KR20230160268A - 프로그래밍 가능한 단백질 분해용 화합물 및 질환 치료를 위한 사용 방법 - Google Patents

프로그래밍 가능한 단백질 분해용 화합물 및 질환 치료를 위한 사용 방법 Download PDF

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KR20230160268A
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하오지에 후앙
홍위 리
징웨이 샤오
웨이 얀
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메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
바이오벤처스, 엘엘씨
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Abstract

화학식 (IA)의 화합물
(표적화 모이어티)-(링커)-(프로테아제 리간드) (IA)
(여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합할 수 있는 리간드임), 및 이의 사용 방법이 제공된다. 또한, 화학식 (IB)의 화합물
(표적화 모이어티)-(링커)-(프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드) (IB)
(여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합할 수 있는 리간드이고, E3 리가제 리간드는 E3 리가제에 결합할 수 있는 리간드임), 및 이의 사용 방법이 제공된다.

Description

프로그래밍 가능한 단백질 분해용 화합물 및 질환 치료를 위한 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 25일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 63/153,872, 2021년 3월 8일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 63/158,218, 및 2021년 10월 25일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 63/271,534의 이익을 주장한다. 이전 출원의 개시 내용은 본 출원의 개시 내용의 일부로 간주(되고 참조로 포함)된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록이 포함되어 있으며 이로써 그 전체가 참조로 포함된다. 2022년 4월 8일에 생성된 상기 ASCII 복사본의 명칭은 07039-2085WO1_SL.txt이고 크기는 106,211바이트이다.
배경
1. 기술 분야
본 문서는 모든 치료 영역과 관련된 표적 단백질을 분해하는 데 유용한 이중 가닥 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 기반 단백질분해 표적화 키메라(O'PROTAC: oligonucleotide-based proteolysis targeting chimera) 분자 분야에 관한 것이다.
2. 배경정보
기존 PROTAC(PROteolytic-TArgeting Chimera)은 탄두와 E3 리가제 리간드로 구성된 이종이작용성 소분자로 E3 리가제를 관심 단백질(POI: protein of interest)로 동원하고 프로테아좀 경로를 통해 분해를 유도한다. PROTAC 기술은 지난 10년 동안 크게 발전해왔다. PROTAC이 효소 및 수용체를 포함한 다양한 단백질을 분해할 수 있다는 것이 입증되었다(Burslem et al., J. Am. Chem . Soc ., 140(48):16428-16432 (2018); Cromm et al., J. Am. Chem . Soc ., 140(49):17019-17026 (2018); Wang et al., Acta Pharmaceutica Sinica B, 10(2): 207-238 (2020); Sakamoto et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 98(15):8554-8559 (2001); Khan et al., Nat. Med, 25(12):1938-1947 (2019)). PROTAC은 표적 범위 확장, 선택성 향상, 독성 감소 및 억제제 저항성 회피를 포함하여 다른 소분자 억제제에 비해 여러 가지 이점을 제공하며, 이는 PROTAC 기술이 질병을 해결하기 위한, 특히 암을 위한 새로운 유망 치료법임을 시사한다(Pettersson et al., Drug Discov . Today Technol ., 31:15-27 (2019)). 흥미로운 능력에도 불구하고 PROTAC에는 몇 가지 제한 사항이 있다. 보고된 PROTAC의 대부분은 POI를 표적화하는 현재 존재하는 소분자를 기반으로 설계되었으므로 일반적으로 리간드 결합 포켓이 없는 전사 인자(TF)와 같은 "약물 치료 가능성이 없는" 표적에 적용하기가 어렵다. 또한, PROTAC은 높은 분자량(~600-1400 Da)으로 인해 종종 낮은 세포 투과성, 안정성, 및 용해도 문제를 겪는다(Edmondson et al., Bioorg . Med . Chem . Lett ., 29(13):1555-1564 (2019)). 전통적인 소분자 약물과 비교하여 PROTAC은 약물 치료 가능성이 훨씬 낮다.
올리고뉴클레오티드 약물 개발은 지난 10년간 신약 발굴의 주류가 되었다(Sridharan et al., Br. J. Clin . Pharmacol , 82(3):659-672 (2016)). 올리고뉴클레오티드 약물에 통합된 PROTAC(Lai et al., Nat. Rev. Drug Discov ., 16(2):101-114 (2017))의 촉매적 이점은 해당 분야를 더욱 촉진할 수 있었다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드 약물의 전달은 최근 몇 년 동안 특히 mRNA 코로나19 백신에 대해 크게 발전해왔다(Roberts et al., Nat. Rev. Drug. Discov ., 19(10):673-694 (2020); 및 Chung et al., Adv . Drug Deliv . Rev., 170:1-25 (2020)). 따라서 O'PROTAC은 임상 후보물질을 도출하고 신약 발굴을 가속화하기 위해 기존 PROTAC에 대한 보완적인 약물 발굴 및 개발 플랫폼이 될 수 있다.
본 문서의 한 측면은 화학식 (IA)로 나타내는 구조를 갖는 이작용성 화합물(본원에서는 "분해제" 또는 "O'PROTAC"이라고도 함), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체를 특징으로 한다:
여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 의해 인식될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합하는 리간드를 나타내고, 링커는 표적화 모이어티를 프로테아제 리간드에 연결하는 모이어티를 나타낸다.
본 문서의 또 다른 측면은 화학식 (IB)로 나타내는 구조를 갖는 이작용성 화합물(본원에서는 "분해제" 또는 "O'PROTAC"이라고도 함), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체를 특징으로 한다:
여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 의해 인식될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합하는 리간드를 나타내고, E3 리가제 리간드는 E3 리가제에 결합하는 리간드를 나타내고, 링커는 표적화 모이어티를 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드에 연결하는 모이어티를 나타낸다.
본 문서의 또 다른 측면은 치료 유효량의 화학식 (IA) 또는 (IB)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학 조성물을 특징으로 한다.
본 문서의 추가 측면은 이상(예를 들어, 조절 장애 또는 기능 장애) 단백질 활성에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 화학식 (IA) 또는 화학식 (IA)의 이작용성 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
이 문서의 추가 측면은 이작용성 화합물을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 적용될 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 예시일 뿐 제한하려는 의도는 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
[도 1] 일부 실시양태에 따른 O'PROTAC(OP라고도 지칭함)의 작업 방식.
[도 2a-2c] ERG O'PROTAC은 배양된 세포에서 ERG 단백질을 분해한다. [도 2a] 293T 세포를 FITC-표지된 ERG O'PROTAC-13(100 nM 및 1,000 nM)으로 형질감염시키고, 형질감염 효율은 형광 현미경을 사용하여 형질감염 48시간 후에 모니터링하였다. 스케일 바: 50 μm. [도 2b] 293T 세포를 HA-ERG 플라스미드 및 대조군 또는 6개의 지시된 ERG O'PROTAC(100 nM)으로 형질감염시키고 형질감염 48시간 후 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. ERK2는 로딩 대조군으로 사용하였다. [도 2c] VCaP 세포를 대조군 또는 6개의 지시된 ERG O'PROTAC(100 nM)으로 형질감염시키고 형질감염 48시간 후 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 수거하였다. 내인성 전장(FL) 야생형과 TMPRSS2-ERG(T2-ERG) 절단형 ERG가 모두 검출되었다.
[도 3] ERG O'PROTAC은 프로토스톰 경로를 통해 ERG 분해를 촉진한다. VCaP 세포를 증가하는 농도의 ERG O'PROTAC-13으로 36시간 동안 형질감염시킨 후, 프로테이나제 억제제 MG132(20 μM)를 12시간 동안 처리하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
[도 4] ERG O'PROTAC은 ERG에 결합한다. 293T 세포를 대조군(비오틴- 비표지됨) 또는 6개의 지시된 비오틴-표지된 ERG O'PROTAC(100 nM)과 조합된 HA-ERG 플라스미드로 형질감염시키고 형질감염 48시간 후에 항-비오틴(스트렙타비딘) 풀다운 분석을 위해 수집하였다.
[도 5a-5b] ERG O'PROTAC은 ERG 전사 활성을 억제한다. [도 5a] VCaP 세포는 100 nM의 비오틴-표지된 ERG O'PROTAC-13으로 형질감염시켰다. 세포를 다양한 시점에서 수거한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. [b 및 c] VCaP 세포를 다양한 농도의 비오틴-표지된 ERG O'PROTAC-13으로 형질감염시키고 형질감염 후 45시간에 웨스턴 블롯 분석(도 5b) 및 지시된 ERG-표적화된 유전자(ADAM19 , MMP3 , MMP9 , PLAT 및 PLAU)의 mRNA 발현에 대한 RT-qPCR 분석을 위해 수거하였다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산하였다. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001, n.s., 유의하지 않음.
[도 6] LEF-1 O'PROTAC은 배양된 세포에서 LEF1 단백질을 분해한다. PC-3 세포를 대조군(500 nM) 또는 다양한 농도(100 및 500 nM)의 6개의 지시된 LEF1 O'PROTAC으로 형질감염시키고, 형질감염 48시간 후 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 수거하였다. ERK2는 로딩 대조군으로 사용하였다.
[도 7a-7f] LEF1 O'PROTAC은 LEF1 표적 유전자 발현과 전립선암 세포 증식을 억제한다. [도 7a-7c] PC-3 세포를 대조군(500 nM) 또는 다양한 농도의 LEF1 O'PROTAC-45로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에, 세포를 웨스턴 블롯 분석(도 a), LEF1 표적화된 유전자(CCND1 및 c- MYC)의 mRNA 발현에 대한 RT-qPCR 분석(도 7b), 및 처리 후 상이한 날에 MTS 분석(도 7c)을 위해 수거하였다. [도 7d-7f] DU145 전립선암 세포를 대조군(500 nM) 또는 다양한 농도의 LEF1 O'PROTAC-45로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 웨스턴 블롯(도 7d), RT-qPCR(도 7e) 및 MTS 분석(도 7f)을 거쳤다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t- 검정을 사용하여 계산하였다. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001, n.s., 유의하지 않음.
[도 8a-8j] LEF1 OP-V1은 생체 내에서 전립선암 종양 성장을 억제한다. [도 8a] 1ХPBS, 대조군 O'PROTAC(OP), 또는 LEF1 OP-V1로 처리한 후 18일에 지시된 마우스 군의 PC-3 이종이식 종양 사진. [도 8b] 1x PBS, 대조군 OP, 또는 LEF1 OP-V1로 처리한 후 지시된 시점에서 PC-3 종양 성장을 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. P 값은 제18일에 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. n.s., 유의하지 않음. *** P < 0.001. [도 8c] 1ХPBS, 대조군 OP, 또는 LEF1 OP-V1로 처리한 후 제21일에 지시된 마우스 군의 DU145 이종이식 종양 사진. [도 8d] 1x PBS, 대조군 OP, 또는 LEF1 OP-V1로 처리한 후 지시된 시점에서 DU145 종양 성장을 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. P 값은 제18일에 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. n.s., 유의하지 않음. *** P < 0.001. [도 8e] PC-3 또는 DU145 이종이식편에서 지시된 처리 후 다양한 시점에서 마우스의 체중을 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. [도 8f] PC-3 및 DU145 이종이식 종양을 각각 제18일 또는 제21일에 마우스로부터 수거하고 중량을 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. n.s., 유의하지 않음; *** P < 0.001. [도 8g] PC-3 이종이식 종양에서 LEF1, 사이클린 D1, 및 c-MYC 단백질의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. [도 8h] PC-3 이종이식 종양에서 LEF1, CCND1, 및 c- MYC 유전자의 mRNA 수준에 대한 RT-qPCR 분석. 데이터는 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. n.s., 유의하지 않음; *** P < 0.001. [도 8i] 1x PBS, 대조군 OP, 또는 LEF1 OP-V1로 처리한 후 제18일에 마우스로부터 수거한 PC-3 이종이식 종양에서 LEF1, Ki67, 및 절단된 카스파제-3의 IHC의 대표적인 이미지. [도 8j] LEF1, Ki67, 및 절단된 카스파제-3 IHC의 정량화 데이터. 데이터는 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. n.s., 유의하지 않음; *** P < 0.001.
[도 9a-9m] ERG O'PROTAC은 ERG 단백질 분해를 유도한다. [도 9a] 정방향 ERG O'PROTAC 서열(서열 번호 3) 및 역방향 ERG O'PROTAC 서열(서열 번호 419)로부터 식별된 바와 같은 ERG 결합 컨센서스 서열을 포함하는 ERG O'PROTAC에 대한 개략도. [도 9b] VCaP 세포를 대조군 또는 7개의 지시된 ERG O'PROTAC(100 nM)으로 36시간 동안 형질감염시키고 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. ERK2는 로딩 대조군으로 사용하였다. [도 9c] ERG OP-C-N1 구조에 대한 개략도. [도 9d] 비오틴-표지된 ERG OP-C-N1(100 nM)을 증가하는 양의 비표지 대응물(비오틴-표지된 프로브의 농도보다 1배, 10배 및 100배 더 높음)의 존재 하에 VCaP 핵 추출물과 인큐베이션한 후 EMSA을 수행하였다. [도 9e] 비오틴-표지된 ERG OP-C-N1을 VCaP 핵 추출물 및 증가하는 양의 ERG 항체와 함께 인큐베이션한 후 EMSA를 수행하였다. [도 9f] VCaP 세포를 대조군 OP, ERG OP-C-N1(100 nM), 또는 OP-C-A1(100 nM)로 36시간 동안 형질감염시킨 후 프로테아좀 억제제 MG132(20 μM)를 12시간 동안 처리하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. [도 9g] VCaP 세포를 최종 농도 100 nM의 대조군 OP 또는 ERG OP-C-N1로 36시간 동안 형질감염시키고 1배, 25배 또는 50배의 CRBN 리간드 포말리도마이드와 함께 인큐베이션한 후 ERG 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. [도 9h 및 9i] 293T(h) 및 VCaP 세포(도 9i)를 ERG OP-C-N1(100 nM)로 36시간 동안 처리하고 프로테아좀 억제제 MG132(20 μM)로 12시간 동안 처리한 후 ERG 유비퀴틴화에 대한 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. [도 9j 및 9k] VCaP 세포를 Matrigel에서 5일 동안 배양한 후 200 nM의 ERG OP-C-N1을 5일 동안 처리하였다. 3D 구체가 있는 대표적인 이미지는 [도 9j]에 나타내고, 3D 구체의 직경에 대한 정량화 데이터는 [도 9k]에 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD(n = 50)를 나타낸다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. *** P < 0.001. [도 9l 및 9m] ERG 발현 플라스미드로 형질감염된 22Rv1 세포 및 100 nM의 ERG OP-C-N1을 Matrigel-코팅된 트랜스웰에 48시간 동안 플레이팅하였다. 침습된 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 사진은 [도 9l]에 나타내고 정량화 데이터는 [도 9m]에 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. *** P < 0.001.
[도 10a - 10d] ERG OP-C-N1은 시간 및 용량 의존적 방식으로 ERG 단백질을 분해한다. [도 10a] VCaP 세포를 100 nM의 최종 농도로 형질감염시키고 다양한 시점에서 수거한 후, 웨스턴 블롯으로 ERG 발현을 검출하였다. [도 10b] VCaP 세포를 증가하는 농도의 ERG OP-C-N1로 36시간 동안 형질감염시킨 후, ERG 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. [도 10c 및 10d] VCaP 세포를 증가하는 농도의 ERG OP-C-N1로 24시간 동안 형질감염시키고 추가 12시간 동안 20 μg/mL 시클로헥시미드(CHX)로 처리한 후 웨스턴 블롯으로 ERG 발현을 검출하였다(도 10c). 잔여 ERG 단백질(%)은 ERG OP-C-N1 미처리 군의 값에 대해 정규화하여 계산하고 DC50을 결정하였다(도 10d). 이 실험을 한 번 반복하여 비슷한 결과를 얻었다.
[도 11a-11e] ERG O'PROTAC은 ERG 발암단백질을 분해한다. [도 11a] 293T 세포를 pCMV-HA-ERG 플라스미드 및 대조군 또는 6개의 지시된 ERG O'PROTAC(100 nM)으로 형질감염시키고 형질감염 48시간 후 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. ERK2는 로딩 대조군으로 사용하였다. C는 CRBN 기반 OP를 나타내고 V는 VHL을 나타낸다. [도 11b] VCaP 세포를 대조군 또는 6개의 지시된 ERG O'PROTAC(100 nM)으로 형질감염시키고 형질감염 48시간 후 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. 내인성 전장(FL)(야생형)과 TMPRSS2-ERG(T1/E4, 절단형)가 모두 검출되었다. [도 11c] 260 nm에서 UV로 검출된 ERG OP-C-P1의 HPLC 스펙트럼. [도 11d] ERG OP-C-P1의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼. [도 11e] 정방향(F) 서열이 서열 번호 3을 포함하고 역방향(R) 서열이 서열 번호 419를 포함하는 ERG OP-C-P1의 선으로 그려진 구조.
[도 12a-12h] 프탈산 기반 ERG O'PROTAC은 ERG 발암단백질을 분해한다. [도 12a 및 12b] ERG OP-C-P1, ERG OP-C1, OP-C-A1 및 C-N1을 포함하는 FITC-표지된 ERG O'PROTAC을 293T(도 12a) 및 VCaP 세포(도 12b)에 100 nM의 최종 농도로 Lipofectamine 2000을 사용하여 개별적으로 형질감염시켰다. ERG OP-C-A1 및 C-N1은 양성 대조군으로 사용하였다. 어떠한 형질감염도 없는 모세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 지시된 O'PROTAC에 대한 명시야(상부)와 형광 시야(하부)의 대표 이미지를 보여준다. 스케일 바: 50 μm. [도 12c] 293T 세포를 대조군 또는 4개의 지시된 ERG O'PROTAC으로 최종 농도 100 nm에서 형질감염시키고 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. [도 12d 및 12e] VCaP 세포를 대조군 또는 4개의 지시된 ERG O'PROTAC으로 최종 농도 100 nm에서 형질감염시키고 형질감염 후 48시간 후에 웨스턴 블롯 분석(도 12d) 또는 ERG FL 및 T1/E4의 mRNA 수준을 검출하기 위한 RT-qPCR(도 12e)을 위해 수거하였다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)를 나타낸다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. n.s.는 ERG O'PROTAC 처리군의 값을 대조군 OP 처리군과 비교하여 유의하지 않음을 나타낸다. [도 12F] VCaP 세포를 최종 농도 100 nM의 ERG OP-C-P1로 형질감염시키고 다양한 시점에서 수거한 후, ERG 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. [도 12g 및 12h] VCaP 세포를 증가하는 농도의 ERG OP-C-P1로 36시간 동안 형질감염시키고, 20 μg/mL의 시클로헥시미드(CHX)로 추가 12시간 동안 처리하였다. [도 12g] ERG 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 수거하였다. 잔여 ERG 단백질(%)은 각 군의 값을 ERG OP-C-P1 미처리 군의 값에 대해 정규화하여 계산하였다. [도 12h] ERG 단백질의 50%를 분해하는 ERG OP-C-P1의 농도(DC50)는 Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
[도 13a-13g] 프탈산 기반 ERG O'PROTAC은 CRBN 및 프로테아좀 경로를 통해 ERG를 분해한다. [도 13a] VCaP 세포를 최종 농도 100 nM의 대조군 OP 또는 ERG OP-C-P1로 36시간 동안 형질감염시키고, MG132(20 μM)로 미처리하거나 추가로 12시간 동안 처리한 후 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. [도 13b 및 13c] 293T(도 13b) 및 VCaP 세포(도 13c)를 지시된 플라스미드 및 ERG OP-C-P1로 최종 농도 100 nM에서 36시간 동안 형질감염시키고 프로테아좀 억제제 MG132(20 μM)로 12시간 동안 처리한 후 단백질 추출을 위해 수거하였다. ERG 단백질은 단백질 A/G 비드에 의해 HA(도 13b) 또는 ERG 항체(도 13c)로 면역침전시켜 웨스턴 블롯 분석에 의해 유비퀴틴화 수준을 검출하였다. [도 13d] 비오틴-표지된 ERG OP-C-P1(100 nM)을 증가하는 양의 비표지된 대응물(비오틴-표지된 프로브 농도보다 1배, 10배, 100배 더 높은 양)의 존재하에 VCaP 핵 추출물과 함께 인큐베이션한 후 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)을 수행하였다. DPC는 DNA-단백질 복합체를 의미한다. [도 13e] 비오틴-표지 ERG OP-C-P1을 증가하는 양의 ERG 항체(0.5 및 1 μg) 존재 하에 VCaP 핵 추출물과 함께 인큐베이션한 후 EMSA를 수행하였다. [도 13f] VCaP 세포를 100 nM의 최종 농도의 대조군 OP 또는 ERG OP-C-P1 및 siRNA 대조군(siNS) 또는 siCRBN으로 48시간 동안 형질감염시킨 후 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. [도 13g] VCaP 세포를 대조군 OP 또는 ERG OP-C-P1로 최종 농도 100 nM에서 형질감염시키고 1배, 10배 또는 50배의 CRBN 리간드 포말리도마이드와 함께 36시간 동안 인큐베이션한 후, 웨스턴 ERG 단백질 수준에 대한 블롯 분석을 수행하였다.
[도 14a-14f] 프탈산 기반 ERG OP는 ERG 표적 유전자 발현과 전립선암 세포 성장 및 침습을 억제한다. [도 14a 및 14b] VCaP 세포를 대조군 OP 또는 ERG OP-C-P1로 최종 농도 100 nM에서 48시간 동안 형질감염시키고 웨스턴 블롯 분석(도 14a) 및 지시된 ERG 표적 유전자에 대한 RT-qPCR(도 14b)을 위해 수거하였다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)를 나타낸다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. * P < 0.05; ** P < 0.01. [도 14c 및 14d] VCaP 세포를 Matrigel에 포매하고 5일 동안 배양한 후 200 nM의 대조군 OP 또는 ERG OP-C-P1을 추가 5일 동안 처리하였다. 3차원(3D) 구체가 있는 대표적인 이미지는 [도 14c]에 보여주며 3D 구체의 정량화된 직경은 [도 14d]에 나타낸다. 데이터는 상자와 수염(whisker)으로 표시된다. 수염은 최소부터 최대까지를 나타내며, 각 점은 개별 3D 구체(n = 50)의 하나의 값이다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. *** P < 0.001. [도 14e 및 14f] 22Rv1 세포를 pCMV-HA-ERG 및 100 nM의 대조군 OP 또는 ERG OP-C-P1로 형질감염시킨 후, Matrigel-코팅된 챔버에 플레이팅하고 37℃인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 침윤된 세포는 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 대표적인 시야는 [도 14e]에 보여주며 정량화 데이터는 [도 14f]에 보여준다. 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. P 값은 비대응 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. ** P < 0.01.
[도 15] VCaP 세포의 416개의 기능 획득(GOF: gain of function) p53 ChIP-seq 피크에서 MEME-ChIP DNA 모티프 분석. 모티프 서열은 위에서 아래로 나타낸다.
[도 16a-16i] GOF p53 돌연변이체에 의한 CTNNB1의 전사 조절. [도 16a] VCaP 세포에서 p53 R248W 돌연변이체 결합 피크의 분포를 보여주는 p53 ChIP-seq 데이터. [도 16b] VCaP 세포에서 ChIP-seq에 의해 밝혀진 p53 점유 유전자의 KEGG 경로 분석. [도 16c] VCaP 세포의 CTNNB1 프로모터에서 p53 R248W 돌연변이체의 점유를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷. [도 16d] VCaP 세포의 CTNNB1 프로모터에서 결합하는 p53 R248의 ChIP-qPCR 분석. **, p<0.01. [도 16e] CTNNB1 프로모터 영역에서 p53 ChIP-qPCR 앰플리콘 및 EMSA DNA 프로브의 위치를 보여주는 개략도. [도 16f] [도 16e]에 도시된 3개의 순차적인 프라이머 쌍을 사용하여 VCaP 세포의 CTNNB1 프로모터에서 p53 R248 결합의 ChIP-qPCR 분석. [도 16g] [도 16e]에 표시된 CTNNB1 프로모터로부터의 DNA 프로브와 VCaP 세포의 핵 추출물을 사용한 EMSA 분석. DPC, DNA-단백질 복합체. [도 16h] [도 16e]에 표시된 비오틴-표지된 및 비표지된 DNA 프로브 1 및 VCaP 세포로부터의 핵 추출물을 사용한 EMSA 분석. [도 16i] 상단, 실험에 사용된 p53 미스센스 돌연변이체를 보여주는 개략도. 하단, 서열 번호 106의 MP53BS 서열을 나타내는 [도 16e]에 나타낸 DNA 프로브 1, 및 박테리아로부터 정제된 p53WT 또는 돌연변이체에 대한 GST 재조합 단백질을 사용한 EMSA 분석의 결과.
[도 17a-17d]. GOF p53 돌연변이체는 CTNNB1 유전자 프로모터에 결합하고 유전자 발현을 조절한다. [도 17a] 지시된 유방암 세포주로부터의 p53 WT 및 DNA 결합 도메인(DBD) 돌연변이체(R273H, R249S, R248Q)의 ChIP-seq 결과를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷으로 서열 번호 106의 MP53BS 서열을 나타낸다. [도 17b] 항-p53 항체의 존재 또는 부재 하에 CTNNB1 프로모터로부터의 DNA 프로브 1 및 VCaP 세포로부터의 핵 추출물을 사용한 EMSA 분석. DPC, DNA-단백질 복합체. 슈퍼시프트는 DNA-단백질-항체 복합체를 나타낸다. [도 17c] WT p53 결합 컨센서스 모티프(서열 번호 383), 인간(서열 번호 106) 및 마우스(서열 번호 442) CTNNB1 유전자 프로모터의 MP53BS 및 다른 GOF p53 돌연변이체(R248W) 결합 표적 KAT6A(서열 번호 398), KMT2A(서열 번호 403), MCL1(서열 번호 408), 및 MED23(서열 번호 413)의 MP53BS 유사 서열(서열 번호 449로서 개시된 MUT p53 CTNNB1 서열) 간의 DNA 서열 정렬.
[도 18a-18n]. LEF1/TCF O'PROTAC은 피리미딘 합성 유전자(PSG) 발현과 생체 내 PCa 환자 유래 이종이식편(PDX) 성장을 억제한다. [도 18a] LEF1/TCF O'PROTAC(OP; 서열 번호 5)에 사용된 DNA 올리고뉴클레오티드 및 LEF/TCF 패밀리, LEF1, TCF1, TCF3, 및 TCF4의 구성원의 DNA 모티프 요소의 컨세서스 서열과의 서열 정렬. [도 18b] 대조군 또는 LEF1/TCF O'PROTAC으로 48시간 동안 처리한 VCaP 세포에서 지시된 단백질의 웨스턴 블롯 분석. [도 18c] 대조군 또는 LEF1/TCF OP로 처리된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. [도 18d] LuCaP 23.1 PDX 종양 샘플에서 C238Y 돌연변이의 Sanger 서열분석 확인. [도 18e] LuCaP 23.1 PDX(PDXO)로부터 유래된 오가노이드에서 지시된 단백질의 웨스턴 블롯 분석. [도 18f-18h] LuCaP 23.1 PDXO를 지시된 O'PROTAC 및/또는 데옥시뉴클레오티드로 처리하고 처리 48시간 후 웨스턴 블롯 분석(도 18f)을 위해 수거하거나 3일 동안 배양한 후 사진(도 18g)을 찍고 오르가노이드의 직경을 정량화(도 18h)하였다. 데이터는 평균 ± S.D. (3개의 독립적인 실험/군의 n=60 오가노이드)로 나타낸다. 양측 스튜던트 t 검정을 수행하였다. ***, p<0.001. n.s., 유의하지 않음. [도 18i] 비히클 또는 지시된 OP로 처리 21일 후 마우스에서 LuCaP 23.1 PDX 종양의 대표적인 이미지. [도 18j] 비히클 또는 지시된 OP로 처리된 마우스에서의 LuCaP 23.1 PDX의 성장 곡선. 데이터는 평균 ± S.D.(n=6)로 나타낸다. ***, p<0.001. n.s., 유의하지 않음. [도 18k] 비히클 또는 지시된 OP 처리 21일 후의 마우스에서의 LuCaP 23.1 PDX 종양의 중량. 데이터는 평균 ± S.D.(n=6)로 나타낸다. ***, p<0.001. [도 18l] 비히클 또는 지시된 OP 처리 21일 후의 마우스의 체중. 데이터는 평균 ± S.D.(n=6)로 나타낸다. n.s., 유의하지 않음. [도 18m] [도 18i]에 나타낸 종양으로부터 지시된 단백질의 대표적인 IHC 이미지. [도 18n] 지시된 단백질의 IHC 염색 정량화. 실시예 13에서 염색 점수 및 지수에 대한 자세한 내용을 참조한다. 데이터는 평균 ± S.D.(n=3개 섹션/군)로 나타낸다. ***, p<0.001.
[도 19] 일부 실시양태에 따른 O'PROTAC 합성 경로의 개략도.
[도 20] 일부 실시양태에 따른 O'PROTAC 합성 경로의 개략도.
[도 21a-21d]. 올리고뉴클레오티드의 HPLC 및 질량 스펙트럼. [도 21a] 260 nm에서 UV로 검출된 ERG-R-OP-C1의 HPLC 스펙트럼. [도 21b] ERG OP-R-C1의 질량 스펙트럼. 디콘볼루션된 질량은 우측 상단 모서리에 표시되어 있다. [도 21c] 260 nm에서 UV로 검출된 ERG-F-FITC의 HPLC 스펙트럼. [도 21d] ERG-F-FITC의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼 질량 스펙트럼.
[도 22a-22b] 탈리도마이드(도 22a) 및 3-N-치환-아미노프탈산(도 22b)에 의해 결합된 CRBN의 도킹 모델. 검은 점선은 수소 결합을 나타내고 청록색 점선은 파이-파이 상호작용을 나타낸다.
[도 23a-23g] TMPRSS2 -ERG와 p53 돌연변이체의 임상적으로 관련된 공동 발현은 마우스에서 전립선 종양 형성을 유도한다. [도 23a] TCGA(상단) 및 SU2C(하단) 코호트의 PCa 환자에서 ERG 및 TP53 유전자의 유전적 변경의 백분율을 보여주는 cBioPortal의 OncoPrint 이미지. [도 23b] TCGA(좌측) 및 SU2C(우측) PCa 환자 샘플에서 TMPRRS2 -ERG 융합과 TP53 변경 사이의 연관에 대한 Fisher 정확 검정(양측). [도 23c] 15개월령에 지시된 유전자형을 갖는 마우스의 전립선 조직 내 ERG, AR 및 Ki67 단백질의 H&E 및 IHC의 대표적인 이미지. [도 23d] [도 23c]에 나타낸 지시된 유전자형을 갖는 마우스에서 PIN 및/또는 암 발생률의 정량화. ***, p<0.001. [도 23e] [도 23c]의 조직 절편으로부터 Ki67 양성 세포의 정량화. ***, p<0.001. [도 23f] 지시된 shRNA를 안정적으로 발현하는 VCaP 세포에서 지시된 단백질의 웨스턴 블롯 분석. ERK2는 로딩 대조군으로 사용하였다. [도 23g] 지시된 shRNA를 안정적으로 발현하는 VCaP 세포에서의 MTS 분석. ***, p<0.001. n.s., 유의하지 않음.
[도 24a-24i] 피리미딘 합성 유전자(PSG)의 발현은 뮤린 전립선 종양과 인간 PCa 세포에서 ERG와 GOF p53 돌연변이체에 의해 공동 조절된다. [도 24a] RNA-seq 데이터로 밝혀진 Pb - ERG;Trp53 R172H /- 마우스(n=3, 15개월)와 Pb - ERG;Trp53 -/- 마우스(n=3, 15개월)의 전립선 조직에서 고유하게 상향조절된 유전자 사이의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램. [도 24b] 뮤린 PCa(GSM1145303)에서 ChIP-seq에 의해 밝혀진 ERG 결합 표적 유전자를 갖는 Pb - ERG;Trp53R172H /- 마우스(n=3, 15개월)의 전립선 조직에서 고유하게 상향조절된 유전자의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램. [도 24c] 지시된 유전자형(Trp53 pcR172H /- 군을 제외하고 n=3)을 갖는 마우스(15개월)의 전립선 조직에서 차등적으로 발현된 유전자(n=531)의 서브세트를 보여주는 RNA-seq 데이터의 히트맵. [도 24d] [도 24c]에 나타낸 Pb - ERG;Trp53 R172H /- 마우스의 전립선 조직에서 고유하게 상향조절된 531개 ERG 표적 유전자의 KEGG 경로 분석. [도 24e] UMPS, RRM1 , RRM2 및 TYMS를 포함하는 주요 피리미딘 합성 효소를 설명하는 다이어그램. [도 24f] [도 24c]에 나타낸 Pb - ERG;Trp53 R172H /- 마우스의 전립선 조직 내 RNA-seq 및 ERG ChIP-seq(GSM1145303)의 Umps 유전자좌의 결과를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷. [도 24g] 지시된 마우스 유형(n=3, 15개월)의 전립선 조직에서 PSG 발현의 RT-qPCR 분석. **, p<0.01. [도 24h 및 24i] 대조군 또는 유전자 특이적 shRNA를 안정적으로 발현하는 VCaP 세포에서 지시된 단백질 및 PSG 유전자 mRNA의 웨스턴 블롯(도 24h) 및 RT-qPCR(도 24i) 분석. ***, p<0.01, **, p<0.01.
[도 25a-25l]. GOF p53 돌연변이체에 의한 프로모터 결합 및 CTNNB1 유전자 발현 조절. [도 25a] VCaP 세포에서 p53 R248W 돌연변이체 결합 피크의 분포를 보여주는 p53 ChIP-seq 데이터. [도 25b]) VCaP 세포에서 ChIP-seq에 의해 밝혀진 p53-점유 표적 유전자의 KEGG 경로 분석. [도 25c] VCaP 세포의 CTNNB1 유전자 프로모터에서 p53 R248W 돌연변이체의 점유를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷. [도 25d] VCaP 세포의 CTNNB1 프로모터에서 p53 R248 결합의 ChIP-qPCR 분석. **, p<0.01. n.s., 유의하지 않음. [도 25e] CTNNB1 프로모터 영역에서 p53 ChIP-qPCR 앰플리콘 및 EMSA DNA 프로브의 위치를 보여주는 개략도. [도 25f] [도 25e]에 도시된 3개의 순차적 프라이머 쌍을 사용하여 VCaP 세포의 CTNNB1 프로모터에서 p53 R248 결합의 ChIP-qPCR 분석. **, p<0.01. n.s., 유의하지 않음. [도 25g] [도 25e])에 지시된 CTNNB1 프로모터로부터의 이중 가닥(ds) DNA 프로브 및 VCaP 세포로부터의 핵 추출물을 사용한 EMSA 분석. DPC, DNA-단백질 복합체. [도 25h] [도 25e]에 나타낸 비오틴-표지된 및 비표지된 ds DNA 프로브 1 및 VCaP 세포로부터의 핵 추출물을 사용한 EMSA 분석. [도 25i] 상단, 실험에 사용된 p53 미스센스 돌연변이체를 보여주는 개략도. 하단, 서열 번호 106의 MP53BS 서열을 나타내는 [도 25e]에 나타낸 ds DNA 프로브 1 및 박테리아로부터 p53 WT 또는 정제된 지시된 돌연변이체에 대한 GST 재조합 단백질을 사용한 EMSA 분석의 결과. [도 25j 및 25k] 지시된 shRNA를 안정적으로 발현하는 VCaP 세포에서 지시된 단백질 및 mRNA의 웨스턴 블롯(도 25j) 및 RT-qPCR(도 25k) 분석. **, p<0.01. ***, p<0.001. [도 25l] p53 야생형(WT), DBD 도메인의 손실(null) 및 돌연변이(Mut)을 갖는 SU2C 코호트의 PCa 환자 샘플에서 CTNNB1, MDM2(p53 표준 표적, 양성 대조군) 및 ACTB(비특이적 내부 대조군) mRNA 수준의 발현을 보여주는 RNA-seq 데이터의 메타 분석. **, p<0.01. *, p<0.05. n.s., 유의하지 않음.
[도 26 a-26o] ERG와 β-카테닌에 의한 PSG 발현의 공동 조절. [도 26a 및 26b] 지시된 shRNA를 안정적으로 발현하는 VCaP 세포에서 지시된 단백질 및 mRNA의 웨스턴 블롯(도 26a) 및 RT-qPCR(도 26b) 분석. ***, p<0.001. **, p<0.01. *, p<0.05. [도 26c] VCaP 세포의 ERG ChIP-seq 및 β-카테닌 ChIP-seq(GSE53927)에 의해 밝혀진 UMPS 및 RRM2 유전자좌에서 ERG 및 β-카테닌의 점유를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷. [도 26d 및 26e] VCaP 세포의 UMPS, RRM1, RRM2 및 TYMS 유전자좌에서 ERG(도 26d) 및 β-카테닌(도 26e) 점유에 대한 ChIP-qPCR 분석. ***, p<0.001. **, p<0.01. [도 26f] UMPS 유전자 프로모터에서 ERG 및 β-카테닌 공동 점유의 ChIP-qPCR 분석. ***, p<0.001. [도 26g 및 26h] 지시된 플라스미드 및/또는 shRNA를 발현하는 p53 KO DU145 세포에서 지시된 단백질 및 mRNA의 웨스턴 블롯(도 26g) 및 RT-qPCR(도 26h) 분석. **, p < 0.01. [도 26i] 지시된 플라스미드 및/또는 shRNA를 발현하는 p53 KO DU145 세포의 RRM2 유전자좌에서 ERG 및 β-카테닌 점유 부위 사이의 염색질 상호작용 분석을 위한 염색체 입체구조 분석(Chromosome Conformation Capture assay)(3C 분석). **, p < 0.01. [도 26j] PSG 유전자좌에서 가능한 공간적 상호작용을 도시하는 가상 모델. [도 26k] 지시된 shRNA를 발현하는 VCaP 세포에서 지시된 단백질의 웨스턴 블롯 분석. [도 26l 및 26m] [도 26k]에서와 같이 ERG 및 p53 단백질이 공동 고갈된 VCaP 세포에서 LC-MS에 의해 측정된 UDP 및 dTDP의 수준을 보여주는 대표적인 크로마토그램(도 26l) 및 정량적 데이터(도 26m). *, p <0.05; **, p < 0.01. [도 26n] 지시된 sgRNA를 발현하는 VCaP 세포에서 UMPS, RRM1 및 RRM2 단백질의 웨스턴 블롯 분석. [도 26o] [도 26n]에서와 같이 지시된 단백질이 고갈된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. 이원 분산분석을 수행하였다. ***, p<0.001.
[도 27a-27m] CBP PROTAC은 마우스에서 PSG 발현과 PCa 이종이식편 성장을 억제한다. [도 27a] TCGA 코호트의 TMPRRS2 -ERG 융합 양성 PCa 샘플에서 UMPS, RRM1 및 RRM2의 발현 증가와 높은 수준의 CTNNB1 mRNA의 연관성을 보여주는 RNA-seq 데이터의 메타 분석. [도 27b] TCGA 코호트의 TMPRRS2 -ERG 융합 양성 PCa 샘플의 불량한 생존과 3개의 PSG(UMPS, RRM1 및 RRM2)의 높은 mRNA 발현의 연관성을 보여주는 Kaplan-Meier 생존 곡선. 로그 순위(Mantel-Cox)를 사용하였다. [도 27c] CBP PROTAC을 통한 β-카테닌의 전사 활성 억제 전략. [도 27d] 연구에 사용된 CBP PROTAC(CP1 내지 CP4)의 선형 구조. [도 27e] ICG-001 또는 CBP PROTAC으로 처리된 VCaP 세포에서 CBP 및 β-카테닌 단백질의 웨스턴 블롯 분석. [도 27f] VCaP 세포를 CP2로 36시간 동안 그리고 MG132로 8시간 동안 처리하고 지시된 항체를 사용한 IP 및 웨스턴 블롯을 위해 수거하였다. [도 27g] VCaP 세포를 CP2로 36시간 동안 그리고 MG132로 8시간 동안 처리한 후 지시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. [도 27h 및 27i] VCaP 세포를 비히클 또는 2회 용량의 CP2로 48시간 동안 처리하고 지시된 유전자 또는 단백질의 RT-qPCR(도 27h) 및 웨스턴 블롯(도 27i) 분석을 위해 수거하였다. ***, p<0.001. **, p<0.01. *, p<0.05. [도 27j] 다양한 용량의 CP2로 처리된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. 이원 분산분석을 수행하였다. ***, p<0.001. [도 27k] CP2 및/또는 지시된 데옥시뉴클레오티드로 처리된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. *, p <0.05; ***, p < 0.001; n.s., 유의하지 않음. [도 27l] 지시된 치료 23일 후에 마우스로부터 단리된 종양의 대표적인 이미지. [도 27m] 비히클, ICG-001 및 CP2로 처리된 마우스에서의 종양 성장 곡선. 평균 ± S.D.(n=5개 종양/군)로 나타낸 데이터. 이원 분산분석을 수행하였다. ***, p<0.001. **, p<0.01.
