KR20230144179A - 3차원 라만 영상을 구현하는 라만 현미경 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따른 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현하는 라만 현미경은 단색광을 광원으로 사용하여 대물렌즈(5)로 시료의 실상(RI)을 얻은 후 이를 라만 분광기(8) 및 시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9) 중에서 선택된 하나의 기기로 보내주며, 대물렌즈(5)로 얻어진 시료의 실상(RI) 중 원하는 부분만 선택적으로 통과시켜주는 영상선택기구(6)와 상기 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 촛점(f2)과 대물렌즈(5) 간의 거리(D3)를 조절하여 단색광의 초점(f2)을 대물렌즈(5) 자체의 촛점(f1)과 다른 위치에 형성시키는 가변 이중초점 형성기구를 포함하고, 상기 영상선택기구(6)는 구멍크기 조절이 가능하고 가로축(x축), 세로축(y축) 및 깊이축(z축)으로 움직일 수 있는 3차원 스캐너(X)에 설치되어 있는 것을 특징으로 한다.
광원의 크기를 시료에 맞출 필요가 없고, 3차원 라만 영상(3-DRI) 구현시에도 종래 방법에 비해 측정점(data point) 간격이 대물 렌즈의 초점 직경보다 클 경우 생기는 미측정 죽은 공간(dead space)을 작게 줄이거나 없앨 수 있으며, 상기 가변 이중초점 형성기구로 인해 매 측정 시 마다 별도의 광원의 세기 조절이 필요치 않아 사용이 편리하고, 우수한 잡음 대비 신호 비율(S/N)의 스펙트럼 과 정밀한 3차원 라만 영상(3-DRI)을 얻을 수 있다.
본 발명은 시료 및 대물렌즈는 고정된 상태에서 이미지 선택을 위한 영상선택기구(6)를 움직여 확대된 실상에서 시료 중 특정부분을 선택하기 때문에 종래의 라만 현미경 보다 공간 분해능이 크고 정밀한 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현한다.

Description

3차원 라만 영상을 구현하는 라만 현미경{Laman microscope mapping 3-dimensional raman image}
본 발명은 3차원 라만 영상을 구현하는 라만 현미경에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 광원의 크기를 시료에 맞출 필요가 없고, 3차원 라만 영상(3-DRI) 구현시에도 종래 방법에 비해 측정점(data point) 간격이 대물 렌즈의 초점 직경보다 클 경우 생기는 미측정 죽은 공간(dead space)을 작게 줄이거나 없앨 수 있으며, 상기 가변 이중초점 형성기구로 인해 매 측정 시 마다 별도의 광원의 세기 조절이 필요치 않아 사용이 편리하고, 우수한 잡음 대비 신호 비율(S/N)의 스펙트럼과 정밀한 3차원 라만 영상(3-Dimensional Raman Image : 이하 "3-DRI"라고 약칭한다)을 구현할 수 있는 라만 현미경에 관한 것이다.
본 발명이 기반이 되는 라만 분광법(Raman spectroscopy)에 대해 간단히 설명한다. 이는 라만 산란을 이용하여 물질을 정성, 정량 분석하는 방법으로서, 그 측정 원리를 살펴보면, 진동수가 V0인 레이저광 등의 단색광을 V1의 진동수로 진동하고 있는 분자 결합에 조사하면 거의 대부분(99% 이상)의 빛은 진동수의 변화 없이 그대로 산란이 되지만 극히 일부는 결합 에너지 준위의 볼쯔만 분포(Boltzmann distribution) 수준에 따라 분자의 결합에너지에 해당하는 V1 만큼을 분자 결합에 주거나(V0-V1) 또는 분자 결합으로부터 에너지를 받으며(V0+V1) 산란이 일어나서 파장이 길어지거나, 파장이 짧아진다. 이와 같이 산란광의 파장이 변화하는 현상을 라만 산란이라 한다. 그 파장의 변화 정도는 적외선 에너지 영역에 해당하는데 모든 화합물들은 각각의 고유한 파장 변화 값을 갖으며 산란광의 세기 변화는 그 농도에 비례한다. 따라서 사람의 지문과 같은 이 파장의 변화와 세기의 차이로부터 물질의 정성, 정량 분석이 가능해 진다.
