체칩에 상기 제1 용액 및 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)를 포함하는 제2 용액을 주입하여 지질 나노 입자를 제조하였다.
구체적으로, 상기 제1 용액 및 제2 용액을 주입하기 위해, 쉬린지에 18G 니들, 타이곤 튜빙(외경: 2.38 mm, 내경: 0.79 mm), 그리고 튜빙 커넥터(1.58 mm 외경)를 연결하였다. 상기 튜빙 커넥터를 연결할 수 있도록, 마이크로 유체칩에 상부를 17G 니들로 천공하고, 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구와 연결하였다.
상기 제2 용액을 연속상으로 하여 제1 주입구에 각각 3 ㎕/min, 4 ㎕/min 및 5 ㎕/min의 속도로 쉬린지 펌프를 통해 주입하고, 제1 용액을 불연속상으로 하여 제1 주입구에 0.2 ㎕/min의 속도로 쉬린지 펌프를 통해 주입하였다.
상기 제1 용액과 제2 용액은 마이크로 유체칩 내 섬유형 마이크로 채널부에서 혼합되어 지질 나노 입자를 형성하고, 형성된 상기 지질 나노 입자는 배출구를 통해 수득하였다.
실시예 2: 지질 나노 입자의 제조
제조예 2에서 제조한 마이크로 유체칩을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 지질 나노 입자를 제조하였다.
실시예 3: 지질 나노 입자의 제조
제조예 3에서 제조한 마이크로 유체칩을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 지질 나노 입자를 제조하였다.
실시예 4: 파이렌(Pyrene) 함입 지질 나노 입자의 제조
(1) 실시예 2의 제1 용액에 파이렌(Pyrene, Sigma社) 1 mg 첨가하고, 상기 실시예 2과 동일하게 하여 지질 나노 입자(큰 파이렌 함입 지질 나노 입자(Large LNPs))를 제조하였다. 이때 연속상인 제2 용액을 3 ㎕/min의 속도로 쉬린지 펌프를 통해 주입하였다.
(2) 실시예 3의 제1 용액에 파이렌(Pyrene, Sigma社) 1 mg 첨가하고, 상기 실시예 3과 동일하게 하여 지질 나노 입자(작은 파이렌 함입 지질 나노 입자(Small LNPs))를 제조하였다. 이때 연속상인 제2 용액을 5 ㎕/min의 속도로 쉬린지 펌프를 통해 주입하였다.
실시예 5: 독소루비신(Doxorubicin) 함입 지질 나노 입자의 제조
(1) 실시예 2의 제1 용액에 독소루비신(Doxorubicin, DOX, Sigma社) 1 mg 첨가하고, 상기 실시예 2과 동일하게 하여 지질 나노 입자(큰 독소루비신 함입 지질 나노 입자(Large LNPs))를 제조하였다. 이때 연속상인 제2 용액을 3 ㎕/min의 속도로 쉬린지 펌프를 통해 주입하였다.
(2) 실시예 3의 제1 용액에 독소루비신(Doxorubicin, DOX, Sigma社) 1 mg 첨가하고, 상기 실시예 3과 동일하게 하여 지질 나노 입자(작은 독소루비신 함입 지질 나노 입자(Small LNPs))를 제조하였다. 이때 연속상인 제2 용액을 5 ㎕/min의 속도로 쉬린지 펌프를 통해 주입하였다.
실시예 6: 나노 입자의 제조
(1) 제1 용액 및 제2 용액의 제조
디클로로메탄에 폴리(ε-카프로락톤)(Poly(ε-caprolactone), PCL, Sigma-Aldrich, 440744-500G, Mn 70,000 ~ 90,000) 15%를 용해하여 불연속상인 제1 용액을 제조하고,
폴리비닐알코올(PVA, Mw 13,000~23,000, Sigma-Aldrich社)을 3% 증류수에 용해시켜 연속상인 제2 용액을 제조하였다.
(2) 나노 입자의 제조
상기 제조예 4에서 제조한 마이크로 유체칩에 상기 제1 용액 및 제2 용액을 주입하여 나노 입자를 제조하였다.