[도 28a-28n] LEF1/TCF O'PROTAC은 PSG 발현과 PCa PDX 성장을 억제한다. [도 28a] LEF1/TCF O'PROTAC(OP; 서열 번호 5)에 사용된 DNA 올리고뉴클레오티드의 서열 및 LEF/TCF 패밀리, LEF1, TCF1, TCF3, 및 TCF4의 구성원의 DNA 결합 요소와의 정렬. [도 28b] 48시간 동안 대조군 또는 LEF1/TCF OP로 처리된 VCaP 세포에서 지시된 단백질의 웨스턴 블롯 분석. [도 28c] 대조군 또는 LEF1/TCF OP로 처리된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. [도 28d] LuCaP 23.1 PDX 종양 샘플에서 C238Y 돌연변이의 Sanger 서열분석 확인. [도 28e] LuCaP 23.1 PDX(PDXO)로부터 유래된 오가노이드에서 지시된 단백질의 웨스턴 블롯 분석. [도 28f-28h] LuCaP 23.1 PDXO를 지시된 OP 및/또는 데옥시뉴클레오티드로 처리하고 처리 48시간 후 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하거나(도 28f) 3일 동안 배양한 후 사진 촬영(도 28g)하고 직경을 정량화(도 28h)하였다. 데이터는 평균 ± S.D.(3개의 독립적인 실험으로부터의 n=60 오가노이드/군)로 나타낸다. 양측 스튜던트 t 검정을 수행하였다. ***, p<0.001. n.s., 유의하지 않음. [도 28i] 비히클 또는 지시된 OP로 처리 21일 후 마우스에서의 LuCaP 23.1 PDX 종양의 대표적인 이미지. [도 28j] 비히클 또는 지시된 OP로 처리된 마우스에서의 LuCaP 23.1 PDX의 성장 곡선. 데이터는 평균 ± S.D.(n=6)로 나타낸다. ***, p<0.001. n.s., 유의하지 않음. [도 28k] 비히클 또는 지시된 OP로 처리한 21일 후 마우스에서의 LuCaP 23.1 PDX 종양의 중량. 데이터는 평균 ± S.D.(n=6)로 나타낸다. ***, p<0.001. [도 28l] 비히클 처리 또는 지시된 OP 처리 21일 후 마우스의 체중. 데이터는 평균 ± S.D.(n=6)로 나타낸다. n.s., 유의하지 않음. [도 28m] [도 28i]에 나타낸 종양으로부터 지시된 단백질의 대표적인 IHC 이미지. [도 28n] 지시된 단백질의 IHC 염색의 정량화. 방법에서 염색 채점 및 지수에 대한 자세한 내용을 참조한다. 데이터는 평균 ± S.D.(n=3개 섹션/군)로 나타낸다. ***, p<0.001.
[도 29] PCa 발달 및 진행에서 TMPRSS2-ERG 및 GOF p53 돌연변이체의 협력성을 해독하는 가상 모델. TMPRSS2-ERG와 GOF p53 돌연변이체의 공동 발현은 CTNNB1 유전자 발현의 p53 돌연변이 의존적 상향 조절 및 PSG 및 기타 암 관련 유전자의 게놈 유전자좌에서 염색질 상 ERG와 β-카테닌의 기능적 상호작용을 통해 피리미딘 합성 유전자(PSG) 발현 및 PCa 성장 및 진행을 유도한다. β-카테닌 의존성은 ERG/GOF p53 돌연변이 PCa의 치료를 위해 CBP PROTAC 및 LEF1/TCF O'PROTAC에 의해 약리학적으로 표적화될 수 있다.
[도 30a-30e] PCa 환자 샘플에서 TMPRSS2-ERG와 p53 변경의 동시 발생 및 ERG와 GOF p53 돌연변이체의 공동 발현은 [도 23]과 관련하여 마우스에서 전립선 종양의 조기 발병을 유도한다. [도 30a] MSKCC 코호트의 PCa 환자에서 ERG 및 TP53 유전자의 유전자 변경의 백분율을 보여주는 cBioPortal의 OncoPrint 이미지. [도 30b] MSKCC PCa 환자 샘플에서 TMPRRS2 -ERG 융합과 TP53 변경 사이의 연관성에 대한 Fisher 정확 검정(양측). [도 30c] 10개월령에 지시된 유전자형을 갖는 마우스로부터의 전립선 조직 내 ERG, AR 및 Ki67 단백질의 H&E 및 IHC의 대표적인 이미지. [도 30d] [도 30c]에 나타낸 지시된 유전자형을 갖는 마우스에서 PIN 및/또는 암 발생률의 정량화. **, p<0.01. [도 30e] [도 30c]에 나타낸 마우스의 전립선 조직 내 Ki67 양성 세포의 정량화. **, p<0.01.
[도 31a-31f] [도 2]와 관련하여, Pb - ERG;Trp53 R172H /-, Pb -ERG; Trp53 -/- 및 기타 유전자형 마우스에서 고유하게 상향조절된 유전자의 비교. [도 31a 및 31b] RNA-seq 데이터에 의해 밝혀진 15개월령의 지시된 유전자형 마우스로부터의 전립선 조직에서 고유하게 발현된 유전자를 보여주는 벤 다이어그램(한 마리 마우스의 데이터가 품질이 좋지 않아 분석에서 제외된 Trp53 R172H /- 군을 제외하고는 n=3/군). [도 31c-31e) RRM1(도 31c), RRM2(도 31d) 및 TYMS(도 31e) 유전자좌의 RNA-seq 및 ERG ChIP-seq(GSM1145303) 데이터를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷. [도 31f] VCaP 세포로부터 얻은 416개의 p53 ChIP-seq 피크에서의 MEME-ChIP DNA 모티프 분석. 위에서 아래로 나타낸 모티프 서열.
[도 32a-32h] [도 25]와 관련하여, GOF p53 돌연변이체는 CTNNB1 유전자 프로모터에 결합하고 다양한 암 세포주에서 β-카테닌 발현을 조절한다. [도 32a] 지시된 유방암 세포주로부터의 p53 WT 및 GOF DBD 돌연변이체(R273H, R249S, R248Q)의 ChIP-seq 결과를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷으로 서열 번호 106의 MP53BS 서열을 나타낸다. [도 32b] EMSA에 사용되는 단일 가닥(ss) 센스(S) 및 안티센스(AS) 올리고 및 어닐링된 이중 가닥(ds) DNA 프로브의 아가로스 겔(4%) 전기영동. [도 32c] 항-p53 항체의 존재 또는 부재 하에 [도 3e]에 도시된 바와 같은 CTNNB1 프로모터로부터의 ds DNA 프로브 1 및 VCaP 세포로부터의 핵 추출물을 사용한 EMSA 분석. DPC, DNA-단백질 복합체. 슈퍼시프트는 DNA-단백질-항체 복합체를 나타낸다. [도 32d] WT p53 결합 컨센서스 요소(서열 번호 383), 인간(서열 번호 106) 및 마우스(서열 번호 442) CTNNB1 유전자 프로모터의 MP53BS 및 다른 GOF p53 돌연변이체(R248W) 결합 표적 KAT6A(서열 번호 398), KMT2(서열 번호 403), MCL1(서열 번호 408), 및 MED23(서열 번호 413)의 유사 서열(서열 번호 449로서 개시된 MUT p53 CTNNB1 서열) 간의 DNA 서열 정렬. [도 32e-32h] VCaP 세포의 KAT6A(도 32e(서열 번호 398)), KMT2A(도 32f(서열 번호 140)), MCL1(도 32g(서열 번호 125)) 및 MED23(도 32h(서열 번호 244)) 유전자의 프로모터에서 p53 R248W 돌연변이체의 점유를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷.
[도 33a-33i]. [도 25]와 관련하여 인간 PCa 세포주 및 마우스 PCa 조직에서 GOF p53 돌연변이체에 의한 CTNNB1 mRNA 발현의 조절. [도 33a 및 33b] 대조군 또는 p53-특이적 sgRNA를 안정적으로 발현하는 p53 돌연변이 DU145 세포의 β-카테닌 단백질 및 mRNA의 웨스턴 블롯(도 33a) 및 RT-qPCR(도 33b) 분석. ***, p<0.001. [도 33c 및 33d] 대조군 또는 p53-특이적 sgRNA를 안정적으로 발현하는 p53 WT LNCaP 세포에서 β-카테닌 단백질 및 mRNA의 웨스턴 블롯(도 33c) 및 RT-qPCR(도 33d) 분석. n.s., 유의하지 않음. [도 33e 및 33f]) p53 녹아웃(KO) DU145 세포를 공 벡터(EV), WT p53 또는 지시된 돌연변이체를 발현하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 세포를 웨스턴 블롯 분석(도 33e) 및 [도 25e]에 지시된 바와 같이 CTNNB1 프로모터로부터의 ds DNA 프로브 1을 사용한 EMSA를 위한 핵 추출물 제조를 위해 수거하였다 [도 33f]. H3은 로딩 대조군으로 사용하였다. [도 33g] 15개월령에 지시된 유전자형 마우스의 다양한 군에서 RNA-seq에 의해 밝혀진 Ctnnb1 mRNA 수준을 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷. [도 33h] 15개월령의 WT 및 Pb -ERG;Trp53 R172H/- 마우스(n=3/군)의 전립선 종양 조직에서 Ctnnb1 mRNA의 RNA-seq 판독을 보여주는 정량적 데이터. Ctnnb1 mRNA의 발현에 대해 Log10(FPKM)을 계산하였다. 유의성을 평가하기 위해 스튜던트 t-검정을 사용하였다. * p<0.05. [도 33i] 상단, VCaP 세포의 CTNNB1 유전자 프로모터에서 ERG의 점유를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷. 하단, 빨간색의 ERG 결합 서열(ERGBS; 서열 번호 443)과 파란색의 MP53BS(서열 번호 444)의 두 핵심 요소가 표시되어 있다.
[도 34a-34e] [도 26]과 관련하여, PSG 유전자좌에서 ERG와 β-카테닌 결합 부위 사이의 염색질 루프형성의 평가. [도 34a-34b] ChIP-seq 데이터에 의해 밝혀진 RRM1(도 34a) 및 TYMS(도 34b) 유전자좌에서 ERG 및 β-카테닌 단백질의 점유를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저 스크린샷. [도 34c 및 34d] 지시된 플라스미드 및/또는 shRN를 발현하는 p53 KO DU145에서 RRM2(도 34c) 및 TYMS(도 34d) 유전자좌에서 ERG 및 β-카테닌 점유 부위 사이의 염색질 상호작용 분석을 위한 염색체 입체구조 분석(3C 분석). **, p < 0.01. [도 34e 및 34f] p53 KO DU145 세포를 지시된 플라스미드로 형질감염시키고/거나 지시된 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염시키고 PSG 유전자좌에서 H3K27ac(도 34e) 및 Pol II-S2-p(도 34f) 수준의 ChIP-qPCR 분석을 위해 세포를 수거하였다. ***, p<0.001. **, p<0.01. *, p<0.05. n.s., 유의하지 않음.
[도 35a-35l] [도 27]과 관련하여 β-카테닌/CBP 복합체 억제제는 PSG 발현 및 TMPRSS2-ERG/p53 돌연변이cp 양성 PCa 세포 성장을 효과적으로 감소시킨다. [도 35a] 대조군(shCon) 또는 β-카테닌 특이적 shRNA를 발현하는 렌티바이러스에 감염된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. ERK2는 로딩 대조군으로 사용하였다. ***, p<0.001. [도 35b 및 35c] 비히클 또는 다양한 용량의 ICG-001로 처리된 VCaP 세포에서 지시된 mRNA 및 단백질의 발현에 대한 RT-qPCR(도 35b) 및 웨스턴 블롯(도 35c) 분석. ***, p<0.001. **, p<0.01. *, p<0.05. [도 35d] 비히클 또는 다양한 용량의 ICG-001로 처리된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. ***, p<0.001. [도 35e 및 35f] 비히클 또는 다양한 용량의 PRI-724로 처리된 VCaP 세포에서 지시된 mRNA 및 단백질의 발현에 대한 RT-qPCR(도 35e) 및 웨스턴 블롯(도 35f) 분석. ***, p<0.001. **, p<0.01. *, p<0.05. [도 35g] 비히클 또는 다양한 용량의 PRI-724로 처리된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. ***, p<0.001. [도 35h] 비히클, ICG-001 또는 CP2로 처리한 23일 후에 마우스로부터 얻은 종양의 중량 비교. ***, p<0.001. **, p<0.01. [도 35i] IC50 측정을 위해 다양한 용량의 ICG-001 및 CP2로 처리된 VCaP 세포에서의 MTS 분석. **, p <0.001. [도 35j] 비히클, ICG-001 또는 CP2로 처리 23일 후 마우스의 체중. n.s., 유의하지 않음. (도 35k) 좌측은 [도 27l]에 나타낸 종양 내 지시된 단백질의 대표적인 IHC 이미지, 우측은 각 단백질의 IHC 강도의 정량적 데이터. 염색 지수 계산 방법의 자세한 내용을 참조한다. ***, p<0.001. **, p<0.01. *, p<0.05. [도 35l] 지시된 처리를 받은 마우스로부터 얻은 PDX 종양에서 지시된 단백질의 웨스턴 블롯 분석(n=3 종양/처리). ERK2는 로딩 대조군으로 사용하였다.
일반적으로, 본원에 기재된 이작용성 화합물은 화학식 (IA), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체로 나타내는 구조를 가질 수 있다:
여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합하는 리간드를 나타내고, 링커는 표적화 모이어티와 프로테아제 리간드를 연결하는 모이어티를 나타낸다.
일부 경우에, 본원에 기재된 이작용성 화합물은 화학식 (IB), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체로 나타내는 구조를 가질 수 있다:
여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합하는 리간드를 나타내고, E3 리가제 리간드는 E3 리가제에 결합하는 리간드를 나타내고, 링커는 표적 모이어티를 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드에 연결하는 모이어티를 나타낸다.
표적화 모이어티
본원에 기재되는 바와 같이, 표적화 모이어티는 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드로 이루어진 분자를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 이중 가닥 뉴클레오티드 분자이다. 표적화 모이어티는 혼성화하여 이중체 구조를 형성하기에 충분히 상보적인 2개의 뉴클레오티드 가닥으로 구성된 이중 가닥 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적화 모이어티는 이중 가닥 유사 구조를 형성할 수 있는 자기 상보적인 단일 뉴클레오티드 가닥이다. 표적 단백질은 이중 가닥 뉴클레오티드에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질이 될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 0 내지 약 30개 뉴클레오티드를 갖는 제1 비단백질 동원 영역, 3 내지 약 50개 뉴클레오티드를 갖는 단백질 동원 영역, 및 0 내지 약 30개 뉴클레오티드를 갖는 제2 단백질 동원 영역을 포함한다. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 각 가닥은 일반적으로 3 내지 100개 뉴클레오티드 길이이다. 이중체의 각 가닥은 동일한 길이일 수도 있고 상이한 길이일 수도 있다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질은 질환 관련 단백질(예를 들어, 기능 또는 활성의 변화가 질환을 유발하거나 그 기능이 질환 상태의 전파에 중요하다고 간주되는 단백질)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 암(예를 들어, 전립선암, 신경내분비 전립선암, 유방암, 결장직장암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 림프종, 교모세포종, 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 T 세포 림프종, T 세포 림프종, 백혈병, 림프형질세포양 B세포 림프종, 신경교종, 소세포폐암, 신경모세포종, 혈관육종, 연골육종, 유잉 육종, 섬유모세포 육종, 부인과 육종, 지방육종, 골육종, 횡문근육종, 연조직 육종, 윤활막 육종, PRAD(전립선 선암종), BRCA(유방 침윤성 암종), BLCA(방광 요로상피 암종), LUAD(폐 선암종), LIHC(간 간세포암종), CESC(경부 편평 세포 암종 및 자궁경부 내막 선암종), CHOL(담관암종), LUSC(폐 편평 세포 암종), COAD(결장 선암종), READ(직장 선암종), PAAD(췌장 선암종), UCEC(자궁체 자궁내막 암종), UCS(자궁암육종), HNSC(두경부 편평세포암종), MESO(중피종), TGCT(고환 생식세포 종양), OV(난소장액 낭선암종), THCA(갑상선암종), SARC(육종), SKCM(피부 흑색종), ACC(부신피질 암종), KIRC(신장 투명 세포 암종), PCPG(갈색 세포종 및 부신경절종), KIRP(신장 유두 세포 암종), DLBC(림프성 신생물 미만성 대형 B 세포 림프종), THYM(흉선종), LGG(뇌 저급 신경교종), KICH(신장 혐색소증), GBM(다형성 교모세포종), LAML(급성 골수성 백혈병) 및 UVM(포도막 흑색종))과 관련된 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 암종 또는 혈액암(예를 들어, 림프종, 백혈병, 또는 림프성 악성종양)과 관련된 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 Fos와 연관된 암 또는 Jun과 연관된 암과 관련된 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 전이성 암(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 암의 전이성 암)과 관련된 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 자가면역 질환(예를 들어, HIV/AIDS, 당뇨병 또는 다발성 경화증)과 관련된 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 염증성 질환(예를 들어, 류마티스 관절염, 지방간 질환 또는 염증성 장 질환) 또는 허혈과 관련된 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 신경퇴행성 질환(예를 들어, 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 근위축성 측색 경화증 또는 다발성 경화증)과 관련된 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 발달 질환, 뮐러-바이스병(MWD), 캄포멜성 이형성증, 심혈관 질환, 희귀 질환, 신장 질환, 또는 뇌 질환(예를 들어, 부신백질이영양증)과 관련된 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화되는 표적 단백질은 흉터, 특발성 폐섬유증, 비알코올성 지방간염, 및 간, 눈, 신장 또는 심장 조직의 섬유증을 포함하나 이에 제한되지 않는 섬유증 질환 또는 병태와 관련된 단백질일 수 있다.
본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화될 수 있는 표적 단백질의 예에는 전사 인자, 전사 공동 조절인자, 폴리머라제, 뉴클레아제, 및 히스톤과 같은 DNA 결합 단백질뿐만 아니라 RNA 결합 단백질이 제한 없이 포함된다. 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화될 수 있는 전사 인자의 예에는 안드로겐 수용체(AR), ERG, 포크헤드 박스 A1(FOXA1), LEF1, 에스트로겐 수용체(ER), NF-κB, E2 인자(E2F)(예를 들어, E2F1, E2F2, E2F3a, E2F3b, E2F4, E2F5, E2F6, E2F7, 또는 E2F8), c-Myc, 전사의 트랜스활성화 인자(TAT), Jun 원발암유전자(Jun/c-Jun), Fos 원발암유전자(Fos/c-Fos), 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFAT)(예를 들어, NFATc1, NFATC2, NFATC3, 또는 NFATC4), Runt 관련 전사 인자 1(RUNX1/AML1), Myc 원발암유전자(Myc/c-Myc), ETS 원발암유전자(ETS1), 신경교종 관련 발암유전자(GL1), ERG/FUS 융합, T 세포 백혈병 호메오박스 1(TLX1), LIM 도메인 단독 1(LMO1), LIM 도메인 단독 2(LMO2), 림프모구성 백혈병 관련 조혈 조절인자 1(LYL1/E2a 이종이량체), MYB 원발암유전자(MYB), 페어드 박스 5(PAX-5), SKI 원발암유전자(SKI), T 세포 급성 림프구성 백혈병 단백질 1(TAL1), T 세포 급성 림프구성 백혈병 단백질 2(TAL2), 글루코코르티코이드 수용체, IL-6 발현을 위한 핵 인자(NF-IL6), 초기 성장 반응 단백질 1(EGR-1), 저산소증 유발 인자 1-알파(HIF-1a), 신호 변환기 및 전사 활성화제 1(STAT1), 신호 변환기 및 전사 활성화제 3(STAT3), 신호 변환기 및 전사 활성화제 5(STAT5), V-Maf 조류 근건막성 섬유육종 발암유전자 상동체-A(MAFA), SRY-박스 전사 인자 2(SOX2), SRY-박스 전사 인자 9(SOX9), CAAT/인핸서 결합 단백질 알파(CEBPA), CAAT/인핸서 결합 단백질 베타(CEBPB), 글로빈 전사 인자(GATA)(예를 들어, GATA1, GATA2, GATA3), 근세포 인핸서 인자 2(MEF2)(예를 들어, MEF2A, MEF2B, MEF2C, MEF2D), POU 클래스 3 호메오박스 2(BRN2), 징크 핑거 E-박스 결합 호메오박스 2(ZEB2), 핵 수용체 서브패밀리 4 그룹 A 구성원 1(NR4A1), 활성화 전사 인자 4(ATF4), T-박스 전사 인자 21(TBX21), RAR 관련 고아 수용체 C(RORC), 및 X -박스 결합 단백질(XBP-1s)이 제한 없이 포함된다.
표적 단백질을 인식하고 이에 결합하는 뉴클레오티드는 잘 알려져 있거나 당업자에게 쉽게 이용 가능하다. 표 A는 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)에 의해 표적화될 수 있는 표적 단백질(예를 들어, 전사 인자)의 목록을 제공한다. 표 A는 또한 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)의 표적화 모이어티를 생성하는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 예시적인 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 경우에, 표 A에 제공된 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산을 함유하는 표적화 모이어티를 갖는 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)은 표 A에 제시된 바와 같이 나타낸 질환(들)을 치료하는 데 사용될 수 있다.
[표 A]
변형
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 화학적으로 변형되어 안정성을 향상시킨다. 뉴클레오티드 합성은 변형된 염기 및 백본 결합을 함유하는 뉴클레오티드의 합성과 마찬가지로 당업계에 잘 알려져 있다. 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기재된 것과 같은 당업계에 잘 확립된 방법에 의한 합성 및/또는 변형은 이로써 본원에 참조로 포함된다.
변형된 백본에는 백본에 인 원자를 보유하는 백본과 백본에 인 원자가 없는 백본이 포함된다. 본 명세서의 목적을 위해, 그리고 종종 당업계에서 언급되는 바와 같이, 뉴클레오시드간 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 뉴클레오시드도 뉴클레오시드로 간주될 수 있다.
변형된 백본에는 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 키타 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트 포함), 포스피네이트, 포스포라미데이트(3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트 포함), 티오노포스포르라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결, 2'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 역 극성을 갖는 것이 포함된다. 다양한 염, 혼합 염, 및 유리산 형태도 포함된다.
상기 인-함유 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 백본은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된 백본을 갖는다. 여기에는 모르폴리노 연결(부분적으로 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성됨)을 갖는 것; 실록산 백본; 황화물, 설폭시드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 N, O, S 및 CH2 구성요소가 혼합된 기타가 포함된다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,3 15호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437; 및 제5,677,439호가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
다른 적합한 뉴클레오티드 모방체에서는 뉴클레오티드 단위의 당과 뉴클레오시드간 연결 둘 모두, 즉 백본이 신규 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 한가지 이러한 올리고머 화합물인 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산(PNA)이라고 한다. PNA 화합물에서, 뉴클레오티드의 당 백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 핵염기는 유지되며 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. PNA 화합물에 대한 추가 교시는 문헌[Nielsen et al., Science, 254:1497-1500 (1991)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 포스포로디아미데이트 모르폴리노(PMO) 백본을 갖는 뉴클레오티드(Heasman, Developmental Biology 243(2):209-214 (2002); 및 Nan et al., Front. Microbiol. 9: 750 (2018)), 포스포로티오에이트 백본 및 헤테로원자 백본을 갖는 뉴클레오시드, 특히 상기 참조된 미국 특허 제5,489,677호의 -CH2-NH- CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 알려짐], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-, 및 -N(CH3)-CH2-CH2-[여기서 천연 포스포디에스테르 백본은 -O-P-O-CH2-로 나타냄], 및 상기 참조된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 백본이다. 또한, 상기 참조된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 백본 구조를 갖는 뉴클레오티드가 바람직하다.
변형된 dsRNA는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수도 있다. 바람직한 dsRNA는 2' 위치에 다음 중 하나를 포함한다: OH; F; 0-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C1 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 다른 바람직한 dsRNA는 2' 위치에 다음 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3,OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, dsRNA의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 dsRNA의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기. dsRNA의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 또는 2'-5' 연결된 dsRNA의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 유사한 변형이 이루어질 수 있다. dsRNA는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 잔기와 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 그러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
접합체
뉴클레오티드의 또 다른 변형은 뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 뉴클레오티드에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 이러한 모이어티에는 콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티(Letsinger et al., Proc . Natl . Acid. Sci . USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Biorg . Med . Chem . Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예를 들어 베릴-스트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y . Acad . Sci ., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg . Med . Chem . Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl . Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behrnoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1 111-1 118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651- 3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim . Biophys . Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol . Exp . Then, 1996, 277:923-937)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 dsRNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호, 5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
전형적인 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에 아미노 링커를 갖는 뉴클레오티드의 합성을 포함한다. 그런 다음 아미노기는 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 접합되는 분자와 반응된다. 접합 반응은 뉴클레오티드가 고체 지지체에 여전히 결합된 채로 또는 용액상에서 뉴클레오티드가 절단된 후에 수행될 수 있다. HPLC에 의한 뉴클레오티드 접합체의 정제는 전형적으로 순수한 접합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 dsDNA이다. dsDNA는 혼성화하여 이중체 구조를 형성하기에 충분히 상보적인 2개의 DNA 가닥 또는 이중 가닥 유사 구조를 형성하기 위해 자가 상보적인 하나의 DNA 가닥을 포함한다. dsDNA는 0 내지 약 30개 염기를 갖는 제1 비단백질 동원 영역, 3 내지 약 50개 염기를 갖는 단백질 동원 영역, 및 0 내지 약 30개 염기를 갖는 제2 단백질 동원 영역을 포함할 수 있다. dsDNA의 각 가닥은 일반적으로 5 내지 100개 염기 길이이다. 이중체의 각 가닥은 동일한 길이일 수도 있고 상이한 길이일 수도 있다.
일부 실시양태에서, dsDNA는 AR(A 및 B는 출현 순서대로 각각 서열 번호 1 및 445 및 2 및 446을 개시함), ERG(C는 출현 순서대로 각각 서열 번호 3 및 447를 개시함), FOXA1(D는 출현 순서대로 각각 서열 번호 2 및 446을 개시함), 또는 LEF(E는 출현 순서대로 각각 서열 번호 5 및 448을 개시함)을 표적화하는 다음 서열 중 어느 하나로 나타내는 dsDNA일 수 있다:
링커
링커(L)는 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드(예를 들어, E3 유비퀴틴 리가제 리간드)에 대한 표적화 모이어티의 공유 부착을 제공한다.
일부 실시양태에서, 링커는 말단 뉴클레오티드 또는 서열 중간의 뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 말단 뉴클레오티드 또는 서열 중간의 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 또는 2' 당 모이어티에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 말단 뉴클레오티드 또는 서열 중간의 뉴클레오티드의 당 모방체에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 말단 뉴클레오티드 또는 서열 중간의 뉴클레오티드의 변형된 핵염기에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커 기 L은 A의 하나 이상의 공유 연결된 구조 단위(예를 들어, -A1...A q -)를 포함하는 기이고, 여기서 A1은 표적화 모이어티에 커플링되고, q는 0 이상의 정수이다. 특정 실시양태에서, q는 1 이상의 정수이다.
예를 들어 q가 2보다 큰 특정 실시양태에서, A q 는 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드에 연결되는 기이고, A1 및 A q 는 A의 구조 단위(A의 이러한 구조 단위 수: q-2)를 통해 연결된다.
예를 들어 q가 2인 특정 실시양태에서, A q 는 A1, 및 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드에 연결되는 기이다.
예를 들어 q가 1인 특정 실시양태에서, 링커 기 L의 구조는 -A1-이고, A1은 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드 및 표적화 모이어티에 연결되는 기이다.
추가 실시양태에서, q는 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 또는 1 내지 10의 정수이다.
특정 실시양태에서, A1 내지 A q 는 각각 독립적으로 결합, CR L1 R L2 , O, S, SO, SO2, NR L3 , SO2NR L3 , SONR L3 , CONR L3 , NR L3 CONR L4 , NR L3 SO2NR L4 , CO, CR L1 =CR L2 , C≡C, SiR L1 CR L2 , P(O)OR L1 , P(O)OR L1 , NR L3 C(=NCN)NR L4 , NR L3 C(=NCN), NR L3 C (=CNO)NR L4 , 0-6개의 R L1 및/또는 R L2 기로 임의로 치환된 C3-11 시클로알킬, 0-6개의 R L1 및/또는 R L2 기로 임의로 치환된 C3-11 헤테로시클릴, 0-6개의 R L1 및/또는 R L2 기로 임의로 치환된 아릴, 0-6개의 R L1 및/또는 R L2 기로 임의로 치환된 헤테로아릴이고, 여기서 R L1 또는 R L2 는 각각 독립적으로, 다른 A 기에 연결되어 0-4개의 R L5 기로 추가로 치환될 수 있는 시클로알킬 및/또는 헤테로 시클릴 모이어티를 형성할 수 있다. 일부 경우에, R L1 , R L2 , R L3 , R L4 및 R L5 는 각각 독립적으로, H, 할로, C1-8 알킬, OC1-8 알킬, SC1- 8알킬, NHC1 - 8알킬, N(C1- 8알킬)2, C3- 11시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, C3-11헤테로시클릴, OC1- 8시클로알킬, S C1- 8시클로알킬, NH C1- 8시클로알킬, N(C1- 8시클로알킬)2, N (C1- 8시클로알킬) (C1- 8알킬), OH, NH2, SH, SO2 C1- 8알킬, P (O) (OC1- 8알킬) (C1- 8알킬), P(O) (O C1- 8알킬)2, CC -C1- 8알킬, CCH, CH=CH (C1- 8알킬), C (C1- 8알킬)=CH (C1- 8알킬), C(C1- 8알킬) = C (C1-8 알킬)2, Si(OH)3, Si (C1- 8알킬)3, Si (OH) (C1-8알킬)2, CO C1- 8알킬, CO2H, 할로겐, CN, CF3, CHF2, CH2F, NO2, SF5, SO2NHC1 - 8알킬, SO2N(C1-8알킬)2, SONHC1 - 8알킬, SON(C1-8알킬)2, CONHC1 - 8알킬, CON(C1-8알킬)2, N(C1-8알킬)CONH(C1-8알킬), N(C1-8알킬)CON(C1-8알킬)2, NHCONH(C1- 8알킬), NHCON (C1- 8알킬)2, NHCONH2, N(C1-8알킬)SONH(C1-8알킬), N(C1- 8알킬) SO2N(C1-8알킬)2, NHSONH(C1- 8알킬), NHSON(C1-8알킬)2, 또는 NHSO2NH2이다.
일부 실시양태에서, 링커는 알킬렌 사슬 또는 2가 알킬렌 사슬일 수 있으며, 이들 중 하나는 P(O)(OH)O-, -O-PO(OH)-O-, -O-, -S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -C(NOR')-, C(O)N(R')-, -C(O)N(R')C(O)-, -C(O)N(R)C(O)N(R')-, -N(R)C(O)-, -N(R)C(O)N(R)-, -N(R)C(O)O-, -OC(O)N(R)-, -C(NR)-, -N(R')C(NR')-, -C(NR')N(R)-, -N(R')C(NR)N(R')-, -S(O)2- -OS(O)-, -S(O)O- -S(O)-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -N(R)S(O)2-, -S(O)2N(R)-, -N(R')S(O)-, -S(O)N(R')-, -N(R)S(O)2N(R')-, -N(R)S(O)N(R)-, C1-C12카보시클렌, 3 내지 12원 헤테로시클렌, 5 내지 12원 헤테로아릴렌 또는 이들의 임의의 조합에 의해 개재되고/거나 (말단 중 하나 또는 둘 모두에서) 종결될 수 있으며, 여기서, R은 H 또는 C1-C12 알킬이고, 개재 기 및 종결기 하나 또는 둘 모두는 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 (말단 중 하나 또는 둘 모두에서) -P(O)(OH)O-, -O-PO(OH)-O-, -S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, - OC(O)O -, -C(NOR)-, -C(O)N(R')-, -C(O)N(R)C(O)-, -C(O)N(R)C(O)N(R')-, -N(R)C(O)-, -N(R')C(O)N(R)-, -N(R)C(O)O-, -OC(O)N(R)-, -C(NR')-, -N(R)C(NR')-, -C(NR')N(R)-, -N(R)C(NR')N(R)-, -S(O)2-, -OS(O)-, -S(O)O-, -S(O)-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -N(R)S(O)2-, -S(O)2N(R)-, -N(R')S(O)-, -S(O)N(R)-, -N(R)S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, C3-12 카보시클렌, 3 내지 12원 헤테로시클렌, 5 내지 12원 헤테로아릴렌 또는 이들의 임의의 조합으로 종결될 수 있는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있으며, 여기서, R은 H 또는 C1-C6 알킬이고, 종결기 하나 또는 둘 모두는 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 1-20개의 알킬렌 단위를 갖고 -O-, -NMe-, -PO(OH)-O-, -O-PO(OH)-O-, 에 의해 개재되거나 이로 종결되는 알킬렌 사슬이다.
일부 실시양태에서, 링커는 2-20개의 PEG 단위를 갖고 -O-, -NMe-, -PO(OH)-O-, -O-PO(OH)-O-, 로 개재되거나 이로 종결되는 폴리에틸렌 글리콜 링커이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)의 링커는 다음 구조 중 어느 하나로 나타낼 수 있다:
.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)의 링커는 LEF1 OP-V1의 맥락에서 나타낸 다음 링커 구조 중 어느 하나로 나타낼 수 있다:
프로테아제 리간드 및 E3 리가제 리간드
프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합하는 작용 모이어티이다. 프로테아제 리간드는 프로테아제와 결합할 수 있는 작용 모이어티로, 프로테아제가 PO와 근접하여 POI가 분해될 수 있도록 한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 리간드는 펩티드 또는 소분자이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 소분자는 프로테아제 리간드의 분자량이 약 900 D 미만, 적합하게는 약 800 D, 700 D, 또는 600 D 미만임을 의미한다.
E3 리가제 리간드는 E3 리가제에 결합하는 작용 모이어티이다. E3 리가제 리간드는 E3 리가제와 결합할 수 있는 작용 모이어티로, E3 리가제가 POI와 근접하여 POI가 분해될 수 있도록 한다. 일부 실시양태에서, E3 리가제 리간드는 펩티드 또는 소분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 소분자는 E3 리가제 리간드의 분자량이 약 900D 미만, 적합하게는 약 800D, 700D, 또는 600D 미만임을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물의 리간드 성분은 E3 리가제 리간드이다. E3 리가제 리간드는 E3 유비퀴틴 리가제에 결합하는 작용 모이어티이다. E3 유비퀴틴 리가제(인간에서 600개 이상이 알려져 있음)는 유비퀴틴화에 대한 기질 특이성을 부여한다. 이러한 리가제에 결합하는 리간드가 알려져 있다. 본원에 기재된 바와 같이, E3 유비퀴틴 리가제 결합 기는 E3 유비퀴틴 리가제에 결합할 수 있는 펩티드 또는 소분자이다. 특정 E3 유비퀴틴 리가제에는 폰 히펠-린다우(VHL: von Hippel-Lindau); 세레블론; XIAP; E3A; MDM2; 후기 촉진 복합체(APC: Anaphase-promoting complex); UBR5 (EDD1); SOCS/ BC-box/ eloBC/ CUL5/ RING; LNXp80; CBX4; CBLL1; HACE1; HECTD1; HECTD2; HECTD3; HECW1; HECW2; HERC1; HERC2; HERC3; HERC4; HUWE1; ITCH; EDD4; NEDD4L; PPIL2; PRPF19; PIAS1; PIAS2; PIAS3; PIAS4; RANBP2; R4; RBX1; SMURF1; SMURF2; STUB1; TOPORS; TRIP12; UBE3A; UBE3B; UBE3C; UBE4A; UBE4B; UBOX5; UBR5; WWPl; WWP2; 파킨; A20/TNFAIP3; AMFR/gp78; ARA54; 베타-TrCP1/BTRC; BRCA1; CBL; CHIP/STUB1; E6; E6AP/UBE3A; F-box 단백질 15/FBX015; FBXW7/Cdc4; GRAIL/RNF 128; HOIP/RNF31; cIAP-1/HIAP-2; cIAP-2/HIAP-l; cIAP(범용); ITCH/AIP4; KAPl; MARCH8; MIB1(Mind Bomb 1); MIB2(Mind Bomb 2); MuRF1/TRFM63 ; DFIP 1; EDD4; NleL; 파킨; R F2; R F4; RNF8; R F 168; R F43; SART1; Skp2; SMURF2; TRAF-1; TRAF-2; TRAF-3; TRAF-4; TRAF-5; TRAF-6; TRFM5; TRFM21; TRFM32; UBR5; 및 ZRF3이 포함된다.
일부 실시양태에서, 화학식 (IB)의 이작용성 화합물은 세레블론에 결합하는 E3 리가제 리간드를 포함한다. 세레블론에 결합하고 본원에 기재된 바와 같이 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드로 사용하기에 적합할 수 있는 리간드의 대표적인 예는 미국 특허 출원 공개 2018/0015085 또는 미국 특허 출원 공개 2018/0215731에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 (IB)의 이작용성 화합물은 세레블론에 결합하고 다음 구조 중 어느 하나로 나타낸 E3 리가제 리간드를 포함한다:
여기서 X는 결합, NH, O 또는 CH2이고, Y는 할로, 알킬, CN, CF3, OCF3 또는 OCHF2이다.
일부 실시양태에서, E3 리가제 리간드는 VHL(폰 히펠-린다우) 종양 억제인자에 결합한다. VHL에 결합하는 E3 리가제 리간드의 대표적인 예는 다음과 같다:
여기서 X는 결합, N, O 또는 C이다.
VHL에 결합하고 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)의 E3 리가제 리간드로서 사용하기에 적합할 수 있는 또 다른 E3 리가제 리간드는 WO2013/106643, 미국 특허 출원 공개 제2016/0045607호, WO2014/187777, 미국 특허 출원 공개 제2014/0356322호, 및 미국 특허 제9,249,153호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, E3 리가제 리간드는 아폽토시스 단백질 억제제(IAP)에 결합하고 다음 구조 중 어느 하나로 나타낸다:
.
