KR20230148207A - 안구 병태에 대한 바이러스 벡터-기반 유전자 요법 - Google Patents
안구 병태에 대한 바이러스 벡터-기반 유전자 요법 Download PDFInfo
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Abstract
대상체에서의 망막 질환, 상해 또는 병태에 대한 유전자 요법은 대상체에게 적어도 하나의 열 충격 단백질, 예컨대 Hsp27을 코딩하는 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터를 함유하는 제약 조성물을 투여하는 것을 수반한다. 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터는 특이적으로 망막 신경절 세포에서의 열 충격 단백질 생산을 유도하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 상기 세포 손실은 안구 병태를 앓는 환자에서 망막 손상 및 시력 손실을 유발한다. 개시된 바이러스 벡터는 투여 장치를 사용하여 유리체내로 투여될 수 있는 제약 조성물에 포함될 수 있다. 단일 주사는 다양한 안구 병태를 치료하는데 치료상 충분할 수 있다.
Description
정부 이해관계에 관한 진술
본 발명은 실명 예방 리서치(Research to Prevent Blindness) 뿐만 아니라, 재생 의학 게이츠 센터(Gates Center for Regenerative Medicine)의 추가 지원과 함께 미국 국립 안연구소(National Eye Institute)의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 22일 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/152,152 (발명의 명칭: "Viral Vector-Based Gene Therapy for Ocular Conditions")에 대한 우선권을 주장하며, 이는 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 상해 또는 질환에 의해 유발된 망막 손상을 치료하기 위한 조성물, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 구체적인 구현은 안구 손상을 앓고 있거나 또는 그가 발생할 위험이 있는 대상체의 망막 신경절 세포로의 적어도 하나의 열 충격 단백질의 바이러스 벡터-매개 전달을 수반한다.
녹내장은 전 세계적으로 약 7,500만 명의 사람들이 앓고 있으며, 대략 800만 명의 사람이 상기 질환으로 실명 상태에 있다. 미국에서만 거의 300만 명의 사람이 녹내장을 앓고 있으며, 이 수치는 2050년까지 2배 이상 증가할 것으로 예상된다. 녹내장 연관 시력 손실은 종종 안압으로 알려진 안구 내부의 압력 상승에 주로 기인하기 때문에, 종래 제1선의 녹내장 치료법은 일반적으로 안압을 강하시키기 위해 제제화된 약물의 국소 적용을 수반한다. 상기 접근법을 통해 안압이 성공적으로 강하되기는 하지만, 축삭 변성 및 망막 신경절 세포 ("RGC")로 알려진 망막내 세포의 지속적인 사멸로 인해 많은 환자가 여전히 실명하고 있다. 축삭 변성 및 RGC 사멸의 원인이 되는 인자는 다양하기 때문에 개별적으로 및 특히 조합하여 이 둘 다는 녹내장 및 다른 안구 병태 치료를 어렵게 만든다. 따라서, RGC 사멸 및 축삭 변성을 퇴치하는 안전하고, 효과적인 방법이 요구되고 있다.
본 개시내용은 녹내장을 포함하는 다양한 안구 병태에 대한 신규한 유전자 요법을 포함한다. 실시양태는 적어도 하나의 열 충격 단백질 ("HSP")을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 ("rAAV 벡터")를 포함한다. 개시된 rAAV 벡터는 또한 눈에서 가장 필요한 코딩된 HSP의 표적화된 발현을 유도하는 RGC 특이적 프로모터 서열을 포함할 수 있다. rAAV-HSP 벡터의 단일 투여를 통해 망막 손상에 의해 유발된 안구 병태의 적어도 하나의 증상의 성공적인 치료, 예방 및/또는 완화를 달성할 수 있다. 본원에 요약된 실험 데이터에 의해 예시되는 바와 같이, 개시된 벡터, 제약 조성물 및 연관 요법은 연장된 기간 (예를 들어, 적어도 약 20주)에 걸쳐 RGC 사멸을 실질적으로 차단하고/거나, 저속화시키고/거나 감소시킴으로써 망막 손상을 예방하거나 또는 치료할 수 있다.
본 개시내용의 구체적인 실시양태에 따르면, 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하고/거나, 그의 위험을 감소시키고/거나, 그를 예방하고/거나 완화시키는 방법은 대상체에게 rAAV 벡터를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 수반할 수 있다. rAAV 벡터는 적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질, 예컨대 Hsp27 (이는 또한 본원에서 "HspB1"로도 지칭됨)을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. rAAV 벡터는 또한 핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있다.
본 방법의 일부 실시양태에서, 망막 신경절 세포는 포유동물 망막 신경절 세포를 포함할 수 있다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물 망막 신경절 세포는 인간 망막 신경절 세포를 포함할 수 있다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체가 안구 상해를 입거나 또는 망막 질환 또는 병태가 대상체에서 진단된 후 24시간 이내에 적어도 1회 투여될 수 있다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 유리체내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 단지 1회 투여될 수 있다. 본 방법의 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 아데노 연관 바이러스-타입 2 벡터일 수 있다.
본 방법의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 녹내장이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 황반 변성, 당뇨병성 눈 질환, 망막 박리, 및 색소성 망막염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 흥분독성 손상, 물리적 손상, 화학적 손상, 신경영양 인자 고갈, 산화 스트레스, 염증, 미토콘드리아 기능장애, 축삭 수송 부전, 또는 그의 조합에 의해 유발된다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 망막 신경절 세포의 손실을 포함한다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 안압의 증가를 포함한다.
본 개시내용의 실시양태에 따르면, 대상체의 망막 신경절 세포에서 Hsp27 단백질 생산을 증가시키는 방법은 대상체의 눈에 rAAV 벡터를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 수반한다. rAAV 벡터는 핵산 서열은 핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열과 함께, Hsp27을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있다. Hsp27 단백질의 양은 조성물이 투여되지 않은 또 다른 눈의 망막 신경절 세포와 비교하여 치료된 눈의 망막 신경절 세포에서 증가될 수 있다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 대상체의 망막 신경절 세포는 인간 망막 신경절 세포를 포함할 수 있다. 본 방법의 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 아데노-연관 바이러스 타입 2 벡터일 수 있다.
본 개시내용의 실시양태에 따르면, 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하고/거나, 그의 위험을 감소시키고/거나, 그를 예방하고/거나 완화시키기 위한 시스템은 주사 장치 및 rAAV 벡터를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 포함할 수 있다. rAAV 벡터는 적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질, 예컨대 Hsp27을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. rAAV 벡터는 또한 핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있다. 주사 장치는 대상체에게 조성물을 유리체내로 투여하도록 구성될 수 있다.
시스템의 일부 실시양태에서, 주사 장치는 투베르쿨린 시린지일 수 있다. 시스템의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 녹내장이다. 시스템의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 망막 신경절 세포의 손실을 포함할 수 있다. 시스템의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 안압의 증가를 포함한다. 시스템의 일부 실시양태에서, 망막 신경절 세포는 포유동물 망막 신경절 세포를 포함할 수 있다. 시스템의 일부 실시양태에서, 망막 신경절 세포는 인간 망막 신경절 세포를 포함할 수 있다. 시스템의 일부 실시양태에서, 주사 장치는 일회용 장치일 수 있다. 시스템의 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 아데노-연관 바이러스 타입 2 벡터일 수 있다.
본 개시내용의 실시양태에 따르면, 제약 조성물은 rAAV 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. rAAV 벡터는 적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질, 예컨대 Hsp27을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. rAAV 벡터는 또한 핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있다. 제약 조성물은 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그를 예방하거나 또는 완화시키기 위해 제제화될 수 있다.
조성물의 일부 실시양태에서, 망막 신경절 세포는 포유동물 망막 신경절 세포를 포함할 수 있다. 조성물의 일부 실시양태에서, 포유동물 망막 신경절 세포는 인간 망막 신경절 세포를 포함할 수 있다. 조성물의 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 유리체내 투여를 위해 제제화될 수 있다. 조성물의 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 아데노-연관 바이러스 타입 2 벡터일 수 있다. 조성물의 일부 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 망막 신경절 세포의 손실, 안압의 증가, 및/또는 녹내장을 포함한다.
본 개시내용의 실시양태에 따르면, rAAV 벡터를 포함하는 제약 조성물은 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그를 예방하거나 또는 완화시키기 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다. rAAV 벡터는 적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질, 예컨대 Hsp27을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. rAAV 벡터는 또한 핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있다.
일부 제조 실시양태에서, 제약 조성물은 유리체내 투여를 위해 제제화될 수 있다. 일부 제조 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 녹내장을 포함한다. 일부 제조 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 망막 신경절 세포의 손실을 포함한다. 일부 제조 실시양태에서, 망막 질환, 상해 또는 병태는 안압의 증가를 포함한다.
본 개시내용의 실시양태에 따르면, rAAV 벡터는 적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질, 예컨대 Hsp27을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. rAAV 벡터는 또한 핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있다. rAAV 벡터는 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그를 예방하거나 또는 완화시키기 위해 제제화될 수 있다.
본 발명의 내용란은 본 개시내용의 전체 범위 및 범주를 나타내는 것으로 의도되지도 않았고, 그렇게 해석되지도 않아야 한다. 더욱이, 본원에서 "본 개시내용," 또는 그의 측면에 대한 언급은 본 개시내용의 특정 실시양태를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 반드시 모든 실시양태를 특정한 기술내용으로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 개시내용은 본 발명의 내용란 뿐만 아니라, 첨부된 도면 및 상세한 설명에서 다양한 상세 수준의 설명으로 기재되어 있고, 본 개시내용의 범주에 대한 제한이 본 발명의 내용란에서의 요소, 성분 등의 포함 또는 비포함으로 의도되지 않는다. 임의의 개시된 실시양태로부터의 특징은 제한 없이 서로 조합하여 사용될 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면의 고찰을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명해질 것이다.