구체적으로, 상기 제1 용액 및 제2 용액을 주입하기 위해, 쉬린지에 14G 니들, 타이곤 튜빙(외경: 2.38 mm, 내경: 0.79 mm), 그리고 튜빙 커넥터(1.58 mm 외경)를 연결하였다. 상기 튜빙 커넥터를 연결할 수 있도록, 마이크로 유체칩에 상부를 14G 니들로 천공하고, 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구와 연결하였다.
상기 제2 용액을 연속상으로 하여 제1 주입구에 각각 1 mL/h 내지 5 mL/h의 속도로 쉬린지 펌프를 통해 주입하고, 제1 용액을 불연속상으로 하여 제1 주입구에 0.4 mL/h의 속도로 쉬린지 펌프를 통해 주입하였다.
상기 제1 용액과 제2 용액은 마이크로 유체칩 내 섬유형 마이크로 채널부에서 혼합되어 나노 입자를 형성하고, 형성된 상기 나노 입자는 배출구를 통해 수득한 뒤, 용매 증발법을 통해 입자화를 진행하였다.
비교예 1: 지질 나노 입자의 제조
비교 제조예 1에서 제조한 마이크로 유체칩을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 지질 나노 입자를 제조하였다.
실험예 1: 전기방사된 파이버의 직경 측정
상기 제조예 1 내지 3에서 제조된 파이버 매트릭스에 대하여, 주사전자현미경(Scanning Electrone Microscope, SEM, HITACHI S-4800)을 통해 관찰하여 이를 도 2에 나타내고, 계측 소프트웨어(ImageJ software, National Institutes of Health, Bethesda, USA)를 사용하여 전기방사된 섬유의 평균 직경을 측정하고 하기 표 1과 같이 나타내었다.
고분자 용액A의 농도(%) 고분자 용액의 유량
(mL/min)		 집진판의 전압
(kV)		 전기방사된 섬유의 평균 직경(㎛) 도 2
(Fiber)
제조예 1 17.5 0.10 9 12 MTMC12
제조예 2 15.0 0.08 11 6 MTMC6
제조예 3 10.0 0.06 10 3 MTMC3
(A는 폴리카프로락톤 용액임)
제조예 1 내지 3에서, 상기 전기방사 파이버 매트릭스는 디클로로메탄을 통해 제거된 뒤 폴리디메틸실록세인에서 섬유형 마이크로 채널부를 형성하므로, 상기 표 1에서 전기방사된 섬유의 평균 직경은 마이크로 유체칩 내 섬유형 마이크로 채널부를 형성하는 각 마이크로 채널의 평균 직경과 동일하다.
상기 표 1을 참조하면, 파이버 매트릭스를 제조하기 위하여 쉬린지 펌프를 통하여 방사할 경우, 고분자(폴리카프로락톤) 용액의 유량(mL/min) 및 집전판 상에 인가되는 전압(kV)을 조절함으로써, 전기방사된 파이버 매트릭스를 이용하여 다양한 직경의 마이크로 채널이 형성될 수 있음을 확인할 수 있다.
실험예 2: 마이크로 채널 형성 확인
상기 제조예 1 내지 3에서 제조된 파이버 매트릭스를 통해, 마이크로 유체칩 내 섬유형 마이크로 채널부가 형성된 것을 확인하기 위하여, 제조예 1 내지 3의 마이크로 유체칩의 섬유형 마이크로 채널부 포함 층의 단면과 표면을 주사전자현미경(Scanning Electrone Microscope, HITACHI S-4800)을 통해 관찰하여 이를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 제조예 1(MTMC12), 제조예 2(MTMC6) 및 제조예 3(MTMC3)에 따른 마이크로 유체칩은 모두 파이버 매트릭스가 위치하던 공간이 디클로로메탄에 의해 용해되어 마이크로 채널로서 형성되었고, 제조예 1 내지 3 각각에서 형성된 전기방사 섬유의 평균 직경과 일치하는 직경의 마이크로 채널이 형성된 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 3을 참조하면, 상기 제조예 1 내지 3의 마이크로 채널 간 연결 부위의 평균 크기는 마이크로 채널의 평균 직경이 작아질수록 작게 형성된 것을 확인할 수 있다. 도 3에서 x축의 12, 6 및 3은 각각 제조예 1, 제조예 2 및 제조예 3에 따른 마이크로 유체칩을 나타낸다.
