KR102631907B1 - 균일한 나노입자 제조를 위한 미세유체장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소수성 물질과 친수성 물질을 포함하는 나노입자를 제조하는데 유용한 장치에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 장치는 소수성 물질과 친수성 물질이 각각 유입되는 복수의 유입 채널, 상기 물질들이 혼합되어 나노입자가 제조되는 혼합 채널, 및 상기 제조된 나노입자가 유출되는 유출 채널을 포함하고, 상기 혼합 채널은 상기 물질의 혼합 효율을 상승시킬 수 있는 미세 기둥을 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 장치로 제조된 나노입자는 우수한 입자 균일성을 가지므로, 약물 또는 약물 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

균일한 나노입자 제조를 위한 미세유체장치 {Microfluidic Device For Preparing Uniform Nanoparticles}
본 발명은 친수성 물질들만으로 구성된 나노입자뿐만 아니라 소수성 물질과 친수성 물질을 함께 포함하는 나노입자를 제조하는데 유용한 신규한 장치, 및 이를 이용한 균일한 나노입자의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 수득된 나노입자는 입자의 균일성이 우수하여 약물 또는 약물 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
암, 심혈관 질환, 당뇨병 및 알츠하이머병을 비롯한 주요 질병의 치료 및 진단을 위한 치료제 및 영상화제의 표적 전달을 위해 많은 나노의약품이 개발되고 있다. 효과적인 약물 전달체는 약물의 치료 효과를 높이고 약물의 독성 효과를 감소시키면서 난용성 및 불안정한 약물의 흡수를 개선시킬 수 있으며 더 나아가 환자 예후 및 삶의 질을 위한 보다 효과적인 약물의 발견 및 개발로 이어지고 있다.
이러한 약물 전달용 나노의약 기술의 발전에 따라 지난 10년간 많은 연구들이 보고되었지만, 매우 소수의 치료 및 진단 관련 나노의약품들만이 FDA 승인을 받았다. 나노의약품의 낮은 성공률의 원인으로, 원하는 특성 또는 효능을 갖는 나노입자의 낮은 재현성(reproducibility) 및 배치간 물리화학적 특성의 차이를 들 수 있다. 약물 방출 프로파일의 재현성과 신뢰성은 성공적인 약물 전달 시스템의 중요한 요소이며, 이는 주로 나노입자의 크기 및 그 균일성에 달려 있다. 따라서, 나노입자의 제조과정에서 입자의 크기 및 균일성을 안정적이고 재현성 높게 확보할 수 있는 기술에 대한 개발 요구가 증가하고 있다. 특히, 나노의약품에서 대부분 전달되는 약물이 소수성인 경우가 많은 반면 약물 전달체로 사용되는 친수성 물질(인지질 등)과 균일한 합성이 더욱 어려워 그 개발이 이루어지지 못하고 있다. 이에 본 발명자들은 친수성 물질들만으로 구성된 나노입자뿐만 아니라, 소수성 물질과 친수성 물질을 함께 포함하는 나노입자를 제조하는데 유용한 신규한 장치를 개발하였고, 상기 신규한 장치를 통해서 균일한 나노입자를 제조하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.
Velencia, P. et al. Single-Step Assembly of Homogenous Lipid-Polymeric and Lipid-Quantum Dot Nanoparticles Enabled by Microfluidic Rapid Mixing. ACS Nano 4, 3, 1671-1679 (2010) Rhee, M. et al. Drop Mixing in a Microchannel for Lab-on-a-Chip Platforms. Langmuir, 24 (2), 590-601 (2008) Rohit, K et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters, 8, 9, 2906-12, (2008). Johnson, B. K. et al. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters, 91, 11,118302-1 -4 (2003) Bekard, I., et al. The Effects of Shear Flow on Protein Structure and Function. Biopolymers, 95, 11, 733-745 (2011)
기존의 나노입자 제조 방법은 주로 나노침전법(nanoprecipitation) 및 유화 기반 용매 증발법(emulsification-based solvent evaporation)과 같은 표준화되지 않은 다단계 공정으로 구성되어 있다. 나노입자 제조 방법의 50% 이상을 차지하는 나노침전법(nanoprecipitation)은 친수성 용매의 교반체에 다른 소수성 용매에 용해된 친유성 또는 고분자 약물을 적하하여 두 용매 상 사이의 콜로이드 현탁액으로부터 나노입자를 형성하는 방법이다. 이 과정에서 합성된 입자의 특성은 두 용매가 섞이는 속도(agitation speed), 고분자 약물의 친유성 정도 및 적하율(polymer drip-rate)로 제어될 수 있다. 이 때 입자 크기는 비선형적이고 예측하기 어려운 교반체 유동에 의해 결정되어 다분산성(polydispersity)과 배치간 큰 차이를 발생시키기 때문에 나노입자들의 재현성(reproducibility) 있는 합성 및 생산이 어려워 합성된 나노입자들의 균질화를 위한 여러가지 추가 단계를 필요로 하는 단점이 있다.
최근에는 약물 전달 시스템 개발에 미세유체(microfluidic) 기술을 적용하여 강한 미세와류 유동을 제어하여 약물 운반체(drug carrier)를 효과적으로 형성하는 기술들이 제시되고 있다. 미세유체 기술은 적은 양의 액체를 조작하여 나노입자의 크기, 모양 및 표면 조성과 같은 미세 환경을 정밀하게 제어할 수 있기 때문에 화학 합성, 화학 및 생체 분자 분석, 조직공학 및 기타 응용 분야에서 널리 활용되고 있다. 특히 미세유체 기술을 통해 다양한 조합의 물리화학적 특성을 가지는 고품질의 나노입자를 재현성 있게 연속 생산함으로써 나노약물 전달 시스템을 최적화할 수 있고, 또한 환자 치료과정에서의 약물 전달, 방출 및 제거의 효과를 촉진시키거나 모니터링하는 등 임상 적용을 촉진시킬 수 있다.