IAP에 결합하고 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)의 E3 리가제 리간드로서 사용하기에 적합할 수 있는 또 다른 E3 리가제 리간드는 국제 특허 출원 공개 WO2008/128171, WO2008/016893, WO2014/060768, WO2014/060767, 및 WO2015092420에 개시되어 있다. IAP는 유비퀴틴-E3 리가제로서 기능을 하는 것으로 당업계에 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 (IB)의 이작용성 화합물은 MDM2(murine double minute 2)에 결합하고 다음 구조 중 어느 하나로 나타내는 E3 리가제 리간드를 포함한다:
MDM2에 결합하고 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)의 E3 리가제 리간드로서 사용하기에 적합할 수 있는 또 다른 E3 리가제 리간드는 WO2014/038606; WO2010/082612; WO2014/044401; WO2009/151069; WO2008/072655; WO2014/100065; WO2014/100071; WO2014/123882; WO2014/120748; WO2013/096150; WO2015/161032; WO2012/155066; WO2012/065022; WO2011/060049; WO2008/036168; WO2006/091646; WO2012/155066; WO2012/065022; WO2011/153509; WO2013/049250; WO2014/151863; WO2014/130470; WO2014/134207; WO2014/200937; WO2015/070224; WO2015/158648; WO2014/082889; WO2013/178570; WO2013/135648; WO2012/116989; WO2012/076513; WO2012/038307; WO2012/034954; WO2012/022707; WO2012/007409; WO2011/134925; WO2011/098398; WO2011/101297; WO2011/067185; WO2011/061139; WO2011/045257; WO2010/121995; WO2010/091979; WO2010/094622; WO2010/084097; WO2009/115425; WO2009/080488; WO2009/077357; WO2009/047161; WO2008/141975; WO2008/141917; WO2008/125487; WO2008/034736; WO2008/055812; WO2007/104714; WO2007/104664; WO2007/082805; WO2007/063013; WO2006/136606; WO2006/097261; WO2005/123691; WO2005/110996; WO2005/003097; WO2005/002575; WO2004/080460; WO2003/051360; WO2003/051359; WO1998/001467; WO2011/023677; WO2011/076786; WO2012/066095; WO2012/175487; WO2012/175520; WO2012/176123; WO2013/080141; WO2013/111105; WO2013/175417; WO2014/115080; WO2014/115077; WO2014/191896; WO2014/198266; WO2016/028391; WO2016/028391; WO2016/026937; WO2016/001376; WO2015/189799; WO2015/155332; WO2015/004610; WO2013/105037; WO2012/155066; WO2012/155066; WO2012/033525; WO2012/047587; WO2012/033525; WO2011/106650; WO2011/106650; WO2011/005219; WO2010/058819; WO2010/028862; WO2009/037343; WO2009/037308; WO2008/130614; WO2009/019274; WO2008/130614; WO2008/106507; WO2008/106507; WO2007/107545; WO2007/107543; WO2006032631; WO2000/015657; WO1998/001467; WO1997/009343; WO1997/009343; WO1996/002642; US2007/0129416; 문헌[Med. Chem. Lett, 2013, 4, 466-469; J. Med. Chem., 2015, 58, 1038-1052; Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (2015) 3621-3625]; 또는 문헌[Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 3310-3314]에 개시되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위해 고려되는 MDM2에 대한 소분자 결합 화합물의 추가의 구체적인 예에는 RG71 12, RG7388, MI 773/SAR 405838, AMG 232, DS-3032b, R06839921, RO5045337, RO5503781, 이다사누틀린, CGM-097, 및 MK-8242가 포함된다. MDM2는 유비퀴틴-E3 리가제로서 기능을 하는 것으로 당업계에 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)의 E3 리가제 리간드는 다음 구조 중 하나로 나타낸다:
약학 조성물
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB)의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 입체이성질체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다. 화학식 (IA) 또는 (IB)의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 단백질의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용하다. 이러한 약학 조성물은 전달 방식에 따라 제제화될 수 있다.
본원에 제공된 약학 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한 지 여부와 치료할 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 분무기에 의한 것을 포함하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해 국소, 폐로; 기관내, 비강내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구로 이루어질 수 있다. 비경구 투여에는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들어 실질내, 척수강내 또는 뇌실내 투여가 포함된다.
본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)은 간(예를 들어 간의 간세포)과 같은 특정 조직을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여를 위한 약학 조성물 및 제제에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 포함될 수 있다. 통상적인 약학 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 적합한 국소 제제에는 본원에 기재된 화학식 (IA) 또는 (IB)의 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)이 지질, 리포솜, 중합체 나노입자 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합되어 있는 것들이 포함된다. 적합한 지질 및 리포솜에는 중성(예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린) 음성(예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민. DOTMA)이 포함된다. 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)은 리포솜 내에 캡슐화될 수 있거나 이에, 특히 양이온성 리포솜에 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)은 지질, 특히 양이온성 지질과 복합체화될 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르에는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C O 알킬 에스테르(예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염이 포함되거나 이에 제한되지는 않는다. 국소 제제는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제6,747,014호에 상세히 기술되어 있다.
약학적으로 허용 가능한 염
일부 실시양태에서, 화학식 (IA) 또는 (IB)의 화합물의 염은 산과 화합물의 염기성 기, 예컨대 아미노 작용기, 또는 염기와 화합물의 산성 기, 예컨대 카르복실 작용기 사이에 형성된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 화합물은 약학적으로 허용 가능한 산 부가염이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (IA) 또는 (IB)의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 형성하기 위해 일반적으로 사용되는 산에는 이황화수소, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산뿐만 아니라 파라-톨루엔설폰산, 살리실산, 타르타르산, 비타르타르산, 아스코르브산, 말레산, 베실산, 푸마르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 포름산, 글루탐산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 락트산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산 및 아세트산과 같은 유기산 뿐만 아니라 관련 무기 및 유기산이 포함된다. 따라서 이러한 약학적으로 허용 가능한 염에는 설페이트, 피로설페이트, 비설페이트, 설파이트, 비설파이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 설포네이트, 자일렌 설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 및 기타 염이 포함된다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 산 부가염에는 염산 및 브롬화수소산과 같은 무기산으로 형성된 염, 특히 말레산과 같은 유기산으로 형성된 염이 포함된다.
일부 실시양태에서, 화학식 (IA) 또는 (IB)의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 형성하기 위해 일반적으로 사용되는 염기에는 나트륨, 칼륨 및 리튬을 비롯한 알칼리 금속의 수산화물; 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리 토금속의 수산화물; 알루미늄 및 아연과 같은 기타 금속의 수산화물; 암모니아, 유기 아민 예컨대 비치환 또는 히드록실 치환 모노-, 디- 또는 트리-알킬아민, 디시클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스- 또는 트리스-(2-OH-(C1-C6)-알킬아민), 예컨대 N,N-디메틸-N-(2-히드록시에틸)아민 또는 트리-(2-히드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 모르폴린; 티오모르폴린; 피페리딘; 피롤리딘; 및 아르기닌, 리신 등과 같은 아미노산이 포함된다.
일부 실시양태에서, 화학식 (IA) 또는 (IB)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 실질적으로 순수하다.
사용 방법
일부 측면에서, 화학식 (IA) 또는 (IB)의 이작용성 화합물은 이상(예를 들어, 상향조절과 같이 조절 장애) 단백질 활성에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료에 유용할 수 있다. 질환 또는 장애는 기능 장애 단백질 활성(예를 들어, 비병리학적 상태에 비해 단백질의 상승된 수준)을 특징으로 하거나 그에 의해 매개된다고 말할 수 있다. "질환"은 일반적으로 대상체가 항상성을 유지할 수 없고, 질환이 개선되지 않으면 대상체의 건강이 계속 악화되는 대상체의 건강 상태로 간주된다. 대조적으로, 대상체의 "장애"는 대상체가 항상성을 유지할 수 있지만 장애가 없을 때보다 대상체의 건강 상태가 덜 유리한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하면 장애가 반드시 동물의 건강 상태를 더 감소시키는 것은 아니다.
화학식 (IA) 또는 (IB)의 이작용성 화합물은 암, 자가면역 질환, 중추신경계(CNS) 질환, 대사 질환, 및 감염 질환의 치료에 유용할 수 있다.
본원에서 치료할 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예에는 편평세포암(예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암종 및 폐 편평 암종을 포함한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함한 위암(gastric 또는 stomach cancer), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 콩팥암 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종, 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.
본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)이 치료에 사용될 수 있는 자가면역 질환에는 류마티스 질환(예를 들어, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 루푸스, 예를 들어 전신 홍반 루푸스(SLE) 및 루푸스 신염, 다발성근염/피부근염, 한랭글로불린혈증, 항인지질 항체 증후군, 및 건선 관절염), 골관절염, 자가면역 위장관 및 간 장애(예를 들어 염증성 장질환(예를 들어, 궤양성 대장염 및 크론병), 자가면역 위염 및 악성 빈혈, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 및 셀리악병), 혈관염(예를 들어, 척-스트라우스 혈관염, 베게너 육아종증 및 다발 동맥염을 포함하는 ANCA 관련 혈관염), 자가면역 신경 장애(예를 들어 다발성 경화증, 안구간대경련-근간대경련　증후군, 중증근육무력증, 시신경척수염, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 자가면역 다발신경병증), 신장 장애(예를 들어 사구체신염, 굿파스처 증후군 및 버거병), 자가면역 피부 장애(예를 들어 건선, 두드러기(urticaria, hives), 심상성 천포창, 수포성 유천포창, 및 피부 홍반 루푸스 등), 혈액 장애(예를 들어, 혈소판 감소성 자반증, 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 수혈 후 자반증, 및 자가면역 용혈성 빈혈), 죽상경화증, 포도막염, 자가면역 청력 질환(예를 들어, 내이 질환 및 청력 상실), 베체트병, 레이노 증후군, 장기 이식 및 자가면역 내분비 장애(예를 들어, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)과 같은 당뇨병 관련 자가면역 질환, 애디슨병, 및 자가면역 갑상선 질환(예를 들어, 그레이브스병 및 갑상선염))이 포함된다. 보다 바람직한 이러한 질환에는 예를 들어 류마티스 관절염, 궤양성 대장염, ANCA 관련 혈관염, 루푸스, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, IDDM, 악성 빈혈, 갑상선염 및 사구체신염이 포함된다.
중추신경계(CNS) 질환에는 정신 장애(예를 들어, 공황 증후군, 일반 불안 장애, 모든 유형의 공포증 증후군, 조증, 조울증, 경조증, 단극성 우울증, 우울증, 스트레스 장애, PTSD, 신체형 장애, 성격 장애, 정신병, 및 정신분열증), 및 약물 의존(예를 들어, 알코올, 정신자극제(예를 들어, 크랙, 코카인, 스피드, 및 메스), 아편유사제, 및 니코틴), 간질, 두통, 급성 통증, 만성 통증, 신경병증, 뇌빈혈, 치매(알츠하이머형 포함), 운동 장애, 다발성 경화증이 포함된다.
대사질환은 대사과정의 장애를 말하며 다음 증상 중 하나 이상을 동반할 수 있다: 고혈압, 이상지질혈증과 함께 내장 비만, 혈청 포도당, 및 인슐린 수치의 증가. 이는 유전적인 효소 이상으로 인해 선천적일 수도 있고, 내분비 기관의 질병이나 췌장과 같은 대사적으로 중요한 기관의 부전으로 인해 후천적일 수도 있다. 대사 질환이라는 용어 내에서, "대사 증후군"이라는 용어는 관상동맥 질환, 뇌졸중 및 제2형 당뇨병과 함께 발생하고 이들의 발병 위험 증가와 관련된 증상 군의 이름이다. 대사증후군의 증상으로는 중심성 또는 복부 비만, 고혈압, 고중성지방, 인슐린 저항성, 낮은 HDL 콜레스테롤, 및 고혈당으로 인한 조직 손상이 포함된다.
감염성 질환은 하나 이상의 박테리아, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 원생동물, 하나 이상의 진균, 하나 이상의 기생충 또는 이들의 조합에 의해 유발된다.
또 다른 측면에서, 화학식 (IA) 또는 (IB)의 이작용성 화합물은 이상 단백질 활성에 의해 매개되는 질환 및 장애를 분석하거나 진단하는 방법에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 실시될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 생체 내에서 실시될 수 있다.
합성
본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 제공된 O'PROTAC)은 화학 분야에 잘 알려진 것과 유사한 공정을 포함하는 합성 경로에 의해 합성될 수 있다. 출발 물질은 일반적으로 Aldrich Chemicals와 같은 상용 공급원으로부터 입수 가능하거나 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 용이하게 제조된다.
일반적인 절차 및 실시예는 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 기재된 O'PROTAC)을 제조하기 위한 예시적인 방법을 제공한다. 당업자는 본원에 기재된 이작용성 화합물(예를 들어, 본원에 기재된 O'PROTAC)을 합성하기 위해 다른 합성 경로가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 출발 물질 및 시약이 반응식, 일반 절차 및 실시예에 도시되고 논의되어 있지만, 다른 출발 물질 및 시약은 쉽게 대체되어 다양한 유도체 및/또는 반응 조건을 제공할 수 있다. 또한, 기재된 방법에 의해 제조된 다수의 예시적인 화합물은 본 개시 내용에 비추어 당업자에게 잘 알려진 통상적인 화학을 사용하여 추가로 변형될 수 있다.
일반적으로, 제조는 통상적인 고상 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 이중체의 2개의 단일 가닥 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 합성하는 것으로 이루어진다. 정제 후 2개의 뉴클레오티드가 이중체로 어닐링된다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 잘 알려진 절차에 따라 뉴클레오티드를 포스포라미다이트 시약과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 다음 합성 경로는 변형된 뉴클레오티드를 제조하는 예시적인 방법을 설명하며, 링커는 이전에 설명된 바와 같으며 이 합성 예에 제한되지 않는다.
a. 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드를 링커 및 E3 리가제 리간드에 연결하기 위해 포스포라미다이트 1을 사용하여 제조될 수 있다.
b. 뉴클레오티드는 먼저 포스포라미다이트 2와 반응한 다음 아미드 축합에 의해 화합물 6과 커플링할 수 있다.
c. 뉴클레오티드는 먼저 포스포라미다이트 3과 반응한 다음 아미드 축합에 의해 화합물 5와 커플링할 수 있다.
d. 뉴클레오티드는 먼저 포스포라미다이트 7과 반응한 다음 클릭 반응에 의해 화합물 5와 커플링할 수 있다.
e. 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 8, 9)는 올리고뉴클레오티드 서열에 직접 추가될 수 있다.
[도 19]를 참조하면, 표적화 모이어티 (i)(예를 들어, 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드)는 히드록실기를 포함할 수 있다. 따라서, 표적화 모이어티는 히드록실기와 반응성인 포스핀 모이어티를 포함하는 시약 (ii)과 반응할 수 있다. 화합물 (i) 및 (ii)의 반응은 예를 들어 조립 완충액에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 화합물 (ii)를 아세토니트릴 중 5-(에틸티오)-1H-테트라졸(EET)과 혼합하여 3차 아민을 양성자화한 후, 화합물 (i)에 과량을 첨가하여 화합물 (iii)을 생성할 수 있다. 생성된 보호된 포스페이트 화합물을 추가로 탈보호하여 화합물 (A)를 얻을 수 있다. 예를 들어, 화합물 (iii)을 진한 수성 암모니아와 혼합하고 가열하여 탈보호 화합물 (iii)인 화합물 (A)를 생성할 수 있다.
[도 20]을 참조하면, 일반식 OH-Aq-RG1을 갖는 화합물로부터, 예를 들어 이 화학식을 Cl-PO(시아노에틸)NiPr2와 반응시켜 포스핀 화합물을 얻은 다음, 적절한 보호기로 RG1 기를 보호시킴으로써, 시약 (iv)을 제조할 수 있다. 이어서, 화학식 (iv)의 화합물을 화학식 (i)의 화합물과 커플링시켜 포스페이트 화합물 (v)을 얻을 수 있다. 포스페이트 화합물 (v)은 추가로 탈보호될 수 있다. 탈보호 반응은 포스페이트로부터 시아노에틸 보호기와 RG1로부터 PG기를 동시에 제거할 수 있다. 예를 들어, 진한 수성 암모니아를 첨가하고 이어서 반응물을 가열함으로써 탈보호를 수행할 수 있다.
일부 경우에, 탈보호 조건은 시아노에틸기를 먼저 제거한 후 PG 기를 제거하거나, PG 기를 먼저 제거한 후 포스페이트에서 시아노에틸기를 제거하도록 선택될 수 있다. 그 후 탈보호된 반응성 화합물 (vi)을 프로테아제 리간드 함유 시약 또는 E3 리간드 함유 시약 (vii)과 커플링시켜 최종 화합물 A를 얻을 수 있다. 이 커플링 반응에서, RG1 기와 RG2 기가 반응하여 A 기를 형성한다. 예를 들어, RG1이 아미노기이고 RG2 기가 반응하면 C(O)NH인 A기가 형성된다. 또 다른 예에서, RG1 기가 알킨이고 RG2 기가 아지드인 경우 트리아졸인 A 기가 형성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여 사용되는 용어 "Cn -m 알킬"은 직쇄 또는 분지형일 수 있고 n 내지 m개의 탄소를 갖는 포화 탄화수소 기를 지칭한다. 알킬 모이어티의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, 이소부틸, sec-부틸과 같은 화학 기; 2-메틸-1-부틸, n-펜틸, 3-펜틸, n-헥실, 1,2,2-트리메틸프로필 등과 같은 고급 동족체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자, 1 내지 4개의 탄소 원자, 1 내지 3개의 탄소 원자, 또는 1 내지 2개의 탄소 원자를 함유한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "헤테로아릴"은 황, 산소 및 질소로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자 고리 구성원을 갖는 단환식 또는 다환식 방향족 헤테로사이클을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 고리는 질소, 황 및 산소로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자 고리 구성원을 갖는다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 모이어티에서 임의의 고리 형성 N은 N-옥시드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 질소, 황 및 산소로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자 고리 구성원을 갖는 5원 내지 10원 단환식 또는 이환식 헤테로아릴이다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 질소, 황 및 산소로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자 고리 구성원을 갖는 5-6 단환식 헤테로아릴이다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 5원 또는 6원 헤테로아릴 고리이다. 5원 헤테로아릴 고리는 1개 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 고리 원자가 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택되는 5개의 고리 원자를 갖는 고리를 갖는 헤테로아릴이다. 예시적인 5원 고리 헤테로아릴은 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 테트라졸릴, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,3,4-트리아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 및 1,3,4-옥사디아졸릴이다. 6원 헤테로아릴 고리는 1개 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 고리 원자가 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택되는 6개의 고리 원자를 갖는 고리를 갖는 헤테로아릴이다. 예시적인 6원 고리 헤테로아릴은 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 트리아지닐, 및 피리다지닐이다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "화합물"은 도시된 구조의 모든 입체이성질체, 기하이성질체, 호변이성질체 및 동위원소를 포함하는 것을 의미한다. 본원에서 이름 또는 구조에 의해 하나의 특정한 호변이성체 형태로 식별되는 화합물은 달리 명시되지 않는 한 다른 호변이성체 형태를 포함하도록 의도된다.
본원에 기재된 화합물은 비대칭일 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 입체중심을 가짐). 달리 명시하지 않는 한 거울상이성질체 및 부분입체 이성질체와 같은 모든 입체 이성질체가 의도된다. 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 함유하는 본원에 기재된 화합물은 광학 활성 또는 라세미 형태로 단리될 수 있다. 예를 들어, 라세미 혼합물의 분해 또는 입체선택적 합성에 의해, 광학적으로 비활성인 출발 물질로부터 광학적으로 활성인 형태를 어떻게 제조하는 지에 대한 방법은 해당 분야에 알려져 있다. 올레핀, C=N 이중 결합, N=N 이중 결합의 많은 기하 이성질체 등도 본원에 기재된 화합물에 존재할 수 있으며, 이러한 안정한 이성질체는 모두 고려된다. 본원에 기재된 화합물의 시스 및 트랜스 기하 이성질체는 이성질체의 혼합물로서 또는 분리된 이성질체 형태로서 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물은 (R)-배열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물은 (S)-배열을 갖는다.
본원에 제공된 화합물에는 호변이성체 형태도 포함된다. 호변이성체 형태는 양성자의 동시 이동과 함께 단일 결합이 인접한 이중 결합으로 교환되어 발생한다. 호변이성질체 형태에는 동일한 실험식과 총 전하를 갖는 이성질체 양성자화 상태인 양성자성 호변이성질체가 포함된다. 양성자성 호변이성체의 예에는 케톤-에놀 쌍, 아미드-이미드산 쌍, 락탐-락팀 쌍, 에나민-이민 쌍, 및 양성자가 헤테로시클릭 시스템, 예를 들어 1H- 및 3H-이미다졸, 1H-, 2H- 및 4H- 1,2,4-트리아졸, 1H- 및 2H-이소인돌, 1H- 및 2H-피라졸의 2개 이상의 위치를 차지할 수 있는 환형 형태가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 호변이성체 형태는 평형 상태에 있거나 적절한 치환에 의해 입체적으로 하나의 형태로 고정될 수 있다.
프탈산 기반 PROTAC
일부 경우에, 본원에 제공된 화합물은 화학식 (IA)의 프로테아제 리간드 또는 화학식 (IB)의 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드가 프탈산 또는 3-아미노프탈산을 기반으로 하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 화학식 (IB)의 E3 리가제 리간드는 다음일 수 있다:
여기서, 각각의 X는 결합, NH, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 Y는 할로, 알킬, CN, CF3, OCF3, 및 OCHF2로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 R은 H 및 C1-8 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 이러한 E3 리가제 리간드는 세레블론에 결합하는 능력을 가질 수 있다.
화학식 (IA)의 프로테아제 리간드 또는 화학식 (IB)의 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드가 프탈산 또는 3-아미노프탈산을 기반으로 하는 경우, 표적화 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 표적 단백질에 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있거나 표적 단백질에 결합하는 임의의 다른 적절한 분자(예를 들어, 뉴클레오티드가 없는 분자)일 수 있다. 화학식 (IA)의 프로테아제 리간드 또는 화학식 (IB)의 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드가 프탈산 또는 3-아미노프탈산을 기반으로 하는 일부 경우에, 표적화 모이어티는 표적 단백질을 인식하고 이에 결합하는 임의의 구조를 가질 수 있다. 화학식 (IA)의 프로테아제 리간드 또는 화학식 (IB)의 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드가 프탈산 또는 3-아미노프탈산을 기반으로 하는 일부 경우에, 표적화 모이어티는 표적 단백질을 인식하고 이에 결합하는 폴리펩티드 또는 단백질의 결합 도메인일 수 있다. 화학식 (IA)의 프로테아제 리간드 또는 화학식 (IB)의 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드가 프탈산 또는 3-아미노프탈산을 기반으로 하는 일부 경우에, 표적화 모이어티는 표적 단백질 활성의 억제제(예를 들어, 키나아제 억제제, HDAC 억제제, 또는 혈관신생 억제제)일 수 있다. 화학식 (IA)의 프로테아제 리간드 또는 화학식 (IB)의 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드가 프탈산 또는 3-아미노프탈산을 기반으로 하는 일부 경우에, 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 소분자일 수 있다. 화학식 (IA)의 프로테아제 리간드 또는 화학식 (IB)의 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드가 프탈산 또는 3-아미노프탈산을 기반으로 하는 일부 경우에, 표적화 모이어티는 면역억제 화합물일 수 있다. 화학식 (IA)의 프로테아제 리간드 또는 화학식 (IB)의 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드가 프탈산 또는 3-아미노프탈산을 기반으로 하는 일부 경우에, 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합하는 소분자일 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이며, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 포스포라미다이트 P1-6의 합성
[표 1]
포스포라미다이트 1-6의 합성
[반응식 1] P1-6의 합성a
a시약 및 조건: (a) DIPEA, NMP, MW, 100℃, 3 h; (b) Cl-POCENiPr2, DIPEA, DCM, 2 h, 실온. (c) HATU, TEA, DMF, 실온; (d) Ac2O, DMAP, DCM, 1 h; (e) TBAF, THF, 실온.
화합물 8a-c의 합성: 화합물 4-플루오로-탈리도마이드(1.0 당량)를 NMP에 용해시키고, DIPEA(2.0 당량) 및 7a-c(1.5 당량)를 첨가하고, 혼합물을 마이크로파 조건하에서 3시간 동안 100℃로 가열하였다. 이어서, 혼합물을 규조토에 흡수시키고 역상 플래시 크로마토그래피(H2O:MeOH=90:10 내지 50:50)로 정제하여 화합물 8a-c를 제공하였다.
2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일)-4-((5- 히드록시펜틸 )아미노) 이소인돌린 -1,3-디온 (8a): 황색 고체, 65%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.16 (s, 1H), 7.49 (dd, J = 8.5, 7.1 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 12.1, 5.4 Hz, 1H), 3.66 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 3.28 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.93 - 2.67 (m, 3H), 2.12 (ddd, J = 9.6, 5.8, 2.9 Hz, 1H), 1.75 - 1.66 (m, 2H), 1.64 - 1.59 (m, 2H), 1.54 - 1.46 (m, 2H).
2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일)-4-((2-(2-(2- 히드록시에톡시 ) 에톡시 )에틸)아미노)이소인돌린-1,3-디온 (8b): 황색 오일, 40%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.31 (s, 1H), 7.48 (dd, J = 8.5, 7.2 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 11.9, 5.3 Hz, 1H), 3.76 - 3.70 (m, 4H), 3.69 - 3.64 (m, 4H), 3.62 - 3.58 (m, 2H), 3.47 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.90 - 2.65 (m, 3H), 2.15 - 2.07 (m, 1H).
2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일)-4-((2-(2-(2-(2- 히드록시에톡시 ) 에톡시 ) 에톡시 )에틸)아미노)이소인돌린-1,3-디온 (8c): 황색 오일, 30%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.08 (s, 1H), 7.63 - 7.55 (dd, J = 8.5, 7.0 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.60 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 13.0, 5.4 Hz, 1H), 4.55 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 3.62 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.59 - 3.43 (m, 12H), 3.39 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.94 - 2.82 (m, 1H), 2.56 (dd, J = 19.8, 10.4 Hz, 2H), 2.08 - 1.96 (m, 1H).
화합물 P1-3의 합성: 화합물 8a-c(1.0 당량)를 무수 DCM에 용해시키고, DIPEA(2.0 당량) 및 Cl-POCENiPr2(1.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피(헥산:액톤(5%TEA)=100:0 내지 75:25)로 정제하여 생성물 P1-3을 제공하였다.
2- 시아노에틸 (5-((2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일)-1,3- 디옥소이소인돌린 -4-일)아미노)펜틸) 디이소프로필포스포라미다이트 (P1): 황색 오일, 65%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.08 (s, 1H), 7.57 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.04 (dd, J = 12.4, 4.5 Hz, 1H), 3.78 - 3.65 (m, 2H), 3.64 - 3.45 (m, 4H), 2.95 - 2.82 (m, 1H), 2.74 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.63 - 2.52 (m, 2H), 2.02 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 1.59 (s, 4H), 1.42 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 1.15 (dt, J = 13.9, 7.3 Hz, 12H).
2-시아노에틸 (2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸) 디이소프로필포스포라미다이트 (P2): 황색 오일, 68%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.08 (s, 1H), 7.61 - 7.54 (dd, J = 8.6, 7.1 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.60 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 12.9, 5.4 Hz, 1H), 3.79 - 3.66 (m, 2H), 3.61 (m, 2H), 3.59 - 3.50 (m, 10H), 3.47 (dd, J = 11.0, 5.4 Hz, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.75 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.63 - 2.52 (m, 2H), 2.06 - 1.99 (m, 1H), 1.12 (dd, J = 6.7, 3.7 Hz, 12H).
2-시아노에틸 (2-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)에틸) 디이소프로필포스포라미다이트 (P3): 황색 오일, 48%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.08 (s, 1H), 7.58 (dd, J = 8.5, 7.2 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.60 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 12.9, 5.4 Hz, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.76 - 3.67 (m, 3H), 3.66 - 3.59 (m, 3H), 3.59 - 3.50 (m, 8H), 3.50 - 3.37 (m, 4H), 2.94 - 2.82 (m, 1H), 2.75 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.63 - 2.53 (m, 2H), 2.06 - 1.98 (m, 1H), 1.15 - 1.07 (m, 12H).
화합물 8d-f의 합성: 화합물 VHL-032(1.0 당량)를 DCM 및 DMF(1:1)에 용해시키고, TEA(3.0 당량), 7d-f(1.5 당량), 및 HATU(1.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액을 DCM으로 희석하고, NaHCO3 용액으로 세척하였다. 유기상을 농축하고 플래시 크로마토그래피(DCM:MeOH = 100:0 내지 98:2)로 정제하여 화합물 8d-f를 제공하였다.
(2S,4R)-1-((S)-2-(6-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산아미도)-3,3-디메틸부타노일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (8d) : 백색 발포형 고체, 70%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.72 (s, 1H), 7.64 (dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 4H), 7.44 - 7.32 (m, 10H), 6.08 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.70 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.56 (dd, J = 15.0, 6.6 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.33 (dd, J = 15.0, 5.2 Hz, 1H), 4.11 - 4.05 (m, 1H), 3.61 (m, 3H), 2.57 - 2.49 (m, 4H), 2.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.13 - 2.03 (m, 1H), 1.63 - 1.50 (m, 4H), 1.41 - 1.30 (m, 2H), 1.05 - 1.00 (m, 9H), 0.92 (s, 9H).
(2S,4R)-1-((S)-14-(tert-부틸)-2,2-디메틸-12-옥소-3,3-디페닐-4,7,10-트리옥사-13-아자-3-실라펜타데칸-15-오일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (8e): 무색 오일, 62%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.72 (s, 1H), 7.69 - 7.63 (m, 4H), 7.44 - 7.28 (m, 10H), 4.73 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.54 (m, 2H), 4.43 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 15.0, 5.3 Hz, 1H), 4.12 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 3.99 (q, J = 15.8 Hz, 2H), 3.80 (dd, J = 7.8, 3.3 Hz, 2H), 3.71 - 3.54 (m, 7H), 2.56 (m, 1H), 2.51 (s, 3H), 2.14 - 2.06 (m, 1H), 1.06 - 1.00 (m, 9H), 0.92 (s,9H).
(2S,4R)-1-((S)-17-(tert-부틸)-2,2-디메틸-15-옥소-3,3-디페닐-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자-3-실라옥타데칸-18-오일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (8f): 무색 오일, 60%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (s, 1H), 7.69 - 7.64 (m, 4H), 7.43 - 7.32 (m, 10H), 4.72 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.53 (m, 2H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.33 (dd, J = 15.0, 5.3 Hz, 1H), 4.08 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 4.03 - 3.91 (m, 2H), 3.79 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.68 - 3.55 (m, 11H), 2.56 - 2.48 (m, 4H), 2.15 - 2.06 (m, 1H), 1.03 (d, J = 2.9 Hz, 9H), 0.94 (s, 9H).
화합물 9a-c의 합성: 화합물 8d-f(1.0 당량)를 DCM에 용해시키고 0℃로 냉각시킨 후 TEA(1.5 당량) 및 DMAP(0.01 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 Ac2O(1.5 당량)를 천천히 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 물로 세척하고, 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(DCM:MeOH = 100:0 내지 98:2)로 정제하여 화합물 9a-c를 제공하였다.
(3R,5S)-1-((S)-2-(6-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산아미도)-3,3-디메틸부타노일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (9a): 백색 발포형 고체, 90%.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.89 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 7.6, 1.3 Hz, 4H), 7.43 - 7.32 (m, 10H), 7.18 - 7.13 (m, 1H), 6.04 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.37 (s, 1H), 4.70 - 4.65 (m, 1H), 4.62 - 4.50 (m, 2H), 4.34 (dd, J = 14.9, 5.3 Hz, 1H), 4.05 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 3.84 - 3.76 (m, 1H), 3.63 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.71 (m, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.17 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.57 (m, 4H), 1.36 (m, 2H),1.03 (s, 9H), 0.89 (s, 9H).
(3R,5S)-1-((S)-14-(tert-부틸)-2,2-디메틸-12-옥소-3,3-디페닐-4,7,10-트리옥사-13-아자-3-실라펜타데칸-15-오일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (9b): 무색 오일, 92%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.76 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 4H), 7.43 - 7.30 (m, 10H), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.36 (s, 1H), 4.73 - 4.67 (m, 1H), 4.56 - 4.47 (m, 2H), 4.33 (dd, J = 14.9, 5.4 Hz, 1H), 4.05 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 3.99 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 3.84 - 3.75 (m, 3H), 3.70 - 3.56 (m, 7H), 2.77 - 2.69 (m, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.15 (m, 1H), 2.03 (s, 3H), 1.03 (s, 9H), 0.90 (s, 9H).
(3R,5S)-1-((S)-17-(tert-부틸)-2,2-디메틸-15-옥소-3,3-디페닐-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자-3-실라옥타데칸-18-오일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (9c): 무색 오일, 87%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.75 (s, 1H), 7.69 - 7.64 (m, 4H), 7.43 - 7.31 (m, 10H), 7.23 (dd, J = 14.1, 7.4 Hz, 2H), 5.36 (s, 1H), 4.71 (dd, J = 8.2, 6.6 Hz, 1H), 4.57 - 4.49 (m, 2H), 4.34 (dd, J = 14.9, 5.4 Hz, 1H), 4.05 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 3.98 (d, J = 4.3 Hz, 2H), 3.80 (dd, J = 11.0, 5.8 Hz, 3H), 3.70 - 3.61 (m, 8H), 3.57 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.77 - 2.68 (m, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.20 - 2.13 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.06 - 1.01 (s, 9H), 0.91 (s, 9H).
화합물 10a-c의 합성: 화합물 9a-c(1.0 당량)를 THF에 용해시키고 TBAF(THF 중 1M, 2.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 플래시 크로마토그래피(DCM:MeOH = 100:0 내지 97:3)로 정제하여 화합물 10a-c를 제공하였다.
(3R,5S)-1-((S)-2-(6-히드록시헥산아미도)-3,3-디메틸부타노일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (10a): 백색 고체, 60%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.75 (s, 1H), 7.40 - 7.32 (m, 4H), 7.20 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.37 (m, 1H), 4.73 - 4.65 (m, 1H), 4.57 (dd, J = 14.9, 6.6 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 14.9, 5.2 Hz, 1H), 4.07 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 11.6, 4.6 Hz, 1H), 3.66 - 3.57 (m, 2H), 2.75 - 2.66 (m, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.19 (m, 3H), 2.05 (s, 3H), 1.64 (m, 2H), 1.60 - 1.51 (m, 2H), 1.47 (m, 2H), 0.90 (s, 9H).
(3R,5S)-1-((S)-2-(2-(2-(2-히드록시에톡시)에톡시)아세트아미도)-3,3-디메틸부타노일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (10b): 백색 고체, 68%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.72 (s, 1H), 7.54 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.37 (s, 4H), 7.16 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.40 (m, 1H), 4.66 (dd, J = 8.2, 6.7 Hz, 2H), 4.57 (dd, J = 14.8, 6.6 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 14.8, 5.4 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 16.1, 5.5 Hz, 1H), 3.98 - 3.90 (m, 2H), 3.83 (dd, J = 11.8, 4.7 Hz, 1H), 3.78 - 3.56 (m, 9H), 2.75 - 2.67 (m, 1H), 2.53 (d, J = 3.3 Hz, 3H), 2.18 (m, 1H), 2.04 (d, J = 2.5 Hz, 3H), 0.92 (s, 9H).
(3R,5S)-1-((S)-2-(tert-부틸)-14-히드록시-4-옥소-6,9,12-트리옥사-3-아자테트라데카노일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (10c): 무색 오일, 52%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.72 (s, 1H), 7.50 (dd, J = 11.1, 5.3 Hz, 1H), 7.39 - 7.28 (m, 5H), 5.39 (m, 1H), 4.69 (dd, J = 8.1, 6.4 Hz, 1H), 4.57 (m, 2H), 4.33 (dd, J = 14.9, 5.3 Hz, 1H), 4.02 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.84 (dd, J = 11.6, 4.9 Hz, 1H), 3.72 - 3.62 (m, 10H), 3.60 (m, 1H), 3.56 (m, 1H), 3.54 - 3.48 (m, 1H), 3.47 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 2.74 - 2.65 (m, 1H), 2.53 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 2.21 - 2.12 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 0.93 (s, 9H).
화합물 P4-6의 합성 : 화합물 10a-c(1.0 당량)를 무수 DCM에 용해시키고, DIPEA(2.0 당량) 및 Cl-POCENiPr2(1.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피(헥산:액톤(5%TEA)=100:0 내지 60:40)로 정제하여 생성물을 무색 오일로 제공하였다.
(3R,5S)-1-((2S)-2-(6-(((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파네일)옥시)헥산아미도)-3,3-디메틸부타노일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (P4): 무색 오일, 60%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.68 (s, 1H), 7.36 (q, J = 8.1 Hz, 4H), 7.19 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 6.01 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.37 (m, 1H), 4.74 - 4.68 (m, 1H), 4.60 - 4.49 (m, 2H), 4.34 (dd, J = 14.7, 5.1 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 3.87 - 3.73 (m, 3H), 3.69 - 3.53 (m, 4H), 2.74 (m, 1H), 2.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.52 (d, J = 0.6 Hz, 3H), 2.19 (m, 3H), 2.05 (s, 3H), 1.60 (m, 4H), 1.42 - 1.35 (m, 2H), 1.16 (q, J = 6.0 Hz, 12H), 0.89 (s, 9H).
(3R,5S)-1-((2S)-2-(2-(2-(2-(((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파네일)옥시)에톡시)에톡시)아세트아미도)-3,3-디메틸부타노일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (P5): 무색 오일, 67%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.67 (s, 1H), 7.36 (q, J = 8.2 Hz, 4H), 7.26 - 7.22 (m, 1H), 7.19 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.37 (m, 1H), 4.72 (dd, J = 8.0, 6.7 Hz, 1H), 4.59 - 4.48 (m, 2H), 4.35 (dd, J = 14.9, 5.3 Hz, 1H), 4.07 - 4.02 (m, 1H), 4.00 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 3.91 - 3.76 (m, 4H), 3.75 - 3.64 (m, 7H), 3.59 ( m, 2H), 2.79 - 2.70 (m, 1H), 2.66 - 2.61 (m, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.21 - 2.12 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.19 - 1.14 (m, 12H), 0.91 (s, 9H).
(3R,5S)-1-((2S)-2-(tert-부틸)-14-(((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파네일)옥시)-4-옥소-6,9,12-트리옥사-3-아자테트라데카노일)-5-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-3-일 아세테이트 (P6): 무색 오일, 40%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.68 (s, 1H), 7.36 (q, J = 8.1 Hz, 4H), 7.25 - 7.17 (m, 2H), 5.37 (m, 1H), 4.75 - 4.69 (m, 1H), 4.59 - 4.49 (m, 2H), 4.36 (dd, J = 14.9, 5.3 Hz, 1H), 4.07 - 4.02 (m, 1H), 4.00 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 3.90 - 3.75 (m, 4H), 3.75 - 3.53 (m, 13H), 2.80 - 2.71 (m, 1H), 2.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.16 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.21 - 1.14 (m, 12H), 0.92 (s, 9H).
변형체의 합성
a시약 및 조건: (a) DIPEA, NMP, MW, 100℃, 3 h; (b) Cl-POCENiPr2, DIPEA, DCM, 2 h, rt. (c) HATU, TEA, DMF, 실온; (d) Ac2O, DMAP, DCM, 1 h; (e) TBAF, THF, 실온; (f) N-히드록시숙신이미드, EDCI, DCM, 하룻밤, 실온. (g) MsCl, TEA, DCM, rt; (h) NaN3, MeOH/H2O, 70℃.
화합물 5a-5c의 합성: 화합물 4-플루오로-탈리도마이드(1.0 당량)를 DMA에 용해시키고, DIPEA(2.0 당량) 및 화합물 1g-i(1.5 당량)를 첨가하고, 혼합물을 밀봉된 튜브에서 100℃로 하룻밤 가열하였다. 이어서, 혼합물을 농축하고 역상 플래시 크로마토그래피(H2O:MeOH=100:0 내지 50:50)로 정제하여 화합물 5a-5c를 제공하였다.
4-((2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일)-1,3- 디옥소이소인돌린 -4-일)아미노)부탄산 (5a): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.10 (s, 1H), 7.58 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.66 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 12.8, 5.1 Hz, 1H), 3.31 (m, 2H), 2.94 - 2.81 (m, 1H), 2.64 - 2.51 (m, 2H), 2.30 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.02 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 1.78 (m, 2H).
7-((2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일)-1,3- 디옥소이소인돌린 -4-일)아미노)헵탄산 (5b): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.00 (s, 1H), 11.10 (s, 1H), 7.58 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.54 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 12.9, 5.2 Hz, 1H), 3.31 - 3.24 (m, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.55 (m, 2H), 2.20 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.07 - 1.97 (m, 1H), 1.61 - 1.44 (m, 4H), 1.32 (m, 4H).
2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일)-4-((3-히드록시프로필)아미노) 이소인돌린 -1,3-디온 (5c): 황색 고체, 60%. 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.15 (s, 1H), 7.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.92 (dd, J = 11.9, 5.1 Hz, 1H), 3.82 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.44 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.93 - 2.66 (m, 3H), 2.16 - 2.07 (m, 1H), 1.96 - 1.87 (m, 2H).
