KR20200065786A - 다중 미립구체 제조장치 및 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다중 미립구체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 화합물, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 유효성분을 포함하는 다중 미립구체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다중 미립구체 제조방법은 저비용으로 유효성분의 미세캡슐화가 가능할 뿐만 아니라 연속공정을 통해 효율적이고, 간편하게 다중 미립구체를 대량 생산할 수 있으므로 산업화를 위한 스케일-업이 가능한바, 제약 및 미용 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.

Description

다중 미립구체 제조장치 및 제조방법{Multi-particulate sphere manufacturing apparatus and method}
본 발명은 다중 미립구체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 화합물, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 유효성분을 포함하는 다중 미립구체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
다중 미립구체(Vesosome)는 계면활성제로 둘러싸인 구형의 단일 구조물 내부 수상(aqueous phase)에 다수의 미립구체(liposome)를 포집하고 있는 다중방 구조(multi-compartment structure)이다. 다중 미립구체는 약물전달 시스템에서 단일 약물의 다기능화 및 내부 유효성분의 체내 안정성 확보를 위해 개발된 것이다.
다중 미립구체는 체내 안정성(Longevity in physical condition), 다기능화(Multi functionality) 및 유효성분의 안정성 강화(Stability of interior component) 특성을 가진다. 구체적으로, 생체에 적용할 때, 상기 다중 미립구체의 외부 막이 다양한 물리·화학적 조건으로부터 내부 유효성분을 안정적으로 보호할 수 있다. 또한 다중 미립구체 및 미립구체의 생체 내 안정성에 관한 연구에서, 다중 미립구체의 체내 안정성이 미립구체보다 우수하다는 것이 밝혀졌다. 또한 다중 미립구체에 다양한 유효성분을 독립적으로 봉입할 수 있으며, 이를 통해 복합 기능성 화장품 및 의약품의 개발이 가능하다. 뿐만 아니라 다중 미립구체의 내부에 포함된 미립구체의 표면 기능화는 유효성분을 원하는 장소까지 전달할 수 있다. 또한 다중 미립구체의 내부의 유효성분이 미립구체에 각각 봉입되어 있으므로, 유효성분 간의 뭉침 현상(aggregation)이 현저히 감소한다.
그러나 종래 다중 미립구체의 제조방법은 제조 과정이 복잡하여, 이를 산업적으로 이용하기 위한 스케일-업(scale-up)에 한계가 있다. 또한 다중 미립구체의 내부에 봉입될 유효성분의 비율 및 외부 막 구성요소의 농도 조절 등이 정밀하게 조정되어야하므로, 균일한 크기 및 균일한 유효성분의 농도를 갖는 다중 미립구체의 개발이 어려운 실정이다.
이에 본 발명자들은 다중 미립구체 제조방법을 단순화시키고, 균일한 크기 및 균일한 유효성분 농도를 갖는 다중 미립구체를 제조하기 위하여, 다채널 미세유체 시스템, UV 경화 시스템 및 회전장치가 병렬로 연결된 다중 미립구체 제조장치를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 다중 미립구체 제조방법 및 이를 통해 제조된 다중 미립구체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 다중 미립구체 제조장치의 다채널 미세유체 시스템에 수용성 용액 및 지용성 용액을 주입하여 미세액적을 제조하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 미세액적에 자외선을 조사하여 미립구체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 미립구체에 원심력을 가하여 다중막을 형성하는 단계;를 포함하는 다중 미립구체 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법을 통해 제조된 다중 미립구체를 제공한다.
본 발명에 따른 다중 미립구체 제조방법은 저비용으로 유효성분의 미세캡슐화가 가능할 뿐만 아니라 연속공정을 통해 효율적이고, 간편하게 다중 미립구체를 대량 생산할 수 있으므로 산업화를 위한 스케일-업이 가능한바, 제약 및 미용 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1 및 2는 본 발명에 따른 다중 미립구체 제조 장치 및 다중 미립구체 제조 시스템의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 다채널 미세유체 시스템을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 다중 미립구체 제조 시스템의 연속공정을 통해 미세액적의 제조 가능 여부를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 다중 미립구체 제조를 위한 회전장치를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 다채널 미세유체 시스템의 유량에 따른 다중 미립구체의 크기 균일도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 본 발명의 다채널 미세유체 시스템의 채널 높이 및 폭에 따른 다중 미립구체의 크기 균일도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 다중 미립구체의 가혹안정성을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 다중 미립구체의 세포독성 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 다중 미립구체의 유지도를 평가한 결과를 타나내는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 다중 미립구체 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 다중 미립구체를 제공한다.