그러나, 이러한 장점에도 불구하고 기존의 대부분의 미세유체를 이용한 나노의약 합성법은 합성 시 상대적으로 낮은 유속에서 기인하는 낮은 생산성(productivity)과 서로 다른 액상 물질의 혼합의 어려움 등의 한계점이 여전히 존재한다. 또한 최근 미세유체 내 유속을 높여 이러한 한계점을 극복하려는 노력이 있었으나, 간단한 직선과 곡선 구조를 통한 제어되지 않는 미세 와류 형성에 그치고 있어 친수성 물질들의 혼합 등에 제한되고 소수성 물질과 친수성 물질의 효과적인 혼합을 이루기 어렵다. 그로 인하여 합성된 나노입자의 생산 수율이 낮거나 생산된 나노입자의 크기가 수백 나노미터에서 수 마이크로미터로, 효과적인 약물전달체가 되기 위해서 입자의 크기가 200 나노미터 이하로 균일하게 만들어져야 하는 나노의약품으로 적용하기에는 상대적으로 큰 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 유체의 유속을 조절하여 생성되는 나노입자의 크기를 조절할 수 있고 고수율로 균질한 나노입자를 수득할 수 있는 신규한 장치를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 소수성 물질 및 친수성 물질이 각각 유입되는 복수의 유입 채널, 상기 물질들이 혼합되어 나노입자가 제조되는 혼합 채널, 및 상기 제조된 나노입자가 유출되는 유출 채널을 포함하고, 상기 혼합 채널은 유입된 물질들의 혼합 효율을 상승시킬 수 있는 미세 기둥을 포함하는 나노입자 제조용 신규한 장치를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 혼합 효율(Mix eff )은 각각 1의 질량분율을 가지는 소수성 및 친수성 물질들이 채널에서 서로 혼합되면서 최종적으로 0.5 로 수렴하는 것을 이용해 그 비율을 백분율로 표현한 값이며 계산식은 다음과 같다.
이 때 Mass fract 는 질량분율이며 질량분율이 0.5에 가까울수록 합성효율이 비례하여 높아진다.
본 발명에서 사용되는 용어 "장치" 또는 "미세유체장치"는 플라스틱, 유리, 금속 또는 실리콘을 포함하는 다양한 소재로 제조된 기판 위에 유체가 흐를 수 있도록 구비된 채널을 포함하는 장치를 의미한다.
본 발명의 장치에서, 소수성 물질과 친수성 물질은 각각 서로 다른 유입 채널을 통해 유입될 수 있다. 여기서 바람직하게는, 소수성 물질은 혼합 채널에서 유체의 흐름 방향과 동일한 방향으로 유입되고, 친수성 물질은 혼합 채널에서 유체의 흐름 방향과 동일하지 않은 방향으로 유입될 수 있다.
상기 소수성 물질이 유입되는 유입 채널은 하나 또는 복수일 수 있고, 상기 친수성 물질이 유입되는 유입 채널은 하나 또는 복수일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 장치는 소수성 물질이 유입되는 1개의 유입 채널과 친수성 물질이 유입되는 2개의 유입 채널을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "미세 기둥(micropost)"은 혼합 채널 내에서 유체의 직선 흐름을 방해하는 구조물을 의미한다. 본 발명의 미세 기둥은 장치 내에 유입된 유체들이 미세 와류(microvortex)를 형성하여 효율적으로 혼합되도록 하기 위한 구조물로 모든 형태를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 기둥 형태일 수 있다. 미세 기둥은 기둥에 부딪히는 유체의 흐름을 분리시키거나 굽이치게 하거나, 서로 다른 흐름과 합쳐지도록 설계될 수 있다. 미세 기둥은 유체의 주된 흐름을 유지시키고 그 흐름이 정체되지 않도록 설계될 수 있고, 예를 들어 유체의 흐름 방향을 기준으로 유체와 직각이 되도록 부딪히게 할 수 있다.
본 발명의 미세 기둥은 유체의 흐름을 바꿀 수 있는 모서리가 존재하는 형태로서, 다각뿔, 다각뿔대, 다각기둥, 및 이의 변형된 형상일 수 있으며, 바람직하게 사각기둥 형상일 수 있다. 또한, 혼합 채널 내에서 유체의 흐름 방향으로 절단 시 단면으로 볼 때, 다각 또는 이의 변형된 형상일 수 있고, 바람직하게 유체의 흐름 방향과 직교 방향(가로)으로 한 변을 가지고 혼합 채널에서의 유체의 흐름 방향과 같은 방향(세로)으로 한 변을 갖는 직사각형일 수 있다.
본 발명에서 "혼합 채널에서의 유체의 흐름 방향" 또는 "혼합 채널에서의 흐름 방향"은 장치 내에서 유입 채널에서 유출 채널로 유체가 흐르는 방향을 의미한다. 바람직하게, 소수성 물질은 혼합 채널에서의 흐름 방향과 동일 방향으로 배치된 유입 채널을 통해 유입되고, 친수성 물질은 혼합 채널에서 흐름 방향과 직교 방향으로 배치된 유입 채널을 통해 유입된다.
본 발명의 미세 기둥은 혼합 채널에서의 유체의 흐름 방향을 따라 1개 이상의 열로 배치될 수 있다. 구체적으로, 상기 미세 기둥은 유체의 흐름 방향을 따라 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 열로 배치될 수 있으며, 바람직하게는 6개의 열로 배치될 수 있다.
본 발명의 미세 기둥은 하나의 열에서 혼합 채널에서의 유체의 흐름 방향과 다른 방향(바람직하게 직교 방향)으로 1개 이상 배치될 수 있다. 각 열에 존재하는 미세 기둥의 수는 일정할 수도 있고 서로 다를 수도 있다.
본 발명에서 미세 기둥은 인접한 열의 미세 기둥과 서로 엇갈리게 배치될 수 있다. 본 발명에서 "엇갈리게 배치된다"는 것은, 상기 복수 열의 미세 기둥들이 유체의 흐름 방향으로 일직선으로 혹은 일렬로 서로 평행하게 배치되지 않는 것을 의미하며, 하나의 열에 배치된 미세 기둥은 유체의 흐름 방향으로 볼 때 인접한 열에 배치된 미세 기둥들 사이의 틈을 일부 또는 전부 가리도록 배치될 수 있다.
본 발명에서 미세 기둥은 높이가 200 내지 800 μm일 수 있으며, 미세 기둥은 혼합 채널을 이루는 벽과 연결되거나 연결되지 않을 수 있다.