실험예 3: 마이크로 유체칩 내 유체의 흐름 및 이를 통한 지질 나노 입자의 형성 확인
(1) 제조예 1 및 비교 제조예 1에 따른 마이크로 유체칩 내 유체의 흐름을 형광 이미지 측정법을 통해 확인하였다.
도 4의 A는 비교 제조예 1, B는 제조예 1에 따른 마이크로 유체칩 내 나노 입자 형성 매커니즘에 관한 개념도 및 형광 측정 이미지이다.
도 4를 참조하면, 비교 제조예 1에 따른 마이크로 유체칩 내 녹색 형광을 가진 도입된 제1 용액은 큰 계면 영역에서 제2 용액과 접촉하고 양쪽의 제2 용액에 의해 유체 역학적으로 집중되어 상대적으로 큰 직경의 배출구에서 얇은 흐름을 형성하는 것을 알 수 있다. 또한, 비교 제조예 1의 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 나노 입자 크기의 바이모달 분포는 제2 용액의 큰 계면 영역과의 비균질 혼합으로부터 기인하는 것으로 생각되며, 제조예 1의 마이크로 유체칩과 달리 내부에 섬유형 마이크로 채널부를 포함하지 않음에 상대적으로 큰 유체 흐름이 생성되어 나노 입자의 핵 생성에 따른 입자간 응집으로 인해 나노 입자의 평균 직경이 증가하는 것 알 수 있다.
이와 달리, 제조예 1에 따른 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 나노 입자의 경우, 내부에 섬유형 마이크로 채널부를 포함함에 따라 나노 입자의 핵 생성은 주로 작은 미세 채널에서 발생하게 되며, 이는 제1 용액과 제2 용액의 미세 접촉으로 인해 상기 비교 제조예 1의 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 나노 입자에 비해 상대적으로 작은 크기의 핵 형성으로 이어지는 것으로 이해될 수 있고, 마이크로 유체칩 내부의 섬유형 마이크로 채널부를 통해 유체의 흐름이 반복적으로 분할 및 병합이 반복됨에 따라 초기 생성된 나노 입자 핵 간의 상호 작용에 방해를 받은 결과 생성되는 나노 입자의 직경이 작은 것을 알 수 있다.
(2) 실시예 1 내지 3을 통해 제조된 지질 나노 입자에 대하여, 나노 입도 분석장비(Dynamic light scattering method, Zetasizer nano ZS, Malvern Instruments, Malvern, UK)를 통해 입자의 평균 직경 분포 중 누적된 50% 지점에서의 입자 크기를 측정하고, 하기 표 2 및 도 5와 같이 나타내었다. 도 5에서, 5, 4 및 3은 각각 제2 용액의 유속인 5 ㎕/min, 4 ㎕/min 및 3 ㎕/min를 나타낸다.
또한, 실시예 2(제2 용액의 유속 3 ㎕/min) 및 실시예 3(제2 용액의 유속 5 ㎕/min)에서 제조된 지질 나노 입자를 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, JEM-1010, 일본 JEOL社)을 통해 관찰하여 이를 도 6에 나타내었다.
도 5에서, MTMC 0, MTMC 12, MTMC 6 및 MTMC 3은 각각 비교예 1 및 실시예 1 내지 실시예 3에서 제조된 지질 나노 입자 크기 분포를 나타낸다.