시료에 조사한 레이저 단색광의 산란광 중에서 파장이 변화된 라만 산란광만을 광학 필터를 사용하여 선택하고 파장 및 세기를 측정한다. 이와 같이 변화된 파장 값을 정성, 정량적으로 측정하는 것이 라만 분광기이다.
보통 시료의 양이 충분히 많거나 큰 경우에는 이와 같은 라만 산란을 비교적 간단한 라만 프로브(probe) 등으로 손쉽게 측정이 가능하나 시료의 크기가 ㎛ 단위수준으로 작아지면 그 측정은 매우 어려워진다. 이와 같은 경우 광학 현미경과 같이 작은 시료를 확대 측정 할 수 있는 장치를 라만 분광기에 연결하여 측정하여야만 한다. 이때 라만 산란광은 매우 미약하여서 이와 같이 작은 시료를 측정을 할 때는 현미경의 성능이 좋아야만 더 작은 시료의 측정이 가능하다.
종래 고감도 라만 현미경으로서 대한민국 등록특허 제10-0882490호에서는 도 2에 도시된 바와 같이 단색광을 광원으로 사용하여 대물렌즈(5)로 시료의 실상(RI)을 얻은 후 이를 라만 분광기(8) 및 시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9) 중에서 선택된 하나의 기기로 보내주며, 대물렌즈(5)로 얻어진 시료의 실상(RI) 중 원하는 부분만 선택적으로 통과시켜주는 영상선택기구(6)와 상기 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 촛점(f2)과 대물렌즈(5) 간의 거리(D3)를 조절하여 단색광의 초점(f2)을 대물렌즈(5) 자체의 촛점(f1)과 다른 위치에 형성시키는 가변 이중초점 형성기구를 포함하는 라만 현미경을 게재하고 있으나, 상기의 종래 라만 현미경은 단일 포인트의 라만스펙트럼을 측정을 통해 측정 부위의 성분 분석만이 가능 할 뿐 특정 성분의 3차원적 공간 분포를 보여주는 3-DRI을 구현할 수 없는 문제가 있었다.
최근에는 이와 같이 작은 시료의 단순한 성분 측정에서 한발 더 나가 시료 내에 특정 성분의 3차원적 분포를 ㎛ 단위 수준에서 측정하고 이를 여러 색깔의 이미지로 바꿔 한눈에 보여주는 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현할 수 있는 라만 현미경이 개발되었다.
3-DRI를 구현하는 종래의 라만 현미경으로는 도 3에 도시된 바와 같은 시료대 이동방식(Stage scanning)의 라만 현미경과 도 4에 도시된 바와 같은 대물렌즈 이동방식(Objective scanning)의 라만 현미경이 알려져 있다.
먼저 도 3의 시료대 이동 방식의 종래 라만 현미경은 일반적인 반사 모드 라만 현미경에 3차원으로 이동 가능한 시료대를 설치하고 이를 라만 분광기에 연결하여 측정한다.
그 측정 과정은 다음과 같다. 라만 현미경의 측정 원리 상 큰 특징은 시료의 현미경 대물렌즈의 레이저광의 밀도가 낮은 경우에는 초점 부위에서 라만 신호가 가장 강하게 발생한다는 것이다. 따라서 x(가로), y(세로), z(깊이)의 3 축으로 움직이는 시료대 위에 시료를 놓고 시료 표면에 초점을 맞추고 x, y축으로 원하는 거리, 횟수만큼 움직이며 측정을 하여서 시료 평면에 대한 초점 부위의 이차원 데이터를 제1층(1st layer)의 x,y 배열로 저장한다.
그런 후 시료대의 z축을 움직여 시료를 조금 위로 올리면 초점은 시료 내부에 맺게 되고 다시 x,y축으로 측정하면 내부 평면의 이차원 데이터를 제2층(2nd layer)의 x,y 배열로 저장한다.