본 발명에서 "주입 유량 비율(inlet volume flow rate ratio)"은 각각 소수성 물질을 포함하는 유체의 주입 유량에 대한 친수성 물질을 포함하는 유체의 주입 유량 비율을 의미한다.
본 발명에서 "유동 막힘율(flow blockage ratio)"은 혼합 채널에서의 유체의 흐름 방향을 따라 첫번째 열에 있어서 전체 채널의 너비에 대한 미세 기둥의 너비 비율이다.
일반적으로 장치 내 유속은 관성력과 점성력의 비율을 나타내는 무차원수인 레이놀즈 수(Re)로 표현될 수 있으며 계산 식은 다음과 같다.
이 때, D h 는 미세유체장치 내 수력 직경이며,ρ, μ, v, Q는 각각 유체의 밀도, 동점성계수, 속도, 유속을 나타낸다. 따라서, 레이놀즈 수가 높아질수록 유속이 비례하여 높아진다.
본 발명의 장치에서 레이놀즈 수는 500 이하일 수 있고, 바람직하게 10 내지 300일 수 있으며, 더욱 바람직하게 12.5 내지 200일 수 있고, 가장 바람직하게 50 내지 100일 수 있다. 레이놀즈 수가 500을 초과할 경우 장치 내 난류성 유동(turbulence-like flow)이 형성되어 제어가능한 와류 패턴이 생성되지 않고 높은 유속에 따른 용매와 물질 사이 전단력의 증가로 인해 원료 약물 물질 및 생성된 나노입자의 불안전성을 야기할 수 있다. 레이놀즈 수가 300 이상인 경우 장치 내 제어할 수 없는 무질서한(chaotic) 유동이 발생하기 시작하고 균일한 나노입자의 제조를 위한 품질 제어(quality control)가 어렵게 된다. 반대로 레이놀즈 수가 10 이하로 낮은 경우, 확산에 의존하게 되어 소수성 물질과 친수성 물질의 효과적인 혼합을 이루기 어렵게 되어 기존 나노입자 합성법과 비교하여 우수한 생산성을 갖기 어렵다.
본 발명의 장치는 레이놀즈 수를 변형시켜 입자의 크기를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 장치를 이용하여 소수성 물질 및 친수성 물질을 포함하는 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본원발명은 복수의 유입 채널, 혼합 채널 및 유출 채널을 포함하는 장치에서 (a) 소수성 물질 및 친수성 물질을 각각 상기 유입 채널을 통해 유입시키는 단계, (b) 상기 물질들이 혼합채널 내에서 미세 기둥에 부딪혀 와류가 형성되고, 나노입자가 제조되는 단계, (c) 상기 제조된 나노입자가 유출 채널로 유출되는 단계를 포함하는 소수성 물질 및 친수성 물질을 포함하는 균일한 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 소수성 물질은 폴리-코-글리콜산(PLGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), DSPE-PEG, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디라우로일포스파티딜콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린(PSPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1,2-디아이코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 리소포스파티딜에탄올아민, N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사마이도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아마이드)(VL-5), 디옥타데실아미도글리클스페르민 4트리플르오로아세틱 산(DOGS), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA), 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), (1,2-디올레일옥시프로필)-3디메틸하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DORIE), 1,2-디미리스틸옥시-프로필-3-디메틸-하이드록시 에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사마이도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-bis(도데실옥시)-1-프로판암모늄 브로마이드(GAP-DLRIE), N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘(diC14-amidine), 에틸포스포콜린(Ethyl PC), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), N4-콜레스테릴-스페르민(GL67), 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODMA), D-Lin-MC3-DMA(MC3, DLin-MC3-DMA), DLin-KC2-DMA, 및 DLin-DMA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 고분자 소수성 물질 및 저분자 소수성 물질 모두를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 친수성 물질은 단백질 또는 고분자일 수 있으며, 바람직하게는 아포지단백질(apolipoprotein), 더욱 바람직하게는 아포지단백질 A 혹은 E일 수 있다.
본 발명의 장치 및 본 발명에 따른 제조방법으로 인지질 및 아포지단백질(Apolipoprotein), 고분자를 포함하는 나노입자를 제조할 수 있다.
본 발명의 장치 및 이를 이용한 나노입자의 제조 방법은 크기가 균일한 나노입자를 단일 과정(single step)을 통해 지속적으로 합성할 수 있고 배치간 변동성이 낮아 일관된 특성을 갖는 나노입자를 대량으로 생산할 수 있는 효과를 갖는다. 이렇게 수득된 나노입자는 입자의 균일성이 우수하고, 계면활성제와 같은 추가의 다른 성분을 포함하지 않기 때문에 약물 및 약물의 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 장치를 통한 유체의 흐름 및 미세 기둥 주변의 유체의 흐름을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 장치의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 장치에서 미세 기둥의 열 수에 따른 혼합 효율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 장치에서 하나의 열에 존재하는 미세 기둥의 수에 따른 혼합 효율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 장치에서 레이놀즈 수의 변화에 다른 혼합 효율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 장치에서 채널 높이의 변화에 다른 혼합 효율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 장치에서 소수성 물질과 친수성 물질의 주입 비율에 따른 혼합 효율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 유체의 체류 시간에 대한 계산 방법을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 제조예 1 및 2에 따른 장치 내 유체 흐름을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 제조예 1 및 2에 따른 rHDL 나노입자 제조 시 나노입자의 입도 분포를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 제조방법으로 제조된 지질-고분자 나노입자의 입도 분포도를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 유입 채널, 혼합 채널 및 유출 채널을 포함하고, 상기 혼합 채널은 미세 기둥을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유입 채널, 혼합 채널 및 유출 채널을 포함하고, 상기 혼합 채널은 미세 기둥을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치에서, 소수성 물질 및 친수성 물질을 유입 채널로 유입시키는 단계; 상기 물질들이 혼합 채널의 미세 기둥에 의해 와류를 형성하는 단계; 및 상기 소수성 물질 및 친수성 물질을 포함하는 나노입자가 형성되는 단계를 포함하는 나노입자의 제조 방법, 및 상기 제조방법에 의해 수득된 나노입자에 관한 것이다.
