KR20230144129A - 신규한 스테로이드 페이로드, 스테로이드 링커, adc및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 글루코코티코스테로이드, 글루코코티코스테로이드-링커 및 면역 세포 상에서 발현되는 항원, 선택적으로 인간 면역 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 제공한다. 일부 예에서, ADC는 짧은 혈청 반감기(인간 VISTA 넉-인 설치류에서 약 24 내지 72 또는 24 내지 48 또는 12 내지 24시간 또는 그 미만)(인간 또는 비-인간 영장류에서 또는 약 1 내지 3.5일 또는 그 미만)를 갖는 생리 pH에서 VISTA 발현 세포에 결합하는 항-인간 VISTA(T 세포 활성화의 V-영역 면역글로불린-함유 억제인자(1): V-region Immunoglobulin-containing Suppressor of T cell Activation(1)) 항체 또는 항-VISTA 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 일부 예에서, 이러한 ADC는 신속하게 작용을 개시하고 연장된 기간 동안 강력한데, 그 이유는 이들이 다량으로 면역 세포에 의해서 매우 효과적으로 내재화되고 여기서 이들이 절단되어 다량의 활성 스테로이드 페이로드를 방출하기 때문이다. 본 발명은 또한 자가면역, 알레르기 및 염증 병태의 치료를 위한 이러한 ADC 및 신규한 스테로이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 ADC를 사용하여 면역 세포, 예컨대, 단핵구, 호중구, B 세포, T 세포, Treg, 호산구, NK 세포, 대식세포, 골수 세포 등 및 특히 골수 세포를 표적으로 하는 항-염증제를 선택적으로 전달하여 비표적 세포에 대한 잠재적인 독성을 감소시킴으로써 유해 부작용을 감소시키는 방법 및/또는 글루코코티코이드 수용체 효능제의 효능을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 스테로이드 페이로드, 스테로이드 링커, ADC 및 이의 용도
본 발명은 신규한 글루코코티코스테로이드, 글루코코티코스테로이드-링커 및 면역 세포 상에서 발현되는 항원, 전형적으로 인간 면역 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate: ADC)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서 ADC는 항-인간 VISTA( T 세포 활성화의 V -영역 면역글로불린-함유 억제인자(1): V -region I mmunoglobulin-containing S uppressor of T cell A ctivation(1)) 항체 또는 항-VISTA 항원-결합 항체 단편, 예를 들어, 짧은 혈청 반감기(인간 VISTA 넉-인 설치류에서 약 24 내지 27시간 이하)를 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 ADC는 신속하게 작용을 개시하고 연장된 기간 동안 효력이 있는데, 그 이유는 이들이 다량으로 면역 세포에 의해서 매우 효과적으로 내재화되고 여기서 이들이 절단되어 다량의 활성 스테로이드 페이로드를 방출하기 때문이다. 본 발명은 또한 자가면역, 알레르기, 염증 및 암 병태, 및 특히 급성 및 만성 자가면역, 알레르기 및 염증 병태의 치료를 위한 상기 ADC 및 신규한 스테로이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 ADC를 사용하여 면역 세포, 전형적으로 인간 면역 세포, 선택적으로 단핵구, 호중구, T 세포, Treg, 호산구, B 세포, NK 세포 등 중 임의의 것 및 특히 골수 세포, 또는 치료되는 자가면역, 알레르기, 염증 또는 암 병태의 병인학에 관련된 다른 면역 세포를 표적으로 하는 항-염증제를 선택적으로 전달하여 비표적 세포에 대한 잠재적인 독성을 감소시킴으로써 유해 부작용을 감소시키는 방법 및/또는 글루코코티코이드를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
VISTA는 NCR 리간드이고, 이의 가장 가까운 계통발생학적 관련자는 PD-L1이다. VISTA는 PD-L1과 상동성을 보유하지만 조혈 구획에 제한되는 고유한 발현 패턴을 나타낸다. 구체적으로, VISTA는 CD11b high 골수 세포에서 구성적으로 높게 발현되며 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서는 더 낮은 수준으로 발현된다. PD-L1과 마찬가지로, VISTA는 면역을 근본적으로 억제하는 리간드이며 PD-L1과 마찬가지로 VISTA를 차단하면 전임상 종양학 모델에서 암에 대한 치료 면역을 개발할 수 있다. VISTA를 차단하면 면역, 특히 CD8+ 및 CD4+ 매개 T 세포 면역이 향상되는 반면, VISTA의 세포외 도메인의 가용성 Ig 융합 단백질(VISTA-Ig)로 치료하면 면역이 억제되고 자가면역 질환의 다수의 뮤린 모델의 진행을 정지시키는 것으로 나타났다. 상기에 기초하여, 길항제 항-VISTA 항체를 사용하여 T 세포 면역을 촉진하고, 암 및 감염과 같이 이것이 유익한 병태를 치료하는 것이 보고되어 있다. 반대로 T 세포 면역을 저해하고 이것이 치료적으로 유익한 병태, 예컨대, 자가면역, 알레르기 및 염증 병태를 치료하기 위한 효능제 항-VISTA 항체의 사용이 보고되어 있다. 불행하게도, 인간 임상 시험에 사용된 일부를 포함하여 일부 항-VISTA 항체는 매우 짧은 혈청 반감기를 가지며, 이는 암 또는 자가면역과 같은 만성 질환을 치료하는 맥락에서 일반적으로 바람직하지 않은데, 그 이유는 이것이 환자에게 불편할 뿐만 아니라 고비용인 매우 빈번한 투여를 필요로 하기 때문이다. 추가로, 항-VISTA 항체 및 VISTA 융합 단백질을 잠재적으로 사용하여 화학치료제와 같은 페이로드를 암 세포 또는 종양 부위에 전달하는 것이 제안되어 있다.
합성 글루코코티코이드 수용체 효능제(예를 들어, 덱사메타손, 프레드니솔론, 부데소나이드, 베클로메타손, 베타메타손, 코티솔, 코티손 아세테이트, 16-알파 하이드록시프레드니솔론, 덱사메타손, 다이플루오라손, 플루메타손, 플루니솔리드, 플루시놀론 아세토나이드, 플루티카손 프로피오네이트, 시클레소나이드, 메틸프레드니솔, 프레드니손, 프레드니솔론, 모메타손, 트라이암시놀론 아세토나이드 등)은 염증 및 이와 연관된 장애의 치료에 사용되는 효력이 있는 소분자 부류이다. 이들 화합물은 상이한 병태, 예컨대, 자가면역, 알레르기 및 염증 장애, 암 및 감염 질환과 연관된 염증을 저해하는 데 있어서 매우 효능이 있지만, 염증, 알레르기 및 자가면역 질환의 만성 치료에서의 이의 유용성은 심각한 부작용으로 인해 제한적이다.
상기에 기초하여, 합성 글루코코티코이드의 항-염증 효능을 유지하면서 원하지 않는 독성을 최소화하기 위한 여러 접근법이 연구되어 왔고 기재되어 있다(Rosen, J and Miner, J N Endocrine Reviews 26: 452-64 (2005)). 특히, 이러한 화합물이 CD40, CD163, CD74, PRLR 및 TNF를 비롯한 면역 세포에 의해서 발현되는 항원을 표적으로 하는 항체에 접합된 항체 약물 접합체(ADC)가 개발되어 있다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 이러한 병태의 치료를 위한 기존의 치료제에 비해서 향상된 효능, 연장된 효능 및/또는 감소된 부작용을 갖는, 개선된 항-염증, 자가면역 및 알레르기 요법 및 개선된 항-염증, 자가면역 및 알레르기 치료제의 개발이 자가면역, 알레르기 및 염증 질환 분야에 여전히 필요하다.
본 발명의 목적은 신규한 스테로이드, 스테로이드-링커, 및 면역 세포, 전형적으로 인간 면역 세포에 의해서 발현되는 항원을 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편, 일부 실시형태에서 VISTA를 포함하는 ADC를 제공함으로써 염증 및 이와 연관된 장애를 치료 또는 예방하기 위한 치료제를 제공하는 것이고, 항체 또는 항체 단편은 생리 pH에서 VISTA 발현 세포에 결합하는 항-인간 VISTA 항체 또는 항-인간 VISTA 항체 단편이다.
본 발명의 구체적인 목적은 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 1 내지 72시간, 1 내지 32시간, 1 내지 16시간, 1 내지 8시간, 1 내지 4시간 또는 1 내지 2시간 또는 시노몰거스 마카크에서 약 3 내지 4일 또는 그 미만의 본 명세서에 정의된, 생리 조건(약 pH 7.5)에서 매우 짧은 혈청 반감기를 보유하는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는 신규한 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하는 것이고, 항-VISTA 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에 개시된 글루코코티코이드 수용체 효능제 또는 글루코코티코이드 수용체 효능제-링커에 접합된다.
하기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ADC는 내부의 스테로이드 링커 페이로드의 신규한 특성으로 인해서 항-염증제, 특히 스테로이드의 면역 세포 내로의 표적화 및 내재화의 유도에 대해서 이전 ADC보다 고유한 이점 조합을 보유하며, 이것은 신속한 내재화 및 면역 세포에 의해서 내재화될 때 다량의 활성 페이로드의 방출을 제공한다.
또한, 본 발명의 ADC는 높은 약물 항체 비율(drug antibody ratio: DAR)을 제공하는데, 그 이유는 이들이 글루코코티코스테로이드를 포함하는 이전 ADC에 비해서 응집 경향이 더 낮기 때문이다.
또한, 본 발명의 ADC는 더 낮은 DAR에서도 높은 효력을 제공하는데, 그 이유는 본 발명의 ADC가 글루코코티코스테로이드를 포함하는 이전 ADC에 비해서 표적 면역 세포 내로 보다 효과적으로 내재화되고 표적 면역 세포 내에서 더 많은 활성 글루코코티코스테로이드 페이로드를 방출하기 때문이다.
또한, 일부 실시형태에서 본 발명의 ADC는 본 명세서에 개시된 스테로이드 링커 페이로드 및 항-VISTA 항체 또는 항체 단편, 특히 생리 pH에서 VISTA 발현 면역 세포에 결합하는 것의 조합된 이익을 보유하고, 이것은 매우 짧은 pK를 보유한다. 특히, 이들 ADC는 예를 들어, 매우 높은 밀도로 VISTA를 발현하는 면역 세포에 결합하고, 이의 매우 짧은 PK에도 불구하고 연장된 기간(즉, 이의 pK보다 훨씬 더 긴 PD를 보유함) 동안 효능이 있고(항-염증 활성을 발휘함), 따라서 만성 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하는 데 매우 적합하고, 연장되고 반복된 투여가 치료적으로 보증된다.
또한, 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는 본 발명의 ADC는 활성화된 및 비활성화된 T 세포, Treg, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 호중구, 골수, 단핵구, 대식세포, 호산구, 수지상 세포, NK 세포 및 내피 세포를 비롯한 넓은 범위의 면역 세포를 표적으로 하고; 따라서 이러한 ADC는 이들 유형의 면역 세포 중 임의의 것 또는 모두와 연관된 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 대안적으로, 본 발명의 ADC는 다른 면역 세포 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편, 바람직하게는 표적 면역 세포에 효과적으로 내재화하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 ADC는 신속하게 효능이 개시되며, 따라서 급성 치료를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. VISTA 항체 함유 ADC의 경우에, 이들 ADC는 B 세포에 결합하지 않기 때문에 유리 스테로이드만큼 면역억제성이 아닐 것이다.
또한, VISTA 항체 함유 ADC의 경우에 본 발명의 ADC는 스테로이드 효능에 책임이 있는 중요한 면역 세포인 Treg에 작용하고, 휴지 및 예컨대, 골수 세포, 단핵구, 호산구, Treg, CD8 T 세포, CD4 T 세포, 면역 세포 둘 다에 작용하고, 결과적으로 염증 및 자가면역 병태의 활성 및 관해 단계 둘 다에서 활성이다(항-염증 활성을 발휘한다).
또한, VISTA 항체 함유 ADC의 경우에 본 발명의 ADC는 급성 염증에 중요한 면역 세포인 호중구에 작용한다.
또한, VISTA 항체 함유 ADC의 경우에 본 발명의 ADC는 면역 세포에 매우 신속하고 구성적으로 면역 세포에 내재화하는데, 그 이유는 VISTA 세포 표면 턴오버가 높기 때문이다.
추가로, VISTA 항체 함유 ADC의 경우에 본 발명의 ADC는 매우 짧은 반감기(PK)를 보유하고 면역 세포를 선택적으로 표적화하기 때문에, 본 발명의 ADC는 비표적 세포 관련 독성 및 바람직하지 않은 말초 스테로이드 노출(낮은 비-특이적 손실 효과)이 적을 것이다.
또한, 본 발명에 따른 일부 VISTA 항체 함유 ADC의 경우에 본 발명의 ADC의 생물학적 활성(항-염증 작용)은 항-염증 페이로드(스테로이드)에 전적으로 기인하는데, 그 이유는 항-VISTA 항체가 면역학적 기능을 발휘하지 않는(어떠한 VISTA 생물학도 차단하지 않음) 내부의 침묵 IgG를 보유하는 것이기 때문이다.
본 발명의 구체적인 목적은 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 신규한 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다:
화학식 (I)
상기 식에서, X는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반(cubane)으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되고;
Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되며;
Y는 CHR1, O, S 및 NR1로부터 선택되고;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아니며;
X에 대한 G의 연결부는 선택적으로 C1-3 알킬 및 에틸렌 옥사이드로부터 선택될 수 있고, 이들 각각은 N, S 및 O으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬로 추가로 치환되고;
Z에 대한 X의 연결부는 X 및 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있고;
치환체 NR1R2는 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있으며;
R1은 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택되되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
R1이 H인 경우, R2는 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택될 수 있되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
R1이 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬 또는 헤테로아릴인 경우, R2는 하기로부터 선택된 작용기일 수 있고:
[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J,
(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-V-J,
(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J, 및
[V]k-(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-J,
상기 식에서, m = 1-6이고, k = 0-1이며, W의 각각의 순열은 독립적으로 H, R3에서 종결되는 분지형 알킬 쇄인 [(CH2)nR3](식에서, n = 1-4임) 및 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기로부터 선택될 수 있고;
R3은 H, 메틸, 에틸, 아이소프로필, OH, O-알킬, NH2, NH-알킬, N-다이알킬, SH, S-알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴 치환체는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택될 수 있고;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,
로부터 선택된 반응성 기이며;
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이며;
R5는 -CH2OH, -CH2SH, -CH2Cl, -SCH2Cl, -SCH2F, -SCH2CF3, 하이드록시, -OCH2CN, -OCH2Cl, -OCH2F, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH2CN, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 수소 및 C1-10 알킬로부터 독립적으로 선택되며;
Q는 H, , C(O)R8(식 중, R8은 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬임) 또는 (C=O)NR4CHnNR4(C=O)OCH2-(V)n-J(식 중, n=1-4이고 R4 =H, 알킬 또는 분지형 알킬임) 또는 P(O)OR4일 수 있고;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되고;
달리 명시되지 않는 한, 모든 가능한 입체이성질체가 청구된다.
본 발명의 구체적인 목적은 상기에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이며, 여기서 X 및 Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, [1.1.1]바이사이클로펜탄 및 바이사이클로 [2.2.2]옥탄으로부터 독립적으로 선택되고; Y는 CH2 및 O로부터 선택되며; W의 순열은 CH2CH2CO2H 및 H로부터 독립적으로 선택되고, 추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아니다.
본 발명의 구체적인 목적은 실시예 3에 개시된 글루코코티코이드 효능제 화합물 중 임의의 것으로부터 선택되거나 INX J 및 INX L을 제외한 도 11에 제시된 것으로부터 선택된, 상기에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 INX J 및 INX L을 제외한 본 명세서에 개시된 INX-스테로이드 페이로드, INX-스테로이드 링커 및 INX-항체 약물 접합체(ADC) 화합물로부터 선택된, 상기에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 하기로부터 선택된, 상기에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다:
본 발명의 구체적인 목적은 적어도 하나의 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 펩타이드 및/또는 비-펩타이드 링커(즉, "스테로이드-링커 페이로드")에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 상기에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다. 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 페이로드.
본 발명의 구체적인 목적은 적어도 하나의 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 링커("L"), 선택적으로 화합물에서 링커를 항체 또는 항체 단편에 연결하는 데 선택적으로 사용되는 화학 모이어티인 "헤테로이작용기" 또는 "헤테로삼작용기"인 "Q" 및 적어도 1종의 항-염증제("AI")를 포함하는 화합물(스테로이드-링커 페이로드)을 제공하는 것이며, AI는 하기 구조로 표현될 수 있는 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물이다:
Q-L-AI 또는 AI-L-Q.
본 발명의 구체적인 목적은 상기에 따른 스테로이드-링커 페이로드를 제공하는 것이며, 링커는 본 명세서에 개시된 것으로부터 선택된다.
본 발명의 구체적인 목적은 PAB로부터 선택된 적어도 하나의 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 링커 및/또는 아미노산 또는 펩타이드, 선택적으로 1 내지 12개의 아미노산, 추가로 선택적으로 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 쿼트라펩타이드, 펜타펩타이드 및 추가로 선택적으로 Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, Phe, Cit, Val, Val-Cit, Val-Ala, Val-Gly, Val-Gln, Ala-Val, Cit-Cit, Lys-Val-Cit, Asp-Val-Ala, Ala-Ala-Asn, Asp-Val-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Asn-Val, 베타Ala-Leu-Ala-Leu, Lys-Val-Ala, Val-Leu-Lys, Asp-Val-Cit, Val-Ala-Val 및 Ala-Ala-Asn; 또는 선택적으로 GlcA, PAB 및 Glu-Gly 중 적어도 하나를 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 스테로이드-링커 페이로드를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 글루코코티코이드 효능제 스테로이드 화합물에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 적어도 하나의 절단 가능한 링커, 및/또는 희생 링커(immolative linker)를 포함하는, 상기에 따른 스테로이드-링커 페이로드를 제공하는 것이다.
본 발명의 보다 구체적인 목적은 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 스테로이드 화합물 또는 스테로이드-링커 페이로드 또는 이를 함유하는 ADC를 제공하는 것이며, 이것은 실시예, 예를 들어, 실시예 3에 개시된 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 페이로드 화합물 중 임의의 것 및 INX J 및 INX L을 제외한 도 118A 내지 도 118O에 언급된 화합물로부터 선택된다.
본 발명의 구체적인 목적은 하기로부터 선택되는 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체를 제공하는 것이다:
(i) INX-SM-3-GluGly-알콕시아민, INX-SM-4-GluGly-알콕시아민, INX-SM-53-GluGly-알콕시아민, INX-SM-54-GluGly-알콕시아민, INX-SM-56-GluGly-알콕시아민, INX-SM-98-GluGly-알콕시아민, INX-SM-6-GluGly-알콕시아민, INX-SM-2-GluGly-알콕시아민, INX-SM-57-GluGly-알콕시아민, INX-SM-31-GluGly-알콕시아민, INX-SM-32-GluGly-알콕시아민, INX-SM-10-GluGly-알콕시아민, INX-SM-40-GluGly-알콕시아민, INX-SM-34-GluGly-알콕시아민, INX-SM-28-GluGly-알콕시아민, INX-SM-27-GluGly-알콕시아민, INX-SM-35-GluGly-알콕시아민, INX-SM-8-GluGly-알콕시아민, INX-SM-7-GluGly-알콕시아민, INX-SM-33-GluGly-알콕시아민 또는 Glu-Gly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(ii) INX-SM-53-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-3-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-54-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-1-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-4-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-2-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-47-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-7-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-8-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-56-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-32-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-6-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-10-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-33-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-31-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-35-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-9-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-28-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-27-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-34-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-35-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-40-GluGly-브로모아세틸 또는 Glu-Gly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(iii) INX-SM-53-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-1-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-4-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-54-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-7-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-8-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-2-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-57-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-40-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-34-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-28-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-27-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-35-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-9-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-10-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-31-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-32-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-33-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-56-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-6-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-3-GluGly-다이벤조사이클로옥틴 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(iv) INX-SM-1-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-31-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-32-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-33-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-53-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-7-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-8-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-2-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-56-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-6-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-54-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-4-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-53-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-3-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-9-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-40-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-34-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-28-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-34-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-28-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-27-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-35-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-10-GluGly-NHS 에스터 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체;
(v) INX-SM-1-GluGly-말레이미드, INX-SM-3-GluGly-말레이미드, INX-SM-4-GluGly-말레이미드, INX-SM-8-GluGly-말레이미드, INX-SM-2-GluGly-말레이미드, INX-SM-7-GluGly-말레이미드, INX-SM-56-GluGly-말레이미드, INX-SM-6-GluGly-말레이미드, INX-SM-54-GluGly-말레이미드, INX-SM-53-GluGly-말레이미드, INX-SM-33-GluGly-말레이미드, INX-SM-35-GluGly-말레이미드, INX-SM-40-GluGly-말레이미드, INX-SM-34-GluGly-말레이미드, INX-SM-28-GluGly-말레이미드, INX-SM-27-GluGly-말레이미드, INX-SM-35-GluGly-말레이미드, INX-SM-9-GluGly-말레이미드, INX-SM-10-GluGly-말레이미드, INX-SM-31-GluGly-말레이미드, INX-SM-32-GluGly-말레이미드, INX-SM-57-GluGly-말레이미드 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(vi) INX-SM-3-GluGly-테트라진, INX-SM-53-GluGly-테트라진, INX-SM-1-GluGly-테트라진, INX-SM-54-GluGly-테트라진, INX-SM-6-GluGly-테트라진, INX-SM-56-GluGly-테트라진, INX-SM-4-GluGly-테트라진, INX-SM-10-GluGly-테트라진, INX-SM-31-GluGly-테트라진, INX-SM-32-GluGly-테트라진, INX-SM-33-GluGly-테트라진, INX-SM-7-GluGly-테트라진, INX-SM-8-GluGly-테트라진, INX-SM-9-GluGly-테트라진, INX-SM-27-GluGly-테트라진, INX-SM-35-GluGly-테트라진, INX-SM-2-GluGly-테트라진, INX-SM-40-GluGly-테트라진, INX-SM-34-GluGly-테트라진, INX-SM-28-GluGly-테트라진, INX-SM-27-GluGly-테트라진 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(vii) INX-SM-6-GluGly-아민, INX-SM-54-GluGly-아민, INX-SM-4-GluGly-아민, INX-SM-53-GluGly-아민, INX-SM-2-GluGly-아민, INX-SM-56-GluGly-아민, INX-SM-57-GluGly-아민, INX-SM-35-GluGly-아민, INX-SM-27-GluGly-아민, INX-SM-40-GluGly-아민, INX-SM-34-GluGly-아민, INX-SM-28-GluGly-아민, INX-SM-35-GluGly-아민, INX-SM-9-GluGly-아민, INX-SM-10-GluGly-아민, INX-SM-31-GluGly-아민, INX-SM-32-GluGly-아민, INX-SM-33-GluGly-아민, INX-SM-7-GluGly-아민, INX-SM-8-GluGly-아민, INX-SM-1-GluGly-아민, INX-SM-3-GluGly-아민 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(viii) INX-SM-53-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-1-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-3-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-2-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-56-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-35-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-25-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-27-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-35-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-9-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-10-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-31-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-32-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-33-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-57-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-7-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-8-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-6-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-54-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-4-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-40-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-34-PAB-GluGly-알콕시아민 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(ix) INX-SM-1-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-3-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-2-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-7-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-8-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-40-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-56-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-6-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-154PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-4-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-33-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX- PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-32-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-10-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-34-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-31-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-9-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-28-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-27-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-35-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-53-PAB-GluGly-브로모아세틸 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(x) INX-SM-6-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-54-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴,
INX-SM-4-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-53-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-1-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-7-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-8-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-2-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-56-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-57-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-33-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-32-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-31-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-3-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-9-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-27-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-35-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-34-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-28-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-40-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-10-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xi) INX-SM-56-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-54-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-4-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-53-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-1-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-3-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-33-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-57-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-7-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-8-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-27-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-35-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-9-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-10-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-31-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-32-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-40-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-34-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-28-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-2-PAB-GluGly-NHS 에스터 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xii) INX-SM-1-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-53-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-5-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-2-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-8-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-56-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-54-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-4-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-57-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-7-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-32-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-31-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-53-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-3-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-34-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-28-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-40-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-27-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-35-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-9-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-10-PAB-GluGly-말레이미드 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xiii) INX-SM-6-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-54-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-4-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-53-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-1-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-3-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-57-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-7-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-8-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-2-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-31-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-32-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-33-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-56-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-35-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-9-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-40-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-34-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-28-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-27-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-35-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-10-PAB-GluGly-테트라진 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xiv) INX-SM-1-PAB-GluGly-아민, INX-SM-3-PAB-GluGly-아민, INX-SM-8-PAB-GluGly-아민, INX-SM-2-PAB-GluGly-아민, INX-SM-56-PAB-GluGly-아민, INX-SM-6-PAB-GluGly-아민, INX-SM-54-PAB-GluGly-아민, INX-SM-4-PAB-GluGly-아민, INX-SM-53-PAB-GluGly-아민, INX-SM-33-PAB-GluGly-아민, INX-SM-53-PAB-GluGly-아민, INX-SM-7-PAB-GluGly-아민, INX-SM-9-PAB-GluGly-아민, INX-SM-35-PAB-GluGly-아민, INX-SM-40-PAB-GluGly-아민, INX-SM-34-PAB-GluGly-아민, INX-SM-28-PAB-GluGly-아민, INX-SM-27-PAB-GluGly-아민, INX-SM-35-PAB-GluGly-아민, INX-SM-10-PAB-GluGly-아민, INX-SM-31-PAB-GluGly-아민, INX-SM-32-PAB-GluGly-아민 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xv) INX-SM-1-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-35-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-9-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-10-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-54-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-31-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-32-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-33-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-57-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-7-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-8-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-2-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-56-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-6-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-4-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-53-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-27-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-40-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-34-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-28-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-3-PAB-GlcA-알콕시아민 또는 GlcA 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xvi) INX-SM-3-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-4-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-56-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-54-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-4-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-53-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-7-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-8-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-2-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-40-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-57-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-33-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-10-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-34-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-31-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-32-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-35-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-9-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-28-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-27-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-1-PAB-GlcA-브로모아세틸 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xvii) INX-SM-4-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-54-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-1-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-54-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-33-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-57-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-7-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-8-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-2-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-5-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-6-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-35-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-9-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-10-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-31-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-32-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-27-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-35-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-28-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-34-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-40-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-3-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴 또는 GlcA 및/또는 PAB 링커가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xviii) INX-SM-3-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-53-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-4-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-56-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-54-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-8-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-2-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-7-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-57-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-32-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-33-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-31-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-9-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-10-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-35-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-27-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-28-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-40-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-34-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-1-PAB-GlcA-NHS 에스터 또는 GlcA 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xix) INX-SM-3-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-4-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-53-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-31-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-32-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-33-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-53-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-7-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-8-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-2-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-56-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-6-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-54-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-1-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-9-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-35-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-27-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-28-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-34-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-40-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-10-PAB-GlcA-말레이미드 또는 GlcA 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xx) INX-SM-33-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-57-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-7-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-8-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-2-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-56-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-6-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-54-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-4-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-9-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-35-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-27-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-28-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-34-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-40-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-10-PAB-GlcA-테트라진 또는 GlcAy 및/또는 PAB 링커가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xxi) INX-SM-1-PAB-GlcA-아민, INX-SM-3-PAB-GlcA-아민, INX-SM-53-PAB-GlcA-아민, INX-SM-6-PAB-GlcA-아민, INX-SM-54-PAB-GlcA-아민, INX-SM-8-PAB-GlcA-아민, INX-SM-2-PAB-GlcA-아민, INX-SM-56-PAB-GlcA-아민, INX-SM-4-PAB-GlcA-아민, INX-SM-35-PAB-GlcA-아민, INX-SM-8-PAB-GlcA-아민, INX-SM-10-PAB-GlcA-아민, INX-SM-31-PAB-GlcA-아민, INX-SM-32-PAB-GlcA-아민, INX-SM-33-PAB-GlcA-아민, INX-SM-57-PAB-GlcA-아민, INX-SM-27-PAB-GlcA-아민, INX-SM-35-PAB-GlcA-아민, INX-SM-34-PAB-GlcA-아민, INX-SM-28-PAB-GlcA-아민, INX-SM-40-PAB-GlcA-아민, INX-SM-7-PAB-GlcA-아민 또는 GlcA 및/또는 PAB 링커가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
(xxii) 알콕시아민-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 알콕시아민-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C11-OH를 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드에 부착된 동일한 또는 상이한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드;
(xxiii) 브로모아세틸-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 브로모아세틸--GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C11-OH를 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드에 부착된 동일한 또는 상이한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드;
(xxiv) 다이벤조사이클로옥틴-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 다이벤조사이클로옥틴-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C11-OH를 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드에 부착된 동일한 또는 상이한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드;
(xxv) 테트라진-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 테트라진 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C11-OH를 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드에 부착된 동일한 또는 상이한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드;
(xxvi) 알콕시아민-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 알콕시아민 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 동일한 또는 상이한 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드;
(xxvii) 브로모아세틸-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 브로모아세틸-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 동일한 또는 상이한 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드;
(xxviii) 말레이미드-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 말레이미드-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 동일한 또는 상이한 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드;
(xxix) 다이벤조사이클로옥틴-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 다이벤조사이클로옥틴-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 동일한 또는 상이한 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드;
(xxx) 테트라진-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 테트라진 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 동일한 또는 상이한 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드; 및
(xxxi) 아민-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 아민 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 동일한 또는 상이한 링커를 포함하는 다른 링커 페이로드.
13. 하기로부터 선택된 항체 약물 접합체(ADC):
(i) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(알콕시아민 + 케톤 접합(C11-OH 연결됨)), 또는 INX-SM 페이로드가 알콕시아민 + 케톤 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(ii) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합(C11-OH 연결됨)), 또는 INX-SM 페이로드가 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(iii) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(할로아세틸 + 시스테인 접합(C11-OH 연결됨)), 또는 INX-SM 페이로드가 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(iv) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(말레이미드 + 시스테인 접합(C11-OH 연결됨)), 또는 INX-SM 페이로드가 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(v) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합(C11-OH 연결됨)), 또는 INX-SM 페이로드가 테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(vi) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(알콕시아민 + 케톤 접합(C11-OH 연결됨)), 또는 INX-SM 페이로드가 알콕시아민 + 케톤 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(vii) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합(C17 연결됨)), 또는 INX-SM 페이로드가 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C17 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(viii) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(할로아세틸 + 시스테인 접합(C17 연결됨)), 또는 INX-SM 페이로드가 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C17 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(ix) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합(C17 연결됨)), 또는 INX-SM 링커 페이로드가 테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합을 통해서 항체에 접합되고 C17 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(x) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(트랜스 글루타미나제를 사용한 아민 + 글루타민 접합(C17 연결됨)), 또는 INX-SM 링커 페이로드가 트랜스 글루타미나제를 사용한 아민 + 글루타민 접합을 통해서 항체에 접합되고 C17 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xi) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(알콕시아민 및 케톤 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 알콕시아민 및 케톤 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xii) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(할로아세틸 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 할로아세틸 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xiii) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xiv) INX-SM-3-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-Glu-Gly-Ab(N-하이드록시석신이미드 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 N-하이드록시석신이미드 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xv) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(아자이드 +다이벤조사이클로옥틴 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 아자이드 +다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xvi) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(N-하이드록시석신이미드 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 N-하이드록시석신이미드 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xvii) INX-SM-3-Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(말레이미드 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 말레이미드 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xviii) INX-SM-3- Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(트랜스-사이클로옥텐 + 테트라진 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 트랜스-사이클로옥텐 + 테트라진 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
(xix) INX-SM-3- Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(아민 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM 링커 페이로드가 트랜스-사이클로옥텐 + 테트라진 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC.
본 발명의 또 다른 구체적인 목적은 하기로부터 선택된 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하는 것이다:
(I)
[상기 식에서,
Ab = 항체, 바람직하게는 생리 pH에서 인간 면역 세포에 결합하는 항체, 바람직하게는 인간 VISTA 면역 세포에 결합하는 항-VISTA 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
NH페이로드 = 이며;
REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨];
(II)
[Ab = 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
NH페이로드 = 이며;
REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨];
(III) ;
[Ab = 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이거나 존재하지 않고;
NH페이로드 = 이며;
REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
RT= AA 또는 임];
(IV)
[Ab = 항체, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
O페이로드 = 또는 임];
(V)
[Ab = 항체, 전형적으로 면역 세포, 전형적으로 인간 면역 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 것, 예를 들어, VISTA이고;
L = 링커이고;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이거나 존재하지 않고;
O페이로드 = 또는 이고;
RT= AA 또는 임].
본 발명의 구체적인 목적은 링커가 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 펩타이드 또는 희생 링커를 포함하는 상기에 따른 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 PAB 및/또는 아미노산 또는 펩타이드, 선택적으로 1 내지 12개의 아미노산, 추가로 선택적으로 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 쿼트라펩타이드, 펜타펩타이드 및 추가로 선택적으로 Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, Phe, Cit, Val, Val-Cit, Val-Ala, Val-Gly, Val-Gln, Ala-Val, Cit-Cit, Lys-Val-Cit, Asp-Val-Ala, Ala-Ala-Asn, Asp-Val-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Asn-Val, 베타Ala-Leu-Ala-Leu, Lys-Val-Ala, Val-Leu-Lys, Asp-Val-Cit, Val-Ala-Val 및 Ala-Ala-Asn으로부터 선택되는 링커를 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 하기 구조로부터 선택된 스테로이드 항체 접합체 화합물을 제공하는 것이다:
및
상기 식에서, n = 2-12, 2-10, 2-8, 2-6, 2-4이고, A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예시적인 실시형태에서는 항-인간 VISTA 항체이다.
본 발명의 구체적인 목적은 화학식 (I)의 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다:
화학식 (I)
상기 식에서,
X는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되고;
Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되며;
Y는 CHR1, O, S 및 NR1로부터 선택되고;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아니며;
X에 대한 G의 연결부는 선택적으로 C1-3 알킬 및 에틸렌 옥사이드로부터 선택될 수 있고, 이들 각각은 N, S 및 O으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬로 추가로 치환되고;
Z에 대한 X의 연결부는 X 및 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있고;
치환체 NR1R2는 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있으며;
R1은 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택되되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
R1이 H인 경우, R2는 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택될 수 있되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
R1이 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬 또는 헤테로아릴인 경우, R2는 하기로부터 선택된 작용기일 수 있고:
[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J,
(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-V-J,
(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J, 및
[V]k-(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-J,
상기 식에서, m = 1-6이고, k = 0-1이며, W의 각각의 순열은 독립적으로 H, R3에서 종결되는 분지형 알킬 쇄인 [(CH2)nR3](식에서, n = 1-4임) 및 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기로부터 선택될 수 있고;
R3은 H, 메틸, 에틸, 아이소프로필, OH, O-알킬, NH2, NH-알킬, N-다이알킬, SH, S-알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴 치환체는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택될 수 있고;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길
로부터 선택된 반응성 기이고,
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이며;
R5는 -CH2OH, -CH2SH, -CH2Cl, -SCH2Cl, -SCH2F, -SCH2CF3, 하이드록시, -OCH2CN, -OCH2Cl, -OCH2F, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH2CN, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 수소 및 C1-10 알킬로부터 독립적으로 선택되며;
Q는 H, , C(O)R8(식 중, R8은 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬임) 또는 (C=O)NR4CHnNR4(C=O)OCH2-(V)n-J(식 중, n=1-4이고 R4 =H, 알킬 또는 분지형 알킬임) 또는 P(O)OR4일 수 있고;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되고;
달리 명시되지 않는 한, 모든 가능한 입체이성질체가 포함된다.
본 발명의 구체적인 목적은 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이며, Z는 하기로부터 선택되고:
이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬기로 추가로 치환되고;
이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 골격 헤테로원자를 함유할 수 있으며;
각각의 는 화학식의 나머지에 대한 부착점을 나타내고, 상기 부착점 각각은 N, S 및 O로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 통해서 화학식의 나머지에 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 구체적인 목적은 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이며, Z-NR1은 하기로부터 선택되고:
이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬기로 추가로 치환되고;
이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 골격 헤테로원자를 함유할 수 있으며; 그리고
각각의 는 화학식의 나머지에 대한 부착점을 나타내고, 상기 부착점 각각은 N, S 및 O로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 통해서 화학식의 나머지에 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 구체적인 목적은 화학식 (II)의 구조를 보유하는 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다:
화학식 (II)
상기 식에서,
Y는 CH2 및 O로부터 선택되며;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
L은 H 및 F로부터 선택되고;
R5는 -CH2OH, -SCH2F 및 로부터 선택되고;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되며;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,
로부터 선택된 반응성 기이고
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이다.
본 발명의 구체적인 목적은 화학식 (III)의 구조를 보유하는 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다:
화학식 (III)
상기 식에서,
Y는 CH2 및 O로부터 선택되며;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
L은 H 및 F로부터 선택되고;
R5는 -CH2OH, -SCH2F 및 로부터 선택되고;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되며;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길
로부터 선택된 반응성 기이고,
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이다.
본 발명의 구체적인 목적은 하기로부터 선택되는 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이다:
본 발명의 구체적인 목적은 즉, 화학식 I, II 또는 III의, 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물을 제공하는 것이고, X 또는 Z는 스피로[3.3]헵탄 또는 [1.1.1]바이사이클로펜탄일 수 있고, Y는 CH2 또는 O일 수 있다.
본 발명의 구체적인 목적은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하는 것을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하는 것이며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 실시형태 중 임의의 것에 따른 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제에 부착된다.
본 발명의 구체적인 목적은 하기로부터 선택된 ADC를 제공하는 것이다:
바람직하게는 상기 식에서, n = 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6 또는 2 내지 4이고, A는 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하는 항체, 일부 예시적인 실시형태에서 항-인간 VISTA 항체이다.
본 발명의 구체적인 목적은 상기 중 임의의 것에 따른 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드-링커 접합체, 또는 이를 함유하는 ADC 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 이를 필요로 하는 대상체에게 생체내 투여하기에 적합한 상기에 제시된 것과 같은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 적어도 1종의 부형제를 포함하는 상기에 제시된 것과 같은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 적어도 1종의 안정화제 또는 완충제를 포함하는 상기에 제시된 것과 같은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 선택적으로 주사에 의한 비경구 투여에 적합한 상기에 제시된 것과 같은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 선택적으로 정맥내, 피하, 근육내, 종양내 또는 척추강내 투여를 통해서, 이를 필요로 하는 대상체에게 주사하기에 적합한 상기에 제시된 것과 같은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 피하, 근육내 또는 정맥내 투여 가능한 상기에 제시된 것과 같은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 주사기, 주사 장치, 주입 펌프, 인젝터 펜, 무바늘 장치(needleless device), 오토인젝터(autoinjector) 및 피하 패치 전달 시스템, 선택적으로 환자에게 고정 용량의 글루코코티코이드 수용체 효능제 또는 이를 함유하는 ADC를 전달하는 장치로 이루어진 군으로부터 선택된 피하 투여를 제공하는 장치에 포함된, 상기에 제시된 바와 같은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 염증, 알레르기 또는 자가면역의 치료, 예방 또는 저해를 필요로 하는 대상체에서 염증, 알레르기 또는 자가면역을 치료, 예방 또는 저해하기 위한, 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 접합체 또는 ADC 또는 이를 함유하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 반응의 치료, 예방 또는 저해를 필요로 하는 대상체에서 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 반응을 치료, 예방 또는 저해하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드-링커 접합체 또는 이를 함유하는 ADC, 또는 이를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 상기 중 임의의 것에 따른 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드-링커 접합체, 또는 상기 중 임의의 것에 따른 이를 함유하는 ADC, 또는 이를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 알레르기, 자가면역, 이식, 유전자 요법, 염증, GVHD 또는 패혈증의 치료, 또는 인간 대상체에서 상기 병태 중 임의의 것과 연관된 염증, 자가면역 또는 알레르기 부작용의 치료 또는 예방을 위한, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 급성 용도를 위한, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 만성 용도를 위한, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 유지 요법을 위한, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 급성 또는 만성 염증 및 이와 연관된 자가면역 및 염증 적응증의 치료 또는 예방을 위한 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이며, 병태는 선택적으로 특히 후천성 재생불량성 빈혈 +, 후천성 혈우병 +, 급성 파종성 뇌척수염(Acute disseminated encephalomyelitis: ADEM) +, 급성 출혈성 뇌백질염(Acute hemorrhagic leukoencephalitis: AHLE)/허스트병(Hurst's disease) +, 무감마글로불린혈증, 1차 +, 원형 탈모증 +, 강직성 척추염(AS), 항-NMDA 수용체 뇌염 +, 항인지질 증후군(APS) +, 동맥경화증, 자폐 스펙트럼 장애(ASD), 자가면역 애디슨병(AAD) +, 자가면역 자율신경실조증/자가면역 자율 신경절증(AAG), 자가면역 뇌염 +, 자가면역 위염, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA) +, 자가면역 간염(AIH) +, 자가면역 고지혈증, 자가면역 뇌하수체염/림프구성 뇌하수체염 +, 자가면역 내이 질환(AIED) +, 자가면역 림프증식 증후군(ALPS) +, 자가면역 심근염, 자가면역 난소염 +, 자가면역 고환염 +, 자가면역 췌장염(AIP)/면역글로불린 G4-관련 질환(IgG4-RD) +, 자가면역 다선성 증후군, 타입 I, II 및 III +, 자가면역 프로게스테론 피부염 +, 자가면역 돌발성 감각신경성 난청(SNHL)이완불능(Achalasia), 애디슨병, 성인형 스틸병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신장염, 항인지질 증후군, 자가면역 혈관부종, 자가면역 자율신경실조증, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막증, 자가면역 두드러기, 축삭 및 신경성 신경병증(AMAN), 발로병, 베체트병, 양성 점막 유천포창, 수포성 유천포창, 캐슬만병(CD), 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 척-스트라우스 증후군(CSS) 또는 호산구성 육아종증(EGPA), 반흔성 유사천포창, 코간 증후군(Cogan's syndrome), 한랭 응집소병, 선천성 심차단, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 당뇨병, 타입 1, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경 척수염), 원판성 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 식도염 (EoE), 호산성 근막염, 결절성 홍반, 진성 혼합 한냉글로불린혈증, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐렴, 섬유성 폐렴, 거대 세포 심근염, 사구체신염, 굿파스쳐 증후군, 육아종증 다발혈관염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쉔라인 자반병(HSP), 임신성 헤르페스 또는 임신성 유사천포창(PG), 화농성 한선염(HS)(역성 여드름), 저감마글로불린혈증, IgA 신장병, IgG4-관련 경화병, 면역 혈소판감소성자반병(ITP), 포함체 근육염(IBM), 간질성 방광염(IC), 소아 관절염, 소아 당뇨병(타입 1 당뇨병), 소아 근염(JM), 가와사키병, 램버트-이튼 증후군, 백혈구파괴 혈관염, 편평태선, 경화성 태선, 목질결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 루푸스(신장염 및 피부성 포함), 라임병 만성, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염(MPA), 혼합 결합 조직병(MCTD), 무렌 궤양, 무하-하버만병(Mucha-Habermann disease), 다초점성 운동 신경병증(MMN) 또는 MMNCB, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 미엘린 희소돌기신경교 당단백질 항체 장애, 근염, 기면증, 신생아 루푸스, 시신경 척수염, 호중구감소증, 안반흔성 유사천포창(Ocular cicatricial pemphigoid), 시신경염, 안구간대경련-근간대경련 증후군(OMS), 재발성 류마티스(PR), PANDAS, 부신생물성 소뇌 변성(PCD), 발작성 야간 혈색뇨(PNH), 파리-롬버르그 증후군, 평면부염(말초 포도막염), 파르소니지-터너 증후군, 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈(PA), POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 다선성 증후군 타입 I, II, III, 류마티스성 다발성근육통, 다발성근염, 심근경색후 증후군, 심막절개술후 증후군, 원발성 담즙성 담관염, 원발 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선성 관절염, 순적혈구무형성증(PRCA), 괴저성 농피증, 레이노 증후군, 반응성 관절염, 반사성 교감신경이영양증, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군(RLS), 후복막 섬유증, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 슈미트증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 강직 인간 증후군(SPS), 아급성 박테리아성 심내막염(SBE), 스삭 증후군, 교감성 안염(SO), 타까야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성자반병(TTP), 갑상선 눈질환(TED), 톨로사-헌트 증후군(THS), 횡단 척수염, 타입 1 당뇨병, 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증, 보그트 고야나기 하라다병을 포함한다.
본 발명의 구체적인 목적은 급성 또는 만성 염증 및 자가면역 및 염증 및 알레르기 적응증 또는 이와 연관된 부작용의 치료 또는 예방을 위한, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이며, 병태는 선택적으로 중증 천식, 거대 세포 동맥염, ANKA 혈관염 및 IBD(대장염 및 크론병)을 포함한다.
본 발명의 구체적인 목적은 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 하기 중 하나 이상을 포함하는 환자에서 치료 또는 예방을 위한, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다:
(i) 만성, 급성, 간헐적 알레르기, 염증 또는 염증 병태, 예를 들어, 만성, 급성, 간헐적 및/또는 완화형/재발성 병태;
(ii) 주로 고용량의 스테로이드로만 효과적으로 치료될 수 있는 병태, 선택적으로 천식, COPD, 류마티스성 다발성근육통 및/또는 거대 세포 동맥염, 환자는 선택적으로 고용량의 스테로이드로 치료된 적이 있거나 치료 중임;
(iii) 스테로이드 사용을 제한하는 동반이환을 갖는 병태, 선택적으로 진성 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH), 병적 비만 무혈관성 괴사/골괴사증(AVN), 녹내장, 스테로이드-유도 고혈압, 심한 피부 취약성, 및/또는 골관절염;
(iv) 안전한 장기간 치료제가 사용 가능하지만 고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 바람직한 병태, 선택적으로 AAV, 다발성근염, 피부근염, 루푸스, 염증성 폐질환, 자가면역 간염, 염증성 장 질환, 면역 혈소판감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 통풍 환자(고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 치료적으로 타당함);
(v) 선택적으로 불확실한 치료 또는 기간 및/또는 스테로이드 투여에 대한 효과적인 대안이 없는 장기간/단기간 치료가 요구되는 피부과적 병태, 선택적으로 스티븐슨 존슨, 다른 중증 약물 발진 병태, 광범위한 접촉 피부염을 포함하는 병태, 다른 중증 면역-관련 피부과적 병태, 예컨대, PG, LCV, 홍피증 등;
(vi) 발적/재발에 대해 고용량 코티코스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 COPD, 천식, 루푸스, 통풍, 가성통풍;
(vii) 면역-관련 신경학적 질환, 예컨대, 소-섬유 신경병증, MS(하위세트), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 중증 근무력증 등;
(viii) 혈액학적/종양학 적응증, 선택적으로 고용량의 스테로이드가 치료적으로 타당하거나 유익할 것임;
(ix) 안과적 병태, 선택적으로 포도막염, 홍채염, 공막염 등;
(x) 영구적인 또는 장기간의 부신 기능부전 또는 2차 부신 기능부전, 선택적으로 의원성 애디슨병과 연관된 병태;
(xi) 보통 장기간, 저용량 스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 루푸스, RA, psA, 혈관염 등; 또는
(xii) 상기 중 임의의 것의 임의의 조합.
본 발명의 구체적인 목적은 스테로이드 치료에서 독성 위험이 있는 특별한 부류에 속하는 환자, 예컨대, 임산부/수유기 여성, 소아 환자, 선택적으로 성장 장애 또는 백내장이 있는 환자에서의 치료 또는 예방을 위한, 상기 중 임의의 것의용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이며, 환자는 또 다른 활성제로 추가로 치료 중이다.
본 발명의 구체적인 목적은 환자가 선택적으로 CTLA4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, B7-H4, B7-H3, VISTA 중 하나 이상을 표적으로 하는 면역저해 항체 또는 융합 단백질 및/또는 CD40, CD137, OX40, GITR, CD27, CD28 또는 ICOS 중 하나 이상을 표적으로 하는 효능작용 항체 또는 융합 단백질로부터 선택되는 면역조절 항체 또는 융합 단백질로 추가로 치료 중인, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 T 세포 활성화의 인간 V-도메인 Ig 억제인자(인간 VISTA)("A")에 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이며, ADC는, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우, VISTA 발현 면역 세포, 선택적으로 단핵구, 골수 세포, T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 대식세포, NK 세포 및 내피 세포 중 하나 이상에 우선적으로 전달되어, 항-염증제의 면역 세포 중 하나 이상 내로의 기능적 내재화를 초래한다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 생리 pH(약 7.5)에서 VISTA 발현 세포에 우선적으로 결합하는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고; 이것은 선택적으로 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 최대 70시간의 pK를 갖는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 생리 pH에서 시노몰거스 마카크 또는 인간에서 최대 3.5±.5일, 보다 전형적으로 최대 48시간, 최대 36시간, 최대 24시간 또는 최대 18시간 또는 최대 12시간의 pK를 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 생리 pH에서 시노몰거스 마카크 또는 인간에서 최대 2.8 또는 2.3 또는 1.5일 또는 1일 또는 12시간 또는 8시간±.5일의 pK를 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 생리 pH에서 인간 VISTA 설치류에서 최대 6 내지 12시간의 pK를 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 링커를 포함하는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이며, 링커는 ADC가 VISTA-발현 면역 세포, 선택적으로 활성화된 또는 비-활성화된 T 세포, CD4 또는 CD8 T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, 골수 세포, 수지상 세포, NK 세포, 대식세포, 호산구 및 내피 세포 중 하나 이상 내로 내재화될 때 절단되어 면역세포에서 치료적 유효량의 항-염증제(글루코코티코이드 효능제)의 방출을 초래하고, 항-염증제는 항-염증 활성을 도출한다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 항-VISTA 항체 또는 항원 결합 단편이 생리 pH(약 pH 7.5)에서 영장류, 선택적으로 시노몰거스 마카크에서 약 2.3일의 생체내 혈청 반감기를 갖는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 갖고, 항-VISTA 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 생리 pH(약 pH 7.5)에서 70시간 이하, 60시간 이하, 50시간 이하, 40시간 이하, 30시간 이하, 24시간 이하, 22 내지 24시간 이하, 20 내지 22시간 이하, 18 내지 20시간 이하, 16 내지 18시간 이하, 14 내지 16시간 이하, 12 내지 14시간 이하, 10 내지 12시간 이하, 8 내지 10시간 이하, 6 내지 8시간 이하, 4 내지 6시간 이하, 2 내지 4시간 이하, 1 내지 2시간 이하, 0.5 내지 1.0시간 이하 또는 0.1 내지 0.5시간 이하의 생체내 혈청 중 혈청 반감기를 갖는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 생체내에서 사용되는 경우 ADC의 PD/PK 비율이 인간 VISTA 넉-인 설치류 또는 인간 또는 비-인간 영장류, 선택적으로 시노몰거스 마카크에서 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1 또는 그 초과인, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, ADC의 PD가 설치류 중 임의의 하나에서 또는 인간 또는 비-인간 영장류, 선택적으로 시노몰거스 마카크에서 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 2 내지 4주, 1개월 또는 그 초과인, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 항체가 손상된 FcR 결합 또는 온전한 FcR 결합을 갖는 Fc 영역을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원을 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것이 손상된 FcR 결합 또는 온전한 FcR 결합을 갖는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것이 손상된 FcR 결합을 갖는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것이 적어도 2개의 천연 인간 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 손상시키거나 제거하도록 변형된 인간 또는 비-인간 영장류 불변 또는 Fc 영역을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것이 다음 FcR: hFcγRI(CD64), FcyRIIA 또는 hFcyRIIB(CD32 또는 CD32A) 및 FcγRIIIA(CD16A) 또는 FcγRIIIB(CD16B) 중 임의의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 모두에 대한 결합을 손상시키거나 제거하도록 변형된 인간 또는 비-인간 영장류 불변 또는 Fc 영역을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것이 선택적으로 Fc 영역에 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG2 카파 골격을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것이 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이 및 선택적으로 보체(C1Q) 결합을 손상시키는 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것이 선택적으로 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이 및 E269R 및 E233A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 면역 세포에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합이 면역에 대한 상기 면역 세포 발현된 항원 매개 효과, 예를 들어, 면역에 대한 VISTA-매개 효과를 직접적으로 효능작용하거나 길항작용하지 않는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 내인성 FcR 결합이 손상되지 않은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함하는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 천연(비변형된) 인간 IgG2 Fc 영역을 포함하는 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 항체 또는 항원 결합 단편이 24℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 결정된 .0001nM 내지 10.0nM, .001 내지 1.0nM 또는 .01 내지 7 범위 또는 그 미만의 KD를 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 항체 또는 항원 결합 단편이 24℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 결정된 .13 내지 .64nM의 KD를 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 선택적으로 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 약물 항체 비율이 약 1:1 내지 12:1 범위인, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 약물 항체 비율이 약 2 내지 12:1, 2 내지 8:1, 4 내지 8:1 또는 6 내지 8:1 범위인, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 약물 항체 비율이 약 8:1(n =8)이거나 약 4:1(n =4)인, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은, ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것은 단핵구, 골수 세포, T 세포, Treg, 대식세포 및 호중구 중 하나 이상에 내재화하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 B 세포에 인식 가능하게 내재화되지 않는 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 이것은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 네이키드(접합되지 않은) 형태로 투여된 동일한 투여량의 항-염증제에 비해서, 효능을 촉진시키고/시키거나 유해 부작용, 예컨대, 항-염증제와 연관된 독성을 감소시키는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 선택적으로 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 글루코코티코이드가 선택적으로 쇄간 이황화물 통해서 항체 또는 항원-결합 단편에 접합된, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 에스터라제 감응성 링커를 포함하는 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 절단 가능한 링커가 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스터라제-유도 절단 및 이황화 결합 절단 중 하나 이상에 민감한, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, ADC에 포함된 항-VISTA 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2 또는 scFv 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 내부에 함유된 항-VISTA 항체 또는 항체 단편이 도 8, 10 또는 12의 서열을 갖는 항체와 동일한 CDR을 포함하거나, 선택적으로 하기 중 하나로부터 선택되는 것인, 상기 중 임의의 것의 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다:
(i) 서열번호 100, 101 및 102의 VH CDR 및 서열번호 103, 104 및 105의 VL CDR을 포함하는 것;
(ii) 서열번호 110, 111 및 112의 VH CDR 및 서열번호 113, 114 및 115의 VL CDR을 포함하는 것;
(iii) 서열번호 120, 121 및 122의 VH CDR 및 서열번호 123, 124 및 125의 VL CDR을 포함하는 것;
(iv) 서열번호 130, 131 및 132의 VH CDR 및 서열번호 133, 134 및 135의 VL CDR을 포함하는 것;
(v) 서열번호 140, 141 및 142의 VH CDR 및 서열번호 143, 144 및 145의 VL CDR을 포함하는 것;
(vi) 서열번호 150, 151 및 152의 VH CDR 및 서열번호 153, 154 및 155의 VL CDR을 포함하는 것;
(vii) 서열번호 160, 161 및 162의 VH CDR 및 서열번호 163, 164 및 165의 VL CDR을 포함하는 것;
(viii) 서열번호 170, 171 및 172의 VH CDR 및 서열번호 173, 174 및 175의 VL CDR을 포함하는 것;
(ix) 서열번호 180, 181 및 182의 VH CDR 및 서열번호 183, 184 및 185의 VL CDR을 포함하는 것;
(x) 서열번호 190, 191 및 192의 VH CDR 및 서열번호 193, 194 및 195의 VL CDR을 포함하는 것;
(xi) 서열번호 200, 201 및 202의 VH CDR 및 서열번호 203, 204 및 205의 VL CDR을 포함하는 것;
(xii) 서열번호 210, 211 및 212의 VH CDR 및 서열번호 213, 214 및 215의 VL CDR을 포함하는 것;
(xiii) 서열번호 220, 221 및 222의 VH CDR 및 서열번호 223, 224 및 225의 VL CDR을 포함하는 것;
(xiv) 서열번호 230, 231 및 232의 VH CDR 및 서열번호 233, 234 및 235의 VL CDR을 포함하는 것;
(xv) 서열번호 240, 241 및 242의 VH CDR 및 서열번호 243, 244 및 245의 VL CDR을 포함하는 것;
(xvi) 서열번호 250, 251 및 252의 VH CDR 및 서열번호 253, 254 및 255의 VL CDR을 포함하는 것;
(xvii) 서열번호 260, 261 및 262의 VH CDR 및 서열번호 263, 264 및 265의 VL CDR을 포함하는 것;
(xviii) 서열번호 270, 271 및 272의 VH CDR 및 서열번호 273, 274 및 275의 VL CDR을 포함하는 것;
(xix) 서열번호 280, 281 및 282의 VH CDR 및 서열번호 283, 284 및 285의 VL CDR을 포함하는 것;
(xx) 서열번호 290, 291 및 292의 VH CDR 및 서열번호 293, 294 및 295의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxi) 서열번호 300, 301 및 302의 VH CDR 및 서열번호 303, 304 및 305의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxii) 서열번호 310, 311 및 312의 VH CDR 및 서열번호 313, 314 및 315의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxiii) 서열번호 320, 321 및 322의 VH CDR 및 서열번호 323, 324 및 325의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxiv) 서열번호 330, 331 및 332의 VH CDR 및 서열번호 333, 334 및 335의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxv) 서열번호 340, 341 및 342의 VH CDR 및 서열번호 343, 344 및 345의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxvi) 서열번호 350, 351 및 352의 VH CDR 및 서열번호 353, 354 및 355의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxvii) 서열번호 360, 361 및 362의 VH CDR 및 서열번호 363, 364 및 365의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxviii) 서열번호 370, 371 및 372의 VH CDR 및 서열번호 373, 374 및 375의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxix) 서열번호 380, 381 및 382의 VH CDR 및 서열번호 383, 384 및 385의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxx) 서열번호 390, 391 및 392의 VH CDR 및 서열번호 393, 394 및 395의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxi) 서열번호 400, 401 및 402의 VH CDR 및 서열번호 403, 404 및 405의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxii) 서열번호 410, 411 및 412의 VH CDR 및 서열번호 413, 414 및 415의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxiii) 서열번호 420, 421 및 422의 VH CDR 및 서열번호 423, 424 및 425의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxiv) 서열번호 430, 431 및 432의 VH CDR 및 서열번호 433, 434 및 435의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxv) 서열번호 440, 441 및 442의 VH CDR 및 서열번호 443, 444 및 445의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxvi) 서열번호 450, 451 및 452의 VH CDR 및 서열번호 453, 454 및 455의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxvii) 서열번호 460, 461 및 462의 VH CDR 및 서열번호 463, 464 및 465의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxviii) 서열번호 470, 471 및 472의 VH CDR 및 서열번호 473, 474 및 475의 VL CDR을 포함하는 것;
(xxxix) 서열번호 480, 481 및 482의 VH CDR 및 서열번호 483, 484 및 485의 VL CDR을 포함하는 것;
(xl) 서열번호 490, 491 및 492의 VH CDR 및 서열번호 493, 494 및 495의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xli) 서열번호 500, 501 및 502의 VH CDR 및 서열번호 503, 504 및 505의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlii) 서열번호 510, 511 및 512의 VH CDR 및 서열번호 513, 514 및 515의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xliii) 서열번호 520, 521 및 522의 VH CDR 및 서열번호 523, 524 및 525의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xliv) 서열번호 530, 531 및 532의 VH CDR 및 서열번호 533, 534 및 535의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlv) 서열번호 540, 541 및 542의 VH CDR 및 서열번호 543, 544 및 545의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlvi) 서열번호 550, 551 및 552의 VH CDR 및 서열번호 553, 554 및 555의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlvii) 서열번호 560, 561 및 562의 VH CDR 및 서열번호 563, 564 및 565의 VL CDR을 포함하는 것;
(xlviii) 서열번호 570, 571 및 572의 VH CDR 및 서열번호 573, 574 및 575의 VL CDR을 포함하는 것;
(xlix) 서열번호 580, 581 및 582의 VH CDR 및 서열번호 583, 584 및 585의 VL CDR을 포함하는 것;
(l) 서열번호 590, 591 및 592의 VH CDR 및 서열번호 593, 594 및 595의 VL CDR을 포함하는 것;
(li) 서열번호 600, 601 및 602의 VH CDR 및 서열번호 603, 604 및 605의 VL CDR을 포함하는 것;
(lii) 서열번호 610, 611 및 612의 VH CDR 및 서열번호 613, 614 및 615의 VL CDR을 포함하는 것;
(liii) 서열번호 620, 621 및 622의 VH CDR 및 서열번호 623, 624 및 625의 VL CDR을 포함하는 것;
(liv) 서열번호 630, 631 및 632의 VH CDR 및 서열번호 633, 634 및 635의 VL CDR을 포함하는 것;
(lv) 서열번호 640, 641 및 642의 VH CDR 및 서열번호 643, 644 및 645의 VL CDR을 포함하는 것;
(lvi) 서열번호 650, 651 및 652의 VH CDR 및 서열번호 653, 654 및 655의 VL CDR을 포함하는 것;
(lvii) 서열번호 660, 661 및 662의 VH CDR 및 서열번호 663, 664 및 665의 VL CDR을 포함하는 것;
(lviii) 서열번호 670, 671 및 672의 VH CDR 및 서열번호 673, 674 및 675의 VL CDR을 포함하는 것;
(lix) 서열번호 680, 681 및 682의 VH CDR 및 서열번호 683, 684 및 685의 VL CDR을 포함하는 것;
(lx) 서열번호 690, 691 및 692의 VH CDR 및 서열번호 693, 694 및 695의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxi) 서열번호 700, 701 및 702의 VH CDR 및 서열번호 703, 704 및 705의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxii) 서열번호 710, 711 및 712의 VH CDR 및 서열번호 713, 714 및 715의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxiii) 서열번호 720, 721 및 722의 VH CDR 및 서열번호 723, 724 및 725의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxiv) 서열번호 730, 731 및 732의 VH CDR 및 서열번호 733, 734 및 735의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxv) 서열번호 740, 741 및 742의 VH CDR 및 서열번호 743, 744 및 745의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxvi) 서열번호 750, 751 및 752의 VH CDR 및 서열번호 753, 754 및 755의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxvii) 서열번호 760, 761 및 762의 VH CDR 및 서열번호 763, 764 및 765의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxviii) 서열번호 770, 771 및 772의 VH CDR 및 서열번호 773, 774 및 775의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxix) 서열번호 780, 781 및 782의 VH CDR 및 서열번호 783, 784 및 785의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxx) 서열번호 790, 791 및 792의 VH CDR 및 서열번호 793, 794 및 795의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxxi) 서열번호 800, 801 및 802의 VH CDR 및 서열번호 803, 804 및 805의 VL CDR을 포함하는 것;
(lxxii) 서열번호 810, 811 및 812의 VH CDR 및 서열번호 813, 814 및 815의 VL CDR을 포함하는 것.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 VSTB92, VSTB56, VSTB95, VSTB103 및 VSTB66 중 어느 하나와 동일한 CDR을 포함하는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 하나의 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 각각 다음 VH 폴리펩타이드 및 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체의 서열과 적어도 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 보유하는 VH 폴리펩타이드 및 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 추가로 CDR이 변형되지 않은, 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하는 것이다:
(i) 서열번호 106 동일성의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 108의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(ii) 서열번호 116의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 118의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(iii) 서열번호 126의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 128의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(iv) 서열번호 136의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 138의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(v) 서열번호 146의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 148의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(vi) 서열번호 156의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 158의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(vii) 서열번호 166의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 168의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(viii) 서열번호 176의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 178의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(ix) 서열번호 186의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 188의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(x) 서열번호 196의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 198의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xi) 서열번호 206의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 208의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xii) 서열번호 216의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 218의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xiii) 서열번호 226의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 228의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xiv) 서열번호 236의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 238의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xv) 서열번호 246의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 248의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xvi) 서열번호 256의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 258의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xvii) 서열번호 266의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 268의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xviii) 서열번호 276의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 278의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xix) 서열번호 286의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 288의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xx) 서열번호 296의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 298의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxi) 서열번호 306의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 308의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxii) 서열번호 316의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 318의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxiii) 서열번호 326의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 328의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxiv) 서열번호 336의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 338의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxv) 서열번호 346의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 348의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxvi) 서열번호 356의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 358의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxvii) 서열번호 366의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 368의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxviii) 서열번호 376의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 378의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxix) 서열번호 386의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 388의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxx) 서열번호 396의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 398의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxi) 서열번호 406의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 408의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxii) 서열번호 416의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 418의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxiii) 서열번호 426의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 428의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxiv) 서열번호 436의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 438의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxv) 서열번호 446의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 448의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxvi) 서열번호 456의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 458의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxvii) 서열번호 466의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 468의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxviii) 서열번호 476의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 478의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xxxix) 서열번호 486의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 488의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xl) 서열번호 496의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 498의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xli) 서열번호 506의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 508의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlii) 서열번호 516의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 518의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xliii) 서열번호 526의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 528의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xliv) 서열번호 536의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 533, 534 및 535의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlv) 서열번호 546의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 548의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlvi) 서열번호 556의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 558의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlvii) 서열번호 566의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 568의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlviii) 서열번호 576의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 578의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(xlix) 서열번호 586의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 588의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(l) 서열번호 596의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 598의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(li) 서열번호 606의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 608의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lii) 서열번호 616의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 618의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(liii) 서열번호 626의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 628의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(liv) 서열번호 636의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 638의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lv) 서열번호 646의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 648의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lvi) 서열번호 656의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 658의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lvii) 서열번호 666의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 668의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lviii) 서열번호 676의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 678의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lix) 서열번호 686의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 688의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lx) 서열번호 696의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 698의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxi) 서열번호 706의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 708의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxii) 서열번호 716의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 718의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxiii) 서열번호 726의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 728의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxiv) 서열번호 736의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 738의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxv) 서열번호 746의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 748의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxvi) 서열번호 756의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 758의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxvii) 서열번호 766의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 768의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxviii) 서열번호 776의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 778의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxix) 서열번호 786의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 788의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxx) 서열번호 796의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 798의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxxi) 서열번호 806의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 808의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
(lxxii) 서열번호 816의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 818의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 항-VISTA 항체 또는 항체 단편이 VSTB92, VSTB56, VSTB95, VSTB103 및 VSTB66 중 하나와 동일한 가변 영역을 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 선택적으로 도 8, 도 10 또는 도 12의 것의 CDR 또는 가변 서열을 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 항-VISTA 항체 또는 항체 단편이 상기 Fc 영역에 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG2 카파 골격을 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC가 선택적으로 도 8, 도 10 또는 도 12의 것의 CDR 또는 가변 서열을 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 항-VISTA 항체 또는 항체 단편이 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격을 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 용도, 의약, 조성물 또는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 글루코코티코스테로이드 효능제 또는 링커 접합체가 이의 쇄간 이황화물을 통해서 인간 면역 세포 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-VISTA 항체 또는 항원 결합 단편에 접합된, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료적 유효량의 상기 중 임의의 것에 따른 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 스테로이드 효능제 또는 스테로이드-링커 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 주사 경로, 선택적으로 정맥내, 근육내, 척추강내 또는 피하를 통해서 투여 가능한, 상기 중 임의의 것에 따른 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 피하 투여 가능한 상기 중 임의의 것에 따른 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 주사기, 주사 장치, 주입 펌프, 인젝터 펜, 무바늘 장치, 오토인젝터 및 피하 패치 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 피하 투여를 제공하는 상기 중 임의의 것에 따른 글루코코티코스테로이드 효능제, 링커 접합체, ADC, 조성물 또는 의약을 포함하는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 환자에게 고정 용량의 글루코코티코이드 수용체 효능제 또는 이의 기능성 유도체를 전달하고, 선택적으로 환자에게 내부에 포함된 ADC 조성물을 투여하는 방법 및 투여 요법을 설명하는 설명서를 더 포함하는, 상기에 제시된 바와 같은 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 상기 중 임의의 것에 따른 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 스테로이드 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있는, 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 알레르기, 자가면역, 이식, 유전자 요법, 염증, GVHD 또는 패혈증의 치료 또는 인간 대상체에서 상기 병태 중 임의의 것과 연관된 염증, 자가면역 또는 알레르기 부작용의 치료 또는 예방에 사용되고, 선택적으로 염증은 암 또는 감염, 선택적으로 바이러스 또는 박테리아 감염과 연관된, 상기 중 임의의 것에 따른 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 환자가 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선으로부터 선택된 병태를 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 환자가 하기 중 하나 이상을 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다:
(i) 만성, 급성, 간헐적 알레르기, 염증 또는 염증 병태, 예를 들어, 만성, 급성, 간헐적, 완화형/재발성;
(ii) 주로 고용량의 스테로이드로만 효과적으로 치료될 수 있는 병태, 선택적으로 류마티스성 다발성근육통 및/또는 거대 세포 동맥염, 환자는 선택적으로 고용량의 스테로이드로 치료된 적이 있거나 치료 중임;
(iii) 스테로이드 사용을 제한하는 동반이환을 갖는 병태, 선택적으로 진성 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH), 병적 비만 무혈관성 괴사/골괴사증(AVN), 녹내장, 스테로이드-유도 고혈압, 심한 피부 취약성, 및/또는 골관절염;
(iv) 안전한 장기간 치료제가 사용 가능하지만 고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 바람직한 병태, 선택적으로 AAV, 다발성근염, 피부근염, 루푸스, 염증성 폐질환, 자가면역 간염, 염증성 장 질환, 면역 혈소판감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 통풍 환자(고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 치료적으로 타당함);
(v) 선택적으로 불확실한 치료 또는 기간 및/또는 스테로이드 투여에 대한 효과적인 대안이 없는 장기간/단기간 치료가 요구되는 피부과적 병태, 선택적으로 스티븐슨 존슨, 다른 중증 약물 발진 병태, 광범위한 접촉 피부염을 포함하는 병태, 다른 중증 면역-관련 피부과적 병태, 예컨대, PG, LCV, 홍피증 등;
(vi) 발적/재발에 대해 고용량 코티코스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 COPD, 천식, 루푸스, 통풍, 가성통풍;
(vii) 면역-관련 신경학적 질환, 예컨대, 소-섬유 신경병증, MS(하위세트), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 중증 근무력증 등;
(viii) 혈액학적/종양학 적응증, 선택적으로 고용량의 스테로이드가 치료적으로 타당하거나 유익할 것임;
(ix) 안과적 병태, 선택적으로 포도막염, 홍채염, 공막염 등;
(x) 영구적인 또는 장기간의 부신 기능부전 또는 2차 부신 기능부전, 선택적으로 의원성 애디슨병과 연관된 병태;
(xi) 보통 장기간, 저용량 스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 루푸스, RA, psA, 혈관염 등.
(xii) 특별한 부류의 환자, 예컨대, 임산부/수유기 여성, 소아 환자, 선택적으로 성장 장애 또는 백내장이 있는 환자 또는 상기의 임의 조합.
본 발명의 목적은 환자가 또 다른 활성제로 추가로 치료될, 상기 중 임의의 것에 따른 방법, 의약 또는 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 환자가 CTLA4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, B7-H4, B7-H3, VISTA 중 하나 이상을 표적으로 하는 면역저해 항체 또는 융합 단백질 및/또는 CD40, CD137, OX40, GITR, CD27, CD28 또는 ICOS 중 하나 이상을 표적으로 하는 효능작용 항체 또는 융합 단백질로부터 선택적으로 선택되는 면역조절 항체 또는 융합 단백질로 추가로 치료 중인, 상기 중 임의의 것에 따른 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 환자 또는 공여자로부터의 면역 세포가 상기 중 임의의 하나에 따른 ADC 또는 스테로이드와 접촉되고, 그 다음 이를 필요로 하는 환자, 예를 들어, 상기에 식별된 병태 중 하나 이상을 갖는 환자에게 주입되는, 상기 중 임의의 하나에 따른 ADC 또는 스테로이드의 생체외 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 링커가 양, 음 또는 중성으로 하전된 절단 가능한 펩타이드, 선택적으로 에스터라제 절단 가능한 펩타이드인, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 약물 항체 비율이 약 1:1 내지 12:1 또는 1:1 내지 10:1 범위인, 상기 중 임의의 것의 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 약물 항체 비율이 약 2 내지 8:1, 4 내지 8:1 또는 6 내지 8:1 범위인, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 약물 항체 비율이 약 8:1(n =8) 또는 4:1(n =4)인, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 다른 면역 세포 유형 중에서 활성화된 또는 비-활성화된 단핵구, 골수 세포, B 세포, NK 세포, T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, 비만 세포, 호산구, 수지상 세포, 비만 세포, 대식세포 및 호중구 중 하나 이상에 내재화하는, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 활성화된 또는 비-활성화된 B 세포에 인식 가능하게 내재화하지 않는, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 네이키드(접합되지 않은) 형태로 투여된 동일한 투여량의 항-염증제에 비해서 효능을 촉진시키고/시키거나 글루코코티코이드 수용체 효능제와 연관된 유해 부작용을 감소시키는, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 글루코코티코이드 수용체 효능제가 쇄간 이황화물을 통해서 항체 또는 항원-결합 단편에 접합된, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 에스터라제 감응성 링커를 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스터라제-유도 절단 및 이황화 결합 절단 중 하나 이상에 민감한 절단 가능한 링커를 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스터라제-유도 절단 및 이황화 결합 절단 중 하나 이상에 실질적으로 저항성인 절단 가능하지 않은 링커를 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 ADC에 포함된 항-VISTA 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, 또는 scFv 항체 단편을 포함하는, 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있는, 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 알레르기, 자가면역, 이식, 유전자 요법, 염증, GVHD 또는 패혈증의 치료 또는 인간 대상체에서 상기 병태 중 임의의 것과 연관된 염증, 자가면역 또는 알레르기 부작용의 치료 또는 예방을 위해서 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있는, 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선으로부터 선택된 병태를 포함하는 환자의 치료를 위해서 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있는, 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 하기 중 하나 이상을 포함하는 환자의 치료를 위해서 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있는, 방법을 제공하는 것이다:
(i) 주로 고용량의 스테로이드로만 효과적으로 치료될 수 있는 병태, 선택적으로 류마티스성 다발성근육통 및/또는 거대 세포 동맥염, 환자는 선택적으로 고용량의 스테로이드로 치료된 적이 있거나 치료 중임;
(ii) 스테로이드 사용을 제한하는 동반이환을 갖는 병태, 선택적으로 진성 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH), 병적 비만 무혈관성 괴사/골괴사증(AVN), 녹내장; 스테로이드-유도 고혈압, 심한 피부 취약성 및/또는 골관절염;
(iii) 안전한 장기간 치료제가 사용 가능하지만 고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 바람직한 병태, 선택적으로 AAV, 다발성근염, 피부근염, 루푸스, 염증성 폐질환, 자가면역 간염, 염증성 장 질환, 면역 혈소판감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 통풍 환자(고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 치료적으로 타당함);
(iv) 선택적으로 불확실한 치료 또는 기간 및/또는 스테로이드 투여에 대한 효과적인 대안이 없는 장기간/단기간 치료가 요구되는 피부과적 병태, 선택적으로 스티븐슨 존슨, 다른 중증 약물 발진 병태, 광범위한 접촉 피부염을 포함하는 병태, 다른 중증 면역-관련 피부과적 병태, 예컨대, PG, LCV, 홍피증 등;
(v) 발적/재발에 대해 고용량 코티코스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 COPD, 천식, 루푸스, 통풍, 가성통풍;
(vi) 면역-관련 신경학적 질환, 예컨대, 소-섬유 신경병증, MS(하위세트), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 중증 근무력증 등;
(vii) 혈액학적/종양학 적응증, 선택적으로 고용량의 스테로이드가 치료적으로 타당하거나 유익할 것임;
(viii) 안과적 병태, 선택적으로 포도막염, 홍채염, 공막염 등;
(ix) 영구적인 또는 장기간의 부신 기능부전 또는 2차 부신 기능부전, 선택적으로 의원성 애디슨병과 연관된 병태;
(x) 보통 장기간, 저용량 스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 루푸스, RA, psA, 혈관염 등; 및
(xi) 특별한 부류의 환자, 예컨대, 임산부/수유기 여성, 소아 환자, 선택적으로 성장 장애 또는 백내장이 있는 환자.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 또 다른 활성제로 추가로 치료 중인 환자의 치료를 위해서 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있는, 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 CTLA4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, B7-H4, B7-H3, VISTA 중 하나 이상을 표적으로 하는 면역저해 항체 또는 융합 단백질, 및/또는 CD40, CD137, OX40, GITR, CD27, CD28 또는 ICOS 중 하나 이상을 표적으로 하는 효능작용 항체 또는 융합 단백질로부터 선택적으로 선택되는 면역조절 항체 또는 융합 단백질로 추가로 치료중인 환자의 치료를 위해서 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있는, 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 급성 또는 만성 염증 및 자가면역 및 이와 연관된 염증 적응증의 치료 또는 예방을 위해서 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있고, 병태가 선택적으로 중증 천식, 거대 세포 동맥염, ANKA 혈관염 및 IBD(대장염 및 크론병)를 포함하는, 치료 및/또는 예방을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선으로부터 선택된 병태의 치료를 위해서 상기 중 임의의 것에 따른 장치에 존재할 수 있는, 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 대상체에게 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 투여하거나 상기 세포를 생체외에서 상기 중 임의의 것에 따른 ADC와 접촉시키는 단계를 포함하는, 스테로이드를 다른 면역 세포 유형 중에서 골수 세포, T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, B 세포, NK 세포, 골수 세포, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포 및 대식세포 중 하나 이상에 내재화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 대상체에게 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 투여하거나 상기 세포를 생체외에서 상기 중 임의의 것에 따른 ADC와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이것은 생체외에서 달성되고, 면역 세포를 포함하거나 또는 다른 면역 세포 유형 중에서 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, 골수 세포, 비만 세포, 수지상 세포, 호산구 및 대식세포로부터 선택된 특정 유형 또는 유형들의 면역 세포를 포함하는 정제된 또는 농축된 조성물이 상기 중 임의의 것에 따른 ADC와 생체외에서 접촉되고, 그 다음 이를 필요로 하는 환자에게 도입되는, 스테로이드를 골수 세포, NK 세포, B 세포, T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, 골수 세포, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포 및 대식세포 중 하나 이상에 내재화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 스테로이드를 골수 세포, NK 세포, B 세포, T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, 비만 세포, 골수 세포, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포 및 대식세포 중 하나 이상에 내재화하는 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 대상체에게 골수 세포, NK 세포, B 세포, T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, 골수 세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및 대식세포 중 임의의 것 중 하나 이상과 관련된 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 병태를 치료하기 위한 상기 방법 중 임의의 것에 따른 ADC를 투여하거나 상기 세포를 생체외에서 이러한 ADC와 접촉시키는 단계를 포함하거나, 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 중 임의의 것에 따른 ADC를 투여하는 단계를 포함한다.
도 1A 및 도 1B: 본 도면은 트립신 분해에 의한 대조군 VISTA 항체 767-IgG1.3의 펩타이드 매핑을 도시한 도면. 식별된 트립신 분해 펩타이드를 갖는 767-IgG1.3에 대한 결정된 서열은 (A) 경쇄(85.6% 커버리지) (B) 중쇄(76.1% 커버리지)에 밑줄이 그어져 있다.
도 2A 및 도 2B: 본 도면은 Lys-C 분해를 사용한 767-IgG1.3에 대한 결정된 서열을 도시한 도면. 도면에서 Lys-C 펩타이드는 (A) 경쇄(63.3% 커버리지) (B) 중쇄(76.3% 커버리지)에 밑줄이 그어져 있다.
도 3: 이 도면은 합성된 대조군 항체 767-IgG1.3 및 INX200이 역의 pH 의존성 결합 특징을 나타내는 것을 확인해 주는 결합 실험의 결과를 도시한 도면.
도 4A 내지 도 4C: 본 도면은 링커 A를 사용한 DAR 8 접합이 (A) INX200 (B) INX201 또는 (C) 767-IgG1.3에 대한 VISTA 결합에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 결합 연구 결과를 도시한 도면.
도 5: 본 도면은 암컷 hVISTA 넉-인 동물에게 상이한 네이키드 및 Dex 접합된 항-VISTA 항체를 투여하고, 말초 혈액에서 ConA 6시간 후 G-CSF 변화를 검출한 ConA 실험의 결과를 도시한 도면. 마우스 7-플렉스를 사용하여 측정된 혈장 농도(SEM; n=5/군)(투여: Dex-0.2= 0.2㎎/㎏, Dex-2 = 2㎎/㎏, 10㎎/㎏의 INX210 및 INX210A, [INX210A는 0.2㎎/㎏ dex 페이로드를 제공하였음]).
도 6: 본 도면은 수컷 hVISTA 넉-인 동물에게 상이한 네이키드 및 Dex 접합된 항-VISTA 항체를 투여한 ConA 연구 결과를 도시한 도면. 실험에서 도면에서 말초 혈액에서 ConA 6시간 후 사이토카인 변화. 마우스 7-플렉스를 사용하여 측정된 혈장 농도(SEM; n=10/군, ConA-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석(one-way ANOVA))(투여: 0.2 또는 5㎎/㎏의 Dex, 10㎎/㎏의 INX210 및 INX210A).
도 7: 본 도면은 동물에게 상이한 네이키드 및 Dex 접합된 항-VISTA 항체를 투여하고 사이토카인 변화를 말초 혈액에서 ConA 6시간 후 검출한 ConA 실험 결과를 도시한 도면. ELISA 검정을 사용하여 혈장 농도를 측정하였다(SD; n=6/군; ConA-단독 군과 비교한 일원 분산분석)(투여: 0.02, 0.2 또는 2㎎/㎏의 Dex, 10, 5 및 1㎎/㎏의 INX200A).
도 8은 INX200, INX201 및 INX210의 가변 중쇄 및 경쇄 및 불변 영역에 대한 서열 및 서열 범례를 도시한 도면.
도 9는 예시적인 부데소나이드 유도체를 도시한 도면.
도 10A 내지 도10JJ는 예시적인 항-인간 VISTA 항체 VSTB49-VSTB116(이것은 생리 조건(pH 약 7.5)에서 설치류 및 영장류에서 짧은 혈청 반감기를 보유함)의 CDR, 가변 중쇄 및 경쇄 서열, 프레임워크 서열 및 불변 도메인 및 에피토프 정보를 포함하는 서열표를 도시한 도면.
도 11A 내지 도 11C는 실시예 3에 개시된 것으로부터의 예시적인 스테로이드 구조를 도시한 도면.
도 12A 내지 도 12C는 실시예에 개시된 예시적인 항-VISTA 항체 및 대조군 항체의 서열을 도시한 도면.
도 13은 INX200, 및 767-IgG1.3 대 인간 IgG1si에 대한 결합 연구를 도시한 도면. 시험된 항체의 연속 희석물(0 내지 333nM)과 함께 인큐베이션된 단핵구에 대해서 측정된 중간 형광 강도; 흑색 파선은 염색되지 않은 세포의 자가 형광에 상응함; n=1.
도 14는 항-VISTA 항체(INX200)가 면역 세포에 의해서 내재화되는 분율을 도시한 도면. 세포 결합된 항체의 세포내 풀을 60분의 시간 경과에 걸쳐서 플로팅하고; 각각의 데이터 지점에 대해서 형광을 시간 0분에서 INX200의 형광에 정규화하였다; 평균±SD n=2 공여자.
도 15는 INX200 항체의 내재화 비율을 평가하는 실험 결과를 도시한 도면. INX200 항체의 내재화 비율을 60분의 시간 경과에 걸쳐서 단핵구에서 평가하였고; 항-CD45 항체는 어떠한 시점에서도 내재화되지 않았다; 평균±SD, n=2 공여자로 나타냄.
도 16: INX200, INX200A 대 인간 IgG1에 대한 PK 연구를 도시한 도면. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군).
도 17: 767-IgG1.3, 767-IgG1.3A 대 인간 IgG1에 대한 PK 연구를 도시한 도면. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군).
도 18은 본 발명에 따른 ADC 접합체의 효력을 평가하는 실험 결과를 도시한 도면. 실험에서 복막 상주 대식세포 및 비장 단핵구에서 Dex(좌측) 및 ADC INX201J(우측) 처리 후 FKBP5 전사 활성화를 평가하였다. 2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 4시간 및 24시간 후 Dex(좌측) 효과를 평가하였다. 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드를 전달하는10㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 24, 48, 72 및 96시간 후 ADC(우측) 효과를 분석하였다. 실시간 PCR로 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다. 군당 4마리의 마우스를 함께 풀링시켜 RNA 제조에 충분한 물질을 생성시켰다.
도 19는 Dex 처리가 PRM에서 전염증성 사이토카인의 생체외 유도를 방지한다는 것을 나타낸 생체내 실험 결과를 도시한 도면. 2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 2시간 후 Dex 효과를 평가하였고; 마우스 32-플렉스를 사용하여 세포 상청액(1시간에 수집)에서 IL-6 및 TNFα를 평가하였다(n=4 마우스/군; 언페어드 T 검정).
도 20은 PRM에서 TNFα에 대한 INX201J 또는 Dex 처리의 생체내 효과를 평가한 실험 결과를 도시한 도면. 결과는, INX201J 또는 Dex 처리가 PRM에서 TNFα의 생체외 유도를 방지한다는 것을 나타낸다. 이들 실험에서, Dex 효과를 2 및 0.2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 2시간 후 평가하였고; INX201J 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏ 페이로드에 동등함)의 주사 1일(d-1), 2일(d-2) 및 4일(d-4) 후에 평가하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα를 측정하였다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석).
도 21은 본 발명에 따른 예시적인 ADC의 장기간 효과를 평가하는 실험 결과를 도시한 도면. 결과는, 모든 시험된 ADC가 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도에 대해 장기간 효과를 도출하였음을 나타낸다. Dex 효과를 2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 2시간 후 평가하였고; INX201J, INX231J, INX234J 및 INX240 J 효과를 10㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 4일(-4) 및 7일(-7) 후에 평가하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석).
도 22는 본 발명에 따른 예시적인 ADC 접합체, 즉, INX231J, INX234J 및 INX240 J의 효력을 평가하는 실험 결과를 도시한 도면. 결과는 INX231J, INX234J 및 INX240 J ADC가 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 대등한 효력을 가짐을 나타낸다. Dex 효과를 2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 2시간 후에 평가하였고; INX231J, INX234J 및 INX240 J 효과를 10, 3 또는 1㎎/㎏(0.2, 0.06 및 0.02㎎/㎏의 GC 페이로드)의 1회 단일 i.p. 주사 7일 후에 평가하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(기술적 이유를 위해서, PBS 군 n=1을 제외하고는 n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석).
도 23은 INX201J, INX201P, INX231J, INX234J 및 INX240J ADC의 효력이 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 대등함을 나타낸 실험을 도시한 도면. INX201J, INX201P, INX231J, INX234J, INX240 J 및 Dex 효과를 1회 단일 i.p. 주사 후 7일 후에 평가하였고; ADC를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 GC 페이로드)으로 투여하고, Dex를 2㎎/㎏으로 투여하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(기술적 이유를 위해서 n=3인 PBS 및 Dex 군을 제외하고는 n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석).
도 24: INX201J, INX231P, INX234P 및 INX240P ADC는 PRM에서 TNFα의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 대등한 효력을 갖는다. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7일 후에 평가하였고; ADC를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 GC 페이로드)으로 투여하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα를 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 25: INX231P, INX231R, INX233P 및 INX234P는 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 대등한 효력을 갖는다. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7일 후에 평가하였고; ADC를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 GC 페이로드)으로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 26: PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서의 INX231에 접합된 GC 링커 페이로드 INX R, INX O, INX S, INX V 및 INX W 대 INX P의 효력 평가. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 27: PRM에서 FKBP5 전사를 유도하는 데 있어서 GC 페이로드 INX231S, INX231V 및 INX231W 대 INX231P의 효력 평가. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 1일, 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 발현을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 28: PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX231S, INX231V 및 INX231W 대 INX231P의 효력 평가. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 1일, 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 29: 복막 상주 대식세포(상단 행) 및 비장 세포(하단 행)에서 FKBP5 전사를 유도하는 데 있어서 GC 페이로드 INX234A3, INX234A4, INX234T, INX201L 및 INX231S의 효력 평가. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 1일, 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 발현을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 30: PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX234A3, INX234A4, INX234T, INX201L 및 INX231S의 효력 평가. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 1일, 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 31: 복막 상주 대식세포에서 FKBP5 전사를 유도하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX234V, INX234A5 및 INX234A11의 효력 평가. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 발현을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 32: PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX234V, INX234A5 및 INX234A11의 효력 평가. 1회 단일 i.p. 주사 14일 후 ADC 효과를 평가하였고; ELISA를 사용하여 ADC TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 33: 복막 상주 대식세포에서 FKBP5 전사를 유도하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX234V, INX231A7, INX231A12 및 INX231A23의 효력 평가. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7일 및 21일 후에 평가하였고; 0.08㎎/㎏의 페이로드로 투여한 INX231A7을 제외하고는 ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 발현을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 34: PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX234V, INX231A7, INX231A12 및 INX231A23의 효력 평가. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7, 14 및 21일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 35: 말초 혈액에서 LPS 2(좌측) 및 4시간(우측) 후 IL-12p40 변화. 마우스 멀티-플렉스를 사용하여 측정된 혈장 농도; 투여: Dex(사각형)를 0.02, 0.2, 2 및 5㎎/㎏으로 LPS 자극 2시간 전에 투여하였고, INX201J(원)를 0.2㎎/㎏ GC를 제공하는 10㎎/㎏으로 LPS 주사 2 또는 17시간 전에 투여하였다. PBS 단독 군(회색의 채워진 삼각형)은 자극의 부재 하에서 기준선 사이토카인 수준을 나타낸다; PBS + LPS(흑색의 채워진 삼각형)(SEM; 분석으로부터 기술적 실패가 배제되는 것을 제외하고는 n=5/군; PBS + LPS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 36: 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 사이토카인 변화. 마우스 5-플렉스를 사용하여 측정된 혈장 농도; 투여: Dex를 0.002, 0.02, 0.2, 2㎎/㎏으로 LPS 자극 2시간 전(사각형)에 또는 2㎎/㎏으로 LPS 17시간 전(흑색의 채워진 사각형)에 투여하였고, INX201J(원)를 0.02, 0.06, 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다. PBS 단독 군(회색의 삼각형)은 자극의 부재 하에서 기준선 사이토카인 수준을 나타낸다; PBS + LPS(채워진 흑색 삼각형)(SEM; 분석으로부터 기술적 실패가 배제되는 것을 제외하고는 n=5/군; PBS + LPS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 37은 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα 변화를 도시한 도면. ELISA를 사용하여 TNFα 혈장 농도를 측정하였고; 투여: Dex를 0.2 및 2㎎/㎏으로 LPS 자극 2시간 전(사각형)에 투여하였고, INX201J(원)를 0.06 및 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다. PBS 군(채워진 흑색 삼각형)은 LPS 2시간 전에 PBS를 제공받았다. IgG1siJ(G1siJ) 군(삼각형)은 LPS 17시간 전에 0.2㎎/㎏의 페이로드로 GC에 접합된 인간 IgG1 침묵을 제공받았다. (SEM; 분석으로부터 기술적 실패가 배제되는 것을 제외하고는 n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 38은 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα 변화를 도시한 도면. ELISA에 의해 TNFα 혈장 농도를 측정하였고; 투여: Dex를 0.2 및 2㎎/㎏으로 LPS 자극 2시간 전(사각형)에 투여하였고, INX201J(원) 및 INX201N(역삼각형)을 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다. PBS 군은 LPS 2시간 전에 PBS를 제공받았다(채워진 흑색 삼각형). (SEM; 분석으로부터 기술적 실패가 배제되는 것을 제외하고는 n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 39는 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(좌측) 및 IL-12p40(우측) 변화를 도시한 도면. 사이토카인 혈장 농도를 ELISA에 의해서 측정하였다; 투여: PBS(채워진 원), INX201J(사각형), INX231J(삼각형), INX234J(마름모) 및 INX201P(역삼각형)를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다(SEM; n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 40은 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(좌측) 및 IL-12p40(우측) 변화를 도시한 도면. 사이토카인 혈장 농도를 ELISA에 의해서 측정하였다; 투여: PBS(채워진 삼각형), INX201J(원), INX201O(사각형) 및 INX201P(마름모)를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다(SEM; 기술적인 실패가 분석으로부터 배제되는 경우를 제외하고는 n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 41은 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40 (좌측) 변화를 도시한 도면. 사이토카인 혈장 농도를 ELISA에 의해서 측정하였다; 투여: PBS, INX201J(원), INX201O(사각형) 및 INX201P(마름모)를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다(SEM; 기술적인 실패가 분석으로부터 배제되는 경우를 제외하고는 n=5/군; PBS 군(채워진 흑색 삼각형)과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 42는 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40 (좌측) 변화를 도시한 도면. ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 20시간 전에 투여하였다(INX231P(사각형), INX231R(삼각형), INX233P(마름모))(SEM; 기술적인 실패가 분석으로부터 배제되는 경우를 제외하고는 n=5/군; PBS 군(채워진 원)과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 43은 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40 (좌측) 변화를 도시한 도면. ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 20시간 전에 투여하였다(INX231P(채워진 사각형), INX231R(채워진 삼각형), INX201O(채워진 마름모), INX231S(원), INX231V(사각형), INX231W(삼각형))(SEM; 2회의 기술적인 실패가 분석으로부터 배제된 INX231S를 제외하고는 n=4/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석(채워진 원)은 유의하지 않은 데이터를 나타내었음).
도 44는 ADC 처리 4일 후 복막 상주에서 ADC 처리 후 FKBP5 전사 활성화를 도시한 도면. ADC를 제0일에 i.p.로 주사하여 각각 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드를 전달하였고; PRM을 제3일에 단리시켰다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(SEM, PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석, n=4).
도 45: 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40(좌측) 변화. ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 LPS 주사 20시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다(SEM; 군당 1개의 기술적인 실패가 기록된 INX234P, INX234A4 및 INX234T를 제외하고는 n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 46: 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40(좌측) 변화. ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 LPS 주사 20시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다(INX234V(채워진 사각형), INX234A5(채워진 삼각형), INX234A11(채워진 마름모))(SEM; n=5/군 ex; PBS 군(채워진 원)과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 47: 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40(좌측) 변화. ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; INX231A7을 0.08㎎/㎏의 페이로드로 투여한 것을 제외하고는 모든 ADC 및 PBS를 LPS 주사 20시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다(INX234V(채워진 사각형), INX231A7(채워진 삼각형), INX231A12(채워진 마름모), INX231A23(원), INX234A1(사각형), INX234A13(삼각형))(SEM; n=5/군 ex; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 48: 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40(좌측) 변화. ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 LPS 주사 20시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다(SEM; PBS, INX234P, INX201V 군에서 1개의 샘플 및 INX234A9 군에서 2개의 샘플이 기술적인 이유로 인해서 제거되어야 하는 것을 제외하고는 n=5/군, PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 49는 상이한 세포 상에서의 VISTA 발현을 검출하는 실험 결과를 도시한 도면. 도시된 바와 같이, VISTA는 간 내피 세포에서 높게 발현된다. hVISTA 넉-인 마우스 간으로부터 단리되고 항-인간 VISTA로 염색되거나(적색선, 우측으로 이동) 또는 염색되지 않은(채워진 회색) CD45-CD31+ 비-면역 내피 세포.
도 50은 부신, 뇌, 간 및 비장에서 INX201J 주사 후 FKBP5 전사 활성화를 검출하는 실험 결과를 도시한 도면. 도시된 바와 같이 0.3, 3, 10㎎/㎏(각각 0.006, 0.06 및 0.2㎎/㎏의 페이로드를 전달함)으로의 1회 단일 i.p. 주사 20시간 후에 INX201J 효과를 측정하였다. 0.2 또는 2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군의 평균에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(n=4 마우스/군, PBS-단독 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 51: INX-SM-3, INX-SM-4 및 INX-SM-1은 IL-1β(좌측) 및 IL-6(우측) 생산. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 1nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 1nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에는 처리 대조군을 플로팅하지 않았다; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 52: INX-SM-1, INX-SM-3, INX-SM-4 및 INX-SM-6은 IL-1β 생산을 저해한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 1nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 1nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 53: INX-SM-9, INX-SM-31 및 INX-SM-35는 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단) 생산을 저해한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.2nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.2nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=2 공여자-대표적인 공여자를 나타냄. 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 54: INX-SM-32는 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단) 생산을 저해한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(500 내지 1nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 1nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=2. 대표적인 공여자를 제시함. 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 55: INX-SM-10은 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단) 생산에서 강력한 저해를 나타낸다. INX-SM-33은 사이토카인 생산의 중간 정도의 저해를 나타내었다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.5nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.5nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 56: INX-SM-2 및 INX-SM-7은 IL-1β에서 저해를 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 57은 C9 단독에서가 아닌 C6 및 C9 둘 다에서의 할로겐화가 증가된 효력을 제공한다는 것을 도시한 도면. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 58: 다른 표면 표적에 대해서 지향되는 INX P 접합된 항체는 항-VISTA 접합체의 항-염증 효과를 보유한다. 1ng/㎖ LPS 및 글루코코티코이드 접합체의 연속 희석물(8,000 내지 0.26nM의 접합된 페이로드)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였음; n=1, 기술적인 반복물의 평균.
도 59: INX-SM-43은 huIL1-β의 중간 정도의 저해를 나타낸다. 1ng/㎖ LPS 및 글루코코티코이드 페이로드의 연속 희석물(100 내지 0.032nM)의 접합된 페이로드)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였음; n=1, 기술적인 반복물의 평균.
도 60: INX-SM-44는 huIL1-β의 중간 정도의 저해를 나타낸다. 1ng/㎖ LPS 및 글루코코티코이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.32nM)의 접합된 페이로드)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였음; n=1, 기술적인 반복물의 평균.
도 61: INX-SM-25 및 INX-SM-3은 IL-1β 생산에서 강력한 저해를 나타낸다. INX-SM-45 및 INX-SM-46은 사이토카인 생산의 더 양호한 중간 정도의 저해를 나타내었다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.5nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.5nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
도 62: INX231P 및 INX231J 보다 극적으로 증가된 INX231V의 효력. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 측정된 A. huIL-1β B. huIL-6에 대한 평균 사이토카인 수준, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함. ULOQ(IL-1b의 경우 12,500pg/㎖ 및 IL-6의 경우 150,000pg/㎖)보다 높은 값을 외삽값으로서 플로팅하였다.
도 63: INX231V는 상당한 효력을 갖고, INX231P는 INX231J에 비해서 중간 정도의 효력을 가졌다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
도 64: INX231J보다 향상된 INX231S, INX234T 및 INX234A3의 효력. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
도 65: INX201은 INX231에 비해서 접합체의 향상된 초기 효력을 초래할 수 있다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
도 66: INX V는 INX231J에 비해서 효력이 있다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
도 67: INX-SM-36, INX-SM-32(상단) 및 INX-SM-3, INX-SM-J2(하단)는 IL-1β를 저해한다. INX-SM-32 및 INX-SM-36은 덱사메타손과 유사한 효력으로 IL-1β를 저해한다. INX-SM-3 및INX-SM-J2는 부데소나이드와 유사한 효력을 갖는다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.5nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.5nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 68: INX-SM-32, INX-J2 및 INX-SM-3은 IL-1β의 유사한 저해를 도출하고, INX-SM-37은 IL-1β를 약하게 저해한다. INX-SM-32, INX-J2 및 INX-SM-3은 유사한 효력으로 IL-1β를 저해한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.5nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 69: INX231V는 다른 INX231/INX234 접합체보다 실질적으로 더 효력이 있다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
도 70: INX V의 포스포릴화 및 할로겐화 유사체는 INX J에 비해서 효력이 있다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
도 71: INX-SM-14, INX-SM-15 및 INX-J2는 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단)의 유사한 저해를 갖는다. INX-SM-17은 IL-6이 아닌 IL-1β를 약하게 저해한다. INX-SM-14, INX-SM-15 및 INX-J2는 유사한 효력으로 IL-1β 및 IL-6을 저해한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.01nM에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 72: INX-SM-40 및 INX-SM-34는 INX-J2에 비해서 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단)을 약하게 저해한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.01nM에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 73: INX-SM-49 및 INX-SM-47은 INX-J2에 비해서 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단)을 약하게 저해한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC의 경우 24시간에 측정된 사이토카인(IL1-β 및 IL-6) 수준, 처리 대조군은 0.01nM에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 74: INX231A9 및 INX201V는 IL-1β 생산 감소에서 INX234J 및 INX201J보다 향상된 효력을 나타낸다. 접합된 페이로드 농도(1000 내지 0.15nM)와 관련하여 1ng/㎖의 LPS 및 항-VISTA 접합체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.1nM에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 75: 동등한 또는 감소된 DAR에서 INX V 및 INX A23은 IL-1β 생산 감소에서 INX J보다 향상된 효력을 나타낸다. 총 ADC 농도(20 내지 0.003㎍/㎖)와 관련하여 1ng/㎖의 LPS 및 항-VISTA 접합체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.001㎍/㎖에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 76: INX V 접합체는 심지어는 감소된 DAR에서도 IL-1β 영향에서 INX J 접합체보다 향상된 효력을 갖는다. 총 ADC 농도(20 내지 0.003㎍/㎖)와 관련하여 1ng/㎖의 LPS 및 항-VISTA 접합체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.001㎍/㎖에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 77은 예시적인 본 발명의 항체 INX200의 PK 특성을 인간 IgG1과 비교한 실험 결과를 도시한 도면. 도면에 나타난 바와 같은 hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점에서의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군).
도 78은 767-IgG1.3의 PK 특성을 인간 IgG1과 비교한 실험 결과를 도시한 도면. 도면에 나타난 바와 같은 hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점에서의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군).
도 79는 본 발명에 따른 다른 예시적인 항-VISTA 항체, 즉, INX231, INX234, INX237 및 INX240의 PK 값을 비교한 실험 결과를 도시한 도면. 도면에 나타난 바와 같은 hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점에서의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군). 좌측 그래프는 Log10 단위의 y 및 x 축을 나타내는 반면, 우측 그래프의 경우에는 y 축만 Log10으로 나타낸다.
도 80은 본 발명에 따른 예시적인 항-VISTA 항체, 즉, INX901, INX904, INX907 및 INX908의 PK 값을 비교한 실험 결과를 도시한 도면. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군).
도 81은 본 발명에 따른 상이한 ADC, 즉, INX201J, INX231J, INX234J 및 INX240J의 PK 값을 비교한 실험 결과를 도시한 도면. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점에서의 항체의 혈장 농도(SD; n=4/군).
도 82는 코티코스테론 수준에 대한 예시적인 VISTA Ab ADC 접합체 INX201J 및 덱사메타손을 사용한 장기간 처리의 영향을 검정한 실험 결과를 도시한 도면. 이 도는 혈장 코티코스테론 수준의 변화를 도시한다. (SEM, 일원 분산분석, 우측 그래프에서 PBS 대조군의 경우 n=6인 것을 제외하고는 n=8).
도 83은 실시예 12의 실험 1에서 면역화 6일 후 말초 혈액으로부터의 Ag-특이적 CD8 T 세포 수를 도시한 도면. (SEM, 일원 분산분석, n=5).
도 84는 실시예 12의 실험 2에서 면역화 6일 후 말초 혈액으로부터의 Ag-특이적 CD8 T 세포 수를 도시한 도면. 좌측 그래프는 모든 샘플을 포함하는 PBS 대조군을 나타내고, 우측 그래프는 하나의 이상치가 제거된 PBS 대조군을 나타낸다(SEM, 일원 분산분석, 미경험을 제외하고는 n=5; 1개 샘플은 Dex가 0.2㎎/㎏인 군에서 면역화 실패로 제외됨).
도 85는 실시예 12의 실험 3에서 면역화 6일 후 말초 혈액으로부터의 Ag-특이적 CD8 T 세포 수를 도시한 도면. 이 실험에서는 처리 중 기술적 문제로 인해 다수의 샘플을 제외해야 했다: PBS 군 n=3, 2㎎/㎏의 Dex n=2, 0.2㎎/㎏의 Dex n=3, INX201J D-1 n=5, INX201J D-7 n=2, INX231J D-7 n=3, INX234J D-7 n=5, INX240J D-7 n=4(SEM, 일원 분산분석, D=일).
도 86은 실시예 12의 실험 3에서 면역화 6일 후 말초 혈액으로부터의 Ag-특이적 CD8 T 세포 수를 도시한 도면. 기술적인 이유로 PBS, INX231P 및 INX234P 군에서 2개의 샘플이 제외되었고; 다른 모든 군의 경우 n=5(SEM, 일원 분산분석)였다.
도 87은 2개의 실험 일정에서 말초 혈액의 절대 세포수의 변화를 도시한 도면. 14 내지 18일 및 21 내지 25일에 OVA 시험감염(SEM, 일원분산 분석, n=5인 미경험군을 제외하고는 n=10).
도 88은 2개의 실험 일정에서 말초 혈액에서 면역글로불린 생산 변화를 도시한 도면. 14 내지 18일(파트 1) 및 21 내지 25일(파트 2)에 OVA 시험감염(SEM, 일원 분산분석, n=5인 미경험군을 제외하고는 n=10).
도 89A 및 도 89B는 2개의 실험 일정에서 BAL의 면역 침윤 변화를 도시한 도면. 14 내지 18일(파트 1) 및 21 내지 25일(파트 2)의 OVA 시험감염; A) 골수 침윤의 변화; B) 림프구 침윤의 변화(SEM, 일원 분산분석, n=10, 대조군에서 2개의 샘플 제외, Dex 군 및 INX201J 군 둘 다에서 3개의 샘플 제외; 미경험 군의 경우 n=5).
도 90은 2개의 실험 일정에서 BAL의 사이토카인 수준의 변화를 도시한 도면. 14 내지 18일(파트 1) 및 21일 내지 25일(파트 2)에 OVA 시험감염(SEM, 일원 분산분석, n=10, 대조군에서 2개의 샘플을 제외, Dex 군 및 INX201J 군 둘 다에서 3개의 샘플을 제외; 미경험 군의 경우 n=5).
도 91은 연구의 파트 1에 대한 폐 질환 점수를 나타낸 도면. (SEM, 일원 분산분석, 미경험군 n=5를 제외하고는 n=10).
도 92는 비장(좌측) 및 혈액(우측) 세포에서 INX231J 주사 후 FKBP5 전사 활성화를 도시한 도면. INX231J 효과 및 hIgG1siJ(회색)를 5㎎/㎏(0.1㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.v. 주사 20시간 후에 측정하였다. 2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군의 평균에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(n=4 마우스/군, PBS-단독 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 93은 C57Bl/6 마우스에서 INX231P 주사 후 FKBP5 전사 활성화를 도시한 도면. INX231P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.v. 주사 20시간 후에 측정하였다. 2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군의 평균에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(n=4 마우스/군, PBS-단독 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 94는 C57Bl/6 또는 hVISTA KI 마우스에서 INX231P 주사 후 FKBP5 전사 활성화를 나타내는 실험 결과를 포함하는 도면. INX231P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.v. 주사 20시간 후에 측정하였다. 2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군의 평균에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(n=4 마우스/군, PBS-단독 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 95는 생체내 Dex 처리가 LPS에 대한 생체외 단핵구 염증 반응의 감소를 초래한다는 것을 나타내는 실험 결과를 포함하는 도면. 마우스에게 2㎎/㎏ 또는 0.2㎎/㎏의 PBS 또는 Dex를 i.p.로 주사하였다. 2시간 후, 비장 단핵구를 단리시키고 배양물에 넣고 0, 10 및 100ng/㎖에서 LPS로 자극시켰다. 24시간 상청액을 Luminex 32-플렉스에서 분석하였다(n=5 마우스/군이지만 샘플 1, 2, 3 및 4, 5는 2개의 샘플로 풀링됨).
도 96은 INX231P로의 생체내 처리가 LPS에 대한 생체외 단핵구 염증 반응에 영향을 미친다는 것을 나타내는 실험 결과를 포함하는 도면. 마우스에게 세포 단리 2시간, 2일 또는 6일 전에 2㎎/㎏의 PBS 또는 Dex를 i.p. 주사하였고; 세포 단리 1일, 3일 및 7일 전에 10㎎/㎏의 INX231P 및 INX901를 함께 i.v.로 주사하였다. 단리 후, 비장 단핵구를 배양물에 넣고 0 또는 10ng/㎖(10ng/㎖만 표시됨)에서 LPS 자극시켰다. 24시간 상청액을 ELISA에 의해 분석하였다(n=4 마우스/군; PBS 처리군과 비교하는 일원 분산분석은 제1일(D1) 샘플에 대해서만 수행됨).
도 97은 INX231P로의 생체내 처리가 LPS에 대한 생체외 단핵구 염증 반응에 영향을 미친다는 것을 나타내는 실험 결과를 포함하는 도면. 마우스에게 세포 단리 2시간 전에 2㎎/㎏의 PBS 또는 Dex를 i.p.로 주사하였고; 세포 단리 24시간 전에 10㎎/㎏의 INX231P 및 INX901를 i.v.로 주사하였다. 비장 단핵구를 배양물에 넣고 10 및 100ng/㎖에서 LPS로 자극시켰다. 24시간 상청액을 ELISA로 분석하였다(n=4 마우스/군; 각각의 LPS 용량에 대해 PBS 처리군과 비교하여 보통 일원 분산분석).
도 98은 B 세포 또는 단핵구에서 FKBP5 전사 활성화를 도시한 도면. 세포를 20nM의 유리 J 페이로드 또는 동일 몰량의 INX201(INX201J) 또는 아이소타입 대조군(huIgG1si J)에 접합된 페이로드로 처리하였다. 전사 수준은 기술적 반복물로 분석하였다.
도 99는 단핵구에서 FKBP5 전사 활성화를 도시한 도면. 세포를 증가하는 양의 INX201J[0 내지 100nM 페이로드])로 처리하였다. 0 페이로드는 100nM 페이로드 INX201J 용량에서와 동일한 양의 항체에서 비접합 INX201 항체 단독을 사용한 치료를 나타낸다. 전사 수준은 기술적 반복물로 분석하였다.
도 100은 20nM의 INX-SM-3(유리 페이로드) 또는 동등한 몰 페이로드의 INX231P(접합된 페이로드)로 처리된 2명의 공여자로부터의 Treg에서 FKBP 유도를 도시한 도면. 샘플을 단일물로서 생성시키고 분석하였다. 단리된 Treg 순도는 유세포 분석법으로 평가했을 때 75% 이상이었다.
도 101은 20nM 페이로드 당량의 huIgG1si J에 비해 20nM 페이로드 당량의 INX201J로 처리된 1명의 공여자로부터의 Treg에서 FKBP5 유도를 도시한 도면. 샘플을 기술적 반복물로 분석하였다. 단리된 Treg 순도는 유세포 분석법으로 평가했을 때 75% 이상이었다.
도 102는 보고된 "Transcripts Per Million"(TPM)을 기반으로 하는 VISTA 및 다른 ADC 표적(CD40, TNFα, CD74, CD163(PRLR))에 대한 상이한 세포에 의한 보고된 공통 RNA 발현 수준을 요약하는데 여기서 TPM<10은 (최소/발현 없음 "-")을 나타내고; TPM 10-100은 (낮은/중간 발현 "+")을 나타내고; 및 TPM>100은 (높은 발현 "++")을 나타낸다.
도 103A 내지 도 103E는 확인된 세포 집단에서 VISTA, CD74, CD163 및 mTNFα에 대한 항원 밀도의 정량화를 요약한 도면. A) 단핵구는 VISTA, CD74 및 CD163을 발현하고; B) B 세포는 CD74를 발현하고; C) CD4+ T 세포, D) CD4+ Treg 및 E) CD8+ T 세포는 VISTA를 발현한다(평균±SD, n=5 공여자).
도 104A 내지 도 104F는 인간 혈액에서 확인된 세포 집단에서 VISTA, CD74, CD163 및 mTNFα에 대한 항원 밀도의 정량화를 도시한 도면. A) 단핵구는 VISTA, CD74 및 CD163을 발현하고; B) B 세포는 CD74를 발현하고; C) 호중구는 VISTA, D) CD4+는 T 세포, E) CD4+ Treg를 발현하고, F) CD8+ T 세포는 VISTA를 발현한다(평균±SD, n=3).
도 105는 뼈에서 스테로이드 반응성 유전자는 유리 Dex에 의해 상당히 영향을 받는 반면 VISTA ADC(INX231P)는 제한된 영향을 가짐을 나타내는 데이터를 포함하는 도면. 도면에서 Fkpb5는 좌측에 나타내고, RANKL은 중간 좌측에 나타내고, ddit4는 중간 우측에 나타내고, Fam107a는 가장 우측에 나타낸다. 이 실험에서 INX231P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.p. 주사 20시간 후에 측정하였다. 2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하였고 정규화 계수치로서 제시하였다(n=5 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석).
도 106은 시노몰거스 원숭이의 말초 혈액 세포에서 스테로이드 반응성 유전자 발현에 대한 비히클 대조군의 효과와 VISTA ADC(INX234P)의 효과를 비교한 실험 결과를 포함하는 도면. 이들 실험에서 INX234P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.v. 투여 24시간 후에 측정하였다. 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하였고 정규화 계수치로서 제시하였다 (n=2 비히클, n=6 ADC/군; 비히클 대비 언페어드 t 검정).
도 107은 특정 비-표적 세포에 대한 VISTA ADC(INX234P)의 효과를 평가하는 실험 결과를 포함하는 도면. 데이터로부터 나타난 바와 같이 INX234P는 백색 지방, 뇌 및 뼈에서 FKBP5에 대한 영향이 제한적이거나 전혀 없었다. 이러한 실험에서 INX234P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달) 또는 D8(비히클)의 1회 단일 i.v. 투여 24시간 후에 측정하였다. 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하였고 정규화 계수치로 제시하였다(n=2 비히클, 조직의 경우 n=3 ADC/군, 비히클 대비 언페어드 t 검정 - INX234P는 유의하지 않았음).
도 108은 스테로이드 반응성 유전자에 대한 ADC의 효과를 평가한 실험 결과를 포함하는 도면. 데이터는 백색 지방 조직에서 24시간에 약간의 잔류하는 Dex 효과를 나타내고; ADC 유전자 발현은 비히클 대조군과 유사하다. 유리 Dex(2㎎/㎏) 및 INX234P(10㎎/㎏ - 0.2㎎/㎏의 페이로드 전달) 효과를 1회 단일 i.v. 투여 24시간 후 또는 제8일(비히클)에 측정하였다. 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하였고 정규화 계수치로 제시하였다(n=2 비히클, n=2 덱사메타손, 조직의 경우 n=3 ADC/군, 비히클 대비 언페어드 t 검정).
도 109A 내지 도 109D: INX234P 처리된 원숭이에서 24시간에 활성 페이로드(INX-SM-3)의 높은 축적이 VISTA 발현 조직과 상관관계가 있음을 나타낸 실험 결과를 포함함. 패널 (A)는 INX234P(10㎎/㎏ - 0.2㎎/㎏의 페이로드) 또는 유리 덱사메타손(2㎎/㎏)의 1회 단일 i.v. 투여 24시간 후에 측정된, 방출된 페이로드(INX-SM-3)를 나타내고, 패널 (B)는 시스테인 변형된 링커/페이로드(INXP-cys)를 나타내고, 패널 (C)는 덱사메타손을 나타낸다. 패널 (D)는 제8일에, 방출된 페이로드(INX-SM-3)가 INX234P 처리된 원숭이의 VISTA 발현 조직에서 존재함을 나타낸다. 축적된 화합물 수준을 LC-MS/MS로 측정하고 조직 g당 화합물 ng로 제시하였다(제8일에 골수를 제외하고 INX234P의 경우 n=3 ADC/군, 제한된 샘플로 인해서 n=2, n=2 Dex)(Duod=십이지장).
도 110은 활성화된 면역 세포(단핵구)에서 VISTA와 다른 단백질(특히 다른 스테로이드 ADC로 표적화된 적이 있는 단백질)의 발현을 비교한 도면. 실험에서 건강한 공여자로부터의 인간 전혈을 LPS로 활성화시켰다(U 바닥 96웰 플레이트에서 웰당 100㎕; 1㎍/㎖ LPS; 37℃에서 2시간). 활성화된 면역 세포(단핵구)에서의 세포 표면 단백질 발현 수준을 유세포 분석법으로 평가하였다. 이들 실험에서 염색을 위해서 사용된 직접 접합된 항체는 항-VISTA 클론 GG8, CD163 클론 GHI/61, CD74 클론 332516 및 mTNFα 클론 mAb11을 포함하였다. 제시된 바와 같이, VISTA 발현 패턴은 활성화되지 않은 세포에서 관찰된 발현과 유사하였지만 다른 단백질 발현은 낮았다. 구체적으로, mTNFα MFI는 FMO(Fluorescence Minus One) 대조군보다 약간 더 높았다.
도 111은 Cyno에서 본 발명에 따른 ADC, 즉, INX234P의 PK를 평가한 실험 결과를 포함하는 도면. INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였다. 동물을 지정된 시점에 채혈하였고, 혈청을 단리시키고, 항체 수준을 측정하였다(n=4 시노몰거스 원숭이, SEM).
도 112는 INX234P의 1회 용량에 의해 유도된 혈액학적 변화를 도시한 도면. 이들 실험에서 INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였다. 표시된 시점에서 동물을 채혈하고, 혈액 도말을 실시하고, 상이한 세포 집단을 계수하였다(n=4 시노몰거스 원숭이, SEM)(WBC= 백혈구, NEUT= 호중구, LYMPH= 림프구, MONO= 단핵구, EOS= 호산구, BASO = 호염기구, RBC= 적혈구, Retic= 망상적혈구).
도 113은 개별 동물에서 INX234P의 1회 용량에 의해 유도된 코티솔 변화를 검출한 실험 결과를 포함하는 도면. 이들 실험에서 INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였다. 표시된 시점에 동물을 채혈하고 혈청을 단리시키고 코티솔 수준을 ELISA로 측정하였다(n=4 시노몰거스 원숭이).
도 114는 PBL에서 링커 페이로드(P-cys) 및 방출된 페이로드(SM3)의 PK를 검출하는 실험 결과를 포함하는 도면. INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였다. 표시된 시점에 동물을 채혈하고, PBL을 단리시키고, MS로 분석하였다(n=4 시노몰거스 원숭이, SEM).
도 115는 혈청에서 링커 페이로드(P-cys) 및 방출된 페이로드(SM3)의 PK를 검출한 PK 검정 결과를 포함하는 도면. INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였다. 표시된 시점에 동물을 채혈하고, 혈청을 단리시키고, MS로 분석하였다(n=4 시노몰거스 원숭이, SEM).
도 116은 PBL에서 스테로이드 반응성 유전자가 INX234P에 의해서 상향조절된다는 결과를 포함하는 도면. 이들 실험에서 INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였다. 표시된 시점에서 동물을 채혈하고, PBL을 단리시키고, RNA를 단리시키고, 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하고 채혈 전에 대한 배수 변화로 제시하였다(n=4 시노몰거스 원숭이).
도 117은 4시간까지 인간 PBMC에서 FKBP5 유도에 대한 INX201J, INX231P 및 INX231V의 효과를 나타낸 실험을 포함하는 도면. 실험에서 FKBP5 유도를 GAPDH에 대해서 RT PCR에 의해서 측정된 바와 같이 4시간에 1μM의 접합된 페이로드와 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에서 검출하였다; 여기서 n=1 공여자.
