KR20230169077A - 신규한 시알로사이드 및 그의 치료 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 (I)을 나타내는 합성 시알로사이드에 관한 것이다:
Neu5Ac-α2-6-R1(R2)[GlcNAcβ1-4]n-GlcNAc 화학식 (I)
식 중:
- GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이고;
- GlcNAcβ1-4는 β1-4 연결로 연결된 N-아세틸글루코사민 단위이며;
- n은 1 보다 크거나 같고;
- R1은 적어도 하나의 갈락토스(Gal)를 포함하는 글리칸 구조이고;
- R2는 다음 그룹 중에서 선택된다: H, α1-3 연결 (Fucα1-3) 또는 α1-4 연결 (Fucα1-4).
Neu5Ac-α2-6-R1(R2)[GlcNAcβ1-4]n-GlcNAc 화학식 (I)
식 중:
- GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이고;
- GlcNAcβ1-4는 β1-4 연결로 연결된 N-아세틸글루코사민 단위이며;
- n은 1 보다 크거나 같고;
- R1은 적어도 하나의 갈락토스(Gal)를 포함하는 글리칸 구조이고;
- R2는 다음 그룹 중에서 선택된다: H, α1-3 연결 (Fucα1-3) 또는 α1-4 연결 (Fucα1-4).
Description
본 발명은 시알로사이드라고도 칭해지는 합성 시알산-함유 탄수화물에 관한 것이다. 이러한 새로운 화합물은 발효를 통해 생산될 수 있다. 이들 시알로사이드는 일부 바이러스의 표면 단백질, 특히 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 결합할 수 있다. 결과적으로, 이들 시알로사이드는 바이러스가 숙주 세포에 부착하는 것을 억제하므로 바이러스에 의한 감염을 예방하거나 치료하는 데 유용한 화합물이다.
바이러스는 박테리아, 고세균, 진핵생물이라는 세 가지 생명체 영역의 세포에 진입하도록 진화하였다. 3,600 가지 이상의 알려진 바이러스 중 수백 가지가 인간 세포를 감염시킬 수 있으며 대부분은 질병과 관련이 있다.
바이러스가 동물 세포에 유입되는 것은 수용체에 부착함으로써 시작되며, 이어서 바이러스 단백질의 중요한 구조적 변화, 세포막을 통한 침투 또는 융합이 뒤따른다.
인플루엔자 바이러스와 같은 일부 바이러스는 엔도솜 막을 매우 빠르게 통과할 수 있으며 진입 효율이 50% 이상일 수 있다(즉, 부착된 바이러스의 50%가 세포에 들어간다).
병원성 바이러스에 의한 세포의 바이러스 감염을 예방하거나 적어도 감소시키는 방법은 바이러스와 숙주 세포 수용체의 상호작용을 억제 및/또는 차단하는 것이다. 따라서 이러한 상호 작용 바이러스/숙주 세포에 대한 연구는 매우 중요하다.
오소믹소비리대(Orthomyxoviridae) 계통의 바이러스 중에서 인플루엔자 바이러스는 가장 많이 연구된 바이러스 중 하나이다. 인플루엔자 바이러스의 감염 주기는 바이러스성 헤마글루티닌 단백질(HA)과 숙주 세포 표면에 존재하는 당단백질 및 당지질에 통합된 글리칸(시알로사이드)을 함유한 시알산의 상호작용에 의해 시작된다.
시알산을 포함하는 합성 리간드로 바이러스 헤마글루티닌 HA의 결합 부위를 포화시킴으로써 숙주 세포에 대한 인플루엔자 바이러스 부착을 억제하는 것이 제안된 바 있다(Matrosovich and Klenk, 2003).
이 유망한 접근 방식은 특히 가장 적절한 합성 리간드, 즉 각 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대해 더 나은 친화성을 나타내는 합성 리간드에 대한 조사를 통해 현재 추진되고 있다.
인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 시알로사이드의 상호 작용에 대한 조사를 통해 인플루엔자 바이러스가 특정 시알로사이드에 대한 선택적 결합을 통해 숙주 세포에 특이성을 갖는 것으로 나타났다.
실제로, 인간 및 동물 인플루엔자 바이러스는 숙주 세포 표면에 발현된 다양한 시알로사이드에 대해 서로 다른 결합 선호도를 갖는 헤마글루티닌을 제시한다.
조류 인플루엔자 바이러스 균주는 α 2-3 연결에 의해 글리칸 사슬의 나머지 부분에 연결된 시알산에 대한 결합 우선순위를 갖는 헤마글루티닌을 발현한다. 이와 대조적으로, 인간 인플루엔자 바이러스 균주의 헤마글루티닌은 α2-6-연결 시알산에 대한 결합이 강화된 것으로 나타났다. 이는 인간과 조류 인플루엔자가 각기 복제되는 장소인, 인간의 상부 호흡기도에 α2-6 연결 시알산이 풍부하다는 것과 조류의 장 점막에 α2-3 연결 시알산이 존재하는 것과 관련이 있다.
전 세계적으로 시알산 결합 특이성은 숙주 범위에 영향을 미친다: 조류와 말 계통의 인플루엔자 바이러스는 갈락토스에 대한 α2,3 연결에서 시알산을 인식하는 반면, 인간 계통은 α2,6 연결의 시알산을 선호한다. 그러나 인플루엔자 향성의 결정 요인은 α2-6 및 α2-3 시알산에 대한 결합 선호도보다 더 복잡하다.
인간 호흡 상피 세포는 확장된 폴리-N-아세틸락토사민(폴리-LacNAc) 사슬을 갖는 시알릴화된 N-글리칸을 발현하는 것으로 나타났으며 인간 HA는 확장된 α2-6 시알로사이드에 우선적으로 결합하는 것으로 제안되었다.
이는 합성 시알로사이드를 사용한 글리칸 마이크로어레이 연구에 의해 확인되었는데, 아형 H1, H2 및 H3의 인간 인플루엔자 바이러스 HA가 디- 및 트리-LacNAc 확장을 갖는 선형 시알로사이드에 가장 잘 결합한다는 것을 보여준다(Nycholat et al., 2012 ).
흥미롭게도, H3 인플루엔자 바이러스 아형의 HA 수용체 특이성은 최근 몇 년 동안 진화한 것으로 보이다. "가장 초기의" H3 바이러스는 짧은 분지형 시알로사이드를 선호하는 반면, "최근의" H3 바이러스는 트리-LacNAc 확장이 있는 선형 시알로사이드에만 결합한다. (Yang 외, 2015).
모든 시알로사이드가 HA에 동일한 효율로 결합하는 것은 아니며, 다양한 바이러스 균주가 숙주 향성에 따라 다양한 수용체 특이성을 보인다는 사실이 잘 확립되어 있다.
합성 시알로사이드 생산
이러한 유망한 치료 분자 개발에 있어서 가장 큰 기술적 문제는 이러한 특정 시알로사이드 리간드의 획득/생산이다.
구조적으로 다양한 시알로사이드의 제조는 화학적 합성, 효소적 합성 또는 천연 시알로사이드의 변형을 통해 달성될 수 있다. 천연 자원으로부터의 추출 및 정제는 소량만 얻어지므로 고려되지 않는다.
장쇄 시알릴화 폴리락토사민은 미끼 전략을 통해 인플루엔자 감염을 효율적으로 예방하거나 치료할 수 있는 최고의 후보인 것으로 보이다. 그러나 장쇄 시알로사이드의 화학적 또는 효소적 생산은 대규모로는 불가능한다. 따라서 이러한 시알로사이드 생산을 위한 최선의 대안은 미생물학적 접근, 즉 특정 조작 미생물의 발효에 의한 생산이다.
발효에 의한 3'시알릴락토스 및 6'시알릴락토스의 생산 방법은 국제출원 WO 2007/101862에 개시되어 있다.
또한, 발효 공정은 이미 유아용 조제분유 시장을 위한 모유 올리고당의 산업적 대규모 생산에 사용되고 있다(Bych 등 2019). 이 기술은 글리코실화 반응에 사용되는 당 뉴클레오타이드를 과잉 생산하도록 대사적으로 조작된 대장균 균주의 특정 재조합 글리코실트랜스퍼라제 유전자의 발현을 기반으로 한다.
대사적으로 조작된 박테리아에서 폴리락토사민 구조의 생산이 보고되었음에도 불구하고 장쇄 시알릴화 폴리락토사민의 미생물 생산은 다음과 같은 이유로 달성하기 어려운 것으로 보인다:
-
분자 구조의 복잡성,
-
생산 수율을 극적으로 감소시킬 것으로 예상되는 부산물의 수.
본 발명의 주요 목적은 병원성 바이러스, 특히 인간 인플루엔자 바이러스에 효율적으로 결합하고 발효 공정에 의해 대량으로 생산될 수 있는 장쇄 시알로사이드의 신규한 구조를 밝히는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 (I)을 나타내는 합성 시알로사이드에 관한 것이다:
Neu5Ac-α2-6-R1(R2)[GlcNAcβ1-4]n-GlcNAc
화학식 (I)
식 중:
-
GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이고;
-
GlcNAcβ1-4는 β1-4 연결로 연결된 N-아세틸글루코사민 단위이며;
-
n은 1 보다 크거나 같고;
-
R1은 적어도 하나의 갈락토스(Gal)를 포함하는 글리칸 구조이고;
-
R2는 다음 그룹 중에서 선택된다: H, α1-3 연결 (Fucα1-3) 또는 α1-4 연결 (Fucα1-4).
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 다중 합성 시알로사이드를 갖는 지지체를 포함하는 다가 시알로사이드에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 허용되는 비히클에 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 다가 시알로사이드를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 다가 시알로사이드를 포함하는 의료 기기이다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 다가 시알로사이드 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 시알산에 친화성을 갖는 바이러스로 인한 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 다가 시알로사이드 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 바이러스는 특히 인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 인간, 말, 돼지 또는 조류 인플루엔자 바이러스이다.
도 1. SCH6 균주를 이용하는 COV6S 생합성을 위한 유전적으로 조작된 대사 경로.
[10] 키토펜타오스
[11] 중간 육당류
[12] 시알릴화된 칠당류 COV6S
키토펜타오스와 같은 키토올리고당[10]은 β1-4 갈락토실트랜스퍼라제에 의해 수용체로 사용되어 비환원 말단에 말단 LacNAc 모티프를 포함하는 육당류[11]를 형성할 수 있는 것으로 나타났다. 그러면 시알릴화된 칠당류 COV6S[12]를 형성하기 위한 [11]의 시알릴화가 대사적으로 조작된 대장균 균주에서 α2-6 시알릴트랜스퍼라제의 추가 발현에 의해 가능하다. αGlcNAC는 2-6 시알릴트랜스퍼라제의 기질이 아니기 때문에, 부산물 생성이 방지되며 COV6S[12]가 거의 유일한 최종 산물이다.