도면은 본 발명의 여러 실시양태를 예시하며, 여기서 동일한 참조 번호는 도면에 제시된 상이한 관점 또는 실시양태에서의 동일하거나 유사한 요소 또는 특징을 나타낸다.
도 1은 본원에 개시된 실시양태에 따른 Hsp27 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 맵이다.
도 2는 본원에 개시된 실시양태에 따른 αA-크리스탈린 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 맵이다.
도 3은 본원에 개시된 실시양태에 따른 αB-크리스탈린 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 맵이다.
도 4는 본원에 개시된 실시양태에 따른 Hsp20 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 맵이다.
도 5는 본원에 개시된 실시양태에 따라 Brna3-면역염색을 통해 건강한 마우스 및 녹내장 마우스로부터 유래된 RGC에 대한 다양한 rAAV2 벡터의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 6은 본원에 개시된 실시양태에 따라 건강한 마우스 및 녹내장 마우스로부터 유래된 RGC에 대한 다양한 rAAV2 벡터의 정량적 효과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 7a는 rAAV2-Hsp27의 유리체내 투여에 의해 매개되는 RGC에서의 Hsp27의 발현을 제시하는 공초점 현미경 이미지이다. 도 7b는 도 7a에 도시된 RGC로부터 추출된 Hsp27 단백질을 제시하는 웨스턴 블롯이다.
도 8a는 rAAV2-αA-크리스탈린의 유리체내 투여에 의해 매개되는 RGC에서의 αA-크리스탈린의 발현을 제시하는 공초점 현미경 이미지이다. 도 8b는 도 8a에 도시된 RGC로부터 추출된 αA-크리스탈린 단백질을 제시하는 웨스턴 블롯이다.
도 9a는 rAAV2-αB-크리스탈린의 유리체내 투여에 의해 매개되는 RGC에서의 αB-크리스탈린의 발현을 제시하는 공초점 현미경 이미지이다. 도 9b는 도 9a에 도시된 RGC로부터 추출된 αB-크리스탈린 단백질을 제시하는 웨스턴 블롯이다.
도 10a는 rAAV2-Hsp20의 유리체내 투여에 의해 매개되는 RGC에서의 Hsp20의 발현을 제시하는 공초점 현미경 이미지이다. 도 10b는 도 10a에 도시된 RGC로부터 추출된 Hsp20 단백질을 제시하는 웨스턴 블롯이다.
도 11a는 본원에 개시된 실시양태에 따른 안압에 대한 마이크로비드 주사의 효과를 제시하는 선 그래프이다.
도 11b는 도 11a에 제시된 고안압증의 마이크로비드-기반 마우스 모델에서 RGC 사멸에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 11c는 본원에 개시된 실시양태에 따라 Brna3 면역염색을 사용하여 건강한 마우스, 또는 고안압증을 앓는 마우스의 RGC에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 12a는 본원에 개시된 실시양태에 따라 고안압증의 마이크로비드-기반 마우스 모델에서 RGC 축삭 수송에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 12b는 본원에 개시된 실시양태에 따라 CT-B 염색을 사용하여 RGC 축삭 수송에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 13a는 본원에 개시된 실시양태에 따른 rAAV2-HspB1 투여 전 및 후의 안압에 대한 다중 마이크로비드 주사의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 13b는 도 13a에 제시된 고안압증의 마이크로비드-기반 마우스 모델에서 RGC 사멸에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 선 그래프이다.
도 13c는 본원에 개시된 실시양태에 따라 Brna3 면역염색을 사용하여 도 13b에 제시된 RGC에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 14a는 고안압증의 마이크로비드-기반 마우스 모델에서 RGC 축삭 수송에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 14b는 CT-B 염색을 사용하여 도 14a에 제시된 RGC 축삭 수송에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 15a는 본원에 개시된 실시양태에 따른 rAAV2-HspB1 투여 후 20주 기간 동안의 안압에 대한 마이크로비드 주사의 효과를 제시하는 선 그래프이다.
도 15b는 본원에 개시된 실시양태에 따라 마이크로비드 주사 및 rAAV2-HspB1 투여를 받은 망막에서 측정된 패턴 망막전위도 ("PERG") 진폭을 제시하는 막대 그래프이다.
도 16은 본원에 개시된 실시양태에 따라 망막 신경교증에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지 패널이다.
도 1은 본원에 개시된 실시양태에 따른 Hsp27 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 맵이다.
도 2는 본원에 개시된 실시양태에 따른 αA-크리스탈린 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 맵이다.
도 3은 본원에 개시된 실시양태에 따른 αB-크리스탈린 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 맵이다.
도 4는 본원에 개시된 실시양태에 따른 Hsp20 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 맵이다.
도 5는 본원에 개시된 실시양태에 따라 Brna3-면역염색을 통해 건강한 마우스 및 녹내장 마우스로부터 유래된 RGC에 대한 다양한 rAAV2 벡터의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 6은 본원에 개시된 실시양태에 따라 건강한 마우스 및 녹내장 마우스로부터 유래된 RGC에 대한 다양한 rAAV2 벡터의 정량적 효과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 7a는 rAAV2-Hsp27의 유리체내 투여에 의해 매개되는 RGC에서의 Hsp27의 발현을 제시하는 공초점 현미경 이미지이다. 도 7b는 도 7a에 도시된 RGC로부터 추출된 Hsp27 단백질을 제시하는 웨스턴 블롯이다.
도 8a는 rAAV2-αA-크리스탈린의 유리체내 투여에 의해 매개되는 RGC에서의 αA-크리스탈린의 발현을 제시하는 공초점 현미경 이미지이다. 도 8b는 도 8a에 도시된 RGC로부터 추출된 αA-크리스탈린 단백질을 제시하는 웨스턴 블롯이다.
도 9a는 rAAV2-αB-크리스탈린의 유리체내 투여에 의해 매개되는 RGC에서의 αB-크리스탈린의 발현을 제시하는 공초점 현미경 이미지이다. 도 9b는 도 9a에 도시된 RGC로부터 추출된 αB-크리스탈린 단백질을 제시하는 웨스턴 블롯이다.
도 10a는 rAAV2-Hsp20의 유리체내 투여에 의해 매개되는 RGC에서의 Hsp20의 발현을 제시하는 공초점 현미경 이미지이다. 도 10b는 도 10a에 도시된 RGC로부터 추출된 Hsp20 단백질을 제시하는 웨스턴 블롯이다.
도 11a는 본원에 개시된 실시양태에 따른 안압에 대한 마이크로비드 주사의 효과를 제시하는 선 그래프이다.
도 11b는 도 11a에 제시된 고안압증의 마이크로비드-기반 마우스 모델에서 RGC 사멸에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 11c는 본원에 개시된 실시양태에 따라 Brna3 면역염색을 사용하여 건강한 마우스, 또는 고안압증을 앓는 마우스의 RGC에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 12a는 본원에 개시된 실시양태에 따라 고안압증의 마이크로비드-기반 마우스 모델에서 RGC 축삭 수송에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 12b는 본원에 개시된 실시양태에 따라 CT-B 염색을 사용하여 RGC 축삭 수송에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 13a는 본원에 개시된 실시양태에 따른 rAAV2-HspB1 투여 전 및 후의 안압에 대한 다중 마이크로비드 주사의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 13b는 도 13a에 제시된 고안압증의 마이크로비드-기반 마우스 모델에서 RGC 사멸에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 선 그래프이다.
도 13c는 본원에 개시된 실시양태에 따라 Brna3 면역염색을 사용하여 도 13b에 제시된 RGC에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 14a는 고안압증의 마이크로비드-기반 마우스 모델에서 RGC 축삭 수송에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 막대 그래프이다.
도 14b는 CT-B 염색을 사용하여 도 14a에 제시된 RGC 축삭 수송에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지이다.
도 15a는 본원에 개시된 실시양태에 따른 rAAV2-HspB1 투여 후 20주 기간 동안의 안압에 대한 마이크로비드 주사의 효과를 제시하는 선 그래프이다.
도 15b는 본원에 개시된 실시양태에 따라 마이크로비드 주사 및 rAAV2-HspB1 투여를 받은 망막에서 측정된 패턴 망막전위도 ("PERG") 진폭을 제시하는 막대 그래프이다.
도 16은 본원에 개시된 실시양태에 따라 망막 신경교증에 대한 유리체내 rAAV2-HspB1 투여의 효과를 제시하는 공초점 현미경 이미지 패널이다.
본 개시내용은 녹내장 및 연관된 안구 손상을 비롯한 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하고/거나, 그의 위험을 감소시키고/거나, 그를 예방하고/거나 완화시키기 위한 조성물, 방법, 및 시스템에 관한 것이다. 실시양태는 적어도 하나의 HSP, 예컨대 Hsp27을 코딩하는 rAAV 벡터를 함유하는 제약 조성물을 투여하는 것을 수반하는 유전자 요법 접근법을 통해 RGC 사멸을 감소시키거나 또는 예방하는 것을 수반한다. RGC에서 HSP 수준을 증가시키기 위해, 구체적으로, rAAV 벡터는 HSP 서열에 작동가능하게 연결된 RGC 특이적 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 허용되는 담체 및/또는 부형제를 또한 포함할 수 있는 제약 조성물은 대상체가 안구 병태, 예컨대 녹내장 (예를 들어, 정상 안압 녹내장)으로 진단받기 전 및/또는 후에, 또는 대상체가 눈 상해를 입은 후에 1회 이상 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안구 병태를 효과적으로 치료하거나 또는 예방하는데 단지 1회의 제약 조성물 투여만으로도 충분할 수 있다. 개시된 방식으로, 예를 들어, 유리체내로 제약 조성물을 투여하면 눈에서 항아폽토시스성 HSP의 수준을 증가시킬 수 있으며, 이로써, 다르게는 상해 또는 안구 병태 발병 후에 발생할 RGC 사멸을 유의적으로 억제할 수 있다. 본원에 기술된 유전자 요법에 따라 이용되는 rAAV 벡터는 유리하게는 낮은 면역원성 및 최소 세포독성을 나타낼 수 있다. 전체적으로, 이러한 이점은 안구 요법 분야에서 이전에는 고려되지 않았던 안전하고, 효과적인 방식으로 RGC 사멸을 예방하고/거나, 감소시키고/거나 저속화시킬 수 있다.