도 118A 내지 도 118O는 화학식 I, II 및 III의 예시적인 글루코코티코이드 효능제 화합물 및 글루코코티코이드 효능제-링커 화합물의 전매 및 화학 명칭 및 구조를 포함하는 도면.
도 119는 INX234P 처리가 인간 PBMC 확장을 감소시킨다는 것을 나타낸 GVHD 실험 결과를 포함하는 도면. 이 실험에서 말초 혈액을 제21일에 수집하고 인간 CD45 양성 세포를 유세포 분석법으로 정량화하였다. 마우스에게 제0일부터 제34일까지 주 1회 투여하였다(SEM; n=8/군)(10㎎/㎏ 투여, INX234P는 0.2㎎/㎏의 INX P 링커 페이로드 제공).
도 120은 INX234P 처리가 마우스 생존을 개선시킨다는 것을 나타내는 GVHD 실험 결과를 포함하는 도면. 마우스에게 제0일부터 제34일까지 주 1회 10㎎/㎏(또는 0.2㎎/㎏의 INX P 링커 페이로드)를 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=8/군).
도 121은 INX234V/P 처리가 인간 T 세포 확장을 감소시킨다는 것을 나타낸 GVHD 실험을 포함하는 도면. 전달 후 제15일에 시작하여 매주 말초 혈액을 수집하고 인간 CD45+ CD3+ 양성 세포를 유세포 분석법으로 정량화하였다. 마우스에게 제0일부터 주 1회 투여하였다(SEM; n=8/군)(10㎎/㎏ 투여 시, INX234V 및 INX234P는 각각 0.2㎎/㎏의 INX V 또는 INX P 링커 페이로드를 제공하였음).
도 122는 INX234V/P 처리가 마우스 생존을 개선시킨다는 것을 나타내는 GVHD 모델에서 얻은 결과를 포함하는 도면. 마우스에게 제0일에 시작하여 주 1회 10㎎/㎏(또는 0.2㎎/㎏의 INX V 또는 INX P 링커 페이로드)을 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이다.
도 123은 INX234P 처리가 마우스 생존을 개선시킨다는 것을 나타내는 대장염 모델에서 얻어진 결과를 포함하는 도면. 이 실험에서 마우스에게 제0일부터 제61일까지 INX234P 및 INX234 둘 다를 주 1회 10㎎/㎏(및 해당하는 경우 0.2㎎/㎏의 INX P 링커 페이로드)으로 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=9인 INX234P 군을 제외하고 n=10/군).
도 124는 고용량의 덱사메타손 처리가 마우스 생존을 개선시킨다는 것을 나타내는 대장염 모델에서 얻은 결과를 포함하는 도면. 실험에서 마우스에게 제0일부터 제61일까지 주 1회 2(고용량) 또는 0.2(저용량)㎎/㎏을 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=10/군).
도 125는 INX234V 처리가 마우스 생존을 개선시킨다는 것을 나타내는 대장염 모델에서 얻어진 결과를 포함하는 도면. 이 실험에서 마우스에게 제21일부터 제80일까지 INX234V 및 INX234 둘 다를 주 1회 10㎎/㎏(및 해당하는 경우 0.2㎎/㎏의 INX V 링커 페이로드)으로 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=5인 INX234 처리군을 제외하고 n=10/군).
도 126은 저용량의 덱사메타손 처리가 마우스 생존을 개선시킨다는 것을 나타내는 대장염 모델에서 얻은 결과를 포함하는 도면. 실험에서 마우스에게 제21일부터 제80일까지 주 1회 2(고용량) 또는 0.2(저용량)㎎/㎏을 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=10/군).
도 127은 INX234V 처리가 T 세포 확장 및 활성화를 방지한다는 것을 나타내는 대장염 모델에서 얻어진 결과를 포함하는 도면. 실험에서 마우스에게 제21일부터 제80일까지 주 1회 INX234V 또는 INX234의 경우 10㎎/㎏(및 해당하는 경우 0.2㎎/㎏의 V 페이로드) 및 Dex의 경우 2(고용량) 또는 0.2(저용량)㎎/㎏의 Dex를 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 좌측에 INX234V 및 INX234 대 PBS에 대한 혈액으로부터의 미경험 T 세포 수를, 우측에는 고용량 및 저용량의 Dex 대 PBS에 대한 혈액으로부터의 미경험 T 세포 수를 나타내고; 좌측 및 우측 하단 그래프는 동일한 군에 대한 CD45RB+ CD4+ T 세포의 빈도를 나타내고; 위의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=5인 INX234 치료군을 제외하고 n=10/군).
본 명세서에는 신규한 글루코코티코스테로이드, 글루코코티코스테로이드-링커 및 면역 세포 상에서 발현되는 항원, 전형적으로 인간 면역 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)가 제공된다. 일부 실시형태에서 ADC는 항-인간 VISTA( T 세포 활성화의 V -영역 면역글로불린-함유 억제인자(1): V -region I mmunoglobulin-containing S uppressor of T cell A ctivation(1)) 항체 또는 항-VISTA 항원-결합 항체 단편, 예를 들어, 짧은 혈청 반감기(인간 VISTA 넉-인 설치류에서 약 24 내지 27시간 이하)를 갖는 것을 포함한다. 예시적인 실시형태에서 본 발명의 ADC는 신속하게 작용이 개시되고 연장된 기간 동안 효력이 있는데, 그 이유는 이들이 다량으로 면역 세포에 의해서 매우 효과적으로 내재화되고 이곳에서 이들이 절단되어 다량의 활성 스테로이드 페이로드를 방출하기 때문이다. 본 발명은 또한 자가면역, 알레르기 및 염증 병태의 치료를 위한 이러한 ADC 및 신규한 스테로이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 ADC를 사용하여 면역 세포, 예컨대, 단핵구, 호중구, T 세포, Treg, 호산구, 대식세포, 수지상 세포, NK 세포 등, 및 특히 골수 세포를 표적으로 하는 이들 항-염증제를 선택적으로 전달하여, 그렇지 않았으면 스테로이드 화합물에 의해서 비-표적 세포에 발생하였을 잠재적인 독성을 감소시킴으로써 글루코코티코이드의 유해 부작용을 감소시키고/시키거나 이의 효능을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
구체적으로 본 명세서에는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편, 전형적으로 항체 또는 항체 단편이 생리 조건(pH 약 7.5)에서 매우 짧은 혈청 반감기, 일반적으로 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 72시간, 1 내지 32시간, 1 내지 16시간, 1 내지 8시간, 1 내지 4시간 또는 1 내지 2시간±.5시간 또는 영장류(시노몰거스 마카크)에서 생리 조건(약 pH 7.5)에서 약 3.5, 3, 2.5 또는 2.3일±.5일의 혈청 반감기를 보유하는 것, 및 선택적으로 링커, 예를 들어, 특정 조건 하에서 선택적으로 절단 가능할 수 있는 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커, 예를 들어, 에스터라제 절단 가능한 다이펩타이드 링커를 통해 부착되고, 선택적으로 헤테로이작용성 또는 헤테로삼작용성 기를 통해 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 본 명세서에 개시된 화학식 (I), (II) 또는 (III) 중 임의의 하나의 글루코코티코이드 수용체 효능제를 포함하는 ADC가 제공되며, 이러한 ADC는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 이러한 글루코코티코이드 수용체 효능제를 표적 면역 세포, 예를 들어, 단핵구, T 세포, 호중구, Treg, CD8 T 세포, CD4T 세포, 호산구, 수지상 세포, NK 세포, 대식세포 또는 골수 세포에 전달하고 그 내부에서 글루코코티코이드 수용체 효능제의 기능성 내재화를 초래하는데, 여기서 이것은 유해 부작용, 예컨대, 비표적 세포에 대한 독성을 감소시키거나 실질적으로 감소시키지 않으면서 염증에 대한 바람직한 저해 효과를 도출한다. 추가로 이러한 ADC의 제조 방법 및 특히 자가면역, 알레르기 및 염증 병태, 예컨대, 이전에 확인된 것의 치료에 사용하기 위한 이의 사용 방법이 제공된다.
보다 구체적으로 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 글루코코티코이드 효능제 화합물이 제공된다:
화학식 (I)
X는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되고;
Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되며;
Y는 CHR1, O, S 및 NR1로부터 선택되고;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아니며;
X에 대한 G의 연결부는 선택적으로 C1-3 알킬 및 에틸렌 옥사이드로부터 선택될 수 있고, 이들 각각은 N, S 및 O으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬로 추가로 치환되고;
Z에 대한 X의 연결부는 X 및 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있고;
치환체 NR1R2는 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있으며;
R1은 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택되되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
R1이 H인 경우, R2는 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택될 수 있되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
R1이 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬 또는 헤테로아릴인 경우, R2는 하기로부터 선택된 작용기일 수 있고:
[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J,
(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-V-J,
(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J, 및
[V]k-(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-J,
상기 식에서, m = 1-6이고, k = 0-1이며, W의 각각의 순열은 독립적으로 H, R3에서 종결되는 분지형 알킬 쇄인 [(CH2)nR3](식에서, n = 1-4임) 및 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기로부터 선택될 수 있고;
R3은 H, 메틸, 에틸, 아이소프로필, OH, O-알킬, NH2, NH-알킬, N-다이알킬, SH, S-알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴 치환체는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택될 수 있고;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,
로부터 선택된 반응성 기이고,
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이며;
R5는 -CH2OH, -CH2SH, -CH2Cl, -SCH2Cl, -SCH2F, -SCH2CF3, 하이드록시, -OCH2CN, -OCH2Cl, -OCH2F, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH2CN, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 수소 및 C1-10 알킬로부터 독립적으로 선택되며;
Q는 H, , C(O)R8(식 중, R8은 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬임) 또는 (C=O)NR4CHnNR4(C=O)OCH2-(V)n-J(식 중, n=1-4이고 R4 =H, 알킬 또는 분지형 알킬임) 또는 P(O)OR4일 수 있고;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되고;
달리 명시되지 않는 한, 모든 가능한 입체이성질체가 청구된다.
추가로 하기 화학식 (II)의 구조를 보유하는 글루코코티코이드 효능제 화합물이 제공된다:
화학식 (II)
상기 식에서,
Y는 CH2 및 O로부터 선택되며;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
L은 H 및 F로부터 선택되고;
R5는 -CH2OH, -SCH2F 및 로부터 선택되며;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되고;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,
로부터 선택된 반응성 기이고,
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이다.
또한 하기 화학식 (III)의 구조를 보유하는 글루코코티코이드 효능제 화합물이 제공된다:
화학식 (III)
상기 식에서,
Y는 CH2 및 O로부터 선택되며;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
L은 H 및 F로부터 선택되고;
R5는 -CH2OH, -SCH2F 및 로부터 선택되며;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되고;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,
로부터 선택된 반응성 기이며;
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이다.
또한 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 링커에 부착된 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 구조를 갖는 글루코코티코이드 효능제를 포함하는 글루코코티코이드 효능제-링커 화합물이 제공된다.
추가로 결과적으로 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 링커에 부착된, 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 구조를 갖는 글루코코티코이드 효능제에 부착된, 면역 세포 항원, 예를 들어, VISTA에 결합하는 항체를 포함하는 ADC가 제공된다.
추가로 상기 글루코코티코이드 효능제, 글루코코티코이드 효능제-링커 및 이를 함유하는 ADC를 포함하는 조성물 및 의약이 제공된다.
추가로 특히 염증, 알레르기 및 자가면역 병태를 치료하기 위한, 이러한 글루코코티코이드 효능제, 글루코코티코이드 효능제-링커 및 이를 함유하는 ADC의 치료 및 예방 용도가 제공된다.
달리 정의되지 않는 한 일반적으로 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명 및 본 발명의 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본 명세서에 기재되어 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 제한이도록 의도되지 않는다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험 절차 및 기술은 관련 기술 분야에서 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술이 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형 및 전달 및 환자의 치료를 위해서 사용될 수 있다.
정의
본 개시내용의 이해를 용이하게 하기 위해서, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의되어 있다.
본 명세서의 설명 및 하기 청구범위 전체에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현의 의미는 그 문맥이 달리 명백하게 제시되지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
본 개시내용에서, 용어 "글루코코티코스테로이드" 또는 "스테로이드"는 글루코코티코이드 수용체와 상호작용하는 자연 발생 또는 합성 스테로이드 호르몬을 지칭한다. 비제한적인 예시적인 글루코코티코스테로이드는 특히 WO 2009/069032, US20180126000, WO05/028495에 기재된 것을 포함하며, 바람직하게는 본 명세서에 개시된 화학식 I, II 또는 III의 신규한 글루코코티코이드 효능제 및 글루코코티코이드 효능제-링커 및 이를 함유하는 ADC를 지칭한다. 공지된 글루코코티코스테로이드의 비제한적인 예를 하기를 포함한다:
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다른 공지된 글루코코티코스테로이드는 WO 2009/069032에 기재되어 있다. 글루코코티코스테로이드의 구체적인 예는 16-알파 하이드록시프레드니솔론, 덱사메타손, 다이플루오라손, 플루메타손, 플루니솔라이드, 플루오시놀론 아세토나이드, 플루티카손 프로피오네이트, 시클레소나이드, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니솔론, 모메타손, 트라이암시놀론 아세토나이드 및 화학식 I, II 또는 III의 신규한 글루코코티코이드 효능제 및 글루코코티코이드 효능제-링커 및 이를 함유하는 ADC를 포함한다.
"글루코코티코스테로이드 유도체"는 "글루코코티코스테로이드 유도체"를 또 다른 모이어티, 예를 들어, 링커 및/또는 항체 또는 항체 단편에 부착하는 것을 용이하게 하기 위해서 하나 이상의 원자 또는 작용기의 부가 또는 제거에 의해 유도된 화합물이다. 일반적으로, 이러한 부가 또는 제거는 "글루코코티코스테로이드 유도체"의 활성, 즉 면역 세포에 의한 내재화 시 항-염증 활성을 유도하는 능력을 배제하지 않을 것이다. "글루코코티코스테로이드 유도체"는 구체적으로 "글루코코티코스테로이드의 라디칼" 또는 "글루코코티코스테로이드 라디칼"을 포함한다".
"글루코코티코스테로이드의 라디칼" 또는 "글루코코티코스테로이드 라디칼"은 모 글루코코티코스테로이드의 다른 모이어티, 전형적으로 링커에 대한 부착을 용이하게 하기 위해 모 글루코코티코스테로이드로부터 하나 이상의 원자, 즉 수소 원자를 제거함으로써 생성된다. 예를 들어, 수소 원자가 모 글루코코티코스테로이드의 임의의 적합한 -NH2　기로부터 제거될 수 있고; 수소 원자가 모 글루코코티코스테로이드의 임의의 적합한 -OH 기로부터 제거될 수 있고, 수소 원자가 임의의 적합한 -SH 기로부터 제거될 수 있고; 수소 원자가 임의의 적합한 -N(H)- 기로부터 제거될 수 있고; 수소 원자가 모 글루코코티코스테로이드의 임의의 적합한 -CH3, -CH2- 또는 -CH= 기로부터 제거될 수 있다.
본 개시내용에서 용어 "헤테로이작용기" 또는 용어 "헤테로삼작용기"는 링커 및 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 연결하기 위해 선택적으로 사용될 수 있는 화학 모이어티(본 명세서에 개시된 ADC에 대한 일반식에서 ("Q"))를 지칭한다. 헤테로이- 및 삼-작용기는 화학 모이어티의 단부 중 하나에 상이한 반응성 기를 갖는 것을 특징으로 한다. 비제한적인 예시적인 헤테로이작용기는 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 공개 제20180126000호에 개시되어 있고, 이것은 본 출원의 예시적인 실시형태 부분 및 실시예, 예를 들어 실시예 3 및 도 118A 내지 도 118O의 화합물에 개시된 ADC 접합체에 추가로 예시된다.
헤테로이- 및 삼-작용기는 구체적으로 단백질 접합체 및 항체 약물 접합체(ADC)의 제조에 대해서 당업계에 널리 공지되어 있다. 이들 모이어티는 화학 모이어티의 단부 중 하나에 상이한 반응성 기를 갖는 것을 특징으로 한다. 비제한적인 예시적인 헤테로이작용기는 하기를 포함한다:
.
예시적인 헤테로삼작용성기는 하기이다:
.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 및 "항체들"는 기술 용어이고 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 갖는 분자를 지칭한다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해서 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질 또는 상기의 조합과 같은 표적을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 온전한 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질 및 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 면역글로불린의 임의의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이들의 하위부류(아이소타입)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)를 가질 수 있으며, 이들은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초한다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이한 널리 공지된 소단위 구조 및 3차원 구성을 갖는다. 항체는 네이키드이거나 독소, 방사성동위원소 등과 같은 다른 분자에 접합될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 이중특이적 및 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭한다. "항원-결합 단편"은 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 지칭한다. 항원-결합 단편은 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 함유할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체 및 단일 쇄 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. "항원-결합 단편"은 이중특이적 또는 다중특이적 항원-결합 단편일 수 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원, 예컨대, VISTA의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 항체이다. 일부 실시형태에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해한다. 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 100%까지 감소될 수 있다.
"촉진" 항체 또는 "향상" 항체 "효능제" 항체는 그것이 결합하는 항원, 예컨대, VISTA의 생물학적 활성을 향상시키거나 증가시키는 항체이다. 일부 실시형태에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해한다. 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 100%까지 감소될 수 있다.
용어 "항-VISTA 항체" 또는 "VISTA에 결합하는 항체"는 항체가 VISTA 발현 면역 세포를 표적화하는데 유용한 충분한 친화도로 VISTA, 일반적으로 인간 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 비관련, 비-VISTA 단백질에 대한 항-VISTA 항체의 결합 정도는 예를 들어, 방사면역검정(RIA)에 의해 측정되는 경우 VISTA에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 수 있다. 특정 실시양태에서, VISTA에 결합하는 항체는 1μM 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하 또는 0.1nM 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 본 발명의 ADC에 포함된 예시적인 항-VISTA 항체 및 단편은 VSTB94 또는 VSTB49-116에서와 동일한 CDR 및/또는 동일한 가변 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 것이며, 즉 각각 도 8, 10 및 도 12에 도시된 서열을 갖는다.
"단클론성" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 매우 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 또는 항원 결합 단편 집단을 지칭한다. 이것은 상이한 항원 결정기에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체와 대조적이다. 용어 "단클론성" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 온전한 항체 및 전장 단클론성 항체 둘 다뿐만 아니라 항체 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(scFv) 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 또한, "단클론성" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 수의 방식으로 만들어진 이러한 항체 및 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
용어 "인간화" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특정 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린 또는 최소 비-인간(예를 들어, 뮤린) 서열을 함유하는 이의 단편인 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체 또는 항원-결합 단편의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력("CDR 그래프팅")을 갖는 비-인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 또는 단편 내의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 특이성, 친화도 및/또는 능력을 리파인하고 최적화하기 위해서 Fv 프레임워크 영역 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서의 추기 잔기의 치환에 의해서 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부를 함유하는 적어도 하나, 전형적으로 2개 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이지만, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는 데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호; 문헌[Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), 및 Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)]에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, "인간화 항체"는 재표면화된(resurfaced) 항체이다.
항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄의 CDR은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기초한 접근법(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). 또한, CDR을 결정하기 위해 당업계에서 이 두 접근법의 조합이 때때로 사용된다.
Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기(대략 경쇄의 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113)를 언급하는 경우 사용된다(예를 들어, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 넘버링 시스템은 Kabat 넘버링 시스템이다.
Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에서 항체의 집합의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해서 사용되는 넘버링 시스템을 지칭한다. 이 넘버링 시스템을 사용하여 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 삽입에 해당하는 더 적거나 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 항체의 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 대신에 Chothia는 구조 루프의 위치를 지칭한단(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링되는 경우 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변동된다(이는 카바트 넘버링 시스템이 H35A 및 H35B에 삽입을 위치시키기 때문이며; 35A 또는 35B 어느 것도 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 종료하고; 단지 35A만이 존재하는 경우, 루프는 33에서 종료하고; 35A 및 35B 둘 모두가 존재하는 경우, 루프는 34에서 종료한다). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
특정 양태에서, 항체의 CDR은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있으며, 이는 면역글로불린의 구조 루프의 위치를 지칭한다(예를 들어, 문헌[Chothia C & Lesk A M, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82]; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조). 전형적으로, Kabat 넘버링 관례를 사용하는 경우, Chothia CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33, 또는 34에 존재하고, Chothia CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52 내지 56에 존재하고, Chothia CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95 내지 102에 존재하고, 한편, Chothia CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, Chothia CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하며, Chothia CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링되는 경우 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변동된다(이는 카바트 넘버링 시스템이 H35A 및 H35B에 삽입을 위치시키기 때문이며; 35A 또는 35B 어느 것도 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 종료하고; 단지 35A만이 존재하는 경우, 루프는 33에서 종료하고; 35A 및 35B 둘 모두가 존재하는 경우, 루프는 34에서 종료한다).
특정 양태에서, 항체의 CDR은 문헌[Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 및 Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212]에 기재된 바와 같은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. IMGT 넘버링 시스템에 따르면, VH-CDR1은 위치 26 내지 35에 존재하고, VH-CDR2는 위치 51 내지 57에 존재하고, VH-CDR3은 위치 93 내지 102에 존재하고, VL-CDR1은 위치 27 내지 32에 존재하고, VL-CDR2는 위치 50 내지 52에 존재하며, VL-CDR3은 위치 89 내지 97에 존재한다.
특정 양태에서, 항체의 CDR은 문헌[MacCallum R M et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745]에 따라 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌[Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)]을 참조한다.
특정 양태에서, 항체의 CDR은 AbM 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있고, 이는 AbM 초가변 영역을 지칭하고, Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충안을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular 군, Inc.)에 의해 사용된다.
항체의 "불변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다.
용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체, 또는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 기법을 이용함으로써 제 된, 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 가진 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 온전한 또는 전장 항체, 이의 단편 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체, 예를 들어, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종들로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 가진 포유동물의 한 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 반면, 불변 영역은 그 종에서 면역 반응을 이끌어내는 것을 피하기 위해 또 다른 종(통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며 특정 항체를 인식하고 이에 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부위를 나타낸다. 항원이 폴리펩타이드인 경우, 에피토프는 인접 아미노산 및 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 비인접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 보존되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간 입체배좌 내에 적어도 3개, 통상적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 예시적인 항-VISTA 항체가 결합될 수 있는 VISTA 상의 바람직한 에피토프는 도 10에서 확인된다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체) 및 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 제시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본 명세서에 기재된 방법을 포함하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은-친화도 항체는 일반적으로 항원과 더 빠르게 결합하고 오랫동안 결합을 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이들 중 임의의 것이 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 표면 플라스몬 공명(BIAcore), ELISA, Kinexa Biosensor, 섬광 근접 검정, ORIGEN 면역검정(IGEN), 형광 소광, 형광 전달 및/또는 효모 디스플레이를 포함한다. 결합 친화도는 또한 적합한 생물검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 본 출원에서 예시적인 ADC에 포함된 예시적인 항-VISTA 항체의 Kd는 ProteOn 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법에 의해서 결정될 수 있다.
"또는 더 양호한"은 본 명세서에 사용되는 경우 분자와 이의 결합 파트너 간의 더 강한 결합을 지칭하는 결합 친화도를 지칭한다. "또는 더 양호한"은 본 명세서에 사용되는 경우, 더 작은 수치 Kd 값을 나타내면서, 더 강한 결합을 지칭한다. 예를 들어, "0.6nM 또는 더 양호한"의 항원에 대한 친화도를 갖는 항체의 경우, 항원에 대한 항체의 친화도는 0.6nM 미만, 즉 0.59nM, 0.58nM, 0.57nM 등 또는 0.6nM 미만의 임의의 값이다.
"특이적으로 결합한다"는 것은 일반적으로 항체가 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고 그 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이에 약간의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는 그것이 무작위의 관련되지 않은 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 용어 "특이성"은 본 명세서에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 한정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 말할 수 있다.
"우선적으로 결합한다"는 것은 항체가 관련되거나, 유사하거나, 동종이거나, 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 에피토프에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련 에피토프와 교차 반응할 수 있더라도 관련된 에피토프보다 그 에피토프에 더 많이 결합할 것이다.
만약 항체가 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 어느 정도 차단하는 정도로 상기 에피토프에 우선적으로 결합하면, 상기 항체는 제시된 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 "경쟁적으로 저해한다"고 한다. 경쟁적 저해는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 경쟁 ELISA 분석에 의해 측정될 수 있다. 항체는 제시된 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해한다고 할 수 있다.
"아이소타입"은 본 명세서에서 중쇄 불변 영역 유전자에 의해서 암호화된 항체 클래스(예를 들어, IgM, IgG1, IgG3, IgG3 또는 IgG4)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "K-assoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 넓게 지칭하고, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "Kdiss" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻고, 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 지칭하도록 의도된다. 항체의 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법, 예컨대, 플라스몬 공명(BIAcore®), ELISA 및 KINEXA를 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명을 사용하는 것, 바람직하게는 바이오센서 시스템을 사용하는 것, 예컨대, BIAcore® 시스템 또는 ELISA에 의해서이다. 전형적으로, 이들 방법은 25℃또는 37℃에서 달성된다. 치료 용도를 위한 항체는 일반적으로 표면 플라스몬 공명에 의해서 결정되는 경우 50nM 이하, 또는 보다 전형적으로는 25℃ 또는 37℃에서 1nM 이하의 KD를 보유할 것이다.
본 명세서에서 어구 "Kd"는 항체와 이의 항원 사이의, Koff/Kon의 계산된 비율인 평형 해리 상수인 Kd를 지칭한다. 회합 상수(Kon)는 항체가 이의 표적에 얼마나 빨리 결합하는 지를 특징규명하기 위해서 사용된다. 본 명세서에서 항체 Kd는 Proteon 장비를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 결정되었다.
본 명세서에서 어구 "PK"는 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편 또는 항체 약물 접합체(ADC), 바람직하게는 항-VISTA 또는 항체 단편(즉, 생리 pH에서 VISTA 발현 세포에 결합하는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것) 및 항-염증제(AI)(AI는 효능(항-염증 활성)을 위해서 세포 내재화가 필요한 소분자임) 및 전형적으로 스테로이드 및 보다 전형적으로는 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 효능제의 양의 절반이 혈청에서 말초 순환계에 남아있는 기간(시간) 또는 생체내 반감기를 지칭한다. PK는항체 또는 항체 단편 또는 ADC가 투여된 대상체, 예를 들어, 인간 VISTA 넉-인 설치류 또는 영장류(예를 들어, 인간 또는 시노몰거스 마카크)에서 생체내에서 결정될 수 있다. 하기에 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 ADC에 포함된 항-VISTA 항체는 전형적으로 짧은 PK, 즉, 일반적으로 시노몰거스 마카크에서 대략 2.3±.7일 및 전형적으로 최대 약 2.5일 및 보다 전형적으로 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 단지 1일, 수 시간 또는 그 미만을 포함할 것이다.
본 명세서에서 어구 "PD"는 본 발명에 따른 항체 또는 항체 약물 접합체(ADC), 예를 들어, 생리 pH에서 VISTA 발현 세포에 결합하는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것 및 항-염증제(AI)(AI는 효능(항-염증 활성)을 위해서 세포 내재화가 필요한 소분자임) 및 전형적으로 스테로이드 및 보다 전형적으로 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 효능제를 포함하는 것의 투여량이 표적 세포 내로의 내재화 시에 효능(항-염증 활성)을 발휘하는 기간(시간)을 지칭한다. 스테로이드, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 효능제 또는 글루코코티코이드 효능제-링커 및 이를 함유하는 ADC에 대한 PD는 상이한 검정에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 VISTA ADC의 PD는 ADC와 접촉된 VISTA 발현 면역 세포를 사용하여 시험관내에서 결정될 수 있거나 또는 ADC 투여량이 투여된 대상체, 예를 들어, 설치류 또는 영장류(예를 들어, 인간 또는 시노몰거스 마카크)에서 생체내에서 결정될 수 있다. 추가로, 예시적인 항-VISTA ADC가 상이한 면역 세포(예를 들어, T 세포, Treg, 단핵구, 대식세포, 호중구)에 결합하기 때문에, 추가로 이들 ADC가 상기 면역 세포 상에 결합된 항원의 상대적인 발현, 예를 들어, VISTA 발현에 기초하여 상이한 유형의 면역 세포에 상이하게 내재화하기 때문에, 그리고 추가로 이러한 면역 세포의 턴 오버가 달라지기 때문에, 상이한 유형의 면역 세포, 예를 들어, VISTA 발현 면역 세포를 사용하여 시험관내에서 결정되는 경우 PD 값은 달라질 것이다. 일반적으로 본 명세서에서 항-VISTA ADC의 경우에 PD는 대식세포에 의해서 발휘되는 항-염증 활성의 기간에 기초하여 표현되는데, 그 이유는 이들 세포가 순환계에 존재하고, (놀랍게도) 본 발명에 따른 VISTA 항체를 포함하는 ADC는 대식세포에서, 예를 들어, ADC 투여 후 수 주 또는 심지어는 1개월의 연장된 항-염증 활성을 유도한다는 것이 입증되었기 때문이다. 그러나, ADC가 VISTA가 아닌 상이한 면역 세포, 예를 들어, B 또는 NK 세포를 표적으로 하는 경우 PD는 이들 세포에서 염증 활성을 검출함으로써 잠재적으로 결정될 것인데, 그 이유는 글루코코티코이드 효능제의 내재화가 이들 세포에 존재할 것이기 때문일 것이다.
본 명세서에서 구 "PD/PK 비율"은 특정 종의 면역 세포에서 또는 동물 모델에서, 예를 들어, 항-VISTA ADC의 경우에는 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 또는 영장류(예를 들어, 인간 또는 시노몰거스 마카크)에서 시험관내 또는 생체내에서 결정된 본 발명에 따른 ADC의 PD 값과 PK 값의 비율을 지칭한다. 하기에 나타내 바와 같이, 본 발명에 따른 항-VISTA ADC의 PD/PK 비율은 놀랍게도 높고, 즉, VISTA 넉-인 설치류 및 Cyno에서 14:1 또는 28:1만큼 높다는 것이 입증되었다. 또한, 유사하거나 더 높은 PD/PK 비율이 인간 및 다른 비-인간 영장류에서 얻어진다고 예상되는데, 그 이유는 설치류 및 인간 및 영장류에서 상이한 면역 세포에 의한 VISTA의 발현이 매우 유사하고, 추가로 약물 대사가 일반적으로 인간 및 비-인간 영장류에서보다 설치류에서 훨씬 더 빨리 일어나기 때문이다. 본 출원인은 이러한 이론에 얽매이고자 함은 아니지만; 본 발명에 따른 VISTA 항체를 포함하는 ADC의 경우, 본 발명의 ADC는 이들 면역 세포 상에서의 표면 VISTA 발현의 높은 밀도로 인해서 특정 유형의 VISTA 발현 세포에 매우 많은 양으로 내재화한다고 여겨지며, 이는 "저장소(depot) 효과"를 명백하게 생성하고, 즉, 내재화된 ADC의 저장소가 매우 느리게 대사되어, 치료적 유효(항-염증)량의 항-염증제(예를 들어, 스테로이드, 예컨대, 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 효능제 또는 글루코코티코스테로이드 효능제-링커 또는 이를 함유하는 ADC)의 놀랍게도 연장된 방출을 제공한다.
"효능 개시"는 치료제, 예를 들어, 스테로이드 또는 ADC 접합체의 효능이 생체내에서 시작되는 시간을 지칭한다. 본 발명에서, 이것은 스테로이드의 항-염증 효능을 검출하는 공지된 생체내 검정을 사용하여 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 효능제 또는 본 발명에 따른 글루코코티코스테로이드 효능제-링커 또는 ADC 접합체가 투여된 대상체에서 검출될 수 있다. 하기에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 항-VISTA ADC는 즉, 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 약 2시간인 신속한 효능 개시를 갖는다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "실질적으로 유사한," 또는 "실질적으로 동일한"은 2개의 수치 값들(일반적으로 하나는 본 발명의 항체와 연관되고 다른 하나는 참조/비교용 항체와 연관됨) 간에 충분히 높은 유사도를 나타내어 당업자는 두 값들 간의 차이가 상기 값들(예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 없거나 없는 것으로 간주할 것이다. 상기 두 값들 간의 차이는 참조/비교용 항체에 대한 값의 함수로서 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 또는 약 10% 미만이다.
"단리된" 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 그들이 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한(즉, 오염물질이 없는), 적어도 90% 순수한, 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "면역접합체", "접합체", "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 항-VISTA 항체 또는 이의 단편 및 항-염증제, 예컨대, 글루코코티코스테로이드 효능제 및 사이의 링커에 연결된 화합물 또는 이의 유도체를 지칭하며, 이것은 하기 일반 화학식으로 표현될 수 있다: (AI-L-Q)n-A, 상기 식에서, AI=항-염증제, 일반적으로 소분자 글루코코티코이드 수용체 효능제, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화학식 1, II 또는 III에 따른 글루코코티코스테로이드 효능제 화합물이고, L=링커이고, Q=헤테로이작용기, 헤테로삼작용기이거나, 존재하지 않고, A=생리 pH에서 인간 VISTA에 우선적으로 결합하고 일반적으로 상기에 기재된 바와 같은 짧은 pK를 보유하는 항-VISTA 항체 또는 이의 VISTA 결합 단편이고, n은 1 초과의 정수, 선택적으로 1 내지 10이다. 면역접합체는 역 순서의 하기 일반 화학식으로도 정의될 수 있다: A-(Q-L-AI)n.
본 개시내용에서, 용어 "링커"는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 항-염증제 약물에 대한 기능성 등가물, 일반적으로 글루코코티코스테로이드 수용체 효능제, 예를 들어, 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 효능제를 연결할 수 있는 임의의 화학 모이어티를 지칭한다. 링커는 절단에 민감하여("절단 가능한 링커") 항-염증제, 예컨대, 글루코코티코스테로이드의 방출을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 절단 가능한 링커는 글루코코티코스테로이드 및/또는 항체가 면역 세포, 예컨대, 다른 면역 세포 유형 중에서 호중구, 단핵구, 대식세포, 호산구, T 세포, 수지상 세포, Treg, NK 세포, B 세포, 비만 세포, 대식세포 또는 골수 세포에 내재화되기 전 또는 후에 활성으로 유지되는 조건에서 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스터라제-유도 절단 및 이황화 결합 절단에 민감할 수 있다. 대안적으로, 링커는 절단에 실질적으로 저항성일 수 있다("절단 가능하지 않은 링커").
절단 가능하지 않은 링커는 항-염증제, 예컨대, 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 효능제를 안정적인 공유 방식으로 항체에 연결할 수 있는 임의의 화학 모이어티를 포함하고, 절단 가능한 링커에 대해서 상기에 열거된 카테고리에 포함되지 않는다. 따라서, 절단 가능하지 않은 링커는 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스터라제-유도 절단 및 이황화 결합 절단에 실질적으로 저항성이다. 추가로, 절단 가능하지 않은은 산, 광불안정성-절단제, 펩티다제, 에스터라제 또는 글루코코티코스테로이드 및/또는 항체가 면역 세포, 예컨대, 단핵구 또는 골수 세포 내로의 내재화 전 또는 후에 이의 활성을 잃어버리지 않는 조건에서 이황화 결합을 절단하는 화학 또는 생리 화합물에 의해서 유도되는 절단을 견디는 링커 내의 화학 결합 또는 링커에 대한 연결의 능력을 지칭한다.
일부 절단 가능한 링커는 펩티다제에 의해서 절단된다("펩티다제 절단 가능한 링커"). 특정 펩타이드만 세포 내부 또는 외부에서 쉽게 절단된다. 예를 들어, 문헌[Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 626-629 (1982) 및 Umemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)]를 참조한다. 추가로, 펩타이드는 화학적으로 하나의 아미노산의 카복실레이트와 제2 아미노산의 아미노기 간의 아마이드 결합인 펩타이드 결합 및 α-아미노산 단위로 구성된다. 다른 아마이드 결합, 예컨대, 라이신의 α 아미노산기와 카복실레이트 간의 결합은 펩타이드 결합이 아닌 것으로 이해되고, 절단 가능하지 않은 것으로 간주된다.
일부 링커는 에스터라제("에스터라제 절단 가능한 링커")에 의해서 절단된다. 특정 에스터만 세포 내부 또는 외부에 존재하는 에스터라제에 의해서 절단될 수 있다. 에스터는 카복실산과 알코올의 축합에 의해서 형성된다. 단순 에스터는 단순 알코올, 예컨대, 지방족 알코올 및 작은 환식 알코올 및 작은 방향족 알코올로 생성된 에스터이다.
일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커 성분은 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 이들 실시형태에서, 펩타이드는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 허용하여 세포내 프로테아제, 예컨대, 리소좀 효소에 대한 노출 시 항-염증제, 예를 들어, 글루코코티코스테로이드의 방출을 용이하게 한다(Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). 예시적인 펩타이드는 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 테트라펩타이드 및 펜타펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 다이펩타이드는 알라닌-알라닌(ala-ala), 발린-시트룰린(vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌(af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-라이신(fk 또는 phe-lys); 페닐알라닌-호모라이신(phe-homolys); 및 N-메틸-발린-시트룰린(Me-val-cit)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 트라이펩타이드는 글리신-발린-시트룰린(gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신(gly-gly-gly)뿐만 아니라 본 출원의 "예시적인 실시형태" 부분에서 식별되고 실시예 3에서 구현된 특정 링커를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
펩타이드는 자연 발생 및/또는 비자연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 용어 "자연 발생 아미노산"은 Ala, Asp, Cys, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr을 지칭한다. "비자연 아미노산"(즉, 아미노산이 자연에서 발생하지 않음)은 비제한적인 예의 방식으로 호모세린, 호모아르기닌, 시트룰린, 페닐글리신, 타우린, 아이오도타이로신, 셀레노-시스테인, 노르류신("Nle"), 노르발린("Nva"), 베타-알라닌, L- 또는 D-나프트알라닌, 오르니틴("Orn") 등을 포함한다. 펩타이드는 특정 효소, 예를 들어, 종양-연관 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소 절단을 위해서 설계되고 최적화될 수 있다.
아미노산은 또한 자연 아미노산 및 비자연 아미노산의 D-형태를 포함한다. "D-"는 자연 발생 ("L-") 아미노산에서의 배위와 상반되는 바와 같이 "D"(우선성) 배위를 갖는 아미노산을 지칭한다. 자연 및 비자연 아미노산은 상업적으로 구입할 수 있거나(Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech) 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
용어 "약물 항체 비율" 또는 "DAR"은 항-염증제 또는 기능성 유도체(즉, 소분자 글루코코티코이드 수용체 효능제, 예를 들어, 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드로부터 유래된 라디칼)의 수를 지칭한다. 따라서, 일반 화학식 (AI-L-Q)n-A 또는 이의 반대 화학식을 갖는 면역접합체에서, DAR은 변수 "n"으로 정의된다. 전형적으로 본 발명의 ADC에서 "n"은 1 내지 12 범위이다.
개별 면역접합체를 나타내는 화학식 (AI-L-Q)n-A를 갖는 화합물을 지칭하는 경우, DAR은 A(예를 들어, n은 선택적으로 1 내지 12의 정수 또는 분수임)에 연결된, 특정 A(예를 들어, n은 1 내지 12의 정수임)에 연결된 염증제 또는 기능성 유도체(예를 들어, 소분자 글루코코티코이드 수용체 효능제, 예를 들어, 글루코코티코스테로이드, 예컨대, 덱사메타손 또는 부데소나이드 또는 화학식 I, II 또는 III의 신규한 글루코코티코스테로이드로부터 유래된 라디칼)의 수를 지칭한다.
복수의 면역접합체를 나타내는 화학식 (AI-L-Q)n-A를 갖는 화합물을 지칭하는 경우, DAR은 링커에 의해서 A(예를 들어, n은 1 내지 12의 정수 또는 분수임)에 연결된 항-염증제 또는 기능성 유도체(예를 들어, 소분자 글루코코티코이드 수용체 효능제, 예를 들어, 글루코코티코스테로이드, 예컨대, 화학식 I, II 또는 III의 신규한 스테로이드)의 평균 수를 지칭한다. 따라서, 예의 방식으로, A당 3개의 AI를 갖는 제1 면역접합체 및 A당 4개의 AI를 갖는 제2 면역접합체를 포함하는 화학식 (AI-L-Q)n-A를 갖는 화합물은 3.5의 DAR(즉, "n")을 가질 것이다.
용어 "대상체"는 특정한 치료의 수용자가 되는, 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하는 동물(예를 들어, 포유동물)을 나타낸다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 이와 같은 형태로 존재하고 제형이 투여되는 대상체에게 허용되지 않게 독성인 부가적 성분을 함유하지 않는 제제를 나타낸다. 이러한 제형은 멸균될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이 ADC 또는 글루코코티코이드 수용체 효능제의 "효과적인 양"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "효과적인 양"은 언급된 목적과 관련하여 결정될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료하기에" 효과적인 면역접합체 또는 글루코코티코이드 수용체 효능제의 양을 지칭한다. "예방적 유효량"은 목적하는 예방적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "경감하는" 또는 "경감하기 위한"과 같은 용어는 진단된 병리적 병태 또는 장애를 치유하고/하거나, 둔화시키고/둔화시키거나 이의 증상을 경감시키고/시키거나 이의 진행을 멈추는 치료적 조치를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상체는 장애를 갖는 것으로 이미 진단된 대상체 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 대상체를 포함한다. 예방적 또는 예방 조치는 표적화된 병리적 병태 또는 장애의 발달을 예방하고/하거나 둔화시키는 조치를 지칭한다. 따라서, 예방적 또는 예방 조치를 필요로 하는 대상체는 장애를 갖기 쉬운 대상체 및 장애가 예방되어야 하는 대상체를 포함한다.
"폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 경우 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합 체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 메틸화 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열에는 비-뉴클레오타이드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 표지 성분과의 접합에 의해서 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 종류의 변형은 예를 들어, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오타이드의 유사체로의 "캡(cap)" 치환, 뉴클레오타이드간 변형, 예를 들어, 전하를 띠지 않는 연결기(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)로 및 전하를 띤 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)로의 변형, 펜던트 모이어티, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-라이신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator)(예를 들어, 아크리딘, 솔라렌 등)을 함유하는 것, 킬레이터(chelator)(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 함유하는 것, 알킬레이터(alkylator)를 함유하는 것, 변형 연결기(예를 들어, 알파 아노머(anomeric) 핵산 등)을 갖는 것뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 비변형 형태를 포함한다. 또한, 당 내에 보통 존재하는 임의의 하이드록실기는 예를 들어, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오타이드에 대해 추가의 연결기를 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사체, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환식 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어, 아라비노스, 자일로스 또는 라이소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 비염기성(abasic) 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대, 메틸 리보사이드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 연결기는 대체 연결기로 교체될 수 있다. 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR2("아미 데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("폼아세탈")(여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 선택적으로 에터(--O--) 연결기를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬(1-20 C), 아릴, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 아르알딜임)로 대체된 실시형태를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드 내의 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본 명세서에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
용어 "벡터"는 관심 대상의 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 숙주 세포에게 전달할 수 있고 선택적으로서 숙주 세포에서 이들을 발현할 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터 및 특정 진핵세포, 예컨대, 생산자 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이것은 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 변형되었거나 개재, 예를 들어, 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대, 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들면, 비자연 아미노산 등을 포함함)를 함유하는 폴리펩타이드뿐만 아니라 당분야에서 공지되어 있는 다른 변형이 또한 상기 정의에 포함된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드는 항체에 기반하기 때문에, 일부 실시형태에서 폴리펩타이드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있다는 것이 이해된다.
2개 이상의 핵산들 또는 폴리펩타이드들과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 부분으로서 간주하지 않으면서 최대 상응을 위해 (필요한 경우 갭을 도입함으로써) 비교되고 정렬될 때 동일하거나 명시된 퍼센트의 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열들 또는 하위서열들을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용함으로써, 또는 시각적 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 수득하는 데 이용될 수 있는 다양한 알고리즘들 및 소프트웨어가 당분야에서 공지되어 있다. 서열 정렬 알고리즘의 이러한 하나의 비제한적인 예는 문헌[Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877 (1993)]에서와 같이 변형되었고 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(Altschul et al., 핵산s Res., 25:3389-3402 (1991)) 내로 도입된, 문헌[Karlin et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268 (1990)]에 기재된 알고리즘이다. 일부 실시형태에서, 갭핑된(Gapped) BLAST가 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2(Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2(Genentech, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프랜시스코주 소재) 또는 Megalign (DNASTAR)은 서열을 정렬시키는 데 이용될 수 있는 추가로 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 프로그램이다. 일부 실시형태에서, GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 이용하여(예를 들어, NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 40, 50, 60, 70 또는 90의 갭 가중 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하여) 2개의 뉴클레오타이드 서열들 사이의 퍼센트 동일성을 측정한다. 일부 대안적인 실시형태에서, Needleman 및 Wunsch의 알고리즘(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))을 도입하는, GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 이용하여(예를 들어, BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중 및 1, 2, 3, 4 또는 5의 길이 가중을 사용하여) 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성을 측정할 수 있다. 대안적으로, 특정 실시형태에서, Myers 및 Miller의 알고리즘(CABIOS, 4:11-17 (1989))을 이용하여 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성을 측정한다. 예를 들어, ALIGN 프로그램(버전 2.0)을 이용하고 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티과 함께 PAM120을 사용하여 퍼센트 동일성을 측정할 수 있다. 당업자는 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬을 위해 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 사용된다. 일부 실시형태에서, 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 퍼센트 동일성 "X"는 100배(Y/Z)로서 계산되고, 여기서 Y는 (시각적 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬되는 경우) 제1 서열과 제2 서열의 정렬에서 동일한 일치로서 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, Z는 제2 서열의 총 잔기 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열의 길이보다 더 긴 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 퍼센트 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 퍼센트 동일성보다 더 높을 것이다.
비제한적인 예로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오타이드가 참조에 대해서 특정 백분율 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 및 일부 실시형태에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일)을 갖는지에 관계없이, 특정 실시형태에서 서열은 Bestfit 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)을 사용하여 결정될 수 있다. Bestfit은 Smith 및 Waterman의 로컬 상동성 알고리즘(Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981))을 사용하여 두 서열 간의 최상의 상동성 분절을 찾는다. Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예를 들어, 본 개시내용에 따른 참조 서열과 95% 동일한지 여부를 결정하는 경우, 동일성 백분율이 참조 뉴클레오타이드의 전체 길이에 걸쳐 계산되고 참조 서열 내의 뉴클레오타이드의 총 수의 최대 5%의 상동성의 갭이 허용되도록 파라미터가 설정된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하다는 것은, 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 시각적인 조사에 의해서 측정되는 경우 최대 상응성을 위해서 비교 및 정렬되는 경우 이들이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 일부 실시형태에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 동일성은 적어도 약 10개, 약 20개, 약 40 내지 60개의 잔기 길이 또는 이들 사이의 임의의 정수 값의 잔기 길이인 서열의 영역에 걸쳐서 존재할 수 있고, 60 내지 80개 잔기보다 긴 영역, 예를 들어, 적어도 약 90 내지 100개 자기에 걸쳐서 존재할 수 있고, 일부 실시형태에서, 서열은 비교되는 서열, 예컨대, 뉴클레오타이드 서열의 암호 영역의 전체 길이에 걸쳐서 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유하는 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있고, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 타이로신의 페닐알라닌으로의 치환은 보존적 치환이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드 및 항체의 서열에서의 보존적 치환은 항체가 결합하는 항원(들), 예를 들어, VISTA에 대한, 이러한 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합을 제거하지 않는다 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)] 참조).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한(즉, 오염물질이 없는), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)에 대한 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 이 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 본래의 모 세포와 (형태 또는 게놈 DNA 보체에서) 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(들)로 생체 내에서 형질주입된 세포를 포함한다.
용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기에서부터 또는 Pro230에서부터 이의 카복실-말단까지 연장되어 있는 것으로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 FcγRI, FcγRII 및 FcγRII 하위클래스의 수용체, 예컨대, 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 이의 세포질 도메인이 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, ImmunoMethods, 4:25-34; 및 de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에 검토되어 있다. "FcR"은 또한 모체 IgG를 태아로 전달하는 역할을 하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다(Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; 및 Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적이 용해되는 것을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체화된 분자(예를 들어, 항체)에 대한 보체 시스템(C1q)의 제1 성분의 결합에 의해 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 Fc 영역을 필요로 하며, 이러한 항체 효과기 기능을 평가하기 위해 당업계에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "내인성 FcR"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이하지만 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 가질 것이고, 가장 바람직하게는 그것과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 가질 것이며, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가질 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 일으키는 세포-매개 반응을 지칭한다. 관심 분자의 ADCC 활성은 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS) 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, 문헌[Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다.
본 개시내용에서, 용어 "할로"는 그 자체로 사용되는 경우 또는 또 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 -Cl, -F, -Br 또는 -I를 지칭한다. 예를 들어, 할로는 -Cl 또는 -F이다.
본 개시내용에서, 용어 "하이드록시"는 그 자체로 사용되는 경우 또는 또 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 -OH를 지칭한다.
본 개시내용에서, 용어 "티올" 또는 용어 "설프하이드릴"은 그 자체로 사용되는 경우 또는 또 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 -SH를 지칭한다.
본 개시내용에서, 용어 "알킬"은 그 자체로 사용되는 경우 또는 또 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 비치환된 직쇄형 또는 분지쇄형 지방족 탄화수소, 즉, C1-12 알킬, 또는 지정된 탄소 원자의 수를 함유하는 비치환된 직쇄형 또는 분지쇄형 지방족 탄화수소, 예를 들어, C1 알킬, 예컨대, 메틸, C2 알킬, 예컨대, 에틸, C3 알킬, 예컨대, 프로필 또는 아이소프로필, C1-3 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 프로필 또는 아이소프로필 등을 지칭한다. 예를 들어, 알킬은 C1-10 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 C1-6 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 C1-4 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 직쇄형 C1-10 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 분지쇄형 C3-10 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 직쇄형 C1-6 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 분지쇄형 C3-6 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 직쇄형 C1-4 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 분지쇄형 C3-4 알킬이다. 또 다른 예에서, 알킬은 직쇄형 또는 분지쇄형 C3-4 알킬이다. 비제한적인 예시적인 C1-10 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, sec-부틸, tert-부틸, 아이소-부틸, 3-펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함한다. 비제한적인 예시적인 C1-4 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, sec-부틸, tert-부틸, 및 아이소-부틸을 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "선택적으로 치환된 알킬"은 비치환이거나 또는 나이트로, 하이드록시, 사이아노, 할로알콕시, 아릴옥시, 알킬티오, 설포아미도, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 카복시, 카복스아미도, 알콕시카보닐, 티올, --N(H)C(=O)NH2, 및 --N(H)C=NH)NH2, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3개의 치환체로 치환된 알킬을 지칭한다. 예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬은 2개의 치환체로 치환된다. 다른 실시형태에서, 선택적으로 치환된 알킬은 하나의 치환체로 치환된다. 또 다른 예에서, 선택적으로 치환된 알킬은 비치환된다. 비제한적인 예시적인 치환된 알킬기는 --CH2OH, --CH2SH, --CH2Ph, --CH2(4-OH)Ph, --CH2(이미다졸릴), --CH2CH2CO2H, --CH2CH2SO2CH3, --CH2CH2COPh 및 --CH2OC(=O)CH3를 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 또 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 12개의 탄소 원자(즉, C3-12 사이클로알킬) 또는 명시된 탄소의 수를 갖는 1 내지 3개의 고리를 함유하는 비치환된 포화 또는 예를 들어, 1개 또는 2개의 이중 결합을 함유하는 부분적으로 불포화된 환식 지방족 탄화수소를 지칭한다. 일례에서, 사이클로알킬기는 2개의 고리를 갖는다. 또 다른 예에서, 사이클로알킬기는 1개의 고리를 갖는다. 또 다른 예에서, 사이클로알킬은 포화된다. 또 다른 예에서, 사이클로알킬은 불포화된다. 또 다른 예에서, 사이클로알킬은 C3-8 사이클로알킬이다. 또 다른 예에서, 사이클로알킬은 C3-6 사이클로알킬이다. 용어 "사이클로알킬"은 고리 --CH2--가 --C(=O)--로 대체된 기를 포함하도록 의도된다. 비제한적인 예시적인 사이클로알킬기는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 노보닐, 데칼린, 아다만틸, 사이클로헥센일, 사이클로펜텐일 및 사이클로펜탄온을 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "선택적으로 치환된 사이클로알킬"은 비치환되거나 또는 할로, 나이트로, 사이아노, 하이드록시, 알킬카보닐옥시, 사이클로알킬카보닐옥시, 아미노, 할로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 할로알콕시, 아릴옥시, 아르알킬옥시, 알킬티오, 카복스아미도, 설포아미도, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 카복시, 카복시알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 알콕시알킬, (아미노)알킬, (카복스아미도)알킬, (헤테로사이클로)알킬 및 --OC(=O)-아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환체로 치환된 사이클로알킬을 지칭한다. 용어 선택적으로 치환된 사이클로알킬은 융합된 선택적으로 치환된 아릴, 예를 들어, 페닐 또는 융합된 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 예를 들어, 피리딜을 갖는 사이클로알킬기를 포함한다. 융합된 선택적으로 치환된 아릴 또는 융합된 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 갖는 선택적으로 치환된 사이클로알킬은 사이클로알킬 고리 상의 임의의 가능한 탄소 원자에서 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 일례에서, 선택적으로 치환된 사이클로알킬은 2개의 치환체로 치환된다. 다른 실시형태에서, 선택적으로 치환된 사이클로알킬은 하나의 치환체로 치환된다. 다른 예에서, 선택적으로 치환된 사이클로알킬은 비치환된다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "아릴" 6 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 단환식 또는 바이사이클릭 고리계(즉, C6-14 아릴)를 지칭한다. 비제한적인 예시적인 아릴기는 페닐("Ph"로서 약칭), 나프틸, 페난트릴, 안트라실, 인덴일, 아줄렌일, 바이페닐, 바이페닐엔일, 및 플루오르엔일기를 포함한다. 일례에서, 아릴기는 페닐 또는 나프틸로부터 선택된다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "선택적으로 치환된 아릴"은 비치환되거나 또는 할로, 나이트로, 사이아노, 하이드록시, 티올, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 선택적으로 치환된 알킬, 할로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 할로알콕시, 아릴옥시, 아르알킬옥시, 알킬티오, 카복스아미도, 설포아미도, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬설포닐, 할로알킬설포닐 사이클로알킬설포닐, (사이클로알킬)알킬설포닐, 아릴설포닐, 헤테로아릴설포닐, 헤테로사이클로설포닐, 카복시, 카복시알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 알콕시카보닐, 알콕시알킬, (아미노)알킬, (카복스아미도)알킬 및 (헤테로사이클로)알킬로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환체로 치환된 아릴을 지칭한다.
일례에서, 선택적으로 치환된 아릴은 선택적으로 치환된 페닐이다. 또 다른 예에서, 선택적으로 치환된 페닐은 4개의 치환체를 갖는다. 또 다른 예에서, 선택적으로 치환된 페닐은 3개의 치환체를 갖는다. 또 다른 예에서, 선택적으로 치환된 페닐은 2개의 치환체를 갖는다. 또 다른 예에서, 선택적으로 치환된 페닐은 1개의 치환체를 갖는다. 또 다른 예에서, 선택적으로 치환된 페닐은 비치환된다. 비제한적인 예시적인 치환된 아릴기는 2-메틸페닐, 2-메톡시페닐, 2-플루오로페닐, 2-클로로페닐, 2-브로모페닐, 3-메틸페닐, 3-메톡시페닐, 3-플루오로페닐, 3-클로로페닐, 4-메틸페닐, 4-에틸페닐, 4-메톡시페닐, 4-플루오로페닐, 4-클로로페닐, 2,6-다이-플루오로페닐, 2,6-다이-클로로페닐, 2-메틸, 3-메톡시페닐, 2-에틸, 3-메톡시페닐, 3,4-다이-메톡시페닐, 3,5-다이-플루오로페닐 3,5-다이-메틸페닐, 3,5-다이메톡시, 4-메틸페닐, 2-플루오로-3-클로로페닐, 3-클로로-4-플루오로페닐, 4-(피리딘-4-일설포닐)페닐을 포함한다. 용어 선택적으로 치환된 아릴은 융합된 선택적으로 치환된 사이클로알킬 또는 융합된 선택적으로 치환된 헤테로사이클로기를 갖는 페닐기를 포함한다. 융합된 선택적으로 치환된 사이클로알킬 또는 융합된 선택적으로 치환된 헤테로사이클로기를 갖는 선택적으로 치환된 페닐은 페닐 고리 상의 임의의 가능한 탄소 원자에서 분자의 나머지에 부착될 수 있다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "알켄일"은 1개, 2개 또는 3개의 탄소-대-탄소 이중 결합을 함유하는 알킬을 지칭한다. 일례에서, 알켄일은 1개의 탄소-대-탄소 이중 결합을 갖는다. 또 다른 예에서, 알켄일은 C2-6 알켄일이다. 또 다른 예에서, 알켄일은 C2-4 알켄일이다. 비제한적인 예시적인 알켄일기는 에텐일, 프로펜일, 아이소프로펜일, 부텐일, sec-부텐일, 펜텐일 및 헥센일을 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "선택적으로 치환된 알켄일"은 비치환되거나 할로, 나이트로, 사이아노, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 할로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 할로알콕시, 아릴옥시, 아르알킬옥시, 알킬티오, 카복스아미도, 설포아미도, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 카복시, 카복시알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 선택적으로 치환된 아릴, 헤테로아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로사이클로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개 또는 3개의 치환체로 치환된 알켄일을 지칭한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "알킨일"은 1 내지 3개의 탄소-대-탄소 삼중 결합을 함유하는 알킬을 지칭한다. 일례에서, 알킨일은 1개의 탄소-대-탄소 삼중 결합을 갖는다. 또 다른 예에서, 알킨일은 C2-6 알킨일이다. 또 다른 예에서, 알킨일은 C2-4 알킨일이다. 비제한적인 예시적인 알킨일기는 에틴일, 프로핀일, 부틴일, 2-부틴일, 펜틴일 및 헥신일기를 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 일부로서 사용되는 경우 용어 "선택적으로 치환된 알킨일"은 비치환되거나 할로, 나이트로, 사이아노, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 할로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 할로알콕시, 아릴옥시, 아르알킬옥시, 알킬티오, 카복스아미도, 설포아미도, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 카복시, 카복시알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 헤테로사이클로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개 또는 3개의 치환체로 치환된 알킨일을 지칭한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "할로알킬"은 하나 이상의 플루오린, 염소, 브로민 및/또는 아이오딘에 의해서 치환된 알킬을 지칭한다. 일례에서, 알킬기는 1개, 2개 또는 3개의 플루오린 및/또는 염소 원자에 의해서 치환된다. 또 다른 예에서, 할로알킬기는 C1-4 할로알킬기이다. 비제한적인 예시적인 할로알킬기는 플루오로메틸, 2-플루오로에틸, 다이플루오로메틸, 트라이플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 1,1-다이플루오로에틸, 2,2-다이플루오로에틸, 2,2,2-트라이플루오로에틸, 3,3,3-트라이플루오로프로필, 4,4,4-트라이플루오로부틸 및 트라이클로로메틸기를 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "알콕시"는 말단 산소 원자에 부착된 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알켄일 또는 선택적으로 치환된 알킨일을 지칭한다. 일례에서, 알콕시는 말단 산소 원자에 부착된 선택적으로 치환된 알킬을 지칭한다. 일례에서, 알콕시기는 말단 산소 원자에 부착된 C1-6 알킬이다. 또 다른 예에서, 알콕시기는 말단 산소 원자에 부착된 C1-4 알킬이다. 비제한적인 예시적인 알콕시기는 메톡시, 에톡시 및 tert-부톡시를 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "알킬티오"는 말단 황 원자에 부착된 선택적으로 치환된 알킬을 지칭한다. 일례에서, 알킬티오기는 C1-4 알킬티오기이다. 비제한적인 예시적인 알킬티오기는 --SCH3 및 --SCH2CH3를 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "할로알콕시"는 말단 산소 원자에 부착된 할로알킬을 지칭한다. 비제한적인 예시적인 할로알콕시기는 플루오로메톡시, 다이플루오로메톡시, 트라이플루오로메톡시 및 2,2,2-트라이플루오로에톡시를 포함한다.
본 개시내용에서, 용어 "헤테로아릴"은 5 내지 14개의 고리 원자(즉, 5 내지 14원 헤테로아릴)를 갖는 비치환된 단환식 및 바이사이클릭 방향족 고리계를 지칭하되, 고리 중 하나의 적어도 하나의 탄소 원자는 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자로 대체된다. 일례에서, 헤테로아릴은 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유한다. 일례에서, 헤테로아릴은 3개의 헤테로원자를 갖는다. 또 다른 예에서, 헤테로아릴은 2개의 헤테로원자를 갖는다. 또 다른 예에서, 헤테로아릴은 1개의 헤테로원자를 갖는다. 또 다른 예에서, 헤테로아릴은 5- 내지 10-원 헤테로아릴이다. 또 다른 예에서, 헤테로아릴은 5- 내지 6-원 헤테로아릴이다. 또 다른 예에서, 헤테로아릴은 5개의 고리 원자, 예를 들어, 티엔일을 갖고, 5-원 헤테로아릴은 4개의 탄소 원자 및 1개의 황 원자를 갖는다. 또 다른 예에서, 헤테로아릴은 6개의 고리 원자, 예를 들어, 피리딜을 갖고, 6-원 헤테로아릴은 5개의 탄소 원자 및 1개의 질소 원자를 갖는다. 비제한적인 예시적인 헤테로아릴기는 티엔일, 벤조[b]티엔일, 나프토[2,3-b]티엔일, 티안트렌일, 퓨릴, 벤조퓨릴, 피란일, 아이소벤조퓨란일, 벤조옥사존일, 크롬엔일, 잔텐일, 2H-피롤릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피라진일, 피리미딘일, 피리다진일, 아이소인돌릴, 3H-인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 퓨린일, 아이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 프탈라진일, 나프티리딘일, 신놀린일, 퀴나졸린일, 프테리딘일, 4aH-카바졸릴, 카바졸릴, β-카볼린일, 페난트리딘일, 아크리딘일, 피리미딘일, 페난트롤린일, 펜아진일, 티아졸릴, 아이소티아졸릴, 페노티아졸릴, 아이소옥사졸릴, 퓨라잔일 및 페녹사진일을 포함한다. 일례에서, 헤테로아릴은 티엔일(예를 들어, 티엔-2-일 및 티엔-3-일), 퓨릴(예를 들어, 2-퓨릴 및 3-퓨릴), 피롤릴(예를 들어, 1H-피롤-2-일 및 1H-피롤-3-일), 이미다졸릴(예를 들어, 2H-이미다졸-2-일 및 2H-이미다졸-4-일), 피라졸릴(예를 들어, 1H-피라졸-3-일, 1H-피라졸-4-일 및 1H-피라졸-5-일), 피리딜(예를 들어, 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 및 피리딘-4-일), 피리미딘일(예를 들어, 피리미딘-2-일, 피리미딘-4-일 및 피리미딘-5-일), 티아졸릴(예를 들어, 티아졸-2-일, 티아졸-4-일 및 티아졸-5-일), 아이소티아졸릴(예를 들어, 아이소티아졸-3-일, 아이소티아졸-4-일 및 아이소티아졸-5-일), 옥사졸릴(예를 들어, 옥사졸-2-일, 옥사졸-4-일 및 옥사졸-5-일), 아이소옥사졸릴(예를 들어, 아이소옥사졸-3-일, 아이소옥사졸-4-일 및 아이소옥사졸-5-일) 및 인다졸릴(예를 들어, 1H-인다졸-3-일)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 용어 "헤테로아릴"은 또한 가능한 N-옥사이드를 포함하는 것을 의미한다. 비제한적인 예시적인 N-옥사이드는 피리딜 N-옥사이드를 포함한다.
일례에서, 헤테로아릴은 5- 또는 6-원 헤테로아릴이다. 일례에서, 헤테로아릴은 5-원 헤테로아릴이고, 즉, 헤테로아릴은 고리 중 적어도 하나의 탄소 원자가 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자로 대체된 5개의 고리 원자를 갖는 단환식 방향족 고리계이다. 비제한적인 예시적인 5원 헤테로아릴기는 티엔일, 퓨릴, 피롤릴, 옥사졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 아이소티아졸릴 및 아이속사졸릴을 포함한다. 또 다른 예에서, 헤테로아릴은 6-원 헤테로아릴이고, 예를 들어, 헤테로아릴은 고리의 적어도 하나의 탄소 원자는 질소 원자로 대체된 6개의 고리 원자를 갖는 단환식 방향족 고리이다. 비제한적인 예시적인 6-원 헤테로아릴기는 피리딜, 피라진일, 피리미딘일 및 피리다진일을 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "선택적으로 치환된 헤테로아릴"은 비치한되거나 할로, 나이트로, 사이아노, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 할로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 할로알콕시, 아릴옥시, 아르알킬옥시, 알킬티오, 카복스아미도, 설포아미도, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬설포닐, 할로알킬설포닐 사이클로알킬설포닐, (사이클로알킬)알킬설포닐, 아릴설포닐, 헤테로아릴설포닐, 카복시, 카복시알킬, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 알콕시알킬, (아미노)알킬, (카복스아미도)알킬 및 (헤테로사이클로)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 치환체로 치환된 헤테로아릴을 지칭한다. 일례에서, 선택적으로 치환된 헤테로아릴은 1개의 치환체를 갖는다. 또 다른 예에서, 선택적으로 치환된 헤테로아릴은 비치환된다. 임의의 가능한 탄소 또는 질소 원자는 치환될 수 있다. 용어 선택적으로 치환된 헤테로아릴은 융합된 선택적으로 치환된 사이클로알킬 또는 융합된 선택적으로 치환된 헤테로사이클로기를 갖는 헤테로아릴기를 포함한다. 융합된 선택적으로 치환된 사이클로알킬 또는 융합된 선택적으로 치환된 헤테로사이클로기를 갖는 선택적으로 치환된 헤테로아릴은 헤테로아릴 고리 상의 임의의 가능한 탄소 원자에서 분자의 나머지에 부착될 수 있다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "헤테로사이클로"은 비치환된 포화된 및 예를 들어, 함유 1개 또는 2개의 이중 결합을 함유하는 부분적으로 불포화된, 3개 내지 14개의 고리원을 갖는 1개, 2개, 또는 3개의 고리를 함유하는 환식기(즉, 3- 내지 14-원 헤테로사이클로)를 지칭하되, 고리 중 1개의 적어도 1개의 탄소 원자는 헤테로원자로 대체된다. 각각의 헤테로원자는 산소, 설폭사이드 및 설폰을 비롯한 황 및/또는 산화 또는 4차화될 수 있는 질소 원자로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 용어 "헤테로사이클로"는 고리 --CH2--가 --C(=O)--로 대체된 기, 예를 들어, 환식 우레이도기, 예컨대, 2-이미다졸리딘온 및 환식 아마이드기, 예컨대, β-락탐, γ-락탐, δ-락탐, ε-락탐 및 피페라진-2-온을 포함한다. 용어 "헤테로사이클로"는 또한 융합된 선택적으로 치환된 아릴기를 갖는 기, 예를 들어, 인돌린일 또는 크로만-4-일을 포함한다. 일 실시형태에서, 헤테로사이클로기는 1개의 고리 및 1개 또는 2개의 산소 및/또는 질소 원자를 함유하는 C4-6 헤테로사이클로, 즉, 4-, 5- 또는 6-원 환식기이다. 일 실시형태에서, 헤테로사이클로기는 1개의 고리 및 1개의 질소 원자를 함유하는 C4-6 헤테로사이클로이다. 헤테로사이클로는 임의의 가능한 탄소 또는 질소 원자를 통해서 분자의 나머지에 선택적으로 연결될 수 있다. 비제한적인 예시적인 헤테로사이클로기는 아제티딘일, 다이옥산일, 테트라하이드로피란일, 2-옥소피롤리딘-3-일, 피페라진-2-온, 피페라진-2,6-다이온, 2-이미다졸리딘온, 피페리딘일, 모르폴린일, 피페라진일, 피롤리딘일 및 인돌린일을 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "선택적으로 치환된 헤테로사이클로"는 비치환되거나 할로, 나이트로, 사이아노, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 할로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 할로알콕시, 아릴옥시, 아르알킬옥시, 알킬티오, 카복스아미도, 설포아미도, 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 알콕시카보닐, CF3C(＝O)--, 아릴카보닐, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 카복시, 카복시알킬, 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 알콕시알킬, (아미노)알킬, (카복스아미도)알킬, 또는 (헤테로사이클로)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 치환체로 치환된 헤테로사이클로를 지칭한다. 치환은 임의의 가능한 탄소 또는 질소 원자, 또는 이들 둘 다 상에서 일어날 수 있다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "아미노"는 화학식 --NROaRb의 라디칼을 지칭하되, Ra 및 Rb는 각각 수소, 선택적으로 치환된 알킬 및 아르알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, Ra와 Rb는 함께 합쳐져서 3- 내지 8-원의 선택적으로 치환된 헤테로사이클로를 형성한다. 비제한적인 예시적인 아미노기는 --NH2 및 --N(H)(CH3)를 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "카복스아미도"는 화학식 --C(=O)NRaRb의 라디칼이되, Ra 및 Rb는 각각 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 하이드록시알킬 및 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, Ra와 Rb는 이들이 부착되는 질소와 함께 3- 내지 8-원의 선택적으로 치환된 헤테로사이클로기를 형성한다. 일 실시형태에서, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 일 실시형태에서, Ra와 Rb는 이들이 부착되는 질소와 함께 합쳐져서 3- 내지 8-원의 선택적으로 치환된 헤테로사이클로기를 형성한다. 비제한적인 예시적인 카복스아미도기는 --CONH2, --CON(H)CH3 및 --CON(CH3)2를 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "알콕시카보닐"은 알콕시로 치환된 카보닐기, 즉, --C(=O)--를 지칭한다. 일 실시형태에서, 알콕시는 C1-4 알콕시이다. 비제한적인 예시적인 알콕시카보닐기는 --C(=O)OMe, --C(=O)OEt 및 --C(=O)OtBu을 포함한다.
본 개시내용에서, 그 자체로 또는 다른 기의 일부로서 사용되는 경우 용어 "카복시"는 화학식 --CO2H의 라디칼을 지칭한다.
본 개시내용에서, 용어 "자기-희생기" 또는 "희생기" 또는 "희생 링커"는 절단 가능한 링커의 모두 또는 일부를 지칭하며, 일반적으로 안정적인 3부분 분자 내의 2개의 이격된 화학 모이어티에 공유 연결할 수 있고, 효소적 절단에 의해서 3부분 분자로부터 이격된 화학 모이어티 중 하나를 방출할 수 있고; 효소적 절단 후 분자의 나머지로부터 자발적으로 절단되어 이격된 화학 모이어티의 나머지, 예를 들어, 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드를 방출할 수 있는 이작용성 화학 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 희생 링커는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, p-아미노벤질 알코올은 아마이드 결합을 통해서 아미노산 단위에 부착되어, 카바메이트, 메틸카바메이트 또는 카보네이트가 벤질 알코올과 약물 사이에 만들어진다(Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). 일부 실시형태에서, 희생 링커는 p-아미노벤질옥시카보닐(PAB)이다. (본 출원의 실시예 3 및 예시적인 실시형태 참조).
본 개시내용에서, 용어 "보호기" 또는 "PG"는 반응이 분자의 다른 작용기 또는 부분에서 수행되는 동안 작용기, 예를 들어 아민 작용기를 차단, 즉 보호하는 기를 지칭한다. 당업자는 아민 보호기의 선택, 부착 및 절단에 익숙할 것이며, 많은 상이한 보호기가 당업계에 공지되어 있고, 하나의 보호기 또는 다른 보호기의 적합성은 계획된 특정 합성 계획에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 주제에 관한 논문은 문헌, 예컨대, [Wuts, P. G. M.; Greene, T. W., "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", 4th Ed., J. Wiley & Sons, N Y, 2007]에서 입수 가능하다. 적합한 보호기는 카보벤질옥시(Cbz), tert-부틸옥시카보닐(BOC), 9-플루오렌일메틸옥시카보닐(FMOC) 및 벤질(Bn)기를 포함한다. 일 실시형태에서, 보호기는 BOC기이다.
본 개시내용에서, 용어 "에틸렌 글리콜"은 화학식 -OCH2CH2O-의 화학물질을 지칭한다.
본 개시내용에서, 용어 "에틸렌 옥사이드"는 화학식 -CH2CH2O-의 화학물질을 지칭한다.
본 개시내용 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
"포함하는"이라는 언어로 본 명세서에서 실시형태가 설명되는 경우, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 용어로 설명되는 유사한 실시형태가 또한 제공된다는 것이 이해된다.
본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" 및 "B"를 모두 포함하는 것으로 의도된다. " 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 각각의 실시형태를 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "자가면역" 또는 "자가면역 질환 또는 병태"는 개체 자신의 조직 또는 그의 공동-분리물 또는 이의 징후 또는 이로부터 생성된 병태로부터 발생하고 이에 대해 지시된 질환 또는 장애를 광범위하게 지칭하고, 포함한다. 본 명세서에서 자가면역 병태는 염증 또는 알레르기 병태, 예를 들어, 염증을 특징으로 하는 류마티스 관절염과 같은 조직 파괴와 잠재적으로 관련된 자기-항원에 대한 숙주 면역 반응을 특징으로 하는 만성 질환 및/또는 스테로이드가 효과적인 치료를 포함한다.
"알레르기 질환 또는 병태" 또는 "알레르기 반응"은 전형적으로 환경에서 무해한 물질 또는 항원에 대한 면역계의 과민성에 의해 유발되는 병태이다. 이러한 질환은 예를 들어, 아토피성 피부염, 알레르기성 천식, 원발성 면역결핍, 만성 부비동염, 호산구 연관 질환 및 알레르기 반응 또는 반응을 수반하는 기타 병태를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "면역 세포"는 조혈 기원의 세포이고 면역 반응에서 기능을 수행하는 세포를 넓게 지칭한다. 면역 세포는 림프구, 예컨대, B 세포 및 T 세포; 자연 살해 세포; 수지상 세포, 및 골수 세포, 예컨대, 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구 및 과립구를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
"면역 관련 질환(또는 장애 또는 병태)"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 자가면역 질환, 이식편 이식 거부와 연관된 염증성 장애 및 면역 장애, 예컨대, 기관 이식의 급성 및 만성 거부, 동종 줄기세포 이식, 자가유래 줄기세포 이식, 골수 이식, 및 이식편대숙주병을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 군으로부터 선택된 임의의 질환, 장애 또는 병태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"염증 장애", "염증 병태" 및/또는 "염증"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 바와 같이, 만성 또는 급성 염증 질환을 넓게 지칭하고, 염증 자가면역 질환 및 염증 알레르기성 병태를 명확하게 포함한다. 이들 병태는 예의 방식으로 유해한 자극, 예컨대, 병원균, 손상된 세포, 또는 자극원에 대한 이상 조절된 면역 반응을 특징으로 하는 염증성 이상을 포함한다. 염증 장애는 광범위한 인간 질환의 기저를 이루고 있다. 염증 과정에서 병인학적 기원을 갖는 비-면역 질환은 암, 죽상경화증, 및 허혈성 심장질환을 포함한다. 염증과 연관된 장애의 예는 하기를 포함한다: 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 골반염, 허혈재관류 손상, 사르코이드증, 혈관염, 간질성 방광염, 정상보체형성성 두드러기 혈관염, 심막염, 근염, 항-신쎄타제 증후군, 공막염, 대식세포 활성화 증후군, 베체트 증후군, PAPA 증후군, 블라우 증후군, 통풍, 성인 및 소아의 스틸병, 크라이로피리노패티(cryropyrinopathy), 머클-웰스 증후군, 가족성 한랭-유도성 자가-염증 증후군, 신생아기 개시 전신성 염증 질환(neonatal onset multisystemic inflammatory disease), 가족성 지중해열, 만성 유아 신경증, 피부 관절 증후군, 전신성 소아기 특발성 관절염, Hyper IgD 증후군, 슈니츨러 증후군, 및 TNF 수용체-연관된 주기성 증후군(TNF receptor-associated periodic syndrome, TRAPSP), 치은염, 치근막염, 간염, 간경변, 췌장염, 심근염, 혈관염, 위염, 통풍, 통풍성 관절염, 및 건선, 아토피 피부염, 습진, 주사, 두드러기 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 피부 장애.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "포유동물"은 피부의 모발, 암컷에서 새끼에게 영양분을 공급하기 위한 젖 생성 유선을 포괄하는 것을 특징으로 하는, 인간을 비롯한 포유류의 임의의 모든 온혈 척추 동물을 넓게 지칭한다. 포유동물의 예는 알파카, 아르마딜로, 카피바라, 고양이, 낙타, 침팬지, 친칠라, 소, 개, 염소, 고릴라, 햄스터, 말, 인간, 여우원숭이, 라마, 마우스, 비-인간 영장류, 돼지, 래트, 양, 뒤쥐(shrew), 다람쥐, 맥 및 들쥐(vole)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 포유동물은 소, 개, 말, 고양이, 뮤린, 양, 돼지, 영장류 및 설치류 종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 포유동물은 또한 미국 워싱턴 디씨의 스미스소니언 국립 자연사 박물관(National Museum of Natural History, Smithsonian Institution)에 의해 유지되는 세계의 포유동물 종(Species of the World)에 열거된 임의의 모든 동물을 포함한다.
"환자", 또는 "대상체" 또는 "수용자", "개체", 또는 "치료되는 개체"는 질환 상태를 완화하거나 또는 질환 상태의 발생 또는 재발을 예방하기 위해 치료를 필요로 하는 임의의 동물을 넓게 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "환자"는 질환의 위험 인자, 질환력, 감수성, 증상 및 징후를 갖거나, 이전에 질환으로 진단되었거나, 질환의 위험이 있거나, 또는 질환에 대한 환자 집단의 구성원인 임의의 동물을 넓게 지칭한다. 환자는 임상 환자, 예컨대, 인간 또는 가축 환자, 예컨대, 반려, 사육, 가축, 외래종, 또는 동물원 동물일 수 있다.
"대상체" 또는 "환자" 또는 "개체"는 본 명세서에서 치료 또는 진단의 문맥에서 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 젖소, 닭, 양서류, 파충류 등, 즉, 조류 및 포유동물 대상체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 발명에 따라서 치료될 적합한 임의의 것을 포함하고, 바람직하게는 포유동물이다. 본 발명에 따라서 치료될 필요가 있는 임의의 포유동물 대상체가 적합하다. 두 성별 및 임의의 발달기(즉, 신생아, 유아, 소아, 청소년 및 성인)의 인간 대상체가 본 발명에 따라 치료될 수 있다. 본 발명은 또한 동물 대상체, 특히 포유 동물 대상체, 예컨대 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 염소, 양, 및 말에 대해 수의학 목적으로, 그리고 약물 스크리닝 및 약물 개발 목적으로 수행될 수 있다. "대상체"는 "개체" 및 "환자"와 상호 교환 가능하게 사용된다.
"요법", "치료적", "치료하는" 또는 "치료"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 질환의 치료, 질환 또는 이의 임상 증상의 발생의 정지 또는 감소, 및/또는 질환의 경감, 질환 또는 이의 임상 증상의 퇴행의 유도를 넓게 지칭한다. 요법은 질환, 질환의 징후, 및/또는 증상의 예방법, 치료, 개선, 감소, 완화, 및/또는 경감 제공을 포함한다. 요법은 진행 중인 질환 징후 및/또는 증상(예를 들어, 염증, 통증)이 있는 환자에서 징후 및/또는 증상의 완화를 포함한다. 요법은 또한 "예방법"을 포함한다. 요법을 위해 용어 "감소된"은 징후 및/또는 증상의 임상적으로 유의한 감소를 넓게 지칭한다. 요법은 재발 또는 재발되는 징후 및/또는 증상(예를 들어, 염증, 통증)의 치료를 포함한다. 요법은 어느 시기에서든 징후 및/또는 증상의 발생 방지뿐만 아니라 존재하는 징후 및/또는 증상의 감소 및 존재하는 징후 및/또는 증상의 제거를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 요법 만성 질환("유지") 및 급성 질환의 치료를 포함한다. 예를 들어, 치료는 징후 및/또는 증상(예를 들어, 염증, 통증)의 재발 또는 반복의 치료 또는 예방을 포함한다.
본 출원에서 사용된 특정 용어 및 어구를 정의하였으므로, 본 발명에 따른 신규한 글루코코티코스테로이드 스테로이드 효능제, 글루코코티코스테로이드 스테로이드 효능제-링커 및 이를 함유하는 ADC, 이의 생산 및 사용 방법이 하기에 추가로 기재된다.
본 발명은 면역 세포 항원, 전형적으로 인간 면역 세포 항원, 예를 들어, T 세포 활성화의 인간 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 링커를 통해서 직접적으로 또는 간접적으로 부착되는 화학식 I, II 또는 III의 신규한 글루코코티코스테로이드 효능제를 포함하는 ADC에 관한 것이다. 그러나, 본 명세서에서 본 발명에 따른 글루코코티코스테로이드 스테로이드 효능제 및 글루코코티코스테로이드 스테로이드 효능제-링커를 포함하는 ADC는 VISTA 이외의 면역 세포 항원에 결합하는 항체 또는 단편에 커플링되는 경우에도 효능이 있는 것으로 나타났다.
일부 예시적인 실시형태에서, ADC는 생리 pH 조건(약 pH 7.5) 하에서 짧은 혈청 반감기를 보유하는 항체 또는 단편을 포함하고, 예를 들어, 설치류(인간 VISTA 넉-인)에서 항체 또는 단편의 혈청 반감기는 일반적으로 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 1 내지 72시간, 1 내지 32시간, 1 내지 16시간, 1 내지 8시간, 1 내지 4시간 또는 1 내지 2시간±.5 시간이거나 영장류(시노몰거스 마카크)에서 생리 조건(약 pH 7.5)에서 약 3.5, 3, 2.5 또는 2.3일±.5일이고, 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편은 링커를 통해서 항-염증제, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드 또는 코티코스테로이드 수용체 효능제 또는 이를 함유하는 코티코스테로이드 수용체 효능제 -링커 또는 이의 기능성 유도체 또는 라디칼, 즉, 대상체, 예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물에게 투여되는 경우 면역 세포에 내재화될 때 이를 함유하는 ADC로부터 방출되는 경우 목적하는 항-염증 효과를 발휘하는 유도체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다.
특별하게는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는 ADC의 경우 ADC는 생리 pH에서 VISTA 발현 면역 세포에 특이적으로 결합할 것이고, 화학식 I, II 또는 III의 코티코스테로이드 수용체 효능제는 표적(면역) 세포, 예컨대, 호중구, 단핵구, 예컨대, 골수 세포, 대식세포, T 세포, CD4 T 세포에 내재화될 때 ADC로부터 방출될 것이다. CD8 T 세포, Treg 및 다른 면역 세포가 말초 혈액에 존재한다. 이러한 코티코스테로이드 수용체 효능제의 방출은 그것이 표적 면역 세포에 의해서 내재화된 후 ADC의 절단을 제공하는, 효소, 예를 들어, 에스터라제에 의해서 자명하게 발휘된다. 그 다음 면역 세포에 내재화될 때 코티코스테로이드 수용체 효능제를 함유하는 ADC로부터의 코티코스테로이드 수용체 효능제의 방출은 ADC에 의해서 결합되는 항원, 예를 들어, VISTA를 발현하는 면역 세포에서 목적하는 항-염증 효과를 선택적으로 발휘한다. 이미 언급된 바와 같이, 코티코스테로이드 수용체 효능제의 효능(항-염증 활성)은, 이러한 스테로이드 화합물이 세포, VISTA 또는 ADC에 의해서 결합되는 다른 항원을 발현하는 면역 세포에 의해서 내재화된 후에만 달성된다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 단편, 예를 들어, 항-VISTA 항체 또는 단편은 침묵인, 즉, FcR 결합을 손상시키도록 돌연변이된 Fc 영역, 예를 들어, 침묵 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 가장 전형적으로 침묵 IgG2 또는 침묵 IgG1을 포함할 것이거나 항체 또는 단편은 Fc 영역이 결여될 수 있거나 FcR에 결합하지 않는 Fc 단편을 포함할 수 있다. 예시적인 침묵 Fc 영역은 하기에 개시되어 있다. 따라서 일부 예에서 항원을 발현하는 면역 세포에 결합하고 내재화되는 동안 면역 세포 항원, 예를 들어, 항-VISTA 항체 또는 단편에 결합하는 항체 또는 단편을 포함하는 ADC는 이에 의해서 결합된 항원, 예를 들어, VISTA에 조절 효과를 발휘하지 않을 것이고, 즉, 이것은 이것이 결합하는 항원의 효과를 효능작용하거나 길항작용하지 않을 것이고, 예를 들어, 이것은 면역에 대한 VISTA의 억제 효과를 효능작용하거나 길항작용하지 않을 것이다. 오히려 ADC에 의해서 발휘되는 치료 효과는 투여 시 ADC에 포함되는 경우 내재화되고 면역 세포로 방출되어 ADC에 의해 결합된 항원을 발현하는 표적 면역 세포에서만 또는 이에 우선적으로 원하는 항-염증 효과를 발휘하는 그것에 결합된 항-염증제(들), 즉, 화학식 I, II 또는 III의 코티코스테로이드 수용체 효능제에 단독으로 또는 대부분 기인할 것이다.
본 발명의 ADC, 예를 들어, 항-VISTA ADC는 표적 면역 세포, 예를 들어, 골수 세포, T 세포, 호중구, 단핵구, 등에 특이적으로 결합하기 때문에, 본 발명의 ADC는 다수의 면역 세포에서 효력이 있을 것이지만 이러한 스테로이드 화합물이 비-표적 세포에 의해서 내재화될 때 일어날 수 있는, 다수의 항-염증제, 예를 들어, 코티코스테로이드 수용체 효능제, 예컨대, 덱사메타손, 부데소나이드 및 다른 스테로이드에 의해서 발휘되는 유해 부작용을 여전히 완화하거나 예방할 것이다.
추가로, 미경험 및 활성화된 표적 VISTA 발현 면역 세포, 예를 들어, 미경험 및 활성화된 단핵구, 대식세포, T 세포, Treg, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 호중구, 호산구, 수지상 세포, NK 세포 및 골수 세포에 선택적으로 결합하고 내재화하는 본 발명의 ADC, 예를 들어, 항-VISTA ADC는 종래의 유리 스테로이드, 예컨대, 덱사메타손, 부데소나이드 및 다른 스테로이드, 예컨대, 당업계에 이미 식별되고 일반적으로 알려진 것에 비해서 감소된 투여량의 본 발명의 코티코스테로이드 수용체 효능제의 사용을 용이하게 할 수 있다. 또한, 다른 면역 세포 항원을 표적으로 하는 항체에 결합하는 경우 화학식 I, II 또는 III의 본 발명의 코티코스테로이드 수용체 효능제 화합물 또는 이를 함유하는 코티코스테로이드 수용체 효능제-링커 화합물은 이러한 항원을 발현하는 이러한 특정 유형의 면역 세포의 임의의 것 또는 전부가 질환 병리학에 관련된 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 화학식 I, II 또는 III의 코티코스테로이드 수용체 효능제 화합물 또는 이를 함유하는 코티코스테로이드 수용체 효능제-링커 화합물을 포함하는 VISTA ADC의 특정 경우에, 본 발명의 ADC는 항-염증제의 내재화를 표적으로 하고 지시하기 위한 이전에 보고된 ADC, 특히, 면역 세포 내로의 스테로이드의 내재화를 달성하기 위한 것, 예를 들어, CD74, CD163, TNF 및 PRLR을 표적으로 하는 ADC에 비해서 고유한 이점의 조합을 갖는데; 그 이유는 ADC 표적으로서의 VISTA와 본 발명의 ADC에 포함된 항-VISTA 항체의 특정 특징(즉, 생리 pH에서 VISTA 발현 면역 세포에 결합하고 매우 짧은 pK를 보유하지만 그럼에도 불구하고 긴 PD를 발휘함)의 조합된 유익 및 본 명세서에 제공된 신규한 본 발명의 화학식 I, II 또는 III의 코티코스테로이드 수용체 효능제 화합물의 이점 때문이다.
특히, VISTA ADC의 특별한 경우에, 본 발명의 ADC는 예를 들어, 매우 높은 밀도로 VISTA를 발현하는 면역 세포에 결합하고, 이의 매우 짧은 PK에도 불구하고 내부에서 연장된 기간 동안 효능이 있고(항-염증 활성을 발휘함), 따라서 만성 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하는 데 매우 적합하고, 스테로이드의 연장되고 반복된 투여가 치료적으로 보증된다.
또한, 항-VISTA ADC의 특별한 경우에 본 발명의 ADC는 호중구, 골수, T 세포, Treg, 대식세포 및 내피 세포를 비롯한 다양한 범위의 면역 세포를 표적으로 하거나; 알레르기, 염증 및 자가면역 반응 및 병태에 관련된 면역 세포 상에서 발현되는 다른 항원에 결합하는 ADC, 따라서 본 발명의 ADC는 질환, 예컨대, 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 질환, 염증과 연관된 병태, 예컨대, 심장 질환, ARDS, 암 및 이러한 유형의 면역 세포 중 임의의 것 또는 전부에 관련된 감염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC는 박테리아 또는 바이러스 감염, 예컨대, COVID-19, 인플루엔자 바이러스, 폐렴(바이러스 또는 박테리아) 감염 등과 연관된 염증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 VISTA ADC에 제한되지 않는데, 그 이유는 본 출원인이 다른 면역 항원을 표적으로 하는 항체에 연결되는 경우 본 명세서에 제공된 화학식 (I), (II) 및 (III)의 신규한 글루코코티코스테로이드 스테로이드 효능제-링커가 또한 효과적으로 내재화되고 내부에서 활성 스테로이드 페이로드를 방출한다는 것을 보여주었기 때문이다.
추가로, 본 발명의 ADC가 신속한 효능 개시를 갖고, 예를 들어, 이것은 투여 2시간 이내에 항-염증 활성을 발휘할 수 있기 때문에, 이들은 박테리아 또는 바이러스 감염, COVID-19 및 다른 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스, 폐렴(바이러스 또는 박테리아) 감염 등과 연관된 염증 등을 치료/예방하는 것과 관련하여 특히 유익할 수 있고 신속하게 치료되지 않는 경우 사이토카인 폭풍, ARDS 및 더 나쁜 경우에는 시나리오 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있는 급성 치료를 위해서 사용될 수 있다.
더욱이, 항-VISTA ADC의 특별한 경우에, 일부 다른 ADC 표적 항원과 달리 VISTA는 면역 세포에 의해서만 발현되고; 따라서 본 발명의 ADC는 비-표적 세포에 내재화하는 경향이 없을 것이다.
또한, 항-VISTA ADC의 특별한 경우에, 본 발명의 ADC는 B 세포에 결합하지 않고 유리 스테로이드만큼 면역억제성이 아닐 것이며, 이는 본 발명의 ADC를 반복적으로 그리고/또는 연장된 기간 동안 제공받는 대상체에서 유익할 것인데, 그 이유는 만성 스테로이드 사용이 장기간 스테로이드 사용으로 인한 장기간 면역억제의 의도하지 않은 결과일 수 있는 일부 암, 감염 및 기타 병태와 관련이 있기 때문이다. 그러나 본 발명의 ADC가 다른 항원을 표적으로 하는 항체에 결합될 때, 이러한 ADC는 이에 의해 결합되는 이들 특정 유형의 면역 세포 중 임의의 것 또는 모두가 질환 병리학에 관여하는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
추가로, 본 발명의 화학식 I, II 또는 III의 코티코스테로이드 수용체 효능제 화합물, 또는 이를 함유하는 코티코스테로이드 수용체 효능제- 링커 화합물을 포함하는 VISTA ADC의 특별한 경우에, 본 발명의 ADC는 스테로이드 효능을 담당하는 중요한 면역 세포인 Treg에 작용하고, 따라서 이들은 특히 코티코스테로이드 수용체 효능제 화합물을 포함하는 이전 ADC와 관련하여 자가면역, 알레르기 또는 염증 병태 또는 Treg를 수반하는 염증을 치료하는데 광범위하게 또는 구체적으로 더 효과적일 수 있다.
추가로, 본 발명의 화학식 I, II 또는 III의 코티코스테로이드 수용체 효능제 화합물 또는 이를 함유하는 코티코스테로이드 수용체 효능제- 링커 화합물을 포함하는 VISTA ADC의 특별한 경우에, 본 발명의 ADC는 휴지기(미경험) 및 활성화된 면역 세포, 예를 들어, 단핵구, 대식세포, T 세포, Treg, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 호중구, 호산구, 수지상 세포, NK 세포 및 골수 세포(VISTA가 구성적으로 발현됨) 둘 다에 작용하고, 결과적으로 본 발명의 ADC는 알레르기, 염증 및 자가면역 병태의 활성 및 완화 단계 모두에서 활성 상태를 유지할 것이다(항-염증 활성을 유도함).
더욱이, 본 발명의 화학식 I, II 또는 III의 코티코스테로이드 수용체 효능제 화합물을 포함하는 VISTA ADC는 면역 세포가 급성 염증에 중요한 호중구에 작용하기 때문에, 본 발명의 ADC는 급성 염증 및/또는 염증 또는 드문 또는 산발적인 염증 에피소드를 특징으로 하는 자가면역 또는 알레르기 병태를 치료하는 데 유용할 것이다.
또한, 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 신규한 글루코코티코스테로이드 스테로이드 효능제-링커를 포함하는 본 발명의 ADC는 이롭게는 면역 세포에 신속하게 내재화하고 다량의 활성 스테로이드 페이로드를 전달하여 신속하고 연장된 효능을 초래한다.
VISTA ADC의 특별한 경우에, ADC는 면역 세포에 매우 신속하게(예를 들어, 약 30분 이내) 내재화하는 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 VISTA 세포 표면 턴오버가 높기 때문인데, 이는 본 발명의 ADC가 드문 또는 산발적인 염증 에피소드를 특징으로 하는 급성 염증 및/또는 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 병태를 치료하는 데 상당히 적합하다는 것을 추가로 나타낸다.
추가로, 일부 예에서 본 발명의 ADC는 매우 짧은 반감기(PK)를 보유하고 면역 세포에만 결합할 것이기 때문에; 본 발명의 ADC는 종래의(더 긴) pK의 항체, 예컨대, Humira를 포함하는 다른 ADC에 비해서 표적 관련 독성 및 바람직하지 않은 말초 스테로이드 노출(낮은 비-특이적 손실 효과)이 적을 것이다.
더 추가로 일부 실시형태에서 본 발명의 ADC의 생물학적 활성(항-염증 작용)은 내부에 포함된 항-염증 페이로드(스테로이드)에 전적으로 기인하고, 즉, 항체, 예를 들어, 항-VISTA 항체가 침묵 IgG, 예컨대, 침묵 IgG1 또는 IgG2 Fc 영역을 보유하는 예에서, 이것은 VISTA-매개된 면역학적 기능(어떠한 VISTA 생물학도 차단하지 않음)을 도출하지 않는다.
적어도 상기 이점의 조합에 기초하여, 본 발명의 ADC는 급성 및 만성 사용에 상당히 적합해야 하고, 즉, 염증의 감소 및 저해, 질환의 비활성 상의 연장을 위한 그리고 다수의 상이한 유형의 염증, 알레르기 및 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 치료 및 예방 용도 둘 다에 적합할 것이다.
언급된 바와 같이, 일부 실시형태에서 본 발명의 ADC는 짧은 반감기 또는 PK를 보유하는 생리 pH 조건에서 VISTA(일반적으로 인간 VISTA) 발현 면역 세포에 결합하는 항-VISTA 항체를 포함한다. 전형적으로, 이러한 항체는 침묵 Fc를 포함하거나 Fc를 포함하지 않을 것이고, VISTA 발현 세포에 대한 ADC의 결합은 면역에 대한 VISTA 신호전달 또는 VISTA-매개 효과에 대해서 어떠한 효과도 유도하지 않을 것이다.
이에 반해서, 일부 실시형태에서 ADC에서의 항체, 예를 들어, 항-VISTA 항체 또는 또 다른 면역 세포 항원을 표적으로 하는 항체는 기능성 IgG, 예를 들어, 기능성 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함할 것이다. 기능성 IgG2를 포함하는 항-VISTA 항체의 경우에, 이러한 ADC는 VISTA 또는 다른 면역 세포 항원 매개-신호전달 또는 VISTA 또는 다른 면역 세포 항원 연관된 기능, 예컨대, T 세포 증식 및 T 세포 활성의 억제 및 일부 전염증성 사이토카인의 억제를 촉진할 수 있다. 이것은 염증, 알레르기 반응 및/또는 자가면역의 억제에 대한 상가적 또는 상승작용적 효과를 유발할 수 있다.
예시적인 항-VISTA 항체 및 항체 단편, 즉, 생리 pH 조건(약 pH 7.5) 하에서 짧은 혈청 반감기를 보유하는 단편의 CDR 및 가변 서열(예를 들어, 여기서 생리 pH 조건(약 pH 7.5)에서 시노몰거스 원숭이 또는 인간에서 항체 또는 단편의 혈청 반감기는 일반적으로 대략 2.3일±.7일 또는 그 미만이고 설치류(인간 VISTA 넉-인)에서, 인간 VISTA 넉-인 설치류에서는 일반적으로 1 내지 72시간, 1 내지 32시간, 1 내지 16시간, 1 내지 8시간, 1 내지 4시간 또는 1 내지 2시간±.5시간이거나 또는 영장류(시노몰거스 마카크)에서는 약 3.5, 3, 2.5, 또는 2.3일±.5일임)은 도 8, 도 10 및 도 12에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 ADC에 혼입될 수 있는, 즉, 예를 들어, 링커를 통해서, 선택적으로 추가로 헤테로이작용기에 의해서 항-VISTA 항체 및 항-VISTA 항체 단편에 접합될 수 있는 예시적인 염증제는 스테로이드 또는 코티코스테로이드 수용체 효능제, 예컨대, 이전에 일반적으로 기재된 코티코스테로이드, 보다 구체적으로는 부데소나이드, 베클로메타손, 베타메타손, 시클레소나이드(Ciclesonide), 코티솔, 코티손, 코티손 아세테이트, 16-알파 하이드록시프레드니솔론, 덱사메타손, 다이플루오라손, 에타메타소넵, 플루메타손, 플루니솔라이드, 플루오시놀론 아세토나이드, 플루드로코티손, 플루티카손 프로피오네이트(Flovent™, Flonase™), 하이드로코티손, 시클레소나이드, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니솔론, 모메타손, 풀미코트, 트라이암시놀론, 트라이암시놀론 아세토나이드 또는 또 다른 스테로이드 화합물 또는 항-염증 또는 스테로이드 활성을 보유하는 이의 유도체를 포함하고, 특히 본 발명에 따른 화학식 I, II 또는 III의 신규한 스테로이드 및 스테로이드-링커 및 이의 기능성 유도체를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 예시적인 ADC, 스테로이드 및 스테로이드-링커는 하기 실시예, 특히 실시예 3, 예시적인 실시형태 부분에 개시되어 있고, 도 118A 내지 118O에 도시되어 있다.
본 발명의 ADC는 항-염증제, 예컨대, 스테로이드의 사용에 의해서 염증의 완화가 치료적으로 타당한 임의의 병태를 갖는 대상체, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 병태는 급성 또는 만성 염증, 예를 들어, 산발적 또는 간헐적 염증과 연관될 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 대상체는 항-염증제, 예컨대, 코티코스테로이드 수용체 효능제의 반복적인 및/또는 높은 투여량이 필요한 병태를 가질 것이고, 여기서 즉 항-염증제가 네이키드이거나 비접합된 종래의 조건 하에서의 투여는 약물이 바람직하지 않은 부작용, 예컨대, 비-표적화 세포에 대한 독성을 유도할 수 있다. 이러한 병태는 자가면역 및 염증 병태를 포함한다. 이러한 병태의 비제한적인 예는 알레르기, 자가면역, 이식, 유전자 요법, 염증, GVHD 또는 패혈증, 감염, 암을 포함하거나 인간 대상체에서 상기 병태 중 임의의 것과 연관된 염증, 자가면역 또는 알레르기 부작용의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
일부 다른 바람직한 실시형태에서, 대상체는 효능의 신속한 개시가 치료적으로 바람직한 급성 또는 만성 염증 병태 또는 발적, 예를 들어, 반복적인 급성 염증 에피소드, 빈번한 또는 드문 에피소드를 특징으로 하는 염증 병태를 가질 것이고, 선택적으로 항-염증제, 예컨대, 코티코스테로이드 수용체 효능제의 반복적인 및/또는 높은 투여량은 치료적으로 타당하고, 선택적으로 즉, 항-염증제가 네이키드이거나 비접합된 종래의 조건 하에서의 투여는 약물이 바람직하지 않은 부작용, 예컨대, 비-표적화 세포에 대한 독성을 유도할 수 있다. 이러한 병태는 자가면역 및 염증 병태, 암 및 예를 들어, 급성 및/또는 중증 염증 에피소드를 특징으로 하는 염증과 연관된 감염 병태를 포함한다.
이러한 병태의 비제한적인 예는 알레르기, 자가면역, 이식, 유전자 요법, 염증, 암, GVHD 또는 패혈증, 감염(예를 들어, 박테리아, 바이러스 진균, 기생충), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)를 포함하거나 인간 대상체에서 상기 병태 중 임의의 것과 연관된 염증, 자가면역 또는 알레르기 부작용의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
본 발명의 ADC의 사용이 유익할 수 있는 다른 구체적인 예시적인 병태는 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선을 포함한다.
본 발명의 ADC의 사용이 치료적으로 유익할 수 있는 다른 예시적인 병태 및 예는 다음을 포함한다:
(i) 주로 고용량의 스테로이드로만 효과적으로 치료될 수 있는 병태, 선택적으로 류마티스성 다발성근육통 및/또는 거대 세포 동맥염, 환자는 선택적으로 고용량의 스테로이드로 치료된 적이 있거나 치료 중임;
(ii) 스테로이드 사용을 제한하는 동반이환을 갖는 병태, 선택적으로 진성 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH), 병적 비만 무혈관성 괴사/골괴사증(AVN), 녹내장; 스테로이드-유도 고혈압, 심한 피부 취약성 및/또는 골관절염;
(iii) 안전한 장기간 치료제가 사용 가능하지만 고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 바람직한 병태, 선택적으로 AAV, 다발성근염, 피부근염, 루푸스, 염증성 폐질환, 자가면역 간염, 염증성 장 질환, 면역 혈소판감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 통풍 환자(고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 치료적으로 타당함);
(iv) 선택적으로 불확실한 치료 또는 기간 및/또는 스테로이드 투여에 대한 효과적인 대안이 없는 장기간/단기간 치료가 요구되는 피부과적 병태, 선택적으로 스티븐슨 존슨, 다른 중증 약물 발진 병태, 광범위한 접촉 피부염을 포함하는 병태, 다른 중증 면역-관련 피부과적 병태, 예컨대, PG, LCV, 홍피증 등;
(v) 발적/재발에 대해 고용량 코티코스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 COPD, 천식, 루푸스, 통풍, 가성통풍;
(vi) 면역-관련 신경학적 질환, 예컨대, 소-섬유 신경병증, MS(하위세트), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 중증 근무력증 등;
(vii) 혈액학적/종양학 적응증, 선택적으로 고용량의 스테로이드가 치료적으로 타당하거나 유익할 것임;
(viii) 안과적 병태, 선택적으로 포도막염, 홍채염, 공막염 등;
(ix) 영구적인 또는 장기간의 부신 기능부전 또는 2차 부신 기능부전, 선택적으로 의원성 애디슨병과 연관된 병태;
(x) 보통 장기간, 저용량 스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 루푸스, RA, psA, 혈관염 등; 및
(xi) 특별한 부류의 환자, 예컨대, 임산부/수유기 여성, 소아 환자, 선택적으로 성장 장애 또는 백내장이 있는 환자.
본 발명에 따른 ADC 또는 화학식 I, II 또는 II의 신규한 글루코코티코스테로이드 또는 이를 함유하는 스테로이드-링커를 함유하는 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제, 특히 다른 면역억제제 분자 또는 항-염증제 또는 자가면역, 알레르기 및 염증 병태를 치료하는 데 사용되는 다른 치료제, 예컨대, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 후천성 비장 위축, 급성 전방 포도막염, 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 급성 통풍성 관절염, 급성 괴사성 출혈성 뇌백질염, 급성 또는 만성 부비동염, 급성 화농성 수막염 (또는 다른 중추신경계 염증 장애), 급성의 심각한 염증, 애디슨병(Addison's disease), 부신염, 성인 발병 진성 당뇨병(제II형 당뇨병), 성인-발병 특발성 부갑상선기능저하증(AOIH), 무감마글로불린혈증, 무과립구증, 혈관염, 선택적으로 거대 혈관 혈관염, 선택적으로, 류마티스성 다발근육통 및 거대 세포(다카야스(Takayasu)) 관절염을 비롯한 혈관병증, 알레르기성 병태, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 육아종성 혈관염, 알레르기성 과민성 장애, 알레르기성 신경염, 알레르기 반응, 원형 탈모증, 전두 탈모증, 알포트 증후군, 폐포염, 선택적으로 알레르기성 폐포염 또는 섬유화 폐포염, 알츠하이머병, 아밀로이드증, 근위축 측삭 경화증(ALS; 루게릭병), 호산구-관련 장애, 선택적으로 호산구증가증, 아나필락시스, 강직성 척추염, 혈관확장증, 항체-매개 신장염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 항인지질 증후군(APS), 아프타, 아프타성 구내염, 재생불량성 빈혈, 부정맥, 동맥경화증, 동맥경화성 장애, 관절염, 선택적으로 류마티스 관절염, 예컨대 급성 관절염, 또는 만성 류마티스 관절염, 만성 진행성 관절염, 변형성 관절염, 회충증, 아스페르길루스증, 호산구 함유 육아종), 아스페르길루스증, 아스퍼미오제네스(aspermiogenese), 천식, 임의로 기관지성 천식, 기관지 천식, 및 자가-면역 천식, 모세혈관확장성 운동실조, 운동실조성 경화증, 죽상경화증, 자폐증, 자가면역 혈관부종, 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 당뇨병, 자가면역 고환염 및 난소염을 비롯한 고환 및 난소의 자가면역 질환, 콜라겐 질환과 연관된 자가면역 장애, 자가면역 자율신경실조증, 자가면역 귀 질환, 선택적으로 자가면역 내이 질환(AGED), 갑상선염, 예컨대, 자가면역 갑상선염을 비롯한 자가면역 내분비 질환, 자가면역 장병증 증후군, 자가면역 생식선 부전, 자가면역 청각 상실, 자가면역 용혈, 자가면역 간염, 자가면역 간 장애, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 췌장염, 자가면역 다발내분비병증, 자가면역 다선성 증후군 타입 I, 자가면역 망막증, 자가면역 혈소판감소성자반병(ATP), 자가 면역 갑상선 질환, 자가면역 두드러기, 자가면역-매개 위장 질환, 축삭 및 뉴런 신경병증, 발로 질환, 베체트병, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 양성 림프구성 혈관염, 베르게르병(IgA 신병증), 조류 사육자 폐, 실명, 뵈크병(Boeck's disease), 폐쇄성 세기관지염(비-이식) 대 NSIP, 기관지염, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 브루톤 증후군(Bruton's syndrome), 수포성 유천포창, 카플란 증후군(Caplan's syndrome), 심근병증, 심 혈관 허혈, 캐슬맨 증후군(Castleman's syndrome), 복강 질환, 복강 스프루(글루텐 장병증), 소뇌 변성, 뇌 허 혈, 및 혈관화 동반하는 질환, 샤가스병(Chagas disease), 채널병증, 임의로, 간질, CNS의 채널병증, 맥락망막 염, 맥락막염, 자가면역 혈액 장애, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 만성 접촉성 피부염, 만성 호산구성 폐렴, 만성 피로 증후군, 만성 간염, 만성 과민성 폐렴, 만성 염증성 관절염, 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(CIDP), 만성 난치성 염증, 만성 점막피부 칸디다증, 만성 신경병증, 임의로 IgM 다발신경병증 또 는 IgM-매개 신경병증, 만성 폐쇄성 기도 질환, 만성 폐 염증성 질환, 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염) 또는 아급성 갑상선염, 척-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성 유사천포창/양성 점막 유천포창, 코로나바이러스 매개 감염, 예컨대, SARS-CoV-2(COVID-19), SARS-CoV, MERS, SARS-CoV-2 및 연관된 부작용, CNS 염증 장애, CNS 혈관염, 복강 질환, 코간 증후군, 한랭 응집소병, 폴립성 대장염, 대장염, 예컨대, 궤양성 대장염, 궤양 대장염, 콜라겐성 대장염, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 병태, 선천성 심차단, 선천성 풍진 감염, 쿰스 양성 빈혈, 관상 동맥 질환, 콕사키 심근염, CREST 증후군(석회증, 레이노 현상), 크론병, 한랭글로불린혈증, 쿠싱 증후군, 모양체염, 선택적으로 만성 모양체염, 이색성 모양체염, 홍채모양체염 또는 푹스 모양체염, 낭성 섬유증, 사이토카인-유도된 독성, 난청, 퇴행성 관절염, 탈수초성 질환, 임의로 자가면역 탈수초성 질환, 탈수초성 신경병증, 뎅기, 포진성 피부 염 및 아토피성 피부염, 접촉성 피부염을 비롯한 피부염, 피부근염, 급성 염증 요인이 있는 피부병, 데빅병(Devic's disease)(시신경 척수염), 당뇨 병성 거대 동맥 장애, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 미만성 간질성 폐 섬유증, 확장형 심근병증, 원판성 루푸스, 백혈구 누출에 관여된 질환, 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 듀피트렌 구축(Dupuytren's contracture), 에코바이러스 감염, 알레르기성 또는 아토피성 습진을 비롯한 습진, 뇌염, 예컨대 라스무센 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 뇌척수염, 선택적으로 알레르기 뇌척수염 또는 알레르기성 뇌척수염 및 실험적 알레르기 뇌척수염(EAE), 동맥내막 증식증, 심내막염, 내분비 안병증, 자궁내막증, 심내막심근 섬유증, 수정체과민 안내염, 안내염, 알레르기성 장염, 호산구증가증- 근육통 증후군, 호산구성 근막염, 유행성 각결막염, 후천성 수포성 표피박리증(EBA), 상공막, 상공막염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 장기 융기성 홍반, 다형성 홍반, 나병 결절성 홍반, 결절성 홍반, 태아 적모구증, 식도 운동장애, 진성 혼합 한냉글로불린혈증, 벌집뼈, 에반스 증후군, 실험적 알레르기 뇌척수염(EAE), 인자 VIII 결핍, 농부폐, 류마티스성 열, 펠티 증후군(Felty's syndrome), 섬유근육통, 섬유성 폐렴, 사상충증, 초점성 분절성 사구체경화증(FSGS), 식중독, 전두, 위 위축, 거대 세포 관절염(측두 관절염), 거대 세포 간염, 거대 세포 다발근육통, 사구체신염, 신증후군 동반 및 비동반 사구체신염(GN), 예컨대 만성 또는 급성 사구체신염(예를 들어, 원발성GN), 굿패스쳐 증후군, 통풍성 관절염, 과립구 수혈-연관 증후군, 육아종증, 예를 들어, 림프종성 육아종증, 육아종증 다발혈관염 (GPA), 육아종성 포도막염, 그레이브병, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 적상 건선, 발작성 혈색소뇨, 해먼-리치병(Hamman-Rich's disease), 하시모토병, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 혈색소증, 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 예를 들어, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 용혈성 빈혈, A형 혈우병, 헤노흐-쉔라인 자반증, 임신 헤르페스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염, 통각과민, 저감마글로불린혈증, 성선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 특발성 요붕증, 특발성 안면 마비, 특발성 갑상선기능 저하증, 특발성 IgA 신장병, 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신병증, 특발성 신염성 증후 군, 특발성 폐 섬유증, 특발성 스프루, 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), IgA 신장병, IgE-매개 질환, 임의로 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, IgG4-관련 경화 질환, 국한성 회장염, 면역 복합체 신염, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후 군(ARDS)을 비롯한 면역-매개 GN, 면역조절 지질단백질, 봉입체 근염, 감염성 관절염, 항정자 항체로 인한 불임, 포도막 전부 또는 일부의 염증, 염증성 장 질환 (IBD), 염증성 과다증식성 피부 질환, 염증성 근병증, 인슐린-의존성 당뇨병(제1형), 췌도염, 간질성 방광염, 간질성 폐 질환, 간질성 폐 섬유증, 홍채염, 허혈 재-관류 장애, 관절 염증, 소아 관절염, 소아 피부근염, 소아 당뇨병, 소아성 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)을 비롯한 소아 발병(제I형) 당뇨병, 소아-발병 류마티스 관절염, 가와사키 증후군, 건성 각결막염, 키파노소미아시스, 램버트-이튼 증후군, 리슈마니아증, 나병, 백혈구감소증, 백혈구 부착 결핍, 백혈구파쇄성 혈관염, 백혈구감소증, 편평태선, 경화 태선, 목질 결막염, 선형 IgA 피부병, 선형 IgA 질환(LAD), 뢰플러 증후군, 루푸스양 간염, 루푸스(신염, 뇌염, 소아성, 비신성, 신장외, 원반모양, 탈모 포함), 루푸스(SLE), 파종상 홍반성 루푸스, 라임 관절염, 라임병, 림프성 간질성 폐렴, 말라리아, 남성 및 여성 자가면역 불임, 상악, 중간 혈관 혈관염(가와사키병 및 결절성 다발동맥염 포함), 제I형 및 제II형, 및 급속 진행성 GN, 막성 GN(막성 신병증)을 비롯한 막- 또는 막성 증식성 GN(MPGN), 메니에르병(Meniere's disease), 수막염, 현미경적 대장염, 현미경적 다발혈관염, 편두통, 미세 변화 신병증, 혼합 결합 조직 질환(MCTD), 감염성 단핵구증, 무렌 궤양(Mooren's ulcer), 무카-하버만병(Mucha-Habermann disease), 다초점성 운동 신경병증, 다발성 내분비 부전, 다발성 기관 손상 증후군, 예컨대 패혈증, 외상 또는 출혈에 이차적인 것, 다발성 기관 손상 증후군, 다발성 경화증(MS), 예컨대 척수-눈 MS, 다발성 경화증, 멈프스, 근육 장애, 중증 근무력증, 예컨대 흉선종-연관 중증 근무력증, 중증 근무력증, 심근염, 근염, 기면증, 괴사성 소장대장염, 및 경벽성 대장염, 및 자가면역 염증성 장 질환, 괴사성, 피부 또는 과민성 혈관염, 신생아 루푸스 증후군(NLE), 신증, 신증후군, 신경계 질환, 시신경척수염(데빅병), 시신경척수염, 신경근긴장증, 호중구감소증, 비-암성 림프구증가증, 비육아종성 포도막염, 비-악성 흉선종, 안구 및 안와 염증성 장애, 안구 반흔성 유천포창, 난소염, 교감신경성 안염, 안진전 근간대성경련 증후군(OMS), 안진전 또는 안진전 근간대성경련 증후군(OMS), 및 감각 신경병증, 시신경염, 육아종성 고환염, 골관절염, 재발성 류마티스, 췌장염, 범혈구감소증, PANDAS(스트렙토코쿠스 연관 소아성 자가면역 신경정신과 장애), 부신생물성 소뇌 변성, 신경계 부신생물성 증후군(예를 들어, 램버트-이튼 근무력 증후군 또는 이튼-램버트 증후군)을 비롯한 부신생물성 증후군, 부신생물성 증후군, 기생충 질환, 예컨대 레슈마니아, 발작성 야간 혈색뇨(PNH), 파리-롬버르그 증후군(Parry Romberg syndrome), 평면부염(말초 포도막염), 파르소니지-터너 증후군(Parsonnage-Turner syndrome), 파르보바이러스 감염, 유천포창, 예컨대 수포성 유천포창 및 피부 유천포창, 천포창(심상성 천포창 포함), 홍반성 천포창, 낙엽상 천포창, 천포창 점액-막 유천포창, 천포창, 소화성 궤양, 주기성 마비, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈(악성 빈혈증), 악성 빈혈, 수정체항원성 포도막염, 폐경간경변, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 제I형, 제II형 및 제III형, 만성 원발성 다발관절염, 다발연골염(예를 들어, 불응성 또는 재발성 다발연골염), 다발내분비 자가면역 질환, 다발내분비 부전, 다선성 증후군, 선택적으로, 자가면역 다선성 증후군(또는 다분비선 내분비병증 증후군)), 류마티스성 다발성근육통, 다발성근염, 다발성근염/피부근염, 다발신경병증, 급성 다발신경근염, 심장절개술후 증후군, 후방 포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 심근 경색후 증후군, 심장막절개술 후 증후군, 스트렙토코쿠스 감염후 신염, 백신접종 후 증후군, 초로기 치매, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 갑상선기능저하증, 원발성 특발성 점액수종, 원발 림프구증가증(단클론성 B 세포 림프구증가증, 선택적으로 양성 단클론성 감마병증 및 의미 불명 단클론성 감마병증, MGUS 포함), 원발성 점액수종, 원발성 진행성 MS(PPMS), 및 재발성 완화형 MS(RRMS), 원발 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 진행성 전신 경화증, 증식성 관절염, 건선, 예컨대 판상형 건선, 건선, 건선성 관절염, 폐포 단백증, 폐 침윤 호산구증가증, 순수 적혈구 빈혈 또는 무형성증(PRCA), 순적혈구무형성증, 화농성 또는 비화농성 부비동염, 농포성 건선 및 손발톱 건선, 신우염, 괴저성 농피증, 퀘르뱅 갑상선염(Quervain's thyroiditis), 레이노 증후군, 반응성 관절염, 반복 유산, 혈압 반응의 감소, 반사성 교감신경이영양증, 불응성 스프루, 라이터병(Reiter's disease) 또는 증후군, 재발성 다발연골염, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 재관류 손상, 호흡 곤란 증후군, 하지 불안 증후군, 망막 자가면역, 후복막 섬유증, 레이노 증후군(Reynaud's syndrome), 류마티스 질환, 류마티스 열, 류마티즘, 류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 풍진 바이러스 감염, 샘프터 증후군(Sampter's syndrome), 사르코이드증, 주혈흡충증, 슈미트 증후군(Schmidt syndrome), SCID 및 엡스타인-바 바이러스-연관 질환, 공막, 공막염, 손발가락경화증, 경피증, 선택적으로 전신 경피증, 경화성 담관염, 파종성 경화증, 경화증, 예컨대 전신 경화증, 감각 신경성 청각 상실, 혈청음성 척추관절염, 쉬한 증후군, 슐만 증후군, 규폐증, 쇼그렌 증후군(Sjoegren's syndrome), 정자 및 고환 자가면역, 접형 부비동염, 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome), 강직-인간(또는 강직-사람) 증후군, 아급성 박테리아성 심내막염(SBE), 아급성 피부 홍반성 루푸스, 돌발성 난청, 수삭 증후군, 시데남 무도병, 교감신경성 안염, 전신 홍반성 루푸스(SLE) 또는 전신 루푸스 홍반증, 피부 SLE, 전신 괴사성 혈관염, 및 ANCA-연관 혈관염, 선택적으로 척-스트라우스 혈관염(Churg-Strauss vasculitis) 또는 증후군 (CSS)), 척수로, 다카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 모세혈관확장증, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 폐쇄성 혈전혈관염, 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP) 및 자가면역 또는 면역-매개 혈소판감소증, 예컨대 특발성 혈소판감소성자반병(ITP), 예를 들어, 만성 또는 급성 ITP, 혈소판감소성자반병(TTP)을 비롯한 혈소판 감소증, 갑상선중독증, 조직 손상, 톨로사-헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome), 독성 표피 괴사용해, 독성 쇼크 증후군, 수혈 반응, 유아의 일과성 저감마글로불린혈증, 횡단 척수염, 횡단 척수염, 열대성 폐 호산구증가증, 결핵, 궤양성 대장염, 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 두드러기, 선택적으로, 만성 알레르기 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어, 만성 자가면역 두드러기, 포도막염, 전방 포도막염, 포도막망막염, 판막염, 혈관 기능장애, 혈관염, 척추 관절염, 수포성 피부병, 백반증, 베게너 육아종증(육아종증 다발혈관염(GPA)), 비스코트-알드리치 증후군(Tolosa-Hunt syndrome), 및 x-연결된 과다 IgM 증후군의 치료에 사용되는 약물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 ADC 및 화학식 I, II 또는 III의 신규한 코티코스테로이드 및 이를 함유하는 코티코스테로이드-링커는 염증 및 예를 들어, 자가면역 장애, 염증 장애, 감염 질환 및 암을 비롯한 염증과 연관된 질환의 예방 및/또는 치료적 치료 둘 다를 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 ADC의 바람직한 응용 분야는 염증과 연관된 만성 질환의 치료용이다. 더욱이, VISTA 항체 포함 ADC의 특별한 경우에, 실시예에 나타난 바와 같이, 거의 예상치 못하게, 이들 ADC는 내부에 포함된 항-VISTA 항체(이것은 생리 조건에서 VISTA 발현 세포에 결합하고, pH 결합을 변경시키거나 최적화하거나 반감기를 향상시키도록 조작되지 않음)의 짧은 pK, 즉, 전형적으로 cyno에서 대략 2.3일 이하의 pK 및 전형적으로 인간 VISTA 조작된 마우스에서 단지 수 시간의 pK에도 불구하고, 훨씬 더 짧은 반감기(pK)의 항체에 비해서 훨씬 더 연장된 기간(PD) 동안 효력을 유지하는 것을 발견하였다.