도 2. 본 발명의 두 시알로사이드의 전개된 구조
화학식 (II)의 COV6S가 맨 위에 표시되었다. 또 다른 시알로사이드 구조(R1 = Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4, R2 = H, n =4인 화학식 (I))의 일례가 하단에 표시되어 있다.
도 3. 적혈구응집 억제 분석(HI 또는 HAI)의 모식도
도 4. 미세중화 분석(MN)의 모식도
도 5. ER15 화합물의 잠재적인 치료 효과를 D0(1시간 pi), D1 및 D2에 세 가지 감염 후 처리를 통해 분석하였다.
A/캘리포니아/7/09 H1N1 바이러스를 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양한다. ER15는 5가지 다른 농도(20, 10, 5, 2.5 및 1.25μM) vs. 미처리 조건(NT: 미처리 및 PL: 폴리라이신을 증가하는 양으로 전달)로 사용한다. (i) MDCK 세포의 ml당 감염성 입자 수(TCID50/ml)의 적정 및 (ii) 바이러스 게놈의 정량화(RT-qPCR)에 의해 바이러스 생산을 정량화하기 위해, 감염 후 D1, D2 및 D3에 상등액 샘플을 수집한다.
A 및 C: 생성된 감염성 입자의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi)으로, TCID50/ml로 표시됨;
B 및 D: RT-qPCR을 통한 바이러스 mRNA의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi);
A 및 B: 감염 다중도(MOI) = 0.1
C 및 D: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 6. ER15 화합물의 잠재적인 치료 효과를 D0(1시간 pi), D1 및 D2에 세 가지 감염 후 처리를 통해 분석하였다.
실험 조건은 A/텍사스/50/2012 H3N2 바이러스가 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양된다는 점을 제외하면 도 5와 동일하다.
A 및 C: 생성된 감염성 입자의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi)으로, TCID50/ml로 표시됨;
B 및 D: RT-qPCR을 통한 바이러스 mRNA의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi);
A 및 B: 감염 다중도(MOI) = 0.1
C 및 D: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 7. A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15 화합물의 잠재적 치료 효과를 D0(1시간 pi)에 일회 감염 후 처리로 분석하였다
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 8. A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15의 치료 특성(바이러스 감염과 동시에 단 한 번만 투여)
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 9. A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15의 예방 특성(감염 하루 전 일회 치료 수행)
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 10. H1N1 A/리옹/969/09 균주에 대한 ER15의 치료 특성
실험 조건은 A/리옹/969/09 H1N1 바이러스를 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양한 것을 제외하고 도 5와 동일하다.
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 11. 감염된 생체외 상피 모델에서 테스트된 ER15 효능 및 세포독성 평가
상피를 0.1의 감염 다중도로 150μl의 정점극(apical pole)에서 A/캘리포니아/7/2009 H1N1 균주로 감염시킨다.
동결건조된 화합물 ER15를 0.1 mM의 농도로 다음과 혼합한다:
- 물,
- 포스페이트 완충액(2g/L 글리세린 9g/L NaCl 10mM pH = 7.9) 및
- 시트레이트 완충액(2g/L 글리세린 9g/L NaCl 10mM pH = 6.0).
A - 경상피 전기 저항(TEER)을 매일 측정
음성 대조군은 "목(mock) NT" 세포, 즉 감염되지 않고 치료되지 않은 세포이다.
또 다른 음성 대조군은 "PL"이다. 즉, 0.1mM로 물에 희석된 폴리라이신으로 처리된 세포이다.
B - ER15, 폴리라이신(PL) 또는 미처리(NT)로 처리된 목(감염되지 않은) 세포의 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출의 정량화. 샘플은 기본 배지에서 매일 수집한다.
C - ml당 생성된 감염성 입자의 적정에 의한 바이러스 생산의 정량화(TCID50/ml). 샘플은 D1, D2 및 D3의 정점극에서 수집된다.
D - 동일한 샘플을 RT-qPCR에 의한 바이러스 게놈 정량화에 제출한다.
도 12. H1N1 A/캘리포니아/7/09 균주에 대한 ER61의 치료 특성
실험조건은 ER61 화합물을 사용한 점을 제외하면 도 5와 동일하다. 생성된 감염성 입자의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi)으로, TCID50/ml로 표시된다.
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 13. 최근 균주에 대한 ER15 및 ER61 화합물의 치료 효과.
테스트된 바이러스 균주를 A549 세포에서 MOI 0.1로 37℃에서 1시간 동안 배양한다. ER15 및 ER61을 3가지 다른 농도(20, 5, 1.25 μM) vs. 처리되지 않은 조건(NT: 처리되지 않음)으로 사용한다. D0(1시간 pi), D1 및 D2에 세 번의 감염후 처리를 수행하였다. ml당 감염성 입자 수(TCID50/ml)를 적정하여 바이러스 생산을 정량화하기 위해 감염 후 D1, D2 및 D3에 상등액 샘플을 수집한다.
테스트된 바이러스 균주는 다음과 같다.
A) A/미시간/45/2015 H1N1
B) A/캔자스/14/2017/ H3N2.
C) B/푸켓/3073/2013.
도 14. 내성 H1N1 바이러스 균주에 대한 ER15 화합물의 치료 효과.
실험 조건은 도 13과 동일하다. 역유전법으로 얻은 다음의 바이러스 균주를 사용하여 감염된 세포에 대해 D0(1시간 pi), D1 및 D2에 ER15를 사용하여 세 가지 감염 후 처리를 수행한다.
A) RG H1N1 A/리옹/969/09 I38T
B) RG H1N1 A/리옹/969/09 H275Y
C) RG H1N1 A/리옹/969/09 I38T + H275Y
[10] 키토펜타오스
[11] 중간 육당류
[12] 시알릴화된 칠당류 COV6S
키토펜타오스와 같은 키토올리고당[10]은 β1-4 갈락토실트랜스퍼라제에 의해 수용체로 사용되어 비환원 말단에 말단 LacNAc 모티프를 포함하는 육당류[11]를 형성할 수 있는 것으로 나타났다. 그러면 시알릴화된 칠당류 COV6S[12]를 형성하기 위한 [11]의 시알릴화가 대사적으로 조작된 대장균 균주에서 α2-6 시알릴트랜스퍼라제의 추가 발현에 의해 가능하다. αGlcNAC는 2-6 시알릴트랜스퍼라제의 기질이 아니기 때문에, 부산물 생성이 방지되며 COV6S[12]가 거의 유일한 최종 산물이다.
도 2. 본 발명의 두 시알로사이드의 전개된 구조
화학식 (II)의 COV6S가 맨 위에 표시되었다. 또 다른 시알로사이드 구조(R1 = Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4, R2 = H, n =4인 화학식 (I))의 일례가 하단에 표시되어 있다.
도 3. 적혈구응집 억제 분석(HI 또는 HAI)의 모식도
도 4. 미세중화 분석(MN)의 모식도
도 5. ER15 화합물의 잠재적인 치료 효과를 D0(1시간 pi), D1 및 D2에 세 가지 감염 후 처리를 통해 분석하였다.
A/캘리포니아/7/09 H1N1 바이러스를 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양한다. ER15는 5가지 다른 농도(20, 10, 5, 2.5 및 1.25μM) vs. 미처리 조건(NT: 미처리 및 PL: 폴리라이신을 증가하는 양으로 전달)로 사용한다. (i) MDCK 세포의 ml당 감염성 입자 수(TCID50/ml)의 적정 및 (ii) 바이러스 게놈의 정량화(RT-qPCR)에 의해 바이러스 생산을 정량화하기 위해, 감염 후 D1, D2 및 D3에 상등액 샘플을 수집한다.
A 및 C: 생성된 감염성 입자의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi)으로, TCID50/ml로 표시됨;
B 및 D: RT-qPCR을 통한 바이러스 mRNA의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi);
A 및 B: 감염 다중도(MOI) = 0.1
C 및 D: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 6. ER15 화합물의 잠재적인 치료 효과를 D0(1시간 pi), D1 및 D2에 세 가지 감염 후 처리를 통해 분석하였다.
실험 조건은 A/텍사스/50/2012 H3N2 바이러스가 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양된다는 점을 제외하면 도 5와 동일하다.
A 및 C: 생성된 감염성 입자의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi)으로, TCID50/ml로 표시됨;
B 및 D: RT-qPCR을 통한 바이러스 mRNA의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi);
A 및 B: 감염 다중도(MOI) = 0.1
C 및 D: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 7. A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15 화합물의 잠재적 치료 효과를 D0(1시간 pi)에 일회 감염 후 처리로 분석하였다
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 8. A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15의 치료 특성(바이러스 감염과 동시에 단 한 번만 투여)
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 9. A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15의 예방 특성(감염 하루 전 일회 치료 수행)
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 10. H1N1 A/리옹/969/09 균주에 대한 ER15의 치료 특성
실험 조건은 A/리옹/969/09 H1N1 바이러스를 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양한 것을 제외하고 도 5와 동일하다.
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 11. 감염된 생체외 상피 모델에서 테스트된 ER15 효능 및 세포독성 평가
상피를 0.1의 감염 다중도로 150μl의 정점극(apical pole)에서 A/캘리포니아/7/2009 H1N1 균주로 감염시킨다.
동결건조된 화합물 ER15를 0.1 mM의 농도로 다음과 혼합한다:
- 물,
- 포스페이트 완충액(2g/L 글리세린 9g/L NaCl 10mM pH = 7.9) 및
- 시트레이트 완충액(2g/L 글리세린 9g/L NaCl 10mM pH = 6.0).
A - 경상피 전기 저항(TEER)을 매일 측정
음성 대조군은 "목(mock) NT" 세포, 즉 감염되지 않고 치료되지 않은 세포이다.
또 다른 음성 대조군은 "PL"이다. 즉, 0.1mM로 물에 희석된 폴리라이신으로 처리된 세포이다.
B - ER15, 폴리라이신(PL) 또는 미처리(NT)로 처리된 목(감염되지 않은) 세포의 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출의 정량화. 샘플은 기본 배지에서 매일 수집한다.
C - ml당 생성된 감염성 입자의 적정에 의한 바이러스 생산의 정량화(TCID50/ml). 샘플은 D1, D2 및 D3의 정점극에서 수집된다.