하기에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위하여, 명확성을 위해 하기 용어를 정의한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 HSP는 각각 약 80 내지 약 100개의 아미노산 잔기 범위의 크리스탈린 코어 도메인을 갖는 스트레스 단백질이다. 추가적인 생리학적 기능 중에서 HSP는 HSP가 존재하는 세포 내에서 항아폽토시스성 및 분자 샤페론 활성을 나타낼 수 있다. HSP는 카테고리상 작은 HSP (~12-43 kDa) 및 큰 HSP (~100-110 kDa)로 분류될 수 있다. 작은 HSP의 예로는 Hsp27 (HspB1로도 또한 명명됨), Hsp20 (HspB6으로도 또한 명명됨), 및 α-크리스탈린 (2개의 서브유닛 αA 및 αB로 구성됨)을 포함한다. 큰 HSP는 예를 들어, Hsp90을 포함한다. 본 개시내용에서, HSP 유전자 또는 서열은 HSP 단백질 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 인간 또는 다른 포유동물을 의미한다. 비인간 대상체로는, 예를 들어, 다양한 포유동물, 예컨대 애완동물 및/또는 가축을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 대상체는 치료를 필요로 하는 것으로 간주될 수 있다. 개시된 조성물, 방법 및 시스템은 건강한 인간 대상체, 녹내장으로 진단받은 환자, 하나 이상의 다른 안구 질환으로 진단받은 환자, 다양한 눈 상해로 고생하는 환자, 당뇨병 환자, 또는 시력 손실을 겪고 있는 환자를 치료하는데 효과적일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "안구 병태"는 대상체의 한쪽 눈 또는 양쪽 눈 모두에 부정적인 영향을 미치는 것을 포함하여 눈과 관련된 모든 질환 또는 병태를 포함한다. 본원에 개시된 치료 방법에 의해 표적화되는 안구 질환, 상해, 및 병태는 특히 망막 조직을 손상시킬 수 있다. 본원에서 고려되는 안구 병태의 비제한적인 예로는 녹내장, 정상 안압 녹내장, 황반 변성, 당뇨병성 눈 질환, 당뇨병성 망막병증, 망막 신경교증, 망막 박리, 색소성 망막염, RGC 사멸, 상승된 안압, 흥분독성 손상, 물리적 손상 (예를 들어, 허혈 및/또는 재관류), 화학적 손상, 신경영양 인자 고갈, 산화 스트레스, 염증, 미토콘드리아 기능장애, 축삭 수송 부전, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "녹내장"은 시신경의 비가역적 손상으로 인해 시각 기능이 영구적으로 손실되는 것을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 녹내장의 2가지 주요 유형은 원발성 개방각 녹내장 및 폐쇄각 녹내장이며, 이들 중 하나 또는 둘 다는 본원에 개시된 실시양태에 따라 치료될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안압"은 눈 내부의 유체의 압력을 지칭한다. 정상적인 인간 눈의 안압은 전형적으로 약 10 내지 약 21 mm Hg 범위이다. "상승된" 안압은 통상 약 21 mm Hg 이상인 것으로 간주된다. 상승된 안압이 녹내장 발생의 위험 인자일 수 있다.
본원에서 고려되는 바와 같이 망막 손상 치료는 질환, 상해 또는 다른 병태에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 망막 손상의 적어도 하나의 증상을 치료하고/거나, 그의 위험을 감소시키고/거나, 그를 예방하고/거나 완화시키는 것을 포함한다. 따라서, "치료하는," "치료" 또는 "완화"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하며, 여기서 목적은 표적화된 병리적 병태 및/또는 증상을 예방하거나 또는 저속화시키는 (완화시키는) 것이다. 치료를 필요로 하는 대상체로는 병태로 이미 진단받은 대상체 뿐만 아니라, 병태에 걸리기 쉽거나 또는 병태가 발생하기 쉬운 대상체를 포함한다. 본 개시내용의 방법에 따라 치료 유효량의 제약 조성물을 투여받은 후, 대상체에서 시력 장애, 시력 손실, 시력 이상, RGC 축삭 변성, RGC 소마 손상, 및 RGC 사멸 중 하나 이상이 관찰가능하게 및/또는 측정가능하게 감소되거나 또는 그가 부재한다면, 대상체는 망막 손상에 대해 성공적으로 "치료된" 것이다. "치료하다" 또는 "치료하는"이라는 용어는 본원에서 오직 설명의 편의를 위해 일관되게 사용되는 바, 따라서, 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
"감소시키는," "감소시키다" 또는 "감소"는 망막 손상의 중증도, 범주, 빈도 또는 기간을 감소시키는 것을 의미한다.
rAAV 벡터를 함유하는 조성물의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이고, 언급된 목적과 관련하여 경험적으로 및 통상의 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같은 "유효량"은 대상체의 RGC에서 HSP 단백질 생산을 증가시키거나 또는 증진시키는 rAAV 벡터의 양으로 정의될 수 있다. "치료 유효량"이라는 용어는 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 검출가능하게 및 반복적으로 치료하고/거나, 그의 위험을 감소시키고/거나, 그를 예방하고/거나 완화시키는 rAAV 벡터를 함유하는 조성물의 양을 지칭한다. 이는 상승된 안압, RGC 소마 손상, RGC 사멸, 시력 손실 및/또는 RGC 축삭 변성과 같은 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기와 같은 개선은 본원에 개시된 방법에 따라 개시된 제약 조성물을 투여받지 않은 대상체의 눈 대비 상대적으로 고려될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 치료가 질환 병태를 개선시킬 수 있지만, 질환의 완전한 치료는 아닐 수 있다는 것을 이해한다. 예를 들어, 녹내장 환자의 성공적인 치료는 이환된 눈의 시야 손실이 더 이상 진행되지 않거나, 이환된 눈의 시야 손실 진행 속도가 느려지는 것으로 입증될 수 있다.
화합물, 조성물 또는 작용제"의 투여" 및 "이를 투여하는"이란, 본원에 기술된 바와 같은 화합물, 조성물 또는 작용제, 화합물, 조성물 또는 작용제의 프로드럭, 또는 제약 조성물을 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 화합물, 작용제 또는 조성물은 또 다른 사람에 의해 대상체에게 (예를 들어, 유리체내로 또는 복강내로) 제공되거나 또는 투여될 수 있거나, 또는 대상체가 자가 투여할 수 있다.
"제약 조성물" 또는 "제약 제제"는 담체, 희석제 및/또는 아주반트를 비롯한, 하나 이상의 비독성 제약상 허용되는 첨가제, 및 임의적으로 다른 생물학적 활성 성분과 함께, 일정량 (예를 들어, 단위 투여량)의 하나 이상의 개시된 화합물, 예를 들어, rAAV-HSP를 포함하는 조성물이다. 상기 제약 조성물은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.(19th Edition)]에 개시된 것들과 같은 표준 제약 제제화 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용되는 부형제" 또는 "제약상 허용되는 담체"란, 제약 조성물의 원하는 형태 또는 농도에 기여하는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각각의 부형제 또는 담체는 대상체에게 투여되었을 때, 본 개시내용의 조성물의 효능을 실질적으로 감소시키는 상호작용 및 제약상 허용되지 않는 제약 조성물을 생성할 수 있는 상호작용을 피할 수 있도록, 혼합 시 제약 조성물의 다른 성분과 화합성이어야 한다. 추가로, 각각의 부형제 또는 담체는 제약상 허용될 수 있을 만큼 충분히 높은 순도를 가져야 한다. 제약상 허용되는 담체의 비제한적 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만닛톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 담체는 활택제, 습윤화제, 향미제, 유화제, 현탁화제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아데노바이러스"는 외피가 없는 단일 가닥 DNA 바이러스를 지칭한다. 용어 "재조합 아데노-연관 바이러스 벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 HSP, HSP 단편, 또는 HSP 도메인을 코딩하는 핵산 서열, 예를 들어, 유전자를 지칭하는, 적어도 하나의 "HSP 서열"을 포함하는 재조합 아데노바이러스 구축물을 지칭한다. 유전자 발현 및 DNA 복제에 필요한 추가 핵산 서열이 주어진 rAAV 벡터에 포함될 수 있다. 상기 서열은 하나 이상의 폴리아데닐화 서열, 복제 기점, 전사 인핸서 등과 함께 HSP 서열에 작동가능하게 연결된 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 개시된 rAAV 벡터는 높은 형질도입 효율로 표적 세포에 도입될 수 있으며, 여기서 벡터는 적어도 하나의 HSP 구축물을 발현한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 요소들이 그들의 일반적인 기능을 수행할 수 있도록 하는 요소들의 배열을 지칭한다. 예를 들어, DNA 코딩 서열, 예컨대 HSP 서열은 코딩 서열이 정확하게 mRNA로 전사되고, 스플라이싱/결합되고, 폴리펩티드로 번역되고, 생성된 단백질이 살아있는 세포에서 적절하게 기능하는데 필요한 입체형태로 폴딩되도록 프로모터, 인핸서 및/또는 종결인자 서열 등에 융합될 수 있다. 프로모터 및/또는 추가 조절 요소는 상기 요소가 그의 발현을 지시하는 한, HSP 서열과 반드시 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 전사된 DNA 서열은 프로모터 서열과 HSP 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 재조합 벡터에의 작동가능한 연결은 상동성 재조합과 같은, 관련 기술분야에 공지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 개시된 rAAV 벡터는 이종성, 조직 특이적, 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 실시양태에는 RGC에서 특이적으로 적어도 하나의 HSP를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 강건한 발현을 유도하는 RGC 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, RGC 특이적 프로모터는 RGC에서만 발현을 구동시킴으로써 잠재적인 오프-타겟 효과를 최소화하거나 또는 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 인간-DNA, 미니-RGC 특이적 신경필라멘트 경쇄 프로모터, 예를 들어, Ple345-NEFL을 포함할 수 있다. RGC 손실은 녹내장을 앓는 대상체의 실명의 주요 원인이기 때문에, RGC 특이적 프로모터는 상기 질환이 발병할 위험이 있거나 또는 이미 진단받은 대상체에서 RGC 손실을 예방하는데 중요할 수 있다.