본 발명에 있어서, “다중 미립구체”는 다수의 미립구체를 포집하고 있는 다중방 구조의 계면활성제로 둘러싸인 구형의 단일 구조물을 의미하며, 다소포성 소포(multivesicular vesicule, MVV)로도 불린다. 종래에는 단일막의 미립구체를 제조한 후 시트 형태로 부유된 막에 상기 미립구체를 첨가하여 다중 미립구체를 제조하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 미립구체는 0.1 내지 10000 nm인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다중 미립구체 제조방법은 (a) 다중 미립구체 제조장치의 다채널 미세유체 시스템에 수용성 용액 및 지용성 용액을 주입하여 미세액적을 제조하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 미세액적에 자외선을 조사하여 미립구체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 미립구체에 원심력을 가하여 다중막을 형성하는 단계;를 포함한다.
상기 다중 미립구체 제조장치는 주사기 펌프; 하나 이상의 미세유체 채널을 포함하며, 상기 주사기 펌프의 일단과 연결된 다채널 미세유체 시스템; 상기 미세유체 채널에 연결된 회전장치; 및 상기 미세유체 채널에 자외선을 조사하는 UV 경화 시스템;을 포함한다.
본 발명에 따른 다중 미립구체 제조 장치 및 다중 미립구체 제조 시스템의 모식도는 도 1 및 2에 나타내었다.
본 발명의 일 실시예에서, 주사기 펌프는 2 개 이상으로 구성되며, 상기 2 개 이상의 주사기 펌프와 각각 연결된 튜브는 교차하는 지점이 1 개 이상인 것이 바람직하다. 상기 주사기 펌프는 수용성 용액 또는 지용성 용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 다채널 미세유체 시스템은 채널의 높이 및 폭이가 500 μm 이하인 경우 소프트-식각(soft-lithography) 공정을 통해 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane, PDMS)기반으로 제작하는 것이 바람직하며, 500 μm 이상인 경우 폴리메틸메타크릴레이트(Poly(methyl methacrylate), PMMA) 시트를 레이저 조각기로 조각하여 제작하는 것이 바람직하다. 또한 상기 다채널 미세유체 시스템의 채널의 높이 및 폭 조절을 통하여 미립구체의 크기 및 생산 속도를 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 회전장치는 상기 주사기 펌프를 통해 미세유체 채널에 주입되는 수용성 용액 및 지용성 용액을 포함하며, 회전장치의 중앙부에 다채널 미세유체 시스템에서 나오는 채널이 연결되어 있다. 상기 회전 장치를 작동시키면, 원심력에 의하여 수용성 용액과 지용성 용액이 분리되어 회전하며, 수용성 용액과 지용성 용액의 경계에는 단일 지질층이 형성된다. 다채널 미세유체 채널에서 형성된 미립구체가 원심력에 의해 회전장치 내부의 수용성 용액에서 지용성 용액으로 이동되며, 이 때 다중 미립구체가 제조된다.
본 발명의 다른 실시예에서, UV 경화 시스템은 미세유체 채널에 자외선을 조사하며, 이를 통해 제조된 미립구체가 경화된다. 상기 UV 경화 시스템은 자외선을 조사할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용 가능하다.
본 발명의 다른 실시예에서, 수용성 용액은 용매로서 1차 및 2차 알코올 및 물로 구성된 군으로부터 선택된 최소 하나 이상의 수용성 용매를 포함한다. 상기 수용성 용매는 산 또는 염기를 더 포함할 수 있다.