D - 동일한 샘플을 RT-qPCR에 의한 바이러스 게놈 정량화에 제출한다.
도 12. H1N1 A/캘리포니아/7/09 균주에 대한 ER61의 치료 특성
실험조건은 ER61 화합물을 사용한 점을 제외하면 도 5와 동일하다. 생성된 감염성 입자의 경시적 측정(감염 후 시간: hpi)으로, TCID50/ml로 표시된다.
A: 감염 다중도(MOI) = 0.1
B: 감염 다중도(MOI) = 0.01
도 13. 최근 균주에 대한 ER15 및 ER61 화합물의 치료 효과.
테스트된 바이러스 균주를 A549 세포에서 MOI 0.1로 37℃에서 1시간 동안 배양한다. ER15 및 ER61을 3가지 다른 농도(20, 5, 1.25 μM) vs. 처리되지 않은 조건(NT: 처리되지 않음)으로 사용한다. D0(1시간 pi), D1 및 D2에 세 번의 감염후 처리를 수행하였다. ml당 감염성 입자 수(TCID50/ml)를 적정하여 바이러스 생산을 정량화하기 위해 감염 후 D1, D2 및 D3에 상등액 샘플을 수집한다.
테스트된 바이러스 균주는 다음과 같다.
A) A/미시간/45/2015 H1N1
B) A/캔자스/14/2017/ H3N2.
C) B/푸켓/3073/2013.
도 14. 내성 H1N1 바이러스 균주에 대한 ER15 화합물의 치료 효과.
실험 조건은 도 13과 동일하다. 역유전법으로 얻은 다음의 바이러스 균주를 사용하여 감염된 세포에 대해 D0(1시간 pi), D1 및 D2에 ER15를 사용하여 세 가지 감염 후 처리를 수행한다.
A) RG H1N1 A/리옹/969/09 I38T
B) RG H1N1 A/리옹/969/09 H275Y
C) RG H1N1 A/리옹/969/09 I38T + H275Y
본 발명은 하기 화학식 (I)을 나타내는 합성 시알로사이드에 관한 것이다:
Neu5Ac-α2-6-R1(R2)[GlcNAcβ1-4]n-GlcNAc
`
화학식 (I)
식 중:
-
GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이고;
-
GlcNAcβ1-4는 β1-4 연결로 연결된 N-아세틸글루코사민 단위이며;
-
n은 1 보다 크거나 같고, 특히 n은 1 내지 4이며;
-
R1은 적어도 하나의 갈락토스(Gal)를 포함하는 글리칸 구조이고;
-
R2는 다음 그룹 중에서 선택된다: H, α1-3 연결 (Fucα1-3) 또는 α1-4 연결 (Fucα1-4).
달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 다음 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 갖다.
본 발명에서, 시알로사이드라는 용어는 O-글리코사이드 결합에 의해 탄수화물에 결합된 시알산으로 이루어진 시알산 접합체를 의미한다.
시알산은 5-아미노-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토-논-2-울로소닉산(뉴라민산)의 43가지 자연 발생 유도체를 포함하는 단당류 계열로서, 모든 척추동물에서 편재적으로 발현되는 9개-탄소 백본으로 구성된 당이다. 가장 일반적인 시알산은 5-아세트아미도-2-케토-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노논산이며, N-아세틸뉴라민산 또는 시알산이라고도 하며 Neu5Ac로 약칭된다.
시알산은 박테리아 독소와 다양한 바이러스에 대한 수용체의 핵심 구성 요소로 인식된다.
"합성"이라는 용어는 본 발명에 따른 시알로사이드의 인공적인 성질을 강조한다. 실제로, 이 시알로사이드는 자연에서는 발견되지 않으며 그 구조는 발명자들에 의해 설계되었다. 유리하게도, 이 합성 시알로사이드는 시알산에 대한 친화성을 갖는 바이러스의 표면 단백질, 특히 인플루엔자 바이러스 균주의 헤마글루티닌과 최고의 친화성을 제공하도록 설계되었다. 본 발명의 시알로사이드는 다양한 헤마글루티닌에 대해 서로 다른 친화성을 가질 수 있으며, 특히 본 발명의 각 시알로사이드는 하나의 특정 헤마글루티닌에 우선적으로 결합할 수 있다.
다른 용어 및 약어는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특히:
-
N-아세틸글루코사민(GlcNAc)은 포도당의 아미드 유도체이다. 이것은 글루코사민과 아세트산 사이의 2차 아미드이다. 이 분자는 세포벽을 구성하는 생체고분자의 일부이기 때문에 생물체 사이에서 널리 발현된다. 그의 CAS 번호는 7512-17-6이다.
-
β1-4 연결은 탄수화물 그룹을 다른 기에 연결하는 베타 유형의 공유 글리코사이드 결합을 나타낸다.
α- 및 β-글리코사이드 결합은 아노머 위치와 당의 C1에서 가장 먼 입체중심의 상대적 입체화학으로 구별된다. α-글리코사이드 결합은 두 탄소가 동일한 입체화학을 가질 때 형성되는 반면, β-글리코사이드 결합은 두 탄소가 서로 다른 입체화학을 가질 때 발생한다.
-
"글리칸 구조"는 "사슬"을 형성하는 글리코사이드로 연결된 단당류로 구성된 탄수화물 구조이다.
-
갈락토스(Gal)는 포도당의 에피머인 알도헥소스. CAS 번호는 59-23-4이다.
-
H는 수소 원자를 나타낸다.
-
푸코스(Fuc)는 6-데옥시-L-갈락토스라고도 칭해지는 육탄당 데옥시 슈가이다. 그의 CAS 번호는 2438-80-4이다. 이것은 α1-3 연결(Fucα1-3) 또는ㅇα1-4 연결(Fucα1-4)로 결합될 수 있다.
화학식 (I)은 본 발명자들에 의해 설계된 신규한 장쇄 시알로사이드 구조에 해당하며, β1-4 연결로 연결된 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 단위를 포함하며, 즉 n은 1보다 크거나 같다. 일부 구현예에서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 이상이다. 바람직한 구현예에서, n은 1 내지 4이다.
화학식 (I)에서, 성분 R1은 하나 이상의 갈락토스(Gal)를 포함하는 글리칸 구조로 정의된다. R1은 일렬로 연결된 하나 이상의 단당류 사슬로 구성되며, 이는 R1의 "주쇄"를 정의한다. 이 주쇄에는 단당류 또는 2개 이상의 단당류를 포함하는 2차 사슬이 그래프트될 수 있다.
R1은 특히 글리칸을 구성하는 하나 이상의 단당류, 특히 주쇄의 단당류에 하나 이상의 메틸기("메틸화") 또는 하나 이상의 설페이트(SO3)기("황화")를 첨가함으로써 화학적으로 변형될 수 있는 글리칸 구조이다.
본 발명의 특정 구현예에서, R1은 최대 5개의 단당류를 포함하는 주쇄를 갖는 글리칸 구조이다. 이 구현예에서, R1은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 연결된 단당류로 구성되어 하나의 주요 글리칸 사슬을 형성한다. 이 주 글리칸 사슬은 주쇄의 하나 이상의 단당류에 분지된 이차 글리칸 사슬과 추가로 그래프트될 수 있다.
우선적으로, R1은 1개, 2개 또는 3개의 연결된 단당류를 포함하는 주쇄로 구성되어 하나의 주 글리칸 사슬을 형성한다. 이 주 글리칸 사슬은 주쇄의 하나 이상의 단당류에 분지된 이차 글리칸 사슬과 추가로 그래프트될 수 있다.
특정 구현예에서, R1은 3개의 연결된 단당류를 포함하는 주쇄로 구성된다.
또 다른 구체적인 구현예에서, R1은 3개의 단당류로 구성된 그래프트되지 않은 주쇄이다.
또 다른 구체적인 구현예에서, R1은 3개의 단당류로 구성된 그래프트된 주쇄이다.
또 다른 구체적인 구현예에서, R1은 갈락토스인 단일 단당류로 구성된다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, R1은 하나 이상의 갈락토스가 주쇄의 말단 중 하나에 연결된 글리칸 구조이다.
첫 번째 배열에서, R1은 글리칸 주쇄의 말단 중 하나에 하나의 갈락토스를 포함한다. 두 번째 배열에서, R1은 두 개의 갈락토스를 포함하며, 이들 각각은 글리칸 주쇄의 각 말단에 연결된다.
본 발명의 특정 구현예에서, R1은 다음 그룹 중에서 선택된다:
-
Galβ1-4,
-
Galβ1-3,
-
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4, 및
-
Galβ1-4 (Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, R2는 H이다. 이 구현예에 따르면, 하기 제시된 화학식 (III)을 갖는 구조가 본 발명의 목적이다:
Neu5Ac-α2-6-R1-[GlcNAcβ1-4]n-GlcNAc
(화학식 (III))
식 중:
-
n은 1보다 크거나 같고, 특히 n은 1 내지 4이며;
-
R1은 적어도 하나의 갈락토스(Gal)를 포함하는 글리칸 구조이다.
본 발명에 따른 시알로사이드 구조의 비포괄적 목록은 다음과 같다:
본 발명의 특정 구현예에 따르면, R1은 1-4 연결(Galβ1-4)로 연결된 갈락토스이다. 이러한 구현예에서, 합성 시알로사이드는 하기 화학식 (II)를 나타낸다:
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
이러한 화학식 (II)의 특정 시알로사이드는 또한 본 출원, 특히 실시예 섹션에서 "COV6S"로 지칭된다. 이것의 개발된 구조를 도 2의 상단에 나타내었다.
실시예에 나타난 바와 같이, 다른 구조의 시알로사이드들을 합성하고 시험하였다. 화학식 (I) 및 (III)에 해당하는 이들 구조를 다음 표 1에 나타내었다.
이러한 시알로사이드 COIII6S, COIV6S, 1-COV6S 및 COV6S는 키토올리고당 말단 사슬을 함유하는 본 발명에 따른 합성 시알로사이드를 대표한다. 이러한 새로운 시알로사이드는 인플루엔자 바이러스에 효율적으로 결합할 수 있고 인플루엔자 감염에 대한 약물로 사용될 수 있는 다가 시알로사이드 화합물을 구성하는 데 사용될 수 있다.
각 시알로사이드는 헤마글루티닌에 대해 뚜렷한 특이성을 나타낼 수 있다. 실제로, 그 구조에 따르면, 시알로사이드는 다양한 바이러스 계통의 헤마글루티닌에 결합하는 특이성을 나타낼 수 있다.