본원에 개시된 유전자 요법 및 연관된 시스템은 RGC에서 HSP의 발현을 유도하도록 제제화된 rAAV 벡터 형태의 발현 구축물을 함유하는 제약 조성물을 이용한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 구축물"은 HSP 또는 그의 펩티드 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 구축물을 지칭할 수 있다. 발현 구축물은 그 안에서 코딩되는 HSP(들)의 상향조절 또는 과다발현을 유도할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성" 또는 "유사성"은 서열을 비교함으로써 결정된 2개 이상의 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열 사이의 관계를 의미한다. 관련 기술분야에서, 동일성은 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미하는 것으로, 이는 상기 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정된다.
단수형 용어는 문맥상 달리 명시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 문맥상 달리 명시하지 않는 한, "및"을 포함하는 것으로 의도된다. "포함한다"라는 용어는 "수반한다"를 의미한다. 또한, "A 또는 B를 포함하는"이라는 것은 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, A 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 본원에 개시된 것과 유사하거나, 또는 등가인 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에서 기술된다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시일 뿐, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 참조로 포함된다. 본원에서 인용된 참고문헌은 청구된 발명에 대한 선행 기술로 인정되지 않는다.
벡터
본 개시내용의 벡터는 RGC 특이적 프로모터 서열과 함께, 적어도 하나의 HSP를 코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다.
도 1은 본원의 실시양태에 따라 이용되는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1을 갖는 예시적인 rAAV 벡터 (100)를 예시한 것이다. 제시된 바와 같이, rAAV 벡터 (100)는 본 실시예에서는 Ple345 NEFL인 RGC 특이적 프로모터 (104)의 하류에 위치하는 Hsp27 코딩 서열 (102) ("Hsp27 서열")을 포함한다. 일부 예에서, Hsp27은 안구 상해 또는 질환과 연관된 RGC 사멸을 예방하고/거나, 감소시키고/거나 저속화시키는데 가장 효과적인 HSP일 수 있다. Hsp20, αA-크리스탈린, 및/또는 αB-크리스탈린을 비롯한 추가의 HSP는 또한 본원에 개시된 rAAV 벡터를 통해 대상체에게 전달되었을 때, RGC 사멸을 효과적으로 퇴치할 수 있다. 상기 HSP는 일부 예에서 Hsp27보다 덜 효과적일 수 있다. 특정한 HSP는 대상체 및/또는 치료되는 병태 및/또는 치료 방법에 따라 다양한 효능 수준을 나타낼 수 있다. 상기 언급된 HSP 중 하나 이상은 손상 또는 질환에 의해 유발되는 변성으로부터 RGC의 소마 및/또는 축삭을 보호하는데 특히 효과적일 수 있다.
바이러스 복제 및 패키징을 촉진하는 2개의 역전된 말단 반복부 (106a, 106b)가 rAAV 벡터 (100)의 Hsp27 서열 (102) 및 그의 프로모터 (104) 측면에 위치한다. 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열 (108) 형태의 리보솜 결합 부위가 또한 mRNA 프로세싱 및 HSP 발현을 증진시키는 키메라 인트론 서열 (110)과 같이 포함된다. rAAV 벡터 (100)는 또한 우드척 간염 전사 후 조절 요소 ("WPRE") (112), SV40 폴리아데닐화 서열 (114), SV40pA-R 서열 (116) 및 효소 제한 절단을 위한 인자 Xa 부위 (118)를 포함한다. rAAV 벡터는 복제 기점 (120)을 포함하고, 전사 중 RNA 폴리머라제 결합을 위해, lac 프로모터 (122) 및 중첩 lac 오퍼레이터 서열 (124)이 포함된다. F1 복제 기점 (126)은 ssDNA의 파지 입자로의 패키징을 촉진한다. 시험관내 선택을 위해, 예시된 rAAV 벡터 (100)는 또한 암피실린 내성 유전자 (128) 및 상류 프로모터 (130)를 포함한다. 항생제 내성 카세트는 포유동물 주사용으로 제제화된 rAAV 벡터의 실시양태를 포함하는 모든 실시양태에 포함되지 않을 수 있다. 하나 이상의 추가의 DNA 구축물이 다른 실시양태에 포함될 수 있으며, 예시된 DNA 구성물 중 하나 이상이 제외될 수 있다.
본 발명의 rAAV 벡터를 생성하는데 사용되는 특정한 아데노바이러스는 달라질 수 있다. 예를 들어, 타입 1, 타입 2, 타입 3, 타입 4, 타입 5 등이 사용될 수 있다. 구체적으로 기술된 실시양태에서, rAAV 벡터는 아데노-연관 바이러스 타입 2 벡터 ("rAAV2 벡터")이다.
Hsp27 서열 (102)은 야생형 Hsp27 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 실시양태는 HSP의 일부, 예를 들어, Hsp27의 일부를 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열은 야생형 Hsp27을 코딩하는 핵산 서열과 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99% 동일할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본원에서 고려되는 rAAV 벡터는 몇 가지만 예로 들자면, 하나 이상의 하나 이상의 상이한 HSP, 예컨대 Hsp20, αA-크리스탈린, 또는 αB-크리스탈린을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 단일 rAAV 벡터는 하나의 HSP 또는 다중의 HSP에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다.
일부 예에서, rAAV 벡터는 스크리닝 및/또는 추적 목적으로 리포터 유전자 및/또는 마커를 포함할 수 있다. 예시적인 리포터 유전자로는 녹색 형광 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광 단백질 (mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 변형된 적색 형광 단백질 (mRFP), 증강된 적색 형광 단백질 (ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 증강된 황색 형광 단백질 (EYFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 증강된 청록색 형광 단백질 (ECFP) 등을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
제약 조성물
본 개시내용의 제약 조성물은 RGC 사멸 및/또는 망막 신경교증에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 안구 질환, 상해 및/또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그를 예방하거나 또는 완화시키는데 적합하다. 제약 조성물의 실시양태는 RGC 특이적 프로모터 서열과 함께 적어도 하나의 HSP를 코딩하는 rAAV 벡터를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 또한 대상체의 표적 부위(들)로의 rAAV 벡터의 전달을 촉진하고/거나 안정화시키도록 구성된 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 각각 하나 이상의 고유한 HSP를 코딩하는 2개 이상의 별개의 rAAV 벡터의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 Hsp27을 코딩하는 rAAV 벡터, Hsp20을 코딩하는 rAAV 벡터, αA-크리스탈린을 코딩하는 rAAV 벡터, 및/또는 αB-크리스탈린을 코딩하는 rAAV 벡터를 포함할 수 있다.
실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있거나 또는 그와 공동으로 투여될 수 있다. 적합한 부형제는 이용되는 특정한 투여량에 따라 달라질 수 있다. 추가로, 안정한 투여량 형태의 제조를 촉진하는 능력과 같은 특정한 기능에 적합한 부형제가 선택될 수 있다. 규정 준수를 위한 부형제가 선택될 수도 있다. 비제한적인 부형제의 예로는 충전제, 결합제, 붕해제, 활택제, 유동화제, 과립화제, 코팅제, 습윤화제, 용매, 공용매, 현탁화제, 유화제, 착색제, 고결 방지제, 습윤제, 킬레이트제, 가소제, 점도제, 항산화제, 보존제, 안정제, 계면활성제를 포함한다. 통상의 기술자는 특정 제약상 허용되는 부형제가 하나 초과의 기능을 제공할 수 있고, 최종 조성물에 존재하는 부형제의 양과 조성물에 존재하는 다른 성분에 따라 대체 기능을 제공할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시양태에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 완충화제 및/또는 희석제와 공동으로 투여될 수 있으며, 그의 비제한적인 예로는 다양한 농도의 수산화나트륨 및 인산나트륨을 포함할 수 있다.
특정한 부형제 및/또는 담체를 포함하는 것은 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 액제, 비-수성 용제, 현탁제, 에멀젼, 동결 건조된 제제 및/또는 좌제를 포함할 수 있다. 비-수성 용제는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및/또는 주사가능한 에스테르를 포함할 수 있다. 좌제용 베이스로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오 버터, 라우린 버터, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 펩티드의 안정성 또는 흡수를 증가시키기 위해, 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정제가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 또한 국소 조성물로서, 예를 들어, 점적 형태로 제공될 수 있다. 점안제는 하나 이상의 분산화제, 가용화제 및/또는 현탁제를 또한 포함하는 수성 또는 비-수성 베이스로 제제화될 수 있다. 상기 실시양태에 따르면, 제약 조성물 중 rAAV 벡터의 농도는 유리체내 구현에 이용되는 농도보다 높을 수 있다.
치료 접근법
안구 병태를 치료하는 방법은 대상체의 눈에 본원에 개시된 rAAV-HSP 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 수반할 수 있다. 본 조성물은 안구 상해를 입거나 또는 안구 질환이 진단된 후에 투여될 수 있다. 실시양태는 또한 개시된 rAAV-HSP 조성물을 진단받지 않은 대상체에게 투여하여 대상체에서 질환 발생을 예방하거나, 또는 질환 발병 시 증상의 중증도를 감소시키는 것을 수반할 수 있다. 일부 예에서, 예방적 투여는 대상체가 안구 질환이 발생할 위험이 평균 이상인지 여부를 결정한 후에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 제약 조성물의 단일 유리체내 투여는 눈 중 하나 이상의 HSP의 농도를, 치료되지 않은 채 방치될 경우, 비가역적인 망막 손상을 유발할 수 있는 RGC 손실을 감소시키기에 충분한 수준으로 증가시킬 수 있다. 실시양태는 특이적으로 표적화된 RGC의 소마에서 하나 이상의 HSP의 농도를 증가시킬 수 있다.