본 명세서에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 VISTA ADC 접합체는 시험관내 및 생체내 모델에서 평가되는 경우 면역 세포에서 적어도 14:1 및 심지어는 28:1 또는 더 긴 PD/PK 비율을 제공한다는 것이 입증되었다. (사실 PD/PK 비율은 더 높을 수 있는데, 그 이유는 설치류 또는 비-인간 영장류를 PD를 결정한 시간에 안락사시켰기 때문에 더 긴 효력 평가가 허용되지 않기 때문이었다).
본 출원인이 이들의 확신에 얽매이고자 함은 아니지만, 본 발명의 화학식 I, II 또는 III의 코티코스테로이드 수용체 효능제 화합물을 포함하는 VISTA ADC는 표적 VISTA 발현 세포, 예컨대, 대식세포, T 세포 및 Treg 및 긴 세포 턴오버(수주, 수개월 또는 더 김)를 갖는 면역 세포를 비롯한 다른 VISTA 발현 면역 세포에 매우 많은 양으로 전달된다는 가설이 세워졌다. 본질적으로, 특정 유형의 면역 세포 내에서 저장소 효과(depot effect)가 생성되는 것으로 보이며, 즉, VISTA의 매우 높은 표면 발현으로 인해서 본 발명의 ADC의 많은 양 또는 "저장소"가 이러한 VISTA 발현 면역 세포, 예를 들어, 대식세포 및 골수 세포에 내재화되는 것으로 보인다. 이는 결국 내재화된 ADC를 포함하는 이러한 저장소가 예를 들어, 세포 효소에 의해 면역 세포 내에서 서서히 대사되거나 절단되는 결과를 초래한다. 본 명세서에 개시된 생체내 연구는, 본 발명에 따른 내재화된 ADC의 대사 또는 절단이 분명히 설치류 또는 영장류에서 1주, 2주, 4주 또는 더 긴 기간 동안 일어나기 때문에 숙주의 면역 세포 내에서 치료적 유효량의 스테로이드 페이로드의 점진적이고 장기간의 방출을 제공한다는 것을 나타낸다. 이것은 (ADC 및 내부의 항체의 짧은 pK로 인해서) 그 시점까지 주목할 만한 양의 ADC가 혈청에 남아 있지 않아야 한다는 사실에도 불구하고 일어난다(즉, ADC의 짧은 pK를 기반으로 면역에 대한 치료적으로 유의미한 효과를 도출하기 위해서 충부하지 않은 ADC 분자가 말초 순환에 여전히 남아 있을 것임).
더욱이, 이러한 관찰은 매우 놀라운 반면; 약물 대사는 일반적으로 영장류보다 설치류에서 훨씬 빠르게 발생하기 때문에 예상되고(즉, 약물 대사는 설치류보다 인간에서 훨씬 느림); 또한 VISTA 발현 및 VISTA를 발현하는 면역 세포의 수준이 설치류, 인간 및 비인간 영장류에서 유사하기 때문에 본 발명의 ADC는 인간 및 다른 영장류에서 유사하거나 훨씬 더 큰 PD/PK 비율을 보유할 것이다. 따라서, 본 발명의 ADC는 연장된 약물 효능이 바람직하거나 필요한 치료적 적용에 매우 적합할 것이다.
또한, 본 출원인은 본 발명에 따른 ADC가 화학식 (I), (II) 및 (III)의 신규한 글루코코티코스테로이드 및 스테로이드 효능제-링커에 의해 제공되는 특성으로 인해 이전에 보고된 ADC와 비교하여 본질적인 이점을 갖고, 즉, 이를 함유하는 ADCS는 응집되기 쉬운 것으로 보이지 않고, 높은 DAR을 제공하고, 더욱이 면역 세포를 매우 효과적으로 내재화하고 내부에 많은 양의 활성 페이로드를 전달하여 신속하고 장기간 효능을 나타낸다는 것을 발견하였다. 전술한 내용에도 불구하고, 낮은 DAR, 예를 들어 4.0 이하의 DAR을 갖는 본 발명에 따른 ADC는 본 명세서에서 양호한 효력을 나타내는 것으로 나타났으며, 예를 들어 더 양호한 개발 가능성 특성을 가질 수 있기 때문에 대안적으로 요법에 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 ADC 및 화학식 I, II 또는 III의 신규한 글루코코티코스테로이드의 또 다른 바람직한 용도는 급성 용도, 즉 급성 염증 치료를 위한 것이다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 및 본 발명에 따른 것을 함유하는 ADC는 신속한 효능 개시를 가지며, 예를 들어, 이들은 투여 후 2시간 이내에 신속하게 항-염증 효과를 유도할 수 있다. 본 발명의 항-VISTA ADC의 급성 사용은 본 발명의 항-VISTA ADC가 비-표적 세포가 아닌 항-염증 효과를 도출하는 호중구를 효과적으로 표적화하고 내재화하는 것으로 입증되었기 때문에 추가로 유리하다. 이는 호중구가 염증 반응의 초기 단계에 관여하므로 급성 사용에 특히 유익하며, 따라서 본 발명의 화학식 I, II 또는 III의 글루코코티코스테로이드 및 이를 함유하는 ADC는 또한 급성 염증 적응증을 치료하는 데 매우 적합하다.
본 발명의 ADC 및 화학식 I, II 또는 III의 신규한 코티코스테로이드의 또 다른 바람직한 용도는 유지 요법을 위한 것이다. VISTA ADC의 특별한 경우에, VISTA는 활성화 및 비-활성화(미경험) 면역 세포 둘 다, 예를 들어, 단핵구, 대식세포, T 세포, Treg, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 호중구, 호산구, 수지상 세포, NK 세포 및 골수 세포에서 발현되기 때문에, (VISTA는 이에 의해 구성적으로 발현됨), 본 발명의 ADC는 장기간에 걸쳐 주기적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여는 치료되는 대상체가 염증 반응의 활성 단계에 있을 때뿐만 아니라 대상체가 질환 완화 상태에 있을 때 모두 항-염증 활성을 유도할 것이다. 이것은 많은 만성 자가면역과 마찬가지로 치료적으로 유익하다. 알레르기 및 염증 장애는 환자가 질환과 연관된 염증 및 기타 증상 또는 병리학적 반응을 경험하는 활성 기간 또는 에피소드, 및 염증 및 기타 증상 또는 질환과 연관된 병리학적 반응을 비롯한 질환 증상이 존재하지 않거나 훨씬 덜 심각한(즉, 완화/재발 또는 간헐적) 완화 기간을 특징으로 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 ADC는 활성화 및 비-활성화 면역 세포 둘 다, 예를 들어 단핵구, 대식세포, T 세포, Treg, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 호중구, 호산구, 수지상 세포, NK 세포 및 골수 세포에 결합하기 때문에, 본 발명의 ADC로 치료받은 환자는 질환 완화를 더 효과적으로 유지할 수 있으며, 즉 완화 기간은 더 연장될 것이고/것이거나 질환의 활성 단계는 훨씬 덜 심각한 형태로 나타날 수 있는데, 그 이유는 활성 질환 동안 그리고 완화 동안 표적 면역 세포에 대한 본 발명의 ADC의 항-염증 효능의 유지로 인한 것이다.
더욱이, 본 발명의 ADC는 비-표적 세포, 즉 비-면역 세포에 대해서 어떠한 효과도 없기 때문에 장기간 또는 만성적 사용에 매우 적합할 것이다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 본 발명의 ADC는 비-면역 세포가 아닌 표적 면역 세포에 사실상 배타적으로 작용한다(일부 항-염증 활성이 간에서 검출되었지만, 이는 간이 면역 세포를 포함한다는 사실에 의해 설명될 가능성이 있다.
또한, 본 발명의 ADC의 pK가 짧은(그러나 놀랍게도 여전히 긴 PD를 갖는) 실시형태에서 본 발명의 ADC는 연장된 기간 동안 혈청에 남아 있지 않고, 즉, 이들이 항-염증성 페이로드를 전달하는 면역 세포에 신속하게 결합하고 이에 의해서 내재화되어 연장된 기간 동안 효력이 있고, 이는 분명히 ADC가 면역 세포에 의해 효율적이고 빠르게 대량으로 흡수되고 이러한 면역 세포 내에서 서서히 대사되기 때문이다. 따라서, 본 발명의 ADC는 짧은 기간 동안 말초 순환계에만 존재하기 때문에, 본 발명의 ADC는 긴 pK를 갖는 ADC와 비교할 때 비-표적 세포와 상호작용하는 제한된 기회를 갖는데, 그 이유는 내부에 포함된 항체가 긴 PK(이는 대부분의 치료용 항체에 대해 통상적임)를 보유하기 때문이다. 특정 예는 대부분의 종래의 치료용 항체와 마찬가지로 긴 pK, 즉 대략 1개월을 갖는 Humira를 포함하는 ADC이다.
더 추가로 본 발명의 ADC는 장기간 또는 만성 사용에 상당히 적합할 것인데, 그 이유는 일부 실시형태에서 본 발명에 따른 ADC(특히, FcR을 손상시키고 결합을 보완하도록 조작된 Fc 영역을 포함하는 본 발명에 따른 항-VISTA ADC)의 효능이 전적으로 항-염증성 페이로드, 예를 들어, 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 스테로이드에 기인하기 때문이다. 본질적으로 항체, 예를 들어, 항-VISTA 항체는 이러한 경우에만 표적화 기능을 제공하며, 즉, 이것은 표적 면역 세포에 의한 ADC의 결합 및 내재화를 촉진한다. 그러나, VISTA 발현 면역 세포에 대한 이러한 ADC의 결합은 VISTA의 활성을 조절하지 않으며, 즉, Fc 가교결합을 배제하도록 조작된 Fc를 포함하는 항-VISTA 항체는 VISTA 활성을 길항작용하거나 효능작용하지 않는다. [이는 표적 항원에 결합할 때 생물학적 효과를 유발하는 항체를 포함하는 스테로이드 전달을 위한 기존 ADC(예컨대, Humira ADC)와 대조적이다.] 이것은 ADC 효력이 항-염증 페이로드에만 의존하기 때문에 투여 관점에서 유익할 것이다. 또한, 이는 항-VISTA 또는 다른 면역 세포 항원 표적화 항체가 그렇지 않았으면 염증 완화를 목적으로 하는 약물의 맥락에서 바람직하지 않을 수 있는 전염증성 사이토카인 반응을 일부 예에서 유도할 수 있기 때문에 치료적으로 더 유익하다.
본 발명의 ADC가 사용될 수 있는 급성 및 만성 자가면역 및 염증 적응증은 상기에 언급되어 있고, 후천성 재생불량성 빈혈 +, 후천성 혈우병 +, 급성 파종성 뇌척수염(ADEM) +, 급성 출혈성 뇌백질염(AHLE)/허스트병 +, 무감마글로불린혈증, primary +, 원형 탈모증 +, 강직성 척추염 (AS), 항-NMDA 수용체 뇌염 +, 항인지질 증후군(APS) +, 동맥경화증, 자폐 스펙트럼 장애(ASD), 자가면역 애디슨병(AAD) +, 자가면역 자율신경실조증/자가면역 자율 신경절증(AAG), 자가면역 뇌염 +, 자가면역 위염, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA) +, 자가면역 간염(AIH) +,자가면역 고지혈증, 자가면역 뇌하수체염/림프구성 뇌하수체염 +, 자가면역 내이 질환(AIED) +, 자가면역 림프증식 증후군(ALPS) +, 자가면역 심근염, 자가면역 난소염 +, 자가면역 고환염 +, 자가면역 췌장염(AIP)/면역글로불린 G4-관련 질환(IgG4-RD) +, 자가면역 다선성 증후군, 타입 I, II 및 III +, 자가면역 프로게스테론 피부염 +, 자가면역 돌발성 감각신경성 난청(SNHL)이완불능, 애디슨병, 성인형 스틸병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신장염, 항인지질 증후군, 자가면역 혈관부종, 자가면역 자율신경실조증, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막증, 자가면역 두드러기, 축삭 및 신경성 신경병증(AMAN), 발로병, 베체트병, 양성 점막 유천포창, 수포성 유천포창, 캐슬만병(CD), 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 척-스트라우스 증후군(CSS) 또는 호산구성 육아종증(EGPA), 반흔성 유사천포창, 코간 증후군, 한랭 응집소병, 선천성 심차단, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 당뇨병, 타입 1, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경 척수염)을 포함한다. 원판성 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 식도염 (EoE), 호산성 근막염, 결절성 홍반, 진성 혼합 한냉글로불린혈증, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐렴, 섬유성 폐렴, 거대 세포 심근염, 사구체신염, 굿파스쳐 증후군, 육아종증 다발혈관염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쉔라인 자반병(HSP), 임신성 헤르페스 또는 임신성 유사천포창(PG), 화농성 한선염(HS)(역성 여드름), 저감마글로불린혈증, IgA 신장병, IgG4-관련 경화병, 면역 혈소판감소성자반병(ITP), 포함체 근육염(IBM), 간질성 방광염(IC), 소아 관절염, 소아 당뇨병(타입 1 당뇨병), 소아 근염(JM), 가와사키병, 램버트-이튼 증후군, 백혈구파괴 혈관염, 편평태선, 경화성 태선, 목질결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 루푸스(신장염 및 피부성 포함), 라임병 만성, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염(MPA), 혼합 결합 조직병(MCTD), 무렌 궤양, 무하-하버만병(Mucha-Habermann 질환), 다초점성 운동 신경병증(MMN) 또는 MMNCB, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 미엘린 희소돌기신경교 당단백질 항체 장애, 근염, 기면증, 신생아 루푸스, 시신경 척수염, 호중구감소증, 안반흔성 유사천포창(Ocular cicatricial pemphigoid), 시신경염, 안구간대경련-근간대경련 증후군(OMS), 재발성 류마티스(PR), PANDAS, 부신생물성 소뇌 변성(PCD), 발작성 야간 혈색뇨(PNH), 파리-롬버르그 증후군, 평면부염(말초 포도막염), 파르소니지-터너 증후군, 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈(PA), POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 다선성 증후군 타입 I, II, III, 류마티스성 다발성근육통, 다발성근염, 심근경색후 증후군, 심막절개술후 증후군, 원발성 담즙성 담관염, 원발 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선성 관절염, 순적혈구무형성증(PRCA), 괴저성 농피증, 레이노 증후군, 반응성 관절염, 반사성 교감신경이영양증, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군(RLS), 후복막 섬유증, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 슈미트증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 강직 인간 증후군(SPS), 아급성 박테리아성 심내막염(SBE), 스삭 증후군, 교감성 안염(SO), 타까야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성자반병(TTP), 갑상선 눈질환(TED), 톨로사-헌트 증후군(THS), 횡단 척수염, 타입 1 당뇨병, 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증, 보그트 고야나기 하라다병.
ADC가 치료적으로 효과적일 수 있는 바람직한 적응증은 중증 천식, COPD, 거대 세포 동맥염, ANKA 혈관염 및 IBD(대장염(예를 들어, 궤양성) 및 크론병)를 포함한다. 물론, 본 명세서에서 식별된 질환 상태는 예시적인 것으로 의도된 것이며 모든 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명의 ADC는 동일하거나 상이한 조성물로 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있는 다른 치료제와 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC는 PD-1 또는 PD-L1 효능제, CTLA4-Ig, 사이토카인, 사이토카인 효능제 또는 길항제, 또는 다른 면역억제 수용체 효능제 또는 길항제의 투여를 포함하는 치료 요법으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 ADC와 조합될 수 있는 특정 면역억제 분자의 다른 예는 (예를 들어, CD28 또는 ICOS에 대한) 공자극 신호를 차단하는 항체, CTLA4를 통해 저해 신호를 활성화하는 항체 및/또는 다른 면역 세포 마커에 대한(예를 들어, CD40, CD40 리간드 또는 사이토카인에 대한) 항체, 융합 단백질(예를 들어, CTLA4-Fc 또는 PD-1-Fc) 및 면역억제 약물(예를 들어, 라파마이신, 사이클로스포린 A 또는 FK506)을 포함한다.
본 발명에 따른 ADC에서 변형된 Fc 영역
언급된 바와 같이, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, ADC는 Fc 영역 내에서의 변형을 포함하도록, 전형적으로는 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대, 보체 고정화, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포 세포독성을 변경하도록 조작될 수 있는 Fc를 포함한다. 추가로, 본 발명의 일부 실시형태에서, ADC는 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 화학 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 다시 변경하도록 이의 글리코실화를 변경하도록 변형될 수 있다. 이러한 실시형태는 하기에 추가로 기술되어 있다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스의 넘버링이다.
일 실시형태에서, CH1의 힌지 영역은, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어, 증거되거나 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,677,425호(Bodmer 등)에 추가로 기술되어 있다. CHI의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해서 변경된다.
또 다른 실시형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해서 손상된 스타필로코칼(Staphylococcal) 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내에 도입한다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,165,745호(Ward 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
추가의 다른 실시형태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경되어 항체의 효과기 기능을 변경한다. 예를 들어, 항체가 효과기 리간드에 대해서 변경된 친화도를 갖지만, 모 항체의 항원-결합 능력을 유지하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 친화도가 변경된 효과기 리간드는 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 Cl 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,624,821호 및 5,648,260호(둘 모두 Winter 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 또는 파괴된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,194,551호(Idusogie 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경하여 이에 의해서 보체에 고정되는 항체의 능력을 변경한다. 이러한 접근법은 PCT 공개 제WO 94/29351호(Bodmer 등)에 추가로 기술되어 있다.
추가의 또 다른 예에서, ADC 내의 Fc 영역은 하기 위치에서 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 PCT 공개 제WO 00/42072호(Presta)에 추가로 기술되어 있다. 더욱이, FcyRI, FcyRII, FcyRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위는 매핑되어 있고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기술되어 있다(문헌[Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 256, 290, 298, 333, 334 및 339번 위치에서의 특이적 돌연변이가 FcyRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 나타난다. 추가로, 하기 조합 돌연변이체가 FcyRIII 결합을 개선시키는 것으로 나타난다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A. 추가로, 돌연변이, 예컨대, M252Y/S254T/T256E 또는 M428L/N434S는 FcRn에 대한 결합을 개선시키고, 항체 순환 반감기를 증가시킨다(문헌[Chan CA and Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol 10:301-316] 참조).
추가의 또 다른 실시형태에서, 항체는 생체내 Fab 아암 교환을 파괴하도록 변형될 수 있다. 구체적으로, 이러한 과정은 기능적으로 1가인 b 특이적 항체를 효과적으로 초래하는 다른 IgG4 항체들 간의 IgG4 절반-분자(하나의 중쇄 + 하나의 경쇄)의 교환을 포함한다. 중쇄의 힌지 영역 및 불변 도메인에 대한 돌연변이는 이러한 교환을 파괴할 수 있다(문헌[Aalberse, RC, Schuurman J., 2002, Immunology 105:9-19] 참조).
추가의 또 다른 실시형태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 탈글리코실화된(aglycosylated) 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화되지 않음). 글리코실화는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 부위의 글리코실화를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위가 제거되고, 이에 의해서 그 부위에서 글리코실화가 제거된 하나 이상의 아미노산 치환이 행해질 수 있다. 이러한 탈글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호(Co 등)에 상세하게 기술되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대, 감소된 양의 푸코실 잔기를 항체 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시킨다고 입증되어 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 글리코실화 머시너리를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 성취될 수 있다. 변경된 글리코실화 머시너리를 갖는 세포는 관련 기술 분야에 기술되어 있고, 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 재조합 항체를 발현하여 이에 의해서 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8(a (1,6) 푸코실트랜스퍼라제)가 결핍되어, Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 이의 탄수화물 상에 푸코스가 결핍되어 있다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8 세포주는 2종의 교체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해서 생성된다(미국 특허 공개 제20040110704호(Yamane) 등 및 문헌[Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22] 참조). 또 다른 예로서, 유럽 특허 제EP 1,176,195호(Hanai 등)에는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기술되어 있는데, 이것은 푸코실트랜스퍼라제를 암호화하여, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 1,6 결합-관련 효소를 감소 또는 제거함으로써 저푸코실화(hypofucosylation)를 나타낸다. Hanai 등은 또한 항체의 Fc 영역에 결합하거나 또는 효소 활성도를 갖지 않는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 첨가하기 위해서 낮은 효소 활성도를 갖는 세포주, 예를 들어, 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)을 기술한다. PCT 공개 제WO 03/035835호(Presta)에는 푸코스를 Asn(297)-연결 탄수화물에 부착하는 능력이 감소되고, 또한 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 유발한 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포가 기술되어 있다(또한 문헌[Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 제WO 99/54342호(Umana 등)에는 당단백질-변형 글리코실트랜스퍼라제(예를 들어, P(1,4)-N-아세틸글루코사민일트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주가 기술되어 있고, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체는 항체의 증가된 ADCC 활성도를 초래하는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타낸다(또한 문헌[Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180 참조). 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다(Tarentino, A. L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).
예시적인 실시형태에서 언급된 바와 같이, 항체의 Fc 영역은 FcR 결합을 손상시키도록, 선택적으로는 보체 결합을 손상시키도록 돌연변이된다. 이들 돌연변이는 이들의 예시적인 항체에 포함된 이들 돌연변이를 포함한다. 이들 돌연변이는 L234A/L235A 및 L234A/L235A/E269R/K322A(IgG1 Fc); 및 V234A/G237A/P238s.V309L/A330S/P331S(IgG2 Fc) 중 임의의 것 또는 모두를 포함한다.
본 발명에 따른 ADC의 생체외 사용
적어도 일부 실시형태에 따르면, 면역 세포, 예를 들어, 다른 면역 세포 유형 중에서 단핵구 또는 골수 세포, 호중구, 단핵구, T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 비만 세포, 수지상 세포, Treg 및 다른 조혈 세포는 본 발명의 ADC와 생체외에서 접촉되어 항-염증 반응을 유도할 수 있고, 그 다음 접촉된 세포는 염증의 감소가 치료적으로 바람직한 환자, 예를 들어, 알레르기, 자가면역 또는 염증 병태를 갖는 환자에게 주입되어 면역 반응을 조절한다.
자가면역 질환의 치료를 위한 본 발명의 ADC 및 이를 함유하는 약제학적 조성물의 예시적인 용도
본 명세서에 기재된 ADC 및 화학식 I, II 또는 III의 신규한 스테로이드는 면역계 관련 질환의 치료를 위해서 사용될 수 있다. 선택적으로, 면역계 관련 질환은 자가면역 또는 염증 질환, 예컨대, 이전에 확인된 질환, 예를 들어, 이식 거부, 중증 천식, 대장염 또는 IBD, 이식편대숙주병을 포함한다. 선택적으로 치료는 면역 관련 병태를 치료하는 데 유용한 또 다른 모이어티와 조합된다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 다발성 경화증의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 다발성 경화증의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 류마티스 관절염 또는 다른 류마티스 병태의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 류마티스 관절염의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 IBD의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 IBD의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 건선의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 건선의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 타입 1 당뇨병의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 타입 1 당뇨병의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 포도막염의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 포도막염의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 건선의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 건선의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 쇼그렌 증후군의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 쇼그렌 증후군의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 전신 홍반성 루푸스의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 전신 홍반성 루푸스의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 GVHD의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 GVHD의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 만성 또는 급성 감염 및/또는 이와 연관된 간독성, 예를 들어, 간염의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 만성 또는 급성 감염 및/또는 이와 연관된 간독성, 예를 들어, 간염의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 만성 또는 급성 중증 천식의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 중증 천식의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 거대 세포 동맥염의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 거대 세포 동맥염의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 만성 또는 급성 ANKA 혈관염의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 ANKA 혈관염의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC를 사용한 만성 또는 급성 IBD (대장염 및 크론병)의 치료는 예를 들어, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 ANKA 혈관염의 치료를 위한 임의의 공지된 치료제 또는 방법과 조합될 수 있다.
다시, 본 명세서에서 확인된 질환 상태 및 본 발명의 코티코스테로이드 화합물, 코티코스테로이드-링커 화합물 및 이를 함유하는 ADC를 사용한 제안된 치료는 예시적이고 모든 것이 아님을 이해해야 한다.
상기에 기재된 요법에서, 바람직하게는 상기에 언급되거나 다른 자가면역 또는 염증 병태 중 하나를 갖는 대상체는 본 발명에 따른 ADC가 투여되어 질환 증상이 예방되거나 개선된다.
약제학적 조성물
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 ADC 또는 화학식 I, II 또는 III의 신규한 스테로이드 또는 코티코스테로이드-링커 화합물 중 하나 또는 조합물 및 선택적으로 또 다른 면역억제제 또는 다른 활성제를 함유하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 ADC 또는 화학식 I, II 또는 III의 신규한 스테로이드 또는 이를 함유하는 코티코스테로이드-링커 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 치료적 유효[항-염증성]량의 본 발명에 따른 화학식 I, II 또는 III의 신규한 스테로이드 또는 이를 함유하는 코티코스테로이드-링커 화합물 또는 이를 함유하는 ADC 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
용어 "치료적 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하기에 유효한 본 발명에 다른 작용제의 양을 지칭한다. 본 발명의 치료제는 대상체에게 단독으로, 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합된 약제학적 조성물의 부분으로서 제공될 수 있다. 다수의 예에서, 본 발명에 따른 ADC는 특정 병태를 치료하는 데 유용한 다른 면역치료제 또는 다른 치료제와 조합하여 사용될 것이다.
조성물은, 이의 투여가 수용자 환자에 의해서 관용될 수 있으면 "약제학적으로 허용 가능한 담체"라 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 또는 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해서)에 적합하다.
이러한 조성물은 멸균수, 완충 염수(예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도 및 선택적으로 첨가제, 예컨대, 세정제 및 가용화제(예를 들어, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트), 보존제(예를 들어, 티머졸, 벤질 알코올) 및 벌킹 물질(예를 들어, 락토스, 만니톨)을 포함한다. 비수성 용매 또는 비히클이 또한 하기에 상술된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 담체 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물유, 예컨대, 올리브유 및 주사 가능한 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대, 레시틴에 의해서, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해서 그리고 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉, 단클론성 또는 다클론성 항체 및 항원-결합 단편 및 이를 함유하는 접합체 및/또는 VISTA 단백질 중 임의의 것에 특이적으로 결합하는 대안적인 스캐폴드, 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 또는 다른 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위해서 물질 중에 코팅될 수 있다. 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 약제학적 화합물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성도를 유지하고, 임의의 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기산, 예컨대, 염화수소산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 인 등뿐만 아니라 비독성 유기산, 예컨대, 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 설폰산 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 항산화제의 예는 하기를 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 유-용해성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, a-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타타르산, 인산 등.
이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 상기 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘 모두에 의해서 보장될 수 있다. 또한 등장제, 예컨대, 당분, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사 가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 제공될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약제학적으로 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 임의의 종래의 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 약제학적 조성물 중에서의 이의 사용이 고려된다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물 중에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 멸균되어야 하고, 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 한다. 조성물은 높은 약물 농도에 적합한 용액, 마이크로에멀션, 리포솜 또는 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴에 의해서, 분산액의 경우에는 요구되는 입다 크기의 유지에 의해서 그리고 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 다수의 경우, 조성물 중에 등장제, 예를 들어, 당분, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 솔비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 제공될 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입하고, 필요한 경우, 그 다음 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 배지 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조(동결건조)이다.
멸균 주사 가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입하고, 필요한 경우, 그 다음 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 배지 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조(동결건조)이다.
본 발명의 조성물은 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해서 투여될 수 있다. 통상의 기술자에게 인지될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 모드는 목적하는 결과에 따라서 달라질 것이다. 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 치료제를 위한 바람직한 투여 경로는 혈관내 전달(예를 들어, 주사 또는 주입), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추, 경구, 장, 직장, 폐(예를 들어, 흡입), 코, 국소(경피, 협측 및 설하 포함), 방광내, 유리체내, 복강내, 질, 뇌 전달(예를 들어, 두개내, 대뇌내, 및 대류 강화 확산), CNS 전달(예를 들어, 척추강내, 척추주변, 및 척추내) 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함), 점막경유(예를 들어, 설하 투여), 투여 또는 이식편을 통한 투여, 또는 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 다른 비경구 투여 경로, 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 전달 경로 및/또는 투여 형태를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여가 아닌 투여 모드를 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강 내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 단백질, 치료제 또는 약제학적 조성물은 복강내로 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 ADC는 비-비경구 경로를 통해서, 예컨대, 국소, 상피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
치료 조성물은 관련 기술 분야에 공지된 의학 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 치료 조성물은 니들 피하 주사 장치, 예컨대, 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 개시된 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 널리 공지된 이식편 및 본 발명에서 유용한 모듈의 예는 하기를 포함한다: 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식 가능한 미세-주입 펌프를 개시한 미국 특허 제4,487,603호; 피부를 통해서 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시한 미국 특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시한 미국 특허 제4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위해서 가변적인 유동 이식 가능 주입 장치를 개시한 미국 특허 제4,447,224호; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 제4,439,196호; 및 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 제4,475,196호. 이들 특허는 본 명세서에서 참조에 의해 포함된다. 다수의 다른 이러한 이식편, 전달 시스템 및 모듈이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, ADC는 생체내에서 적절한 분포를 보장하기 위해서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 다수의 고도로 친수성인 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 치료 화합물이 BBB를 통과하는 것을 보장하기 위해서(바람직한 경우), 이것은 예를 들어, 리포솜 중에 제형화될 수 있다. 리포솜의 제조 방법에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조하기 바란다. 리포솜은 특정 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송되고, 따라서 표적화 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 엽산염 또는 바이오틴(예를 들어, 미국 특허 제5,416,016호(Low 등); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체(P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233: 134); pl20(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함하고; 또한 문헌[K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; 및 I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조하기 바란다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 또는 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해서)에 적합하다. 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉, 본 발명에 따른 ADC는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 또는 다른 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위해서 물질 중에 코팅될 수 있다. 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 약제학적 화합물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성도를 유지하고, 임의의 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기산, 예컨대, 염화수소산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 인 등뿐만 아니라 비독성 유기산, 예컨대, 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 설폰산 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 항산화제의 예는 하기를 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 유-용해성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, a-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타타르산, 인산 등. 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 담체 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물유, 예컨대, 올리브유 및 주사 가능한 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대, 레시틴에 의해서, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해서 그리고 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 상기 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘 모두에 의해서 보장될 수 있다. 또한 등장제, 예컨대, 당분, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사 가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 제공될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약제학적으로 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 임의의 종래의 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 약제학적 조성물 중에서의 이의 사용이 고려된다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물 중에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 멸균되어야 하고, 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 한다. 조성물은 높은 약물 농도에 적합한 용액, 마이크로에멀션, 리포솜 또는 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴에 의해서, 분산액의 경우에는 요구되는 입다 크기의 유지에 의해서 그리고 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 다수의 경우, 조성물 중에 등장제, 예를 들어, 당분, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 솔비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 제공될 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입하고, 필요한 경우, 그 다음 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 배지 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조(동결건조)이다.
멸균 주사 가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입하고, 필요한 경우, 그 다음 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 배지 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조(동결건조)이다.
단일 투여형을 생성하기 위해서 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분, 즉, 본 발명에 따른 ADC 또는 신규한 스테로이드 화합물의 양은 치료하고자 하는 대상체 및 특정 투여 모드에 따라서 달라질 것이다. 단일 투여형을 생성하기 위해서 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분, 즉, 본 발명에 따른 ADC 또는 신규한 스테로이드 화합물의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이러한 양은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분의 범위일 것이다.
투여 요법은 최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스(bolus)가 투여될 수 있거나, 몇 개로 분할된 용량이 시간에 걸쳐서 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급 사태에 의해서 지시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여 균일성을 위해서 비경구 조성물을 투여 단위 중에 제형화하는 것이 특히 이롭다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 나타내고; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하기 위해서 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따른 투여 단위 형태를 위한 상세한 내역은 (a) 활성 화합물의 특유한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 이러한 활성 화합물의 컴파운딩 분야에 고유한 제한점에 의해 결정되고 이에 직접 의존적이다.
본 명세서에 개시된 ADC의 투여를 위해서, 투여량 범위는 일반적으로 즉, 스테로이드가 특정 병태를 치료하기 위해서 네이키드 또는 비접합된 형태로 투여되는 종래의 경로를 통해서 투여되는 경우 종래의 스테로이드 화합물, 예컨대, 덱사메타손 또는 부데소나이드의 효능을 위해서 필요한 양에 비해서 치료 효능을 위해서 동일한 양 또는 더 적은 양의 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드를 전달하는 ADC의 양의 투여를 포함할 것이다. 예시적인 실시형태에서, 투여량 범위는 일반적으로 즉, 스테로이드가 특정 병태를 치료하기 위해서 네이키드 또는 비접합된 형태로 투여되는 종래의 경로를 통해서 AI가 투여된 것보다 치료 효능을 위해서 감소된 양의, 예를 들어, 이의 10 내지 90%의 항-염증제, 예를 들어, 덱사메타손 또는 부데소나이드를 전달하는 ADC의 양의 투여를 포함할 것인데, 그 이유는 지금까지 얻어진 결과에 기초하여 본 발명의 ADC는 AI, 예컨대, 스테로이드의 유해 부작용을 감소 또는 제거하는 것 이외에 목적하는 표적 면역 세포에 보다 효과적으로 전달될 것이고 비표적 세포에 더 적게 도달할 것이므로, 이에 의해서 스테로이드의 요구되는 투여량의 효과적인 양을 감소시키고/시키거나 비표적 세포에 대한 효과를 감소시킬 것이라고 예상되기 때문이다.
본 명세서에 개시된 ADC는 다수의 경구로 투여될 수 있다. 단일 투여량은 예를 들어, 3 내지 5일마다, 주마다, 2주마다, 2 내지 3주마다 등일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 목적하는 수준의 혈장 스테로이드 농도를 달성하도록 조정된다. 본 발명의 ADC를 사용하는 치료 또는 예방을 위한 효과적인 투여 요법을 결정하는 것은 비교적 쉬울 수 있는데, 그 이유는 일부 예에서 본 발명의 ADC의 치료 활성이 항-염증 페이로드에 의해서 전적으로 지배되기 때문이다. (본질적으로, 일부 예에서, 항체는 특정 면역 세포만을 표적으로 하고 본 발명의 ADC를 특정 면역 세포에 내재화하고 그 자체는 면역에 대해 어떠한 효과도 유도하지 않는다).
대안적으로, ADC는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있고, 그러한 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방인지 또는 치료인지의 여부에 따라서 달라질 수 있다. 예방적 응용에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐서 비교적 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 치료가 계속된다. 치료적 응용에서, 비교적 짧은 간격으로 비교적 많은 투여량이 때로는 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적이거나 완전한 개선을 나타낼 때까지 필요하다. 그 후, 환자는 예방 요법이 투여될 수 있다. 언급된 바와 같이 본 발명의 ADC는 이러한 용도에 바람직한데, 그 이유는 이것이 매우 짧은 기간 동안 말초 순환에 남아있고, 비-면역 세포에 결합하지 않고, 비-표적 세포 독성을 인식 가능하게 유도하지 않기 때문이다.
본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서, 특정 환자에 대한 바람직한 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양, 조성물 및 투여 모드를 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성도를 비롯한 다양한 약동학 인자, 투여 경로, 투여 시간, 사용될 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 다른 약물, 사용된 특정 조성물과 조합물로 사용된 화합물 및/또는 물질, 치료하고자 하는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적 건강 및 이전 의학적 이력 및 의학 분야에 널리 알려진 유사한 인자에 따라서 달라질 것이다.
예시적인 실시형태
본 발명은 면역 세포 항원, 예를 들어, T 세포 활성화의 인간 V-도메인 Ig 억제인자(인간 VISTA)("A")에 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편, 절단 가능한 및/또는 절단 가능하지 않은 링커("L") 및 적어도 1종의 소분자 항-염증제("AI"), 선택적으로 "Q", 헤테로이작용기" 또는 "헤테로삼작용기"(이것은 링커를 항-VISTA 항체 또는 항체 단편 및 적어도 1종의 소분자 항-염증제("AI")(전형적으로 스테로이드)에 연결하는 데 선택적으로 사용되는 화학 모이어티임)를 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하며, 상기 ADC는 하기 화학식으로 표현된다:
"A-(Q-L-AI)n" 또는 "(AI-L-Q)n -A"
상기 식에서, "n"은 적어도 1이고, 12 이상만큼 클 수 있고, ADC 또는 이를 함유하는 조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우, 항체에 의해서 결합되는 항원을 발현하는 세포, 예를 들어, VISTA 발현 면역 세포, 선택적으로 단핵구, 골수 세포, T 세포, Treg, 호산구, CD4 또는 CD8 T 세포, 호중구에 우선적으로 전달되고; 소분자 항-염증제는 선택적으로 생리 조건(약 pH 7.5)에서 상기 면역 세포에 기능적으로 내재화하고, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-VISTA 항체 또는 항원 결합 단편은 생리 pH(약pH 7.5)에서 혈청에서 짧은 생체내 혈청 반감기, 선택적으로 약 70시간 이하, 약 60시간 이하, 50시간 이하, 40시간 이하, 30시간 이하, 24시간 이하, 22 내지 24시간 이하, 20 내지 22시간 이하, 18 내지 20시간 이하, 16 내지 18시간 이하, 14 내지 16시간 이하, 12 내지 14시간 이하, 10 내지 12시간 이하, 8 내지 10시간 이하, 6 내지 8시간 이하, 4 내지 6시간 이하, 2 내지 4시간 이하, 1 내지 2시간 이하, 0.5 내지 1.0시간 이하 또는 0.1 내지 0.5시간의 설치류(인간 VISTA 넉-인 마우스 또는 래트)에서 생리 pH(약pH 7.5)에서 혈청에서 생체내 혈청 반감기 및/또는 약 3, 2.5 또는 2.3±.7일 이하의 영장류(예를 들어, 인간 또는 시노몰거스 마카크)에서의 혈청 반감기를 갖는다.
본 발명의 ADC에 혼입될 수 있는 예시적인 절단 가능한 및 절단 가능하지 않은 링커는 본 명세서에 이미 확인되어 있고 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따른 ADC에 사용될 수 있는 이러한 유형의 링커의 예 및 특정 유형이 하기에 추가로 식별된다.
언급된 바와 같이, 스테로이드 화합물은 상이한 병태, 예컨대, 자가면역, 알레르기 및 염증 장애, 암 및 감염 질환과 연관된 염증을 저해하는 데 있어서 매우 효능이 있지만, 질환의 만성 치료에서의 이의 유용성은 이들이 본 발명에 따른 ADC에 혼입될 때 개선될 심각한 부작용으로 인해서 제한적이다.
특히 본 발명은 AI가 하기 일반 구조를 포함하는 스테로이드(글루코코티코이드 효능제)를 포함하는 본 발명에 따른 ADC를 포함한다:
구체적으로 본 명세서에는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 글루코코티코이드 효능제 화합물:
화학식 (I)
상기 식에서, X는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반(쿠반e)으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되고;
Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반(쿠반e)으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되며;
Y는 CHR1, O, S 및 NR1로부터 선택되고;
E는 CH2 및 O로부터 선택되며;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아니며;
X에 대한 G의 연결부는 선택적으로 C1-3 알킬 및 에틸렌 옥사이드로부터 선택될 수 있고, 이들 각각은 N, S 및 O으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬로 추가로 치환되고;
Z에 대한 X의 연결부는 X 및 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있고;
치환체 NR1R2는 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있으며;
R1은 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택되되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
R1이 H인 경우, R2는 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택될 수 있되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
R1이 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬 또는 헤테로아릴인 경우, R2는 하기로부터 선택된 작용기일 수 있고:
[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J,
(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-V-J,
(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J, 및
[V]k-(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-J,
상기 식에서, m = 1-6이고, k = 0-1이며, W의 각각의 순열은 독립적으로 H, R3에서 종결되는 분지형 알킬 쇄인 [(CH2)nR3](식에서, n = 1-4임) 및 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기로부터 선택될 수 있고;
R3은 H, 메틸, 에틸, 아이소프로필, OH, O-알킬, NH2, NH-알킬, N-다이알킬, SH, S-알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴 치환체는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택될 수 있고;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,
로부터 선택된 반응성 기이고
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이며;
R5는 -CH2OH, -CH2SH, -CH2Cl, -SCH2Cl, -SCH2F, -SCH2CF3, 하이드록시, -OCH2CN, -OCH2Cl, -OCH2F, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH2CN, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 수소 및 C1-10 알킬로부터 독립적으로 선택되며;
Q는 H, , C(O)R8(식 중, R8은 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬임) 또는 (C=O)NR4CHnNR4(C=O)OCH2-(V)n-J(식 중, n=1-4이고 R4 =H, 알킬 또는 분지형 알킬임) 또는 P(O)OR4일 수 있고;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되며; 달리 명시되지 않는 한, 모든 가능한 입체이성질체가 청구되고, 추가로 선택적으로, X 및 Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, [1.1.1]바이사이클로펜탄 및 바이사이클로 [2.2.2]옥탄으로부터 독립적으로 선택되고; Y는 CH2 및 O로부터 선택되며; W의 순열은 CH2CH2CO2H 및 H로부터 독립적으로 선택되고, 추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아님;
또는
하기 화학식 (II)의 구조를 보유하는 글루코코티코이드 효능제 화합물:
화학식 (II)
상기 식에서,
Y는 CH2 및 O로부터 선택되며;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
L은 H 및 F로부터 선택되고;
R5는 -CH2OH, -SCH2F 및 로부터 선택되고;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되며;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,
로부터 선택된 반응성 기이고
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me임;
또는
하기 화학식 (III)의 구조를 보유하는 글루코코티코이드 효능제 화합물이 제공된다:
화학식 (III)
상기 식에서,
Y는 CH2 및 O로부터 선택되며;
E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
L은 H 및 F로부터 선택되고;
R5는 -CH2OH, -SCH2F 및 로부터 선택되고;
A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되며;
V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,
로부터 선택된 반응성 기이며;
R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이다.
I. 예시적인 링커
언급된 바와 같이 상이한 링커가 본 발명에 따른 ADC에 혼입될 수 있다. 이러한 링커는 정의 부분에 이미 식별되어 있고 "링커"는 정의되어 있다. 추가로, 본 발명에 따른 ADC에 혼입될 수 있는 예시적인 링커가 하기에 식별되어 있다:
A. 희생 링커 ADC
(I)
[상기 식에서,
Ab = 항체, 바람직하게는 생리 pH에서 인간 면역 세포에 결합하는 항체, 바람직하게는 인간 VISTA 면역 세포에 결합하는 항-VISTA 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
NH페이로드 = 이며;
REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨];
(II)
[Ab = 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
NH페이로드 = 이며;
REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨];
(III)
[Ab = 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이거나 존재하지 않고;
NH페이로드 = 이며;
REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
RT= AA 또는 임];
(IV)
[Ab = 항체, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
O페이로드 = 또는 임];
(V)
[Ab = 항체이고;
L = 링커이며;
AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이거나 존재하지 않고;
O페이로드 = 또는 임;
RT= AA 또는 임];
B. 아미노산(AA) 링커
(I) 카텝신에 의해서 절단되는 서열
a. 단일 아미노산 링커
b. 다이펩타이드 링커
c. 트라이펩타이드 링커
(I) Legumain 절단 가능한 링커
상기 식에서,
L = 링커이며;
Ab = 항체이고;
는 페이로드 또는 희생 링커에 대한 부착점을 나타낸다.
II. 예시적인 항체 접합 전략
상이한 접합 전략을 사용하여 항-VISTA 항체를 링커 및 페이로드(스테로이드 또는 다른 항-염증 화합물)에 접합할 수 있다. 예시적인 ADC 및 링커 페이로드를 생성하기 위한 상세한 합성 방법이 실시예에 제공된다. 추가로, 예시적인 접합 전략이 하기에 제공된다:
(I) 페이로드-링커-J
상기 식에서 페이로드는 하기이다:
링커 = Q, R1 또는 R2이고
J는 Ab 상의 상보적 작용기와 반응하여 항체-약물 접합체를 형성하기에 적합한 작용기이다.
J는 하기로부터 선택되고:
는 Q, R1 또는 R2로부터 선택된 링커에 대한 J의 부착점을 나타낸다.
상기 식에서, R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 또는 토실레이트이고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐이며, R34는 H, Me 또는 피리딜이고;
-OH기는 예를 들어, 아스파트산 또는 글루탐산 측쇄 상의 항체 상의 카복시기와 에스터화될 수 있다.
-CO2H기는 항체 상의 (예를 들어, 라이신 측쇄 상의) 아미노기와 아마이드화되거나 -OH기와 에스터화될 수 있다.
N-하이드록시석신이미드기는 기능적으로 활성화된 카복실기이고, (예를 들어, 라이신으로부터의) 아미노기와의 반응에 의해서 편리하게 아마이드화될 수 있고;
말레이미드기는 마이클 첨가 반응으로, (예를 들어, 설프하이드릴 작용기를 도입하기 위해서 항체의 화학 변형으로부터 또는 시스테인으로부터) 항체 상의 -SH기와 접합될 수 있고;
항체가 접합에 사용 가능한 -SH인 시스테인을 갖지 않는 경우, 라이신 잔기의 측쇄 내의 ε-아미노산을 2-이미노티올란 또는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트("SPDP")와 반응시켜 유리 티올(-SH)기-생성 시스테인 대용체를 도입한다. 티올기를 말레이미드 또는 다른 친핵성 억셉터기와 반응시켜 접합을 달성할 수 있다.
항체 Ab를 Sigma-Aldrich로부터 입수 가능한 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산카복실산 N-하이드록시석신이미드 에스터("SMCC") 또는 이의 설폰화 변이체인 설포-SMCC로 변형시켜, 이것에 말레이미드기를 도입할 수 있다. 그 다음, 링커 상에 -SH기를 갖는 약물-링커 화합물을 사용하여 접합을 달성할 수 있다.
아자이드기(-N3)가 스트레인드(strained) 사이클로옥틴에 첨가되는 구리-무함유 "클릭 화학"은 1,2,3-트라이아졸 고리를 형성한다. 아자이드는 항체 상에 위치되고 사이클로옥틴은 약물- 링커 모이어티 상에 위치되거나, 그 역도 가능하다. 바람직한 사이클로옥틴기는 다이벤조사이클로옥틴(DBCO)이다.
비-자연 아미노산을 항체에 도입하고, 비-자연 아미노산은 약물 모이어티 내의 반응성 작용기와의 접합을 위한 작용기를 제공한다. 예를 들어, 비-자연 아미노산 p-아세틸페닐알라닌이 항체 또는 다른 폴리펩타이드에 혼입될 수 있다. p-아세틸페닐알라닌 내의 케톤기는 링커-약물 모이어티 상의 하이드록실아미노기와의 옥심 형성을 통한 접합 부위일 수 있다. 대안적으로, 비-자연 아미노산 p-아지도페닐알라닌(또는 p-아지도메틸-l-페닐알라닌)을 항체에 혼입시켜 DBCO와의 클릭 화학을 통한 접합을 위한 아자이드 작용기를 제공하여 1,2,3-트라이아졸 고리를 형성할 수 있다.
또 다른 예는 스트레인드 알켄인 노보넨, 트랜스-사이클로옥텐 또는 사이클로프로펜을 함유하는 비자연 아미노산의 혼입일 것인데, 이것은 테트라진과의 역 전자 요구 딜즈 엘더(inverse electron demad Diels Alder) "클릭 화학" 반응을 겪어서 바이사이클릭 다이아진 생성물을 형성할 수 있다.
또 다른 접합 기술은 효소인 트랜스글루타미나제(바람직하게는 스트렙토마이세스 모바랜시스(Streptomyces mobaraensis)로부터의 박테리아 트랜스글루타미나제 또는 BTG)를 사용한다. BTG는 글루타민의 측쇄 카복스아마이드(아민 억셉터)와, 예를 들어, 라이신의 ε-아미노기 또는 5-아미노-n-펜틸기일 수 있는 알킬렌아미노기(아민 도너) 사이에 아마이드 결합을 형성한다. 전형적인 접합 반응에서, 글루타민 잔기는 항체 상에 위치하는 반면, 알킬렌아미노기는 링커-약물 모이어티 상에 위치한다.
III. 예시적인 항체 접합체
목적하는 면역 세포 항원을 표적으로 하는 항체 또는 단편, 예를 들어, 항-VISTA 항체(이것은 생리 pH에서 인간 VISTA에 선택적으로 결합하고 이미 정의된 바와 같이 짧은 PK를 가짐)), 하나 이상의 절단 가능한 및/또는 절단 가능하지 않은 링커 및 선택적으로 희생 링커에 부착된 하나 이상의 페이로드(스테로이드 또는 다른 항-염증 화합물)를 선택적으로 포함하는 본 발명에 따른 ADC 접합체는 상기에 기재된 상세한 합성 방법을 사용하여 그리고 실시예에 개시된 바와 같이 생성될 수 있다. 일부 예시적인 ADC 구조 및 접합 방법을 하기에 제공한다:
(I) 바람직한 예
는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 부착점을 나타낸다
는 시스테인 잔기의 황 원자를 통한 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 부착점; 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 호변이성질체, 입체이성질체, 및/또는 이의 입체이성질체의 혼합물을 나타낸다.
는 링커 또는 AA에 대한 부착점을 나타낸다.
IV. 예시적인 페이로드-링커 구조
링커에 부착된 상이한 페이로드(스테로이드 또는 다른 항-염증 화합물)는 상기에 기재된 상세한 합성 방법을 사용하여 그리고 실시예에 개시된 바와 같이 생성될 수 있다. 예시적인 페이로드-링커 구조는 하기뿐만 아니라 도 118A 내지 도 118O에 제공되어 있다:
(I) 페이로드-링커-J
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA)이고,
J= 알콕시아민임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA)이고,
J= 브로모아세틸임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA)이고,
J= 다이벤질사이클로옥틴임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA)이고,
J= 하이드록시석신이미드임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA)이고,
J= 말레이미드임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA)이고,
J= 테트라진임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA)이고,
J= TG 접합임.
(II) 페이로드-링커-J
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 알콕시아민임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 브로모아세틸임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 다이벤조사이클로옥틴임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 하이드록시석신이미드임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 말레이미드임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 테트라진임.
상기 식에서,
링커 = 프로테아제 절단 가능한 서열(AA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 아민임.
(II) 페이로드-링커-J
상기 식에서,
링커 = 글루쿠로니다제 절단 가능한 당(GlcA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 알콕시아민임.
상기 식에서,
링커 = 글루쿠로니다제 절단 가능한 당(GlcA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 브로모아세틸임.
상기 식에서,
링커 = 글루쿠로니다제 절단 가능한 당(GlcA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 다이벤조사이클로옥틴임.
상기 식에서,
링커 = 글루쿠로니다제 절단 가능한 당(GlcA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 하이드록시석신이미드임.
상기 식에서,
링커 = 글루쿠로니다제 절단 가능한 당(GlcA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 말레이미드임.
상기 식에서,
링커 = 글루쿠로니다제 절단 가능한 당(GlcA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 테트라진임.
상기 식에서,
링커 = 글루쿠로니다제 절단 가능한 당(GlcA) + 희생 링커 파라 아미노 벤질(PAB)이고,
J= 아민임.
(IV) 페이로드-링커-J
페이로드에 대한 링커-J 접합의 대안적인 부위(C11-OH).
INX-SM-3을 페이로드 예로서 사용한다.
(IV) 페이로드-링커-J
페이로드에 대한 링커-J 접합의 대안적인 부위(C17).
INX-SM-3을 페이로드 예로서 사용한다.
V. 예시적인 페이로드-링커-Ab 접합체(INX-SM-3은 예시적인 페이로드임)
본 명세서에 기재된 pH 결합/PK 특성을 갖는 면역 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-VISTA 항체 또는 단편, 하나 이상의 링커 및 하나 이상의 페이로드(스테로이드 또는 다른 항-염증 화합물)을 포함하는 상이한 ADC 접합체는 상기에 기재된 상세한 합성 방법을 사용하여 그리고 실시예에 개시된 바와 같이 생성될 수 있다. 예시적인 스테로이드 페이로드(INX-SM-3)를 포함하는 일부 예시적인 ADC를 하기에 제공한다. 다른 예시적인 ADC, 즉, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드 화합물을 포함하는 것은 실시예에 개시되어 있고 본 발명에 따른 다른 스테로이드 페이로드를 추가로 포함할 수 있다.
알콕시아민 + 케톤 접합(C11-OH 연결됨)
아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합(C11-OH 연결됨)
할로아세틸 + 시스테인 접합(C11-OH 연결됨)
말레이미드 + 시스테인 접합(C11-OH 연결됨)
테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합(C11-OH 연결됨)
트랜스 글루타미나제를 사용한 아민+글루타민 접합(C11-OH 연결됨)
알콕시아민 + 케톤 접합(C17)
아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합(C17)
시스테인에 대한 할로아세틸 접합(C17)
시스테인에 대한 말레이미드 접합(C17)
테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 (C17)
트랜스 글루타미나제를 사용한 아민 + 글루타민 접합(C17)
N-연결된 페이로드-링커-Ab ADC
화학식 I, II 및 III 의 스테로이드 페이로드, 스테로이드-링커 페이로드 및 이를 함유하는 ADC의 치료 응용
본 발명에 따른 합성 글루코코티코이드 효능제를 포함하는 ADC는 상기에 기재된 바와 같이 그리고 하기 실시예에서와 같이 생성될 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 내부에 함유된 항체는 생리 pH에서 면역 세포에 결합하고 또한 짧은 PK를 보유하는 항-인간 VISTA 항체 또는 단편을 포함할 것이거나 또 다른 면역 세포 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편, 바람직하게는 표적 면역 세포에 효율적으로 내재화하고, 바람직하게는 비-표적 세포에 실질적으로 결합하지 않거나 내재화하지 않는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 일반적으로 본 발명의 ADC는 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드 또는 이를 함유하는 스테로이드-링커 및 특정 유형의 면역 세포 상에서 발현되는 항원, 바람직하게는 표적 면역 세포 상에서만 발현되는 항원에 결합하거나, 항원을 발현하는 비-표적 세포에 비해서 표적 면역 세포 상에서 실질적으로 더 높은 수준으로, 예를 들어, 적어도 2배, 4배, 10배 더 높게 또는 이를 초과하게 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 것이다.
이들 ADC는 염증, 알레르기, 자가면역, 및 예를 들어, 본 명세서에 개시된 자가면역 장애, 염증 장애, 알레르기 장애 및 암 병태를 비롯한 염증, 자가면역 또는 알레르기와 연관된 질환의 예방 및/또는 치료적 치료를 위해서 사용될 수 있다. 다시, 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드를 포함하는 것을 비롯한 본 발명의 ADC의 바람직한 응용 분야는 염증 또는 자가면역과 연관된 만성 질환의 치료용이다.
본 명세서에 제시된 바와 같이, 본 발명의 VISTA 표적화 ADC는, 생리 조건에서 VISTA 발현 세포에 결합하고 pH 결합을 변경하거나 최적화하도록 조작되지 않은 내부에 포함된 항-VISTA 항체의 짧은 pK(즉, 전형적으로 cyno에서는 대략 2.3일 이하이고, 인간 VISTA 조작된 마우스에서는 70시간 이하, 약 60시간 이하, 50시간 이하, 40시간 이하, 30시간 이하, 24시간 이하, 22 내지 24시간 이하, 20 내지 22시간 이하, 18 내지 20시간 이하, 16 내지 18시간 이하, 14 내지 16시간 이하, 12 내지 14시간 이하, 10 내지 12시간 이하, 8 내지 10시간 이하, 6 내지 8시간 이하, 4 내지 6시간 이하, 2 내지 4시간 이하, 1 내지 2시간 이하, 0.5 내지 1.0시간 이하 또는 0.1 내지 0.5시간 이하)에도 불구하고, 항체의 훨씬 더 짧은 반감기(PK)에 비해서 연장된 기간(PD) 동안 효력을 유지하는 것을 발견하였다.
본 명세서에 나타난 바와 같이, 이러한 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는 본 발명에 따른 ADC 접합체는 생체내 모델에서 평가되는 경우 적어도 14:1 및 28:1의 PD/PK 비율을 제공하는 것으로 입증되었다. 다시, 본 출원인이 이들의 확신에 얽매이고자 함은 아니지만, 이러한 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는 본 발명의 ADC는 긴 세포 턴오버(수주, 수개월 또는 그 초과)를 갖는 표적 VISTA 발현 세포, 예컨대, 대식세포에서 매우 많은 양으로 전달된다는 가설을 세웠다. 본질적으로, 저장소 효과가 생성될 수 있고, 즉, VISTA의 매우 높은 발현으로 인해서 즉, 다량의 본 발명의 ADC가 VISTA 발현 면역 세포에 내재화된 것으로 보이며, ADC가 예를 들어, 세포 효소에 의해서 서서히 대사되거나 절단될 때 치료적 유효량의 스테로이드 페이로드가 면역 세포 내에 서서히 그리고 장기간 방출된다. 그러나, 본 발명에 따른, 즉, 화학식 I, II 또는 III의 스테로이드 페이로드를 포함하는 ADC는 다른 항원, 전형적으로 인간 면역 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다는 것이 강조되어야 한다. 사실, 본 실시예에서 본 출원인은 상이한 면역 세포 항원을 표적으로 하는 항체를 포함하는 본 발명에 따른 스테로이드 페이로드를 포함하는 ADC는 또한 목적하는 효력 특성을 보유한다.
본 발명에 기재된 바와 같이, 하기 실시예는 본 발명 및 이의 내재하는 이점을 추가로 설명하기 위해서 제공된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 예시적인 실시형태를 기술한다.
실시예에서 사용된 약어
Ab 항체
AF488 Alexa Fluor 488
ADC 항체 약물 접합체
BSA 소 혈청 알부민, V 분획
CD14 단핵구 분화 항원 CD14
CD20 분화 항원 CD20
CD4 T-세포 표면 당단백질 CD4
CD8 T-세포 표면 당단백질 CD8
CD66b 과립구 GPI-연결된 당단백질
SSC 사이드 스캐터(side scatter)
CD25 IL-2R α 쇄
CD127 IL-7 수용체 α 쇄
ConA 콘카나발린 A
CPT 시트르산/인산염, 0.05% Tween 20 함유
CPTB: 시트르산/인산염, 0.05% Tween 20 및 1% BSA 함유
DAR 약물 항체 비율
Dex 덱사메타손
ECD 세포외 도메인
FA 폼알데하이드
FACS 형광 활성화 세포 분류
FBS 우태아 혈청
Fc 항체의 중쇄 불변 영역(힌지/CH2/CH3)
FMO 형광 - 1개의 대조군(Fluoresence Minus One Control)(모든 형광단 - 1개의 형광단으로 염색된 실험 세포)
GC 글루코코티코이드
h 시간
HIC 소수성 상호작용 크로마토그래피
HMW 고분자량
i.p. 복막
i.v. 정맥내
KI 넉-인
LAL 리물러스 아메바양세포 용해물(Limulus Amebocyte Lysate)
LOD 검출 한계
LOQ 정량 한계
LPS 지질다당류
M 몰 농도
mAb 단클론성 항체
MFI 중간 형광 강도
min 분
MS 질량 분석법
mTNFα 막 종양 괴사 인자 알파
pAb 단클론성 항체
PBS 인산염 완충 식염수
PBMCS 말초 혈액 단핵 세포
PBS 인산염 완충 식염수
PD 약력학
PK 약동학
PRM 복막 상주 대식세포
PT 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS
PTB 0.05% Tween 20 및 1% BSA를 함유하는 PBS
PTS 휴대용 시험 시스템
QC 품질 제어
RP-HPLC 역상 - 고성능 액체 크로마토그래피
RPMI RPMI 1640, 기본 배양 배지
RSV 호흡기 세포융합 바이러스
RT 실온
SEC 크기 배제 크로마토그래피
SPR 표면 플라스몬 공명
SSC 사이드 스캐터
TMDD 표적 매개 약물 배치
WB 전혈
실시예 1: 예시적인 스테로이드-항-VISTA 항체 접합체의 합성 및 특징규명
A. 합성
링커 A의 합성을 위한 반응식
절차
화합물 2의 제조를 위한 일반적인 절차
다이클로로메탄/아세토나이트릴(500㎖/100㎖)) 중 화합물 1(3.0g, 7.64m㏖, 1.0eq)의 용액에 환식 무수물(3.0g, 30.58m㏖, 4.0eq) 및 DMAP(1.8g, 15.29m㏖, 2.0eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 2시간 동안 교반하고 혼합물을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 DCM/MeOH(10%에서 15%로) + 0.1% AcOH로 용리시키는 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피로 정제시켜 화합물 2(3.2g, 85%)를 백색 고체로서 제공하였다.
TLC: DCM/MeOH = 10:1, UV
Rf (화합물 1) = 0.45
Rf (화합물 2) = 0.30
LC-MS: 394.40(M+1)
NMP(4㎖) 중 2(220㎎, 0.45m㏖) 및 3(230㎎, 0.67m㏖)의 용액에 HATU(342㎎, 0.90m㏖) 및 DIPEA(232㎎, 1.8m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 rt에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 분취용-HPLC(ACN/H2O, 0.1% HCOOH)로 정제시켜 링커 A(122㎎, 39%)를 제공하였다.
LCMS: 703[M+H],
1H NMR(CDCl3, 300MHz) (δ, ppm) 7.20 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 6.73 (s, 2 H), 6.52 (br, 1 H), 6.33 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 6.11 (s, 1 H), 4.91 (q, J = 17.3 Hz, 2 H), 4.35 (d = 9.3 Hz, 1 H), 3.76 - 3.42 (m, 10 H), 3.03 (m, 1 H), 2.79 (m, 2 H), 2.65 - 2.56 (m, 3 H), 2.42 - 2.06 (m, 7 H), 1.84 - 1.63 (m, 3 H), 1.22 (m, 1H), 1.02 (s, 3 H), 0.90 (d, J = 7.2 Hz, 3 H).
19F NMR(CDCl3) (δ, ppm) -166.09 (q).
링커 A를 갖는 접합체의 제조를 위한 일반적인 반응식
항체당 8개의 링커 A를 접합시키기 위해서, 항체를 PBS 완충제 pH 7.4에서 10mg/㎖ 농도로 완충제 교환시키고, 그 후 7당량의 TCEP를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 환원된 항체를 2mM EDTA를 함유하는 50mM 보레이트 완충제 pH 8.0을 사용하여 PD-10 칼럼(GE Healthcare)으로 완충제 교환시키고, 그 후 12당량의 링커 A(DMSO 중에서 10mM 스톡 용액으로서 새로 제조됨)를 첨가하고, 반응물을 튜브 리볼버(revolver) 내에 주변 온도에서 10rpm으로 1시간 동안 정치시켰다. 항체당 8개의 링커-A를 함유하는 접합체를 PBS 완충제 pH 7.4를 사용하는 PD-10 탈염 칼럼을 사용하여 정제시켰다. 용리 후, 접합체를 추가로 완충제 교환시키고 30kDa 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 Amicon Ultra 15㎖ Centrifugal Filters를 사용하여 목적하는 농도까지 농축시켰다. 질량 분석법. 약물 대 항체 비율(DAR)을 결정하기 위해서, 접합체를 25mM의 DTT와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 환원된 접합체를 물에서 50배 희석시키고, Xevo G2-S QToF 질량 분석기에 접속된 Waters ACQUITY UPLC에서 분석하였다. 디컨볼루팅된(deconvoluted) 질량을 Waters MassLynx 4.2 Software를 사용하여 얻었다. 하기 화학식을 사용하여 각각의 약물 로딩 종에 상응하는 피크 강도의 가중 평균을 사용하여 약물 대 항체 비율(DAR)을 계산하였다:
SEC 방법
0.2M 인산나트륨, 0.2M 염화칼륨, 15 w/v 아이소프로판올, pH 6.8의 이동상을 사용하는 20분 등용매 방법을 사용하여 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 통해서 접합체의 순도를 결정하였다. 10㎕의 주입 부피를 0.35㎖/분의 일정한 유량으로 TSKgel SuperSW3000 칼럼에 로딩하였다. 용리 시간에 기초하여 크로마토그래프를 적분하여 단량체 접합체 종의 순도를 계산하였다.
상기에 기재된 바와 같은 항체 약물 접합체(ADC)의 합성 후, 네이키드 항체 및 ADC를 품질 제어 공정에 적용하여 접합, VISTA에 결합하는 능력 및 엔도톡신 수준을 평가 및 확인하였다. 또한, 생리 조건에서 비교적 긴 생체내 반감기를 보유하는 대조군 pH-의존성 결합 항-VISTA 항체(767-IgG1.3 항체)를 합성하고, 펩타이드 매핑을 사용하여 분석하여 이의 서열 동일성 및 이의 pH-의존성 결합을 확인하였다.
B. 약물 항체 비율 및 SEC에 의한 순도의 확인
링커 A를 사용한 접합 후에 접합체에 대해서 접합 수준, 고분자량(HMW) 응집물의 존재 및 엔도톡신 수준을 평가하였다(검정은 Abzena로 수행하였음). 간략하면, 역상 HPLC, 질량 분석법 또는 이들 둘 다를 통해서 접합 수준을 평가하였다. 크기 배제 칼럼을 통해서 HMW 응집물의 수준을 평가하였다. LAL 시험 카트리지를 사용하여 Charles River 엔도세이프(endosafe)-PTS 시스템을 통해서 엔도톡신 수준을 평가하였다.
200㎍의 대조군 항-인간 VISTA 항체(767-IgG1.3)를 23℃에서 14시간 동안 트립신(1/20 트립신/단백질)으로 또는 37℃에서 14시간 동안 Lys-C(1/50 Lys-C/단백질)로 분해시켰다. 80㎍의 샘플을 Agilent QTOF 6530B에서 질량 분석법으로 분석하였다. BioConfirm 9.0을 사용하여 질량 분석법을 수행하였다.
C. ELISA 결과
1. pH 특이적 결합을 결정하기 위한 ELISA
96-웰의 편평 바닥 플레이트(Thermo Scientific Nunc Immuno Maxisorp, 카탈로그 번호 442404)를 PBS에 1㎍/㎖로 희석된 767-IgG1.3 또는 INX200으로 1시간 동안 실온(RT)에서 코팅하였다. 웰을 PT(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)로 3회 세척하고, 그 다음 1.5시간 동안 rt에서 PTB(0.05% Tween 20 및 1% BSA를 함유하는 PBS)로 차단시켰다.
바이오티닐화된 hIX50(인간 VISTA ECD, Aragen Bioscience에서 생산, ImmuNext에서 바이오티닐화됨)을 0.05% Tween 20 및 1% BSA를 함유하는 시트르산/인산염(CPTB)에서 pH 6.1, 6.7 또는 7.5에서 1000 내지 0.001ng/㎖ 범위로 희석시켰다. 웰을 0.05% Tween 20을 함유하는 시트르산/인산염(CPT)으로 pH 6.1, 6.7 또는 7.5에서 3회 세척하고, 그 다음 바이오티닐화된 hIX50을 웰에 첨가하고 1시간 동안 rt에서 인큐베이션시켰다.
pH 6.1, 6.7 또는 7.5에서 CPT로 3회 세척한 후, HRP에 커플링된 스트렙타비딘(Southern Biotech, 카탈로그 번호 7100-05)을 pH 6.1, 6.7 또는 7.5에서 CPTB에서 1/2000으로 희석하여 검출 시약으로 사용하고, 1시간 동안 rt에서 인큐베이션시켰다. pH 6.1, 6.7 또는 7.5에서 CPT로 3회 세척한 후, ELISA 반응을 비색 기질(colorimetric substrate)로서 TMB(Thermo Scientific, 카탈로그 번호 34028)를 사용하여 나타내었다. rt에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
2. 네이키드 및 약물-접합된 항체의 VISTA 결합 확인을 위한 ELISA
96-웰 편평 바닥 플레이트(상기와 동일함)를 PBS에서 1㎍/㎖로 hIX50(ImmuNext를 위해서 인간 VISTA ECD, Aragen Bioscience에서 생산됨)로 1시간 동안 rt에서 코팅하였다. 3회 세척 후, 웰을 1시간 동안 rt에서 PTB로 차단시켰다.
INX200, INX200A, INX201, INX201A, 767-IgG1.3 또는 767-IgG1.3A를 PTB에서 500 내지 0.03, 100 내지 0.02, 또는 400 또는 0.1ng/㎖ 범위로 희석시켰다. 웰을 PT로 3회 세척하고, 그 다음 희석된 항체를 웰에 첨가하고 1시간 동안 rt에서 인큐베이션시켰다.
PT로 3회 세척한 후, 마우스 항-인간 카파-HRP(Southern Biotech, 카탈로그 번호 9230-05)를 검출 시약으로서 PTB에서 1/2000으로 희석하여 사용하였고, 1시간 동안 rt에서 인큐베이션시켰다. 3회 세척한 후, TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. rt에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
D. 평가된 항체에 대한 접합 수준 및 SEC 순도 수준
링커 A의 접합은 쇄간 이황화물의 완전 환원, 그 다음 링커 A를 사용한 완전 변형을 수반하였다(질량 분석법[MS] 접합 평가에 의해서 확인됨). 최소 HMW 응집물을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 평가된 바와 같이 검출하고 순도%로 기록하였다(하기 표 1 참조).
E. 767-IgG1.3의 펩타이드 매핑
도 1에 도시된 바와 같이 트립신 분해는 85.6% 경쇄 서열 커버리지 및 76.1% 중쇄 서열 커버리지를 생성하였다. 이 도면은 밑줄이 그어진 식별된 트립신 분해 펩타이드 (A) 경쇄(85.6% 커버리지) (B) 중쇄(76.1% 커버리지)를 갖는 767-IgG1.3에 대한 서열을 도시한다.
도 2에 도시된 바와 같이 Lys-C 분해는 63.3% 경쇄 서열 커버리지 및 76.3% 중쇄 서열 커버리지를 생성하였다. 이 도면은 밑줄이 그어진 식별된 Lys-C 펩타이드 (A) 경쇄(63.3% 커버리지) (B) 중쇄(76.3% 커버리지)를 갖는 767-IgG1.3에 대한 서열을 도시한다.
트립신과 Lys-C 분해 전략 간의 전체의 조합된 서열 커버리지는 91.7% 경쇄 서열 커버리지 및 80.8% 중쇄 서열 커버리지였다. 경쇄 및 중쇄 둘 다는 WO 2018/169993 A1에 기재된 바와 같이 의도된 서열과 일치한다. 이에 기초하여 본 발명자들은 클로닝되고 발현된 서열이 767-IgG1.3의 서열임을 확인하였다.
F. 상이한 pH 조건에서 항-VISTA 항체의 VISTA 결합의 비교
도 3에 도시된 바와 같이 플레이트 결합된 767-IgG1.3 및 INX200은 역의 항-VISTA pH 의존성 결합 특징을 보유하는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 도 3은 pH 7.5(생리 pH)에서, 767-IgG1.3이 가용성 VISTA에 대해서 최소의 결합을 갖고, VISTA에 대한 결합은 pH 6.7에서 인지 가능하게 더 높고, 최고 결합도는 pH 6.1(시험된 최저 pH)에서 존재하였다는 것을 나타낸다. 이에 반해서, INX200은 생리 pH에서 가용성 VISTA에 대해서 최고 결합도를 가졌고, INX200은 pH에 감소함에 따라서 가용성 VISTA에 훨씬 약하게 결합한다(다시 pH 6.7 및 pH 6.1에서의 상대 결합을 비교하였음). 따라서, 767-IgG1.3 및 INX200은 역의 pH 의존성 결합 특징을 나타낸다.
G. VISTA 결합에 대한 약물 접합의 효과
상기에서 확인된 항-VISTA 항체 약물 접합체는 시험관내 및 생체내 ADC 연구에서 덱사메타손-기반 링커 A에 대한 대략 DAR 8 접합으로 쇄간 이황화물의 완전한 환원을 겪는 것으로 입증되었다. 추가로, 도 4A 내지 도 4C에 나타난 바와 같이, 링커 A와의 DAR 8 접합은 네이키드 항체에 비해서 VISTA에 대한 INX200A, INX201A 또는 767-IgG1.3A의 결합에 대해 무시할 만한 효과를 갖는 것으로 나타났다(도 4A 내지 도 4C).
H. 결론
상기에 기재된 실험 및 데이터는 대조군 767-IgG1.3 항체가 이전에 기재된 767-IgG1.3 항체와 동일한 서열 및 기능적 특징(pH 의존성 결합)을 포함함을 확인시켜준다. 이들 데이터는 추가로 제조된 모든 항-VISTA 항체 약물 접합체가 완전한 시스테인 환원을 겪었고 덱사메타손-기반 링커 A를 사용한 DAR 8 접합이 최소 HMW 응집물 형성(SEC 순도에 의해 평가됨)을 초래했다는 것을 확인시켜 주고, 추가로 이러한 접합이 인간 VISTA에 대한 항체 약물 접합체의 결합에 대해 무시할 만한 영향을 미쳤다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 예시적인 항-VISTA 약물 접합체의 생체내 특징규명
A. ConA 모델
다시, VISTA는 대부분의 조혈 세포, 특히 골수 세포에서 높게 발현되기 때문에 본 발명자들은 이것을 항-염증 항체 약물 접합체(ADC)의 잠재적 표적으로 선택하였다. 자가면역 및 염증 질환 치료에 잠재적으로 사용하기 위한 ADC 개발에서의 잠재적 효능을 평가하기 위해서, Dex-항체 약물 접합체의 효능을 콘카나발린 A 유도 간 염증(ConA-유도 간염)의 단기 모델에서 평가하였다.
이 모델은 마우스에서 식물 렉틴 콘카나발린 A(ConA)의 정맥내(i.v.) 주사를 포함하고 마우스에서 급성 면역 매개 간염에 널리 사용되는 모델을 포함한다. 급성 간 손상에 대한 다른 여러 모델과 달리, ConA-유도 손상은 주로 T 세포 활성화 및 간으로의 동원에 의해 발생한다. 따라서, ConA 모델은 자가면역 간염, 급성 바이러스 간염 또는 면역 활성화를 유도하는 약물 독성의 뚜렷한 엔티티와 같은 인간에서의 면역-매개 간염과의 병인 및 중요한 유사성과 관련하여 고유한 특징을 갖는다. ConA 모델은 주사 후 6시간만큼 빨리 모니터링될 수 있는 전염증성 사이토카인의 폭발을 특징으로 한다. 24시간까지, 높은 수준의 전염증성 사이토카인이 여전히 검출되고, 간 손상/괴사가 조직병리학에 의해 관찰될 수 있다. 본 발명자들은 주로 ConA 주사 6시간 후 사이토카인 반응을 모니터링함으로써 이 모델을 활용하였다. 하기에 논의되고 도면에 나타낸 바와 같이, 이들 연구는 Dex 치료가 G-CSF, IFNγ, IL-2, IL-6, IL-12p40, IL-12p70 및 KC에 대한 용량 의존적 효과를 가짐을 보여주었기 때문에 본 발명자들의 연구는 이들 사이토카인의 일부를 측정하는 데 중점을 두었다.
B. 연구 설계
이들 실험에서, 마우스에게 질환 개시 약 15시간 전에 항체 또는 Dex 치료를 제공하였다. 콘카나발린 A 투여를 예비 실험에서 확립된 6시간에 급성이지만 치명적이지 않은 염증을 생성하도록 조정하였다. 혈액을 ConA i.v. 주사 6시간 후에 수집하고, 혈장을 사이토카인 분석을 위해 단리시켰다.
생체내 연구의 목적은 ConA-유도 간염에서 유리 Dex와 비교하여 에스터라제 감응성 링커를 통해 덱사메타손에 접합된 이들 INX 인간 VISTA 항체의 상대적인 효능을 평가하는 것이었다. 특히, 콘카나발린 A-유도 간염 모델에서 네이키드 또는 덱사메타손에 접합된 항-인간 VISTA 항체(INX210[침묵 IgG2 Fc], INX200[침묵 IgG1 Fc] 및 767.3-IgG1.3[대조군 pH 감응성 항체])의 효능을 평가하기 위해 생체내 연구를 수행하였다(각각 실험 1, 2 및 3).
이들 실험은 인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI) 마우스에서 수행되었다. hVISTA KI 마우스는 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있으며 RNA 및 단백질 수준에서 인간 VISTA를 발현한다. 또한 성별-기반 차이를 제외하기 위해 암컷과 수컷 마우스에서 이러한 실험을 수행하였다. 모든 동물에게 콘카나발린 A(ConA) 주사 15시간 전에 치료(항체 또는 덱사메타손)를 제공하였다. 그 다음 마우스를 ConA 주입 6시간 후 채혈하였고 사이토카인 반응을 질환 진행의 마커로 평가하였다.
C. 방법 및 물질
항-VISTA 항체 및 접합체
INX200: 생리 pH에서 매우 짧은 혈청 반감기를 보유하고 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이를 갖고(하기 표 7 참조) IgG1 Fc 영역을 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체(도 8에 포함됨).
INX200A: 약 8의 약물/항체 비율(DAR)로 쇄간 이황화물을 통해 덱사메타손 약물에 접합된 INX200. 링커/페이로드(A)는 덱사메타손 페이로드를 갖는 에스터라제 감응성 링커로 이루어진다(문헌[Graverson et al, 2012]에 기재된 바와 같음).
INX201: 생리 pH에서 매우 짧은 혈청 반감기를 보유하고 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖고(하기 표 7 참조) IgG1 Fc 영역을 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체(도 8에 포함됨).
INX201A: 8의 약물/항체 비율(DAR)로 쇄간 이황화물을 통해 덱사메타손 약물에 접합된 INX201 항체. 링커/페이로드(A)는 다시 덱사메타손 페이로드를 갖는 에스터라제 감응성 링커로 이루어진다(문헌[Graverson et al, 2012]에 기재된 바와 같음).
INX210: 매우 짧은 혈청 반감기를 보유하는 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 Fc 영역에 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 침묵 돌연변이(하기 표 7 참조) 및 IgG1 Fc 영역을 갖는 인간 IgG2/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체(도 8에 포함됨)(Vafa et al, 2014).
INX210A: 약 8의 약물/항체 비율(DAR)로 쇄간 이황화물을 통해 약물에 접합된 INX210 항체. 링커/페이로드(A)는 다시 덱사메타손 페이로드를 갖는 에스터라제 감응성 링커로 이루어진다(문헌[Graverson et al, 2012]에 기재된 바와 같음).
767-IgG1: 생리 pH에서 훨씬 긴 짧은 혈청 반감기(설치류 및 영장류에서 24시간 초과)를 보유하는 도 8에 포함된 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 Fc 영역에 L234A/L235E/G237A　침묵 돌연변이 및 IgG1 Fc 영역을 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 Five Prime Therapeutics 및 Bristol-Myers Squibb Company에서 개발된 대조군 인간화 항-인간 VISTA 항체. 이 항체는 낮은 pH(예를 들어, pH 6)에서 VISTA에 결합하지만 생리 pH(pH 7.4)에서 최소 결합을 갖도록 설계되었다(WO 2018/169993 A1).
767-IgG1A: 약 8의 약물/항체 비율(DAR)로 쇄간 이황화물을 통해 약물에 접합된 767-IgG1 항체. 링커/페이로드(A)는 다시 덱사메타손 페이로드를 갖는 에스터라제 감응성 링커로 이루어진다(문헌[Graverson et al, 2012]에 기재된 바와 같음).
항체 투여:
모든 항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 복강내(i.p.) 주사하여 10㎎/㎏의 용량을 전달하였다.
덱사메타손
덱사메타손(Phoenix의 멸균 주사제, NDC 57319-519-05)을 PBS에 희석시키고 5, 2, 0.2 및 0.02㎎/㎏에서 i.p. 주사로 투여하였다.
콘카나발린 A
콘카나발린 A는 Sigma Aldrich(C2010)로부터 입수하였다. 로트에 따라서, ConA는 다소 독성이 있을 수 있으므로 6시간에 급성이지만 치명적이지 않은 염증을 생성하기 위한 최상의 ConA 투여를 정의하기 위해 예비 실험을 항상 수행하였다. 실험 1 및 2의 경우 15㎎/㎏(로트 번호 SLBX7517) 및 실험 3 및 4(로트 번호 SLCC2664)의 경우 7.5㎎/㎏.
마우스
hVISTA 마우스는 Sage Labs(미국 펜실베이니아주 보이어타운 소재)에서 사육되었다. 8 내지 12주령의 마우스를 먼저 검역소에 3주 동안 이동시킨 후 일반 시설로 옮겼다. 이들을 실험 시작 전 1 내지 2주 동안 적응시켰다.
채혈 및 준비
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다. 그런 다음 혈액을 400rcf에서 5분 동안 원심분리시키고 혈장을 수집하여 사이토카인 분석 전에 -80℃에서 저장하였다.
혈장 사이토카인 분석
밀리포어 마우스 7-플렉스 플랫폼을 사용하여 25㎕의 혈장에 대해 사이토카인 분석을 수행하였다.
실험 1 및 2: 생체내 연구를 위한 분석에 포함된 사이토카인은 G-CSF, IL-2 IFNγ, IL-6, IL-12p40, IL-12p70 및 KC였다.
실험 3: 생체내 실험 3의 경우, G-CSF(DY414-05; 예측치 <100,000pg/㎖ G-CSF　및 가능성 <50,000pg/㎖ - 키트 검출 수준: 2000pg/㎖ 내지 31.3 pg/㎖)및 KC(DY453-05;　예측치 <120,000pg/㎖ 및 가능성 <50,000pg/㎖ - 키트 검출 수준: 1000pg/㎖ 내지 15.6pg/㎖)의 경우 R&D Duo 세트를 사용하여 ELISA를 통해서 G-CSF 및 KC만 분석하였다.
D. 결과
실험 1: 암컷 hVISTA KI 마우스에서 ConA-유도 간염에서 INX210A 효능
도 5는 암컷 hVISTA KI 마우스의 말초 혈액에서 ConA 6시간 후 G-CSF 변화를 나타낸다. 마우스 7-플렉스를 사용하여 측정된 혈장 농도(SEM; n=5/군)(투여: Dex-0.2= 0.2㎎/㎏, Dex-2 = 2㎎/㎏, 10㎎/㎏의 INX210 및 INX210A, [INX210A는 0.2㎎/㎏ dex 페이로드를 제공하였음]).
도면에 도시된 바와 같이, INX210A를 사용한 처리는 5㎎/㎏에서 Dex 처리에 필적하는 ConA-유도된 G-CSF 상향조절을 제어하는 데 있어서 약간의 효능(유의하지는 않지만)을 나타내었다. 대조적으로, 0.2㎎/㎏(INX210A에 의해 전달된 Dex의 몰 당량임)의 투여된 비-Dex 접합된 항체 INX210 또는 Dex는 항-염증 효과가 없었다.
본 발명자들이 ConA 반응에서 높은 수준의 군 내 가변성을 관찰했기 때문에, 6개의 다른 사이토카인으로부터의 데이터는 해석하기에는 너무 많이 변했기 때문에 포함시키지 않았다. 실험이 암컷 마우스에서 실행될 때 ConA의 효과가 동물의 호르몬 상태에 크게 의존하기 때문에 이것은 예상치 못한 것이 아니다. 암컷 마우스는 ConA에 대해 더 높은 감수성을 나타낼 수 있지만 이들은 질환 결과에서 더 큰 변화를 나타낸다. 모든 후속 ConA 실험은 수컷 마우스에서 실행하였다.
실험 2: 수컷 hVISTA KI 마우스에서 ConA-유도 간염에서 INX210A 효능
도 6은 수컷 hVISTA KI 마우스의 말초 혈액에서 ConA 6시간 후 사이토카인 변화를 나타낸다. 마우스 7-플렉스를 사용하여 측정된 혈장 농도(SEM; n=10/군, ConA-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석(one-way ANOVA))(투여: 0.2 또는 5㎎/㎏의 Dex, 10㎎/㎏의 INX210 및 INX210A).
이전에 문헌에 보고된 바와 같이, 수컷 마우스는 ConA에 대해 보다 일관된 사이토카인 반응을 나타내었다. 분석된 7개의 사이토카인 중 6개는 INX210A 처리 후 6시간에 미처리 ConA 군과 비교할 때 상당한 감소(1 내지 3배)를 나타내었다(도 6). 감소는 Dex 0.2㎎/㎏(INX210A dex 페이로드의 몰당량)과 Dex 5㎎/㎏ 사이의 중간이었다. 반대로 INX210 처리군에서는 효능이 나타나지 않았다.
실험 3: DDE1 수컷 마우스에서 콘카나발린 A-유도 간염에 대한 INX200A의 용량 반응
도 7은 DDE1 수컷 마우스의 말초 혈액에서 ConA 6시간 후 사이토카인 변화를 나타낸다. 실험에서 ELISA 검정을 사용하여 측정된 사이토카인 혈장 농도(SD; n=6/군; ConA-단독 군과 비교한 일원 분산분석)(투여: 0.02, 0.2 또는 2㎎/㎏의 Dex, 10, 5 및 1㎎/㎏의 INX200A).
ADC INX200A가 효능 증강을 부여하는지 평가하기 위해서, ADC로부터의 등가 Dex 페이로드에 대한 다양한 Dex 투여량에 대한 반응(0.2㎎/㎏의 유리 Dex = 10㎎/㎏에서의 INX200A; 0.02㎎/㎏의 유리 Dex = 1㎎/㎏의 INX200A)을 비교하였다. 도 7의 데이터에서 인지될 수 있는 바와 같이 유리 Dex는 0.02㎎/㎏에서 사이토카인 반응을 제어하는 효능이 손실되었지만 1㎎/㎏에서 INX200A는 여전히 효능이 있다. 보다 일반적으로 데이터는 다음을 나타낸다:
실험 1
Figure pct00236
암컷 hVISTA KI 마우스에서, INX210은 Dex와 접합되었을 때(INX210A) ConA-유도 G-CSF 반응을 제어하는 데 효능을 나타내었다.
실험 2
수컷 hVISTA KI 마우스는 ConA 손상에 대해 보다 일관된 반응을 나타낸다.
INX210은 Dex와 접합된 경우(INX210A) ConA-유도 사이토카인 반응을 제어하는 데 효능을 나타내었다. 네이키드 항체는 효능이 없었다.
10㎎/㎏으로 투여된 INX210A는 약 0.2㎎/㎏의 Dex를 전달하고; INX210A에서 관찰된 효능은 0.2㎎/㎏의 유리 Dex의 효능과 대등하였다.
실험 3
용량 반응 실험은 Dex 페이로드가 ADC INX200A를 통해 전달될 때 효능이 개선/증강되는 것으로 나타났고; 0.02㎎/㎏의 유리 Dex는 효능이 없지만 ADC를 통해 전달되는 등가의 몰은 높은 효력을 나타낸다.
결론
본 발명자들은 항-VISTA 항체(INX210)가 Dex와 접합된 경우(INX210A) 등가의 몰 투여량의 Dex에서 유리 Dex보다 효율적으로 또는 더 양호하게 ConA 유도 염증을 예방할 수 있다는 것을 발견하였다. 비접합, INX210은 효과가 없다. 본 발명자들은 또한 Dex를 항-VISTA 항체 INX200에 접합하는 것이 Dex 전달을 개선시켰다는 것을 발견하였는데, 그 이유는 본 발명자들이 0.02㎎/㎏의 유리 Dex가 효능이 없는 반면 ADC를 통해서 전달된 등가의 몰이 높은 효력을 갖는 것을 발견하였기 때문이다.
실시예 3: 예시적인 스테로이드 페이로드 및 항체 약물 접합체의 합성
스테로이드 페이로드 및 접합체의 합성을 위한 절차
본 실시예에서 본 발명자들은 본 발명에 따른 신규한 스테로이드, 상기 스테로이드가 항체에 대한 스테로이드 링커 접합체의 부착을 허용하는 링커 및/또는 이작용기 또는 삼작용기에 커플링된 접합체 및 항체, 선택적으로 생리 pH에서 인간 VISTA에 결합하고 짧은 pK를 포함하는 항-VISTA 항체 또는 면역 세포, 전형적으로 인간 면역 세포 상에서 선태적으로 발현되는 또 다른 항원을 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편에 커플링된 링커 및/또는 이작용기 또는 삼작용기에 커플링된 상기 스테로이드를 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)의 합성을 기재한다.
이미 언급된 바와 같이 이들 스테로이드는 일반적으로 글루코코티코이드 효능제 화합물을 포함할 것이고 상기에 개시된 화학식 I, II 또는 III의 구조를 보유한다. 화학식 I, II 및 III의 예시적인 화합물은 도 118A 내지 도 118AO에 도시되어 있다. 이들 및 다른 예시적인 화합물의 합성이 본 명세서에 기재되어 있다.
일반적인 절차
액체 크로마토그래피(분취용 또는 분석) 및 핵자기공명에 대해서 하기 일방적인 절차를 사용하였다.
액체 크로마토그래피
달리 언급되지 않는 한, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)에 대해서 하기 조건을 사용하였다:
LCMS 방법 A
이 방법에 따른 샘플 분석은 Onyx™ Monolithic C18 LC 칼럼, 50×2㎜가 구비된 Agilent 1260 LCMS-4-QUAD 시스템에서 수행하였다. 샘플을 B 중 5-95% A의 구배를 사용하여 6분에 걸쳐서 전개시켰고, A = 물/ACN(95:5 v/v) 중 0.05% AcOH이고, B = ACN 중 0.05% AcOH이다.
LCMS 방법 B
이 방법에 따른 샘플 분석은 Kinetex® 1.7㎛ C18 100Å, LC 칼럼 50×2.1㎜가 구비된 Waters Acquity LCMS-5-SQD에서 수행하였다. 샘플을 B 중 10-95% A의 구배를 사용하여 2.5분에 걸쳐서 전개시켰고, A = 물 중 0.02% 폼산이고 B = ACN 중 0.05% 폼산이다.
하기는 최종 표적의 분석을 위해서 사용된 LCMS 방법이다:
LCMS 방법-1:
칼럼 상세사항: X-BRIDGE BEH 2.1*50㎜ 2.5㎛
기계 상세사항: - PDA 및 Acquity SQ 검출기가 장치된 Water Acquity UPLC- H Class, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 5℃, 이동상 A: Milli Q 물(pH= 2.70) 중의 0.1% 폼산, 이동상 B: Milli Q 물 중 0.1% 폼산: 아세토나이트릴(10:90).
이동상 구배 상세사항: T = 0분(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 0.75분(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 2.7분까지 구배(2% A, 98% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 3분까지 구배(0% A, 100% B) 유량: 1㎖/분; T = 3.5분(0% A, 100% B) 유량: 1㎖/분; T= 3.51분까지 구배(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 4분에 전개 마지막(97% A, 3% B), 유량: 0.8㎖/분, 유량: 0.8㎖/분, 전개 시간: 4분, UV 검출 방법: PDA.
질량 매개변수:
Probe: ESI, 이온화 모드: 양성 및 음성, 콘 전압(Cone 전압): 30V 및 10V, 모세관 전압: 3.0KV, 추출기 전압: 1V, Rf 렌즈: 0.1V, 공급원 온도: 120℃, 탈용매화 온도: 400℃. 콘 기체 유량: 100L/시간, 탈용매화 기체 유량: 800L/시간.
LCMS 방법-2:
칼럼 상세사항: Xtimate C18 4.6*150㎜ 5㎛
기계 상세사항: Waters Micro mass ZQ 검출기가 장치된 Waters 996 포토다이오드 어레이 검출기, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: Milli Q 물 중 5mM 아세트산암모늄 및 0.1% 폼산(pH =3.50), 이동상 B: 메탄올
이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B); T = 7.0분(10% A, 90% B); T = 9.0분까지 구배(0% A, 100% B); T까지 구배 = 14.00분(0% A, 100% B); T = 14.01분(90% A, 10% B); T = 17분에 구배 마지막(90% A, 10% B), 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분, UV 검출 방법: PDA.
질량 매개변수:
프로브: ESI, 이온화 모드: 양성 및 음성, 콘 전압: 30V 및 10V, 모세관 전압: 3.0KV, 추출기 전압: 2V, Rf 렌즈: 0.1V, 공급원 온도: 120℃, 프로브 온도: 400℃, 콘 기체 유량: 100L/Hr, 탈용매화 기체 유량: 800L/Hr.
LCMS 방법-3:
칼럼 상세사항: Sunfire C18 150×4.6㎜, 3.5㎛
기계 상세사항: Agilent 1260 Infinity-II 및 G6125C(LC/MSD) 질량 검출기, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: Milli Q 물 중 5mM 아세트산암모늄 및 0.1% 폼산(pH =3.50), 이동상 B: 메탄올
이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B); T = 7.0분(10% A, 90% B); T = 9.0분까지 구배(0% A, 100% B); T까지 구배 = 14.00분(0% A, 100% B); T = 14.01분(90% A, 10% B); T = 17분에 구배 마지막(90% A, 10% B), 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분, UV 검출 방법: PDA.
질량 매개변수:
프로브: MMI, 이온화 모드: (ESI) 양성 및 음성, 단편 전압: 30V 및 70V, 모세관 전압: 3000 V, 공급원 기체 온도: 325℃, 증발기 온도: 225℃, 기체 유량: 12 L/분, 네블라이저: 50.
HPLC 방법-1:
칼럼 상세사항: Sunfire C18 (150㎜ x 4.6㎜),3.5㎛
기계 상세사항: Agilent Technologies. PDA 검출기가 구비된 1260 Series, Infinity-II, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: Milli Q 물(pH= 2.2) 중 0.05% 트라이플루오로아세트산, 이동상 B: 아세토나이트릴.
이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 7.0분(10% A, 90% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 9.0분까지 구배(00% A, 100% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 14분까지 구배(00% A, 100% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 14.01분(90% A, 10% B) 유량: 1㎖/분; T= 17분에 전개 마지막(90% A, 10% B) 유량: 1.0㎖/분, 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분, UV 검출 방법: PDA.
HPLC 방법-2
칼럼 상세사항: Atlantis C18(150㎜×4.6㎜), 5.0㎛ 또는 Welch C18(150㎜×4.6㎜), 5.0㎛
기계 상세사항: - 2998 PDA 검출기가 구비된 Waters Alliance e2695, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: Milli Q 물(pH= 10.5) 중 0.1% 암모니아, 이동상 B: 아세토나이트릴.
이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 7.0분(10% A, 90% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 9.0분까지 구배(00% A, 100% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 14분까지 구배(00% A, 100% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 14.01분(90% A, 10% B) 유량: 1㎖/분; T= 17분에 전개 마지막(90% A, 10% B) 유량: 1.0㎖/분, 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분, UV 검출 방법: PDA.
HPLC 상세사항: 2998 PDA 검출기가 구비된 Waters Alliance e2695; 칼럼 상세사항: Atlantis C18 (150㎜×4.6㎜), 5.0㎛ 또는 Welch C18(150㎜×4.6㎜), 5.0㎛; 이동상 A: Milli Q 물(pH= 10.5) 중 0.1% 암모니아, 이동상 B: 아세토나이트릴; 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분
NMR
양성자 핵자기공명(NMR)스펙트럼을 얻기 위해서 다음 조건을 사용하였다: NMR 스펙트럼은 1H NMR(400MHz) Bruker Advancer-III HD FT-NMR 분광광도계(Bruker, 미국 소재)에서 기록하였다. 원시 NMR 데이터는 Topspin 3.6.3 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
화학적 이동은 중수소화된 NMR 용매에 의해서 추론된 TMS 위치로부터의 백반부당부(ppm) 다운필드에 의해서 기록한다. 명백한 다중성을 하기로서 기록한다: 단일항-s, 이중항-d, 삼중항-t, 사중항-q 또는 다중항-m. 넓게 나타나는 피크를 br로서 추가로 나타낸다. 적분은 대략적인 값이다. 적분 강도, 피크 형상, 화학적 이동 및 커플링 상수는 용매, 농도, 온도, pH 및 다른 인자에 좌우될 수 있음이 언급되어야 한다.
실험 상세사항
달리 언급되지 않는 한 모든 반응은 무수 질소 분위기 하에서 수행하였다. 모든 주요 화학물질은 제공된 그대로 사용하였다. 모든 다른 상업적으로 입수 가능한 물질, 예컨대, 용매, 시약 및 촉매를 추가로 정제시키지 않고 사용하였다. 반응은 사전 코팅된 Merck 실리카겔 60F254 알루미늄 시트(Merck, 옥일 소재)를 사용하여 박막 크로마토그래피(TLC)로 모니터링하였다. TLC 플레이트의 가시화는 UV 광, 닌하이드린 분무 및 아이오딘 증기를 사용하여 달성하였다. 칼럼 크로마토그래피 분리는 적절한 이동상을 사용하여 고정상으로서 230 내지 400메시, 100 내지 200메시 및 60 내지 120메시 실리카겔 또는 C18 실리카를 사용하여 수행하였다.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX J )의 합성
반응식
(S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산( INX J.a )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 Fmoc-Gly-OSu(1.0g, 2.535m㏖, 1.0eq), H-Glu(OtBu)-OH(0.6183g, 3.043m㏖, 1.2eq) 및 중탄산나트륨(0.4260g, 5.07m㏖, 2.0eq)을 충전하였다. 물과 1,4-다이옥산(1:1, 26㎖)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하고 용매를 감소시켜, 다이옥산을 제거하였지만 물은 남겼다. 그 다음 혼합물을 로 산성화시키고 pH 2-3, 분리 깔때기에 첨가하고, 5:1 아이소프로필 아세테이트/아이소프로판올(3×100㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감소시키고, Isco C18 Aq 100g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중의 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.9982g의 INX J.a를, 82% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 B (ESI+): 1.14분에 C26H31N2O7 [M+H]+ 요구치 483.21, 실측치 483.25.
tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)페닐)카바메이트( INX J-1 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 아르곤을 다시 채우고 tert-부틸 (3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)페닐)카바메이트(4.2765g, 13.40m㏖, 1.0eq), 4-브로모메틸벤즈알데하이드(4.0g, 20.1m㏖, 1.5eq), 탄산칼륨(9.2594g, 67.0m㏖, 5.0eq), 및 [1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로팔라듐-다이클로로메탄 착물(0.3841g, 0.469m㏖, 0.035eq)을 충전하였다. 무수 THF(84㎖)를 플라스크에 첨가하고, 그 다음 이것에 환류 응축기를 장치하고, 80℃까지 16시간 동안 가열시켰다. 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하고 그 다음 혼합물을 냉각시키고, 물(200㎖)로 희석시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, EtOAc(3×100㎖)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감소시키고, Isco Rf Gold 80g SiO2 칼럼 상에 로딩하고, 헥산 중 0-100% EtOAc의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고 감소시켜 3.529g의 화합물 INX J-1를, 85% 수율, 투명한 오일로서 제공하였고, 이것을 감압으로부터 제거한 후 밤새 결정화시켰다. LCMS 방법 A (ESI-): 3.080분에서 C19H20NO3 [M-H]- 요구치 310.15, 실측치 310.1.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX J-2 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 16-α-하이드록시프레드니솔론(3.30g, 8.765m㏖, 1.0eq), 알데하이드 INX J-1(3.0023g, 9.641m㏖, 1.1eq) 및 MgSO4(3.1659g, 26.29m㏖, 3.0eq)를 충전하였다. 고체를 아세토나이트릴(88㎖)에 현탁시키고, 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 트라이플루오로메탄설폰산(3.9㎖, 43.83m㏖, 5.0eq)을 적가하였다. 10 내지 20분 후 반응물이 분홍색으로 변했고, 1시간 후 출발 물질이 완전히 소모되었다. 용매를 감소시키고, 조물질을 2개의 배취에서 정제시키고, 각각을 Isco C18 Aq 275g 역상 칼럼에 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 5-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 두 배취로부터의 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 2.50g의 INX J-2를, 50% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.572분에서 C35H40NO6 [M+H]+ 요구치 570.28, 실측치 570.3.
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX J-3 )의 합성:
절차:
DMF(2.3㎖)를, 비스-아미노산 INX J.a(0.3074g, 0.6372m㏖, 1.1eq)가 충전된 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 그 다음 아닐린 INX J-2(0.330g, 0.579m㏖, 1.0eq)을 첨가하고, 그 다음 트라이에틸아민(0.24㎖, 1.73m㏖, 3.0eq)을 첨가하였다. 용액을 0℃까지 냉각시키고, DMF 중 50% 프로판포스폰산 무수물의 용액(0.70㎖, 1.1586m㏖, 2.0eq)을 첨가하였다. 실온까지 가온시키면서 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응 완결이 확인되면, 조 혼합물을 직접 Isco C18 Aq 50g 역상 칼럼 상에 로딩하고 H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.200g의 INX J-3을, 33% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 3.073분에서 C61H68N3O12 [M+H]+ 요구치 1034.47, 실측치 1034.4.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트 AcOH 염(I NX J-4 )의 합성:
절차:
바이알에 화합물 INX J-3(0.080g, 0.0774m㏖, 1.0eq)을 충전하고, 그 다음 이것을 아세토나이트릴(0.50㎖) 및 피페리딘(62 ㎕)에 용해시켰다. 모든 출발 물질이 탈보호될 때까지, 30분 동안 혼합물을 교반하였다. 용매를 감소시키고, 조물질을 DMSO에 희석시키고, Isco C18 Aq 15.5g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0423g의 INX J-4·AcOH를, 63% 수율, 투명한 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.638분에서 C46H58N3O10 [M+H]+ 요구치 812.40, 실측치 812.4.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX J-5 )의 합성:
절차:
바이알에 2-브로모아세트산(0.0092g, 0.0665m㏖, 2.1eq) 및 DMF(0.33㎖)를 충전하였다. N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-다이하이드로퀴놀린(0.0156g, 0.0632m㏖, 2.0eq) 첨가하고, 혼합물을 약 90분 동안 교반하였다. 그 다음 아민 INX J-4·AcOH(0.0270g, 0.0309m㏖, 1.0eq)를 중탄산나트륨(0.0140g, 0.1665m㏖, 5.4eq)과 함께 용액에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안(모든 INX J-4가 소모될 때까지) 교반하였다. LCMS로 반응 완결이 확인되면, 조 혼합물을 직접 Isco C18 Aq 5.5g 역상 칼럼 상에 로딩하고 H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0100g의 INX J-5를, 35% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.926분에 C48H59BrN3O11 [M+H]+ 요구치 932.33, 실측치 932.2.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX J )의 합성:
절차:
바이알에 tert-부틸 에스터 INX J-5(0.010g, 0.01072m㏖, 1.0eq)를 충전하였고, 이것을 DCM 중 50% TFA의 용액(0.200㎖)에 용해시키고, 1시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응 완결이 확인되면, 용매를 제거하고, 잔류물을 DMSO에 용해시키고, Isco C18 Aq 5.5 g 역상 칼럼 상에 로딩하고 H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0033g의 INX J를, 35% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.524분에 C44H51BrN3O11 [M+H]+ 요구치 876.26, 실측치 877.2.
S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX L) 의 합성
반응식
(S)-5-(tert-부톡시)-2-(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)아세트아미도)-5-옥소펜탄산(Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH)의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 Boc-Gly-OSu(12.0g, 44.07m㏖, 1.0eq), H-Glu(OtBu)-OH(9.8524g, 48.47m㏖, 1.1eq) 및 중탄산나트륨(7.4040g, 88.14m㏖, 2.0eq)을 충전하였다. 물과 1,4-다이옥산(1:1, 220㎖)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하고 용매를 감소시켜, 다이옥산을 제거하였지만 물은 남겼다. 그 다음 혼합물을 pH 2 내지 3으로 산성화시켜, 침전물을 형성하였고, 그 다음 이것을 여과하고 동결건조기에서 건조시켜 14.0152g의 Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH를, 88% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.122분에서 C16H29N2O7 [M+H]+ 요구치 361.19, 실측치 361.2.
tert-부틸 (S)-4-(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX L-1 )의 합성:
절차:
불활성 분위기 하에서 오븐-건조된 바이알에 아민 INX J-2(0.8200g, 2.63m㏖, 1.0eq), Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(2.5916g, 7.197m㏖, 2.73eq), ((7-아자벤조트라이아졸-1-일옥시)트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)(2.2515g, 4.318m㏖, 1.64eq) 및 DMF(15㎖)를 충전하였다. 다음, N,N-다이아이소프로필에틸아민(1.5㎖, 8.636m㏖, 3.3eq)을 첨가하고, 모든 아민이 소모될 때까지, 1시간 동안 혼합물을 교반하였다. 그 다음 조 용액을 Isco C18 Aq 100g 역상 칼럼에 직접 첨가하고, H2O(0.05% TFA 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% TFA 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.4404g의 INX L-1을, 34% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.524분에서 C51H66N3O12 [M+H]+ 요구치 912.46, 실측치 912.4.
tert-부틸 (S)-4-(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX L-2 )의 합성:
절차:
불활성 분위기 하에서 오븐-건조된 바이알에 tert-부틸 에스터 INX L-1(0.200g, 0.220m㏖, 1.0eq) 및 DMF(0.50㎖)를 충전하였다. 다음으로, 1-H 테트라졸(0.1540g, 2.20m㏖, 10eq) 및 다이-tert-부틸 N,N-다이에틸포스포르아미다이트(1.311g, 5.265m㏖, 24.0eq)를 첨가하고, 혼합물을 72시간 동안 교반하여 90% 전환을 달성하였다. 과산화수소(2㎖)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 그 다음 Isco C18 Aq 50g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.120g의 INX L-2를, 49% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 3.894분에서 C59H83N3O15P [M+H]+ 요구치 1104.55, 실측치 1104.5.
(S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산 TFA 염( INX L-3 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 에스터 INX L-2(0.772g, 0.7m㏖, 1.0eq), DCM(10㎖), 트라이플루오로아세트산(5㎖) 및 트라이아이소프로필실란(1.2㎖)을 충전하였다. 혼합물을 8시간 동안 실온에서 교반하였다. 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하고 용매를 감소시켰다. 생성된 잔류물을 DMF(4㎖)에 용해시키고, Isco C18 Aq 100g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.05% TFA 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% TFA 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.3976g의 INX L-3·TFA를, 54% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.053분에서 C42H51N3O13P [M+H]+ 요구치 836.3, 실측치 836.3.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX L )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 2-브로모아세트산(0.0250g, 0.180m㏖, 3.5eq), DMF(0.50㎖), (7-아자벤조트라이아졸-1-일옥시)트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(0.0470g, 0.090m㏖, 1.7eq) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민(0.0155g, 0.120m㏖, 2.3eq)을 충전하였다. 별개의 바이알에서, 아민 INX L-3·TFA(0.050g, 0.052m㏖, 1.0eq)를 DMF(2.0㎖)에 용해시키고, 브로모아세트산 및 커플링제를 함유하는 용기에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하였다. 조 혼합물을 H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상을 사용하여 분취용 HPLC로 정제시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.030g의 INX L을, 60% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.323분에서 C44H52BrN3O14P [M+H]+ 요구치 956.78, 실측치 956.2.
INX-SM- 1 및 INX N 의 합성
반응식
알릴 (S)-(1-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)카바메이트( INX-SM-1-1 )의 합성:
절차:
불활성 분위기 하에서 둥근 바닥 플라스크에 4-(브로모메틸)벤즈알데하이드(1.465g, 7.40m㏖, 1.2eq), tert-부틸 (5-(트라이부틸스타닐)티아졸-2-일)카바메이트(3.00g, 6.10m㏖, 1.0eq), 트라이포타슘 포스페이트(3.902g, 18.40m㏖, 3.0eq) 및 (2-다이사이클로헥실포스피노-2',6'-다이메톡시바이페닐) [2-(2'-아미노-1,1'-바이페닐)]팔라듐(II) 메탄설포네이트(1.148g, 1.50m㏖, 20mol%)를 충전하였다. 물(10㎖) 및 THF(100㎖)를 탈기시키고, 그 다음 첨가하고, 혼합물을 밤새 환류시켰다. LCMS로 결정된 완결 후, 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 감소시키고, Isco C18 Aq 450g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(10mM NH4OAc 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(10 mM NH4OAc 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 1.064g의 INX-SM-1-1을, 55% 수율, 회백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 B (ESI+): 1.66분에서 C11H11N2OS [M-Boc+H]+ 요구치 219.10, 실측치 219.04.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-아미노티아졸-5-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 AcOH 염(I NX-SM-1 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 16-α-하이드록시프레드니솔론(1.1833g, 3.143m㏖, 1.0eq), 알데하이드 INX-SM-1-1(1.10g, 3.458m㏖ 1.1eq) 및 MgSO4(1.1355g, 9.431m㏖, 3.0eq)를 충전하였다. 고체를 아세토나이트릴(31㎖)에 현탁시키고, 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 트라이플루오로메탄설폰산(1.4㎖, 15.718m㏖, 5.0eq)을 적가하였다. 10 내지 20분 후 반응물이 분홍색으로 변했고, 1시간 후 출발 물질이 소모되었다. 용매를 감소시키고, 조물질을 Isco C18 Aq 275g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 1.059g의 INX-SM-1·AcOH를, 53% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 B (ESI+): 1.10분에서 C32H37N2O6S [M +H]+ 요구치 577.23, 실측치 577.93.
tert-부틸 (S)-4-(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)티아졸-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX N-1 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 INX-SM-1·AcOH(1.000g, 1.57m㏖, 1.0eq), Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(3.1212g, 8.607m㏖, 5.5eq) 및 PyAOP(4.5210g, 8.678m㏖, 5.5eq)를 충전하였다. 1:1 DCM/DMF(22㎖ 총 부피)의 혼합물을 첨가하고, 그 다음 DIPEA(3.0㎖, 17.356m㏖, 11.0eq)를 첨가하고, 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. INX-SM-1의 대부분이 소모된 후, 용매를 (약간의 DMF 까지) 감소시키고, 조 혼합물을 Isco C18 Aq 275g 역상 칼럼 상에 로딩하고 H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 5-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.4050g의 INX N-1을, 28% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 3.089분에서 C48H63N4O12S [M +H]+ 요구치 919.41, 실측치 919.4.
(S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)티아졸-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산 TFA 염( INX N-2 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 에스터 INX N-1(0.200g, 0.2177m㏖, 1.0eq), MeCN(2.0㎖), 트라이플루오로아세트산(2.0㎖) 및 트라이아이소프로필실란(0.70㎖, 3.266m㏖, 15.0eq)을 충전하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하고 용매를 감소시켰다. 생성된 잔류물을 Isco C18 Aq 30g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.10% TFA 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.10% TFA 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0954g의 INX N-2·TFA를 50% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 1.732분에서 C39H47N4O10S [M +H]+ 요구치 763.29, 실측치 763.3.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)티아졸-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX N )의 합성:
절차:
바이알에 2-브로모아세트산(0.0127g, 0.0913m㏖, 2.0eq)를 충전하였고, 이것을 DMF(0.500㎖)에 용해시켰다. N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-다이하이드로퀴놀린(0.0215g, 0.0867m㏖, 1.9eq)을 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반하였다. 그 다음 아민 INX N-2·TFA(0.040g, 0.0457m㏖, 1.0eq)를 중탄산나트륨(0.0230g, 0.2739m㏖, 6.0eq)과 함께 용액에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안(모든 INX N-2가 소모될 때까지) 교반하였다. LCMS로 반응 완결이 확인되면, 조 혼합물을 Isco C18 Aq 15.5g 역상 칼럼 상에 직접 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0091g의 INX N을, 22% 수율, 솜털 같은 황색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.247분에 C41H48BrN4O11S [M +H]+ 요구치 883.21, 실측치 883.2.
INX-SM-2 및 INX Q 의 합성
반응식
tert-부틸 (4-(4-폼일벤질)티아졸-2-일)카바메이트( INX-SM-2-1 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 아르곤을 다시 채우고 tert-부틸 (4-(브로모메틸)티아졸-2-일)카바메이트(0.150g, 0.5115m㏖, 1.5eq), (4-폼일페닐)보론산(0.0511g, 0.3411m㏖, 1.0eq), 탄산칼륨(0.2357g, 1.706m㏖, 5.0eq) 및 [1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로팔라듐-다이클로로메탄 착물(0.0279g, 0.0341m㏖, 0.10eq)을 충전하였다. 무수 THF(2.5㎖)를 플라스크에 첨가하고, 그 다음 이것에 환류 응축기를 장치하고, 80℃까지 16시간 동안 가열시켰다. 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하고 그 다음 혼합물을 냉각시키고, 물(10㎖)로 희석시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, EtOAc(3 x 20㎖)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감소시키고, Isco Rf Gold 24g SiO2 칼럼 상에 로딩하고, 헥산 중 0-100% EtOAc의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고 감소시켜 0.0082g의 화합물 IN-SM-2-1을, 8% 수율, 투명한 오일로서 제공하였고, 이것을 감압 하에서 감소시킨 후 밤새 결정화하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.1716분에 C16H19N2O3S [M+H]+ 요구치 319.10, 실측치 319.1.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-아미노티아졸-4-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 AcOH 염( INX-SM-2 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 16-α-하이드록시프레드니솔론(0.1936g, 0.5143m㏖, 1.0eq), 알데하이드 INX-SM-2-1(0.1800g, 0.5659m㏖ 1.1eq) 및 MgSO4(0.1857g, 1.5428m㏖, 3.0eq)를 충전하였다. 고체를 아세토나이트릴(5.1㎖)에 현탁시키고, 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 트라이플루오로메탄설폰산(0.23㎖, 2.571m㏖, 5.0eq)을 적가하였다. 10 내지 20분 후, 반응물이 분홍색으로 변했고, 약 1시간 후 출발 물질이 소모되었다. 용매를 감소시키고, 조물질을 Isco C18 Aq 30g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.1680g의 INX-SM-2·AcOH를, 52% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 1.974분에 C32H37N2O6S [M+H]+ 요구치 577.23, 실측치 577.3.
tert-부틸 (S)-4-(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)티아졸-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX Q-1 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 INX-SM-2·AcOH(0.1125g, 0.176m㏖, 1.0eq), Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(0.0700g, 0.1760m㏖, 1eq) 및 PyAOP(0.1220g, 0.2340m㏖, 1.3eq)를 충전하였다. DMF(1.6㎖), 그 다음 DIPEA(0.081㎖, 0.4686m㏖, 2.6eq)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. INX-SM-2의 대부분이 소모되면, 조 혼합물을 Isco C18 Aq 15.5g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.060g의 INX Q-1을, 37% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.931분에 C48H63N4O12S [M+H]+ 요구치 919.41, 실측치 919.4.
(S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)티아졸-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산 TFA 염( INX Q-2 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 에스터 INX Q-1(0.0800g, 0.0871m㏖, 1.0eq), MeCN(1.0㎖), 트라이플루오로아세트산(1.0㎖) 및 트라이아이소프로필실란(0.178㎖, 0.871m㏖, 10.0eq)을 충전하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하고 용매를 감소시켰다. 생성된 잔류물을 Isco C18 Aq 15.5g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.10% TFA 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.10% TFA 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0100g의 INX Q-2·TFA를, 13% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 1.945분에 C39H47N4O10S [M+H]+ 요구치 763.29, 실측치 763.2.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)티아졸-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX Q )의 합성:
절차:
바이알에 2-브로모아세트산(0.0036g, 0.0262m㏖, 2.3eq)을 충전하고, 이것을 DMF(0.500㎖)에 용해시켰다. N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-다이하이드로퀴놀린(0.0062g, 0.0250m㏖, 2.2eq)을 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반하였다. 그 다음 아민 INX Q-2·TFA(0.010g, 0.0114m㏖, 1.0eq)를 중탄산나트륨(0.0066g, 0.0786m㏖, 6.9eq)과 함께 용액에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안(모든 INX Q-2가 소모될 때까지) 교반하였다. LCMS로 반응 완결이 확인되면, 조 혼합물을 Isco C18 Aq 5.5g 역상 칼럼 상에 직접 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0036g의 INX Q를, 36% 수율, 솜털 같은 황색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 B (ESI+): 1.20분에 C41H48BrN4O11S [M+H]+ 요구치 883.21, 실측치 883.53.