다시 시료대의 z축을 움직여 시료를 올리고 위 과정을 반복하면서 제3층(3rd layer)의 x,y 배열로 저장한다. z축에 대해서도 원하는 거리,횟수만큼 이를 반복한다.
이와 같이 만들어진 각 평면의 2차원 배열 데이터를 순서대로 적층하면 각 측정점의 라만 스펙트럼으로 된 3차원의 배열 데이터가 만들어 진다. 이때 x축으로 n개의 측정점(data point), y축으로 m개의 측정점, z축으로 p개의 측정점을 측정한다면 3차원 배열 데이터 전체 측정점의 수는 n x m x p개가 된다. 그런 후 각 측정점의 라만 스펙트럼에서 특정 목적 피크의 세기에 따라 색상, 농담을 정해주면 3차원 라만 영상(3-DRI)이 만들어진다.
이와 같은 3차원 데이터 배열의 측정 방법들에 있어 이와 같이 3축 이동 시료대를 사용하는 것이 가장 손쉬워 많이 사용되는 방법이나 측정 상 몇 가지 문제점들이 있다. 먼저 시료가 작고 가벼운 경우는 시료대가 이동할 때 시료 위치가 움직일 수 있으며, 시료가 큰 경우는 제한된 대물렌즈와 시료대의 간격(working distance)으로 이동 시료대에 올릴 수가 없어 측정이 불가능하며 시료가 무거울 경우에도 시료대의 하중 제한으로 측정 불가능하며 초과하중 시 고장날수도 있다. 또 젤리처럼 유동성이 있는 시료의 경우는 시료대의 움직임에 따라 시료가 흔들릴 수 있어 정확한 측정 위치를 잡기가 어려울 수도 있다.
다음으로 도 4의 대물렌즈 이동방식의 종래 라만 현미경은 이동 시료대 대신 대물렌즈 스캐너(Y)를 설치, 사용하기 때문에 상기의 시료대 이동방식의 라만 현미경의 문제점들을 해결할 수 있으나, 광학적 측면에서의 또 다른 문제점이 있다.
구체적으로, 측정 시 스캐너에 붙은 대물렌즈의 이동으로 시료 측정 평면상 대물렌즈의 레이저 조사광 초점 위치가 달라지면 신호광의 초점 위치도 당연히 달라진다. 측정 평면상 대물렌즈의 모든 측정점에서 라만 신호를 얻기 위해서는 모든 위치에서의 신호광 촛점이 검출계로 가야만 한다. 이를 위해서는 신호 영상 조리개의 크기를 충분히 크게 만들어야만 한다. 이와 같은 경우 시료 신호광 외에 잡광들도 함께 통과 하게 되어 시료 측정의 공간 분해능과 신호대비 잡음비의 저하를 유발하고 라만 스펙트럼 및 라만 이미지의 질이 현저히 저하된다. 또한 대물렌즈 스캐너는 매우 고가의 장치로 핵심 부품인 피에조 단결정이 기계적 충격에 매우 취약하여 대물렌즈의 조작 과정에서 작은 충격으로도 파손 우려가 크다는 문제점도 있다.
본 발명의 과제는 종래 라만 현미경 보다 공간 분해능이 크고, 시료 크기의 한계를 1~10㎛ 수준까지 낮출 수 있고, 광원의 크기를 시료에 맞출 필요가 없고, 3차원 라만 영상(3-DRI) 구현시에도 종래 방법에 비해 측정점(data point) 간격이 대물 렌즈의 초점 직경보다 클 경우 생기는 미측정 죽은 공간(dead space)을 작게 줄이거나 없앨 수 있으며, 상기 가변 이중초점 형성기구로 인해 매 측정 시 마다 별도의 광원의 세기 조절이 필요치 않아 사용이 편리하고, 우수한 잡음 대비 신호 비율(S/N)의 스펙트럼 과 정밀한 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현할 수 있는 라만 현미경을 제공하는 것이다.