다가 시알로사이드
본 발명은 또한 다중 합성 시알로사이드를 갖는 지지체를 포함하는 다가 시알로사이드에 관한 것이다.
본 발명의 의미에서 "다가 시알로사이드"는 다중 시알로사이드를 포함하는 분자 구조를 나타내며, 상기 구조는 단일 시알로사이드의 결합 친화도와 비교하여 수용체(예: 헤마글루티닌)에 대해 증가된 결합 친화도를 나타낸다.
숙주 세포에 대한 초기 바이러스 부착은 다가 상호작용에 의해 조절되는데, 여기서 다중 HA 삼량체는 세포 표면 당단백질 및 당지질에 발현된 다중 시알로사이드 리간드와의 상호작용에 관여한다. 가용성 모노머 시알로사이드의 결합은 너무 약해서 이러한 강력한 다가 상호작용을 경쟁적으로 방해할 수 없다. "다가 효과" 이론에 따르면, 바이러스/숙주 세포 결합 억제에 기초한 합리적인 약물 설계에는 다가 시알로사이드 화합물의 합성이 포함되어야 한다.
인플루엔자 바이러스 억제의 경우, "다가 시알로사이드" 리간드는 헤마글루티닌에 대해 더 강한 친화력을 갖고, 따라서 HA 결합 부위를 차단하여 숙주 세포 표면에 존재하는 당단백질과의 상호작용을 억제함으로써 길항제로 작용하는데 더 적합한 것으로 나타났다. 헤마글루티닌 결합 부위의 이러한 포화 과정은 안정성을 얻고 바이러스의 해리를 방지하기 위한 다가 결합을 기반으로 한다.
다양한 종류의 다가 시알로사이드 구조를 생산하기 위해 다양한 전략이 개발되었다. 인플루엔자 바이러스 부착에 대한 다양한 합성 다가 시알로사이드 억제제가 이미 개발되었다. 이들은 리포솜(Kingery-Wood et al 1992), 덴드리머(Reuter et al 1999), 합성 폴리머(Gambaryan et al 2005), 키토산(Umemura et al., 2010) 다당류(Li et al 2011) 및 금 나노입자(Papp et al 2010)와 같은 지지체를 기반으로 한다.
본 명세서에서, "다중 시알로사이드를 갖는 지지체", "다중 시알로사이드를 갖는 지지체", "지지체에 그래프트된 다중 시알로사이드", "시알로사이드를 갖는 지지체" 및 "지지체에 로딩된 다중 시알로사이드"라는 표현은 상호 동등하고 독립적으로 사용된다; 이들 모두는 당업자에게 공지된 임의의 지지체에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 시알로사이드의 다중 사슬을 포함하는, 본 발명에 따른 다가 시알로사이드를 지칭한다.
상기 다중 시알로사이드는 일반적으로 모두 동일하다; 그럼에도 불구하고, 단일 지지체에 결합된 적어도 2개, 3개 또는 4개의 서로 다른 시알로사이드를 포함하는 다가 시알로사이드가 생성될 수도 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 지지체는 리포솜, 폴리머(들), 덴드리머 또는 나노입자로 구성된다.
리포솜은 이미징 및 제어된 약물 방출에 적용하기 위해 약물, 단백질, 유전자 및 형광 염료 분자를 캡슐화하는 데 사용할 수 있다. 시알로사이드를 운반하는 리포솜은 시알로사이드 인지질과 양친매성 전구체로부터 제조될 수 있다. 다양한 크기의 리포솜이 생성될 수 있다.
시알로사이드의 폴리머 네트워크를 생성하는 폴리머의 사용은 다가 시알로사이드의 가장 초기에 알려진 예 중 하나이다. 시알로사이드 함유 폴리머를 얻기 위해 개발된 주요 접근법은 다음과 같다.
●
아크릴레이트 자유 라디칼 중합 방법을 이용한 모노머 시알로사이드 리간드의 조립; 및
●
시판되는 잘 정의된 폴리머 스캐폴드에 시알로사이드 리간드를 커플링.
덴드리머는 관심 대상 리간드를 뚜렷한 균질 대칭 형태로 장식하는 데 사용되는 중요한 다가 스캐폴드이다. 폴리머와 비교하여 덴드리머는 보다 제어 가능한 단분산성과 지속적인 형태를 제공한다. 더욱이, 덴드리머를 운반하는 시알로사이드의 3D 기하학적 구조는 세포 표면 위의 시알로사이드 기의 장식을 근접하게 모방한다.
나노입자는 넓은 표면적을 나타내고 특정 상호작용의 감지 및 이미징을 촉진하는 고유한 광학적, 전기화학적, 자기적 특성을 갖는 잘 조직되고 견고한 덴드리머이다. 나노입자를 함유한 여러 유형의 시알로사이드가 문헌에 보고되었으며, 그 중 가장 널리 퍼진 것은 금, 은, 실리카, 철, 카드뮴, 셀레늄 및 바이러스-유사 나노입자이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 지지체는 폴리머, 바람직하게는 천연 폴리머이고, 특히 폴리라이신(ε-폴리-L-라이신)으로 구성된다.
ε-폴리-L-라이신(ε-PL)은 인접한 라이신 분자의 카르복실기와 엡실론 아미노기 사이의 펩타이드 결합으로 연결된 호모폴리머이다. 이것은 자연적으로 발생하며, 수용성, 생분해성이고, 식용가능하며 인간과 환경에 무독하다. ε-PL은 25~35개의 L-라이신 잔기로 구성된다. 이것은 스트렙토마이세스 알불루스(Streptomyces albulus)를 이용한 호기성 발효를 통해 산업적으로 생산되며 항균 활성이 있고, 일본과 미국에서 식품용 보존제로 승인되었다.
다가 시알로사이드는 그 구성성분(지지체 및 시알로사이드)과 그래프팅 속도에 의해 구조적으로 특징지워진다.
커플링 수율로도 지정되는 그래프팅 속도는 시알로사이드로 치환된 지지체의 반응기의 백분율로 정의된다.
당업자는 지지체에 대한 시알로사이드의 그래프팅 속도를 조절하는 방법을 알고 있다. 특히 그래프팅 속도는 반응 조건, 특히 실시예 6에 나타난 바와 같이 지지체와 시알로사이드의 비례적인 양에 따라 제어된다.
그래프트율(grafting rate)은 일반적으로 10%에서 100%까지 다양하다.
본 발명의 특정 구현예에서, 다가 시알로사이드는 20% 내지 100%의 그래프트율을 제공한다.
바람직하게는 그래프트율은 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 90%, 및 100%를 포함한다.
약학적 조성물
본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 비히클 내에 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 다가 시알로사이드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 비히클에 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 다가 시알로사이드를 포함하는 수의학적 조성물에 관한 것이다. 유리하게는, 상기 다가 시알로사이드는 동물 숙주 세포를 갖는 바이러스의 억제를 위해 설계된다.
이러한 약학적 또는 수의학적 조성물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 다가 시알로사이드의 유효량을 포함한다.
본 발명의 목적 상, "유효량"은 바이러스의 증식 및/또는 복제, 및/또는 감염된 유기체 내에서 바이러스 감염의 발달을 억제하기에 충분한 다가 시알로사이드의 양을 의미한다. 이러한 억제는 예를 들어 바이러스 복제를 측정하여 정량화할 수 있다.
예를 들어, 시험관 내에서 소위 "유효량"은 실시예 9 내지 11에 기재된 바와 같이 1 μm 내지 1 mM 사이이다.
본 발명에 따른 약학적 또는 수의학적 조성물은 1, 2, 3, 4, 5가 또는 그 이상의 다가 시알로사이드를 포함할 수 있다. 유리하게는, 조성물 중 각각의 다가 시알로사이드는 특정 바이러스 균주에 대해 뚜렷한 특이성을 제공한다.
본 발명에 따르면, 용어 "약학적으로 허용되는 비히클"은 개인 또는 동물에게 투여시 심각한 유해 효과를 수반하지 않으면서 당업자에게 잘 알려진, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 부형제를 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 또는 수의학적 조성물은 경구, 설하, 흡입, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 안구 또는 직장 투여에 적합하다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 약학적 조성물은 흡입 투여에 적합한 생약 형태(galenic form)인 것을 특징으로 한다.
흡입이란 호흡기를 통한 흡수를 의미한다. 이는 특히 치료 목적을 위한 화합물, 가스, 미세액적 또는 현탁액 분말 형태의 특정 물질을 흡수하는 방법이다.
흡입에 의한, 즉 비강 및/또는 경구 통로를 통한 약학적 조성물의 투여는 당업자에게 잘 알려져 있다.
흡입 투여에는 두 가지 유형이 있다.
-
조성물이 분말 형태인 경우 흡입(insufflation)에 의한 투여, 및
-
조성물이 에어로졸(현탁액) 형태이거나 압력 하에서 용액, 예를 들어 수용액 형태인 경우 분무에 의한 투여. 이어서, 약학적 또는 수의학적 조성물을 투여하기 위해 네뷸라이저 또는 스프레이어의 사용이 권장될 것이다.
따라서 본원에서 고려되는 생약 형태는: 분말, 액적의 수성 현탁액 또는 압력 하의 용액 중에서 선택된다. 비강으로 투여하는 것이 바람직하다.
의료 기기
본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 다가 시알로사이드를 포함하는 의료 기기에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 의료 기기는 본 발명의 하나 이상의 다가 시알로사이드로 코팅된 지지체로 구성된다.
특정 구현예에서, 지지체는 다수(적어도 2개)의 다가 시알로사이드로 코팅되며, 각각의 다가 시알로사이드는 다양한 바이러스 균주의 표면에서 발현된 헤마글루티닌에 대해 특이적인 친화성을 갖는다.
예를 들어, 지지체는 첫 번째는 H1N1 인플루엔자 바이러스 주에 특이적이고, 두 번째는 H2N2 인플루엔자 바이러스 주에 특이적이며, 세 번째는 H3N2 인플루엔자 바이러스 주에 특이적인, 3 가지 다가 시알로사이드로 코팅된다.
상기 지지체는 예를 들어 호흡 보호 마스크 또는 마스크에 삽입되는 필터일 수 있다. 대규모 전염병이 등장함에 따라 보호 마스크에 대한 대중의 요청이 점점 더 늘어나고 있다. 상기 지지대는 장갑이나 기타 개인 보호 장치일 수도 있다.