화합물 mc4 및 mc5의 합성: 화합물 5a 또는 5b(1.0 당량) 및 N-히드록시숙신이미드(1.5 당량)를 DCM에서 혼합하고, 0℃로 냉각시킨 후, EDCI(1.3 당량)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응물을 DCM으로 희석하고 H2O 및 염수로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축하여 mc4 및 mc5를 황색 고체로 제공하였다.
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)부타노에이트 (mc4): 88%; LC-MS (ESI+): m/z 457.2 [M + H+]
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 7-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)헵타노에이트 (mc5): 85%; LC-MS (ESI+): m/z 499.3 [M + H+]
화합물 mc6 및 mc7의 합성: 화합물 5c 또는 8을 DCM에 용해시키고, TEA(2.0 당량) 및 MsCl(1.2 당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물에 물을 첨가한 후, DCM으로 추출하고, 유기상을 건조시키고 농축하였다. 잔류물을 DCM MeOH/H2O에 용해시키고 NaN3를 첨가한 후, 혼합물을 70℃로 하룻밤 가열하였다. 용매를 제거하고 잔류물에 물을 첨가한 후 EA로 2회 추출하였다. 유기상을 농축하고 플래시 크로마토그래피(DCM: EA=100:0 내지 85:15)로 정제하여 화합물 mc6 및 mc7을 제공하였다.
4-((3- 아지도프로필 )아미노)-2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일) 이소인돌린 -1,3-디온 ( mc6 ): 황색 고체, 30%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.07 (s, 1H), 7.52 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.29 (s, 1H), 4.92 (dd, J = 11.9, 5.2 Hz, 1H), 3.47 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.80 (m, 3H), 2.19 - 2.08 (m, 1H), 1.92 (m, 2H).
4-((5- 아지도펜틸 )아미노)-2-(2,6- 디옥소피페리딘 -3-일) 이소인돌린 -1,3- 디온 ( mc7 ): 황색 고체, 46%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.17 (s, 1H), 7.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 4.91 (dd, J = 12.0, 5.3 Hz, 1H), 3.30 (m, 4H), 2.93 - 2.67 (m, 3H), 2.17 - 2.08 (m, 1H), 1.68 (m, 4H), 1.50 (m, 2H).
변형된 역방향 가닥의 합성
올리고뉴클레오티드의 합성
본 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 ExonanoRNA 회사(미국 오하이오주 콜럼버스 소재)에서 합성하고 역상-HPLC 정제하였다. Xcalibur 시스템을 갖춘 Novatia, LLC 회사의 LC-MS로 질량 및 순도(>95%)를 확인하였다.
어닐링 반응
단일 가닥 및 역방향 올리고뉴클레오티드를 조립 완충액(10 mM Tris-HCl [pH7.5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 혼합하고, 90℃로 5분간 가열한 후, 1시간 이내에 천천히 37℃로 냉각시켰다. 이중 가닥 O'PROTAC을 잘 혼합하고 분취하여 향후 사용을 위해 -20℃에 보관하였다.
예시적인 O'PROTAC
[표 2]
세포 배양 및 형질 감염
PC-3, DU145, VCaP 및 293T 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. 293T 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 유지시켰고, PC-3 및 DU145 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 유지시켰으며, VCaP 세포는 15% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 유지시켰다. 제조사의 지시에 따라 O'PROTAC과 혼합된 Lipofectamine 2000을 사용하여 세포를 일시적으로 형질감염시켰다.
웨스턴 블롯
세포 용해물에 SDS-PAGE를 시행하고, 단백질을 니트로셀룰로오스 막(GE Healthcare Sciences)으로 옮겼다. 막을 5% 무지방 우유와 0.1% Tween-20이 함유된 Tris 완충 식염수(TBS, pH 7.4)에서 차단시키고, 0.1% Tween-20이 함유된 TBS로 2회 세척하고 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 관심 단백질은 ECL 화학발광 시스템(Thermo Fisher)을 사용하여 시각화하였다.
실시예 2: ERG O'PROTAC
ERG 전사 인자는 ETS 패밀리에 속하며 뼈 발달, 조혈, 혈관 신생, 혈관 형성, 염증, 이동 및 침습에 관여한다(Oncogene 2016;35:403-14). 특히, ERG 단백질은 원발성 및 전이성 전립선암을 포함하여 모든 인간 전립선암 사례의 약 50%에서 과발현되는데, 대부분은 ERG 유전자와 안드로겐 반응성 TMPRSS2 유전자 프로모터의 융합에 기인한다. TMPRSS2 -ERG 융합 유전자는 손상되지 않은 DNA 결합 도메인과 전사활성화를 포함하는 절단형 ERG의 비정상적인 과발현을 초래하며, 이는 절단되었으나 완전히 기능하는 ERG의 발현 증가가 전립선암 진행을 촉진하는 핵심 인자임을 의미한다(Am J Surg Pathol. 2007; 31:882-8). 따라서 전립선암 환자를 효과적으로 치료하기 위해서는 ERG를 표적화하는 치료법이 시급히 필요하다.
세포 내 ERG의 단백질 수준에 대한 ERG O'PROTAC의 효과를 평가하기 위해, 293T 세포를 HA-ERG 플라스미드 및 비오틴-표지된 O'PROTAC으로 100 nM에서 48시간 동안 형질감염시켰다. 그런 다음 웨스턴 블롯팅으로 ERG 단백질 수준을 측정하였다. 놀랍게도, 매우 낮은 농도의 포말리도마이드가 부착된 ERG O'PROTAC-31, 32 및 33으로 처리할 때 ERG 단백질 수준의 유의미한 하향조절이 관찰되었지만, VH 032와 접합된 ERG O'PROTAC 34, 35 및 36으로 형질감염된 세포에서는 효과적으로 검출되지 않았다(도 2b). 또한, 비오틴 풀다운 분석을 사용하여 상당량의 이소성으로 발현된 HA-ERG가 비오틴-표지된 ERG O'PROTAC 31 및 32에 의해 효과적으로 풀다운되었지만 다른 ERG O'PROTAC에서는 효과가 없거나 덜 효과적이었는데(도 4). 이는 이 두 O'PROTAC이 예상대로 ERG 단백질에 효과적으로 결합할 수 있음을 나타낸다. 이는 ERG O'PROTAC 31 및 32가 조사된 다른 ERG O'PROTAC에 비해 ERG 단백질 분해에 더 큰 영향을 미친다는 관찰에 대한 그럴듯한 설명을 제공할 수 있다. 흥미롭게도 보다 안정적인 삼원 복합체에는 5개의 탄소 원자와 같은 짧은 링커가 선호되었다.
내인성 ERG 단백질 수준에 대한 세포 효과를 추가로 조사하기 위해, ERG O'PROTAC을 TMPRSS2-ERG 융합을 보유하는 ERG 과발현 인간 전립선암 세포주(VCaP 세포)에서 테스트하였다. 293T 세포애서의 효과와 유사하게, ERG O'PROTAC 31 및 32로 VCaP 세포를 처리하면 내인성 전장(FL) ERG 및 TMPRSS2-ERG(T2-ERG) 단백질의 수준이 효과적으로 감소하였다(도 2c). 중요한 것은 ERG O'PROTAC에 의해 유도된 ERG 단백질의 하향조절이 프로테아좀 억제제 MG132로 세포를 처리함으로써 완전히 차단되었다는 것인 데(도 3). 이는 ERG O'PROTAC이 ERG 단백질의 프로테아좀 분해를 유도한다는 것을 시사한다. 추가 시간 경과 결과에 따르면 ERG O'PROTAC은 조사된 12시간부터 시작하여 48시간까지 효과적이었다(도 5a). [도 3]에 나타난 결과와 일관되게, 용량별 실험에서는 100 nM의 ERG O'PROTAC 31이 ERG 단백질 수준을 상당히 억제하는 결과를 가져왔으며 이 효과는 500 nM 및 1,000 nM과 같은 더 높은 농도에서는 명백히 개선되지 않는 것으로 나타났는데, 이는 ERG 31의 효과가 고농도에서 포화될 수 있음을 나타낸다(도 5b f). 또한 ERG O'PROTAC 31로 VCaP 세포를 처리하면 ADAM19, MMP3, MMP9, PLAT 및 PLAU를 포함한 ERG 표적 유전자의 mRNA 발현이 억제되었는데(도 5c), 이는 ERG O'PROTAC이 VCaP 전립선암 세포에서 ERG 전사 활성을 억제한다는 것을 시사한다.
실시예 3: LEF -1 O'PROTAC
LEF1은 전사 인자 패밀리, 즉 β-카테닌과 중요한 전사 복합체로 간주되는 림프구 강화 인자/T 세포 인자(LEF/TCF)에 속한다(Nature, 1996, 382(6592): p. 638-42). LEF1은 특히 전립선암의 성장 및 침습 능력을 조절하는 데 있어서 전립선암의 발달과 관련이 있다(Oncogene, 2006, 25(24): p. 3436-44; Cancer Res, 2009, 69(8): p. 3332-8). 따라서, LEF1의 억제는 전립선암과 같은 암 치료의 중요한 표적이 되고 있다.
PC-3 전립선암 세포주에서 각 LEF1 O'PROTAC의 분해 능력을 평가하였다. LEF1 단백질의 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 활용하였다. LEF1 O'PROTAC 54로 형질감염된 PC-3 세포에서 LEF1의 발현이 감소되었으며(도 6), 이는 LEF1 O'PROTAC 54가 LEF1 단백질 분해에 효과적임을 시사한다.
다음으로, LEF1 O'PROTAC이 카테닌/LEF1의 전사 활성에 미치는 영향을 조사하였다. LEF1 O'PROTAC 54로 PC-3 전립선암 세포를 처리하면 카테닌/LEF1의 두 표적 유전자인 CCND1 및 c- MYC의 mRNA 발현이 용량 의존적으로 하향조절되었다(도 7a, b). LEF1 O'PROTAC 54 처리는 LEF1의 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았지만 PC-3에서 LEF1 단백질과 그 표적 단백질 사이클린 D1의 발현을 현저하게 감소시켰다(도 7a). 중요한 것은 LEF1 O'PROTAC 54 처리가 시간 및 용량 의존 방식으로 PC-3 세포의 성장을 유의하게 억제했다는 것이다(도 7a, c). 다른 전립선암 세포주 DU145에서도 유사한 결과를 얻었다(도 7d-f).
실시예 4: LEF1 OP-V1은 생체 내에서 전립선암 종양 성장을 억제한다
LEF OP-V1의 효과를 생체 내에서 추가로 조사하였다. PC-3 및 DU145 세포를 SCID 마우스에 피하 주사하여 PC-3 및 DU145 이종이식 종양을 생성하였다. 양전하를 띤 폴리에틸렌이민(PEI) 축합 DNA 올리고 기반 O'PROTAC으로 마우스를 처리함으로써, LEF1 OP-V1이 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 대조군 OP 처리와 비교하여 마우스에서 PC-3 및 DU145 종양 성장을 효과적으로 억제한다는 것이 입증되었다(도 8a-8d). LEF1 OP-V1 투여 후 마우스의 체중 감소에 대한 뚜렷한 효과는 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다(도 8e). 반대로, LEF1 OP-V1의 처리로 종양 중량이 크게 감소하였으며(도 8f), 이는 종양 성장에 대한 LEF1 OP-V1의 억제 효과가 마우스에서 O'PROTAC의 일반적인 독성으로 인해 발생하지 않았음을 의미한다. 종양 성장에 대한 LEF1 OP-V1의 효과와 일관되게, LEF1 OP-V1 처리는 LEF1 단백질을 감소시키고 종양에서 LEF1/β-카테닌 표적 유전자 발현을 억제하였다(도 8g 및 8h). 중요한 것은 LEF1 OP-V1 처리가 본 발명자들이 조사한 PC-3 종양에서 Ki67 발현을 크게 방해하였으며 세포 사멸에 대한 LEF1 OP-V1의 눈에 띄는 효과가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다는 것이다(도 8i 및 8j). 이러한 결과는 LEF1 O'PROTAC이 LEF1 단백질을 효과적으로 고갈시키고 생체 내에서 전립선암 세포 성장을 억제할 수 있음을 시사한다.
실시예 5: ERG O'PROTAC은 시험관 내에서 전립선암 세포 성장을 억제하고 세포 침윤을 감소시킨다
4개의 ERG 포말리도마이드 기반 PROTAC(OP-C-N1, OP-C-N2, OP-C-A1 및 OP-C-A2라고 함)은 NHS-에스테르 및 아지드 중간체의 합성과 NHS-에스테르 변형 및 클릭 반응 각각을 통한 올리고뉴클레오티드의 통합에 따라 생성하였다(도 9a 및 표 3).
ERG OP-C-N1 및 ERG OP-C-A1은 VCaP 세포에서 ERG 단백질을 분해하였다(도 9b). 추가 조사를 위해 ERG OP-C-N1을 선택하였다(도 9c). 동역학 실험은 ERG OP-C-N1이 시간 및 용량 의존 방식으로 ERG 단백질을 효과적으로 분해한다는 것을 보여주었다(도 10a 및 10b). 또한, ERG OP-C-N1의 DC50은 182.4nM이었다(도 10c 및 10d). ERG OP-C-N1이 시험관 내에서 ERG에 결합할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, VCaP 세포의 핵 추출물을 사용하여 EMSA를 수행하였다. 비오틴-표지된 ERG OP-C-N1은 VCaP 핵 추출물과 함께 인큐베이션한 후 DNA-단백질 복합체(DPC)를 형성한다는 것이 입증되었다. 이 결합은 경쟁적 비오틴-비표지된 ERG OP-C-N1을 추가하여 제거되었다(도 9d). ERG 항체를 첨가하면 DPC의 슈퍼시프트가 발생하였으며(도 9e), 이는 검출된 DPC에 ERG 단백질이 포함되어 있음을 나타낸다. 또한, ERG OP-C-N1에 의한 ERG 단백질의 불안정화는 MG132(도 9f) 및 포말리도마이드(도 9g)를 사용한 전처리에 의해 제거되었다. 다음으로, ERG OP-C-N1 처리가 ERG 단백질의 폴리유비퀴틴화를 증가시키는 것으로 나타났다(도 9h 및 9i).
ERG OP-C-N1의 항-세포 효과를 확인하기 위해, ERG OP-C-N1 처리 후 VCaP 세포에 대한 3D 배양을 수행하였다. 3D 배양 직경의 정량화는 ERG OP-C-N1이 시험관 내에서 VCaP 세포 성장을 억제한다는 것을 보여주었다(도 10j 및 10k). 더욱이, 세포 침습 분석은 ERG OP-C-N1의 처리가 VCaP 세포의 침습 능력을 감소시키는 것으로 나타났다(도 9l 및 9m). 따라서, 시험관 내에서 ERG 단백질을 분해하고 암세포 성장을 억제할 수 있는 생체 활성 ERG O'PROTAC이 식별되었다.
[표 3]
세포 배양 및 형질 감염
RWPE-1, C4-2, LNCaP, 22Rv1, VCaP, PC-3 및 DU145 전립선암 세포주와 293T 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. BPH1 세포주와 LAPC4 세포주는 얻었다. 293T 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 유지시켰다. RWPE-1 세포는 0.05 mg/mL 소 뇌하수체 추출물, 5 ng/mL 표피 성장 인자, 및 100 U/mL 페니실린-100 μg/mL 스트렙토마이신 혼합물이 보충된 각질세포 무혈청 배지에서 배양하였다. VCaP 세포는 15% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 배양하였다. LAPC4 세포는 10% FBS가 포함된 IMEM에서 배양하였다. 다른 모든 세포주는 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 유지시켰다. 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 2000 또는 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 세포를 O'PROTAC으로 일시적으로 형질감염시켰다.
웨스턴 블롯
세포 용해물에 SDS-PAGE에 시행하고 단백질을 니트로셀룰로오스 막(GE Healthcare Sciences)으로 옮겼다. 막을 5% 무지방 우유와 0.1% Tween-20을 함유한 Tris 완충 식염수(TBS, pH 7.4)에서 차단하고, 0.1% Tween-20을 함유한 TBS에서 2회 세척하고, 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 관심 단백질은 ECL 화학발광 시스템(Thermo Fisher)을 사용하여 시각화하였다.
비오틴 풀다운 분석
PC-3 세포를 PEI(Polysciences)를 사용하여 100 nM의 비오틴-표지된 LEF1 O' PROTAC OP-V1 내지 V3으로 36시간 동안 형질감염시켰다. 세포를 12시간 동안 MG132로 처리한 후 50 mM Tris-HCl(pH7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트 및 1% 프로테이나제 억제제를 함유하는 용해 완충액에서 용해시켰다. 세포 용해물을 Streptavidin Sepharose High Performance bead(GE Healthcare)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 결합 단백질을 용출 완충액으로 용출하고 웨스턴 블롯을 실시하였다.
RNA 추출 및 RT- qPCR
TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고 SuperScript III First-Strand Synesis System(Promega)을 사용하여 cDNA로 역전사하였다. iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 iQ Thermal cycler(Bio-Rad)에서 정량적 PCR(qPCR)을 수행하였다. 각 샘플은 3회 반복 수행하였으며 3회의 생물학적 반복을 수행하였다. △CT는 특정 유전자의 역치 차이를 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)에 대해 정규화하여 계산하였다. 프라이머 서열은 다음과 같이 나열되어 있다:
면역형광 세포화학 분석
PC-3 세포를 하룻밤 6웰 플레이트의 슬라이드에 접종하고 60-70% 합류점에 도달한 다음 LEF1 OP-V1(0 nM 또는 100 nM)으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 0.05% Triton X-100으로 투과화시켰다. 실온에서 1시간 동안 차단한 후, 세포를 4℃에서 하룻밤 LEF1 항체(#2230S, Cell Signaling Technology)로 면역블롯을 거쳤다. 세척 후 세포를 항-토끼 Alexa Fluor® 594(A-11012, Thermo Fishers)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 세척 후 DAPI가 함유된 대조염색 용액(H-1200, Vector Laboratories)을 사용하여 슬라이드에 장착하였다. 이미지는 LSM 780 공초점 현미경(Zeiss)으로 촬영하였다.
세포 성장 분석
세포 생존율은 제조사의 지침(Promega)에 따라 MTS 분석을 사용하여 측정하였다. PC-3 및 DU145 세포를 LEF1 OP-V1로 48시간 동안 형질감염시키고, 1,000개의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL의 배지와 함께 접종하였다. 세포가 플레이트에 부착된 후 지시된 시점에 세포 배양 배지를 1 x PBS로 교체하고 10 μL의 CellTiter 96R Aqueous One Solution Reagent(Promega)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 세포 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 각 웰에서 490 nm의 흡광도를 측정하였다.
핵 추출 및 전기영동 이동성 이동 분석( EMSA )
핵 단백질을 NE-PER™ 핵 및 세포질 추출 시약(카탈로그 번호 78833, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 추출하였다. EMSA는 비오틴-표지된 LEF1 또는 ERG OPROTAC을 프로브로 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 슈퍼시프트 분석을 위해 ERG 또는 LEF1 항체를 비오틴-표지된 OPROTAC 프로브와 혼합된 세포 핵 추출물에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션 한 후 6%의 비변성 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다.
3차원(3D) 배양
2만 개의 VCaP 세포를 250 μL 일반 배지에 재현탁하고 24웰 플레이트에서 Matrigel 매트릭스(BD Bioscience)의 얇은 층 상단에 접종하였다. 30분 후 세포가 가라앉으면 DMEM/F12 배지로 희석한 10% Matrigel 층으로 덮었다. 세포를 ERG OP-C-N1(200 nM)으로 형질감염시키고, 배지를 신선하고 따뜻한 DMEM/F12 + 10% FBS 배지로 2-3일마다 교체하였다.
마우스 이종이식 및 약물 처리
Matrigel 매트릭스(BD Bioscience)와 혼합된 3 x 106 PC-3 세포 또는 DU145 세포를 6주령 SCID 수컷 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 부피가 약 75 mm3에 도달하면 마우스를 무작위로 3개 군으로 나누어 격일로 꼬리 정맥 주사를 통해 1ХPBS, 대조군 OP 또는 LEF1 OP-V1(PEI 용액 중 10 mg/kg)로 처리하였다. 이종이식편의 부피와 마우스 체중을 3일마다 측정하였다. 18일(PC-3 종양의 경우) 또는 21일(DU145 종양의 경우) 처리 후, 마우스를 안락사시키고 체중 측정을 위해 이종이식편을 수거하였다. 조직의 한 부분은 IHC 분석을 위해 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE)였으며 나머지 조직은 각각 RT-qPCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위한 RNA 및 단백질 추출에 사용하였다.
면역조직화학(IHC)
IHC 분석을 위해 FFPE 이종이식 조직을 4 마이크로미터로 연속적으로 절단하였다. IHC 염색은 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다(Hong et al., Mol . Cell, 79:1008 (2020)).
통계 분석
단일 비교를 위해 단측 또는 양측 대응 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. P 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 표시된 모든 값은 평균 ± SD로 나타내었다.
실시예 6
디메틸 3-((5-(((2- 시아노에톡시 )( 디이소프로필아미노 ) 포스파네일 ) 옥시 )펜틸) 아미노) 프탈레이트의 합성
a시약 및 조건: a) 1. DMP, DCM; 2. 디메틸 3-아미노프탈레이트, NaBH(OAc)3, AcOH, DCM; b) Pd/C, H2, MeOH; c) Cl-POCENiPr2, DIPEA, DCM, 2 h, 실온(RT).
절차:
디메틸 3-((5-( 벤질옥시 ) 펜틸 )아미노) 프탈레이트 (2): 화합물 1(1.94 g, 10 mmol)을 DCM(30 mL)에 용해시킨 후, DMP(5.5 g, 13 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 흰색 고체를 여과하고 EA로 세척하였다. 여과액을 농축하였다. 잔류물을 Et2O에 용해시키고 물로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 잔류물을 DCM(30 mL)에 용해시킨 후, 디메틸 3-아미노프탈레이트(836 mg, 4 mmol) 및 3 방울의 AcOH를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, NaBH(OAc)3(1.22, 6 mol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 완료 후, 반응 용액을 DCM으로 희석하고 물로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(헥산:EA =100:0 내지 80:20)로 정제하여 생성물을 황색 오일(915 mg, 59.4%)로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35 - 7.30 (m, 6H), 6.80 (t, J = 1.1 Hz, 1H), 6.79 - 6.77 (m, 1H), 4.50 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.49 (t, J = 7.3, 2H), 3.16 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.71 - 1.63 (m, 4H), 1.53 - 1.47 (m, 2H).
디메틸 3-((5- 히드록시펜틸 )아미노) 프탈레이트 (3): 화합물 2(900 mg, 2.33 mmol)를 MeOH(15 mL)에 용해시킨 후, Pd/C(180 mg, 20 중량%)를 첨가하였다. 혼합물을 H2 대기 하에 실온에서 하룻밤 교반하였다. Pd/C를 여과하고 MeOH로 세척하였다. 여과액을 농축하고 플래시 크로마토그래피(헥산:EA =100:0 내지 65:35)로 정제하여 생성물을 황색 오일(530 mg, 77%)로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 - 7.27 (m, 1H), 6.77 (t, J = 1.5 Hz, 1H), 6.75 (m, 1H), 3.85 - 3.82 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.65 (t, J = 7.8, 2H), 3.16 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.67 (dd, J = 14.6, 7.2 Hz, 2H), 1.63 - 1.56 (m, 2H), 1.51 - 1.42 (m, 2H).
디메틸 3-((5-(((2- 시아노에톡시 )( 디이소프로필아미노 ) 포스파네일 ) 옥시 ) 펜틸 ) 아미노) 프탈레이트 (P2): 화합물 3(130 mg, 0.44 mmol)을 무수 DCM(5 mL)에 용해시키고 DIPEA(218 μL, 1.32 mmol) 및 Cl-POCENiPr2(147 μL, 0.66 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피(헥산:액톤(5%TEA)=100:0 내지 75:25)로 정제하여 생성물을 무색 오일(135 mg, 62%)로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.31 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.76 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 3.88 - 3.83 (m, 4H), 3.83 - 3.77 (m, 4H), 3.71 - 3.55 (m, 4H), 3.17 (dd, J = 12.3, 6.9 Hz, 2H), 2.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.66 (m, 4H), 1.54 - 1.46 (m, 2H), 0.92 - 0.83 (m, 12H).
실시예 7: 예시된 변형체
적절한 시판 출발 물질을 사용하여 실시예 6의 방법 및 절차에 따라 하기 화합물을 제조하였다.
실시예 8: ERG 단백질의 분해제로서 프탈산 기반 O'PROTAC의 개발
처음에 포스포라이다이트 화학을 사용하여 ERG를 표적화하기 위해 상이한 링커 길이를 가진 포말리도마이드- 및 VH032-기반 O'PROTAC(ERG OP-C1 내지 C3 및 OP-V1 내지 V3)을 구축하였다. VH032 기반 ERG O'PROTAC의 질량 분석 결과와 달리, 3개의 포말리도마이드 기반 ERG O'PROTAC의 질량 스펙트럼에서는 프탈이미드가 아닌 프탈산이 DNA 합성기의 주요 생성물인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 포말리도마이드가 일반적인 DNA 합성 동안 탈보호 조건에 잠재적으로 취약하였음을 시사한다(반응식 2A). O'PROTAC의 설계 및 구성은 표 4를 참조한다.
[반응식 2A 및 2B]
293T 세포를 ERG 발현 플라스미드로 형질감염시키고 3개의 조질 3-N-치환-아미노프탈산 기반 O'PROTAC(OP-C1 내지 C3) 중 하나로 처리한 경우, 그 중 2개(C1 및 C2)가 ERG 분해에서 강력한 활성을 나타냈다(도 11a). 대조적으로, VH032 기반 ERG O'PROTAC은 비활성이었다. 이 두 ERG O'PROTAC(C1 및 C2)은 TRMPRSS2-ERG 유전자 융합으로 인해 높은 수준의 내인성 ERG 단백질을 발현하는 전립선암 VCaP 세포에서 ERG 단백질을 효과적으로 감소시켰다(도 11b).
프탈산이 표적 단백질의 단백질 분해에 효과적인 O'PROTAC의 E3 리가제 동원자라는 가설을 테스트하기 위해 프탈산 디메틸 에스테르를 출발 물질로 사용하는 합성 경로를 적용하여 ERG O'PROTAC(OP-C-P1)을 합성하였다(반응식 2B). HPLC 및 질량 분석 데이터는 ERG OP-C-P1(프탈산-연결된 역방향 가닥 및 FITC-표지된 정방향 가닥으로 구성된 DNA 올리고 함유)이 고순도 및 예상 분자량으로 포스포라미다이트 화학에 의해 성공적으로 합성되었음을 나타냈다(도 11c, 11d, 21c, 및 21d). 추가 생화학적 및 기능적 연구에 이 ERG OP-C-P1(도 11e)을 사용하였다.
[표 4]
실시예 9: 프탈산 기반 ERG O'PROTAC은 ERG 프로테아좀 분해를 유도한다
프탈산 기반 ERG OP(순도가 높은 C-P1 및 순도가 낮은 C1)의 효능을 클릭 반응을 통해 합성된 2개의 포말리도마이드 기반 ERG O'PROTAC과 비교하였다. 이들 O'PROTAC의 형질감염 효율을 평가하는 데 FITC-표지된 ERG O'PRORAC를 사용하였다. 형광 현미경 분석에 따르면 프탈산 기반 ERG O'PROTAC은 293T 및 VCaP 세포주 모두에서 ERG O'PROTAC C-A1 및 C-N1만큼 효과적으로 형질감염되었다(도 12a, b).
웨스턴 블롯 분석에 따르면 OP-C-P1은 293T 세포에서 OP-C-A1 및 OP-C-N1보다 이소성으로 발현된 전장(FL) ERG 단백질의 하향조절에 대해 약간 더 강한 억제 효과를 나타냈으며(도 12c), VCaP 세포에서 내인성 FL ERG에 대해서도 유사한 결과를 얻었다(도 12d).
추가 분석에 따르면 이들 ERG OP는 TMPRSS2-ERG 유전자 융합에서 유래된 절단형 ERG T1/E4 및 FL ERG 둘 다의 mRNA 수준에 영향을 미치지 않았으며(도 12d 및 12e), 이는 ERG OP-C-P1이 ERG 발현을 전사 후 수준에서 억제함을 시사한다.
단백질 분해에 대한 OP-C-P1 효력의 동역학을 평가하였다. 시간 경과 연구에 따르면 OP-C-P1은 형질감염 후 24시간부터 ERG 단백질 발현을 억제하는 것으로 나타났다(도 12f). 용량별 실험에서는 OP-C-P1이 50 nM만큼 낮은 농도에서 ERG 단백질 수준의 극적인 감소를 유도한다는 사실이 추가로 밝혀졌다(도 12g). 훨씬 더 높은 농도(100 또는 500 nM)가 사용되어도 ERG 단백질 수준의 감소가 거의 없거나 추가로 증가하지 않았는데, 이는 세포 내 ERG OP-C-P1의 양이 포화되거나 세포에 의한 흡수가 형질감염 효율로 인해 제한될 수 있었음을 의미한다. 분해 농도(DC) 곡선은 OP-C-P1이 172.4 nM에서 ERG 단백질의 50%를 억제한다는 것을 입증하였다(도 12h).
실시예 10: 프탈산 기반 ERG OP는 프로테아좀 경로를 통해 ERG를 분해한다
프탈산 기반 ERG OP-C-P1에 의해 유도된 ERG 단백질 하향조절이 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해 경로를 통해 매개되는지 확인하기 위해 VCaP 세포를 먼저 OP-C-P1로 형질감염시키고 프로테아좀 억제제 MG132로 처리하였다. MG132 처리는 ERG 단백질의 분해를 완전히 차단하였으며(도 13a), 이는 ERG 분해가 프로테아좀 경로에 의존한다는 것을 시사한다. 한편, 유비퀴틴화 분석은 OP-C-P1의 처리가 각각 293T 및 VCaP 세포에서 외인성 및 내인성 ERG 모두의 유비퀴틴화 수준을 향상시키는 것으로 나타났다(도 13b 및 1c).
ERG OP-C-P1이 시험관 내에서 ERG에 결합할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, VCaP 세포의 핵 추출물을 사용하여 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)을 수행하였다. 비오틴-표지된 ERG OP-C-P1은 VCaP 세포의 핵 추출물에서 DNA-단백질 복합체(DPC)를 형성하였다. 이 결합은 경쟁적 비오틴-비표지된 ERG OP-C-P1의 첨가에 의해 중단되었다(도 13d). 또한, ERG 항체를 첨가하면 DPC의 슈퍼시프트가 발생하였으며(도 13e), 이는 검출된 DPC에 ERG 단백질이 포함되어 있음을 시사한다.
실시예 11: 프탈산 기반 ERG OP 유발 ERG 분해는 CRBN에 의해 매개된다
다음으로, OP-C-P1 매개 ERG 분해가 세레블론(CRBN)에 의존하는지 여부를 확인하기 위해 다음을 수행하였다. VCaP 세포에서 CRBN을 녹다운시키고, 세포를 OP-C-P1로 처리하였다. CRBN 녹다운은 OP-C-P1 유도 ERG 분해를 완전히 제거하였다(도 13f). 세레블론 리간드 포말리도마이드의 처리는 또한 OP-C-P1에 의해 유도된 ERG 단백질의 분해를 극복하였으며, 이 효과는 용량 의존적이었다(도 13g). 이러한 결과는 OP-C-P1 유발 ERG 분해가 CRBN E3 리가제를 통해 매개됨을 보여준다.
CRBN 단백질과 3-아미노프탈산 사이의 상호작용을 이해하기 위해, 3-N-치환 프탈산과 CRBN(PDB:4CI1)을 사용하여 도킹을 수행하였다. 프탈산의 상호작용은 탈리도마이드와 유사한 것으로 관찰되었다(도 22). 예를 들어, 1'-카르복실산 기는 소수성 포켓을 향해 배향되어 두 개의 강한 수소 결합을 형성하였다. 히드록시 기의 카르보닐 산소와 수소는 각각 TRP382와 HIS380의 백본과 상호작용하였다. 이러한 수소 결합 상호작용은 탈리도마이드의 글루타르이미드 기와 유사했으며, 여기서 상호작용은 두 카르보닐과 아미드 사이에서 잔기 HIS380 및 TRP382에 각각 발생하였다. 추가적으로, 다른 2'-카르복실산 기는 용매에 더 많이 노출된다. 벤젠과 카르복실산 사이의 C-C 결합의 유연성으로 인해 카르보닐 산소는 소수성 포켓을 향하여 위치하여 HIS380의 이미다졸 측쇄와 수소 결합을 유지할 수 있었다. 한편, 히드록시 기는 HIS359 측쇄와 약한 물 매개 수소 결합을 형성하였다. 탈리도마이드와 비교하여 프탈이미드는 완전히 용매에 노출되었으며 HIS359와 물 매개 수소 결합으로 수용되었다. 또한 TRP388의 인돌과 프탈산의 벤젠 고리 사이에 파이-파이 상호작용이 관찰되었다. 3-아미노기의 배향은 포말리도마이드 및 레날리도마이드와 유사하게 완전히 용매에 노출되었으며, 이는 잠재적인 탄두와 링커를 형성하는 데 크게 기여하였다. 이 결합 정보는 프탈산 기반 O'PROTAC이 포말리도마이드 기반 O'PROTAC과 비슷한 활성을 보였다는 관찰에 대한 설명을 제공하였다.
실시예 12: 프탈산 기반 ERG OP는 ERG 표적 유전자 발현과 세포 성장 및 침습을 약화시킨다
ERG OP-C-P1이 ERG 신호전달 경로에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, ERG 표적 유전자의 전사 수준을 평가하였다. OP-C-P1에 의한 ERG의 하향조절은 또한 ADAM19 , MMP3 , MMP9 , PLAT 및 PLAU를 포함하는 ERG 표적 유전자의 mRNA 발현을 상당히 감소시켰다(도 14a 및 14b). 세포 성장에 대한 OP-C-P1의 기능적 효과를 조사하기 위해, VCaP 세포를 사용하여 3차원(3D) 구형 형성 분석을 수행하였다. OP-C-P1 처리는 VCaP 세포 구체의 직경을 크게 감소시켰으며, 이는 OP-C-P1이 VCaP 세포 성장을 억제했음을 나타낸다(도 14c 및 1d). 세포 침습에 대한 ERG의 역할을 고려하여21, 이 ERG OP가 세포 침습에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 알아내기 위해 세포 침습 분석을 수행하였다. OP-C-P1 처리는 VCaP 세포의 침습 능력을 감소시켰다(도 14e 및 1f). 종합적으로, OP-C-P1 유발 ERG 분해는 ERG의 전사 활성과 전립선암 세포 성장 및 침습을 효과적으로 약화시킨다.
요약하면, 프탈산과 3-아미노프탈산이 CRBN 리가제의 리간드로 식별되었다. 프탈산 기반 ERG O'PROTAC은 유비퀴틴화-프로테아좀 경로를 통해 ERG의 단백질 수준을 유의하게 억제하고 세포 성장 및 침습에서 ERG 기능을 약화시켰다. 이 ERG O'PROTAC은 프탈산이 O'PROTAC에서 포말리도마이드와 마찬가지로 활발하게 기능을 한다는 명확한 증거를 제공한다. 이러한 결과는 이 CRBN 리간드가 핵산 결합제(예를 들어, 전사 인자)를 분해하기 위해 O'PROTAC을 설계하거나 핵산에 결합하지 않는 POI를 포함하여 임의의 적절한 POI를 분해하기 위해 표준 PROTAC을 설계하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 13
p53의 기능 획득 돌연변이체를 위한 DNA 결합 서열
기능 획득(GOF) 활성을 갖는 돌연변이 p53이 피리미딘 합성 유전자(PSG)의 게놈 유전자좌에 결합하는지 여부를 확인하기 위해 다음을 수행하였다. 이를 위해, VCaP 세포에서 p53 ChIP-seq를 수행하였고, 이 세포주에서 400개 이상의(n=416) p53 R248W 돌연변이체 결합 게놈 유전자좌가 식별되었다(표 5). DNA 결합 모티프 분석은 특정 전사 인자 결합 모티프가 일반적으로 풍부하지 않음을 보여주었다(도 15). GOF p53-결합 피크는 프로모터 및 비-프로모터 영역 모두에 국한되어 있었고 VCaP 세포의 PSG 유전자좌에는 아무것도 존재하지 않았으며(도 16a 및 표 5), 이는 p53 돌연변이체가 간접적인 메커니즘(들)을 통해 PSG 발현을 조절할 수 있음을 시사한다.
[표 5]
p53 돌연변이체 매개 PSG 발현의 기본이 되는 잠재적인 하류 이펙터(들)를 정의하기 위해, 경로 농축 분석을 수행하였고, Wnt 신호전달이 R248W 결합 표적 중에서 농축된 경로 중 하나인 것으로 밝혀졌다(도 16b 및 표 5). 구체적으로, Wnt 신호전달 경로의 핵심 성분인 β-카테닌을 코딩하는 CTNNB1 유전자의 프로모터에서 p53 돌연변이체(R248W) 결합 피크가 검출되었다(Clevers et al., Cell, 127:469-480 (2006))(도 16c). 비-프로모터 영역이 아닌 CTNNB1 유전자의 프로모터에서의 p53 R248W의 특이적 점유가 VCaP 세포에서 정량적 ChIP-PCR(ChIP-qPCR)에 의해 확인되었다(도 16d). WT 또는 GOF 돌연변이 p53을 발현하는 다양한 유방암 세포주에서 생성된 p53 ChIP-seq 데이터의 메타 분석(Zhu et al. Nature, 525:206-211 (2015))에서는 p53 R273H, R249S 및 R248Q 돌연변이체가 변함없이 CTNNB1 프로모터에 결합했지만 WT p53은 그렇지 않은 것으로 나타났다(도 17a).
CTNNB1 프로모터에서 GOF p53 돌연변이체에 의해 결합된 DNA 서열을 정의하기 위해, p53 R248W ChIP-qPCR 분석을 순차적 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다(도 16e). p53 R248W는 VCaP 세포에서 p53 돌연변이체 ChIP-seq 피크의 중앙(#2 앰플리콘)에 특이적으로 점유되어 있었다(도 16f). VCaP 세포 용해물을 사용하여 EMSA를 수행함으로써, 이는 CTNNB1 유전자 프로모터에서 25-bp p53 돌연변이체 결합 DNA 서열(MP53BS)로 더욱 좁혀졌다(도 16e 및 16g). 이 모티프는 WT p53 결합 컨센서스 서열과 대략 50%의 상동성을 공유하였으며, 마우스 Ctnnb1 프로모터와 거의 동일하였다(도 17c). 특히, KAT6A 및 KMT2A와 같이 이전에 보고된 것들을 포함하여 많은 다른 GOF p53-결합 암 관련 유전자의 프로모터에도 존재하는 CCCGCCC 코어 모티프가 있었다(Zhu et al., Nature 525(7568): 206-211 (2015))(도 17c 및 표 6). MP53BS의 EMSA 신호는 분석에 비표지된 프로브 또는 항-p53 항체를 추가함으로써 크게 감소되었으며(도 15h 및 17b), 이는 검출된 결합 신호가 p53 돌연변이체(R248W) 특이적임을 나타낸다. 세포핵 추출물을 사용하는 것 외에도, EMSA는 또한 R175H p53, C238Y p53, R248W p53, R273H p53, 및 Q331R p53를 포함하여 p53 WT의 DNA 결합 도메인(DBD) 내에 다양한 돌연변이, 및 WT p53(음성 대조군)를 함유하는 박테리아로부터 정제된 글루타티온-S 트랜스퍼라제(GST)-p53 재조합 단백질을 사용하여 수행하였다. WT 및 Q331R을 제외하고 p53의 모든 DBD 돌연변이체는 DNA 프로브에 결합하였으며(도 16i), 이는 p53의 DBD 돌연변이체가 CTNNB1 유전자 프로모터의 MP53BS에 직접 결합함을 시사한다.