이와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에서는 단색광을 광원으로 사용하여 대물렌즈(5)로 시료의 실상(RI)을 얻은 후 이를 라만 분광기(8) 및 시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9) 중에서 선택된 하나의 기기로 보내주며, 대물렌즈(5)로 얻어진 시료의 실상(RI) 중 원하는 부분만 선택적으로 통과시켜주는 영상선택기구(6)와 상기 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 촛점(f2)과 대물렌즈(5) 간의 거리(D3)를 조절하여 단색광의 초점(f2)을 대물렌즈(5) 자체의 촛점(f1)과 다른 위치에 형성시키는 가변 이중초점 형성기구를 포함하는 라만 현미경을 제조할 때 상기 영상선택기구(6)를 구멍크기 조절이 가능하고 가로축(x축), 세로축(y축) 및 깊이축(y축)으로 움직일 수 있는 3차원 스캐너(X)에 설치해 준다.
광원의 크기를 시료에 맞출 필요가 없고, 3차원 라만 영상(3-DRI) 구현시에도 종래 방법에 비해 측정점(data point) 간격이 대물 렌즈의 초점 직경보다 클 경우 생기는 미측정 죽은 공간(dead space)을 작게 줄이거나 없앨 수 있으며, 상기 가변 이중초점 형성기구로 인해 매 측정 시 마다 별도의 광원의 세기 조절이 필요치 않아 사용이 편리하고, 우수한 잡음 대비 신호 비율(S/N)의 스펙트럼 과 정밀한 3차원 라만 영상(3-DRI)을 얻을 수 있다.
본 발명은 시료 및 대물렌즈는 고정된 상태에서 이미지 선택을 위한 영상선택기구(6)를 움직여 확대된 실상에서 시료 중 특정부분을 선택하기 때문에 종래의 라만 현미경 보다 공간 분해능이 크고 정밀한 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현한다.
도 1은 본 발명에 따른 라만 현미경의 기본 구조를 나타내는 개략도.
도 2는 1차원 라만 영상(1-DRI)만 구현 가능한 종래 고감도 라만 현미경의 기본 구조를 나타내는 개략도.
도 3은 시료대 이동방식으로 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현하는 종래 라만 현미경의 기본 구조를 나타내는 개략도.
도 4는 대물렌즈 이동방식으로 라만 영상(3-DRI)을 구현하는 종래 라만 현미경의 기본 구조를 나타내는 개략도.
도 5는 본 발명의 라만 현미경으로 실시예 2와 같이 폴리에스테르(PET) 사출판의 3차원적인 물성 변화를 측정하여 얻은 3차원 라만 영상(3-DRI)의 그림.
도 6은 본 발명의 라만 현미경으로 실시예 1과 같이 폴리에스테르(PET) 사출판을 측정하여 얻은 라만 스펙트럼.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현하는 라만 현미경은 단색광을 광원으로 사용하여 대물렌즈(5)로 시료의 실상(RI)을 얻은 후 이를 라만 분광기(8) 및 시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9) 중에서 선택된 하나의 기기로 보내주며, 대물렌즈(5)로 얻어진 시료의 실상(RI) 중 원하는 부분만 선택적으로 통과시켜주는 영상선택기구(6)와 상기 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 촛점(f2)과 대물렌즈(5) 간의 거리(D3)를 조절하여 단색광의 초점(f2)을 대물렌즈(5) 자체의 촛점(f1)과 다른 위치에 형성시키는 가변 이중초점 형성기구를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 상기의 라만 현미경은 상기 영상선택기구(6)는 구멍크기 조절이 가능하고 가로축(x축), 세로축(y축) 및 깊이축(z축)으로 움직일 수 있는 3차원 스캐너(X)에 설치되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 영상선택기구(6)는 시료(S)중 선택하는 특정영역의 크기를 임의로 조절할 수 있다.
이때, 시료(S)중 선택하는 특정영역의 모양이 원 또는 다각형인 것이 바람직하다.
상기 단색광의 파장범위는 자외선에서 근적외선까지 이다.
다음은 본 발명에 따른 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현하는 라만 현미경의 기본 골격을 설명키 위해 본 발명자가 출원하여 등록받은 특허(특허번호:10-0882490)인 잡음 대비 신호 특성이 우수한 라만 현미경(이하 "상기 등록 라만 현미경"이라고 한다)의 원리를 살펴본다.