상기 지지체는 예를 들어 본 발명에 따른 다중 시알로사이드로 그래프트된 폴리머로 구성된 다가 시알로사이드로 코팅된다. 각 시알로사이드는 서로 다른 헤마글루티닌에 대해 뚜렷한 특이성을 나타낼 수 있다.
유리하게는, 이 의료 기기는 시알산에 친화성을 갖는 적어도 하나의 바이러스, 특히 인간 인플루엔자 바이러스, 또는 인간 인플루엔자 바이러스의 다중 계통을 포획하고 보유하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 의료 기기는 본 발명에 따른 하나 이상의 다가 시알로사이드를 포함하는 용액을 주사 용액으로 포함하는 코 스프레이이다.
약제 및 치료 용도
본 발명은 또한 약제(medicament)로서 사용하기 위한, 기재된 바와 같은 다가 시알로사이드, 또는 하나 이상의 다가 시알로사이드를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 시알산에 친화성을 갖는 바이러스로 인한 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 기재된 다가 시알로사이드, 또는 적어도 하나의 다가 시알로사이드를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나의 숙주 유기체에서 다른 숙주 유기체로의 바이러스 전염을 예방하는데 사용하기 위한, 기재된 다가 시알로사이드, 또는 적어도 하나의 다가 시알로사이드를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
"시알산에 대한 친화성을 갖는 바이러스"라는 표현은 병원성 작용을 갖고, 즉 살아있는 유기체에서 질병을 일으키고, 시알산에 대한 수용체를 발현하여 시알산 접합체에 결합할 수 있는 모든 바이러스를 의미한다.
이러한 바이러스는 Matrosovich M 등, 2015의 검토에서 포괄적인 방식으로 제시된다. 특히, 시알산에 대한 친화성을 갖는 이러한 바이러스는 오소믹소비리대(인플루엔자 바이러스 포함), 코리나비리대, 파라믹소비리대, 칼리시비리대, 피코르나비리대 레오비리대, 폴리오마비리대, 아데노비리대 및 파보비리대로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 이 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 특히 인간, 말, 돼지 또는 조류 인플루엔자 바이러스이다.
인플루엔자 바이러스는 독감 질병에 책임이 있다. 이들은 A, B, C 세 가지 유형으로 나누어진다.
인플루엔자 바이러스는 표면의 단백질 유형에 따라 정의된다. 표면에 발현되는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA) 당단백질의 특성에 따라 다양한 인플루엔자 A 바이러스 아형이 있다. 순환하는 인플루엔자 A 바이러스에서는 16가지 유형의 HA와 9가지 유형의 NA가 확인되었다.
인간에서 가장 흔한 A형 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H2N2 및 H3N2 아형에 속하며, 특히 동물에서 인간으로, 조류 바이러스 H5N1, H7N7, H7N9, H5N2 및 H9N2가 가끔 종간 전염되기도 한다.
특정 구현예에 따르면, 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H7N9, H5N2 및 H9N2 아형으로부터 선택된 A형 인간 바이러스이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 인플루엔자 바이러스는 인간이고, 균주 H1N1, H3N2 및 B 중에서 선택된다.
본 발명에서, "인플루엔자 바이러스"라는 용어는 인플루엔자 바이러스의 모든 유형(A 또는 B) 및 아형(H1N1, N3N2 등)을 포함한다. 이 용어에는 야생형 인플루엔자 균주, 돌연변이된 인플루엔자 균주, 특히 항바이러스 화합물에 대한 상기 균주의 내성을 초래하는 유전적 돌연변이가 있는 균주가 포함된다.
본 발명에 따른 조성물은 특히 인플루엔자 바이러스 감염 예방에 사용하기 위한 것이다.
유리하게는, 이들 조성물은 오셀타미비르 내성 균주 및 발록사비르 내성 균주와 같은 일반적인 항바이러스 화합물에 대한 내성을 나타내는 인플루엔자 돌연변이 균주의 감염을 예방하는데 사용하기 위한 것이다. 이 측면은 실시예 13에 자세히 나와 있다.
"예방"이라는 용어는 인간 또는 동물 유기체에서 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스에 의한 감염이 나타날 확률을 예방하거나 적어도 감소시키는 것을 의미한다. 그 목적은 바이러스 표면에 존재하는 헤마글루티닌의 항원 부위를 본 발명의 다가 시알로사이드로 포화시켜 바이러스가 숙주 세포에 부착되는 것을 방지하는 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 인플루엔자 바이러스 감염의 치료에 사용하도록 의도될 수 있다.
"치료"라는 용어는 인간이나 동물 유기체에서 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 감염과 싸우는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 적어도 하나의 조성물을 투여함으로써, 유기체의 바이러스 감염 수준은 점진적으로 감소한 다음 완전히 사라질 것이다. '치료'라는 용어는 바이러스 감염에 따른 증상(발열, 피로 등)을 완화시키는 것을 의미하기도 한다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스에 의한 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 하나 이상의 다가 시알로사이드 및 하나 이상의 다른 항바이러스 화합물을 포함하는 조합 제품에 관한 것이다.
바람직한 일 측면에서, 항바이러스 화합물은 인플루엔자를 예방하거나 치료하기 위해 전통적으로 사용되는 항바이러스 화합물 중에서 선택된다. 이러한 항바이러스 화합물은 시판되고 있으며 Vidal 등의 참고서에 기재되어 있다. 예를 들어, 오셀타미비르 및 발록사비르 마르복실은 항바이러스 화합물이며 본 발명의 다가 시알로사이드와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 인간에게 본 발명에 따른 하나 이상의 다가 시알로사이드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 시알산에 친화성을 갖는 바이러스로 인한 감염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
실시예
본 명세서에서 본 발명은 특정 구현예를 참조하여 설명되었지만, 이들 구현예는 단지 본 발명의 원리 및 응용을 예시하는 것임을 이해해야 한다. 따라서, 예시적인 구현예에 대해 다양한 수정이 이루어질 수 있고, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 다른 구성이 고려될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1. COV6S 시알로사이드의 생산
키토올리고당은 여러 가지 이유로 폴리락토사민 사슬에 대한 흥미로운 대안이다. 첫째, 폴리락토사민과 키토올리고당은 모두 β 글리코사이드 결합으로 연결된 장쇄 육탄당이다. 둘째, 두 구조 모두 N-아세틸글루코사민을 주요 성분으로 함유하고 있다. 세 번째로, 키토올리고당은 키토올리고당 합성효소 nodC를 발현하는 대사적으로 조작된 E. coli 에 의해 좋은 수율로 생산될 수 있다 (Samain 등 1997).
더욱이, Bettler 등(1999)은 도 1에 도시된 바와 같이, 키토펜타오스[10]와 같은 키토올리고당이 β1-4 갈락토실트랜스퍼라제에 의해 수용체로 사용되어 그의 비환원 말단에 말단 LacNAc 모티프를 함유하는 육당류[11]를 형성할 수 있음을 보여주었다.
시알릴화된 칠당류 COV6S[12]를 형성하기 위한 [11]의 시알릴화는 아래 설명된 대로 얻은 대사적으로 조작된 E. coli 균주 SCH1에서 α2-6 시알릴트랜스퍼라제의 추가 발현에 의해 가능하다.
균주 SCH1은 숙주 균주 ZLKA를 4개의 플라스미드 pBSnodC, pBBR3-SS, pWKS-lgtB 및 pSU6ST로 형질전환하여 구성된다.
a) 숙주 균주 ZLKA의 작제는 Fierfort 및 Samain(2008)에 의해 기술되었다.
ZLKA 균주는 Deutsche Sam mlung von Mikroorganismen에서 입수한 대장균 K12 균주 DH1(endA1 recA1 gyrA96 thi-1 glnV44 relA1 hsdR17) (참조 DSM 4235)의 파생물로서, lacZ lacA nanA 및 nanK 유전자에 추가적인 멀 돌연변이를 가지고 있다.
b) 아조리조비움 콜리노단스(Azorhizobium caulinaudans)의 키틴올리고당 합성효소에 대한 nodC 유전자를 보유하는 pBSnodC 플라스미드는 Cottaz 및 Samain(2005)에 의해 기술된 대로 작제되었다.
c) pBBR3-SS 플라스미드의 작제는 Fierfort 및 Samain(2008)에 의해 기술되었다. 이것은 각각 N-아세틸글루코사민-6-P 에피머라제, 시알산 합성효소 및 CMP-NeuA 합성효소를 인코딩하는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 균주 ATCC 4343로부터의 세 가지 유전자 neuC neuB 및 neuA를 갖는다.
d) 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)로부터의 갈락토실트랜스퍼라제 lgtB를 운반하는 pWKS-lgtB 플라스미드의 작제. 이 플라스미드는 Cottaz 및 Samain(2005)에 설명된 대로 구성되었다.
e) 포토박테리움(Photobacterium) sp. JT-ISH-224로부터 α2-6 NeuAc 트랜스퍼라제를 운반하는 pSU6ST 플라스미드의 작제. 이 플라스미드는 Richard et al (2017) 에 의해 설명되었다.
이 균주 SCH1은 이전에 설명한 대로 높은 세포 밀도에서 성장한다(Priem et al. 2002): 배양은 1.5리터의 미네랄 배양 배지가 들어 있는 3리터 반응기에서 수행되었으며 온도는 34℃로 유지되고 14% NH4OH를 사용하여 pH를 6.8로 조절한다.
고밀도 세포 배양은 발효기 접종으로 시작하여 탄소 기질(글리세롤 17.5gL-1)이 고갈될 때까지 지속되는 지수 성장 단계, 5 g.L-1h-1의 높은 글리세롤 공급률로 수행되는 5시간 유가식 뱃치, 및 3 g.L-1h-1의 글리세롤 공급률로 수행되는 20 시간 유가식 뱃치의 3 단계로 구성된다.
발효 기간이 끝나고 원심분리(7000g, 30분)를 통해 박테리아 세포를 회수하였다. 세포 펠릿을 증류수에 재현탁시키고 100℃에서 50분 동안 고압멸균하여 세포를 투과화시켰다. 혼합물을 원심분리하고(7000g, 30분) 올리고당을 함유하는 상등액을 회수한다.
강한 양이온 교환 수지(AmberliteIR120 H+ 형태)를 첨가함으로써 세포외 분획의 pH를 3.0으로 낮춘다. 이에 의해 단백질이 침전되었고 이를 원심분리에 의해 제거하였다. 이어서, 약한 음이온 교환기(Dowex 66 유리 염기 형태)를 첨가하여 투명한 상등액의 pH를 6.0으로 조정하고, 따라낸 후 상등액을 Dowex 1(HCO3 형태) 컬럼(5 x 20cm)에 로딩한다. 증류수로 세척한 후 Dowex 1 수지에 남아 있는 산성 올리고당을 0~500mM 연속(NH4)2 CO3 구배로 용출하였다.