상기 수용성 용액은 유효성분으로서 화합물, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 유효성분을 포함하며, 바람직하게는 EGF(epidermal growth factor), FGF(fibroblast growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor 1), 나이아신아마이드(niacinamide) 및 아데노신(adenocin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에서, 지용성 용액을 제조하기 위한 유기용매는 헥세인(Hexane), 데칸(decane), n-데칸(n-decane), 도데칸(dodecane), 스쿠알렌, 콜레스테롤, 테트라데칸(tetradecane), 헥사데칸(hexadecane), 노난(nonane), 사이클로헥산, 폴리비닐알코올, 라우르산, 아세트산, 포름산, 벤젠, 나프탈렌, 니트로벤젠, 페놀 및 에틸렌 브로마이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 유기용매를 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 본 발명에 적합한 유기용매는 헥세인(Hexane), 데칸(decane), n-데칸(n-decane), 스쿠알렌 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된 최소 하나 이상의 유기용매를 포함한다. 또한, 더욱 견고한 지질 이중막을 제조하기 위해, 상기 유기용매의 혼합 비율을 조절할 수 있다. 또한, 더욱 견고한 지질 이중막을 제조하기 위해, 상기 유기용매의 혼합 비율을 조절할 수 있다. 또한 미립구체의 형태를 구형을 유지거나 미립구체의 안정성을 강화하기 위해 span80 같은 용매의 점성보다 높은 지용성 용액을 첨가할 수 있다.
또한 상기 지용성 용액은 미립구체의 지질 이중막 전구체의 제조에 사용되는 어떠한 지질과 친수성과 소수성을 포함하는 블록공중합체(AB diblock copolymer, ABA triblock copolymer)도 포함한다. 예를 들어, 상기 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 카르디오리핀(cardiolipin), 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 적합한 지질은 아솔렉틴(Asolectin), 다이파이타노일포스파티딜콜린(Diphytanoylphosphatidylcholine, DPhPC), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DHPC(1,2-diheptanoyl -sn-glycero-3-phosphocholine), DHPE(1,2-dihexanoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine), DMPC(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DIODPC(1,2-DiODodecyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine), DMPS(dimyristoylphophatidylserine), DLPC(dimyristoyl phosphatidylglycerol, dilauryl phosphatidycholine), DMPE(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPG(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)]), Lyso PC(1-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), Lyso PE(1-oleoyl-2 -hydroxysn-glycero-3-phosphoethanolamine), DDPC(1,2-didecanoyl-sn- glycero-3-phosphocholine), DEPA-NA(1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt)), DEPC(1,2-erucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPE(1,2- dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLOPC(1,2-linoleoyl- sn-glycero-3-phosphocholine), DLPA-NA(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt)), DLPE(1,2-dilauroyl-snglycero-3-phosphoethanolamine), DLPS-NA(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine (sodium salt)), DMPANA(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt)), DMPS-NA(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (sodium salt)), DOPA-NA(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt)), DOPC(1,2-oleoyl -sn-glycero-3-phosphocholine), DOPE(1,2-dioleoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine), DOPSNA(1,2-dioleoyl-sn- glycero-3-phosphoserine (sodium salt)), DPPA-NA(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt)), DPPE(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine), DPPS-NA(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (sodium salt)), DSPA-NA(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodium salt)), DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPE(1,2-diostearpyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine), MSPC(1-myristoyl, 2-stearoyl-sn-glycero 3-phosphocholine), PMPC(1-palmitoyl, 2-myristoyl-sn-glycero 3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl, 2-oleoyl-sn-glycero 3-phosphocholine), POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), PSPC(1-palmitoyl, 2-stearoyl-sn-glycero 3-phosphocholine), SMPC(1-stearoyl, 2-myristoyl-sn-glycero 3-phosphocholine), SOPC(1-stearoyl, 2-palmitoyl-sn-glycero 3-phosphocholine), SPPC(1-stearoyl, 2-palmitoyl-sn-glycero 3-phosphocholine), PCDA (10,12- pentacosadiynoic acid), 및 PMOXA-PDMS-PMOXA(poly(methyloxazoline)-poly(dimethylsiloxane)- poly(methyloxazoline)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 지용성 용액에서 지질의 농도는 특별하게 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.1 내지 19 중량%이고, 보다 바람직하게는 1 내지 3 중량%이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 단계 (a)의 미세액적의 크기는 수용성 용액 및 지용성 용액의 유속에 따라 조절되는 것이 바람직하며, 상기 유속의 비율이 감소할수록 미세액적의 크기가 감소하며, 상기 유속이 증가할수록 미세액적의 크기가 증가한다.