제2 용액(연속상)의 유속
(㎕/min)		 지질 나노 입자 크기
(nm)
비교예 1
(마이크로 채널 없음)		 3.0 451.8 ± 129.0
4.0 330.0 ± 130.1
5.0 298.5 ± 102.8
실시예 1
(마이크로 채널 직경: 12 ㎛)		 3.0 529.9 ± 141.3
4.0 404.0 ± 81.8
5.0 321.6 ± 43.5
실시예 2
(마이크로 채널 직경: 6 ㎛)		 3.0 215.5 ± 136.9
4.0 169.4 ± 91.5
5.0 90.1 ± 24.8
실시예 3
(마이크로 채널 직경: 3 ㎛)		 3.0 97.1 ± 56.5
4.0 85.9 ± 39.4
5.0 69.1 ± 31.0
상기 표 2 및 도 5를 참조하면, 마이크로 채널의 평균 입경을 달리하는 실시예 1 내지 3에서 쉬린지 펌프을 통해 제2 용액(연속상)의 유속을 달리 조절함으로써, 다양한 평균 입경의 지질 나노 입자를 형성할 수 있는 것을 확인하였다.
또한, 도 5의 결과를 통해, 제2 용액(연속상)의 유속이 증가할수록 생성되는 지질 나노 입자의 평균 입경이 줄어드는 것을 확인하였다.
실험예 4: 마이크로 유체칩을 통한 지질 나노 입자의 유효 성분 함입 및 방출 거동 평가
(1) 지질 나노 입자의 유효 성분 함입 거동 확인
실시예 4를 통해 제조된 지질 나노 입자를, 각각 NIH/3T3, HepG2 및 HeLa 세포가 있는 메디아(media)에 넣어준 후 각 세포의 함입량 및 함입효율을 측정하고, 그 결과를 도 7A에 나타내었다. 도 7A을 참조하면, 실시예 4에서 제조된 지질 나노 입자는 NIH/3T3 세포보다 암세포인 HepG2 및 HeLa 세포에서 더 함입이 많이 되는 것을 확인하였다.
또한, 실시예 4를 통해서 제조된 지질 나노 입자를 함입한 HeLa 세포를 공초점 현미경(confocal Microscope, LSM710, Carl Zeiss)으로 관찰하고, 그 결과를 도 7B에 나타내었다. 도 7B를 참조하면, 작은 지질 나노 입자가 큰 지질 나노 입자보다 세포에 더 함입이 많이 되는 것을 확인하였다.
(2) 지질 나노 입자의 유효 성분 방출 거동 확인
실시예 5를 통해 제조된 지질 나노 입자를, 각각 NIH/3T3, HepG2 및 HeLa 세포가 있는 메디아(media)에 넣어준 후 각 세포의 사멸율 측정하고, 그 결과를 도 8A에 나타내었다. 도 8A를 참조하면, 실시예 5에서 제조된 지질 나노 입자는 NIH/3T3 세포보다 암세포인 HepG2 및 HeLa 세포를 더 많이 사멸시키는 것을 확인하였다.
또한, 실시예 5를 통해서 제조된 지질 나노 입자를 함입한 각 NIH/3T3, HepG2 및 HeLa 세포를 LIVE/DEADTM로 염색한 후 이를 형광현미경 (Fluorescence microscope, IX71, OLYMPUS Co. Ltd.)으로 관찰하고, 그 결과를 도 8B에 나타내었다. 도 8B를 참조하면, 작은 지질 나노 입자가 큰 지질 나노 입자보다 세포를 더 많이 사멸시키는 것을 확인하였다.
실험예 5: 불소 함유 폴리머 기재층의 유기 용매에 대한 팽윤 저항성 평가
퍼플루오로폴리에테르(PFPE, Fluorolink MD 700, Solvay 社) 17 g을 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA, Mn=575) 3 g 및 2-hydroxy-2-methylpropiophenone 0.8 g과 섞어 혼합한 후 진공 조건 하에서 기포를 제거한다. 이후, 상기 혼합물을 254 nm 파장의 자외선을 5분간 조사하여 친수성 개질된 불소 함유 폴리머를 제조한다. 경화된 폴리머를 1×1 cm의 크기로 절단한다. 엘라스토머(elastomer)와 경화제(SYLGARD 184 Base&Curing Agent, 세왕하이텍)를 10:1 중량비로 혼합하여 폴리디메틸실록세인 용액을 제조하였다. 이를 오븐에 60 ℃에서 5시간 동안 경화시켰다. 경화된 폴리디메틸실록세인을 1×1 cm의 크기로 절단한다.