유리체내 투여가 망막 손상의 국재화된 호전에 가장 효과적일 수 있지만, 구체적인 투여 모드는 달라질 수 있다. 허용되는 투여 방법의 비제한적인 예로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국소 투여를 포함할 수 있다.
이전 섹션에서 언급된 바와 같이, 제약 조성물은 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있거나 또는 그와 공동으로 투여될 수 있다. 관련하여, 제약 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 조합하여 연속적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 추가 치료제는 동일한 안구 병태(들)를 치료하기 위해 제제화되거나 또는 제제화되지 않을 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 제약 조성물의 1회 이상의 용량을 포함할 수 있는 단일 투여만으로도 녹내장 및 그의 하나 이상의 증상을 비롯한 안구 병태를 치료하는데 충분할 수 있다. 단지 한 번만 투여하여야 한다면 환자의 불순응 문제를 피할 수 있는 바, 성공 가능성은 더 증가할 수 있다. 1회 초과의 투여를 필요로 하는 대상체의 경우, 투여 빈도는 달라질 수 있다. 실시양태에서, 제약상 유효량의 조성물은 매주, 매월 또는 매년 투여될 수 있다. 치료 기간과 함께 개시된 조성물이 대상체에게 투여되는 횟수는 망막 손상을 유발하거나, 또는 유발할 위험이 있는 병태의 중증도 또는 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 눈 상해를 치료하기 위해 제약 조성물을 투여하는 실시양태는 보다 지속적인 치료 접근법을 필요로 할 수 있는 녹내장과 같은 질환을 치료하기 위해 rAAV 조성물을 투여하는 실시양태보다 더 적은 개별 투여를 수반할 수 있다. 치료 기간은 또한 환자 특이적일 수 있으며, 의사 또는 다른 건강 관리 제공자에 의해 정기적으로 재평가될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 제약 조성물은 상해 후 즉시, 예컨대 상해 후 1, 2, 6, 12 또는 24시간 이내에 투여될 수 있다. 제제는 1회 또는 다회, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과로 투여될 수 있다. 일부 예에서, 단일 용량의 개시된 제약 조성물은 적어도 약 20주 동안 안구 병태를 효과적으로 치료할 수 있다. 상기 예에 따라, 제약 조성물은 20주마다 1회 투여될 수 있다.
본원에 개시된 제약 조성물은 구체적으로 본원에 기술된 목적을 위해 구성될 수 있는 주사 장치, 예컨대 투베르쿨린 시린지 또는 IV 드립 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 일부 예에서, 투여 장치는 일회용 장치일 수 있으며, 이는 단일 용량의 제약 조성물을 또한 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 따라서, 주사 장치는 망막 손상의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그를 예방하거나 또는 완화시키기 위한 시스템의 일부를 구성할 수 있다.
대상체에게 투여되는 제약 조성물의 치료 유효량은 달라질 수 있다. 실시양태에서, 대상체에게 제공되는 제약 조성물의 각각의 유리체내 용량은 약 2x109 pfu/ml 내지 약 1x1010 pfu/ml 범위의 rAAV, 또는 약 1x1010 바이러스 게놈/ml (vg/ml), 약 1x1011 vg/ml, 약 1x1012 vg/ml, 약 1x1013 vg/ml, 약 1x109 vg/눈, 약 5x109 vg/눈 또는 그 초과, 또는 그 사이의 임의의 농도를 포함할 수 있다. 투여는 예를 들어, 치료되는 병태, 병태의 중증도, 제제의 성질, 투여 방법, 대상체의 상태, 대상체의 연령, 대상체의 체중, 또는 그의 조합에 따라 달라질 수 있다. 투여량 수준은 전형적으로 작용 부위에서 시험관내, 생체내 또는 조직 배양물에서 활성이 있는 것으로 나타난 농도와 적어도 동일한 농도를 달성하는데 충분하다.
다중 투여 기술 및 스케줄을 수용하기 위해, 본원에 개시된 제약 조성물은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 사용하는 방법에 따라 제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 단위 투여량 형태 또는 다중 투여량 형태로 제조될 수 있다. 예시적인 제제는 수용액 또는 오일-기반 용액, 현탁액 또는 에멀젼 형태일 수 있다. 안정성 증가 및 장기 저장을 위해, 제약 조성물은 동결건조될 수 있다.
하기 실험 실시예는 본 발명의 예시적인 실시양태를 예시하기 위해 제공되며, 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
실시예
실시예
1
다양한 HSP의 rAAV2-매개 전달이 RGC 사멸을 특징으로 하는 망막 병태, 예컨대 녹내장에 미치는 효과를 평가하기 위해, 녹내장의 마우스 모델을 생성하고, 본원에 개시된 제약 조성물을 1회 유리체내 투여하여 처리하였다.
녹내장 마우스 모델의 생성은 야생형 (WT) 마우스를 마취시키고, 안압을 15 mm Hg에서 120 mm Hg로 상승시켜 허혈/재관류 (I/R) 상해를 입히는 것을 수반하였다. 상승된 안압을 1시간 동안 유지시킨 후, 다시 정상 범위 내의 압력으로 감소시켰다. 이 절차로 인해 상당한 양의 RGC 사멸 (>50%)이 발생하였으며, 이는 녹내장 환자에서 관찰되는 RGC 사멸 정도와 유사하다.
해밀턴(Hamilton) 시린지 (해밀턴 보나두츠 아게(Hamilton Bonaduz AG: 스위스 보나두츠))에 부착된 유리 피펫을 사용하여 유리체내 주사를 수행하였다. 눈꺼풀을 조심스럽게 벌리고, 33-게이지 니들을 윤부 바로 뒤의 유리체에 45° 각도로 공막을 통해 유리체에 삽입하였다. 각 주사 사이에 30초의 간격을 두고, 2 마이크로리터의 용액을 1 μL씩 증량시키면서 주사하였다. 주사 후, 니들을 천천히 빼고, 주사 부위를 국소 항생제로 처리하였다.
내부에 코딩된 특정한 HSP만이 유일하게 상이한 4개의 별개의 rAAV2 치료 벡터를 I/R 상해 4주 전에 별개의 마우스 처리 그룹에 유리체내로 투여하고, RGC 사멸을 예방하고/거나, 감소시키고/거나 저속화시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다. I/R 상해를 입지 않은 상해가 없는 반대쪽 눈 및 상해를 입은 반대쪽 눈을 각각 건강한 대조군 및 비처리된 녹내장 대조군으로 사용하였다.
서열식별번호: 2를 갖는, 하나의 rAAV2 벡터, rAAV2-HspB4의 맵은 도 2에 제시되어 있다. 제시된 바와 같이, rAAV2-HspB4 (200)는 Hsp27 서열 (102) 대신 HspB4 (αA-크리스탈린) 코딩 서열 (202)을 포함한다는 점에서만 rAAV2-Hsp27 (도 1 참조)과 상이하다. 도 3은 Hsp27 서열 (102) 대신 HspB5 (αB-크리스탈린) 코딩 서열 (302)을 포함하는, 서열식별번호: 3을 갖는 또 다른 rAAV2 벡터인 rAAV2-HspB5의 맵을 제시하는 것이다. 도 4는 Hsp27 서열 (102) 대신 HspB6 (Hsp20) 코딩 서열 (402)을 포함하는, 서열식별번호: 4를 갖는 제3 rAAV2 벡터인 rAAV2-HspB6의 맵을 제시한다. 최종 벡터인 rAAV2-HspB1은 서열식별번호: 1을 포함하고, 도 1에 제시된 바와 같이, rAAV2-Hsp27과 동일하다 (Hsp27 = HspB1).
I/R 상해 14일 후 및 rAAV2 투여 후 6주차에 모든 마우스를 마취시키고, 망막을 절개하고, 플랫-마운팅하고, RGC에 대한 마커인 Brn3a (뇌 특이적 호메오박스/POU 도메인 단백질 3A)에 대해 면역염색하였다. 1회 유리체내 rAAV2 투여가 RGC 소마 손상 및 전체 RGC 손실에 미치는 효과는 도 5에 도시되어 있다. Brn3a-양성 RGC 염색으로 입증되는 바와 같이 (우측 하단 스케일 막대 = 100 μm), RGC 개수는 건강한 처리 그룹 (502)으로부터 제거된 반대쪽 망막에서 가장 높았고, 녹내장 비처리 그룹 (504)으로부터 제거된 반대쪽 망막에서 가장 낮았다. 건강한 마우스 대비 rAAV2-HspB1 처리 그룹 (512)은 최고 RGC 카운트를 포함하였고, 그 다음은 rAAV2-HspB6 처리 그룹 (510), rAAV2-HspB5 처리 그룹 (508), 및 rAAV2-HspB4 처리 그룹 (506) 순이었다. 따라서, rAAV2-HspB1 (rAAV2-Hsp27)은 녹내장 마우스 모델에서 RGC 손실을 감소시키는데 가장 효과적이었다. 특히, 다른 HSP 코딩 rAAV2 벡터가 또한 비처리된 녹내장 마우스 대비 RGC 손실을 감소시켰으며, 이는 그가 안구 병태를 단독으로 또는 조합하여 치료하는데 잠재적인 효능이 있다는 것을 시사하는 것이다.