본 발명의 다중 미립구체 제조방법은 연속공정을 통해 다중 미립구체를 제조하는바, 효율적이며 간편하게 다중 미립구체를 대량 생산할 수 있으므로 산업화를 위한 스케일-업이 가능하다. 뿐만 아니라 상기 제조방법은 저비용으로 유효성분의 미세캡슐화가 가능하다는 장점이 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 다중 미립구체는 내부의 미립구체에 다양한 유효성분을 독립적으로 봉입할 수 있으며, 이를 통해 복합 기능성 화장품 및 의약품의 개발이 가능한바, 제약 및 미용 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
비교예 1. 미립구체 제조 및 특성 분석
1-1. 미립구체 제조
태반 유래 성분인 EGF(epidermal growth factor), FGF(fibroblast growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor 1), 나이아신아마이드(niacinamide) 및 아데노신(adenocin)을 포함하는 미립구체를 제조하였다.
INCI명 EGF Liposome FGF Liposome IFG-1 Liposome Niacin
some		 Adeno
some
증류수 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100
레시틴 10.0 10.0 10.0 4.0 4.0
부틸렌글리콜 2.0 2.0 2.0 10.0 10.0
sh-oligopeptide-1
(EGF)		 0.01
sh-polypeptide-1
(bFGF)		 0.01
sh-oligopeptide-2
(IGF-1)		 0.01
나이아신아마이드 2.0
아데노신 2.0
EDTA-2Na 0.01 0.01 0.01
Tween 20 2.0 2.0 2.0
1,2-헥산디올 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
구체적으로, 상기 표 1의 성분을 칭량한 후 50℃로 가온 및 용해하였다. 용해된 혼합물을 호모-믹서(Mark-Ⅱ, Primix, Japan)로 3,000 rpm으로 3 분 동안 혼합하였다. 상기 혼합물을 고압유화기(Picomax MN 4000BF, Korea)를 이용하여 1,000 Bar에서 3 회 통과시킨 후 30 ℃로 냉각하여 미립구체를 수득하였다.
1-2. 미립구체의 입도 분석
상기 비교예 1-1에서 제조된 미립구체의 입도는 Particle Size Analysis(Malvern, USA)를 이용한 DLS(dianymic light scattering) 법으로 분석하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.
INCI명 EGF Liposome FGF Liposome IGF -1 Liposome Niacin
some 		Adeno
some
입도(nm) 217.9 221.9 242.5 202.5 207.4
표 2에 나타낸 바와 같이, 비교예 1-1에서 제조된 미립구체의 평균 입도는 218.44 nm인 것을 알 수 있다.
실시예 1. 다중 미립구체 제조 시스템 설계 및 제조
다중 미립구체 제조 시스템을 설계하였으며, 상기 시스템의 모식도는 도 1 및 2에 나타내었다.
다채널 미세유체 시스템 설계 및 제작
다채널 미세유체 시스템은 미세액적(microdroplet)이 연속으로 생산될 수 있는 구조로 설계된 플로우 포커싱(flow focusing) 형태이며, 제조되는 미세액적의 크기를 용이하게 제어하기 위하여 채널의 높이 및 폭(100 μm, 200 μm, 400 μm, 2 mm, 4 mm)을 동일하게 설계하였다. 채널의 높이 및 폭이 500 μm 이하인 미세유체 시스템은 소프트-식각(soft-lithography) 공정을 통해 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane, PDMS)기반으로 제작했으며, 500 μm 이상인 미세유체 시스템은 폴리메틸메타크릴레이트(Poly(methyl methacrylate), PMMA) 시트를 레이저 조각기로 조각하여 제작하였다. 제작된 다채널 미세유체 시스템은 도 3에 나타내었다.
상기 다중 미립구체 제조 시스템의 연속공정을 통해 미세액적을 제조할 수 있는지 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, PDMS 또는 PMMA 기반의 시스템을 이용한 다중 미립구체 제조 시스템에서 미세액적이 연속적으로 생산되는 것을 확인하였다. 또한 상기 미세액적은 유체가 모두 소모될 때까지도 안정적으로 생산된다는 것을 확인하였다.