두 절단된 폴리머를 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) 용액에 20분 침지 후 변화된 길이를 측정한다. 도 10을 참조하면 폴리디메틸실록세인의 길이는 20% 증가하였지만 불소 함유 폴리머의 길이는 변하지 않은 것을 확인하였다.
실험예 6: 불소 함유 폴리머 기재층의 친수성 개질 비율에 따른 접촉각 평가
퍼플오로폴리에테르(PFPE, Fluorolink MD 700, Solvay 社)에 다양한 비율 (0%, 10%, 15%, 20%)의 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA, Mn=575)를 혼합한다. 이후 경화제인 2-hydroxy-2-methylpropiophenone와 섞어 혼합한 후 진공 조건 하에서 기포를 제거한다. 이후, 상기 혼합물을 254 nm 파장의 자외선을 5분간 조사하여 친수성 개질된 불소 함유 폴리머를 제조한다.
상기 각각의 상이한 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트의 비율을 가진 불소 함유 폴리머를 슬라이드 글라스 위에 두고 30G 주사바늘을 시린지 펌프를 이용하여 0.1 mL/min의 유속으로 밀어 일정한 양의 물방울을 떨어뜨린다. 20분 후 물과의 접촉각을 계측 소프트웨어(ImageJ software, National Institutes of Health, Bethesda, USA) 등을 통해 측정한다. 도 11을 참조하면 친수성 개질된 불소 함유 폴리머 내 폴리(에틸렌) 글리콜 함량이 0% 부터 15%인 경우 까지는 물과의 접촉각이 감소하다가 이후 유의미한 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다.
실험예 7: 섬유성 파이버의 크기와 유체의 흐름에 따른 입자 크기의 변화
섬유형 마이크로 채널의 평균 직경이 각각 12 ㎛와 17 ㎛인 마이크로 유체칩을 제조한다.
폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL, Mn 14,000) 3 g, 덱사메타손(Dexamethasone-Water soluble, DEX, Sigma-Aldrich, D2915-100MG) 0.08 g, 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) 17 g을 혼합하여 제1 용액을 제조한다.
폴리비닐알코올(PVA, Mw 13,000~23,000, Sigma-Aldrich)을 물에 용해하고 3% 농도가 되도록 하여 제2 용액을 제조한다.
제2 용액을 상기 제조한 마이크로 유체칩의 제1주입구에 주입하고 제1 용액을 제2 주입구에 주입한다. 이때 제1 용액의 유속은 0.4 mL/h으로 고정하고 제2 용액의 유속을 1.0 mL/h, 3.0 mL/h, 5.0 mL/h로 각각 변화시키면서 에멀젼을 생성시킨다. 생성된 에멀젼은 80 rpm으로 24시간 동안 교반하면서 디클로로메탄을 증발시켜 입자가 형성되도록 한다. 이후 3,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 폴리비닐알코올을 제거한 후 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관찰하고 계측 소프트웨어(ImageJ software, National Institutes of Health, Bethesda, USA)를 통해 입자의 크기를 측정한다.
도 12를 참조하면, 섬유형 마이크로 채널의 평균 직경이 17 ㎛인 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 나노 입자의 직경보다 평균 직경이 12 ㎛인 마이크로 유체칩을 통해 제조되는 나노 입자의 직경이 더 작음을 확인할 수 있고 동일한 평균 직경의 섬유형 마이크로 채널을 포함하는 마이크로 유체칩에서도 제2 용액의 유속이 증가할수록 생성되는 나노 입자의 크기가 줄어듦을 확인할 수 있다.
도 13을 참조하면, 상기 생성된 입자를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관측한 결과이며, 매끈한 표면의 구형 입자가 생성됨을 확인할 수 있다.