COV6S를 포함하는 용출 분획을 모아서 (NH4)2CO3를 동결건조로 제거하였다.
흥미롭게도 GlcNAC는 α2-6 시알릴트랜스퍼라제의 기질이 아니기 때문에 부산물 형성이 방지되며; 결과적으로 COV6S(도 1의 생성물[12])이 거의 유일한 최종 산물이다.
COV6S의 구조는 핵자기공명(NMR)과 질량분석법을 통해 확인된다.
실시예 2. 타입 1 COV6S 시알로사이드의 생산
1형 COV6S 시알로사이드(1-COV6S)는 다음 화학식을 나타낸다.
화학식 (IV) Neu5Acα2-6Galβ1-3GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
이 화학식은 R1 = Galβ1-3, R2=H 및 n=4인 화학식 (I)에 해당한다.
이는 균주 SCH1에 대해 실시예 1에 설명된 바와 같이 균주 SCH11의 발효에 의해 생산된다.
SCH11 균주는 SCH1과 유사하지만 b1-3 갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 플라스미드 pWKS-lgtB가 생략되고 pBBR3-SS가 β1-3 갈락토실트랜스퍼라제에 대한 추가 유전자를 포함하는 pBBR3-SS-β-3GalT로 대체된다.
플라스미드 pBBR3은 다음과 같이 구성된다: β1-3 갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 서열을 함유하는 1.34kb DNA를 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) ATCC43504의 게놈 DNA 주형을 사용하여 PCR로 증폭시킨다.
SalI 사이트는 왼쪽 프라이머에 추가되고:
5'GGTCGACGGTAAGGAGATATACATATGATTTCTGTTTATATCATTTCTTTAAAAG (SEQ ID NO.1)
PstI 사이트는 오른쪽 프라이머에 추가된다:
5' CTGCAGTTAAACCTCTTTAGGGGTTTTTAAAGG(SEQ ID NO. 2).
증폭된 단편은 먼저 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 클로닝된 다음 pBBR3-SS 플라스미드의 XhoI 및 PstI 부위에 서브클로닝되어 pBBR3-SS-β-3GalT를 형성한다.
실시예 3. COIV6S 시알로사이드의 생산
COIV6S 시알로사이드는 다음 화학식을 나타낸다:
화학식 (Ⅴ) Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
이 화학식은 R1 = Galβ1-4, R2=H 및 n=3인 화학식 (I)에 해당한다.
이는 균주 SCH1에 대해 실시예 1에 기술된 바와 같이 균주 SCH9의 발효에 의해 생산된다.
균주 SCH9는 아조르히조비움 콜리노단스(Azorhizobium caulinaudans)의 키틴올리고당 합성효소를 인코딩하는 플라스미드 pBS-nodC가 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti)의 키틴올리고당 합성효소를 암호화하고 Samain 등 (1997)에 의해 기술된 플라스미드 pUC-nodC로 대체된 점을 제외하면, SCH1과 유사하다.
실시예 4. COII6S 및 COIII6S 시알로사이드의 생산
COII6S 및 COIII6S 시알로사이드는 다음 화학식을 나타낸다.
화학식 (VI)
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
화학식 (VII)
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
COII6S 및 COIII6S의 두 화학식 모두, 각각 R1 = Galβ1-4, R2=H 및 n=1 또는 2인 화학식 (I)에 해당한다.
COII6S 및 COIII6S 시알로사이드는 균주 SCH1을 균주 SCH10으로 대체한 것을 제외하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 발효에 의해 동시에 생산되었다. Dowex1에 대한 정제 단계 후 두 개의 시알로사이드가 HW40 컬럼의 크기 배제 크로마토그래피로 분리된다.
균주 SCH10은, 플라스미드 pWKS-lgtB가 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) WL12의 추가 chiA 유전자를 포함하는 플라스미드 pWKS-lgtB-ChiA로 대체된다는 점을 제외하면 균주 SCH1과 유사하다. chiA 유전자는 키틴트리오스의 일시적 축적과 함께 키틴펜타오스를 키틴비오스로 절단하는 키티나제를 인코딩하는 것으로 앞서 밝혀진 바 있다(Cottaz 및 Samain, 2005).
플라스미드 pWKS-lgtB-ChiA는 다음과 같이 작제된다: chiA 유전자를 포함하는 1.3kb DNA 세그먼트를 KpnI notI 분해에 의해 pBBR1-ChiA(Cottaz 및 Samain 2007)으로부터 절제하여 XbaI/kpnI 링커의 존재 하에 pWKS-lgtB의 XbaI notI 사이트에 클로닝한다.
실시예 5. LSTc 시알로사이드(본 발명에 포함되지 않은 시알로사이드)의 생산
LSTc는 모유에서 발견되는 천연 시알로사이드로서 기준 화합물로 사용된다. 그 구조는 다음과 같다:
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc
이것은 균주 SCH1이 균주 LST1로 대체되고 락토스(5g/l)가 지수 성장 단계의 마지막에 첨가된다는 점을 제외하고는 실시예 1에 설명된 바와 같이 발효에 의해 생산될 수 있다. LST1 균주는 pBS-nodC 플라스미드를 함유하지 않는 것을 제외하고 SCH14 균주와 유사하다.
실시예 6. 다가 시알로사이드의 합성
천연 폴리머(ε-폴리-L-라이신)의 아민기의 환원성 아민화에 기초한 간단한 접근법을 사용하여 실시예 1 내지 5에서 얻은 다양한 시알로사이드의 말단 환원 종단을 연결하였다.
시알로사이드로 치환된 ε-폴리-L-라이신의 아민기의 백분율로 정의되는 그래프트율은 반응 조건에 의해 제어될 수 있다. 아래 표 2에 제시된 바와 같이 그래프트율은 20%에서지 100%까지 다양하다.
ER15를 얻기 위한 간단한 실험 프로토콜은 다음과 같다.
1.5 ml 마이크로튜브에 0.4 mmol의 시알로사이드(아민당 1 당량)를 500 μl의 탈이온수에 용해시킨다. 완벽한 가용화를 달성하려면 초음파 처리가 필요하다(용액 1). 또 다른 마이크로튜브 1.5 ml에는 폴리라이신 50 mg을 탈이온수 100 μl에 용해시킨다(용액 2). 두 용액 1과 2를 혼합하고 붕산염 완충액(500 mM, pH 8.5) 100 μl를 첨가한다.
흄 후드 하, 1.5 ml 마이크로튜브에서 123.6 mg NaBH3CN(2 mmol, 5 당량/올리고당)을 50μl 탈이온수에 용해시키고 생성된 용액 3을 이전 혼합물에 적가한다. 반응 혼합물을 보텍스처리하고 흄 후드 하 건조조에서 40℃에서 72시간 동안 배양한다.
반응 혼합물(1 ml)을 15 ml 원심분리 튜브로 옮긴다. 마이크로튜브를 1 ml 탈이온수로 세척하고 이를 15 ml 튜브(총 부피 2 ml)로 옮긴다. 4 ml의 96% 에탄올(2 볼륨)을 첨가한 후, 튜브를 9000 rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상등액(약 6 ml)을 제거하고 침전물을 1% NaCl 용액 2 ml에 녹인다. 4 ml의 96% 에탄올을 첨가하고 두 번째 원심분리(15분, 9000rpm, 4℃) 후, 침전물을 5 ml 탈이온수에 수집하고 예비 HW40 입체 크로마토그래피 컬럼(5 x 90cm)에서 정제한다. 용출은 2 ml/분의 유속으로 100 mM 탄산암모늄을 사용하여 수행된다.
정제 후 생성물이 들어있는 튜브를 모은다. 생성물을 증발건조시켜 탄산암모늄을 제거한 후, 탈이온화 동결건조수 3 ml를 첨가한다.
화합물 ER59, 60 및 61을 얻기 위해 올리고당 당량의 수를 각각 아민당 0.75당량, 아민당 0.5당량 및 아민당 0.25당량으로 수정하였다.
커플링 속도는 NMR(핵자기공명) 1H 및 MALS(다각 광산란 검출)를 갖춘 GPC(겔 투과 크로마토그래피)에 의해 구한다.
실시예 7. 혈구응집 억제 분석(HI 또는 HAI)
HI 기술은 고정된 양의 바이러스와 함께 감소하는 용량의 다가 시알로사이드(바이러스 억제제일 수 있음)를 배양하는 것으로 구성된다. 인식과 결합이 있으면 바이러스는 억제제에 부착된다.
그런 다음 적혈구를 첨가하고 혼합물을 배양한다. 유리 바이러스는 적혈구 표면에 존재하는 시알산을 인식하여 네트워크(적혈구 응집 과정을 대표하는 붉은색 베일)를 생성할 수 있는 반면, 다가 시알로사이드에 부착된 바이러스는 적혈구 세포에 결합하지 못하여, 웰 바닥에 침강하여 펠릿을 생성한다(혈구응집 억제를 나타냄).
적혈구응집 역가는 적혈구응집 억제가 관찰되는 가장 높은 희석의 역수에 해당한다. 희석은 2의 비율로 이루어지므로 역가 <2는 ½의 첫 번째 희석에서는 적혈구응집 억제가 관찰되지 않음을 의미하는 반면, 예를 들어 역가 4096은 1/4096 희석까지 적혈구응집 억제가 있음을 의미한다.
도 3은 HI 기술의 요약 체계를 보여준다.
이 HI 분석에 사용된 바이러스 균주는 A/캘리포니아/7/2009 H1N1, A/포르토리코/8/34 H1N1, A/텍사스/50/12 H3N2, A/모스크바/10/99 H3N2, B/매사츄세츠/2/2012 및 B/브리즈번/60/08이며, 웰당 4 HAU의 용량으로 사용된다. 사용된 적혈구는 0.5% 암탉의 적혈구와 0.8% 기니피그 적혈구이다.
하기 표 3은 표 2에 나열된 다가 시알로사이드를 사용하여 얻은 결과를 나타낸다. ER10 및 ER13은 화학식 (I)에 포함되지 않는 다가 시알로사이드이므로 본 발명에 속하지 않는다.
중요한 결과는 굵은 글씨로 표시되어 있다.
