KR20230164793A - 항염증 효과를 갖는 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물의 제조 방법은 인삼으로부터 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 추출 단계; 상기 추출 단계에서 수득되는 추출물로부터 진세노사이드를 정제하는 정제 단계; 및 상기 정제 단계에서 수득되는 정제물을 포함하는 수용액에 유기산을 첨가하여 pH 2.0 내지 2.3으로 조절하고 70 내지 90℃로 10시간 이상 열처리하는 산 및 열처리 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 항염증 효과를 갖는 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 희귀 진세노사이드인 Rg3가 다량으로 함유되어 있을 뿐만 아니라 Rk1 및 Rg5와 같은 희귀 진세노사이드 또한 함유되어 있고 고도로 정제된 Rg3와 비견될 수 있고 한편으로는 더 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있는 조성물을 인삼 소재로부터 간단하면서도 안전하게 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.
인삼은 두릅나무과의 여러해살이풀로서, 주로 약재로 사용되어 왔다. 인삼에는 다른 식물에서 발견되는 것과는 화학 구조가 상이한 특유의 사포닌이 함유되어 있으며, 이를 진세노사이드(ginsenoside)라고 부른다.
진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계 (protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다.
현재 40여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, 지페노사이드 XVII(gypenoside XVII), 컴파운드 오(compound O), 컴파운드 엠씨원(compound Mc1), F2, 컴파운드 와이(compound Y), 컴파운드 엠씨(compound Mc), Rg3, Rh2, Rk1, Rg5, 컴파운드 케이(compound K, C-K)가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1 등이 포함된다.
인삼 그리고 이의 가공물로서 대표적인 홍삼 등에 함유된 전체 진세노사이드의 90% 이상이 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc 등과 같은 주요 진세노사이드(메이저 진세노사이드로도 불림)이며, Rd, F2, Rg3, Rk1, Rg5, Rh1, Rh2, 지페노사이드 XVII, 지페노사이드 LXXV 및 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨, 컴파운드 엠씨원 등과 같은 희귀 진세노사이드(마이너 진세노사이드로도 불림)는 아주 적은 양만이 함유되어 있다. 주요 진세노사이드는 큰 분자량으로 인해 생체 내 흡수율이 매우 낮은 반면 희귀 진세노사이드는 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 것으로 알려져 있다. 이에 주요 진세노사이드로부터 희귀 진세노사이드를 제조하기 위한 다양한 연구가 이루어지고 있다.
희귀 진세노사이드 중에서도 Rg3는 항암, 항염 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있어 관련 기술분야에서 많은 관심을 보이고 있다. 인삼 소재로부터 이러한 Rg3를 생성하거나 Rg3가 다량으로 함유된 인삼 가공물을 얻기 위한 방법으로 한국등록특허 제10-1423100호, 한국등록특허 제10-1916189호 등 여러 가지 방법이 개시되어 있다. 그러나 이들 기술은 대부분 미생물을 이용하는 기술이거나 고온의 증숙 및 냉각 과정을 반복하는 기술이다. 미생물을 이용하는 기술인 경우 미생물의 배양 및/또는 발효를 위한 고가의 설비가 필요하며 오염 문제 등으로 인해 관리가 어렵다는 문제가 있고, 고온의 증숙 및 냉각 과정을 반복하는 기술인 경우 높은 온도의 열처리와 냉각을 반복해야 하기 때문에 번거롭고 작업 상의 위험도가 상당하다는 문제가 있다. 또한, 수득되는 산물의 생물학적 활성이 확인되지 않거나 활성이 기대에 미치지 못하는 문제도 있다.