상기 유입 채널, 혼합 채널 및 유출 채널은 유체의 흐름 방향으로 순차적으로 배열될 수 있다.
상기 유입 채널은 친수성 물질이 유입되는 채널과 소수성 물질이 유입되는 채널을 포함할 수 있으며, 상기 친수성 물질과 소수성 물질은 각각 다른 유입 채널로 유입될 수 있다.
상기 소수성 물질은 유체의 흐름 방향과 동일한 방향으로 유입되고, 친수성 물질은 유체의 흐름 방향과 다른 방향으로 유입될 수 있으며, 바람직하게는 소수성 물질은 유체의 흐름 방향과 동일한 방향으로 유입되고, 친수성 물질은 유체의 흐름 방향과 직교 방향으로 유입될 수 있다.
상기 소수성 물질과 친수성 물질의 주입 유량 비율(inlet volume flow rate ratio)은 1:2.5 내지 1:8.5 (v/v)일 수 있다.
상기 소수성 물질은 폴리-코-글리콜산(PLGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), DSPE-PEG, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디라우로일포스파티딜콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린(PSPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1,2-디아이코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 리소포스파티딜에탄올아민, N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사마이도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아마이드)(VL-5), 디옥타데실아미도글리클스페르민 4트리플르오로아세틱 산(DOGS), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA), 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), (1,2-디올레일옥시프로필)-3디메틸하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DORIE), 1,2-디미리스틸옥시-프로필-3-디메틸-하이드록시 에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사마이도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-bis(도데실옥시)-1-프로판암모늄 브로마이드(GAP-DLRIE), N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘(diC14-amidine), 에틸포스포콜린(Ethyl PC), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), N4-콜레스테릴-스페르민(GL67), 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODMA), D-Lin-MC3-DMA(MC3, DLin-MC3-DMA), DLin-KC2-DMA, 및 DLin-DMA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 친수성 물질은 지단백질(lipoprotein), 막관통 단백질(transmembrane protein), 펩타이드(peptide) 또는 고분자일 수 있으며, 바람직하게는 아포지단백질 A 혹은 E일 수 있다. 또한, 상기 고분자는 PLGA(poly-co-glycolic acid)일 수 있다.
상기 혼합 채널에서 친수성 물질과 소수성 물질이 서로 혼합될 수 있다.
상기 유출 채널은 생성된 나노입자가 유출되는 채널일 수 있다.
상기 미세 기둥은 혼합 채널을 이루는 벽과 연결되어 있거나 연결되지 않을 수 있고, 다각뿔, 다각뿔대, 다각기둥, 및 이의 변형된 형상으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 사각기둥일 수 있다.
상기 미세 기둥은 유체의 흐름 방향으로 1개 또는 복수의 열(columns)로 배치될 수 있고, 바람직하게는 유체의 흐름 방향으로 6개 이상 열로 배치될 수 있다. 또한, 하나의 열에서 미세기둥이 유체의 흐름 방향과 다른 방향으로 1개 또는 복수로 배치될 수 있고, 바람직하게는 하나의 열에서 미세기둥이 유체의 흐름 방향과 다른 방향으로 1 내지 6개 배치될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하나의 열에서 미세기둥이 유체의 흐름 방향과 직교 방향으로 1 내지 6개 배치될 수 있고, 가장 바람직하게는 하나의 열에서 미세기둥이 유체의 흐름 방향과 직교 방향으로 1 내지 2개 배치될 수 있다.
상기 복수의 미세 기둥들이 유체의 흐름 방향으로 일렬로 배치되지 않을 수 있고, 상기 복수의 미세 기둥들은 유체의 흐름 방향으로 볼 때 인접한 열에 배치된 미세 기둥들 사이의 틈을 일부 또는 전부 가리도록 배치될 수 있다.
상기 혼합 채널에서 유체의 흐름에 대한 레이놀즈 유속을 변화시켜 입자의 크기를 조절할 수 있다. 또한, 상기 혼합 채널에서 유체의 흐름에 대한 레이놀즈 유속은 12.5 내지 200일 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 100일 수 있다.
상기 채널의 높이는 200 내지 800 μm일 수 있다.
상기 장치에서 유동 막힘률(Flow Blockage Ratio)은 0.2 내지 0.8일 수 있고, 바람직하게는 0.35 내지 0.65일 수 있다.
상기 제조된 나노입자의 다분산성 지표(polydispersity index)는 0.15 이하일 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
나노입자 제조를 위한 장치 설계
소수성 및 친수성 유기물을 혼합하여 재구축 고밀도 나노입자를 제조하기 위한 미세유체장치(microfluidic device)를 설계하였다(도 1 및 도 2). 상기 미세유체장치는 3개의 유입(inlet) 채널 및 1개의 유출(outlet) 채널을 포함하며, 3개의 유입 채널 중 가운데 위치한 채널로는 소수성(hydrophobic)을 띄는 인지질 또는 소수성 약물을, 양쪽에 위치한 2개의 채널로는 친수성(hydrophilic)을 띄는 단백질 또는 친수성 약물을 첨가하였다. 또한, 지질 및 단백질을 효과적으로 혼합하기 위하여 장치 내부에 미세 기둥 구조를 도입하였다.
[실시예 2]
단일 미세 기둥 구조의 효과
장치 내부에 배치된 미세 기둥의 유무 및 개수, 배열에 따른 소수성과 친수성 물질들의 혼합 효율을 확인하기 위해, 미세유체장치 내 소수성 물질의 분포를 유체 역학 기술을 통해 분석하였다.
본 발명에서 주입 유량 비율(inlet volume flow rate ratio)은 각각 소수성 물질을 포함하는 유체의 주입 유량에 대한 친수성 물질을 포함하는 유체의 주입 유량 비율을 의미하며, 유동 막힘율(flow blockage ratio)은 혼합 채널에서의 유체의 흐름 방향을 따라 첫번째 열에 있어서 전체 채널의 너비에 대한 미세 기둥의 너비 비율이다.