INX-SM-3 및 INX-SM-53 의 합성
반응식
메틸 3-((tert-부톡시카보닐)아미노)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트( INX-SM-3-1 )의 합성
절차:
실온에서 tet-부틸 알코올(20㎖) 중 3-(메톡시카보닐)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실산(10g, 58.76m㏖)의 용액에 다이페닐포스포릴 아자이드(DPPA)(20.2㎖, 88.15m㏖) 및 트라이에틸 아민(33.04㎖, 235.0m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산: 12:88)로 정제시켜 INX-SM-3-1을 백색 고체로서 제공하였다(10g, 70.55%). 1H NMR(CDCl3) δ: 7.43(bs, 1H), 3.69(s, 3H), 2.30(s, 6H), 1.46(s, 9H).
tert-부틸 (3-(하이드록시메틸)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트( INX-SM-3-2 )의 합성
절차:
THF:MeOH(3:1)(20㎖) 중 메틸 3-((tert-부톡시카보닐)아미노)바이사이클로 [1.1.1]펜탄-1-카복실레이트(INX-SM-3-1)(5g, 20.70m㏖)의 교반 용액에, 소듐 보로하이드라이드(3.9g, 103.5m㏖)를 실온에서 첨가하고, 추가로 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 증류 수성 HCl 용액으로 반응정지시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 INX-SM-3-2 조생성물(4.3g, 97.38%)을 수득하였다. LCMS: 214.0 [M+H]+; 1H NMR(CDCl3) δ: 4.99 (bs, 1H), 3.72(s, 2H), 1.95(s, 6H), 1.42(s, 6H).
tert-부틸 (3-폼일바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트( INX-SM-3-3 )의 합성
절차:
DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (3-(하이드록시메틸)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-3-2)(0.1g, 0.46m㏖)의 교반 용액에, 데스-마틴 퍼아이오디난(DMP)(0.40g, 40.93m㏖)을 실온에서 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:40:60)로 정제시켜 INX-SM-3-3을 백색 고체로서 제공하였다(0.050g, 52%). 1H NMR (DMSO-d6) δ: 9.59(s, 1H), 7.68(bs, 1H), 2.12(s, 6H), 1.37(s, 9H).
tert-부틸 (3-((2-토실하이드라조노)메틸)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일) 카바메이트( INX-SM-3-4) 의 합성
절차:
다이옥산(5㎖) 중 tert-부틸 (3-폼일바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-3-3)(0.40g, 1.89m㏖)의 교반 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드(8.8g, 47.20m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 50℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:30:70)로 정제시켜 INX-SM-3-4를 백색 고체로서 제공하였다(0.28g, 38.96%). LCMS: 324.5(M-56); 1H NMR (DMSO-d6) δ: 11.07 (s, 1H), 7.66(d, J= 8Hz, 2H), 7.40(d, J=8Hz, 2H), 7.23(s, 1H), 2.38(s, 3H), 1.90(s, 6H), 1.36(s, 9H).
tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트( INX-SM-3-5 )의 합성
절차:
다이옥산(30㎖) 중 tert-부틸)-(3-((2-토실하이드라조노) 메틸)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-3-4)(3.20g, 8.43m㏖)의 교반 용액에, (4-폼일페닐)보론산(1.64g, 8.43m㏖) 및 K2CO3(1.74g, 12.64m㏖)를 실온에서 첨가하고 추가로 2시간 동안 110℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:15:85)로 정제시켜 INX-SM-3-5를 백색 고체로서 제공하였다(0.81g, 31.87%). LCMS: 302.5(M+H)+; 1H NMR (DMSO-d6) δ: 9.97 (s, 1H), 7.84(d, J= 7.6Hz, 2H), 7.33(d, J= 7.6Hz, 2H), 2.89(s, 2H), 1.68(s, 6H), 1.33(s, 9H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-3 ); 및
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-53) 의 합성
절차:
DCM(10㎖) 중 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-3-5)(1.0g, 3.31m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-α-하이드록시프레드니솔론)(1.24g, 3.31m㏖)의 용액에, PTSA (0.95g, 4.97m㏖)를 첨가하고, 추가로 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 이성질체의 혼합물로서 제공하였다. 조물질을 분취용-HPLC로 정제시키고, 그 다음 이성질체를 카이럴 분취용-HPLC(칼럼: IG 250*21㎛, 5마이크론, 이동상: A= 헵탄 중 0.1% 암모니아, B = IPA:ACN(70:30), A:B = 60:40)로 분리시켜 이성질체-1 및 이성질체-2를 제공하였다. 이러한 이성질체를 체류 시간 6.72분(이성질체-1) 및 11.87분(이성질체-2)에 용리시켰다.
INX-SM-3 (이성질체-1): LCMS: 561.0(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.45(s, 1H, 아세탈-H), 5.07(d, J=5.2Hz, 1H, C16H)
INX-SM-53 (이성질체-2): LCMS 561.1(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 6.13(s, 1H, 아세탈-H), 5.41(d, J=5.6Hz, 1H, C16H)
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질) 바이사이클[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-P )의 합성
반응식
1-벤질 5-(tert-부틸) (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-L-글루타메이트( INX-P-1 )의 합성
절차:
500㎖ 3구 둥근 바닥 플라스크에 DMF(200㎖) 중 (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(25g, 58.82m㏖) 및 중탄산나트륨(9.8g, 116.66m㏖)을 충전하였다. 이러한 현탁액에, 벤질 브로마이드(10.9g, 63.74m㏖)를 실온에서 첨가하고 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 물로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터 및 펜탄으로 배산처리(triturate)하여 INX P-1을 백색 고체로서 제공하였다(26g, 85.83%). LCMS: 516.4(M+H)+ .
1-벤질 5-(tert-부틸) L-글루타메이트( INX-P-2 )의 합성
절차:
500㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 1-벤질 5-(tert-부틸) (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)-L-글루타메이트(INX-P-1)(26g, 50.42m㏖) 및 THF(200㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(36.8g, 504.11m㏖)을 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시키고, 펜탄으로 배산처리하여 INX-P-2를 연황색 끈적이는 물질(28g)로서 제공하였다. 조 생성물을 어떠한 분석 데이터도 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.
1-벤질 5-(tert-부틸) (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실-L-글루타메이트( INX-P-3 )의 합성
절차:
500㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리신(28.0g, 94.27m㏖) 및 DMF(200㎖)를 충전하였다. 이 용액에, EDC.HCl(19.7g, 102.76m㏖), HOBT(13.9g, 102.76m㏖), DIPEA(24.2g, 187.24m㏖) 및 1-벤질 5-(tert-부틸) L-글루타메이트(INX-P-2)(30.38g, 103.25m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 50:50)로 정제시켜 INX-P-3을 연황색으로서 제공하였다(12.0g, 23.64%). LCMS: 574.4(M+H)+.
(S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산( INX-P-4 )의 합성
절차:
500㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 MeOH(120㎖) 중의 1-벤질 5-(tert-부틸) (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실-L-글루타메이트(INX-P-3)(12.0g, 20.95m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 10% Pd/C(2.4g)를 실온에서 첨가하고, 3 내지 4시간 동안 수소로 퍼징하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 셀라이트층으로 여과하고, 여과액을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물)로 정제시키고 INX-P-4를 회백색 고체로서 제공하였다(5g, 49.45%). LCMS: 483.2(M+H)+.
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-P-5 )의 합성
절차:
실온에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.47g, 0.97m㏖), HATU(0.55g, 1.45m㏖), DIPEA(0.25g, 1.94m㏖) 및 DMF(4㎖)를 충전하였다. 실온에서 이 용액에 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸) 페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-3)(0.59g, 1.06m㏖)을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물, 50:50)로 정제시켜 INX-P-5 연황색 고체로서 제공하였다(0.42g, 57.38%). LCMS:1025.0(M+H)+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS, 10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8, 8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-P-6 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a, 12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클 [1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-P-5)(0.40g, 0.41m㏖) 및 THF(4㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.40g, 4.10m㏖)을 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 INX-P-6을 황색 고체를 제공하였다(0.23g, 73.43%) LCMS:802.1(M+H)+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS, 8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7, 8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-P-7 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시 아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토 [2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-P-6)(0.23g, 0.28m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖) 중 Na2CO3(0.12g, 0.57m㏖) 용액, 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.029g, 0.28m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물, 50:50)로 정제시켜 INX-P-7을 연한 황색 고체(0.090g, 34.00%)로서 제공하였다. LCMS: 922.9 및 924.8(M 및 M+2).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질) 바이사이클[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-P )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소 펜탄오에이트(INX-P-7)(0.090g, 0.097m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.055g, 0.48m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC로 정제시켜 INX-P(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = 아세토나이트릴; A:B, 55:45)(체류 시간 15.51분)를 얻었고 R-이성질체를 회백색 고체로서 제공하였다(0.010g, 11.83%). LCMS: 866.80 및 868.8(M 및 M+2); 1H NMR (400 MHz, DMOS-d6, 주요 양성자 배정): δ: 5.40(s, 1H, 아세탈-H), 4.92(d, J=4.8 Hz, 1H, C16H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-아미노벤질) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 (INX-SM-4 ); 및
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-아미노벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-54 )의 합성
반응식
메틸 3-(하이드록시메틸)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트( INX-SM-4-1 )의 합성
절차:
THF(15㎖) 중 3-(메톡시카보닐)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실산(10g, 58.75m㏖)의 용액에, 보란 다이메틸 설파이드(BH3.DMS)(13.49㎖, 176.2m㏖)를 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 추가로 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 묽은 HCl 용액을 서서히 첨가하여 반응정지시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 검 같은 고체로서 제공하였다(8.2g, 89.30%). 조물질을 다음 단계에서 그대로 사용하였다. 1H NMR(CDCl3) δ: 3.68(s, 3H), 3.63(s, 2H), 3.07(bs, 1H), 2.05(s, 6H).
메틸 3-폼일바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트( INX-SM-4-2 )의 합성
절차:
DCM(240㎖) 중 메틸 3-(하이드록시메틸)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트(INX-SM-4-1)(8.0g, 56.27m㏖)의 교반 용액에, 데스-마틴 퍼아이오디난(DMP)(23.87g, 56.27m㏖)을 0℃에서 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 NaHCO3의 포화 용액으로 반응정지시켰다. 반응 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 검 같은 백색 고체로서 제공하였다(12g, 조물질). 조 생성물을 정제시키지 않고 다음 단계에서 그대로 사용하였다.
메틸 3-((2-토실하이드라조노)메틸)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트( INX-SM-4-3 )의 합성
절차:
다이옥산(120㎖) 중의 메틸 3-폼일바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트(INX-SM-4-2)(8g, 51.88m㏖) 및 p-톨루엔설포닐 하이드라자이드(9.66g, 51.88m㏖)의 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(10g, 60.34%). LCMS: 323.2 (M+H)+; 1H NMR (DMSO-d6) δ: 11.19 (s, 1H), 7.66(d, J= 8Hz, 2H), 7.40(d, J=8Hz, 2H), 7.20(s, 1H), 3.60(s, 3H), 2.38(s, 3H), 2.09(s, 6H).
메틸 3-(3-나이트로벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트( INX-SM-4-4 )의 합성
절차:
다이옥산(30㎖) 중 메틸 3-((2-토실하이드라조노)메틸)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트(INX-SM-4-3)(4g, 12.42m㏖)의 교반 용액에, (4-나이트로페닐)보론산(2.07g, 12.42m㏖) 및 K2CO3(2.57g, 18.63m㏖)를 실온에서 첨가하고 110℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:06:94)로 정제시키고 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(0.520g, 16.04%). 1H NMR (DMSO-d6) δ: 8.10(d, J= 6.4Hz, 1H), 8.01(s, 1H), 7.64-7.59(m, 2H), 3.55(s, 3H), 2.95(s, 2H), 1.82(s, 6H).
3-(3-나이트로벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카브알데하이드 ( INX-SM-4-5 )의 합성
절차:
DCM(25㎖) 중 메틸 3-(3-나이트로벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카복실레이트(INX-SM-4-4)(0.490g, 1.87m㏖)의 교반 용액에, 다이아이소부틸알루미늄 하이드라이드(톨루엔 중 1M, 3.2㎖, 3.75m㏖)를 -78℃에서 첨가하고, 추가로 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 묽은 HCl 용액으로 반응정지시키고 실온을 가져오고 그 다음 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:18:82)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(0.27g, 62.26%). 1H NMR (DMSO-d6) δ: 9.55(s, 1H), 8.12(d, J= 8Hz, 1H), 7.99(s, 1H), 7.51(t, J=7.6 Hz, 1H), 7.44(d, J=7.6Hz, 1H), 2.95(s, 2H), 1.93(s, 6H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시 아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(3-(3-나이트로벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)-1,2,6a,6b,7,8,8a, 8b, 11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-4-6 )의 합성
절차:
DCM(30㎖) 중 3-(3-나이트로벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-카브알데하이드(INX-SM-4-5)(0.27g, 1.16m㏖)의 교반 용액에 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.351g, 0.93m㏖) 및 p-톨루엔설폰산(0.30g, 1.76m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가로 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 이성질체의 혼합물로서 제공하였다(0.470g, 조물질). LCMS: 590.93(M+H)+.
추가로 이성질체를 카이럴 분취용 HPLC(칼럼: IG 250*21㎛, 5마이크론, 이동상: A= 헵타 중 0.1% 암모니아, B = IPA: ACN(70:30), A: B = 75:25)으로 분리시켜 이성질체-1 및 이성질체-2를 제공하였다. 이러한 이성질체를 체류 시간 12.85분(이성질체-1) 및 19.40분(이성질체-2)에 용리시켰다.
이성질체-1: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) Fr-1: δ 4.94(d, 1H, C16H), 4.57(s, 1H, 아세탈-H)
이성질체-2: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) Fr-1: δ 5.19(d, 1H, C16H), 5.08(s, 1H, 아세탈-H)
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-아미노벤질) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 (INX-SM-4 ); 및
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-(3-아미노벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-54 )의 합성
절차:
에탄올(10㎖) 중 (INX-SM-4 -6, 이성질체의 혼합물 )(0.30g, 0.50m㏖)의 교반 용액에 NH4Cl(0.22g, 4.0m㏖) 및 Zn 더스트(0.26g, 4.0m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 80℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 이성질체의 혼합물(0.360g, 조물질)로서 제공하였다.
추가로 이성질체를 카이럴 분취용 HPLC(칼럼: IG 250*21㎛, 5마이크론, 이동상: A= 헵타 중 0.1% 암모니아, B = IPA: ACN(70:30), A: B = 82:18)으로 분리시켜 이성질체-1 및 이성질체-2를 제공하였다. 이러한 이성질체를 체류 시간 27.96분(이성질체-1) 및 43.90분(이성질체-2)에 용리시켰다.
INX-SM-4 (이성질체-1): LCMS: 560.90(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정) δ: 5.00-4.90 (m, 2H, 아세탈 및 C16-H)
INX-SM-54 (이성질체-2: LCMS: 561.00(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정) δ: 5.16 (d, J = 7.2Hz, 1H, C16-H), 5.09 (s, 1H, 아세탈-H)
S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX O )의 합성
반응식
tert-부틸 (S)-4-(2-((tert-부톡시카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX O-1 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 INX-SM-4(0.050g, 0.0894m㏖, 1.0eq), Boc-Gly-Glu(OtBu)-OH(0.0805g, 0.2235m㏖, 2.5eq) 및 PyAOP(0.1165g, 0.2235m㏖, 2.5eq)를 충전하였다. DMF(0.10㎖), 그 다음 DIPEA(0.078㎖, 0.4470m㏖, 5.0eq)를 첨가하고, 혼합물을 45분 동안 교반하였다. 이 시점에 모든 INX-SM-4가 소모되었고, 2:1 비율의 목적하는 생성물 대 비스 Gly-Glu 커플링된 화합물이 존재하였다. 조 혼합물을 Isco C18 Aq 30g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 5-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0220g의 INX O-1을, 28% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 B (ESI+): 1.76분에 C50H68N3O12 [M +H]+ 요구치 902.47, 실측치 902.88.
(S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산 TFA 염(I NX O-2 )의 합성:
절차:
둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 에스터 INX O-1(0.020g, 0.022m㏖, 1.0eq), MeCN(0.50㎖), 트라이플루오로아세트산(1.0㎖) 및 트라이아이소프로필실란(0.075㎖, 0.3662m㏖, 16.6eq)을 충전하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 출발 물질 소모를 LCMS로 확인하고 용매를 감소시켰다. 생성된 잔류물을 Isco C18 Aq 30g 역상 칼럼 상에 로딩하고, H2O(0.10% TFA 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.10% TFA 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0144g의 INX O-2·TFA를, 76% 수율, 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.088분에 C41H52N3O10 [M +H]+ 요구치 746.36, 실측치 746.3.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-((3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX O )의 합성:
절차:
바이알에 2-브로모아세트산(0.0205g, 0.1476m㏖, 2eq)을 충전하고, 이것을 DMF(0.40㎖)에 용해시켰다. N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-다이하이드로퀴놀린(0.0347g, 0.1402m㏖, 2eq)을 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반하였다. 그 다음 아민 INX O-2·TFA(0.0622g, 0.072m㏖, 1.0eq)를 중탄산나트륨(0.0371g, 0.4428m㏖, 6.15eq)과 함께 용액에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안(모든 INX O-2가 소모될 때까지) 교반하였다. LCMS로 반응 완결이 확인되면, 조 혼합물을 직접 Isco C18 Aq 5.5g 역상 칼럼 상에 로딩하고 H2O(0.05% AcOH 첨가제) 중 0-100% 아세토나이트릴(0.05% AcOH 첨가제)의 이동상으로 용리시켰다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결시키고, 동결건조시켜 0.0124g의 INX O를, 20% 수율, 솜털 같은 백색 고체로서 제공하였다. LCMS 방법 A (ESI+): 2.174분에 C43H53BrN3O11 [M +H]+ 요구치 866.28, 실측치 866.3.
INX-SM-6 및 INX-SM-56 의 합성
반응식
2-(3-나이트로페닐) 아세트아마이드( INX-SM-6-1 )의 합성
절차:
DCM(15㎖) 중 2-(3-나이트로페닐)아세트산(0.5g, 2.76m㏖)의 용액에, 옥살릴 클로라이드(0.71㎖, 8.28m㏖)를 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시켜 검 같은 액체를 제공하였고, 이것을 DCM에 용해시키고, 암모니아 기체를 0℃에서 퍼징하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 중탄산나트륨 용액으로 반응정지시키고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체로서 제공하였다(0.3g, 60.33%). 조물질을 다음 단계에서 그대로 사용하였다. LCMS: 181.1(M+H)+.
2-(3-나이트로페닐) 에탄티오아마이드( INX-SM-6-2 )의 합성
절차:
THF(50㎖) 중 2-(3-나이트로페닐) 아세트아마이드(INX-SM-6-1)(3.0g, 16.6m㏖)의 교반 용액에, 로손 시약(Lawesson's reagent)(13.4g, 33.33m㏖)을 실온에서 첨가하고 반응 혼합물을 환류 온도에서 14시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:28:72)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체로서 제공하였다(3.0g, 91.76%). LCMS: 197.1(M+H)+; 1H NMR (DMSO): 9.62, 9.54 (2 brs, 2H), 8.28 (s, 1H), 8.13 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.63 (t, J=8.0 Hz, 1H), 3.96 (s, 2H).
포타슘 2-클로로-3-에톡시-3-옥소프로프-1-엔-1-올레이트( INX-SM-6-3 )의 합성
절차:
다이아이소프로필 에터(25㎖) 중 메틸 에틸 폼에이트(0.5g, 6.75m㏖) 및 에틸 2-클로로아세테이트(0.824g, 6.75m㏖)의 용액에, 포타슘 tert-부톡사이드(0.75g, 6.75m㏖)를 0℃에서 첨가하고, rt에서 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로의 배산처리로 정제시키고 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 제공하였다(0.55g, 71.40%). 1H NMR (DMSO-d6) δ: 8.94 (s, 1H), 3.94 (q, 2H), 1.11 (t, 3H).
에틸 2-(3-나이트로벤질) 티아졸-5-카복실레이트( INX-SM-6-4 )의 합성
절차:
포타슘 2-클로로-3-에톡시-3-옥소프로프-1-엔-1-올레이트(INX-SM-6-3)(5.5g)를 묽은 HCl로 처리하고 에틸 아세테이트로 추출하고 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 에틸 2-클로로-3-옥소프로판오에이트(3.0g)의 황색 반고체를 제공하였다. 에탄올(50㎖) 중 2-(3-나이트로페닐) 에탄티오아마이드(INX-SM-6-2)(3g, 15.30m㏖)의 교반 용액에, 에틸 2-클로로-3-옥소프로판오에이트(2.75g, 18.36m㏖) 및 Na2SO4(8.03g, 76.53m㏖)를 첨가하고, 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 액체(1.6g, 35.80%)로서 제공하였다. LCMS: 293.40(M+H)+; 1H NMR(CDCl3) δ: 8.34 (s, 1H), 8.22-8.19 (m, 2H), 7.70 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.57 (t, J=8Hz, 1H), 4.49 (s, 2H), 4.32 (q, 2H), 1.31 (t, 3H).
2-(3-나이트로벤질) 티아졸-5-카브알데하이드( INX-SM-6-5 )의 합성
절차:
DCM(100㎖) 중 에틸 2-(3-나이트로벤질) 티아졸-5-카복실레이트(INX-SM-6-4)(1.6g, 5.4m㏖)의 교반 용액에, 다이아이소부틸알루미늄 하이드라이드(DIBAL)(톨루엔 중 1M, 12.05㎖, 12.05m㏖)를 -78℃에서 첨가하고, 추가로 20분 동안 -78℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 묽은 HCl 용액으로 반응정지시키고 실온으로 가져왔다. 생성물을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체로서 제공하였다(0.400g, 29.44%). LCMS: 249.29(M+H)+; 1H NMR (DMSO-d6) δ: 10.00 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.30(s, 1H), 8.17 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.85 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.67 (t, J=8Hz, 1H), 4.65 (s, 2H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(2-(3-나이트로벤질)티아졸-5-일)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-6-7 ); 및
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(2-(3-나이트로벤질)티아졸-5-일)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-56-1 )의 합성
절차:
DCM(20㎖) 중 2-(3-나이트로벤질) 티아졸-5-카브알데하이드((INX-SM-6-5)(0.4g, 1.06m㏖)의 교반 용액에 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.211g, 0.84m㏖) 및 p-톨루엔설폰산(1.0g, 5.30m㏖)을 첨가하고, 8시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 중탄산염 용액으로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 플래시 크로마토그래피(메탄올/DCM: 6:94)로 정제시켜 화합물을 부분입체이성질체의 혼합물(INX-SM-6-6)로서 제공하였다.
추가로 부분입체이성질체를 분취용 HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S,250 X 20㎜ S-10㎛, 12㎜, 이동상: A = 물 중 0.05% 암모니아, B = ACN 중 20% A-Line, A:B = 45:55)로 정제시켰다. 이러한 이성질체는 체류 시간 13.5분(INX-SM-6-7, 이성질체-1)(0.030g, 8.8%) 및 18.50분(INX-SM-56-1, 이성질체-2)(0.040g, 11.8%)에 용리되었다.
((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS)-10- (2- (3-아미노벤질) 티아졸-5-일) -7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a, 8a-다이메틸-1,2, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 11a, 12, 12a, 12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-6 )의 합성
절차:
에탄올(2㎖) 중 (INX-SM-6-7, 이성질체-1)(0.030g, 0.049m㏖)의 교반 용액에 NH4Cl(0.020g, 0.39m㏖) 및 Zn 금속(0.025g, 0.39m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 분취용 HPLC(0.05% 암모니아-아세토나이트릴)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(0.005g, 17.8%).
INX-SM-6(R-이성질체): LCMS: 577.2(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.86 (s, 1H, 아세탈-H), 5.02 (d, C-16H).
(6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10S, 11aR, 12aS,12bS)-10-(2-(3-아미노벤질) 티아졸-5-일)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a, 8a-다이메틸-1, 2, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 11a, 12, 12a, 12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-56 )의 합성
절차:
에탄올(2㎖) 중 (INX-SM-56-1, 이성질체-2)(0.040g, 0.065m㏖)의 교반 용액에 NH4Cl(0.027g, 0.52m㏖) 및 Zn 금속(0.034g, 0.52m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 분취용 HPLC(0.05% 암모니아-아세토나이트릴)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(0.015g, 39%); LCMS: 577.1(M+H)+.
INX-SM-56 (S-이성질체): LCMS: 577.2(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 6.40(s, 1H, 아세탈-H), 5.33(d, J=6.0 Hz, C-16H)
INX-SM-7 및 INX-SM-57 의 합성
반응식
tert-부틸 (2-브로모티아졸-5-일) 카바메이트( INX-SM-7-1 )의 합성
절차:
t-BuOH(50㎖) 중 2-브로모티아졸-5-카복실산(5.0g, 24.0m㏖)의 용액에, 다이페닐포스포릴 아자이드(DPPA)(7.74㎖, 36.0m㏖) 및 트라인에틸아민(13.48㎖, 96.1m㏖)을 첨가하고, 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 갈색 고체로서 제공하였다(2.3g, 34.28%). LCMS: 278(M+H)+; 1H NMR (DMSO-d6): 10.98 (s, 1H), 7.09 (s, 1H) 1.46 (s, 9H).
tert-부틸 (2-바이닐티아졸-5-일) 카바메이트( INX-SM-7-2 )의 합성
절차:
실온에서 다이옥산(50㎖) 중 tert-부틸 (2-브로모티아졸-5-일) 카바메이트(INX-SM-7-1)(1.5g, 5.37m㏖)의 교반 용액에 트라이부틸(바이닐)틴(1.70g, 5.37m㏖)을 첨가하고, 15분 동안 N2(g)로 탈기시켰다. 테트라키스 트라이페닐포스핀 팔라듐(0)(0.310g, 0.26m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 100℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고, 여과액을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:20:80)로 정제시켜 표제 화합물(0.9g, 74.2%)을 제공하였다. LCMS: 227.0(M+H)+; 1H NMR (DMSO-d6): 10.72(s, 1H), 7.26(s, 1H), 6.76(dd, J=11.2 & 17.6 Hz,1H), 5.82(d, J=17.6Hz, 1H), 5.42(d, J=11.2Hz, 1H), 1.46(s, 9H).
tert-부틸 (2-폼일티아졸-5-일) 카바메이트( INX-SM-7-3 )의 합성
절차:
다이옥산(50㎖) 중 tert-부틸 (2-바이닐티아졸-5-일) 카바메이트(INX-SM-7-2)(3.8g, 16.8m㏖)의 용액에, 물(2㎖) 중 K2OsO4.2H2O(0.179g, 0.48m㏖)의 용액을 첨가하였다. NaIO4(18.15g, 85.2m㏖)를 물(10㎖)에 용해시키고, 반응 혼합물에 첨가하고 rt에서 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 셀라이트층으로 여과하고, 여과액을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산: 15:85)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(2.5g, 65.22%)로서 제공하였다. LCMS: 229.0(M+H)+.
tert-부틸-(2-((2-토실하이드라조노) 메틸) 티아졸-5-일) 카바메이트( INX-SM-7-4 )의 합성
절차:
다이옥산(50㎖) 중 tert-부틸 (2-폼일티아졸-5-일) 카바메이트(INX-SM-7-3)(2.5g, 10.9m㏖)의 용액에, p-톨루엔설포닐하이드라자이드(2.23g, 12.0m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 90℃에서 5시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산: 25:75)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(2.8g, 64.48%)로서 제공하였다. LCMS: 397.0(M+H)+.
tert-부틸 (2-(4-폼일벤질) 티아졸-5-일) 카바메이트(INX-SM-7-5)의 합성
절차:
다이옥산(50㎖) 중 tert-부틸-(2-((2-토실하이드라조노) 메틸) 티아졸-5-일) 카바메이트(INX-SM-7-4)(2.8g, 7.06m㏖)의 교반 용액에, (4-폼일페닐)보론산(1.16g, 7.76m㏖) 및 K2CO3(1.94g, 14.12m㏖)를 첨가하고, 110℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:20:80)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.4g, 17.79%)제공하였다. LCMS: 319.0(M+H)+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-아미노티아졸-2-일)메틸) 페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-7 ); 및
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-아미노티아졸-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-57 )의 합성
절차:
DCM(50㎖) 중 tert-부틸 (2-(4-폼일벤질) 티아졸-5-일) 카바메이트(INX-SM-7-5)(0.1g, 0.31m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.118g, 0.31m㏖)의 교반 용액에, 아세토나이트릴(6.2㎖) 중 트라이플산(0.15g, 1.03m㏖)용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaOH 용액에 붓고, MDC로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 이성질체의 혼합물(0.060g, 조물질)로서 제공하였다.
추가로 부분입체이성질체를 분취용 HPLC(칼럼: Xbridge prep, C18, OBD19*250㎜, 5마이크론, 이동상: A = 물 중 0.05% 암모니아, B = ACN(67:33), A: B = 67:33)로 분리시켜 이성질체-1 및 이성질체-2를 제공하였다. 이러한 이성질체는 체류 시간 17.70분(이성질체-1) 및 20.87분(이성질체-2)에 용리되었다.
INX-SM-7(이성질체-1, R-이성질체): (수율: 0.010g, 3%). LCMS: 577.4(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.47(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(d, J=5.2Hz, 1H, C16H)
INX-SM-57 (이성질체-2, S 이성질체): (수율: 0.003g, 0.6%). LCMS 577.4(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 6.03(s, 1H, 아세탈-H), 5.41(d, J=5.2Hz, 1H, C16H)
INX-SM-13 및 INX-SM-63의 합성
반응식
(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-13 ); 및
(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-63 )의 합성
절차:
DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-3-5)(0.180g, 0.597m㏖) 및 (8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(트라이암시놀론)(0.259g, 0.656m㏖)의 용액에, p-톨루엔설폰산 (0.908g, 4.77m㏖)을 첨가하고, 실온에서 추가로 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조 생성물 화합물을 이성질체의 혼합물로서 제공하였다. 추가로 조 생성물을 정제시키고, 이성질체를 역상 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-10㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% 암모니아, B = ACN:MeOH(50:50))로 분리시켰다. 이러한 이성질체를 체류 시간 14분(이성질체-1) 및 19.5분(이성질체-2)에 용리시켰다.
INX-SM-13(이성질체-1): (수율: 0.038g, 11.08%). LCMS: 578.20(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.47(s, 1H, 아세탈-H), 5.05(d, J=5.2Hz, 1H, C16H)
INX-SM-63 (이성질체-2): (수율: 0.005g, 1.45%). LCMS 578.30(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 6.13(s, 1H, 아세탈-H), 5.42(d, J=6.8Hz, 1H, C16H)
INX-SM-24 및 INX-SM-74 의 합성
반응식
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-24 ); 및
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일) 메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b, 7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-74 )의 합성
절차:
DCM(10㎖) 중 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-3-5)(0.500g, 1.66m㏖) 및 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a,10,10-테트라메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(플루오시놀론 아세토나이드)(0.716g, 1.65m㏖)의 용액에, p-톨루엔설폰산 (2.5g, 13.26m㏖)을 첨가하고, 실온에서 추가로 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 이성질체의 혼합물로서 제공하였다. 추가로 조 생성물을 정제시키고 이성질체를 역상 분취용-HPLC(칼럼: Unisil 10-120 C18 Ultra, 250×21.2㎜×10㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% 암모니아, B = 아세토나이트릴)로 분리시켜 이성질체-1 및 이성질체-2를 제공하였다. 이러한 이성질체는 체류 시간 13.5분 (이성질체-1) 및 19.5분(이성질체-2)에 용리되었다.
INX-SM-24(R-이성질체): (수율 0.100g, 10.11%).). LCMS: 596.20(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.48(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(d, J=4.4Hz, 1H, C16H)
INX-SM-74(S-이성질체): (수율 0.020g, 2.02%). LCMS: 596.20(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 6.17(s, 1H, 아세탈-H), 5.43(d, J=7.2Hz, 1H, C16H)
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-아미노쿠반-1-일)메틸) 페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 (INX-SM-9 )의 합성
반응식
메틸 4-((tert-부톡시카보닐)아미노)쿠반-1-카복실레이트( INX-SM-9-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 4-메톡시카보닐 쿠반카복실산(2g, 9.69m㏖) 및 tert-부틸 알코올(60㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 다이페닐포스포릴 아자이드(DPPA)(3.1㎖, 14.54m㏖) 및 트라이에틸아민(10.8㎖, 77.59m㏖)을 실온에서 첨가하고 30분 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산: 15:85)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.90g, 33.46%)로서 제공하였다. 1H NMR(CDCl3) δ: 4.1(bs, 6H), 3.71(s, 3H), 1.46(s, 9H).
tert-부틸 (4-(하이드록시메틸)쿠반-1-일)카바메이트( INX-SM-9-2 )의 합성
절차:
질소 하에서 100㎖ 3구 둥근 바닥 플라스크에 메틸 4-((tert-부톡시카보닐)아미노)쿠반-1-카복실레이트(INX-SM-9-1)(0.9g, 3.24m㏖) 및 THF(40㎖)를 충전하였다. 이 용액에, THF 중 1M 리튬 알루미늄 하이드라이드(3.2㎖, 3.24m㏖)를 -78℃에서 첨가하고 추가로 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 1N NaOH 용액으로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물(0.8g, 98.88%)을 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ: 7.58(bs, 1H), 4.42(t, 1H), 3.80(bs, 3H), 3.57(bs, 3H) 3.48(d, 2H, J=5.2), 1.37(s, 9H).
4tert-부틸 (4-폼일쿠반-1-일)카바메이트( INX-SM-9-3 )의 합성
절차:
질소 하에서 100㎖ 3구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4-(하이드록시메틸)쿠반-1-일)카바메이트(INX-SM-9-2)(0.9g, 3.60m㏖) 및 DCM(25㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 데스-마틴 퍼아이오디난(DMP)(3.06g, 7.21m㏖)을 0℃에서 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 다이에틸 에터로 세척하였다. 합한 여과액을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(1.0g, 조물질, 정량적). 조물질을 즉시 다음 단계에 사용하였다.
tert-부틸 (4-((2-토실하이드라조노)메틸)쿠반-1-일)카바메이트( INX-SM-9-4 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4-폼일쿠반-1-일)카바메이트(INX-SM-9-3)(1.0g, 4.04m㏖) 및 EtOH(30㎖)를 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설포닐하이드라자이드(1.1g, 6.06m㏖)를 촉매량의 AcOH와 함께 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 부었다. 고체를 여과하고 생성물을 진공 하에서 건조시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:헥산, 1:4)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(0.8g, 47.61%). LCMS: 416.3(M+H)+; 1H NMR (DMSO-d6) δ: 11.07(s, 1H), 7.67(d, J=8.4Hz, 2H), 7.40-7.38(m, 3H), 3.85-3.81(m, 6H), 2.38(s, 3H), 1.36(s, 9H).
tert-부틸 (4-(4-폼일벤질)쿠반-1-일)카바메이트( INX-SM-9-5 )의 합성
절차:
질소 하에서 35㎖ 바이알에 tert-부틸 (4-((2-토실하이드라조노)메틸)쿠반-1-일)카바메이트(INX-SM-9-4)(0.50g, 1.20m㏖) 및 다이옥산(10㎖)을 충전하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 N2로 퍼징하였다. 이 용액에, (4-폼일 페닐)보론산(0.36g, 2.40m㏖) 및 K2CO3(0.33g, 2.41m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 110℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 15:85)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(0.040g, 9.85%). 1H NMR (DMSO-d6) δ: 9.96 (s, 1H), 7.83(d, J= 8Hz, 2H), 7.59(bs, 1H), 7.40(d, J= 7.6Hz, 2H), 3.76(bs, 3H), 3.58(bs, 3H), 2.96(s, 2H), 1.35(s, 9H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-아미노쿠반-1-일)메틸) 페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-9 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((2r,3R,4s,5S)-4-(4-폼일벤질)쿠반-1-일)카바메이트(INX-SM-9-5)(0.035g, 0.10m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S, 13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시 프레드니솔론)(0.038g, 0.10m㏖), MgSO4(0.062g, 0.51m㏖) 및 DCM(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, HClO4(0.157g, 1.55m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 차가운 물로 배산처리하고 침전물을 여과하고 진공 하에서 건조시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = ACN:MeOH:IPA(65:25:10), A:B, 67:33); 체류 시간 15.14분)로 정제시켜 R-이성질체를 백색 고체(0.010g, 16.18%)로서 제공하였다; LCMS: 597.4(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.47(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(d, J=4.8 Hz, 1H, C16H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-32 )의 합성
반응식
tert-부틸 (6-(하이드록시메틸)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-32-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 메틸 6-((tert-부톡시카보닐)아미노)스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트(2.0g, 7.43m㏖) 및 THF:MeOH(15:5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, NaBH4(1.4g, 37.17m㏖)를 0℃에서 나누어 첨가하고 추가로 4시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 희석시키고 1N HCl로 중성 pH로 조정하였다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물(2.0g, 정량적)을 제공하였다. LCMS: 186.2 (M+H -56), 1H NMR(CDCl3) δ: 4.63(bs, 1H), 3.97(bs, 1H), 3.54(d, J=6.8 Hz, 2H), 2.50-2.25(m, 3H), 2.20-1.95(m, 2H), 1.90-1.40(m, 5H), 1.46(s, 9H).
tert-부틸 (6-폼일스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-32-2 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (6-(하이드록시메틸)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-32-1)(2.0g, 8.30m㏖) 및 DCM(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 데스-마틴 퍼아이오디난(DMP)(3.51g, 8.30m㏖)을 0℃에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 다이에틸 에터로 세척하였다. 합한 유기 층을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 40:60)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(1.7g, 85.72%)로서 제공하였다. LCMS: 184.2 (M+H-56).
tert-부틸 (6-((2-토실하이드라조노)메틸)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트 ( INX-SM-32-3 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (6-폼일스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-32-2)(1.5g, 6.27m㏖) 및 EtOH(15㎖)를 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드(1.16g, 6.27m㏖) 및 촉매량의 AcOH(0.2㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 부었다. 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(2.2g, 86.13%)로서 제공하였다. LCMS: 425.5 (M+18).
tert-부틸 (6-(4-폼일벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-32-4 )의 합성
절차:
질소 하에서 35㎖ 바이알에 tert-부틸(6-((2-토실하이드라조노)메틸) 스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-32-3)(1.0g, 2.45m㏖) 및 다이옥산(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 실온에서 (4-폼일페닐)보론산(0.36g, 2.45m㏖) 및 K2CO3 (0.51g, 3.68m㏖)를 첨가하고 100℃에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.16g, 19.79%)로서 제공하였다. LCMS: 274.3(M+H-56).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-32 )의 합성
절차:
35㎖ 바이알에 tert-부틸 (6-(4-폼일벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-32-4)(0.16g, 0.48m㏖), (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.13g, 0.34m㏖), MgSO4(0.29g, 2.43m㏖) 및 DCM(4㎖)을 충전하였다. 이 용액에, HClO4(0.40g, 2.43m㏖)를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공에서 농축시켰다. 조물질을 차가운 물로 배산처리하고 침전된 고체를 여과하고 진공 하에서 건조시켰다.
조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = 아세토나이트릴, A:B, 80:20), (체류 시간 18.54분)로 정제시켜 R-이성질체를 백색 고체로서 제공하였다(0.045g, 15.76%); LCMS: 588.4(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.45(s, 1H, 아세탈-H), 5.05(d, J=4.8Hz, 1H, C16H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-7-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12, 12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-31 )의 합성
반응식
tert-부틸 7-폼일-5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-2-카복실레이트( INX-SM-31-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 100㎖ 3구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 7-(하이드록시메틸)-5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-2-카복실레이트(1.0g, 4.11m㏖) 및 DCM(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 실온에서 데스-마틴 퍼아이오디난(DMP)(3.40, 8.22m㏖)을 첨가하고 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 검 같은 고체(0.8g, 78.71%)로서 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ: 9.59(s, 1H), 4.08-4.04(m, 1H), 3.88-3.70(m, 5H), 3.21-3.19(m, 1H), 2.37-2.21(m, 2H), 1.36(s, 9H).
tert-부틸-7-((2-토실하이드라조노)메틸)-5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-2-카복실레이트( INX-SM-31-2 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 7-폼일-5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-2-카복실레이트(INX-SM-31-1)(0.8g, 4.04m㏖) 및 EtOH(30㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 실온에서 p-톨루엔설포닐하이드라자이드(0.92g, 4.97m㏖) 및 촉매량의 AcOH를 첨가하고, 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 고체를 진공 하에서 여과하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 20:80)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.7g, 51.56%)로서 제공하였다. LCMS:410.8(M+H)+.
tert-부틸 7-(4-폼일벤질)-5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-2-카복실레이트 ( INX-SM-31-3 )의 합성
절차:
질소 하에서 35㎖ 바이알에 tert-부틸-7-((2-토실하이드라조노)메틸)-5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-2-카복실레이트(INX-SM-31-2)(0.72g, 1.76m㏖) 및 다이옥산(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 실온에서 (4-폼일페닐)보론산(0.26g, 1.76m㏖) 및 K2CO3(0.48g, 3.52m㏖)을 첨가하고 110℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 15:85)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.30g, 52.96%)로서 제공하였다. LCMS:332.8(M+H)+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-7-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12, 12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-31 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 7-(4-폼일벤질)-5-옥사-2-아자스피로[3.4]옥탄-2-카복실레이트(INX-SM-31-3)(0.30g, 0.90m㏖), (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.34g, 0.90m㏖), MgSO4(0.54g, 4.52m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, HClO4(0.45g, 4.52m㏖)를 첨가하고 추가로 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다.
합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 정제시키고 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = ACN:MEOH:IPA(65:25:10); (체류 시간: 16.40분)로 정제시켜 R-이성질체를 백색 고체(0.022g, 4.50%)로서 제공하였다; LCMS: 591.3(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.44(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(d, J=4.8 Hz, 1H, C16H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노옥세탄-3-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카 하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-33 )의 합성
반응식
tert-부틸 (3-폼일옥세탄-3-일) 카바메이트( INX-SM-33-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 100㎖ 3구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(하이드록시메틸)옥세탄-3-일)카바메이트(2.0g, 9.84m㏖) 및 DCM(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 데스-마틴 퍼아이오디난(DMP)(4.17g, 9.84m㏖)을 0℃에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 다이에틸 에터로 세척하였다. 합한 유기 층을 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:45:55)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(2.0g, 정량적)로서 제공하였다. 1H NMR(CDCl3) δ: 9.85(s, 1H), 5.50-5.42 (m,1H), 5.10-4.940(m, 1H), 4.86-4.84(d, 2H), 1.47 (s, 9H).
tert-부틸 (3-((2-토실하이드라조노)메틸)옥세탄-3-일)카바메이트( INX-SM-33-2 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-폼일옥세탄-3-일)카바메이트(INX-SM-33-1)(1.7g, 8.44m㏖) 및 EtOH(17㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 실온에서 p-톨루엔설포닐하이드라자이드(1.57g, 8.44m㏖) 및 촉매량의 AcOH를 첨가하고, 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(2.5g, 80.10%)로서 제공하였다. LCMS: 387.4(M+18).
tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)옥세탄-3-일)카바메이트( INX-SM-33-3 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 바이알에 tert-부틸(3-((2-토실하이드라조노)메틸)옥세탄-3-일)카바메이트(INX-SM-33-2)(2.5g, 6.77m㏖) 및 다이옥산(25㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 실온에서 (4-폼일페닐)보론산(1.0g, 6.77m㏖) 및 K2CO3(1.4g, 10.16m㏖)를 첨가하고 추가로 2시간 동안 100℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.25g, 12%)로서 제공하였다. LCMS: 292.2(M+H)+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노옥세탄-3-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카 하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-33 )
절차:
35㎖ 바이알에 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)옥세탄-3-일)카바메이트(INX-SM-33-1)(0.080g, 0.27m㏖), (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타 [a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.073g, 0.19m㏖), MgSO4(0.16g, 1.37m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, HClO4(0.23g, 1.37m㏖)를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 차가운 물로 배산처리하고 침전된 고체를 여과하고 진공 하에서 건조시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = 아세토나이트릴; A:B,80:20); 체류 시간: 8.70분)로 정제시켜 표제 화합물의 R-이성질체를 백색 고체(0.004g, 2.65%)로서 제공하였다. LCMS: 551.3(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.48(s, 1H, 아세탈-H), 5.07(d, J=5.4Hz, 1H, C16H).
(6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-10-(4-((4-아미노바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일) 메틸) 페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a, 8a-다이메틸-1, 2, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 11a, 12, 12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-10) 의 합성
반응식
메틸 4-아이소사이아네이토바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-카복실레이트( INX-SM-10-1 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 4-(메톡시 카보닐) 바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-카복실산(1g, 4.47m㏖) 및 톨루엔(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 다이페닐포스포릴 아자이드(DPPA)(1.29g, 4.47m㏖) 및 트라이에틸 아민(0.47g, 4.47m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 110℃에서 2시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 실온에서 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 10% 시트르산 용액으로 세척하고, 그 다음 포화 중탄산염 용액으로 세척하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 무색 액체로서 제공하였다. (0.45g, 45.46%). 1H NMR(CDCl3) δ: 3.62(s, 3H), 1.90-1.87 (m, 12H).
4-아미노바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-카복실산( INX-SM-10-2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 메틸 4-아이소사이아네이토바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-카복실레이트(INX-SM-10-1)(0.45g, 2.15m㏖) 및 6N HCl(10㎖)을 충전하였다. 반응 혼합물을 실온에서 추가로 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 함유하는 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 n-펜텐으로 배산처리하여 다이에틸 에터를 백색 고체(0.45g, 정량적)로서 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ: 12.21(bs, 1H), 8.20(s, 3H), 1.83-1.69(m, 12H).
에틸 4-아미노바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-카복실레이트( INX-SM-10-3 )의 합성
절차:
25㎖ 3구 둥근 바닥 플라스크에 에탄올(5㎖)을 질소 하에서 충전하였다. 이 용액에, 티오닐 클로라이드(0.62g, 5.32m㏖)를 0℃에서 첨가하고, 4-아미노바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-카복실산(INX-SM-10-2)(0.45g, 2.65m㏖)을 첨가하고, 3시간 동안 환류시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 n-펜텐 및 다이에틸 에터로 배산처리하여 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.55g, 정량적)로서 제공하였다. LCMS: 198.20; 1H NMR (DMSO-d6) δ: 8.13(s, 1H), 7.68(s, 2H), 4.04-4.99(q, J=6.8 Hz, 2H), 1.82-1.71(m, 12 H) 1.16-1.12(t, 3H, J=8 Hz).
(4-아미노바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-일) 메탄올 (INX-SM-10-4 )의 합성
절차:
질소 하에서 25㎖ 3구 둥근 바닥 플라스크에 에틸 4-아미노바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-카복실레이트(INX-SM-10-3)(0.55g, 2.27m㏖) 및 THF(5.5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, LiAlH4(THF 중 1M)(6.9㎖, 6.9m㏖)를 -20℃에서 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 10% NaOH 용액으로 반응정지시키고, 셀라이트층으로 여과하였다. 여과액을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 n-펜텐 및 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.30g, 69.32%)로서 제공하였다. LCMS: 156.1(M+H)+; 1H NMR (DMSO-d6) δ: 3.05(s, 2H), 1.48-1.37(m, 12H).
tert-부틸 (4-(하이드록시메틸) 바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-일) 카바메이트( INX-SM-10-5 )의 합성
절차:
질소 하에서 25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (4-아미노바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-일) 메탄올(INX-SM-10-4)(0.30g, 1.93m㏖) 및 DCM(15㎖)을 충전하였다. 이 용액에, Boc-무수물(0.63g, 2.90m㏖)을 실온에서 첨가하고 추가로 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 중탄산염 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이아이소프로필 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.45g, 91.19%)로서 제공하였다. LCMS: 200.2 (M+H-56); 1H NMR(CDCl3) δ: 4.34 (bs, 1H), 3.27 (s, 2H), 1.86=1.82(m, 6H), 1.59-1.53(m, 6H), 1.43(s, 9H).
tert-부틸 (4-폼일바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-일) 카바메이트( INX-SM-10-6 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4-(하이드록시메틸) 바이사이클로[2.2.2] 옥탄-1-일) 카바메이트(INX-SM-10-5)(0.45g, 1.76m㏖) 및 THF(10㎖)를 충전하였다. 데스-마틴 퍼아이오디난(DMP)(1.12g, 2.64m㏖)을 실온에서 첨가하고 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 수성 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.45g, 조물질)로서 제공하였다. LCMS: 198.3(M+H-56).
tert-부틸 (4-((2-토실하이드라조노)메틸) 바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-일) 카바메이트( INX-SM-10-7 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (4-폼일바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-일) 카바메이트(INX-SM-10-6)(0.45g, 1.77m㏖) 및 에탄올(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설포닐하이드라자이드(0.39g, 2.13m㏖) 및 아세트산(0.05g, 0.88m㏖)을 실온에서 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 부었다. 백색 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 회백색 고체(0.38g 51.42%)로서 제공하였다. LCMS: 422.3(M+H)+; 1H NMR (DMSO-d6) δ: 10.72(s, 1H), 7.65(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.39(d, J=8.0 Hz, 2H) 7.02 (s,1H), 6.37 (bs, 1H), 2.37(s, 3H), 1.71-1.69(m, 6H), 1.46-1.42(m, 6H),1.34(s, 9H).
tert-부틸 (4-(4-폼일벤질)바이사이클로[2.2.2] 옥탄-1-일) 카바메이트( INX-SM-10-8 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸(4-((2-토실하이드라조노) 메틸) 바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-일) 카바메이트(INX-SM-10-7)(1.0g, 2.37m㏖) 및 다이옥산(20㎖)을 충전하였다. (4-폼일페닐) 보론산(0.53g, 3.55m㏖) 및 K2CO3(0.49g, 3.55m㏖)를 실온에서 첨가하고 추가로 2시간 동안 110℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 무색 액체(0.06g, 7.36%)로서 제공하였다. LCMS: 288.8(M+H-56).
(6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-10-(4-((4-아미노바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일) 메틸) 페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a, 8a-다이메틸-1, 2, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 11a, 12, 12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-10) 의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4-(4-폼일벤질) 바이사이클로 [2.2.2] 옥탄-1-일) 카바메이트(INX-SM-10-8)(0.05g, 0.145m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.054g, 0.14m㏖), MgSO4 (0.080g, 0.73m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, HClO4(0.072g, 0.73m㏖)를 첨가하고, 추가로 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 중탄산염 용액으로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5 ㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = ACN: MEOH: IPA(65:25:10); A:B, 80:20); 체류 시간 18.76분)로 정제시켜 표제 화합물의 R-이성질체를 백색 고체(0.015g, 14.27%)로서 제공하였다; LCMS 603.52(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD 주요 양성자 배정) δ: 5.46 (s, 1H, 아세탈-H), 5.06 (d, J=4.80 Hz, 1H, C16H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((1-아미노-3,3-다이플루오로사이클로 부틸)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-35 )의 합성
반응식
tert-부틸 (E)-(3,3-다이플루오로-1-((2-토실하이드라조노)메틸)사이클로부틸)카바메이트( INX-SM-35-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 30㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (3,3-다이플루오로-1-폼일사이클로부틸) 카바메이트(0.50g, 2.12m㏖) 및 다이옥산(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설포닐하이드라자이드(0.4g, 2.12m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 90℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.55g, 64.23%)로서 제공하였다. LCMS: 348.1(M+H-56).
tert-부틸 (3,3-다이플루오로-1-(4-폼일벤질)사이클로부틸)카바메이트( INX-SM-35-2 )의 합성
절차:
질소 하에서 30㎖ 바이알에 tert-부틸(3,3-다이플루오로-1-((2-토실하이드라조노) 메틸)사이클로부틸)카바메이트(INX-SM-35-1)(0.50g, 1.72m㏖) 및 다이옥산(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, (4-폼일페닐)보론산(0.18g, 1.72m㏖) 및 K2CO3(0.25g, 1.85m㏖)를 실온에서 첨가하고 추가로 2시간 동안 110℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.11g, 24.80%)로서 제공하였다. LCMS: 326.1(M+H)+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((1-아미노-3,3-다이플루오로사이클로 부틸)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-35 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3,3-다이플루오로-1-(4-폼일벤질)사이클로부틸)카바메이트(INX-SM-35-3)(0.11g, 0.33m㏖), (8S,9S,10R,11S, 13S, 14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.1g, 0.27m㏖), MgSO4(0.2g, 1.69m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, HClO4(0.16g, 1.69m㏖)를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% 암모니아, B = 아세토나이트릴; A:B, 58:42), 체류 시간 18.36분)로 정제시켜 표제 화합물의 R-이성질체(Fr-1)를 백색 고체로서 제공하였다(0.030g, 15.58%); LCMS: 585.4(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.48(s, 1H, 아세탈-H), 5.07(d, J=5.2Hz, 1H, C16H).
INX-A1 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3,3-다이플루오로-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A1-1) 의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.20g, 0.41m㏖), HATU(0.24g, 0.64m㏖), DMF(2㎖) 및 DIPEA(0.11g, 0.82m㏖)를 실온에서 충전하였다. 이 용액에, tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐) 아미노)아세트아미도)-5-((3,3-다이플루오로-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-SM-35)(0.25g, 0.41m㏖)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.24g, 52.03%)로서 제공하였다.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3,3-다이플루오로-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS, 10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A1-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3,3-다이플루오로-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS, 8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질) 사이클로부틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A1-1)(0.2g, 0.12m㏖) 및 THF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.3g, 0.24m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.13g, 68.74%)로서 제공하였다 LCMS: 827.6 (M+1).
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3,3-다이플루오로-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A1-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3,3-다이플루오로-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A1-2)(0.1g, 0.12m㏖) 및 DCM(4㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖) 중 Na2CO3(0.048g, 0.24m㏖) 용액 및 브로모 아세틸 브로마이드(0.005g, 0.48m㏖)를 실온에서 적가하고, 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.10g, 67.10%)로서 제공하였다. LCMS: 946.8, 848.9(M &M+2).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3,3-다이플루오로-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A1-1 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3,3-다이플루오로-1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A1-3)(0.10g, 0.01m㏖)를 충전하였다 이 용액에, TFA(0.24g, 2.10m㏖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.090g, 95.67%)로서 제공하였다. LCMS: 890.90, 893.0(M&M+2).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-V )의 합성
반응식
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(( INX-V-1 )의 합성
절차:
실온에서 10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.25g, 0.41m㏖) 및 HATU(0.20g, 0.41m㏖), DMF(2㎖) 및 DIPEA(0.10g, 0.82m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3] 다이옥솔-4-온(INX-SM-32)(0.25g, 0.41m㏖)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체로서 제공하였다. 이것을 즉시 다음 단계에 사용하였다.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS, 10R,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12, 12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3] 헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-V-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a, 12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3] 헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-V-1)(0.2g, 0.19m㏖) 및 THF(2㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.14g, 1.9m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터로 배산처리하여 황색 고체(0.15g, 90.12%)를 제공하였다. LCMS:831.9(M+H)+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S, 8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a, 6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-V-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(3㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시 아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토 [2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-V-2)(0.15g, 0.28m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖) 중 Na2CO3(0.11g, 0.57m㏖) 용액, 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.037g, 0.18m㏖)를 실온에서 적가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.070g, 40%)로서 제공하였다. LCMS: 950.9, 952.9(M & M+2).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-V )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-V-3)(0.070g, 0.07m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.055g, 0.71m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 연황색 고체로서 제공하였다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: Xbridge Prep, C18, OBD 19 x 250㎜, 5㎛; 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = 아세토나이트릴; A:B, 58:42)로 정제시켜 R-이성질체를 제공하였고, 이것은 체류 시간 16.92분에 용리되었으며 표제 화합물을 회백색 고체(0.004g, 11.83%)로서 제공하였다. LCMS: 895.1 & 897.1(M& M+2); 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.44(s, 1H, 아세탈-H), 5.05(d, J=4.8Hz, 1H, C16H).
(S)-6-아미노-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12, 12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클 [1.1.1]펜탄-1-일)헥산아마이드( INX-W )의 합성
반응식
벤질 N2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실)-N6-(tert-부톡시 카보닐)-L-라이시네이트( INX-W-1 )의 합성
절차:
실온에서 250㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리신 (8.8g, 29.62m㏖), HATU(16.9g, 44.67m㏖), DMF(100㎖) 및 DIPEA(16g, 89.28m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 벤질 N6-(tert-부톡시카보닐)-L-라이시네이트(10g, 29.76m㏖)를 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(15g, 81.96%)로서 제공하였다. LCMS: 616.6(M+H)+.
N2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실)-N6-(tert-부톡시카보닐)-L-라이신( INX-W-2 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 벤질 N2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실)-N6-(tert-부톡시카보닐)-L-라이시네이트 (INX-W-1)(5g, 8.12m㏖) 및 MeOH(50㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 10% Pd/C(2.5g)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 수소 퍼징하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고, 여과액을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을황색 고체(0.5g, 23.43%)로서 제공하였다. LCMS:426.2(M+1-Boc).
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(((S)-6-((tert-부톡시카보닐)아미노)-1-((3-(4-((6aR, 6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3] 다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트( INX-W-3 )의 합성
절차:
실온에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 N2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실)-N6-(tert-부톡시카보닐)-L-라이신(INX-W-2)(0.5g, 0.95m㏖), HATU(0.54g, 1.42m㏖), DMF(25㎖) 및 DIPEA(0.5㎖, 2.85m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a, 6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-3)(0.53g, 0.95m㏖)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 70:30)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.45g, 44.32%)로서 제공하였다. LCMS:1067.7(M+H)+.
tert-부틸 ((S)-5-(2-아미노아세트아미도)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12, 12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클 [1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트( INX-W-4 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(((S)-6-((tert-부톡시카보닐)아미노)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카 하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일) 아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트(INX-W-3)(0.45g, 0.42m㏖) 및 THF(20㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.30g, 4.21m㏖)을 첨가하고, 2시간 동아 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 다이에틸 에터-헥산으로 배산처리하여 정제시키고, 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.35g, 98.23%)로서 제공하였다. LCMS:845.6(M+H)+.
tert-부틸 ((S)-5-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S, 8aS, 8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7, 8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일) 벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트( INX-W-5 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((S)-5-(2-아미노아세트아미도)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시 아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토 [2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-6-옥소헥실) 카바메이트(INX-W-4)(0.35g, 0.41m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖) 중 Na2CO3(0.070g, 0.82m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.1g, 0.49m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.330g, 82.48%)로서 제공하였다. LCMS:967.5(M+H)+.
(S)-6-아미노-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12, 12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클 [1.1.1]펜탄-1-일)헥산아마이드 (INX-W )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((S)-5-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-6-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트(INX-W-5)(0.10g, 0103m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.059g, 0.52m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질 INX-W를 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = ACN:MeOH:IPA(65:25:10); A:B, 62:38); (체류 시간 19.06분)로 정제시켜 R-이성질체를 백색 고체(0.008g, 8.93%)로서 제공하였다; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.47(s, 1H, 아세탈-H), 5.07(d, J=4.8Hz, 1H, C16H).
(S)-2-(2-브로모아세트아미도)-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a, 12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)프로판아마이드( INX-R )의 합성
반응식
메틸 (tert-부톡시카보닐)-L-알란일-L-알라니네이트( INX-R-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 30㎖ 유리 바이알에 (tert-부톡시카보닐)-L-알라닌 (5.0g, 26.45m㏖), DIPEA(1.36㎖, 79.36m㏖) 및 DMF(50㎖)를 충전하였다. 이 용액에, HATU(15.07g, 39.67m㏖)를 0℃에서 첨가하고, 그 다음 메틸 L-알라니네이트 하이드로클로라이드(3.69g, 26.45m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 차가운 빙수로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 헥산 및 DCM으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(5.5g, 56.20%)로서 제공하였다. LCMS 275.3(M+H)+.
(tert-부톡시카보닐)-L-알라닐-L-알라닌( INX-R2 )의 합성
절차:
100㎖ 유리 밀봉된 바이알에 (tert-부톡시카보닐)-L-알라닐-L-알라니네이트(INX-R-1)(4.5g, 16.42m㏖) 및 THF-물(9:1)(55㎖)을 충전하였다. 이 용액에, LiOH.H2O(20.69g, 49.26m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 60℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 헥산 및 DCM으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(4.0g, 93.70%)로서 제공하였다. LCMS: 261.20(M+H)+.
tert-부틸 ((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1] 펜탄-1-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)카바메이트( INX-R-3 )의 합성
절차:
질소 하에서 30㎖ 유리 바이알에 DMF(5㎖) 중 (tert-부톡시카보닐)-L-알라닐-L-알라닌 (INX-R-2)(0.33g, 1.26m㏖) 및 DIPEA(0.65㎖, 3.78m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, HATU(0.96g, 2.52m㏖)를 0℃에서 첨가하고, 그 다음 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a, 12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-3)(0.70g, 1.26m㏖)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 차가운 빙수로 반응정지시켰다. 고체를 진공 하에서 여과하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(메탄올/DCM: 6:94)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.35g, 34.42%)로서 제공하였다. LCMS: 802.6(M+H)+.
(S)-2-아미노-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1] 펜탄-1-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)프로판아마이드( INX-R-4 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노 [1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)카바메이트(INX-R-3)(0.35g, 0.44m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 에터 중 2M HCl(3㎖)을 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 n-펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.3g, 97.92%)로서 제공하였다. LCMS: 702.5 (M+H)+.
(S)-2-(2-브로모아세트아미도)-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a, 12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)프로판아마이드( INX-R )의 합성
절차:
질소 하에서 10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-아미노-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노 [1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일) 프로판아마이드 (INX-R-4)(0.30g, 0.43m㏖) 및 DCM:물(8:2)(3.6㎖)을 충전하였다. 이 용액에, Na2CO3(0.91g, 0.855m㏖)를 첨가하고, 그 다음 브로모아세틸 브로민(0.87g, 0.43m㏖)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조 표제 화합물 INX-R을 분취용-HPLC(칼럼: Xbridge Prep, C18, OBD 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% NH3, B = 아세토나이트릴; A:B, 65:35)(체류 시간 24.10분)로 정제시켜 R-이성질체를 백색 고체(0.030g, 8.53%)로서 제공하였다; LCMS: 822.5, 824.4(M&M+2); 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.46(s, 1H, 아세탈-H), 5.05(d, J=5.2 Hz, 1H, C16H).
(S)-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS, 8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일) 벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)석신아마이드( INX-X) 의 합성
반응식
메틸 tert-부틸 (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실-L-아스파라기네이트( INX-X-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 100㎖ 스크류 캡 유리 바이알에 (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리신(5.0g, 16.83m㏖), DIPEA(8.68㎖, 50.50m㏖) 및 DMF(50㎖)를 충전하였다. 이 용액에, HATU(7.67g, 20.19m㏖)를 0℃에서 첨가하고, 그 다음 tert-부틸 L-아스파라기네이트(3.79g, 20.19m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 차가운 빙수로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 헥산 및 DCM으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(7.5g, 95.41%)로서 제공하였다. LCMS 412.83(M-56).
(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실-L-아스파라긴( INX-X2 )의 합성
절차:
250㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 메틸 tert-부틸 (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실-L-아스파라기네이트 (INX-X-1)(2.0g, 4.28m㏖) 및 DCM(50㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(40㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 DCM으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(1.5g, 85.22%)로서 제공하였다. LCMS: 412.8(M+H)+.
(9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(((S)-4-아미노-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일) 벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-1,4-다이옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트( INX-X-3 )의 합성
절차:
질소 하에서 30㎖ 유리 바이알에 (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실-L-아스파라긴(INX-X-2)(0.4g, 0.973m㏖), DMF(5㎖), HATU(0.96g, 2.52m㏖) 및 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸) 페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-3)(0.70g, 1.26m㏖)을 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.50㎖, 2.91m㏖)를 첨가하고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 차가운 빙수로 반응정지시켰다. 고체를 진공 하에서 여과하였다. 조물질을 다이에틸 에터 및 n-펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.6g, 64.72%)로서 제공하였다. LCMS: 954.24(M+H)+.
(S)-2-(2-아미노아세트아미도)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS, 12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12, 12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클 [1.1.1]펜탄-1-일)석신아마이드( INX-X-4 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(((S)-4-아미노-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-1,4-다이옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트(INX-X-3)(0.30g, 0.314m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DEA(0.48㎖, 4.72m㏖)를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 헥산으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.20g, 96.06%)로서 제공하였다. LCMS: 731.0(M+H)+.
(S)-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS, 8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일) 벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)석신아마이드( INX-X )의 합성
절차:
질소 하에서 25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-아미노아세트아미도)-N1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)석신아마이드 (INX-X-4)(0.20g, 0.273m㏖) 및 THF-물(8:2)(3.6㎖)을 충전하였다. 이 반응 혼합물에, Na2CO3(0.58g, 0.55m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로민(0.066g, 0.33m㏖)을 첨가하고, 4시간 동안 rt에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질 표제 화합물 INX-X을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 증 0.05% NH3, B = 아세토나이트릴; A:B 62:38)(체류 시간 17.79분)로 정제시켜 R-이성질체를 백색 고체(0.030g, 8.53%)로서 제공하였다; LCMS: 852.7(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 5.46(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(d, J=5.2 Hz, 1H, C16H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a, 6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3] 다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-Y )의 합성
반응식
(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8, 8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-Y-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(트라이암시놀론)(1.0g, 2.53m㏖) 및 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-3-5)(0.76g, 2.53m㏖) 및 DCM(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(1.51g, 12.65m㏖)를 첨가하고, 5분 동안 실온에서 교반하였다. HClO4(1.2g, 12.65m㏖)를 반응 혼합물에 첨가하고 추가로 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물; 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.5g, 34.14%)로서 제공하였다. LCMS: 579.4(M+H)+
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-Y-2 )의 합성
절차:
실온에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.42g, 0.87m㏖), HATU(0.49g, 1.30m㏖), DMF(4㎖) 및 DIPEA(0.22g, 1.74m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 실온에서 (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-Y-1)(0.50g, 0.97m㏖)을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.65g, 71.42%)로서 제공하였다.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR, 12aS,12bS)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b, 7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-Y-3 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 THF(4㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8, 8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-Y-2)(0.65g, 0.62m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.40g, 64.24m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.42g, 84.82%)로서 제공하였다. LCMS: 821.4(M+H)+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-Y-4 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(10㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-Y-3)(0.42g, 0.51m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖)에 용해된 Na2CO3(0.11g, 1.02m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.10g, 0.51m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.20g, 41.45%)로서 제공하였다. LCMS: 942.0(M+H)+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a, 6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3] 다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-Y )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-Y-4)(0.20g, 0.20m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.11g, 1.01m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질 INX-Y를 분취용-HPLC(칼럼: Xbridge Prep, C18, 30×250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% 폼산, B =ACN:MeOH, 50:50; A:B, 47:53); (체류 시간 18.83분)로 정제시켜 R-이성질체(Fr-1)를 백색 고체(0.040g, 22.37%)로서 제공하였다. LCMS: 885.8(M+H)+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 주요 양성자 배정): δ: 5.48(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(d, J=4.8Hz, 1H, C16H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS, 10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-S )의 합성
반응식
(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-다이플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온( INX-S-1 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a,10,10-테트라메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(플루오시놀론 아세토나이드)(1.0g)를 충전하고, 50% 수성 HBF4(20㎖)를 첨가하고, 그 다음 추가로 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 고체를 여과하고, 물로 세척하고, 진공 하에서 건조시켜 INX-S-1(1.0g, 정량적)을 얻었다. LCMS: 413.3(M+H)+.
((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1] 펜탄-1-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-S-2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-다이플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(INX-S-1)(1.0g, 2.42m㏖) 및 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)바이사이클로[1.1.1] 펜탄-1-일)카바메이트(0.80g, 2.66m㏖) 및 DCM(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(1.42g, 12.14m㏖)를 첨가하고, 추가로 5분 동안 실온에서 교반하였다. HClO4(1.2g, 12.14m㏖)를 첨가하고, 추가로 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물, 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.61g, 42.28%)로서 제공하였다. LCMS: 596.4(M+H)+.
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-S-3 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.45g, 0.93m㏖), HATU(0.53g, 1.40m㏖), DMF(4㎖) 및 DIPEA(0.23g, 1.86m㏖)를 실온에서 충전하였다. 이 용액에, ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1] 펜탄-1-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-S-2)(0.61g, 1.02m㏖)을 실온에서 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.40g, 56.19%)로서 제공하였다. LCMS: 1061.5(M+H)+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3] 다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-S-4 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b, 7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일) 벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-S3)(0.41g, 0.39m㏖) 및 THF(4㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.28g, 3.91m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.26g, 82.24%)로서 제공하였다. LCMS: 838.5(M+H)+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR, 7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-S-5 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-S4)(0.22g, 0.26m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖) 중 Na2CO3(0.10g, 0.53m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.030g, 0.28m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색(0.1g, 39.72%)으로서 제공하였다. LCMS: 960.4(M+H)+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS, 10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-S )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모 아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a, 12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클[1.1.1] 펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-S-5)(0.10g, 0.10m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.059g, 0.52m㏖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 직접 진공 하에서 증발시켰다. 조물질 INX-S를 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% 폼산, B = 아세토나이트릴; A:B, 65:35); (체류 시간 17.7분)로 정제시켜 R-이성질체를 백색 고체(0.011g, 11.68%)로서 제공하였다. LCMS: 902.3, 904.3(M & M+2). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 주요 양성자 배정): δ: 5.45(s, 1H, 아세탈-H), 4.95(d, J=4.8Hz, 1H, C16H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-T )의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-T-1 )의 합성
절차:
10㎖ 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-P-5)(0.20g, 0.19m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.137g, 1.950m㏖) 및 (tBuO)2PNEt2(1.3g, 4.68m㏖)를 실온에서 첨가하고 79시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 과산화수소(1.3g, 4.68m㏖)를 용액에 첨가하였다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 80:20)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.070g, 29.47%)로서 제공하였다. 이것을 즉시 다음 단계에 사용하였다.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토 [2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-T-2 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 THF(1㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-T-1)(0.070g, 0.057m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.042g, 0.57m㏖)을 실온에서 첨가하고 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 조물질을 다이에틸 에터 및 헥산으로 배산처리하여 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.30g, 52.44%)로서 제공하였다. 이것을 즉시 다음 단계에 사용하였다.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S, 8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-T-3 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 DCM(1㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토 [2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-T-2)(0.030g, 0.030m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 물(0.1㎖) 중 Na2CO3(0.006g, 0.060m㏖) 용액 및 브로모아세틸 브로마이드(0.006g, 0.030m㏖)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 회백색 고체(0.040g, 조물질)로서 제공하였다
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-T )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(1㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a, 12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1] 펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-T-3)(0.001g, 0.0089m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.005g, 0.043m㏖) 및 촉매 트라이아이소프로필실란을 실온에서 첨가하고 20분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 제공하였다. (0.006g, 71%). LCMS: 946.2, 948.2(M& M+2).
INX-A 의 합성
반응식
INX-A-2의 합성
절차:
다이클로로메탄/아세토나이트릴(500㎖/100㎖) 중 화합물 INX-A-1(3.0g, 7.64m㏖, 1.0eq)의 용액에 환식 무수물(3.0g, 30.58m㏖, 4.0eq) 및 DMAP(1.8g, 15.29m㏖, 2.0eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 2시간 동안 교반하고 혼합물을 감압 하에서 농축시켰다 잔류물을 DCM/MeOH(10%에서 15%로) + 0.1% AcOH로 용리시키는 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피로 정제시켜 화합물 INX-A-2(3.2g, 85%)를 백색 고체로서 제공하였다. TLC: DCM/MeOH = 10:1. Rf (화합물 1) = 0.45. Rf (화합물 2) = 0.30. LC-MS: (M+H)+ = 394.40
INX-A 의 합성
절차:
NMP(4㎖) 중 INX-A-2(220㎎, 0.45m㏖) 및 INX-A-3(230㎎, 0.67m㏖)의 용액에 HATU(342㎎, 0.90m㏖) 및 DIPEA(232㎎, 1.8m㏖)첨가하였다. 혼합물을 rt에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 분취용-HPLC(ACN/H2O, 0.1% HCOOH)로 정제시켜 INX-A(122㎎, 39%)를 제공하였다. LCMS: [M+H]+ = 703; 1H NMR(CDCl3, 300MHz) (δ, ppm) 7.20 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 6.73 (s, 2 H), 6.52 (br, 1 H), 6.33 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 6.11 (s, 1 H), 4.91 (q, J = 17.3 Hz, 2 H), 4.35 (d = 9.3 Hz, 1 H), 3.76 - 3.42 (m, 10 H), 3.03 (m, 1 H), 2.79 (m, 2 H), 2.65 - 2.56 (m, 3 H), 2.42 - 2.06 (m, 7 H), 1.84 - 1.63 (m, 3 H), 1.22 (m, 1H), 1.02 (s, 3 H), 0.90 (d, J = 7.2 Hz, 3 H).19F NMR(CDCl3) (δ, ppm) -166.09 (q).
달리 언급되지 않는 한 하기에 기재된 모든 반응은 무수 질소 분위기 하에서 수행하였다. 모든 주요 화학물질은 제공된 그대로 사용하였다. 모든 다른 상업적으로 입수 가능한 물질, 예컨대, 용매, 시약 및 촉매를 추가로 정제시키지 않고 사용하였다. 반응은 사전 코팅된 Merck 실리카겔 60F254 알루미늄 시트(Merck, 옥일 소재)를 사용하여 박막 크로마토그래피(TLC)로 모니터링하였다. TLC 플레이트의 가시화는 UV 광, 닌하이드린 분무 및 아이오딘 증기를 사용하여 달성하였다. 1H NMR(400MHz)은 Bruker Advancer-III HD FT-NMR 분광광도계(Bruker, 미국 소재)에서 기록하였고 수동으로 해석하였다. 칼럼 크로마토그래피 분리는 적절한 이동상을 사용하여 고정상으로서 230 내지 400메시, 100 내지 200메시 및 60 내지 120메시 실리카겔 또는 C18 실리카를 사용하여 수행하였다.
하기는 최종 표적의 분석을 위해서 사용된 LCMS 방법이다:
LCMS 방법-1
칼럼 상세사항: X-BRIDGE BEH 2.1*50㎜ 2.5 ㎛
기계 상세사항: - PDA 및 Acquity SQ 검출기가 장치된 Water Acquity UPLC- H Class, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 5℃, 이동상 A: Milli Q 물(pH= 2.70) 중의 0.1% 폼산, 이동상 B: Milli Q 물 중 0.1% 폼산: 아세토나이트릴(10:90).
이동상 구배 상세사항: T = 0분(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 0.75분(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 2.7분까지 구배(2% A, 98% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 3분까지 구배(0% A, 100% B) 유량: 1㎖/분; T = 3.5분(0% A, 100% B) 유량: 1㎖/분; T= 3.51분까지 구배(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 4분에 전개 마지막(97% A, 3% B), 유량: 0.8㎖/분, 유량: 0.8㎖/분, 전개 시간: 4분, UV 검출 방법: PDA.
질량 매개변수:
프로브: ESI, 이온화 모드: 양성 및 음성, 콘 전압: 30 및 10V, 모세관 전압: 3.0KV, 추출기 전압: 1V, Rf 렌즈: 0.1V, 공급원 온도: 120℃, 탈용매화 온도: 400℃. 콘 기체 유량: 100L/시간, 탈용매화 기체 유량: 800L/시간.
LCMS 방법-2
칼럼 상세사항: X-BRIDGE BEH 2.1*50㎜ 2.5 ㎛
기계 상세사항: PDA가 장치되고 QDA 검출기가 구비된 Waters Acquity Ultra performance LC, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 5℃, 이동상 A: Milli Q 물(pH= 2.70) 중의 0.1% 폼산, 이동상 B: Milli Q 물 중 0.1% 폼산: 아세토나이트릴(10:90). 이동상 구배 상세사항: T = 0분(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 0.75분(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 2.7분까지 구배(2% A, 98% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 3분까지 구배(0% A, 100% B) 유량: 1㎖/분; T = 3.5분(0% A, 100% B) 유량: 1㎖/분; T= 3.51분까지 구배(97% A, 3% B) 유량: 0.8㎖/분; T = 4분에 전개 마지막(97% A, 3% B), 유량: 0.8㎖/분, 전개 시간: 4분, UV 검출 방법: PDA.
질량 매개변수: 프로브: ESI, 이온화 모드: 양성 및 음성, 콘 전압: 30V 및 10V, 모세관 전압: 0.8KV, 추출기 전압: 1V, Rf 렌즈: 0.1V, 공급원 온도: 120℃, 프로브 온도: 600℃, 콘 기체 유량: 디폴트, 탈용매화 기체 유량: 디폴트.
LCMS 방법-3
칼럼 상세사항: Xtimate C18 4.6*50㎜ 5 ㎛
기계 상세사항: - PDA가 접속되고 SQ 검출기가 장치된 Waters Acquity Ultra performance LC, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 5℃, 이동상 A: Milli Q 물 중 5mM 중탄산암모늄(pH = 7.35), 이동상 B: 아세토나이트릴. 이동상 구배 상세사항: T = 0분(97% A, 3% B) 유량 = 1.0㎖/분, T = 0.20분(97% A, 3% B) 유량 = 1.0㎖/분; T = 2.70분(20% A, 80% B)까지 구배 유량 = 1.0㎖/분; T = 3.0분(0% A, 100% B)까지 구배 유량 = 1.2㎖/분; T = 3.50분(0% A, 100% B) 유량 = 1.2㎖/분; T = 3.51분(97% A,3% B) 유량 = 1.0㎖/분; T = 4.0분(97% A, 3% B)에 구배 마지막 유량 = 1.0㎖/분, 전개 시간: 4분, UV 검출 방법: PDA.
질량 매개변수: 프로브: ESI, 이온화 모드: 양성 및 음성, 콘 전압: 30V 및 10V, 모세관 전압: 3.0KV, 추출기 전압: 2V, Rf 렌즈: 0.1V, 공급원 온도: 120℃, 프로브 온도: 400℃, 콘 기체 유량: 100L/Hr, 탈용매화 기체 유량: 800L/Hr.
LCMS 방법-4
칼럼 상세사항: Xtimate C18 4.6*150㎜ 5 ㎛
기계 상세사항: Waters Micro mass ZQ 검출기가 장치된 Waters 996 포토다이오드 어레이 검출기, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: Milli Q 물 중 5mM 아세트산암모늄 및 0.1% 폼산(pH =3.50), 이동상 B: 메탄올
이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B); T = 7.0분(10% A, 90% B); T = 9.0분까지 구배(0% A, 100% B); T까지 구배 = 14.00분(0% A, 100% B); T = 14.01분(90% A, 10% B); T = 17분에 구배 마지막(90% A, 10% B), 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분, UV 검출 방법: PDA.
질량 매개변수:
프로브: ESI, 이온화 모드: 양성 및 음성, 콘 전압: 30V 및 10V, 모세관 전압: 3.0KV, 추출기 전압: 2V, Rf 렌즈: 0.1V, 공급원 온도: 120℃, 프로브 온도: 400℃, 콘 기체 유량: 100L/Hr, 탈용매화 기체 유량: 800L/Hr.
LCMS 방법-5
칼럼 상세사항: Sunfire C18 150×4.6㎜, 3.5 ㎛
기계 상세사항: Agilent 1260 Infinity-II 및 G6125C(LC/MSD) 질량 검출기, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: Milli Q 물 중 5mM 아세트산암모늄 및 0.1% 폼산(pH =3.50), 이동상 B: 메탄올
이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B); T = 7.0분(10% A, 90% B); T = 9.0분까지 구배(0% A, 100% B); T까지 구배 = 14.00분(0% A, 100% B); T = 14.01분(90% A, 10% B); T = 17분에 구배 마지막(90% A, 10% B), 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분, UV 검출 방법: PDA.
질량 매개변수:
프로브: MMI, 이온화 모드: (ESI) 양성 및 음성, 단편 전압: 30V 및 70V, 모세관 전압: 3000 V, 공급원 기체 온도: 325℃, 증발기 온도: 225℃, 기체 유량: 12 L/분, 네블라이저: 50.
HPLC 방법-1
칼럼 상세사항: Sunfire C18 (150㎜×4.6㎜), 3.5㎛
기계 상세사항: Agilent Technologies. PDA 검출기가 구비된 1260 Series, Infinity-II, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: Milli Q 물(pH= 2.2) 중 0.05% 트라이플루오로아세트산, 이동상 B: 아세토나이트릴.
이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 7.0분(10% A, 90% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 9.0분(0% A, 100% B)까지 구배 유량: 1.0㎖/분; T = 14분(0% A, 100% B)까지 구배 유량: 1.0㎖/분; T = 14.01분(90% A, 10% B) 유량: 1㎖/분; T= 17분에 전개 마지막(90% A, 10% B) 유량: 1.0㎖/분, 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분, UV 검출 방법: PDA.
HPLC 방법-2
칼럼 상세사항: Atlantis C18(150㎜×4.6㎜), 5.0㎛ 또는 Welch C18(150㎜×4.6㎜), 5.0㎛
기계 상세사항: - 2998 PDA 검출기가 구비된 Waters Alliance e2695, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: Milli Q 물(pH= 10.5) 중 0.1% 암모니아, 이동상 B: 아세토나이트릴. 이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 7.0분(10% A, 90% B) 유량: 1.0㎖/분; T = 9.0분(0% A, 100% B)까지 구배 유량: 1.0㎖/분; T = 14분(0% A, 100% B)까지 구배 유량: 1.0㎖/분; T = 14.01분(90% A, 10% B) 유량: 1㎖/분; T= 17분에 전개 마지막(90% A, 10% B) 유량: 1.0㎖/분, 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분, UV 검출 방법: PDA.
HPLC 상세사항: 2998 PDA 검출기가 구비된 Waters Alliance e2695; 칼럼 상세사항: Atlantis C18 (150㎜×4.6㎜), 5.0㎛ 또는 Welch C18(150㎜×4.6㎜), 5.0㎛; 이동상 A: Milli Q 물(pH= 10.5) 중 0.1% 암모니아, 이동상 B: 아세토나이트릴; 유량: 1.0㎖/분, 전개 시간: 17분
HPLC 방법-3
칼럼 상세사항: Agilent 1260 Infinity-II 및 G6125C (LC/MSD) 질량 검출기, 칼럼 온도: 35℃, 오토 샘플러 온도: 15℃, 이동상 A: 5mM 아세트산암모늄 + 물 중 0.1% 폼산(pH = 3.5) 이동상 B: MeOH. 이동상 구배 상세사항: T = 0분(90% A, 10% B); T = 7.0분(10% A, 90% B); T = 9분(0% A, 100% B)까지 구배 T = 14분(0% A, 100% B)까지 구배; T = 14.1분(90% A, 10% B)까지 구배; T = 17.0분(90% A, 10% B). 유량: 1㎖/분, 구배시간:17분. UV 검출 방법: PDA. 질량 매개변수: 프로브: MMI, 이온화 모드: (ESI) 양성 및 음성, 단편 전압:70 V 및 30V, 모세관 전압:3000 V, 공급원 기체 온도 325℃, 증발기 온도: 225℃, 기체 유량: 12 L/분, 네블라이저: 50.
tert-부틸 (6-(4-폼일페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-43-1) 의 합성
tert-부틸 (6-(4-폼일페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-43-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 10㎖ 유리 바이알에 THF(0.7㎖) 중 tert-부틸 (6-하이드록시스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(0.050g, 0.21m㏖) 및 4-하이드록시벤즈알데하이드(0.053g, 0.43m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 트라이페닐포스핀(0.086g, 0.32m㏖) 및 DIAD(0.066g, 0.32m㏖)를 첨가하고, 65℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 80:20)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.025g, 35.9%)로서 제공하였다. LCMS: 332.2 [M+H]+, 1H NMR (400 MHz, DMOS-d6) δ: 9.84 (s, 1H), 7.82 (d, J=8.8Hz, 2H), 7.10 (br s, 1H), 7.01 (d, J=8.8 Hz, 2H), 4.72 (quint, 1H), 3.90-3.80 (m, 1H), 2.60-2.40 (m, 4H), 2.25-1.90 (m, 4H), 1.35 (s, 9H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)옥시)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12, 12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-43 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (6-(4-폼일페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-43-1)(0.1g, 0.30m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.113g, 0.30m㏖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.181g, 1.50m㏖), 그 다음 HClO4(0.459g, 4.53m㏖)를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18(250 X 20)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = 아세토나이트릴 + 10% MTBE; A:B = 80:20), 체류 시간 17.19분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.017g, 8.91%)로서 제공하였다. LCMS: 590.4 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.46(d, J=10.0Hz,1H), 7.34(d, J=8.4Hz, 2H), 6.81(d, J=8.4Hz, 2H), 6.26(d, J=10.0Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.41 (s, 아세탈-H, 1H), 5.04 (d, J=4.8 Hz, C16H, 1H), 4.70-4.25(m, 4H), 3.67-3.63(m, 1H), 2.70-1.60(m, 17H), 1.51(s, 3H), 1.20-1.03(m, 2H), 0.99(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A4) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A4-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.8g, 1.65m㏖), DIPEA(0.85㎖, 4.9m㏖) 및 DMF(8㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 0℃에서 HATU(1.26g, 3.31m㏖) 및 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)옥시)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-43)(1.07g, 1.82m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 차가운 빙수에 붓고, 침전된 고체를 진공 하에서 여과하였다. 조 고체를 다이에틸 에터/n-펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(1.3g, 74.38%)로서 제공하였다. LCMS: 1054.40 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11a R,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b, 7,8,8a,8b, 11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A4-2 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A4-1)(1.3g, 1.23m㏖) 및 THF(15㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DEA(2.5㎖, 23.97m㏖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 DCM으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.9g, 88.23%)로서 제공하였다. LCMS: 832.39[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A4-3 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A4-2)(0.8g, 0.961m㏖) 및 DCM-물(8:2, 12㎖)을 충전하였다. 이 용액에, Na2CO3(0.30g, 2.88m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로민(0.23g, 1.15m㏖)을 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 크로마토그래피(MeOH/DCM, 5: 95)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.4g, 43.65%)로서 제공하였다. LCMS: 954.61[M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A4 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A4-3)(0.40g, 0.420m㏖) 및 DCM(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(4㎖)를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 헥산으로 배산처리하였다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: Xbridge Prep, C18, OBD 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 72:28), (체류 시간 16.39분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.006g, 1.59%)로서 제공하였다; LCMS: 896.2 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.48(d, J=10.0Hz,1H), 7.36(d, J=8.4Hz, 2H), 6.83(d, J=8.4Hz, 2H), 6.29(d, J=10.0Hz, 1H), 6.06(s, 1H), 5.43(s, 아세탈-H, 1H), 5.00-3.50(m, 11H), 2.90-1.60(m, 21H), 1.53(s, 3H), 1.20-1.03(m, 2H), 0.91(s, 3H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)옥시)-2-플루오로페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-44) 의 합성
tert-부틸 (6-(3-플루오로-4-폼일페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-44-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (6-하이드록시스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(0.50g, 2.19m㏖), 2-플루오로-4-하이드록시벤즈알데하이드(0.61g, 4.35m㏖), 트라이페닐포스핀(0.86g, 3.29m㏖) 및 THF(7㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIAD(0.66g, 3.29m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 65℃에서 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 순상 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 20:80)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.40g, 51.97%)로서 제공하였다. LCMS: 350.1[M+H]+
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)옥시)-2-플루오로페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-44 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(5㎖) 중 tert-부틸 (6-(3-플루오로-4-폼일페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-44-1)(0.20g, 0.57m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S,13S,14S, 16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(0.215g, 0.57m㏖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.34g, 2.86m㏖) 및 HClO4(0.57g, 5.72m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 그 다음 조물질을 차가운 물로 배산처리하고 침전된 고체를 여과하고 진공 하에서 건조시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(물:아세토나이트릴, 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.020g, 5.75%)로서 제공하였다. LCMS: 608.4 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 7.46-7.42(m, 2H), 6.67-6.55(m, 2H), 6.25(d, J=10Hz, 1H), 6.27(s, 1H), 5.64(s, 아세탈-H, 1H), 5.04-5.03 (d, J=4.8Hz, C16H, 1H), 4.63-4.29(m, 4H), 3.64-3.60(m, 1H), 2.70-1.73(m, 17H), 1.50(s, 3H), 1.30-1.12(m, 2H), 0.92(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A5) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A5-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(1.0g, 2.07m㏖) 및 DMF(10㎖)를 충전하고 0℃에서 냉각시켰다. 이 용액에, HATU(1.57g, 4.14m㏖), (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)옥시)-2-플루오로페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-44)(1.25g, 2.07m㏖), 그 다음 DIPEA(1.0㎖, 6.22m㏖)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 차가운 빙수에 부었다. 생성된 고체를 진공 하에서 여과하였다. 고체를 다이에틸 에터 및 n-펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(1.3g, 59.09%)로서 제공하였다. LCMS: 1072.8[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A5-2 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A5-1)(1.3g, 1.21m㏖) 및 THF(10㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DEA(1.8㎖, 17.26m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 DCM으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.9g, 87.37%)로서 제공하였다. LCMS: 850.5[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A5-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A5-2)(0.9g, 1.05m㏖) 및 DCM-물(8:2, 12㎖)을 충전하였다. 이 용액에, Na2CO3(0.33g, 3.17m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로민(0.25g, 1.27m㏖)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 크로마토그래피(MeOH/DCM, 5: 95)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.5g, 49.01%)로서 제공하였다. LCMS: C48H62 79BrFN3O12에 대한 계산치 (970.35), 실측치 970.40[M+H]+;
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A5 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A5-3)(0.2g, 0.0.205m㏖) 및 DCM(7㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(3㎖)를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 헥산으로 배산처리하였다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 45:55, 체류 시간 12부)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.006g, 3.18%)로서 제공하였다;
LCMS: C44H54 79BrFN3O12에 대한 계산치(914.29), 실측치 914.5[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.47-7.42(m, 2H), 6.68(dd, J=8.4 & 2Hz, 1H), 6.59(dd, J=12.4 & 2.4Hz, 1H), 6.27(J=10.0 & 2.0Hz,1H), 6.04(s, 1H), 5.65(s, 1H, 아세탈-H), 5.03(d, J=5.2 Hz, 1H, C16H), 4.64-4.55(m,2H), 4.44-4.43(m, 1H), 4.34-4.30(m, 2H), 4.22-4.16(m, 1H), 3.95(d, 2H), 3.92-3.90(m, 2H), 2.80-1.80(m, 21H), 1.51(s, 3H), 1.25-1.15(m, 2H), 1.00(s, 3H).
(INX-J2)의 합성
tert-부틸 (3-(4- 폼일벤질) 페닐) 카바메이트( INX-J2-A1 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 4-(브로모메틸)벤즈알데하이드(0.5g, 2.5m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, tert-부틸 (3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)페닐)카바메이트(1.2g, 3.7m㏖) 및 탄산칼륨(0.8g, 6.2m㏖)을 첨가하고, 15분 동안 N2로 퍼징하였다. PdCl2.dppf-DCM(0.3g, 0.15m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고, 16시간 동안 80℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산, 5:95)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.32g, 40.95%)로서 제공하였다. LCMS: 312.4[M+H]+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-J2-R ); 및
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-J2-S )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (tert-부틸 (3-(4- 폼일벤질)페닐) 카바메이트(INX-J2-A1)(0.30g, 0.96m㏖)를 충전하고, (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16 알파-하이드록시프레드니솔)(0.36g, 0.96m㏖)을 DCM(10㎖)에 용해시켰다. 이 용액에, MgSO4(0.57g, 4.8m㏖)를 첨가하고, 5분 동안 실온에서 교반하였다. HClO4(0.48g, 4.82m㏖)를 반응 혼합물에 첨가하고, 실온에서 추가로 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용 HPLC(칼럼: VIRDIS 분취용 실리카,2EP-OBD,250×19㎜ S-5㎛, 이동상: A= 헵탄 중 0.1% 암모니아, B = IPA:MTBE(70:30); A:B, 80:20)로 정제시켜 이성질체-1 및 이성질체-2를 제공하였다. 이들 이성질체는 체류 시간 25.49분(INX-J2-S) 및 31.53 분(INX-J2-R)에 용리되었다.
INX-J2-R (이성질체-2, R-이성질체): (수율: 0.10g, 18.2%). LCMS: 570.4 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.45(d, J=10Hz, 1H), 7.35(d, J=8.0Hz, 2H), 7,20(d, J=7.6Hz, 2H), 7.00(t, 1H), 6.56-6.52(m, 3H), 6.27(d, J=10Hz, H), 6.03(s, 1H), 5.44(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(d, J=5.2Hz, 1H, C16H), 4.63(d, J=19.2Hz, 1H), 4.43(brs, 1H), 4.33(d, J=19.2Hz, 1H),3.85(s, 2H), 2.70-1.600(m, 9H), 1.51(s, 3H), 1.20-1.00(m, 2H), 0.93(s, 3H).
INX-J2-S (이성질체-1, S-이성질체): (수율: 0.010g, 1.82%). LCMS 570.4[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.49(d, J=10Hz, 1H), 7.23-7.17(m, 4H), 7.01(t, 1H), 6.57-6.52(m, 3H), 6.27(d, J=10Hz, 1H), 6.12(s, 아세탈-H, 1H), 6.04(s, 1H), 5.40(d, J=6.4Hz, C16H, 1H), 4.43(br s, 1H), 4.33(d, J=19.2Hz, 1H), 4.12(d, J=19.2Hz, 1H), 3.85(s, 2H), 2.70-1.60(m, 9H), 1.52(s, 3H), 1.20-1.00(m, 2H), 0.93(s, 3H).
S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-J) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-J-3 )의 합성
절차:
실온에서 N2 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.8g, 1.65m㏖), HATU(0.94, 2.47m㏖), DIPEA(0.42g, 3.30m㏖) 및 DMF(8㎖)를 충전하였다. 이 용액에, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-J-2-R)(0.93g, 1.65m㏖)을 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.4g, 23.31%)로서 제공하였다. LCMS: 1034.8 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-J-4 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-J3)(0.4g, 0.38m㏖) 및 THF(4㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸아민(0.27g, 3.8m㏖) 실온에서 첨가하고 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.3g, 조물질)로서 제공하였다. LCMS: 812.5[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-J-5 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-J-4)(0.3g, 0.36m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.5㎖)에 용해된 Na2CO3(0.075g, 0.72m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.088g, 0.43m㏖)를 실온에서 첨가하고 추가로 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 정제시키고 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.27g, 78.29%)로서 제공하였다. LCMS: 932.5[M+H]+
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-J )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-J5)(0.27g, 0.28m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.15g, 1.40m㏖)을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: C18 (250*21.2)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 48:52), (체류 시간 12.5 분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.020g, 10.62%)로서 제공하였다. LCMS: C44H51 79BrN3O11에 대한 계산치(876.27), 실측치 876.40[M+H]+;
1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.47-7.36(m, 5H), 7.23-7.20(m, 3H), 6.96(d, 1H), 6.27(d, J=10Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.45(s, 아세탈-H, 1H), 5.06(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.70-4.20(m, 4H), 4.10-4.00(m, 6H), 2.70-1.60(m, 13H), 1.50(s, 3H), 1.10-1.02(m, 2H), 1.00(, 3H).
(S)-4-(2-(2-(((R)-2-아미노-2-카복시에틸)티오)아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-J-CYS )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산(INX-J)(0.2g, 0.22m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, L-시스테인(0.041g, 0.34m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. LCMS로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 동결건조시키고, 조물질을 분취용 HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250×20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A: B = 78:22), (체류 시간 20분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.010g, 4.78%)로서 제공하였다. LCMS: C47H57 79BrN4O13S에 대한 계산치(917.36), 실측치 917.4[M+H]+;
1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.47-7.36(m, 5H), 7.24-7.20(m, 3H), 6.96(d, 1H), 6.27(d, J=10Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.45(s, 아세탈-H, 1H), 5.06(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.70-4.20(m, 4H), 4.10-3.90(m, 5H), 3.50-3.00(m,4H), 2.70-1.60(m, 13H), 1.50(s, 3H), 1.10-1.02(m, 2H), 1.00(, 3H).
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-25) 의 합성
(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-다이플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온( INX-SM-25-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 플루오시놀론 아세토나이드(1g, 2.23m㏖) 및 플루오로붕산(10㎖)을 충전하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 생성된 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(0.8g, 87.77%)로서 제공하였다. LCMS: 413.2[M+H]+.
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-25 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (6-(4-폼일벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-32-4)(0.10g, 0.33m㏖), (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-다이플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(INX-SM-25-1)(0.1g, 0.24m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.18g, 1.59m㏖) 및 HClO4(0.15g, 1.59m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 70:30), (체류 시간 9.98분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.024g, 13.40%)로서 제공하였다. LCMS: 624.4[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD,): δ: 8.55(br s, 1H), 7.36-7.33(m, 3H), 7.16(d, J=8.0Hz, 2H), 6.36-6.33(m, 2H), 5.66-5.51(m, J=45.6Hz, CHF, 1H) 5.48(s, 아세탈-H, 1H), 5.07(d, J=3.2Hz, C16H, 1H), 5.07-5.06(m, 1H), 4.63(d, J=19.2Hz, 1H), 4.36-4.31(m, 2H), 3.58-3.54(m, 1H), 2.75-1.60(m, 18H), 1.60(s, 3H), 1.00(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A23 )의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A23-1 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.38g, 0.78m㏖), HATU(0.608g, 1.6m㏖) 및 DMF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.25g, 2.0m㏖), 그 다음 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-25)(0.5g, 0.80m㏖)을 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.3g, 34.39%)로서 제공하였다. LCMS 1088.6[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A23-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A23-1)(0.12g, 0.11m㏖) 및 THF(2㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.08g, 1.10m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.08g, 83.78%)로서 제공하였다. LCMS: 866.6 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A23-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A23-2)(0.08g, 0.09m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, Na2CO3(0.039g, 0.36m㏖)를 물(1㎖)에 용해시키고, 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.037g, 0.18m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색(0.080g, 40%)으로서 제공하였다. LCMS: 986.6 [M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A23 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A23-3)(0.080g, 0.08m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.048g, 0.45m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B = 58:42), 체류 시간 14.62분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.008g, 10.60%)로서 제공하였다. LCMS: C45H54 79BrF2N3O11Na에 대한 계산치 (953.80), 실측치 953.5[M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD, 주요 양성자 배정): δ: 7.36-7.34(m, 3H), 7.17(d, J=8.0Hz, 2H), 6.38-6.35(m, 2H), 5.66-5.49(m, CHF, 1H), 5.48(s, 1H, 아세탈-H), 5.07(d, J=4.4 Hz, 1H, C16H), 4.64(d, 1H), 4.37-4.32(m, 2H), 4.15-4.10(m, 1H), 3.94-3.90(m, 4H), 2.68(d, 2H), 2.50-1.65(m,22H), 1.60(s, 3H), 0.90(s, 3H).
(S)-6-아미노-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N-(6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)헥산아마이드 (INX-A6) 의 합성
tert-부틸 ((S)-5-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트( INX A6-1 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 N2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실)-N6-(tert-부톡시카보닐)-L-라이신 (INX-W-2)(0.25g, 0.48m㏖), HATU(0.27g, 0.72m㏖) 및 DMF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.12g, 0.96m㏖) 및 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-25)(0.3g, 0.48m㏖)를 반응 혼합물에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.28g, 51.46%)로서 제공하였다. LCMS:1131.7[M+H]+.
tert-부틸 ((S)-5-(2-아미노아세트아미도)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트( INX A6-2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((S)-5-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트(INX A6-1)(0.25g, 0.22m㏖) 및 THF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸아민(0.16g, 2.0m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.19g, 94.21%)로서 제공하였다. LCMS: 909.5[M+H]+.
tert-부틸 ((S)-5-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트( INX A6-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((S)-5-(2-아미노아세트아미도)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트(INX A6-2)(0.19g, 0.21m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖)에 용해된 Na2CO3(0.093g, 0.83m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.088g, 0.41m㏖)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.090g, 41.81%)로서 제공하였다. LCMS: 1029.7[M+H]+.
(S)-6-아미노-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N-(6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)헥산아마이드 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX A6 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(4㎖) 중 tert-부틸 ((S)-5-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-6-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a, 12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-6-옥소헥실)카바메이트(INX A6-3)(0.070g, 0.067m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.038g, 0.33m㏖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 50:50), (체류 시간 16분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.005g, 7.05%)로서 제공하였다. LCMS: 929.59[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.36-7.34(m, 3H), 7.16(d, J=8.0Hz, 2H), 6.38-6.34(m, 2H), 5.67-5.49(m, CHF, J=48.8Hz, 1H) 5.49(s, 아세탈-H, 1H), 5.08(d, J=3.6Hz, C16H, 1H), 4.65(d, J=19.6Hz, 1H), 4.37-4.32(m, 3H), 4.20-4.10(m, 2H), 3.97(s, 2H), 3.94(d, 2H), 3.00-2.90(m, 2H), 2.80-2.60(m, 2H), 2.50-1.55(m, 20H), 1.60(s, 3H), 1.55-1.40(m, 2H), 1.00(s, 3H).
(S)-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)석신아마이드 (INX-A11) 의 합성
(9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(((S)-4-아미노-1-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-1,4-다이옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트( INX-A11-1 )의 합성
INX-A11-1
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-32)(0.50g, 0.85m㏖), (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)글리실-L-아스파라긴(INX-X-2)(0.52g, 1.27m㏖) 및 DMF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, HATU(0.64g, 1.70m㏖) 및 DIPEA(0.32g, 2.55m㏖) 실온에서 첨가하고 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.32g, 38.34%)로서 제공하였다. LCMS:981.5[M+H]+.
(S)-2-(2-아미노아세트아미도)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)석신아마이드( INX-A11-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(((S)-4-아미노-1-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-1,4-다이옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트(INX-A11-1)(0.32g, 0.32m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.23g, 3.23m㏖)을 실온에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.20g, 82.35%)로서 제공하였다. LCMS: 759.5[M+H]+.
(S)-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)석신아마이드( INX-A11 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-아미노아세트아미도)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)석신아마이드(INX-A11-2)(0.1g, 0.13m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.5㎖)에 용해된 Na2CO3(0.055g, 0.52m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.053g, 0.26m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조 표제 화합물을 분취용 HPLC(칼럼: YMC C18 120gm, 50㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B, 55:45), (체류 시간 15.51분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.035g, 30.5%)로서 제공하였다. LCMS: C44H56 79BrFN4O10에 대한 계산치 (879.32), 실측치 879.4[M+H]+;
2,2,2-트라이플루오로아세트산을 갖는 S-(2-((2-(((S)-4-아미노-1-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-1,4-다이옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)-L-시스테인 화합물( INX-A11-CYS )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N1-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)석신아마이드(INX-A11)(0.1g, 0.11m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, L-시스테인(0.026g, 0.22m㏖)을 첨가하고, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. LCMS로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 동결건조시키고 조물질을 분취용 HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴:MTBE, 90:10, A:B = 60:40), (체류 시간 16분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.0096g, 9.61%)로서 제공하였다. LCMS: 920.5[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): 8.54(t, 1H), 8.34(d, 1H), 7.88(br d, 3H), 7.43(br s, 1H), 7.35-7.31(m, 3H), 7.15(d, J=8.0Hz, 2H), 6.87(br s, 1H), 6.17(d, J=10Hz 1H), 5.94(s, 1H), 5.39(s, 아세탈-H, 1H), 5.10(br s, 1H), 4.93(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.80(br s, 1H), 4.53-4.43(m, 2H), 4.30-4.16(m, 2H), 4.01-3.98(m, 1H), 3.71(d, 2H), 2.90-3.00(m, 2H), 2.70-1.60(m, 25H), 1.40(s, 3H), 1.02-0.95(m, 2H), 0.87(s, 3H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노스피로[3.3]헵탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-45) 의 합성
tert-부틸 (E)-(3-((2-토실하이드라조노)메틸)스피로[3.3]헵탄-1-일)카바메이트( INX-SM-45-1) 의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-폼일스피로[3.3]헵탄-1-일)카바메이트(1.0g, 4.18m㏖) 및 EtOH(25㎖)를 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드(0.934g, 6.276m㏖), 촉매량의 AcOH(0.2㎖)를 첨가하고 0.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 고체가 형성되었고, 그것을 여과하였다. 화합물을 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.81g, 46.94%)로서 제공하였다. LCMS: 407.53[M+H]+
tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)카바메이트 (INX-SM-45-2 )의 합성
절차:
35㎖ 바이알에 tert-부틸 (E)-(3-((2-토실하이드라조노)메틸)스피로[3.3]헵탄-1-일)카바메이트(INX-SM-45-1)(0.5g, 1.22m㏖) 및 다이옥산(20㎖)을 질소 하에서 충전하였다. 이 용액에, (4-폼일페닐)보론산(0.551g, 3.68m㏖) 및 K2CO3(0.508g, 3.68m㏖)를 실온에서 첨가하고 추가로 2시간 동안 100℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 끈적이는 고체(0.180g, 44.7%)로서 제공하였다. LCMS: 330[M+H]+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노스피로[3.3]헵탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-45 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)카바메이트(INX-SM-45-2)(0.400g, 1.244m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.457g, 1.244m㏖)을 충전하였다. 그것을 DCM(8㎖)에 용해시키고, MgSO4(0.730g, 6.07m㏖)를 용액에 첨가하였다. 이 용액에, HClO4(0.405g, 6.07m㏖)를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공에서 농축시켰다. 그 다음 조물질을 차가운 물로 배산처리하고 침전물을 여과하고 진공 하에서 건조시켜 조물질을 제공하였다. 조물질 일부(0.10g)를 분취용-HPLC(칼럼: C18 (250*21.2) MM, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 53:46, 체류 시간 12분)로 정제시켜 표제 화합물(0.013g, 7%)을 제공하였다. LCMS: 588.4[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.40(d, J=8.0Hz, 2H), 7.28(d, J=8.0Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0 & 1.6Hz 1H), 6.04(s, 1H), 5.49(s, 아세탈-H, 1H), 5.08(d, J=4.8Hz, C16H, 1H), 4.61(d, J=19.2Hz, 1H), 4.44-4.43(m, 1H), 4.34(d, J=19.2Hz, 1H), 3.05-2.95(m, 1H), 2.80-1.60(m, 20H), 1.52(s, 3H), 1.20-1.00(m, 2H), 1.01(s, 3H).
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A8) 의 합성
tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A8-1 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.410g, 0.850m㏖)을 충전하고, DMF(5㎖) 중 HATU(0.485g, 1.27m㏖) 및 DIPEA(0.329g, 2.55m㏖)를 실온에서 첨가하였다. 이 용액에, tert(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노스피로[3.3]헵탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-45)(0.5g, 0.850m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 순상 칼럼 크로마토그래피(DCM:MeOH, 90:10)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.3g, 33.51%)로서 제공하였다. LCMS:1052.9[M+H]+
tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A8-2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 THF(5㎖) 중 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로 [3.3]헵탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A8-1)(0.3g, 0.285m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸아민(0.208g, 2.85m㏖)을 실온에서 첨가하고 2.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 직접 농축시켜 조물질을 제공하였고, DCM 및 헥산으로 배산처리하여 정제시키고 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.175g, 74%)로서 제공하였다. LCMS:831 [M+H]+.
tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A8-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(5㎖) 중 tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A8-2)(0.175g, 0.210m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 실온에서 물(1㎖)에 용해된 Na2CO3(0.044g, 0.421m㏖)를 첨가하고 그 다음 그것에 브로모아세틸 브로마이드(0.042g, 0.210m㏖)를 실온에서 첨가하고 1.5시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, MDC로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물:50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.055g, 27.43%)로서 제공하였다. LCMS: C49H65 79BrFN3O11에 대한 계산치 (950.38), 실측치 950.6[M+H]+.
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A8 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A8-3)(0.250g, 0.262m㏖) 및 DCM(15㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(2.5㎖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: C18, 250*21.2㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% 트라이플루오로아세트산, B = 아세토나이트릴, A:B = 65:25, 체류 시간 4분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.014g, 5.95%)로서 제공하였다. LCMS: 894.4[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.37(d, J=8.4Hz, 2H), 7.25(d, J=8.0Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0 & 1.6Hz 1H), 6.04(s, 1H), 5.46(s, 아세탈-H, 1H), 5.07(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.63(d, J=19.6Hz, 1H), 4.45-4.43(m, 2H), 4.34(d, J=19.6Hz, 1H), 4.10-3.90(m, 5H), 2.90-1.60(m, 24H), 1.52(s, 3H), 1.25-1.05(m, 2H), 1.00(s, 3H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[2.5]옥탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-46) 의 합성
에틸 2-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)사이클로헥실리덴)아세테이트( INX-SM-46-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 NaH(1.2g, 30.5m㏖) 및 THF(50㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 에틸 2-(다이에톡시포스포릴) 아세테이트(6.83g, 30.5m㏖)를 0 oC에서 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. THF(5㎖) 중 tert-부틸 (4-옥소사이클로헥실) 카바메이트(5.0g, 23.47m㏖)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 용액(100㎖)으로 반응정지시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(6.5g, 97.78%). LCMS: 284.1 [M+H]+.
에틸 6-((tert-부톡시카보닐)아미노)스피로[2.5]옥탄-1-카복실레이트( INX-SM-46-2 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 60% NaH(0.7g, 17.6m㏖) 및 DMSO(40㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 트라이메틸 설폭소늄 아이오다이드(3.8g, 17.6m㏖)를 0 oC에서 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. DMSO(5㎖) 중 에틸 2-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)사이클로헥실리덴)아세테이트(INX-SM-46-1)(2.0g, 7.06m㏖)의 용액을 이 용액에 첨가하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 용액(100㎖)으로 반응정지시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산, 20:80)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.75g, 35.73%)로서 제공하였다. LCMS 298.2 [M+H]+.
tert-부틸 (1-(하이드록시메틸)스피로[2.5]옥탄-6-일)카바메이트( INX-SM-46-3 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 에틸 6-((tert-부톡시카보닐)아미노)스피로[2.5]옥탄-1-카복실레이트(INX-SM-46-2)(0.1g, 0.33m㏖) 및 THF(5㎖)를 질소 하에서 충전하였다. 이 용액에, LiBH4(3.3㎖, 67.3m㏖)를 0℃에서 첨가하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 묽은 HCl(30㎖)로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 무색 액체(0.05g, 58.22%)로서 제공하였다. LCMS: 256.2 [M+H]+.
tert-부틸 (1-폼일스피로[2.5]옥탄-6-일)카바메이트( INX-SM-46-4 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (1-(하이드록시메틸)스피로[2.5]옥탄-6-일)카바메이트(INX-SM-46-3)(0.2g, 0.78m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DMP(0.498g, 1.17m㏖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 액체(0.2g, 조물질)로서 제공하였고, 이것을 추가로 정제시키지 않고 다음 단계에 그대로 사용하였다.
tert-부틸 (E)-(1-((2-토실하이드라조노)메틸)스피로[2.5]옥탄-6-일)카바메이트( INX-SM-46-5 )의 합성
INX-SM-46-5
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (1-폼일스피로[2.5]옥탄-6-일)카바메이트(INX-SM-46-4)(0.85g, 3.35m㏖) 및 에탄올(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설포닐 하이드라자이드(0.74g, 4.03m㏖) 및 아세트산(0.05g, 0.88m㏖)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(1.0g, 70.70%)로서 제공하였다. LCMS: 422.3[M+H]+
tert-부틸 (1-(4-폼일벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)카바메이트( INX-SM-46-6 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (E)-(1-((2-토실하이드라조노)메틸)스피로[2.5]옥탄-6-일)카바메이트(INX-SM-46-5)(0.5g, 1.18m㏖)를 충전하고, K2CO3(0.24g, 1.78m㏖) 및 다이옥산(15㎖)을 첨가하고, 혼합물을 N2로 30분 동안 탈기하였다. 이 용액에, (4-폼일페닐)보론산(0.26g, 1.78m㏖)을 첨가하고, 110℃에서 2시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물(50㎖)에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산, 1:1)로 정제시켜 표제 화합물을 무색 액체(0.27g, 67.5%)로서 제공하였다. LCMS: 344.21 [M+H]+
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[2.5]옥탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-46 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (1-(4-폼일벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)카바메이트(INX-SM-46-6)(0.55g, 1.60m㏖), (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-α-하이드록시프레드니솔론)(0.602g, 1.60m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.96g, 8.01m㏖) 및 HClO4(0.80g, 8.01m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액으로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질 일부(0.150 g)를 분취용-HPLC(칼럼: C18-(250×21.2㎜), 5 MICRON, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴:메탄올:IPA(65:25:10); A:B, 75:25), (체류 시간 13.67분)로 정제시켜 표제 화합물(0.005g, 2.8%)을 제공하였다. LCMS:602.4 [M+H]+;
1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.39(d, J=8.0Hz, 2H), 7.31(d, J=8.0Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0 & 2.4Hz 1H), 6.04(s, 1H), 5.47(s, 아세탈-H, 1H), 5.07(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.70-4.60(m, 2H), 4.45(br s, 1H), 4.35(d, J= 19.2Hz, 1H), 3.00-0.80(m,22H), 1.51(s, 3H), 1.00(s, 3H), 00.59-0.56(m, 1H),.26-0.25(m, 1H).
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A9) 의 합성
tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A9-1 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.32g, 0.68m㏖), ((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[2.5]옥탄-1-일) 메틸) 페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a, 8a-다이메틸-1, 2, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 11a, 12, 12a, 12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-46)(0.4g, 0.68m㏖) 및 DMF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.13g, 1.02m㏖) 및 HATU(0.33g, 1.02m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.3g, 42.31%)로서 제공하였다. LCMS: 1066.41[M+H]+.
tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A9-2 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A9-1)(0.3g, 0.28m㏖) 및 THF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.20g, 2.81m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.16g, 67.40%)로서 제공하였다 LCMS: 844.5 [M+H]+.
tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A9-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A9-2)(0.16g, 0.18m㏖) 및 DCM(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖)에 용해된 Na2CO3(0.040g, 0.37m㏖) 및 브로모아세틸 브로마이드(0.038g, 0.18m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM 중 10% 메탄올로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물, 70:30)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.13g, 74.8%)로서 제공하였다. LCMS: 964.4[M+H]+.
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A9 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[2.5]옥탄-6-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A9-3)(0.13g, 0.13m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.38g, 3.3m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다(0.11g, 조물질). 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B, 60:40), (체류 시간 14.4분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.007g, 5.72%)로서 제공하였다. LCMS: 908.40 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.49-7.27(m, 5H), 6.28(d, J=10Hz, 1H), 6.06(s, 1H), 5.48(s, 아세탈-H, 1H), 5.08(d, J=5.2 Hz, C16H, 1H), 4.70-3.70(m, 9H), 3.00-0.90(m, 26H), 1.50(s, 3H), 1.10(s, 3H), 0.54-0.51(m, 1H), 0.19-0.17(m, 1H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-Z) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-Z-1 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.20g, 0.41m㏖)을 충전하고, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-아미노바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-10)(0.28g, 0.46m㏖)을 DMF(2㎖)에 취하였다. 이 용액에 DIPEA(0.21g, 1.6m㏖) 및 HATU(0.44g, 1.1m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.1g, 20.16%)로서 제공하였다. LCMS 1066.9[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-Z-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-Z-1)(0.15g, 0.14m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.10g, 1.4m㏖)을 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.08g, 67.38%)로서 제공하였다, LCMS: 844.6 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-Z-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-Z-2)(0.08g, 0.094m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖) 중 Na2CO3(0.030g, 0.28m㏖) 용액 및 브로모아세틸 브로마이드(0.024g, 0.12m㏖)를 실온에서 적가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 연황색 고체로서 제공하였다(0.08g, 88.2%). LCMS: C50H6779BrN3O11에 대한 계산치 (964.40), 실측치 964.6[M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-Z )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-Z-3)(0.08g, 0.08m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.23g, 2.10m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용 HPLC(칼럼 YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = ACN: MeOH(50:50), A:B = 35:65, 체류 시간 20.17분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.005g, 6.64%)로서 제공하였다. LCMS: C46H59 79BrN3O11에 대한 계산치 (908.33), 실측치 908.4[M+H]+;
1H NMR (400 MHz, MeOD) 주요 양성자 배정): 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.46(d, J=10.4Hz, 1H), 7.34 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.09(d, J=7.6Hz, 2H), 6.26(d, J=9.6Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.44(s, 아세탈-H, 1H), 5.05(d, J=5.2 Hz, C16H, 1H), 5.00-4.10(m, 9H), 2.70-1.60(m, 20H), 1.51 (s, 3H), 1.50-1.40(m, 6H), 1.25-1.05(m, 2H), 1.00(s, 3H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-아미노-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-36) 의 합성
tert-부틸 (E)-(1-((2-토실하이드라조노)메틸)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)카바메이트( INX-SM-36-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (1-폼일-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)카바메이트(0.2g, 0.78m㏖) 및 EtOH(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드(0.218g, 1.17m㏖) 및 촉매량의 AcOH(0.1㎖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 생성된 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(0.30g, 90.42%)로서 제공하였다. LCMS: 424.23[M+H]+
tert-부틸 (1-(4-폼일벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)카바메이트( INX-SM-36-2) 의 합성
절차:
질소 하에서 35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (E)-(1-((2-토실하이드라조노)메틸)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)카바메이트(INX-SM-36-1)(0.1g, 0.236m㏖) 및 다이옥산(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, (4-폼일페닐)보론산(0.053g, 0.354m㏖) 및 K2CO3(0.048g, 0.354m㏖)를 첨가하고, 100℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 끈적이는 황색 고체(0.030g, 36.78%)로서 제공하였다. LCMS: 346.2 [M+H]+
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-아미노-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-36 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (1-(4-폼일벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)카바메이트(INX-SM-36-2)(0.025g, 0.072m㏖), (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.027g, 0.072m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4 (0.043g, 0.3615m㏖) 및 HClO4(0.036g, 0.3615m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 차가운 물로 배산처리하고 침전된 고체를 여과하고 진공 하에서 건조시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B = 75:25, 체류 시간 12.52분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.008g, 15.54%)로서 제공하였다. LCMS: 604.4 [M+H]+ ; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.37(d, J=8.0Hz, 2H), 7.22(d, J=8.0Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0 & 1.6Hz 1H), 6.04(s, 1H), 5.47(s, 아세탈-H, 1H), 5.08(d, J=4.8Hz, C16H, 1H), 4.65(d, J= 19.6Hz, 1H), 4.45-4.40(m 1H), 4.33(d, J= 19.6Hz, 1H), 3.30(s, 2H), 2.73(s, 2H), 2.70-2.69(m, 1H), 2.50-1.60(m, 16H), 1.52(s, 3H), 1.20-1.04(m, 2H), 1.01(s, 3H).
((4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A24) 의 합성
tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A24-1 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.263g, 0.546m㏖), HATU(0.207g, 0.546m㏖) 및 DMF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.141g, 0.109m㏖), 그 다음 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-아미노-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-36)(0.330g, 0.546m㏖)을 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(MeOH/DCM, 10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.3g, 51.38%)로서 제공하였다. LCMS:1068.7[M+H]+
tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A24-2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A24-1)(0.5g, 0.468m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸아민(0.342g, 4.68m㏖)을 첨가하고, 2.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 DCM 및 헥산으로 배산처리하여 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.35g, 88.38%)로서 제공하였다. LCMS:846.5[M+H]+.
tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A24-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A24-2)(0.365g, 0.431m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.5㎖)에 용해된 Na2CO3(0.091g, 0.862m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.087g, 0.431m㏖)를 첨가하고, 0.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체로서 제공하였다(0.22g, 52.8%). LCMS:966.4 [M+H]+
((4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A24 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A24-3)(0.2g, 0.206m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.5㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: X-bridge Prep, C18, OBD (250×19)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴:MeOH:IPA(65:25:10); A:B = 70:30, (체류 시간 15.88분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.025g, 13.32%)로서 제공하였다. LCMS: C45H57 79BrN3O12에 대한 계산치 (910.31), 실측치 910.6[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.37(d, J=8.0Hz, 2H), 7.20(d, J=8.0Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0, 1H), 6.04(s, 1H), 5.46(s, 아세탈-H, 1H), 5.08(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.64(d, J= 19.6Hz, 1H), 4.45-4.44(m 1H), 4.34(d, J= 19.6Hz, 1H), 4.27-4.22(m, 1H), 3.98-3.89(m, 6H), 2.70(s, 2H), 2.50-1.55(m, 21H), 1.52(s, 3H), 1.20-1.04(m, 2H), 1.01(s, 3H).