상기 다채널 미세유체 시스템을 이용한 미립구체 제조는 주사기 펌프를 통해 수용성 용액을 다채널 미세유체 시스템에 일정한 속도로 주입하는 동시에 지용성 용액의 유속을 높임으로써 미세액적을 형성시킨다. 그 후 상기 미세액적을 UV 경화 시스템에 통과시켜, 미립구체가 제조된다.
다중 미립구체 제조를 위한 회전장치 설계 및 제작
제조된 다중 미립구체의 용이하게 제조하기 위한 회전장치를 설계하였다. 회전장치에는 RCF(relative centrifugal force)라는 상대원심력의 세기를 나타내거나 혹은 이러한 상대원심력을 유추할 수 있는 회전수(RPM)이 표시가 되는 장치가 있어야한다. 또한, 회전을 원활하게 해줄 수 있는 장치가 필요하다. 상용화되어 있는 제품으로는 스핀쿼터라는 장치가 있지만 고가에 부피도 크기 때문에 쉽게 구할 수 있는 개인용 컴퓨터의 쿨링팬을 이용하였다. 회전장치는 회전체, 쿨링팬(Zalman)과 회전수를 조절하기 위한 RPM 컨트롤러를 이용하여 제작하였다.
구체적으로, 회전체는 페트리 디쉬(SPC)와 그 뚜껑의 중심부에 구멍을 뚫은 후 레이저로 절단한 팔콘 튜브를 연결하여 제작하였다(도 5). 제작된 회전체를 쿨링팬과 연결하여 회전장치를 완성하였다. 상기 회전장치의 경우 내부에 다채널 미세유체 시스템에서 주입하는 수용성 용액 및 지용성 용액과 동일한 용액을 채운다. 상기 회전장치를 회전시키면 원심력에 의하여 수용성 용액과 지용성 용액이 분리되어 돌아가며, 수용성 용액과 지용성 용액의 경계에는 단일 지질층(lipid mono layer)이 형성된다. 상기 회전장치의 중앙부에 다채널 미세유체 시스템에서 나오는 채널을 연결하였다. 다채널 미세유체 시스템에서 형성된 미립구체가 원심력에 의해 회전장치 내부의 수용성 용액에서 지용성 용액으로 이동되며, 이 때 다중 미립구체가 제조된다.
다중 미립구체 제조 시스템을 이용한 다중 미립구체 제조
다중 미립구체 제조 시스템은 주사기 펌프, 다채널 미세유체 시스템, UV 경화 시스템 및 회전장치를 포함한다(도 1 및 2). 상기 다채널 미세유체 시스템은 채널의 높이 및 폭에 따라 PDMS 또는 PMMA 기반의 시스템을 사용하였다.
구성요소 공급업체 제품번호 혼합 비율
(부피 비)
수용성
용액		 PEG-DA 600 Sigma aldrich 455008 10
Tris -EDTA 용액 Sigma aldrich 93302 10
Darocur Sigma aldrich 405655 1
초순수 증류수
(Di water)
(또는 cosmetic solution)		 - - 80
지용성
용액		 미네랄 오일 Sigma aldrich M5904 100
Span 80 Sigma aldrich S6760 2
구체적으로, 표 2에 나타낸 조성을 갖는 수용성 용액 및 지용성 용액을 주사기 펌프를 통해 다채널 미세유체 시스템에 주입하여 미세액적을 생산하였다. 그 후 생산된 미세액적을 UV 경화 시스템에서 경화시켜 미립구체를 제조하였다. 다중 막을 제조하기 위하여, 제조된 미립구체를 회전장치에 통과시켜 다중 미립구체를 제조하였으며, 이를 회수하였다.
실시예 2. 다중 미립구체의 크기 균일도 및 생산속도 분석
다채널 미세유체 시스템의 유량 조절을 통해 다중 미립구체의 크기 균일도를 분석하였다. 구체적으로, 다중 미립구체 제조 시스템의 연속공정을 통해 다중 미립구체를 제조하였으며, 유량이 조절된 다채널 미세유체 시스템 내에서 형성된 미세 액적의 크기 균일도를 현미경으로 관찰하였다. 상기 분석 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 다채널 미세유체 시스템 내부로 주입되는 수용성 용액의 유량이 감소할수록 생산되는 미세액적의 크기가 감소하였으며, 유량이 증가할수록 미세액적의 크기도 증가한다는 것을 확인하였다. 이는 수용성 용액 및 지용성 용액의 유속의 비율에 따라 크기가 조절된다는 것을 의미한다.