이에 본 발명자는 희귀 진세노사이드 Rg3가 다량으로 함유되어 있는 조성물을 인삼 소재로부터 보다 간단하면서 안전하게 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 하였으며, 이와 동시에 높은 생물학적 활성, 특히 높은 항염증 활성을 나타낼 수 있는 조성물을 간단하면서 안전하게 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 하였다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 희귀 진세노사이드 Rg3가 다량으로 함유되어 있으며 높은 항염증 활성을 나타낼 수 있는 조성물을 인삼 소재로부터 간단하면서도 안전하게 제조할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 것으로서 희귀 진세노사이드 Rg3가 다량으로 함유되어 있으며 높은 항염증 활성을 나타낼 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 본 발명은 인삼으로부터 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 추출 단계; 상기 추출 단계에서 수득되는 추출물로부터 진세노사이드를 정제하는 정제 단계; 및 상기 정제 단계에서 수득되는 정제물을 포함하는 수용액에 유기산을 첨가하여 pH 2.0 내지 2.3으로 조절하고 70 내지 90℃로 10시간 이상 열처리하는 산 및 열처리 단계를 포함하는 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조되어 진세노사이드 Rg3, Rk1 및 Rg5를 함유하는 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 희귀 진세노사이드인 Rg3가 다량으로 함유되어 있고 Rk1 및 Rg5와 같은 희귀 진세노사이드 또한 함유되어 있는 조성물을 인삼 소재로부터 간단하면서도 안전하게 제조할 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면 상기와 같은 희귀 진세노사이드가 다량으로 함유되어 있을 뿐만 아니라 고도로 정제된 Rg3와 비견될 수 있고 한편으로는 더 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있는 조성물을 제조할 수 있다.
도 1 내지 4는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 희귀 진세노사이드 함유 조성물 중의 진세노사이드를 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 1은 화기삼 잎을 사용하여 제조된 조성물의 분석 결과이다. 도 2는 화기삼(뿌리)을 사용하여 제조된 조성물의 분석 결과이다. 도 3은 삼칠삼(뿌리)을 사용하여 제조된 조성물의 분석 결과이다. 도 4는 고려인삼(뿌리)을 사용하여 제조된 조성물의 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 희귀 진세노사이드 함유 조성물(GRg3-mix)의 처리에 따른 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 희귀 진세노사이드 함유 조성물(GRg3-mix)의 산화질소(NO) 생성 억제 활성을 고도로 정제된 고순도(98% 이상)의 Rg3 정제물(Rg3-STD)과 비교하여 나타낸 것이다.
도 7 및 8은 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 희귀 진세노사이드 함유 조성물(GRg3-mix)의 염증성 사이토카인 발현 억제 활성을 고도로 정제된 고순도(98% 이상)의 Rg3 정제물(Rg3(STD))과 비교하여 나타낸 것이다. 도 7은 RT-PCR 실험 결과이다. 도 8은 웨스턴 블롯 실험 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 희귀 진세노사이드 함유 조성물(GRg3-mix)의 처리에 따른 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 희귀 진세노사이드 함유 조성물(GRg3-mix)의 산화질소(NO) 생성 억제 활성을 고도로 정제된 고순도(98% 이상)의 Rg3 정제물(Rg3-STD)과 비교하여 나타낸 것이다.
도 7 및 8은 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 희귀 진세노사이드 함유 조성물(GRg3-mix)의 염증성 사이토카인 발현 억제 활성을 고도로 정제된 고순도(98% 이상)의 Rg3 정제물(Rg3(STD))과 비교하여 나타낸 것이다. 도 7은 RT-PCR 실험 결과이다. 도 8은 웨스턴 블롯 실험 결과이다.
본 발명의 방법은 인삼으로부터 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 추출 단계; 상기 추출 단계에서 수득되는 추출물로부터 진세노사이드를 정제하는 정제 단계; 및 상기 정제 단계에서 수득되는 정제물을 포함하는 수용액에 유기산을 첨가하여 pH 2.0 내지 2.3으로 조절하고 70 내지 90℃로 10시간 이상 열처리하는 산 및 열처리 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이러한 본 발명의 방법에 따르면 수삼 또는 건삼으로부터, 심지어는 인삼의 잎과 같은 뿌리 이외의 다른 부분으로부터도, 희귀 진세노사이드인 Rg3(20(S)-Rg3 및 20(R)-Rg3 포함)가 다량으로 함유되어 있고 희귀 진세노사이드 Rk1 및 Rg5 또한 다량으로 함유되어 있는 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 방법은 추출, 유기산 및 열처리, 추출물 또는 처리 산물로부터의 진세노사이드 정제와 같은 비교적 간단하면서 높은 온도의 가열을 필요로 하지 않는 단계들로 이루어지며, 많은 공정 단계(예를 들어 가열 및 냉각의 반복 공정 단계)를 필요로 하지 않는다.