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A25) 의 합성
tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A25-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A24-1)(0.300g, 0.280m㏖) 및 DMF(0.6㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.196g, 2.800m㏖) 및 (tBuO)2PN(iPr)2(1.86g, 6.741m㏖)을 첨가하고, 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고 과산화수소(3㎖)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하고, 그 다음 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 70:30)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.140g, 39.55%)로서 얻었다. LC/MS: 1260.7 [M+H]+
tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A25-2) 의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A25-1)(0.140g, 0.111m㏖) 및 EtOAc(2㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.081g, 1.111m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 H2O로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 헥산으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.080g, 69.37%)로서 얻었다. LC/MS: 1039.0 [M+H]+
tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A25-3 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A25-2)(0.080g, 0.077m㏖) 및 DCM(0.9㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.1㎖)에 용해된 Na2CO3(0.017g, 0.154m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.016g, 0.077m㏖)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다(0.080g, 89.57%). LC/MS: 1160.4 [M+H]+
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A25 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((1-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄-4-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A25-3)(0.080g, 0.069m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.2㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B, 70:30); (체류 시간 12.88분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.007g, 10.24%)로서 제공하였다. LCMS: C45H58 79BrN3O15P에 대한 계산치 (990.28), 실측치 990.5[M+H]+;
1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.51-7.47(m, 1H), 7.36 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.20(d, J=8.0Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0 & 1.6Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.52(s, 아세탈-H, 1H), 5.07(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.85-4.80(m, 1H). 4.50-4.40(m, 1H), 4.35-4.20(m, 1H), 4.00-3.80(m, 6H), 2.70-1.55(m, 24H), 1.52(s, 3H), 1.25-1.05(m, 2H), 1.03(s, 3H)
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A17) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A17-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)옥시)-2-플루오로페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H 나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-A5-1)(0.3g, 0.280m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.19g, 2.80m㏖) 및 (tBuO)2PN(iPr)2(1.8g, 6.72m㏖)를 실온에서 첨가하고 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 과산화수소(3㎖)를 0℃에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 80:20)시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.18g, 50.84%)로서 제공하였다. LCMS: 1264.5[M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A17-2) 의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4 ((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A17-1)(0.18g, 0.17m㏖) 및 THF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.125g, 1.70m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터 및 헥산으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.15g, 조물질)로서 제공하였다. LCMS: 1042.9[M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A17-3 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A17-2)(0.13g, 0.14m㏖) 및 DCM(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.3㎖)에 용해된 Na2CO3(0.030g, 0.28m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.043g, 0.21m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조 표제 화합물을 회백색 고체(0.12g, 73.69%)로서 제공하였다. LCMS: 1162.6[M+H]+
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A17 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(3-플루오로-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A17-3)(0.1g, 0.085m㏖) 및 DCM(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.049g, 0.42m㏖)를 실온에서 첨가하고 20분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B, 67:33, 체류 시간 10.33분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.010g, 11.71%)로서 제공하였다. LCMS: 994.3[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.49-7.42(m, 2H), 6.68 (dd, J=8.8 & 2Hz, 1H), 6.58-6.55(m, 1H), 6.28-6.25(dd, J=10 & 1.6 Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.69(s, 1H), 5.03 (d, J=5.2Hz, 1H), 4.95-4.74(m, 2H), 4.63-4.60(m, 1H), 4.45-4.44(m, 1H), 4.35-4.31(m, 1H), 4.24-4.18(m, 1H), 3.95-3.90(m, 4H), 2.69-1.72(m, 21H), 1.52(s, 3H), 1.31-1.05(m, 2H), 1.02(m, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A18) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A18-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A5-1)(0.3g, 0.270m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.189g, 2.70m㏖) 및 (tBuO)2PNEt2 (1.7g, 6.48m㏖)을 첨가하고, 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 과산화수소(1㎖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 80:20)시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.15g, 42.65%)로서 제공하였다. LCMS: 1300.51[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A18-2 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A18-1)(0.12g, 0.09m㏖) 및 THF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.067g, 0.92m㏖)을 첨가하고, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 농축시키고, 고체를 다이에틸 에터 및 헥산으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.09g, 92.74%)로서 제공하였다. LCMS: 1078.8[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A18-3 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS}-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3] 헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A18-2)(0.090g, 0.083m㏖) 및 DCM(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.3㎖)에 용해된 Na2CO3(0.017g, 0.166m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.025g, 0.12m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 포함하는 조 생성물을 회백색 고체(0.090g, 90.42%)로서 제공하였다. LCMS: 1199.6[M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A18 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)-3-플루오로페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A18-3)(0.090g, 0.075m㏖) 및 DCM(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.042g, 0.37m㏖)를 첨가하고, 20분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B, 67:33, 체류 시간 11.32분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.010g, 12.93%)로서 제공하였다. LCMS: 1031.2[M+H]+. 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.44(t, J=8.4Hz, 1H), 7.36(d, J=10Hz, 1H), 6.68(m, J=8.4 & 2 Hz,1H), 6.60-6.55(m, 1H), 6.37-6.33(m, 2H), 5.73(s, 아세탈-H, 1H), 5.66-5.49(m, CH-F, 1H), 5.05 (d, J=4.4Hz, C16H, 1H), 4.80-4.74(m, 2H), 4.63-4.60(m, 1H), 4.35-4.31(m, 2H), 4.30-4.26(m, 1H), 3.95-3.90(m, 4H), 2.68-1.55(m, 20H), 1.50(s, 3H), 1.02(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A7) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A7-1 )의 합성
절차:
N2 하에서 35㎖ 유리 바이알에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(1.14g, 2.385m㏖), HATU(1.35g, 3.577m㏖) 및 DMF(14㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.8㎖, 4.77m㏖), 그 다음 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-32)(1.4g, 2.385m㏖)을 실온에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 고체를 진공 하에서 여과하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(MeOH: DCM 5:95)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(1.6g, 63.84%)로서 제공하였다. LCMS: 1052.6[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A7-2 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A7-1)(1.6g, 1.520m㏖) 및 DMF(2.5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(1.06g, 15.20m㏖) 및 (tBuO)2PN(i-Pr)2(10.11g, 36.501m㏖)를 실온에서 첨가하고 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 ℃까지 냉각시키고 과산화수소(16㎖)를 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 15:85)시켜 표제 화합물을 백색 고체(1.2g, 63.42%)로서 제공하였다. LCMS: 1244.6[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A7-3 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A7-2)(1.2g, 0.964m㏖) 및 에틸 아세테이트(12㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.704g, 9.64m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 물로 세척하고 유가 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 헥산으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.650g, 65.94%)로서 제공하였다. LCMS: 1023.9[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A7-4 )의 합성
INX-A7-4
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A7-3)(0.650g, 0.636m㏖) 및 DCM(9㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1.0㎖)에 용해된 Na2CO3(0.135g, 1.272m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.128g, 0.636m㏖)를 실온에서 첨가하고 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 40:60)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.25g, 34.79%)로서 제공하였다. LCMS: 1142.6[M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A7 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A7-4)(0.250g, 0.218m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.5㎖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5 ㎛, 12 nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 55:45, 체류 시간 19.15분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.026g, 12.20%)로서 제공하였다. LCMS: 974.3[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.36(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0 &1.6Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.51(s, 아세탈-H, 1H), 5.06 (d, J= 4.8Hz, C16H, 1H), 5.00--4.70(m, 2H), 4.46-4.45(m, 1H), 4.33-4.30(m, 1H), 4.15-4.09(m, 1H), 3.94-3.92(m, 3H), 2.68-1.72(m, 20H), 1.52(s, 3H), 1.18-1.05(m, 2H), 1.03(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A12) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A12-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A23-1)(1.2g, 1.10m㏖) 및 DMF(2.0㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.771g, 11.020m㏖) 및 (tBuO)2PN(i-Pr)2(7.33g, 26.46m㏖)를 첨가하고, 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 과산화수소(12㎖)를 반응 혼합물에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 70:30)시켜 표제 화합물을 백색 고체(1.1g, 77.91%)로서 제공하였다. LC/MS: 1280.8 [M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A12-2 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A12-1)(1.1g, 0.859m㏖) 및 EtOAc(11㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.628g, 8.593m㏖)을 실온에서 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 물로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 헥산으로 배산처리하고 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.550g, 60.50%)로서 얻었다. LC/MS: 1058.8 [M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A12-3 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A12-2)(0.550g, 0.519m㏖) 및 DCM(9㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1.0㎖)에 용해된 Na2CO3(0.110g, 1.038m㏖) 및 브로모아세틸 브로마이드(0.105g, 0.0.519m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 표제 화합물(0.400g, 65.27%)을 제공하였다. LC/MS: 1180.2 [M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A12 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A12-3)(0.250g, 0.212m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.5㎖)를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B = 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.022g, 10.27%)로서 제공하였다. LCMS: 1010.4[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.37-7.34(m, 3H), 7.17 (d, J=8.0Hz, 2H), 6.38-6.35(m, 2H), 5.70-5.55(m, CHF, 1H), 5.54(s, 아세탈-H, 1H), 5.07(d, J=4.8Hz, C16H, 1H), 5.05-4.80(m, 3H), 4.35-4.30(m, 2H), 4.13-4.09(m, 1H), 3.94-3.89(m, 3H), 2.68-1.65(m, 20H), 1.60(s, 3H), 1.03(s, 3H)
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A14) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A14-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-S-3)(0.5g, 0.471m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.33g, 4.71m㏖) 및 (tBuO)2PN(i-Pr)2(3.13g, 11.31m㏖)를 실온에서 첨가하고 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 냉각시키고 과산화수소(10V)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 70:30)시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.28g, 47.45%)로서 제공하였다. LCMS: 1252.73 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A14-2 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A14-1)(0.28g, 0.23m㏖) 및 THF(2.8㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.168g, 2.31m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시키고 조물질을 다이에틸 에터 및 헥산으로 배산처리하여 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.19g, 80.19%)로서 제공하였다. LCMS: 1030.68 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A14-3 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A14-2)(0.190g, 0.18m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.4㎖)에 용해된 Na2CO3(0.038g, 0.36m㏖) 및 브로모아세틸 브로마이드(0.036g, 0.18m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 조물질인 끈적이는 고체(0.15g, 72.39%)로서 제공하였다. LCMS: 1150.4[M+H]+
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A14 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A14-3)(0.15g, 0.130m㏖) 및 DCM(4㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.074g, 0.65m㏖)를 첨가하고, 20분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B, 65:35); (체류 시간 12.76분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.012g, 9.39%)로서 제공하였다. LCMS: 982.3[M+H]+, 1H NMR (400 MHz, DMSO: δ 8.55(t, 1H), 8.35(s, 1H), 8.04(d, 1H), 7.35 (d, 2H),7.25(d, 1H), 7.10(d, 2H), 6.30(d, 1H), 6.13(s, 1H), 5.80-5.60(m, 1H), 5.50(s, 아세탈-H, 1H), 4.96(d, J=4.8Hz, C16H, 1H), 4.90-4.70(m, 2H), 4.30-4.10(m, 3H), 3.90(s, 2H), 3.75(d, 2H), 2.80(d, 2H), 2.50-1.55(m, 18H), 1.50(s, 3H), 1.30-1.10(m, 2H), 0.92(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A15) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A15-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A4-1)(0.5g, 0.42m㏖) 및 DMF(2㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.33g, 4.75m㏖) 및 (tBuO)2PN(i-Pr)2(3.1g, 11.20m㏖)를 실온에서 첨가하고 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 과산화수소(10V)를 반응 혼합물에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 80:20)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.3g, 57.30%)로서 제공하였다. LCMS: 1247.50 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A15-2 )의 합성
절차:
25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A15-1)(0.3g, 0.24m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.75g, 2.4m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 농축시키고 다이에틸 에터 및 헥산으로 배산처리하여 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.2g, 81.13%)로서 제공하였다. LCMS: 1024.9 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A15-3 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A15-2)(0.2g, 0.20m㏖) 및 DCM(4㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.3㎖)에 용해된 Na2CO3(0.082g, 0.89m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.082g, 0.45m㏖)를 반응 혼합물에 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 표제 화합물 INX-A15-3 생성물을 회백색 고체(0.18g, 78.59%)로서 제공하였다. LCMS: 1145.4[M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A15 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a, 12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A15-3)(0.18g, 0.17m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.3㎖)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-PACK ODS-AQ Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴:메탄올:2-프로판올(65:25:10); A:B, 55:45; 체류 시간 15.60분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.021g, 12.64%)로서 제공하였다. LCMS: 976.5[M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 주요 양성자 배정): 1H NMR (400 MHz, DMSO: δ 7.31-7.28(m, 3H), 6.72(d, 2H), 6.16(d, J=10.8Hz, 1H), 5.92(s, 1H), 5.41(s, 아세탈-H, 1H), 4.95(d, C16H, 1H), 4,85-3.50(m, 10H), 2.72-1.60(m, 21H), 1.39(s, 3H), 1.10-0.98(m, 2H), 0.88(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A16) 의 합성
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)옥시)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-A16-1 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (6-(4-폼일페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-43-1)(1.1g, 3.32m㏖), (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-다이플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(INX-S-1)(1.09g, 2.65m㏖) 및 DCM(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(1.99g, 16.61m㏖), 그 다음 HClO4(1.6g, 16.61m㏖)를 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 연황색 고체(1.3g, 조물질)로서 제공하였다. LCMS: 625.9 [M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A16-2 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)옥시)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-A16-1)(1.29g, 2.08m㏖), (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(1.0g, 2.08m㏖) 및 DMF(10㎖)를 충전하였다. 이 용액에 HATU(0.94g, 2.49m㏖) 및 DIPEA(0.89㎖, 5.20m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(물:아세토나이트릴 46:54)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.8g, 35.32%)로서 제공하였다. LCMS: 1091.5 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A16-3 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A16-2)(0.38g, 0.32m㏖) 및 DMF(1.5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.24g, 3.40m㏖) 및 (tBuO)2PN(i-Pr)2(2.3g, 8.21m㏖)를 첨가하고, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 냉각시키고, 과산화수소(4㎖)를 반응 혼합물에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 80:20)시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.2g, 48.73%)로서 제공하였다. LCMS: 1283.7 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A16-4 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A16-3)(0.17g, 0.13m㏖) 및 THF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.096g, 1.3m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 다이에틸 에터 및 헥산으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.13g, 94.32%)로서 제공하였다. LCMS: 1060.8[M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A16-5 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A16-4)(0.13g, 0.12m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.3㎖)에 용해된 Na2CO3(0.051g, 0.49m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.049g, 0.24m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 표제 화합물 INX-A16-5 생성물을 회백색 고체(0.12g, 84.66%)로서 제공하였다. LCMS 1182.1 [M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A16 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)페녹시)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A16-5)(0.12g, 0.10m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.057g, 0.50m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep C18 OBD(250×19)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B = 64:36; 체류 시간 12.86분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.013g, 12.83%)로서 제공하였다. LCMS: 1012.4[M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO: δ: 8.54(t, 1H), 8.11-8.09(m, 2H), 7.33-7.25(m, 3H), 6.84(d, J=8.4Hz, 2H), 6.30(dd, J=10.4 & 1.6Hz, 1H), 6.13(s, 1H), 5.72-5.60(m, CH-F, 1H), 5.48(s, 아세탈-H, 1H), 4.93(d, J=4.8Hz, C16H, 1H), 4.90-4.91(m, 1H), 4.61-4.57(m, 2H), 4.30-4.00(m, 5H), 3.94(s, 2H), 3.00-1.67(m, 20H), 1.50-1.48(m, 3H), 0.89(s, 3H)
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-아자스피로[3.3]헵탄-6-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-47 )의 합성
단계-1: tert-부틸 (E)-6-((2-토실하이드라조노)메틸)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트( INX-SM-47-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 6-폼일-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트(0.2g, 0.88m㏖) 및 EtOH(10㎖)를 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드(0.247g, 1.333m㏖) 및 촉매량의 AcOH(0.1㎖)를 첨가하고, 0.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(0.3g, 86.6%)로서 제공하였다. LCMS: 394.2 [M+H]+
tert-부틸 6-(4-폼일벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트( INX-SM-47-2 )의 합성
절차:
질소 하에서 35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (E)-6-((2-토실하이드라조노)메틸)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트(INX-SM-47-1)(0.3g, 0.762m㏖) 및 다이옥산(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, (4-폼일페닐)보론산(0.171g, 1.143m㏖) 및 K2CO3(0.158g, 1.143m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 100℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 끈적이는 고체(0.065g, 27.03%)로서 제공하였다. LCMS: 316.2 [M+H]+
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-아자스피로[3.3]헵탄-6-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-47 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 6-(4-폼일벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트(INX-SM-47-2)(0.065g, 0.206m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.077g, 0.206m㏖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.103g, 1.03m㏖) 및 HClO4(0.123g, 1.03m㏖)를 첨가하고, 추가로 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 차가운 물로 배산처리하고 고체를 여과하였다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-PACK ODS-AQ Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴: 메탄올:2-프로판올(65:25:10), A:B = 58:42, 체류 시간 12.23분)로 정제시켜 표제 화합물(0.025g, 17.77%)을 백색 고체로서 제공하였다. LCMS: 574.4 [M+H]+ ; 1H NMR (400 MHz, MeOD: δ: 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.37(d, J=8.0Hz, 2H), 7.18(d, J=8.4Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0 & 2.0Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.46(s, 아세탈-H, 1H), 5.06(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.65-4.60(m, 2H), 4.44(d, J=2.8Hz, 1H), 4.35-4.31(m, 1H), 4.03(s, 2H), 3.95(s, 2H), 2.70-1.60(m, 15H), 1.50(s, 3H), 1.17-1.04(m, 2H), 1.01(s, 3H)
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(4-((3-(메틸아미노)사이클로부틸)메틸)페닐)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-49) 의 합성
메틸 3-((tert-부톡시카보닐)아미노)사이클로부탄-1-카복실레이트카바메이트( INX-SM-49-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 3-((tert-부톡시카보닐)아미노)사이클로부탄-1-카복실산(3.0g, 13.95m㏖), 탄산칼륨(3.8g, 27.90m㏖) 및 DMF(20㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 메틸 아이오다이드(2.9g, 20.92m㏖)를 첨가하고, 추가로 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 H2O로 희석시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체(2.2g, 68.85%)로서 제공하였다. LCMS: 230.20 [M+H]+
메틸 3-((tert-부톡시카보닐)(메틸)아미노)사이클로부탄-1-카복실레이트( INX-SM-49-2 )의 합성
절차:
0℃에서 100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DMF(20㎖) 중 메틸 3-((tert-부톡시카보닐)아미노)사이클로부탄-1-카복실레이트카바메이트(INX-SM-49-1)(2.2g, 9.60m㏖) 및 60% 소듐 하이드라이드(0.77g, 19.21m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 메틸 아이오다이드(2.03g, 14.40m㏖)를 첨가하고, 추가로 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체(1.8g, 77.0%)로서 제공하였다. LCMS: 244.20 [M+H]+
tert-부틸 (3-(하이드록시메틸)사이클로부틸)(메틸)카바메이트( INX-SM-49-3 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 THF:MeOH(1:1, 20㎖) 중 메틸 3-((tert-부톡시카보닐)(메틸) 아미노)사이클로부탄-1- 카복실레이트(INX-SM-49-2)(1.8g, 7.40m㏖)를 충전하고 소듐 보로하이드라이드(1.3g, 37.0m㏖)를 첨가하고, 추가로 5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 검 같은 고체(1.7g, 조물질)로서 제공하였다. LCMS: 216.1[M+H]+
tert-부틸 (3-폼일사이클로부틸)(메틸)카바메이트( INX-SM-49-4 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(20㎖) 중 tert-부틸 (3-(하이드록시메틸)사이클로부틸) (메틸)카바메이트(INX-SM-49-3)(1.7g, 조물질)를 충전하였다. 이 용액에, DMP(5.02g, 11.80m㏖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 다이클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 검 같은 고체(1.5g, 89.06%)로서 제공하였다. 조물질을 즉시 다음 단계에 사용하였다.
tert-부틸 (E)-메틸(3-((2-토실하이드라조노)메틸)사이클로부틸)카바메이트( INX-SM-49-5 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (3-폼일사이클로부틸)(메틸)카바메이트(INX-SM-49-4)(1.5g, 7.04m㏖) 및 에탄올(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설포닐 하이드라자이드(1.4g, 7.7m㏖) 및 아세트산(촉매)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 생성된 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(2.0 g 74.46%)로서 제공하였다. LCMS: 382.22 [M+H]+
tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)사이클로부틸)(메틸)카바메이트( INX-SM-49-6 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (E)-메틸(3-((2-토실하이드라조노)메틸)사이클로부틸)카바메이트(INX-SM-49-5)(2.0g, 5.24m㏖) 및 다이옥산(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, (4-폼일페닐) 보론산(1.17g, 7.87m㏖) 및 K2CO3(1.08g, 7.87m㏖)를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 110℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:1:1)로 정제시켜 표제 화합물을 무색 액체(0.500g, 31.45%)로서 제공하였다. LCMS: 304.2 [[M+H]+
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(4-((3-(메틸아미노)사이클로부틸)메틸)페닐)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-49 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)사이클로부틸)(메틸)카바메이트(INX-SM-49-6)(0.16g, 0.52m㏖), (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.21g, 0.58m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.31g, 2.6m㏖) 및 HClO4(0.26g, 2.6m㏖)를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, MDC로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 분취용-HPLC로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.050g, 17.11%)로서 제공하였다. LCMS: 562.4[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6-d2O: δ: 7.37(d, J=8.4Hz, 2H), 7.32(d, J=10.0Hz, 1H), 7.17(d, J=8.0Hz, 2H), 6.17(dd, J=10 & 1.6Hz, 1H), 5.94(s, 1H), 5.41(s, 아세탈-H, 1H), 4.93(d, J=4.8Hz, C16H, 1H), 4.48(m, 1H), 4.31-4.29(m, 1H), 4.21-4.15(m, 1H), 3.50-3.40(m, 1H), 2.69-1.60(m, 19H), 1.40(s, 3H), 0.99-0.96(m, 2H), 0.87(s, 3H).
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)쿠반-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A2) 의 합성
tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)쿠반-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A2-1 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4) 0.137g, 0.285m㏖), HATU(0.163g, 0.428m㏖) 및 DMF(2㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.110g, 0.857m㏖) 및 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1s,2R,3S,8S)-4-아미노쿠반-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-9)(0.160g, 0.0.285m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.08g, 26.39%)로서 제공하였다. LCMS:1060.7[M+H]+
tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)쿠반-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A2-2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)쿠반-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A2-1)(0.08g, 0.075m㏖) 및 THF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.055g, 0.75m㏖) 및 1,8-다이아자바이사이클로(5.4.0)운데스-7-엔(DBU)(촉매)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 DCM 및 헥산으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.06g, 95.46%)로서 제공하였다. LCMS: 839.4 [M+H]+.
tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)쿠반-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A2-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)쿠반-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A2-2)(0.09g, 0.107m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, Na2CO3(0.022g, 0.21m㏖)를 물(0.1㎖)에 용해시키고, 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.043g, 0.021m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.065g, 63.11%)로서 제공하였다.
LCMS: C50H6179BrN3O11에 대한 계산치 (958.35), 실측치 958.2[M+H]+.
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)쿠반-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((2S,3R,4R,5S)-4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)쿠반-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A2-3)(0.065g, 0.067m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.5㎖) 및 트라이아이소프로필 살린(촉매)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 조물질 표제 화합물 생성물을 회백색 고체(0.055 g 조물질)로서 제공하였다. LCMS 903.5 [M+H]+.
(S)-4-(2-(2-(((R)-2-아미노-2-카복시에틸)티오)아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-P-CYS )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산(INX-P-CYS)(0.1g, 0.11m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, L-시스테인(0.003g, 0.12m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. LCMS로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 동결건조시키고, 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 45:55)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.050g, 50.11%)로서 제공하였다. LCMS: 907.5 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD: δ: 7.47(d, J=10.4Hz, 1H), 7.38(d, J=8.0Hz, 2H), 7.14(d, J=8.0Hz, 2H), 6.28(d, J=10.0Hz, 1H), 6.05(s, 1H), 5.46(s, 아세탈-H, 1H), 5.06(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.65(d, 1H), 4.46(m, 1H), 4.35 (d, 1H), 4.18-4.16(m, 1H), 3.90(m, 2H), 3.79(m, 1H), 3.50-3.00 (m, 4H), 3.00-1.60 (m, 21H), 1.52(s, 3H), 1.30-1.07(m, 2H), 1.01(s, 3H).
2,2,2-트라이플루오로아세트산을 갖는 (S)-4-(2-(2-(((R)-2-아미노-2-카복시에틸)티오)아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산 화합물( INX-V-CYS )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산(INX-V)(0.1g, 0.11m㏖) 및 DMF(1.5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, L-시스테인(0.0027g, 0.223m㏖)을 첨가하고, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. LCMS로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 동결건조시켰다. 단리된 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = MTBE:아세토나이트릴(10:90), A:B = 75:25), (체류 시간 12.5분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.012g, 10.24%)로서 제공하였다. LCMS: 935.5 [M+H]+;
1H NMR (400 MHz, MeOD: δ: 7.46(d, J=10.4Hz, 1H), 7.34(d, J=8.0Hz, 2H), 7.15(d, J=8.0Hz, 2H), 6.27(dd, J=1.4Hz, 10Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.45(s, 아세탈-H, 1H), 5.06(d, J=5.2Hz, C16H, 1H), 4.66(d, 1H), 4.45-4.40(m, 1H), 4.36-4.31(m, 2H), 4.12(m, 1H), 4.00-3.92(m, 3H), 3.50-1.73(m, 28H), 1.52(s, 3H), 1.20-1.03(m, 2H), 1.00(s, 3H).
2,2,2-트라이플루오로아세트산을 갖는 S-(2-((2-(((S)-6-아미노-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)-L-시스테인 화합물( INX-W-CYS )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 ((S)-6-아미노-2-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-N-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)헥산아마이드 (INX-W)(0.2g, 0.23m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, L-시스테인(0.041g, 0.34m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. LCMS로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 동결건조시켰다. 조물질을 분취용 HPLC(칼럼: SUNFIRE Prep Silica, OBD, 150-19㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 76:24), (체류 시간 19.5분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.020g, 8.49%)로서 제공하였다. LCMS: 906.4 [M+H]+;
1H NMR (400 MHz, MeOD: δ: 7.47(d, J=10.4Hz, 1H), 7.38(d, J=8.0Hz, 2H), 7.14(d, J=8.0Hz, 2H), 6.28(d, 1H), 6.05(s, 1H), 5.48(s, 아세탈-H, 1H), 5.07 (d, J=5.2Hz, C16H,1H), 4.67(d, 1H), 4.50-4.32(m, 3H), 3,39(s, 2H), 3.40-3.00(m, 2H), 3.00-2.90(m, 2H), 2.85(s, 2H), 2.75-1.60(m, 22H), 1.52(s, 3H), 1.50-1.35(m, 2H), 1.20-1.05(m, 2H), 1.01(s, 3H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-34) ; 및
2,2,2-트라이플루오로아세트산을 갖는(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-카복실산 화합물( INX-SM-42) 의 합성
반응식-1
반응식-2
반응식-3
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-벤질-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-34-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (11□)-21-(아세틸옥시)-11-하이드록시프레그나-1,4,16-트라이엔-3,20-다이온(5.0g, 13.0m㏖) 및 1, 4-다이옥산(50㎖)을 충전하였다. 이 용액에, N-(메톡시메틸)-N-(트라이메틸실릴메틸)벤질아민 (30.8g, 13.0m㏖) 및 TFA(0.10g, 0.9m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 110℃에서 4시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:헥산, 20:80)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(3.0g, 44.56%)로서 제공하였다. LCMS 518.29[M+H]+
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트 하이드로클로라이드( INX-SM-34-2 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-벤질-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-34-1)(3.0g, 5.79m㏖) 및 아세토나이트릴(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(0.97g, 11.5m㏖) 및 1-클로로에틸 클로로폼에이트(1.65g, 11.59)를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축시키고 조물질을 n-펜텐 및 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(2.0g, 74.38%)로서 제공하였다. LCMS 428.3 [M+H]+.
tert-부틸 (3-(4-브로모벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트( INX-SM-34-3 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (E)-(3-((2-토실하이드라조노) 메틸) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 카바메이트(INX-SM-3-4)(0.05g, 0.13m㏖) 및 1, 4-다이옥산(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, K2CO3(0.039g, 0.19m㏖)를 첨가하고, N2(g)를 1시간 동안 퍼징하였다. 반응 혼합물에서 침전이 관찰된 후, (4-브로모페닐)보론산(0.039g, 0.19m㏖)을 반응에 첨가하고 110℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 염수로 세척하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산: 10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.02g, 43.0%)로서 제공하였다. 1H NMR(CDCl3) δ: 7.39 (d, J=6.4 Hz, 2H)), 6.96 (d, J=6.4 Hz 2H,), 2.79 (s, 2H), 1.81(s, 6 H) 1.44(s, 9H).
tert-부틸 (3-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트( INX-SM-34-4 )의 합성
절차:
질소 하에서 25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-브로모벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-34-3)(0.5g, 1.42m㏖) 및 1,4-다이옥산(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 비스피나콜론다이보란(1.07g, 4.26m㏖) 및 아세트산칼륨(0.27g, 2.84m㏖)을 첨가하고 N2로 15분 동안 퍼징하였다. PdCl2(dppf).DCM(0.12g, 0.14m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고 110℃에서 2시간 동안 가열시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 실온에서 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 이것을 셀라이트층으로 여과하고, 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산: 20:80)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 반고체(0.8g, 조물질)로서 제공하였다. 이것을 다음 단계에 사용하였다.
(4-((3-((tert-부톡시카보닐) 아미노) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일) 메틸) 페닐) 보론산( INX-SM-34-5 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-34-4)(1.0g, 2.5m㏖) 및 아세톤:물(9:1)(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaIO4(4.28g, 20.0m㏖) 및 아세트산암모늄(1.54g, 20.0m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 환류 온도에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 n-펜텐 및 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 회백색 고체(0.4g, 50.3%)로서 제공하였다. LCMS: 262.2 [M+1-t-Bu]
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((tert-부톡시카보닐)아미노)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-34-6 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 아세토나이트릴(5㎖) 중 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트 하이드로클로라이드(INX-SM-34-2)(0.1g, 0.23m㏖) 및 (4-((3-((tert-부톡시카보닐) 아미노) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일) 메틸) 페닐) 보론산(INX-SM-34-5)(0.25g, 0.81m㏖)을 충전하였다. 이 용액에, KOH(0.13g, 2.34m㏖) 및 Cu(OAc)2(0.12g, 0.70m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.15g, 93.31%)로서 제공하였다. LCMS: 699.5 [M+H]+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-34 ); 및
2,2,2-트라이플루오로아세트산을 갖는 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-카복실산 화합물( INX-SM-42 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((tert-부톡시카보닐)아미노)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-34-6)(0.13g, 0.18m㏖) 및 메탄올(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, K2CO3(0.038g, 0.27m㏖)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 합한 유기 층을 진공 하에서 증발시키고, DCM(2㎖)에 용해시켰다. 이 용액에, TFA(0.2㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = MTBE:아세토나이트릴(90:10), A:B = 78:22)로 정제시켜 INX-SM-34(0.010g, 8.01%): LCMS: 557.30 [M+H]+ ; 1H NMR (400 MHz, MeOD: δ: 7.49(d, J=10.4Hz, 1H), 6.94(d, J=8.8Hz, 2H), 6.62(d, J=8.4Hz, 2H), 6.26(dd, J= 10.0 & 2.0 Hz, 1H), 5.99(s, 1H), 4.60-4.25(m, 3H), 3.60-3.00(m, 4H), 2.77-1.55(m, 18H), 1.50(s, 3H), 1.15(s, 3H), 1.15-1.00(m, 2H).
및 INX-SM-42(0.0041g, 3.36%)를 제공하였다: LCMS: 543.3[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD: δ: 7.50(d, J=10.4Hz, 1H), 6.94(d, J=8.4Hz, 2H), 6.60(d, J=8.4Hz, 2H), 6.26(dd, J=10.0& 2.0Hz, 1H), 5.99(s, 1H), 4.45(br s, 1H), 3.60-3.30(m, 4H), 2.77(s, 2H), 2.70-1.55(m, 16H), 1.50 (s, 3H), 1.22(s, 3H), 1.15-1.00(m, 2H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A13) 의 합성
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-A13-1 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((tert-부톡시카보닐)아미노)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-34-6)(0.33g, 0.47m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.1㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 회백색 고체(0.28g, 정량적)로서 제공하였다. LCMS:599.5 [M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A13-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일) 메톡시) 카보닐) 아미노) 아세트아미도) -5- (tert-부톡시) -5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.24g, 0.50m㏖), 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트 2,2,2-트라이플루오로아세테이트(INX-A13-1)(0.3g, 0.50m㏖) 및 DMF(2㎖)를 충전하였다. 이 용액에 DIPEA(0.16g, 1.25m㏖) 및 HATU(0.22g, 0.60m㏖)를 첨가하고, 15분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 회백색 고체(0.4g, 74.99%)로서 제공하였다. LCMS:1063.7 [M+H]+
tert-부틸 (S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A13-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A13-2)(0.4g, 0.37m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.55g, 7.5m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.22g, 조물질)로서 제공하였다, 이것을 분석 없이 다음 단계에 사용하였다.
tert-부틸 (S)-5- ( (3-(4- ( (6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a, 8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토 [2',1':4,5] 인데노 [1,2-c] 피롤-10 (2H)-일) 벤질) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 아미노)-4-(2-(2-브로모아세트아미도) 아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A13-4 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A13-3)(0.22g, 0.26m㏖) 및 DCM(4㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖) 중 NaHCO3(0.06g, 0.78m㏖) 용액 및 브로모아세틸 브로마이드(0.04g, 0.20m㏖)를 적가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.24g, 조물질)로서 제공하였다. 이것을 정제시키지 않고 다음 단계에 취하였다. LCMS: 963.5 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A13-5 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-5-((3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a, 8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토 [2',1':4,5] 인데노 [1,2-c] 피롤-10 (2H)-일) 벤질) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 아미노)-4-(2-(2-브로모아세트아미도) 아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A13-4)(0.12g, 0.12m㏖) 및 메탄올:H2O(9:1, 5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(0.020g, 0.24m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 6시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 합한 유기 층을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.08g, 72.46%)로서 제공하였다. LCMS: 920.5 [M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A13 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A13-5)(0.08g, 0.08m㏖) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.4㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용 HPLC(SUNFIRE Prep C18 OBD, 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = 아세토나이트릴, A:B = 58:42, 체류 시간 13분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.007g, 10.12%)로서 제공하였다. LCMS: 863.4[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.48(d, J=10Hz, 1H), 6.95-6.80(m, 3H), 6.60 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.26(d, 1H), 5.99(m, 1H), 4.51-3.50(m, 8H), 3.51-2.60(m, 4H), 2.50-2.00(s, 8H), 2.00-1.20(m, 22H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노 [1,2-c]피롤-4(2H)-온( INX-SM-37) 의 합성
tert-부틸 (6-(4-브로모벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-37-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (E)-(6-((2-토실하이드라조노)메틸)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-32-3)(2.0g, 0.49m㏖) 및 다이옥산(80㎖)을 충전하였다. 이 용액에, (4-브로모페닐)보론산(1.47g, 0.73m㏖) 및 K2CO3(1.0g, 0.73m㏖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 100℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:헥산, 5:95)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.4g, 21.43%)로서 제공하였다. LCMS: 380 [M+H]+.
단계-5: tert-부틸 (6-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)벤질)스피로[3.3] 헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-37-2 )
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (6-(4-브로모벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-37-1)(0.2g, 0.5m㏖) 및 다이옥산(6㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 비스(피나콜레이토)다이보론(0.39g, 0.15m㏖) 및 KOAc(0.1g, 0.10m㏖)를 첨가하고, N2로 30분 동안 퍼징하였다. 이 용액에, Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(0.04g, 0.05m㏖)를 첨가하고, 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산, 5:95)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.3g, 정량적)로서 제공하였다. LCMS: 327.2 [[M+H-Boc]+].
(4-((6-((tert-부톡시카보닐)아미노)스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐) 보론산( INX-SM-37-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (6-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-37-2)(IBIS-T-66-A2)(0.3g, 0.70m㏖) 및 아세톤:물(9:1, 3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaIO4(1.2g, 5.6m㏖) 및 CH3COONH4(0.43g, 0.56m㏖)를 실온에서 첨가하고 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.18g, 74.87%)로서 제공하였다. LCMS: 245.7 [[M+H-Boc]+].
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-((tert-부톡시카보닐)아미노)스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-37-4 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토 [2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트 하이드로클로라이드(INX-SM-34-2)(0.12g, 0.28m㏖), (4-((6-((tert-부톡시카보닐) 아미노)스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)보론산(INX-SM-37-3)(0.29g, 0.84m㏖) 및 아세토나이트릴(12㎖)을 충전하였다. 이 용액에, KOH(0.15g, 2.80m㏖) 및 Cu(OAc)2(0.15g, 0.84m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트로 여과하였다. 수집된 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.060g, 31.91%)로서 제공하였다. LCMS: 727.6 [M+H]+.
tert-부틸 (6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-37-5 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-((tert-부톡시카보닐)아미노)스피로[3.3]헵탄 -2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-37-4)(0.06g, 0.082m㏖) 및 메탄올(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(0.013g, 0.16m㏖)를 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 농축시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.060g, 정량적)로서 제공하였다. LCMS: 585.4 [[M+H]+-Boc].
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노 [1,2-c]피롤-4(2H)-온( INX-SM-37 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-37-5)(0.050 g) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.5㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.1% FA, B = 아세토나이트릴; 체류 시간 10.27분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.011g, 23.42%)로서 제공하였다. LCMS: 585.4 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ: 7.48(d, J=10Hz, 1H), 6.95-6.83(m, 3H), 6.58(d, J=8.8 Hz, 1H), 6.26(d, 10.0 Hz, 1H), 5.98(s, 1H), 4.50-3.00 (m, 8H), 2.60-1.55(m,21H), 1.50(s, 3H), 1.20-1.05(m, 2H), 1.06(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11, 11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A10) 의 합성
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-A10-1 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-((tert-부톡시카보닐)아미노)스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-37-4)(0.3g) 및 DCM(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(1㎖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.30g, 정량적)로서 제공하였다. LCMS:627.41[M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A10-2 )의 합성
INX-A10-2
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일) 메톡시) 카보닐) 아미노) 아세트아미도)-5- (tert-부톡시) -5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.230g, 0.47m㏖), 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-A10-1)(0.3g, 0.47m㏖) 및 DMF(6㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.185g, 1.25m㏖) 및 HATU(0.27g, 0.71m㏖)를 첨가하고, 15분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 고체를 진공 하에서 여과하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(물/아세토나이트릴, 13:87)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.380g, 74.0%)로서 제공하였다. LCMS: 1091.7 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A10-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A10-2)(0.3g, 0.27m㏖) 및 THF(54㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.20g, 2.7m㏖)을 실온에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터-펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.22g, 93.75%)로서 제공하였다. LCMS: 869.7 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A10-4 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A10-3)(0.22g, 0.25m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖)에 용해된 NaHCO3(0.053g, 0.50m㏖) 및 브로모아세틸 브로마이드(0.076g, 0.37m㏖)를 실온에서 첨가하고 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.21g, 84.8%)로서 제공하였다. LCMS: 989.6 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A10-5 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A10-4)(0.210g, 0.21m㏖) 및 메탄올(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(0.035g, 0.42m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 합한 유기 층을 농축시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.220g, 정량적)로서 제공하였다. LCMS: 947.3 [M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR, 12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11, 11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A10 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A10-5)(0.220g, 0.232m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(1.5㎖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용 HPLC(SUNFIRE Prep C18 OBD(250×19)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 55:45, 체류 시간: 15.67분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.026g, 12.56%)로서 제공하였다. LCMS: 891.5 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD: δ: 7.48(d, J=10Hz, 1H), 6.95(d, J=8.4Hz, 2H), 6.62(d, J=8.4Hz, 2H), 6.26(dd, J= 10.0&2.0 Hz, 1H), 5.99(s, 1H), 4.50-4.27(m, 4H), 4.20-3.80 (m, 5H), 3.60-2.90(m, 4H), 2.50-1.55(m, 25H), 1.50(s, 3H), 1.20-1.00(m, 2H),1.07(s, 3H).
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온 (INX-SM-28) 의 합성
반응식-1
반응식-2
반응식-3
2-((6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S)-6,9-다이플루오로-11-하이드록시-10,13-다이메틸-3-옥소-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-17-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-28-1 )의 합성
절차:
100㎖ 밀봉 튜브에 다이플루프레드네이트(5.0g, 9.84m㏖) 및 DMF(50㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 아세트산칼륨(7.71g, 7.87m㏖)을 첨가하고, 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 고체를 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(4.0g, 96.76%)로서 얻었다. LC/MS: 421.3 [M+H]+.
2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-벤질-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토 [2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-28-2 )의 합성
절차:
100㎖ 유리 밀봉 튜브에 2-((6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S)-6,9-다이플루오로-11-하이드록시-10,13-다이메틸-3-옥소-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-17-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-28-1)(4.0g, 9.523m㏖) 및 1,4-다이옥산(40㎖)을 충전하였다. 이 반응 혼합물에, TFA(0.076g, 0.666m㏖) 및 N-벤질-1-메톡시-N-((트라이메틸실릴)메틸)메탄아민(22.5g, 95.23m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고, 110℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 32:68)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(3.5g, 66.45%)로서 얻었다. LC/MS: 554.3 [M+H]+.
2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-28-3 )의 합성
절차:
100㎖ 유리 밀봉 튜브에 2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-벤질-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-28-2)(3.5g, 6.329m㏖) 및 아세토나이트릴(35㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(1.06g, 12.66m㏖) 및 1-클로로에틸 클로로폼에이트(1.81g, 12.658m㏖)를 실온에서 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반하였다 TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 H2O로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 25:75)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(1.6g, 54.60%)로서 얻었다. LC/MS: 464.3 [M+H]+.
(4-브로모페닐)(3-나이트로페닐)메탄온( INX-SM-28-4 )의 합성
절차:
250㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 3-나이트로벤조일 클로라이드 (10.0g, 0.054 mol) 및 브로모벤젠(70㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 염화암모늄(7.1g, 0.054m㏖)를 0℃에서 첨가하고 2시간 동안 80℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 H2O로 희석시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산: 10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(14.0g, 84.64%)로서 제공하였다. 1H NMR(DMSO-d6) δ 8.51 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.43(s, 1H), 8.16(d, J= 7.6Hz, 1H), 7.87-7.71(m, 5H).
(4-브로모페닐)(3-나이트로페닐)메탄올( INX-SM-28-5 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (4-브로모페닐)(3-나이트로페닐)메탄온(INX-SM-28-4)(13.0g, 0.042 mol) 및 THF(100㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 소듐 보로하이드라이드(1.5g, 0.042m㏖)를 실온에서 첨가하고 추가로 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 검 같은 고체(13.0g, 99.35%)로서 제공하였다. 1H NMR(DMSO-d6) δ 8.24 (s, 1H), 8.10(d, J= 8.4Hz, 1H), 7.81(d, J= 7.6Hz, 1H), 7.60 (dd, J= 8Hz, 1H), 7.53(d,J=8.4Hz, 2H), 7.38(d, J=8.4Hz, 2H), 6.35(brs, 1H), 5.88(s, 1H).
1-(4-브로모벤질)-3-나이트로벤젠( INX-SM-28-6 )의 합성
절차:
250㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (4-브로모페닐)(3-나이트로페닐)메탄올(INX-SM-28-5)(14.0g, 0.045 mol) 및 클로로폼(50㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 트라이플산(27.0g, 0.18 mol) 및 트라이에틸실란(5.27g, 0.045 mol)을 0℃에서 첨가하고 1시간 동안 0℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산: 10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(8.0g, 60.8%)로서 제공하였다. 1H NMR(DMSO-d6) δ 8.11 (s, 1H), 8.08(d, J= 8.0Hz, 1H), 7.72(d, J= 7.6Hz, 1H), 7.59 (dd, J= 8Hz, 1H), 7.51(d,J=8.4Hz, 2H), 7.27(d, J=8.0Hz, 2H), 4.08(s, 2H).
3-(4-브로모벤질)아닐린( INX-SM-28-7 )의 합성
절차:
250㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 1-(4-브로모벤질)-3-나이트로벤젠 (8.0g, 0.027 mol) 및 에탄올:물(1:1, 100㎖)을 충전하였다 이 용액에, Zn 더스트(14.0g, 0.21m㏖) 및 (INX-SM-28-6) 염화암모늄(11.8g, 0.21m㏖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 여과액을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(7.0g, 98.8%)로서 제공하였다. LCMS: 262.1 [M+H]+.
tert-부틸 (3-(4-브로모벤질)페닐)카바메이트( INX-SM-28-8 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 3-(4-브로모벤질)아닐린(INX-SM-28-7)(7.0g, 0.026 mol) 및 THF(20㎖)를 충전하였다. 이 용액에, TEA(5.3g, 0.053 mol) 및 boc 무수물(8.7g, 0.040 mol)을 0℃에서 첨가하고 실온에서 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고 에틸 아세테이트로 추출하고 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:10:90)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(14g, 조물질)로서 제공하였다. 이것을 추가로 정제시키지 않고 다음 단계에 취하였다. LCMS: 361.7[[M+H 단편화].
tert-부틸 (3-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)벤질)페닐)카바메이트( INX-SM-28-9 )의 합성
절차:
질소 하에서 25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-브로모벤질)페닐)카바메이트(INX-SM-28-8)(14.0g, 0.038 mol) 및 1,4-다이옥산(30㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 비스피나콜론다이보란(14.4g, 0.057 mol) 및 아세트산칼륨(7.4g, 0.076 mol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 N2로 15분 동안 퍼징하였다. PdCl2(dppf).DCM(3.1g, 0.0038 mol)을 첨가하고, 110℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:20:80)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 반고체(20.0g, 조물질)로서 제공하였다. LCMS: 410.4 [M+H]+.
(4-(3-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤질)페닐)보론산( INX-SM-28-10 )의 합성
절차:
1000㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)벤질)페닐)카바메이트(INX-SM-28-9)(20.0g, 0.048 mol) 및 아세톤:물(9:1, 200㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaIO4(81.7g, 0.38 mol) 및 아세트산암모늄(29.26 g,.38 mol)을 첨가하고 환류에서 2시간 동안 가열하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트로 여과하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 n-펜텐 및 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 회백색 고체(15.0g, 95.5%)로서 제공하였다. LCMS: 328.2 [[M+H]+
2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤질)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-28-11 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-28-3)(0.320g, 0.691m㏖) 및 아세토나이트릴(35㎖)을 충전하였다. 이 용액에, (4-(3-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤질)페닐)보론산(INX-SM-28-10)(1.01g, 3.109m㏖), KOH(0.387g, 6.910m㏖) 및 Cu(OAC)2(0.375g, 2.073m㏖)를 첨가하고 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 셀라이트로 여과하고 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 실리카 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.095g, 18.59%)로서 제공하였다.
LC/MS: 745.4 [M+H]+.
tert-부틸 (3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)카바메이트( INX-SM-28-12 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤질)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-28-11)(0.095g, 0.127m㏖) 및 메탄올 (2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 탄산칼륨(0.027g, 0.191m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 EtOA로 희석시키고 H2O로 세척하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 농축시켜 조물질 표제 화합물 생성물을 황색 고체(0.085g, 95.2%)로서 얻었다. LCMS: 703.4 [M+H]+
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온( INX-SM-28 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)카바메이트(INX-SM-28-12)(0.085g, 0.121m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.1㎖)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 분취용 HPLC(칼럼: C18, 250*21.2㎜, 5㎛, 이동상 A=물 중 0.05% 트라이플루오로아세트산칼륨, B = 아세토나이트릴:메탄올:IPA(65:25:10), A:B = 65:35; 체류 시간 15.32분)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.005g, 6.86%)로서 얻었다. LC/MS: 603.3 [M+H]+
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온 (INX-SM-40) 의 합성
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤질)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-40-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 아세토나이트릴(40㎖) 중 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트 하이드로클로라이드(INX-SM-34-2)(0.4g, 0.93m㏖) 및 (4-(3-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤질)페닐)보론산(INX-SM-28-10)(1.07g, 3.27m㏖)을 충전하였다 이 용액에, KOH(0.52g, 9.36m㏖) 및 Cu(OAc)2(0.50g, 2.81m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트로 여과하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.1g, 15.8%)로서 제공하였다. LCMS: 709.5 [M+H]+.
tert-부틸 (4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)카바메이트( INX-SM-40-2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤질)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-40-1) (0.13g, 0.18m㏖) 및 메탄올:물(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(0.030g, 0.36m㏖)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트로 여과하였다. 합한 유기 층을 증발시켜 조물질 INX-SM-40-2 생성물을 회백색 고체(0.06 g 49.98%)로서 제공하였다. MS: 667.4 [M+H]+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온( INX-SM-40 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)카바메이트(INX-SM-40-2)(0.06g, 0.08m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.12㎖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 66:34, 체류 시간 14.5분)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.004g, 8.82%)로서 제공하였다. LCMS: 567 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD: δ: 7.48(d, J=10Hz, 1H), 7.39(t, J=8.0Hz, 1H), 7.25(d, J=7.6Hz, 1H), 7.11(d, J=7.6Hz 1H), 7.06(s, 1H), 7.03(d, J=8.4Hz, 2H), 6.62(d, J=8.4Hz, 2H), 6.26(dd, J= 10.0 & 2.0Hz, 1H), 5.99(s, 1H), 4.60-4.30(m, 3H), 3.91(s, 2H), 3.60-3.00(m, 4H), 2.70-1.55(m, 10H), 1.50(s, 3H), 1.10(s, 3H), 1.10-0.95(m, 2H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-아자스피로[3.3]헵탄-6-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-47) 의 합성
tert-부틸 (E)-6-((2-토실하이드라조노)메틸)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트( INX-SM-47-1 )의 합성
절차:
질소 분위기 하에서 35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 6-폼일-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트(0.2g, 0.880m㏖) 및 EtOH(10㎖)를 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드(0.247g, 1.33m㏖) 및 촉매 AcOH(0.1㎖)를 첨가하고, 0.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 고체 침전물을 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(0.3g, 85.88%)로서 제공하였다. LCMS: 394.2 [M+H]+.
tert-부틸 6-(4-폼일벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트( INX-SM-47-2 )의 합성
절차:
질소 분위기 하에서 35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 (E)-6-((2-토실하이드라조노)메틸)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트(INX-SM-47-1)(0.3g, 0.762m㏖) 및 다이옥산(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 100℃에서 (4-폼일페닐)보론산(0.171g, 1.14m㏖) 및 K2CO3(0.158g, 1.14m㏖)를 실온에서 첨가하고 추가로 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 검 같은 고체(0.065g, 27.86%)로서 제공하였다. LCMS: 316.2 [M+H]+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-아자스피로[3.3]헵탄-6-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-47 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 6-(4-폼일벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-카복실레이트(INX-SM-47-2)(0.065g, 0.206m㏖), (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.077g, 0.206m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.103g, 1.03m㏖) 및 HClO4(0.123g, 1.03m㏖)를 첨가하고, 추가로 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 차가운 물로 배산처리하고 침전물을 여과하고 진공 하에서 건조시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-PACK ODS-AQ Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴:메탄올:2-프로판올(65:25:10), A:B = 58:42, 체류 시간 12.23분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.025g, 17.77%)로서 제공하였다. LCMS: 574.5 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): : □7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.37(d, J=8.0Hz, 2H), 7.18(d, J=8.4Hz, 2H), 6.27(dd, J=10.0& 2.0 Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.46(s, 아세탈 H, 1H), 5.07(d, J=5.2Hz,C16-H 1H), 4.63 (d,J=19.6Hz, 1H), 4.45-4.44(s, 1H), 4.33(d, J=19.6Hz 1H), 4.07(s, 2H), 3.95(s, 2H), 2.75-1.73(m, 16H), 1.50(s, 3H), 1.05-1.05(m, 2H), 1.01(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일)-5-옥소펜탄산( INX-A19) 의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS, 12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A19-1 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DMF(6㎖) 중 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.605g, 1.25m㏖) 및 HATU(0.596g, 1.56m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.405g, 3.13m㏖), 그 다음 6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-아자스피로[3.3]헵탄-6-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-47)(0.6g, 1.04m㏖)을 실온에서 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(ACN:물, 70:30)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.20g, 18.42%)로서 제공하였다. LCMS:1038.8 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A19-2 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A19-1)(0.2g, 0.192m㏖) 및 THF(2㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸아민(0.140g, 1.92m㏖)을 첨가하고, 2.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 DCM 및 헥산으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.12g, 76.34%)로서 제공하였다. LCMS:816.6 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A19-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A19-2)(0.120g, 0.147m㏖) 및 DCM(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.1㎖)에 용해된 Na2CO3(0.031g, 0.294m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.029g, 0.147m㏖)를 실온에서 첨가하고 0.5시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.095g, 68.95%)로서 제공하였다. LCMS: C48H6379BrFN3O11에 대한 계산치 (936.36), 실측치 936.4[M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일)-5-옥소펜탄산( INX-A19 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(3㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)-2-아자스피로[3.3]헵탄-2-일)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A19-3)(0.095g, 0.101m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.2㎖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: NEW X-bridge Prep, C18, OBD (250×19)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = ACN, A:B = 68: 32, 체류 시간 13.59분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.006g, 6.72%)로서 제공하였다. LCMS: C44H5579BrFN3O11에 대한 계산치 (880.3), 실측치 880.2[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.36(d, J=7.6Hz, 2H), 7.20-7.17(m, 2H), 6.27(dd, J=10.0 & 2.0Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.45(s, 1H), 5.06(d, J=5.2Hz, 1H), 5.00-3.80(m, 12H), 2.75-1.65(m, 20H), 1.51(s, 3H), 1.18-1.05(m, 2H), 1.03 (s, 3H).
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1r,4R)-4-아미노사이클로헥실)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온( INX-SM-14 의 합성)
tert-부틸 ((1r,4r)-4-(하이드록시메틸)사이클로헥실)카바메이트( INX-SM-14-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에서, (1r,4r)-4-((tert-부톡시카보닐)아미노)사이클로헥산-1-카복실산(3.0g, 12.34m㏖)을 THF(30㎖)에 용해시키고 보란 다이메틸 설파이드(BH3.DMS)(3.0㎖, 6.17m㏖)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 묽은으로 반응정지시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 백색 고체(3.0g, 조물질)로서 제공하였다. 이것을 정제시키지 않고 다음 단계에 사용하였다. LCMS: 230.2 [M+H]+.
tert-부틸 ((1r,4r)-4-폼일사이클로헥실)카바메이트( INX-SM-14-2 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에서, DCM(30㎖) 중 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(하이드록시메틸)사이클로헥실)카바메이트(INX-SM-14-1)(3.0g, 13.08m㏖)용액을 첨가하였다. 이 용액에, DMP(6.6g, 15.72m㏖)를 0℃에서 첨가하고 추가로 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 조물질 표제 화합물을 백색 고체(3.0g)로서 제공하였다. 이것을 분석 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.
tert-부틸 ((1r,4r)-4-((E)-(2-토실하이드라조노)메틸)사이클로헥실) 카바메이트( INX-SM-14-3 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((1r,4r)-4-폼일사이클로헥실)카바메이트(INX-SM-14-2)(3.0g, 13.21m㏖) 및 에탄올(30㎖)을 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드 (3.6g, 19.82m㏖) 및 촉매량의 AcOH(0.1㎖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 형성된 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 백색 고체(3.5g, 67.05%)로서 제공하였다. LCMS: 396.2 [M+H]+.
tert-부틸 ((1r,4r)-4-(4-폼일벤질)사이클로헥실)카바메이트( INX-SM-14-4 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((1r,4r)-4-((E)-(2-토실하이드라조노)메틸)사이클로헥실)카바메이트(INX-SM-14-3)(2.0g, 5.06m㏖) 및 다이옥산(20㎖)을 충전하였다. 이 용액에, K2CO3(1.0g, 7.50m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 N2로 20분 동안 퍼징하였다. 이 용액에, (4-폼일페닐)보론산(1.13g, 7.58m㏖)을 첨가하고, 추가로 2시간 동안 환류시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 황색 끈적이는 고체(0.6g, 37.38%)로서 제공하였다. LCMS: 318.3 [M+H]+.
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1r,4R)-4-아미노사이클로헥실)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-14 )의 합성
절차:
10㎖ 유리 바이알에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(4-폼일벤질)사이클로헥실)카바메이트(INX-SM-14-4)(0.10g, 0.31m㏖) 및 (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-다이플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(INX-SM-25-1)(0.13g, 0.31m㏖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.18g, 1.50m㏖) 및 HClO4(0.26g, 2.6m㏖)를 0℃에서 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B = 70:30, 체류 시간 15.92분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.015g, 7.78%)로서 제공하였다. LCMS: 612.3 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): □ 7.62 (brs, 3H), 7.35(d, J=8Hz, 2H), 7.27(d, J=9.6Hz, 1H), 7.18(d, J=8Hz, 2H), 6.30(dd, J=10Hz, 1H), 6.13(s, 1H), 5.70-5.60(m, 1H), 5.56(br s, 1H), 5. 5.46(s, 아세탈-H, 1H), 5.14(t, 1H), 5.09(d, J=4.4Hz, C16-H, 1H), 4.53-4.48(m, 1H), 4,24-4.18(m, 2H), 2.94-2.88(m, 1H), 2.60-1.40(m, 15H), 1.45(s, 3H), 1.23-0.98(m, 4H), 0.87(s, 3H).
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1s,4S)-4-아미노사이클로헥실)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 (INX-SM-15) 의 합성
tert-부틸 ((1s, 4s)-4-하이드록시메틸) 사이클로헥실) 카바메이트( INX-SM-15-1 )의 합성
절차:
50㎖ 둥근 바닥 플라스크에 (1s,4s)-4-((tert-부톡시카보닐)아미노)사이클로헥산-1-카복실산(2.5g, 10.28m㏖) 및 THF(25㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 보라.DMS(THF 중 2M)(12.34㎖, 30.60m㏖)를 0℃에서 첨가하고 추가로 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 MeOH 및 묽은 HCl로 반응정지시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(2.3g, 97.61%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 6.67 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 4.35 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 3.44 (br s, 1H), 3.25 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 1.50-1.43 (m, 19H).
tert-부틸 ((1s, 4s)-4-폼일사이클로헥실) 카바메이트( INX-SM-15-2 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((1s, 4s)-4-하이드록시메틸) 사이클로헥실) 카바메이트(INX-SM-15-1)(2.3g, 10.03m㏖) 및 DCM(25㎖)을 충전하였다. 이 용액에, DMP(6.4g, 15.09m㏖)를 실온에서 첨가하고 추가로 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 연한 황색 검 같은 고체(2.3 g 조물질)로서 제공하였다. 이것을 분석 없이 다음 단계에 사용하였다.
tert-부틸 ((1s,4s)-4-((E)-(2-토실하이드라조노)메틸)사이클로헥실) 카바메이트( INX-SM-15-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((1s, 4s)-4-폼일사이클로헥실) 카바메이트(INX-SM-15-2)(2.3g, 10.12m㏖) 및 EtOH(25㎖)을 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드(1.88g, 10.12m㏖) 및 아세트산(촉매)을 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 1:1)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(2.5g, 62.47%)로서 제공하였다. LCMS: 394.4 [M-H]+.
tert-부틸 ((1s, 4s)-4-(4-폼일벤질) 사이클로헥실) 카바메이트( INX-SM-15-4 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((1s,4s)-4-((E)-(2-토실하이드라조노)메틸)사이클로헥실)카바메이트(INX-SM-15-3)(0.85g, 2.15m㏖) 및 다이옥산(10㎖)을 충전하였다. 이 용액에, (4-폼일페닐)보론산(0.30g, 2.02m㏖) 및 K2CO3(0.45g, 3.23m㏖)을 첨가하고, 추가로 2시간 동안 100℃에서 환류시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 1:1)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 검 같은 고체(0.15g, 21.99%)로서 제공하였다. LCMS: 318.3 [M+H]+.
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1s,4S)-4-아미노사이클로헥실)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-15 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 ((1s,4s)-4-(4-폼일벤질)사이클로헥실)카바메이트(INX-SM-15-4)(0.15g, 0.47m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-다이플루오로-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(INX-SM-25-1)(0.15g, 0.37m㏖), MgSO4(0.28g 2.36m㏖) 및 HClO4(0.23g, 2.36m㏖)를 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 NaHCO3로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: NEW X-bridge Prep, C18, OBD (250×19)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴; A:B = 80:20, 체류 시간 10.00분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.030g, 10.38%)로서 제공하였다. LCMS: 612.2 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): □: 7.69(br s, 3H), 7.36(d, J=10.0, 2H), 7.28(d, J=10.2, 1H), 7.19(d, J=10.0, 2H), 6.30(dd, J=10.0 & 2.0Hz, 2H), 5.74-5.60(m, 2H), 5.56(br s, 1H), 5.46 (s, 아세탈-H, 1H), 5.14(t, J=6.0, 1H), 4.96(d, J=4.4Hz, C16-H, 1H), 4.65-4.20(m, 3H), 3.25-3.10(m, 1H), 2.62-2.1.60(m, 12H), 1.50(s, 3H), 1.46-1.30(m, 4H), 1.20 (s, 3H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)벤질)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온( INX-SM-17) 의 합성식
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((tert-부톡시카보닐) 아미노)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)벤질)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a, 6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b (2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트 카바메이트( INX-SM-17-1 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 다이옥산(5㎖) 중 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-34-2)(0.5g, 1.17m㏖) 및 tert-부틸 (3-(4-폼일벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(0.352g, 1.17m㏖)(INX-SM-3-5)를 충전하였다. 이 용액에, AcOH(0.070g, 1.16m㏖) 및 NaCNBH3(0.088g, 1.4m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, EtOAC로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트, 30:70)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.1g, 12%)로서 제공하였다. LCMS: 713.7 [M+H]+.
tert-부틸 (3-(4-(((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)메틸)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트( INX-SM-17-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((tert-부톡시카보닐)아미노)바이사이클로[1.1.1] 펜탄-1-일)메틸)벤질)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a, 12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트카바메이트(INX-SM-17-1)(0.1g, 0.14m㏖) 및 메탄올(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(0.023g, 0.28m㏖)를 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트로 여과하였다. 합한 유기 층을 농축시켜 조물질 표제 화합물 생성물을 회백색 고체(0.080g, 85.01%)로서 제공하였다. LCMS: 671.5 [M+H]+.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)벤질)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-17 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-(((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)메틸)벤질)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)카바메이트(INX-SM-17-2)(0.080 g) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(1㎖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터 및 n-펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 백색 고체(0.070g, 정량적)로서 제공하였다. LCMS: 571.4 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ:7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.42(d, J=8.0Hz, 2H), 7.25(d, J=10.0Hz, 2H), 6.28(d, J=9.2Hz, 1H), 6.05(s, 1H), 4.48-4.26(m, 5H), 3.87-3.77(m, 2H),3.60-3.20(m, 2H), 2.96(s, 2H), 2.90-2.60(m, 2H), 2.50-2.00(m, 4H), 1.89(s, 6H), 1.70-1.55(m, 2H), 1.51(s, 3H), 1.30-1.19(m, 3H), 1.07(s, 3H)
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A29) 의 합성
2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-29-A-1 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-((tert-부톡시카보닐)아미노)벤질)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로 나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-40-1)(0.38g, 0.53m㏖) 및 DCM(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(1.2㎖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 배산처리하여 표제 화합물을 회백색 고체(0.22g, 67.42%)로서 제공하였다. LCMS: 609.4 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-29-A-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-( ( ( (9H-플루오렌-9-일) 메톡시) 카보닐) 아미노) 아세트아미도) -5- (tert-부톡시) -5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.39g, 0.85m㏖), 2-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-10-(4-(3-아미노벤질)페닐)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 9, 10, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-29A-1)(0.5g, 0.85m㏖) 및 DMF(2㎖)를 충전하였다. 이 용액에, DIPEA(0.26g, 2.05m㏖) 및 HATU(0.37g, 0.98m㏖)를 첨가하고, 15분 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 회백색 고체(0.26g, 29.47%)로서 제공하였다. LCMS 1073.9 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)아미노)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트( INX-29-A-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((4-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토[2', 1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일) 벤질) 페닐) 아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-29-A-2)(0.26g, 0.24m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.17g, 2.4m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 다이에틸 에터 및 펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 회백색 고체(0.14g, 67.89%)로서 제공하였다, LCMS: 851 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)아미노)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트( INX-29-A-4 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-5-((3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토[2', 1':4, 5]인데노[1,2-c]피롤-10 (2H) -일) 벤질) 페닐) 아미노)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트(INX-29-A-3)(0.14g, 0.16m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(1㎖) 중 NaHCO3(0.04g, 0.49m㏖) 용액 및 브로모아세틸 브로마이드(0.05g, 0.24m㏖)를 실온에서 적가하고, 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.18g, 정량적)로서 제공하였다. LCMS: C51H6479BrFN4O10에 대한 계산치 (971.38), 실측치 971.80[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-29-A-5 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-5-((3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-8b-(2-아세톡시아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)아미노)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-옥소펜탄오에이트(INX-29-A-4)(0.18g, 0.18m㏖) 및 메탄올:H2O(9:1, 2㎖)를 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(0.03g, 0.37m㏖)를 첨가하고, 실온에서 6시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 합한 유기 층을 농축시켜 조물질 표제 화합물 생성물을 회백색 고체(0.17 g 98.71%)로서 제공하였다. LCMS: C49H6279BrFN4O9에 대한 계산치 (929.37), 실측치 929.70[M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,4,6a,6b,7,8,8a,8b,9,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10(2H)-일)벤질)페닐)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-29-A )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5] 인데노 [1,2-c] 피롤-10 (2H) -일) 벤질) 페닐) 아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-29-A-5)(0.17g, 0.18m㏖) 및 DCM(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.85㎖)를 실온에서 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용 HPLC(YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-5㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = CAN, A:B = 55:45, 체류 시간 14분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 제공하였다(0.025 g 15.65%). LCMS: C45H5479BrFN4O9에 대한 계산치 (873.31), 실측치 873.20 [M+H] +; 1H NMR (400 MHz, MeOD): □: 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.42-7.37(m, 2H), 7.20(d, J=8.0Hz, 1H), 7.03(d, J=8.4Hz, 2H), 6.93(d, J=7.2Hz, =1H), 6.64(d, J=8.4Hz, =2H), 6.26 (dd, J=10.0 & 1.6Hz, 1H), 5.99(s, 1H), 4.53-4.26(m, 4H), 3.93-3.92(m, 3H), 3.83(s, 2H), 3.57-2.98(m, 6H), 2.70-1.56(m, 12H), 1.50(s, 3H), 1.07(m, 5H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)벤조일)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,6a,6b,7,8,8a,8b,9,10,11,11a,12,12a,12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-4(2H)-온( INX-SM-16) 의 합성식
메틸 4-((3-((tert-부톡시카보닐) 아미노) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 메틸) 벤조에이트( INX-SM-16-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (E)-(3-((2-토실하이드라조노) 메틸) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 카바메이트(INX-SM-3-4)(1.0g, 2.64m㏖), 다이옥산(20㎖) 및 K2CO3(0.576g, 3.95m㏖)를 첨가하고 백색 ppt가 관찰될 때까지 N2(g)로 탈기시켰다. 4-(메톡시카보닐) 페닐) 보론산(0.75g, 3.95m㏖)을 첨가하고, 110 oC에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 조 생성물을 제공하였다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산:1:1)로 정제시켜 표제 화합물을 무색 액체(0.4g, 45.80%)로서 제공하였다. 1H NMR(CDCl3) δ: 7.97 (d, J= 8.4 Hz, 2H,), 7.18 (d, J=8 Hz, 2H), 4.89 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 2.89 (s, 2H), 1.83(s, 6H), 1.46(s, 9H).
4-((3-((tert-부톡시카보닐) 아미노) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 메틸) 벤조산( INX-SM-16-2 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 메틸 4-((3-((tert-부톡시카보닐) 아미노) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 메틸) 벤조에이트(INX-SM-16-1)(0.9g, 2.72m㏖) 및 THF: H2O (1:1, 6㎖)를 충전하였다. 이 용액에, LiOH.H2O(0.65g, 16.3m㏖)를 첨가하고, 50℃에서 5시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 10% MeOH:DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.8g, 92.82%)로서 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ: 12.56(brs, 1H) 7.85 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.41 (brs, 1H), 7.27 (d, J=8.4 Hz, 2H), 2.85 (s, 2H), 1.77 (s, 6H), 1.23 (s, 9H).
2-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-10-(4-((3-((tert-부톡시카보닐)아미노)바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)벤조일)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 9, 10, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5] 인데노 [1,2-c] 피롤-8b (2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트( INX-SM-16-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DMF(2㎖) 중 4-((3-((tert-부톡시카보닐) 아미노) 바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)벤조산(INX-SM-16-2)(0.18g, 0.56m㏖) 및 2-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-7-하이드록시-6a, 8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 9, 10, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-8b(2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-34-2)(0.29g, 0.68m㏖)를 충전하였다. 이 용액에 DIPEA(0.8g, 1.4m㏖) 및 HATU(0.32g, 0.85m㏖)를 실온에서 첨가하고 15분 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 회백색 고체(0.19g, 38.53%)로서 제공하였다. 조물질 표제 화합물을 다음 단계를 위해서 그대로 사용하였다. LCMS: 727.43 [M+H]+.
tert-부틸 (3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 2, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 10, 11, 11a, 12, 12a, 12b-헥사데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10-카보닐) 벤질) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 카바메이트( INX-SM-16-4 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 2-( (6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)- 10- (4- ((3-( (tert-부톡시카보닐) 아미노) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일)메틸)벤조일)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 9, 10, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토[2',1':4,5] 인데노 [1,2-c] 피롤-8b (2H)-일)-2-옥소에틸 아세테이트(INX-SM-16-3)(0.19g, 0.26m㏖) 및 메탄올(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, NaHCO3(0.04g, 0.53m㏖)를 첨가하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트층으로 여과하였다. 합한 유기 층을 농축시켜 표제 화합물 조 생성물을 회백색 고체(0.17g, 조물질)로서 제공하였다. LCMS: 585.29 [M+H-Boc]+.
(6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-10-(4-((3-아미노바이사이클로[1.1.1]펜탄-1-일)메틸)벤조일)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 10, 11, 11a, 12, 12a, 12b-테트라데카하이드로나프토 [2',1':4,5] 인데노 [1,2-c] 피롤-4(2H)-온( INX-SM-16 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1, 2, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 9, 10, 11, 11a, 12, 12a, 12b-헥사데카하이드로나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-c]피롤-10-카보닐) 벤질) 바이사이클로 [1.1.1] 펜탄-1-일) 카바메이트(INX-SM-16-4)(0.2g, 0.29m㏖) 및 DCM(1㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(60.4㎖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: NEW X-bridge Prep, C18, OBD (250×19)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴 + 5% 테트라하이드로퓨란 중 20% A 라인, A:B = 75:25)로 정제시켜 표제 화합물(0.02g 11.71%)을 제공하였다. LCMS: 585.50 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): □: 7.50-7.39(m, 3H), 7.23(d, J=7.6Hz, 2H), 7.30-7.27(m, 1H), 6.04(s, 1H), 4.57-3.54(m, 7H), 2.97(s, 2H), 2.80-2.00(m, 6H), 1.90(s, 6H), 1.89-1.60(m, 2H), 1.50(s, 3H), 1.45-1.12(m, 4H),1.10(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)(메틸)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A21 )의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)(메틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A21-1 )의 합성
절차:
실온에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.34g, 1.65m㏖), HATU(0.40, 1.05m㏖), DIPEA(0.18g, 1.41m㏖) 및 DMF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(4-((3-(메틸아미노)사이클로부틸)메틸)페닐)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-49)(0.39g, 0.7m㏖)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.3g, 42.10%)로서 제공하였다. LCMS: 1026.92 [M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)(메틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A21-2 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)(메틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A-21-1)(0.3g, 0.29m㏖) 및 THF(4100㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸아민(0.21g, 2.9m㏖)을 실온에서 첨가하고 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.18g, 76.59%)로서 제공하였다. LCMS: 804.41[M+H]+.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)(메틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A21-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)(메틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A21-2)(0.18g, 0.22m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 물(0.5㎖) 중 Na2CO3(0.046g, 0.44m㏖) 용액, 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.067g, 0.33m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.18g, 86.93%)로서 제공하였다. LCMS: C47H6379BrFN3O11에 대한 계산치 (924.36), 실측치 924.70[M+H]+.
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)(메틸)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A21 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로부틸)(메틸)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A21-3)(0.17g, 0.18m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.10g, 0.91m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.021g, 13.15%)로서 제공하였다; LCMS: C43H5579BrFN3O11에 대한 계산치 (868.30), 실측치 868.40[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.46(d, J=10.0Hz, 1H), 7.38-7.36(m, 2H), 7.23-19(m, 2H), 6.27(dd, J=10.0 & 2.0Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5,46(s, 아세탈-H, 1H), 5.07 (s, J=5.2Hz, C16-H, 1H), 5.04-5.00(m, 1H), 4.46-4.15(m, 4H), 3.95-3.89(m, 4H), 3.30-1.60(m, 23H), 1.52(s, 3H), 1.08-1.05(m, 2H)1.00(s, 3H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(4-((octa하이드로사이클로펜타[c]피롤-5-일)메틸)페닐)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트)( INX-SM-48 )의 합성
tert-부틸 5-(메톡시메틸렌)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트( INX-SM-48-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 5-옥소헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트(1.0g, 4.44m㏖), 포타슘 tert-부톡사이드(0.99g, 8.88m㏖) 및 THF(20㎖)를 충전하였다. 이 용액에, (메톡시메틸)트라이페닐포스포늄 클로라이드(2.74g, 7.99m㏖)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 염화암모늄 용액으로 희석시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.8g, 71.14%)로서 제공하였다, 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ: 5.98(s, 1H), 3.48(s, 3H), 3.41-3.37(m, 2H), 2.98-2.90(m, 2H), 2.59-2.53(m, 2H), 2.41-2.33(m, 2H), 2.04-1.96(m, 2H), 1.38(s, 9H).
tert-부틸 5-폼일헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트( INX-SM-48-2 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 아세톤(5㎖) 중 메틸 tert-부틸 5-(메톡시메틸렌)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트(INX-SM-48-1)(0.55g, 2.17m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, PTSA(0.41g, 2.17m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 수성 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 다이클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 검 같은 고체(0.45g, 95.28%)로서 제공하였다. 조물질을 어떠한 분석도 없이 다음 단계를 위해서 직접 사용하였다.
tert-부틸 (E)-5-((2-토실하이드라조노)메틸)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트( INX-SM-48-3 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 tert-부틸 5-폼일헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트(INX-SM-48-2)(0.45g, 1.88m㏖) 및 에탄올(5㎖)을 충전하였다. 이 용액에, p-톨루엔설폰하이드라자이드(0.38g, 2.06m㏖) 및 아세트산(촉매)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 생성된 백색 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물(0.58 g 75.69%)을 제공하였다. C20H30N3O4S에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 408.3임.
tert-부틸 5-(4-폼일벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트( INX-SM-48-4 ) 의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (E)-5-((2-토실하이드라조노)메틸)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트(INX-SM-48-3)(0.58g, 1.44m㏖) 및 다이옥산(10㎖)을 충전하였다. (4-폼일페닐) 보론산(0.21g,1.44m㏖) 및 K2CO3(0.29g, 2.16m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 110℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 무색 액체(0.17g, 35.8%)로서 제공하였다. C16H20NO3에 대한 LCMS [(M + H)-tBu]+ 실측치는 273.8임.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(4-((octa하이드로사이클로펜타[c]피롤-5-일)메틸)페닐)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-48 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 5-(4-폼일벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-카복실레이트(INX-SM-48-4)(0.16g, 0.485 m㏖) 및 (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(0.19g, 0.51m㏖)을 충전하였다. 이 용액에, MgSO4(0.30g, 2.55m㏖) 및 HClO4(0.25g, 2.55m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC AQUA (250×19)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 66:34, 체류 시간 8.78분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.040g, 11.74%)로서 제공하였다. C36H46NO6에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 588.5임; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ: 8.76(brs, 1H), 8.58(brs, 1H), 7.37-7.31(m, 3H), 7.22-7.16(m, 2H), 6.17(dd, J=1.6Hz 및 10.0 Hz, 1H), 5.94(s, 1H), 5.41(s, 아세탈-H, 1H), 5.12-5.10(m, 1H), 4.92(d, J=4.8Hz, C16-H, 1H), 4.82(brs, 1H), 4.53-4-47(m, 1H), 4.30(brs, 1H), 4.21-4.17(m, 1H), 3.20-3.00(m, 2H), 2.80-1.51(m, 20H), 1.38(s, 3H), 1.07-0.96(m, 2H), 0.87(s, 3H).
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-l)-5-옥소펜탄산( INX-A-20 )의 합성
tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A20-1 )의 합성
절차:
실온에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.53g, 1. 10m㏖), HATU(0.62, 1.64m㏖), DIPEA(0.28g, 2.19m㏖) 및 DMF(6㎖)를 충전하였다. 이 용액에, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-10-(4-((octa하이드로사이클로펜타[c]피롤-5-일)메틸)페닐)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트(INX-SM-48)(0.64g, 0.91m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.32g, 33.35%)로서 제공하였다. LCMS: C62H74N3O12에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 1052.5임.
tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A20-2 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(5-(4 ((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A20-1)(0.32g,0.30m㏖) 및 THF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸아민(0.22g, 3.04m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.24g, 96.4%)로서 제공하였다. C47H64N3O10에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 830.5임.
tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A20-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (4S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A20-2)(0.24g, 0.28m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 물(0.5㎖) 중 Na2CO3(0.058g, 0.56m㏖) 용액, 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.087g, 0.43m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.20g, 75.1%)로서 제공하였다. LCMS: C49H65 79BrN3O11에 대한 계산치 (950.38), 실측치 950.40[M+H]+
(4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-5-옥소펜탄산( INX-A20 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(5-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)헥사하이드로사이클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A20-3)(0.17g, 0.18m㏖) 및 DCM(2㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.10g, 0.91m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질 표제 화합물을 분취용-HPLC(new Xbridge Prep, C18, OBD 19 x 250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 90:10)로 정제시켜 생성물의 2개의 이성질체를 제공하였다.
Fr-1(체류 시간: 18분)(0.0092g, 5.75%, 백색 고체) LCMS: C45H57 79BrN3O11에 대한 계산치 (894.32), 실측치 894.5 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ:7.46(d, J=10.0Hz, 1H), 7.35(d, J=7.6Hz, 2H), 7.19(d, J=8.0Hz, 2H), 6.26(d, J=10Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.45(s, 1H, 아세탈-H), 5.05(d, J=5.2Hz, 1H), 4.76-4.44(m, 4H), 3.96-3.92(m, 4H), 3.80-3.40 (m, 4H), 2.80-1.60(m, 20H), 1.51(s, 3H), 1.31-1.05(m, 4H), 1.00(s, 3H).
Fr-2 (체류 시간: 19.5분)(0.0035g, 2.19%, 백색 고체). LCMS: C45H57 79BrN3O11에 대한 계산치 (894.3), 실측치 894.3 [M+H]+ ; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ:7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.36(d, J=7.6Hz, 2H), 7.21-7.20(m, 2H), 6.27(d, J=10Hz, 1H), 6.05(s, 1H), 5.44(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(d, J=5.2Hz, 1H), 4.80-4.30(m, 4H), 4.00-3.70(m, 4H), 3.65-1.5 (m, 26H), 1.54(s, 3H), 1.25-1.05(m, 2H), 1.00(s, 3H).
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A-28 )의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A-28-1 )의 합성
절차:
실온에서 10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.39g, 0.81m㏖) 및 HATU(0.37g, 0.924m㏖), DIPEA(0.26g, 0.82m㏖) 및 DMF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, tert-부틸 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR, 12aS,12bS)-10-(4-(((1s,4S)-4-아미노사이클로헥실)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토 [2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-15)(0.5g, 0.81m㏖)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연황색 고체(0.45g, 41.8%)로서 제공하였다. C61H72F2N3O12에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 1077.0 [M+1]+임.
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A-28-2 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A-28-1)(0.4g, 0.37m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸 아민(0.27g, 3.72m㏖)을 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 조물질을 다이에틸 에터 및 펜탄으로 배산처리하여 표제 화합물을 황색 고체(0.25g, 79.1%)로서 제공하였다. C46H62F2N3O10에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 854.8임.
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A-28-3 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A-28-2)(0.25g, 0.29m㏖) 및 DCM(4㎖)을 충전하였다. 이 용액에, 물(0.5㎖)에 용해된 Na2CO3(0.12g, 1.17m㏖), 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.117g, 0.58m㏖)를 반응 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 50:50)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.2g, 70.08%)로서 제공하였다. LCMS: C48H63 79BrF2N3O11에 대한 계산치 (974.36), 실측치 974.4[M+H]+
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS, 10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A-28 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(4㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((1S,4R)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A-28-3)(0.2g, 0.20m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.4㎖)을 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: X-bridge Prep, C18, OBD (250×19)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 65:35, 체류 시간 14.40분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.015g, 8.16%)로서 제공하였다. LCMS: C44H55 79BrF2N3O11에 대한 계산치 (918.30), 실측치 918.5[M+H]+; 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ: 7.45-7.36(m, 3H), 7.22-7.20(m, 2H), 6.40-6.35(m, 2H), 5.66-5.50(m, 1H, CH-F), 5.48(s, 1H, 아세탈-H), 5.07(d, J=4.4Hz, 1H), 4.66 (d, 1H), 4.43-4.30(m, 3H), 3.95(s, 2H), 3.92(s, 2H), 3.86(brs, 1H), 2.80-1.65(m, 17H), 1.55(s, 3H), 1.50-1.36(m, 6H), 1.01(s, 3H).
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-아미노사이클로헥실)옥시)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-18 )의 합성
tert-부틸 (4-하이드록시사이클로헥실)카바메이트( INX-SM-18-1 )의 합성
절차:
질소 하에서 100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (4-옥소사이클로헥실)카바메이트(5.0g, 23.43m㏖) 및 MeOH(50㎖)를 충전하였다. 이 용액에 NaBH4(7.43g, 117.16m㏖)를 0℃에서 나누어 첨가하고, 추가로 1시간 동안 0℃에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 희석시키고 1N HCl로 중성 pH로 조정하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물(4.8g, 95.10%)을 제공하였다. C11H22NO3에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 216.2임.
tert-부틸 (4-(4-폼일페녹시)사이클로헥실)카바메이트( INX-SM-18-2 )의 합성
절차:
질소 하에서 35㎖ 유리 바이알에 THF(10㎖) 중 tert-부틸 (4-하이드록시사이클로헥실)카바메이트(INX-SM-18-1)(1g, 4.64m㏖), 4-하이드록시벤즈알데하이드(0.680g, 5.57m㏖) 및 트라이페닐포스핀 (1.82g, 6.96m㏖)을 충전하였다. 이 용액에 DIAD(1.4g, 6.967m㏖)를 0 0 C에서 첨가하고 반응 혼합물을 65℃에서 16시간 동안 환류시켰다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 10% NaOH 용액으로 희석시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산, 80:20)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(1.0g, 67.40%)로서 제공하였다. C18H26NO4에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 320.2임.
(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-아미노사이클로헥실)옥시)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-18 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(10㎖) 중 tert-부틸 (4-(4-폼일페녹시)사이클로헥실)카바메이트(INX-SM-18-2)(1g, 3.13m㏖), (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-트라이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온(16-알파-하이드록시프레드니솔론)(1.17g, 3.13m㏖)을 충전하였다, 이 용액에, MgSO4(1.57g, 15.65m㏖) 및 HClO4(1.88g, 15.65m㏖)를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 반응정지시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질을 차가운 물로 배산처리하여 1.5g의 조물질 고체를 제공하였다. 조물질 일부(308 mg)를 분취용-HPLC(칼럼: SHIM-PACK-GIST C18 (2508 (250 X 20)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 70:30, 체류 시간 11.80분)로 정제시켜 0.019g의 표제 화합물을 제공하였고 이것은 백색 고체로서 0.092g(0.137m㏖, 4.38%)의 총 정제된 질량에 상응할 것이다. C34H43NO7에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 578.4임; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.47(d, J=10.0Hz, 1H), 7.40-7.36(m, 2H),6.98-6.92(m, 2H), 6.27(dd, J=1.6Hz, J=10.0Hz, 1H), 6.04(s, 1H), 5.43(m, 1H), 5.04(d, J=5.2Hz, 1H), 4.65(d, 1H), 4.44(brs, 1H), 4.36-4.30(m, 2H), 3.20(brs, 1H), 2.80-1.54(m, 15H), 1.49(s, 3H), 1.30-1.02(m, 4H), 1.00(s, 3H).
S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A27 )의 합성
tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A-27-1 )의 합성
절차:
실온에서 50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-2-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산(INX-P-4)(0.39g, 0.81m㏖), HATU(0.46, 1.2m㏖), DIPEA(0.20g, 1.62m㏖) 및 DMF(3㎖)를 충전하였다. 이 용액에, (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(((1r,4R)-4-아미노사이클로헥실)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-14)(0.49g, 0.81m㏖)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물: 60:40)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.50g, 57.48%)로서 제공하였다. LCMS: 1076.7 [M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A-27-2 )의 합성
절차:
50㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)아세트아미도)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A-27-1)(0.5g, 0.46m㏖) 및 THF(5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이에틸아민(0.32g, 4.6m㏖)을 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.3g, 75.61%)로서 제공하였다. LCMS: 854.64 [M+H]+
tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트( INX-A-27-3 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-아미노아세트아미도)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A-27-2)(0.3g, 0.35m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 물(0.5㎖) 중 Na2CO3(0.073g, 0.7m㏖) 용액, 그 다음 브로모아세틸 브로마이드(0.10g, 0.52m㏖)를 실온에서 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 물로 반응정지시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 다이에틸 에터로 배산처리하여 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.30g, 87.60%)로서 제공하였다. LCMS: C48H63 79BrF2N3O11에 대한 계산치 (974.36), 실측치 974.69 [M+H]+
(S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A-27 )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(2㎖) 중 tert-부틸 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-(((1R,4S)-4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜탄오에이트(INX-A-27-3)(0.15g, 0.15m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, TFA(0.087g, 0.76m㏖)를 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart Prep C18-S, 250 X 20㎜ S-10㎛, 12nm, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 60:40, 체류 시간 16.00분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.010g, 7.07%)로서 제공하였다, LCMS: C44H55 79BrF2N3O11에 대한 계산치 (918.30), 실측치 918.20 [M+H]+ ; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.37-7.33(m, 3H), 7.17(d, J=8.0Hz, 2H), 6.38-6.35(m, 2H), 5.66-5.50(m, 1H, CH-F), 5.48(s, 1H), 5.05(d, J=4.8Hz, 1H), 4.65(d, 1H), 4.37-4.31(m, 3H), 3.94 (s, 2H), 3.90(s, 2H), 3.60-3.50(m, 1H), 2.80-1.66(m, 18H), 1.62(s, 3H), 1.50-1.04(m, 5H), 1.00(s, 3H)
6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-아미늄 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-38 )의 합성
tert-부틸 (6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-38-1 )의 합성
절차:
실온에서 100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(INX-SM-32)(1.0g, 1.70m㏖), TEA(0.47㎖, 3.40m㏖) 및 DCM(10㎖)-MeOH(0.5㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이-tert-부틸다이카보네이트(0.74g, 3.40m㏖)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 직접 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 70:30)로 정제시켜 표제 화합물을 연한 황색 고체(0.25g, 21.36%)로서 제공하였다. C41H54NO8에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 688.5[M+H]+임.
tert-부틸 (6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트( INX-SM-38-2 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 DMF(0.5㎖) 중 tert-부틸 (6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-38-1)(0.25g, 0.36m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(0.254g, 3.63m㏖) 및 (tBuO)2PNEt2(2.42g, 8.73m㏖)를 첨가하고 실온에서 24시간 동안 교반하였다. -5 내지 0℃에서 과산화수소(2.5㎖)를 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 조물질을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴:물, 90:10)로 정제시켜 표제 화합물을 회백색 고체(0.18g, 56.81%)로서 제공하였다. C49H71NO11P에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 880.6 [M+H]+임.
6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-아미늄 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-38 )의 합성
절차:
25㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(4㎖) 중 tert-부틸 (6-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((다이-tert-부톡시포스포릴)옥시)아세틸)-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-38-2)(0.17g, 0.193m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, 0℃에서 TFA(0.17㎖)를 첨가하고 추가로 1시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: New X-bridge Prep, C18, OBD 19 x 250㎜, 5㎛ 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 72:28, 체류 시간 11.7분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.025g, 16.93%)로서 제공하였다. C36H47NO9P에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 668.4임; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.47(dd, J=10 & 2.0, 1H), 7.35(d, J=7.6Hz, 2H), 7.11(d, J=8.0Hz, 2H), 6.23 (d, 1H), 6.01(s, 1H), 5.52(s, 1H), 5.06 (d, J=4.8Hz, 1H), 5.00-4.70(m, 2H), 4 43(brs, 1H), 3.60-3.50(m, 1H), 1.80-1.60 (m, 20H), 1.51 (s, 3H),1.20-1.10(m,1H), 1.03(s, 3H), 1.00-0.95(m, 1H).
6-(4 ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-아미늄 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-21 )의 합성
다이-tert-부틸 (2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-일)-2-옥소에틸) 인산염(I NX-SM-21-1 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (2S, 6aS, 6bR, 7S, 8aS, 8bS, 11aR, 12aS, 12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a, 8a, 10, 10-테트라메틸-1, 2, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 8b, 11a, 12, 12a, 12b-도데카하이드로-4H-나프토 [2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(1.0g, 2.21m㏖), 다이-tert-부틸 N,N-다이아이소프로필포스포르아미다이트 (14.7g, 53.0m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 1H-테트라졸(1.5g, 22.1m㏖)을 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고 과산화수소(10 V)를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 실온에서 첨가하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 소듐 티오설페이트 용액에 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질 표제 화합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(아세토나이트릴/물)로 정제시켜 표제물(0.4g, 28.08%)을 제공하였다. C32H48F2O9P에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 645.3 [M+H]+임.
6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-아미늄 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-21 )의 합성
절차:
100㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 DCM(10㎖) 중 다이-tert-부틸 (2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1, 2, 4, 6a, 6b, 7, 8, 8a, 11a, 12, 12a, 12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5] 인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-일)-2-옥소에틸) 인산염(INX-SM-21-1)(0.2g, 0.31m㏖) 및 tert-부틸 (6-(4-폼일벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-32-4)(0.1g, 0.30m㏖)를 충전하였다. MgSO4(0.18g, 1.5m㏖) 및 HClO4(0.15g, 1.5m㏖)를 0℃에서 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액에 붓고 10% MeOH:DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: Shim-Pack Gist C18, 20X250㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 71:29, 체류 시간 16.5분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.033g, 15.6%)로서 제공하였다. C36H45F2NO9P에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 704.3임; 1H NMR (400 MHz, MeOD): □: 7.40-7.35(m, 3H), 7.15(d, J=7.6Hz, 2H), 6.37-6.34 (m, 2H), 5.67-5.52(m, 1H), 5.54(s, 1H, 아세탈-H), 5.07 (m, J=3.6Hz, 1H, C16-H), 4.95-4.72(m, 2H), 4.35-4.30(m, 1H), 3.70-3.58(m, 1H), 2.78-1.63(m, 19H), 1.61 (s, 3H), 1.03 (s, 3H).
(S)-4-(2-(2-(((R)-2-아미노-2-카복시에틸)티오)아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX A23-CYS )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a-다이메틸-4-옥소-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산(INX-A-23)(0.05g, 0.053m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, L-시스테인(0.009g, 0.074m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. LCMS로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 동결건조시키고, 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: NEW Xbridge Prep, C18, OBD 19 x 250㎜, 5㎛ 이동상: A= 물 중 0.1% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 67:33, 체류 시간 11.0분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.050g,15.98%)로서 제공하였다. C48H61F2N4O13S에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 971.6임; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.36-7.34(m, 3H), 7.16(d, J=8.0, 2H), 6.37-6.32(m, 2H), 5.70-5.48(m, 1H), 5.48(s, 1H, 아세탈-H), 5.08(d, J=4.0Hz, 1H), 4.65(d, 1H), 4.37-3.30(m, 3H), 4.13-4.09(m, 1H), 4.03-4.01(m, 1H), 3.92(s, 2H), 3.33(s, 2H), 3.30-3.27(m, 1H), 3.10-3.05(m, 1H), 2.80-1.64(m, 23H), 1.60(s, 3H), 0.92 (s, 3H).
(S)-4-(2-(2-(((R)-2-아미노-2-카복시에틸)티오)아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산( INX-A-12-CYS )의 합성
절차:
10㎖ 1구 둥근 바닥 플라스크에 (S)-4-(2-(2-브로모아세트아미도)아세트아미도)-5-((6-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-8b-(2-(포스포노옥시)아세틸)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-1H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-10-일)벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)아미노)-5-옥소펜탄산(INX-A-12)(0.2g, 0.19m㏖) 및 DMF(1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, L-시스테인(0.035g, 0.29m㏖)을 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 동결건조시키고, 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: 새로운 Xbridge Prep, C18, OBD 19 x 250㎜, 5㎛ 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 70:30, 체류 시간 11.2분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.025g, 12.02%)로서 제공하였다. C48H62F2N4O16PS에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 1052.4임; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ: 7.38-7.36(m, 3H), 7.15(d, J=8.0Hz, 2H), 6.38-6.34(m, 2H), 5.68-5.50(m, 1H, CH-F), 5.53(s, 1H, 아세탈-H), 5.05(d, J=4.0Hz, 1H), 5.00-4.83(m, 3H), 4.34-4.30(m, 2H), 4.20-4.08(m, 2H), 3.91(s, 2H), 3.43(s, 2H), 3.11-3.05(m, 1H), 2.80-1.72(m, 23H), 1.61(s, 3H), 1.03(s, 3H)
S-(사이아노메틸) (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카보티오에이트 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-11 )의 합성
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카복실산( INX-SM-11-1 )의 합성
절차:
250㎖ 둥근 바닥 플라스크에 1,4-다이옥산(80㎖) 중 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-8b-(2-하이드록시아세틸)-6a,8a,10,10-테트라메틸-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-4H-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-4-온(플루오시놀론 아세토나이드)(5.0g, 11.06m㏖)를 충전하였다. 이 용액에, H2O(20㎖) 중 HIO4(3.2g, 33.18m㏖)를 적가하고 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 트라이에틸아민으로 반응정지시키고 감압 하에서 농축시켰다 조물질을 2M 수성 NaOH 용액에 추가로 붓고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 수성 층을 1N HCl로 산성화시키고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축시켜 표제 화합물을 황색 고체(4.0g, 82.56%)로서 제공하였다. C23H29F2O6에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 439.2임.
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카복실 다이메틸카밤 티오무수물( INX-SM-11-2 )의 합성
절차:
100㎖ 둥근 바닥 플라스크에 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카복실산(INX-SM-11-1)(4.0g, 9.13m㏖) 및 아세톤:H2O(40:1㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 다이메틸카바모티오 클로라이드(2.24g, 18.26m㏖), TEA(3.9㎖, 27.39m㏖) 및 NaI(0.272g, 1.826m㏖)를 실온에서 첨가하고 16시간 동안 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 DMA로 희석시켜 그것을 투명한 용액으로 만들고 그 다음 급냉수에 부었다. 생성된 고체를 진공 하에서 여과하여 표제 화합물을 황색 고체로서 제공하였고 이것을 어떠한 추가 정제도 없이 다음 단계에 사용하였다(2.0g, 41.71%). C26H34F2NO6S에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 526.2임.
(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카보티오 S-산( INX-SM-11-3 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카복실 다이메틸카밤 티오무수물(INX-SM-11-2)(2.0g, 3.809m㏖) 및 DMA(20㎖)를 충전하였다. 이 용액에, 소듐 바이설파이드(2.13g, 38.095m㏖)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 1N HCl로 반응정지시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 표제 화합물을 황색 고체(0.500g, 28.91%)을 제공하였다. C23H29F2O5S에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 455.2임.
S-(사이아노메틸) (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카보티오에이트( INX-SM-11-4) 의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카보티오 S-산(INX-SM-11-3)(0.500g, 1.101m㏖) 및 1,4-다이옥산(5.0㎖)을 충전하였다. 이 용액에, TEA(0.3㎖, 2.20m㏖) 및 브로모아세토나이트릴(0.197g, 1.651m㏖)을 첨가하고, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 H2O에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축시켰다. 조물질을 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트: 헥산, 35:65)로 정제시켜 표제 화합물을 갈색 고체(0.17g, 31.31%)로서 제공하였다. C25H30F2NO5S에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 494.2임.
S-(사이아노메틸) (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-아미노스피로[3.3]헵탄-2-일)메틸)페닐)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a-다이메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카보티오에이트 2,2,2-트라이플루오로아세테이트( INX-SM-11 )의 합성
절차:
35㎖ 유리 바이알에 S-(사이아노메틸) (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-다이플루오로-7-하이드록시-6a,8a,10,10-테트라메틸-4-옥소-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-도데카하이드로-8bH-나프토[2',1':4,5]인데노[1,2-d][1,3]다이옥솔-8b-카보티오에이트(INX-SM-11-4)(0.15g, 0.30m㏖) 및 DCM(3㎖)을 충전하였다. 이 용액에, tert-부틸 (6-(4-폼일벤질)스피로[3.3]헵탄-2-일)카바메이트(INX-SM-32-4)(0.100g, 0.30m㏖), MgSO4(0.183g, 1.52m㏖) 및 HClO4(0.152g, 1.520m㏖)를 첨가하고, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 확인된 바와 같은 반응 완결 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시키고, 포화 NaHCO3로 반응정지시켰다. 고체를 여과하고 조물질을 분취용-HPLC(칼럼: SHIM-PACK-GIST C18 (2508 (250 X 20)㎜, 5㎛, 이동상: A = 물 중 0.05% TFA, B = 아세토나이트릴, A:B = 49:51, 체류 시간 16.50분)로 정제시켜 표제 화합물을 백색 고체(0.010g, 4.37%)로서 제공하였다. C37H43F2N2O5S에 대한 LCMS [M + H]+ 실측치는 665.5임; 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ: 7.38-7.33(m, 3H), 7.19 (d, J=8.0Hz, 2H), 6.37-6.31(m, 2H), 5.67-5.50(m, 2H), 5.01(d, 1H), 4.35-4.25(m, 1H), 3.90(dd, J= 16.8Hz, 2H), 3.61--3.59(m, 1H), 2.70-1.67 (m, 19H), 1.59(s, 3H), 1.12(s, 3H).
실시예 4 : 생리 pH에서 항-VISTA 항체의 결합 및 내재화의 비교
먼저 VISTA 항체가 잠재적으로 효과적으로 스테로이드 또는 다른 페이로드를 표적 면역 세포로 전달할 것인지를 평가하기 위해서, 상이한 항-VISTA 항체의 인간 단핵구로의 내재화를 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 구체적으로, 인간 단핵구에서 네이키드 항-인간 VISTA 항체(각각 INX200, 767 IgG1,3(도 12의 항체 서열))의 결합 및 내재화를 비교하였다. VISTA는 대부분의 조혈 세포, 특히 골수 세포에서 높게 발현된다. 본 발명자들은 관련 세포 유형에 대한 높은 밀도 및 선택성과 조합된 신속한 내재화가 VISTA를 항-염증 항체 약물 접합체(ADC)의 이상적인 표적으로 만들 수 있다고 추측하였다.
항-EGFR 항체에 대한 약물 접합체는 EGFR에 결합된 항체가 표적 세포로 신속하게 내재화되기 때문에 광범위하게 연구되었다. 문헌은 내재화율을 결정하기 위한 강력한 방법을 자세히 설명한다. 예를 들어, EGFR-발현 세포주에서, EGFR에 대한 LA22 mAb는 37℃에서 10분 이내에 최대 내재화 수준 65.8%에 도달한 반면(Liu, Z., et al., (2009), "In-vitro internalization and in-vivo tumor uptake of anti-EGFR monoclonal antibody LA22 in A549 lung cancer cells and animal model", Cancer Biother Radiopharm, 15-20), Ab033은 15분에 54% 내재화를 나타내었다(Durbin, K. R. et al., 2018, "Mechanistic Modeling of Antibody-Drug Conjugate Internalization at the Cellproton assignmentular Level Reveals Inefficient Processing Steps", Mol Cancer Ther, 1535-7163).
본 연구의 목적은 인간 단핵구에서 항-VISTA 단클론성 항체 INX200의 내재화율을 평가하고 Five Prime Therapeutics 및 Bristol-Myers Squibb Company가 개발한 향상된 혈청 PK 반감기를 갖는 pH 감응성 항-인간 VISTA와 비교하여 767-IgG1,3의 내재화 특성을 추가로 평가하는 것이었다(Johnston, R. J. et al., (2019), "VISTA is an acidic pH-selective ligand for PSGL-1", Nature,　574(7779), 565-570).
물질 및 방법
본 실험에서 항-VISTA 항체 INX200 및 767-IgG1,3의 (새로 단리된 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMCS로부터의) 인간 단핵구에 대한 결합 곡선을 먼저 결정하였다. 두 번째로, 인간 단핵구에 대한 이들 상이한 항체의 내재화율을 비-내재화 항체 항-CD45를 음성 대조군으로 사용하여 정의하였다. 간략하면, 내재화된 항체만을 검출하기 위해서, 먼저 세포를 형광 표지된 항체와 함께 내재화가 거의 또는 전혀 일어나지 않는 온도인 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고 25℃에서 인큐베이션시켜 내재화를 허용하였다. 그런 다음 세포 표면 신호를 등량의 항-AF488 항체를 사용하여 다양한 시점에서 켄칭하였다. 이어서, PBMCS를 항-CD14 항체로 염색하여 단핵구를 확인하고 유세포 분석법으로 분석하였다.
시험 작용제 및 투여량
Figure pct00681
INX200(Aragen, 로트 번호 BP-2875-019-6.1)은 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
인간 IgG1si(BioXcell ref, 로트 번호 659518N1)는 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격을 갖는 항-RSV(호흡기 세포융합 바이러스) 항체이다.
767-IgG1,3(Aragen, 로트 번호 BP-2985-019-6)은 Fc 영역에 L234A/L235E/G237A　침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 Five Prime Therapeutics 및 Bristol-Myers Squibb Company에서 개발된 항-인간 VISTA 항체이다. 이 항체는 낮은 pH(예를 들어, pH 6)에서는 결합하지만 생리 pH(pH 7.4)에서는 최소 결합을 갖도록 설계되었으며, 그 결과 다른 항-VISTA 항체와 같이 TMDD를 거치지 않아 향상된 혈청 PK 반감기를 보유한다. 이 항체는 출원 WO2018169993A1에 기재된 바와 같이 제조되었다. 항체의 pH 감응성 거동을 ELISA 포맷을 통해 확인하였다. 간략하면 767-IgG1,3 또는 INX200을 플레이트 결합시키고 BSA를 포함하는 시트르산/트윈 완충액으로 희석한 hIX50-바이오틴(VISTA ECD)을 pH 6.1, 6.7 또는 7.5에서 적정하고 스트렙타비딘-HRP 접합체/TMB 판독을 사용하여 검출하였다. 가장 큰 INX200 결합이 pH 7.5에서 관찰된 반면, 767-IgG1,3의 최소 결합은 pH 7.5에서 관찰되었으며, 결합 수준은 pH 6.7에서 증가되었고, pH 6.1에서는 훨씬 더 증가되었다.
CD45, 클론 HI30은 항-인간 CD45 단클론성 항체이다.
Anti-Alexa Fluor 488(AF488) 다클론성 항체(Life Technologies, #A-11094)는 AF488 형광 신호를 켄칭시키는 데 사용되는 항 Alexa Fluor 488 항체이다.
항-AF488을 제외한 모든 항체는 표지 및 정제에 대한 제조사의 지침(Invitrogen Cat#A10235)에 따라 AF488과 접합되었다. 달리 언급하지 않는 한, 항체는 1% BSA를 함유하는 RPMI 배지에 희석하였다.
PBMC 제조
인간 PBMC는 Dartmouth Hitchcock Medical Center의 혈액 공여자 프로그램에서 건강한 비혈연 인간 공여자로부터 얻은 성분채집 콘으로부터 멸균 조건 하에서 단리시켰다 혈액을 50㎖ Falcon 튜브로 옮기고 PBS로 30㎖로 희석시켰다. 13㎖의 Histopaque 1077(Sigma Aldrich)을 혈액 아래에 겹쳐 두고 튜브를 실온에서 20분 동안 850×g에서 약간의 가속 및 제동 없이 원심분리시켰다. 단핵 세포를 혈장/Ficoll 계면에서 수집하고 50㎖의 PBS에 재현탁시키고 300×g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포를 PBS에 재현탁시킨 다음 계수하였다.
항체의 형광 표지
표지 및 정제에 대한 제조사의 지침(Invitrogen Cat#A10235)에 따라 항-인간 VISTA 항체 및 huIgG1si를 Alexa Fluor 488 염료와 접합시켰다. 농도 및 표지 정도는 Nanodrop을 통해 평가하였다. 표지 정도는 INX200이 5.9, 767 IgG1,3이 7.1이었다. AF488(Biolegend, # 304017)에 접합된 항-인간 CD45(클론 H130) 및 APC(클론 M5E2, Biolegend, # 301808)에 접합된 항-CD14를 그대로 사용하였다.
항체 결합의 분석
PBMC를 인간 Fc 차단 시약(eBioscience, 14-9161-73)을 함유하는 RPMI/1% BSA 완충액에 5×106개 세포/㎖로 재현탁시키고, 이어서 50㎕/웰의 세포를 96-웰 플레이트에 분포시켰다. 항-인간 VISTA 항체를 RPMI/1% BSA 완충액에서 333nM(50㎍/㎖)부터 시작하여 2x 희석 시리즈(10개 농도)로 제조하였다. PBMCS를 내재화를 제한하기 위해 얼음에서 30분 동안 염색하고, PBS로 2회 세척하고, 4℃에서 10분 동안 PBS 중 2% FA로 고정시켰다. 단핵구를 RT에서 20분 동안 PBS/0.2% BSA에서 1:400(v/v)의 항-CD14 mAb로 표지하였다. 세포를 세척하고 분석을 위해 Macsquant(Miltenyi) 유세포 분석기 및 FlowJo를 사용하여 FACS로 분석하였다. 모든 그래프는 GraphPad(Prism)로 작성되었다.
항체 내재화의 분석
5 x106개의 PBMC를 인간 Fc 차단 시약(eBioscience, 14-9161-73)을 함유하는 RPMI/1% BSA 완충액에서 1㎖에 재현탁시키고, 항-인간 VISTA mAb와 133nM(20㎍/㎖)에서 30분 동안 얼음에서 인큐베이션시켰다. 세포를 3㎖의 얼음 냉각된 PBS로 세척하고 515 x g에서 2분 동안 원심분리시켰다. PBMCS를 1.25㎖의 새로운 RPMI/1% BSA에 재현탁시키고 실온에 두었다. 내재화를 늦추면 강력한 곡선을 생성할 수 있다. 각각의 시점에서, 50㎕의 세포를 50㎕ RPMI/1% BSA 및 항-CD14 APC를 함유하는 96웰 플레이트로 옮겨 결합된 총 항체를 측정하였다. 후속 내재화를 차단하기 위해 세포를 얼음에 유지시켰다.
이어서, 50㎕의 세포를 50㎕ RPMI/1% BSA, 표면 결합 항체의 형광을 켄칭시키기 위한 266nM(40㎍/㎖)의 항-AF488 항체 및 단핵구를 표지하기 위한 항-CD14 APC를 함유하는 96웰 플레이트로 옮겼다. 후속 내재화를 차단하기 위해 세포를 얼음에 유지시켰다. 샘플을 기술적 중복물로 수집하고 그 다음 항체 내재화를 최대 60분 동안 수행하였다. 시간 경과 마지막에 모든 샘플을 PBS로 세척하고 4℃에서 10분 동안 PBS 중 2% FA로 고정시켰다. PBS에서 마지막으로 세척한 후, 분석을 위해 Macsquant(Miltenyi) 유세포 분석기 및 FlowJo를 사용하여 FACS로 세포를 분석하였다. 항-VISTA 또는 CD45 mAb의 중간 형광 강도(MFI)를 측정하고 데이터를 플로팅하였다.
미처리 세포의 배경 형광을 차감하고 MFI 값을 시간 = 0에서 MFI로 정규화하여 세포내 분율을 계산하였다. 내재화율은 각각의 시점에서 총 세포 연관 형광에 대한 세포내 신호의 분율로 계산하였고(아래 방정식 참조), 100%로 정규화하였다(Liao-Chan, S. et al., (2015), "Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores", PLoS One, 10(4): e012470).
N 1 - 각각의 시점(t1)에 켄칭되지 않은 MFI
O 1 - 각각의 시점(t1)에 켄칭된 MFI
N 0 - 0분(t0)에 켄칭되지 않은 MFI
Q 0 - 0분(t0)에 샘플에 대한 켄칭된 MFI
네이키드 항-VISTA 항체(INX200 , 767-IgG1 , 3)의 결합
도 13의 본 실험에서 중간 형광 강도를 시험된 항체의 연속 희석물(0 내지 333nM)과 함께 인큐베이션된 단핵구에 대해서 측정하였고; 흑색 파선은 염색되지 않은 세포의 자가 형광에 상응한다; n=1. 각각의 농도에서 단일 측정을 수행하였다. 7.3의 생리 pH에서 거기에 나타난 바와 같이, INX200은 CD14+ PBMCS에 대해서 시험된 범위(0 내지 333nM) 내에서 농도 의존적 형광 증가를 나타내었다(도 13 참조). 대조적으로, 세포가 767-IgG1,3 항체와 함께 인큐베이션되었을 때 어떠한 신호도 검출되지 않았다. 이것은 이전에 ELISA 포맷으로 확인된 낮은 pH에서의 결합에 대한 선택성으로 인한 것이라고 예상되었다. 비특이적 결합 수준을 평가하기 위해 사용된 인간 IgG1si 항체는 높은 항체 농도에서도 결합이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 나타났다.
항-인간 VISTA 항체의 내재화
도 14는 항-VISTA 항체의 내재화 분율을 나타낸다. 이들 실험에서, 세포 결합 항체의 세포내 풀을 60분의 시간 경과에 걸쳐서 플로팅하고; 각각의 지점에 대해서 형광을 시간 0분에서 INX200의 형광으로 정규화하였다; 평균±SD n=2 공여자. 항체의 내재화 분율을 비교하기 위해서, 각각의 시점에서의 MFI 값을 미처리 단핵구의 MFI를 차감하여 배경 형광에 대해 보정하고 t=0 시점에서 INX200의 총 MFI로 정규화하였다(도 14). 도 13에 나타낸 데이터와 일치하게, t=0에서 767-IgG1,3은 INX200에 비해 3.2%±4.5%로 약한 결합을 나타내었다(도 14).
여기에 나타난 바와 같이 인간 IgG1si 염색으로 표현되는 비특이적 신호는 0분에 5.9%로 평가되었다. 세포가 INX200과 함께 인큐베이션되었을 때 시간 경과에 따라 세포내 신호의 명확한 증가가 관찰되었으며, 60분까지 세포내 분율은 70.4%±9.2%였다. MFI 값은 시간 경과의 40분에 정체기에 도달하였다. 대조적으로, 767-IgG1,3의 5.3%±7.5%만 60분에 내부 분율로 검출되었다. 인간 IgG1si의 세포내 신호는 시간 경과 기간 동안 5 내지 6% 이내였다.
추가로, 도 15에서 INX200 항체의 내재화 비율이 60분 시간 경과에 걸쳐 단핵구에서 평가되고 항-CD45 항체인 HI30과 비교되는 또 다른 실험을 수행하였다. 거기에 나타난 바와 같이 항-CD45 항체는 어떠한 시점에서도 내재화되지 않았다; 평균±SD, n=2 공여자로 나타냄. 대조적으로 INX200은 20분까지 세포내에서 검출된 표면 항체의 절반이 효율적으로 내재화되었다(도 15). 또한, 40분 이내에 INX200의 64.5%±11.2%가 단핵구에 내재화되었다. 대조적으로, 항-CD45 mAb의 내재화는 시험된 모든 시점에서 관찰되지 않았다.
데이터는 항-인간 VISTA INX200이 높은 친화도로 결합하고 40분에 64%의 최대 내재화 수준으로 내재화됨을 나타낸다. 이는 VISTA가 항-염증 페이로드를 면역 세포에 전달하는 데 고유하게 적합한 표적임을 강력히 시사하는데, 그 이유는 이러한 결과가 대부분의 페이로드가 상대적으로 짧은 시간 내에 전달되어야 하고 이것은 CD45의 내재화가 부족하다는 것을 고려할 때 명백한 것이고 사소하지 않기 때문이다. 대조적으로, pH 감응성 항체인 항인간 VISTA 767.3-IgG1.3은 생리 pH에서 단핵구에 대한 결합이 제한적이다. 또한, INX200과 비교하여 767-IgG1,3은 생리 pH에서 제한된 수준의 내재화로 무시할 수 있는 수준을 나타내었다.
실시예 5 : 생리 pH에서 네이키드 항체 또는 덱사메타손 접합체로서의 항-VISTA 항체의 PK의 비교 예시적인 항-VISTA 항체의 결합 및 내재화
인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI) 마우스에서, 제1 실험(실험 1)에서 항-인간 VISTA 항체 INX200 네이키드 또는 덱사메타손에 접합된 것(INX200A), 및 제2 실험(실험 2)에서 네이키드 767-IgG1.3 또는 덱사메타손에 접합된 것(767-IgG1.3A)의 약동학(PK)을 비교하기 위해 2개의 실험을 수행하였다(Johnston et al, "VISTA　is an acidic pH-selective ligand for　PSGL-1." Nature.　2019 Oct;574(7779):565-5702019). 이 마우스는 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있으며 RNA 및 단백질 수준에서 인간 VISTA를 발현한다. 실험은 수컷 hVISTA KI 마우스에서 수행되었으며 두 연구에서 동물에게 10㎎/㎏의 항체를 1회 제공하였다. 실험 1의 경우 20분, 4, 24, 48시간, 그 다음 제5일, 제8일, 제14일, 제21일, 제28일에, 실험 2의 경우 제4일, 제7일, 제14일, 제21일, 제28일에 말초 혈액 내 항체 양을 정량화하였다.
이들 2개의 실험의 목적은 8개의 링커-페이로드 분자/항체의 첨가가 PK를 변형시킬 것인지를 평가하고, BMS/Five Prime Therapeutics에 의해 기술된 "pH 감응성" 항체 및 글루코코티코이드 연결된 형태가 생리학적 및 각각의 글루코코티코이드 연결된 형태(hIgG1에 비해 짧음)에서 인간 VISTA 발현 세포에 결합하는 항-VISTA 항체와 상당히 상이한 PK(hIgG1과 대등함)를 갖는다는 것을 확인하는 것이었다.
물질 및 방법
실험 1: 인간 VISTA KI 마우스에서 INX200, INX200A(덱사메타손 접합체)에 대한 PK 연구
hVISTA KI 마우스를 각각 10마리씩 3개의 군으로 나누고, 제0일에 인간 IgG1, INX200 및 INX200A 10㎎/㎏으로 각각 처리하였다.
실험 2: 인간 VISTA KI 마우스에서 767-IgG1.3, 767-IgG1.3A(덱사메타손 접합체)에 대한 PK 연구
hVISTA KI 마우스를 각각 10마리씩 3개의 군으로 나누고, 제0일에 인간 IgG1, 767-IgG1.3 및 767-IgG1A 10㎎/㎏으로 각각 처리하였다. 두 실험에서 실험 1의 경우 20분, 4, 24, 48시간, 그 다음 제5일 및 제8일, 실험 2의 경우 제4일 및 제7일에 마우스의 안와후강으로 채혈하고; 순환 항체를 ELISA로 정량화하였다.
시험 작용제 및 투여량
Figure pct00687
INX200(Aragen, Lot# BP-2875-019-6.1)은 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX200A(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-005)는 쇄간 이황화물을 통해서 접합된, 약물/항체 비율이 8인 INX200 항체이다. 링커/페이로드(A)는 덱사메타손 페이로드를 갖는 에스터라제 감응성 링커로 이루어진다.
(인간 IgG1(BioXcell ref, 로트 번호 659518N1)
767-IgG1.3(Aragen, 로트 번호 BP-2985-019-6)은 Fc 영역에 L234A/L235E/G237A　침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 Five Prime Therapeutics 및 Bristol-Myers Squibb Company에서 개발된 항-인간 VISTA 항체이다. 이 항체는 낮은 pH(예를 들어, pH 6)에서 결합하지만 생리 pH(pH 7.4)에서 최소 결합을 갖도록 설계되었다(1).
767-IgG1.3A(Abzena, 로트 번호 JCC0624003)는 쇄간 이황화물을 통해서 접합된, 약물/항체 비율이 8인 767-IgG1.3 항체이다. 링커/페이로드(A)는 덱사메타손 페이로드를 갖는 에스터라제 감응성 링커로 이루어진다.
모든 항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 마우스 꼬리 정맥에 정맥 주사하여 10㎎/㎏ 용량을 전달하였다.
마우스
hVISTA 마우스는 Sage Labs(미국 펜실베이니아주 보이어타운 소재)에서 사육되었다. 8 내지 12주령의 마우스를 먼저 검역소에 3주 동안 이동시킨 후 일반 시설로 옮겼다. 이들을 실험 시작 전 1 내지 2주 동안 적응시켰다.
채혈 및 준비
동물은 24시간마다 1회 이하로 채혈하였다. 각각의 마우스 군을 제0일에 교대로 채혈한 5마리 마우스의 2개 하위군으로 나누었다. 혈액을 주사 후 0일에 20분, 4, 24, 48시간에 수집한 다음, 실험 1을 위해 제5일 및 제8일 실험 2를 위해서 제4일 및 제7일에 수집하였다. 처음 24시간 동안, 등록된 정맥 주사 품질에 따라 일부 데이터를 제외시켰다. 후속 시점에서는 성공적으로 정맥 주사된 동물만 채혈하였다.
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다. 그런 다음 혈액을 400rcf에서 5분 동안 원심분리시키고 혈장을 수집하여 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다(상기 참조).
항체 혈액 농도 분석
인간 IgG1의 검출을 위한 ELISA
먼저 96-웰 편평 바닥 플레이트(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp, 카탈로그 번호 442404)를 실온(RT)에서 1시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 마우스 항-huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-005-098)로 코팅하였다.
웰을 PT(0.05% Tween 20을 함유한 PBS)로 3회 세척한 다음 RT에서 1시간 동안 PTB(0.05% Tween 20 및 1% BSA를 함유한 PBS)로 차단시켰다. 인간 IgG(Southern Biotech, 카탈로그 번호 0150-01)를 양성 대조군으로 사용하고 인간 IgG1(BioXcell, 카탈로그 번호 BE0297)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PT로 3회 세척한 후, HRP(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-035-098)에 커플링된 마우스 항-인간 IgG Fcγ를 검출 시약으로 1/2000 희석하여 사용하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 비색 기질로서 TMB(Thermo Scientific, 카탈로그 번호 34028)를 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5 내지 10분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
INX200 또는 INX200A의 검출을 위한 ELISA
먼저, 96-웰 편평 바닥 플레이트(이전과 동일)를 hIX50(인간 VISTA ECD, ImmuNext를 위해서 Aragen Bioscience에서 생산)으로 PBS 중 1㎍/㎖로 RT에서 1시간 동안 코팅하였다. 3회 세척 후, RT에서 1시간 동안 PTB로 웰을 차단시켰다. INX908(ImmuNext를 위해서 Aragen Bioscience에서 생산)을 양성 대조군으로 사용하고 INX200 또는 INX200A를 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PT로 3회 세척한 후, 마우스 항-인간 Kappa-HRP(Southern Biotech, 카탈로그 번호 9230-05)를 검출 시약으로 1/2000으로 사용하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 비색 기질로서 TMB를 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
767-IgG1.3 또는 767-IgG1.3A의 검출을 위한 ELISA
먼저 96-웰 편평 바닥 플레이트(상기와 같음)를 RT에서 1시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 마우스 항-huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-005-098)로 코팅하였다.