채널 높이(channel height)를 200 μm, 주입 유량 비율(inlet volume flow rate ratio)을 1:5.5(소수성 물질: 친수성 물질), Re를 50, 유동 막힘율(flow blockageg ratio)을 0.5로, 직사각형 미세 기둥 크기를 1000 μm x 400 μm의 조건에서 확인하였고, 그 결과를 도 2, 도 3 및 도 4에 나타내었다. 미세 기둥의 개수는 채널 너비에 대해 균등하게 분포하도록 한 상태에서 미세 기둥의 크기를 유지하고 미세 기둥 사이의 유동이 지나가는 너비를 일정하게 유지하면서 설계하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 소수성 물질이 미세 기둥 구조를 통과하여 흐를 때 발생되는 미세 와류(microvortex)에 의해 소수성 물질 및 친수성 물질이 효율적으로 혼합되는 것을 확인하였다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 미세 기둥이 있는 경우가 미세 기둥이 없는 경우와 비교하여, 미세 기둥의 분포 수에 따라 혼합 효율이 약 1.5 ~ 4.0배 향상된 것을 확인하였다.
미세 기둥 열의 수에 따른 혼합 효율
미세 기둥 열의 수 (number of rows) 혼합 효율 (mixing efficiency)
0 0.26
2 0.78
4 0.95
6 0.98
도 3 및 상기 표 1 나타낸 바와 같이, 열의 수가 증가할수록 혼합 효율이 증가하며, 6개 이상일 때 98% 이상의 우수한 혼합 효율을 나타내는 것을 알 수 있다.
하나의 열에서 미세 기둥의 수에 따른 혼합 효율
열에서 미세 기둥의 수 (number of posts in a row) 혼합 효율 (mixing efficiency)
0 0.26
1-2 0.98
2-3 0.68
3-4 0.54
4-5 0.44
5-6 0.39
도 4 및 상기 표 2 나타낸 바와 같이, 하나의 열에서 채널 내에 위치한 미세 기둥의 수가 증가할수록 혼합 효율이 오히려 감소하며, 그 수가 1 - 2개일 때 가장 우수한 혼합 효율을 나타내는 것을 알 수 있다.
따라서, 장치 내부에 배치된 미세 기둥의 개수 및 배열에 따라 혼합 효율이 변화하며, 특히 단일 미세 기둥 구조가 엇갈리게 배치될 때 가장 높은 혼합 효율을 가지는 것을 알 수 있다. 미세 기둥은 채널 너비에 대해 균등하게 배치되고 배치된 미세 기둥 사이의 유동이 지나가는 너비를 일정하게 유지하였다.
[실시예 3]
장치 내 가용 유속 범위 및 유속 비율 범위 최적화
장치 내 소수성과 친수성 물질의 유속 및 이들의 주입 비율에 따른 나노입자 합성의 최적화를 위해 다양한 레이놀즈 유속(Re) 및 유속 비율 조건에서 혼합 효율을 분석하였다.
가용 유속 범위를 조사하기 위해, 장치에서 채널 높이 200 μm 및 주입 비율 1:5.5에서 레이놀즈 유속(Re)을 12.5 내지 200으로 변화할 때 혼합 효율을 분석하여 그 결과를 도 5 및 표 3에 나타내었다.
레이놀즈 유속 (Re) 혼합 효율 (mixing efficiency)
12.5 0.92
25 0.97
50 0.98
100 0.98
200 0.95
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 레이놀즈 유속(Re)이 12.5 내지 200일 때 모두 90% 이상의 혼합 효율을 수득하였고, 레이놀즈 유속(Re)가 50 및 100 일 때는 98%의 혼합 효율을 갖는 것을 확인하였다.
또한, 주입 비율 1:5.5 및 레이놀즈 유속(Re) 50에서, 채널 높이를 200 내지 800 μm로 변화할 때 혼합 효율을 분석하여 그 결과를 도 6 및 표 4에 나타내었다.
채널 높이 (μm) 혼합 효율 (mixing efficiency)
200 0.98
400 0.98
600 0.97
800 0.95
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 채널 높이가 200 내지 800 μm일 때 혼합효율이 95% 이상을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 장치에서 채널 높이 200 μm 및 레이놀즈 유속(Re)을 50에서, 주입 비율을 1:2.5 내지 1:8.5로 변화시킬 때 혼합 효율을 분석하여 그 결과를 도 7 및 표 5에 나타내었다.
주입 비율 혼합 효율 (mixing efficiency)
1:2.5 0.97
1:5.5 0.98
1:8.5 0.98
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 주입 비율이 1:2.5 내지 1:8.5일 때 혼합효율이 97% 이상을 나타내는 것을 확인하였다.
[실시예 4]
혼합 효율 증가를 위한 장치의 높이에 대한 연구
장치의 혼합 채널의 높이에 따른 혼합 효율을 최대로 상승시키기 위해 서로 다른 높이 조건에서 혼합 효율을 분석하였다.
장치를 이용한 나노입자 합성 과정에서 상대적으로 높은 유속에서(Re>50) 원료물질을 주입할 때 채널 내 좁은 폭으로 인해 벽으로부터 강한 전단력(shear stress)이 발생하게 된다.
단백질의 경우 여러 문헌에서 체외의 장비에서 발생되는 유체 흐름의 전단응력에 의해 단백질의 응집, 접힘, 분해 등을 포함한 단백질 변형이 유발되는 것이 보고되고 있다. 전구 물질이 되는 단백질의 이런 변형은 제조된 나노입자의 구조, 크기, 및 기능까지 변화시키게 된다. 일반적으로 전단응력이 발생되는 장비의 구조, 사용되는 물질의 형태 및 크기에 따라 변형이 유발되는 범위가 각각 다르지만, 인슐린, 효소, 면역글로블린 등의 1 - 10 nm(20kDa - 300kDa 질량 범위) 크기의 단백질의 경우 전단응력이 1000 dyne/cm2 범위에서 단백질의 구조를 변형시킬 수 있다고 보고되고 있다(Bekard, I., et al. The Effects of Shear Flow on Protein Structure and Function. Biopolymers, 95, 11, 733-745 (2011)).
따라서, 본 발명의 장치에서 유체 흐름 통해 발생되는 전단응력(τ w )에 의한 전구 물질과 나노입자의 변형 유무를 확인하기 위해, 먼저 각 채널 높이에 따라 발생하는 전단응력을 다음과 같이 계산하였다.
이 때, Q는 유량이며, μ,h,w는 각각 유체의 동점성계수, 채널 단면의 높이, 채널 단면의 가로 길이를 나타낸다.