일반적으로 라만 현미경은 앞에서 설명한 바와 같이 단색광을 광원으로 사용하여 시료의 실상(RI)을 얻은 후 이를 라만 분광기(8)로 보내 스펙트럼을 측정하거나, 시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9)로 보낸다.
상기 등록 라만 현미경 역시 도 2에 도시된 바와 같이 단색광을 광원으로 사용하여 대물렌즈(5)로 시료의 실상(RI)을 얻은 후 이를 라만 분광기(8) 및 시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9) 중에서 선택된 하나의 기기로 보내준다.
상기 등록 라만 현미경은 도 2에 도시된 바와 같이 대물렌즈(5)로 얻어진 시료의 실상(RI) 중 원하는 부분만 선택적으로 통과시켜주는 영상선택기구(6)를 포함한다.
상기 영상선택기구(6)는 크기를 연속적으로 또는 단계적으로 변화시킬 수 있는 조리개 등이고, 상기 조리개는 모양이 원형 또는 다각형 등이다.
상기 단색광으로는 보통 레이져광이 사용되며, 파장범위는 자외선 영역에서 근적외선 영역까지이다.
시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9)는 모니터 또는 카메라 등이다.
또한, 상기 등록 라만 현미경은 상기의 영상선택기구(6)와 함께 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 촛점(f2)과 대물렌즈(5) 간의 거리(D3)를 조절하여 단색광의 초점(f2)을 대물렌즈(5) 자체의 촛점(f1)과 다른 위치에 형성시키는 가변 이중초점 형성기구를 추가로 더 포함한다.
상기의 가변 이중초점 형성기구는 단색광 조사 기기(1)의 말단부와 상기 단색광 조사 기기(1)로 부터 조사되는 단색광을 처음으로 통과시키는 볼록렌즈(L1) 간의 거리(D1)를 조절하는 장치 등이다.
도 2를 통해 상기 등록 라만 현미경의 일례를 보다 상세하게 살펴보면,
레이져광 조사 기기(1)에서 나온 레이져광은 첫번째 볼록렌즈 L1을 통과하면서 집광되거나 평행광이 된다.
한편 가시광선 조사 기기(2)에서 나온 가시광선은 첫번째 볼록렌즈 L2를통과하면서 집광되거나 평행광이 된다.
조사광의 종류는 이동거울(3)에 의해 상기 레이져광과 가시광선 중에서 필요에 따라 하나를 선택할 수 있다.
시료 상태를 시각적으로 확인하고자 할 때는 가시광선을 선택하고 라만 분광기로 스펙트럼을 얻고자 할 때에는 레이져광을 선택하며 이때 이동거울(3)은 뉘어져서 레이져 광로에서 치워지며 이 위를 통과한 단색광은 볼록렌즈 L3로 집광되면서 광분할기(4)에서 절반은 투과되고 절반은 반사되어 F1에 촛점을 맺는다.
다음으로, 광분할기(4)에서 반사된 단색광은 대물렌즈(5)를 통과하여 초점 f2 위치에 형성한다. f2는 대물렌즈를 통과한 단색광의 촛점이다.
이때 촛점 f2의 위치는 대물렌즈(5)와 상기의 초점 F1 간의 거리에 의해 결정되는데 상기의 초점 F1은 단색광 조사 기기(1)와 단색광이 첫번째로 통과하는 볼록렌즈(L1) 간의 거리(D1)에 따라 결정되므로 결국 촛점 f2의 위치는 단색광 조사 기기(1)와 단색광이 첫번째로 통과하는 볼록렌즈(L1) 간의 거리(D1)를 조절하므로서 조절이 가능하다.
여기에서는 촛점 f2의 위치를 상기와 같이 조절하여 대물렌즈(5) 자체의 촛점(f1)과 다른 위치에 형성시켜주는 기구를 통칭하여 가변 이중초점 형성기구라고 한다.
상기 촛점 f2와 촛점 f1은 서로 다른 위치에 각각 별도로 형성되며 대물렌즈(5)와 촛점 f2와의 거리(D3)는 대물렌즈(5) 자체의 촛점(f1) 거리의 1/2 지점에서부터 무한대까지 변경이 가능하다.