실험예 8: 마이크로 유체칩를 이용한 입자의 약물 거동과 호모게나이져를 이용한 약물 거동의 비교
섬유형 마이크로 채널의 평균 직경이 12 ㎛인 마이크로 유체칩을 이용하여 제1 용액의 유속이 0.4 mL/h, 제2 용액의 유속이 1.0 mL/h로 하여 생성된 입자를 사용한다. 상기 제1 용액 및 제2 용액은 상기 실험예 7에서와 동일한 조건으로 준비한다.
대조군으로 호모게나이져(Homogenizer, VELP SCIENTIFICA, R20900010)를 이용하여 2,000 rpm으로 교반하여 입자를 제조한다.
상기 마이크로 유체칩과 호모게나이져를 이용하여 제조된 나노 입자 내 봉입율을 측정하기 위해, 나노 입자 10 mg을 아세토나이트릴(Acetonitrile, Burdick&Jackson, HPLC) 5 mL에 용해시킨 후 포토 다이오드 어레이 검출기(Photodiode array detector, alliance 2998 HPLC system)가 장착된 고성능 액체크로마토그래피(High performance Liquid chromatography, HPLC, water alliance 2695 HPLC system)을 이용한다. 컬럼은 C18 역상컬럼(250×4.6 mm, 5 ㎛), 이동상은 아세토나이트릴 : Deionized water (DW) : 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, Sigma Aldric, T6508-500ML) = 50 : 50 : 0.01(v/v/v)을 이용하고 1.0 mL/min, 254 nm파장에서 검출한다. 도 14를 참조하면, 마이크로 유체칩을 통해 생성된 입자의 약물 봉입률은 56.26%, 호모게나이져로 생성된 입자의 약물 봉입률은 11.95%로 약 5배의 봉입률 차이를 나타내었다.
약물 방출실험은 각 프란츠 셀에 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS) 7.5 mL을 넣고 투석막(Dialysis membranes MWCO 3,500, Cellu-Sep, Sequin, TX, USA)으로 연결시켰다. 한쪽 프란츠 셀에만 입자 10 mg을 분산시키고 37 ℃상에서 방출 실험을 진행하였다. 시간 마다 200 ㎕를 채취하고 새로운 인산완충식염수 200 ㎕를 첨가하였다. 이후 위에 기제된 조건으로 HPLC를 통해 시간마다 약물 방출량을 측정하였다.
도 15 A를 참조하면, 방출되는 약물의 양은 마이크로 유체칩으로 제작된 나노 입자의 쪽이 더 큰 것을 알 수 있으며, 이는 도 14에서 확인되는 바와 같이 마이크로 유체칩과 호모게니이져를 이용한 나노 입자의 각 약물 봉입률 차이에 따른 차이로부터 기인한 것으로 이해될 수 있다.
도 15 B는 봉입율에 대한 약물 방출을 %로 나타낸 그래프로서, 호모게나이져를 통해 제조된 나노 입자보다 마이크로 유체칩을 통해 제조된 나노 입자의 경우가 서방성으로 약물이 방출됨을 확인할 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
100: 제1 기재
111: 제1 주입구
112: 제1 채널
113: 제1 주입 튜빙
121: 제2 주입구
122: 제2 채널
123: 제2 주입 튜빙
131: 배출구
132: 제3 채널
133: 배출 튜빙
200: 제2 기재
210: 섬유형 마이크로 채널부
300: 베이스 기재
400: 마이크로 유체칩

Claims (12)

  1. 기재상에 형성된 제1 주입구, 제2 주입구, 배출구 및 섬유형 마이크로 채널부를 포함하고, 상기 제1 주입구를 통해 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 주입구를 통해 제2 용액이 주입되며,
    상기 제1 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점과 제1 채널을 통해 연결되고, 상기 제2 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제2 지점과 제2 채널을 통해 연결되며,
    상기 배출구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점과 제3 채널을 통해 연결되되, 상기 제1 주입구를 통해 주입된 제1 용액 및 제2 주입구를 통해 주입된 제2 용액은, 상기 제3 채널을 통해 배출되고,
    상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점 내지 제3 지점은 각각 서로 다른 지점인 것인,
    마이크로 유체칩.