채널 높이 (μm) 전단력 (dyne/cm2), Re 50
100 165.00
200 41.25
400 10.31
800 2.58
상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장치에서 채널의 높이가 감소할 수록 전단력은 기하급수적으로 증가하지만 단백질 구조 변형 1000 dyne/cm2 범위를 초과하지 않는 것을 확인하였다.
그러나 채널 높이 100 μm인 경우, 유속을 Re 300으로 높일 경우 1000 dyne/cm2 범위에 도달하게 된다. 또한, 제조할 나노입자의 크기가 단백질의 크기보다 큰 10 - 100 nm 범위인 것을 고려할 때, 채널 높이 200 μm 이상인 경우 전단 응력으로 인해 전구 물질 및 나노입자가 변형되지 않는 것을 알 수 있다.
또한, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 장치의 혼합 채널의 높이가 증가하면 부피가 증가하여 같은 유량에 대해서 혼합되는 전구 물질들이 채널 내 머무르는 체류시간(τ res )과 전구 물질들이 합성되는데 필요한 혼합 시간(τ mix )이 증가하게 된다. 혼합되는 물질들이 채널 내 머무르는 체류시간의 구체적인 계산 방법은 도 8에 나타내었다. 물질들이 합성되는데 필요한 혼합 시간(τ mix )은 장치 내 대류(convection) 와 확산(diffusion) 중 더 지배적인 물리적 현상을 통해서 계산할 수 있으며, 확산 시간 대비 대류 시간의 비율을 나타내는 무차원 수인 페클릿 수(Pe)를 통해 다음과 같이 계산할 수 있다.
본 발명의 장치에서 페클릿 수(Pe)는 100 - 5000를 가지며 이를 토대로 대류에 의한 혼합이 지배적인 것을 알 수 있어, 채널 내 대류에 의한 혼합 시간(τ mix, convection )을 아래와 같이 계산하였다(Velencia, P. et al. Single-Step Assembly of Homogenous Lipid-Polymeric and Lipid-Quantum Dot Nanoparticles Enabled by Microfluidic Rapid Mixing. ACS Nano 4, 3, 1671-1679 (2010), 및 Rhee, M. et al. Drop Mixing in a Microchannel for Lab-on-a-Chip Platforms. Langmuir, 24 (2), 590-601 (2008)).
이 때, D는 확산계수를 나타내며, L, w는 각각 채널의 길이, 채널 단면의 가로길이를 나타낸다.
채널 높이 (μm) 체류 시간 (ms) 혼합 시간 (ms)
Re 50
100 36 13
200 72 21
400 145 34
800 290 53
이 때, 기본적으로 체류시간(τ res )은 혼합 시간(τ mix )보다 길어야 물질들이 채널 내에서 충분히 혼합될 수 있는데, 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 모든 채널 높이에서 체류시간이 혼합시간보다 길기 때문에 주어진 채널 높이에서 충분히 혼합될 수 있는 시간을 확보한 것을 확인할 수 있다.
또한, 채널 높이의 증가에 따른 혼합 시간 증가는 상기 표 7에 나타낸 바와 같이 제일 큰 높이인 800 μm에서 53 ms로 계산하게 되는데, 이는 주입되는 물질들이 서로 뭉쳐 응집되는 응집 시간(τ agg )인 50 - 100ms 범위에 들어가기 시작하는 시간으로서 본 발명의 장치 및 제조 방법을 적용하기 위한 최대 높이로 볼 수 있다(Rohit, K et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters, 8, 9, 2906-12, (2008) 및 Johnson, B. K. et al. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters, 91, 11,118302-1 -4 (2003) 참고).
따라서, 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 상기 장치 내의 수득된 나노입자의 응집 및 비균일한 나노입자 생성을 최대한 방지할 수 있는 최적의 혼합 채널의 높이는 200 내지 800 μm인 것을 알 수 있다.
[실시예 5]
장치 내의 유체 흐름
채널 높이 및 미세 기둥 조건에 따라, 하기 표 8과 같이 2가지의 제조예로 본 발명의 장치를 설계하였다.
제조예 1 제조예 2
채널 높이 (μm) 200 200
미세기둥 가로 X 세로 크기 (μm) 200 X 400 1000 X 400
열의 수 6 6
하나의 열에 기둥 수 5-6 1-2
상기 제조예 1 및 제조예 2를 제조하고 소수성 물질과 친수성 물질의 혼합 흐름 패턴을 확인하기 위해, 물질의 분포를 잉크를 통해 가시화하여 현미경으로 관찰하였다.
소수성 물질을 포함하는 유체는 에탄올에 6%의 잉크를 사용하고, 친수성 물질을 포함하는 유체는 생리 식염수를 사용하여 가시화하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 소수성 물질이 미세 기둥 구조를 통과하여 흐를 때 발생되는 와류(microvortex)에 의해 소수성 물질 및 친수성 물질이 효율적으로 혼합되는 것을 알 수 있다.
[실시예 6]
재구축 고밀도 지단백(Reconstituted high density lipoprotein, rHDL) 나노입자의 제조
실시예 5의 제조예 1과 제조예 2를 이용하여 다음과 같은 방법으로 인지질(DMPC) 및 아포지단백질을 포함하는 rHDL 나노입자를 제조하였다.
무수에탄올 중 DMPC(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 용액 및 PBS 중 아포지단백질 용액을 준비하였다. 그 후 하나의 주사기에 약 0.8 mL의 무수에탄올 중 0.83 mg/ml 농도의 상기 DMPC 용액을, 다른 두 개의 주사기에 약 1.25 ml(총 약 2.5ml)로 동일한 양의 상기 PBS 중 0.2 mg/ml 농도의 아포지단백질 용액을 채운 후, 모든 주사기의 거품을 제거하였다.
튜브를 이용하여 각각의 주사기 바늘과 본 발명의 장치의 유입 채널을 연결하고, 장치를 세척하기 위해 주사기 펌프를 이용하여 유출 속도 1 mL/min로 PBS를 흘려주었다. 그 후, 주사기 펌프를 이용하여 상기 DMPC 용액의 주입 유속을 0.8 mL/min로, 상기 아포지단백질 용액의 주입 유속을 2.2 mL/min로 설정하였다. 장치의 출구를 통해 제조된 rHDL 나노입자를 수득하고, 수득한 나노입자를 PBS와 혼합한 후, 10K 필터를 이용하여 원심분리하고, 4℃에서 20분간 3번 정제하였다.