다채널 미세유체 시스템의 채널 높이 및 폭 조절을 통해 다중 미립구체의 크기 균일도를 분석하였다. 구체적으로, 다중 미립구체 제조 시스템의 연속공정을 통해 다중 미립구체를 제조하였으며, 채널의 높이 및 폭이 상이한 다채널 미세유체 시스템 내에서 형성된 미세 액적의 크기 균일도를 현미경으로 관찰하였다. 상기 분석 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 채널의 높이 및 폭이 400 μm인 다채널 미세유체 시스템을 통해 제조된 다중 미립구체의 크기는 381.03 ± 56.95 μm(CV=14.9 %)이며, 높이 및 폭이 2 mm인 다채널 미세유체 시스템을 통해 제조된 다중 미립구체의 크기는 1.96 ± 0.19 mm(CV=9.7 %)임을 확인하였다. 상기 결과로부터 다채널 미세유체 시스템의 채널 높이 및 폭의 규모가 제조되는 다중 미립구체의 크기에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.
추가적으로, 채널의 크기에 따른 미세액적 생산 속도를 분석한 결과, 채널의 높이 및 폭이 2 mm인 다채널 미세유체 시스템을 사용하였을 때 최대 72 ml/h의 생산 속도를 보였다.
실시예 3. 다중 미립구체의 유효성분 봉입률 확인
상기 비교예 1-1에서 제조한 태반 유래 성분을 포함하는 미립구체인 아데노좀(adenosome) 및 나이아신좀(niacinsome)을 포함하는 다중 미립구체의 유효성분 봉입률을 확인하였다. 구체적으로 상기 아데노신좀 및 나이아신좀은 입도가 103.0 nm이며, 상기 실시예 1의 방법으로 다중 미립구체를 제조하였다. 제조된 다중 미립구체의 유효성분(아데노신 및 나이아신아마이드) 봉입률을 분석하였다. 구체적으로, 아데노신을 포함하고 형광을 띠는 폴리다이아세틸렌 리포솜(polydiacetylene liposome)을 포집한 다중 미립구체를 제조하였다. 상기 다중 미립구체의 겔화를 진행하기 전 용액과 겔화된 다중 미립구체를 제조하였다. 겔화된 다중 미립구체를 으깬 부피와 겔화되지 않은 용액의 부피를 같게 한 후 형광을 측정하고, 96웰 플레이트의 바닥 면적에 대한 형광 세기의 비율을 계산하였다.
봉입률을 분석한 결과, 아데노좀 및 나이아신좀을 포함하는 다중 미립구체의 유효성분 봉입률은 64.86 %이며, 표준편차는 약 4.11임을 확인하였다. 학계에 보고된 최고 수준의 유효성분 봉입률은 약 70 %이므로, 제조된 다중 미립구체의 유효성분 봉입률은 우수하다는 것을 알 수 있다.
실시예 4. 다중 미립구체의 가혹안정성 분석
가혹조건에서 실시예 1에서 제조한 다중 미립구체의 안정성을 분석하였다. 보다 상세하게는 다중 미립구체를 각각 4, 25 및 45 ℃에서 방치하였으며, 방치한 직후, 2 개월 후 및 4 개월 후에 지표성분인 아데노신의 함량을 측정하였다. 상기 아데노신 함량은 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 측정하였으며, 실험 조건은 다음과 같다.
- 검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 260 nm)
- 컬럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15cm인 스테인레스관에 5 um의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴화한 실리카겔을 충전한다.
- 이동상 : 10 mM 인산이수소칼륨 혼합액, 아세토니트릴 (95 : 5)
- 유량 : 0.8 mL/분
대조군으로는 비교예 1-1에서 제조된 미립구체를 사용하였으며, 다중 미립구체와 같은 방법으로 가혹안정성을 측정하였다. 상기 가혹안정성 측정 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 미립구체는 가혹조건에 방치한지 2 개월 후부터 지표성분인 아데노신의 함량이 감소하였다. 반면에, 다중 미립구체는 가혹조건에서 4 개월이 방치된 후에도 지표성분인 아데노신의 함량의 변화가 적은 것을 알 수 있다. 상기 결과는 다중 미립구체의 가혹안정성이 우수하다는 것을 의미한다.