본 발명에서 인삼은 예를 들어 화기삼(Panax quinquefolius L.), 삼칠삼(Panax notoginseng Burkill) 또는 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 원료로 사용되는 인삼의 부위는 뿌리 일 수 있으며, 뿌리 이외의 다른 부위 예를 들어 잎일 수 있으나, 이로 제한되지 않으며, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 뿌리이다. 본 발명에서 원료로 사용되는 인삼은 말리지 않은 것(수삼), 말린 것(건삼) 또는 쪄서 말린 것(예를 들어, 홍삼)일 수 있으나, 이로 제한되지 않으며, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 수삼 또는 건삼이다.
본 발명의 추출 단계는 용매를 사용하여 인삼으로부터 진세노사이드를 추출하는 단계로서, 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있는 통상적인 추출 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 용매를 사용한 열탕 추출, 초음파 추출, 환류 추출 등 당업계의 통상적인 추출 방법을 적용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 물과 에탄올의 혼합 용매, 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 10 내지 10 : 1의 부피비인 혼합 용매, 보다 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 7 내지 7 : 1의 부피비인 혼합 용매, 보다 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 5 내지 5 : 1의 부피비인 혼합 용매, 보다 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 3 내지 3 : 1의 부피비인 혼합 용매, 보다 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 2 내지 2 : 1의 부피비인 혼합 용매, 보다 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 1.5 내지 1.5 : 1의 부피비인 혼합 용매, 보다 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 1.3 내지 1.3 : 1의 부피비인 혼합 용매, 보다 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 1.1 내지 1.1 : 1의 부피비인 혼합 용매를 사용한다.
추출 시 사용하는 용매의 양은 예를 들어 추출 원료, 즉 인삼의 중량 1㎏ 기준 1 내지 100ℓ로 할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 20ℓ, 보다 바람직하게는 7 내지 15ℓ, 보다 바람직하게는 8 내지 13ℓ로 한다. 추출 온도는 다양하게 할 수 있으나, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 0 내지 80℃로 하며, 보다 바람직하게는 20 내지 70℃, 보다 바람직하게는 40 내지 60℃로 한다. 추출 시간 또한 다양하게 설정할 수 있으나, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 5시간 내지 3일로 하며, 보다 바람직하게는 10시간 내지 2일, 보다 바람직하게는 12 내지 36시간으로 한다.
본 발명에서 정제 단계는 추출 단계에서 수득되는 추출물로부터 진세노사이드를 정제하는 단계로서, 바람직하게는 프로토파낙사이다이올계(PPD 타입) 진세노사이드를 정제하는 단계이다. 혼합물로부터 진세노사이드(또는 PPD 타입 진세노사이드)를 정제하기 위한 통상적인 정제 방법을 적용할 수 있으나, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 흡착 수지를 이용한 크로마토그래피를 사용한다. 진세노사이드(또는 PPD 타입 진세노사이드)를 정제하는데 사용할 수 있는 다양한 흡착 수지가 알려져 있으나, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 다공성의 비극성 합성 흡착 수지를 사용하며, 보다 바람직하게는 폴리스티렌/다이비닐벤젠 매트릭스 기반의 다공성 흡착 수지를 사용하며, 이 중에서도 바람직하게는 DIAION HP20을 사용한다.