  2. 제1항에서,
    상기 섬유형 마이크로 채널부는 복수개의 마이크로 채널이 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수 연결부위를 형성하는 3차원의 네트워크 구조인 것인,
    마이크로 유체칩.
  3. 제2항에서,
    상기 마이크로 채널의 평균 직경은 1 ㎛ 내지 20 ㎛인 것인,
    마이크로 유체칩.
  4. 제2항에서,
    상기 마이크로 채널 간의 연결부위의 평균 직경은 0.5 ㎛ 내지 10 ㎛인 것인,
    마이크로 유체칩.
  5. 제1항에서,
    상기 제1 용액은 인지질을 포함하고, 상기 제2 용액은 버퍼 용액을 포함하며,
    상기 제1 용액과 제2 용액은 상기 섬유형 마이크로 채널부에서 합류하여 나노 입자를 형성하고,
    상기 나노 입자는 상기 제3 채널을 통해 배출되는 것인,
    마이크로 유체칩.
  6. 제5항에서,
    상기 인지질은 디올레일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine, EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
    마이크로 유체칩.
  7. 제5항에서,
    상기 버퍼 용액은 탈이온수, 인산완충용액, 인산완충식염수인 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
    마이크로 유체칩.
  8. 제1항에서,
    상기 기재는 불소 함유 폴리머를 포함하고,
    상기 불소 함유 폴리머는 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene) 폴리에테르 에테르 케톤(Polyether ether ketone) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
    마이크로 유체칩.
  9. 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구를 포함하는 제1 기재; 및
    섬유형 마이크로 채널부를 포함하는 제2 기재를 포함하고,
    상기 제1 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점과 제1 채널을 통해 연결되고, 상기 제2 주입구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제2 지점과 제2 채널을 통해 연결되며,
    상기 배출구는 상기 섬유형 마이크로 채널부의 제3 지점과 제3 채널을 통해 연결되되, 상기 제1 주입구를 통해 주입된 제1 용액 및 제2 주입구를 통해 주입된 제2 용액은, 상기 제3 채널을 통해 배출되고,
    상기 섬유형 마이크로 채널부의 제1 지점 내지 제3 지점은 각각 서로 다른 지점인 것인,
    마이크로 유체칩.
  10. 제9항에서,
    상기 마이크로 유체칩은 베이스 기재를 더 포함하고,
    상기 제1 기재의 어느 한 면과 상기 제2 기재의 어느 한 면은 서로 맞닿도록 구비될 때,
    상기 제2 기재의 상기 제1 기재와 맞닿지 않은 타면이 상기 베이스 기재의 어느 한 면과 맞닿도록 형성되는 것인,
    마이크로 유체칩.
  11. 제10항에서,
    상기 제1 기재, 제2 기재 및 베이스 기재 중 적어도 어느 하나의 기재는 불소 함유 폴리머를 포함하고,
    상기 불소 함유 폴리머는 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene) 폴리에테르 에테르 케톤(Polyether ether ketone) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인,
    마이크로 유체칩.
  12. (1) 복수개의 마이크로 채널이 서로 얽혀 마이크로 채널 간의 다수 연결부위를 형성하는 3차원 네트워크 구조의 섬유형 마이크로 채널부를 제조하는 단계;
    (2) 기재상에 제1 주입구, 제2 주입구, 배출구 및 상기 (1) 단계에서 제조된 섬유형 마이크로 채널부와 상기 제1 주입구, 제2 주입구 및 배출구를 각각 연결하는 통로인 제1 채널, 제2 채널 및 제3 채널을 형성하는 단계;
    (3) 상기 제1 주입구를 통해 제1 용액을 주입하고, 상기 제2 주입구를 통해 제2 용액을 주입하여 상기 섬유형 마이크로 채널부에서 상기 제1 용액 및 제2 용액이 혼합되어 나노 입자를 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 용액은 인지질을 포함하고,
    상기 제2 용액은 버퍼 용액을 포함하는 것인,
    나노 입자의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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