3회 세척 후, RT에서 1시간 동안 PTB로 웰을 차단시켰다. 인간 IgG(Southern Biotech, 카탈로그 번호 0150-01)를 양성 대조군으로 사용하고 767-IgG1.3 또는 767-IgG1.3A을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PTB에서 3회 세척한 후, 마우스 항-인간 IgG Fcγ-HRP(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-035-098)를 검출 시약으로서 1/2000으로 사용하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다. 정맥 볼러스 후 비구획 분석(NCA)을 수행하는 PKsolver 프로그램을 사용하여 항체 반감기를 결정하였다.
결과
실험 1: INX200 네이키드 또는 접합된 항체 혈장 PK
INX200, INX200A 또는 hIgG1로 처리된 군으로부터의 혈장 샘플을 수집하여 항체 농도 및 후속적으로 이들의 반감기를 결정하였다. INX200은 0.1일의 반감기를 나타내었는데, 이것은 더 낮지만 이전 PK 데이터(T1/2= 약 0.3일)와 일치하며 이 항체는 24시간에 정량 수준 미만이었다. INX200A는 동일한 PK를 나타내었다. 대조적으로, 인간 IgG1은 반감기가 7.2일로 낮지만 면역글로불린에 대해서 비정형은 아니다(도 16). 도면은 hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점의 항체의 혈장 농도를 나타낸다(SD; n=5/군).
실험 2: 767-IgG1.3 네이키드 또는 접합된 항체 혈장 PK
767-IgG1.3, 767-IgG1.3A 또는 hIgG1로 처리된 군으로부터의 혈장 샘플을 수집하여 항체 농도 및 후속적으로 이들의 반감기를 결정하였다. 결과는 767-IgG1.3 및 767-IgG1.3A가 각각 3.5일 및 4일의 유사한 반감기를 나타냈으며 둘 다 제7일에도 여전히 검출 가능함을 나타내었다. hIgG1 반감기는 8.7일로 실험 1에서 관찰된 것과 유사하였다(767-IgG1.3, 767-IgG1.3A 대 인간 IgG1에 대한 PK 연구를 포함하는 도 17 참조, hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점에서의 항체의 혈장 농도임(SD; n=5 /군)).
결론
이들 2개의 실험의 결과는 다음을 나타낸다:
실험 1
도 16의 데이터는, 항-인간 VISTA 항체 INX200(생리 pH에서 인간 VISTA 세포에 결합함)이 표적 매개 약물 배치(TMDD)로 인해 투여 후 24시간에 혈장에서 정량화될 수 없는 반면 인간 IgG1 대조군은 IgG에 대한 보다 전형적인 연장된 반감기를 나타낸다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 INX200에 대한 DAR=8의 덱사메타손의 접합이 이의 PK에 영향을 미치지 않는다는 것을 추가로 나타낸다.
실험 2
도 17의 데이터는 pH 감응성 항-인간 VISTA 767-IgG1.3이 인간 IgG1 대조군 항체와 유사한 PK를 나타낸다는 것을 나타내는데, 이는 이것이 VISTA 표적에 대한 제한된 결합을 가지며 TMDD를 받지 않는다고 주장한다. 또한, 767-IgG1.3에 대한 DAR=8의 덱사메타손의 접합은 이의 PK에 영향을 미치지 않는다.
실시예 6 : 생체외 대식세포 활성화에 대한 항체 약물 접합체의 장기간 영향
본 실시예에서, 골수 및 T 세포를 포함하는 대부분의 조혈 세포에서 높게 발현되는 세포 표면 분자인 VISTA를 표적으로 하는 항체 및 글루코코티코이드(GC) 약물을 포함하는 예시적인 본 발명의 항체 약물 접합체(ADC) 분자의 장기간 효능을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 이전에 이러한 ADC가 단기간 염증 모델에서 강력한 항-염증 활성을 발휘한다는 것을 (내부 미발표 연구) 나타내었다. 이러한 연구의 목적은 (i) 골수 세포에서 글루코코티코이드(GC) 페이로드에 연결된 다양한 항체 약물 접합체(ADC) 및 항-인간 VISTA 단클론성 항체의 약력학적 범위를 평가하고; (ii) 예시적인 INX GC 링커 페이로드 ADC의 효능을 평가하는 것이었다.
먼저, 본 발명자들은 복막 상주 대식세포(PRM) 및 비장 단핵구에 대한 덱사메타손(Dex)와 비교하여, 초기 GC 반응 유전자인 FKBP51에 대한 ADC의 장기간 생체 내 영향을 평가하였다(Vermeer et al. (2003) "Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression: a potential marker for glucocorticoid sensitivity, potency, and bioavailability", J Clin Endocrinol Metab. 88(1):277-84).
이를 기반으로 PRM과 같은 특정 표적 집단에 대한 ADC의 장기간 항-염증 효과를 평가할 수 있는 모델을 개발하였다. 간략하며, ADC를 복강내(i.p.) 주사를 통해 생체내 전달하였고, 1 내지 7일 후에 PRM을 단리시키고 배양기에 넣었다. GC 처리가 없는 경우, 2시간 후 PRM은 사이토카인 생산의 증가로 나타난 바와 같이 고도로 활성화되었다. PRM 단리 2시간 전에 생체내 Dex 처리는 사이토카인 생산을 강력하게 감소시킨다. 이러한 연구의 목적은 유리 Dex와 비교하여 글루코코티코이드 페이로드에 접합된 INX 인간 VISTA 항체의 효능 및 약력학적 범위를 평가하는 것이었다.
물질 및 방법
PRM 및 비장 단핵구에서 FKBP5 전사에 대한 ADC 또는 Dex 영향을 평가하는 방법
Dex를 i.p.주사하였고 2 내지 24시간 후 마우스를 안락사시키고 세포를 단리시켰다. 그 다음 ADC를 주사하고 17시간 내지 7일 후에 마우스를 안락사시키고 세포를 단리시켰다.
시험 작용제 및 투여량
항체
INX201(Aragen, 로트 번호 BP-3200-019-6)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX201J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-025-1, JZ-0556-027, JZ-0556-013)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(J)는 이전에 보고된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-1)는 DAR이 8.0인 접합된 INX231이다. 링커/페이로드(INX J)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커이다.
INX234J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-2)는 DAR이 8.0인 접합된 INX234이다. 링커/페이로드(INX J)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커이다.
INX240J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-3)는 DAR이 8.0인 접합된 INX240이다. 링커/페이로드(INX J)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201O(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-016-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX201이다. 링커/페이로드(INX O)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-4)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201P(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-016-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX201이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX233(ATUM 로트 번호 82276.1.a)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX233P(Abzena, 로트 번호 PP-0924-001-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX233이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231(ATUM 로트 번호 72928.1.a)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX231P(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-017-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234(ATUM 로트 번호 72931.2.a)는 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX234P(Abzena, 로트 번호　JZ-0556-017-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX240(ATUM 로트 번호 73419.2.a)는 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX240P(Abzena, 로트 번호　JZ-0556-017-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX240이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231R(Abzena, 로트 번호 PP-0924-001-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(INX R)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 중성 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231S(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 6.9인 INX231이다. 링커/페이로드(INX S)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-24)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231V(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-2)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.8인 INX231이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231W(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-3)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.5인 INX231이다. The 링커/페이로드(INX W)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 양으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A3(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-1)은 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A3)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 양으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A4(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A4)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-43)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234T(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX T)는 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201L(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-026-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(J)는 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234V(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-003)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A5(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-002)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A5)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-44)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A11(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A11)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커(Asn/gly)로 이루어진다.
INX231A7(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.8인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A7)는 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A12(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-002)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 6.99인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A12)는 인산화된 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A23(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-006-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.34인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A23)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 복강내(i.p.) 주사하여 명시된 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사제인 NDC 57319-519-05를 PBS에 희석시키고 i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
마우스
hVISTA 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였다. 모든 실험은 9 내지 15주령으로 등록된 암컷 마우스에서 수행하였다.
세포 단리
안락사, 마우스 복강에 7㎖의 PBS/0.5% BSA/2mM EDTA를 주사하였다. 복막을 간단히 마사지한 후, 작은 절개를 수행하고 복막 세척액을 채취하였다. 음성 선택(Miltenyi kit, ref 130-110-434)을 사용하여 PRM을 단리시켰다. 비장을 기계적으로 해부하고 분리시키고; 음성 선택(Stem Cell, EasySep™ Mouse CD11b Positive Selection Kit II)을 사용하여 단핵구를 분리시켰다.
RNA 준비 및 실시간 PCR
상이한 조직으로부터의 세포 펠릿을 RNeasy Plus Mini kit(Qiagen, PN: 74136)로부터의 0.4㎖ RNeasy 용해 완충액에 재현탁시키고, 20G 니들로 5회 균질화시켰다. 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리시키고 RNA를 30 또는 40㎖ H2O(RNase/DNase 무함유)에 용출시켰다. RNA 농도를 Nanodrop에서 평가하였다.
Taqman 역전사 시약(#N8080234)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사를 수행하였다. 정량 실시간 PCR은 Taqman 마스터 믹스 2X 키트(#4369016) 및 마우스 FKBP5용 Taqman 프라이머(Mm00487401_m1) 및 마우스 HPRT를 하우스키핑 유전자(Mm446968_m1)로 사용하여 수행하고 Applied Biosystem의 QuantStudio3에서 실행하였다.
Ct 데이터를 DCt(샘플 내의 HPRT로 정규화된 FKBP5)로 변환한 다음 ΔΔCt(처리된 샘플 대 PBS 대조군에 대한 FKBP5 상대 수준)로 변환하여 PBS에 대한 Log2 배수 변화를 얻었다.
복막 상주 대식세포 배양 및 사이토카인 분석
배양 조건
PRM을 10% FBS, 10mM Hepes, 페니실린/스트렙토마이신 및 글루타민과 함께 RPMI 1640에 재현탁시키고 100,000개의 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 웰당 플레이팅하였다. 플레이팅 후 2시간 및 24시간에 상청액을 수집하여 -80℃에 저장하였다.
Millipore 플랫폼을 사용한 사이토카인 분석
밀리포어 마우스 32-플렉스 플랫폼을 사용하여 25㎕의 혈장에 대해 사이토카인 분석을 수행하였다. Immune Monitoring Lab(IML, Dartmouth-Hitchcock Norris Cotton Cancer Center의 Shared Resources)에서 분석을 수행하였다.
ELISA를 통한 사이토카인 분석
BioLegend (카탈로그 번호 430904) ELISA MAX Deluxe Set Mouse TNF-α
BioLegend (카탈로그 번호 431304) ELISA MAX Deluxe Set Mouse IL-6
제조사의 포함된 프로토콜에 따라 ELISA를 수행하였다.
결과
실험 1: 복막 상주 대식세포 및 비장 단핵구에서 Dex 처리 후 FKBP5 전사 활성화
도 18의 실험은 복막 상주 대식세포 및 비장 단핵구에서 Dex(좌측) 및 ADC INX201J(우측) 처리 후 FKBP5 전사 활성화 효과를 비교한다. 여기에 나타난 바와 같이 Dex(왼쪽) 효과는 2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 후 4시간 및 24시간에 평가하였고; ADC(우측) 효과는 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드를 전달하는 10㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 후 24, 48, 72 및 96시간에 분석하였다 실시간 PCR로 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다. 군당 4마리의 마우스를 함께 풀링시켜 RNA 제조에 충분한 물질을 생성시켰다. 도 18의 데이터는 Dex 처리가 처리 후 4시간까지 PRM과 비장 단핵구 모두에서 FKBP5 메신저 RNA의 극적인 증가를 유발하지만 전사 영향은 24시간까지 사라짐을 나타낸다(도 18, 좌측). 이에 반해서, FKBP5에 대한 INX201J의 영향은 장기간 지속되며, 즉, FKBP5 메신저 RNA의 증가는 PRM에서는 96시간만큼 늦게, 비장 단핵구에서는 72시간만큼 늦게 검출된다(도 18, 우측).
추가된 자극의 부재 하에서, PRM이 조직 배양 플레이트에 전달될 때 이들은 매우 빠르게 활성화되고 플레이팅 후 1시간만큼 빠르게 세포 상청액에서 측정될 수 있는 다수의 전염증성 사이토카인의 생산을 크게 증가시킨다.
실험 2: Dex 처리는 PRM에서 전염증성 사이토카인의 생체외 유도를 방지한다.
도 19의 실험은 Dex 처리가 PRM에서 전-염증성 사이토카인의 생체외 유도를 방지한다는 것을 나타낸다. 실험에서, 2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 2시간 후 Dex 효과를 평가하였고; 마우스 32-플렉스를 사용하여 세포 상청액(1시간에 수집)에서 IL-6 및 TNFα를 평가하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; 언페어드 T 검정).
이들 결과는 세포 단리 2시간 전 생체내 Dex 처리가 IL-6 및 TNFα 분비로 예시된 생체외 PRM 활성화를 세포 플레이팅 1시간 후만큼 빠르게 강력하게 차단할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 영향은 배양 24시간 후에도 여전히 명확하게 검출된다(표시되지 않음).
실험 3: ADC INX201J의 약력학
도 20에 포함된 실험에서, ADC INX201J의 약력학적 범위를 PRM의 단리 및 생체외 자극 -4일, -2일 및 -1일 전에 ADC를 주사하여 평가하였다. Dex 대조군에게 PRM 단리 2시간 전에 주사하였다. 여기서 Dex 효과를 2 및 0.2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 2시간 후 평가하였고; INX201J 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏ 페이로드에 동등함)의 주사 1일(d-1), 2일(d-2) 및 4일(d-4) 후에 평가하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα를 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석). INX201J를 10㎎/㎏ 또는 상응하는 0.2㎎/㎏의 페이로드로 투여하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, INX201J 치료는 제-1일에 투약했을 때 TNFα 생산 감소에 매우 중요한 영향을 미쳤다. 또한, 제-2일 또는 제-4일에 대신 ADC를 투여하면 Dex 대조군과 유사하게 분비된 사이토카인 수준에 여전히 영향을 미쳤다. 이 데이터는 INX201J가 PRM에 대한 장기간(4일 초과) 항-염증 효과를 이끌어낸다는 것을 시사한다. 특히 이 실험에서 상청액에서 검출된 TNFα의 양은 이전 실험에서보다 훨씬 적은데, 그 이유는 아마도 ELISA(Luminex 대신)에 의해 정량화가 수행되었기 때문일 것이다. 본 발명자들은 또한 다른 실험에서 ELISA에 의해서 정량화를 수행하였을 때 더 낮은 IL-6 수준을 관찰하였다.
실험 3: J 페이로드에 접합된 상이한 항-VISTA 항체의 장기간 효력
도 21의 실험에서 본 발명자들은 J 페이로드에 접합된 상이한 항-VISTA 항체의 장기간 효력을 평가하였다. INX201J, INX234J 및 INX240J를 제-4일 및 제-7일에 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드)로 주사하였고, Dex를 세포 단리 2시간 전에 2㎎/㎏로 투여하였다. 실용적인 실험상의 이유로 INX231J는 제-4일에만 투여하였다.
도 21의 결과는 시험된 ADC가 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도에 장기간 영향을 미친다는 것을 나타내었다. Dex 효과를 2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 2시간 후 평가하였고; INX201J, INX231J, INX234J 및 INX240J 효과를 10㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 4일(-4) 및 7일(-7) 후에 평가하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석). 도 21에 도시된 바와 같이, TNFα 및 IL-6 둘 다에 대해, 4개의 ADC 모두 제-4일 또는 제-7일에 투여되었을 때 효력이 있는 항-염증 활성을 나타내었다.
실험 5: 생체외 PRM 활성화에 대한 INX231J, INX234J 및 INX240 J의 용량의존적 영향
도 22의 실험에서 생체외 PRM 활성화에 대한 INX231J, INX234J 및 INX240J의 용량 의존적 영향을 평가하였다. 이들 실험에서, Dex 효과를 2㎎/㎏의 1회 단일 i.p. 주사 2시간 후에 평가하였고; INX231J, INX234J 및 INX240J 효과를 10, 3 또는 1㎎/㎏(0.2, 0.06 및 0.02㎎/㎏의 GC 페이로드)의 1회 단일 i.p. 주사 7일 후에 평가하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(기술적 이유를 위해서, PBS 군 n=1을 제외하고는 n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석).
언급한 바와 같이 모든 ADC는 제-7일에 상이한 투여량: 각각 0.2, 0.06 및 0.02㎎/㎏의 GC 페이로드를 전달하는 10, 3 및 1㎎/㎏으로 i.p.로 주사하였다. 세포 단리 2시간 전에 Dex를 2㎎/㎏로 투여하였다. 결과는 상이한 ADC들 간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며 유사한 효력을 가지고 있음을 시사한다(도 22).
실험 6: 처리 후 제7일에 Dex 및 링커/페이로드 P에 접합된 INX201과 비교한 예시적인 본 발명의 ADC의 효력
도 23의 실험에서, 1) 처리 후 제7일에 Dex와 비교한 J-연결된 ADC 및 2) 링커/페이로드 P에 접합된 INX201의 효력을 평가하였다. 도 23의 결과는 INX201J, INX201P, INX231J, INX234J 및 INX240J ADC가 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 대등한 효력이 있음을 나타낸다. 이 실험에서, INX201J, INX201P, INX231J, INX234J, INX240 J 및 Dex 효과를 1회 단일 i.p. 주사 후 7일 후에 평가하였고; ADC를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 GC 페이로드)으로 투여하고, Dex를 2㎎/㎏으로 투여하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. 상기에 기재된 것을 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(기술적 이유를 위해서 n=3인 PBS 및 Dex 군을 제외하고는 n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석).
언급된 바와 같이, 모든 치료제를 제-7일에 i.p.로 주사하였고, Dex를 2㎎/㎏, ADC를 0.2㎎/㎏의 페이로드로 주사하였다. 도 23의 데이터는 Dex가 사이토카인 반응을 제어하는 데 있어서 모든 효능을 잃었지만 J 또는 P 페이로드를 보유하는 모든 ADC는 대등한 효력을 가짐을 나타낸다.
실험 7: 처리 후 제7일에 Dex 및 링커/페이로드 P에 접합된 INX201과 비교한 예시적인 본 발명의 ADC의 효력
도 24의 이 실험에서, INX201J와 비교하여 상이한 항-VISTA 항체에 접합된 INX P 페이로드를 평가함으로써 다양한 항-VISTA CDR의 연장된 효력에 대한 영향을 평가하였다. 모든 ADC를 제-7일에 0.2㎎/㎏의 페이로드의 용량으로 i.p.로 주사하였다.
데이터는 INX J 또는 INX P 페이로드를 보유하는 모든 항-VISTA ADC가 연장된 기간 후에 대등한 효력을 가짐을 나타낸다(도 24). 도 24는 INX201J, INX231P, INX234P 및 INX240P ADC가 PRM에서 TNFα의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 대등한 효력을 갖는다는 것을 나타낸다. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7일 후에 평가하였고; ADC를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 GC 페이로드)으로 투여하였다. 세포 상청액을 2시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα를 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
실험 8: INX231에 접합된 INX R 링커 페이로드의 장기간 효력.
도 25의 이 실험에서, INX231에 접합된 INX R 링커 페이로드의 장기간 효능을 평가하였다. 이 접합체는 INX231P와 유사하지만; 이것은 중성 다이펩타이드 링커를 함유하고 INX231P는 음으로 하전된 다이펩타이드 링커를 갖는다. 추가적인 항-VISTA 항체 INX233을 함유하는 ADC의 효능을 또한 평가하였다. 비교자로서, INX231P와 INX234P를 사용하였다. 모든 ADC를 제-7일에 0.2㎎/㎏의 페이로드의 용량으로 i.p.로 주사하였다. 24시간에 수집된 세포 상청액을 이전 실험에서와 같이 분석하였다. 2시간 또는 24시간에 수집된 상청액 사이에 유의한 차이는 나타나지 않았다.
이 데이터는 일반적인 효력보다 낮은 INX231P를 제외하고(실험 6 참조), INX231R 및 INX233P가 INX234P와 대등한 효력을 가짐을 추가로 나타낸다(도 25). 특히, 도 25의 데이터는 INX231P, INX231R, INX233P 및 INX234P가 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 대등한 효능을 갖는다는 것을 나타낸다. 실험에서 ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7일 후에 평가하였고; ADC를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 GC 페이로드)으로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
실험 9: INX231에 접합된 INX R 링커 페이로드의 장기간 효력.
도 26의 이 실험에서, 본 발명자들은 INX231에 접합된 여러 다른 INX 링커 페이로드의 장기간 효력을 평가하였다. 이 실험에서, 다이펩타이드 링커(INX R, INX W 대 INX P)의 전하, 스테로이드 고리의 할로겐화(INX S 대 INX P) 및 페이로드(INX V 대 INX P)를 독립적으로 변화시켰다. INX P와 구별되는 페이로드를 갖는 링커 페이로드 INX O를 또한 INX201 접합체로 평가하였다. 모든 ADC를 제-7일에 0.2㎎/㎏의 페이로드의 용량으로 i.p.로 주사하였다. 본 발명자들은 24시간에 수집된 세포 상청액을 분석하였다.
도 26의 데이터로부터 나타낸 바와 같이, INX231에 접합된 링커 페이로드 INX S, INX V 및 INX W는 사이토카인 반응을 제어하는 데 있어서 현저한 장기간 효력을 나타낸 반면, INX231P 및 INX231R은 상당한 장기간 효력을 나타내지만 더 제한적이었고; INX231에 접합된 INX O 페이로드는 PRM 사이토카인 반응에 유의미한 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않았다. 도 26은 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서의 INX231에 접합된 GC 링커 페이로드 INX R, INX O, INX S, INX V 및 INX W 대 INX P의 효력 평가를 나타낸다. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
실험 10: 제1일, 제7일 및 제14일 약력학적 범위에서 페이로드 INX S, INX V 및 INX W의 효력.
도 27의 이 실험에서, 제1일, 제7일 및 제14일 약력학적 범위를 관찰하면서 페이로드 INX S, INX V 및 INX W의 장기간 효력을 평가하였다. INX231P, INX231S 및 INX231V를 제-14, 제-7 또는 제-1일에 i.p.로 주사하였고, INX231W를 제-14일에만 주사하였다. 모든 ADC를 0.2㎎/㎏의 페이로드의 용량으로 i.p.로 투여하였다. PRM을 제0일에 수집하였다. 세포의 일부를 RNA 단리에 사용하였고 나머지를 배양에 넣었다. 본 발명자들은 단리 후 24시간에 수집된 세포 상청액을 분석하였다.
도 27의 데이터로부터 나타난 바와 같이, 24시간(제1일/D1) 또는 7일 후, 페이로드 INX S 및 INX V는 INX P와 유사한 수준의 FKBP5 유도를 나타낸다. 14일 후, INX P로 처리된 군에서 FKBP5 전사의 명확한 감소가 존재하고, 페이로드 INX S, V 및 W로 처리된 군은 여전히 높은 수준의 FKBP5 전사를 나타낸다. 도 27은 PRM에서 FKBP5 전사 유도에서 GC 페이로드 INX231S, INX231V 및 INX231W 대 INX231P의 효력 평가 결과를 포함한다. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 1일, 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 발현을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 28의 실험은 처리 후 24시간에 페이로드 INX P, INX S 및 INX V 가 대식세포에 의한 TNFα 및 IL-6 생산을 방지하는 데 유사한 효력을 가짐을 추가로 나타낸다. 7일 더 일찍 투여하는 것은 약간 더 큰 효력이 있는 INX231S와 유사한 데이터를 나타내었다. 14일 더 일찍 투여하는 것은 INX231P, INX231V 및 INX231W의 기능적 활성이 손실되는 반면 INX231S는 일부 활성을 유지하였다(제14일에 IL-6의 감소는 유의성 p= 0.0669에 가깝다). 도 28의 데이터는 특히 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 GC 페이로드 INX231S, INX231V 및 INX231W 대 INX231P의 효력 평가를 나타낸다. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 1일, 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
실험 11: 제1일, 제7일 및 제14일에 관찰한 접합체 INX234A3, INX234A4, INX234T, INX201L 및 INX231S의 효력
도 29의 이 실험에서, 제1일, 제7일 및 제14일 약력학적 범위를 관찰하면서 대식세포 검정에서 5개의 다른 페이로드, INX234A3, INX234A4, INX234T, INX201L 및 INX231S의 효력을 평가하였다. 모든 ADC를 제-14일, 제-7일 또는 제-일에 0.2㎎/㎏의 페이로드의 용량으로 i.p.로 주사하였다. PRM을 제0일에 수집하였다. 세포의 일부를 RNA 단리에 사용하였고 나머지를 배양에 넣었다. 단리 후 24시간에 수집된 세포 상청액을 분석하였다. 단리된 비장 세포를 또한 수집하여 FKBP5 발현 수준을 분석하는 데 사용하였다.
도 29의 데이터는 모든 시험된 페이로드가 24시간에 유사하게 높은 수준의 FKBP5 전사체를 유도하였음을 나타낸다. 7일 후, 모든 군에서 FKBP5 전사가 전반적으로 감소하였고; 14일까지, INX201L 처리군만 지속적인 FKBP5 감소를 나타낸 반면, INX234A3, INX234A4, INX234T 및 INX231S는 제7일부터 변하지 않은 안정적인 FKBP5 전사 수준을 유도하는 것으로 보인다.
이전 실험에서, INX J 및 INX P 페이로드 접합체로 주사한 후 4일 초과 동안 분석했을 때 비장에서 FKBP5 신호가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. 매우 흥미롭게도, INX234A4, INX234T, INX201L 및 INX231S의 효력을 시험한 도 29의 실험은 제7일에 FKBP5의 상당한 유도를 나타내었고; 또한 제14일까지 INX234T 및 INX231S 둘 다는 여전히 상당한 증가를 유도하였다. 보다 구체적으로, 도 29는 복막 상주 대식세포(상단 행) 및 비장 세포(하단 행)에서 FKBP5 전사를 유도하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX234A3, INX234A4, INX234T, INX201L 및 INX231S의 효력 평가를 나타낸다. ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 1일, 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 발현을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 30의 실험은 처리 후 24시간에 모든 페이로드 INX A3, INX A4, INX T, INX L 및 INX S가 대식세포에 의한 TNFα 및 IL-6 생산을 방지하는 데 유사한 효력을 가짐을 추가로 나타낸다. 7일 더 일찍 투여하는 것은 약간 더 큰 효력이 있는 INX234A3 및 INX231S와 유사한 데이터를 나타내었다. 14일 더 일찍 투여하는 것은 TNFa 및 IL-6 생산 둘 다를 제어하는 데 있어서 INX234A4의 기능적 활성이 손실되지만 흥미롭게도 INX234A3, INX234T, INX201L 및 INX231S는 여전히 TNFα 생산을 상당히 감소시켰다. 보다 특별하게는, 도 30에서의 실험은 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX234A3, INX234A4, INX234T, INX201L 및 INX231S의 효력을 평가한다. 이러한 ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 1일, 7일 및 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
실험 12: 제7일 및 제14일 접합체 INX234A5 및 INX234A11 대 INX234V의 효력
도 31의 이 실험에서, 제7일 및 제14일 약력학적 범위를 관찰하면서 대식세포 검정에서 2개의 다른 페이로드, INX234A5 및 INX234A11 vs INX234V의 효력을 평가하였다. 모든 ADC를 제0일에 0.2㎎/㎏의 페이로드의 용량으로 i.p.로 주사하였다. PRM을 제7일 및 제14일에 수집하였다. 세포의 일부를 RNA 단리에 사용하였고 나머지를 배양에 넣었다. 단리 후 24시간에 수집된 세포 상청액을 평가하였다. 도 31의 데이터로부터 나타난 바와 같이, 모든 페이로드는 주사 7일 후에 유사하게 높은 수준의 FKBP5 전사체를 유도하였다. 14일까지 FKBP5 전사가 전반적으로 감소하지만 대조군과 비교하여 여전히 상당한 차이가 있다.
보다 구체적으로, 도 31의 실험에서, GC 페이로드 INX234V, INX234A5의 효력을 복막 상주 대식세포에서 FKBP5 전사 유도에서 평가하고 검정하였고 ADC 효과는 1회 단일 i.p. 주사 후 제7일 및 제14일에 평가하였고; 이들 ADC는 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여되었다. 정량적 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 발현을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 32의 실험은 14일 후, 시험된 모든 ADC가 대식세포에 의한 TNFα 및 IL-6 생산을 방지하는 데 있어서 유사한 효능을 유지하였음을 추가로 나타낸다. 특히, 도 32에서의 실험은 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서의 GC 페이로드 INX234V, INX234A5 및 INX234A11의 효력을 평가한다. 이러한 ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 14일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
실험 13: 제7일, 제14일 및 제21일에 접합체 INX231A7, INX231A12 및 INX231A23 vs INX234V의 효력
도 33의 이 실험에서, 주사 후 제7일 및 제21일 약력학적 범위에서 관찰하면서 INX231A7, INX231A12 및 INX231A23 대 INX234V의 대식세포 검정에서 3개의 다른 페이로드의 효력을 평가하였다. INX231A7을 0.08㎎/㎏의 페이로드로 투여한 것을 제외하고는 모든 ADC를 제0일에 0.2㎎/㎏의 페이로드로 i.p.로 주사하였다. PRM을 제7일에 수집하였다. 세포의 일부를 RNA 단리에 사용하였고 나머지를 배양에 넣었다. 단리 후 24시간에 수집된 세포 상청액을 평가하였다. 보다 구체적으로 도 33의 이러한 실험에서, 복막 상주 대식세포에서 FKBP5 전사 유도에서 GC 페이로드 INX234V, INX231A7, INX231A12 및 INX231A23의 효력을 검정하였고 ADC 효과는 1회 단일 i.p. 주사 후 제7일 및 제21일에 평가하였고; INX231A7을 0.08㎎/㎏의 페이로드로 투여한 것을 제외하고는 ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 발현을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로서 나타내었다(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).
도 33의 데이터로부터 나타난 바와 같이, 시험된 모든 페이로드는 주사 후 제7일에 유사하게 높은 수준의 FKBP5 전사체를 유도하였고, INX231A23은 약간 더 효력이 있다. 주사 후 제21일까지, INX231A7 처리군을 제외하고, PBS 처리군에 비해 FKBP5 전사의 작지만 유의한 증가가 여전히 검출되었다.
도 34에 포함된 실험의 결과는 제7일, 제14일 및 제21일 후에 시험된 모든 ADC가 대식세포에 의한 TNFα 및 IL-6 생산을 방지하는 데 유사한 효력을 유지했으며, 다시 INX231A23이 특히 TNFa 생산과 관련하여 가장 효능이 있었다. 주사 후 제14일에, TNFα의 현저한 감소가 시험된 모든 ADC에 대해 관찰되었고, 투여 후 21일까지 INX231A7, INX231A12 및 INX231A23으로 처리된 군의 경우 TNFα 생산에서 여전히 상당한 감소가 존재하였다.
보다 구체적으로, 도 34는 PRM에서 TNFα 및 IL-6의 생체외 유도를 방지하는 데 있어서 GC 페이로드 INX234V, INX231A7, INX231A12 및 INX231A23의 효력 평가 결과를 나타낸다. 이들 실험에서, ADC 효과를 1회 단일 i.p. 주사 7, 14 및 21일 후에 평가하였고; ADC를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. ELISA를 사용하여 TNFα 및 IL-6을 측정하였다(방법 부분 참조)(n=4 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석, SEM).특히 주목해야 할 점은 INX231A7이 0.08㎎/㎏의 페이로드만 투여되지만, 21일 후에도 여전히 TNFa 생산에 상당한 영향을 미쳤다는 것이다.
결론
데이터는 다음을 나타낸다:
INX201J의 1회 주사는 PRM 표적 세포 집단에서 GC 리포터 전사체 FKBP5의 장기간 전사 유도를 유도하는데, 이는 ADC가 4일 초과의 약력학적 범위를 갖는 반면 Dex에 의한 FKBP5 전사 유도는 24시간까지 검출 가능하지 않다는 것을 나타낸다.
링커 페이로드 INX S, INX V, INX W, INX A3, INX A4, INX A5, INX A11 및 INX T는 FKBP5 유도와 관련하여 14일 일찍 투여했을 때 여전히 상당한 효능을 나타낸다.
상당한 FKBP5 유도는 INX P, 특히 INX T(인산화) 및 INX S(C6/C9에서 플루오린화)의 유사체가 있는 비장 세포에서 제1일, 제7일 및 제14일에 나타난다. INX A4뿐만 아니라 선행 문헌인 INX L(INX J의 인산화된 버전)은 제1일 및 제7일에만 상당한 유도를 나타낸다.
전-염증성 IL-6 및 TNFα 생산/분비에 기초한 PRM 염증 상태의 생체내 치료/생체외 평가의 본 발명자들의 모델에서:
- 시험된 ADC(INX231J/INX234J/INX240J)는 0.02㎎/㎏의 페이로드를 투여한 경우에도 7일 후에 효력을 내는데, 이는 2㎎/㎏을 투여한 Dex 대조군보다 100배 더 적다.
- 시험된 모든 ADC(INX201J/INX201P/INX231J/INX234J/INX240J)는 TNFα 및 IL-6 감소에 기반한 PRM에서 약리학적 범위가 7일 이상인 반면 Dex는 모든 효력을 잃었다.
- 링커/페이로드 INX R, INX P 및 INX J는 7일 일찍 투여했을 때 유사한 효력을 나타낸다.
- 링커/페이로드 INX S, INX V 및 INX W는 7일 일찍 투여했을 때 페이로드 INX P 및 INX R보다 현저하게 더 효력이 있는 것으로 보인다. INX V 및 INX W의 경우 향상된 방출로 인한 것일 수 있다. INX S의 경우, 이는 C6/C9에서 플루오린환된 유리 페이로드의 효력 때문일 수 있다.
- 링커 페이로드 INX O는 INX201에 접합될 때 매우 제한적이고 유의하지 않은 효력을 나타낸다.
- 링커/페이로드 INX S, INX V, INX A3, INX T, INX L, INX A5 및 INX A11은 14일 일찍 투여했을 때 PRM에서 사이토카인 반응을 제어하는 데 상당한 효력을 가졌다.
- 링커/페이로드 INX A7, INX A23 및 INX A12는 주사 후 적어도 21일 동안 효력을 발휘한다.
이들 검정에서 특히 주목할 점은 - 스피로[3.3]헵탄을 함유하는 INX V의 모든 유사체가 생체외 PRM 모델에서 FKBP5 및 사이토카인 감소를 유도하는 능력에 기초하여 주사 후 적어도 7일 동안 효력이 있었다는 것이다. 적어도 7일 동안 효력이 있는 것으로 나타난 시험된 유사체는 INX A3, INX A4, INX A5, INX A7, INX A11, INX A12 및 INX A23을 포함하고 추가로 다음을 포함한다:
- 인산화 유사체(INX A12/INX A7)
- 이중 플루오린화 유사체(INX A23/A12)
- 페닐 고리와 스피로 [3.3] 헵탄 사이의 메틸렌의 에터 변경(INX A4 및 INX A5)
- 양으로 하전된 lys/gly(INX A3), 음으로 하전된 Asn/gly(INX A11)를 포함하는 음으로 하전된 gly/glu 링커의 링커 변이체
실시예 7 : LPS 유도된 염증에 대한 항체 약물 접합체의 영향
본 실시예에 개시되고 도 35 내지 도 48에 도시된 14개의 생체내 연구는 LPS-유도된 염증에 대한 본 발명에 따른 예시적인 항체 약물 접합체의 영향을 평가하기 위해 수행되었다.
자가-면역 질환에서 ADC 잠재적 효능을 평가하기 위해서, 본 발명자들은 LPS-유도된 전신 염증의 단기간 모델을 사용하였다. 지질다당류(LPS)의 복강내(ip) 주사는 마우스에서 급성 면역 반응-국소 및 전신 모두-의 모델로 널리 사용된다. LPS 모델은 혈액 순환에서 전염증성 사이토카인의 폭발을 특징으로 하며 주사 후 2시간만큼 빨리 모니터링될 수 있다. 24시간까지, 대부분의 사이토카인은 정상 수준으로 돌아간다. 본 발명자들은 주로 LPS 주사 2 또는 4시간 후 사이토카인 반응을 모니터링함으로써 이 모델을 활용하였다. 예비 연구에 따르면 덱사메타손(Dex) 치료는 IL-12p40, TNFα, MIG, MIP-1α 및 IL-1β에 대한 용량 의존적 효과가 빠르면 2시간 내에 검출될 수 있으므로 본 발명자들의 연구는 이러한 5가지 사이토카인 중 하나 이상을 측정하는 데 중점을 두었다. (문헌[Vermeer et al. (2003) Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression: a potential marker for glucocorticoid sensitivity, potency, and bioavailability. J Clin Endocrinol Metab. Jan;88(1):277-84] 참조)
연구의 목적은 유리 Dex와 비교하여 다양한 글루코코티코이드 페이로드에 접합된 인간 항-VISTA 항체의 효능을 평가하는 것이었다.
물질 및 방법
방법
이들 실험에서, 마우스에게 LPS 주사 전 각각 약 20시간 또는 2 내지 4시간에 항체 또는 Dex 처리를 제공하였다. Dex는 수명이 짧고 빠르게 작용하는 반면 ADC는 추가 처리 시간이 필요하다. 이 시점은 ADC와 Dex의 피크 활성을 공정하게 비교하는 방법으로 선택되었다.
혈액을 LPS i.p. 주사 2 또는 4시간 후에 수집하고, 혈장을 사이토카인 분석을 위해 단리시켰다.
시험 작용제 및 투여량
항체
INX201(Aragen, 로트 번호 BP-3200-019-6)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
huIgG1si(Aragen, 로트 번호 BP-2211-018-6)는 Fc 영역에 E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 항-RSV mAb이다.
INX201J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-025-1, JZ-0556-027, JZ-0556-013)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(J)는 이전에 보고된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
huIgG1si J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-025-2)는INX J 링커/페이로드를 갖는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 huIgG1si 항체이다.
INX201N(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-028)은 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX201이다. 링커/페이로드(INX N)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-1)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201O(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-016-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX201이다. 링커/페이로드(INX O)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-4)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201P(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-016-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX201이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX233(ATUM 로트 번호 82276.1.a)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX233P(Abzena, 로트 번호 PP-0924-001-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX233이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231(ATUM 로트 번호 72928.1.a)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX231P(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-017-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX201이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231R(Abzena, 로트 번호 PP-0924-001-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(INX R)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 중성 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231S(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 6.9인 INX231이다. 링커/페이로드(INX S)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-24)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231V(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-2)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.8인 INX231이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231W(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-3)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.5인 INX231이다. 링커/페이로드(INX W)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 양으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(J)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(J)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX240J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX240 항체이다. 링커/페이로드(J)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234P(Abzena, 로트 번호 HA-0853-02)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A3(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-1)은 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드 (INX A3)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 양으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A4(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A4)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-43)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234T(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX T)는 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234V(Abzena, RJS-1054-003)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A5(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-002)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A5)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-44)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A11(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A11)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커(Asn/gly)로 이루어진다.
INX231A7(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.8인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A7)는 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A12(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-002)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 6.99인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A12)는 인산화된 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A23(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-006-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.34인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A23)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A13(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-003)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 5.82인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A13)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-34)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A1(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-004)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.6인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A1)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-35)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
표적 B-P(Abzena PP-0924-031)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 항-마우스 표적 B 항체이다. 이 항체는 상이한 면역 세포 유형 상에서 발현되고 내재화 항체인, VISTA 이외의 면역 세포 특이적 항원에 결합한다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201V(Abzena, 로트 번호 SCG-1120-012-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.86인 INX201이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A9(Abzena, 로트 번호 AF-1114-007-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 7.3인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A9)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-46)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 복강내(i.p.) 주사하여 명시된 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사제인 NDC 57319-519-05를 PBS에 희석시키고 i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
LPS
LPS는 AMSBIO(#9028)로부터 얻었다. 마우스에게 0.5㎎/㎏을 투여하였다.
마우스
hVISTA 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였다. 모든 실험은 9 내지 15주령으로 등록된 암컷 마우스에서 수행하였다.
채혈 및 준비
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다. 그런 다음 혈액을 550rcf에서 5분 동안 원심분리시키고 혈장을 수집하여 사이토카인 분석 전에 -80℃에서 저장하였다.
혈장 사이토카인 분석
Millipore 플랫폼을 사용한 사이토카인 분석
밀리포어 마우스 5 또는 7-플렉스 플랫폼을 사용하여 25㎕의 혈장에 대해 사이토카인 분석을 수행하였다. ADC-INVIVO-30 및 35의 경우, Immune Monitoring Lab(IML, Dartmouth-Hitchcock Norris Cotton Cancer Center의 Shared Resources)에서 분석을 수행하였다.
분석에 포함된 사이토카인은 MIP-1α, TNFα, IL-1β, IL-12p40 및 MIG였고, 하기와 같이 ELISA를 통해서 검출되었다:
BioLegend (카탈로그 번호 430904) ELISA MAX Deluxe Set Mouse TNF-α
BioLegend (카탈로그 번호 431604) ELISA MAX Deluxe Set Mouse IL-12/IL-23 (p40)
제조사의 포함된 프로토콜에 따라 ELISA를 수행하였다.
사이토카인 데이터는 IL-12p40의 경우에는 20pg/㎖ 임계값 및/또는 TNF-α의 경우에는 10pg/㎖ 임계값 미만일 때 삭제되는데, 그 이유는 그것이 LPS 주사 실패를 나타내기 때문이다.
세포 단리
안락사, 마우스 복강에 7㎖의 PBS/0.5% BSA/2mM EDTA를 주사하였다. 복막을 간단히 마사지한 후, 작은 절개를 수행하고 복막 세척액을 채취하였다. 음성 선택(Miltenyi kit, ref 130-110-434)을 사용하여 PRM을 단리시켰다. 비장을 기계적으로 해부하고 분리시키고; 음성 선택(Stem Cell, EasySep™ Mouse CD11b Positive Selection Kit II)을 사용하여 단핵구를 분리시켰다.
RNA 준비 및 실시간 PCR
상이한 조직으로부터의 세포 펠릿을 RNeasy Plus Mini kit(Qiagen, PN: 74136)로부터의 0.4㎖ RNeasy 용해 완충액에 재현탁시키고, 20G 니들로 5회 균질화시켰다. 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리시키고 30 또는 40㎕ H2O(RNase/DNase 무함유)에 용출시켰다. RNA 농도를 Nanodrop을 사용하여 UV 분광학으로 평가하였다.
Taqman 역전사 시약(#N8080234)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사를 수행하였다.
정량 실시간 PCR은 Taqman 마스터 믹스 2X 키트(#4369016) 및 마우스 FKBP5용 Taqman 프라이머(Mm00487401_m1) 및 마우스 HPRT를 하우스키핑 유전자(Mm446968_m1)로 사용하여 수행하고 Applied Biosystem의 QuantStudio3에서 실행하였다.
Ct 데이터를 ΔCt(샘플 내의 HPRT로 정규화된 FKBP5)로 변환한 다음 ΔΔCt(처리된 샘플 대 PBS 대조군에 대한 FKBP5 상대 수준)로 변환하여 PBS에 대한 Log2 배수 변화를 얻었다.
결과
실험 1: LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX201J 효능의 생체내 효능의 평가
도 35에 도시된 바와 같이, 10㎎/㎏의 INX201J 처리는 LPS-유도된 IL-12p40 방출 제어에 있어서 2㎎/㎏의 Dex와 유사한 효능을 나타내었다. 10㎎/㎏의 INX201J는 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드(Dex가 부분적인 효능만 있는 용량)에 해당하는 몰을 전달한다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
이 실험에서 본 발명자들은 본 발명자들의 ADC가 유리 Dex보다 처리에 더 많은 시간이 필요한지를 평가하였다. 본 발명자들은 LPS 전 2시간에 비해 LPS 주사 17시간 전에 ADC를 투여했을 때 효능이 개선되었음을 보여주었다. LPS 후 2시간과 4시간 사이에 사이토카인 반응 차이는 인지되지 않았고 모든 본 발명자들의 다음 연구에서는 2시간 시점에서만 혈장을 수집하였다. 도 35는 말초 혈액에서 LPS 2(좌측) 및 4시간(우측) 후 IL-12p40 변화를 도시한다. 마우스 멀티-플렉스를 사용하여 측정된 혈장 농도; 투여: Dex(사각형)를 0.02, 0.2, 2 및 5㎎/㎏으로 LPS 자극 2시간 전에 투여하였고, INX201J(원)를 0.2㎎/㎏ GC를 제공하는 10㎎/㎏으로 LPS 주사 2 또는 17시간 전에 투여하였다. PBS 단독 군(회색의 채워진 삼각형)은 자극의 부재 하에서 기준선 사이토카인 수준을 나타낸다; PBS + LPS(흑색의 채워진 삼각형)(SEM; 분석으로부터 기술적 실패가 배제되는 것을 제외하고는 n=5/군; PBS + LPS 군과 비교된 보통 일원 분산분석). 데이터는 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)로 투여된 INX201J가 LPS 유도된 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 2 또는 5㎎/㎏로 투여된 덱사메타손과 유사한 효능을 나타냄을 보여준다.
실험 2: LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX201J 용량 반응
본 실험에서 본 발명자들은 더 높은 희석에서 INX201J 항-염증 특성을 평가하였다. 도 36에 도시된 바와 같이, 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드)의 INX201J는 MIG를 제외하고 분석된 모든 사이토카인에 대해 2㎎/㎏의 Dex 효능과 동등한 효능을 가진 반면 0.2㎎/㎏의 Dex는 INX201J에 비해서 감소된 효능을 갖는다. INX201J는 0.06 및 0.02㎎/㎏의 페이로드로 희석했을 때 여전히 약간의 효능을 나타내었다.
본 발명자들은 또한 INX201J에서 수행한 것처럼 LPS 전 17시간에 주사했을 때 Dex의 효능을 시험하였다. 보다 구체적으로, 도 36의 실험 데이터는 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 사이토카인 변화를 나타낸다. 이 실험에서 혈장 농도를 마우스 5-플렉스를 사용하여 측정하였고; Dex를 0.002, 0.02, 0.2, 2㎎/㎏으로 LPS 자극 2시간 전(사각형)에 또는 2㎎/㎏으로 LPS 17시간 전(흑색의 채워진 사각형)에 투여하였고, INX201J(원)를 0.02, 0.06, 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다. PBS 단독 군(회색의 삼각형)은 자극의 부재 하에서 기준선 사이토카인 수준을 나타낸다; PBS + LPS(채워진 흑색 삼각형)(SEM; 분석으로부터 기술적 실패가 배제되는 것을 제외하고는 n=5/군; PBS + LPS 군과 비교된 보통 일원 분산분석). 예상된 바와 같이, Dex의 반감기가 짧기 때문에 LPS 2시간 전에 투여된 군과 비교했을 때 해당 군에서 효력 손실이 있었으며, 이는 INX201J가 사이토카인 생산에 대한 약력학적 영향을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 데이터는 INX201J가 LPS-유도된 MIP-1α, TNFα, IL-1β, IL-12p40 및 MIG 반응을 제어하는 데 있어서 2㎎/㎏의 Dex에 대해서 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 대등한 효능을 가짐을 나타낸다. 상대적으로 0.2㎎/㎏의 Dex는 효능이 제한적이었다.
실험 3 : LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX201J 용량 반응
본 실험에서, 0.2 및 0.06㎎/㎏의 GC 페이로드에서 INX201J의 효능과 2 및 0.2㎎/㎏의 유리 Dex의 효능을 비교하였다. 구체적으로, 도 37의 실험은 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα 변화를 도시한다. ELISA를 사용하여 TNFα 혈장 농도를 측정하였고; 투여: Dex를 0.2 및 2㎎/㎏으로 LPS 자극 2시간 전(사각형)에 투여하였고, INX201J(원)를 0.06 및 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다. PBS 군(채워진 흑색 삼각형)은 LPS 2시간 전에 PBS를 제공받았다. IgG1siJ(G1siJ) 군(삼각형)은 LPS 17시간 전에 0.2㎎/㎏의 페이로드로 GC에 접합된 인간 IgG1 침묵을 제공받았다. (SEM; 분석으로부터 기술적 실패가 배제되는 것을 제외하고는 n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 37의 데이터로부터 나타난 바와 같이, 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드에서 INX201J는 2㎎/㎏에서 Dex에 대해서 LPS에 대한 TNFα 반응을 제어하는 데 대등한 효능을 나타내었다. 0.06㎎/㎏의 GC 페이로드에서 INX201J는 0.2㎎/㎏의 Dex보다 여전히 더 높은 효능을 나타내었다. 동일한 페이로드에 접합된 대조군 인간 IgG1 침묵이 주사된 대조군은 TNFα 상향 조절을 방지하는 데 어느 정도 수준의 효능을 나타내었다. 용량 반응 연구는 GC 페이로드가 ADC INX201J를 통해 전달되었을 때 효능이 개선/증강되었음을 나타낸 반면; 0.2㎎/㎏의 유리 Dex는 TNFα의 LPS 유도 상향조절을 방지하는 효능이 없는 것으로 나타났고 ADC를 통해 전달된 등가의 몰의 GC 페이로드는 높은 효력을 나타내었다 참고: GC에 접합된 인간 IgG1 침묵 대조군(INX201J와 동일한 링커 및 GC 페이로드)은 TNFα의 LPS 유도 상향조절에 약하게 영향을 미치는 것으로 나타났다.
실험 4: LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX201J 대 덱사메타손의 생체내 효능의 평가
도 38의 실험은 상이한 ADC를 사용한 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα 변화를 나타내며, TNFα 혈장 농도는 ELISA에 의해 측정되었고; Dex는 LPS 자극 2시간 전에 0.2 및 2㎎/㎏(사각형)으로 투여되었고, INX201J(원) 및 INX201N(역삼각형)은 각각 LPS 주사 17시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여되었고; PBS군은 LPS 2시간 전에 PBS를 제공받았다(채워진 검은색 삼각형). (SEM; 분석으로부터 기술적 실패가 배제되는 것을 제외하고는 n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 38의 데이터로부터 나타난 바와 같이 그리고 상기 실험에서 추가로 관찰된 바와 같이, 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드에서 INX201J는 LPS 유도 사이토카인 반응을 제어하는데 있어서 2㎎/㎏의 Dex와 유사한 효능을 가졌다. 또한 데이터는 INX201N이 TNFα 반응을 제어하는 데 있어서 효능이 없었다는 것을 나타내는데, 이는 아마도 생체내에서 이 링커/페이로드의 방출된 생성물의 비효율적인 절단 또는 미세응집물 형성으로 인한 것일 것이다. INX201J는 2㎎/㎏에서의 Dex와 동등한 효력으로 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드)를 투여했을 때 LPS 유도 TNFα의 상향조절을 방지하였다. 이에 반해서, INX201N은 해당 모델에서 효능을 나타내지 않았다.
실험 5: LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX231J, INX234J 및 INX240J 대 INX201J의 생체내 효능의 평가
본 발명자들은 동일한 INX J 페이로드에 접합된 3개의 상이한 항-VISTA 항체를 추가로 평가하였다. 구체적으로, 도 39의 실험은 사이토카인 혈장 농도는 ELISA에 의해 측정된 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(좌측) 및 IL-12p40(우측) 변화를 나타내고; PBS(채워진 원), INX201J(사각형), INX231J(삼각형), INX234J(마름모) 및 INX201P(역삼각형)는 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다(SEM; n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 39의 데이터로부터 나타난 바와 같이, INX231J, INX234J 및 INX240J는 LPS-유도 사이토카인 반응을 제어하는데 있어서 INX201J와 유사한 효력을 나타내었다. 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)로 투여된 모든 ADC는 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 INX201J와 대등한 효능을 나타내었다.
실험 6: LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX201O 및 INX201P 대 INX201J의 생체내 효능의 평가
도 40의 실험에서 상이한 ADC를 10㎎/㎏으로 투여하여 0.2㎎/㎏의 페이로드를 전달하고 특정 사이토카인에 대한 이들의 효과를 평가하였다. 구체적으로, 도 40은 사이토카인 혈장 농도가 ELISA에 의해 측정된 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(좌측) 및 IL-12p40(우측) 변화를 도시하고; PBS(채워진 삼각형), INX201J(원), INX201O(사각형) 및 INX201P(마름모)는 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다(SEM; 기술적인 실패가 분석으로부터 배제되는 경우를 제외하고는 n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 40의 데이터로부터 나타난 바와 같이, INX201P는 LPS-유도 사이토카인 반응을 제어하는 데 있어서 INX201J와 유사한 효능을 보인 반면, INX201O는 효능이 감소하였다. INX201P는 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 INX201J와 대등한 효능을 가졌다. 상대적으로, INX201O는 활성이 감소하였다.
실험 7: LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX201O 및 INX201P 대 INX201J의 생체내 효능의 평가 - 용량 반응 연구
도 41의 실험에서 사이토카인 혈장 농도는 ELISA에 의해 측정하였고; PBS, INX201J(원), INX201O(사각형) 및 INX201P(마름모)는 각각 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 17시간 전에 투여하였다(SEM; 기술적인 실패가 분석으로부터 배제되는 경우를 제외하고는 n=5/군; PBS 군(채워진 흑색 삼각형)과 비교된 보통 일원 분산분석). 구체적으로, 도 41은 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40 (좌측) 변화를 도시한다.
이전 실험 6의 결과와 유사하게, 이들 실험에서 INX201O는 INX201J에 비해 감소된 효능을 나타내었다. 이에 반해서, INX201P 및 INX201J는 LPS에 대한 IL-12p40 및 TNFα 반응을 제어하는 데 있어서 유사한 효력을 나타내었다. 또한 0.06㎎/㎏의 페이로드에서 여전히 사이토카인 반응의 효력이 있는 제어가 존재한다는 것을 주목하기 바란다(도 41). 용량 반응 비교를 포함하는 이전 실험의 이 반복에서, INX201P는 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 INX201J와 대등한 효능을 나타내었다. INX201O는 다시 활성이 감소하였다.
실험 8: LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX231R, INX233P 대 INX231P의 생체내 효능의 평가
도 42의 실험은 상이한 ADC를 사용하여 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40 (좌측) 변화를 도시한다. 이 실험에서 ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 20시간 전에 투여하였다(INX231P(사각형), INX231R(삼각형), INX233P(마름모))(SEM; 기술적인 실패가 분석으로부터 배제되는 경우를 제외하고는 n=5/군; PBS 군(채워진 원)과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 42에서 볼 수 있는 바와 같이, INX231R(중성 다이펩타이드 링커)은 IL-12p40 유도에 거의 영향을 미치지 않았지만 LPS 주사 후 TNFα의 현저한 감소를 나타내었다. 이에 반해서, INX233P는 INX231P(둘 다 음으로 하전된 다이펩타이드 링커 포함)와 유사한 효능을 가졌다. 모든 ADC는 10㎎/㎏으로 투여되어 0.2㎎/㎏의 페이로드를 전달하였다. INX231R 및 INX233P는 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 INX231P와 대등한 효능을 나타낸다.
실험 9: LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX231R, INX201O, INX231S, INX231V 및 INX231W 대 INX231P의 생체내 효능의 평가
도 43의 실험은 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40 (좌측) 변화를 도시한다. 이들 실험에서 ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 LPS 주사 20시간 전에 투여하였다(INX231P(채워진 사각형), INX231R(채워진 삼각형), INX201O(채워진 마름모), INX231S(원), INX231V(사각형), INX231W(삼각형))(SEM; 2회의 기술적인 실패가 분석으로부터 배제된 INX231S를 제외하고는 n=4/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석(채워진 원)은 유의하지 않은 데이터를 나타내었음). 또한 이 실험에서 일부 ADC의 DAR은 8 미만이므로 ADC 용량을 0.2㎎/㎏의 페이로드를 전달하도록 조정하였다.
실험 8에서 관찰된 바와 같이, 이들 실험에서 INX231R은 INX231P보다 효능이 낮았고 INX231W는 주로 TNFα에 미치는 영향과 유사하게 거동하였다. 또한 INX231S 및 INX231V는 INX231P와 유사한 효능을 나타내었다. 마지막으로, 이전의 두 실험에서 관찰된 바와 같이 INX201O는 다른 ADC에 비해 효능이 감소한 것으로 나타났다(도 43). INX231R, INX231S, INX231V 및 INX231W는 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 INX231P와 대등한 효능을 나타낸다. 상대적으로, INX201O는 활성이 감소하였다. 또한 INX201O를 제외하고 시험된 모든 ADC는 약력학적 범위가 적어도 4일인 FKBP5 전사 유도에 의해 입증된 바와 같이 GC 페이로드를 강력하게 전달하였다.
실험 10: FKBP5 전사에 대한 INX231R, INX201O, INX231S, INX231V 및 INX231W 대 INX231P 영향의 비교
도 44의 실험은 복막 상주 4일 post ADC 처리 4일 후 복막 상주에서 ADC 처리 후 FKBP5 전사 활성화를 나타낸다. 이들 실험에서 ADC를 제0일에 i.p.로 주사하여 각각 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드를 전달하였고; PRM을 제3일에 단리시켰다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(SEM, PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석, n=4).
본 명세서에 나타낸 바와 같이 복막 상주 대식세포(PRM)는 ADC에 매우 감응성이며 GC 표적 FKBP5에 대한 GC 영향은 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의해 측정될 수 있다. 따라서, PRM을 LPS 처리 3일 후(ADC 투여 4일 후)에 단리시키고, RNA를 추출하고, FKBP5에 대해 RT-qPCR을 수행하였다. 도 44의 데이터로부터 나타난 바와 같이, INX201O를 제외하고 모든 ADC는 효력이 있는 FKBP5 전사를 유도하여 GC 페이로드의 적절한 전달 및 약력학적 범위가 적어도 4일임을 입증하였다. INX234P, INX234A3, 및 INX234A4는 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 대등한 효능을 나타낸다. INX234T는 TNFα에 제한적인 영향만을 가졌다. INX231R, INX231S, INX231V 및 INX231W는 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 INX231P와 대등한 효능을 나타낸다. 상대적으로, INX201O는 활성이 감소하였다. 또한 INX201O를 제외하고 시험된 모든 ADC는 약력학적 범위가 적어도 4일인 FKBP5 전사 유도에 의해 입증된 바와 같이 GC 페이로드를 강력하게 전달하였다.
실험 11: LPS 유도 사이토카인 반응에 대한 INX234P, INX234A3, INX234A4, INX234T 및 표적 B-P의 생체내 효능의 평가
도 45의 실험에 나타낸 바와 같이, INX234P, INX234A3, 및 INX234A4는 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 대등한 효능을 나타낸다. INX234T는 TNFα에 제한적인 영향만을 가졌다. 본 실험에서 본 발명자들은 또한 항체가 INX P 페이로드에 접합된 새로운 표적(표적 B)의 마우스 버전에 대해 지향되는 항체인 ADC 표적 B-P를 평가하였고; 표적 B-P는 IL-12P40의 상당한 감소와 함께 INX234T와 유사한 효능을 나타냈지만 TNFα의 변화는 없었다.
보다 구체적으로, 도 45에서 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40(좌측) 변화를 도시한다. ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 LPS 주사 20시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다(SEM; 군당 1개의 기술적인 실패가 기록된 INX234P, INX234A4 및 INX234T를 제외하고는 n=5/군; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석). INX P 페이로드에 접합된 다른 면역 세포 특이적 항원(VISTA 제외)에 대한 항체를 포함하는 ADC는 IL-12P40의 상당한 감소와 함께 INX234T와 유사한 효능을 나타내었지만 TNFα의 변화는 없었다.
실험 12: 단기간 LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX234V, INX234A5, INX234A11 vs PBS의 효능 평가
도 46의 실험에서 사이토카인에서 TNFα(우측) 및 IL-12p40(좌측) 변화를 말초 혈액에서 LPS 2시간 후에 도시하고, ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 LPS 주사 20시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다(INX234V(채워진 사각형), INX234A5(채워진 삼각형), INX234A11(채워진 마름모))(SEM; n=5/군 ex; PBS 군(채워진 원)과 비교된 보통 일원 분산분석). 도 46의 데이터는 INX234V, INX234A5 및 INX234A11이 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 대등한 효능을 나타낸다는 것을 나타낸다.
실험 13: 단기간 LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX231A7, INX231A12, INX231A23; INX234A1, INX234A13 vs INX234V 및 PS의 효능 평가
도 47에서의 실험은 상이한 ADC의 투여 후 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40(좌측) 변화를 나타낸다. ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; INX231A7을 0.08㎎/㎏의 페이로드로 투여한 것을 제외하고는 모든 ADC 및 PBS를 LPS 주사 20시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다(INX234V(채워진 사각형), INX231A7(채워진 삼각형), INX231A12(채워진 마름모), INX231A23(원), INX234A1(사각형), INX234A13(삼각형))(SEM; n=5/군 ex; PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 47의 결과에 나타난 바와 같이, INX234V, INX231A12 및 INX231A23은 IL-12p40 및 TNFα의 생산을 제어하는 데 있어서 유사한 효능을 나타내었다. INX2341A7는 여전히 IL-12p40에서 상당한 변화를 일으키고 TNFα에 대해 유의한 변화(P=0.052)에 가깝지만 효력이 더 낮았다. (그러나 참고로 INX231A7은 0.08㎎/㎏의 페이로드로 투여되었다). 또한, INX234A1 및 INX234A13 모두 LPS-유도된 사이토카인 생산에 영향을 미치지 않았다. INX234V, INX231A12, INX231A23 및 INX234A1는 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 대등한 효능을 나타낸다. INX231A7은 또한 0.08㎎/㎏의 페이로드로 투여하면서 대등한 효능을 나타내었다. INX234A13 및 INX234A11은 효능을 나타내지 않았다.
실험 14: 단기간 LPS-유도 사이토카인 방출에서 INX234P, INX234A9, INX201V vs PBS의 효능 평가
도 48의 실험은 상이한 ADC로 인한 말초 혈액에서 LPS 2시간 후 TNFα(우측) 및 IL-12p40(좌측) 변화를 나타낸다. 이들 실험에서 ELISA에 의해서 사이토카인 혈장 농도를 측정하였고; 모든 ADC 및 PBS를 LPS 주사 20시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여하였다(SEM; PBS, INX234P, INX201V 군에서 1개의 샘플 및 INX234A9 군에서 2개의 샘플이 기술적인 이유로 인해서 제거되어야 하는 것을 제외하고는 n=5/군, PBS 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 48의 데이터로부터 나타난 바와 같이, INX234A9 및 INX201V는 사이토카인 반응을 방지하는데 있어서 INX234P보다 효력이 덜한 것으로 나타났지만; 감소된 효력은 하나의 이상치 지점에 의해서 유도된다(두 사이토카인에 대한 동일한 동물은 주사 실패로 인한 치료 영향을 나타내지 않음).
결론
본 명세서에 개시된 바와 같이, 생리 pH에서 VISTA에 결합하고 또한 모두 짧은 PK 및 상이한 상보성 결정 영역(CDR) 및 상이한 GC 페이로드를 갖는 상이한 항-VISTA 항체를 포함하는 상이한 ADC를 합성하였다.
이 데이터는 INX201, INX231, INX234, INX240 또는 INX233 각각을 사용한 면역 세포 표적화 GC 전달은 다음을 나타낸다:
Figure pct00762
LPS 유도 사이토카인 반응을 효율적으로 감소시킴.
㎎/㎏의 페이로드 기준으로 약 10배 낮은 용량의 GC를 전달하여 유사한 효력을 허용함.
GC의 약력학의 증가된 기간을 초래할 수 있음.
추가로, 본 발명자들은 다이펩타이드 링커의 전하가 변화된 INX P 링커 페이로드와 유사한 접합체를 평가하였다. 이것은 양전하(INX W), 중성 전하(INX R) 및 음전하(INX P)를 포함하였다. 이러한 결과는 다음을 나타내었다:
양으로 하전된 INX W 및 중성 INX R 둘 다는 이 모델에서 효능이 있었지만 음으로 하전된 INX P가 더 효력이 있었다.
모든 다이펩타이드 링커 변이체(양성, 음성 및 중성)는 GC 리포터 FKBP5의 높은 발현 수준으로 입증된 바와 같이 적어도 4일의 약력학적 범위를 나타내었다.
본 발명자들은 페이로드의 구조를 변화시킨 초기 INX J 링커/페이로드에 더하여 4개의 부데소나이드 유사체 링커/페이로드, INX N, INX O, INX P 및 INX V를 갖는 접합체를 추가로 평가하였다. 이러한 결과는 다음을 나타내었다:
접합된 INX N 링커/페이로드는 단기간 LPS 활성화 모델에서 효력이 없는데, 이는 아마도 INX N의 방출된 생성물의 효율적인 절단의 결여 또는 미세응집물 형성을 반영한다.
접합된 INX O 링커/페이로드는 이 모델에 영향을 미쳤지만 접합된 INX J, INX P 또는 INX V 링커/페이로드에 비해 감소된 효력을 나타내었다.
접합된 INXP는 접합된 INX J 및 INX V 링커/페이로드와 유사한 효능을 나타내었다.
접합된 INX P, INX V, 및 INX J 링커 페이로드는 GC 리포터 유전자 FKBP5의 높은 수준의 발현으로 입증된 바와 같이 적어도 4일의 약력학적 범위를 나타내었다.
특정 페이로드 변경은 효력을 방해하지 않고 내약성일 수 있다.
본 발명자들은 부데소나이드 유사체(INX P)와 비교하여 플루오시놀론 아세토나이드 유사체(INX S)와의 접합체를 평가하였다. 이러한 결과는 다음을 나타내었다:
INX231P와 INX231S는 유사한 효능을 나타내었다.
INX231P 및 INX231S 둘 다는 GC 리포터 유전자 FKBP5의 높은 수준의 발현으로 입증된 바와 같이 적어도 4일의 약력학적 범위를 나타내었다.
INX234P, INX234A3 및 INX234A4는 유사한 효력을 갖는 반면, INX234T는 LPS 유도 TNFa 생산의 더 제한적인(그리고 유의하지 않은) 제어를 나타내었다.
INX234V, INX234A5 및 INX234A11은 LPS 유도 IL-12p40 및 TNFa 생산을 제어하는 데 있어서 유사한 효력을 나타내었다.
INX231A7, INX231A12 및 INX231A23은 LPS 유도 IL-12p40 및 TNFa 생산을 제어하는 데 있어서 INX234V 효력과 유사한 효력을 나타낸 반면 INX234A1 및 INX234A13은 영향이 없었다.
INX234V, INX231A12, INX231A23 및 INX234A1은 10㎎/㎏(약 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드 전달)에서 LPS-유도 TNFα 및 IL-12p40 반응을 제어하는 데 있어서 대등한 효능을 나타낸다. INX231A7은 또한 0.08㎎/㎏의 페이로드로 투여하면서 대등한 효능을 나타내었다. 이에 반해서, INX234A13 및 INX234A11은 효능을 나타내지 않았다.
더욱이, 중요한 것은, 본 발명자들은 본 발명에 따른 예시적인 페이로드인 INX P 페이로드가 표적 B로 지칭되는 항원의 뮤린 오쏘로그를 포함하는 구별되는 표적(VISTA 아님)에 결합하는 항체에 접합된 경우 면역 세포에 전달될 때 이의 효력을 보존하였다는 것을 발견하였. 결과는 INX P 페이로드가 다른 면역 세포 항원에 결합하는 항체에 접합될 때 이러한 동일한 페이로드가 항-VISTA 항체에 접합되었을 때 관찰되는 결과와 유사하게, 골수 세포에 의해 효율적으로 내재화됨을 나타낸다. 이에 기초하여, 본 발명자들은 본 발명에 따른 페이로드가 다른(비-VISTA) 면역 세포 항원, 예를 들어, 예를 들어, 다른 면역 세포 유형 중에서 B, T NK, 골수, 대식세포, Treg, 호중구 및 수지상 세포를 포함하는 하나 이상의 유형의 면역 세포에 의해 발현되는 다른 항원에 결합하는 다른 항체에 접합되고 또한 본 발명에 따른 페이로드를 이들 면역 세포로 효과적으로 전달할 것이라는 것이라고 예상한다.
또한, 본 발명자들은 절단 지점 근처에 스피로중심을 함유하는 링커 페이로드를 갖는 2개의 접합체인 INX234A9 및 INX201V가 LPS 유도된 IL-12p40 및 TNFa 생산을 제어하는데 있어서 INX234P보다 효력이 약한 것으로 보이지만, 감소된 효력은 가능한 이상치 데이터 지점에 의해 유도된다는 것을 입증하였다(두 사이토카인에 대한 동일한 동물은 치료 영향을 나타내지 않았으므로 이러한 효력 차이는 주입 실패에 기인할 수 있음).
참고문헌
실시예 8: 항-VISTA 항체 약물 접합체는 비-VISTA 발현 세포에 대해서 제한된 영향을 갖는다.
비-표적(비-VISTA) 발현 세포에 대한 예시적인 ADC의 영향을 본 실시예에 기재되고 도 49의 실험에서 나타낸 실험에서 평가하였다. 이들 연구의 목적은 유리 덱사메타손(Dex)과 비교하여 VISTA 발현 세포/조직에 대한 본 발명의 ADC의 표적화 특이성을 검증하는 것이었다. GC 전달 및 활성을 모니터링/확인하기 위해서, 본 발명자들은 감응성이고 초기 GC 반응 유전자인 FKBP5의 전사 활성화를 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)로 측정하였다(Vermeer et al., (2003) Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression: a potential marker for glucocorticoid sensitivity, potency, and bioavailability. J Clin Endocrinol Metab. Jan;88(1):277-84). 아래에 자세히 설명되어 있는 이러한 실험에서 INX201J 또는 유리 Dex를 복강내(i.p.) 주사를 통해 생체 내 전달한 후 간, 뇌 및 부신으로부터 VISTA 발현 비장 세포 및 비-VISTA 발현 세포를 단리시켰다. 그런 다음 RNA를 추출하고, FKBP5 전사 수준을 평가하였다.
물질 및 방법
방법
Dex를 i.p.주사하였고, 피크 FKBP5 유도에 상응하는 2시간 후 마우스를 안락사시키고 세포를 단리시켰다. INX201J를 주사하였고 20시간 후 마우스를 안락사시키고 세포를 단리시켜 ADC 처리 및 피크 FKBP5 유도에 충분한 시간을 제공하였다. PBS를 주사한 대조군은 FKBP5 전사 기준선을 정의하기 위해서 포함되었다.
시험 작용제 및 투여량
항체
Figure pct00779
INX201(Aragen, 로트 번호 BP-3200-019-6)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX201J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-025-1, JZ-0556-027, JZ-0556-013)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(J)는 이전에 보고된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 복강내(i.p.) 주사하여 명시된 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사제인 NDC 57319-519-05를 PBS에 희석시키고 i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
마우스
hVISTA KI 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였다. 모든 실험은 9 내지 15주령으로 등록된 암컷 마우스에서 수행하였다.
세포 단리
안락사 후, 비장, 간, 부신 및 뇌를 절제하고 기계적으로 해리시켰다. 40㎛ 필터를 통과시킨 후, 세포 펠릿을 RNA 용해 완충액에 재현탁시켰다(하기 참조).
RNA 준비 및 실시간 PCR
상이한 조직으로부터의 세포 펠릿을 RNeasy Plus Mini kit(Qiagen, PN: 74136)로부터의 0.4㎖ RNeasy 용해 완충액에 재현탁시키고, 20G 니들로 5회 균질화시켰다. 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리시키고 30 또는 40㎕ H2O(RNase/DNase 무함유)에 용출시켰다. RNA 농도를 Nanodrop에서 평가하였다.
Taqman 역전사 시약(#N8080234)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사를 수행하였다. 정량 실시간 PCR은 Taqman 마스터 믹스 2X 키트(#4369016) 및 마우스 FKBP5용 Taqman 프라이머(Mm00487401_m1) 및 마우스 HPRT를 하우스키핑 유전자(Mm446968_m1)로 사용하여 수행하고 Applied Biosystem의 QuantStudio3에서 실행하였다.
Ct 데이터를 PBS에 대한 ΔCt 및 ΔΔCt 또는 Log2 배수 변화로 변환시켰다.
결과
간략하면 Miltenyi의 Liver dissociation kit 및 Liver Endothelial Cell Isolation kit(각각 130-105-807 및 130-092-007)를 사용하여 hVISTA KI 마우스로부터 간 내피 세포를 단리시켰다. 도 49의 실험에서 나타난 바와 같이, CD45 음성(비-면역) CD31 양성(내피) 세포는 높은 수준의 VISTA 발현을 나타낸다(적색 선 VISTA; 실선 회색 항체 없음). 구체적으로, 도 49는 VISTA가 간 내피 세포, 특히 hVISTA 넉-인 마우스 간으로부터 단리되고 항-인간 VISTA로 염색되거나(적색선, 우측으로 이동) 또는 염색되지 않은(채워진 회색) CD45-CD31+ 비-면역 내피 세포에서 높게 발현된다는 것을 나타낸다.
도 50에 나타낸 실험에서 본 발명자들은 비-VISTA 발현 조직(부신, 뇌 및 간) 및 암컷 hVISTA KI 마우스에서 VISTA 발현 비장에 대한 INX201J 대 Dex의 영향을 평가하였다. 구체적으로, 도 50에 나타난 바와 같은 부신, 뇌, 간 및 비장에서 INX201J 주사 후 FKBP5 전사 활성화. 0.3, 3, 10㎎/㎏(각각 0.006, 0.06 및 0.2㎎/㎏의 페이로드를 전달함)으로의 1회 단일 i.p. 주사 20시간 후에 INX201J 효과를 측정하였다. 0.2 또는 2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군의 평균에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(n=4 마우스/군, PBS-단독 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
도 50의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, INX201J 주사 후 부신 및 뇌에서 기준선을 초과하는 신호가 검출되지 않은 반면, 2㎎/㎏의 Dex는 부신에 대한 FKBP5 전사체의 약간의 증가 및 뇌에서 강력한 증가를 초래하였다. 간에서, FKBP5는 0.2㎎/㎏의 페이로드에서 INX201J 또는 Dex와 유사한 수준으로 검출되었으며, 2㎎/㎏의 Dex에서 높은 수준으로 검출되었다.
또한, 0.2㎎/㎏의 페이로드의 Dex와 비교했을 때 0.2㎎/㎏의 페이로드의 INX201J를 사용하여 FKBP5 신호의 10배 증가와 함께 INX201J를 사용한 명확한 용량 의존적 유도가 비장에서 관찰되었다. 대조적으로 Dex를 사용한 대등한 반응은 2㎎/㎏에서만 달성되었다.
결론
데이터는 3 및 10㎎/㎏(0.06 및 0.2㎎/㎏의 페이로드)에서 INX201J가 VISTA-발현 비장세포에서 FKBP5 발현을 유도하지만 부신 또는 뇌에서는 유도하지 않는다는 것을 나타낸다(도 49). 간에서, INX201J는 3 및 10㎎/㎏(페이로드의 0.06 및 0.2㎎/㎏)로 투여되었을 때 FKBP5를 적절히 유도하였는데, 이는 아마도 이 조직의 풍부한 면역 세포 및 간 내피 세포에서의 강력한 VISTA 발현 때문일 것이다(도 50). 이에 반해서, 2㎎/㎏의 치료 용량에서 Dex는 비장 세포에서 FKBP5 유도를 유도하였고, 이러한 동일한 용량은 뇌 및 간에서 강력한 수준의 FKBP5를 유도하였고 부신에서 보통 수준의 FKPB5를 유도하였다.
실시예 9: 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 본 발명의 스테로이드 페이로드 및 항체 글루코코티코이드 접합체의 시험관내 효력
본 실시예에서 본 발명자들은 염증의 시험관내 모델에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 스테로이드에서 상이한 스테로이드 페이로드의 시험관내 효능을 평가하였다. LPS의 존재는 PBMCS 증식 및 사이토카인 방출을 초래한다(Jansky, L., Reymanova, P., & Kopecky, J. (2003), "Dynamics of cytokine production in human peripheral blood mononuclear cells stimulated by LPS, 또는 infected by Borrelia", Physiological Research, 52(5), 593-5981).
물질 및 방법
방법
신규한 스테로이드의 효력을 LPS 자극된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)의 모델에서 평가하였다. 이 검정에서 자극된 PBMC는 다수의 전염증성 사이토카인1을 생산한다. 스테로이드 효력은 이러한 연구에서 24시간에 미처리에 비해 용량 의존적 방식으로 자극-관련 사이토카인의 발현을 감소시키는 능력에 의해 판단되었다.
본 연구의 목적은 유리 소분자로서 또는 펩타이드 링커를 통해서 항체에 접합된 것으로서, 양호하게 특징규명된 시험관내 염증 모델에서 INX-SM-GC로 확인된 ImmuNext에서 생성된 새로운 글루코코티코이드의 효력을 평가하는 것이었다. 인간 PBMCS는 LPS로 자극되는 경우 몇몇 전염증성 사이토카인을 생산하며 이 사이토카인 반응은 글루코코티코이드(GC)에 의해 극적으로 제어될 수 있다. 본 발명자들은 본 발명자들의 연구에서 매우 효력이 있고 임상적으로 관련된 GC인 부데소나이드를 비교자로 사용하였다.
물질 및 방법
실험 설계
다음의 모든 실험에서, 연구당 1 내지 2명의 건강한 공여자로부터 단리된 인간 PBMC를 LPS로 자극하여 사이토카인 생산을 유도하였다.
세포를 연속 희석된 GC 또는 GC 접합체(1000 내지 0.2nM 페이로드)로 처리하여 개별 약물의 용량 의존적 효력을 확인하였고 부데소나이드를 양성 대조군으로 사용하였다. 유리 페이로드를 첨가한 직후 또는 접합체의 경우 접합체를 첨가한 지 4시간 후에 LPS를 첨가하였다.
본 발명자들의 예비 실험에서, 본 발명자들은 IL-6 및 IL-1b를 GC 반응성이 높은 사이토카인으로 확인하였다. 따라서, PBMC를 GC 또는 GC에 접합된 항체와 함께 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포 상청액을 수집하고, ELISA를 통해서 IL-6 및 IL-1b 사이토카인 수준에 대해서 평가하였다.
시약
시험 페이로드
부데소나이드: DMSO 중 10mM
INX-SM-1 (Abzena): DMSO 중 5mM
INX-SM-2 (Abzena): DMSO 중 2mM
INX-SM-3 (O2H): DMSO 중 10mM
INX-SM-53 (O2H): DMSO 중 10mM (INX-SM-3의 S 입체이성질체)
INX-SM-4 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-54 (O2H): DMSO 중 10mM (INX-SM-4의 S 입체이성질체)
INX-SM-6 (O2H): DMSO 중 10mM
INX-SM-56 (O2H): DMSO 중 10mM (INX-SM-6의 S 입체이성질체)
INX-SM-7 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-9 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-10 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-13 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-24 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-31 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-32 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-33 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-35 (O2H): DMSO 중 2mM
INX-SM-74 (O2H): DMSO 중 2mM (INX-SM-24의 S 입체이성질체)
INX-SM-43 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-44 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-45 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-46 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-36 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-37 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-J2 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-14 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-15 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-17 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-34 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-40 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-47 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-49 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-18 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-32 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-SM-48 (O2H): DMSO 중 20mM
INX-J2 (INX-SM-J2) (O2H): DMSO 중 20mM
덱사메타손 (Sigma 카탈로그 번호 D4902): DMSO 중 20mM
시험 접합체
INX231J (Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(INX J)는 공개된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다(INX J2).
INX231P(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-017-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231V(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-2)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.8인 INX231이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234P(Abzena, 로트 번호　JZ-0556-017-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A4(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-2)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A4)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-43)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231S(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 6.9인 INX231이다. 링커/페이로드(INX S)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-24)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234T(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX T)는 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A3(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-1)은 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드 (INX A3)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 양으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201J(Abzena, 로트 번호s: JZ-0556-025-1, JZ-0556-027, JZ-0556-013)는 DAR이 8.0이고 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 링커/페이로드에 접합된 INX201 항체이다. 링커/페이로드(INX J)는 공개된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다(INX J2).
INX201L(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-026-1)은 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(INX L)는 공개된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A11(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A11)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커(Asn/gly)로 이루어진다.
INX234V(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-003)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A5(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-002)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A5)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-44)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A23(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-006-001)은 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.34인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX A23)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A12(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-002)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 6.99인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX A12)는 인산화된 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A7(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-001)은 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.8인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX A7)는 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A13(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-003)은 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 5.82인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A13)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-34)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A1(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-004)은 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.6인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A1)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-35)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX1302(ATUM, 로트 번호 78597.2.a)는 Fc 침묵 항-인간 표적 B 항체이다.
INX1302P(Abzena, 로트 번호 PP-0924-019-002)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인, Fc 침묵 항-인간 표적 B 항체, INX1302이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX1400P(Abzena, 로트 번호 PP-0924-019-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인, Fc 침묵 항-인간 표적 A 항체이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234J(Abzena,　로트 번호 JZ-0556-013-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX J)는 공개된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다(INX J2).
INX234A9(Abzena, 로트 번호 AF-1114-007-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.3인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A9)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-46)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201V(Abzena, 로트 번호 SCG-1120-012-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.86인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231V(Pearl River, 로트 번호 101-1_02)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 3.66인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201P(Pearl River, 로트 번호 101-2_02)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 4.52인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201A23(Pearl River, 로트 번호 101-3_02)은 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 4.34인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(INX A23)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201A23(Pearl River, 로트 번호 101-4_01)은 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.71인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(INX A23)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201V(Abzena, 로트 번호 SCG-1120-032-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 3.95인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
세포 배양 배지
L-글루타민이 없는 RPMI 1640(VWR 카탈로그 번호 16750-084)
페니실린/스트렙토마이신/글루타민(ThermoFisher 카탈로그 번호 10378016)
1M Hepes(Gibco 카탈로그 번호 15630-080)
인간 AB 혈청(Valley Biomedical 카탈로그 번호 HP1022HI)
다른 시약
에쉐리키아 콜라이 O111:B4로부터의 지방다당류(Sigma 카탈로그 번호 L2630)
Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare 카탈로그 번호 17-1440-03)
ELISA 키트
인간 IL-6 ELISA MAX Deluxe(Biolegend 카탈로그 번호 430504)
인간 IL-1β ELISA MAX Deluxe (Biolegend 카탈로그 번호 437004)
PBMCS 준비
인간 PBMC를 Dartmouth Hitchcock Medical Center의 혈액 공여자 프로그램에서 확인되지 않은 건강한 인간 공여자로부터 얻은 성분채집 콘으로부터 멸균 조건 하에서 단리시켰다.
혈액을 50㎖ Falcon 튜브로 옮기고 PBS로 30㎖로 희석시켰다. 13㎖의 Ficoll-Paque Plus(Sigma Aldrich)을 혈액 아래에 겹쳐 두고 튜브를 실온에서 20분 동안 850×g에서 약간의 가속 및 제동 없이 원심분리시켰다.
단핵 세포를 혈장/Ficoll 계면에서 수집하고 50㎖의 PBS에 재현탁시키고 300×g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포를 PBS에 재현탁시키고, 계수하였다.
검정 프로토콜
단리된 PBMC를 10% 인간 A/B 혈청, 10mM Hepes, 1x 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640(검정 배지)에 재현탁시켰다.
세포를 편평 바닥 96웰 플레이트에 150,000개 세포/웰의 최종 농도로 플레이팅하고, 각각의 조건에 대해서 기술적인 반복물이 존재한다.
시험 작용제를 검정 배지에서 연속 희석시키고, 검정에 따라 또는 미처리 대조군으로서 1,000nM 내지 1nM 또는 0.2nM의 최종 농도로 첨가하였다.
LPS 자극은 1ng/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 지연된 LPS 연구를 위해서, LPS를 항체 약물 접합체(INX231J, INX231P, INX231V)의 첨가 4시간 후에 첨가하였다.
상청액을 수거하기 전에 세포를 24시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에 두었다.
인간 IL-1β 및 IL-6 ELISA 키트는 공급업체 프로토콜에 따라 상청액에 사용하였다.
모든 그래프는 GraphPad(Prism)로 작성되었다.
결과
실험 1: LPS 자극된 인간 PBMC의 사이토카인 생산에 대한 스테로이드 페이로드 INX-SM-3, INX-SM-53, INX-SM-4, INX-SM-54, 및 INX-SM-1의 저해 효과의 평가
도 51에 도시된 실험에서, 본 발명자들은 신규한 INX-GC 페이로드 INX-SM-3, INX-SM-4, INX-SM-1, INX-SM-53 및 INX-SM-54의 항-염증 효력을 평가하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMCS를 시험하였다. 도 51에 도시된 바와 같이, INX-SM-3, INX-SM-4, 및 INX-SM-1은 IL-1β 및 IL-6 생산 둘 다를 저해하고, INX-SM-3이 이들 3개 중에서 가장 효력이 있는 화합물인 것으로 보인다. 이에 반해서, 아세탈 위치에서의 S 입체이성질체-INX-SM-53 및 INX-SM-54-는 저해를 나타내지 않았다.
도 51에서의 데이터로부터, INX-SM-3, INX-SM-4 및 INX-SM-1은 IL-1β(좌측) 및 IL-6(우측) 생산을 저해하는 것으로 관찰될 수 있다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 1nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 1nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에는 처리 대조군을 플로팅하지 않았다; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
실험 2: 스테로이드 페이로드 INX-SM-6, 및 INX-SM-56의 저해 효과의 평가 및 LPS 자극된 인간 PBMC의 사이토카인 생산에 대한 INX-SM-1, INX-SM-3 및 INX-SM-4의 효과의 확인
도 52의 실험에서, 본 발명자들은 신규한 글루코코티코이드 페이로드 INX-SM-3, INX-SM-4, INX-SM-1의 항-염증 효력을 확인하였고 추가적인 화합물 INX-SM-6 및 INX-SM-56의 효력을 평가하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMCS를 시험하였다. 특히, 도 52에서 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 1nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 1nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에는 처리 대조군을 플로팅하지 않았다; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 52에 나타난 바와 같이, INX-SM-1, INX-SM-3, INX-SM-4 및 INX-SM-6은 IL-1β 생산의 저해를 나타낸다. INX-SM-3은 다시 시험된 이들 화합물 중에서 가장 효력이 있는 화합물인 것으로 보인다. 이에 반해서, 아세탈 위치에서의 S 입체이성질체-INX-SM-56-는 저해를 나타내지 않았다.
실험 3 : LPS 자극된 인간 PBMC의 사이토카인 생산에 대한 스테로이드 페이로드 INX-SM-9, INX-SM-31, 및 INX-SM-35의 저해 효과의 평가
본 실험에서, 본 발명자들은 신규한 글루코코티코이드 페이로드 INX-SM-9, INX-SM-31 및 INX-SM-35의 항-염증 효력을 평가하였다. 2명의 공여자로부터의 PBMCS를 시험하였다. 구체적으로, 도 53은 INX-SM-9, INX-SM-31 및 INX-SM-35이 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단) 생산을 저해한다는 것을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.2nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.2nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=2 공여자-대표적인 공여자를 나타냄. 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 53의 결과로부터 나타난 바와 같이, INX-SM-9, INX-SM-35 및 INX-SM-31은 IL-1β 생산에서 용량 의존적인 저해를 나타낸다. INX-SM-31은 시험된 이들 화합물 중에서 가장 약한 화합물인 것으로 보인다.
실험 4: LPS 자극된 인간 PBMC의 사이토카인 생산에 대한 예시적인 스테로이드 페이로드 INX-SM-32의 저해 효과의 평가
본 실험에서, 본 발명자들은 신규한 글루코코티코이드 페이로드 INX-SM-32의 항-염증 효력을 평가하였다. 실험을 제2 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 반복하였다. 구체적으로 도 54에서의 데이터는 INX-SM-32가 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단) 생산을 저해한다는 것을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(500 내지 1nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 1nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=2. 대표적인 공여자를 제시함. 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
도 54의 데이터로부터 나타난 바와 같이, INX-SM-32는 IL-1β 및 IL-6 생산에서 용량 의존적인 저해를 나타낸다.
실험 5: LPS 자극된 인간 PBMC의 사이토카인 생산에 대한 스테로이드 페이로드 INX-SM-10 및 INX-SM-33의 저해 효과의 평가
본 실험에서, 본 발명자들은 신규한 글루코코티코이드 페이로드 INX-SM-10, 및 INX-SM-33의 항-염증 효력을 평가하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMCS를 시험하였다. 도 55는 INX-SM-10이 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단) 생산에서 강력한 저해를 유도한다는 것을 나타낸다. INX-SM-33은 사이토카인 생산의 중간 정도의 저해를 나타내었다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.5nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.5nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
보다 구체적으로, 도 55의 데이터는 INX-SM-10, 및 INX-SM-33이 IL-1β 생산에서 용량 의존적인 저해를 유도한다는 것을 나타내고, INX-SM-33이 시험된 이들 화합물 중에서 효력이 가장 약한 화합물인 것으로 보인다.
실험 6 : LPS 자극된 인간 PBMC의 사이토카인 생산에 대한 예시적인 스테로이드 페이로드 INX-SM-2, INX-SM-7, INX-SM-13, INX-SM-24, 및 INX-SM-74의 저해 효과의 평가
도 56의 이러한 실험에서, 본 발명자들은 신규한 글루코코티코이드 페이로드 INX-SM-2 및 INX-SM-7의 항-염증 효력을 평가하였다. 추가로, INX-SM-13(C9에서의 할로겐화), INX-SM-24(C6 및 C9에서의 할로겐화) 및 INX-SM-74(INX-SM-24의 S 입체이성질체) 대 INX-SM-3(할로겐화 없음)을 평가하여 이들 화합물에 대한 스테로이드 고리의 할로겐화의 영향을 확립하였다. 이러한 실험은 단일 공여자로부터의 PBMC를 사용하였다.
구체적으로, 도 56의 데이터는 INX-SM-2 및 INX-SM-7에 의한 IL-1β 생산에서 용량-의존적 저해를 나타낸다. 구체적으로, 도면에서는 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 측정된 평균 사이토카인 수준을 나타내고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않는다; n=1, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
또한, 도 57에 도시된 바와 같이, INX-SM-3의 효능에 대한 할로겐화의 영향 평가는 INX-SM-24의 C6 및 C9 위치 둘 다에서의 플루오린화가 비-플루오린화된 INX-SM-3보다 증가된 효력을 초래한다는 것을 나타내었다. 그러나 C9 위치 단독에서의 플루오린화(INX-SM-13)는 비-플루오린화된 페이로드(INX-SM-3)보다 증가된 효력을 초래하지 않았다. 주목할 만한 것은, INX-SM-24의 S 입체 이성질체 또한 용량 의존적인 효력을 나타내었다는 것이다. 이는 유사한 시험관내 연구(INX-SM-53; INX-SM-54 및 INX-SM-56)에서 효력을 나타내지 않은 본 발명자들이 시험한 몇몇 비-플루오린화된 S 입체 이성질체와 다른 것이다.
도 57에서의 데이터는 C9 단독에서가 아닌 C6 및 C9 둘 다에서의 할로겐화가 증가된 효력을 제공한다는 것을 도시한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함.
실험 7 : 예시적인 본 발명의 링커 페이로드(INX P 링커 페이로드)를 포함하는 다른 면역 세포 표적에 특이적인 항체에 접합된 것을 포함하는 상이한 ADC의 항-염증 효과의 평가
본 실험에서 본 발명자들은 다른 면역 세포 표적(VISTA 이외의 2개의 구별되는 면역 세포 항원)에 특이적인 항체를 포함하는 ADC의 항-염증 효과를 평가하였는데, ADC는 예시적인 본 발명의 링커 페이로드(INX P 링커 페이로드)를 포함한다. 특히, 이러한 항체는 표적 B(INX1400P) 및 표적 A(INX1302P)에 지향되고, LPS 자극된 인간 PBMC에 대한 이의 효과를 검출하였다. 상기에 언급된 바와 같이, 표적 A 및 표적 B는 서로 그리고 VISTA와 구별되는 항원이고, 둘 다 특이적 면역 세포 유형에 의해서 높게 발현된다.
본 연구에서 본 발명자들은 INX P 링커 페이로드와 접합되지만 다른 세포 표면 표적인 항-표적 B(INX1400P) 및 항-표적 A(INX1302P)에 지향되는 항체의 항-염증 효과를 평가하였다. 접합되지 않은 항-표적 A 항체(INX1302)를 잠재적인 항체 효과에 대한 대조군으로서 첨가하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMC를 시험하였다.
도 58에 도시된 바와 같이, 3개의 모든 INXP 접합체는 활성 유리 페이로드를 전달할 수 있고 항-VISTA INX P 접합체에서 관찰되는 효력을 보유한다. 도 58은 표적 B 및 표적 A(VISTA 이외의 2개의 상이한 면역 세포 특이적 항원)에 대해서 지향되는 항체에 접합된 INX P가 또한 효력이 있는 항-염증 효과를 유도한다는 것을 나타낸다. 1ng/㎖ LPS 및 글루코코티코이드 접합체의 연속 희석물(8,000 내지 0.26nM의 접합된 페이로드)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였음; n=1, 기술적인 반복물의 평균.
추가로, 2개의 유리 페이로드인 INX-SM-43 및 INX-SM-44를 항-염증 효과에 대해서 평가하였다. 두 페이로드는 모두 도 59(INX-SM-43) 및 도 60(INX-SM-44)에 도시된 바와 같이 어느 정도의 항-염증 효과를 가질 수 있었다.
구체적으로 도 59에서의 실험은 INX-SM-43이 중간 정도의 huIL1-β의 저해를 유도함을 나타낸다. 1ng/㎖ LPS 및 글루코코티코이드 페이로드의 연속 희석물(100 내지 0.032nM)의 접합된 페이로드)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였음; n=1, 기술적인 반복물의 평균. 도 60에서의 실험은 INX-SM-44가 중간 정도의 huIL1-β의 저해를 유도함을 나타낸다. 1ng/㎖ LPS 및 글루코코티코이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.32nM)의 접합된 페이로드)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 평균 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였음; n=1, 기술적인 반복물의 평균.
실험 8 : 예시적인 글루코코티코이드 페이로드 INX-SM-25, INX-SM-45 및 INX-SM-46 대 INX-SM-3의 항-염증 효력의 평가
본 연구에서, 본 발명자들은 신규한 글루코코티코이드 페이로드 INX-SM-25, INX-SM-45 및 INX-SM-46 대 INX-SM-3의 항-염증 효력을 평가하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMC를 시험하였다. 구체적으로, 도 61은 INX-SM-25 및 INX-SM-3은 IL-1β 생산에서 강력한 저해를 나타낸다. INX-SM-45 및 INX-SM-46은 사이토카인 생산의 더 양호한 중간 정도의 저해를 나타내었다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.5nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.5nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 61의 실험에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 유리 페이로드는 IL-1β 생산의 용량 의존적 저해를 나타내고, INX-SM-45 및 INX-SM-46은 명백하게 INX-SM-25 및 INX-SM-3에 비해서 감소된 효력을 갖는다.
실험 9 : 완전 접합 형태(INX231J, INX231P, INX231V)에서 신규한 글루코코티코이드 페이로드의 항-염증 효력의 평가
도 62의 데이터인 본 연구에서 본 발명자들은 완전 접합 형태의 신규한 글루코코티코이드 페이로드의 항-염증 효력을 평가하였다. 이미 보고된 링커/페이로드인 INX J(INX-J2)를 INX-SM-3 페이로드를 함유하는 신규한 링커 페이로드 INX P 및 INX-SM-32 페이로드를 함유하는 INX V와 비교하였다. 모든 링커 페이로드를 DAR 대략 8로 INX231J, INX231P 및 INX231V로서, 항-VISTA 항체인 INX231에 접합시켰다. 주목할 만한 것은, 모든 페이로드 (INX-SM-3), (INX-SM-32) 및 (INX-SM-3 및 INX-J2)는 시험관내 자극 PBMC 검정에서 부데소나이드에 비해서 유사한 효력을 가졌다는 것이다.
접합체를 페이로드 농도의 용량 반응으로서 단일 공여자의 PBMC에 첨가하였고, 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 이러한 지연은 페이로드 처리를 위한 시간을 허용하였다. 4시간 후, LPS를 첨가하고, 샘플을 IL-1b 및 IL-6의 평가 전에 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 도 62에 나타난 바와 같이, INX231V는 INX231P 및 INX231J보다 극적으로 향상된 효력을 가졌다. INX231P는 INX231J(문헌 비교자)보다 약간 향상된 효력을 가졌다. 동일한 링커(gly/glu)가 사용되었고 모든 유리 페이로드가 부데소나이드에 비해 유사한 효력을 가졌기 때문에 이러한 발견은 예상치 못한 것이었다.
동일한 링커(gly/glu)가 사용되었고 모든 유리 페이로드가 부데소나이드에 비해 유사한 효력을 가졌기 때문에 이러한 발견은 예상치 못한 것이었다. 특히, 도 62는 INX231P 및 INX231J보다 INX231V의 극적으로 증가된 효력을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 측정된 A. huIL-1β B. huIL-6에 대한 평균 사이토카인 수준, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물로부터 표준 편차를 플로팅함. ULOQ(IL-1b의 경우 12,500pg/㎖ 및 IL-6의 경우 150,000pg/㎖)보다 높은 값을 외삽값으로서 플로팅하였다.
실험 10 : 완전 접합 형태(INX231J, INX231P, INX234P, INX231V, INX234A4, INX231S, INX234T, INX234A3, INX201J, INX201L, INX234A11, INX234V, INX234A5)에서 신규한 글루코코티코이드 페이로드의 항-염증 효력의 평가
도 63의 데이터인 본 연구에서 본 발명자들은 완전 접합 형태의 신규한 글루코코티코이드 페이로드의 항-염증 효력을 평가하였다. 구체적으로, 이전에 보고된 링커/페이로드인 INX J(INX-J2)와 접합된 INX231을 INX231P, INX234P, INX231V, INX234A4, INX231S, INX234T, INX234A3, INX201J, INX201L, INX234A11, INX234V, INX234A5와 비교하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMCS를 시험하였다.
도 63의 실험에서 나타낸 바와 같이, V가 동일한 항-표적 항체에 접합될 때, 접합된 INX V는 접합된 INX P 및 INX J에 비해 상당한 효력 향상을 갖는다. 접합된 INX P는 접합된 INX J에 비해 중간 정도의 향상을 갖는다. 이것은 INX231P에 비해 INX231V의 235x의 방출된 페이로드 및 INX231J에 비해서 INX231P에 대한 3배 초과의 방출된 페이로드를 나타내는 본 명세서에 개시된 인간 PBMC에서의 누적 데이터와 일치한다. 주목할 점은, INX234P 및 INX231P가 유사한 효력을 갖고, 이들 항체의 유사한 특성을 반영한다는 것이다.
도 64의 실험은 추가로 INX231V가 상당한 효력을 갖고, INX231P가 INX231J에 비해 중간 정도의 효력을 가짐을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함. 구체적으로, 도 64의 실험에 나타난 바와 같이, INX231S는 방출된 C6/C9 플루오린화된 페이로드(INX-SM-24)의 향상된 효력으로 인해 다른 접합체보다 상당한 효력을 갖는다. INX234T(INX P의 인산화된 버전) 및 INX234A3(INX V의 양으로 하전된 링커 변이체)도 INX231J보다 효력이 더 크다. 구체적으로, 도 64의 실험은 INX231J에 비해 INX231S, INX234T 및 INX234A3의 향상된 효력을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
본 발명자들은 INX231 및 INX234 접합체가 유사하게 거동하는 것을 관찰하였지만, INX201에 접합된 링커 페이로드는 INX201 항체의 보다 빠른 내재화로 인해 시험관내에서 향상된 효력을 가질 수 있다. 실제로, 도 65의 실험에 나타난 바와 같이, INX201J 및 IN201L은 INX231J 접합체에 비해 향상된 효력을 갖는다. 주목할 점은, INX234A4(INX231A4 접합 형태와 대등함)가 INX231J에 비해 효력이 향상되었다는 것이다. 특히, 도 65는 INX201이 INX231에 비해 접합체의 초기 효력을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
또한, 도 66의 실험에 나타난 바와 같이, INX V의 Glu/gly 링커와 대조적으로 Asn/gly 링커를 이용하는 V의 음으로 하전된 링커 변이체인, INX A11은 INX J에 비해 유사한 효력 향상을 갖는다. 주목할 만한 것은, INX234A5가 또한 스피로[2.2] 헵탄을 가지며, INX231J보다 향상된 효력을 나타내는데, 이는 방출 및 후속 효력의 중요성을 시사한다. 구체적으로, 도 66의 실험은 INX V의 상이한 유사체가 INX231J에 비해 효력이 있음을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
본 발명자들은 INX-SM-3, INX-J2, 부데소나이드, 덱사메타손, INX-SM-32, INX-SM-36의 효능을 추가로 비교하였다. 도 67의 실험에 나타난 바와 같이: INX-SM-36, INX-SM-32(상단) 및 INX-SM-3, INX-SM-J2(하단)는 IL-1β를 저해한다. INX-SM-32 및 INX-SM-36은 덱사메타손과 유사한 효력으로 IL-1β를 저해한다. INX-SM-3 및INX-J2는 부데소나이드와 유사한 효력을 갖는다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.5nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.5nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
실험 11 : 보고된 글루코코티코이드 페이로드(INX-J2)에 대한 신규한 글루코코티코이드 페이로드(INX-SM-3, INX-SM-37 및 INX-SM-32)의 항-염증 효력의 평가
본 연구에서 본 발명자들은 본 발명자들의 신규한 글루코코티코이드인 INX-SM-3, INX-SM-37 및 INX-SM-32와 비교하여 유리 글루코코티코이드인 INX-J2(알려진 유리 글루코코티코이드)의 항-염증 효력을 평가하였다. 도 68의 실험에 나타난 바와 같이, INX J, INX P, 및 INX V 링커 페이로드의 유리 페이로드(각각 INX-J2, INX-SM-3, 및 INX-SM-32)의 직접 비교에서, 모두 유사한 효력을 나타낸다. 또한, 결과는 INX-J2가 INX-SM-32 및 INX-SM-3에 비해 약간의 효력 향상을 나타낼 수 있음을 시사한다. 효력의 이러한 유사성은 도 68 및 도 64의 실험에 나타난 바와 같이 INX J 접합체에 비해 INX V 및 INX P 접합체(및 관련 유사체)에서 관찰된 효력 향상이 방출된 페이로드의 향상된 효능으로 인한 것이 아니라 아마도 향상된 축적으로 인한 것임을 결정적으로 입증한다. 대조적으로, INX-SM-37은 다른 유리 페이로드에 비해 약한 효력을 갖는다.
도 68의 데이터는, INX-SM-32, INX-J2, 및 INX-SM-3이 유사한 IL-1β의 저해를 갖고, INX-SM-37이 IL-1β를 약하게 저해하며, INX-SM-32, INX-J2 및 INX-SM-3이 유사한 효력으로 IL-1β를 저해함을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.5nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 69의 실험은 INX231V가 다른 INX231/INX234 접합체보다 실질적으로 더 효력이 있다는 것을 추가로 나타낸다. 본 실험에서 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 평균 IL-1β에 대한 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
도 70에 나타난 바와 같이, INX V의 인산화된 형태(INX231A7, INX231A12) 및 할로겐화된 형태(INX231A23 및 INX231A12)는 또한 INX 231J보다 향상된 효력을 나타낸다. 특히 도 70의 실험은 INX V의 인산화 및 할로겐화 유사체가 INX J에 비해 효력이 있음을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 접합된 스테로이드 링커 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.16nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 IL-1β에 대한 평균 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.16nM 미만에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1, 기술적인 반복물의 평균을 플로팅함.
실험 12 : 신규한 글루코코티코이드 페이로드(INX-SM-14, INX-SM-15, INX-SM-17, INX-SM-40, INX-SM-34, INX-SM-47, INX-SM-49 및 INX-J2)의 항-염증 효력의 평가
본 연구에서, 본 발명자들은 신규한 글루코코티코이드 페이로드의 항-염증 효력을 평가하였다. 이미 보고된 페이로드인 INX-J2를 페이로드 INX-SM-14, INX-SM-15, INX-SM-17, INX-SM-40, INX-SM-34, INX-SM-47 및 INX-SM-49와 비교하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMCS를 시험하였다.
도 71에 나타난 바와 같이, INX-SM-14와 INX-SM-15는 IL-1β 및 IL-6의 저해 능력이 INX-J2와 유사하다. 도 71, 도 72 및 도 73에 나타난 바와 같이, 다른 GC 페이로드인 INX-SM-17, INX-SM-34, INX-SM-40, INX-SM-47 및 INX-SM-49는 IL-1β 및 IL-6을 약하게 저해하거나 INX-J2에 비해서 IL-1β(INX-SM-17)를 약하게만 저해한다.
특히, 도 71의 데이터는 INX-SM-14, INX-SM-15 및 INX-J2가 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단)의 유사한 저해를 갖는다는 것을 나타낸다. INX-SM-17은 IL-6이 아닌 IL-1β를 약하게 저해한다. INX-SM-14, INX-SM-15 및 INX-J2는 유사한 효력을 IL-1 및 IL-6을 저해한다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.01nM에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
추가로, 도 72의 데이터는 INX-SM-40 및 INX-SM-34가 INX-J2에 비해서 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단)을 약하게 저해한다는 것을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.01nM에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
또한, 도 73의 데이터는 INX-SM-49 및 INX-SM-47이 INX-J2에 비해서 IL-1β(상단) 및 IL-6(하단)을 약하게 저해한다는 것을 나타낸다. 1ng/㎖의 LPS 및 스테로이드 페이로드의 연속 희석물(1000 내지 0.15nM)과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준(IL1-β 및 IL-6)을 측정하였고, 처리 대조군은 0.01nM에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
실험 13 : 완전 접합 형태(INX234J, INX201J, INX234A9, INX201V)에서 신규한 글루코코티코이드 페이로드의 항-염증 효력의 평가
본 연구에서, 본 발명자들은 완전 접합 형태의 신규한 글루코코티코이드 링커 페이로드의 항-염증 효력을 평가하였다. 이미 보고된 링커 페이로드인 INX-J2를 INX234 및 INX201에 접합시키고 INX231에 접합된 INX A9 및 INX201에 접합된 INX V와 비교하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMCS를 시험하였다. 도 74에 나타난 바와 같이, INX A9 및 INX V는 동일한 항체 골격에 접합된 INX J보다 향상된 효력을 나타낸다. 주목할 만한 것은, INX A9가 페이로드의 어댑터 영역에 INX V의 것과 상이한 스피로사이클릭 고리계를 포함한다는 것인데, 이는 유리 페이로드(도 118A 내지 도 118O에 도시된 INX-SM-46)에 의해서 예측된 것보다 INX V와 유사한 접합된 형태의 향상된 효력을 나타낸다. 이것은 아마도 INX V에서 관찰된 향상된 축적으로 인한 것일 것이다.
특히 도 74의 데이터는 INX231A9 및 INX201V가 IL-1β 생산 감소에서 INX234J 및 INX201J보다 향상된 효력을 나타낸다는 것을 보여준다. 접합된 페이로드 농도(1000 내지 0.15nM)와 관련하여 1ng/㎖의 LPS 및 항-VISTA 접합체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 사이토카인 수준을 24시간에 측정하였고, 처리 대조군은 0.1nM에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
실험 14 : 완전 접합 형태(INX231V, INX231J, INX201A23, INX201V, INX201J, INX201P)(DAR 4 VS DAR 8)에서 신규한 글루코코티코이드 페이로드의 항-염증 효력의 평가
본 연구에서, 본 발명자들은 완전 접합 형태의 신규한 글루코코티코이드 페이로드의 항-염증 효력을 평가하였고, 구체적으로 감소된 DAR(약 4 대 약 8)의 영향을 평가하였다. 접합체 INX231V(DAR 3.66), INX201A23(DAR 4.34 및 7.71), INX201V(DAR 3.95 및 7.86) 및 INX201P(DAR 4.52)를 이미 보고된 링커/페이로드인 INX201 및 INX231에 접합된 INX J(INX-J2)(이들 둘 다 DAR 8.0)에 대해서 평가하였다. 1명의 공여자로부터의 PBMCS를 시험하였다.
도 75에 나타난 바와 같이, 감소된 DAR(3.66)의 INX V 접합체는 DAR 8.0인 동일한 항체 골격을 갖는 INX J 접합체보다 IL-1β 감소에서 극적으로 더 큰 효력을 갖는다. 유사하게, INX V와 유사한 페이로드를 포함하지만 C6, C9 플루오린화를 갖는 INX201A23은 INX231V DAR 3.66 및 INX231J DAR 8.0 둘 다보다 DAR 7.71 및 DAR 4.43 둘 다에서 증가된 효력을 갖는다. 특히 도 75의 데이터는 동등한 또는 감소된 DAR에서 INX V 및 INX A23이 IL-1β 생산 감소에서 INX J보다 향상된 효력을 나타낸다는 것을 보여준다. 총 ADC 농도(20 내지 0.003㎍/㎖)와 관련하여 1ng/㎖의 LPS 및 항-VISTA 접합체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.001㎍/㎖에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
도 76에서의 실험은 DAR 7.86 또는 감소된 DAR 3.95의 INX201V가 INX201J DAR 8.0보다 효력을 나타냄을 추가로 나타낸다. 주목할 만한 것은, INX201P(DAR 4.52)가, 대등한 INX J 접합체의 것보다 43% 더 작은 DAR을 가짐에도 불구하고 INX201J(DAR 8.0)와 유사한 효력을 갖는다는 것이다. INX201V 접합체 및 INX201A23 접합체 둘 다의 경우, DAR 약 8 접합체는 DAR 약 4 접합체의 효력의 대략 2배를 가졌다. 본 명세서에 기재된 이들 및 다른 신규한 링커 페이로드의 효력 프로파일을 고려할 때, DAR 4는 치료 용도에 충분할 수 있고 바람직한 개발 가능성 특성을 가질 수 있다.
보다 특별하게는 도 76의 데이터는, INX V 접합체가 감소된 DAR을 가짐에도 불구하고 IL-1β 영항에서 INX J 접합체보다 향상된 효력을 가짐을 나타낸다. 실험에서 총 ADC 농도(20 내지 0.003㎍/㎖)와 관련하여 1ng/㎖의 LPS 및 항-VISTA 접합체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 대해서 24시간에 사이토카인 수준을 측정하였고, 처리 대조군은 0.001㎍/㎖에서 log-스케일 x-축 상에 플로팅하지 않음; n=1 공여자, 기술적인 반복물로부터의 평균을 플로팅함.
결론
신규한 글루코코티코스테로이드와 관련된 결론
본 발명자들은 다음 신규한 GC가 LPS-활성화 인간 PBMC를 사용한 시험관내 검정에서 유리 페이로드와 상이한 정도의 용량 의존적인 스테로이드 효력을 나타낸다는 것을 발견하였다:
INX-SM-1, INX-SM-2, INX-SM-3, INX-SM-4, INX-SM-6, INX-SM-7, INX-SM-9, INX-SM-10, INX-SM-13, INX-SM-24, INX-SM-31, INX-SM-32, INX-SM-33, INX-SM-35, INX-SM-36, INX-SM-37, INX-SM-43, INX-SM-44, INX-SM-45, INX-SM-46, INX-SM-74, INX-SM-14, INX-SM-15, INX-SM-17, INX-SM-34, INX-SM-40, INX-SM-47, INX-SM-49
이 계열의 R 입체이성질체 중에서 가장 낮은 효력은 INX-SM-31, INX-SM-33, 및 INX-SM-37에서 관찰되었다.
INX-SM-3의 효력에 대한 플루오린화의 영향에 대한 평가는 INX-SM-24의 C6 및 C9 위치 둘 다에서 이중 할로겐화가 효력을 증가시킨다는 것을 입증하였다. 그러나 C9 위치 단독에서의 플루오린화(INX-SM-13)는 비-플루오린화된 페이로드(INX-SM-3)보다 증가된 효력을 초래하지 않았다.
아세탈 위치에 S 입체이성질체를 함유하는 페이로드-INX-SM-53, INX-SM-54 및 INX-SM-56-는 효력을 나타내지 않았다. 이에 대한 예외는 C9 및 C6 위치 둘 다에서 할로겐화된 INX-SM-74인데, 이것은 동일한 할로겐화를 갖는 R 입체이성질체보다 훨씬 약하지만 중간 정도의 효력을 나타내었다.
아세탈을 피롤리딘으로 변경(예를 들어, INX-SM-32를 INX-SM-37로 전환)하는 것 또한 유리 페이로드의 효력을 극적으로 낮추었다.
접합된 링커 페이로드에 관련된 결론
데이터는 다음을 나타낸다:
Figure pct00856
이의 접합된 형태에서, 대부분의 링커 페이로드는 유리 페이로드의 효력을 유지한다.
스피로 [3.3] 헵탄을 갖는 링커 페이로드(INX V 계열)는 유리 페이로드의 효력에 의해 예측되지 않는 수준까지 문헌의 선행 링커 페이로드(INX J)보다 효력이 향상되었다. 이러한 효력 향상은 이전 예에서 볼 수 있는 바와 같이 더 높은 수준의 축적으로 이어지는 향상된 방출로 인한 것일 수 있다.
효력이 향상된 이러한 링커 페이로드는 다음을 포함한다: INX V, INX A11, INX A3, INX A4, INX A5, INX A12, INX A7, INX A23, 및 INX A9.
항체당 페이로드의 약 50% 감소에서 합리적으로 예상되는 바와 같이 총 효력이 상응하는 DAR 약 8 접합체의 대략 절반이지만 접합체의 효력 향상은 DAR 약 4에서 보존된다. 효력 감소에도 불구하고, DAR 4는 치료 용도에 충분할 수 있으며 DAR 8 분자보다 더 바람직한 개발 가능성 특성을 가질 수 있다.
스피로 [2.5] 옥탄을 갖는 별개의 링커 페이로드 또한 유리 페이로드인 INX-SM-46의 효력에 의해 예측되지 않는 수준까지 INX J보다 효력이 향상되었다.
INX P 접합체는 잠재적으로 더 높은 수준의 축적으로 이어지는 향상된 방출로 인해서 동일한 항체 골격을 갖는 INX J 접합체에 비해 약간의 효력 증가를 가졌다. 이러한 효력 증가는 동일한 항체 골격을 갖는 INX J 접합체와 동등한 효력을 갖는 43% 더 낮은 DAR을 갖는 INX P 접합체를 초래한다.
링커 페이로드가 동일한 INX201 접합체는 INX231 접합체보다 효력이 증가하였다. 링커 페이로드가 동일한 INX234 및 INX231 접합체는 유사한 효력을 갖는다.
다른 세포 표면 표적(예를 들어, 항-표적 A-P, 항-표적 B-P)에 대해 지향되는 INX P 접합체도 이 검정에서 효력을 가졌는데, 이는 특히 항-VISTA 표적 항체에 대한 접합이 링커 페이로드가 효력을 갖는 데 필요하지 않음을 확인시켜 준다.
데이터는 추가로 다음을 나타낸다:
스테로이드 구조는 효력을 유지하면서 C17/C16 아세탈의 다양한 대체 기하학적 형상, 고리 크기 및 구조를 수용할 수 있다.
그러나 할로겐화되지 않은 스테로이드의 아세탈 탄소에서의 R 이성질체만 허용된다. 주목할 만한 것은, 스테로이드 고리 상의 C6 및 C9 위치 둘 모두에서 플루오린화의 존재는 상응하는 R 이성질체보다 훨씬 약하지만 S 이성질체의 효력을 허용한다는 것이다.
R 이성질체: INX-SM-1, INX-SM-2, INX-SM-3, INX-SM-4, INX-SM-6, INX-SM-7, INX-SM-09, INX-SM-10, INX-SM-13, INX-SM-24, INX-SM-31, INX-SM-32, INX-SM-33, INX-SM-35, INX-SM-43, INX-SM-44, INX-SM-45, INX-SM-46, INX-SM-36
S 이성질체: INX-SM-53, INX-SM-54, INX-SM-56, INX-SM-74(C6/C9에서 플루오린화됨)
아세탈 대신에 피롤리딘 유사체(INX-SM-37)는 효력이 약하지만 여전히 일부 효력을 유지한다.
일부 페이로드의 접합된 형태, 특히 INX-SM-32 페이로드 및 이의 유사체를 갖는 INX V는 잠재적으로 상응하는 유리 페이로드의 향상된 방출 및 노출로 인해 효능을 크게 향상시킬 수 있다.
항체가 일정하게 유지되는 경우, INX J의 유리 페이로드 형태(INX-SM-J2)가 INX P(INX-SM-3)의 것보다 약간 더 효력이 있을 수 있지만 INX P의 접합된 형태는 INX J 접합체보다 약간의 효력 향상을 갖는다.
실시예 10 : 예시적인 항-VISTA 항체의 약동학적 평가
본 실시예에서 연구는 본 발명에 따른 다양한 항-인간 VISTA 항체의 약동학(PK)을 정의하고 이를 BMS로부터의 pH 감응성 항-인간 VISTA(767-IgG1.3, Johnston et al., 2019)와 비교한다.
본 실험의 목적은 1) BMS/Five Prime Therapeutics에 의해 기술된 "pH 감응성" 항체가 ImmuNext(INX) 항-VISTA 항체와 비교하여 상당히 상이한 PK(hIgG1과 대등함)를 가짐을 확인하고; 2) 더 많은 수의 INX 항-VISTA 항체의 PK를 평가하고 (도 8, 도 10 및 도 12의 INX200 및 다른 INX 항체 서열 참조); 더 많은 수의 다른 항-VISTA 항체의 PK를 추가로 평가하는 것이었다(도 8, 도 10 및 도 12의 다른 INX 항체 서열 참조).
이들 연구는 인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI) 마우스에서 수행되었고, 이 마우스는 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있으며 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 인간 VISTA를 발현한다. 실험은 암컷 또는 수컷 hVISTA KI 마우스에서 수행되었으며 두 연구에서 동물에게 10㎎/㎏의 항체를 1회 제공하였다. 말초 혈액 내 항체 양은 ELISA로 정량화하였다.
물질 및 방법
실험 설계
실험 1:
hVISTA KI 마우스를 각각 10마리씩 2개의 군으로 나누고, 제0일에 인간 IgG1 및 INX200 10㎎/㎏의 1회 용량으로 각각 처리하였다.
실험 2:
hVISTA KI 마우스를 각각 10마리씩 2개의 군으로 나누고, 제0일에 인간 IgG1 및 767-IgG1.3 10㎎/㎏의 1회 용량으로 각각 처리하였다.
실험 1 및 실험 2 두 실험에서, 실험 1의 경우 20분, 4, 24, 48시간, 그 다음 제5일 및 제8일, 실험 2의 경우 제4일 및 제7일에 5마리 마우스를 안와후강으로 채혈하고; 순환 항체를 ELISA로 정량화하였다. 이러한 결과는 각각 도 77과 도 78에 도시되어 있다.
실험 3:
hVISTA KI 마우스를 각각 15마리씩 4개의 군으로 나누고, 제0일에 INX231, INX234, INX237 및 INX240 10㎎/㎏의 1회 용량으로 각각 처리하였다. 군당 5마리의 마우스를 20분, 4시간, 24시간 및 그 다음 제2일, 제3일, 제4일, 제5일, 제8일, 제11일, 제14일 및 제21일에 안와후강으로 채혈하였다. 결과는 도 79에 도시되어 있다.