[표 6]
염색질 면역침전( ChIP ) 및 ChIP - qPCR
VCaP 세포를 고정하고 다른 곳에 설명된 바와 같이 Bioruptor(Diagenode)에 의해 초음파 처리를 실시하였다(Zhang et al., Nat Med. 23(9): 1055-1062 (2017)). 상층액을 얻고 단백질 A/G 비드와 항-p53 또는 항-ERG 항체를 첨가하였다. 하룻밤 인큐베이션한 후, 비드를 세척하고 DNA를 포함하는 복합체를 65℃에서 용출하였다. 용출액은 RNAase 및 프로테이나제 K로 추가 처리하였다. 고처리량 시퀀싱 또는 정량적 PCR을 위해 농축된 DNA를 추출하였다.
ChIP-seq 분석을 위해, 시퀀싱 라이브러리는 다른 곳에 설명된 바와 같이 준비하였다(Zhang et al., Nat Med. 23(9): 1055-1062 (2017)). 고처리량 시퀀싱은 Genome Analysis Core의 Illumina HiSeq 4000 플랫폼에 의해 수행하였다. 원시 판독은 bowtie2(버전 2.2.9)를 사용하여 인간 참조 게놈(GRCh37/hg38)에 적용하였다. MACS2(버전 2.1.1)를 실행하여 p 값 임계값이 1 x 10-5인 피크 호출을 수행하였다. 시각화를 위해 UCSC Genome Browser를 사용하여 BigWig 파일을 생성하였다. 잠재적인 표적 유전자에 대한 피크 할당은 GREAT(Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool)에 의해 수행하였다. 마우스 전립선 조직에서 생성된 ERG ChIP-seq 데이터는 NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)에서 등록 번호 GSE47119로 다운로드하였다(Chen et al., Nat Med. 19(8): 1023-1029 (2013)). β-카테닌 ChIP-seq 데이터는 GEO에서 등록 번호 GSE53927로 다운로드하였으며(Watanabe et al., PloS one 9, e92317 (2014)), 유방암 세포주의 p53 ChIP-seq 데이터는 GEO에서 등록 번호 GSE59176으로 다운로드하였다( Zhu et al., Nature 525(7568): 206-211(2015)).
GST - 태그된 재조합 단백질 정제
야생형(WT) 및 돌연변이된 p53을 포함하는 GST-태그된 p53 발현 플라스미드를 이. 콜라이(E. coli) BL21에 형질전환시켰다. 성공적으로 형질전환된 BL21을 인큐베이터 진탕기에서 플라스크에 배양하고 18℃에서 하룻밤 100 μM IPTG(Sigma)로 처리하였다. 유도된 BL21을 수집하고 프로테아제 억제제(Sigma)가 포함된 용해 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0)에 재현탁하고 초음파 처리하였다. GST-p53(WT/돌연변이) 단백질을 농축하기 위해 글루타티온 아가로스(Thermo Fisher Scientific)를 첨가하였다. 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 중 10 mM 환원 글루타티온(Sigma)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 아가로스와 함께 인큐베이션하였다. 경쟁된 단백질을 원심분리기로 수집하고 추가 사용을 위해 -80℃에 보관하였다.
핵 추출 및 전기영동 이동성 이동 분석( EMSA )
이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 사용 전 상용 키트(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 89818)를 사용하여 프로브로서 비오틴으로 표지하였다. 표지된 프로브를 NE-PER™ 핵 및 세포질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 78833)을 사용하여 VCaP 세포로부터 제조된 핵 추출물 또는 제조사가 제공하는 프로토콜에 따른 정제된 GST-p53 단백질(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 20148)과 함께 인큐베이션하였다. 슈퍼시프트 분석을 위해, 항-p53 항체를 비오틴-표지된 프로브와 혼합된 세포 핵 추출물에 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 6%의 비변성 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다.
실시예 14: ERG/ GOF p53 돌연변이 PCa에서 β-카테닌 - LEF / TCF 복합체의 치료적 표적화
O'PROTAC은 LEF1 단백질을 표적화하여 파괴하도록 설계하였다. β-카테닌은 DNA 결합 파트너인 LEF1 및 TCF1, TCF3 및 TCF4를 포함한 기타 LEF/TCF 패밀리 단백질과 단백질 복합체를 형성하여 표적 유전자를 트랜스활성화한다(Hrckulak et al., Cancers, 8:70 (2016)). ERG/기능 획득(GOF) p53 돌연변이 PCa 세포에서 β-카테닌의 비정상적인 상향조절은 이 세포 유형이 LEF1 O'PROTAC의 항암 효능을 테스트하기 위한 이상적인 모델을 나타냄을 시사한다. LEF1 OP-V1은 VCaP 세포에서 LEF1 단백질을 제거하였고, TCF3 및 TCF4 단백질을 어느 정도 하향조절하였는데, 이는 LEF/TCF 단백질 패밀리의 구성원이 동일한 핵심 DNA 서열 TCAAAG에 결합한다는 관찰 결과와 일치한다(도 18a 및 18b). TCF1은 VCaP 세포에서는 거의 검출되지 않았기 때문에 조사하지 않았다. 유전자형-조직 발현(GTEx) RNA-seq 데이터는 TCF1 발현이 전립선 조직에서 검출되지 않음을 보여주었다(www. proteinatlas.org/). 중요하게는, 이 LEF1/TCF O'PROTAC은 또한 배양물에서 피리미딘 합성 효소 단백질의 발현과 VCaP 세포의 성장을 억제하였다(도 18b 및 18c).
다음으로, ERG/GOF p53 돌연변이 PCa 오르가노이드와 PDX를 사용하여 LEF1/TCF O'PROTAC의 항암 효능을 확인하기 위해 다음을 수행하였다. LuCaP 23.1 PDX 및 이의 안드로겐 비의존성(거세 저항성) 하위계열 LuCaP23.1AI는 TMPRSS2 -ERG 양성이고 TP53의 한 대립유전자가 결실된 것으로 보고되었다(Kumar et al., PNAS, 108:17087 (2011)). 모 LuCaP 23.1 PDX 종양은 p53 DBD에 C238Y 돌연변이를 보유하는 것으로 밝혀졌다(도 18d). p53 C238Y 돌연변이체가 CTNNB1 프로모터의 MP53BS에 결합하였다는 EMSA 결과(도 16i)와 일치하여, p53 KD는 LuCaP23.1 PDX 유래 오가노이드(PDXO)에서 β-카테닌 단백질 발현을 크게 감소시켰으며(도 18e), 이는 LuCaP23.1이 β-카테닌-LEF/TCF 경로 억제의 항암 효능을 테스트하기 위한 이상적인 모델 시스템임을 강조한다.
LEF1/TCF O'PROTAC 처리는 주요 피리미딘 합성 효소 단백질의 발현을 억제할 뿐만 아니라 LuCaP23.1 PDXO의 성장을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 18f-18h). 가장 중요하게는, 이 효과는 dTTP/dCTP의 보충에 의해 거의 완전히 역전되었지만 dATP/dGTP의 보충에 의해서는 그렇지 않았으며(도 18g 및 18h), 이는 LEF1/TCF O'PROTAC의 항암 효과가 주로 피리미딘 합성의 억제를 통해 매개되었음을 시사한다. 대조군 OP 또는 비히클의 효과와 비교하여, LEF1/TCF O'PROTAC의 처리는 마우스 체중의 명백한 감소를 전혀 유발하지 않으면서 LuCaP23.1 PDX 종양의 성장을 현저하게 차단하였다(도 18i-18l). 면역조직화학(IHC) 및 웨스턴 블롯 분석에서 LEF1/TCF O'PROTAC은 LEF1 및 기타 LEF/TCF 단백질과 UMPS 및 RRM1과 같이 조사된 피리미딘 합성 효소의 발현을 감소시켰을 뿐만 아니라 Ki67 양성 세포 수를 크게 감소시킨 것으로 나타났다(도 18m 및 18n). 이러한 결과는 O'PROTAC을 사용하여 TCF/LEF 단백질을 표적화하여 β-카테닌 및 PSG 발현을 억제하면 TMPRSS2 -ERG 융합 및 GOF p53 돌연변이가 있는 PCa의 성장을 효과적으로 차단할 수 있음을 보여준다.
세포 및 오가노이드 배양
VCaP, DU145, LNCaP 및 293T 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. DU145 및 LNCaP 세포를 10% 우태 혈청(FBS)(Gbico)이 함유된 RPMI 1640 배지(Corning)에서 배양하였다. VCaP 및 293T 세포를 10% FBS(Millipore)가 보충된 DMEM 배지(Corning)에서 성장시켰다. 모든 세포는 5% CO2가 공급되는 37℃에서 인큐베이션하였다. 후속 실험에 앞서 세포를 플라스모신(Invivogene)으로 처리하여 마이코플라스마를 박멸하였다.
오가노이드는 다른 곳에서 설명된 방법을 사용하여 LuCaP 23.1 환자 유래 이종이식편(PDX)으로부터 생성하였다(Drost et al., Nature Protocols, 11:347-358 (2016)). 간략하게, 오가노이드를 다른 인자가 보충된 FBS 무함유 DMEM/F-12 배지와 혼합된 40 μL Matrigel(Sigma)에서 배양하였다.
형질감염 및 렌티바이러스 감염
제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific) 또는 폴리에틸렌이민(PEI)(Polysciences, 카탈로그 번호 23966)을 사용하여 지시된 플라스미드로 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 렌티바이러스 패키지의 경우, Lipofectamine 2000을 사용하여 psPAX2, pMDG.2 및 shRNA에 대한 플라스미드로 293T 세포를 공동 형질감염시켰다. 바이러스가 함유된 상층액을 48시간 후에 수거하고 0.45 μm 필터(Millipore)로 여과한 후 세포에 추가하였다. 지시된 세포를 폴리브렌(5 μg/mL)(Millipore) 존재 하에 바이러스 함유 상청액와 합하고 1 μg/mL 퓨로마이신(Selleck)으로 선별하였다.
세포 성장 분석
VCaP 세포를 96웰 플레이트에 웰당 5,000개 세포의 밀도로 하룻밤 접종하였다. 지시된 시점에서 세포 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 MTS(Promega)와 함께 인큐베이션한 후 세포의 광학 밀도(OD)를 마이크로타이터 판독기(Biotek)로 490 nm에서 측정하였다. CP-2, ICG-001 또는 PRI-724로 처리하기 위해 세포를 96웰 플레이트에 하룻밤 접종한 후 지시된 화합물을 첨가하였다. OD 값은 지시된 시점에서 측정하였다.
헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 면역조직화학(IHC)
지시된 마우스의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 전립선 조직에서 4 μm 절편을 연속적으로 절단하였다. 조직은 자일렌으로 파라핀을 제거한 후 100%, 95%, 70% 에탄올과 물을 통해 차례로 재수화하였다. 헤마톡실린 염색 및 Scott's Bluing 용액(40.1 g MgSO4-7H2O, 2g 탄산수소나트륨, 1L H2O) 세척 후 조직을 1% 에오신으로 대비염색하였다. 95% 에탄올로 세척한 후, 조직을 95% 및 100% 에탄올로 탈수시켰다. 마지막으로 염색된 조직을 자일렌에 넣고 커버슬립을 장착하였다.
IHC의 경우, 다른 곳에 설명된 바와 같이 조직을 재수화하고 내인성 퍼옥시다제 활성을 파괴하고 항원을 회수하였다(Blee et al., Clin . Cancer Res., 24:4551 (2018)). IHC에 대한 항체는 다음과 같다: 항-AR(ab108341, Abcam), 항-ERG(ab92513, Abcam), 항-Ki67(ab15580), 항-UMPS(NOVUS, #85896), 항-RRM1(Cell signaling technology, #8637), 항-CBP(Santa Cruz Biotechnology, sc-583), 및 항-LEF1(Cell signaling technology, #2230S). 정량화를 위해, 양성 세포의 백분율을 곱하여 염색 점수를 결정하였으며 강도는 1(약한 염색), 2(중간 염색), 3(강한 염색) 범위였다. Ki67 정량화를 위해, 핵에 양성 염색이 있는 세포를 포함시켜 Ki67 양성 염색 세포의 백분율을 계산하였다.
실시예 15: 프로그래밍 가능한 O'PROTAC : 올리고뉴클레오티드 기반 PROTAC에 의한 DNA 결합 단백질의 파괴
요약
전사 인자(TF)를 포함한 DNA 결합 단백질은 매력적인 치료 표적의 큰 레퍼토리로 간주되는 정상적인 기관 발달 및 암, 심혈관 질환 및 비만과 같은 질환의 발병 과정에서 유전자 전사와 DNA 복제 및 복구에 필수적인 역할을 한다. 그러나 이 단백질 군은 효소 촉매 부위나 리간드 결합 포켓이 없기 때문에 일반적으로 약물 치료 가능성이 없는 것으로 간주된다. PROTAC(PROteolytic-TArgeting Chimera) 기술은 프로테아좀 분해를 위해 관심 단백질(POI)을 E3 유비퀴틴 리가제 근처로 가져오도록 이작용성 소분자 키메라를 설계하여 개발되었으며, 이를 통해 POI의 유비퀴틴화와 프로테아좀을 통한 추가 분해를 유도한다. 여기서 본 발명자들은 TF 인식 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 POI의 결합 모이어티로 통합된 비표준 PROTAC 클래스인 올리고뉴클레오티드 기반 PROTAC(O'PROTAC)의 개발을 보고한다. 본 발명자들은 암과 고도로 관련된 두 가지 전사 인자인 ERG와 LEF1의 O'PROTAC이 이들 단백질의 분해를 선택적으로 촉진하고 전사 활성을 억제하며 시험관 내 및 생체 내에서 암세포 성장을 억제한다는 것을 입증한다. O'PROTAC의 프로그래밍 가능한 특성은 이 접근 방식이 다른 TF를 파괴하는 데 적용 가능함을 나타낸다. O'PROTAC은 연구 도구로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 암과 같은 질환의 효과적인 치료를 위해 질환 관련 TF를 표적화하는 치료 무기로 활용될 수도 있다.
도입
많은 DNA 결합 단백질은 특정 DNA 서열 및 전사 공동 조절인자와 상호작용하여 유전자 발현을 전사적으로 활성화하거나 억제하는 전사 인자(TF)로서 역할을 한다. 진핵 세포에서는 약 2,000개의 TF가 확인되었으며 이는 수많은 생물학적 과정과 연관되어 있다. 그 중 약 300개의 TF가 암 발병과 연관되어 있으며 이는 발암유전자의 ~19%를 차지한다1. 따라서 암 발병과 관련된 TF를 표적화하는 것은 암 치료를 위한 매력적인 전략인 것으로 보인다.
지난 수십 년 동안 이 클래스의 TF가 명확하게 정의된 리간드 결합 포켓을 포함한다는 점을 고려하여 핵 수용체를 표적화하는 소분자 조절제가 개발되었다2. 그러나 대부분의 다른 TF는 리간드 결합 포켓이 없어 표적화하기 어렵다. 전사 복합체의 조립 메커니즘에 관한 지식이 기하급수적으로 증가함에 따라 단백질/단백질 상호작용, 단백질/DNA 상호작용, 또는 염색질 리모델링/후생유전적 판독기 단백질의 차단을 포함하여 소분자 화합물로 TF의 활성을 조절하는 다양한 전략이 등장하였다3. 그러나 비-리간드 TF를 억제하는 전통적인 소분자의 개발은 여전히 매우 어려운 일이며, 장애물을 극복하기 위한 새로운 표적화 전략이 절실히 필요하다.
PROTAC은 탄두인 POI 리간드, 링커 및 E3 리가제 리간드로 구성된 이종이작용성 소분자로서 E3 리가제를 POI로 동원하고 먹이 단백질이 프로테아좀 경로에 의해 분해되도록 유도한다. PROTAC 기술은 지난 10년 동안 크게 발전하였다. PROTAC은 효소와 수용체를 포함한 다양한 단백질을 분해할 수 있다는 것이 입증되었다4 -8. 안드로겐 수용체(AR) 및 에스트로겐 수용체(ER) 분해제인 두 개의 PROTAC ARV-110 및 ARV-471이 각각 1상 임상 시험에 들어갔다9 -11. PROTAC은 표적 범위 확장, 선택성 향상, 독성 감소, 억제제 저항 회피를 비롯하여 다른 소분자 억제제에 비해 여러 가지 장점을 제공한다. 이는 PROTAC 기술이 질환, 특히 암을 해결하기 위한 새로운 유망한 방식임을 시사한다. 가장 최근에는 PROTAC이 TF를 분해하도록 설계되었다. Wang의 그룹은 STAT3 억제제 SI-109를 기반으로 강력한 신호 변환기 및 전사 활성화제 3(STAT3) 특이적 분해제를 개발하였으며 생체 내에서 그의 표적화 효능을 입증하였다13. Crews 그룹은 haloPROTAC, dCas9-HT7 및 dsDNA/CRISPR-RNA 키메라를 활용하여 TF를 분해하는 전사 인자 표적화 키메라(TRAFTAC) 의 개발을 보고하였다14. 그럼에도 불구하고, 이 접근법은 인공적으로 조작된 dCas9-HT7 융합 단백질을 매개체로 사용하므로 임상에서의 잠재적인 사용이 제한된다.
ETS 관련 유전자(ERG) 전사 인자는 ETS 패밀리에 속하며 뼈 발달, 조혈, 혈관 신생, 혈관 형성, 염증, 이동 및 침습에 관여한다15 -16. 중요한 것은 ERG 유전자와 안드로겐 반응성 TMPRSS2 유전자 프로모터의 융합으로 인해 원발성 전립선암과 전이성 전립선암을 포함한 모든 인간 전립선암 사례의 약 50%에서 과발현된다는 점이다17 -18. TMPRSS2 -ERG 유전자 융합은 절단형 ERG의 비정상적인 과발현을 초래하며, 이는 ERG의 발현 증가가 전립선암 진행을 유도하는 핵심 요소임을 의미한다19 -20. 따라서 전립선암 환자를 효과적으로 치료하기 위해서는 ERG를 표적화하는 치료법이 시급히 필요하다. 림프 인핸서 결합 인자 1(LEF1)은 암과 고도로 관련된 또 다른 TF이다. 이는 T 세포 인자(TCF)/LEF1 패밀리에 속한다. β-카테닌과 복합체를 형성한 LEF1은 Wnt 표적 유전자의 전사를 촉진한다21. LEF1은 또한 상피-중간엽 전이(EMT)를 촉진할 수 있다22. LEF1의 비정상적인 발현은 여러 암 유형에 연관되어 있으며 암세포 증식, 이동 및 침습과 관련이 있다23. 따라서 LEF1은 암 치료를 위한 또 다른 이상적인 표적이 된다.
본 연구에서는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 PROTAC에 POI 결합 모이어티로 통합되는 O'PROTAC을 사용하여 TF를 표적화하는 새로운 전략을 소개한다(도 1). 본 발명자들은 ERG O'PROTAC이 ERG 단백질의 프로테아좀 분해를 촉진하고 ERG 전사 활성을 억제한다는 것을 입증한다. ERG 분해제와 마찬가지로 LEF1 O'PROTAC은 시험관 내 및 마우스에서 LEF1의 분해를 유도하고 LEF1 전사 활성과 전립선암 세포 성장을 억제한다. 결과적으로, 표적 유전자 발현과 전립선암 세포 성장도 효과적으로 억제되었다.
결과
O'PROTAC 설계
ERG는 5'-GGAA/T-3' 코어 모티프를 포함하여 고도로 보존된 DNA 결합 합의 서열을 인식한다. 본 발명자들은 강조된 ERG 결합 모이어티와 함께 ACGGACCGGAAATCCGGTT (서열 번호 3)의 서열을 포함하는 19-mer 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. E3 리가제 동원 요소의 경우 세레블론과 폰 히펠-린다우(VHL)를 각각 하이재킹할 수 있는 널리 사용되는 포말리도마이드와 VH 032를 선택하였다. PROTAC은 링커가 중요한 역할을 하는 삼원 복합체 형성을 기반으로 그 기능을 발휘한다. 따라서 본 발명자들은 상이한 길이와 유형의 상이한 링커를 사용하여 6개의 포스포라미다이트를 설계하고 합성하였으며, 그 중 3개는 포말리도마이드에 연결되어 있고 3개는 VH 032와 연결되어 있다(P1-6, 표 7). 포스포라미다이트는 DNA 합성기를 통해 한 DNA 가닥의 5' 말단에 부착시켰다(지원 정보). 어닐링 후 ERG와 LEF1 모두에 대해 6개의 O'PROTAC(OP)을 생성하였으며 그 중 3개는 세레블론에 결합(OP-C1-3 시리즈)되고 3개는 VHL에 결합(OP-V1-3 시리즈)되도록 설계하였다(표 8).
P1-6의 화학적 합성
P1-6의 합성은 반응식 1에 도시되었다. 4-플루오로-탈리도마이드 및 VHL-032는 문헌 절차에 따라 제조하였다25 -26. 4-플루오로-탈리도마이드와 다양한 아민의 직접적인 친핵성 방향족 치환 반응은 핵심 중간체 8a-c를 제공하였다. VH 032를 TBDPS 보호된 히드록실기를 함유하는 다양한 카르복실산과 커플링시켜 중간체 8d-f를 산출하였다. 8d-f에서 히드록실기의 후속 아세틸화 및 TBDPS 보호 제거로 중간체 10a-c를 생성하였다. DIPEA 존재 하에서 Cl-POCENiPr2로 8a-c 또는 10a-c의 포스피틸화로 P1-6을 생산하였다.
ERG O'PROTAC은 WT 및 TMPRSS2 -ERG 단백질의 프로테아좀 분해를 촉진한다
핵산 기반 작용제는 일반적으로 세포 내로 전달하기 위해 지질 매개 형질감염에 의존한다. 형광 현미경으로 형질감염 효율을 측정하기 위해 FITC-표지된 ERG O'PROTAC을 합성하였다. 본 발명자들은 Lipofectamine 2000을 사용하여 또는 Lipofectamine 2000 없이 100 또는 1,000 nM의 O'PROTAC으로 293T 세포를 형질감염시켰다. 예상한 대로 Lipofectamine의 존재는 모의 형질감염과 비교하여 세포 흡수를 크게 향상시켰다(도 2a). 그러나 저농도(100 nM)와 고농도(1,000 nM) 사이의 흡수 효능에는 차이가 없었는데(도 2a), 이는 아마도 음전하를 띤 올리고뉴클레오티드로 양전하를 띤 지질의 포화로 인해 발생했을 것이다.
세포 내 ERG 단백질에 대한 ERG O'PROTAC의 효과를 평가하기 위해, 293T 세포를 외인성 발현 HA-ERG 플라스미드와 6개의 ERG O'PROTAC으로 100 nM에서 48시간 동안 형질감염시키고 ERG 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. VH 032와 접합된 ERG OP-V1-3의 효과는 훨씬 미미한 반면, 포말리도마이드가 부착된 ERG OP-C1-3으로 처리 시 ERG 단백질 수준의 상당한 감소가 관찰되었다(도 2b). 내인성 ERG 단백질 수준에 대한 세포 효과를 추가로 입증하기 위해 본 발명자들은 전장 ERG 및 TMPRSS2-ERG 절단형을 모두 발현하는 ERG 과발현 인간 전립선암 세포주 VCaP에서 ERG O'PROTAC을 테스트하였다. 이소성으로 발현된 ERG에 대한 효과와 유사하게, ERG OP-C1-3은 또한 VCaP 세포에서 내인성 ERG 단백질을 효과적으로 감소시켰다(도 2c). 흥미롭게도 보다 안정적인 삼원 복합체에는 5개의 탄소 원자와 같은 짧은 링커가 선호되었다. ERG OP-C1은 ERG 단백질 수준을 크게 감소시켰지만, 프로테이나제 억제제 MG132는 이러한 분해를 차단하였으며(도 3), 이는 ERG O'PROTAC이 프로테아좀 경로를 통해 ERG 단백질을 분해한다는 것을 시사한다.
시험관 내 비오틴 풀다운 분석은 293T 세포에서 발현된 상당량의 HA-ERG가 비오틴-표지된 ERG OP-C1 및 OP-C2에 의해 풀다운되었음을 보여주었으며(도 4), 이는 이 두 O'PROTAC이 ERG 단백질과 강력하게 상호작용함을 나타낸다. 이 결과는 또한 ERG 분해에 대한 이 두 O'PROTAC의 더 나은 효과에 대한 그럴듯한 설명을 제공한다.
시간 경과 연구에 따르면 ERG O'PROTAC은 조사된 12시간부터 시작하여 48시간까지 효과가 나타났다(도 5a). 293T 세포에서의 발견(도 2a)과 일관되게, 용량별 실험에서는 100 nM의 ERG OP-C1이 ERG 단백질 수준의 상당한 억제를 나타냈으며 이 효과는 500 및 1,000 nM과 같은 더 높은 농도에서는 개선되지 않는 것으로 나타났으며, 이는 ERG OP-C1이 아마도 더 높은 농도로 포화됨을 나타낸다(도 5b). 또한, ERG OP-C1로 VCaP 세포를 처리하면 ADAM19 , MMP3 , MMP9 , PLAT 및 PLAU를 포함한 ERG 표적 유전자의 mRNA 발현이 억제되었으며(도 5c), 이는 ERG O'PROTAC이 VCaP 전립선암 세포에서 ERG 전사 활성을 억제한다는 것을 시사한다.
O'PROTAC에 의한 분해를 위해 다른 TF의 표적화
O'PROTAC의 유용성을 확장하기 위해, 본 발명자들은 또 다른 전사 인자 LEF1를 살펴보았다. LEF1은 β-카테닌/LEF1 복합체에서 DNA 결합 서브유닛 역할을 하며 뉴클레오티드 서열 5'-A/TA/TCAAAG-3'에 결합하여 전사 조절을 발휘한다27. 본 발명자들은 LEF1 결합 모이어티로서 TACAAAGATCAAAGGGTT (서열 번호 5)의 서열을 함유하는 18-mer 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. ERG O'PROTAC과 동일한 프로토콜을 사용하여 6개의 LEF1 O'PROTAC(표 8)을 합성하였다.
본 발명자들은 먼저 PC-3 전립선암 세포주에서 각 LEF1 O'PROTAC의 분해 능력을 평가하였다. LEF1 단백질의 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 활용하였다. [도 6]에서 볼 수 있듯이, LEF1 OP-V1은 더 낮은 농도(100 nM)에서 PC-3 세포에서 LEF1 분해를 강력하게 유도한 반면, 다른 LEF1 O'PROTAC은 활성이 적거나 없었다. 이 결과는 ERG O'PROTAC과 유사하며, 이는 링커 길이와 E3 리가제가 모두 특정 TF 분해에 중요한 요소임을 시사한다.
다음으로, 본 발명자들은 β-카테닌 /LEF1 복합체의 전사 활성에 대한 LEF1 O'PROTAC의 효과를 조사하였다. LEF1 OP-V1로 PC-3 전립선암 세포를 처리하면 β-카테닌/LEF1의 두 가지 표적 유전자인 CCND1 및 c- MYC의 mRNA 발현이 용량 의존적으로 하향조절된다는 것을 발견하였다(도 7a 및 b). LEF1 OP-V1 처리는 LEF1 유전자의 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았지만 PC-3의 단백질 수준에서 LEF1 및 그의 표적 단백질 사이클린 D1의 발현을 현저하게 감소시켰다(도 7a). 중요한 것은 LEF1 OP-V1이 시간 및 용량 의존 방식으로 PC-3 세포 성장을 유의하게 억제하였다는 것이다(도 7a 및 c). 다른 전립선암 세포주 DU145에서도 유사한 결과를 얻었다(도 7d-f). 종합적으로, LEF1 OP-V1은 강력한 LEF1 분해제이다.
고찰
이 연구에서 본 발명자들은 O'PROTAC을 사용하여 "약물 치료 가능성이 없는" 전사 인자를 분해하는 새로운 전략을 취한다. O'PROTAC은 링커를 통해 E3 리가제 리간드에 부착되는 전사 인자의 천연 "리간드", 즉 특정 DNA 서열을 활용한다. 이 전술은 배양된 세포에서 강력한 효능으로 ERG 및 LEF1 TF를 분해하는 데 성공적으로 적용되었다.
기존의 PROTAC 기술은 급속도로 발전하고 있으며 그 중 일부는 임상 시험 단계에 있다. 그러나 특정 제한 사항이 이어진다. 첫째, 보고된 PROTAC의 대부분은 POI를 표적화할 때 기존 소분자에 의존하므로 TF와 같은 "약물 치료 가능성이 없는" 표적에 적용하기가 어렵다. 또한 PROTAC은 높은 분자량(600~1400 Da)으로 인해 낮은 세포 투과성, 안정성 및 용해도 문제를 겪는다29. 전통적인 소분자 약물과 비교하여, PROTAC은 약물 치료 가능성이 훨씬 낮다. O'PROTAC은 기존 PROTAC의 한계를 뛰어넘는 엄청난 잠재력을 갖고 있다. 그 양식으로 인해 분해제는 주어진 TF의 DNA 결합 순서에 따라 합리적으로 프로그래밍될 수 있으므로 이론적으로 관심 있는 모든 TF를 표적화하는 것이 가능하다. 우리의 데이터는 링커와 E3 리가제 리간드의 길이와 유형을 선택하여 O'PROTAC의 효능을 더욱 최적화할 수 있음을 시사한다. 더욱이, O'PROTAC의 합성은 매우 간단하고 효율적이므로 가장 강력한 TF 분해제의 고처리량 스크리닝을 위한 O'PROTAC 라이브러리의 신속한 개발을 촉진한다. O'PROTAC은 DNA/DNA, DNA/RNA 또는 RNA/RNA 이중체에 결합된 모든 단백질에 적용될 수 있다.
Hall과 동료들은 최근 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 활용하여 RNA 결합 단백질(RBP)을 동원하는 RNA-PROTAC을 보고하였다. RBP와 단일 가닥 RNA의 결합은 서열 모티프와 2차 구조 모두에 크게 의존한다30. ssRNA의 높은 유연성으로 인해 ssRNA와 RBP 간의 상호작용을 예측하는 데에는 어려움이 있다31. 우리의 데이터는 단일 가닥 O'PROTAC가 ERG 또는 LEF1을 분해하지 않았음을 보여준다. 그러나 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 잘 정의된 3차원 이중체 구조를 가지고 있다. 따라서 단백질 결합 영역은 접근 가능하고 예측 가능하다. 따라서 O'PROTAC은 단백질과 결합하는 뉴클레오티드 서열을 변경함으로써 프로그래밍이 가능하다. 또한, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드와 비교하여 ssRNA는 유해한 화학 또는 효소 공격에 취약하다31. 종합하면, O'PROTAC은 예측 가능성이 높고 안정성이 뛰어나기 때문에 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 약물 개발은 지난 10년 동안 신약 사냥의 주류가 되었다32. 올리고뉴클레오티드 약물에 통합된 PROTAC의 촉매적 이점은 해당 분야에 더욱 활력을 불어넣을 수 있었다33. 더욱이, 특히 mRNA 코로나19 백신에서 올리고뉴클레오티드 약물의 전달이 최근 몇 년간 크게 발전하였다34 -35. 따라서 O'PROTAC은 임상 후보물질을 도출하고 신약 발굴을 가속화하기 위해 기존 PROTAC에 대한 보완적인 신약 발굴 및 개발 플랫폼이 될 수 있다.
실험 부문
포스포르아미다이트 1-6의 합성
포스포르아미다이트 1-6의 합성은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
올리고뉴클레오티드의 합성
이 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 합성하였으며 ExonanoRNA(미국 오하이오주 콜럼버스 소재)에 의해 역상-HPLC 정제하였다. 질량 및 순도(>95%)는 Xcalibur 시스템을 사용하는 Novatia, LLC의 LC-MS를 통해 확인하였다.
어닐링 반응
단일 가닥 및 역방향 올리고뉴클레오티드를 조립 완충액(10 mM Tris-HCl [pH7.5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 혼합하고, 90℃로 5분간 가열한 후 1시간 이내에 천천히 37℃로 냉각시켰다. 이중 가닥 O'PROTAC을 잘 혼합하고 분취하여 향후 사용을 위해 -20℃에 보관하였다.
세포 배양 및 형질 감염
VCaP, PC-3 및 DU145 전립선암 세포주와 293T 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. 293T 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 유지시켰고, PC-3 및 DU145 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 유지시켰다. VCaP 세포는 15% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 배양하였다. 제조사의 지침에 따라 O'PROTAC용 Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)을 사용하여 세포를 일시적으로 형질감염시켰다.
웨스턴 블롯
세포 용해물에 SDS-PAGE을 시행하고 단백질을 니트로셀룰로오스 막(GE Healthcare Sciences)으로 옮겼다. 막을 5% 무지방 우유와 0.1% Tween-20을 함유한 Tris 완충 식염수(TBS, pH 7.4)에서 차단하고, 0.1% Tween-20을 함유한 TBS에서 2회 세척한 후 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 관심 단백질은 ECL 화학발광 시스템(Thermo Fisher)을 사용하여 시각화하였다.
비오틴 풀다운 분석
293T 세포를 10 cm 접시에서 Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)을 사용하여 100 nM의 비오틴-표지된 ERG O' PROTAC 및 1 μg의 HA-ERG 플라스미드로 36시간 동안 형질감염시켰다. 세포를 MG132로 12시간 동안 처리한 후 50 mM Tris-HCl(pH7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트 및 1% 프로테이나제 억제제를 함유하는 용해 완충액에서 용해시켰다. 세포 용해물을 Streptavidin Sepharose High Performance bead(GE Healthcare)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 결합 단백질을 용출 완충액으로 용출하고 웨스턴 블롯을 실시하였다.
RNA 추출 및 RT- qPCR
TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고 SuperScript III First-Strand Synthesis System(Promega)을 사용하여 cDNA로 역전사하였다. iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 iQ Thermal Cycler(Bio-Rad)에서 정량적 PCR(qPCR)을 수행하였다. 각 샘플은 3회 반복 수행하였으며 3회의 생물학적 반복을 수행하였다. △CT는 특정 유전자의 역치 차이를 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)에 대해 정규화하여 계산하였다. 프라이머 서열은 표 9에 나열되어 있다.
세포 성장 분석
PC-3 및 DU145 세포를 LEF1 OP-V1로 48시간 동안 형질감염시키고 96웰 플레이트에 웰당 1,000개의 밀도로 접종하였다. 세포가 플레이트에 부착된 후 지정된 시점에 CellTiter 96 Aqueous One solution Cell Proliferation Assay(MTS)(Promega)를 각 웰에 첨가하여 세포 생존도를 측정하였다. MTS를 PBS에 1:10의 비율로 희석하고 웰에 첨가한 후 세포 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 각 웰에서 490 nm의 흡광도를 측정하였다.
[표 8]
[표 9]
[표 9B]
[반응식 1] P1-6의 합성 a
a시약 및 조건: (a) DIPEA, NMP, MW, 100℃, 3 h; (b) Cl-POCENiPr2, DIPEA, DCM, 1 h, 실온. (c) HATU, TEA, DMF; (d) Ac2O, DMAP, DCM, 1 h; (e) TBAF, THF.
실시예 16: O'PROTAC에 의한 표적 단백질 분해를 위한 세레블론의 새로운 리간드인 3- 아미노프탈산의 발견
요약
관심 단백질(POI)의 분해를 위해 기존의 단백질 분해 표적화 키메라(PROTAC) 및 올리고뉴클레오티드 기반 PROTAC(O'PROTAC) 전술이 개발되었다. 이번 연구에서 본 발명자들은 세레블론(CRBN) E3 유비퀴틴 리가제의 새로운 리간드인 3-아미노프탈산의 발견과 ERG 전사 인자의 표적 분해를 위한 프탈산 기반 O'PROTAC의 개발을 보고하였다. 프탈산-O'PROTAC은 CRBN 의존적 방식으로 ERG 단백질 분해를 유도하였다. 본 발명자들은 또한 ERG 프탈산-O'PROTAC이 ERG의 전사 활성을 억제할 뿐만 아니라 전립선암 세포의 성장과 침습도 억제한다는 것을 보여주었다. 우리의 연구 결과는 PROTAC, 특히 O'PROTAC 개발을 위한 새로운 장을 제시한다.
도입
단백질 분해 표적화 키메라(PROTAC)는 두 개의 활성 도메인, 즉 탄두인 관심 단백질(POI) 리간드 및 E3 리가제 리간드 및 링커로 구성된 이종이작용성 분자로서 POI와 E3 리가제의 근접성을 유도하여 결과적으로 POI의 유비퀴틴화 및 분해를 유도한다. PROTAC은 사건 중심 약리학을 작용 방식(MOA)으로 활용하므로 표적 이탈 효과, 약물 저항성 감소 및 '약물 치료 가능성이 없는' 표적 조절과 관련하여 점유 중심 MOA인 기존 억제제에 비해 잠재적인 이점을 가지고 있으며1, 이는 인간의 질환을 치료하는 유망한 접근법을 나타낸다.
강력한 PROTAC 분자를 설계하는 요소는 E3 리가제 리간드이다. 최초의 PROTAC 분자는 Deshaies에 의해 보고되었으며 E3 리가제 β-TRCP에 대한 펩티드 리간드를 활용하였다2. 펩티드 모이어티는 낮은 세포 투과성과 생물학적 불안정성을 유발하여 PROTAC 개발을 방해하였다3. 지난 10년 동안 폰 히펠-린다우 (VHL)4, Mdm25, CRBN6, IAP7, DCAF158, RNF49, RNF11410 및 DCAF1611을 포함하여 E3 리가제를 동원하는 여러 소분자 리간드가 확인되었다. 그러나 CRBN 및 VHL 리간드만이 PROTAC 설계에 E3 리간드로 자주 사용된다3.
CRBN은 다수의 표적 단백질을 유비퀴틴화하는 E3 유비퀴틴 리가제 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN의 서브유닛이다. 면역조절 약물(IMiD)이라고 불리는 탈리도마이드 유도체는 CRBN에 결합하여 다발성 골수종 및 기타 B 세포 악성종양의 치료에서 그 기능을 중재하는 것으로 나타났다12 -13. 탈리도마이드는 원래 1957년에 불면증과 입덧 치료용으로 판매되었다. 그러나 강력한 기형 유발성으로 인해 최종적으로 시장에서 퇴출되었다14. Hiroshi 그룹은 탈리도마이드가 CRBN에 결합하여 유비퀴틴 리가제 활성을 억제하는 것이 기형 유발 효과를 유발하는 메커니즘임을 입증하였다. 나중에 탈리도마이드 유사체인 포말리도마이드와 레날리도마이드가 CRBN의 관여를 통해 IKZF1과 IKZF3의 분해를 유도하는 것으로 보고되었다12 -13. CRNB 및 IKZF와 탈리도마이드의 결정 구조는 2014년에 해석되었다.
2015년에는 CRBN 리간드로 구성된 PROTAC 분자가 BET 및 FKBP12를 분해하도록 설계되었다6. 그 후, CRBN 동원 PROTAC 분야는 여러 PROTAC이 임상 시험에 적용되면서 극적으로 확장되었다16.
강력한 CRBN 동원 PROTAC 개발의 지속적인 진전에도 불구하고 상당한 문제가 남아 있다. IMiD 기반 PROTAC은 Ikaros 전사 인자에 대한 IMiD의 활성을 유지하여 표적 외 효과를 유발하는 것으로 설명되었다17. 또한, 탈리도마이드는 프탈이미드와 글루타르이미드 모이어티의 가수분해로 인해 생리학적 pH 7.4에서 낮은 안정성을 나타냈다18-19.
이번 연구에서 본 발명자들은 CRBN 리가제의 리간드로서 프탈산을 식별하였다. 프탈산 기반 ERG O'PROTAC(ERG OP-C-P1)은 ERG 단백질 분해에 있어 포말리도마이드 O'PROTAC과 비슷하거나 더 나은 효능을 보여주었다. ERG OP-C-P1은 ERG의 전사 활성을 크게 감소시키고, 표적 유전자 발현을 억제하고, ERG 양성 전립선암 세포의 성장과 침습을 억제하였다
결과
ERG 단백질의 분해제로서 프탈산 기반 O'PROTAC 개발
본 발명자들은 처음에 포스포라이다이트 화학을 사용하여 ERG를 표적화하기 위해 상이한 길이를 가진 포말리도마이드- 및 VH032-기반 O'PROTAC(ERG OP-C1 내지 C3 및 OP-V1 내지 3)을 구축하였다. VH032 기반 ERG O'PROTAC의 질량 분석 결과와 달리, 3개의 포말리도마이드 기반 ERG O'PROTAC의 질량 스펙트럼은 프탈이미드가 아닌 프탈산이 DNA 합성기의 주요 생성물임을 보여주었다(도 21a 및 21b). 이러한 결과는 포말리도마이드가 일반적인 DNA 합성 동안 탈보호 조건에 취약함을 시사한다(반응식 2A).