절제된 망막 제곱 밀리미터당 존재하는 RGC의 개수에 기초하여 각 rAAV2 벡터의 1회 유리체내 투여가 RGC 손실에 미치는 정량적 효과는 도 6에 그래프로 제시되어 있으며, 여기서 ns=비유의적, *p < 0.05 및 ***p < 0.001이다. 제시된 바와 같이, 제시된 바와 같이, I/R 상해를 입지 않은 건강한 대조군 마우스 ("Cont")는 ㎟당 2,000개 초과의 RGC를 보인 반면, 비처리된 녹내장 마우스 ("비히클")는 유의적인 RGC 손실을 보였다. 비처리된 녹내장 마우스와 비교하여, rAAV2-HspB5, rAAV2-HspB6, 및 rAAV2-HspB1로 처리된 녹내장 마우스는 모두 통계상 유의적으로 RGC 손실을 예방하는 것으로 나타났다. 본 연구에서는 통계상 유의적이지는 않았지만, rAAV2-HspB4로 처리된 녹내장 마우스에서도 또한 RGC 손실 예방이 관찰되었다.
녹내장 마우스 모델을 사용하여 얻은 데이터를 고려하면, HSP를 코딩하는 rAAV2 벡터의 단지 단일 유리체내 투여가 RGC를 변성으로부터 유의적으로 보호하고, RGC 손실을 감소시키는데 효과적일 수 있으며, 여기서 rAAV2-HspB1 (또는 rAAV2-Hsp27)이 가장 효과적이다. RGC 소마 및 축삭 둘 다는 본원에 개시된 rAAV2 벡터 투여에 의해 보호될 수는 있지만, rAAV2-HSP 투여의 보호 효과는 축삭과 대조적으로 RGC 소마에서 특히 뚜렷할 수 있다. 따라서, 개시된 rAAV2 벡터는 안구 상해 또는 질환, 예컨대 녹내장을 앓는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 시력 손실을 예방하거나 또는 적어도 감소시킬 수 있는 장기적인 효과를 나타낼 수 있다.
실시예
2
실시예 1에서 평가된 rAAV2 벡터가 RGC에 효과적으로 침투하여 그 안에서의 적어도 하나의 HSP의 지속적인 과다발현을 유도하는지 여부를 확증하기 위해, 비처리된 마우스, 및 시험되는 rAAV2 벡터 중 하나로 처리된 마우스로부터 수득된 망막 절편을 유리체내 주사 1개월 후 투여된 HSP에 대해 면역염색하였다. 표적화된 RGC가 또한 유리체내 투여 1개월 후에 분해하였고, 각 HSP에 특이적인 항체를 사용하여 수행된 웨스턴 블롯팅을 통해 HSP 단백질 수준을 결정하였다.
도 7a에 제시된 바와 같이, Hsp27은 rAAV2-Hsp27을 투여받지 않은 반대쪽 눈으로부터 수득된 대조군 RGC와 비교하여 유리체내로 rAAV2-Hsp27이 주사된 망막의 RGC에서 과다발현되었다. 도 7b에 그래프로 제시된 바와 같이, rAAV2 벡터로 감염되지 않은 대조군 세포의 이중 샘플 (레인 1 및 2)은 어떤 검출가능한 Hsp27 단백질도 포함하지 않은 반면, rAAV2-Hsp27로 감염된 세포의 이중 샘플은 레인 3 및 4에 존재하는 두꺼운 ~25 kDa 밴드로 표시된, 강건한 수준의 Hsp27을 포함하였다.
도 8a는 αA-크리스탈린이 rAAV2-αA-크리스탈린을 투여받지 않은 반대쪽 눈으로부터 수득된 대조군 RGC와 비교하여 유리체내로 rAAV2-αA-크리스탈린이 주사된 망막의 RGC에서 과다발현되었다는 것을 제시한다. 도 8b에 제시된 바와 같이, rAAV2-αA-크리스탈린으로 감염된 RGC의 이중 샘플은 레인 3 및 4에 존재하는 두꺼운 ~19 kDa 밴드로 표시된, 강건한 수준의 αA-크리스탈린을 생산하였다. 레인 1 및 2는 rAAV2 벡터로 감염되지 않은 대조군 세포는 어떤 검출가능한 αA-크리스탈린 단백질도 포함하지 않았다는 것을 제시한다.
도 9a는 αB-크리스탈린이 rAAV2-αB-크리스탈린을 투여받지 않은 반대쪽 눈으로부터 수득된 대조군 RGC와 비교하여 유리체내로 rAAV2-αB-크리스탈린이 주사된 망막의 RGC에서 과다발현되었다는 것을 제시한다. 도 9b의 블롯은 rAAV2-αB-크리스탈린으로 감염된 RGC가 레인 3 및 4에 존재하는 두꺼운 ~20 kDa 밴드로 표시된, 강건한 수준의 αB-크리스탈린을 생산하였다는 것을 제시한다. 레인 1 및 2는 rAAV2 벡터로 감염되지 않은 대조군 세포는 어떤 검출가능한 αB-크리스탈린 단백질도 포함하지 않았다는 것을 제시한다.
도 10a는 Hsp20이 또한 rAAV2-Hsp20을 투여받지 않은 반대쪽 눈으로부터 수득된 대조군 RGC와 비교하여 유리체내로 rAAV2-Hsp20이 주사된 망막의 RGC에서 과다발현되었다는 것을 제시한다. 도 10b의 블롯은 rAAV2-Hsp20으로 감염된 RGC가 레인 3 및 4에 존재하는 두꺼운 ~18 kDa 밴드로 표시된, 강건한 수준의 Hsp20을 생산하였다는 것을 제시한다. 레인 1 및 2는 rAAV2 벡터로 감염되지 않은 대조군 세포는 어떤 검출가능한 Hsp20 단백질도 포함하지 않았다는 것을 제시한다.
실시예
3
rAAV2-HspB1이 RGC 사멸을 예방할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 고안압증 마우스 모델을 채택하여 안압이 증가하기 전에 마우스에 벡터를 유리체내로 주사하였다.
rAAV2-HspB1 투여의 예방 효과를 시험하는 제1 실험에서는 시험 동물에서 고안압증이 유발되기 2주 전에 HBSS 중 단일 용량 1x109 vg/눈 또는 5x109 vg/눈의 rAAV2-HspB1을 별개의 마우스 처리 그룹에 유리체내로 주사하였다. 2주 후, 0.5% 프로파라카인 히드로클로라이드의 국소 적용으로 보충된 케타민/크실라진의 복강내 주사를 통해 마우스를 먼저 마취시킴으로써 고안압증 모델을 생성하였다. 각 동물의 오른쪽 눈의 전방에 폴리스티렌 마이크로비드 (직경 10 μm, 500만개의 비드/mL PBS)를 주사하여 편측으로 고안압증을 유발하였다. 33G 니들을 사용하여 각막 중심 부근을 가볍게 천공한 후, 작은 기포를 주사하여 눈 전방을 들어 올렸다. 소량 (2 μL)의 마이크로비드를 해밀턴 시린지에 연결된 마이크로피펫을 통해 기포 아래의 전방으로 주사하였다. 감염을 예방하기 위해 주사된 눈에 항생제 연고를 국소적으로 도포하였다.
안압계를 사용하여 4주 동안 매주 안압을 측정하였다. 특히, 지속적으로 흐르는 이소플루란 (산소와 혼합된 5% 이소플루란, 2 L/분)으로 충전된 마취실에 마우스를 두었다. 안압계는 매주 체크인할 때마다 5회 측정하고, 높은 판독값과 낮은 판독값을 제거하고, 각 마우스의 나머지 판독값으로부터 평균 안압을 생성하였다.
마이크로비드 주사 4주 후, 눈을 절개하고, 4℃에서 밤새도록 4% PFA로 사후 고정시켰다. 이어서, 망막을 절개하고, PBS로 3회 세척한 후, 밤새도록 차단하였다 (5% 정상 당나귀 혈청 및 PBS 중 1% 트리톤 X-100). 이어서, RGC에 대한 마커인 Brn3a에 대해 전체-마운팅된 망막을 면역염색하였다. ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 전체-마운팅된 망막의 4개 사분면으로부터의 중간-주변부 영역에서 Brn3a-양성 RGC 개수 (세포/㎟)를 카운팅하였다. 반대쪽 상해를 입지 않은 눈을 대조군으로 사용하였다.
도 11a에 제시된 바와 같이, 안구 마이크로비드 주사는 1주 만에 안압을 약 11 mmHg에서 약 18 mmHg로 상승시켰다. 그 후 안압은 감소하여 마이크로비드 주사 4주 후 약 14 mmHg로 낮은 값에 도달하였다. 고안압증 마우스의 안압은 마이크로비드를 주사받지 않은 대조군 마우스보다 유의적으로 더 높았다 (***p < 0.001, ****p < 0.0001, 0일차 대비).
rAAV2-HspB1 주사 6주 후 유리체내로 투여된 rAAV2-HspB1이 RGC 생존에 미치는 영향이 도 11b에 그래프로 도시되어 있으며, 여기서 ns=비유의적, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001이다. 제시된 바와 같이, 안압이 상승되지 않은 대조군 샘플로부터 제거되거나, 또는 바이러스 벡터로 처리된 망막은 ㎟당 거의 3,900개에 달하는 RGC를 가졌다. 그에 반해, 마이크로비드 및 PBS가 주사된 비처리된 고안압증 마우스 ("비히클")는 6주 후 ㎟당 단지 약 2,000개의 RGC만을 가졌고, 마이크로비드 및 rAAV2 캡시드가 주사된 마우스 ("AAV2")는 ㎟당 약 2,300개의 RGC를 가졌다. 1x109 vg/눈의 rAAV2-HspB1로 처리된 마우스로부터 추출된 망막은 6주 후 ㎟당 3,600개 초과의 RGC를 보유하였고, 5x109 vg/눈의 rAAV2-HspB1로 처리된 마우스로부터 추출된 망막은 ㎟당 약 3,900개의 RGC를 가졌다. 따라서, 상기 두 용량 모두 그러한 rAAV2-HspB1은 안압이 고안압증 수준으로 상승된 망막 내에 존재하는 RGC의 손실을 유의적으로 예방하였다.