본 발명의 효과를 위한 바람직한 구체적인 일 실시형태에서, 정제 단계는 추출 단계에서 수득되는 추출물을 에탄올 함량이 10%(v/v) 미만, 바람직하게는 5%(v/v) 미만인 수용액 중에서 DIAION HP20 다공성 수지와 접촉시키는 단계; 및 다공성 수지로부터 70%(v/v) 이상, 바람직하게는 75%(v/v) 이상, 보다 바람직하게는 78%(v/v) 이상의 에탄올 수용액(또는 에탄올)에 의한 용출물을 수득하는 단계를 포함한다. 보다 바람직하게는 추출물을 DIAION HP20 다공성 수지와 접촉시킨 다음 다공성 수지를 물로 세척하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 효과를 위한 보다 바람직한 구체적인 일 실시형태에서, 정제 단계는, 프로토파낙사트라이올계(PPT 타입)의 진세노사이드가 제거된 PPD 타입의 진세노사이드를 정제하는 단계로서, 추출 단계에서 수득되는 추출물을 에탄올 함량이 10%(v/v) 미만, 바람직하게는 5%(v/v) 미만인 수용액 중에서 DIAION HP20 다공성 수지와 접촉시키는 단계; 다공성 수지로부터 20 내지 29%(v/v) 에탄올 수용액에 의한 용출물을 제거하는 단계; 및 다공성 수지로부터 70%(v/v) 이상, 바람직하게는 75%(v/v) 이상, 보다 바람직하게는 78%(v/v) 이상의 에탄올 수용액(또는 에탄올)에 의한 용출물을 수득하는 단계를 포함한다. 보다 바람직하게는 추출물을 DIAION HP20 다공성 수지와 접촉시킨 다음 다공성 수지를 물로 세척하는 단계를 더 포함한다.
본 발명에서 산 및 열처리 단계는 추출물로부터 정제된 메이저 진세노사이드(또는 PPD 타입의 메이저 진세노사이드)를 마이너 진세노사이드로 전환시키는 단계로서, 정제 단계에서 수득되는 정제물을 포함하는 수용액에 유기산을 첨가하여 pH 2.0 내지 2.3으로 조절하고 70 내지 90℃로 10시간 이상 열처리하는 것을 특징으로 한다. 열처리는 액체를 가열하는데 적용할 수 있는 통상적인 가열 방식을 적용할 수 있다. 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 75 내지 85℃로 열처리하며, 보다 바람직하게는 77 내지 83℃로 열처리한다. 또한 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 11시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상 열처리한다. 열처리 시간이 너무 길어질 경우 경과된 시간에 비해 원하는 희귀 진세노사이드의 전환 정도가 감소할 수 있어 결과적으로 효율이 떨어질 수 있으므로, 열처리 시간은 바람직하게는 24시간 이하로 하며, 보다 바람직하게는 20시간 이하, 보다 바람직하게는 15시간 이하로 한다.
유기산은 구연산(citric acid), 프로피온산(propionic acid), 락트산(lactic acid), 타르타르산(tartaric acid), 아세트산(acetic acid) 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 구연산을 사용한다.
본 발명의 방법은 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 산 및 열처리 단계 이후 산 및 열처리 단계에서 수득되는 처리 산물로부터 진세노사이드(또는 PPD 타입 진세노사이드)를 정제하는 2차 정제 단계를 더 포함한다. 2차 정제 단계는 산 및 열처리 단계에서 수득되는 처리 산물로부터 진세노사이드(또는 PPD 타입 진세노사이드)를 정제하는 단계로서, 혼합물로부터 진세노사이드(또는 PPD 타입 진세노사이드)를 정제하기 위한 통상적인 정제 방법을 적용할 수 있으나, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 흡착 수지를 이용한 크로마토그래피를 사용한다. 진세노사이드(또는 PPD 타입 진세노사이드)를 정제하는데 사용할 수 있는 다양한 흡착 수지가 알려져 있으나, 본 발명의 효과를 위해 바람직하게는 다공성의 비극성 합성 흡착 수지를 사용하며, 보다 바람직하게는 폴리스티렌/다이비닐벤젠 매트릭스 기반의 다공성 흡착 수지를 사용하며, 이 중에서도 바람직하게는 DIAION HP20을 사용한다.