표 3에 제시된 결과는 ER15가 H1N1 바이러스 A/캘리포니아/7/09 및 A/PR/8/34에 대한 HI 측면에서 역가가 각각 128 및 4096로 가장 성능이 좋은 화합물인 반면, ER10 또는 ER13 화합물은 2 및 16의 역가(ER10)와 <2 및 2의 역가(ER13)를 나타냄을 보여준다.
이러한 실험은 HI 특성, 특히 ER15 화합물에 대한 GlcNAc 모티프 존재의 중요성을 강조한다. 모든 화합물이 동일한 혈구응집 억제 활성을 갖는 것은 아니며 바이러스 유형(A 또는 B) 및/또는 A 바이러스 아형에 따라 심지어 활성이 전혀 없는 경우도 있다.
실시예 8. 미세중화 분석
미세중화 분석을 통해 감염성 바이러스에 대한 항바이러스 화합물의 억제 가능성을 정량화할 수 있다. 이 기술의 개략를가 도 4에 나타내었다.
이 분석은 인플루엔자 바이러스에 대한 참조 세포 시스템인 Madin-Darby Canine Kidney Cells(MDCK)에서 수행되는데 이 세포는 표면에 α 2.3 결합 또는 α 2.6 결합에 의해 갈락토스에 결합된 시알산을 제시한다. 이 테스트에 사용된 바이러스 균주는 50μL당 100 TCID50의 보정된 용량의 A/캘리포니아/7/2009 H1N1이었다.
이 기술은 1시간 동안 고정된 양의 바이러스와 함께 점점 감소하는 용량의 테스트 화합물을 배양하는 것으로 구성된다. 인식되면 바이러스는 화합물에 결합한다. 그런 다음 이 바이러스/화합물 혼합물을 MDCK 세포에 첨가하고 72시간 동안 배양한다. 결합되지 않은 바이러스는 세포 표면에 존재하는 시알산을 인식하여 세포를 감염시킬 수 있는 반면(세포변성 효과의 시각화), 시알릴화 화합물에 결합된 바이러스는 세포에 부착될 수 없으므로 세포를 감염시킬 수 없다(감염의 "중화").
미세중화 역가는 4개 웰 중 적어도 2개 웰에서 세포변성 효과가 전혀 없는 것으로 관찰되는 최고 희석배수의 역수이다. 희석이 1:5부터 시작하여 2의 비율로 이루어지면 역가 <5는 처음 1:5 희석에서 감염이 중화되지 않았음을 의미하는 반면 역가가 예를 들어 160이라는 것은 최대 1:160 희석까지 감염이 중화되지 않았음을 의미한다.
ER15 다가 시알로사이드는 바이러스 균주 A/캘리포니아/7/2009 H1N1에 대해 최고의 중화 활성을 나타낸다.
실시예 9. 인간 세포주 A549에 대한 본 발명의 다가 시알로사이드의 분석
이 분석의 목적은 다양한 치료 조건(치료/감염 후, 예방/감염 전 치료) 하에서 인간 호흡기 세포주 A549(인간 폐암종 유래)에 대한 항바이러스제로서의 ER15의 성능을 다양한 농도와 다회 바이러스 용량(용량-효과)에서 평가하는 것이다. .
A549 세포를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 DMEM + SVF 10% + L-글루타민 2mM + 페니실린(100U/ml) + 스트렙토마이신(100μg/ml)에서 배양한다. 감염 및 화합물 평가를 위해 세포를 DMEM + L-글루타민 2mM + 페니실린(100U/ml) + 스트렙토마이신(100μg/ml) + 소 트립신(T6763 Sigma) 0.5μg/ml의 12웰 플레이트에 접종한다.
A/캘리포니아/7/2009 H1N1 바이러스 균주를 두 가지 다른 감염 다중도(MOI): 0.1과 0.01로 사용한다. 이 균주는 D225G 돌연변이된 헤마글루티닌을 보유하여 세포 수용체에 대한 더 큰 친화력을 제공한다.
또 다른 바이러스 균주 A/리옹/969/09 H1N1을 세 가지 다른 MOI, 즉: 1; 0.1 및 0.01로 사용한다. 이 균주는 D225G 돌연변이를 나타내지 않으며 세포 수용체의 알파 2-6 시알산에 대한 친화력이 낮다.
동결건조된 화합물을 0.1 mM의 물과 혼합하고 0.22μM로 여과한 후 -20℃에서 보관한다. 음성 대조군으로 사용된 화합물은 폴리라이신 단독(PL)이다.
A549 세포의 치료 및 감염 후, 감염 후 D1, D2 및 D3에 상등액 샘플을 채취하여 (i) MDCK 세포의 ml당 감염성 입자 수(TCID50/ml)를 적정하고 (ii) 바이러스 게놈의 정량화(RT-qPCR)에 의해 바이러스 생산을 정량화한다..
A - H1N1 균주에 대한 ER15 vs. 폴리라이신 단독(PL)의 치료 특성
ER15 화합물의 잠재적인 치료 효과를 3가지 감염 후 처리(D0(1시간 pi), D1 및 D2)를 통해 분석한다. A/캘리포니아/7/09 H1N1 바이러스를 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 제거한다.
ER15가 포함된 배지를 추가한다 - ER15는 5가지 상이한 농도(20, 10, 5, 2.5 및 1.25μM)로 존재한다 vs 미처리 조건(NT: 미처리 및 PL: 증가하는 양의 폴리라이신 전달). 바이러스 정량화를 위해 세포 상등액의 여러 샘플을 3회에 걸쳐 채취한다.
도 5에 표시된 결과는 감염 후 1시간, 24시간 및 48시간에 투여된 ER15 치료가 A/캘리포니아/7/09 H1N1 역가에서 5-6-로그 감소를 제공한다는 것을 나타낸다. 바이러스 접종원(viral inoculum)의 MOI가 0.1일 때 치료 농도에 따른 용량 의존적 효과가 관찰된다. MOI 0.01에서, 테스트된 모든 ER15 농도(20, 10, 5, 2.5 및 1.25μM)는 빠르면 24hpi에서 최대 바이러스 부하 감소를 허용한다.
RT-qPCR에서 얻은 결과는 일치하며 감염이 크게 억제되었음을 나타낸다.
B- H3N2 균주에 대한 ER15 vs. 폴리라이신 단독(PL)의 치료 특성
A/텍사스/50/2012 H3N2 바이러스를 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 제거한다는 점을 제외하면 실험 조건은 (A)와 동일하다.
도 6에 표시된 결과는 다음을 나타낸다.
● 감염 후 1시간, 24시간, 48시간에 20μM의 용량으로, 테스트된 2개의 MOI, 즉 0.1 및 0.01로 투여한 ER15 치료에서 감염성 역가(약 3-로그)의 상당한 감소가 관찰되었다.
● 1.25 내지 10μM 농도의 ER15 처리는 이 H3N2 균주에 대한 감염성 바이러스 부하를 크게 감소시키지 않다.
이들 결과는 역가가 <2인 HIA에서 얻은 결과와 일치한다.
따라서 H3N2 균주에 대해 용량 의존적으로 유의미한 효과가 관찰된다.
RT-qPCR에서 얻은 결과는 일치하며 20μM에서만 처리한 경우 바이러스 부하가 크게 감소한 것으로 나타났다.
전반적으로, A549 세포의 HIA 및 효능 결과는 A/캘리포니아/7/09 H1N1에 비해 A/텍사스/50/2012 H3N2 균주에 대해 ER15의 더 낮은 친화도/성능을 보여준다.
C - A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15 vs. 폴리라이신 단독(PL)의 치료 특성(감염 후 단 한 번 투여)
실험 조건은 ER15를 감염된 세포에 배지에 첨가하여 D0, 1시간 pi에 한 번만 투여하는 것을 제외하고 (A)와 동일하다. 3가지 다른 농도로 테스트한다: 20; 5 및 1,25μM.
도 7에 표시된 결과는 감염 후 1시간에 투여된 ER15 처리가 시작 MOI(0.1 또는 0.01)에 관계없이 감염성 바이러스 부하를 대폭 감소시키는 데 충분하다는 것을 나타낸다. 24hpi에서는 최소 2 log의 감소가 관찰되고, 72hpi에서는 최대 5 log 이상의 감소가 관찰된다. 따라서 효과는 단일 투여(1hpi)로 지속되며 MOI 0.1에서 용량 효과가 관찰된다.
D - A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15 vs. 폴리라이신 단독(PL)의 치료 특성(바이러스 감염과 동시에 단 한 번 투여)
실험 조건은 ER15를 배지에 첨가하여 D0에 바이러스와 함께 한 번만 세포에 투여하는 것을 제외하고 (A)와 동일하다. 3가지 다른 농도로 테스트한다: 20; 5 및 1.25μM.
도 8에 표시된 결과는 바이러스와 동시에(감염 단계 중) 투여된 ER15 처리가 특히 초기 단계에서 감염성 바이러스 부하(최대 3-log)를 크게 감소시킬 수 있음을 나타낸다. (24시간 및 48시간 pi). MOI 0.01 조건에서는 시간이 지나도 효과가 유지된다(4 내지 5 log 사이). ER15 농도의 용량 의존적 효과뿐만 아니라 MOI의 용량 의존적 효과도 관찰된다.
E- A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER15 vs. 폴리라이신 단독(PL)의 예방 특성,
여기서의 목적은 감염 하루 전에 3가지 다른 농도(20, 5 및 1.25 μM)에서 수행된 단일 치료를 통해 ER15 화합물의 예방 효과를 평가하는 것이다.
감염 시 A/캘리포니아/7/09 H1N1 바이러스를 화합물이 이미 포함된 배지에 직접 첨가한다. 5시간 배양 후 바이러스와 화합물이 포함된 배지를 제거하고 새로운 배지로 교체한다.
감염성 바이러스 정량화를 위해 D1, D2 및 D3에 샘플을 채취한다.
도 9에 표시된 결과는 감염 24시간 전에 수행된 ER15를 사용한 단회의 예방 적 처치가 시간이 지남에 따라 감염성 바이러스 부하를 유의하게 감소시킴을 보여준다: MOI에 따라 24시간 pi에서 2 내지 3 로그, 최대 5 로그 감소. 효과는 시간이 지나도 유지된다(4 내지 5 로그). ER15 농도와 MOI의 용량 의존적 효과가 명확하게 관찰된다.
F- H1N1 A/리옹/969/09 균주에 대한 ER15 vs. 폴리라이신 단독(PL)의 치료 특성
H1N1 A/리옹/969/09 균주 바이러스를 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 제거한다는 점을 제외하고 실험 조건은 (A)와 동일하다.