도 11b의 정량적 RGC 농도 수득 기점이 된 망막의 공초점 현미경 이미지는 도 11c에 제시되어 있다. 더 큰 Brn3a 염색으로 입증되는 바와 같이, RGC 개수는 건강한 대조군 그룹 (1102)으로부터 제거된 망막에서 가장 높았다. Brn3a 염색은 비처리된 고안압증 그룹 (1104) 및 rAAV2-캡시드 고안압증 그룹 (1106)에서 훨씬 더 낮았다. 더 큰 Brn3a 염색으로 입증되는 바와 같이, 1x109 vg/눈 rAAV2-HspB1 그룹 (1108) 및 5x109 vg/눈 rAAV2-HspB1 그룹 (1110)은 비처리된 고안압증 그룹 (1104) 및 rAAV2-캡시드 고안압증 그룹 (1106)과 비교하여 RGC 사멸을 유의적으로 예방하는 것으로 나타났다.
rAAV2-HspB1이 RGC에서의 축삭 수송 결함에 미치는 예방 효과를 또한 유리체내 rAAV2-HspB1 주사 6주 후에 측정하였다. 도 12a에 그래프로 도시된 바와 같이 (ns=비유의적 및 *p < 0.05), 콜레라 독소 B ("CT-B") 표지화를 사용하여 RGC에서의 축삭 수송을 시각화하고, 정량화하였다. 대조군 마우스로부터 제거된 망막은 rAAV2-HspB1 주사 6주 후 약 42인 CT-B 강도 값을 보였다. 그에 반해, PBS 중 마이크로비드 주사를 받은 비처리된 마우스 ("비히클")는 6주 후 단지 약 25인 CT-B 강도 값을 보였고, 마이크로비드 및 rAAV2 캡시드가 주사된 마우스는 약 26인 CT-B 강도 값을 보였다. 1x109 vg/눈의 rAAV2-HspB1로 처리된 마우스로부터 추출된 망막은 6주 후 약 35인 CT-B 강도 값을 보였고, 5x109 vg/눈의 rAAV2-HspB1로 처리된 마우스로부터 추출된 망막은 약 42인 CT-B 강도 값을 보였다. 따라서, 더 낮은 저용량의 rAAV2-HspB1은 안압이 상승된 RGC에서의 축삭 수송 결함 발생을 부분적으로 예방한 반면, 더 큰 용량의 rAAV2-HspB1은 축삭 수송 결함의 발생을 유의적으로 예방하였다. 5x109 vg/눈의 rAAV2-HspB1이 주사된 RGC에서의 축삭 수송은 안압이 상승되지 않은 RGC에서 측정된 축삭 수송과 거의 동일하였으며, 이는 5x109 vg/눈의 rAAV2-HspB1의 유리체내 투여가 추후 고안압증을 앓게 될 마우스에서의 축삭 수송 결함의 발생을 실질적으로 예방하는데 충분할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
도 12a의 정량적 CT-B 강도 값 수득 기점이 된 RGC 축삭의 공초점 현미경 이미지는 도 12b에 제시되어 있다. 비교적 높은 CT-B 염색으로 입증되는 바와 같이, 건강한 대조군 그룹 (1202)에서의 축삭 수송은 5x109 vg/눈의 rAAV2-HspB1이 주사된 고안압증 그룹 (1210)에서 측정된 축삭 수송과 유사하였다. 축삭 수송은 비처리된 고안압증 그룹 (1204) 및 rAAV2-캡시드 고안압증 그룹 (1206)에서에서 현저히 더 낮았다. 1x109 vg/눈 rAAV2-HspB1 그룹 (1208) 군은 비처리된 고안압증 그룹 (1204) 및 rAAV2-캡시드 고안압증 그룹 (1206)과 비교하여 어느 정도의 축삭 수송 보존을 보였다. 따라서, 고안압증에 의해 유발되는 축삭-매개 CT-B 수송 감소는 5x109 vg/눈 rAAV2-HspB1의 유리체내 투여를 통해 실질적으로 예방되었다.
실시예
4
안압 상승 후 rAAV2-HspB1 개입이 RGC 사멸 및 축삭 수송 결함을 감소시키거나, 제거하거나, 또는 저속화시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 고안압증 마우스 모델을 채택하여 안압이 증가한 후에 마우스에 벡터를 유리체내로 주사하였다.
0.5% 프로파라카인 히드로클로라이드의 국소 적용으로 보충된 케타민/크실라진의 복강내 주사를 통해 마우스를 먼저 마취시킴으로써 고안압증 모델을 생성하였다. 각 동물의 오른쪽 눈의 전방에 폴리스티렌 마이크로비드 (직경 10 μm, 500만개의 비드/mL PBS)를 주사하여 편측으로 고안압증을 유발하였다. 33G 니들을 사용하여 각막 중심 부근을 가볍게 천공한 후, 작은 기포를 주사하여 눈 전방을 들어 올렸다. 소량 (2 μL)의 마이크로비드를 해밀턴 시린지에 연결된 마이크로피펫을 통해 기포 아래의 전방으로 주사하였다. 감염을 예방하기 위해 주사된 눈에 항생제 연고를 국소적으로 도포하였다.
안압계를 사용하여 6주 동안 매주 안압을 측정하였다. 특히, 지속적으로 흐르는 이소플루란 (산소와 혼합된 5% 이소플루란, 2 L/분)으로 충전된 마취실에 마우스를 두었다. 안압계는 매주 체크인할 때마다 5회 측정하고, 높은 판독값과 낮은 판독값을 제거하고, 각 마우스의 나머지 판독값으로부터 평균 안압을 생성하였다.
시험 동물에서 고안압증이 유발되고, 1주일 후에 단일 용량의 rAAV2-HspB1 (1 μL 행크스 균형 염 용액 (HBSS) 중 1x109 바이러스 게놈)을 마우스 처리 그룹에 유리체내로 주사하였다. 화살표로 표시된 바와 같이(첫 번째 화살표 표시는 맨 처음의 마이크로비드 주사를 나타냄), 안압은 rAAV2-HspB1 투여 2주 후 두 번째 마이크로비드 주사를 통해 또 다시 증가되었다.
도 13a의 선 그래프로 제시된 바와 같이, 첫 번째 안구 마이크로비드 주사는 마이크로비드 및 rAAV2 캡시드가 주사된 망막에서 1주 만에 안압을 약 10 mmHg에서 약 23 mmHg로 상승시켰다. 안압은 두 번째 마이크로비드 주사가 투여된 시점인 3주차까지 감소하였다. 주사를 받지 않은 비처리된 대조군 눈은 실험 기간 내내 대략 일정한 IOP를 유지하였다. 마이크로비드 및 rAAV2-HspB1이 주사된 눈은 건강한 대조군 및 AAV2 캡시드가 주사된 고안압증 눈과 비교하여 2주 및 4주차에 상승된 IOP 수준을 나타내었다. 그러나, 3주차에, rAAV2-HspB1의 유리체내 주사는 AAV2 캡시드가 주사된 고안압증 눈에 비해 안압을 낮추었다.
안압이 상승된 눈에서 유리체내 rAAV2-HspB1 주사가 RGC 생존에 미치는 영향이 도 13b에 그래프로 도시되어 있다. 제시된 바와 같이, 대조군 마우스로부터 제거된 망막은 첫 번째 마이크로비드 주사 1주 후 ㎟당 거의 3,800개에 달하는 RGC를 가졌다. RGC 개수는 2주차 ㎟당 약 3,500개로 감소하였고, 4주차 ㎟당 약 3,700개로 증가한 후, 6주차 ㎟당 약 3,400개로 하락하였다.
그에 반해, 마이크로비드 및 rAAV2 캡시드가 주사된 마우스는 연구가 진행되는 동안 ㎟당 RGC 개수가 꾸준히 감소하는 것으로 나타났고, 1주차 마크에서 ㎟당 약 3,500개인 것을 시작으로, 2주차 ㎟당 3,000개, 4주차 ㎟당 2,500개, 6주차 ㎟당 2,200개였다.
rAAV2-HspB1로 처리된 마우스로부터 추출된 망막은 연구 2주차에 ㎟당 약 3,400개의 RGC를 가졌다. 이어서, RGC 농도는 4주차 ㎟당 약 3,500개의 RGC로 상승한 후, 6주차에는 ㎟당 약 3,100개의 RGC로 하락하였다. 따라서, rAAV2-HspB1로 처리된 망막에서 최종 RGC 농도는 건강한 대조군 망막에서 측정된 최종 RGC 농도의 약 88%였다. 따라서, rAAV2-HspB1의 유리체내 주사는 안압이 상승되지 않고, rAAV2 캡시드가 주사된 망막과 비교하여 안압이 상승된 망막에서 RGC의 손실을 유의적으로 감소시켰다 (**p < 0.01, ***p < 0.001).
도 13b의 정량적 RGC 농도 수득 기점이 된 망막의 공초점 현미경 이미지는 도 13c에 제시되어 있다. 연구 6주차의 더 큰 Brn3a 염색으로 입증되는 바와 같이, rAAV2-HspB1 그룹 (1302)의 RGC 개수는 건강한 대조군 그룹 (1304)의 RGC 개수와 유사하였지만, 그에 반해 RGC 개수는 연구가 진행되는 동안 비처리된 고안압증 그룹 (1306)에서 유의적으로 감소하였다.