수득한 rHDL 나노입자를 PBS에 용해시킨 후, Zetasizer Nano ZS를 사용하여, 동적광산란법(DLS, Dynamic Light Scattering)을 통한 나노입자의 응집현상에 따른 입자의 크기 분포 변화를 측정하여 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 제조예 1 및 2의 장치에서 수득된 rHDL 나노입자를 PBS에 용해시킨 뒤 DLS 데이터를 측정한 결과, 제조예 1 및 2에서 수득된 rHDL 나노입자의 크기는 각각 18.78 ± 4.58 nm 및 13.06 ± 0.00 nm로 측정되었다.
따라서, 본 발명 장치를 이용한 제조예 2의 나노입자가 기존의 장치를 이용한 제조예 1의 나노입자와 비교하여 더욱 우수한 균일성을 갖는 것을 알 수 있다.
[실시예 7]
장치를 이용한 지질-고분자 나노입자(lipid-polymer nanoparticle)의 제조 방법
제조예 2를 사용하여 다음과 같은 방법으로 고분자 PLGA(poly-co-glycolic acid) 및 인지질(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 페길화 인지질(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DSPE-PEG2000)을 포함하는 지질-고분자 나노입자를 제조하였다.
PLGA를 무수 아세토니트릴(acetonitrile, ACN) 용액으로 준비하여 5 mL를 주사기에 주입하였다. DPPC는 무수 에탄올 용액으로, DSPE-PEG2000는 초순수 증류수 (deionized water, DW)를 이용하여 수용액으로 준비하였다.
상기 두가지 인지질의 배합 비율은 DPPC:DSPE-PEG2000 = 1:2 (중량비)로 진행하며 최종 용액은 4% 에탄올이 되도록 하여 5 mL를 주사기에 주입하였다. 하기 표 9의 2가지 합성 조건으로 나노입자를 각각 수득하였다. 수득한 나노입자를 DW(deionized water; 이온이 전혀 없는 순수한 물)로 정제하였다.
합성조건 Re PLGA:지질
(중량비)		 PLGA (mg) DPPC (mg) DSPE-PEG2k (mg)
1 50 10:1 30 1 2
2 250 5:1 15 1 2
상기 2가지 합성 조건에서 수득된 나노입자의 입도 분포를 확인한 결과를 도 11에 나타내었다. 합성조건 1 및 2에서 수득된 나노입자에 대해, 동적광산란법으로 입자 크기를 측정한 결과 각각 124 ± 5.3 nm 및 56 ± 4.4 nm이고, 다분산성 지표 (polydispersiy index)로 입자 크기의 균일성을 측정한 결과 각각 0.05 및 0.13인 것을 확인하였다. 다분산성 지표는 일반적으로 낮을수록 우수한 균일성을 가지며, 다분산성 지표가 0.15 이하일 때 균일성이 확보된 것을 볼 수 있기 때문에, 상기의 합성조건에서 제조된 나노입자는 균일성을 갖는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 장치를 이용하여 주입 유속 및 친수성 물질 및 친유성 물질의 중량비에 따라, 다른 크기를 갖는 나노입자를 제조할 수 있고, 다양한 인지질 및 단백질로 구성된 균일한 입자크기를 갖는 나노입자를 제조할 수 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 8]
장치내 구조 설계 최적화
장치 내 설계된 채널의 크기 및 미세기둥에 따른 혼합 효율을 최적화하기 위해서 장치의 구조 내 1) 미세기둥의 시작 간격, 2) 미세기둥 간격, 3) 미세기둥 세로 길이, 4) 유동 막힘률(Flow Blockage Ratio)의 여러가지 조건에서 혼합 효율을 확인하였다.
각 변수에 대한 혼합 효율은 고정된 채널 높이 0.2 mm, 주입 비율 1:5.5, 레이놀즈 수 50의 조건에서 확인하였고, 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
조건 미세기둥 시작 간격 (mm) 미세기둥 간격 (mm) 미세기둥 세로 길이 (mm) 혼합 효율
A(기준) 2 0.4 0.4 0.98
B 1 0.4 0.4 0.98
C 4 0.4 0.4 0.97
D 2 0.2 0.4 0.96
E 2 0.8 0.4 0.98
F 2 0.4 0.2 0.97
G 2 0.4 0.8 0.97
도 12 및 상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 기둥의 간격 및 세로 길이 조건에 상관없이 채널 내 설계된 미세 기둥을 통과하는 유체의 흐름 형태가 크게 변하지 않고 모든 조건에서 높은 혼합효율(>0.95)을 유지하는 것을 확인하였다.
유동 막힘률 (Flow Blockage Ratio) 혼합 효율
0.2 0.72
0.35 0.92
0.5 0.98
0.65 0.98
0.8 0.98
반면, 도 13 및 상기 표 11 나타낸 바와 같이, 채널 내 미세기둥의 가로 간격 비율인 막힘률의 경우 그 값이 증가할 수록 혼합효율이 증가하며, 막힘률이 0.5일 때 혼합효율이 0.98 이상으로 일정하게 유지되는 것을 확인하였다.
하지만 유동 막힘률이 증가할 경우 채널의 폭 또한 좁아지게 되며 이에 따라 전단 응력도 비례하여 증가하게 된다. 높은 전단 응력은 앞서 계산한 바와 같이 특정 수치 이상일 경우, 유체 내 존재하는 유기 물질의 응집 및 변형을 발생시킬 수 있다(Bekard, I., et al. The Effects of Shear Flow on Protein Structure and Function. Biopolymers, 95, 11, 733-745 (2011)). 막힘률이 0.65를 초과하는 조건에서 유속을 Re 300으로 높일 경우 전단 응력이 1000 dyne/cm2 이상 높아지는 것을 고려하였을 때, 채널의 유동 막힘률은 0.2 내지 0.8일 수 있으며, 바람직하게는 0.35 이상 0.65 이하의 범위일 때 전단응력에 크게 영향받지 않으면서 높은 혼합 효율을 가지는 것을 알 수 있다.