293T 세포를 ERG 발현 플라스미드로 형질감염시키고 3개의 조질 3-N-치환-아미노프탈산 기반 O'PROTAC(OP-C1 내지 C3) 중 하나로 처리한 경우, 본 발명자들은 그 중 2개(C1 및 C2)가 ERG 분해의 강력한 활성을 나타냈음을 발견하였다(도 11a). 대조적으로, VH032 기반 ERG O'PROTAC은 비활성이었다. 이 두 ERG O'PROTAC(C1 및 C2)은 TRMPRSS2-ERG 유전자 융합으로 인해 높은 수준의 내인성 ERG 단백질을 발현하는 전립선암 VCaP 세포에서 ERG 단백질을 효과적으로 감소시켰다(도 11b).
프탈산이 표적 단백질의 단백질 분해에 효과적인 O'PROTAC의 E3 리가제 동원자라는 가설을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 프탈산 디메틸 에스테르를 출발 물질로 사용을 사용하는 합성 경로를 적용하여 ERG O'PROTAC(OP-C-P1)을 합성하였다(반응식 2B). HPLC 및 질량 분석 데이터는 ERG OP-C-P1(프탈산 연결 역방향 가닥 및 FITC 표지 정방향 가닥으로 구성된 DNA 올리고 함유)이 고순도 및 예상 분자량으로 포스포라미다이트 화학에 의해 성공적으로 합성되었음을 나타냈다(도 11c, 11d, 21c 및 21d). 따라서 본 발명자들은 추가 생화학적 및 기능적 연구에 이 ERG OP-C-P1(도 11e)을 사용하였다.
프탈산 기반 ERG O'PROTAC은 ERG 프로테아좀 분해를 유도한다
본 발명자들은 먼저 프탈산 기반 ERG OP(순도가 높은 C-P1 및 순도가 낮은 C1)의 효능을 클릭 반응을 통해 합성된 2개의 포말리도마이드 기반 ERG O'PROTAC과 비교하였다. 이들 O'PROTAC의 형질감염 효율을 평가하는 데 FITC-표지된 ERG O'PRORAC를 사용하였다. 형광 현미경 분석에 따르면 프탈산 기반 ERG O'PROTAC은 293T 및 VCaP 세포주 모두에서 ERG O'PROTAC C-A1 및 C-N1만큼 효과적으로 형질감염되었다(도 12a, b). 웨스턴 블롯 분석에 따르면 OP-C-P1은 293T 세포에서 OP-C-A1 및 OP-C-N1보다 이소성으로 발현된 전장(FL) ERG 단백질의 하향조절에 대해 약간 더 강한 억제 효과를 나타냈으며(도 12c), VCaP 세포의 내인성 FL ERG에 대해서도 유사한 결과를 얻었다(도 12d).
추가 분석에 따르면 이들 ERG OP는 TMPRSS2-ERG 유전자 융합에서 유래된 절단형 ERG T1/E4 및 FL ERG 둘 다의 mRNA 수준에 영향을 미치지 않았으며(도 12d 및 12e), 이는 ERG OP-C-P1이 ERG 발현을 전사 후 수준에서 억제함을 시사한다.
그런 다음 본 발명자들은 단백질 분해에 대한 OP-C-P1 효능의 동역학을 분석하였다. 시간 경과 연구에 따르면 OP-C-P1은 형질감염 후 24시간부터 ERG 단백질 발현을 억제하는 것으로 나타났다(도 12f). 용량별 실험에서는 OP-C-P1이 50 nM만큼 낮은 농도에서 ERG 단백질 수준의 극적인 감소를 유도한다는 사실이 추가로 밝혀졌다(도 12g). 훨씬 더 높은 농도(100 또는 500 nM)가 사용되어도 ERG 단백질 수준의 감소가 거의 없거나 추가로 증가하지 않았는데, 이는 세포 내 ERG OP-C-P1의 양이 포화되거나 세포에 의한 흡수가 형질감염 효율로 인해 제한될 수 있었음을 의미한다. 분해 농도(DC) 곡선은 OP-C-P1이 172.4 nM에서 ERG 단백질의 50%를 억제한다는 것을 입증하였다(도 12h).
프탈산 기반 ERG OP는 프로테아좀 경로를 통해 ERG를 분해한다
프탈산 기반 ERG OP-C-P1에 의해 유도된 ERG 단백질 하향 조절이 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해 경로를 통해 매개되는지 확인하기 위해 VCaP 세포를 먼저 OP-C-P1로 형질감염시키고 프로테아좀 억제제 MG132로 처리하였다. MG132 처리는 ERG 단백질의 분해를 완전히 차단하였으며(도 13a), 이는 ERG 분해가 프로테아좀 경로에 의존한다는 것을 시사한다. 한편, 유비퀴틴화 분석은 OP-C-P1의 처리가 각각 293T 및 VCaP 세포에서 외인성 및 내인성 ERG 모두의 유비퀴틴화 수준을 향상시키는 것으로 나타났다(도 13b 및 1c).
ERG OP-C-P1이 시험관 내에서 ERG에 결합할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, VCaP 세포의 핵 추출물을 사용하여 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)을 수행하였다. 본 발명자들은 비오틴-표지된 ERG OP-C-P1이 VCaP 세포의 핵 추출물에서 DNA-단백질 복합체(DPC)를 형성한다는 것을 입증하였다. 이 결합은 경쟁적 비오틴-표지된 ERG OP-C-P1의 첨가에 의해 중단되었다(도 13d). 또한, ERG 항체를 첨가하면 DPC의 슈퍼시프트가 발생하였으며(도 13e), 이는 검출된 DPC에 ERG 단백질이 포함되어 있음을 시사한다.
프탈산 기반 ERG OP에 의한 ERG 분해는 CRBN에 의해 매개된다
다음으로, 본 발명자들은 OP-C-P1 매개 ERG 분해가 세레블론(CRBN)에 의존하는지 여부를 조사하였다. VCaP 세포에서 CRBN을 녹아웃시키고, 세포를 OP-C-P1로 처리하였다. CRBN 녹다운이 OP-C-P1에 의한 ERG 분해를 완전히 제거한다는 것을 발견하였다(도 13f). 세레블론 리간드 포말리도마이드의 처리는 또한 OP-C-P1에 의해 유도된 ERG 단백질의 분해를 극복하였으며, 이 효과는 용량 의존적이었다(도 13g). 이러한 데이터는 OP-C-P1에 의해 유발된 ERG 분해가 CRBN E3 리가제를 통해 매개됨을 나타낸다.
CRBN 단백질과 3-아미노프탈산 사이의 상호작용을 이해하기 위해, 본 발명자들은 3-N-치환 프탈산과 CRBN(PDB: 4CI1)을 사용하여 도킹을 수행하였다. 프탈산의 상호작용은 탈리도마이드와 유사한 것으로 관찰되었다(도 22). 예를 들어, 1'-카르복실산 기는 소수성 포켓을 향해 배향되어 두 개의 강한 수소 결합을 형성한다. 히드록시 기의 카르보닐 산소와 수소는 각각 TRP382와 HIS380의 백본과 상호작용하였다. 이러한 수소 결합 상호작용은 탈리도마이드의 글루타르이미드 기와 유사했으며, 여기서 상호작용은 두 카르보닐과 아미드 사이에서 잔기 HIS380 및 TRP382에 각각 발생하였다. 추가적으로, 다른 2'-카르복실산 기는 용매에 더 많이 노출된다. 벤젠과 카르복실산 사이의 C-C 결합의 유연성으로 인해 카르보닐 산소는 소수성 포켓을 향하여 위치하여 HIS380의 이미다졸 측쇄와 수소 결합을 유지할 수 있었다. 한편, 히드록시 기는 HIS359 측쇄와 약한 물 매개 수소 결합을 형성하였다. 탈리도마이드와 비교하여 프탈이미드는 완전히 용매에 노출되었으며 HIS359와 물 매개 수소 결합으로 수용되었다. 또한 TRP388의 인돌과 프탈산의 벤젠 고리 사이에 파이-파이 상호작용이 관찰되었다. 3-아미노기의 배향은 포말리도마이드 및 레날리도마이드와 유사하게 완전히 용매에 노출되었으며, 이는 잠재적인 탄두와 링커를 형성하는 데 크게 기여하였다. 이 결합 정보는 프탈산 기반 O'PROTAC이 포말리도마이드 기반 O'PROTAC과 비슷한 활성을 보였다는 관찰에 대한 설명을 제공한다.
프탈산 기반 ERG OP는 ERG 표적 유전자 발현과 세포 성장 및 침습을 약화시킨다.
ERG OP-C-P1이 ERG 신호 전달 경로에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 ERG 표적 유전자의 전사 수준을 검출하였다. 본 발명자들은 OP-C-P1에 의한 ERG의 하향조절이 ADAM19 , MMP3 , MMP9 , PLAT 및 PLAU를 포함하는 ERG 표적 유전자의 mRNA 발현을 상당히 감소시켰음을 입증하였다(도 14a 및 14b). 세포 성장에 대한 OP-C-P1의 기능적 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 VCaP 세포를 사용하여 3차원(3D) 구형 형성 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 OP-C-P1 처리가 VCaP 세포 구체의 직경을 크게 감소시켰으며, 이는 OP-C-P1이 VCaP 세포 성장을 억제했음을 나타낸다(도 14c 및 1d). 세포 침습에 대한 ERG의 역할을 고려하여21, 이 ERG OP가 세포 침습에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 알아내기 위해 세포 침입 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 OP-C-P1의 처리가 VCaP 세포의 침습 능력을 감소시켰음을 발견하였다(도 14e 및 1f). 종합적으로, OP-C-P1 유발 ERG 분해는 ERG의 전사 활성과 전립선암 세포 성장 및 침습을 효과적으로 약화시킨다.
요약하면, 본 발명자들은 프탈산을 CRBN 리가제의 리간드로 식별하였다. 프탈산 기반 ERG O'PROTAC은 유비퀴틴화-프로테아좀 경로를 통해 ERG의 단백질 수준을 유의하게 억제하고 세포 성장 및 침습에서 ERG 기능을 약화시켰다. 이 ERG O'PROTAC은 프탈산이 O'PROTAC에서 포말리도마이드와 마찬가지로 활발하게 기능을 한다는 명확한 증거를 제공한다. 우리의 데이터는 이 CRBN 리간드가 다른 전사 인자 또는 POI를 분해하기 위해 O'PROTAC 또는 표준 PROTAC을 설계하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
실험 부분
디메틸 3-((5-(((2- 시아노에톡시 )( 디이소프로필아미노 ) 포스파네일 ) 옥시 ) 펜틸 )아미노)프탈레이트의 합성
디메틸 3-((5-(((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노) 포스파네일)옥시)펜틸)아미노)프탈레이트의 합성을 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다.
올리고뉴클레오티드 합성 및 어닐링 반응
본 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 ExonanoRNA(미국 오하이오주 콜럼버스 소재)에서 합성하였다. 올리고 어닐링 반응을 위해, 단일 가닥 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드를 조립 완충액(10 mM Tris-HCl [pH7.5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 혼합하고 90℃로 5분간 가열한 후 1시간 이내에 천천히 37℃로 냉각시켰다. 이중 가닥 O'PROTAC을 잘 혼합하고 분취하여 향후 사용을 위해 -20℃에 보관하였다.
플라스미드 및 시약
siRNA 구축물(siNS 및 siCRBN)은 GE Dharmacon에서 구입하였다. HA-Ub에 대한 포유류 발현 벡터는 Addgene에서 구입하는 한편, pMCV-HA-ERG는 VCaP 세포의 cDNA를 주형으로 사용하여 구축하였다. 시클로헥시미드(CHX), MG132는 Sigma Aldrich에서 구입하였다. 사용된 항체는 Covance의 HA(카탈로그 번호 MMS-101R); Sigma의 Flag(M2)(카탈로그 번호 F-3165); Santa Cruz의 ERK2(sc-1647); Cell Signaling Technology의 CRBN(카탈로그 번호 71810S); Biocare Medical의 ERG (카탈로그 번호 901-421-101520)였다. 웨스턴 블롯의 경우, 모든 항체를 TBST 중 5% BSA로 1:1,000으로 희석하였다.
세포주, 세포 배양 및 형질 감염
불멸화 인간 배아 신장 세포주 293T와 2개의 PCa 세포주(VCaP 및 22Rv1)는 ATCC(미국 버지니아주 머내서스 소재)에서 구입하였다. 293T 및 VCaP 세포는 10% FBS(Thermo Fisher Scientific)가 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 배양하였다. 22Rv1 세포는 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포는 5% CO2가 공급되는 37℃ 가습 인큐베이터에서 유지시켰다.
제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000(카탈로그 번호 11668500, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 일시적인 형질감염을 수행하였다. siRNA 서열 및 정보는 표 10에 나열되어 있다.
단백질 추출 및 웨스턴 블롯
세포를 PBS로 한 번 세척한 후 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 및 5% 글리세롤을 함유하는 용해 완충액에 얼음 위에서 30분간 용해하였다. 용해물을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 총 단백질 50 μg을 함유한 상층액을 SDS-PAGE 겔에 적용하였다. 단백질 겔을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 5% 탈지유로 1시간 동안 차단한 후 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 신호는 PierceTM ECL Western Blotting Substrate(카탈로그 번호 32106, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 발색하였다.
RNA 추출 및 RT- qPCR
총 RNA를 추출하고 이전에 기재된 바와 같이 cDNA로 역전사한 다음22 iQ SYBR Green Supermix(카탈로그 번호 1708880, Bio-Rad)를 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. △CT는 특정 유전자의 역치 차이를 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)에 대해 정규화하여 계산하였다. RT-qPCR에 사용된 프라이머는 표 11에 열거되어 있다.
핵 추출 및 전기영동 이동성 이동 분석( EMSA )
VCaP 세포 핵 단백질은 NE-PER™ 핵 및 세포질 추출 시약(카탈로그 번호 78833, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 추출하였다. 제조사의 지시에 따라 LightShift™ Chemiluminescent EMSA Kit(카탈로그 번호 20148, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 EMSA를 수행하였다. 간략하게, 잠재적 ERG 결합 모티프를 함유하는 ERG OP-C-P1을 VCaP 핵 단백질과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 6% 아크릴아미드 DNA 겔로 분리하였다. 비오틴-표지된 프로브를 0.5 또는 1 μg의 ERG 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 6% 폴리아크릴아미드 DNA 겔에 로딩하였다.
3차원(3D) 구체
~120 μL의 matrigel 매트릭스(카탈로그 번호 354234, BD Bioscience)를 24웰 플레이트의 웰 바닥에 37℃에서 30분 동안 미리 코팅하였다. ERG OP-C-P1(200 nM)으로 형질감염된 약 20,000개의 VCaP 세포를 10% FBS를 함유하는 250 μL의 DMEM/F12 배지에 재현탁시키고 matrigel 사전 코팅된 웰의 상단에 접종하였다. 30분 후, 세포가 가라앉으면 DMEM/F12 배지로 희석된 10% matrigel의 또 다른 층으로 덮었다. 배지는 2~3일마다 교체하였다.
세포 침습
22Rv1 세포를 100 nM의 OP-C-P1 및 0.5 μg의 pCMV-HA-ERG로 형질감염시켰다. 대략 50,000개의 형질감염된 22Rv1 세포를 200 μL의 무혈청 RPMI-1640 배지로 재현탁시키고 matrigel 침습 챔버(카탈로그 번호 354480, Corning)에 접종하였다. 그런 다음 챔버를 10% FBS가 보충된 800 μL의 RPMI-1640 배지로 채워진 웰에 배치하였다.
단백질 분해 실험(생화학적 및 기능적 연구)에 사용된 프탈산 E3 결합 리간드(ERG O'PROTAC(OP-C-P1))를 포함하는 O'PROTAC 접합체를 포스페이트 탈보호 단계에서 표적화 모이어티를 중간체 P2에 커플링하는 시점에서 얻었다. 반응식 2A 및 2B를 참조한다.
[반응식 2A 및 2B]
[표 10]
[표 12]
실시예 17: GOF p53 돌연변이체의 전사 활성은 TMPRSS2 -ERG를 가담시켜 피리미딘 합성 및 암 적합성을 촉진한다
본 실시예는 CTNNB1 유전자 프로모터의 고유 서열의 직접 결합 및 β-카테닌 유전자 발현의 상향조절에서 p53 돌연변이체의 GOF 역할을 설명한다. 이 실시예는 또한 ERG/GOF p53-양성 PCa의 치료 표적으로서 β-카테닌 및 피리미딘 합성을 확인한다.
결과
TMPRSS2 -ERG 융합과 TP53 변경은 인간 PCa에서 동시에 발생한다
환자 표본에서 TMPRSS2 -ERG 융합과 TP53 유전자 변경(결실 및 돌연변이 모두 포함)이 동시에 발생하는지 여부를 조사하였다. 이 두 병변은 TCGA 코호트의 1차 PCa, MSKCC 코호트의 1차 및 진행성 PCa, 및 SU2C 코호트의 진행성 PCa를 포함하는 분석된 환자 샘플의 약 1,500개 사례에서 상당히 중복되는 것으로 나타났다(도 23a, 23b, 30a, 및 30b). 이러한 결과는 환자의 PCa 발병 및 진행에서 TMPRSS2 -ERG 융합과 TP53 변경 동시 발생의 중요성을 강조한다.
마우스의 PCa 초기 발병에서 p53 돌연변이체의 GOF 역할
TMPRSS2 -ERG 융합과 TP53 변경의 동시 발생이 전립선 종양 형성에서 인과적인 역할을 하는지 확인하기 위해 TMPRSS2 -ERG 과발현이 있거나 없는 6개의 유전자형 GEM 군, Trp53 유전자 녹아웃(KO) 및/또는 GOF 돌연변이 녹인(KI)을 생성하였다(도 23c): 1) "야생형"(Cre 음성 "WT" 한배새끼); 2) AR 의존성 프로바신(Pb) 프로모터에 의해 유도되는, TMPRSS2-ERG 유전자 융합으로 인해 N-말단의 처음 32개 아미노산이 없는 절단형 ERG인 PCa-관련 ERG△N32의 과발현이 있는 ERG 트랜스제닉 단독(Pb-ERG); 3) 전립선 특이적 Trp53 KO (Trp53 pc -/-); 4) R172H의 전립선 특이적 Trp53 KO 및 KI(인간 p53의 R175H와 동일, 핫스팟 GOF 돌연변이(Muller and Vousden, 2014)) (Trp53 pcR172H /-); 5) 전립선 특이적 Pb - ERG;Trp53 pc -/-; 및 6) 전립선 특이적 Pb - ERG;Trp53 pcR172H/-. 이러한 마우스 군을 Pb 유도 Cre 재조합효소 트랜스제닉 마우스(Pb - Cre4), Pb -ERG 트랜스제닉 마우스, 및 Trp53 loxp -stop- loxp - R172H / loxp 마우스를 원래의 번식동물로 사용하여 생성하였다.
조직학적 분석에 따르면 10개월령에 ERG/GOF p53 R172H KI(Pb -ERG;Trp53 pcR172H/-) 마우스의 약 10%에서 국소 선암종이 발생하였으며 그 중 60%는 저등급 전립선 상피내 신생물(LGPIN) 및 고등급 PIN(HGPIN)을 갖는 것으로 나타났다. 그러나 ERG/p53 KO(Pb - ERG;Trp53 pc -/-) 마우스는 국소 선암종을 나타내지 않았고, 이들 마우스 중 20%만이 LGPIN을 갖고 나머지는 신생물성 표현형을 나타내지 않았다(도 30c 및 30d). 15개월령까지 Pb - ERG;Trp53 pcR172H /- 마우스의 약 60%에서 국소성 또는 광범위 선암종이 발생하였고 나머지는 LGPIN 및/또는 HGPIN을 나타냈다. 대조적으로, Pb - ERG;Trp53 pc -/- 마우스의 10%만이 국소 선암종이 발생하였다(도 23c 및 23d). Pb -ERG 마우스에서는 10개월까지 PIN이 형성되지 않았다(도 30c 및 30d). 그러나, 15개월령까지 Pb -ERG 마우스의 약 20%가 국소 LGPIN 병변을 나타냈다(도 23d). 연령에 따른 질병 진행은 ERG 과발현이 전립선 종양 발생을 유도하기 위해 2차 및/또는 3차 돌연변이를 필요로 한다는 개념을 더욱 뒷받침한다. 면역조직화학(IHC) 분석은 ERG/GOF p53 R172H KI 및 ERG/p53 KO 마우스 모두에서 모든 병변이 안드로겐 수용체(AR) 양성임을 보여주었다(도 23c 및 30c). 조직학적 결과와 일치하게, Ki67 양성 세포의 백분율은 ERG/p53 KO 및 기타 유전자형 마우스에 비해 10개월 및 15개월령 모두에서 ERG/GOF p53 R172H KI 마우스의 전립선 조직에서 훨씬 더 높았다(도 23e 및 30e). 따라서 Trp53 손실과 관련하여 p53 돌연변이체(예를 들어, R172H)는 TMPRSS2-ERG와 협력하여 마우스에서 PCa의 조기 발병을 유도하며, 이는 전립선 종양 발생에서 p53 돌연변이체의 생체 내 GOF 역할을 강조한다.
인간 PCa 세포 성장에 대한 GOF p53의 중요성을 조사하였다. TMPRSS2 -ERG 융합 양성 인간 PCa 세포주 VCaP에서 TP53의 한 대립 유전자를 결실시키고 다른 대립 유전자를 돌연변이(R248W)시킨다. 내인성 ERG(전장 및 ERG△N39, TMPRSS2-ERG 융합으로 인해 N 말단에서 처음 39개 아미노산이 없는 절단형 ERG) 및 p53 R248W 돌연변이체는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 사용하여 개별적으로 또는 함께 녹다운시켰다. ERG 또는 p53 R248W의 녹다운이 세포 성장을 현저하게 억제한다는 것이 입증되었다(도 23f 및 23g). GEM 모델과 인간 VCaP 세포의 결과는 ERG가 GOF p53 돌연변이체와 협력하여 PCa 종양 발생 및 진행을 촉진한다는 개념을 변함없이 뒷받침한다.
ERG 및 GOF p53 돌연변이체에 의한 PSG의 공동 조절
마우스에서 ERG 과발현 및 GOF p53 돌연변이체(예를 들어, R172H)에 의해 유발된 전립선 종양 형성 가속화의 기본 분자 메커니즘을 이해하기 위해, ERG/GOF p53(Pb-ERG;Trp53 pcR172H/-)에서 고유하게 변경되었지만 ERG/p53 KO(Pb - ERG;Trp53 pc -/-)에서는 변경되지 않은 하류 이펙터를 결정하였다. [도 23c]에 도시된 6개 군의 마우스의 전립선 조직에서 RNA-seq 분석을 수행하였다. RNA-seq 데이터의 클러스터링 분석은 ERG/p53 KO 대응물과 비교하여 ERG/GOF p53 마우스의 종양에서 901개의 유전자가 고유하게 상향조절되었음을 보여주었다(도 24a, 31a, 31b 및 표 13). 이들 상향조절된 유전자 및 뮤린 전립선 종양으로부터의 ERG ChIP-seq 데이터의 통합 분석은 531개의 ERG 표적 유전자가 ERG/GOF p53 종양에서 고도로 상향조절되었음을 밝혔다(도 24b, 24c 및 표 14). IPA 분석은 이들 유전자 중 일부가 세포 외 기질, DNA 복제, 세포 주기 및 기타 암 관련 경로와 관련되어 있음을 보여주었다(도 24d). Upms , Rrm1 , Rrm2 및 Tyms와 같은 필수 피리미딘 합성 유전자를 포함하는 PSG 군은 ERG 또는 GOF p53 단독 마우스의 전립선 조직과 비교하여 ERG/GOF p53 종양에서 고도로 상향조절되었다(도 24c, 24e, 24f, 24f 및 31c-31e). ERG 및 GOF p53에 의한 이러한 필수 PSG의 공동 조절은 ERG/GOF p53 종양(도 24g) 및 VCaP 인간 PCa 세포주(도 24h 및 24i)에서 RT-qPCR에 의해 추가로 검증되었다.
[표 13]
[표 14]
돌연변이 p53의 결합 표적으로 CTNNB1 유전자 식별
여러 주요 PSG가 ERG 및 GOF p53(GEM 종양의 R172H 및 인간 VCaP 세포의 R248W)에 의해 공동 조절되고(도 24c-24h) ERG가 이들 PSG의 프로모터에 점유한다는 점을 고려하여(도 24f 및 31c-31e), 본 발명자들은 돌연변이 p53이 이러한 PSG의 게놈 유전자좌에도 결합하는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해 VCaP 세포에서 p53 ChIP-seq를 수행하고 이 세포주에서 400개 이상(n=416)의 p53 R248W 돌연변이체가 고도로 농축된 게놈 유전자좌를 식별하였다(도 25a 및 표 5; 참고: 식별된 416개 피크는 359 유전자좌에 위치함). DNA 결합 모티프 분석은 DNA 결합 단백질 동원체 단백질 B(CENPN) 결합 요소를 제외하고는 일반적인 전사 인자 결합 모티프가 특이적으로 농축되지 않음을 보여주었다(도 31f). GOF p53 결합 피크는 프로모터 및 비-프로모터 영역 모두에 국한되어 있었지만 놀랍게도 VCaP 세포의 PSG 유전자좌에는 이들 중 어느 것도 존재하지 않으며(도 25a 및 표 5), 이는 p53 돌연변이체가 간접적 메커니즘(들)을 통해 PSG 발현을 조절할 수 있음을 시사한다.
p53 돌연변이 매개 PSG 발현의 기본이 되는 잠재적인 하류 이펙터(들)를 정의하기 위해, 경로 농축 분석을 수행하였고, Wnt 신호전달이 R248W 결합 표적 중에서 농축된 경로 중 하나인 것으로 밝혀졌다(도 25b 및 표 5). 구체적으로, Wnt 신호전달 경로의 핵심 성분인 β-카테닌을 코딩하는 CTNNB1 유전자의 프로모터에서 p53 돌연변이체(R248W) 결합 피크가 검출되었다(도 25c). 비점유 영역이 아닌 CTNNB1 유전자의 프로모터에서의 p53 R248W의 특이적 점유가 VCaP 세포에서 정량적 ChIP-PCR(ChIP-qPCR)에 의해 확인되었다(도 25d). WT 또는 GOF 돌연변이 p53을 발현하는 다양한 유방암 세포주에서 생성된 p53 ChIP-seq 데이터의 메타 분석에서는 p53 R273H, R249S 및 R248Q 돌연변이체가 변함없이 CTNNB1 프로모터에 결합했지만 WT p53은 그렇지 않은 것으로 나타났다(도 32a).
CTNNB1 프로모터에서 GOF p53 돌연변이체에 의해 결합된 DNA 서열을 정의하기 위해, p53 R248W ChIP-qPCR 분석을 순차적 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다(도 25e). p53 R248W는 VCaP 세포에서 p53 돌연변이체 ChIP-seq 피크의 중앙(#b 앰플리콘)을 특이적으로 점유한다는 것이 입증되었다(도 25f). 최소 돌연변이 p53 결합 서열을 탐색하기 위해, VCaP 세포 용해물 및 #b 앰플리콘을 덮는 4개의 비오틴-표지된 이중 가닥 프로브를 사용하여 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)을 수행하였다(도 25e 및 32b). 결합 서열은 CTNNB1 유전자 프로모터에서 25-bp 돌연변이 p53 결합 DNA 서열(MP53BS)로 좁혀졌다(도 25e 및 25g). MP53BS의 EMSA 신호는 분석에 비표지된 프로브 또는 항-p53 항체를 추가함으로써 크게 감소되었으며(도 25h 및 32c), 이는 검출된 결합 신호가 p53 돌연변이체(R248W) 특이적임을 나타낸다. 세포 핵 추출물을 사용하는 것 외에도 EMSA는 또한 박테리아에서 정제된 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)-p53 재조합 단백질을 사용하여 수행하였으며, 여기에는 WT p53 및 R175H(GEM에 사용된 R172H와 동일), C238Y(LuCaP 23.1 환자 유래 이종이식편(PDX)), R248W(VCaP 세포주), R273H(MDA-MB-468 유방암 세포주) 및 DBD 외부 잔기인 Q331R(22Rv1 세포)을 포함하는 본 연구에 관련된 돌연변이체가 포함된다. WT 및 Q331R을 제외하고 p53의 모든 DBD 돌연변이체가 DNA 프로브에 결합된 것으로 확인되었으며(도 25i), 이는 p53의 DBD 돌연변이체가 CTNNB1 유전자 프로모터의 MP53BS에 직접 결합할 수 있음을 시사한다. 이 모티프는 WT p53 결합 컨센서스 서열과 대략 50%(다소 다를 수 있음)의 상동성을 공유하지만, 마우스 Ctnnb1 프로모터의 모티프와 거의 동일하다(도 32d). 유사한 모티프, 특히 CCCGCCC 코어 서열은 KAT6A 및 KMT2A와 같은 많은 다른 GOF p53 결합 암 관련 유전자의 프로모터에서 발견될 수 있다(도 32d, 32e 및 표 6).
p53 돌연변이체 ChIP-seq 및 EMSA 결과와 일치하여, 내인성 p53 R248W의 녹다운(KD)이 VCaP 세포의 mRNA와 단백질 수준 모두에서 β-카테닌 발현을 억제하는 것으로 확인되었으며(도 25j 및 25k), 이는 β-카테닌 발현 조절에 GOF p53 돌연변이체의 중요한 역할을 나타낸다. VCaP 세포와 유사하게 TP53 유전자가 돌연변이(R223L/V274F)되고 ETS 패밀리 단백질(예를 들어, ETV4)이 DU145 PCa 세포주에서 발현된다. GOF p53 돌연변이체의 KO는 또한 DU145 세포에서 β-카테닌 발현을 감소시켰다(도 33a 및 33b). 대조적으로, LNCaP 세포에서 내인성 WT p53의 KO는 β-카테닌 mRNA 및 단백질 발현에 뚜렷한 영향을 미치지 않았다(도 33c 및 33d).
p53-KO/ETV4 발현 DU145 세포에서 WT p53 또는 다양한 돌연변이체의 발현이 회복되었다. EMSA 결과와 일치하여, DBD 돌연변이체 R175H, C248Y 및 R248W의 발현이 구조되었지만 WT p53 및 Q331R은 β-카테닌 발현을 유도하지 않았다(도 33e 및 33f). 이러한 데이터는 GOF p53 돌연변이체가 PCa 세포에서 β-카테닌 발현을 상향조절하는 능력을 공유했음을 시사한다. 이러한 관찰 결과와 일치하여, RNA-seq 결과는 ERG 및 p53 R172H의 공동발현이 GEM 마우스의 뮤린 전립선 종양에서 Ctnnb1 mRNA 발현을 증가시킨다는 것을 보여주었다(도 33g 및 33h). p53 R172H 녹인 단독으로는 마우스 전립선에서 Ctnnb1 유전자 발현을 상향조절하는 데 불충분하였으며(도 33g), 이는 ERG 과발현이 CTNNB1 발현의 GOF p53 돌연변이 조절을 프라이밍한다는 것을 의미한다. 이 개념은 ERG가 CTNNB1 유전자 프로모터에도 결합하고 ERB 결합 서열(ERGBS)의 두 핵심 요소가 이 유전자좌의 MP53BS 측면에 위치한다는 ChIP-seq 데이터에 의해 뒷받침된다(도 33i). 더욱이, VCaP 세포의 ERG KD는 CTNNB1 mRNA 및 β-카테닌 단백질의 발현도 하향조절하고, 효과는 두 가지 모두의 KD에 의해 강화되는 것으로 나타났다(도 25j 및 25k). 마지막으로, 진행성 PCa 환자의 SU2C 데이터에 대한 메타 분석을 수행하였다. CTNNB1 mRNA 수준은 p53 WT 또는 동형접합성 결실이 있는 샘플과 비교하여 p53의 DNA 결합 도메인(DBD)에 돌연변이가 있는 종양에서 유의하게 더 높은 것으로 밝혀졌다(도 25l). 종합하여, 이러한 데이터는 GOF p53 돌연변이체가 프로모터에 결합하여 CTNNB1 유전자를 상향 조절한다는 개념을 뒷받침한다.
ERG와 β-카테닌은 PCa에서 PSG 발현을 공동 조절한다
UMPS, RRM1, RRM2 및 TYMS는 피리미딘 합성에 필요한 핵심 효소이다(도 24e). ERG 또는 p53 R248W KD의 효과와 유사하게, β-카테닌 KD 단독도 VCaP 세포에서 단백질 및 mRNA 수준 모두에서 이들 PSG의 발현을 억제하였다(도 26a 및 26b). ERG 또는 p53 R248W KD는 β-카테닌 결핍 세포에서 이들 유전자의 발현을 추가로 감소시키지 못했으며(도 26a 및 26b), 이는 β-카테닌이 p53 돌연변이체 및 ERG에 의한 PSG 발현 조절의 필수적인 하류 매개자임을 시사한다. 이 가설을 뒷받침하기 위해, ChIP-seq 및 ChIP-qPCR 데이터 분석은 ERG 및 β-카테닌 둘 다 이러한 PSG 유전자좌에서 프로모터 및/또는 추정 인핸서에 결합한다는 것을 보여주었다(도 26c-26e, 34a 및 34b).
RRM1 , RRM2 및 TYMS 유전자좌에서 프로모터의 ERG 결합과 추정 인핸서의 β-카테닌 점유 사이의 가능한 상호작용을 확인하기 위해 염색체 입체구조 분석(3C 분석)을 수행하였다. ERG△N39 및 p53 돌연변이체(R248W) 둘 다의 동시 발현만이 p53-KO DU145 세포에서 mRNA 수준에서 이들 PSG의 발현을 실질적으로 증가시키고(도 26g 및 26h) 이들 PSG 유전자좌에서 ERG- 및 β-카테닌-점유 부위 사이에 공간 루프형성을 유도하지만 각각의 단독은 그러지 못하는 것으로 밝혀졌다(도 26i, 34c 및 34d). 그러나, 이들 PSG의 염색질 루프형성 및 발현에 대한 ERG△N39 및 p53 R248W의 효과는 β-카테닌 KD에 의해 완전히 역전되었다(도 26g-26i, 34c 및 34d). 염색질 루프형성 결과는 또한 이들 유전자좌에서 히스톤 H3 리신 27 아세틸화(H3K27ac) 및 세린-2 인산화된 RNA 폴리머라제 II(Pol II S2-p)의 강화된 농축과 일치하였다(도 34e 및 34f). 이러한 데이터는 PSG 유전자좌의 ERG-결합 부위와 β-카테닌 결합 부위 사이에서 염색질 루프형성이 발생하여 H3K27ac 수준의 증가, Pol II의 동원 및 이러한 PSG의 발현을 유발하는 가상 모델을 뒷받침한다(도 26j).
다음으로, 피리미딘 합성에 대한 ERG 및 p53 돌연변이 발현의 영향을 확인하였다. 내인성 ERG△N39 및 p53 R248W를 VCaP 세포에서 녹다운시키고 피리미딘 합성을 위한 두 가지 주요 중간체인 UMP 및 dTDP의 수준을 측정하였다(도 24e). ERG 및 p53 R248W 둘 다의 KD는 VCaP 세포에서 UMP 및 dTDP의 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 입증되었다(도 26k-26m). 가장 중요한 것은, 피리미딘 합성을 위한 세 가지 주요 효소인 UMPS, RRM1 및 RRM2의 고갈(도 24e)이 개별적으로 또는 함께 VCaP 세포 성장을 크게 억제하였다는 것이다(도 26n 및 26o). 이러한 데이터는 이러한 PSG의 발현 증가가 TMPRSS2-ERG/p53 돌연변이 양성 PCa 세포의 성장에 중요하다는 것을 나타낸다.
ERG와 β-카테닌에 의한 PSG의 공동 조절의 임상적 관련성을 확인하기 위해, PCa의 TCGA 코호트에서 RNA-seq 데이터의 메타 분석을 수행하였다. TMPRSS2 -ERG 양성 환자 샘플 중에서 CTNNB1 mRNA 발현이 UMPS , RRM1 및 RRM2를 포함하여 조사된 주요 PSG의 수준과 양의 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(도 27a). 추가 분석에 따르면 이들 3가지 PSG의 높은 수준의 발현은 해당 환자의 불량한 전체 생존율과 유의하게 연관되어 있는 것으로 나타났다(도 27b). 배양 세포주와 환자 표본의 데이터는 ERG와 β-카테닌 모두가 PCa 세포에서 PSG의 상향 조절에 중요하다는 것을 시사한다.
CBP PROTAC에 의한 β-카테닌 억제는 PSG 발현 및 종양 성장을 억제한다
VCaP 세포에서 PSG 발현에 있어서 β-카테닌의 중요성과 일치하여, β-카테닌이 VCaP 세포 성장에도 필요하다는 것이 입증되었다(도 35a). ICG-001로 VCaP 세포를 처리하면 mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서 PSG 및 표준 β-카테닌 표적 유전자 CCND1 및 c- MYC의 발현이 감소하고 용량 의존 방식으로 세포 성장이 억제된다는 것이 입증되었다(도 35b-35d). PRI-724는 2세대 특이적 β-카테닌/CBP 길항제인 C-82의 전구약물이다. ICG-001의 효과와 유사하게, PRI-724 처리는 PSG, CCND1 및 c-MYC의 발현 및 VCaP 세포의 성장을 억제하는 결과를 가져왔다(도 35e-35g).
PROTAC 기술은 POI를 E3 유비퀴틴 리가제 근처에 가져와 관심 단백질(POI)의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 유도하는 이작용성 소분자 키메라를 설계하여 개발되었다. CBP-결합 리간드로서 ICG-001을 사용하여 일련의 CBP PROTAC(CP1 내지 CP4)을 합성하였다(도 27c 및 27d). CP2 처리는 VCaP 세포에서 CBP 단백질의 하향조절을 효과적으로 유도한 것으로 밝혀졌다(도 27e). 이 효과는 CBP의 CP2-유도 프로테아좀 분해에 의해 매개될 가능성이 높은데, 그 이유는 CP2 처리가 CBP 폴리유비퀴틴화를 크게 증가시키고 그 효과가 프로테아좀 억제제 MG132에 의해 차단되었기 때문이다(도 27f 및 27g).
다음으로 β-카테닌 표적 유전자 발현 및 ERG/GOF p53 양성 PCa 세포의 성장에 대한 CP2의 효과를 조사하였다. CP2 처리는 VCaP 세포에서 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 PSG, CCND1 및 c- MYC의 발현을 크게 감소시켰다(도 27h 및 27i). CP2는 또한 VCaP 세포 성장을 억제하였다(도 27j). 그러나, 이 효과는 배양 배지에서 dTTP/dCTP의 보충에 의해 역전되었으나, dATP/dGTP에 의해서는 그렇지 않았다(도 27k). 이러한 데이터는 세포 성장에 대한 CP2의 억제 효과가 주로 피리미딘 합성 경로의 억제를 통해 매개된다는 것을 의미한다.
종양 성장에 대한 CBP PROTAC의 효과를 평가하기 위해, VCaP 이종이식편을 생성하고 마우스를 비히클, β-카테닌/CBP 소분자 억제제 ICG-001(양성 대조군) 또는 CP2로 처리하였다. CP2 처리는 마우스에서 VCaP 종양의 성장을 억제하였고 억제 효과는 ICG-001보다 훨씬 컸으며(도 27l, 27m 및 35h), 이는 CP2의 IC50이 ICG-001의 IC50보다 낮았다는 발견과 일치한다(도 34i). 반대로, CP2 또는 ICG-001로 처리하면 마우스 체중에 명백한 유해 효과를 초래하지 않았으며(도 35j), 이는 이들 두 화합물의 사용된 용량이 마우스에서 어떠한 일반적인 독성도 유발하지 않았음을 나타낸다. 종양 성장과 일치하여, IHC 분석은 CP2 처리가 CBP, 피리미딘 합성 효소 단백질(예를 들어, UMPS 및 RRM1) 및 Ki67의 발현 수준을 감소시키는 것으로 나타났다(도 35k). 종합하면, 이러한 결과는 신호전달 결절 β-카테닌/CBP를 표적화하여 피리미딘 합성 경로를 억제하는 것이 TMPRSS2-ERG/GOF p53 양성 PCa에 대한 실행 가능한 치료 옵션임을 나타낸다.