본 발명의 효과를 위한 바람직한 구체적인 일 실시형태에서, 2차 정제 단계는 산 및 열처리 단계에서 수득되는 처리 산물을 수용액 중에서 DIAION HP20 다공성 수지와 접촉시키는 단계; 및 다공성 수지로부터 70%(v/v) 이상, 바람직하게는 75%(v/v) 이상, 보다 바람직하게는 78%(v/v) 이상의 에탄올 수용액(또는 에탄올)에 의한 용출물을 수득하는 단계를 포함한다. 보다 바람직하게는 처리 산물을 DIAION HP20 다공성 수지와 접촉시킨 다음 다공성 수지를 물로 세척하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 상기와 같은 본 발명의 방법으로 제조되어 진세노사이드 Rg3(20(S)-Rg3 및 20(R)-Rg3 포함), Rk1 및 Rg5를 함유하는 희귀 진세노사이드 함유 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 높은 항염증 활성을 나타낼 수 있다. 특히 높은 산화질소 생성 억제 활성 및 염증 사이토카인 발현 억제 활성을 통해 항염증 활성을 제공할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 건조 중량을 기준으로 150㎎/g 이상으로 진세노사이드 Rg3(20(S)-Rg3 및 20(R)-Rg3의 합을 기준으로 함)를 함유하며, 보다 바람직하게는 200㎎/g 이상으로 진세노사이드 Rg3를 함유하며, 보다 바람직하게는 220㎎/g 이상으로 진세노사이드 Rg3를 함유한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1 내지 4
(1) 추출 단계
추출 재료로는 화기삼의 잎(실시예 1), 화기삼(뿌리)(실시예 2), 삼칠삼(뿌리)(실시예 3) 또는 고려인삼(뿌리)(실시예 4)을 사용하였다. 약 50%(v/v) 에탄올 약 10ℓ에 분말 형태의 추출 재료 약 1㎏을 첨가하여 약 50℃에서 약 24시간씩 3회 추출(추출 잔사에 약 50% 에탄올 약 10ℓ를 첨가하여 그 다음 회의 추출을 진행하는 방식을 사용)하였다.
(2) 1차 정제 단계
상기 추출 단계의 3회 추출에서 수득되는 각 추출액을 모은 다음 감압농축기를 사용하여 에탄올 함량이 5%(v/v) 이하의 수준이 되도록 농축하고, 추출 농축액을 DIAION HP20 다공성 수지 칼럼(column)에 통과시키고, 칼럼에 약 40ℓ 이상의 증류수를 흘려주어 불순물 제거하였다.
이후 화기삼 잎을 사용한 경우(실시예 1)에는 약 100% 에탄올 20ℓ를 흘려주어 진세노사이드(PPD 타입과 PPT 타입 모두 포함)를 용출하여 수득하였으며, 화기삼(뿌리)(실시예 2), 삼칠삼(뿌리)(실시예 3) 또는 고려인삼(뿌리)(실시예 4)을 사용한 경우에는 약 29% 에탄올 약 32ℓ를 흘려주어 PPT 타입의 진세노사이드를 먼저 용출시켜 제거한 다음, 약 80% 에탄올 20ℓ를 흘려주어 PPD 타입의 진세노사이드를 용출하여 수득하였다. 수득된 각각의 용출액을 분말화하여 이후의 단계에 사용하였다.
(3) 산 및 열처리 단계
상기 1차 정제 단계에서 수득되는 용출물 분말 20g에 20배(v/w)의 물을 혼합하고, 구연산을 약 2%(w/v) 비율로 첨가하여 pH 약 2.0 내지 2.3이 되도록 맞춘 다음, 약 80℃로 약 12시간 동안 열처리하였다.
(4) 2차 정제 단계
상기 산 및 열처리로 수득되는 산물(반응액)을 DIAION HP20 다공성 수지 칼럼(column)에 통과시키고, 칼럼 부피의 약 10배 이상 부피의 증류수를 칼럼에 흘려주어 불순물 제거하고, 칼럼 부피의 약 5배 부피의 약 100% 에탄올을 흘려주어 용출액을 수득하고, 이를 분말화하였다.
실험예 1. 진세노사이드 분석
고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하여 상기 실시예 1 내지 4의 각 조성물의 진세노사이드를 분석하였다.
각 조성물을 증류수에 용해시킨 다음 멤브레인 필터(0.45㎛)로 여과하여 시험용액으로 사용하였다.