실시예 5. 다중 미립구체의 세포독성 분석
피부 각질형성 세포주(HaCaT)에서 다중 미립구체의 세포독성을 WST-1 Proliferation assay(Roche Diagnostics, GmbH Mannheim, Germany)로 분석하였다. 구체적으로, 피부 각질형성 세포주는 한국 세포주 은행(서울, 한국)으로부터 구입하였으며, DMEM 배지(10 % FBS, 100 unit/ml 페니실린, 100 uni/ml 스트렙토마이신)를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 조건을 유지하는 배양기에서 배양하였다. 상기 피부 각질형성 세포를 96 웰 플레이트에 6x103 cells/well에 분주하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 상기 실시예 1-1에서 제조된 다중 미립구체를 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 ELISA 리더를 이용하여, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 다중 미립구체의 세포독성 분석 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 다중 미립구체는 화장품에 적용할 농도 수준 이상에서 세포에 대한 독성이 거의 없으며, 세포의 생장이 촉진되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 다중 미립구체를 고농도로 처리한 세포에서도 독성이 거의 없는 것을 확인하였다.
실시예 6. 다중 미립구체의 유지도 평가
비교예 1의 아데노좀 및 상기 아데노좀을 포함하는 다중 미립구체를 동결건조한 후 그 유지도를 비교하였다. 두 실험군 중 아데노좀을 포함하는 다중 미립구체의 찢어 샘플을 보관하고 있던 용액에 적셔 아데노좀을 분리하였다. 분리된 아데노좀을 투과전자현미경을 통해 관찰하여, 다중 미립구체의 유지도를 평가하였다. 다중 미립구체의 유지도 평가 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 아데노좀은 건조 중 미립구체가 터졌으며, 이로 인하여 아데노신이 결정화되어 있는 것을 관찰하였다(도 10A). 다양한 크기의 다중 미립구체는 건조시켰음에도 불구하고, 형태가 유지된 것을 알 수 있다(도 10B 내지 10C).
종합적으로 본 발명자들은 다중 미립구체 제조 시스템의 연속공정을 통해 효율적이고, 간편하게 다중 미립구체를 대량 생산할 수 있으며, 제조된 다중 미립구체가 세포독성이 낮을 뿐만 아니라 가혹조건에서도 매우 안정하다는 것을 확인하였다. 이는 저비용으로 유효성분의 미세캡슐화가 가능하다는 것을 의미하는 바, 본 발명의 다중 미립구체 제조 시스템은 약물 전달 및 미용 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. (a) 다중 미립구체 제조장치의 다채널 미세유체 시스템에 수용성 용액 및 지용성 용액을 주입하여 미세액적을 제조하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 미세액적에 자외선을 조사하여 미립구체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 미립구체에 원심력을 가하여 다중막을 형성하는 단계;를 포함하며,
    상기 다중 미립구체 제조장치는 주사기 펌프;
    하나 이상의 미세유체 채널을 포함하며, 상기 주사기 펌프의 일단과 연결된 다채널 미세유체 시스템;
    상기 미세유체 채널에 연결된 회전장치; 및
    상기 미세유체 채널에 자외선을 조사하는 UV 경화 시스템;을 포함하는 것인, 다중 미립구체 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지용성 용액은 지질을 0.1 내지 19 중량%의 농도로 포함하는 것인, 다중 미립구체 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 수용성 용액은 화합물, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 유효성분을 포함하는, 다중 미립구체 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 수용성 용액은 EGF(epidermal growth factor), FGF(fibroblast growth factor), IGF-1(Insulin-like growth factor 1), 나이아신아마이드(niacinamide) 및 아데노신(adenocin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상을 포함하는, 다중 미립구체 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 미세액적의 크기는 수용성 용액 및 지용성 용액의 유속의 비율에 따라 조절되는 것인, 다중 미립구체 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 다중 미립구체.

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