다음으로, 촛점 f1 위치에 있는 시료(S)에 조사된 단색광으로부터 나온 라만 산란광은 대물렌즈(5)에 의해 집광되어 촛점 f3 위치에 시료의 확대된 실상(RI)이 맺어진다.
상기 실상(RI)에서 측정을 원하는 부분만을 남기고 나머지 부분을 영상선택기구(6)로 가려 원하는 부위에서 온 신호(단색광)만 라만 분광기(8)로 들어가 스펙트럼을 얻게 된다.
상기 등록 라만 현미경은 도 2와 같이 영상선택기구(6)와 가변 이중초점 형성기구를 동시에 포함하는 것이 양호한 신호비의 스펙트럼을 얻는데 보다 바람직하다.
가변 이중초점 형성기구로 대물렌즈(5) 자체의 초점 f1과 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 초점 f2가 서로 겹쳐지지 않도록 하여 이중초점을 형성하는 것은 아래 2가지 측면에서 매우 중요하다.
도 2와 같이 초점 f2가 초점 f1 보다 길면 시료의 크기보다 조사되는 단색광의 광폭(A)이 더 크게 된다.
이 경우에는 시료(S)가 조사되는 단색광에 의해 녹는 현상을 피하기 위해 조사되는 단색광의 출력을 낮출 필요가 없어진다.
이에 비해, 종래의 라만 현미경에서는 단색광의 안정적인 출력 유지를 위해 최대 출력의 약 60~90% 정도의 전류 값을 걸어 주어야 하며, 이 경우 집광되는 단색광이 너무 강해져 시료가 분해되거나 녹는 현상이 종종 발생되었다.
반대로, 시료가 녹는 현상을 피하기 위해 최대출력을 낮추면 단색광의 안정성이 떨어지는 문제로 스펙트럼의 잠음 대비 신호 비율(S/N비)가 나빠졌다.
결국, 종래의 라만 현미경은 단색광의 안정성도 유지하고 시료의 분해도 막을 수 있는 최대 출력 조건을 찾기 위해서는 많은 시행 착오를 거쳐야 했다.
그러나, 상기 등록 라만 현미경은 단색광의 최대 출력을 낮추는 대신에 f2 초점 거리(D3)를 바꾸어 단색광의 광폭(A)을 넓혀서 단색광의 밀도를 낮춤으로서 시료가 분해 또는 용융되는 현상을 방지하고 단색광의 출력도 안정된 상태로 유지할 수 있다.
또한, f2 초점의 거리(D3)가 길어질수록 단색광의 밀도는 떨어지지만, 시료(S)에 입사되는 단색광의 입사각이 클수록 좋은 라만 특성상 라만 산란효과는 더욱 좋아지게 된다.
한편, 종래의 라만 현미경은 시료에서 나오는 라만 산란광뿐만 아니라 시료 주변에서 나오는 라만 산란광도 라만 분광기로 들어가기 때문에 잡음 대비 신호 비율(S/N)이 저조한 문제가 있었다.
특히, f2 초점의 거리(D3)가 도 1과 같이 대물렌즈 자체의 초점(f1) 길이보다 길어지는 경우에는 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 광폭(A)이 시료크기보다 커져 시료에서 반사되는 라만 산란광보다 주변에서 나오는 라만 산란광이 더 커져서 시료만의 양호한 스펙트럼을 얻기 어려운 문제가 더 심각해 질 수 있다.
여기서는 이와 같은 문제점을 해결하기 위해서 단색광에 의해 생긴 시료의 실상(RI) 중에서 원하는 부분만을 남겨놓고 나머지 부분은 상기의 영상선택기구(6)로 가려서 시료 주변에서 반사되는 라만 산란광을 제거하여 시료 중 목적 부위만의 라만 산란광 신호를 얻을 수 있다.
도 2에 도시된 상기 등록 라만 현미경은 상기와 같이 영상선택기구(6)로 원하는 시료만의 라만 산란광 신호를 얻고, 가변 이중 초점 형성 기구로 최적의 라만 산란 신호를 얻어 극미세 시료의 스펙트럼을 얻을 수 있다.