도 10에 표시된 결과는 ER15가 A/리옹/969/09 H1N1 균주의 감염성 바이러스 부하를 크게 감소시킨다는 것을 나타낸다. 예상한 대로 리옹 균주에 대한 결과는 D225G 돌연변이를 나타내는 캘리포니아 균주의 결과보다 좋지 않다.
실시예 10: 재구성된 인간 코 기원의 호흡 상피에 기초한 시험관내 생리학적 모델에서 ER15 화합물의 평가
공기/액체 경계면의 24개 웰 플레이트에 배치된 삽입물에서 상피를 배양한다. 따라서 기저극(basal pole)을 구성하는 세포는 배양액과 접촉하고, 정점극을 구성하는 세포는 공기와 접촉하게 된다. 배양 배지는 Mucilair(Epithelix)이고 상피는 기증자 풀(Epithelix)의 비강 면봉에서 추출된다. 이를 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양한다.
A/캘리포니아/7/2009 H1N1 균주에 의한 감염은 150μl의 OptiMEM 배지에 있는 정점극에서 0.1의 감염 다중도에서 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 발생한다. 그런 다음 바이러스 현탁액을 제거하고 세척을 수행한다. 정점극에서 전체 배지를 조심스럽게 제거한 후 3가지 다른 농도(50, 20 및 5μM)에서 10μl당 1hpi로 처리가 수행된다.
동결건조된 화합물 ER15를 0.1mM 농도로 다음과 혼합한다:
-
물,
-
포스페이트 완충액(2g/L 글리세린 9g/L NaCl 10mM pH = 7.9) 및
-
시트레이트 완충액(2g/L 글리세린 9g/L NaCl 10mM pH = 6.0)
음성 대조군은 물에 0.1 mM로 희석된 폴리라이신(PL)이다.
일부 세포는 미처리(NT)되고/되거나 목(mock: 미감염)이다.
경상피 전기 저항(TEER) 측정은 상피의 완전성을 모니터링하기 위해 매일 수행된다. ml당 감염성 입자 수의 적정에 의해(TCID50/ml - 도 11C) 바이러스 생산을 정량화하기 위해 D1, D2 및 D3의 정점극에서 샘플을 수집하고 RT-qPCR을 통해 바이러스 게놈을 정량화(도 11D)한다.
동시에, ER15의 세포독성을 동일한 치료 조건에서 목(mock) - 감염 조건 하에 평가한다. 여기서는 바이러스 접종량을 OptiMEM 배지로 대체하였다. 락테이트 탈수소효소(LDH, 세포독성의 경우 방출됨)의 방출을 정량화하기 위해 매일 기본 배지에서 샘플을 채취한다. 도 11B에 표시된 결과는 ER15 화합물이 상피에서 최소 50μM까지 세포독성이 없음을 나타낸다.
또한, 50μM의 ER15는 상피의 감염성 바이러스 양을 크게 감소시킨다 (도 11C 및 11D). 포스페이트 및 시트레이트 완충액은 용매 물에 비해 20μM에서 ER15의 효능이 더 나은 것으로 보이다.
이러한 결과는 도 11D에 표시된 바와 같이 RT-qPCR로 확인된다. TEER 측정 역시도 전체 결과와 일치한다.
실시예 11. A/캘리포니아/7/09 H1N1 균주에 대한 ER61 vs. 폴리라이신 단독(PL)의 치료 특성
ER61 화합물의 잠재적인 치료 효과를 3가지 감염 후 처리(D0(1시간 pi), D1 및 D2)를 통해 분석한다. A/캘리포니아/7/09 H1N1 바이러스를 A549 세포에서 37℃에서 1시간 동안 0.1 또는 0.01의 감염 다중도로 배양한 후 제거한다.
실험 조건은 ER61 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 9(A)와 동일하다.
ER61을 5가지 다른 농도(20, 10, 5, 2.5 및 1.25 μM) vs. 미처리 조건(NT: 미처리 및 PL: 증가하는 양의 폴리라이신 전달)으로 테스트하였다. 바이러스 정량화를 위해 세포 상등액의 여러 샘플을 3회에 걸쳐 채취한다.
도 12에 표시된 결과는 감염 후 1시간, 24시간 및 48시간에 투여된 ER61 처리가 A/캘리포니아/7/09 H1N1 역가에서 최대 5-로그 감소를 제공한다는 것을 나타낸다. 바이러스 접종원의 MOI가 0.1일 때 치료 농도에 따른 용량 의존적 효과가 관찰된다. MOI 0.01에서, 테스트된 모든 ER61 농도(20, 10, 5, 2.5 및 1.25μM)는 빠르면 24h pi 안에 최대 바이러스 부하 감소를 허용한다.
실시예 12. 최근 균주에 대한 ER15 및 ER61 화합물의 치료 특성
백신 조성물에 포함된 테스트된 "최근" 균주는 다음과 같다: A/미시간/45/2015 H1N1; A/캔자스/2017년 14월 H3N2; 및 B/푸켓/3073/2013.
ER15 및 ER61 화합물의 잠재적인 치료 효과를 3가지 감염 후 처리(D0(1시간 pi), D1 및 D2)를 통해 분석한다. 바이러스를 A549 세포에서 37℃에서 1시간 동안 감염 다중도 0.1로 배양한 후 제거한다.
다가 시알로사이드 ER15 및 ER61을 3가지 다른 농도(20, 5, 1.25μM) vs. 미처리 조건(NT: 미처리)에서 테스트한다. 바이러스 정량화를 위해 세포 상등액의 여러 샘플을 3개의 서로 다른 시간(24, 48 및 72시간 pi)에서 채취한다.
도 13A, 13B 및 13C에 도시된 결과는 감염 후 1, 24 및 48시간에 투여된 ER15 및 ER61 처리가 동등함을 나타낸다. 치료 농도에 따라 용량 의존적인 효과가 관찰된다. 20μM의 농도에서 두 화합물 ER15와 ER61은 세 가지 바이러스 균주에 대해 유의한 항바이러스 효과를 나타낸다.
실시예 13. 재조합 오셀타미비르 및 발록사비르 내성 H1N1 바이러스에 대한 ER15 화합물의 치료 효과
3개의 재조합 H1N1 바이러스를, 뉴라미니다제의 H275Y 돌연변이(오셀타미비르에 대한 내성 부여) 또는 폴리머라제 PA 서브유닛의 I38T 돌연변이(발록사비르에 대한 내성 부여) 또는 양자 모두(H275Y + I38T)를 포함하는 A/리옹/969/09 H1N1 유전자 백본을 사용한 유전적 역전(genetic reverse)에 의해 생성하였다. ER15 화합물의 잠재적인 치료 효과를 3가지 감염 후 처리(D0(1시간 pi), D1 및 D2)를 통해 분석한다. 재조합 내성 H1N1 바이러스를 A549 세포에 37℃에서 1시간 동안 감염 다중도 0.1로 배양한 후 세척하여 제거한다. 실험 조건은 이들 바이러스를 사용한 것을 제외하고는 실시예 9(A)와 동일하다. ER15는 5가지 농도(20, 10, 5, 2.5 및 1.25 μM) vs. 미처리 조건(NT: 미처리 및 PL: 증가하는 양의 폴리라이신 전달)으로 테스트되었다. 바이러스 정량화를 위해 세포 상등액의 여러 샘플을 3회에 걸쳐 채취한다.
도 14A에 도시된 결과는 감염 후 1시간, 24시간 및 48시간에 투여된 ER15 처리가 H1N1 I38T 역가에서 최대 2-로그 감소를 제공한다는 것을 나타낸다. 처리 농도에 따른 용량 의존적 효과가 관찰된다. 각각 도 14B 및 도 14C에 도시된 바와 같이, H1N1 H275Y 및 이중 내성 H1N1(I28T + H275Y 바이러스)에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
참고문헌
특허
WO 2007/101862
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<223> Oligonucleotide comprising a PstI site
<400> 2
ctgcagttaa acctctttag gggtttttaa agg 33
Claims (18)
- 하기 화학식 (I)을 나타내는 합성 시알로사이드:
Neu5Ac-α2-6-R1(R2)[GlcNAcβ1-4]n-GlcNAc 화학식 (I)
식 중:
● GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이고;
● GlcNAcβ1-4는 β1-4 연결로 연결된 N-아세틸글루코사민 단위이며;
● n은 1 보다 크거나 같고;
● R1은 적어도 하나의 갈락토스(Gal)를 포함하는 글리칸 구조이고;
● R2는 다음 그룹 중에서 선택된다: H, α1-3 연결(Fucα1-3) 또는 α1-4 연결(Fucα1-4). - 제1항에 있어서, R1은 최대 5개의 단당류를 포함하는 주쇄를 갖는 글리칸 구조인 합성 시알로사이드.
- 제2항에 있어서, R1은 1개, 2개 또는 3개의 단당류를 포함하는 주쇄를 갖는 글리칸 구조인 합성 시알로사이드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 적어도 하나의 갈락토스가 주쇄의 말단 중 하나에 연결된 글리칸 구조인 합성 시알로사이드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 다음 그룹 중에서 선택되는 합성 시알로사이드: Galβ1-4, Galβ1-3, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4 및 Galβ1-4 (Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 H인 합성 시알로사이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 (II)를 나타내는 합성 시알로사이드:
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 다중 합성 시알로사이드를 갖는 지지체를 포함하는 다가 시알로사이드.
- 제8항에 있어서, 지지체는 리포솜, 덴드리머, 폴리머 또는 나노입자로 구성되는 다가 시알로사이드.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 지지체는 폴리라이신(ε-폴리-L-라이신)으로 구성되는 다가 시알로사이드.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 상의 시알로사이드의 그래프트율은 20% 내지 100%인 다가 시알로사이드.
- 약학적으로 허용되는 비히클에 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 다가 시알로사이드를 포함하는 약학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 흡입 투여에 적합한 형태인 약학적 조성물.
- 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 다가 시알로사이드를 포함하는 의료 기기.
- 약제로서 사용하기 위한, 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 다가 시알로사이드, 또는 제12항 또는 제13항에 따른 약학적 조성물.
- 시알산에 친화성을 갖는 바이러스로 인한 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 다가 시알로사이드, 또는 제12항 또는 제13항에 따른 약학적 조성물.
- 제16항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 특히 인간, 말, 돼지 또는 조류 인플루엔자 바이러스인, 상기 용도의 다가 시알로사이드 또는 약학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 인간이고, 균주 H1N1, H3N2 및 B 중에서 선택되는, 상기 용도의 다가 시알로사이드 또는 약학적 조성물.
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