칼럼은 Prodigy ODS(2) C18 칼럼(5㎛, 150x4.6㎜ i.d.; Phenomenex)을 사용하였고, 이동상은 아세토니트릴(acetonitrile)과 증류수를 사용하였으며, 시료 주입량은 10㎕으로, 유속은 1㎖/분, 온도는 30℃로 하여 UV 검출기로 203㎚에서 흡광도를 측정하였다. 보다 구체적인 HPLC 분석 조건은 다음 표 1과 같다.
분석 결과, 화기삼 잎, 화기삼, 삼칠삼 및 고려인삼을 사용하여 제조한 실시예 1 내지 4의 각 조성물 중에는 희귀 진세노사이드인 진세노사이드 Rg3(20(S)-Rg3 및 20(R)-Rg3), Rk1 및 Rg5가 다량으로 함유되어 있는 것으로 나타났다(도 1 내지 4, 표 2).
| 진세노사이드 | 실시예 1 | 실시예 2 | 실시예 3 | 실시예 4 |
| Rg3(S) | 90.10 | 140.2 | 212.0 | 170.61 |
| Rg3(R) | 72.29 | 101.6 | 152.7 | 70.68 |
| Rg3(S)+Rg3(R) | 162.39 | 241.8 | 364.7 | 241.29 |
* 단위: ㎎/g
실험예 2. 항염 활성 조사
(1) 세포 생존율 측정
마우스 대식세포주 RAW264.7 세포를 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였고, 10% 비활성화 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco-BRL, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 및 1% 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin)(PEST; WelGene, 한국 대구 소재)을 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium; WelGene) 배지를 이용하여 5% CO2가 공급되는 배양기(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)에서 37℃ 조건으로 배양하였다. RAW264.7 세포는 충분한 세포를 얻기 위해 배양용 플라스크(T75㎠)에서 배양하고, 약 80% 밀집하면 부착된 세포를 떼어낸 후 각 실험에 사용하였다.
RAW264.7 세포를 떼어낸 후 성장배지에 세포수를 1×104 세포/웰로 조정하여 24-웰 플레이트에 세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 본 발명의 조성물(실시예 4)을 정해진 농도로 처리하였고, 1시간 후 LPS 10㎍/㎖를 처리하여 48시간 배양하였다.
실험결과, 본 발명의 조성물은 실험 농도 모두에서 세포 독성을 나타내지 않았다(도 5).
(2) NO 생산 확인
24웰-플레이트 내 성장배지에 RAW264.7 세포를 1×104 세포/웰로 접종하여 24시간 동안 배양한 다음, 본 발명의 조성물(실시예 4)과 LPS(10㎍/㎖)를 48시간 동안 처리하였다. 또한, 고도로 정제된 Rg3(S) 정제물(순도 약 98%)을 비교 시료로 사용하였다.
세포배양액 0.5㎖에 동량의 Griess 시약(1% Sulfanilamide in 5% Phosphoric acid와 1% α-naphtylamide in H2O) 0.5㎖를 넣고 혼합하여 암실에서 10분간 반응시킨 후, 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, 본 발명의 조성물은 실험한 농도에서 농도의존적인 NO(산화질소) 생성 억제 효과를 보였다(도 6). 특히 본 발명의 조성물은 고도로 정제된 Rg3(S) 정제물과 비교하여 더 높은 효과를 보였다(도 6).
(3) 염증성 사이토카인 유전자의 mRNA 발현 양상 확인
본 발명 조성물의 항염증 효과를 mRNA 발현 단계에서 확인하기 위해, 상기 NO 생산 확인을 위한 실험과 같은 방식으로 본 발명의 조성물 또는 고도로 정제된 Rg3(S) 정제물(순도 약 98%)을 정해진 농도로 처리하고, 염증 반응에 관여하는 주요 유전자의 mRNA 발현을 RT-PCR 방법으로 분석하였다.
실험결과, 본 발명의 조성물은 iNOS, COX-2, NFκB, IL6, TNFα 및 IL-1β에 대해 농도의존적인 발현 억제 효과를 보였으며, 이러한 염증성 사이토카인 유전자의 발현 억제 효과는 고도로 정제된 Rg3(S) 정제물과 유사한 수준을 나타내었다(도 7).