ERG/ GOF p53 돌연변이 PCa에서 β-카테닌 - LEF / TCF 복합체의 치료적 표적화
β-카테닌은 DNA 결합 파트너인 LEF1 및 TCF1, TCF3 및 TCF4를 포함한 기타 LEF/TCF 패밀리 단백질과 단백질 복합체를 형성하여 표적 유전자를 트랜스활성화한다. ERG/GOF p53 돌연변이 PCa 세포에서 β-카테닌의 비정상적인 상향 조절은 이 세포 유형이 LEF1 O'PROTAC의 항암 효능을 테스트하기 위한 이상적인 모델을 나타냄을 예고한다. 효과적인 LEF1 O'PROTAC(OP-V1)은 VCaP 세포에서 LEF1 단백질을 거의 완전히 제거하였다. 이 O'PROTAC은 또한 TCF3 및 TCF4 단백질을 어느 정도 하향조절했는데, 이는 LEF/TCF 단백질 패밀리의 구성원이 TCAAAG와 유사한 핵심 DNA 서열에 결합한다는 관찰 결과와 일치한다(도 28a 및 28b). TCF1은 VCaP 세포에서는 거의 검출되지 않았기 때문에 조사하지 않았는데, 이는 TCF1 발현이 전립선 조직에서 검출될 수 없음을 보여주는 유전자형 조직 발현(GTEx) RNA-seq 데이터와 일치한다(www. proteinatlas.org/). 중요하게는, 이 LEF1/TCF OP는 또한 배양물에서 피리미딘 합성 효소 단백질의 발현 및 VCaP 세포의 성장을 억제하였다(도 28b 및 28c).
다음으로 ERG/GOF p53 돌연변이 PCa 오르가노이드 및 PDX를 사용하여 LEF1/TCF O'PROTAC의 항암 효능을 확인하고자 하였다. LuCaP 23.1 PDX 및 이의 안드로겐 비의존성(거세 저항성) 하위계열 LuCaP 23.1AI는 TMPRSS2 -ERG 양성이고 TP53의 한 대립유전자가 결실되어 있다(Kumar et al., 2011). 모 LuCaP 23.1 PDX 종양은 또한 p53 DBD에 C238Y 돌연변이를 보유한다(도 28d). p53 C238Y 돌연변이체가 CTNNB1 프로모터의 MP53BS에 결합하였다는 EMSA 결과와 일치하여(도 25i), p53 KD는 LuCaP 23.1 PDX 유래 오가노이드(PDXO)에서 β-카테닌 단백질 발현을 크게 감소시켰으며(도 28e), 이는 LuCaP 23.1 β-카테닌-LEF/TCF 경로 억제의 항암 효능을 테스트하기 위한 이상적인 모델 시스템임을 강조한다.
LEF1/TCF OP 처리는 주요 피리미딘 합성 효소의 단백질 발현을 억제할 뿐만 아니라 LuCaP 23.1 PDXO의 성장을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 28f-28h). 가장 중요하게는, 이 효과는 dTTP/dCTP의 보충에 의해 거의 완전히 역전되었으나 dATP/dGTP의 보충에 의해서는 그렇지 않았으며(도 28g 및 28h), 이는 LEF1/TCF OP의 항암 효과가 주로 피리미딘 합성의 억제를 통해 매개됨을 시사한다. 대조군 OP 또는 비히클의 효과와 비교하여, LEF1/TCF OP의 처리는 마우스 체중의 명백한 감소를 전혀 유발하지 않으면서 LuCaP 23.1 PDX 종양의 성장을 현저하게 차단하였다(도 28i-28l). 면역조직화학(IHC) 및 웨스턴 블롯 분석에서 LEF1/TCF OP는 LEF1 및 기타 LEF/TCF 단백질과 UMPS 및 RRM1과 같은 피리미딘 합성 효소의 발현을 감소시켰을 뿐만 아니라 Ki67 양성 세포 수를 크게 감소시킨 것으로 나타났다(도 28m, 28n, 35l). 이러한 결과는 O'PROTAC을 사용하여 LEF/TCF 단백질을 표적화하여 β-카테닌 및 PSG 발현을 억제하면 TMPRSS2 -ERG 융합 및 GOF p53 돌연변이가 있는 PCa의 성장을 효과적으로 차단할 수 있음을 나타낸다.
종합하면, 이러한 결과는 β-카테닌이 ERG/GOFG p53 돌연변이 PCa의 치료 표적이 될 수 있음을 입증한다(도 29). 예를 들어, CBP PROTAC 및/또는 LEF1/TCF O'PROTAC을 사용하여 β-카테닌을 억제하면 ERG/GOF p53 양성 PCa뿐만 아니라 GOF p53 돌연변이 단백질을 발현하는 혈액 악성 종양 및 고형 종양과 같은 다른 암 유형을 치료하는 데 효과적일 수 있다.
실험 모델 및 주제 세부사항
세포 및 오가노이드 배양
VCaP, DU145, LNCaP 및 293T 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. DU145 및 LNCaP 세포를 10% 우태 혈청(FBS)(Gbico)이 함유된 RPMI 1640 배지(Corning)에서 배양하였다. VCaP 및 293T 세포를 10% FBS(Millipore)가 보충된 DMEM 배지(Corning)에서 성장시켰다. 모든 세포는 5% CO2가 공급되는 37℃에서 인큐베이션하였다. 후속 실험에 앞서 세포를 플라스모신(Invivogene)으로 처리하여 마이코플라스마를 박멸하였다.
오가노이드는 설명된 방법을 사용하여 LuCaP 23.1 환자 유래 이종이식편(PDX)으로부터 생성하였다(Drost et al., 2016). 간략하게, 오가노이드를 다른 인자가 보충된 FBS 무함유 DMEM/F-12 배지와 혼합된 40 μL Matrigel(Sigma)에서 배양하였다.
형질감염 및 렌티바이러스 감염
제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific) 또는 폴리에틸렌이민(PEI)(Polysicences, 23966)을 사용하여 지시된 플라스미드로 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 렌티바이러스 패키지의 경우, Lipofectamine 2000을 사용하여 psPAX2, pMDG.2 및 shRNA에 대한 플라스미드로 293T 세포를 공동 형질감염시켰다. 바이러스가 함유된 상층액을 48시간 후에 수거하고 0.45 μm 필터(Millipore)로 여과한 후 세포에 추가하였다. 지시된 세포를 폴리브렌(5 μg/mL)(Millipore) 존재 하에 바이러스 함유 상청액와 합하고 1 μg/mL 퓨로마이신(Selleck)으로 선별하였다.
세포 성장 분석
VCaP 세포를 96웰 플레이트에 웰당 5,000개 세포의 밀도로 하룻밤 접종하였다. 지시된 시점에서 세포 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 MTS(Promega)와 함께 인큐베이션한 후 세포의 광학 밀도(OD)를 마이크로타이터 판독기(Biotek)로 490 nm에서 측정하였다. CP-2, ICG-001 또는 PRI-724로 처리하기 위해 세포를 96웰 플레이트에 하룻밤 접종한 후 지시된 화합물을 첨가하였다. OD 값은 지시된 시점에서 측정하였다.
유전자 조작된 마우스 모델 및 유전자형 분석
지시된 표적군 및 대조군 마우스는 다음 마우스를 교배하여 생성하였다: 국립 암 연구소(NCI) 마우스 저장소에서 획득한 프로바신(Pb) 유도 Cre4 재조합효소 트랜스제닉 마우스; Jackson Laboratory에서 구입한 형질전환 ERG 마우스(카탈로그 번호 010929); NCI 마우스 저장소에서 획득한 Trp53 loxp/loxp 조건부 마우스; 및 NCI 마우스 저장소에서 획득한 Trp53 loxp-STOP-loxp-R172H 조건부 마우스. PCR 유전형 분석 프라이머는 표 6에 나열되어 있다.
헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 면역조직화학(IHC)
지시된 마우스의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 전립선 조직에서 4 μm 절편을 연속적으로 절단하였다. 조직은 자일렌으로 파라핀을 제거한 후 100%, 95%, 70% 에탄올과 물을 통해 차례로 재수화하였다. 헤마톡실린 염색 및 Scott's Bluing 용액(40.1 g MgSO4-7H2O, 2g 탄산수소나트륨, 1L H2O) 세척 후 조직을 1% 에오신으로 대비염색하였다. 95% 에탄올로 세척한 후, 조직을 95% 및 100% 에탄올로 탈수시켰다. 마지막으로 염색된 조직을 자일렌에 넣고 커버슬립을 장착하였다.
IHC의 경우, 조직을 재수화하고 내인성 퍼옥시다제 활성을 파괴하고 항원을 회수하였다. IHC에 대한 항체는 다음과 같다: 항-AR(ab108341, Abcam), 항-ERG(ab92513, Abcam), 항-Ki67(ab15580), 항-UMPS(NOVUS, #85896), 항-RRM1(Cell signaling technology, #8637), 항-CBP(Santa Cruz Biotechnology, sc-583), 항-LEF1(Cell signaling technology, #2230S). 정량화를 위해, 양성 세포의 백분율을 곱하여 염색 점수를 결정했으며 강도는 1(약한 염색), 2(중간 염색), 3(강한 염색) 범위였다. Ki67 정량화를 위해, 핵에 양성 염색이 있는 세포를 포함시켜 Ki67 양성 염색 세포의 백분율을 계산하였다.
RNA 추출 및 RT- qPCR
제조사의 지시에 따라 Trizol 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 배양된 세포 또는 오르가노이드로부터 총 RNA를 추출하였다. 역전사효소(Promega)를 사용하여 상보성 DNA를 합성하였다. mRNA 발현 수준은 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad)과 함께 SYBR Green Mix(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 실시간 정량적 PCR(qPCR)에 의해 결정하였다. 상대적인 유전자 발현은 항존 유전자 액틴 베타(ACTB)의 발현에 대해 정규화하였다. qPCR에 사용된 프라이머 서열은 표 15에 나열되어 있다.
[표 15]
공동면역침전(Co-IP) 분석
VCaP 세포를 지정된 농도의 CP2로 24시간 동안 처리하고 20 μM MG132(Millipore)로 추가 8시간 동안 처리한 후 수집하였다. 세척 후, 세포를 프로테아제 억제제(Sigma)를 포함하는 IP 완충액(0.5% NP-40, 20 mM Tris-HCl, pH=8.0, 10 mM NaCl, 1mM EDTA)에서 용해시켰다. 항-CBP 항체를 세포 용해물에 첨가하고 단백질 A/G 비드(Millipore)와 함께 하룻밤 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯에 의한 추가 분석을 위해 비드를 세척하고 단백질 로딩 염료(Bio-Rad)와 함께 끓였다.
GST 태그된 재조합 단백질 정제
야생형(WT) 및 돌연변이 p53을 포함하는 GST 태그된 p53 발현 플라스미드를 이. 콜라이 BL21에 형질전환시켰다. 성공적으로 형질전환된 BL21을 인큐베이터 진탕기의 플라스크에서 배양하고 18℃에서 하룻밤 100 μM IPTG(Sigma)로 처리하였다. 유도된 BL21을 수집하고 프로테아제 억제제(Sigma)가 포함된 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 재현탁하고 초음파 처리하였다. GST-p53(WT/돌연변이체) 단백질을 농축하기 위해 글루타티온 아가로스(Thermo Fisher Scientific)를 첨가하였다. 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 중 10 mM 환원 글루타티온(Sigma)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 아가로스와 함께 인큐베이션하였다. 경쟁된 단백질을 원심분리기로 수집하고 추가 사용을 위해 -80℃에 보관하였다.
핵 추출 및 전기영동 이동성 이동 분석( EMSA )
이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 사용 전 상용 키트(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 89818)를 사용하여 프로브로서 비오틴으로 표지하였다. 표지된 프로브를 NE-PER™ 핵 및 세포질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 78833)을 사용하여 VCaP 세포로부터 제조된 핵 추출물 또는 제조사(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 20148)가 제공하는 프로토콜에 따른 정제된 GST-p53 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 슈퍼시프트 분석을 위해, 항-p53 항체를 비오틴-표지된 프로브와 혼합된 세포 핵 추출물에 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 6%의 비변성 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다.
RNA- seq 분석
RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)에 의한 RNA 추출을 위해 마우스의 전립선을 절제하고 수집하였다. 추출된 RNA는 Mayo Clinic의 Genome Analysis Core에서 시퀀싱을 거쳤다. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2(Illumina)를 사용하여 RNA 무결성 수치가 >9.0인 고품질 총 RNA를 사용하여 RNA-seq 라이브러리를 생성하였다. 생물학적 삼중체의 RNA 샘플을 제조사의 프로토콜에 따라 Illumina HiSeq 4000으로 시퀀싱하였다. 페어드 엔드 원시 판독은 RNA-seq 스플라이싱 판독 매퍼 STAR(v2.7.7a)를 사용하여 마우스 참조 게놈(GRCm38/mm10)의 정렬에 적용하였다. RSeQC 패키지(v2.3.6)를 사용하여 유전자 원시 및 정규화된 판독 카운트를 수행하였다. DESeq2(버전 1.30.1)를 사용하여 차등 유전자 발현 분석을 수행하였다. 오발견율(FDR: false discovery rate) 임계값 0.001을 적용하여 차등적 유전자를 얻었다.
염색질 면역침전( ChIP ) 및 ChIP - qPCR
VCaP 세포를 고정하고 Bioruptor(Diagenode)를 사용하여 초음파 처리하였다. 상층액을 얻고 단백질 A/G 비드와 항-p53 또는 항-ERG 항체를 첨가하였다. 하룻밤 인큐베이션한 후, 비드를 세척하고 DNA를 포함하는 복합체를 65℃에서 용출하였다. 용출액은 RNAase 및 프로테이나제 K로 추가 처리하였다. 고처리량의 시퀀싱 또는 정량적 PCR을 위해 농축된 DNA를 추출하였다.
ChIP-seq 분석을 위해 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, Illumina HiSeq 4000 플랫폼을 사용하여 고처리량 시퀀싱을 수행하였다. 원시 판독은 bowtie2(버전 2.2.9)를 사용하여 인간 참조 게놈(GRCh37/hg38)에 적용하였다. MACS2(버전 2.1.1)를 실행하여 p 값 임계값이 1 x 10-5인 피크 호출을 수행하였다. 시각화를 위해 UCSC Genome Browser를 사용하여 BigWig 파일을 생성하였다. GREAT(Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool)에 의해 잠재적인 표적 유전자에 대한 피크 할당을 수행하였다. 마우스 전립선 조직에서 생성된 ERG ChIP-seq 데이터는 NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)에서 접속 번호 GSE47119로 다운로드받았다. β-카테닌 ChIP-seq 데이터는 GEO에서 등록 번호 GSE53927로 다운로드받았으며, 유방암 세포주의 p53 ChIP-seq 데이터는 GEO에서 등록 번호 GSE59176으로 다운로드받았다.
염색체 입체구조 분석(3C 분석)
3C 분석은 다른 곳에 설명된 바와 같이 수행하였다(예를 들어 Hagege et al., Nature Protocols, 2:1722-1733 (2007) 참조). 간략하게, 세포를 교차결합시키고 용해시켰다. 지시된 제한 효소로 염색질을 분해하였다. 역전 및 결찰 후, DNA를 정제하고 추가 분석을 실시하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용하였다.
마우스에서 PCa 이종이식편의 생성 및 처리
6주령 SCID 수컷 마우스를 연구에 사용하였다. Matrigel 혼합물(1ХPBS:Matrigel(BD Biosciences)=1:1)과 혼합된 VCaP 세포(5Х106)를 마우스에 피하 주사하였다. 이종이식편의 크기가 약 100 mm3에 도달한 후, 마우스에 주당 5일 동안 비히클(90% 옥수수유(Sigma-Aldrich) + 10% DMSO), ICG-001 또는 CBP PROTAC CP2을 25 mg/kg으로 복강 내 처리하였다. LEF1/TCF O'PROTAC 투여를 위해 마우스에 LuCaP23.1 PDX 종양을 거의 동일한 부피로 이식하였다. PDX 부피가 100 mm3에 도달했을 때 LEF1/TCF OP를 마우스에 정맥 내 투여하였다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 3일마다 측정하였으며, 종양 부피는 (L Х W2)/2 공식으로 계산하였다. 마우스를 안락사시키고 지정된 날짜 동안 처리 후 종양 이식편을 절제하였다. 종양 조직을 포르말린 고정 및 파라핀 포매 처리하거나 단백질 추출을 위해 용해시켰다.
방법
ICG -001 유래 PROTAC의 설계
소분자 ICG-001은 원래 CBP에 결합하고 β-카테닌-LEF/TCF 복합체 기능을 억제하는 것으로 확인되었다. ICG-001의 비오티닐화 유도체를 합성하여 CBP의 성공적인 풀다운을 위해 사용하였다는 점을 고려하면, ICG-001의 페닐-메탄아민 기의 메타 -위치에 대한 비오틴-링커의 부착은 CBP에 대한 이 소분자의 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 추론되었으며, 이는 PROTAC의 링커가 ICG-001의 동일한 위치에 부착될 수 있음을 시사한다(반응식 1).
[반응식 1] ICG-001 유래 PROTAC의 설계
ICG -001 유래 PROTAC의 합성
ICG-001 유래 PROTAC의 합성은 1,3- 페닐렌디메탄아민의 하나의 아민 기를 Fmoc 보호기로 부분적으로 보호하여 화합물 1을 얻는 것으로 시작하였다. 그 후 다른 아민 기는 트리포스겐과 이소시아네이트화 반응을 거친 후 tert -부틸 3- 아미노프로파노에이트 염산염과 우레아 형성 반응을 통해 화합물 2를 얻었다. 이어서, 트리플루오로아세트산으로 tert -부틸 기로부터 탈보호시킨 후, 생성된 분자는 HATU에 의해 촉매되는 (S)-3-(4-( tert - 부톡시 )페닐)-N-(2,2- 디에톡시에틸 )-N-(나프탈렌-1-일메틸)프로판아미드와 아미드 형성 반응을 거쳤다. 얻은 화합물 3을 포름산과 환화 반응시켜 화합물 4를 얻었다. 그 후, 디에틸아민을 이용한 탈보호 반응에 의해 화합물 5를 얻었다. 이어서, 생성된 화합물은 상이한 길이의 링커와 접합된 각각의 E3 리가제 리간드와 HATU 촉매화된 아미드 형성 반응을 거쳐, 각각 상이한 길이의 링커를 갖는 PROTAC 유래 화합물을 얻었다.
[반응식 2] ICG-001 유래 PROTAC의 합성 반응식
[반응식 3] 합성된 ICG-001 유래 PROTAC
[반응식 4] ICG-001 유래 PROTAC의 합성 반응식
1의 합성: Fmoc 클로라이드(0.65 g, 2.5 mmol)을 함유한 DCM 용액(10 mL, 무수)을 1,3-페닐렌디메탄아민(0.68 g, 5.0 mmol) 및 트리메틸아민(1.4 mL, 10 mmol)을 함유한 DCM 용액(10 mL, 무수)에 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 빙조에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 물(20 mL)과 DCM(20 mL Х 3)을 첨가하고 유기층을 모아 무수 Na2SO4로 건조시킨 후 진공에서 농축하였다. 생성된 고체는 다음 단계에 바로 사용하였다. MS m/z [M + 1] 358.9.
2의 합성: 트리포스겐(0.74 g, 2.5 mmol)을 화합물 1(2.5 mmol) 및 트리메틸아민(1.05 mL, 7.5 mmol)을 함유하는 DCM 용액(20 mL, 무수)에 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 빙조에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 반응 종결을 확인한 후, H-베타-Ala-OtBu HCl(0.45 g, 2.5 mmol)을 용액에 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 추가 8시간 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 용액을 진공에서 농축하였다. 플래시 크로마토그래피(EA/헥산 0-80%)를 통해 A-SM2를 백색 고체(0.52 g, 39.27%)로 산출하였다. MS m/z [M + 1] 529.8. 1 H NMR (400 MHz, dmso) δ 7.88 (dd, J = 10.4, 7.0 Hz, 3H), 7.70 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.33 (dd, J = 10.9, 4.0 Hz, 2H), 7.25 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 10.2, 7.5 Hz, 3H), 6.55 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 6.07 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.23 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.17 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 3.22 - 3.15 (m, 2H), 2.32 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.39 (s, 9H).
3의 합성: 화합물 2(2.50 g, 4.72 mmol)를 혼합 용액(DCM:TFA = 3:1, 40 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 하룻밤 교반하였다. 그 후, 반응액을 진공에서 농축하였다. 그 후, DMF(30 mL)를 빙조 상에서 생성된 오일에 첨가하고, A3(2.48 g, 5.04 mmol), HATU(5.57 g, 6.75 mmol) 및 DIPEA(2.35 mL, 13.50 mmol)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 하룻밤 교반하였다. 그 후, 물(50 mL)과 EA(50 mL Х 3)를 첨가하고 유기층을 모아 H2O(50 mL Х 2)와 염수(50 mL)로 세척한 후 무수 Na2SO4로 건조시키고 진공에서 농축하였다. 플래시 크로마토그래피(EA)로 B4를 복숭아색 고체(2.87g, 67.26%)로 산출하였다. MS m/z [M + 1] 948.6. 1 H NMR (400 MHz, dmso) δ 8.05 - 7.99 (m, 1H), 7.98 - 7.92 (m, 1H), 7.87 (dd, J = 12.7, 7.4 Hz, 4H), 7.70 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.59 - 7.51 (m, 2H), 7.47 - 7.37 (m, 3H), 7.32 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.24 (dd, J = 9.2, 6.9 Hz, 2H), 7.09 (t, J = 9.7 Hz, 5H), 6.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.49 - 6.42 (m, 1H), 5.94 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 5.15 - 4.99 (m, 2H), 4.33 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.29 - 4.20 (m, 2H), 4.19 - 4.08 (m, 4H), 4.05 - 3.95 (m, 1H), 3.63 - 3.38 (m, 4H), 3.30 - 3.18 (m, 2H), 3.19 - 3.09 (m, 2H), 2.95 - 2.86 (m, 2H), 2.23 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.20 (s, 9H), 0.99 (t, J = 6.9 Hz, 6H).
4의 합성: 화합물 3(2.75 g, 2.90 mmol)을 포름산(40 mL)에 용해시키고 혼합물을 N2 분위기 하에 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 진공에서 농축하였다. 플래시 크로마토그래피(EA)로 A7을 백색 고체(82 mg, 80.12%)로 산출하였다. MS m/z [M + 1] 800.0. 1 H NMR (400 MHz, dmso) δ 8.32 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.17 - 8.11 (m, 1H), 7.97 (dd, J = 6.9, 2.5 Hz, 1H), 7.93 - 7.86 (m, 2H), 7.86 - 7.81 (m, 1H), 7.57 (ddt, J = 9.6, 6.6, 3.5 Hz, 4H), 7.52 - 7.46 (m, 1H), 7.42 (dd, J = 7.4, 1.1 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 7.34 (td, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 15.7, 8.3 Hz, 2H), 7.18 (s, 1H), 7.05 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.65 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.28 (s, 1H), 5.75 (dd, J = 10.7, 4.0 Hz, 1H), 5.18 - 5.07 (m, 2H), 4.92 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 15.2, 5.8 Hz, 1H), 4.26 - 4.05 (m, 3H), 4.01 (dt, J = 7.2, 5.7 Hz, 1H), 3.91 - 3.81 (m, 1H), 3.68 (s, 2H), 3.56 (t, J = 11.1 Hz, 1H), 3.50 (s, 1H), 3.18 - 3.13 (m, 1H), 3.06 (dd, J = 12.4, 6.8 Hz, 2H), 2.07 (s, 2H).
5의 합성: 화합물 4(2.30 g, 2.88 mmol)를 DCM(20mL)에 용해시켰다. 이어서, 디에틸아민(DEA)(10 mL, 과량)을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 교반하였다. TLC로 반응 종료를 확인한 후 DCM을 감압 증류 제거하였다. 플래시 크로마토그래피(MeOH/DCM 0-10%)로 B6을 황색 고체(1.11 g, 66.83%)로 산출하였다. MS m/z [M + 1] 578.1. 1 H NMR (400 MHz, dmso) δ 8.47 (s, 2H), 8.14 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.99 - 7.94 (m, 1H), 7.90 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.63 - 7.52 (m, 3H), 7.52 - 7.46 (m, 1H), 7.38 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 15.5, 8.1 Hz, 2H), 7.19 (s, 1H), 7.07 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.53 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.78 - 5.71 (m, 1H), 5.18 - 5.07 (m, 2H), 4.91 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 15.3, 5.9 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 15.3, 5.2 Hz, 1H), 3.91 - 3.80 (m, 1H), 3.71 (s, 2H), 3.60 - 3.52 (m, 1H), 3.50 (s, 1H), 3.13 - 3.09 (m, 1H), 3.09 - 2.98 (m, 2H), 2.14 - 2.04 (m, 2H).
ICG -001 유래 PROTAC의 합성(일반 절차): 화합물 5(44 mg, 76.17 umol), 각각의 E3 리가제 리간드-링커 산(43 mg, 99-115 umol), HATU(43 mg, 114.25 umol) 및 TEA(40 uL, 228.50 umol)을 3 mL DMF에 용해시켰다. 용액을 N2 분위기 하에 하룻밤 교반하였다. TLC로 반응 종결을 확인한 후, DMF를 감압 증류 제거하였다. 플래시 크로마토그래피(MeOH/DCM 0-8%)에 이어 제조 TLC로 ICG-001 유래 PROTAC을 황색 고체(9-16 mg, 15%-40%)로 산출하였다.
CP1의 합성: CP1은 ICG-001 유래 PROTAC의 일반 절차를 따라 합성하였다. MS m/z [M + 1] 933.1. 1 H NMR (400 MHz, dmso) δ 11.10 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.31 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.99 - 7.94 (m, 1H), 7.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.60 - 7.52 (m, 3H), 7.51 - 7.44 (m, 1H), 7.38 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.24 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.13 - 7.04 (m, 4H), 7.01 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.55 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 5.75 (dd, J = 10.3, 4.2 Hz, 1H), 5.14 (dd, J = 8.7, 4.7 Hz, 1H), 5.09 (s, 1H), 5.04 (dd, J = 12.9, 5.4 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.27 (dd, J = 15.5, 5.9 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.16 (dd, J = 15.3, 5.2 Hz, 1H), 4.03 (dd, J = 14.3, 7.1 Hz, 1H), 3.91 - 3.80 (m, 1H), 3.56 (t, J = 11.1 Hz, 1H), 3.31 - 3.25 (m, 2H), 3.14 (dd, J = 11.5, 3.9 Hz, 1H), 3.05 (ddd, J = 22.5, 13.8, 9.0 Hz, 2H), 2.93 - 2.82 (m, 1H), 2.60 (s, 1H), 2.56 (s, 1H), 2.16 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.08 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 2.05 - 1.97 (m, 2H), 1.56 (d, J = 5.7 Hz, 4H). 13 C NMR (101 MHz, dmso) δ 172.82, 171.90, 170.11, 168.91, 167.30, 165.89, 165.19, 156.02, 155.85, 146.36, 140.30, 139.62, 136.25, 133.45, 132.21, 131.60, 131.08, 130.23, 128.64, 128.23 (2C), 126.83 (2C), 126.48, 126.03, 125.97, 125.50, 125.42, 125.28, 123.52, 117.17, 114.95, 110.37, 109.02, 60.23, 59.77, 55.84, 48.53, 47.28, 43.56, 41.99, 41.52, 36.09, 35.47, 34.97, 31.37, 30.99, 28.36, 22.64, 22.17, 20.79, 14.11.
CP2의 합성: CP2는 ICG-001 유래 PROTAC의 일반 절차를 따라 합성하였다. MS m/z [M + 1] 947.2. 1 H NMR (400 MHz, dmso) δ 11.11 (s, 1H), 8.30 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.99 - 7.92 (m, 1H), 7.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.61 - 7.51 (m, 3H), 7.50 - 7.44 (m, 1H), 7.38 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.26 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.15 - 6.98 (m, 5H), 6.93 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.57 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 5.81 - 5.73 (m, 1H), 5.20 - 5.13 (m, 1H), 5.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.08 - 5.01 (m, 1H), 4.92 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 15.5, 5.8 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.18 (dd, J = 15.5, 5.2 Hz, 1H), 4.05 (s, 1H), 3.86 (dd, J = 13.9, 3.8 Hz, 1H), 3.56 (t, J = 11.1 Hz, 1H), 3.25 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.17 - 3.12 (m, 1H), 3.11 - 3.00 (m, 2H), 2.88 (ddd, J = 17.5, 14.1, 5.3 Hz, 1H), 2.61 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 2.60 - 2.53 (m, 1H), 2.20 - 2.06 (m, 4H), 2.02 (ddd, J = 10.3, 6.8, 4.6 Hz, 2H), 1.55 (dt, J = 14.8, 7.5 Hz, 4H), 1.31 (dt, J = 9.4, 7.6 Hz, 2H). 13 C NMR (101 MHz, dmso) δ 172.89, 172.14, 170.18, 169.01, 167.37, 165.98, 165.28, 156.09, 155.93, 146.44, 140.35, 139.71, 136.31, 133.51, 132.23, 131.63, 131.14, 130.30, 128.69, 128.28 (2C), 126.89 (2C), 126.52, 126.07, 125.99, 125.56, 125.47, 125.34, 123.57, 117.19, 115.02, 110.45, 109.06, 69.85, 60.32, 55.92, 54.96, 48.67, 48.61, 47.35, 43.65, 42.04, 41.81, 36.15, 35.52, 35.33, 31.43, 31.05, 28.53, 26.06, 25.11, 22.23.
CP3의 합성: CP3은 ICG-001 유래 PROTAC의 일반 절차를 따라 합성하였다. MS m/z [M + 1] 975.2. 1 H NMR (400 MHz, dmso) δ 11.10 (s, 1H), 9.19 (s, 1H), 8.27 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.56 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 7.47 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.25 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.20 - 7.03 (m, 4H), 7.01 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.60 - 6.46 (m, 3H), 5.75 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 5.09 (s, 1H), 5.07 - 4.99 (m, 1H), 4.92 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 15.6, 5.6 Hz, 1H), 4.21 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.17 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.03 (dd, J = 14.3, 7.3 Hz, 1H), 3.85 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 3.56 (t, J = 11.0 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 13.0, 7.1 Hz, 2H), 3.14 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 3.04 (dd, J = 20.8, 12.0 Hz, 2H), 2.94 - 2.81 (m, 1H), 2.60 (s, 1H), 2.56 (s, 1H), 2.24 - 2.04 (m, 4H), 2.01 (d, J = 17.6 Hz, 2H), 1.51 (dd, J = 16.1, 8.3 Hz, 4H), 1.37 - 1.18 (m, 6H). 13 C NMR (101 MHz, dmso) δ 172.83, 172.10, 170.13, 168.95, 167.31, 165.89, 165.19, 156.02, 155.86, 146.41, 140.28, 139.70, 136.28, 133.46, 132.20, 131.60, 131.08, 130.24, 128.65, 128.21 (2C), 126.83 (2C), 126.47, 126.03, 125.93, 125.47, 125.42, 125.25, 123.53, 117.17, 114.94, 110.37, 108.99, 60.23, 59.78, 55.84, 48.54, 47.29, 43.58, 41.94, 41.81, 36.09, 35.46, 35.31, 31.37, 30.99, 28.67, 28.51, 26.26, 25.26, 22.15.
CP4의 합성: CP4는 ICG-001 유래 PROTAC의 일반 절차를 따라 합성하였다. MS m/z [M + 1] 961.2. 1 H NMR (400 MHz, dmso) δ 11.10 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.28 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 7.1, 2.4 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.60 - 7.52 (m, 3H), 7.51 - 7.44 (m, 1H), 7.38 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.29 - 7.22 (m, 1H), 7.13 - 7.04 (m, 4H), 7.01 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.60 - 6.48 (m, 3H), 5.75 (dd, J = 10.6, 3.9 Hz, 1H), 5.14 (dd, J = 8.7, 4.8 Hz, 1H), 5.09 (s, 1H), 5.05 (dd, J = 12.9, 5.4 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 15.5, 6.0 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.17 (dd, J = 15.6, 5.5 Hz, 1H), 4.03 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.89 - 3.80 (m, 1H), 3.56 (t, J = 11.1 Hz, 1H), 3.29 - 3.23 (m, 2H), 3.18 - 3.10 (m, 1H), 3.09 - 2.98 (m, 2H), 2.87 (ddd, J = 17.6, 14.1, 5.4 Hz, 1H), 2.60 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 2.56 (s, 1H), 2.10 (dd, J = 14.0, 6.5 Hz, 4H), 2.06 - 1.98 (m, 2H), 1.60 - 1.45 (m, 4H), 1.36 - 1.25 (m, 4H). 13 C NMR (101 MHz, dmso) δ 172.83, 172.07, 170.13, 168.95, 167.31, 165.89, 165.19, 156.03, 155.86, 146.40, 140.29, 139.70, 136.28, 133.46, 132.20, 131.60, 131.08, 130.24, 128.65, 128.21 (2C), 126.83 (2C), 126.48, 126.03, 125.93, 125.48, 125.43, 125.26, 123.53, 117.16, 114.95, 110.38, 109.00, 60.24, 59.78, 55.85, 48.54, 47.29, 43.58, 41.95, 41.81, 36.09, 35.47, 35.30, 31.37, 30.99, 28.59, 28.44, 26.11, 25.25, 22.16, 20.79, 14.11.
정량화 및 통계 분석
환자 데이터의 메타 분석
SU2C 코호트에서 TP53 유전자 돌연변이 또는 결실 상태는 ciBioPortal(www.cbioportal.org/)을 통해 얻었다: (1) 야생형(WT), (2) 동형접합성 결실(null) 및 (3) p53의 DNA 결합 도메인에 있는 GOF p53 돌연변이(Mut). mRNA 수준을 반영하는 CTNNB1의 Z-점수(FPKM)를 다운로드하여 TP53 유전자 변경 상태를 기준으로 비교하였다. 비교를 위한 p 값을 생성하기 위해 Mann-Whitney U 검정을 수행하였다.
UMPS, (2015a)RRM1, RRM2 mRNA 발현과 CTNNB1 수준의 상관 관계에 대해, 상대적인 발현은 Z=(x - μ)/σ 공식을 사용하여 Z-점수로 나타냈으며 x는 원시 log2(FPKM)를 의미하고, μ는 평균값이고 σ는 유전자의 모든 샘플에 대한 표준 편차이다. TCGA 데이터베이스로부터 ERG 융합 양성 환자를 CTNNB1 발현 수준이 낮거나(≤평균) 높은(>평균) 2개의 군으로 나누었다. 비교를 위한 p 값을 생성하기 위해 Mann-Whitney U 검정을 수행하였다. Kaplan-Meier 생존 곡선 분석에 사용되는 계층화 군 간의 통계적 차이를 결정하기 위해 로그 순위(Mantel-Cox) 검정을 수행하였다.
통계 분석
P 값은 양측 스튜던트 t 검정, 이원 분산분석 검정, 로그 순위 검정, Fisher 정확 검정 또는 χ2 검정에 의해 결정하였다. 모든 데이터는 3회의 독립적인 실험을 나타내는 실험에 대한 평균값 ± S.D.로 나타낸다. P 값 <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 18: 돌연변이 p53 O'PROTAC의 설계
각 서열에 대해 4개의 O'PROTAC을 설계하였으며 아래 나타낸 바와 같이 5'-정방향 가닥의 E3 리간드에 부착시켰다.
총 35개의 서열을 합성하고 이들을 하기 표에 나타낸다.
지질 나노입자의 제조
이온화 가능한 지질 L319(Chemicals, 카탈로그 번호 DC57006, 100mg), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC; Avanti Polar Lipids, 850365C-25mg), 콜레스테롤(Sigma-Aldrich, C8667-500mg) 및 PEG-DMG(Avanti Polar Lipids, 880151P-1g)를 55:10:32.5:2.5(L319: DSPC: 콜레스테롤: PEG-DMG)의 몰비로 혼합하였다.
siRNA는 10 mmol/L 시트레이트 완충액, pH 4에 ~1 mg/mL로 희석하였다.
지질을 용해시키고 에탄올(예를 들어, 35% 에탄올)에 적절한 비율로 혼합하였다.
주사기 펌프를 사용하여 siRNA 용액과 지질 용액을 각각 15 및 5 mL/min으로 전달하였다.
siRNA 용액과 지질 용액이 들어 있는 주사기를 PEEK 고성능 액체 크로마토그래피 튜브(siRNA 용액의 경우 0.02 인치 ID이고 지질 용액의 경우 0.01 인치 ID)로 유니온 커넥터(0.05 인치 관통 구멍, #P-728; IDEX Health & Science, Oak 미국 워싱턴주 하버 소재)에 연결하였다.
일정 길이의 PEEK 고성능 액체 크로마토그래피 튜브(0.04 인치 ID)를 유니온 커넥터의 출구에 연결하고 수집 튜브로 연결하였다.
그런 다음 에탄올을 제거하고 투석 또는 접선 흐름 정용여과를 통해 외부 완충액을 인산염 완충 식염수(155 mmol/L NaCl, 3 mmol/L Na2HPO4, 1 mmol/L KH2PO4, pH 7.5)로 교체하였다.
LNP를 0.2 μm 멸균 필터를 통해 여과하였다. Malvern Zetasizer Nano ZS(영국 말번 소재)를 사용하여 입자 크기를 측정하였다. siRNA 함량은 260 nm에서의 자외선 흡수에 의해 결정하였으며 siRNA 포착 효율은 Quant-IT Ribogreen(Invitrogen, 미국 캘리포니아 칼즈배드 소재) 분석에 의해 결정하였다.
이들 서열 중 하나 이상을 임의의 적절한 리간드에 부착할 수 있다. 예를 들어, 이들 서열 중 하나 이상을 레날리도마이드, 포말리도마이드 또는 탈리도마이드에 부착할 수 있다.
실시예 19: 예시적인 실시양태
실시양태 1. 화학식 (IA)의 화합물:
여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합할 수 있는 리간드이다.
실시양태 2. 실시양태 1에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
실시양태 3. 이상 단백질 활성에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 실시양태 1에 따른 화합물 또는 유효량의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 이상 단백질 활성에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 4. 선행하는 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 표적화 모이어티는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드인 것인 화합물, 조성물, 또는 방법.
실시양태 5. 선행하는 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 리간드는 E3 리가제 리간드인 것인 화합물, 조성물, 또는 방법.
실시양태 6. 선행하는 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 전사 인자, 전사 공동 조절인자, 폴리머라제, 뉴클레아제, 히스톤, 및 RNA 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물, 조성물, 또는 방법.
실시양태 7. 선행하는 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질의 이상 단백질 활성은 질환 또는 장애를 매개하는 것인 화합물, 조성물, 또는 방법.
실시양태 8. 선행하는 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질의 이상 단백질 활성은 암, 자가면역 질환, 중추신경계 질환, 대사 질환, 및 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 매개하는 것인 화합물, 조성물, 또는 방법.
실시양태 9. 실시양태 1에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
여기서 a는 A1의 표적화 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고, b는 A의 프로테아제 리간드에 대한 부착 지점을 나타내고, q는 1 내지 20의 정수이다.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 각각의 A1 및 Aq는 P(O)(OR L1 )O, CR L1 R L2 , O, NR L3 , CONR L3 , C(O)O, C(S)O, CO, 및 0-6개의 R L1 R L2 기로 임의로 치환된 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되며, 여기서 R L1 , R L2 및 R L3 은 H, 할로, Cl-8 알킬, 및 OC1-8 알킬로부터 각각 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
실시양태 11. 실시양태 9 또는 10에 있어서, A1은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
여기서 c는 A에 대한 부착 지점을 나타낸다.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
.
실시양태 13. 실시양태 10에 있어서, 헤테로아릴은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
.