실험 4:
hVISTA KI 마우스를 각각 10마리씩 4개의 군으로 나누고, 제0일에 INX901, INX904, INX907 및 INX908 10㎎/㎏의 1회 용량으로 각각 처리하였다. 군당 5마리의 마우스를 30분, 4시간, 24시간 및 그 다음 제2일, 제3일, 제4일, 제7일 및 제14일에 안와후강으로 채혈하였다. 결과는 도 80에 도시되어 있다.
실험 5:
hVISTA KI 마우스를 각각 4마리씩 5개의 군으로 나누고, 제0일에 INX201J, INX231J, INX234J, 및 INX240 J 10㎎/㎏의 1회 용량으로 각각 처리하였다. 마우스를 제3일 및 제6일에 안와후강으로 채혈하였다. 결과는 도 81에 도시되어 있다.
시험 작용제 및 투여량
INX200(Aragen, 로트 번호 BP-2875-019-6.1)은 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX201(Aragen, 로트 번호 BP-3200-019-6)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체(INX200과 동일한 가변 도메인)이다.
인간 IgG1 (BioXcell ref, 로트 번호 659518N1)
767-IgG1,3(Aragen, 로트 번호 BP-2985-019-6)은 Fc 영역에 L234A/L235E/G237A　침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 Five Prime Therapeutics 및 Bristol-Myers Squibb Company에서 개발된 항-인간 VISTA 항체이다. 이 항체는 낮은 pH(예를 들어, pH 6)에서 결합하지만 생리 pH(pH 7.4)에서 최소 결합을 갖도록 설계되었다.
INX231, INX234, INX237 및 INX240(각각 로트 번호 72928.1.a, 72931.1.a, 72934.1.a 및 73419.1.a)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX201J, INX231J, INX234J 및 INX240J(로트 번호 JZ-0556-027, JZ-0556-013-1, JZ-0556-013-2, JZ-0556-013-3)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 각각 INX201, INX231, INX234, INX237 및 INX240이다. 링커/페이로드(J)는 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진 문헌에 보고된 링커/페이로드에 기반한다.
INX901, INX904, INX907 및 INX908는 천연 인간 IgG2/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이고, 가변 도메인은 각각 INX231, INX234, INX237 및 INX200/INX201과 일치한다.
모든 항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 마우스 꼬리 정맥에 정맥 주사하여 10㎎/㎏ 용량을 전달하였다.
마우스
hVISTA 마우스는 Sage Labs(미국 펜실베이니아주 보이어타운 소재)에서 사육되었다. 8 내지 12주령의 마우스를 먼저 검역소에 3주 동안 이동시킨 후 일반 시설로 옮겼다. 이들을 실험 시작 전 1 내지 2주 동안 적응시켰다.
채혈 및 준비
동물은 24시간마다 1회 이하로 채혈하였다. 각각의 마우스 군을 제0일에 교대로 채혈한 5마리 마우스의 2개 또는 3개의 하위군으로 나누었다. 혈액을 주사 후 0일에 20분, 4, 24, 48시간에 수집한 다음, 실험 1을 위해 제5일 및 제8일 실험 2를 위해서 제4일 및 제7일에 수집하였다. 처음 24시간 동안, 등록된 정맥 주사 품질에 따라 일부 데이터를 제외시켰다. 후속 시점에서는 성공적으로 정맥 주사된 동물만 채혈하였다.
실험 3의 경우, 마우스를 20분, 4시간, 24시간 및 그 다음 제2일, 제3일, 제4일, 제5일, 제8일, 제11일, 제14일 및 제21일에 채혈하였다.
실험 4 및 5의 경우, 마우스를 30분, 4시간, 24시간 및 제2일, 제3일, 제4일, 제7일, 제14일에 채혈하였다.
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다. 그런 다음 혈액을 400rcf에서 5분 동안 원심분리시키고 혈장을 수집하여 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다(하기 참조).
항체 혈액 농도 분석
인간 IgG1의 검출을 위한 ELISA
먼저 96-웰 편평 바닥 플레이트(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp, 카탈로그 번호 442404)를 실온(RT)에서 1시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 마우스 항-huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-005-098)로 코팅하였다.
웰을 PT(0.05% Tween 20을 함유한 PBS)로 3회 세척한 다음 RT에서 1시간 동안 PTB(0.05% Tween 20 및 1% BSA를 함유한 PBS)로 차단시켰다. 인간 IgG(Southern Biotech, 카탈로그 번호 0150-01)를 양성 대조군으로 사용하고 인간 IgG1(BioXcell, 카탈로그 번호 BE0297)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PT로 3회 세척한 후, HRP(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-035-098)에 커플링된 마우스 항-인간 IgG Fcγ를 검출 시약으로 1/2000 희석하여 사용하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 비색 기질로서 TMB(Thermo Scientific, 카탈로그 번호 34028)를 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5 내지 10분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
INX200의 ELISA 검출(실험 1)
먼저, 96-웰 편평 바닥 플레이트(4.5.1에서와 동일)를 hIX50(인간 VISTA ECD, ImmuNext를 위해서 Aragen Bioscience에서 생산)으로 PBS 중 1㎍/㎖로 RT에서 1시간 동안 코팅하였다.
3회 세척 후, RT에서 1시간 동안 PTB로 웰을 차단시켰다. INX908(ImmuNext를 위해서 Aragen Bioscience에서 생산)을 양성 대조군으로 사용하고 INX200을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PT로 3회 세척한 후, 마우스 항-인간 Kappa-HRP(Southern Biotech, 카탈로그 번호 9230-05)를 검출 시약으로 1/2000으로 사용하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 비색 기질로서 TMB를 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
767-IgG1.3의 ELISA 검출(실험 2)
먼저 96-웰 편평 바닥 플레이트(상기와 같음)를 RT에서 1시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 마우스 항-huIgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-005-098)로 코팅하였다.
3회 세척 후, RT에서 1시간 동안 PTB로 웰을 차단시켰다. 인간 IgG(Southern Biotech, 카탈로그 번호 0150-01)를 양성 대조군으로 사용하고 767-IgG1.3을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PTB에서 3회 세척한 후, 마우스 항-인간 IgG Fcγ-HRP(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-035-098)를 검출 시약으로서 1/2000으로 사용하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. rt에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
실험 3에 대한 ELISA
먼저, 96-웰 편평 바닥 플레이트(상기와 동일함)를 PBS에서 1mg/㎖로 hIX50(ImmuNext를 위해서 인간 VISTA ECD, Aragen Bioscience에서 생산됨)로 1시간 동안 rt에서 코팅하였다.
3회 세척 후, RT에서 1시간 동안 PTB로 웰을 차단시켰다.　INX908(ImmuNext를 위해서 Aragen Bioscience에서 생산)을 양성 대조군으로 사용하고 INX231, INX234, INX237 또는 INX240을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PTB에서 3회 세척한 후, 마우스 항-인간 IgG Fcγ-HRP(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-035-098)를 검출 시약으로서 1/2000으로 사용하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. rt에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
실험 4에 대한 ELISA
먼저, 96-웰 편평 바닥 플레이트(이전 실험과 동일함)를 PBS에서 1㎎/㎖로 hINX50(ImmuNext를 위해서 인간 VISTA ECD, Aragen Bioscience에서 생산됨)로 1시간 동안 rt에서 코팅하였다.
3회 세척 후, RT에서 1시간 동안 PTB로 웰을 차단시켰다.　INX201을 양성 대조군으로 사용하고 INX231, INX234 또는 INX240을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PTB에서 3회 세척한 후, 마우스 항-인간 IgG Fcγ-HRP(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-035-098)를 검출 시약으로서 1/2000으로 사용하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. rt에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
실험 5에 대한 ELISA
먼저, 96-웰 편평 바닥 플레이트(상기와 동일함)를 PBS에서 1㎎/㎖로 hIX7(마우스 IgG2s 골격 상의 인간 VISTA ECD)로 1시간 동안 rt에서 코팅하였다.
3회 세척 후, RT에서 1시간 동안 PTB로 웰을 차단시켰다. INX901, INX904, INX907 또는 INX908을 양성 대조군으로서 사용하고 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PTB에서 3회 세척한 후, 마우스 항-인간 IgG Fcγ-HRP(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 209-035-098)를 검출 시약으로서 1/2000으로 사용하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
ELISA 검정 계산
LOQ는 표준 곡선의 가장 낮은 지점과 샘플을 희석시키는 데 사용되는 가장 낮은 희석 계수를 곱하여 계산된다. 예를 들어, 최저 표준점이 0.3ng/㎖이고 최저 표준 희석액이 1/400이면, LOQ는 샘플이 보고되는 것과 동일한 단위로 보고되는 경우 0.1ug/㎖이다.
LOD는 샘플 OD가 대략 0.01의 OD인 배경 OD와 구별될 수 없을 때 결정된다. LOD에 대해 농도가 계산되지 않지만 그래프 작성 및 PK 계산 목적을 위해 0 또는 0.001ug/㎖의 농도가 배정된다.
정맥 볼러스 후 비구획 분석(NCA)을 수행하는 PKsolver 프로그램을 사용하여 항체 반감기를 결정하였다.
실험 1 내지 5의 결과는 각각 도 77 내지 도 81에 도시되어 있다.
도 77은 INX200 대 인간 IgG1에 대한 PK를 비교하는 실험 1의 결과를 포함한다. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군)를 나타낸다.
도 78은 767-IgG1.3 대 인간 IgG1의 PK를 비교하는 실험 2의 결과를 포함한다. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군)를 나타낸다.
도 79는 INX231, INX234, INX237 및 INX240에 대한 PK를 비교하는 실험 3의 결과를 포함한다. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군)를 나타낸다. 좌측 그래프는 Log10으로 y 및 x 축을 나타내는 반면, 우측 그래프의 경우에는 y 축만 Log10으로 나타낸다.
도 80은 INX901, INX904, INX907 및 INX908에 대한 PK를 비교하는 실험 4의 결과를 포함한다. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점의 항체의 혈장 농도(SD; n=5/군)를 나타낸다.
도 81은 INX201J, INX231J, INX234J 및 INX240J에 대한 PK를 비교하는 실험 5의 결과를 포함한다. hVISTA KI 마우스에서 주석이 달린 시점에서의 항체의 혈장 농도(SD; n=4/군)를 도시한다.
이들 실험의 데이터는 다음을 나타낸다:
실험 1(도 77)은 항-인간 VISTA 항체 INX200에 대한 PK가 표적 매개 약물 배치(TMDD)로 인해 투여 후 24시간에 혈장에서 정량화될 수 없는 반면 인간 IgG1 대조군은 IgG에 대한 보다 전형적인 연장된 반감기를 나타낸다는 것을 나타낸다.
실험 2(도 78)는 pH 감응성 항-인간 VISTA 767-IgG1,3이 인간 IgG1 대조군 항체와 유사한 PK를 나타낸다는 것을 나타내는데, 이는 이것이 VISTA 표적에 대한 제한된 결합을 가지며 TMDD를 받지 않는다는 것을 시사한다.
실험 3(도 79) 결과는 INX231, INX234, INX237 및 INX240이 모두 24시간 후에도 여전히 검출 가능하고 INX237이 현저하게 증가된 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다.
실험 4(도 80) 결과는 상이한 IgG 골격을 본 발명의 INX 항체에 혼입하는 것은 항체 반감기를 인지 가능하게 변화시키지 않았다는 것을 나타낸다.
실험 5(도 81) 결과는 GC 페이로드의 첨가가 분석된 2개의 시점에서 INX 항-VISTA 항체의 청소율에 추가로 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
이들 결과는 본 발명의 항-VISTA 항체 및 이를 함유하는 ADC가 PK 값 및 청소율 특성을 보유하여 원하는 페이로드, 특히 표적 면역 세포로의 스테로이드 페이로드의 표적 전달에 매우 적합하다는 것을 나타낸다.
실시예 11 : 코티코스테론 수준에 대한 INX 201J 대 덱사메타손을 사용한 장기간 치료의 영향
글루코코티코이드 호르몬은 스트레스에 반응하여 빠르게 합성되고 부신에서 분비된다. 또한 기저 조건 하에서 글루코코티코이드는 일주기(circadian) 및 하루이내(ultradian)(박동(pulsatile)) 패턴으로 리드미컬하게 방출된다. 이러한 리듬은 글루코코티코이드 표적 기관의 정상적인 기능뿐만 아니라 스트레스에 대한 HPA 축 반응에도 중요하다. 다수의 연구는, 연장된 GC 치료에 의한 글루코코티코이드 리듬의 중단이 인간 및 설치류 둘 다에서 질환과 관련이 있음을 나타내었다. 인간에서, 가장 풍부한 GC는 코티솔이고 마우스에서는 코티코스테론이다.
상기에 기초하여, 본 발명자들은 예시적인 항체 약물 접합체(ADC) INX201J, 및 글루코코티코이드(GC) 페이로드에 연결된 항-인간 VISTA 단클론성 항체를 사용한 장기간 치료의 HPA 축, 구체적으로 코티코스테론 기저 수준에 대한 영향을 평가하였다. 하기에 논의된 바와 같이 실험을 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있고 마우스 VISTA와 동일한 발현 패턴으로 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 인간 VISTA를 발현하는 인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI)에서 수행하였다. 실험은 GC의 기저 수준에서 스트레스-유도 변화를 제한하기 위해 이후에 모든 주사 및 채혈을 수반하는 특정 핸들러에 일주일 동안 먼저 순응시킨 암컷 마우스에서 수행하였다.
이어서, 마우스에게 INX201J 10 또는 3㎎/㎏(각각 0.2 또는 0.06㎎/㎏의 페이로드) 또는 덱사메타손(Dex) 2 또는 0.2㎎/㎏을 주사하였다. Dex를 4일 동안 매일 투여하였고 INX201J는 제1일, 제3일 및 제4일에 투여하였다. 제5일에 마우스를 채혈하고 코티코스테론 수준을 ELISA로 평가하였다.
물질 및 방법
실험 설계
실험을 암컷 hVISTA KI 마우스에서 수행하였다. 이어서, 제1일, 제3일 및 제4일에 마우스에게 INX201J 10 또는 3㎎/㎏(각각 0.2 또는 0.06㎎/㎏의 페이로드); 또는 4일 동안 계속해서 덱사메타손(Dex) 2 또는 0.2㎎/㎏을 매일 주사하였다. PBS 주사를 매일 제공받은 대조군을 포함시켰다. 제5일에 마우스를 채혈하고 혈장 코티코스테론 수준을 ELISA로 평가하였다.
투여 일정에 대한 이론적 근거는 본 발명의 ADC가 Dex(24시간 미만)보다 훨씬 더 긴 약력학적 범위(96시간 초과)를 가짐을 나타낸 다른 연구(이전 실시예 참조)를 기반으로 한다.
실험: (군당 8마리 마우스)
군 1: PBS
군 2: Dex 2㎎/㎏
군 3: Dex 0.2㎎/㎏
군 4: INX201J 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드)
군 5: INX201J 3㎎/㎏(0.06㎎/㎏의 페이로드)
시험 작용제 및 투여량
항체
INX201J(Abzena, 로트 번호: JZ-0556-025-1, JZ-0556-027, JZ-0556-013)는 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체인 INX201에 기반한다. INX201J는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율이 8.0인 접합된 항체이다. 링커/페이로드(J)는 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 복강내(i.p.) 주사하여 명시된 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사제인 NDC 57319-519-05를 PBS에 희석시키고 i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
마우스
hVISTA 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였다. 모든 실험은 9 내지 15주령으로 등록된 암컷 마우스에서 수행하였다.
채혈 및 준비
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다. 그런 다음 혈액을 550rcf에서 5분 동안 원심분리시키고 혈장을 수집하여 코티코스테론 분석 전에 -80℃에서 저장하였다.
코티코스테론 ELISA
ELISA는 Arbor Assays(카탈로그 번호 K014-H5) Corticosterone 5 pack ELISA Kit를 사용하여 제조사의 포함된 프로토콜에 따라 수행하였다.
결과
INX201J는 코티코스테론 수준에 제한된 영향을 갖는다.
도 82의 실험에서 나타난 바와 같이, 마우스 순응은 2마리의 동물을 제외하고 대조군에서 상대적으로 일관된 수준의 코티코스테론으로 이어졌고, 1마리는 매우 높은 코티코스테론 수준을 나타내고 나머지는 매우 낮은 코티코스테론 수준을 나타내었다. 도 82는 좌측에 제외되지 않은 데이터 및 우측에 제외된(대조군에서 2개의 이상치가 없음) 데이터를 나타내고, 혈장 코티코스테론 수준의 변화를 나타낸다. (SEM, 일원 분산분석, 우측 그래프에서 PBS 대조군의 경우 n=6인 것을 제외하고는 n=8). 나타낸 바와 같이 2㎎/㎏의 Dex는 기저 코티코스테론 수준을 극적으로 감소시켰지만 0.2㎎/㎏에서는 유의한 영향이었지만 제한적이었다. 이에 반해서, INX201J는 0.06㎎/㎏의 페이로드의 용량에서 영향이 없었지만 0.2㎎/㎏의 페이로드에서는 제한된 감소가 관찰되었다.
결론
이 데이터는, 2㎎/㎏의 Dex가 코티코스테론의 기저 수준을 극적으로 감소시키는 반면 0.2㎎/㎏에서 감소는 여전히 매우 유의하지만(P< 0.001) 더 제한적이라는 것을 나타낸다. 대조적으로, 0.2㎎/㎏의 페이로드(치료적으로 2㎎/㎏ Dex와 동등)의 INX201J는 더 제한적인 영향을 가졌다(ns 또는 P<0.5). 0.06㎎/㎏에서, 코티코스테론 수준에 대해서는 효과가 없었다. (이러한 용량은 이전 실시예에 나타난 바와 같이 0.2㎎/㎏의 페이로드에서의 INX201J가 2㎎/㎏의 Dex와 유사한 효능을 갖기 때문에 선택되었다.)
실시예 12 : 항원 특이적 반응에 대한 ADC의 영향
글루코코티코이드(GC)는 1차 면역 반응에 중대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며 백신에 대한 IgG 반응에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 따라서 항원-특이적 반응을 방해하는 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)의 기능성을 평가하기 위해 백신 모델을 사용하였다. 하기에 자세히 논의되는 바와 같이 본 발명자들은 마우스 CD40 효능제 항체(FGK4.5), 모델 항원(Ag)으로서의 OVA 펩타이드 SIINFEKL 및 사량체 기술을 사용하여 측정될 수 있는 효력이 있는 CD8 T 세포 유도된 Ag 반응을 유도하는 TLR 효능제 Poly (I:C)를 조합한 표준 면역화 프로토콜을 사용하였다. 추가 이점은 이 모델은 또한 백신 접종 전 최대 1주일까지 처리하여 본 발명자들의 ADC의 약력학적 범위를 평가할 수 있다는 것이었다.
하기에 상세하게 논의된 바와 같이 3가지 연구를 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있고 마우스 VISTA와 동일한 발현 패턴으로 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 인간 VISTA를 발현하는 인간 VISTA 넉-인 마우스(hVISTA KI)에서 수행하였다. 간략하면, 이들 마우스에게 면역화 전 7일까지 ADC를 주사하였다. 덱사메타손(Dex)을 양성 GC 대조군으로서 사용하였다. 말초 혈액에서 면역 반응을 항-Ag 반응의 피크에서 면역화 6일 후에 측정하였다.
물질 및 방법
실험 설계
4개의 실험 모두는 군당 5마리 마우스를 사용하여 암컷 마우스에서 수행하였다.
실험 1 : 면역화 2시간 전에 투여되는 경우 Ag-특이적 반응에 대한 Dex의 영향
도 83에 제시된 실험은 면역화 2시간 전에 투여되고 C57Bl/6 마우스에서 수행되는 경우 Ag-특이적 반응에 대한 Dex의 영향을 확인하기 위해서 수행되었다.
군 1: PBS
군 2: 2㎎/㎏의 Dex
군 3: 0.2㎎/㎏의 Dex
마우스에게 i.p.로 2 또는 0.2㎎/㎏의 Dex 또는 PBS를 투여하였다. 2시간 후, 이들에게 i.p. 주사로 백신 칵테일을 제공하였다. 그 다음 이들 마우스를 6일 후에 채혈하고 Ag 특이적 CD8 T 세포 수를 정량화하였다.
실험 2 : 면역화 전 상이한 시점에 투여되는 경우 Ag-특이적 반응에 대한 ADC INX201J의 영향
도 84에서의 이러한 실험은 면역화 전 상이한 시점에 투여되고 hVISTA KI 마우스에서 수행되는 경우 Ag-특이적 반응에 대한 ADC INX201J의 영향을 평가하기 위해서 수행되었다.
군 1: PBS
군 2: 2㎎/㎏의 Dex
군 3: 0.2㎎/㎏의 Dex
군 4: 10㎎/㎏의 INX201J - d-1
군 5: 10㎎/㎏의 INX201J - d-2
군 6: 10㎎/㎏의 INX201J - d-4
군 1 내지 3으로부터의 마우스에게 면역화 2시간 전에 i.p.로 투여하였다. 군 4 내지 6으로부터의 마우스에게 면역화 1일, 2일 또는 4일 전에 제시된 바와 같이 투여하였다. 모든 마우스를 제0일에 면역화시켰다. 그 다음 이들 동물 모두를 6일 후에 채혈하고 Ag 특이적 CD8 T 세포 수를 정량화하였다.
실험 3
도 85에서의 이러한 실험은 면역화 전 상이한 시점에 투여되고 hVISTA KI 마우스에서 수행되는 경우 Ag-특이적 반응에 대한 다수의 ADC의 영향을 평가하기 위해서 수행되었다.
군 1: PBS - 백신 2시간 전
군 2: 2㎎/㎏의 Dex - 백신 2시간 전
군 3: 0.2㎎/㎏의 Dex - 백신 2시간 전
군 4: 2㎎/㎏의 Dex - 제-7일
군 5: 10㎎/㎏의 INX201J - d-1
군 6: 10㎎/㎏의 INX201J - d-7
군 7: 10㎎/㎏의 INX231J - d-7
군 8: 10㎎/㎏의 INX234J - d-7
군 9: 10㎎/㎏의 INX240J - d-7
군 1 내지 3으로부터의 마우스에게 면역화 2시간 전에 i.p.로 투여하였다. 군 4 내지 9로부터의 마우스에게 면역화 1일 또는 7일 전에 제시된 바와 같이 투여하였다. 모든 마우스를 제0일에 면역화시켰다. 그 다음 이들 동물 모두를 6일 후에 채혈하고 Ag 특이적 CD8 T 세포 수를 정량화하였다.
실험 4 : Ag-특이적 반응에 대한 GC 페이로드(P)에 접합된 다수의 ADC의 영향
도 86에서의 이러한 실험은 면역화 전 상이한 시점에 투여되고 hVISTA KI 마우스에서 수행되는 경우 Ag-특이적 반응에 대한 GC 페이로 (P)에 접합된 다수의 ADC의 영향을 평가하기 위해서 수행되었다.
군 1: PBS - 백신 2시간 전
군 2: 2㎎/㎏의 Dex - 백신 2시간 전
군 3: 10㎎/㎏의 INX201J - d-1
군 4: 10㎎/㎏의 INX201J - d-7
군 5: 10㎎/㎏의 INX231P - d-7
군 6: 10㎎/㎏의 INX234P - d-7
군 7: 10㎎/㎏의 INX240P - d-7
군 1 내지 2로부터의 마우스에게 면역화 2시간 전에 i.p.로 투여하였다. 군 3 내지 7로부터의 마우스에게 면역화 1일 또는 7일 전에 제시된 바와 같이 투여하였다. 모든 마우스를 제0일에 면역화시켰다. 그 다음 이들 동물 모두를 6일 후에 채혈하고 Ag 특이적 CD8 T 세포 수를 정량화하였다.
시험 작용제 및 투여량
항체
INX201, INX231, INX234 및 INX240(각각 로트 번호 72928.1.a, 72931.1.a 및 73419.1.a)를 이들 실험에서 사용하였는데, 이것 모두는 Fc 영역에 L234A/L235A /E269R/K322A　침묵 돌연변이를 갖는 인간　IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체를 포함한다.
INX201J, INX231J, INX234J 및 INX240J(로트 번호 JZ-0556-027, JZ-0556-013-1, JZ-0556-013-2, JZ-0556-013-3)는 각각 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 각각 INX201, INX231, INX234, 및 INX240을 포함한다. 링커/페이로드(J)는 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX201P, INX231P, INX234P 및 INX240 P(로트 번호 JZ-0556-0271, JZ-0556-017-1, JZ-0556-017-2, JZ-0556-017-3)는 각각 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 각각 INX201, INX231, INX234 및 INX240이다. 링커/페이로드(P)는 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
이들 항체 각각을 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 복강내(i.p.) 주사하여 명시된 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사제인 NDC 57319-519-05를 PBS에 희석시키고 i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
백신 칵테일
50㎍ 마우스 CD40 효능제 항체(클론 FGK4.5) + 50㎍ SIINFEKL 펩타이드 + 50㎍ poly(I:C)를 함유한 항체/펩타이드/poly(I:C)의 표준 면역화 프로토콜을 마우스당 사용하였다. 백신을 PBS에 희석시키고, 200㎕의 최종 부피로 i.p. 주사하였다.
마우스
hVISTA 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였다. 모든 실험은 9 내지 15주령으로 등록된 암컷 마우스에서 수행하였다. C57Bl/6 마우스는 Jackson Laboratories에서 구입하였다.
채혈 및 면역염색
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다. 절대 혈액 세포 계수를 허용하는 1-세척 프로토콜을 사용하였다.
10㎕의 항체 칵테일(아래 참조)을 50 또는 100㎕의 혈액에 직접 첨가하였다. 실온(RT)에서 30분 인큐베이션 후, 600㎕ BD FACS 용해 완충액을 샘플에 첨가하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 후, 샘플을 550rcf에서 5분 동안 회전시키고, PBS에서 1회 세척하고, 고정 부피의 PBS에 재현탁시켰다. 전체 샘플을 MacsQuant 유세포 분석기에서 분석하여 절대 세포 수를 얻었다.
항체 패널:
다음 항체를 PBS에 용해시켰다.
CD11a - FITC (BioLegend; 클론 2D7; 0.5mg/㎖) 1:200
H-2kb-OVA-PE 사량체 (MBL iTag MHC Tetramer 카탈로그 번호 T03000; 로트 번호 T1603004); (10 ㎕/샘플)
CD8-Alexa647 (클론 KT15; MBL # D271-A64; 1mg/㎖)(1:800).
마우스 Fc 블록 (1:200)
게이팅 전략:
FSC 대 SSC - 림프구 집단에 대한 게이팅.
FSC-H 대 FSC-A - 단일항 집단
CD8+ T 세포에 대한 게이트
CD8+ → CD11a+ 대 Ova-tet+
결과
실험 1
상기에서 주목되는 바와 같이 도 83의 실험은 면역화 2시간 전에 투여되고 C57Bl/6 마우스에서 수행되는 경우 Ag-특이적 반응에 대한 Dex의 영향을 확인하기 위해서 수행되었다. 2㎎/㎏의 Dex는 Ag-특이적 CD8 T 세포(OVA tet)의 수를 극적으로 감소시켰고 0.2㎎/㎏에서도 관찰된 명확한 감소를 나타내었다. 구체적으로, 도 83은 면역화 6일 후 말초 혈액으로부터의 Ag-특이적 CD8 T 세포 수를 도시한다. (SEM, 일원 분산분석, n=5).
실험 2
도 84에 나타난 바와 같이, 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 면역화 24시간, 48시간 또는 96시간 전에 투여되는 경우 INX201J는 Ag-특이적(Ova Tet+ CD8 T 세포) 반응의 감소에서 2㎎/㎏으로 면역화 2시간 전에 투여된 Dex와 유사한 효능을 나타낸다. 본 실험에서 2마리의 미경험 마우스로부터의 혈액을 마지막에 첨가하여 기준선 대조군을 제공하였다. 보다 구체적으로, 도 84는 면역화 6일 후 말초 혈액으로부터의 Ag-특이적 CD8 T 세포 수를 도시한다. 도 84의 좌측 그래프는 모든 샘플을 포함하는 PBS 대조군을 나타내고, 우측 그래프는 하나의 이상치가 제거된 PBS 대조군을 나타낸다(SEM, 일원 분산분석, 미경험을 제외하고는 n=5; 1개 샘플은 Dex가 0.2㎎/㎏인 군에서 면역화 실패로 제외됨).
실험 3
도 85의 실험에서 4개의 상이한 ADC를 평가하였다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 ADC는 면역화 1일 또는 7일 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여되는 경우 Ag-특이적(Ova Tet+ CD8 T 세포) 반응의 감소에서 상당한 효능을 나타내었다. 추가로 Dex는 2㎎/㎏로 투여되었을 때 효능을 나타내었지만 0.2㎎/㎏에서 또는 면역화 7일 전에 2㎎/㎏에서 투여되었을 때 효능이 상실되었음을 상기 도면으로부터 인지될 수 있다. 보다 구체적으로, 도 85의 실험은 면역화 6일 후 말초 혈액으로부터의 Ag-특이적 CD8 T 세포 수를 도시한다. 본 실험에서는 처리 중 기술적 문제로 인해 여러 샘플을 제외해야 했다: PBS 군 n=3, 2㎎/㎏의 Dex n=2, 0.2㎎/㎏의 Dex n=3, INX201J D-1 n=5, INX201J D-7 n=2, INX231J D-7 n=3, INX234J D-7 n=5, INX240J D-7 n=4(SEM, 일원 분산분석, D=일).
실험 4
도 86에 포함된 이 실험에서, 상이한 GC 페이로드(P)와 각각 접합된 4개의 ADC를 평가하였다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 면역화 1일 또는 7일 전에 투여했을 때 INX201P, INX231P 및 INX234P에서 Ag-특이적(Ova Tet+ CD8 T 세포) 반응의 상당한 감소가 관찰되었으며, 이는 0일에 2㎎/㎏으로 투여된 Dex의 효과와 대등하였다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, INX240P만 거의 효능을 나타내지 않았다. 보다 구체적으로, 도 86의 데이터는 면역화 6일 후에 말초 혈액으로부터의 Ag-특이적 CD8 T 세포 수를 나타내며, 여기서 기술적인 이유로 PBS, INX231P 및 INX234P 군에서 2개의 샘플이 제외되었고; 다른 모든 군의 경우 n=5(SEM, 일원 분산분석)였다.
결론
상기에 언급된 바와 같이 실험 1 내지 4의 데이터는 다음을 나타낸다:
(i) 실험 1은 2 및 0.2㎎/㎏ 둘 다에서 면역화 2시간 전에 투여된 Dex가 Ag-특이적 반응을 효율적으로 감소시킨다는 것을 나타내고;
(ii) 실험 2는 본 발명에 따른 예시적인 ADC 접합체인 INX201J가 면역화 24시간, 48시간 또는 96시간 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여되는 경우 Ag-특이적 반응의 감소에서 2㎎/㎏으로 면역화 2시간 전에 투여된 Dex와 유사한 효능을 나타낸다는 것을 나타내고;
(iii) 실험 3은 면역화 1일 또는 7일 전에 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여되는 경우 Ag-특이적 반응의 감소에서 상당한 효능을 나타낸다는 것을 나타낸다. 이에 반해서 Dex는 2㎎/㎏로 투여되는 경우 효능을 나타내었지만 0.2㎎/㎏에서 또는 면역화 7일 전에 2㎎/㎏으로 투여되는 경우 효능이 상실되었다.
(iv) 실험 4는 상이한 GC 페이로드와 각각 접합된 4개의 예시적인 ADC를 나타낸다. 다시, INX240P를 제외하고 면역화 1일 또는 7일 전에 투여되는 경우 모든 시험된 ADC에 대해 Ag-특이적 반응의 현저한 감소가 관찰되었다.
종합하면, 이들 데이터는 다음을 나타낸다:
(i) 0.2㎎/㎏의 GC 페이로드로 투여된 본 발명에 따른 예시적인 ADC는 Ag-특이적 반응을 감소시키는 데 있어서 Dex가 2㎎/㎏으로 투여된 것과 대등한 효능을 갖고;
(ii) J 및 P GC 페이로드 둘 다는 대등한 효력을 갖고;
(iii) Dex는 면역화 7일 전에 주사되는 경우 효력을 상실하지만, 상이한 ADC는 Ag 특이적 반응의 발달을 제어하는 데 있어서 여전히 상당한 효력을 갖는다.
실시예 13 : OVA-천식 마우스 모델에서 항-VISTA 항체 약물 접합체의 효능
천식은 임상적으로 기도 과민성, 기관지폐포 세척액(BALF) 및 기관지 벽에서의 염증 세포 침윤 및 기도 구조적 변화를 특징으로 하는 복합 염증성 질환이다. 흡입형 글루코코티코이드(GC)는 대부분의 천식 유형에 대한 표준 치료로 간주된다. 이에 기초하여 알레르기 천식의 마우스 모델에서 예시적인 항체 약물 접합체(ADC) INX201J의 치료 효능을 평가하기 위한 연구를 수행하였다.
간략하면, 하기에 상세히 논의되고 본 실시예에서 참조된 도면에 도시된 바와 같이, 마우스를 수산화알루미늄에 에멀션화된 오브알부민(OVA)을 1주 간격으로 2회 주사하여 감작시켰다. 1주 또는 2주 후(실험의 파트 1 및 파트 2), 마우스를 연속 5일 동안 OVA에 흡입을 통해 매일 노출시켜 시험감염시켰다. 치료는 OVA 노출 동안 매일 10㎎/㎏(또는 0.2㎎/㎏의 페이로드)의 INX201J 또는 2㎎/㎏의 덱사메타손(Dex)의 3회 용량으로 이루어졌다. 분석은 마지막 시험감염 24시간 후에 수행되었다.
이들 실험을 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있고 마우스 VISTA와 동일한 발현 패턴으로 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 인간 VISTA를 발현하는 인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI) 마우스 또는 C57Bl/6 마우스에서 다시 수행하였다. 본 연구의 목적은 OVA 천식 뮤린 모델에서 유리 덱사메타손(Dex)과 비교하여 본 발명자들의 ADC인 INX201J의 치료 효능을 평가하는 것이었다.
본 발명자들의 ADC의 효능 수준을 평가하기 위해, 본 발명자들은 BAL에서 사이토카인 생산뿐만 아니라 폐에 동원된 염증 세포의 수를 유세포 분석기로 측정하였다. 전신 반응을 ELISA로 평가하여 OVA 특이적 IgG 및 IgE의 생산을 정량화하였다. 마지막으로, H&E로 염색된 폐 절편을 맹검 분석하여 질환에 대한 점수를 매겼다.
하기에 상세히 논의되는 바와 같이, 내부 반복으로 간주될 수 있는 문헌에 기술된 2개의 상이한 프로토콜을 병렬로 평가함에 따라 OVA 시험감염에 대해 2개의 상이한 시점을 사용하여 이들 실험을 수행하였다.
물질 및 방법
실험 설계
실험은 군당 10마리의 암컷 마우스로 하기 군을 포함하였다. 군 1 내지 3 및 5, 6은 C57Bl/6이고, 군 4 및 7의 마우스는 인간 VISTA KI 마우스이다. 군 2 내지 7의 모든 마우스는 OVA에 대해서 감작되었고 OVA로 시험감염되었다.
군 1: 미경험
군 2: OVA alum - 흡입 D14-18
군 3: OVA alum - 흡입 D14-18 - 2㎎/㎏의 Dex
군 4: OVA alum - 흡입 D14-18 - 10㎎/㎏의 INX201J
군 5: OVA alum - 흡입 D21-25
군 6: OVA alum - 흡입 D21-25 - 2㎎/㎏의 Dex
군 7: OVA alum - 흡입 D21-25 - 10㎎/㎏의 INX201J
군 2 내지 7의 마우스는 모두 수산화알루미늄에 에멀션화된 10㎍/마우스의 오브알부민으로 감작되었다.
- 실험의 파트 1:
군 1(미경험)의 5마리의 마우스 및 군 2 내지 4의 모든 동물을 제14일부터 제18일까지 연속 5일 동안 30분 동안 OVA 흡입(PBS 중 3% OVA)시켰다. 2㎎/㎏의 Dex를 제14일부터 제18일까지 i.p.로 주사하였다. 10㎎/㎏의 INX201J를 제13일, 제15일 및 제17일에 i.p.로 투여하였다. 처리된 동물을 제19일에 희생시켰다.
- 실험의 파트 2:
군 1의 5마리의 마우스 및 군 5 내지 7의 모든 동물을 제21일부터 제25일까지 연속 5일 동안 30분 동안 OVA 흡입(PBS 중 1% OVA)시켰다. 2㎎/㎏의 Dex를 제21일부터 제25일까지 i.p.로 주사하였다. 10㎎/㎏의 INX201J를 제20일, 제22일 및 제24일에 i.p.로 투여하였다. 처리된 동물을 제25일에 희생시켰다.
실험 설계 및 분석은 문헌(Gueders et al, "Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 및 BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production", Inflamm. Res. (2009) 58:845-854; Yu et al, "Establishment of different experimental asthma models in mice", Experimental and Therapeutic Medicine 15: 2492-2498, 2018)에 기초하였다.
시험 작용제 및 투여량
항체
INX201J (Abzena, 로트 번호: JZ-0556-025-1, JZ-0556-027, JZ-0556-013). INX201은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다. INX201J는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율이 8.0인 접합된 항체이다. 링커/페이로드(J)는 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다. INX201J를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 복강내(i.p.) 주사하여 명시된 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사제인 NDC 57319-519-05를 PBS에 희석시키고 i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
오브알부민
오브알부민(또는 계란 흰자로부터의 알부민)을 Sigma(A5503)에서 구입하고 PBS에 재현탁시켰다. 이것을 i.p. 또는 네블라이저를 통해서 투여하였다.
마우스
hVISTA KI 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였다. 모든 실험은 15주령으로 등록된 암컷 마우스에서 수행하였다. C57Bl/6 마우스는 Jackson Laboratories에서 구입하였다.
OVA 흡입
OVA는 Kent Scientific(AG-ALSM-0530LG)으로부터의 네블라이저 전달 시스템을 사용하여 네블라이저를 통해서 전달하였다.
채혈
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다. 그런 다음 혈액을 550rcf에서 5분 동안 원심분리시키고 75㎕의 혈장을 수집하여 사이토카인 분석 전에 -80℃에서 저장하였다. 혈액 세포를 75㎕의 PBS에 재현탁시키고, 면역염색을 위해서 처리하였다.
기관지폐포 세척액
마우스를 CO2 흡입으로 희생시키고 즉시 기관지 폐포 세척을 5×1㎖ PBS-EDTA(0.5mM)를 사용하여 수행하였다. 부드러운 수동 흡인으로 세포를 회수하였다. 부피를 기록하였다. 회수 부피가 4㎖ 미만인 샘플은 제외시켰다. 550rcf에서 5분 동안 원심분리시킨 후, 상청액을 수집하고, 단백질 평가를 위해 -80℃에서 동결시켰다. 세포를 PBS에 재현탁시키고 면역염색을 위해 처리하였다.
BAL 면역염색
BAL 세포 샘플을 2개로 나누고 림프구 및 골수 세포에 대해 2개의 상이한 항체 패널로 염색하였다(표 2 및 표 3 참조). 4℃에서 30분 후 샘플을 1회 세척하고 고정된 부피로 재현탁시켰다. 고정된 부피를 MacsQuant 유세포 분석기에서 분석하여 대등한 세포 수를 얻었다.
전혈 면역염색
본 발명자들은 절대 혈구 계수를 허용하는 1-회 세척 프로토콜을 사용하였다. 10㎕의 항체 칵테일(아래 참조)을 100㎕의 혈액에 직접 첨가하였다. 실온(RT)에서 30분 인큐베이션 후, 600㎕ BD FACS 용해 완충액을 샘플에 첨가하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 후, 샘플을 550rcf에서 5분 동안 회전시키고, PBS에서 1회 세척하고, 고정 부피의 PBS에 재현탁시켰다. 전체 샘플을 MacsQuant 유세포 분석기에서 분석하여 절대 세포 수를 얻었다.
표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이 림프구 및 골수 세포에 대해 상이한 항체 패널을 사용하였다.
ELISA
IgG, OVA-특이적 IgG, IgE, OVA-특이적 IgE에 대한 ELISA
마우스 IgG1에 대한 ELISA
먼저 96-웰 편평 바닥 플레이트(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp, 카탈로그 번호 442404)를 RT에서 1시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 염소 항-마우스 IgG1(Southern Biotech, 카탈로그 번호 1070-01)로 코팅하였다. 웰을 PT(0.05% Tween 20을 함유한 PBS)로 3회 세척한 다음 RT에서 1시간 동안 PTB(0.05% Tween 20 및 1% BSA를 함유한 PBS)로 차단시켰다. 마우스 IgG1 항-오브알부민(Biolegend, 카탈로그 번호 520502)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.　
PT로 3회 세척한 후, 염소 항-마우스 IgG1-HRP (Southern Biotech, 카탈로그 번호 1070-05)를 검출 시약으로 1/20,000으로 사용하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5 내지 10분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
마우스 IgG1 항-오브알부민에 대한 ELISA
먼저 96-웰 편평 바닥 플레이트(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp, 카탈로그 번호 442404)를 RT에서 1시간 동안 PBS 중 95㎍/㎖의 오브알부민(Sigma, 카탈로그 번호 1070-01)으로 코팅하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 후 RT에서 1시간 동안 PTB로 차단시켰다. 마우스 IgG1 항-오브알부민(Biolegend, 카탈로그 번호 520502)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PT로 3회 세척한 후, 염소 항-마우스 IgG1-HRP (Southern Biotech, 카탈로그 번호 1070-05)를 검출 시약으로 1/20,000으로 사용하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5 내지 10분 후, 반응을 1M H2S04로 다시 중단시켰다.
마우스 IgE에 대한 ELISA
먼저 96-웰 편평 바닥 플레이트(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp, 카탈로그 번호 442404)를 rt에서 1시간 동안 PBS 중 1㎍/㎖의 염소 항-마우스 IgE (Southern Biotech, 카탈로그 번호 1110-01)로 코팅하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 후 RT에서 1시간 동안 PTB로 차단시켰다. 마우스 IgE 항-오브알부민(BioRad, 카탈로그 번호 MCA2259)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PT로 3회 세척한 후, 염소 항-마우스 IgE-HRP (Southern Biotech, 카탈로그 번호 1110-05)를 검출 시약으로 1/2000으로 사용하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5 내지 10분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
마우스 IgE 항-오브알부민에 대한 ELISA
먼저 96-웰 편평 바닥 플레이트(Thermo Scientific Nunc Immunol Maxisorp, 카탈로그 번호 442404)를 rt에서 1시간 동안 PBS 중 95㎍/㎖의 오브알부민(Sigma, 카탈로그 번호 1070-01)으로 코팅하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 후 RT에서 1시간 동안 PTB로 차단시켰다. 마우스 IgG1 항-오브알부민(BioRad, 카탈로그 번호 MCA2259)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 웰을 PT로 3회 세척한 다음, 혈장 샘플을 RT에서 1시간 동안 PTB(표준 곡선에 맞추기 위해)에서 최대 4개의 상이한 희석액으로 인큐베이션시켰다.
PT로 3회 세척한 후, 염소 항-마우스 IgE-HRP (Southern Biotech, 카탈로그 번호 1110-05)를 검출 시약으로 1/2000으로 사용하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후, 제조사 지침에 따라 TMB 기질을 사용하여 ELISA 반응을 가시화하였다. RT에서 5 내지 10분 후, 반응을 1M H2S04로 중단시켰다.
사이토카인에 대한 ELISA
Figure pct00873
R&D (카탈로그 번호 DY420-05) Duoset mouse CCL11/Eotaxin
R&D (카탈로그 번호 DY478-05) Duoset mouse CCL5/RANTES
R&D (카탈로그 번호 DY405-05) Duoset mouse IL-5
R&D (카탈로그 번호 DY413-05) Duoset mouse IL-13
제조사의 포함된 프로토콜에 따라 모든 ELISA를 수행하였다.
조직병리학적 폐 점수화
폐를 해부하고, 폼알린 고정시키고, 파라핀 포매를 위해 처리하였다. 질환 점수화는 H&E 염색 섹션에서 맹검 방식으로 수행하였고 점수는 다음과 같이 지정되었다:
4: 풍부하게 침윤하여 전체에 퍼짐 - 폐 구조의 소실
3: 풍부하게 침윤하여 전체에 퍼짐 - 폐 구조에 제한된 손상
2: 큰 병소로 보이는 침윤
1: 작은 병소로 보이는 침윤
0: 정상
결과
혈액 반응
세포 반응
도 87의 실험에 나타난 바와 같이, 림프구 또는 골수 세포의 질환-유발 변화는 2개의 실험 일정에서 말초 순환에서 관찰되지 않았고, GC 처리는 유리(Dex) 또는 접합(INX201J)되어 투여되는 경우 B 및 T 세포에서 유사한 감소를 초래하였다 구체적으로, 도 87은 2개의 실험 일정에서 말초 혈액의 절대 세포수의 변화를 도시한다. 14 내지 18일(파트 1) 및 21 내지 25일(파트 2)에 OVA 시험감염(SEM, 일원 분산 분석, n=5인 미경험군을 제외하고는 n=10).
면역글로불린 반응
도 88의 실험에 나타난 바와 같이, 미처리 OVA 시험감염된 동물은 미경험 동물과 비교하여 OVA 특이적 Ig 뿐만 아니라 IgG1 및 IgE의 극적인 증가를 나타내었다. Dex 및 INX201J 처리군 둘 다는 IgG1, IgG1 OVA 특이적 생산에서 유사한 상당한 감소를 나타내었다. IgE 및 OVA 특이적 IgE에서는 감소가 제한적이거나 감소되지 않는 것으로 관찰되었다. 특히, 도 88은 2개의 실험 일정에서 말초 혈액에서 면역글로불린 생산 변화를 나타낸다. 14 내지 18일(파트 1) 및 21 내지 25일(파트 2)에 OVA 시험감염(SEM, 일원 분산분석, n=5인 미경험군을 제외하고는 n=10).
기관지폐포 세척액에서의 반응
세포 반응
도 89의 실험에 나타난 바와 같이, OVA 시험감염은 림프구 및 골수 세포 둘 다로 구성된 기관지폐포 공간에서 큰 염증성 침윤물의 동원을 유발하였다. INX201J 치료는 CD8 T 세포를 제외하고 두 실험 일정 모두에서 Dex와 비교했을 때 면역 침윤물에서 유사한 감소를 초래하였다. 특히, INX201J는 호산구 수(CD11b+, Ly6G-, SiglecF+ CD193+로 정의됨) 감소에서 Dex와 동일한 효능을 나타내었다. 특히, 도 89는 2개의 실험 일정에서 BAL의 면역 침윤 변화를 나타낸다. 14 내지 18일(파트 1) 및 21 내지 25일(파트 2)의 OVA 시험감염; A) 골수 침윤의 변화; B) 림프구 침윤의 변화(SEM, 일원 분산분석, n=10, 대조군에서 2개의 샘플 제외, Dex 군 및 INX201J 군 둘 다에서 3개의 샘플 제외; 미경험 군의 경우 n=5).
사이토카인 변화
도 90의 실험은 질환 유도 후 제한된 증가를 나타낸 CCL11을 제외하고 평가된 다른 모든 사이토카인이 변화를 나타내지 않았음을 나타낸다. INX201J 및 Dex 치료 모두 BAL의 사이토카인 수준에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 구체적으로 도 90은 2개의 실험 일정에서 BAL의 사이토카인 수준의 변화를 도시한다. 14 내지 18일(실험 파트 1) 및 21일 내지 25일(실험 파트 2)에 OVA 시험감염(SEM, 일원 분산분석, n=10, 대조군에서 2개의 샘플 제외, Dex 군 및 INX201J 군 둘 다에서 3개의 샘플 제외; 미경험 군의 경우 n=5).
폐 질환 점수
도 91의 실험에 나타난 바와 같이(실험 파트 1, SEM, 일원 분산분석, 미경험군 n=5를 제외하고 n=10); 기관지폐포 형태의 손실 및 염증 세포의 대규모 동원을 포함하여 미처리 폐에서 상당한 손상이 관찰되었다. 이러한 결과에서 INX201J 및 Dex 치료 둘 다 구조적 손상 및 염증 침윤물이 제한되고 폐 손상이 유사하고 크게 감소했음을 인지할 수 있다.
결론
도 87 내지 도 91의 실험은 INX201J 처리가 다음에서 유리 Dex(10배를 초과하게 더 많이 투여됨)와 동등한 영향을 갖는다는 구체적인 증거를 제공한다:
- 기관지폐포 세척액(BAL)에서 염증 침윤물의 동원 감소
- 폐의 조직병리학적 수준에서 손상 감소
- 혈액 순환에서 IgG1, 보다 구체적으로는 항-OVA IgG1 생산 감소
- IgE 또는 항-OVA IgE의 변화를 유도하지 않았다는 것이 혈액 순환에서 두 치료적 접근법 모두에서 관찰되었다.
- 사이토카인 생산의 변화를 유도하지 않았다는 것이 기관지폐포 세척액에서 두 치료적 접근법 모두에서 관찰되었다.
중요한 점은, 이러한 실험의 2 파트/2개의 상이한 일정에서 유사한 결과가 관찰되었다는 것이다.
실시예 14 : VISTA 발현 면역 세포에 대한 예시적인 항-VISTA 항체 약물 접합체의 영향
이들 실험에서 본 발명자들은 글루코코티코이드(GC) 페이로드에 연결된 항-인간 VISTA 단클론성 항체인 항체 약물 결합체(ADC) INX231J의 표적화 특이성을 평가하였다. GC 전달 및 활성을 모니터링/확인하기 위해서, 본 발명자들은 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 통해 FKBP5의 전사 활성화를 측정하였다(1). 이들 실험을 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있고 마우스 VISTA와 동일한 발현 패턴으로 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 인간 VISTA를 발현하는 인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI) 마우스에서 다시 수행하였다.
특히, 본 발명자들은 2개의 상이한 접근법에 의해 비-특이적 ADC 내재화의 영향을 평가하였다. 먼저, 본 발명자들은 동일한 페이로드에 접합된 인간 IgG1 침묵을 첨가하였다. 둘째, 본 발명자들은 인간 VISTA 표적을 발현하지 않는 C57Bl/6 마우스(마우스 VISTA 단독)에서 동일한 실험을 실행하였다. 간략하면, INX231J 또는 INX231P, 인간 IgG1siJ, 또는 유리 덱사메타손(Dex)을 복강내(i.p.) 주사를 통해 생체내 전달하였다. INX231J/hIgG1siJ/INX231P의 경우 20시간 및 Dex의 경우 2시간 후, 혈액 세포 및 비장 세포를 단리시키고, RNA를 추출하고, FKBP5 전사 수준을 평가하였다.
이들 실험의 목적은 유리 덱사메타손(Dex)과 비교하여 인간 VISTA 발현 세포/조직에 대한 본 발명자들의 ADC의 표적화 특이성을 검증하는 것이었다. GC 전달 및 활성을 모니터링/확인하기 위해서 본 발명자들은 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)로 감응성인 초기 GC 반응 유전자인 FKBP5의 전사 활성화를 측정하였다. 본 발명자들은 이전에 이 응용 분야에서 Dex 처리가 처리 2 내지 4시간 후 VISTA 발현 세포에서 FKBP5 메신저 RNA의 극적인 증가를 유발하지만 전사 영향이 24시간까지 사라짐을 발견하였다. 대조적으로, FKBP5 전사에 대한 ADC의 영향은 처리 20시간 후에 피크 유도로 오래 지속되지만 신호는 단핵구에서 3일 동안, 대식세포에서 14일 동안 여전히 검출 가능하다.
이들 실험에서, 본 발명자들은 각각 정맥내(i.v.) 또는 복강내(i.p.) 주사를 통해 생체내 전달된 2개의 상이한 페이로드(J 및 P)를 갖는 항-VISTA 항체 INX231 또는 유리 Dex를 사용하였다. 비장 세포 및 혈액 세포를 단리시키고, RNA를 추출하여 FKBP5 전사 수준을 평가하였다. 이들 실험 및 그 결과는 하기에 상세히 기재되어 있다.
물질 및 방법
실험 설계
3개 연구 모두에 대해:
Dex를 i.p.주사하였고, 피크 FKBP5 유도에 상응하는 2시간 후 마우스를 안락사시키고 세포를 단리시켰다.
ADC (INX231J 또는 INX231P 또는 hIgG1siJ)를 i.v. 주사하였고 20시간 후 마우스를 안락사시키고 세포를 단리시켜 ADC 처리 및 피크 FKBP5 유도에 충분한 시간을 제공하였다. 참고로 ADC는 큰 분자의 보다 일관된 전달을 보장하기 위해서 i.v.로 주사되었다.
PBS를 주사한 대조군은 FKBP5 전사 기준선을 정의하기 위해서 포함되었다.
시험 작용제 및 투여량
항체
Figure pct00877
INX231(로트 번호 72928.1.a)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX231J(로트 번호 JZ-0556-013-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(J)는 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231P(로트 번호 JZ-0556-017-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(P)는 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
인간 IgG1siJ(로트 번호 JZ-0556-025-2)는 Fc 영역에 E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 항-RSV mAb이다. 약물/항체 비율은 8.0이고, 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 J 링커/페이로드와 접합된다.
군 1의 5마리의 마우스 및 군 5 내지 7의 모든 동물을 제21일부터 제25일까지 연속 5일 동안 30분 동안 OVA 흡입(PBS 중 1% OVA)시켰다. 2㎎/㎏의 Dex를 제21일부터 제25일까지 i.p.로 주사하였다. 10㎎/㎏의 INX201J를 제20일, 제22일 및 제24일에 i.p.로 투여하였다. 처리된 동물을 제25일에 희생시켰다. 모든 ADC를 PBS에 희석시키고, 0.2㎖의 최종 부피로 i.v.로 주사하여 명시된 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사 용액인 NDC 57319-519-05를 PBS에 희석시키고 i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
마우스
hVISTA KI 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였고; C57Bl/6 마우스는 Jackson Laboratories(ref# 000665)에서 제공받았다.
수컷 또는 암컷 마우스를 9 내지 15주령에 등록하였다.
세포 단리
안락사 후, 심장 혈액(0.3 내지 0.5㎖ 범위의 부피) 및 비장을 수집하였다.
혈액 준비: 적혈구 용해를 위해 6㎖의 ACK 완충액을 혈액에 첨가하였다. RT에서 5분 후, 세포를 1500rpm에서 5분 동안 회전시키고; 10㎖의 PBS로 1회 세척한 후, 세포를 펠릿화하고, RNA 용해 완충액에 직접 재현탁시켰다.
비장을 기계적으로 해리시켰다. 40㎛ 필터를 통과시킨 후, 세포 펠릿을 RNA 용해 완충액에 재현탁시켰다(하기 참조).
RNA 준비 및 실시간 PCR
혈액 및 비장으로부터의 세포 펠릿을 NucleoSpin® RNA Plus kit(Macherey-Nagel # 740984)의 RNA 용해 완충액 0.4㎖에 재현탁시켰다. 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리시키고 30 또는 40㎕ H2O(RNase/DNase 무함유)에 용출시켰다. RNA 농도를 Nanodrop에서 평가하였다.
Taqman 역전사 시약(#N8080234)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사를 수행하였다.
정량 실시간 PCR은 Taqman 마스터 믹스 2X 키트(#4369016) 및 마우스 FKBP5용 Taqman 프라이머(Mm00487401_m1) 및 마우스 HPRT를 하우스키핑 유전자(Mm446968_m1)로 사용하여 수행하고 Applied Biosystem의 QuantStudio3에서 실행하였다.
Ct 데이터를 PBS에 대한 ΔCt 및 ΔΔCt 또는 Log2 배수 변화로 변환시켰다.
실험 1
본 실험에서, 본 발명자들은 hVISTA KI 수컷 마우스에서 VISTA 발현 조직(혈액 및 비장)에 대한 J 페이로드에 접합된 인간 IgG1 침묵 대조군(IgG1siJ) 대 INX231J 및 Dex의 영향을 평가하였다. IgG1siJ 및 INX231J를 5㎎/㎏(0.1㎎/㎏의 페이로드 전달)로 투여하였고 FKBP5 유도를 20시간 후에 측정하여 ADC 처리 및 강력한 FKBP5 유도를 위한 충분한 시간을 제공하였다. Dex를 2㎎/㎏로 주사하고 2시간 후에 FKBP5 유도를 측정하였다.
도 92의 실험에 나타난 바와 같이, INX231J 및 Dex 처리로 강력한 FKBP5 유도가 관찰된 반면, 접합된 Ig 대조군은 FKBP5 신호에서 단지 작고 유의하지 않은 변화를 초래하였다. 보다 구체적으로, 도 92는 비장(좌측) 및 혈액(우측) 세포에서 INX231J 주사 후 FKBP5 전사 활성화를 나타낸다. INX231J 효과 및 hIgG1siJ를 5㎎/㎏(0.1㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.v. 주사 20시간 후에 측정하였다.2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군의 평균에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(n=4 마우스/군, PBS-단독 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
실험 2
본 실험에서, 본 발명자들은 인간 VISTA를 발현하지 않는 C57Bl/6 수컷 마우스에서 혈액 및 비장 세포에 대한 INX231P 대 Dex의 영향을 평가하였다. INX231P를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)로 투여하였고 FKBP5 유도를 20시간 후에 측정하여 ADC 처리 및 강력한 FKBP5 유도를 위한 충분한 시간을 제공하였다. Dex를 2㎎/㎏로 주사하고 2시간 후에 FKBP5 유도를 측정하였다.
도 93의 실험에 나타난 바와 같이, 강력하고 상당한 FKBP5 유도가 Dex 처리로 관찰되었지만, INX231P는 야생형 마우스의 혈액 및 비장 세포에 영향을 미치지 않았는데, 이는 ADC 영향이 표적-유래임을 입증한다. 보다 구체적으로, 도 93은 C57Bl/6 마우스에서 INX231P 주사 후 FKBP5 전사 활성화를 도시한다. INX231P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.v. 주사 20시간 후에 측정하였다.2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군의 평균에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(n=4 마우스/군, PBS-단독 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
실험 3
본 실험에서, 본 발명자들은 인간 VISTA를 발현하지 않는 C57Bl/6 암컷 마우스에서 혈액 및 비장 세포에 대한 INX231P 대 Dex의 영향을 평가하였다. 본 발명자들은 ADC 활성에 대한 대조군으로 hVISTA KI 군을 추가하였다. INX231P를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)로 투여하였고 FKBP5 유도를 20시간 후에 측정하여 ADC 처리 및 강력한 FKBP5 유도를 위한 충분한 시간을 제공하였다. Dex를 2㎎/㎏로 주사하고 2시간 후에 FKBP5 유도를 측정하였다.
도 94의 실험에 나타난 바와 같이, 강력하고 상당한 FKBP5 유도가 Dex 처리로 관찰되었지만, INX231P는 야생형 마우스의 혈액 및 비장 세포에 영향을 미치지 않았는데, 이는 ADC 영향이 표적-유래임을 입증한다. 이에 반해서, hVISTA KI 동물에서 동일한 투여량의 INX231P 처리는 FKBP5 전사체의 강력하고 상당한 유도로 이어지는데, 이는 표적 집단에 대한 ADC 효력을 입증한다. 보다 구체적으로, 도 84는 C57Bl/6 또는 hVISTA KI 마우스에서 INX231P 주사 후 FKBP5 전사 활성화를 도시한다. INX231P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.v. 주사 20시간 후에 측정하였다.2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 실시간 PCR에 의해서 FKBP5 전사 수준을 측정하였고, PBS 대조군의 평균에 대한 Log2 배수 변화로 나타내었다(n=4 마우스/군, PBS-단독 군과 비교된 보통 일원 분산분석).
결론
실험 1의 결과는 hVISTA KI에서 INX231J 및 Dex가 비장 및 혈액 세포에서 강력한 수준의 FKBP5를 유도하는 반면, 인간 IgG1 침묵 스테로이드 접합 대조군은 두 조직 모두에서 FKBP5 전사 수준에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
실험 2의 결과는 수컷 C57Bl/6 마우스에서 인간 VISTA 표적의 부재 하에서 INX231P가 VISTA-발현 혈액 세포 또는 비장 세포에서 FKBP5 전사 수준에 영향을 미치지 않는 반면, 유리 스테로이드는 두 조직 모두에서 FKBP5의 강력한 수준을 유도하였음을 나타낸다.
hVISTA KI 마우스의 양성 대조군을 추가한 암컷 C57Bl/6 마우스에서 실험 2를 반복한 실험 3의 결과는, 인간 VISTA 표적의 부재 하에서 INX231P가 VISTA-발현 혈액 세포 또는 비장세포에서 FKBP5 전사 수준에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 이에 반해서, hVISTA KI 마우스 동일한 용량의 INX231P 또는 Dex는 두 조직 모두에서 강력한 수준의 FKBP5를 유도하였다.
종합하면, 이 데이터는 GC 페이로드와 관계없이 ADC에 의한 GC의 효율적인 세포 전달을 위해 인간 VISTA 표적의 존재가 필요하다는 것을 입증한다.
실시예 15 : 생체외 단핵구 활성화(급성(1일)) 평가에 대한 예시적인 항-VISTA 항체 약물 접합체의 평가
본 실시예의 실험은 단핵구에서 글루코코티코이드(GC) 페이로드에 연결된 항-인간 VISTA 단클론성 항체인 항체 약물 접합체(ADC) INX231P의 효능 및 약력학적 범위를 평가하기 위해 수행되었다. 본 발명자들은 이전 예에서 GC 표적 유전자 FKBP5의 전사가 처리 후 최대 3일까지 단핵구에서 상향조절되는 반면 FKBP5에 대한 유리 덱사메타손(Dex) 영향은 24시간에 검출 가능하지 않음을 발견하였다.
본 발명자들은 단핵구에 대한 ADC의 잠재적인 장기 항-염증 영향을 평가할 수 있는 모델을 추가로 개발하였다. 간략하면, ADC를 정맥내(i.v.) 주사를 통해 생체내 전달하였고, 1 내지 7일 후에 비장 단핵구를 단리시키고 배양기에 넣었다. 그런 다음 세포를 상이한 농도의 지방다당류(LPS)로 활성화시켜 24시간에 사이토카인 생산을 극적으로 증가시켰다. 단핵구 단리 2시간 전 Dex 처리는 사이토카인 생산을 강력하게 감소시킨다.
3개의 실험(하기에서 논의되는 실험 1, 2 및 3)을 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있고 마우스 VISTA와 동일한 발현 패턴으로 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 인간 VISTA를 발현하는 인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI) 마우스에서 수행하였다. 이러한 연구의 목적은 구체적으로 높은 수준의 VISTA를 발현하는 단핵구에 대한 INX231P 생체내 처리의 영향을 평가하는 것이었다. 두 번째 목적은 이의 항-염증 능력을 이의 효능제 대응물인 INX901과 비교하는 것이었다. 간략하면, ADC를 정맥내(i.v.) 주사를 통해 생체내 전달하였고, 1 내지 7일 후에 비장 단핵구를 단리시키고 배양기에 넣었다. 그런 다음 세포를 상이한 농도의 LPS로 활성화시키고 상청액을 24시간에 수집하여 사이토카인 반응을 평가하였다(Luminex 마우스 32-플렉스(실험 1) 또는 선택된 사이토카인의 경우 ELISA(실험 2 및 실험 3)에 의해서).
물질 및 방법
모든 3가지 실험의 경우 Dex를 최적의 반응에서 마우스 안락사 및 세포 단리 2시간 전에 i.p.로 주사하였다. 실험 2 및 실험 3에서, ADC INX231P 및 효능제 대응물 INX901 둘 다를 ADC 처리를 위한 충분한 시간을 제공하기 위해 마우스 안락사 및 세포 단리 24시간 전에 i.v.로 주사하였다. 또한, 최대 사이토카인 반응을 정의하기 위해 PBS를 주사한 대조군을 포함시켰다.
시험 작용제 및 투여량
항체
INX231(로트 번호 72928.1.a)은 Fc 영역에 L234A/L235A /E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX231P(로트 번호 JZ-0556-017-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(P)는 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX901(로트 번호 BP-021-016-23)은 인간 IgG2/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
모든 항체 및 ADC를 PBS에 희석시키고, 0.2㎖의 부피로 정맥내(i.v.)로 주사하여 명시된 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사 용액인 NDC 57319-519-05를 0.2㎖의 부피로 PBS에 희석시키고 복강내(i.p.) 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
마우스
hVISTA KI 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였고; C57Bl/6 마우스는 Jackson Laboratories(ref# 000665)에서 제공받았다. 수컷 또는 암컷 마우스를 9 내지 15주령에 등록하였다.
비장 단핵구 단리
실험 1 및 실험 2에서, 세포를 StemCell의 EasySep™ Mouse Monocyte Isolation Kit(Catalog # 19861)를 사용하여 제조사의 지침에 따라서 단리시키고; ADC-INVIVO-109에서, Miltenyi의 Monocyte Isolation Kit를 사용하였다(카탈로그 # 130-100-629). 유사한 세포 수 및 순도를 실험 전체에서 얻었다.
생체외 LPS 자극 검정
계수 후, 세포를 단리된 세포의 수에 따라 약 100,000개 세포/웰로 플레이팅하고(모든 보고된 데이터는 플레이팅된 세포 수로 정규화됨을 주목해야 함) 단일체로서 플레이팅하였다. 기재된 바와 같이 LPS를 조직 배양 배지에 0, 10 또는 100ng/㎖로 첨가하였다. 사이토카인 분석을 위해 세포 상청액을 24시간에 수집하였다.
사이토카인 분석
실험 1 :
Millipore 마우스 32-플렉스 플랫폼을 사용하여 25㎕의 상청액에 대해 사이토카인 분석을 수행하였고; Immune Monitoring Lab(IML, Dartmouth-Hitchcock Norris Cotton Cancer Center의 Shared Resources)에서 분석을 수행하였다. 모든 프로토콜 및 분석 설명에 대해서는 다음 웹사이트를 참조한다http://www.dartmouth.edu/~dartlab/?page=multiplexed-cytokines.
실험 2 및 3 :
하기 키트를 사용하여 TNFα, MIP-1a 및 MIP-1b에 대한 ELISA를 통해 사이토카인 분석을 수행하였다:
o Mouse CCL3/MIP-1alpha DuoSet ELISA (R&D #DY450-05)
o Mouse CCL3/MIP-1beta DuoSet ELISA (R&D #DY451-05)
o Mouse TNFα ELISA (Biolegend 카탈로그 번호 430904)
모든 ELISA는 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
결과
실험 1 : 비장으로부터 단리된 단핵구의 생체외 LPS 자극에 대한 덱사메타손의 영향
실험 1에서, 본 발명자들은 생체외 비장 단핵구에 대한 2가지 상이한 용량의 Dex를 사용한 생체내 처리의 영향을 평가하였다. 간략하면, 암컷 C57Bl/6 마우스를 2 또는 0.2㎎/㎏의 Dex로 i.p. 주사하여 처리하였다. 대조군에게는 PBS를 제공하였다. 2시간 후, 동물을 희생시키고 비장을 수집하였다. 단핵구를 단리시키고 배양물에 넣었다. 단리 후 낮은 단핵구 수로 인해 군당 5개의 샘플을 플레이팅을 위해서 2개의 샘플로 풀링시켰다(2개 또는 3개의 초기 샘플의 풀). 그 다음 사이토카인 데이터를 세포 수로 정규화하였다.
플레이팅 후, 세포를 10 또는 100ng/㎖의 LPS로 처리하거나 처리하지 않았다. 세포 상청액을 30분 및 24시간에 수집하였다. 사이토카인 생산을 마우스 32-플렉스에서 분석하였다. 사이토카인 수준의 변화는 30분에 관찰되지 않았다(표시되지 않음). 24시간에, 8개의 사이토카인 G-CSF, IL-6, IL-10, IP-10, MIP-1a, MIP-1b, TNFα 및 RANTES는 비장 샘플에서 LPS 처리에 의해 상향조절되었다. 도 95에 나타난 바와 같이 Dex 생체내 처리는 두 LPS 농도 모두에서 사이토카인 반응을 감소시켰다. 보다 구체적으로, 도 95는 생체내 Dex 처리가 LPS에 대한 생체외 단핵구 염증 반응의 실질적인 감소를 유도함을 나타낸다. 실험에서 마우스에게 2㎎/㎏ 또는 0.2㎎/㎏의 PBS 또는 Dex를 i.p.로 주사하였다. 2시간 후, 비장 단핵구를 단리시키고 배양물에 넣고 0, 10 및 100ng/㎖에서 LPS로 자극시켰다. 24시간 상청액을 Luminex 32-플렉스에서 분석하였다(n=5 마우스/군이지만 샘플 1, 2, 3 및 4, 5는 2개의 샘플로 풀링됨).
실험 2 : 비장으로부터 단리된 단핵구의 생체외 LPS 자극에 대한 덱사메타손 대 INX231P 대 INX901의 영향
실험 2에서, 본 발명자들은 LPS에 의해 생체외 자극된 hVISTA KI 암컷 마우스의 비장 단핵구에 대한 INX231P 대 INX901(INX231과 동일한 CDR이지만 인간 IgG2 골격에 기반함) 대 Dex 생체내 처리의 영향을 평가하였다. 이들 분자의 약력학적 범위를 평가하기 위해서, 비장 단핵구를 INX231P 및 INX901 처리군 둘 다의 경우 24시간, 3일 및 7일 후에 단리시키고, Dex 처리군의 경우 2시간, 2일 및 6일에 단리시켰다. INX231P 및 INX901을 10㎎/㎏으로 투여하였고, Dex를 2㎎/㎏으로 주사하였다. 플레이팅 후, 샘플을 10ng/㎖의 LPS로 처리하거나 처리하지 않았다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. 사이토카인 분석을 NFα, MIP-1b 및 MIP-1a에 대해 ELISA를 통해 수행하였다. 사이토카인 데이터를 플레이팅된 세포 수로 정규화하였다.
도 96의 실험에 나타난 바와 같이, 제1일에 INX231P는 2시간에 Dex에 대등하게 TNFα 및 MIP-1b 생산에 강력한 영향을 가졌다. 추후 시점에는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. 이에 반해서, INX901은 분석된 사이토카인에 영향을 미치지 않거나(MIP-1a 및 b) 증가시켰다(TNFα). 보다 구체적으로, 도 96은 LPS에 대한 생체외 단핵구 염증 반응에 대한 INX231P 영향에 의한 생체내 처리의 효과를 나타낸다. 마우스에게 세포 단리 2시간, 2일 또는 6일 전에 2㎎/㎏의 PBS 또는 Dex를 i.p. 주사하였고; 세포 단리 1일, 3일 및 7일 전에 10㎎/㎏의 INX231P 및 INX901를 함께 i.v.로 주사하였다. 단리 후, 비장 단핵구를 배양물에 넣고 0 또는 10ng/㎖(10ng/㎖만 표시됨)에서 LPS 자극시켰다. 24시간 상청액을 ELISA에 의해 분석하였다(n=4 마우스/군; PBS 처리군과 비교하는 일원 분산분석은 제1일(D1) 샘플에 대해서만 수행됨).
실험 3: 비장으로부터 단리된 단핵구의 생체외 LPS 자극에 대하 덱사메타손 vs INX231P vs INX901의 영향
실험 3에서, 본 발명자들은 Dex(2㎎/㎏)의 경우 2시간 후 또는 항체 처리(10㎎/㎏)의 경우 24시간 후에만 사이토카인 반응을 평가하였다. 비장 단핵구를 단리시키고 배양물에 넣고 10 또는 100ng/㎖에서 LPS로 처리하였다. 세포 상청액을 24시간에 수집하였다. 사이토카인 분석은 TNFα, MIP-1b 및 MIP-1a의 경우에는 ELISA를 통해 수행되었으며 데이터는 플레이팅된 세포 수로 정규화하였다.
도 97의 실험은 INX231P가 두 LPS 농도에서 분석된 모든 3개의 사이토카인에 대해 단핵구의 생체외 활성화를 강력하게 방지했음을 나타낸다. 세포가 100ng/㎖의 LPS로 자극될 때 Dex 처리는 효력을 잃는 것으로 나타났는데, 이는 INX231P가 10배 더 적은 페이로드를 전달하지만 더 효력이 있다는 것을 시사한다는 것을 주목하기 바란다. 마지막으로, 실험 3에서 관찰된 바와 같이, INX901 처리는 LPS 유도 사이토카인 반응에 영향을 미치지 않았다. 보다 구체적으로, 도 97은 LPS에 대한 생체외 단핵구 염증 반응에 대한 INX231P 영향과 함께 생체내 처리를 나타낸다. 마우스에게 세포 단리 2시간 전에 2㎎/㎏의 PBS 또는 Dex를 i.p.로 주사하였고; 세포 단리 24시간 전에 10㎎/㎏의 INX231P 및 INX901를 i.v.로 주사하였다. 비장 단핵구를 배양물에 넣고 10 및 100ng/㎖에서 LPS로 자극시켰다. 24시간 상청액을 ELISA로 분석하였다(n=4 마우스/군; 각각의 LPS 용량에 대해 PBS 처리군과 비교하여 보통 일원 분산분석).
결론
실험 1은 2㎎/㎏의 생체내 Dex 처리가 사이토카인 생산의 극적인 감소로 나타난 바와 같이 LPS에 의한 생체외 단핵구 활성화를 효율적으로 방지함을 나타낸다. 실험 2는 생체내 INX231P 처리가 24시간에 일부 사이토카인의 생산 감소로 나타난 바와 같이 단핵구의 생체외 활성화를 감소시킬 수 있음을 나타내었지만, 이러한 효과는 2 내지 3일 범위인 단핵구의 알려진 반감기와 일치하는 처리 후 3일 또는 7일에는 관찰되지 않았다. 또한, 사이토카인 생산에 대한 ADC 영향은 접합되지 않은 효능제 대응물 항체(동일한 CDR)를 사용한 처리가 항-염증 활성을 갖지 않기 때문에 VISTA 발현 세포에 대한 GC 전달에 기인한다. 실험 2의 반복인 실험 3은, Dex는 2시간 후 또는 ADC는 24시간 후에만 보이는 것을 제외하고는, 접합되지 않은 효능제 처리가 INX231P가 단핵구의 생체외 활성화를 강력하게 감소시키는 반면 효능제 항체는 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
따라서, 실험 결과는 다음을 나타낸다:
Figure pct00884
단리된 비장 단핵구에 대한 LPS-유도 사이토카인 반응은 덱사메타손에 의해 효율적으로 제어된다.
INX901 처리가 아닌 INX231P는 생체내에서 24시간 일찍 투여되는 경우 단리된 비장 단핵구에 대한 LPS-유도 사이토카인 반응을 효율적으로 제어한다. 3일까지, 2 내지 3일 범위인 마우스 단핵구의 알려진 반감기와 일치하는 효과가 관찰되지 않았다.
INX901 처리가 아닌 INX231P는 비장 단핵구의 LPS-유도 생체외 활성화를 강력하게 방지한다. 본 실험에서, 본 발명자들은 INX231P가 유리 Dex보다 10배 적은 GC 페이로드를 전달하지만 높은 자극 수준(100ng/㎖에서 LPS)에서 높은 효력을 나타내는 반면 Dex는 효능을 잃는 것을 주목하였다. 마지막으로, 실험 3에서 관찰된 바와 같이, INX901 처리는 LPS 유도 사이토카인 반응에 영향을 미치지 않았다.
종합하면, 실험 결과는 INX231P 생체내 처리가 유리 스테로이드보다 적어도 10배 우수한 효력으로 단핵구 생체외 활성화를 방지할 수 있음을 나타낸다. 대조적으로, 효능제 항-VISTA 항체 INX901은 이 모델에서 효력을 나타내지 않았다. 따라서, 본 실험에서 관찰된 결과는 VISTA 조절에 의해서가 아닌 스테로이드 페이로드에 의해 완전히 유도된다.
실시예 16 : 단핵구, Treg 및 B 세포에서 전사에 대한 항-VISTA 약물 접합체 효과의 영향은 표적 발현에 좌우된다.
본 발명자들은 다양한 글루코코티코이드(GC) 페이로드에 연결된 상이한 항-인간 VISTA 단클론성 항체 및 및 이들의 시험관내 및 생체내 효과를 본 명세서에 기재한다. 본 실시예에서 본 발명자들은 1) 단핵구 및 B 세포에 대한 INX201J 대 아이소타입 대조군(huIgG1si J) 및 유리 J 페이로드 및 2) INX231P(Treg에서) 대 유리 페이로드(INX-SM-3)의 효과를 평가함으로써, 본 발명에 따른 예시적인 ADC에 대한 GC 리포터 유전자 FKBP5의 전사에 대한 영향을 평가하여 VISTA 표적 의존성을 평가하였다.
본 명세서에 나타난 바와 같이, 항-VISTA 스테로이드 ADC로의 처리는 VISTA의 높은 발현 수준을 갖는 세포인 단핵구 상에서 FKBP5의 강력하고 용량 의존적인 상향조절을 유도하였다. 단핵구보다 VISTA 발현이 낮은 Treg에서 유의하지만 더 약한 영향이 관찰되었다. VISTA가 발현되지 않는 B 세포에 미치는 영향은 무시할 수 있다. FKBP5 발현의 변화는 스테로이드 접합된 아이소타입 대조군으로 처리되는 경우 단핵구 또는 B 세포에서 관찰되지 않았다.
항체 약물 접합체(ADC)는 매우 효력이 있는 약물의 특정 세포 표적화를 허용하여 독성을 제한하면서 효능을 허용한다. INX201 및 INX231은 항-인간 VISTA 항체이다. 스테로이드 접합된 형태에서, INX201J 및 INX231P는 골수 세포 및 T 세포를 포함하는 VISTA 발현 세포에 스테로이드를 전달하고, 본 발명자들은 B 세포와 같은 VISTA 음성 세포에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않기를 희망하였다(Cancer Res. 74: 1924-1932, 2014).
GC 전달 및 활성을 모니터링/확인하기 위해서 본 발명자들은 글루코코티코이드 활성의 직접적이고 강력한 바이오마커인 FKBP5의 전사 활성화를 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)에 의해서 측정하였다(JCEM 101: 4305-4312, 2016). 본 발명자들은 ADC로의 시험관내 처리 후 단리된 인간 단핵구, 조절 T 세포(Treg) 및 B 세포에 대해 이 평가를 수행하였다.
물질 및 방법
단핵구 또는 B 세포를 건강한 공여자 혈액 샘플로부터 단리시키고 유리 스테로이드, 항-VISTA 접합 스테로이드 또는 접합 아이소타입 대조군으로 처리하였다. RNA를 단리시키고 FKBP5 전사 수준의 변화를 qPCR로 평가하였다.
단핵구 대 B 세포 분석을 위해, 단일 약물 농도 실험을 위해 1명의 혈액 공여자 수집물을 사용하였고; 별도의 단일 공여자 수집물로부터의 혈액을 사용하여 약물 용량 반응을 평가하였다. 조절 T 세포(Treg) 분석을 위해, 두 명의 별도의 공여자의 혈액을 사용하였다.
시험 작용제
유리 J 페이로드, INX J-2(Abzena). INX J-2 또는 간단히 유리 J 페이로드는 전체 링커/페이로드 INX J에서 활용되는 특허 보고된 부데소나이드 유사체이다.
INX201(Aragen, 로트 번호 BP-3200-019-6)은 Fc 영역에 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX201J (Abzena, 로트 번호 JZ-0556-025-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX201 항체이다. 링커/페이로드(J)는 이전에 보고된 링커/페이로드에 기반한다. 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX-SM-3(O2H)은 링커/페이로드 INX P에서 사용되는 부데소나이드 아날로그 페이로드이다.
INX231(ATUM, 로트 번호 72928.1.a)은 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX231P(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-017-1)는 DAR 8.0으로 쇄간 이황화물의 전체 변형을 통해서, INX-SM-3과 함께 프로테아제 감응성 링커로 이루어진 링커/페이로드 INX P에 접합된 INX231이다.
인간 IgG1siJ(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-025-2)는 Fc 영역에 E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 아이소타입 대조군이다. DAR 비율은 8.0이고, 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 INX J 링커/페이로드와 접합된다.
추가 시약
Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare 카탈로그 번호 17-1440-03)
L-글루타민이 없는 RPMI 1640(VWR 카탈로그 번호 16750-084)
페니실린/스트렙토마이신/글루타민(ThermoFisher 카탈로그 번호 10378016)
1M Hepes(Gibco 카탈로그 번호 15630-080)
인간 AB 혈청(Valley Biomedical 카탈로그 번호 HP1022HI)
PBMC 제조
인간 PBMC를 Dartmouth Hitchcock Medical Center의 혈액 공여자 프로그램에서 확인되지 않은 건강한 인간 공여자로부터 얻은 성분채집 콘으로부터 멸균 조건 하에서 단리시켰다.
혈액을 50㎖ Falcon 튜브로 옮기고 PBS로 30㎖로 희석시켰다. 13㎖의 Histopaque 1077(Sigma Aldrich)을 혈액 아래에 겹쳐 두고 튜브를 실온에서 20분 동안 850×g에서 약간의 가속 및 제동 없이 원심분리시켰다.
단핵 세포를 혈장/Ficoll 계면에서 수집하고 50㎖의 PBS에 재현탁시키고 300×g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포를 PBS에 재현탁시키고, 계수하였다.
검정 프로토콜
다양한 면역 집단을 상이한 세포 단리 키트를 사용하고 제조사 지침에 따라 단리시켰다:
CD16 고갈이 없는 EasySep 인간 단핵구 농축 키트(StemCell 카탈로그 번호 19058)
Pan B 세포 단리 키트, 인간(Miltenyi Biotec, 130-101-638)
EasySep™ Human CD4+ CD127 low CD49d- 조절 T 세포 농축 키트(StemCell 카탈로그 번호 19232)
단핵구, B 세포 또는 Treg를 RPMI, 10% 인간 AB 혈청, 10mM Hepes, 1x 페니실린/스트렙토마이신/글루타민에서 12-웰 플레이트에 웰당 2x10^6개 세포로 (단일 공여자로부터) 플레이팅하였다.
단일 용량 실험을 위해, 세포를 20nM 유리 J 페이로드 또는 INX-SM-3 페이로드 또는 동등한 몰 페이로드의 huIgG1si J, INX201J 또는 INX231P(INX-SM-3의 연결된 형태)로 처리하였다.
용량 반응의 경우, 100, 20, 5, 0.5, 0nM의 유리 J 페이로드 또는 동등한 몰 페이로드의 INX201J를 생성하는 연속 희석물. 0nM 지점의 경우, 100nM 몰 페이로드 당량의 INX201J에 사용된 항체의 양과 동등한 접합되지 않은 INX201을 사용하였다(예를 들어, 12.5nM의 접합되지 않은 항체). 미처리 웰을 대조군으로 사용하였다.
플레이트를 37℃에서 1일 동안 인큐베이션시켰다.
이어서, 세포를 수거하고, 후속 qRT-PCR 분석을 위한 충분한 RNA를 허용하기 위해 수거 후 각각의 조건에 대한 웰을 풀링시켰다.
RNA 준비 및 실시간 PCR
PBS로 1회 세척한 후, RNeasy Plus Mini kit(Qiagen, PN: 74136) 또는 NucleoSpin RNA Plus(Macherey-Nagel #740984.250)를 사용하여 세포 펠flt으로부터 RNA를 단리시켰다. 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리시키고 30 또는 40㎕ H2O(RNase/DNase 무함유)에 용출시켰다. RNA 농도를 Nanodrop 2000을 사용하여 UV 분광학으로 평가하였다.
Taqman 역전사 시약(#N8080234)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사를 수행하였다.
정량 실시간 PCR은 Taqman 마스터 믹스 2X 키트(# 4369016)를 사용하여 수행하고 Applied Biosystem의 QuantStudio3에서 실행하였다. 사용된 프라이머:
실험 1 및 실험 2
i. Life Technologies 카탈로그 번호 433111182 Hs01561006_m1 (FKBP5)
ii. Life Technologies 카탈로그 번호 HS99999905_m1 (GapDH)
실험 3 및 실험 4
i. TaqMan Gene Expression Assay (FAM-MGB); Assay ID:Hs01561006_m1 (FKBP5)
ii. TaqMan Gene Expression Assay (FAM-MGB); Assay ID:Hs01922876_u1 (GapDH)
Ct 데이터를 미처리 대조군과 비교하여 ΔCt 및 ΔΔCt 또는 Log2 배수 변화로 변환시켰다.
결과
실험 1
본 실험에서, 본 발명자들은 VISTA 양성 세포 집단으로서 단핵구에서 그리고 VISTA 음성 집단으로서 B 세포에서 FKBP5 전사의 유도에 의해 평가된 바와 같이 ADC에 의한 스테로이드 전달을 위한 표적 발현의 필요성을 평가하였다. 유리 스테로이드는 특정 세포 유형에 대해서 FKBP5 수준에 대한 스테로이드 영향에 대한 양성 대조군으로 추가되었다. 유리 스테로이드(유리 J 페이로드), J 링커-페이로드 접합된 항-VISTA(INX201J) 또는 아이소타입 대조군(huIgG1si J)을 투여하여 동일한 몰 당량의 페이로드(20nM)를 제공하였다.
도 98에 나타난 바와 같이, 미처리 대조군에 비해 단핵구 및 B 세포 둘 다에서 유리 J 페이로드로 FKBP5 전사의 강력한 증가가 관찰되었다. 그러나, 항-VISTA 접합된 페이로드(INX201J)로 처리되는 경우 단핵구에서 강력한 FKBP5 전사가 관찰되었지만 B 세포에서는 관찰되지 않았다. FKBP5 전사는 페이로드 접합된 아이소타입 대조군(HuIgG1si)으로 처리되는 경우 두 세포 유형 모두에서 검출되지 않았다. 특히 도 98은 20nM의 유리 J 페이로드 또는 동일 몰량의 INX201(INX201J) 또는 아이소타입 대조군(huIgG1siJ)에 접합된 페이로드로 처리된 세포의 B 세포 또는 단핵구에서 FKBP5 전사 활성화를 나타낸다. 전사 수준은 기술적 반복물로 분석하였다.
실험 2
도 99의 실험에서, 본 발명자들은 단핵구(높은 VISTA 발현)에 대한 스테로이드 연결된 항-VISTA(INX201J)를 사용한 치료의 용량 의존적 효과를 평가함으로써 실험 1을 확장하였다. 세포를 INX201J의 연속 희석액(100nM 내지 0nM 페이로드)으로 처리하였다. 0nM 농도의 경우에만, INX201 비접합 항체를 100nM 페이로드 샘플에 대해 존재하는 것과 동등한 양의 항체로 처리하였다. 구체적으로, 12.5nM의 ADC가 100nM 페이로드를 전달하기 때문에, 0nM 샘플에 대해 비접합 INX201을 12.5nM에 첨가하였다. 도 99에 나타난 바와 같이, INX201J로 단핵구를 처리하면 강력한 용량 의존적 효과로 이어진다. 도 99에서 단핵구에서의 FKBP5 전사 활성화는 증가하는 양의 INX201J[0 내지 100nM 페이로드])로 처리된 세포에서 나타난다. 0 페이로드는 100nM 페이로드 INX201J 용량에서와 동일한 양의 항체에서 비접합 INX201 항체 단독을 사용한 치료를 나타낸다. 전사 수준은 기술적 반복물로 분석하였다.
실험 3
도 100의 실험에서, 본 발명자들은 VISTA 발현 Treg에서 FKBP5 전사 유도에 대한 제2 항-VISTA 스테로이드 접합체(INX231P)의 영향을 평가하였다. 도 100에 나타난 바와 같이, 20nM의 유리 페이로드(INX-SM-3) 또는 동등한 몰 페이로드의 항-VISTA 접합 페이로드(INX231P)로 Treg를 처리하면 FKBP5 전사가 증가한다. 본 실험은 2명의 상이한 공여자로 수행되었으며 단리된 Treg 순도는 75% 이상이었다.
실험 4
도 101의 실험에서, 본 발명자들은 Treg에서 FKBP5 전사 유도에 대한 항-VISTA 스테로이드 접합체(INX201J) 대 동일한 링커/페이로드와 접합된 아이소타입 대조군(huIgG1si J)의 영향을 평가하였다 증가하는 -1/델타 Ct는 INX201J 처리에서 나타난 바와 같이 하우스키핑(GapDH)에 비해 증가된 전사체 존재비를 나타낸다. 20nM 스테로이드 페이로드를 전달하는 INX201J로 Treg를 처리하면 접합된 아이소타입 대조군에 비해 FKBP5 전사가 2.1배 증가한다(배수 변화 = 2^(ΔCt INX201J -ΔCt huIgG1si J)). 본 실험은 1의 공여자로 수행되었으며 단리된 Treg 순도는 75% 이상이었다. 구체적으로, 도 101의 데이터는 20nM 페이로드 당량의 huIgG1si J에 비해 20nM 페이로드 당량의 INX201J로 처리된 1명의 공여자로부터의 Treg에서 FKBP5 유도를 나타낸다. 샘플을 기술적 반복물로 분석하였다. 단리된 Treg 순도는 유세포 분석법으로 평가했을 때 75% 이상이었다.
결론
이 데이터는 스테로이드에 접합된 항-VISTA 항체가 단핵구 및 Treg에서 FKBP5 전사를 특이적으로 유도하지만 B 세포에서는 그렇지 않음을 입증하는데, 이는 페이로드 전달이 특이적이고 표적 의존적임을 나타낸다.
분석된 모든 세포 유형이 유리 페이로드에 대해 강력한 반응을 나타낸 반면, VISTA 발현 세포 유형(단핵구/Treg)만 20nM의 항-VISTA 스테로이드 접합체로 처리되는 경우 중간 내지 강한 반응을 나타낸다. 추가로, 아이소타입 대조군 ADC는 미처리 대조군과 비교할 때 FKBP5의 유도가 거의 또는 전혀 없는 것으로 나타났다.
GC 효과에 대한 표적 요건은 VISTA 발현 세포에 대한 강력한 용량 의존적 영향에 의해 뒷받침되고 항-VISTA ADC에 의한 비-VISTA 발현 세포에 대한 영향은 제한적이거나 없다.
실시예 17 : 예시적인 항-염증 약물 접합체에 의해서 표적화되는 항원에 의한 RNA 발현 다양한 면역 세포
상기에 언급된 바와 같이 본 발명의 항-염증 약물 접합체는 부분적으로는 이전 항-염증 약물 접합체에 의해 표적화된 항원과 비교하여 특정 면역 및 비-면역 세포에서 VISTA의 발현 또는 발현 부재로 인해서 이전의 항-염증 약물 접합체와 관련하여 우수한 속성을 갖는 것으로 여겨진다.
이는 이들의 보고된 RNA 발현 프로파일에 의해 제안된다. 특히 본 발명자들은 처음으로 "Human Protein Atlas Version 20.1 and Berglund L et al., "A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies", Mol Cell Proteomics, Vol. 7(10): 2019-2027 (October 1, 2008) (https://www.proteinatlas.org)"의 포괄적인 검토를 기반으로 하는 면역 및 비-면역 세포 상의 VISTA 및 다른 면역 세포 표적의 RNA 발현을 비교하였다.
이 분석에 기초하여 본 발명자들은 Human Protein Atlas Version 20.1 및 Berglund 등으로부터의 보고된 인간 조직/세포 RNAseq 데이터로부터의 공통 데이터세트를 준비하였다. (Id). 이 비교 결과를 도 102에 나타낸다. 특히, 도 102는 보고된 "Transcripts Per Million"(TPM)을 기반으로 하는 VISTA 및 다른 ADC 표적(CD40, TNF, PRLR, CD174)에 대한 상이한 세포에 의한 공통 RNA 발현 수준을 요약하는데 여기서 TPM<10은 (최소/발현 없음 "-")을 나타내고; TPM 10-100은 (낮은/중간 발현 "+")을 나타내고; 및 TPM>100은 (높은 발현 "++")을 나타낸다. 당업계에 알려진 바와 같이 TPM은 RNA-seq에 대한 잘 알려진 정규화 방법이며 "RNA-seq 샘플에서 1,000,000개의 RNA 분자마다 x는 이 유전자/전사체에서 유래하였다"로 읽어야 한다.
도 102에 나타난 바와 같이, VISTA는 RNA가 활성화 및 비활성화 골수 세포(단핵구, 대식세포, 호중구), T 세포, 수지상 세포, NK 세포 및 호산구 상에서 광범위하게 발현되는 유일한 표적이고(데이터 나타내지 않음, 예를 들어, 문헌["The immune checkpoint molecule VISTA regulates allergen-specific Th2-mediated immune responses", Tatsukuni Ohno et al., International Immunology, Volume 30, Issue 1, January 2018, Pages 3-11] 참조); 이에 반해서 TNF 발현은 대부분의 세포 유형에서 상대적으로 낮고 더욱이 활성화된 면역 세포에서만 발현되고; CD163은 골수 세포에 의해서 발현되지만 림프구에 의해서는 발현되지 않고; CD40은 T 세포를 지나치고; PRLR은 면역 세포에서 광범위하게 발현되지 않고 면역 제한되지 않으며; CD74은 호중구를 지나친다. (이는 호중구가 염증의 시작(급성) 단계, 특히 세균 감염, 환경 노출 및 일부 암 동안 중요하고 실제로 화학주성을 통해 염증 부위로 이동하는 염증 세포의 제1 반응자 중 하나이기 때문에 중요하다(Yoo SK et al., (November 2011). "Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo", Nature, 480 (7375): 109-12).
상기와 관련하여, 상이한 면역 세포에 의한 이러한 보고된 RNA 발현 수준이 관심의 대상이기는 하지만 이들은 ADC 표적으로서 이들 항원의 비교 추정 효능에 대한 실제 증거를 제공하지는 않는다. 오히려, 이것은 상이한 면역 세포에서 이들 표적의 실제 표면 단백질 발현 수준 및 VISTA ADC가 상이한 면역 세포를 효과적으로 표적화하고 이러한 세포에서 효능이 있다는 실험적 증거에 의해서만 합리적으로 평가될 수 있다(즉, 치료적 유효량의 활성 염증 약물, 예컨대, 스테로이드의 이러한 상이한 유형의 면역 세포 내로의 내재화 및 방출을 제공한다).
실시예 18 : 예시적인 항-염증 약물 접합체에 의해 표적화된 항원과 비교한 다양한 면역 세포에 의한 VISTA의 표면 발현 비교 및 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 전혈에 대한 항-VISTA, 항-CD74, 항-CD163, 및 항-mTNFα 항체의 항체 결합 능력
VISTA, CD74, CD163 및 막 TNFα(mTNFα)의 표면 항원 밀도를 미경험 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS) 및 전혈에서 유세포 측정법에 의해 평가하였다. 하기에 나타낸 바와 같이 데이터는 CD74, CD163 및 mTNFα와 비교할 때 다음을 나타낸다:
VISTA만 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 정상 상태로 발현된다.
VISTA는 CD14+ 단핵구에서 가장 높은 항원 밀도를 나타낸다.
표면 mTNFα는 시험된 임의의 세포 유형에서 검출되지 않았다.
VISTA는 대부분의 조혈 세포, 특히 골수 및 T 세포에서 높게 발현된다. 본 연구의 목적은 전혈로부터의 인간 PBMC 및 백혈구 둘 다에서 VISTA, CD74, CD163 및 mTNFα의 항원 밀도를 평가하는 것이었다.
물질 및 방법
실험 설계
직접 표지된 항체의 다수의 공여자로부터의 인간 세포(PBMC) 또는 전혈 백혈구에 대한 결합을 유세포 분석법에 의해 결정하였고 항원 밀도는 보정 비드를 사용하여 계산하였다.
시약
항체:
항-VISTA GG8(Aragen 로트 번호 AB131122-3)은 야생형 인간 IgG1/카파 골격 상의 키메라 항-인간 VISTA 항체이며 ImmuNext에서 생성되었다. GG8 클론을 제조사의 표지 및 정제 지침(Invitrogen, 카탈로그 번호 A20186)에 따라 Alexa Fluor 647 염료와 접합시켰다. 나머지 모든 항체는 달리 명시되지 않는 한 BioLegend에서 구입했으며 다음을 포함하는 그대로 사용하였다:
CD127 Brilliant Violet 421 클론 A019D5,
CD14 PE-Cy7 클론 M5E2,
CD20 Brilliant Violet 510 클론 2H7,
CD4 APC-Cy7 클론 OKT4,
CD163 Alexa Fluor 647 클론 GHI/61,
CD25 FITC 클론 BC96,
CD74 Alexa Fluor 647 클론 332516 (R&D Systems),
CD8 PE 클론 BW135/80 (Miltenyi), mTNFα Alexa Fluor 647 클론 mAb11.
다른 시약:
보정 비드(Quantum Simply Cellular Mouse IgG)는 Bangs Laboratories에서 구입하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다.
PBMC 준비
인간 PBMC는 Dartmouth Hitchcock Medical Center의 혈액 공여자 프로그램에서 건강한 비혈연 인간 공여자로부터 얻은 성분채집 콘으로부터 멸균 조건 하에서 단리시켰다 먼저, 혈액을 50㎖ Falcon 튜브로 옮기고 PBS로 30㎖로 희석시켰다. 13㎖의 Histopaque 1077(Sigma Aldrich)을 혈액 아래에 겹쳐 두고 튜브를 실온에서 20분 동안 850×g에서 약간의 가속 및 제동 없이 원심분리시켰다.
단핵 세포를 혈장/Ficoll 계면에서 수집하고 50㎖의 PBS에 재현탁시키고 300×g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포를 PBS에 재현탁시키고, 계수하였다.
전혈 준비
Dartmouth Hitchcock Medical Center로부터 건강한 비혈연 인간 공여자로부터 신선한 혈액을 채취하여 전혈에 대한 염색을 수행하였다.
항체 결합 및 분석
PBMC 염색
PBMC를 인간 Fc 차단 시약(eBioscience, 14-9161-73)을 함유하는 PBS/0.2% BSA 완충액에 재현탁시키고 그 다음 106개 세포/웰을 96-웰 플레이트에 분포시켰다. 항체 칵테일을 준비하고 PBMC를 얼음 상에서 30분 동안 염색하여 내재화를 제한하고 PBS로 2회 세척하였다.
전혈 염색
100㎕의 혈액을 딥 웰 96-웰 플레이트에서 염색하고 항체 칵테일을 직접 첨가하였다. 30분 인큐베이션 후, 적혈구를 1㎖의 ACK 완충액(Gibco)으로 10분 동안 용해시켰다. 혈액을 원심분리시키고, 혈액 백혈구를 96-웰 플레이트로 옮기고, PBS로 세척하고, 분석하였다.
결합 정량화
제조사의 프로토콜에 따라서 정량화 비드를 항-VISTA, 항-CD74, 항-CD163 및 항-mTNFα로 염색하였다. 세포 및 비드를 분석을 위해 Macsquant(Miltenyi) 유세포 분석기 및 FlowJo를 사용하여 형광 연관 세포 분류(FACS)에 의해 분석하였다. Quantum 비드와 함께 제공된 QuickCal 분석 템플레이트를 사용하여 항체 결합 능력을 계산하였다.
모든 그래프는 GraphPad(Prism)로 작성되었다.
결과
PBMC에 대한 시험 항체 결합의 평가
세포 집단에 대한 항원 밀도를 평가하기 위해서, 5개의 상이한 공여자로부터의 인간 PBMC를 mAb와 함께 인큐베이션시키고 유세포 분석법으로 분석하였다. 배경 신호를 차감하여 중간 형광을 정규화시키고 알려진 항체 결합 능력을 가진 정량화 비드에 대해 보정하였다. 세포 집단은 CD20+ B 세포, CD14+ SSChigh 단핵구, CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및 CD4+ CD25+ CD127low T 조절 세포(Treg)로 확인되었다. 모든 값은 평균±SD로 보고된다.
도 103A에 나타난 바와 같이, CD14+ 단핵구는 높은 수준에서 3개의 표적을 발현하였으며, VISTA는 항체 결합 능력을 갖는 가장 풍부한 것 또는 ABC= 111587±30502이고, 그 다음은 CD74(ABC= 52001±4765) 및 CD163(ABC= 36671±12339)이다(도 103A). 주목할 점은, CD163의 경우 나머지 4명보다 5배 더 높은 발현을 나타내는 이상치 공여자 1명으로 인해 평균이 높아졌다는 것이었다.
도 103B에 도시된 바와 같이, B 세포 상에서 CD74만 검출되었고, 69574±14997개 분자가 정량화되었다. VISTA는 CD4+에서 5938±3113개 분자(도 103C), Treg에서 6641±4059개(도 103D) 및 CD8+에서 9958±2741개 분자(도 103E)의 평균 밀도를 갖는 비활성화된 T 세포에서 발현된 유일한 단백질임을 알 수 있다.
미경험 PBMC에서 mTNFα는 배경 수준을 초과하게 검출되지 않았다. mTNFa의 부재는 제2 mTNFα 항체(R&D Systems, 아달리무맙 바이오시밀러, 클론 Hu7)를 사용한 음성 염색으로 확인되었다. mTNFα는 LPS로 활성화된 세포에서도 검출되지 않았다(데이터 나타내지 않음). 상업적으로 입수한 항-TNFα 항체의 특이성은 제조사에 의해 결정되었고 ELISA를 통해 내부적으로 확인되었다(데이터는 나타내지 않음).
도 103A 내지 도 103E는 확인된 세포 집단에서 VISTA, CD74, CD163 및 mTNFα에 대한 항원 밀도의 정량화를 요약한다. A) 단핵구는 VISTA, CD74 및 CD163을 발현하고; B) B 세포는 CD74를 발현하고; C) CD4+ T 세포, D) CD4+ Tregs 및 E) CD8+ T 세포는 VISTA를 발현한다(평균±SD, n=5 공여자).
전혈 백혈구에 대한 항체 결합의 분석
호중구는 PBMCS 제제에서 누락된 면역 시스템의 필수적인 부분이다. 따라서 3명의 건강한 공여자의 전혈 백혈구를 또한 조사하고 세포 집단에 대한 항원 발현을 평가하였다. PBMCS와 유사하게, 전혈을 단클론성 항체 칵테일로 염색하고 FACS로 분석하였다. 배경 신호를 차감하여 중간 형광을 정규화시키고 알려진 항체 결합 능력을 가진 정량화 비드에 대해 보정하였다.
세포 집단은 CD20+ B 세포, CD14+ SSChigh 단핵구, CD66b+ SSChigh 호중구, CD8+ 및 CD4+ T 세포, CD4+ CD25+ CD127low T 조절 세포(Treg)로 확인되었다. 모든 값은 평균±SD로 보고된다.
PBMC에서 관찰된 바와 같이, VISTA는 CD14+ 단핵구에서 가장 풍부했고(ABC= 223674±16503), CD163 발현은 13126±790개 분자로 유지되었지만, CD74의 발현은 PBMC에서보다 훨씬 낮았다(ABC= 562±338)(도 104A). CD20+ B 세포에서 CD74의 발현은 공여자 간에 매우 다양하였다(5800±3121). 최소 신호는 VISTA에 대해 유사하게 관찰되었다(ABC= 1280±291)(도 104B). 호중구는 높은 수준의 VISTA 발현(ABC= 68571±14731)을 나타낸 반면(도 104C), 다른 관심 표적은 검출되지 않았다. 마지막으로, T 세포 상에서 VISTA 발현이 전혈에서도 확인되었으며, 8717±886개 분자가 검출되었다. T 세포 상에서 VISTA 발현이 전혈에서도 확인되었고, CD4+에서는 8717±886개(도 104D), Treg에서는 7486±1767개(도 104E) 및 CD8+에서는 5012±2438개(도 104F) 분자가 검출되었다. 도 104A 내지 도 104F는 인간 혈액에서 확인된 세포 집단에서 VISTA, CD74, CD163 및 mTNFα에 대한 항원 밀도의 정량화를 요약한다. A) 단핵구는 VISTA, CD74 및 CD163을 발현하고; B) B 세포는 CD74를 발현하고; C) 호중구는 VISTA, D) CD4+는 T 세포, E) CD4+ Treg를 발현하고, F) CD8+ T 세포는 VISTA를 발현한다(평균±SD, n=3).
다른 표적과 비교하여 활성화된 면역(단핵구)에서 VISTA 발현
추가로 VISTA의 발현을 활성화된 면역 세포(단핵구) 상의 다른 항원과 비교하는 실험을 수행하였다. 도 110에 나타난 바와 같이 활성화된 면역 세포(특히 단핵구) 상의 VISTA의 발현을 활성화된 면역(단핵구) 세포 상의 다른 단백질(구체적으로 다른 스테로이드 ADC로 표적화된 단백질)의 발현 수준과 비교하였다.
실험에서 건강한 공여자로부터의 인간 전혈을 LPS로 활성화시켰다(U 바닥 96웰 플레이트에서 웰당 100㎕; 1㎍/㎖ LPS; 37℃에서 2시간). 활성화된 면역 세포에서의 세포 표면 단백질 발현 수준을 유세포 분석법으로 평가하였다. 항-VISTA 클론 GG8, CD163 클론 GHI/61, CD74 클론 332516 및 mTNFα 클론 mAb11을 포함하는 염색을 위해서 직접 접합된 항체를 사용하였다. [항-VISTA 클론 GG8(Aragen 로트 번호 AB131122-3)은 야생형 인간 IgG1/카파 골격 상의 키메라 항-인간 VISTA 항체이고 ImmuNext에서 생성되었고; GG8 클론은 제조사의 표지 및 정제 지침(Invitrogen, 카탈로그 번호 A20186)에 따라 Alexa Fluor 647 염료와 접합되었다. 나머지 모든 항체는 구입하여 있는 그대로 사용하였다: CD163 Alexa Fluor 647 클론 GHI/61(Biolegend), CD74 Alexa Fluor 647 클론 332516(R&D Systems), mTNFα Alexa Fluor 647 클론 mAb11(Biolegend)].
도 103에 도시된 바와 같이, 활성화된 단핵구에서의 VISTA 발현 패턴은 비활성화된 단핵구에서 관찰된 발현 수준과 유사한 반면, 다른 검출된 단백질은 활성화된 단핵구에서 검출된 발현 수준이 낮았다. 더욱이, mTNFα MFI는 FMO(Fluorescence Minus One) 대조군보다 약간 더 높았다. 이들 결과는 본 발명의 VISTA ADC가 활성화 면역 세포 및 비활성화 면역 세포, 예를 들어 VISTA를 높은 수준으로 발현하는 단핵구 및 다른 골수 세포(뿐만 아니라 VISTA를 구성적으로 발현하는 다른 면역 세포, 예컨대, 이전에 확인된 것, 예를 들어, 호산구, 수지상 세포, 대식세포, 골수 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, NK 세포, 단핵구, 호중구 등) 둘 다를 표적화하는 데 사용될 수 있다는 것을 추가로 나타낸다.
결론
도 103, 도 104, 도 110 및 하기 표 6에 요약된 데이터는 다음을 나타낸다:
Figure pct00907
Human VISTA는 단핵구, 호중구 및 T 세포에서 높은 발현 수준을 갖는 가장 강력한 ADC 표적 단백질이다. 중요한 것은, 일부 RNA 데이터베이스는 T 세포에서 높은 수준의 CD74 전사체를 기술하지만(Berglund L et al.,　"A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies", Mol Cell Proteomics.　(2008) DOI:　10.1074/mcp.R800013-MCP200), 본 발명자들은 T 세포에서 CD74의 표면 발현을 관찰하지 못했다.
VISTA는 분석된 다른 표적보다 활성화된 면역 세포(단핵구)에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현되며, 활성화 면역 세포 및 비활성화 면역 세포(예를 들어, 단핵구)에서 VISTA의 발현은 유사한데, 이것은 본 발명의 VISTA ADC가 활성화 면역 세포 및 비활성화 면역 세포, 예를 들어 단핵구(호산구, NK 세포, 세포, 대식세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, NK 세포, 호중구 등) 둘 다를 표적화하는 데 사용될 수 있다는 것을 추가로 나타낸다.
CD74는 PBMC 및 전혈 모두 둘 다에서 B 세포에서 지속적으로 검출되지만 PBMC의 단핵구에서만 검출된다.
CD163은 PBMC의 단핵구에서만 발현된다.
mTNFα는 분석된 어떠한 세포 집단에서도 검출되지 않았다.
VISTA는 CD4+ 세포에서 5938±3113개 분자, Treg에서 6641±4059개 및 CD8+ 세포에서 9958±2741개 분자의 평균 밀도를 갖는 비활성화된 T 세포(미경험)에서 발현되는 유일한 단백질이다.
표 6은 인간 면역 세포 집단에서 VISTA를 포함하는 상이한 항원의 표면 발현의 요약을 포함한다. 분석된 표면 표적의 발현을 세포 표면으로부터의 존재(밝은 회색) 또는 부재(어두운 회색)로 분류하였고; 정량 비드에 대한 정규화에 기초하여, +는 1000 내지 10000개 분자에 해당하고 ++는 10000 내지 100000개에 해당하고 +++는 100000개 초과에 해당한다; WB - 전혈, PBMCS - 말초 혈액 단핵 세포; na - 해당 없음.
상기에 언급된 바와 같이 본 발명의 항-염증 약물 접합체는 부분적으로는 이전 항-염증 약물 접합체에 의해 표적화된 항원과 비교하여 특정 면역 및 비-면역 세포에서 VISTA의 발현 또는 발현 부재로 인해서 이전의 항-염증 약물 접합체와 관련하여 우수한 속성을 갖는 것으로 여겨진다.
이러한 결과에 기초하여, VISTA는 면역 제한되지 않는 PRLR과 같은 일부 다른 표적과 달리 면역 세포에 의해서만 발현되기 때문에, VISTA ADC는 비표적 세포에 대한 독성을 덜 유발할 수 있다. 또한, VISTA는 특히 미경험 면역 세포 및 T 세포에 의해 구성적으로 발현되기 때문에, TNF와 같은 일부 다른 ADC 표적과 달리 VISTA ADC는 만성 자가면역 및 염증 질환의 치료에 사용하기에 바람직할 수 있는데, 그 이유는 VISTA ADC가 일정한 수준의 효능을 유지할 수 있어서(즉, 활성화 및 비활성 동안 효과적일 것임) 잠재적으로 염증의 재발 가능성을 감소시키고/시키거나 염증 또는 자가면역의 재발 동안 염증 수준을 감소시킬 수 있기 때문이다. 이것은 많은 자가면역/염증 질환이 완화/재발하기 때문에 치료적으로 중요하며, 결과적으로 이러한 병태를 치료하는 데 사용되는 약물 및 생물학적 제제의 중요한 임상 목적은 질환이 완화 및 재발 동안 모두 효과적으로 관리되는 치료 요법을 제공하여 환자가 조직 손상을 겪지 않도록 하는 것이다.
더욱이, 이들 ADC 표적 중에서 VISTA만 호중구에서 발현된다. 이것은 호중구가 염증의 시작(급성) 단계, 특히 박테리아 감염, 환경 노출 및 일부 암 동안 중요하고 실제로 화학주성을 통해 염증 부위로 이동하는 염증 세포의 제1 반응자 중 하나이기 때문에 중요하다. (Yoo SK et al., (November 2011). "Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo". Nature. 480 (7375): 109-12). 또한, 이들 세포는 염증 반응의 초기 단계에서 발현되기 때문에 VISTA ADC는 신속한 작용 개시를 가질 것으로 예상된다(실제로 본 명세서에 나타남).
또 다른 추가적인 치료적 중요성은, VISTA가 (CD40 및 CD74와 같은 일부 다른 ADC 표적과 달리) B 세포에서도 발현되지 않기 때문에 VISTA ADC는 치료 동안 B 림프구에 영향을 미치지 않을 것이라는 것이다. 따라서 VISTA ADC는 치료 동안 체액성 면역을 보존할 수 있으며, 이는 대상체가 치료 동안 감염 또는 심지어 암이 발병할 가능성을 줄일 수 있다. (스테로이드는 효력이 있는 면역억제제이기 때문에, 특히 만성 사용 동안 이와 관련된 위험은 치료되는 대상체가 치료 중에 치명적인 감염 또는 악성 종양을 일으킬 수 있는 위험이다).
또한, 이들 ADC 표적 중에서 VISTA만 미경험 Treg, CD4+ T 및 CD8+ T 세포에 의해서 구성적으로 발현되는 것으로 보인다. 이것은 특히 이러한 세포가 염증 반응에 관여하고 추가로 Treg가 최근 스테로이드의 효능에 매우 중요한 것으로 보고되었기 때문에 중요하다(문헌[Buttgereit, Frank and Timo Gaber, Timo; Cellular and Molecular Immunology, "New insights into the fascinating world of glucocorticoids: the dexamethasone-miR-342-Rictor axis in regulatory T cells" Vol. 18, 520-522 (2021); 및 Immunity, "Anti-inflammatory Roles of Glucocorticoids Are Mediated by Foxp3+ Regulatory T Cells via a miR-342-Dependent Mechanism:, Vol. 53(2): 581-596 (September 2020); Braitch M. et al., Acta Neurol Scand., "Glucocorticoids increase CD4+CD25high cell percentage and Foxp3 expression in patients with multiple sclerosis", 2009 April; 119(4): 239-245] 참조).
실제로 본 명세서에 포함된 실험적 증거는 VISTA ADC가 이러한 상이한 유형의 면역 세포를 효과적으로 표적화하고 이러한 세포에서 효능이 있음을 입증한다(즉, 치료(항-염증) 양의 스테로이드를 상이한 유형의 면역 세포에 내재화함).
실시예 19 : PK 대 PD 요약
전술한 바와 같이 본 발명의 항-염증 약물 접합체는 접합체에 포함된 항-VISTA 항체의 짧은 PK를 고려할 때 예상한 것보다 훨씬 더 연장된 PD 지속 시간을 제공한다. 본 발명에 따른 예시적인 항-VISTA 항체 및 이를 함유하는 ADC에 대한 PK, PD 및 Kd 값은 표 7에 요약되어 있다.
표 7에서 확인된 항체에 대한 CDR 및 가변 서열은 도 8, 도 10 및 도 12에서 발견된다. 표에서 FKBP5를 지칭하는 PD 또는 효력은 투여 14일 후에 대식세포에서 PBS에 비해서 FKBP5의 2배 유도로 정의된다. 표에서 "사이토카인 감소"를 지칭하는 PD 또는 효력은 생체외 대식세포 활성화 검정에서 투여 7일 후에 TNFα의 20% 감소로 정의된다 이들 검정은 실시예 6에 예시되어 있다.
표 7의 데이터는 예시적인 항체(모두 생리 pH에서 인간 VISTA 발현 면역 세포에 결합하고 짧은 pK를 보유하지만, 긴 PD를 제공함, 즉, 치료용 항체를 위한 더 긴(및 보다 전형적인) PK를 갖는 항체인 것으로 예상되기 때문)를 나타낸다. 이 데이터는 본 발명의 ADC가 연장된 효능이 요구되는 용도에 적합할 것이라는 것을 입증한다.
실시예 20 : 항-VISTA 항체 약물 접합체는 혈액에서 표적 의존적인 효과를 갖지만 표적 발현 세포를 거의 또는 전혀 갖지 않는 조직에서는 표적 의존적인 효과를 갖지 않는다.
VISTA 발현 조직에 대한 항체 약물 접합체(ADC) INX231P 및 INX234P의 표적화 특이성을 평가하기 위해 이들 연구를 수행하였다. GC 전달 및 활성을 모니터링/확인하기 위해서, RNA 서열결정(RNAseq)을 통한 게놈 와이드 전사 영향을 문헌[Vermeer et al. (2003) Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression: a potential marker for glucocorticoid sensitivity, potency, and bioavailability. J Clin Endocrinol Metab. Jan;88(1):277-84]에 따라서 측정하였다. 이전 실시예에 나타난 바와 같이, INX201J는 비장과 같은 VISTA-발현 조직에서 FKBP5를 신속하고 장기적으로 유도한다. 대조적으로, 비-VISTA-발현 조직은 FKBP5 유도를 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. VISTA 발현(혈액) 조직 및 비-발현 조직(뇌, 백색 지방 및 뼈)(실험 1) 및 마우스 뼈(실험 2)를 비교하여 시노몰거스 원숭이에서 분석을 수행하였다.
본 명세서의 이전 실시예에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명에 따른 ADC는 연장된 기간 동안 효력이 있음을 입증하였다. 특히 본 발명자들은 예시적인 ADC, 즉 INX231P 및 INX234P 처리를 사용한 처리가 비장과 같은 VISTA-발현 조직에서 GC의 직접적인 전사 표적인 FKBP5의 신속하고 장기적인(4일 초과) 유도로 이어진다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 비-VISTA-발현 조직은 FKBP5 유도를 거의 나타내지 않았다.
본 실시예에서, 본 발명자들은 전체 전사 변화를 평가하기 위해 RNAseq를 사용하는 본 발명의 ADC에 의한 치료의 표적 특이적 영향을 나타낸다. 분석은 비-인간 영장류(NHP, 시노몰거스 원숭이)에서 수행하였고, VISTA 발현(혈액) 및 비-발현 조직(뇌, 백색 지방 및 뼈) 및 마우스 뼈에서의 전사를 비교하였다. 또한 본 발명자들은 질량 분석법을 통해 다수의 VISTA 발현 및 비-발현 조직에 걸쳐 방출된 페이로드(INX-SM-3), 시스테인 변형 링커 페이로드(INXP-cys) 및 유리 덱사메타손의 세포내 축적을 평가하였다. 구체적으로, 실험은 C57Bl/6 또는 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 녹-인되고 마우스 VISTA와 동일한 발현 패턴으로 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 인간 VISTA를 발현하는 인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI) 마우스에서 수행하였다. 간략하면, 마우스의 경우, INX231P, PBS 또는 유리 덱사메타손(Dex)을 복강내(i.p.) 주사를 통해 전달하였다. INX231P의 경우 20시간, Dex 처리의 경우 2시간 후, 뼈를 단리시키고, 골수를 플러싱하고, RNA를 추출하였다.
NHP(시노몰거스 원숭이) 연구를 위해, INX234P, 비히클 또는 유리 Dex를 정맥내(i.v.) 전달하였다. 각각의 군에 대한 동물 절반을 24시간에 희생시켰고(비히클군 제외) 나머지 절반은 7일 후에 희생시켰다. 두 시점 모두에서 동물을 채혈한 다음 부검을 실시하였다. 조직을 수집하고, RNA 또는 단백질/펩타이드를 추출하였다.
두 연구 모두에 대해 게놈 와이드 전사 수준을 RNAseq(Admera Health)로 평가하고 세포내 페이로드 수준을 질량 분석법(Quintara Biosciences)으로 평가하였다.
이들 연구의 목적은 마우스 및 NHP 둘 다에서 표적 보유 조직 및 비-표적 보유 조직에서의 유전자 발현에 대한 본 발명의 항-VISTA 스테로이드 ADC의 영향을 평가하는 것이었다. 또한 본 발명자들은 질량 분석법(Quintara Biosciences)을 통해 NHP에서 표적 및 비-표적 보유 조직에서 방출된 페이로드의 축적을 평가하였다.
전사체 발현의 게놈 와이드 변화를 RNAseq(Admera Health)를 통해 평가하였다. 글루코코티코이드 작용에 의해 영향을 받는 것으로 문헌에서 구체적으로 확인된 전사체를 모니터링하였다. 이들 전사체 중 하나는 감응성이고 초기 GC 반응 유전자인 FKBP5이다(ermeer et al. (2003) Glucocorticoid-induced increase in lymphocytic FKBP51 messenger ribonucleic acid expression: a potential marker for glucocorticoid sensitivity, potency, and bioavailability. J Clin Endocrinol Metab. Jan;88(1):277-84)). 본 발명자들은 (ADCINVIVO.04) Dex 처리가 처리 2 내지 4시간 후 VISTA 발현 세포에서 FKBP5 메신저 RNA의 극적인 증가를 유발하지만 전사 영향은 24시간까지 사라짐을 발견하였다. 대조적으로, FKBP5 전사에 대한 ADC의 영향은 처리 20시간 후에 피크 유도로 장기간 지속되지만 신호는 단핵구에서 3일 동안, 대식세포에서 14일 동안 여전히 검출 가능하다.