(4) 염증성 사이토카인 단백질 발현 양상 확인
본 발명 조성물의 항염증 효과를 mRNA 발현 단계에서 확인하기 위해, 상기 NO 생산 확인을 위한 실험과 같은 방식으로 본 발명의 조성물 또는 고도로 정제된 Rg3(S) 정제물(순도 약 98%)을 정해진 농도로 처리하고, 염증 반응에 관여하는 주요 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
구체적으로 웨스턴 블롯 분석은 다음과 같이 진행하였다.
각각의 시료를 처리한 세포의 단백질을 전기영동한 후, PVDF 멤브레인(hydrophobic)으로 옮기고, 5% 탈지유(skim milk)로 1시간 동안 블로킹한 후, 각각의 표적 단백질에 대한 1차 항체를 넣어준 다음, 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 10분간 3회 세척하고, 5% 탈지유로 상온에서 1시간 동안 차단하였다. 그런 다음, 각각의 2차 항체를 넣어준 후, 1시간 동안 반응시키고, 10분간 3회 세척하였다. 그런 다음, 검출 시약 A(Luminol Enhancer solution)와 B(Peroxide solution)를 1 : 1 비율로 혼합 적용하여 발색시킨 후, X선 필름으로 현상하였다.
실험결과, 본 발명의 조성물은 iNOS, COX-2, NFκB, IL6 및 TNFα에 대해 농도의존적인 발현 억제 효과를 보였으며, 이러한 염증성 사이토카인 단백질의 발현 억제 효과는 고도로 정제된 Rg3(S) 정제물과 유사한 수준을 나타내었다(도 8).
상기 실험결과를 종합하면, 본 발명의 조성물은 세포 독성을 나타내지 않으면서 NO 생성 억제 및 염증 사이토카인(iNOS, COX-2, NFκB, IL6, TNFα 및 IL-1β)의 발현 억제를 통해 우수한 항염증 효과를 제공할 수 있다. 특히 본 발명의 조성물은 고도로 정제된 Rg3(S) 정제물과 비교하여 더 높은 수준의 NO 생성 억제 효과를 나타낼 수 있으며, 이 정제물과 유사한 수준의 염증 사이토카인 발현 억제 효과를 나타낼 수 있는데, 이는 비교적 간단한 본 발명의 방법으로 복잡하고 어려운 고도의 정제 방법에 비해 더 우수하거나 유사한 수준의 항염증 효과가 있는 조성물을 제조할 수 있음을 나타낸다.
Claims (5)
- 인삼으로부터 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 추출 단계;
상기 추출 단계에서 수득되는 추출물로부터 진세노사이드를 정제하는 정제 단계; 및
상기 정제 단계에서 수득되는 정제물을 포함하는 수용액에 유기산을 첨가하여 pH 2.0 내지 2.3으로 조절하고 70 내지 90℃로 10시간 이상 열처리하는 산 및 열처리 단계
를 포함하는 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 정제 단계의 정제는 흡착 수지를 이용한 크로마토그래피를 통한 정제인, 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물의 제조 방법. - 제2항에 있어서,
상기 흡착 수지는 폴리스티렌/다이비닐벤젠 매트릭스 기반의 다공성 흡착 수지인, 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 인삼은 화기삼, 삼칠삼 또는 고려인삼인, 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물의 제조 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되어 진세노사이드 Rg3, Rk1 및 Rg5를 함유하는 희귀 진세노사이드 Rg3 함유 조성물.
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Citations (2)
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| KR101423100B1 (ko) | 2014-01-17 | 2014-07-25 | 백제홍삼 주식회사 | 진세노사이드 Ｒｇ3 및 Ｒｂ1의 함량을 증폭시키는 발효홍삼의 제조방법 |
| KR101916189B1 (ko) | 2018-05-02 | 2018-11-07 | 조영훈 | 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1의 함량이 증가된 가공인삼 및 그 제조방법 |
-
2022
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