실시양태 14. 실시양태 1에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:
여기서 각각의 n 및 m은 독립적으로 0 내지 20의 수이다.
실시양태 15. 실시양태 1에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:
여기서, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 15의 수이다.
실시양태 16. 실시양태 1-15 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 리간드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
여기서,
각각의 X는 결합, NH, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 할로, 알킬, CN, CF3, OCF3, 및 OCHF2로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R은 H 및 C1-8 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
실시양태 17. 실시양태 1-16 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 리간드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
.
실시양태 18. 화학식 (IB)의 화합물:
여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드 성분은 E3 리가제 리간드이다.
실시양태 19. 실시양태 18에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
실시양태 20. 이상 단백질 활성에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 실시양태 18에 따른 화합물 또는 유효량의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 이상 단백질 활성에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 21. 실시양태 18-20 중 어느 하나에 있어서, 표적화 모이어티는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드인 것인 화합물, 조성물 또는 방법.
실시양태 22. 실시양태 18-21 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 전사 인자, 전사 공동 조절인자, 폴리머라제, 뉴클레아제, 히스톤, 및 RNA 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물, 조성물 또는 방법.
실시양태 23. 실시양태 18-22 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질의 이상 단백질 활성은 질환 또는 장애를 매개하는 것인 화합물, 조성물 또는 방법.
실시양태 24. 실시양태 18-23 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질의 이상 단백질 활성은 암, 자가면역 질환, 중추신경계 질환, 대사 질환, 및 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 매개하는 것인 화합물, 조성물, 또는 방법.
실시양태 25. 실시양태 18에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
여기서 a는 A1의 표적화 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고, b는 A의 E3 리가제 리간드에 대한 부착 지점을 나타내고, q는 1 내지 20의 정수이다.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서, 각각의 A1 및 Aq는 P(O)(OR L1 )O, CR L1 R L2 , O, NR L3 , CONR L3 , C(O)O, C(S)O, CO, 및 0-6개의 R L1 R L2 기로 임의로 치환된 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되며, 여기서 R L1 , R L2 및 R L3 은 H, 할로, Cl-8 알킬, 및 OC1-8 알킬로부터 각각 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
실시양태 27. 실시양태 25 또는 26에 있어서, A1은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
여기서 c는 A에 대한 부착 지점을 나타낸다.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
.
실시양태 29. 실시양태 29에 있어서, 헤테로아릴은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
.
실시양태 30. 실시양태 18에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:
여기서 각각의 n 및 m은 독립적으로 0 내지 20의 수이다.
실시양태 31. 실시양태 18에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:
여기서, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 15의 수이다.
실시양태 32. 실시양태 18-31 중 어느 하나에 있어서, E3 리가제 리간드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
,
여기서,
각각의 X는 결합, NH, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 할로, 알킬, CN, CF3, OCF3, 및 OCHF2로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R은 H 및 C1-8 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
실시양태 33. 실시양태 18-32 중 어느 하나에 있어서, E3 리가제 리간드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
.
실시양태 34. 화학식 (IB)의 화합물:
여기서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있고, 상기 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드 성분은 E3 리가제에 결합할 수 있는 E3 리가제 리간드이고, E3 리가제 리간드는
으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 각각의 X는 결합, NH, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 Y는 할로, 알킬, CN, CF3, OCF3, 및 OCHF2로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 R은 H 및 C1-8 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
실시양태 35. 실시양태 34에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
여기서 a는 A1의 표적화 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고, b는 A의 E3 리가제 리간드에 대한 부착 지점을 나타내고, q는 1 내지 20의 정수이다.
실시양태 36. 실시양태 35에 있어서, 각각의 A1 및 Aq는 P(O)(OR L1 )O, CR L1 R L2 , O, NR L3 , CONR L3 , C(O)O, C(S)O, CO, 및 0-6개의 R L1 R L2 기로 임의로 치환된 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되며, 여기서 R L1 , R L2 및 R L3 은 H, 할로, Cl-8 알킬, 및 OC1-8 알킬로부터 각각 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
실시양태 37. 실시양태 35 또는 36에 있어서, A1은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
여기서 c는 A에 대한 부착 지점을 나타낸다.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
.
실시양태 39. 실시양태 35에 있어서, A1 및 Aq 중 적어도 하나는 헤테로아릴을 포함하고, 헤테로아릴은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
.
실시양태 40. 실시양태 34에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:
여기서 각각의 n 및 m은 독립적으로 0 내지 20의 수이다.
실시양태 41. 실시양태 34에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:
여기서, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 15의 수이다.
실시양태 42. 실시양태 18-41 중 어느 하나에 있어서, 표적화 모이어티는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 화합물.
실시양태 43. 실시양태 42에 있어서, 표적화 모이어티는 적어도 하나의 DNA 가닥 또는 이의 유사체를 포함하는 것인 화합물.
실시양태 44. 실시양태 42에 있어서, 표적화 모이어티는 적어도 하나의 RNA 가닥 또는 이의 유사체를 포함하는 것인 화합물.
실시양태 45. 실시양태 42에 있어서, 표적화 모이어티는 적어도 하나의 DNA 가닥 또는 이의 유사체 및 적어도 하나의 RNA 가닥 또는 이의 유사체를 포함하는 것인 화합물.
실시양태 46. 실시양태 18-45 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 전사 인자, 전사 공동 조절인자, 폴리머라제, 뉴클레아제, 히스톤, 및 RNA 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
실시양태 47. 실시양태 34-41 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 전사 인자, 전사 공동 조절인자, 폴리머라제, 뉴클레아제, 히스톤, 및 RNA 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
실시양태 48. 실시양태 18-47 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 안드로겐 수용체(AR) 폴리펩티드, ETS 관련 유전자(ERG) 폴리펩티드, 포크헤드 박스 A1(FOXA1) 폴리펩티드, 림프 인핸서 결합 인자 1(LEF1) 폴리펩티드, 에스트로겐 수용체(ER) 폴리펩티드, NF-κB 폴리펩티드, E2 인자(E2F) 폴리펩티드, 전사의 트랜스활성화인자(TAT) 폴리펩티드, Jun 원발암유전자 폴리펩티드, Fos 원발암유전자 폴리펩티드, 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 폴리펩티드, Runt 관련 전사 인자 1(RUNX1/AML1) 폴리펩티드, Myc 원발암유전자 폴리펩티드, ETS 원발암유전자 폴리펩티드, 신경교종 관련 발암유전자(GL1) 폴리펩티드, ERG/FUS 융합 폴리펩티드, T 세포 백혈병 호메오박스 1(TLX1) 폴리펩티드, LIM 도메인 단독 1(LMO1) 폴리펩티드, LIM 도메인 단독 2(LMO2) 폴리펩티드, 림프모구성 백혈병 관련 조혈 조절인자 1(LYL1/E2a 이종이량체) 폴리펩티드, MYB 원발암유전자(MYB) 폴리펩티드, 페어드 박스 5(PAX-5) 폴리펩티드, SKI 원발암유전자(SKI) 폴리펩티드, T 세포 급성 림프구성 백혈병 단백질 1(TAL1) 폴리펩티드, T 세포 급성 림프구성 백혈병 단백질 2(TAL2) 폴리펩티드, 글루코코르티코이드 수용체 폴리펩티드, IL-6 발현을 위한 핵 인자(NF-IL6) 폴리펩티드, 초기 성장 반응 단백질 1(EGR-1) 폴리펩티드, 저산소증 유발 인자 1-알파(HIF-1a) 폴리펩티드, 신호 변환기 및 전사 활성화제 1(STAT1) 폴리펩티드, 신호 변환기 및 전사 활성화제 3(STAT3) 폴리펩티드, 신호 변환기 및 전사 활성화제 5(STAT5) 폴리펩티드, V-Maf 조류 근건막성 섬유육종 발암유전자 상동체-A(MAFA) 폴리펩티드, SRY-박스 전사 인자 2(SOX2) 폴리펩티드, SRY-박스 전사 인자 9(SOX9) 폴리펩티드, CAAT/인핸서 결합 단백질 알파(CEBPA) 폴리펩티드, CAAT/인핸서 결합 단백질 베타(CEBPB) 폴리펩티드, 글로빈 전사 인자(GATA) 폴리펩티드, 근세포 인핸서 인자 2(MEF2) 폴리펩티드, POU 클래스 3 호메오박스 2(BRN2) 폴리펩티드, 징크 핑거 E-박스 결합 호메오박스 2(ZEB2) 폴리펩티드, 핵 수용체 서브패밀리 4 그룹 A 구성원 1(NR4A1) 폴리펩티드, 활성화 전사 인자 4(ATF4) 폴리펩티드, T-박스 전사 인자 21(TBX21) 폴리펩티드, RAR 관련 고아 수용체 C(RORC) 폴리펩티드, X-박스 결합 단백질(XBP-1s) 폴리펩티드, 및 종양 단백질 p53(p53)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자인 것인 화합물.
실시양태 49. 실시양태 18-48 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 돌연변이된 전사 인자이고, 전사 인자의 이상 단백질 활성은 질환을 매개하는 것인 화합물.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 질환은 암, 자가면역 질환, 중추신경계 질환, 대사 질환, 및 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
실시양태 51. 실시양태 49-50 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이된 전사 인자는 돌연변이된 p53인 것인 화합물.
실시양태 52. 실시양태 18-47 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 전사 공동 조절인자인 것인 화합물.
실시양태 53. 실시양태 52에 있어서, 전사 공동 조절인자는 CBP, p300, SRC1 패밀리 폴리펩티드, SRC2 패밀리 폴리펩티드, SRC3 패밀리 폴리펩티드, BET 폴리펩티드, TRIM 패밀리 폴리펩티드, 및 CXXC 도메인 징크 핑거 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
실시양태 54. 실시양태 18-47 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 폴리머라제인 것인 화합물.
실시양태 55. 실시양태 54에 있어서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
실시양태 56. 실시양태 18-47 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 뉴클레아제인 것인 화합물.
실시양태 57. 실시양태 56에 있어서, 뉴클레아제는 DNA2 및 FAN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
실시양태 58. 실시양태 18-47 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 히스톤인 것인 화합물.
실시양태 59. 실시양태 58에 있어서, 히스톤은 H3, H4, H2A, H2B, 및 H1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
실시양태 60. 실시양태 18-47 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 RNA 결합 단백질인 것인 화합물.
실시양태 61. 실시양태 60에 있어서, RNA 결합 단백질은 HIV 단백질 TAT, HIV 단백질 REV1, YTHDC1, YTHDC2, YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, HNRNPA2B1, HNRNPC, 및 HNRNPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
실시양태 62. 실시양태 18-61 중 어느 하나의 화합물, 및 이의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
실시양태 63. 이상 단백질 활성에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 실시양태 18-16에 따른 화합물 중 어느 하나 또는 치료 유효량의 화합물을 포함하는 실시양태 62의 약학 조성물을 이상 단백질 활성에 대한 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 이상 단백질 활성에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 가진 상기 포유동물을 치료하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 64. 실시양태 63에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인 방법.
실시양태 65. 하기 화학식 (B)의 화합물을 제조하는 방법으로서,
하기 화학식 (i)의 화합물을 하기 화학식 (ii)의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 (iii)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 방법:
여기서,
표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고;
프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합할 수 있는 리간드이고, E3 리가제 리간드는 E3 리가제에 결합할 수 있는 리간드이고;
각각의 A는 P(O)(OR L1 )O, CR L1 R L2 , O, NR L3 , CONR L3 , C(O)O, C(S)O, CO, 및 0-6개의 R L1 R L2 기로 임의로 치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 R L1 , R L2 및 R L3 은 H, 할로, Cl-8 알킬, 및 OC1-8 알킬로부터 각각 독립적으로 선택되고;
q는 1 내지 20의 정수이고;
.
실시양태 66. 실시양태 65에 있어서, 화학식 (iii)의 화합물을 탈보호하여 화학식 (B)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 67. 실시양태 66에 있어서, 화학식 (ii)의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 방법:
.
실시양태 68. 실시양태 65에 있어서, 화학식 (ii)의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 방법:
실시양태 69. 하기 화학식 (B)의 화합물을 제조하는 방법으로서,
하기 화학식 (i)의 화합물을 하기 화학식 (vii)의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 (B)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 방법:
여기서,
표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고;
프로테아제 리간드는 프로테아제에 결합할 수 있는 리간드이고, E3 리가제 리간드는 E3 리가제에 결합할 수 있는 리간드이고;
각각의 A는 P(O)(OR L1 )O, CR L1 R L2 , O, NR L3 , CONR L3 , C(O)O, C(S)O, CO, 및 0-6개의 R L1 R L2 기로 임의로 치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 R L1 , R L2 및 R L3 은 H, 할로, Cl-8 알킬, 및 OC1-8 알킬로부터 각각 독립적으로 선택되고;
q는 1 내지 20의 정수이고;
여기서 RG1은 반응기이고;
여기서 A2는 결합 및 A로부터 선택되고; RG2는 반응기 RG1과 반응하여 A를 형성할 수 있는 화학 기이다.
실시양태 70. 실시양태 69에 있어서, RG1은 아미노기이고, RG2는 활성화된 에스테르인 것인 방법.
실시양태 71. 실시양태 69에 있어서, RG1은 알킨이고, RG2는 아지드인 것인 방법.
실시양태 72. 실시양태 69에 있어서, 상기 방법은 하기 화학식 (v)의 화합물을 탈보호하여 화학식 (vi)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 방법:
여기서
PG는 보호기이다.
실시양태 73. 실시양태 69에 있어서, 반응기는 알킨, 아지드, 시클로알킨, 시클로옥텐, 테트라진, 아미노기, 히드록실기, 및 카르복실산으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 74. 실시양태 72에 있어서, 보호기는 히드록실 보호기, 아미노 보호기, 및 카르복실산 보호기로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 75. 실시양태 72에 있어서, 반응기는 아미노기이고, 보호기는 아미노 보호기인 것인 방법.
실시양태 76. 실시양태 75에 있어서, 아미노 보호기는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), tert-부톡시카르보닐(Boc), 벤자일옥시카르보닐(Cbz), 프탈이미드, 벤질, 아세틸, 및 트리플루오로아세트아미드로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 77. 실시양태 72에 있어서, 보호기는 히드록실 보호기인 것인 방법.
실시양태 78. 실시양태 77에 있어서, 히드록실 보호기는 t-부틸디메틸실릴, 디에틸이소프로필실릴, 트리페닐실릴, 포르메이트, 메톡시메틸카르보네이트, t-부틸카르보네이트, 9-플루오레닐메틸카르보네이트, N-페닐카르바메이트, 4,4'-디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 및 픽실로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 79. 실시양태 69에 있어서, 상기 방법은 하기 화학식 (i)의 화합물을 하기 화학식 (iv)의 화합물과 반응시켜 화학식 (v)의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 방법:
.
기타 실시양태
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 설명하기 위한 것이지 제한하려는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형은 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH BIOVENTURES, LLC <120> COMPOUNDS FOR PROGRAMMABLE PROTEIN DEGRADATION AND METHODS OF USE FOR THE TREATMENT OF DISEASE <130> 07039-2085WO1 <140> PCT/US2022/017931 <141> 2022-02-25 <150> 63/271,534 <151> 2021-10-25 <150> 63/158,218 <151> 2021-03-08 <150> 63/153,872 <151> 2021-02-25 <160> 449 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ttagggtaca c 11 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ttagggtaca ccgtgtacct 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 acggaccgga aatccggtt 19 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 acaggaagtg 10 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 tacaaagatc aaagggtt 18 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 gggtcagggt gacct 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 gggtcaaggt gaccc 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 gggtcatggt gaccc 15 <210> 9 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 ggtcacagtg acc 13 <210> 10 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 agtcactgtg acc 13 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 tttcgcgc 8 <210> 18 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 atgagtcat 9 <210> 19 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 wggaaaah 8 <210> 20 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 atggaaaaa 9 <210> 21 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 atggaaaat 9 <210> 22 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 atggaaaac 9 <210> 23 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 ttggaaaaa 9 <210> 24 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial 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19 <210> 101 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 gtgtcagagt ccatggga 18 <210> 102 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gatgacgtgt agtat 15 <210> 103 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 gatgacgtgt agttt 15 <210> 104 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gatgacgtgg agttt 15 <210> 105 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 gatgacgtgg agtat 15 <210> 106 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 gccccctcgc gccccgcccc ttgtc 25 <210> 107 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 gtgtacccta a 11 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 aggtacacgg tgtaccctaa 20 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 aaccggattt ccggtccgt 19 <210> 110 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 gaccggaaat ccggttcgt 19 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 acgaaccgga tttccggtc 19 <210> 112 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 aaccggattt ccggtccgta agggaaacgg accggaaatc cggtt 45 <210> 113 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 gctccttaag taaacaaac 19 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 gtttgtttac ttaaggagc 19 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 aaccctttga tctttgta 18 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 116 gatcaagtgt gacccggact 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 117 cttggggtcc atgttctgct 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 118 tacaacaccc gagcaaggac 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 119 aggctggttt tccactaccc 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 120 agcacggaaa gaaagacagc 20 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 121 tcttggacct gtacctgatg c 21 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 122 tcggagtcaa cggatttggt 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 123 ttcccgttct cagccttgac 20 <210> 124 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 tcccacaagc tcccatttcc ctgtc 25 <210> 125 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 cccggccccg gccccgcccc ggccc 25 <210> 126 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gccctcaggg gcgcctcaca ctttc 25 <210> 127 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gccgccttcc ccgccgcccc cgggt 25 <210> 128 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gcccacttcc gccccgcctg cgtcc 25 <210> 129 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 gccgccgtca gtcccgcccc caatc 25 <210> 130 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 ccccgcgcac tcccgagccc tttcc 25 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 gcttcctccc gccgcccctc cccgc 25 <210> 132 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 gccgccgggc cgcccgggcc tcttc 25 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gtcgccttgg ccgccgcctc cttcc 25 <210> 134 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 cccgccggcc gccccctccc ccgtg 25 <210> 135 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 agcccggctg gccgcgcccc tcccc 25 <210> 136 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 gctccctcgg gagtggtcct tgggc 25 <210> 137 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 gaccccgccc accctcgcgt tggtc 25 <210> 138 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 gctccctcgc gccggcgccg gctcc 25 <210> 139 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 gccacctcgc gccgtcaagc gtgat 25 <210> 140 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 gcggcctcgg gcctccgcct ctgac 25 <210> 141 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 gccccgcctg gcgcagcccc cgccc 25 <210> 142 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 gagctcgcgc ttcccgtccc ccgcc 25 <210> 143 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 gccccctctc ccttcgagcc ctcct 25 <210> 144 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 gcgctttccc gccccgcctc gccta 25 <210> 145 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 ccccgcctga gcccttcgac ttctc 25 <210> 146 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 ccgccctcag gctccgggct ttccc 25 <210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 ggccacttcc actccgcctc ctggc 25 <210> 148 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 gcctcctccc cgtccccttc ctttc 25 <210> 149 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 cacccccagc ccgccccctc gtctc 25 <210> 150 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 cgccgctccc gcccgccccc aaggc 25 <210> 151 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 tgcctcttca gccccgaccc tgacc 25 <210> 152 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ccctctttca ctccctcccc ttggc 25 <210> 153 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 gccccctccc gcgcccccta tggcc 25 <210> 154 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 gttcccttgc atctctcccc agttc 25 <210> 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<400> 166 gctcccgcgc ggccaccggc ctctc 25 <210> 167 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 gcccagtcca gcccagccca atcta 25 <210> 168 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 cggccgtccc gcagcgcccc aggtg 25 <210> 169 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 gccctcctgg gcgctgcccg ccgcc 25 <210> 170 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 ggcccgtcgc cctccggcct gggcc 25 <210> 171 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 gccccatcgc cccgcccctc ccggg 25 <210> 172 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 acctccgcgc cgccccccac gcgtc 25 <210> 173 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 ggctcccgaa gccccgcccc tggac 25 <210> 174 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 cccccctccg gctcggcgcc ggata 25 <210> 175 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 gcacctgcgc gaaccaactc ctttc 25 <210> 176 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 gccccgcccc gcccccaggc ctgac 25 <210> 177 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 tgtccctccg ggccggccac gtggc 25 <210> 178 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 gctccggcca gcccaacccc gcgcc 25 <210> 179 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 gcctcttggc gccccctcga tgctc 25 <210> 180 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 gccgccccct cccccgggcc ctgac 25 <210> 181 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 acccccttgc gttcaaagcc tttcc 25 <210> 182 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 acccgcacgc gcacacgccc ctgcc 25 <210> 183 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 gcctcctctc gcctcctccc tggaa 25 <210> 184 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 ggtcccgctc tccccacccc tcagc 25 <210> 185 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 gccccaccgg ggcccgcgcg gccac 25 <210> 186 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 gccggccgac ccccggccac ttagc 25 <210> 187 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 gcgcccccgc ctcccggccg ccgtc 25 <210> 188 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 gcccccaggg tccctccccc gccgc 25 <210> 189 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 tcccccccgt gccccgagcc tcggt 25 <210> 190 <211> 25 <212> DNA <213> 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25 <210> 202 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 tcctccgcga gccgcggccc ttgcc 25 <210> 203 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 gcccggccgc gcccgcctcc ccgag 25 <210> 204 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 ctctcccctt cccccacccc ttgcc 25 <210> 205 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 ggcctccttc cctctccccc ttgtc 25 <210> 206 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 gcctgctcgc tccctccctc ccgac 25 <210> 207 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 gcctgctcgc gcggggcgtc tgagc 25 <210> 208 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 tctcccgcgt cccctccgcc tcgcc 25 <210> 209 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 cagcgctggc gcccggcccc cttcc 25 <210> 210 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 ggccccacgc cccgaggcgc gcggc 25 <210> 211 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 tgcacctggc gctgcgccac ctgct 25 <210> 212 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 gccgtgtcgc gccccaccct gcgcc 25 <210> 213 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 gcccccgcgg gctcccggcc agggc 25 <210> 214 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 gccaccccca cccccaccgc gactc 25 <210> 215 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 cctcctccgc ccccagcgcc tcata 25 <210> 216 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 gacccccccc acctccctcc cggac 25 <210> 217 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 ggccgcgctc tcccctcctc cagtc 25 <210> 218 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 gaccctggat gcccagcctc aagtc 25 <210> 219 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 gcccgcccgc agccccgccc cacgc 25 <210> 220 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 ggcgccgcgg gaccgccctc gtgtc 25 <210> 221 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 gctccctcag gacccacgcg cggac 25 <210> 222 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 cccccgcctg gccagccgcc tcgtc 25 <210> 223 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 gcccgcgccc ctcccgcccc gcggc 25 <210> 224 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 gctccgagcc gcggcgcccc ctcgc 25 <210> 225 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 ggcgccgcga gcttctcctc tcctc 25 <210> 226 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 cgcagcgcgc gccccctccc cggcc 25 <210> 227 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 acccagtcgg cgcccactcc tcgcc 25 <210> 228 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 gtctcagagc cgccccctcc ttgtc 25 <210> 229 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 gcgcccaggt tcccctcccc agccc 25 <210> 230 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 tccccagctc ccgccgcccg tatcc 25 <210> 231 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 cgctgcccgg gccccgcccc gacgc 25 <210> 232 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 ttcccagcca gccccgcgcc tcagc 25 <210> 233 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 cctttccccc tccccttccc ttctc 25 <210> 234 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 tccgtcctgc gccctgccgc tggcc 25 <210> 235 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 acccctccaa gcttcccggc ttgtc 25 <210> 236 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 gccggcgcac gccgcccctc cggtg 25 <210> 237 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 ccctccccgc cccccgcgcc cggat 25 <210> 238 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 ttccccgccc gccctgctcc tacgg 25 <210> 239 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 gccccccgcc tccctgcccc cgggg 25 <210> 240 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 ctcccctcgc tctccgctcc cgggg 25 <210> 241 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 gcctcctcgt gtccctccgc cccct 25 <210> 242 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 atgccctctc tcacccctcc tattc 25 <210> 243 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 243 cgccagccgc gccgcgcacc gagcc 25 <210> 244 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 244 tccggcttgc gggccgccct tctcc 25 <210> 245 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 245 gccgccgctg ccgccgcccc gggcg 25 <210> 246 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 246 agcctcgggg gccccgggcc aggtc 25 <210> 247 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 247 tccccgtcgc acctctcgcc gcccc 25 <210> 248 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 gcccctgttt ccccaaaccc ttgtt 25 <210> 249 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 cgcccctccc ccccagctct tgggc 25 <210> 250 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 ccccgcggcc gctccacccc tggcc 25 <210> 251 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 cttccctccc gcactccccc gggcc 25 <210> 252 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 agccagtgac gccccgcccc cacta 25 <210> 253 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 ggcctcccgc ggccaagtcc ctgcc 25 <210> 254 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 cccccctgcc accccggccc ataac 25 <210> 267 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 gggccctcgg gcgcagccac tgacg 25 <210> 268 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 accctcaccg gcccagcctg gtttc 25 <210> 269 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 ggcccccggc gccccccggt gtccc 25 <210> 270 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 ccccgctcgg cgcacgcccc cagcc 25 <210> 271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 271 ttgcctgcat taccggtcga t 21 <210> 272 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 272 gatcctggca atttcggcta t 21 <210> 273 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 273 aacgagcgca gagttatcgt 20 <210> 274 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 274 ctaggccaca gaattgaaag atct 24 <210> 275 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 275 gtgagcctct ggaagtcgtc 20 <210> 276 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 276 gtaggtggaa attctagcat catcc 25 <210> 277 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 277 cacaaaaaca ggttaaaccc ag 22 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer 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<400> 284 ccgggcccat caacagacgt tgatact 27 <210> 285 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 cgagtatcaa cgtctgttga tgggcttttt 30 <210> 286 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 ccgggctcat atcaaggaag ccttactcga gtaa 34 <210> 287 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 ggcttccttg atatgagctt ttt 23 <210> 288 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 ccggcggcgc acagaggaag agaatctcga 30 <210> 289 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 gattctcttc ctctgtgcgc cgttttt 27 <210> 290 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 290 ccgggtccag atgaagctcc cagaactcga gttctg 36 <210> 291 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 291 ggagcttcat ctggactttt t 21 <210> 292 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 292 ccggtctaac ctcacttgca ataatctcga gattatt 37 <210> 293 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 293 gcaagtgagg ttagattttt g 21 <210> 294 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 294 ccggttgtta tcagaggact aaatactcga gtatttagt 39 <210> 295 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 295 cctctgataa caatttttg 19 <210> 296 <211> 20 <212> DNA <213> 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Synthetic primer <400> 302 ttgggatttt ctgcccgaca 20 <210> 303 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 303 ctccttgtcc cgagtaatct ga 22 <210> 304 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 304 agaagctgtg ctatgttgct cta 23 <210> 305 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 305 acaggattcc atacccaaga agga 24 <210> 306 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 306 aggtctgagg agcagcttca 20 <210> 307 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 307 caaataccct caggggaaca gg 22 <210> 308 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 308 aagcgctacg cctacaagtt 20 <210> 309 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 309 ttcatcttct gtgggtgggc 20 <210> 310 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 310 tgctcaagac tggcgctaaa 20 <210> 311 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 311 cagtctggct gccaatcca 19 <210> 312 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 312 gagcagcggt tagaatggc 19 <210> 313 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 313 tcctcctgct tccaactgaa c 21 <210> 314 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 314 tcctgctcag atcaccatga aa 22 <210> 315 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 315 ggctgccagg atagcatagt c 21 <210> 316 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 316 ctggagtgag gggtcgc 17 <210> 317 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 317 gcggcgtgtt ctccttgt 18 <210> 318 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 318 gagctgtctt ccaagggagt 20 <210> 319 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 319 caactccctg tcctgaataa tctga 25 <210> 320 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 320 agcacagagc ctcgccttt 19 <210> 321 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 321 atcacgccct ggtgcct 17 <210> 322 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 322 gactactttc caccgccccc 20 <210> 323 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 323 taaaatggcg ccgcacaagg 20 <210> 324 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 324 gttgcagctt cgacaaacgt ca 22 <210> 325 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 325 agctatcgat taagcagcct cca 23 <210> 326 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 326 caccccgggg agcgtc 16 <210> 327 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 327 ggtggaaagt agtccccgcg 20 <210> 328 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 328 gccccctcgc gcccc 15 <210> 329 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 329 gagctcttat aagtcgcgca gaagccg 27 <210> 330 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 330 cttgtgcggc gccattttaa 20 <210> 331 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 331 tcagaccttc ctccgtctcc 20 <210> 332 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 332 caagccggga aagctgcag 19 <210> 333 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 333 tgcttcaaat tcccaggcgc 20 <210> 334 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 334 ctgacccagc gggctctag 19 <210> 335 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 335 atatggacat gcccggcgg 19 <210> 336 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 336 aagtcgcgct aaccttggcc 20 <210> 337 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 337 ctcctctgca ttcccagcct 20 <210> 338 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 338 ctcagctgtg gccctggg 18 <210> 339 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 339 tcttcctgct cggcggg 17 <210> 340 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 340 ccaggagaag cacaaactgg c 21 <210> 341 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 341 gaagtcccgc ctcttccgc 19 <210> 342 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 342 gcaagaggta gagaggtgac ctg 23 <210> 343 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 343 gctgtggttg tgacgccttt tag 23 <210> 344 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 344 atcggaggac cccagaagac 20 <210> 345 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 345 ggcaccactt actatgcccc 20 <210> 346 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 346 gcccacattc cttcctgacg 20 <210> 347 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 347 cgggacctgc aggtgacg 18 <210> 348 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 348 agacagccac agtcctgtct g 21 <210> 349 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 349 ctgcactcca tcctgggc 18 <210> 350 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 350 ggacaagacc agcggctaat c 21 <210> 351 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 351 gagcacacca tggctgctg 19 <210> 352 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 352 ggcgagtatc agaggatggg a 21 <210> 353 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 353 ggtgtggcta gttggtaaca ctt 23 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 360 cgctgtatcc tgccgccacc ggcgc 25 <210> 361 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 361 gcttctgcgc gacttataag agctc 25 <210> 362 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 362 gagctcttat aagtcgcgca gaagc 25 <210> 363 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 caccgccgca gatcgatgta gatgg 25 <210> 364 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 364 aaacccatct acatcgatct gcggc 25 <210> 365 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 365 caccggcccc gcagatcgat gtaga 25 <210> 366 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Synthetic oligonucleotide <400> 407 gtcagaggcg gaggcccgag gccgc 25 <210> 408 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 408 cccggccccg gccccgcccc ggccc 25 <210> 409 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 409 cccggccccg gccccgcccc ggccc 25 <210> 410 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 410 cccggccccg gccccgcccc ggccc 25 <210> 411 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 411 cccggccccg gccccgcccc ggccc 25 <210> 412 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 412 gggccggggc ggggccgggg ccggg 25 <210> 413 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 413 tccggcttgc gggccgccct tctcc 25 <210> 414 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 414 tccggcttgc gggccgccct tctcc 25 <210> 415 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 415 tccggcttgc gggccgccct tctcc 25 <210> 416 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 416 tccggcttgc gggccgccct tctcc 25 <210> 417 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 417 ggagaagggc ggcccgcaag ccgga 25 <210> 418 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 418 aaccctttga tctttgta 18 <210> 419 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (48)

  1. 하기 화학식 (IB)의 화합물:
    ,
    상기 화학식에서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드 성분은 E3 리가제 리간드이다.
  2. 제1항에 있어서, 표적화 모이어티는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 단백질은 전사 인자, 전사 공동 조절인자, 폴리머라제, 뉴클레아제, 히스톤, 및 RNA 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    ,
    상기 화학식에서 a는 A1의 표적화 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고, b는 A의 E3 리가제 리간드에 대한 부착 지점을 나타내고, q는 1 내지 20의 정수이다.
  5. 제4항에 있어서, 각각의 A1 및 Aq는 P(O)(OR L1 )O, CR L1 R L2 , O, NR L3 , CONR L3 , C(O)O, C(S)O, CO, 및 0-6개의 R L1 R L2 기로 임의로 치환된 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되며, 여기서 R L1 , R L2 및 R L3 은 H, 할로, Cl-8 알킬, 및 OC1-8 알킬로부터 각각 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, A1은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    ,
    상기 화학식에서 c는 A에 대한 부착 지점을 나타낸다.
  7. 제6항에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    .
  8. 제5항에 있어서, 헤테로아릴은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    .
  9. 제1항에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:

    ,
    여기서 각각의 n 및 m은 독립적으로 0 내지 20의 수이다.
  10. 제1항에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:
    ,
    여기서, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 15의 수이다.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, E3 리가제 리간드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:



    여기서,
    각각의 X는 결합, NH, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고;
    각각의 Y는 할로, 알킬, CN, CF3, OCF3, 및 OCHF2로부터 독립적으로 선택되고;
    각각의 R은 H 및 C1-8 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, E3 리가제 리간드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:

    .
  13. 하기 화학식 (IB)의 화합물:
    ,
    상기 화학식에서 표적화 모이어티는 표적 단백질에 결합할 수 있고, 상기 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드 성분은 E3 리가제에 결합할 수 있는 E3 리가제 리간드이고, E3 리가제 리간드는

    으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 X는 결합, NH, O 및 CH2로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 Y는 할로, 알킬, CN, CF3, OCF3, 및 OCHF2로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 R은 H 및 C1-8 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
  14. 제13항에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    ,
    여기서 a는 A1의 표적화 모이어티에 대한 부착 지점을 나타내고, b는 A의 E3 리가제 리간드에 대한 부착 지점을 나타내고, q는 1 내지 20의 정수이다.
  15. 제14항에 있어서, 각각의 A1 및 Aq는 P(O)(OR L1 )O, CR L1 R L2 , O, NR L3 , CONR L3 , C(O)O, C(S)O, CO, 및 0-6개의 R L1 R L2 기로 임의로 치환된 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되며, 여기서 R L1 , R L2 및 R L3 은 H, 할로, Cl-8 알킬, 및 OC1-8 알킬로부터 각각 독립적으로 선택되는 것인 화합물.
  16. 제164항 또는 제15항에 있어서, A1은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    ,
    상기 화학식에서 c는 A에 대한 부착 지점을 나타낸다.
  17. 제16항에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    .
  18. 제14항에 있어서, A1 및 Aq 중 적어도 하나는 헤테로아릴을 포함하고, 헤테로아릴은 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
    .
  19. 제13항에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:

    여기서 각각의 n 및 m은 독립적으로 0 내지 20의 수이다.
  20. 제13항에 있어서, 링커는 하기 화학식 중 어느 하나를 갖는 것인 화합물:
    ,
    여기서, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 15의 수이다.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 화합물.
  22. 제21항에 있어서, 표적화 모이어티는 적어도 하나의 DNA 가닥 또는 이의 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  23. 제21항에 있어서, 표적화 모이어티는 적어도 하나의 RNA 가닥 또는 이의 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  24. 제21항에 있어서, 표적화 모이어티는 적어도 하나의 DNA 가닥 또는 이의 유사체 및 적어도 하나의 RNA 가닥 또는 이의 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질은 전사 인자, 전사 공동 조절인자, 폴리머라제, 뉴클레아제, 히스톤, 및 RNA 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질은 안드로겐 수용체(AR) 폴리펩티드, ETS 관련 유전자(ERG) 폴리펩티드, 포크헤드 박스 A1(FOXA1) 폴리펩티드, 림프 인핸서 결합 인자 1(LEF1) 폴리펩티드, 에스트로겐 수용체(ER) 폴리펩티드, NF-κB 폴리펩티드, E2 인자(E2F) 폴리펩티드, 전사의 트랜스활성화인자(TAT) 폴리펩티드, Jun 원발암유전자 폴리펩티드, Fos 원발암유전자 폴리펩티드, 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 폴리펩티드, Runt 관련 전사 인자 1(RUNX1/AML1) 폴리펩티드, Myc 원발암유전자 폴리펩티드, ETS 원발암유전자 폴리펩티드, 신경교종 관련 발암유전자(GL1) 폴리펩티드, ERG/FUS 융합 폴리펩티드, T 세포 백혈병 호메오박스 1(TLX1) 폴리펩티드, LIM 도메인 단독 1(LMO1) 폴리펩티드, LIM 도메인 단독 2(LMO2) 폴리펩티드, 림프모구성 백혈병 관련 조혈 조절인자 1(LYL1/E2a 이종이량체) 폴리펩티드, MYB 원발암유전자(MYB) 폴리펩티드, 페어드 박스 5(PAX-5) 폴리펩티드, SKI 원발암유전자(SKI) 폴리펩티드, T 세포 급성 림프구성 백혈병 단백질 1(TAL1) 폴리펩티드, T 세포 급성 림프구성 백혈병 단백질 2(TAL2) 폴리펩티드, 글루코코르티코이드 수용체 폴리펩티드, IL-6 발현을 위한 핵 인자(NF-IL6) 폴리펩티드, 초기 성장 반응 단백질 1(EGR-1) 폴리펩티드, 저산소증 유발 인자 1-알파(HIF-1a) 폴리펩티드, 신호 변환기 및 전사 활성화제 1(STAT1) 폴리펩티드, 신호 변환기 및 전사 활성화제 3(STAT3) 폴리펩티드, 신호 변환기 및 전사 활성화제 5(STAT5) 폴리펩티드, V-Maf 조류 근건막성 섬유육종 발암유전자 상동체-A(MAFA) 폴리펩티드, SRY-박스 전사 인자 2(SOX2) 폴리펩티드, SRY-박스 전사 인자 9(SOX9) 폴리펩티드, CAAT/인핸서 결합 단백질 알파(CEBPA) 폴리펩티드, CAAT/인핸서 결합 단백질 베타(CEBPB) 폴리펩티드, 글로빈 전사 인자(GATA) 폴리펩티드, 근세포 인핸서 인자 2(MEF2) 폴리펩티드, POU 클래스 3 호메오박스 2(BRN2) 폴리펩티드, 징크 핑거 E-박스 결합 호메오박스 2(ZEB2) 폴리펩티드, 핵 수용체 서브패밀리 4 그룹 A 구성원 1(NR4A1) 폴리펩티드, 활성화 전사 인자 4(ATF4) 폴리펩티드, T-박스 전사 인자 21(TBX21) 폴리펩티드, RAR 관련 고아 수용체 C(RORC) 폴리펩티드, 및 X-박스 결합 단백질(XBP-1s) 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 인자인 화합물.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질은 전사 공동 조절인자인 화합물.
  28. 제27항에 있어서, 전사 공동 조절인자는 CBP, p300, SRC1 패밀리 폴리펩티드, SRC2 패밀리 폴리펩티드, SRC3 패밀리 폴리펩티드, BET 폴리펩티드, TRIM 패밀리 폴리펩티드, 및 CXXC 도메인 징크 핑거 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질은 폴리머라제인 화합물.
  30. 제29항에 있어서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질은 뉴클레아제인 화합물.
  32. 제31항에 있어서, 뉴클레아제는 DNA2 및 FAN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  33. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질은 히스톤인 화합물.
  34. 제33항에 있어서, 히스톤은 H3, H4, H2A, H2B, 및 H1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  35. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질은 RNA 결합 단백질인 화합물.
  36. 제35항에 있어서, RNA 결합 단백질은 HIV 단백질 TAT, HIV 단백질 REV1, YTHDC1, YTHDC2, YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, HNRNPA2B1, HNRNPC, 및 HNRNPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 화합물, 및 이의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  38. 하기 화학식 (IB)의 화합물:
    ,
    상기 화학식에서 표적화 모이어티는 종양 단백질 p53(p53)에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 프로테아제 리간드 또는 E3 리가제 리간드 성분은 E3 리가제 리간드이다.
  39. 제38항에 있어서, 표적화 모이어티는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드인 화합물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 p53은 돌연변이 p53인 화합물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 돌연변이 p53은 기능 획득 돌연변이 p53인 화합물.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 서열 번호 388-417 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 화합물.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
    [청구항 43]
    포유동물에게 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 포유동물을 치료하는 방법으로서, 상기 암의 암세포는 돌연변이 p53을 발현하는 것인 치료 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 돌연변이 p53은 기능 획득 돌연변이 p53인 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 림프성 악성종양, 편평세포암, 폐암, 복막암, 간세포암, 위암(gastric cancer, stomach cancer), 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥암 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 전립선암인 방법.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물에서 암세포의 증식을 억제하는 데 효과적인 방법.
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