Claims (40)

  1. 유입 채널, 혼합 채널 및 유출 채널을 포함하고,
    상기 유입 채널은 친수성 물질이 유입되는 채널과 소수성 물질이 유입되는 채널을 포함하고, 상기 친수성 물질과 소수성 물질은 각각 다른 유입 채널로 유입되고, 상기 소수성 물질은 유체의 흐름 방향과 동일한 방향으로 유입되고, 친수성 물질은 유체의 흐름 방향과 다른 방향으로 유입되고, 상기 혼합 채널은 미세 기둥을 포함하고,
    상기 혼합 채널에서 유체의 흐름에 대한 레이놀즈 유속이 12.5 내지 200이고,
    유동 막힘률(Flow Blockage Ratio)이 0.2 내지 0.8인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유입 채널, 혼합 채널 및 유출 채널은 유체의 흐름 방향으로 순차적으로 배열된 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 소수성 물질은 유체의 흐름 방향과 동일한 방향으로 유입되고, 친수성 물질은 유체의 흐름 방향과 직교 방향으로 유입되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유출 채널은 생성된 나노입자가 유출되는 채널인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 혼합 채널에서 친수성 물질과 소수성 물질이 서로 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 미세 기둥은 혼합 채널을 이루는 벽과 연결되어 있거나 연결되지 않은 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 미세기둥은 다각뿔, 다각뿔대, 다각기둥, 및 이의 변형된 형상으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  11. 제10항에 있어서, 상기 미세기둥은 사각기둥인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  12. 제1항에 있어서, 상기 미세 기둥은 유체의 흐름 방향으로 1개 또는 복수의 열(columns)로 배치되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 미세 기둥이 유체의 흐름 방향으로 6개 이상 열(columns)로 배치되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  14. 제12항에 있어서, 하나의 열에서 미세기둥이 유체의 흐름 방향과 다른 방향으로 1개 또는 복수로 배치되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  15. 제14항에 있어서, 하나의 열에서 미세기둥이 유체의 흐름 방향과 다른 방향으로 1 내지 6개 배치되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  16. 제15항에 있어서, 하나의 열에서 미세기둥이 유체의 흐름 방향과 직교 방향으로 1 내지 6개 배치되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  17. 제16항에 있어서, 하나의 열에서 미세기둥이 유체의 흐름 방향과 직교 방향으로 1 내지 2개 배치되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  18. 제12항에 있어서, 상기 복수의 미세 기둥들이 유체의 흐름 방향으로 일렬로 배치되지 않는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  19. 제12항에 있어서, 상기 복수의 미세 기둥들은 유체의 흐름 방향으로 볼 때 인접한 열에 배치된 미세 기둥들 사이의 틈을 일부 또는 전부 가리도록 배치되는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  20. 삭제
  21. 제1항에 있어서, 상기 혼합 채널에서 유체의 흐름에 대한 레이놀즈 유속이 50 내지 100인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  22. 제1항에 있어서, 상기 혼합 채널에서 유체의 흐름에 대한 레이놀즈 유속을 변화시켜 입자의 크기를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  23. 제1항에 있어서, 상기 채널의 높이가 200 내지 800 μm인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  24. 제1항에 있어서, 상기 소수성 물질과 친수성 물질의 주입 유량 비율(inlet volume flow rate ratio)이 1:2.5 내지 1:8.5 (v/v)인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  25. 삭제
  26. 제1항에 있어서, 유동 막힘률(Flow Blockage Ratio)이 0.35 내지 0.65인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  27. 제1항에 있어서, 상기 제조된 나노입자의 다분산성 지표(polydispersity index)가 0.15 이하인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  28. 제1항에 있어서, 상기 소수성 물질이 폴리-코-글리콜산(PLGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), DSPE-PEG, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디라우로일포스파티딜콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린(PSPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1,2-디아이코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 리소포스파티딜에탄올아민, N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사마이도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아마이드)(VL-5), 디옥타데실아미도글리클스페르민 4트리플르오로아세틱 산(DOGS), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA), 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), (1,2-디올레일옥시프로필)-3디메틸하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DORIE), 1,2-디미리스틸옥시-프로필-3-디메틸-하이드록시 에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사마이도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-bis(도데실옥시)-1-프로판암모늄 브로마이드(GAP-DLRIE), N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘(diC14-amidine), 에틸포스포콜린(Ethyl PC), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), N4-콜레스테릴-스페르민(GL67), 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODMA), D-Lin-MC3-DMA(MC3, DLin-MC3-DMA), DLin-KC2-DMA, 및 DLin-DMA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  29. 제1항에 있어서, 상기 친수성 물질이 지단백질(lipoprotein), 막관통 단백질(transmembrane protein), 펩타이드(peptide) 또는 고분자인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  30. 제29항에 있어서, 상기 친수성 물질이 아포지단백질 A 혹은 E인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  31. 제29항에 있어서, 상기 고분자가 PLGA(poly-co-glycolic acid)인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조용 장치.
  32. 제1항에 따른 나노입자 제조용 장치를 이용한 나노입자의 제조방법에서,
    소수성 물질 및 친수성 물질을 유입 채널로 유입시키는 단계;
    상기 물질들이 혼합 채널의 미세 기둥에 의해 와류를 형성하는 단계; 및
    상기 소수성 물질 및 친수성 물질을 포함하는 나노입자가 형성되는 단계를 포함하는 나노입자의 제조 방법.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 제32항에 있어서, 상기 혼합 채널에서 유체의 흐름에 대한 레이놀즈 유속이 50 내지 100인 것을 특징으로 하는, 나노입자의 제조 방법.
  37. 제32항에 있어서, 상기 소수성 물질과 친수성 물질의 주입 유량 비율(inlet volume flow rate ratio)이 1:2.5 내지 1:8.5 (v/v)인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조 방법.
  38. 삭제
  39. 제32항에 있어서, 유동 막힘률(Flow Blockage Ratio)이 0.35 내지 0.65인 것을 특징으로 하는 나노입자 제조 방법.
  40. 제32항, 제36항, 제37항 및 제39항 중 어느 한 항에 따른 나노입자의 제조 방법에 의해 수득된 나노입자.
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