본 발명은 이와 같은 장점들을 갖는 상기 등록 라만 현미경의 영상선택기구(6)를 도 1과 같이 구멍 크기 조절이 가능하고 가로축(x축), 세로축(y축) 및 깊이축(z축)으로 움직일 수 있는 3차원 스캐너(X)에 설치한다. 즉, 영상선택기구(6)를 광로 상에 고정되지 않고 광로 상에 설치된 3차원 스캐너에 장착한다. 이를 통해 라만을 측정하는 단위 면적의 조정은 물론 측정 위치도 3차원적으로 선택 가능하여 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현할 수 있다.
본 발명은 도 1에는 비록 도시되지 않았으나, 도 2에 도시된 시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9)를 포함한다. 다시 말해 본 발명은 앞에서 설명한 상기 등록 라만 현미경의 모든 구성요소들을 포함하면서 상기 3차원 스캐너(X)를 추가로 더 포함하는 것이다.
본 발명은 시료 및 대물렌즈는 고정된 상태에서 이미지 선택을 위한 영상선택기구(6)를 움직여 확대된 실상에서 측정 부분을 선택하므로 종래 방법들에 비해 훨씬 공간 분해능이 크고 정밀한 3차원 라만 영상(3-DRI)을 구현할 수 있다.
본 발명의 라만 현미경은 도 1에 도시된 바와 같이 이중 초점이라는 큰 특징을 갖는다. 볼록렌즈 L3, L5에 의해 시료상에 맺어진 레이저 조사광은 시료의 초점보다 길어서 조사면적이 넓다. 레이저가 조사되는 시료 부분에서는 레이저광 집속도가 높아서 밀도만 충분하면 기본적으로 라만 산란 신호광이 잘 나온다. 즉, 시료(S)에서 나온 라만 산란 신호광은 시료의 실상(RI)위치에 3차원의 실상 이미지를 맺는다. 시료(S)의 여러 위치에서 나온 라만 신호광은 각각 r1, r2, r3, r4 ... rn과 같은 위치에 상응하는 3차원 실상을 맺게 되는데 3차원 스캐너(X)에 장착된 영상선택기구(6)가 특정 위치에 자리하면 그 위치의 실상만이 통과되어 그 라만 신호만이 감지된다. 영상선택기구(6)가 3차원 스캐너(X)에 의해 x,y 평면을 순차적으로 이동하면 2차원 평면의 데이터 배열이 얻어진다. 그런 후 3차원 스캐너가 z축으로 1단계 내려가서 다시 평면을 스캔을 하면 2번째 평면의 데이터 배열이 만들어 지는데 이를 원하는 단계만큼 반복하여 이를 적층하면 시료 전체의 3차원 데이터 배열을 얻게 된다. 이때 그 실상들의 크기는 대물렌즈(5)의 배율만큼 확대되므로 영상선택기구(6) 보다 정확하고 세밀하게 선택하는 것이 가능하다.
이와 같이 영상선택기구(6)의 3차원적 위치 변경으로 시료(S)의 3차원적 라만 스펙트럼 분포 데이터 배열을 얻을 수 있고 이는 각 성분, 특성의 분포를 알게 되어 특성 피크의 세기 차이를 색상화, 농담화 하면 3차원 라만 영상(3-DRI)을 얻을 수 있게 된다.
이때 영상선택기구(6)의 크기를 작게 하고 많이 측정하면 보다 분해능을 높일 수 있으나 이렇게 하면 측정점 수가 늘어나 측정 시간이 길어지게 된다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 살펴본다.
그러나, 본 발명은 하기 실시 예에만 한정된 것은 아니다.
실시예 1
도 1과 같은 본 발명의 라만 현미경으로 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 사출판의 표면을 측정하였다. 그 결과 도 6과 같은 라만 스펙트럼을 얻었으며 영상 선택기구(6)를 3차원 스캐너(X)에 장착하여도 S/N비가 우수한 스펙트럼을 얻을 수 있었다.