고안압증 6주 후 유리체내 rAAV2-HspB1 주사가 축삭 수송에 미치는 영향을 또한 측정하였고, 이는 도 14a에 그래프로 도시되어 있으며, 여기서 ns=비유의적 및 *p < 0.05이다. 제시된 바와 같이, 대조군 마우스로부터 제거된 망막은 연구 참여 6주 후 약 40인 CT-B 강도 값을 보였다. 그에 반해, 마이크로비드 및 PBS가 주사된 비처리된 마우스 ("비히클")는 6주차 약 30인 CT-B 강도 값을 보였고, 마이크로비드 및 rAAV2 캡시드가 주사된 마우스는 약 29인 CT-B 강도 값을 보였다. rAAV2-HspB1로 처리된 마우스로부터 추출된 망막은 6주 후 약 39인 CT-B 강도 값을 보였다. 따라서, 유리체내 rAAV2-HspB1 투여는 동일하게 안압이 증가된 비처리된 RGC와 비교하여 안압이 상승된 RGC에서 축삭 수송 결함을 감소시켰다. rAAV2-HspB1이 주사된 RGC에서의 축삭 수송은 안압이 상승되지 않은 RGC에서 측정된 축삭 수송과 거의 동일하였다.
도 14a의 정량적 CT-B 강도 값 수득 기점이 된 망막의 공초점 현미경 이미지는 도 14b에 제시되어 있다. CT-B 염색으로 입증되는 바와 같이, 축삭 수송은 건강한 대조군 그룹 (1402)에서 가장 컸다. CT-B 강도는 비처리된 고안압증 그룹 (1404) 및 rAAV2-캡시드 고안압증 그룹 (1406)에서 훨씬 더 낮았다. rAAV2-HspB1 그룹 (1408)은 비처리된 고안압증 그룹 (1404 및 rAAV2-캡시드 고안압증 그룹 (1406)과 비교하여 거의 정상적인 축삭 수송 수준을 보존하였다.
실시예
5
rAAV2-HspB1의 유리체내 투여가 20주 기간에 걸쳐 RGC 기능 감소를 완화시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 고안압증 마우스 모델을 채택하여 안압이 증가한 후에 마우스에 벡터를 유리체내로 주사하였다.
실험 1일차에 마이크로비드 주사한 후, 3 및 6주차에 후속 마이크로비드 주사를 통해 고안압증 모델을 생성하였다. 안압계를 사용하여 20주 동안 매주 안압을 측정하였다. 첫 번째 마이크로비드 주사 1주 후, 별개의 마우스 그룹에 단일 용량의 rAAV2-HspB1 또는 AAV2 캡시드를 유리체내로 주사하였다.
도 15a에 제시된 바와 같이, 안구 마이크로비드 주사는 6주 후 안압을 출발 값 약 10 mmHg에서 약 18 mmHg로 유의적으로 상승시켰고, 그 후 안압은 20주차 약 13으로 하락하였다 (ns = 비유의적, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
RGC 기능은 연구 기간인 20주 동안 패턴 망막전위도 (PERG) 진폭을 통해 평가하였다. PERG 측정은 제조업체의 지침에 따라 외르벡(Joervec) 기기 (인텔리전트 히어링 시스템즈(Intelligent Hearing Systems: 미국 플로리다주 마이애미))를 사용하여 수행하였다. 기준 전극과 접지 전극을 각각 두피와 꼬리 부위의 피하 위치에 배치하고, 각막 전극을 안구와 접촉하는 하방 원개에 배치하였다. 각막 건조를 예방하기 위해 GelTear 점안제 소적을 양쪽 눈에 적용하였다. 시스템에 부착된 별도의 두 LED 모니터를 사용하여 0.095 사이클/도의 공간 주파수 및 500 cd/㎡의 휘도에서 콘트라스트 역전 수평 바를 표시하였다. 디스플레이 모니터와 눈 사이의 거리는 10 cm를 유지하였다. LED 모니터는 광 신호의 더 우수한 투사를 위해 대략 60도의 각도로 배치하였다. 이어서, 양쪽 눈으로부터의 372개의 스윕 (온-오프)으로 구성된 각 실행당 생성된 PERG 파형을 각 눈에 대해 별개로 PERG 소프트웨어로 프로세싱하고, 평균화하였다. PERG 소프트웨어를 사용하여 총 평균 PERG 파형을 분석하여 주요 양성파 (P1) 및 음성파를 확인하여 진폭 및 잠복기를 계산하였다.
P1 진폭 판독값 (측정 단위 μV)은 도 15b에 제시되어 있다. 제시된 바와 같이, rAAV2-캡시드 마우스의 눈에서의 안압 상승은 대조군 마우스와 비교하여 P1 진폭을 유의적으로 감소시켰다. 그에 반해, 유리체내 rAAV2-HspB1 주사는 대조군 마우스에서 측정된 P1 진폭과 거의 동일한 P1 진폭을 유지하였다 (*p<0.03; ns = 비유의적). 따라서 유리체내 rAAV2-HspB1 주사는 안압 상승으로 인해 생성된 녹내장 마우스 모델에서 RGC의 시각 기능을 개선시켰다.
실시예
6
rAAV2-HspB1의 유리체내 주사가 망막 신경교증을 완화시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 고안압증 마우스 모델을 채택하여 안압이 증가한 후에 마우스에 벡터를 유리체내로 주사하였다.
신경교증 연구를 위해, 마우스의 대조군 그룹에는 마이크로비드 또는 바이러스 벡터를 주사하지 않았고, 양성 대조군 그룹에는 마이크로비드 및 rAAV2 캡시드를 주사하였고, 제3 그룹에는 마이크로비드 및 rAAV2-HspB1을 주사하였다. 신경교섬유질 산성 단백질 ("GFAP") 및 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1("Iba1") 염색을 사용하여 잘 분화된 신경교 세포의 증식으로 입증되는 망막 신경교증을 확인하였다. 염색이 더 클수록 더 높은 수준의 신경교증을 나타내었다.
도 16의 20X 공초점 현미경 이미지에 제시된 바와 같이, 대조군 그룹 (1602a,b)은 신경교증의 현저한 증가를 나타낸, rAAV2 캡시드가 주사된 비처리된 고안압증 그룹 (1604a,b)과 비교하여 각각 더 적은 GFAP 및 Iba1 염색을 나타냈다. 신경교증이 rAAV2-HspB1-처리된 고안압증 마우스 (1606a,b)에서는 건강한 대조군 그룹과 실질적으로 유사한 수준으로 감소되었다.
상기에서 다양한 대표적인 실시양태 및 구현이 특정 정도로 상세하게 설명되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 명세서 및 청구범위에 기재된 본 발명의 대상의 취지 또는 범주를 벗어나지 않으면서 개시된 실시양태를 다수 변경시킬 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 직접 또는 간접적으로 기재된 방법론에서, 다양한 단계 및 조작은 하나의 가능한 조작 순서로 기술되지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단계 및 조작이 반드시 본 개시내용의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서, 재배열, 대체 또는 제거될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 상기 설명에 포함되거나, 첨부된 도면에 도시된 모든 사항은 제한하는 것이 아니라, 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하는 것으로 의도된다. 첨부된 청구범위에 정의된 본 개시내용의 취지로부터 벗어나지 않으면서 세부사항 또는 구조의 변경이 이루어질 수 있다.
Claims (20)
- 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그를 예방하거나 또는 완화시키는 방법으로서:
대상체에게 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 벡터는 하기를 포함하는 것인 방법:
적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 여기서 적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질은 Hsp27을 포함함; 및
핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열, 여기서 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도함. - 제1항에 있어서, 망막 신경절 세포가 포유동물 망막 신경절 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 대상체가 상해를 입거나 또는 망막 질환 또는 병태가 진단된 후 24시간 이내에 적어도 1회 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 유리체내로 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 단지 1회 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 타입 2 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 질환, 상해 또는 병태가 녹내장인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 질환, 상해 또는 병태가 황반 변성, 당뇨병성 눈 질환, 망막 박리, 및 색소성 망막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 질환, 상해 또는 병태가 흥분독성 손상, 물리적 손상, 화학적 손상, 신경영양 인자 고갈, 산화 스트레스, 염증, 미토콘드리아 기능장애, 축삭 수송 부전, 또는 그의 조합에 의해 유발되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 질환, 상해 또는 병태가 망막 신경절 세포의 손실, 안압의 증가, 또는 둘 다를 포함하는 것인 방법.
- 하기를 포함하는, 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그를 예방하거나 또는 완화시키기 위한 시스템으로서:
주사 장치; 및
재조합 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하며, 여기서 벡터는 하기를 포함하는 것인 조성물의 치료 유효량:
적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 여기서 적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질은 Hsp27을 포함함; 및
핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열, 여기서 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도함,
여기서 주사 장치는 대상체에게 조성물을 유리체내로 투여하도록 구성된 것인
시스템. - 제11항에 있어서, 망막 질환, 상해 또는 병태가 녹내장인 시스템.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 망막 질환, 상해 또는 병태가 망막 신경절 세포의 손실, 안압의 증가, 또는 둘 다를 포함하는 것인 시스템.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 신경절 세포가 포유동물 망막 신경절 세포를 포함하는 것인 시스템.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 장치가 일회용 장치인 시스템.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 타입 2 벡터를 포함하는 것인 시스템.
- 하기를 포함하는 제약 조성물로서:
하기를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터:
적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 여기서 적어도 하나의 생물학적 활성 열 충격 단백질은 Hsp27을 포함함; 및
핵산 서열의 상류에 위치하는 프로모터 서열, 여기서 프로모터 서열은 망막 신경절 세포에서의 핵산 서열의 발현을 유도함; 및
제약상 허용되는 담체,
여기서 제약 조성물은 대상체에서 망막 질환, 상해 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그를 예방하거나 또는 완화시키도록 제제화되는 것인
제약 조성물. - 제17항에 있어서, 제약 조성물이 유리체내 투여를 위해 제제화되는 것인 제약 조성물.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 타입 2 벡터를 포함하는 것인 제약 조성물.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 질환, 상해 또는 병태가 망막 신경절 세포의 손실, 안압의 증가, 또는 녹내장 중 하나 이상을 포함하는 것인 제약 조성물.
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