실시예 2
도 1과 같은 본 발명의 라만 현미경으로 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 사출판 시료의 가로 10㎛ x 세로 10㎛ x 깊이 10㎛ 용적을 배율 100배인 대물렌즈(5)를 사용하여 표면에서부터 측정하였는데 이를 가로 0.1㎜ x 세로 0.1㎜ 크기인 사각형의 영상선택기구(6)를 3차원 스캐너(X)에 설치하여 100배로 확대된 실상을 x축으로 10단계, y축으로 10단계, z축으로 4단계로 하여 x, y 축은 0.1㎜ 간격, z축은 0.25㎜ 간격으로 전체 400개의 측정점을 측정하였다. 그렇게 얻은 스펙트럼 데이터 배열로부터 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)의 결정화 관련 피크인 848cm-1 피크 세기를 기준으로 라만 영상화를 하였다. 결정질이 클수록 파랑→적색으로 되도록 설정한 결과 도 5와 같이 해당 영역의 PET의 특성 변화를 보여주는 3차원 라만 영상(3-DRI) 그림을 얻었으며 이는 사출판의 표면과 내부의 결정화도가 다름을 영상과 색상 변화로 보여 준다.
1 : 단색광 조사 기기 2 : 가시광 조사 기기
3, 7 : 이동거울 4 : 광분해기(Beam splitter)
5 : 대물렌즈 6 : 영상선택기구
8 : 라만 분광기 9 : 시료상태를 시각적으로 확인하는 장치
L1 ~ L5 : 볼록렌즈
F1 : 광분광기(4)에서 반사된 단색광의 촛점
f1 : 대물렌즈(5)의 측정 초점 f2 : 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 초점
f3 : 시료의 실상 초점 f4 ; 관찰 가시광의 실상 초점
S : 시료 X : 3차원 스캐너
Y : 대물렌즈 스캐너
o1~o3 : 대물렌즈의 다른 측정 위치
s11~s13 : o1~o3에 대응하는 시료(S) 내부의 측정점
RL1~RL3 : sl1~sl3에 대응하는 시료의 실상
RI : 시료의 실상(Image)
r1~r3 : 시료(S) 내부의 여러 측정점에 대응하는 시료의 실상
D1 : 단색광 조사 기기(1)와 볼록렌즈(L1) 간의 거리
D2 : 단색광 조사 기기(1')와 볼록렌즈(L2) 간의 거리
D3 : 대물렌즈(5)와 f2 촛점 간의 거리
CL : 집광렌즈

Claims (4)

  1. 단색광을 광원으로 사용하여 대물렌즈(5)로 시료의 실상(RI)을 얻은 후 이를 라만 분광기(8) 및 시료 상태를 시각적으로 확인하는 장치(9) 중에서 선택된 하나의 기기로 보내주며, 대물렌즈(5)로 얻어진 시료의 실상(RI) 중 원하는 부분만 선택적으로 통과시켜주는 영상선택기구(6)와 상기 대물렌즈(5)를 통과한 단색광의 촛점(f2)과 대물렌즈(5) 간의 거리(D3)를 조절하여 단색광의 초점(f2)을 대물렌즈(5) 자체의 촛점(f1)과 다른 위치에 형성시키는 가변 이중초점 형성기구를 포함하는 라만 현미경에 있어서,
    상기 영상선택기구(6)는 구멍크기 조절이 가능하고 가로축(x축), 세로축(y축) 및 깊이축(z축)으로 움직일 수 있는 3차원 스캐너(X)에 설치되어 있는 것을 특징으로 하는 3차원 라만 영상을 구현하는 라만 현미경.
  2. 제1항에 있어서, 상기 영상선택기구(6)는 시료(S)중 선택하는 특정영역의 크기를 임의로 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 3차원 라만 영상을 구현하는 라만 현미경.
  3. 제2항에 있어서, 시료(S)중 선택하는 특정영역의 모양이 원 및 다각형중에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 3차원 라만 영상을 구현하는 라만 현미경.
  4. 제1항에 있어서, 단색광의 파장범위는 자외선에서 근적외선까지인 것을 특징으로 하는 3차원 라만 영상을 구현하는 라만 현미경.
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