이들 실험에서, 각각 생체내 전달된 본 명세서에 기재된 바와 같은 INX P 링커 페이로드를 갖는 항-VISTA 항체 INX231 및 INX234 또는 유리 Dex를 사용하였다. 다양한 조직을 수집하고, RNA를 단리시키고, 마우스 및 시노몰거스 조직 둘 다에 대한 치료의 전사 영향을 평가하였다. 세포내 방출된 페이로드 및 링커 페이로드 축적을 다양한 시노몰거스 조직에 걸쳐 Dex- 및 INX234P-처리군 둘 다에 대해 질량 분석법(Quintara Biosciences)을 통해 평가하였다. 사용된 물질 및 방법은 아래에 구체적으로 자세히 설명되어 있다.
물질 및 방법
방법
실험 1
Dex를 피크 FKBP5 유도에 상응하는 마우스 안락사 및 뼈 단리 2시간 전에 i.p.로 주사하였다. 실험은 C57Bl/6 암컷 마우스에서 수행하였다.
ADC 처리 및 피크 잠재적 유전자 유도에 충분한 시간을 제공하기 위해서 ADC(INX231P)를 마우스 안락사 20시간 전에 i.p.로 주사하였다. hVISTA KI 암컷 마우스에서 실험을 수행하였다.
전사체 기준선을 정의하기 위해 PBS만을 주사한 대조군을 포함시켰다. 안락사 후, RNA 단리 및 RNAseq 분석(Admera Health) 전에 뼈를 단리시키고, 골수를 플러싱하고, 뼈를 액체 질소에서 스냅 동결시켰다.
비히클, INX234P 또는 Dex를 채혈 24시간 전에 시노몰거스 원숭이에게 i.v.로 전달하였다. 혈액을 ImmuNext로 배송하였고, 여기서 이것을 적혈구 용해시키고 PBS로 1회 세척한 다음 세포 펠릿을 액체 질소에서 스냅 냉동시킨 후 RNA 단리시켰다. 그런 다음 원숭이를 안락사시키고 조직 수집 전에 조직을 관류시켰다. 그런 다음 RNA 단리 및 RNAseq 분석(Admera Health) 또는 MS(Quintara Biosciences)를 통한 정량화 전에 다시 조직을 액체 질소에서 스냅 냉동시켰다.
물질
시험 작용제 및 투여량
항체
INX231P(로트 번호 JZ-0556-017-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(P)는 부데소나이드 유도체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234P(로트 번호 JZ-0556-029, JZ-0556-017)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234이다. 링커/페이로드(P)는 부데소나이드 유도체 페이로드를 갖는 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
덱사메타손
실험 1의 경우, Dex(멸균 주사 용액, Phoenix, NDC 57319-519-05)를 PBS에 희석시키고, i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다. 실험 2의 경우, Dex는 i.v.로 투여하였고 Bimeda MTC에서 공급되었다.
마우스
hVISTA KI 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였고; C57Bl/6 마우스는 Jackson Laboratories(ref# 000665)에서 제공받았다.
암컷 마우스를 9 내지 15주령에 등록하였다.
시노몰거스 원숭이
본 연구는 Charles River Laboratory에서 수행하였다. 12마리의 시노몰거스 암컷 원숭이를 등록하였고, 이들은 목적에 맞게 사육되었으며, 미경험이었고, 2세 내지 4년령 범위였다.
군은 비히클 대조군 처리군에서 2마리 동물, Dex 처리군에서 4마리 동물 및 INX234P 처리군에서 6마리 동물로 이루어졌다. 동물을 1일에 주사하였다.
모든 동물을 24시간에 채혈하고 나머지 동물을 8일에 다시 채혈하였다. 24시간(Dex 및 INX234P) 및 8일(INX234P 단독)에 희생된 군에 대해 조직 분석을 수행하였고; Dex로 처리한 동물 2마리 및 INX234P로 처리한 동물 3마리를 24시간에 안락사시켰고, 비히클 대조군을 주사한 동물 2마리, Dex로 처리한 동물 2마리, INX234P로 처리한 동물 3마리를 주사 8일 후에 안락사시켰다.
RNA 준비 및 RNAseq
혈액 및 뇌로부터의 세포 펠릿을 NucleoSpin® RNA Plus kit(Macherey-Nagel # 740984)의 RNA 용해 완충액 0.4㎖에 재현탁시켰다. 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리시키고 30 또는 40㎕ H2O(RNase/DNase 무함유)에 용출시켰다. RNA 농도를 Nanodrop에서 평가하였다.
뼈 및 백색 지방 조직의 RNA는 Admera Health에서 단리시켰다. 모든 샘플에 대한 품질 관리 평가 및 RNAseq는 Admera Health에서 수행하였다.
질량 분석법을 위한 조직 준비
다양한 조직으로부터의 세포 펠릿을 2 부피의 25% 메탄올로 균질화시켰다. 모든 샘플을 해당 혈장 블랭크로 희석시키고 각각의 샘플을 내부 표준(Verapamil)을 포함하는 아세토나이트릴로 추출하였다. 혼합물을 진탕기에서 와동시킨 후 원심분리시켰다. 상청액의 분취량을 LC/MS/MS에 주입하기 위해 옮겼다. 보정 표준품 및 품질 관리 샘플은 시험 화합물을 블랭크 cyno 혈장에 스파이킹하여 준비한 다음 미지의 샘플로 처리하였다.
결과
실험 1
본 연구에서, 본 발명자들은 hVISTA KI(INX231P) 대 C57Bl/6 마우스(Dex/PBS)에서 뼈 전사 수준에 대한 INX231P 및 Dex의 영향을 평가하였다. INX231P를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)으로 투여하였다. 뼈를 단리시키고, 골수를 플러싱하고, 20시간 후에 전사체 발현 수준을 측정하여 ADC 처리 및 잠재적인 피크 전사체 발현 영향을 위한 충분한 시간을 제공하였다. Dex를 2㎎/㎏로 주사하고 전사체 발현 수준을 2시간 후에 측정하였다. INX231P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.p. 주사 20 후에 측정하였다. 2㎎/㎏으로의 단일 i.p. 주사 2시간 후에 Dex 효과를 측정하였다. 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하였고 정규화 계수치로서 제시하였다(n=5 마우스/군; PBS-단독 군과 비교한 보통 일원 분산분석).
도 105의 실험에 나타난 바와 같이, 강력한 FKBP5 유도가 Dex 처리로 관찰된 반면, INX231P는 아마도 VISTA 발현 면역 세포에 의해 유도된 FKBP5 신호의 더 작은 변화를 초래하였다. 마찬가지로, Dex 치료는 Rankl, Ddit4, Fam107a 및 기타(예를 들어, Stc2, Runx2, Errfl1 - 데이터 나타내지 않음)와 같은 여러 다른 뼈 독성 관련 전사체에 상당한 영향을 미쳤다. 결과는 본 발명의 ADC인 INX231P가 동일한 전사체에 유의미한 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 도 105에 나타난 바와 같이, 뼈의 스테로이드 반응성 유전자는 Dex에 의해 상당히 영향을 받는다. INX231P는 영향이 제한적이다. Fkpb5 (좌측) RANKL(중간 좌측) ddit4(중간 우측) Fam107a(우측). INX231P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.p. 주사 20 후에 측정하였다.
실험 2
RNAseq 분석
도 106의 이 실험에서, 본 발명자들은 투여(10㎎/㎏ 내지 0.2㎎/㎏ 페이로드) 24시간 후에 암컷 시노몰거스 원숭이(말초 혈액 백혈구, 뇌, 뼈, 백색 지방)의 전사 수준에 대한 INX234P 대 Dex의 영향을 평가하였다. INX234P 효과를 10㎎/㎏의 용량(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달)의 1회 단일 i.v. 투여 24시간 후에 측정하였다. 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하였고 정규화 계수치로서 제시하였다 (n=2 비히클, n=6 ADC/군; 비히클 대비 언페어드 t 검정). 결과는 혈액에서 본 발명에 따른 예시적인 ADC인 INX234P로의 처리가 INX234P로 명확한 스테로이드 시그니처를 생성함을 나타낸다(도 106). 본 실험에 제시된 바와 같이, 시노몰거스 원숭이의 말초 혈액 세포에서 스테로이드 반응성 유전자 발현의 비히클 대조군에 대한 ADC에 의한 유도.
도 107의 실험에 추가로 나타난 바와 같이, 스테로이드 관련 전사체에 대한 뇌, 백색 지방 및 뼈에서의 INX234P 효과를 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드 전달) 또는 D8(비히클)의 1회 단일 i.v. 주사 24시간 후에 측정하였다. 유전자 전사 수준을 RNAseq로 다시 측정하였고 정규화 계수치로 제시하였다(n=2 비히클, 조직의 경우 n=3 ADC/군, 비히클 대비 언페어드 t 검정 - INX234P는 유의하지 않았음). 도 107의 결과는 뇌, 백색 지방 및 뼈에서 24시간에 스테로이드 관련 전사체가 제한된 변화를 나타내거나 대조군과 유사함을 나타낸다. 또한 이 결과에는 군내에서 약간의 변동성이 있지만 이는 동물 수가 적고 원숭이 사이의 이질성 때문일 가능성이 높다.
도 108의 실험에서, 스테로이드 반응성 유전자는 백색 지방 조직에서 24시간에 잔류 Dex 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 도시된 바와 같이 ADC 유전자 발현은 비히클 대조군과 유사하다. 본 실험에서 유리 Dex(2㎎/㎏) 및 INX234P(10㎎/㎏ 내지 0.2㎎/㎏의 페이로드 전달) 효과를 1회 단일 i.v. 투여 후 24시간 또는 제8일(비히클)에 측정하였다. 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하였고 정규화 계수치로 제시하였다(n=2 비히클, n=2 덱사메타손, 조직의 경우 n=3 ADC/군, 비히클 대비 언페어드 t 검정).
도 108의 결과는 24시간에 Dex가 신속한 제거와 상관관계가 있는 FKBP5와 같은 직접적인 스테로이드 반응성 유전자에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 주목할 만한 것은, 백색 지방에서, PDE3B가 GC에 의해 하향조절되는 것으로 알려진 글루코코티코이드 작용의 간접적인 마커라는 것이다. PDE3B는 Dex에 의해 하향조절되는 것으로 관찰된 반면, ADC 처리된 원숭이에서는 전사 수준이 대조군과 유사하였다(도 101)(Lee R. et al. (2018) Glucocorticoid receptor and adipocyte biology. Nucl Receptor Res. 5: 101373.). 치료로 인해서 상향조절되는 것으로 알려진 스테로이드 작용의 다른 직접적인 표적(ANGPTL4, MgII)이 또한 Dex군에서 24시간에 하향조절되는 것으로 나타났다(도 108)(Lee R. et al. (2018) Glucocorticoid receptor and adipocyte biology. Nucl Receptor Res. 5: 101373.)
본 발명자들은 이것이 초기 상향조절에 따른 음성 피드백 루프의 결과일 수 있다고 가정하고 글루코코티코이드 치료로 어디에서 전사체 발현 변화가 발생했는지에 대한 일부 확인을 제공한다.
MS 분석
도 109A 내지 도 109D의 실험에서, 방출된 페이로드(INX-SM-3) 및 시스테인 변형된 링커 페이로드(INXP-cys)의 농도를 MS를 통해 다양한 VISTA 발현 및 비-VISTA 발현 조직에서 평가하였다. 본 실험은 INX234P 처리된 원숭이에서 24시간에 활성 페이로드(INX-SM-3)의 높은 축적이 VISTA 발현 조직과 상관관계가 있음을 나타내었다. (A) 방출된 페이로드(INX-SM-3) 또는 (B) 시스테인 수정된 링커/페이로드(INXP-cys) 또는 (C) 덱사메타손을 INX234P(10㎎/㎏ - 0.2㎎/㎏의 페이로드 전달) 또는 유리 덱사메타손(2㎎/㎏)의 1회 단일 정맥 주사 후 24시간에 측정하였다. 축적된 화합물 수준을 LC-MS/MS로 측정하고 조직의 g당 화합물의 ng로 제시하였다(조직의 경우 n=3 ADC/군, n=2 덱사메타손).
특히, 24시간에, VISTA 발현 면역 조직에서 방출된 페이로드의 강한 축적이 존재하였고 비-VISTA 발현 조직, 예컨대, 결장 및 십이지장, 지방 또는 뇌에서는 축적이 제한적이거나 존재하지 않았고(도 109A); 여과 및 배설을 담당하는 기관인 간 및 신장에서도 페이로드가 검출되었다(도 109A). 또한 페이로드 방출 전에 대사된 ADC의 예측 생성물인 시스테인 변형된 링커 페이로드의 일부 축적이 존재하였다(도 109B). 본 발명자들이 예측한 바와 같이, Dex 처리된 원숭이는 임의의 조직에서 24시간에 축적된 유리 덱사메타손이 거의 존재하지 않았다(도 109C)잔류 덱사메타손은 VISTA 발현과 상관관계가 없었고, 대신 간, 신장 및 백색 지방에 집중되어 있었다. 24시간에 낮은 수준으로만 존재하는 Dex와 직접적으로 대조적으로, 방출된 페이로드(INX-SM-3)의 강력한 수준은 VISTA 발현 조직에서 제8일(연구 종료)에 지속되었으며 비-VISTA 발현 조직에서는 낮거나 검출할 수 없는 수준만 존재하였다(도 109D).
결론
실험 1의 결과는 마우스 뼈 샘플에서 2㎎/㎏로 투여된 Dex가 강력한 수준의 Fkbp5, Rankl, Ddit4 및 기타 스테로이드 및 뼈 특이 독소 관련 전사물을 유도함을 나타내었다. 대조적으로, 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드)로 투여된 INX231P는 미처리군과 비교하여 동일한 전사체의 발현에서 제한된 변화를 나타내었다. 장기간 GC 치료와 연관된 한 가지 주요 독성은 글루코코티코이드 유발 골다공증 뼈 손상이다. 이러한 데이터는 스테로이드-항-VISTA 접합체가 뼈와 관련된 독성이 제한적일 것이라고 주장한다.
실험 2의 결과는 암컷 시노몰거스 원숭이에서 10㎎/㎏(또는 0.2㎎/㎏의 페이로드)로 투여된 INX234P가 비히클 대조군에 비해 혈액에서 FKBP5 및 기타 스테로이드 경로 관련 전사체에 강한 영향을 미쳤다는 것을 나타내었다. VISTA 발현이 거의 또는 전혀 없는 조직에서 전사체 수준은 대조군과 더 유사하게 나타났지만, 결과는 동물 간의 본질적인 변동성 및 작은 샘플 수에 의해 영향을 받았다.
2㎎/㎏의 Dex는 24시간에 소분자가 제거되어야 한다는 점을 고려할 때 대부분의 조직에서 제한된 영향만을 미쳤다. 이러한 발견은 VISTA 발현 조직에서 INX234P 처리군으로부터 방출된 페이로드의 24시간에 강력한 세포내 축적 및 비-VISTA 발현 조직에서의 제한된 축적과 관련이 있었다. 7일(연구 제8일) 후, 림프절(장골 및 턱 모두) 및 골수와 같은 VISTA 발현 조직에서 강력한 수준의 방출된 페이로드가 지속되었다. 이는 24시간에 예측된 바와 같이 비-면역 조직에서 매우 낮은 수준으로 검출된 유리 덱사메타손과는 극명한 대조를 이룬다.
흥미롭게도, 2㎎/㎏의 Dex는 24시간에 소분자가 제거되어야 한다는 점을 고려할 때 대부분의 조직에서 제한된 영향을 미쳤지만, 일부 전사체는 음성 피드백 루프로 인해 잠재적으로 하향 조절되었다. 이것은 존재하는 경우 스테로이드 영향을 나타내는 전사체의 표시를 제공하고, 본 발명자들은 특히 본 발명자들의 항-VISTA 스테로이드 ADC의 영향이 제한적이거나 없는 것을 인지하였다.
또한, 이러한 결과는 전사 데이터가 페이로드 축적 데이터에 의해서 강력하게 뒷받침되는 결과를 나타내었다. INX234P 처리된 원숭이는 VISTA 발현 조직에서 INX234P의 방출된 활성 페이로드인 INX-SM-3의 강력한 수준 및 더 낮은 수준의 전체 링커 페이로드(INXP-cys)를 나타내었다. 낮은 수준의 잔류 덱사메타손은 VISTA 발현 조직과 상관관계가 없었다.
구체적으로, 실험 1의 데이터는 마우스 뼈 샘플에서 2㎎/㎏으로 투여된 Dex가 추가적인 뼈 독성 관련 전사체, 예컨대, 특히 Rank1, ddit4 및 Fam107a과 함께 강력한 수준의 Fkbp5를 유도했음을 나타낸다. 대조적으로, 10㎎/㎏(0.2㎎/㎏의 페이로드)로 투여된 INX231P는 미처리군과 비교하여 동일한 전사체의 발현에서 매우 제한된 변화를 나타내거나 어떠한 변화도 나타내지 않았다.
암컷 시노몰거스 원숭이에서 10㎎/㎏(또는 0.2㎎/㎏의 페이로드)로 투여된 INX234P는 비히클 대조군에 비해 혈액에서 FKBP5 및 기타 스테로이드 경로 관련 전사체에 강한 영향을 미쳤다. VISTA 발현이 거의 또는 전혀 없는 조직에서 전사체 수준은 대조군과 더 유사하게 나타났지만, 결과는 동물 간의 본질적인 변동성 및 작은 샘플 수에 의해 영향을 받았다.
또한 2㎎/㎏의 Dex는 24시간에 소분자가 제거되어야 한다는 점을 고려할 때 대부분의 조직에서 제한된 영향을 미쳤지만, 일부 전사체은 음성 피드백 루프로 인해 잠재적으로 하향 조절되었다. 이것은 존재하는 경우 스테로이드 영향을 나타내는 전사체의 표시를 제공하고, 본 발명자들은 특히 본 발명자들의 항-VISTA 스테로이드 ADC의 영향이 제한적이거나 없는 것을 인지하였다.
전사 데이터는 페이로드 축적 데이터에 의해서 강력하게 뒷받침되었다. INX234P 처리된 원숭이는 VISTA 발현 조직에서 방출된 활성 페이로드인 INX-SM-3의 강력한 수준 및 더 낮은 수준의 전체 링커 페이로드(INXP-cys)를 나타내었다. 방출된 페이로드의 강력한 수준은 제8일(연구 종료)에 VISTA 발현 조직(림프절 및 골수)에서 지속되었다. 24시간에 낮은 수준의 잔류 덱사메타손은 VISTA 발현 조직과 상관관계가 없었다.
실시예 21 : 시노몰거스 원숭이에서 정맥내 주사에 의한 INX234P의 비-GLP 약동학 연구
시노몰거스 원숭이에서 원숭이에서 15㎎/㎏의 단일 주사 후에 본 발명에 따른 예시적인 ADC, INX234P, 글루코코티코이드(GC) 페이로드에 연결된 항-인간 VISTA 단클론성 항체의 약동학적 특성을 결정하기 위해 Charles River laboratories(CRL)에서 연구를 수행하였다. 면역 인구의 변화, 코티솔 수준 및 GC 페이로드의 세포내/혈청 수준을 또한 측정하였다.
이들 실험에서 백혈구(WBC) 수 및 코티솔 수준의 변화를 실험 과정에 걸쳐 모니터링하였다. 또한, 방출된 페이로드 축적을 질량 분석법(MS)에 의해 혈청 및 혈액 세포 펠릿 둘 다에서 정량화하였다.
물질 및 방법
실험 설계
4마리의 수컷 시노몰거스 원숭이에게 15㎎/㎏의 INX234P를 1회 투여로 정맥내(i.v.)로 제공하였다. 이어서 동물을 하기에 기재된 시점에 채혈하였다. 혈청 및 혈액 세포 펠릿을 모든 시점에서 수집하고 저장하였다.
시험 작용제 및 투여량
INX234P (Abzena, HA-0853-02)
15㎎/㎏ 투여 및 i.v. 주사
시노몰거스 원숭이
RMS Houston(미국 텍사스주 휴스턴 소재) 및 Orient BioResource Center(미국 텍사스주 앨리스 소재)로부터의 목적에 따라 사육되고 미경험이 아닌 비인간 영장류에 대해 CRL에서 연구를 수행하였다.
2 내지 4년령의 4마리의 수컷을 연구에 등록하였다.
샘플 수집 세부사항은 표 8에 제시한다.
혈액학
혈액학 세부사항을 표 9에 제시한다.
각각의 혈액학 샘플로부터 혈액 도말을 준비하였다.
생체분석 샘플 처리
PK 혈액 샘플을 원심분리시키고, 생성된 혈청을 분리시키고, 드라이아이스 또는 -70℃ 이하로 유지하도록 설정된 냉동고에서 즉시 동결시켰다.
생체분석 샘플 분석
96-웰 폴리스타이렌 마이크로플레이트를 2° 내지 8℃에서 12 내지 24시간 동안 0.5㎍/㎖ 코팅 용액(Sheep anti-Human IgG, The binding site, 카탈로그 번호 AU003.M)으로 코팅하였다. 세척 후, 차단 완충액(Pierce/Thermo Scientific, 카탈로그 번호 37528)을 첨가하고 플레이트 진탕기에서 실온에서 350rpm으로 90분±10분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 시험 샘플을 첨가하고, 실온에서 플레이트 진탕기에서 350rpm으로 2시간±20분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 250ng/㎖ Detection Antibody Solution(염소 항-인간 IgG, HRP(H&L), Bethyl, 카탈로그 번호 A80-319P)을 플레이트(들)의 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 플레이트 진탕기에서 350rpm으로60± 5분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 100㎕의 TMB 기질 용액을 플레이트(들)의 각각의 웰(들)에 첨가하고, 실온에서 15± 2분 동안 인큐베이션시켰다. 100㎕의 정지 용액을 플레이트(들)의 각각의 웰에 첨가하여 TMB 반응을 정지시켰다.
반응 정지 15분 이내에 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices SPECTRAmax)를 사용하여 450nm에서 플레이트를 판독하였다. 시험품을 보정 곡선을 위해서 사용하였다.
약동학 평가
정맥 볼러스 후 비구획 분석(NCA)을 수행하는 PKsolver 프로그램을 사용하여 항체 반감기를 결정하였다.
코티솔 ELISA
Cortisol Enzyme Immunoassay kit(Arbor Assays 카탈로그 번호 K003-H5).
공급업체 프로토콜에 따라 Cortisol ELISA kit를 사용하여 혈청 샘플을 분석하였다.
질량 분석법 분석
세포 펠릿 및 혈청에 대해 Quintara Discovery에 의해 MS 정량화를 수행하였다.
세포 펠릿에 대해서:
간략하면, 세포 펠릿을 100㎕의 20% 메탄올로 현탁시켰다. 모든 샘플을 해당 혈장 블랭크로 희석시키고 각각의 샘플을 내부 표준(Verapamil)을 포함하는 아세토나이트릴:메탄올로 추출하였다. 혼합물을 진탕기에서 와동시킨 후 원심분리시켰다. 상청액의 분취량을 LC/MS/MS(ExionLC AD Pump; Sciex Qtrap 6500+)에 주입하기 위해 옮겼다. 보정 표준품 및 품질 관리 샘플은 시험 화합물을 블랭크 cyno 혈장에 스파이킹하여 준비한 다음 미지의 샘플로 처리하였다.
먼저 MS에 대해 처리된 각각의 샘플에 대한 PBL 또는 WBC 혈액학적 수치 및 고정 부피를 기반으로 세포 수를 계산함으로써 세포 부피(ng/㎖)에 대한 데이터의 정규화를 수행하였다. 그런 다음 본 발명자들은 가장 자주 채택되는 세포당 400펨토리터의 임의 평균 혈구 부피(MCV)를 사용하여 부피로 변환하였다(3).
혈청에 대해서:
각각의 혈장 샘플을 내부 표준(Verapamil)을 포함하는 아세토나이트릴:메탄올로 추출하였다. 혼합물을 진탕기에서 와동시킨 후 원심분리시켰다. 상청액의 분취량을 LC/MS/MS(ExionLC AD Pump; Sciex Qtrap 6500+)에 주입하기 위해 옮겼다. 보정 표준품 및 품질 관리 샘플은 시험 화합물을 블랭크 cyno 혈장에 스파이킹하여 준비한 다음 미지의 샘플로 처리하였다.
모든 그래프는 GraphPad(Prism)로 작성되었다.
결과
약동학 데이터
동물에게 15㎎/㎏의 투여량으로 1회 용량의 INX234P를 제공하고 PK 데이터를 PK Solver를 사용하여 분석하여 PK 또는 T1/2 = 14hr을 얻었다.
도 111의 실험은 INX234P PK 분석을 나타낸다. 실험에서 INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였고, 동물을 지정된 시점에 채혈하였고, 혈청을 단리시키고, 항체 수준을 측정하였다(n=4 시노몰거스 원숭이, SEM).
추가로, 원시 PK 데이터는 하기 표 10 및 표 11에 포함되어 있다.
혈액학적 변화
도 112의 실험 결과로부터 나타난 바와 같이, 모든 동물은 백혈구(WBC)의 전반적인 증가를 나타내었고, 주사 후 48시간까지 수치가 정상으로 돌아갔다. 림프구(LYMPH)는 주사 후 3시간에 급격한 감소를 나타내었다. 이 수치는 96시간까지 정상으로 돌아왔다. 단핵구(MONO)는 투여 후 24시간까지 감소를 나타냈지만 96시간까지 정상으로 돌아왔다. 이러한 변화는 일시적인 백혈구 감소증을 유발하는 것으로 알려진 GC의 정상적인 영향과 일치한다.
보다 특별하게는 도 112의 결과는 INX234P의 1회 용량에 의해 유도된 혈액학적 변화를 나타낸다. INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였다. 표시된 시점에서 동물을 채혈하고, 혈액 도말을 실시하고, 상이한 세포 집단을 계수하였다(n=4 시노몰거스 원숭이, SEM)(WBC= 백혈구, NEUT= 호중구, LYMPH= 림프구, MONO= 단핵구, EOS= 호산구, BASO = 호염기구, RBC= 적혈구, Retic= 망상적혈구).
코티솔 변화
기본 코티솔 수준은 동물 간에 매우 다양하였다(193.7ng/㎖에서 298.8ng/㎖까지). i.v. 주사 20분 후, 모든 동물은 스트레스로 인해 코티솔이 증가한 것으로 나타났다. 주사 후 12시간까지, 모든 동물은 코티솔이 다시 정상 수준으로 낮아졌지만 동물 간에 높은 변동성이 있었고 24시간까지 정상으로 돌아갔다(도 113의 실험). 시간 0 = 오전 8시, 약12h = 오후 10시의 코티솔 감소가 시노몰거스 원숭이의 정상적인 일주기 리듬과 일치한다는 점을 고려하기 바란다(Tochitani et al, 2019, "Physiological and drug-induced changes in blood levels of adrenal steroids and their precursors in cynomolgus monkeys: An application of steroid profiling by LC-MS/MS for evaluation of the adrenal toxicity", Toxicol. Sci. Vol.44, No.9, 575-584).
보다 특별하게는 도 113의 결과는 개별 동물에서 INX234P의 1회 용량에 의해 유도된 코티솔 변화를 나타낸다. INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하였다. 표시된 시점에 동물을 채혈하고 혈청을 단리시키고 코티솔 수준을 ELISA로 측정하였다(n=4 시노몰거스 원숭이).
혈청 및 말초 혈액 백혈구에서 페이로드 축적
본 발명자들은 이전 실험에서 INX234P에 대한 주요 대사산물 또는 방출된 페이로드가 INX-SM-3임을 나타내었다. 혈청 및 말초 혈액 백혈구(PBL) 둘 다 Quintara Discovery로 배송하여 MS 분석을 실행하여 링커-페이로드(P-cys) 및 방출된 페이로드(SM3)를 시간 경과에 따라 정량화하였다.
도 114의 실험은 초기 시점까지, 접합체가 내재화되었고 항체가 전체 링커 페이로드(INX P-cys)의 일부를 방출하면서 분해되기 시작했음을 나타낸다. 이것은 세포에 축적된 다음 절단되어 활성 방출 페이로드(INX-SM-3)의 세포 내 농도로 이어진다.
보다 구체적으로, 도 114의 실험은 INX234P가 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여되는 경우 PBL에서 링커 페이로드(P-cys) 및 방출된 페이로드(SM3)의 PK를 나타낸다. 표시된 시점에 동물을 채혈하고, PBL을 단리시키고, MS로 분석하였다(n=4 시노몰거스 원숭이, SEM). 접합체는 제7일에 혈장 안정적이기 때문에(데이터는 나타내지 않음), 혈장에서 방출된 페이로드 및 링커 페이로드는 세포로부터의 페이로드 유출을 대표한다.
도 115의 실험은 혈청에서 P-cys가 약 12시간에 피크가 되는 반면 최대 농도는 방출된 페이로드 SM3의 경우 약 24시간에 도달한다는 것을 나타낸다. 주목할 점은, 효능을 허용하지만 비-표적 조직의 혈청 노출을 제한하는 혈청에 비해 세포내 수준이 링커-페이로드의 경우 100배 더 높고 방출된 페이로드의 경우 20배 더 높다는 것이다.
주사 후 제8일(192시간)까지, 림프절 및 골수에서 방출된 페이로드의 상당한 조직내 수준이 존재함에도 불구하고 방출된 페이로드 및 링커-페이로드 둘 다 검출 미만이다. 보다 구체적으로, 도 115의 실험은 INX234P를 15㎎/㎏으로 i.v.로 투여하고 동물을 지시된 시점에 채혈하고 혈청을 단리시키고 MS로 분석한 경우 혈청에서 링커 페이로드(P-cys) 및 방출된 페이로드(SM3)의 PK를 나타낸다(n=4 시노몰거스 원숭이, SEM).
말초 혈액 백혈구에서 시간 경과에 따른 INX234P 유도 전사 변화
도 116에 제시된 실험은 INX234P 투여 전(또는 채헐 전)에 수집된 혈액을 기준선 수준(변화 배수를 계산하기 위해)으로 사용하여 PK 연구 과정 동안 평가된 PBL의 전사 변화를 나타내다.
도 116에 나타난 바와 같이, 동물 간의 가변성에도 불구하고, 스테로이드 전사 표적, 예컨대, FKBP5, DUSP1, ZBTB16, TSC22D3 및 NFKBIA는 투여 후 이르면 3시간에 전사의 급격한 증가를 나타내며, FKBP5, DUSP1 및 ZBTB16의 경우 대략 12시간에 피크가 된다. 24시간에 대부분의 전사 표적은 여전히 상향조절된다.
여기에 나타난 바와 같이, 96시간에 FKBP5, ZBTB16 및 NKBIA에 대한 전사 수준은 여전히 기준선보다 2배 높은 반면, DUSP1, SGK1 및 TSC22D3은 기준선으로 복귀하였다.
보다 구체적으로, 도 116의 실험은 INX234P를 15㎎/㎏에서 i.v.투여하는 경우 PBL에서 스테로이드 반응성 유전자가 INX234P에 의해서 상향조절된다는 것을 나타낸다. 표시된 시점에서 동물을 채혈하고, PBL을 단리시키고, RNA를 단리시키고, 유전자 전사 수준을 RNAseq로 측정하고 채혈 전에 대한 배수 변화로 제시하였다(n=4 시노몰거스 원숭이).
결론
본 실시예에서 데이터는 다음을 나타낸다:
- INX234P의 반감기(T1/2)는 14시간이다.
- INX234P는 GC에서 예상되는 바와 같이 말초 혈액에서 제한적이고 일시적인 세포 변화를 유도한다. 항체 성분은 독성을 추가하는 것으로 보이지 않는다.
- 일주기 리듬으로 인해 예상되는 것을 제외하고는 INX234P 투여 후 코티솔 수준의 일관된 변화가 관찰되지 않았다.
- 방출된 링커 페이로드 및 후속으로 방출된 혈액 세포 내 페이로드 축적은 수 시간 내에 발생하며 혈청에서보다 20 내지 100배 더 높은 수준으로 혈액 세포의 세포내 농도를 초래한다.
- 제8일에 PBL에서 검출 가능한 수준은 없지만 방출된 페이로드는 아마도 세포 턴오버로 인해 골수 및 림프절 조직에 여전히 지속된다.
- INX234P는 투여 후 이르면 3시간에 PBL에서 전사 변화를 유도하고 일부 표적의 경우 96시간에 여전히 검출 가능하게 변화하는데, 이는 전달된 페이로드가 연장된 약력학적 범위로 기능적으로 활성이라는 것을 입증한다.
실시예 22 : 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 INX 항체 글루코코티코이드 접합체에 대한 방출 페이로드의 식별 및 정량화
본 실시예에서, 본 발명에 따른 예시적인 항-VISTA 글루코코티코이드 접합체가 VISTA 발현 세포 내로 빠르게 내재화됨을 나타내는 실험을 수행하였다. 항체는 시스테인 변형 전체 링커 페이로드를 방출하는 이화 작용을 한다. 링커 페이로드가 또한 절단되어 활성 페이로드를 방출한다. 세포 내 프로테아제의 다양성을 고려하여, 방출된 페이로드는 경험적으로 확인되어야 한다. 본 연구에서, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 내재화된 신규한 항체 글루코코티코이드 접합체로부터 방출된 페이로드가 확인되었고 3개의 상이한 글루코코티코이드 링커 페이로드에 대한 질량 분석법(MS)을 통해 존재비를 정량화하였다.
본 연구의 목적은 인간 PBMC에서 본 발명에 따른 신규한 글루코코티코이드 접합체의 방출된 페이로드를 확인하고 정량화하는 것이었다.
물질 및 방법
실험 설계
다음의 모든 실험에서, 연구당 1명의 건강한 공여자로부터 단리된 인간 PBMC를 본 발명에 따른 예시적인 항-VISTA 글루코코티코이드 접합체로 처리하여 방출된 페이로드의 확인 및 정량화를 허용하였다.
파일럿 실험에서, 본 발명자들은 항-VISTA 글루코코티코이드 접합체와의 4시간(h) 인큐베이션이 인간 PBMC에서 FKBP5의 강력한 증가를 초래함을 나타내었다. 이것은 글루코코티코이드 활성의 직접적인 영향이다.
본 실험에서, PBMC를 글루코코티코이드(GC) 항체 약물 접합체(ADC)와 함께 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 수거하고, 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 통해서 FKBP5 전사 유도에 대해 평가할 뿐만 아니라 질량 분석법(MS)을 통해서 방출된 페이로드 확인 및 정량화에 대해서 평가하였다.
시약
시험 ADC
Figure pct00921
INX201J(Abzena, lot# JZ-0556-025-1)는 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인, 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 링커/페이로드에 접합된 INX201이다. 링커/페이로드(J)는 특허에 보고된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-1)는 DAR이 8.0인 접합된 INX231이다. 링커/페이로드(J)는 특허에 보고된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231P(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-017-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231V(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-2)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.8인 INX231이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A11(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-001)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A11)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커(Asn/gly)로 이루어진다.
INX234A3(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-1)은 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A3)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 양으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234V(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-003)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231V(Abzena, 로트 번호　PP-0920-014-2)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.8인 INX231이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A7(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-001)은 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.8인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX A7)는 인산화된 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A12(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-007-002)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 6.99인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX A12)는 인산화된 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231A23(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-006-001)은 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.34인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX A23)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-25)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A5(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-002)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A5)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-44)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234A4(Abzena, 로트 번호 PP-0924-023-2)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX A4)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-43)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231J(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-013-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX J)는 특허에 보고된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J-2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231P(Abzena, 로트 번호 JZ-0556-017-1)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX231이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234P(Abzena, 로트 번호 HA-0853-02)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234J(Abzena,　로트 번호 JZ-0556-013-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, DAR이 8.0인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX J)는 특허에 보고된 링커/페이로드에 기반한다(US 15/611,037). 이것은 부데소나이드 유사체 페이로드(INX J2)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX231S(Abzena, 로트 번호 PP-0924-014-1)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 6.9인 INX231 항체이다. 링커/페이로드(INX S)는 플루오시놀론 아세토나이드 유사체 페이로드(INX-SM-24)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
세포 배양 배지
L-글루타민이 없는 RPMI 1640(VWR 카탈로그 번호 16750-084)
페니실린/스트렙토마이신/글루타민(ThermoFisher 카탈로그 번호 10378016)
1M Hepes(Gibco 카탈로그 번호 15630-080)
인간 AB 혈청(Valley Biomedical 카탈로그 번호 HP1022HI)
다른 시약
Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare 카탈로그 번호 17-1440-03)
Histopaque 1077 (Sigma Aldrich)
PBMC 준비
인간 PBMC를 Dartmouth Hitchcock Medical Center의 혈액 공여자 프로그램에서 확인되지 않은 건강한 인간 공여자로부터 얻은 성분채집 콘으로부터 멸균 조건 하에서 단리시켰다.
혈액을 50㎖ Falcon 튜브로 옮기고 PBS로 30㎖로 희석시켰다. 13㎖의 Histopaque 1077을 혈액 아래에 겹쳐 두고 튜브를 실온에서 20분 동안 850×g에서 약간의 가속 및 제동 없이 원심분리시켰다.
단핵 세포를 혈장/Ficoll 계면에서 수집하고 50㎖의 PBS에 재현탁시키고 300×g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포를 PBS에 재현탁시키고, 계수하였다.
대사산물 ID 및 정량화 둘 다를 위한 검정 프로토콜
단리된 PBMC를 10% 인간 AB 혈청, 10mM Hepes, 1x 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640(검정 배지)에 재현탁시켰다.
1명의 공여자로부터의 PBMC를 PBS에서 2회 세척한 다음, 배지에서 1x10^7개/㎖로 재현탁시켰다. 사용되는 6웰 플레이트의 각각의 웰에 1㎖를 옮겼다.
약물 첨가 후 웰당 총 부피 2㎖로 1mM 페이로드의 최종 농도에 사용되는 6웰 플레이트의 각각의 웰에 ADC 또는 배지 단독을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 두었다.
4시간 후, 세포가 있는 배지를 수거하고 주어진 처리의 모든 웰에서 합쳤다.
1㎖의 세포 현탁액을 펠릿화하고, 배지를 제거하고, 펠릿을 RNA 용해 완충액에 재현탁시켜 FKBP5 분석을 허용하였다.
각각의 처리에 대해 남은 세포를 분취량당 5천만 개의 세포를 나타내는 분취량으로 나누었다(대사산물 정량화를 위해 조건당 하나의 분취량만 생성됨).
세포를 450rcf에서 4분 동안 펠릿화하였다.
배지를 각각의 세포 펠릿으로부터 제거한 다음 유출된 페이로드의 농도에 대해 평가할 수 있을 때까지 -80℃에서 따로 보관하였다. 임의의 추가 잔류 배지를 MS 분석을 위해 -80℃에 보관된 건조 세포 펠릿을 남기고 튜브에서 제거하였다.
추가적인 대조군으로서, 스톡 약물(2mM)을 배지로 최종 농도(1mM)로 희석시키고, 분취액을 따로 보관하여 0 시점에서 배지에 유리 페이로드가 없음을 확인하였다.
MS 분석
MS 분석은 Quintara Discovery에 의해 수행하였다.
대사산물 ID를 위해서
간략하면, 사전 냉각된 70% ACN(추출 완충액)을 추출을 위해 PBMC 펠릿에 첨가하였다. 펠릿을 추출 완충액에 현탁시키고 빙욕에서 인큐베이션시켰다. 그런 다음 샘플을 원심분리시키고, 각각의 샘플에서 상청액을 수집하였다. 상청액을 Speed Vac로 건조시키고, 50% MeOH로 재구성하였다. 15㎖를 LCMS(Luna C18(2) 칼럼, Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap)에 주입하고 생성된 질량을 평가하였다.
정량화를 위해서
세포 샘플을 100㎕ 20% 메탄올로 현탁시켰다. 각각의 샘플을 내부 표준(Verapamil)을 포함하는 아세토나이트릴:메탄올(95:5, v/v)로 추출하였다. 혼합물을 진탕기에서 와동시킨 후 원심분리시켰다. 상청액의 분취량을 LC/MS/MS(Sciex Qtrap 6500+)에 주입하기 위해 옮겼다. 보정 표준품 및 품질 관리 샘플은 시험 화합물을 미처리 인간 PBMC에 스파이킹하여 준비한 다음 미지의 샘플로 처리하였다.
RNA 준비 및 실시간 PCR
세포 펠릿을 NucleoSpin® RNA Plus kit(Macherey-Nagel # 740984)의 RNA 용해 완충액 0.4㎖에 재현탁시켰다. 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리시키고 30 또는 40㎖ H2O(RNase/DNase 무함유)에 용출시켰다. RNA 농도를 Nanodrop에서 평가하였다.
Taqman 역전사 시약(#N8080234)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사를 수행하였다.
정량 실시간 PCR은 Taqman 마스터 믹스 2X 키트(# 4369016)를 사용하여 수행하고 Applied Biosystem의 QuantStudio3에서 실행하였다. 사용된 프라이머:
i. TaqMan Gene Expression Assay (FAM-MGB); Assay ID:Hs01561006_m1 (FKBP5)
ii. TaqMan Gene Expression Assay (FAM-MGB); Assay ID:Hs01922876_u1 (GapDH)
Ct 데이터를 미처리 대조군과 비교하여 ΔCt 및 ΔΔCt 또는 Log2 배수 변화로 변환시켰다.
결과
실험 1
INX-SM-J2, INX-SM-3 및 INX-SM-32은 각각 INX201J, INX231P 및 INX231V의 주요 대사산물이다.
본 실험에서 본 발명자들은 인간 PBMC(단일 공여자)와 함께 4시간의 시험관내 인큐베이션 후 INX201J, INX231P, 및 INX231V의 인큐베이션으로부터 주요 대사산물을 확인하였다.
도 117에 나타난 바와 같이, 모든 접합체와의 인큐베이션은 FKBP5 전사의 강력한 증가를 야기한다. MS 분석은 접합체 중 임의의 것에 대한 주요 대사산물이 각각의 예측된 방출 페이로드였음을 확인해 주었으며, INX201J의 경우 이는 INX-SM-J2에 상응하고, INX231P 및 INX231V의 경우 각각 INX-SM-3 및 INX-SM-32에 상응한다. 정제된 형태의 이러한 방출된 페이로드는 각각 본 명세서에 보고된 다른 실험 결과에서 활성이고 유사한 효력을 유도하는 것으로 나타났다. 이화 작용된 항체를 나타내는 더 낮은 수준의 절단되지 않은 시스테인 변형된 링커 페이로드가 또한 3개의 접합체 각각에 대해 존재하였다.
표 12의 데이터는 방출된 화합물의 유출을 나타내는 배지 내의 방출된 페이로드, 절단되지 않은 시스테인 변형된 링커 페이로드 및 화합물의 대략적인 존재비를 제공한다. 주목할 만한 것은, INX231V로부터 방출된 페이로드의 존재비는 INX231P 및 INX201J로부터 방출된 페이로드의 양을 훨씬 능가한다는 것이다.
INX231P와 INX201J 간의 방출된 페이로드의 차이는 INX201이 INX231보다 생체내 및 시험관내 둘 다에서 훨씬 더 빠르게 내재화되어(데이터는 표시되지 않음) INX P 페이로드보다 INX201 및 이에 따른 방출된 INX J 페이로드의 추가 축적으로 이어진다는 사실에 의해서 혼동된다. 보다 빠르게 내재화되는 항체의 접합체와 비교할 때에도 INX V에서 방출된 페이로드의 수준은 여전히 상응하는 INX J에서 방출된 페이로드의 수준을 훨씬 능가한다.
표 12에 나타난 바와 같이, INX P 또는 INX J에 비해 INX V 페이로드의 실질적인 방출이 존재하였다. 1mM의 접합된 페이로드(약 20mg/㎖ ADC)와 함께 인큐베이션되고 MS 분석을 통해 정량화된 인간 PBMC의 경우 4시간에 예측된 세포내 페이로드 존재비. 4시간에 배지에 존재하는 유출된 페이로드의 양을 또한 제공한다. 배지에서의 수준을 다른 실험으로부터의 샘플과 병행하여 평가되었기 때문에 예측되지 않고 정량화된다 (n=1 공여자(ND - 검출 불가(예측 LLOQ=0.1ng)), BQL - 정량 한계 미만(0.5ng/㎖ 미만)).
실험 2
INX P 또는 INX J에서 방출된 페이로드보다 더 높은 수준으로 존재하는 INX V에서 방출된 페이로드.
본 연구에서, 본 발명자들은 인간 PBMC와 함께 INX231J, INX231P, 및 INX231V의 4시간 인큐베이션 후 방출된 페이로드의 존재비를 확인하였다. 표 13은 방출된 화합물의 유출을 나타내는 배지 내의 방출된 페이로드, 시스테인 변형된 링커 페이로드 및 화합물의 존재비를 제공한다. 또한 그것은 대조군으로 ADC 스톡 용액을 배지(세포 없음)로 희석시키고, MS 분석을 위해 제출할 때 검출된 방출된 페이로드 수준을 포함한다.
본 연구의 결과는 INX P에 비해서 INX V에서 방출된 페이로드의 극적인 235배 향상(ng/ng) 및 INX J에서 방출된 페이로드에 비해서 훨씬 더 큰 것을 확인해주고 정량화한다. 이러한 실질적인 방출 향상은 3개의 링커 페이로드 사이의 구조적 차이에 기초하여 예측되지 않았으며, 동일한 항체(INX231) 및 gly glu 링커가 3개의 접합체 모두에 사용되었기 때문에 항체 또는 링커 기여의 결과가 아니었다.
항체가 INX P 및 INX J 접합체에 대해 동일하다는 사실에도 불구하고, INX P에서 방출된 페이로드는 4시간에 INX J에서 방출된 페이로드 양의 약 3배이다. 이들 결과는 이전 실시예에서 나타낸 LPS 자극된 PBMC 검정에서 관찰된 효력 이점을 추가로 확증한다.
표 13의 데이터는 INX231V에서 방출된 페이로드의 수준이 INX231J 또는 INX231P의 것의 수준을 초과함을 나타낸다. 1mM의 접합된 페이로드(약 20mg/㎖ ADC)와 함께 인큐베이션되고 MS 분석을 통해 정량화된 인간 PBMC의 경우 4시간에 세포내 페이로드의 정량화된 존재비가 여기에 제시된다. 4시간에 배지에 존재하는 유출된 페이로드의 양을 또한 제공한다. 스톡 용액에서 검출된 방출된 페이로드 수준은 INX231J의 경우 0.8ng/㎖이거나 정량 한계 미만인 0.5ng/㎖(INX231V/INX231P) 미만이었다. 스톡 용액의 시스테인 켄칭된 페이로드 수준은 INX231P의 경우 0.9ng/㎖이거나 정량 한계 미만인 0.5ng/㎖(INX231V/INX231P) 미만이었다.
실험 3
인간 PBMC와 인큐베이션된 INX A11, INX A3, INX V, INX A7, INX A12, INX A23, INX A5, INX A4, INX P, INX S 및 INX J 항-VISTA 접합체로부터의 방출된 페이로드의 정량화
본 연구에서, 본 발명자들은 인간 PBMC(1명의 공여자)와 4시간 인큐베이션 후 일련의 신규한 글루코코티코이드 접합체로부터 방출된 페이로드의 존재비를 확인하였다. 하기 표 14는 방출된 화합물의 유출을 나타내는 배지에서 방출된 페이로드 및 화합물의 존재비를 제공한다. 본 연구는 또한 음성 대조군으로 ADC 스톡 용액을 배지(세포 없음)로 희석시키고, MS 분석을 위해 제출할 때 검출된 방출된 페이로드 수준을 포함하였다. 모든 양은ng/㎖로 제공된다. 2개의 경우(INX234P 및 INX234J)에서 분석 전에 기술적 변경으로 인해 물질의 일부가 손실되었으므로 물질 손실을 설명하기 위해 세포내 물질의 양이 정규화된다.
본 연구는 INX J 문헌 대응물에 비해 ImmuNext의 신규한 링커 페이로드의 극적인 향상(ng/ng)을 확인해주고 정량화한다. 중요한 점은, 항체 골격이 일정하게 유지되고(예를 들어, INX231) INX J 또는 ImmuNext 링커 페이로드에 접합되는 경우, 더 많은 양의 방출된 ImmuNext 페이로드가 세포내에서 검출된다는 것이다. 더 유사한 한 가지 경우(예를 들어, INX234P 대 INX234J)에서 INX234P는 세포내에서 더 높은 수준(약 1.5배)으로 검출되었지만 INX J와 달리 배지에서 검출될 수 있는 유출된 페이로드가 없었다. 이것은 생체내에서 유출된 페이로드가 표적 세포 유형에 의한 보유 시간을 단축시키고 다른 세포에 의한 비특이적 흡수를 초래할 수 있기 때문에 중요하다.
표 14의 데이터는 새로운 링커 페이로드에서 방출되는 페이로드의 수준이 INX J 대응물의 수준을 초과함을 나타낸다. 500nM의 접합된 페이로드(약 10mg/㎖ ADC)와 함께 인큐베이션되고 MS 분석을 통해 정량화된 인간 PBMC에 대한 4시간에서의 정량화된 세포내 페이로드의 존재비가 표에 제시되어 있다. 4시간에 배지에 존재하는 유출된 페이로드의 양을 또한 제공한다. 스톡 용액에서 검출된 방출 페이로드 수준은 모두 BQL이었다(정량 한계 미만 <0.5ng/㎖).
결론
각각의 특정 링커 페이로드(INX J, INX V, 및 INX P)를 갖는 항-VISTA 접합체는 각각 절단되어 이론화된 방출 페이로드를 방출한다. 추가적인 대체 절단 생성물은 검출 가능한 수준으로 존재하지 않는다.
일부 잔류 전체 시스테인 변형 링커 페이로드가 여전히 존재한다.
INX V 접합체로부터 방출된 페이로드 및 다른 새로운 글루코코티코이드 링커 페이로드는 INX J에 대해 상응하는 방출된 페이로드보다 더 풍부하다.
특히, 본 실시예의 실험에서 본 발명자들은 INX201J, INX231P, 및 INX231V의 주요 대사산물이 각각 이론화된 방출 페이로드 INX-J2, INX-SM-3, 및 INX-SM-32인 것으로 확인하였다.
놀랍게도, INX231V에 대한 방출된 페이로드는 인큐베이션 4시간 후에 INX P 및 INX J에 대한 페이로드보다 실질적으로 더 많은 양으로 존재하였다. 이것은 초기 연구에서 INX P 및 INX J 접합체에 대한 페이로드에 비해 75배를 초과하게 풍부(ng/ng)한 것으로 추정되었다. 제2연구에서, 이것은 INX P에 비해 230배를 초과하는 존재비(ng/ng)로 존재하고 INX J에서 방출된 페이로드에 대한 것보다 훨씬 더 큰 존재비로 존재하는 것으로 확인되었다.
INX P 접합체는 또한 동일한 항체가 각각의 접합체에 사용된 경우 INX J 접합체에 비해서 방출된 페이로드의 향상된 축적(약 3배)을 나타내었다.
이러한 증가된 존재비는 효력 및 PD 둘 다에 상당한 영향을 갖는다. 이전 실시예에 개시된 지연된 지질다당류(LPS) 검정을 사용한 추가 연구는, 심지어는 3개에 대해서 방출되는 페이로드가 이들의 유리 형태에서 유사하게 효력이 있음에도 불구하고, INX V 접합체가 이의 접합된 형태에서 동일한 항체의 INX J 접합체보다 더 효력이 있는 INX P보다 실질적으로 더 효력이 있다는 것을 입증하였다. 여기서 시험관내에서 관찰된 방출된 페이로드의 큰 세포내 저장소는 또한 ADC가 단 몇 시간의 짧은 혈청 반감기를 가짐에도 불구하고 생체내에서 관찰된 수주의 지속된 효과에 직접적으로 기여할 수 있다.
본 발명자들이 시험한 모든 추가적인 신규한 글루코코티코이드 접합체는 또한 동일한 항체 골격에 접합된 INX J에 비해 극적으로 향상된 세포내 축적으로 향상되었으며, 방출된 페이로드는 배지로 거의 유출되지 않았다. 이 데이터는 유리 페이로드 형태의 효력 및 일반적으로 글루코코티코이드 소분자의 매우 짧은 PD를 고려할때 예상 효력에 비해서 본 발명의 ADC의 향상된 시험관내 효력 및 긴 PD를 강력하게 뒷받침한다.
실시예 23: IBD 또는 대장염 연구
덱스트란 황산나트륨 대장염 뮤린 모델(DSS)은 일반적으로 잠재적인 IBD 또는 대장염 치료제를 평가하는 데 사용된다(문헌[Eichele et al., "　Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis"　World J Gasteroenterology,　2017 Sep 7; 23(33): 6016-6029"] 참조).　따라서, 이 동물 모델을 사용하여 대장염 또는 IBD의 치료를 위한 본 발명에 따른 ADC의 효능을 예비적으로 평가하였다.
또한 일반적으로 알려진 바와 같이 IBD 및 대장염은 만성적인 병태이며, 효과적으로 치료하고 관리하기 어렵고, 비효율적으로 치료하면 패혈증 및 사망을 초래할 수 있다. 현재 IBD 또는 대장염 질환 관리의 주요 수단은 만성 스테로이드 투여를 포함한다. 그러나, 불행하게도 이것은 예를 들어 비표적(예를 들어, 상피 세포)에 대한 스테로이드의 효과 및/또는 장기간의 면역억제로 인해 잠재적으로 독성을 유발할 수 있다.
이러한 예비 실험에서 하나의 동물군에게 본 발명에 따른 Dex ADC(INX234P)를 격일로 0.2 mpk의 스테로이드 투여량으로 제공하였고, 두 번째 양성 대조군 동물군에게 유리 Dex 스테로이드를 2mpk의 스테로이드 용량으로 매일 투여하였고, 세 번째 음성 대조군 동물군은 처리하지 않았다. 군당 10마리의 동물이 존재하였다. ADC 또는 Dex 처리는 동물이 체중 감소를 나타내기 시작했을 때(7일) 시작하였다(DSS는 0일에 시작됨). 실험은 하나의 군(dex 처리)이 최대 허용 체중 감소에 도달한 13일에 종료되었다.
결과(예비, 나타내지 않음)는 ADC가 미처리 대조군과 비교하여 효능을 나타냄을 시사한다. 또한, 결과는 ADC가 유리 스테로이드 처리 동물에서 관찰된 것과 동일한 독성을 유발하지 않았음을 시사한다. 이와 관련하여, 이 IBD 모델에서 덱사메타손이 독성을 유발하는 것으로 보고되어 있다(문헌[van Meeteren ME, Meijssen MAC, Zijlstra FJ. "The effect of dexamethasone treatment on murine colitis", Scand J Gastroenterol 2000;35:517-521; 및 Ocon et al., "The glucocorticoid budesonide has protective and deleterious effects in experimental colitis in mice",　Biochemical Pharmacology　116 (2016) 73-88] 참조).
이러한 결과는 예비적이지만 본 발명의 ADC가 대장염 또는 IBD 적응증을 치료하는 데 유용할 수 있음을 시사한다. 또한, 이들은 장기간의 유리 스테로이드 요법 중에 발생할 수 있는 독성을 완화할 수 있기 때문에 본 발명의 ADC가 이러한 만성 질환을 치료하기 위해 기존의 유리 스테로이드 요법보다 선호될 수 있음을 시사한다. 이는 실시예 25에서 더욱 확증된다.
실시예 24: xeno-GvHD 모델 - 2 연구에서 T 세포 확장 및 생존에 대한 항체 약물 접합체 INX234P 및 INX234V의 영향
이종 이식편대숙주병(xeno-GvHD)의 인간화 마우스 모델은 생체내 인간 약물 표적에 특이적인 면역조절 화합물의 연구를 가능하게 한다. 이들은 인간의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 주입한 마우스의 면역결핍 균주를 기반으로 한다. NOD-scid IL-2Rγ null(NSG) 균주는 성숙한 T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포가 부족하며 이종 GvHD 연구로 수정 가능하다.
xeno-GvHD의 NSG 모델에서, 공여자 인간 T 세포는 정맥내로(i.v.) 전달되고 수용자 마우스에서 시간 경과에 따라 강력하게 확장되며 피부 조직 침윤으로 이어지는 항-숙주 세포 반응성에 영향을 미친다. 마우스는 체중이 감소하고 치료하지 않고 방치하면 GvHD에 걸릴 것이다. 질환 진행 기간은 3주 내지 6주 범위일 수 있다. 인간 PBMC를 전달하기 전에 마우스에 2.5 내지 3Gy를 조사함으로써 질환 발생 및 진행 시간을 가속화할 수 있다. 이 경우 질환은 대략 1 내지 2주 후에 시작되고 마우스는 2 내지 3주 마크에 의해 사망할 것이다.
간략히 설명하면, 먼저 마우스에게 대조군 인간 IgG1, INX234, 또는 INX234P(실험 1) 또는 INX234V(실험 2)의 용량과 함께 2.5×106개의 인간 PBMC를 주사하였다. 정기적으로 마우스의 체중을 측정하고 말초 혈액의 절대 백혈구 수치(ALC)로 인간 T 세포 확장을 측정하여 질환 진행을 모니터링하였다. 본 연구의 목적은 xeno-GvHD의 진행에 영향을 미치는 2개의 상이한 GC 페이로드에 접합된 인간 VISTA 항체 INX234의 능력을 평가하는 것이었다.
물질 및 방법
연구 설계
이들 실험에서, 공여자 세포에게 i.v.로 주사된 항체 또는 ADC의 첫 번째 투여 후, 치료는 34주까지 10㎎/㎏으로 주 1회 복강내 주사(i.p.)를 통해 수행되었다.
혈액은 실험 1에 대해 21일에 한 번만 수집되었다. 혈액은 실험 2에 대해 15일부터 시작하여 일주일에 한 번 수집되었다.
시험 작용제 및 투여량
INX234(ATUM, 로트 번호 72931.2.a)는 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX234P(Abzena, 로트 번호　JZ-0556-017-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234V(Abzena, 로트 번호 RJS-1054-003)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
huIgG1si(Aragen, 로트 번호 BP-2211-018-6)는 Fc 영역에 E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 항-RSV 단클론성 mAb이다.
모든 항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 i.p. 주사하여 10㎎/㎏의 용량을 전달하였다.
실험 2에서, 동물을 27일까지 INX234V로 처리하였고, 그 다음 나머지 실험 동안 INX234P로 처리하였다.
마우스
8주령의 NSG 마우스는 Jackson Laboratory(NOD.Cg- Prkdc scid 　Il2rg tm1Wjl J Stock No:　005557)에서 구입하여 Dartmouth-Hitchcock Medical Center(DHMC)에서 특정 병원균이 없는 상태로 보관하였다. 실험을 시작하기 전에 마우스에 문신을 새겼다.
실험 1의 경우, 마우스를 PBMC i.v. 투여 7일 전에 2.5Gy로 방사선 처리하였다.
실험 2의 경우, 마우스를 방사선 처리하지 않았다.
채혈 및 면역염색
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다.
하기에 설명된 1-세척 프로토콜은 절대 혈액 세포 계수를 허용한다.
항체 칵테일(우측 참조) 10㎖를 혈액 100㎖에 직접 첨가하였다. 실온(RT)에서 30분 인큐베이션 후, 600㎖ BD FACS 용해 완충액을 샘플에 첨가하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 후, 샘플을 550rcf에서 5분 동안 회전시키고, PBS에서 1회 세척하고, 그 다음 고정 부피의 PBS에 재현탁시켰다. 전체 샘플을 MacsQuant 유세포 분석기에서 분석하여 절대 세포 수를 얻었다.
말초 혈액 단핵 세포 단리
인간 PBMC를 DHMC의 혈액 공여자 프로그램에서 확인되지 않은 건강한 인간 공여자로부터 얻은 성분채집 콘으로부터 멸균 조건 하에서 단리시켰다. 혈액을 50㎖ Falcon 튜브로 옮기고 PBS로 30㎖로 희석시켰다. 13㎖의 Histopaque 1077(Sigma Aldrich)을 혈액 아래에 겹쳐 두고 튜브를 실온에서 20분 동안 850rcf에서 약간의 가속 및 제동 없이 원심분리시켰다.
그 다음 단핵 세포를 혈장/Ficoll 계면에서 수집하고 50㎖의 PBS에 재현탁시키고 300×g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포를 PBS에 재현탁시키고, 계수하였다.
질환 모니터링
마우스를 주 3회 체중을 측정하고, 본 발명자들의 IACUC 기관이 허용하는 바와 같이 체중이 초기 체중의 75% 미만으로 감소하면 안락사시켰다.
결과
실험 1
INX234P 처리는 인간 PBMC 확장을 방지한다.
xeno-GvHD 진행을 모니터링하기 위해서, 본 발명자들은 인간 T 세포 확장 및 체중 감소를 측정하였다. 도 119에 나타낸 바와 같이, 인간 PBMC는 세포 전달 21일 후에 INX234P 처리군에서 상당히 감소되었다. 이 실험에서 말초 혈액을 제21일에 수집하고 인간 CD45 양성 세포를 유세포 분석법으로 정량화하였다. 마우스에게 제0일부터 제34일까지 주 1회 투여하였다(SEM; n=8/군)(10㎎/㎏ 투여, INX234P는 0.2㎎/㎏의 INX P 링커 페이로드 제공).
INX234P 치료는 마우스 생존을 개선시킨다.
INX234P 처리는 또한 hIgG1 및 네이키드 Ab 대조군과 비교하여 체중 감소를 방지하는 것으로 나타났으며 이는 개선된 생존으로 해석되었다. 치료가 종료되면 INX234P 처리 마우스는 체중이 감소하기 시작하였다. INX234P 처리는 인간 IgG1 및 INX234 처리군에 대해 각각 52일 대 38.5일 및 42일의 중간 생존으로 나타난 바와 같이 개선된 생존으로 이어졌다.
도 120의 실험 결과에 나타난 바와 같이, INX234P 처리는 마우스 생존을 개선시킨다. 이 실험에서 마우스에게 10㎎/㎏(또는 0.2㎎/㎏의 INX P 링커 페이로드)을 제0일부터 제34일까지 주 1회 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=8/군).
실험 2
INX234V/P 처리는 인간 PBMC 확장을 방지한다.
이 실험에서 동물을 제27일까지 주 1회 INX234V로 처리한 다음 실험의 나머지 기간 동안 INX234P로 처리하였고, 본 발명자들은 시간 경과에 따라 인간 T 세포 확장을 추적하였는데 그 이유는 이 모델에서 주로(98% 초과) T 세포가 확장되기 때문이다. 도 121에 나타낸 바와 같이, 빠르면 제15일부터 세포 수의 극적인 차이를 관찰할 수 있었다. 두 대조군 모두 제28일에 정체된 세포 확장을 나타내는 반면, INX234V/P 처리군은 지속적으로 낮은 T 세포 수를 나타내었다.
특히 도 121의 실험에서, 전달 후 제15일에 시작하여 매주 말초 혈액을 수집하고 인간 CD45+ CD3+ 양성 세포를 유세포 분석법으로 정량화하였다. 마우스에게 제0일부터 주 1회 투여하였다(SEM; n=8/군)(10㎎/㎏ 투여 시, INX234V 및 INX234P는 각각 0.2㎎/㎏의 INX V 또는 INX P 링커 페이로드를 제공하였음).
INX234V/P 처리는 마우스 생존을 개선시킨다.
INX234V/P 처리는 hIgG1 및 비접합 Ab 대조군과 비교하여 체중 감소를 추가로 완전히 방지하였는데 이는 극적으로 개선된 생존(도 122)으로 해석되며, 인간 IgG1 및 비접합 INX234에 대한 중간 생존은 각각 42일 및 44.5일이었다. INX234V/P 처리군의 모든 동물은 이 보고 시점에 살아 있었다.
도 122의 결과에 나타난 바와 같이, INX234V/P 처리는 마우스 생존을 개선시킨다. 이 실험에서 마우스에게 제0일부터 시작하여 주 1회 10㎎/㎏(또는 0.2㎎/㎏의 INX V 또는 INX P 링커 페이로드)을 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이다.
결론
데이터는 INX234P 및 INX234V 둘 아 면역결핍 마우스에서 인간 T 세포 확장 및 질환 발달을 제한/방지함으로써 xeno-GvHD 진행을 제어하고 생존을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 데이터는 추가로 실험 2에서 링커 페이로드 INX V에서 INX P로의 변경이 치료의 효능을 유지함을 나타낸다. 이 효능은 네이키드 항체 INX234가 효능을 유도하지 않았다는 사실에 의해 입증된 바와 같이 GC 페이로드에 의해 매개된다.
참고문헌
실시예 25: 항-VISTA 항체 약물 접합체는 마우스 T 세포 전달 대장염 모델에서 효능을 갖는다.
염증성 장 질환(IBD)(크론병; 궤양성 대장염)은 장 및/또는 결장의 만성 염증 장애이다. 글루코코티코이드(GC)는 IBD 치료에 매우 효과적이지만 이러한 강력한 항-염증제는 일반적으로 장기 치료와 관련된 독성으로 인해 급성 재발을 치료하는 것으로 제한된다.
만성 대장염의 미경험 T 세포 전달 마우스 모델은 장 염증의 조절뿐만 아니라 유도를 담당하는 면역학적 기전을 기술하는 데 중요한 역할을 하였다. 이것은 또한 GC에 매우 반응성인 유일한 뮤린 대장염 모델이다.
2개의 상이한 글루코코티코이드(GC) 페이로드에 연결된 2개의 항-인간 VISTA 단클론성 항체인 2개의 항체 약물 접합체(ADC) INX234P 및 INX234V의 효능을 대장염의 T 세포 전달 뮤린 모델에서 평가하였다.
간략하면, 인간 VISTA 발현 마우스(hVISTA KI)로부터의 미경험 CD4 T 세포를 성숙한 T, B 및 NK 세포를 생산하지 않는 면역결핍 Rag1-/- 마우스에 전달하였다. 21일 초과 후, 동물은 서서히 체중이 감소하기 시작하고 순환 미경험 T 세포의 감소가 관찰된다. 이 모델에서, ADC는 전달된 세포만 표적으로 하는 반면 유리 GC는 전달된 세포 및 숙주 세포 둘 다에 작용할 수 있다.
실험 1에서, 마우스를 제0일에 시작하여 주 1회 10㎎/㎏의 INX234P로 처리하였다. 실험 2에서 INX234V를 사용한 처리는 질환의 첫 징후가 확인된 후 제21일에 시작되었고 이후 주 1회 처리되었다. 4개의 대조군을 두 실험 모두에 추가하였다: PBS, 2 및 0.2㎎/㎏의 덱사메타손(Dex), 비접합 INX234 항체, 모두 주 1회 투여. 실험 1에서, 처리는 제0일(예방적)에 시작하여 제61일에 종료된 반면, 실험 2에서는 처리를 제21일(또는 치료적)에 시작하였고 본 출원 시점에 계속 진행 중이다.
두 실험에서 얻은 데이터는 INX234P 및 INX234V 둘 다가 하기에 기초하여 어느 한 용량의 Dex에 비해 우수한 영향을 가짐을 나타낸다:
1) 생착된 미경험 CD4 T 세포의 집단 유지
2) 극적으로 증가된 생존으로 입증된 질환으로부터의 보호.
또한, 데이터는 또한 질환 효과기 세포만을 독점적으로 표적화하는 것이 질환 발달을 예방하기에 충분하다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
연구 설계
두 실험 모두에서 모든 처리는 주 1회 투여되었다.
[3] 실험 1의 경우, INX234P 치료는 미경험 CD4 T 세포 전달 후 제0일(또는 예방적)에 시작되었고 제61일에 종료되었다. 실험 2의 경우, INX234V 치료는 미경험 CD4 T 세포 전달 후 제21일(또는 치료적)에 시작되었다. 이 실험에서 제42일, 제49일 및 제56일에 동물에게 INX234P를 제공한 후 나머지 치료 기간 동안 다시 INX234V로 전환하였다.
시험 작용제 및 투여량
항체
Figure pct00957
INX234(ATUM, 로트 번호 72931.2.a)는 Fc 영역에 L234A/L235A/E269R/K322A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격 상의 인간화 항-인간 VISTA 항체이다.
INX234P(Abzena, 로트 번호　JZ-0556-017-2)는 쇄간 이황화물의 완전 변형을 통해서 접합된, 약물/항체 비율(DAR)이 8.0인 INX234이다. 링커/페이로드(INX P)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-3)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
INX234V (Abzena, 로트 번호 RJS-1054-003)는 쇄간 이황화물의 변형을 통해서 접합된, DAR이 7.9인 INX234 항체이다. 링커/페이로드(INX V)는 부데소나이드 유사체 페이로드(INX-SM-32)를 갖는 음으로 하전된 프로테아제 감응성 링커로 이루어진다.
모든 항체를 PBS에 희석시키고 0.2㎖ 부피로 복강내(i.p.) 주사하여 10㎎/㎏의 용량을 전달하였다.
덱사메타손
Phoenix의 덱사메타손 멸균 주사제인 NDC 57319-519-05를 PBS에 0.2㎖의 최종 부피로 희석시키고 i.p. 주사를 통해서 기재된 바와 같이 투여하였다.
마우스
8주령의 암컷 Rag1-/- 마우스 또는 B6.129S7-Rag1 tm1Mom /J는 Jackson Laboratories(스톡 번호:　002216)에서 얻었다.
인간 VISTA 넉-인(hVISTA KI) 마우스는 마우스 VISTA 유전자 대신 인간 VISTA cDNA가 넉-인되어 있고 마우스 VISTA 또는 C57Bl/6 마우스와 동일한 발현 패턴으로 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 인간 VISTA를 발현한다. hVISTA KI 마우스를 현장(나트머스의 비교 의학 연구 센터)에서 사육하였다. 암컷 마우스 8 내지 10주령은 세포 전달에 사용하였다.
질환 모델 설정
미경험 CD4 T 세포 단리
제조사 지침에 따라 StemCell(카탈로그 번호 19765)의 EasySepTM Mouse Na
Figure pct00962
ve CD4+ T cell Isolation kit를 사용하여 미경험 CD4 T 세포를 hVISTA KI 비장으로부터 단리시켰다.
대장염 개시
Ostanin 등(2008)의 프로토콜에 따라, 0.5×106개의 미경험 CD45RB+, CD4+ T 세포를 제0일에 i.p.로 주사하였다.
전혈 면역염색
응고를 방지하기 위해 헤파린으로 먼저 헹군 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 안와후강으로부터 말초 혈액을 수거하였다.
하기에 설명된 1-세척 프로토콜은 절대 혈액 세포 계수를 허용한다.
항체 칵테일(우측 표 참조) 10㎖를 혈액 100㎖에 직접 첨가하였다. 실온(RT)에서 30분 인큐베이션 후, 600㎖ BD FACS 용해 완충액을 샘플에 첨가하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 후, 샘플을 550rcf에서 5분 동안 회전시키고, PBS에서 1회 세척하고, 그 다음 고정 부피의 PBS에 재현탁시켰다. 전체 샘플을 MacsQuant 유세포 분석기에서 분석하여 절대 세포 수를 얻었다.
질환 모니터링
마우스를 주 3회 체중을 재고, 본 발명자들의 IACUC 기관이 허용하는 바와 같이 체중이 초기 체중의 75% 미만으로 감소하면 안락사시켰다.
결과
실험 1
INX234P 치료는 생존을 개선시킨다.
도 123 및 도 124에 나타난 바와 같이, 대조군, PBS 및 비접합(실험 1) 및 낮은 Dex(0.2㎎/㎏) 군은 각각 43일, 74.5일 및 72.5일의 중간 생존을 나타내었다. 대조적으로, 실험이 제91일에 종료되었을 때 INX234P 및 높은 Dex(2㎎/㎏) 군 어느 것도 중간 생존 기간에 도달하지 못했다. 또한, 마우스의 20%(10마리 중 2마리)는 높은 Dex 군에서 희생되어야 했지만 INX234P 처리군에서는 모든 마우스가 생존하였다(관련 없는 초기 사건으로 인해 제외된 1마리 동물 제외). 제61일에 처리 종료 후 10일까지 INX234P 처리된 동물은 체중이 감소하기 시작하였다(도 123 및 도 124).
보다 구체적으로, 도 123의 실험에서, 마우스에게 INX234P 및 INX234 둘 다를 10㎎/㎏(및 해당하는 경우 0.2㎎/㎏의 INX P 링커 페이로드)으로 제0일부터 제61일까지 i.p.로 주 1회 투여였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=9인 INX234P 군을 제외하고 n=10/군).
도 124의 데이터는 고용량 덱사메타손 치료가 마우스 생존을 개선시켰음을 나타낸다. 실험에서 마우스에게 제0일부터 제61일까지 주 1회 2(고용량) 또는 0.2(저용량)㎎/㎏을 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=10/군).
실험 2
이 실험에서, 본 발명자들은 미경험 T 세포 전달 후 제21일에 치료를 시작함으로써 치료 효능을 제공하는 링커 페이로드 INX V에 접합된 항-VISTA의 능력을 평가하였다. 제42일, 제49일 및 제56일에 동물에게 INX234P를 제공한 후 나머지 치료 기간 동안 다시 INX234V로 전환하였다.
INX234V 치료는 생존을 개선시킨다.
도 125 및 도 126의 데이터에 나타난 바와 같이, INX234V로 처리된 동물의 체중은 실험 과정에서 꾸준히 증가한 반면(이는 정상임), 다른 모든 군은 처음 30일 동안 약간의 체중 증가 후에 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
보고 당시 대부분의 군에서 중간 생존율에 도달하지 못했지만 ADC 처리군에서 체중 감소가 없다는 사실은 극적으로 개선된 생존율로 해석될 가능성이 높다. 더욱이 놀랍게도 고용량 Dex를 처리한 군은 PBS군을 포함한 다른 모든 군에 비해 생존율이 감소한 것으로 나타났다(도 126).
도 125의 데이터는 INX234V 치료가 마우스 생존을 개선시킨다는 것을 나타낸다. 이 실험에서 마우스에게 제21일부터 제80일까지 주 1회 INX234V 및 INX234 모두에 대해 10㎎/㎏(및 해당되는 경우 0.2㎎/㎏의 INX V 링커 페이로드)을 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=5인 INX234 처리군을 제외하고 n=10/군).
도 126의 데이터는 저용량 덱사메타손 치료가 마우스 생존을 개선시킨다는 것을 나타낸다. 이 실험에서 마우스에게 제21일부터 제80일까지 주 1회 2(고용량) 또는 0.2(저용량)㎎/㎏을 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 평균 체중 변화를 초기 체중의 백분율로 나타내고; 3개의 하단 그래프는 개별 마우스의 체중 감소 %를 나타내고; 우측 상단 그래프는 Kaplan-Meyer 생존 곡선이고; 위(하단 그래프) 또는 아래(상단 그래프)의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=10/군).
INX234V 치료는 전달된 T 세포의 생존에 영향을 미치지 않고 이의 활성화를 제한한다.
대장염 발병은 전달된 미경험 CD4 T 세포의 확장 및 활성화에 의해 유발된다. 질환 발달을 모니터링하기 위해서, 매주 말초 혈액에서 T 세포 수 및 활성화 상태를 측정하였다. T 세포 활성화는 미경험 세포 마커인 CD45RB 발현의 손실로 측정되었다. 치료는 T 세포의 약 50%가 여전히 CD45RB+인 7일과 비교하여 CD45RB+ CD4 T 세포의 빈도에서 급격한 감소를 관찰한 제21일에 시작되었다(도 127, 하단 그래프). 치료를 위해 등록 시 동물을 무작위 배정하였다.
도 127에 도시된 바와 같이, PBS 대조군과 Dex 처리군 사이에 T 세포 수의 차이는 없었지만(우측 상단 그래프), INX234V 처리 마우스는 T 세포의 매우 일관된 제한된 확장을 나타내었다(좌측 상단 그래프). 비접합 항체로 처리한 군은 치료 첫 2주 동안에만 T 세포 수가 더 낮았다(우측 상단 그래프). 추가로 CD45RB+ T 세포 또는 미경험 T 세포의 빈도는 치료 시작 전 모든 군에서 제15일에서 제21일 사이에 극적으로 감소하였고; INX234V 치료는 생착된 총 T 세포의 20% 초과로 미경험 T 세포 집단의 유지를 허용한 반면(좌측 하단 그래프), 다른 모든 군은 10% 미만의 미경험 세포 빈도를 나타내었다(좌측 및 우측 하단 그래프).
도 127의 데이터는 INX234V 치료가 T 세포 확장 및 활성화를 방지한다는 것을 나타낸다. 이 실험에서 마우스에게 INX234V 또는 INX234를 10㎎/㎏(및 해당하는 경우 0.2㎎/㎏의 V 페이로드)으로 그리고 2(고용량) 또는 0.2(저용량)㎎/㎏의 Dex를 제21일부터 제80일까지 주 1회 i.p.로 투여하였다. 좌측 상단 그래프는 좌측에 INX234V 및 INX234 대 PBS에 대한 혈액으로부터의 미경험 T 세포 수를, 우측에는 고용량 및 저용량의 Dex 대 PBS에 대한 혈액으로부터의 미경험 T 세포 수를 나타내고; 좌측 및 우측 하단 그래프는 동일한 군에 대한 CD45RB+ CD4 T 세포의 빈도를 나타내고; 위의 회색 막대는 치료 기간을 나타낸다(SEM; n=5인 INX234 치료군을 제외하고 n=10/군).
결론
데이터는 INX234P 및 INX234V 둘 다는 하기에 기초하여 예방적 및 치료적 둘 다에서 Dex에 비해 우수한 효능을 가짐을 나타낸다:
1) 생착된 미경험 CD4 T 세포의 집단 유지
2) 극적으로 증가된 생존으로 입증된 질환으로부터의 보호.
또한, 데이터는 또한 질환 효과기 세포만을 독점적으로 표적화하는 것이 질환 발달을 예방하기에 충분하다는 것을 입증한다.
참고문헌
본 발명의 ADC의 예시적인 이점의 요약
본 출원에 개시된 실험 결과는, 본 발명의 ADC가 항-염증제, 특히 스테로이드의 면역 세포 내로의 내재화를 표적화하고 유도하기 위한 이전 ADC, 예를 들어, CD74, CD163, TNF 및 PRLR을 표적으로 하는 ADC와 비교하여 이점의 고유한 조합을 가짐을 나타내는데; 그 이유는 ADC 표적으로서 VISTA 및 본 발명의 ADC에 포함된 항-VISTA 항체의 특정 특성(생리 pH에서 VISTA 발현 면역 세포에 결합하고 매우 짧은 pK를 가짐)의 조합된 유익 때문이다.
이러한 이점은 하기를 포함한다:
1) 본 발명의 ADC는 예를 들어, 매우 높은 밀도로 VISTA를 발현하는 면역 세포에 결합하고, 이의 매우 짧은 PK에도 불구하고 연장된 기간(긴 PD를 보유함) 동안 효능이 있고(항-염증 활성을 발휘함), 따라서 만성 또는 간헐적 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하는 데 매우 적합하고, 연장되고 반복된 투여가 치료적으로 보증된다.
2) 본 발명의 ADC는 호중구, 골수, T 세포 및 내피세포를 비롯한 광범위한 면역 세포를 표적으로 하기 때문에 본 발명의 ADC는 이들 유형의 면역 세포 중 임의의 것 또는 모두와 관련된 질환인 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
3) 본 발명의 ADC는 신속하게(짧게는 2시간 이내) 효능이 개시되며 나타내므로 급성 치료에 사용될 수 있다.
1) 본 발명의 ADC는 B 세포에 결합하지 않으므로 유리 스테로이드만큼 면역 억제성이 아닐 것이다(즉, 체액성 면역은 유지될 것임). 이것은 잠재적으로 유리 스테로이드의 연장된 사용과 연관된 본 발명의 ADC의 만성 또는 연장된 사용 동안 독성 또는 유해 부작용을 감소시킬 것이다(예를 들어, 연장된 스테로이드 사용은 명확하게 연장된 면역억제의 이상 반응으로 인해서 일부 암, 감염 병태 및 다른 질환에 상관관계가 있음).
5) 본 발명의 ADC는 스테로이드 효능을 담당하는 중요한 면역 세포인 Treg에 작용한다.
6) 본 발명의 ADC는 휴지 및 활성화 면역 세포, 예컨대, 골수 세포, 단핵구, 호산구, 수지상 세포, Treg, CD8 T 세포, CD4 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 둘 다에 작용하고(구성적으로 발현됨); 결과적으로 본 발명의 ADC는 염증 및 자가면역 병태의 활성 및 완화 단계 둘 다에서 활성일 것이다(항-염증 활성을 유도함).
7) 본 발명의 ADC는 면역 세포가 급성 염증에 중요한 호중구에 작용하는데, 이는 ADC가 급성 염증을 치료하고, 예를 들어, 발병 초기, 이상적으로는 병리학적 증상이 나타나기 전에 만성 또는 간헐적 자가면역 또는 염증 병태의 활성 단계와 연관된 염증 발작을 제어하는 데 매우 적합하다는 것을 입증한다. 이것은 심지어는 대상체가 통증 또는 염증과 관련된 다른 증상을 경험하기 전에 발생할 수 있는 조직 손상을 잠재적으로 감소시킬 것이다.
8) 본 발명의 ADC는 면역 세포에 매우 신속하고 구성적으로 면역 세포에 내재화하는데, 그 이유는 VISTA 세포 표면 턴오버가 높기 때문이다.
9) 본 발명의 ADC는 매우 짧은 반감기(PK)를 보유하고 면역 세포에만 결합하기 때문에; 본 발명의 ADC는 표적 관련 독성 및 바람직하지 않은 말초 스테로이드 노출(낮은 비-특이적 손실 효과)이 없을 것이다.
10) 내부에 침묵 IgG를 보유하는 항-VISTA 항체가 면역학적 기능을 나타내지 않기 때문에(어떤 VISTA 생물학의 차단도 없음) 일부 실시형태에서 본 발명의 ADC의 생물학적 활성(항-염증 작용)은 전적으로 항-염증 페이로드(스테로이드)에 기인하고, 따라서 잠재적으로 투여를 단순화하고/하거나 예를 들어, VISTA 효능작용이 치료적으로 바람직하지 않을 수 있는 개체에서 유해 부작용을 잠재적으로 피할 수 있다.
11) 본 발명의 ADC의 생물학적 활성(항-염증 또는 면역억제 작용)은 일부 실시형태에서, 특히 항-VISTA 항체가 기능성 IgG2 영역을 포함하는 실시형태에서 항-염증 페이로드(스테로이드) 및 항-VISTA 항체의 Fc 부분 둘 다에 기인하는데, 그 이유는 기능성 기능성 IgG2를 보유하는 항-VISTA 항체가 VISTA 발현 면역 세포에 결합하면 VISTA의 면역억제 효과, 특히 T 세포 증식 및 T 세포 활성에 대한 이의 억제 효과를 효능작용하여 2개의 별개의 기전에 의해서 유도되는 면역억제 활성을 갖는 ADC를 제공하기 때문이다.
- 항-VISTA ADC의 이점
1) VISTA는 선택된 면역세포에서 고도로 발현됨
o 약물을 호중구, 골수, T 세포 및 내피세포에 표적화함
o B 세포에 결합하지 않으므로 유리 글루코코티코이드만큼 면역억제성이 아닐 수 있음
o Treg에서 발현됨(림프구에서 글루코코티코이드에 대한 주요 세포 유형 표적)
o 호중구에서 발현되는 유일한 표적 중 하나임(급성 염증에 중요)
o 빠르고 구성적으로 내재화됨
o VISTA 세포 표면 턴오버가 또한 높음
2) 항-VISTA는 짧은 반감기를 나타내므로 표적 관련 독성을 감소시키고 말초 GC 노출을 감소시킴(낮은 비-특이적 손실 효과)
3) 침묵 IgG는 면역학적 기능을 나타내지 않음(어떠한 VISTA 생물학적 차단도 없음)
o 다른 결합 항체 ADC 후보는 표적, 즉, CD74, CD163, TNF, PRLR에 독립적인 기능을 가짐
글루코코티코이드 링커 페이로드의 이점
INX P 계열(INX P, INX S)
1) 문헌 대응물에 비해 방출된 페이로드의 세포내 수준을 향상시킴
2) 대응물인 유리 페이로드가 유사한 효능을 갖지만 접합된 대응물 링커 페이로드에 비해 접합된 링커 페이로드의 효력을 향상시킴
3) 150mg/㎖에서 응집이 거의 또는 전혀 없이 8의 안정적인 약물 항체 비율을 허용함
o 안정적인 고농축 제형이 피하 투여 가능성을 허용함
INX V 계열(INX V, INX A3, INX A11, INX A7, INX A23, INX A12)
1) 문헌 대응물에 비해 방출된 페이로드의 세포내 수준을 크게 향상시킴
2) 접합된 링커 페이로드는 유사한 효력의 페이로드를 갖는 다른 접합된 링커 페이로드보다 효력이 향상됨
글루코코티코이드 항-VISTA ADC의 이점
1) 면역 세포 내로의 높은 내재화로 인해 글루코코티코이드의 긴 세포내 노출을 제공함
2) ADC의의 24시간 미만의 혈청 반감기로 인해 비면역 세포에 대한 GC의 노출이 제한됨
3) 글루코코티코이드 경로의 더 높은 효력으로 인해서 투여가 개선되어 약물의 제한된 세포내 대사를 초래함
4) 150mg/㎖에서 응집이 거의 또는 전혀 없이 8의 안정적인 약물 항체 비율
o 안정적인 고농축 제형이 피하 투여 가능성을 허용함
본 실시예에 언급된 참고문헌
하기 참고 문헌 및 본 출원에 언급된 참고문헌은 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다.
서열 목록 정보
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Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 840 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INX237_HC <400> 840 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Asn Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Thr Phe Asp Gly Leu Phe Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Arg Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 841 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INX237_LC <400> 841 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Val Asp Lys Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Arg Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu 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Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Val Ser Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Arg Asp 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Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Ile 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (132)

  1. 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 글루코코티코이드 효능제(glucocorticoid agonist) 화합물 또는 달리 명시되지 않는 한, 모든 가능한 입체이성질체:

    화학식 (I)
    상기 식에서,
    X는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반(cubane)으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되고;
    Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반(cubane)으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되며;
    Y는 CHR1, O, S 및 NR1로부터 선택되고;
    E는 CH2 및 O로부터 선택되며;
    G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
    추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아니며;
    X에 대한 G의 연결부는 선택적으로 C1-3 알킬 및 에틸렌 옥사이드로부터 선택될 수 있고, 이들 각각은 N, S 및 O으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬로 추가로 치환되고;
    Z에 대한 X의 연결부는 X 및 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있고;
    치환체 NR1R2는 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있으며;
    R1은 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택되되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
    R1이 H인 경우, R2는 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택될 수 있되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
    R1이 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬 또는 헤테로아릴인 경우, R2는 하기로부터 선택된 작용기일 수 있고:
    [(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J,
    (C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-V-J,
    (C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J, 및
    [V]k-(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-J
    상기 식에서, m = 1-6이고, k = 0-1이며, W의 각각의 순열은 독립적으로 H, R3에서 종결되는 분지형 알킬 쇄인 [(CH2)nR3](식에서, n = 1-4임) 및 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기로부터 선택될 수 있고;
    R3은 H, 메틸, 에틸, 아이소프로필, OH, O-알킬, NH2, NH-알킬, N-다이알킬, SH, S-알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴 치환체는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택될 수 있고;
    V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
    J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,

    로부터 선택된 반응성 기이고
    R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이며;
    R5는 -CH2OH, -CH2SH, -CH2Cl, -SCH2Cl, -SCH2F, -SCH2CF3, 하이드록시, -OCH2CN, -OCH2Cl, -OCH2F, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH2CN, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R6 및 R7은 수소 및 C1-10 알킬로부터 독립적으로 선택되며;
    Q는 H, , C(O)R8(식 중, R8은 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬임) 또는 (C=O)NR4CHnNR4(C=O)OCH2-(V)n-J(식 중, n=1-4이고 R4 =H, 알킬 또는 분지형 알킬임) 또는 P(O)OR4일 수 있고,
    A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, X 및 Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, [1.1.1]바이사이클로펜탄 및 바이사이클로 [2.2.2]옥탄으로부터 독립적으로 선택되고; Y는 CH2 및 O로부터 선택되며; W의 순열은 CH2CH2CO2H 및 H로부터 독립적으로 선택되고, 추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아닌, 글루코코티코이드 효능제 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 실시예 3에 개시된 글루코코티코이드 효능제 화합물 중 임의의 것으로부터 선택되거나 INX J 및 INX L을 제외한 도 11 또는 도 118A 내지 도 118O에 제시된 것으로부터 선택된 글루코코티코이드 효능제 화합물.
  4. INX J 및 INX L을 제외한 본 명세서에 개시된 INX-스테로이드 페이로드, INX-스테로이드 링커 및 INX-항체 약물 접합체(antibody drug conjugate: ADC) 화합물로부터 선택된 글루코코티코이드 효능제 화합물.
  5. 하기로부터 선택된 글루코코티코이드 효능제 화합물:
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 펩타이드 및/또는 비-펩타이드 링커(즉, "스테로이드-링커 페이로드" 또는 "글루코코티코스테로이드-링커 페이로드")에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된, 글루코코티코이드 효능제 화합물.
  7. 화합물(스테로이드-링커 페이로드)로서, 적어도 하나의 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 링커("L"), 선택적으로 상기 화합물에서 링커를 항체 또는 항체 단편에 연결하는 데 선택적으로 사용되는 화학 모이어티인 "헤테로이작용기" 또는 "헤테로삼작용기"인 "Q" 및 적어도 1종의 항-염증제(anti-inflammatory agent: "AI")를 포함하되, AI는 하기 구조로 표현될 수 있는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물인, 화합물(스테로이드 링커 페이로드):
    Q-L-AI 또는 AI-L-Q.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 링커는 본 명세서에 개시된 것 또는 도 118A 내지 도 118E의 스테로이드-링커 화합물에 도시된 것 중 임의의 것으로부터 선택되는, 스테로이드-링커 페이로드.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, PAB로부터 선택된 적어도 하나의 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 링커 및/또는 아미노산 또는 펩타이드, 선택적으로 1 내지 12개의 아미노산, 추가로 선택적으로 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 쿼트라펩타이드, 펜타펩타이드 및 추가로 선택적으로 Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, Phe, Cit, Val, Val-Cit, Val-Ala, Val-Gly, Val-Gln, Ala-Val, Cit-Cit, Lys-Val-Cit, Asp-Val-Ala, Ala-Ala-Asn, Asp-Val-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Asn-Val, 베타Ala-Leu-Ala-Leu, Lys-Val-Ala, Val-Leu-Lys, Asp-Val-Cit, Val-Ala-Val 및 Ala-Ala-Asn; 또는 선택적으로 GlcA, PAB 및 Glu-Gly 중 적어도 하나를 포함하는, 스테로이드-링커 페이로드.
  10. 스테로이드-링커 페이로드로서, 글루코코티코이드 효능제 스테로이드 화합물에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 적어도 하나의 절단 가능한 링커 및/또는 희생 링커(immolative linker)를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제 화합물을 포함하는 스테로이드-링커 페이로드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, INX J 및 INX L을 제외한 실시예 3 또는 도 118A 내지 도 118O에 개시된 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 페이로드 화합물 중 임의의 것으로부터 선택되는, 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 페이로드.
  12. 하기로부터 선택되는, 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체:
    (i) INX-SM-3-GluGly-알콕시아민, INX-SM-4-GluGly-알콕시아민, INX-SM-53-GluGly-알콕시아민, INX-SM-54-GluGly-알콕시아민, INX-SM-56-GluGly-알콕시아민, INX-SM-98-GluGly-알콕시아민, INX-SM-6-GluGly-알콕시아민, INX-SM-2-GluGly-알콕시아민, INX-SM-57-GluGly-알콕시아민, INX-SM-31-GluGly-알콕시아민, INX-SM-32-GluGly-알콕시아민, INX-SM-10-GluGly-알콕시아민, INX-SM-40-GluGly-알콕시아민, INX-SM-34-GluGly-알콕시아민, INX-SM-28-GluGly-알콕시아민, INX-SM-27-GluGly-알콕시아민, INX-SM-35-GluGly-알콕시아민, INX-SM-8-GluGly-알콕시아민, INX-SM-7-GluGly-알콕시아민, INX-SM-33-GluGly-알콕시아민 또는 Glu-Gly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (ii) INX-SM-53-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-3-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-54-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-1-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-4-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-2-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-47-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-7-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-8-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-56-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-32-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-6-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-10-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-33-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-31-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-35-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-9-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-28-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-27-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-34-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-35-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-40-GluGly-브로모아세틸 또는 Glu-Gly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (iii) INX-SM-53-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-1-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-4-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-54-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-7-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-8-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-2-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-57-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-40-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-34-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-28-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-27-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-35-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-9-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-10-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-31-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-32-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-33-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-56-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-6-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-3-GluGly-다이벤조사이클로옥틴 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (iv) INX-SM-1-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-31-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-32-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-33-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-53-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-7-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-8-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-2-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-56-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-6-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-54-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-4-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-53-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-3-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-9-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-40-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-34-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-28-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-34-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-28-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-27-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-35-GluGly-NHS 에스터; INX-SM-10-GluGly-NHS 에스터 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체;
    (v) INX-SM-1-GluGly-말레이미드, INX-SM-3-GluGly-말레이미드, INX-SM-4-GluGly-말레이미드, INX-SM-8-GluGly-말레이미드, INX-SM-2-GluGly-말레이미드, INX-SM-7-GluGly-말레이미드, INX-SM-56-GluGly-말레이미드, INX-SM-6-GluGly-말레이미드, INX-SM-54-GluGly-말레이미드, INX-SM-53-GluGly-말레이미드, INX-SM-33-GluGly-말레이미드, INX-SM-35-GluGly-말레이미드, INX-SM-40-GluGly-말레이미드, INX-SM-34-GluGly-말레이미드, INX-SM-28-GluGly-말레이미드, INX-SM-27-GluGly-말레이미드, INX-SM-35-GluGly-말레이미드, INX-SM-9-GluGly-말레이미드, INX-SM-10-GluGly-말레이미드, INX-SM-31-GluGly-말레이미드, INX-SM-32-GluGly-말레이미드, INX-SM-57-GluGly-말레이미드 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (vi) INX-SM-3-GluGly-테트라진, INX-SM-53-GluGly-테트라진, INX-SM-1-GluGly-테트라진, INX-SM-54-GluGly-테트라진, INX-SM-6-GluGly-테트라진, INX-SM-56-GluGly-테트라진, INX-SM-4-GluGly-테트라진, INX-SM-10-GluGly-테트라진, INX-SM-31-GluGly-테트라진, INX-SM-32-GluGly-테트라진, INX-SM-33-GluGly-테트라진, INX-SM-7-GluGly-테트라진, INX-SM-8-GluGly-테트라진, INX-SM-9-GluGly-테트라진, INX-SM-27-GluGly-테트라진, INX-SM-35-GluGly-테트라진, INX-SM-2-GluGly-테트라진, INX-SM-40-GluGly-테트라진, INX-SM-34-GluGly-테트라진, INX-SM-28-GluGly-테트라진, INX-SM-27-GluGly-테트라진 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (vii) INX-SM-6-GluGly-아민, INX-SM-54-GluGly-아민, INX-SM-4-GluGly-아민, INX-SM-53-GluGly-아민, INX-SM-2-GluGly-아민, INX-SM-56-GluGly-아민, INX-SM-57-GluGly-아민, INX-SM-35-GluGly-아민, INX-SM-27-GluGly-아민, INX-SM-40-GluGly-아민, INX-SM-34-GluGly-아민, INX-SM-28-GluGly-아민, INX-SM-35-GluGly-아민, INX-SM-9-GluGly-아민, INX-SM-10-GluGly-아민, INX-SM-31-GluGly-아민, INX-SM-32-GluGly-아민, INX-SM-33-GluGly-아민, INX-SM-7-GluGly-아민, INX-SM-8-GluGly-아민, INX-SM-1-GluGly-아민, INX-SM-3-GluGly-아민 또는 GluGly가 상이한 절단 가능한 펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (viii) INX-SM-53-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-1-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-3-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-2-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-56-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-35-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-25-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-27-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-35-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-9-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-10-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-31-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-32-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-33-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-57-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-7-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-8-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-6-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-54-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-4-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-40-PAB-GluGly-알콕시아민, INX-SM-34-PAB-GluGly-알콕시아민 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (ix) INX-SM-1-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-3-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-2-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-7-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-8-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-40-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-56-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-6-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-154PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-4-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-33-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX- PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-32-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-10-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-34-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-31-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-9-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-28-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-27-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-35-PAB-GluGly-브로모아세틸, INX-SM-53-PAB-GluGly-브로모아세틸 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (x) INX-SM-6-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-54-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-4-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-53-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-1-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-7-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-8-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-2-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-56-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-57-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-33-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-32-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-31-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-3-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-9-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-27-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-35-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-34-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-28-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-40-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-10-PAB-GluGly-다이벤조사이클로옥틴 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xi) INX-SM-56-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-54-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-4-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-53-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-1-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-3-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-33-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-57-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-7-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-8-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-27-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-35-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-9-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-10-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-31-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-32-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-40-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-34-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-28-PAB-GluGly-NHS 에스터, INX-SM-2-PAB-GluGly-NHS 에스터 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xii) INX-SM-1-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-53-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-5-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-2-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-8-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-56-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-54-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-4-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-57-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-7-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-32-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-31-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-53-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-3-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-34-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-28-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-40-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-27-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-35-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-9-PAB-GluGly-말레이미드, INX-SM-10-PAB-GluGly-말레이미드 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xiii) INX-SM-6-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-54-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-4-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-53-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-1-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-3-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-57-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-7-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-8-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-2-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-31-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-32-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-33-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-56-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-35-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-9-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-40-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-34-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-28-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-27-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-35-PAB-GluGly-테트라진, INX-SM-10-PAB-GluGly-테트라진 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xiv) INX-SM-1-PAB-GluGly-아민, INX-SM-3-PAB-GluGly-아민, INX-SM-8-PAB-GluGly-아민, INX-SM-2-PAB-GluGly-아민, INX-SM-56-PAB-GluGly-아민, INX-SM-6-PAB-GluGly- 또는 화학식 I, II 또는 III 아민에 따른 것, INX-SM-54-PAB-GluGly-아민, INX-SM-4-PAB-GluGly-아민, INX-SM-53-PAB-GluGly-아민, INX-SM-33-PAB-GluGly-아민, INX-SM-53-PAB-GluGly-아민, INX-SM-7-PAB-GluGly-아민, INX-SM-9-PAB-GluGly-아민, INX-SM-35-PAB-GluGly-아민, INX-SM-40-PAB-GluGly-아민, INX-SM-34-PAB-GluGly-아민, INX-SM-28-PAB-GluGly-아민, INX-SM-27-PAB-GluGly-아민, INX-SM-35-PAB-GluGly-아민, INX-SM-10-PAB-GluGly-아민, INX-SM-31-PAB-GluGly-아민, INX-SM-32-PAB-GluGly-아민 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xv) INX-SM-1-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-35-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-9-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-10-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-54-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-31-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-32-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-33-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-57-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-7-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-8-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-2-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-56-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-6-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-4-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-53-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-27-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-40-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-34-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-28-PAB-GlcA-알콕시아민, INX-SM-3-PAB-GlcA-알콕시아민 또는 GlcA 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xvi) INX-SM-3-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-4-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-56-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-54-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-4-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-53-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-7-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-8-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-2-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-40-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-57-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-33-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-10-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-34-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-31-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-32-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-35-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-9-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-28-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-27-PAB-GlcA-브로모아세틸, INX-SM-1-PAB-GlcA-브로모아세틸 또는 GluGly 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xvii) INX-SM-4-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-54-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-1-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-54-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-33-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-57-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-7-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-8-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-2-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-5-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-6-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-35-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-9-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-10-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-31-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-32-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-27-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-35-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-28-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-34-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-40-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴, INX-SM-3-PAB-GlcA-다이벤조사이클로옥틴 또는 GlcA 및/또는 PAB 링커가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xviii) INX-SM-3-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-53-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-4-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-56-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-54-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-8-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-2-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-7-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-57-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-32-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-33-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-31-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-9-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-10-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-35-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-27-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-28-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-40-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-34-PAB-GlcA-NHS 에스터, INX-SM-1-PAB-GlcA-NHS 에스터 또는 GlcA 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xix) INX-SM-3-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-4-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-53-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-31-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-32-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-33-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-53-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-7-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-8-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-2-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-56-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-6-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-54-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-1-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-9-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-35-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-27-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-28-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-34-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-40-PAB-GlcA-말레이미드, INX-SM-10-PAB-GlcA-말레이미드 또는 GlcA 및/또는 PAB가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xx) INX-SM-33-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-57-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-7-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-8-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-2-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-56-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-6-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-54-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-4-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-9-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-35-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-27-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-28-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-34-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-40-PAB-GlcA-테트라진, INX-SM-10-PAB-GlcA-테트라진 또는 GlcAy 및/또는 PAB 링커가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xxi) INX-SM-1-PAB-GlcA-아민, INX-SM-3-PAB-GlcA-아민, INX-SM-53-PAB-GlcA-아민, INX-SM-6-PAB-GlcA-아민, INX-SM-54-PAB-GlcA-아민, INX-SM-8-PAB-GlcA-아민, INX-SM-2-PAB-GlcA-아민, INX-SM-56-PAB-GlcA-아민, INX-SM-4-PAB-GlcA-아민, INX-SM-35-PAB-GlcA-아민, INX-SM-8-PAB-GlcA-아민, INX-SM-10-PAB-GlcA-아민, INX-SM-31-PAB-GlcA-아민, INX-SM-32-PAB-GlcA-아민, INX-SM-33-PAB-GlcA-아민, INX-SM-57-PAB-GlcA-아민, INX-SM-27-PAB-GlcA-아민, INX-SM-35-PAB-GlcA-아민, INX-SM-34-PAB-GlcA-아민, INX-SM-28-PAB-GlcA-아민, INX-SM-40-PAB-GlcA-아민, INX-SM-7-PAB-GlcA-아민 또는 GlcA 및/또는 PAB 링커가 상이한 절단 가능한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커로 치환되고/되거나 또 다른 INX 또는 INX-SM 페이로드가 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III에 따른 것으로부터 선택적으로 선택된 그에 포함된 INX-SM 페이로드 대신 치환된 또 다른 글루코코티코이드 효능제(페이로드)-링커 접합체; 또는
    (xxii) 알콕시아민-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3 또는 알콕시아민-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 동일한 또는 상이한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커를 포함하고 링커가 C11-OH를 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드에 부착된 다른 INX 링커 페이로드;
    (xxiii) 브로모아세틸-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3 또는 브로모아세틸--GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고/되거나 동일한 또는 상이한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커를 포함하고 링커가 C11-OH를 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드에 부착된 다른 INX 링커 페이로드;
    (xxiv) 다이벤조사이클로옥틴-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3 또는 다이벤조사이클로옥틴-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고/되거나 동일한 또는 상이한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커를 포함하고 링커가 C11-OH를 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드에 부착된 다른 INX 링커 페이로드;
    (xxv) 테트라진-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 테트라진 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고/되거나 동일한 또는 상이한 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커를 포함하고 링커가 C11-OH를 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드에 부착된 다른 INX 링커 페이로드;
    (xxvi) 알콕시아민-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 알콕시아민 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고/되거나 동일한 또는 상이한 링커를 포함하고 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 다른 INX 링커 페이로드;
    (xxvii) 브로모아세틸-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 브로모아세틸-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고/되거나 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드를 포함하는 다른 INX 링커 페이로드;
    (xxviii) 말레이미드-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 말레이미드-GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고/되거나 동일한 또는 상이한 링커를 포함하고 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 다른 INX 링커 페이로드;
    (xxix) 다이벤조사이클로옥틴-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 다이벤조사이클로옥틴 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고/되거나 동일한 또는 상이한 링커를 포함하고 링커가 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드에 부착된 다른 INX 링커 페이로드;
    (xxx) 테트라진-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 테트라진 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고/되거나 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드를 포함하는 다른 INX 링커 페이로드; 및
    (xxxi) 아민-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 아민 -GlyGlu-PAB-DMEDA-INX-SM3, 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 C17을 통해서 동일한 또는 상이한 INX 스테로이드 페이로드를 포함하는 다른 INX 링커 페이로드.
  13. 하기로부터 선택된 항체 약물 접합체(ADC):
    (i) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(알콕시아민 + 케톤 접합(C11-OH 연결됨), 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 다른 INX-SM 페이로드가 알콕시아민 + 케톤 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (ii) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합(C11-OH 연결됨), 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 INX-SM 페이로드가 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (iii) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(할로아세틸 + 시스테인 접합(C11-OH 연결됨), 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (iv) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(말레이미드 + 시스테인 접합(C11-OH 연결됨), 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (v) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합(C11-OH 연결됨), 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (vi) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(알콕시아민 + 케톤 접합(C11-OH 연결됨), 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 알콕시아민 + 케톤 접합을 통해서 항체에 접합되고 C11-OH 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (vii) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합(C17 연결됨)), 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 케톤 접합을 통해서 항체에 접합되고 C17 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (viii) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(할로아세틸 + 시스테인 접합(C17 연결됨)), 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 C17 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (ix) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합(C17 연결됨)), 또는 INX-SM 링커 페이로드가 테트라진 + 트랜스-사이클로옥텐 접합을 통해서 항체에 접합되고 C17 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (x) Ab-Gly-Glu-PAB-DMEDA-INX-3 또는 Ab-GlcA-PAB-DMEDA-INX-SM-3(트랜스 글루타미나제를 사용한 아민 + 글루타민 접합(C17 연결됨)), 또는 INX-SM 링커 페이로드가 트랜스 글루타미나제를 사용한 아민 + 글루타민 접합을 통해서 항체에 접합되고 C17 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xi) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(알콕시아민 및 케톤 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 알콕시아민 및 케톤 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xii) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(할로아세틸 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 할로아세틸 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xiii) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 아자이드 + 다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xiv) INX-SM-3-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-Glu-Gly-Ab(N-하이드록시석신이미드 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 N-하이드록시석신이미드 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xv) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(아자이드 +다이벤조사이클로옥틴 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 아자이드 +다이벤조사이클로옥틴 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xvi) INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(N-하이드록시석신이미드 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 N-하이드록시석신이미드 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xvii) INX-SM-3-Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab(말레이미드 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 말레이미드 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xviii) INX-SM-3-Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(트랜스-사이클로옥텐 + 테트라진 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 트랜스-사이클로옥텐 + 테트라진 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC;
    (xix) INX-SM-3-Glu-Gly-Ab 또는 INX-SM-3-PAB-Glu-Gly-Ab 또는 IX-SM-3-PAB-GlcA-Ab(아민 접합)(N-연결된 페이로드) 또는 INX-SM3이 도 118A 내지 도 118O의 것 또는 화학식 I, II 또는 III 페이로드의 또 다른 화합물로부터 선택된 페이로드 대신 치환되고 트랜스-사이클로옥텐 + 테트라진 접합을 통해서 항체에 접합되고 N 연결된 상이한 INX-SM 페이로드를 포함하는 또 다른 ADC.
  14. 하기로부터 선택된 항체 약물 접합체(ADC):
    (I)
    [상기 식에서,
    Ab = 항체, 바람직하게는 생리 pH에서 인간 면역 세포에 결합하는 항체, 바람직하게는 인간 VISTA 면역 세포에 결합하는 항-VISTA 항체이고;
    L = 링커이며;
    AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
    NH페이로드 = 이며;
    REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨];
    (II)
    [Ab = 항체이고;
    L = 링커이며;
    AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
    NH페이로드 = 이며;
    REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨];
    (III)
    [Ab = 항체이고;
    L = 링커이며;
    AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이거나 존재하지 않고;
    NH페이로드 = 이며;
    REG는 수소, 알킬, 바이페닐, -CF3, -NO2, -CN, 플루오로, 브로모, 클로로, 알콕실, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    RT= AA 또는 임];
    (IV)
    [Ab = 항체, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체이고;
    L = 링커이며;
    AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이고;
    O페이로드 = 또는
    임];
    (V)
    [Ab = 항체이고;
    L = 링커이며;
    AA = 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 서열이거나 존재하지 않고;
    O페이로드 = 또는
    이고;
    RT= AA 또는 임].
  15. 제14항에 있어서, 상기 링커는 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 펩타이드 또는 희생 링커를 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC).
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, PAB 및/또는 아미노산 또는 펩타이드, 선택적으로 1 내지 12개의 아미노산, 추가로 선택적으로 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 쿼트라펩타이드, 펜타펩타이드 및 추가로 선택적으로 Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, Phe, Cit, Val, Val-Cit, Val-Ala, Val-Gly, Val-Gln, Ala-Val, Cit-Cit, Lys-Val-Cit, Asp-Val-Ala, Ala-Ala-Asn, Asp-Val-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Asn-Val, 베타Ala-LeuAla-Leu, Lys-Val-Ala, Val-Leu-Lys, Asp-Val-Cit, Val-Ala-Val 및 Ala-Ala-Asn으로부터 선택되는 링커를 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC).
  17. 하기 구조로부터 선택되는 스테로이드 항체 접합체 화합물:

    상기 식에서, n = 2-12, 2-10, 2=8, 2-6, 2-4이고, A는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편, 보다 바람직하게는 항-인간 VISTA 항체이다.
  18. 하기 화학식 (I)의 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 달리 명시되지 않는 한, 모든 가능한 입체이성질체:

    화학식 (I)
    상기 식에서,
    X는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되고;
    Z는 페닐, 스피로[3.3]헵탄, 3 내지 6원 헤테로사이클, 사이클로알킬, 스피로-알킬, 스피로-헤테로사이클로알킬, 바이사이클릭 알킬, 헤테로바이사이클릭 알킬, [1.1.1]바이사이클로펜탄, 바이사이클로 [2.2.2]옥탄, 아다만탄 및 쿠반(쿠반e)으로부터 선택되고, 이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 골격 헤테로원자를 함유할 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬로 추가로 치환되며;
    Y는 CHR1, O, S 및 NR1로부터 선택되고;
    E는 CH2 및 O로부터 선택되며;
    G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
    추가로 G가 CH이고 X가 페닐인 경우, Z는 페닐이 아니며;
    X에 대한 G의 연결부는 선택적으로 C1-3 알킬 및 에틸렌 옥사이드로부터 선택될 수 있고, 이들 각각은 N, S 및 O으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬로 추가로 치환되고;
    Z에 대한 X의 연결부는 X 및 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있고;
    치환체 NR1R2는 Z 상의 임의의 가능한 위치를 점유할 수 있으며;
    R1은 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택되되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
    R1이 H인 경우, R2는 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴 및 헤테로아릴기로부터 선택될 수 있되, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있고;
    R1이 H, 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬 또는 헤테로아릴인 경우, R2는 하기로부터 선택된 작용기일 수 있고:
    [(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J,
    (C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-V-J,
    (C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-[V]k-J, 및
    [V]k-(C=O)OCH2-p-아미노페닐-N-[(C=O)CH(W)NH]m-[C=O]-J,
    상기 식에서, m = 1-6이고, k = 0-1이며, W의 각각의 순열은 독립적으로 H, R3에서 종결되는 분지형 알킬 쇄인 [(CH2)nR3](식에서, n = 1-4임) 및 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기로부터 선택될 수 있고;
    R3은 H, 메틸, 에틸, 아이소프로필, OH, O-알킬, NH2, NH-알킬, N-다이알킬, SH, S-알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴 치환체는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -O-알킬, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)- 및 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택될 수 있고;
    V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
    J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,

    로부터 선택된 반응성 기이고
    R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이며;
    R5는 -CH2OH, -CH2SH, -CH2Cl, -SCH2Cl, -SCH2F, -SCH2CF3, 하이드록시, -OCH2CN, -OCH2Cl, -OCH2F, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH2CN, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R6 및 R7은 수소 및 C1-10 알킬로부터 독립적으로 선택되며;
    Q는 H, , C(O)R8(식 중, R8은 1 내지 8개 탄소의 선형 또는 분지형 알킬임) 또는 (C=O)NR4CHnNR4(C=O)OCH2-(V)n-J(식 중, n=1-4이고 R4 =H, 알킬 또는 분지형 알킬임) 또는 P(O)OR4일 수 있고;
    A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택된다.
  19. 제18항에 있어서, Z는 하기로부터 선택되고

    이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬기로 추가로 치환되고;
    이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 골격 헤테로원자를 함유할 수 있으며;
    각각의 는 화학식의 나머지에 대한 부착점을 나타내고, 상기 부착점 각각은 N, S 및 O로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 통해서 화학식의 나머지에 공유 결합될 수 있는, 화합물.
  20. 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Z-NR1은 하기로부터 선택되고:
    ,
    이들 각각은 F, Cl, Br, I, N, S 및 O로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자로 치환될 수 있고, 선택적으로 1 내지 4개의 C1-3 알킬 또는 C1-3 퍼플루오로알킬기로 추가로 치환되고;
    이들 각각의 고리 구조는 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 추가적인 골격 헤테로원자를 함유할 수 있으며;
    각각의 는 화학식의 나머지에 대한 부착점을 나타내고, 상기 부착점 각각은 N, S 및 O로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 통해서 화학식의 나머지에 공유 결합될 수 있는, 화합물.
  21. 제18항에 있어서, 화학식 (II)의 구조를 보유하는, 화합물:

    화학식 (II)
    상기 식에서,
    Y는 CH2 및 O로부터 선택되며;
    E는 CH2 및 O로부터 선택되며;
    G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
    L은 H 및 F로부터 선택되고;
    R5는 -CH2OH, -SCH2F 및 로부터 선택되고;
    A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되며;
    V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있고;
    J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,


    로부터 선택된 반응성 기이며;
    R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이다.
  22. 제18항에 있어서, 화학식 (III)의 구조를 보유하는, 화합물:

    화학식 (III)
    상기 식에서,
    Y는 CH2 및 O로부터 선택되며;
    E는 CH2 및 O로부터 선택되고;
    G는 CH 및 N으로부터 선택되며;
    L은 H 및 F로부터 선택되고;
    R5는 -CH2OH, -SCH2F 및 로부터 선택되며;
    A1 및 A2는 H 및 F로부터 독립적으로 선택되며;
    V는 1 내지 8개 탄소의 알킬쇄; 1 내지 13개의 단위를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 옥사이드기; 1 내지 8개의 탄소를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기; -O-알킬; 카복실산; 카복스아마이드; 카복실 에스터; 알킬-C(O)O-; 알킬아미노-C(O)-; 다이알킬아미노C(O)-; 1 내지 3개의 아미노산 서열(각각의 아미노산은 Glu, Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, 베타Ala, Phe, Val, 및 Cit으로부터 독립적으로 선택됨); 아릴; 및 헤테로아릴기(상기 아릴 및 헤테로아릴기는 알킬, 할로알킬, 할로겐, 바이페닐, 나이트로, 나이트릴, -OH, -NH2, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 티올, 티오알킬, 구아니딘, 유레아, 카복실산, 알콕실, 카복스아마이드, 카복실 에스터, 알킬-C(O)O-, 알킬아미노-C(O)-, 다이알킬아미노C(O)-로부터 선택된 작용기로 치환될 수 있음)로부터 선택될 수 있으며;
    J는 -NH2, N3, 티오, 사이클로옥틴, -OH, -CO2H, 트랜스-사이클로옥텐, 알킨일, 프로파길,

    로부터 선택된 반응성 기이며;
    R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 및 토실레이트로부터 선택되고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-석신이미딜, -O-(4-나이트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐로부터 선택되고, R34는 H, Me, 테트라진-H 및 테트라진-Me이다.
  23. 제18항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는, 화합물:



  24. 제18항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, X 또는 Z는 스피로[3.3]헵탄 또는 [1.1.1]바이사이클로펜탄일 수 있고, Y는 CH2 또는 O일 수 있는, 화합물.
  25. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC), 바람직하게는 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하는 ADC로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따르거나 또는 도 118A 내지 도 118O에 제시된 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커에 부착되는, ADC.
  26. 제25항에 있어서, 하기로부터 선택되는, ADC:




    바람직하게는 상기 식에서, n = 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6 또는 2 내지 4이고, A는 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하는 항체, 바람직하게는 항-인간 VISTA 항체이다.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 글루코코티코이드 효능제를 포함하는 스테로이드-링커 페이로드로서, 상기 링커는 본 명세서에 개시되거나 실시예에 예시된 것 또는 도 118A 내지 도 118O 및 도 11에 제시된 화합물 중 임의의 것으로부터 선택되는, 스테로이드-링커 페이로드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 글루코코티코이드 효능제를 포함하는 스테로이드-링커 페이로드로서, PAB로부터 선택된 적어도 하나의 절단 가능한 또는 절단 가능하지 않은 링커 및/또는 아미노산 또는 펩타이드, 선택적으로 1 내지 12개의 아미노산, 추가로 선택적으로 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 쿼트라펩타이드, 펜타펩타이드 및 추가로 선택적으로 Gly, Asn, Asp, Gln, Leu, Lys, Ala, Phe, Cit, Val, Val-Cit, Val-Ala, Val-Gly, Val-Gln, Ala-Val, Cit-Cit, Lys-Val-Cit, Asp-Val-Ala, Ala-Ala-Asn, Asp-Val-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Asn-Val, 베타Ala-Leu-Ala-Leu, Lys-Val-Ala, Val-Leu-Lys, Asp-Val-Cit, Val-Ala-Val 및 Ala-Ala-Asn; 또는 선택적으로 GlcA, PAB 및 Glu-Gly 중 적어도 하나를 포함하는, 스테로이드-링커 페이로드.
  29. 스테로이드-링커 페이로드로서, 글루코코티코이드 효능제 스테로이드 화합물에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 적어도 하나의 절단 가능한 링커 및/또는 희생 링커를 포함하는, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제 화합물을 포함하는 스테로이드-링커 페이로드.
  30. 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 면역 세포에 의해서 발현되는 항원, 바람직하게는 인간 면역 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 것을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제 또는 스테로이드-링커 화합물에 부착되는, ADC.
  31. 제30항에 있어서, 하기로부터 선택되는, ADC:





    바람직하게는 상기 식에서, n = 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6 또는 2 내지 4이고, A는 면역 세포, 바람직하게는 인간 면역 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하는 항체, 바람직하게는 항-인간 VISTA 항체이다.
  32. 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 접합체 또는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 ADC 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 투여를 필요로 하는 대상체에게 생체내 투여하기에 적합한, 조성물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 적어도 1종의 부형제를 포함하는, 조성물.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 안정화제 또는 완충제를 포함하는, 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 주사에 의한 비경구 투여에 적합한, 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 정맥내, 피하, 근육내, 종양내, 림프절내(intranodal), 비강내 또는 척추강내를 통해서, 주사를 필요로 하는 대상체에게 주사하기에 적합한 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 피하로 투여 가능한, 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 주사기, 주사 장치, 주입 펌프, 인젝터 펜, 무바늘 장치(needleless device), 오토인젝터(autoinjector) 및 피하 패치 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 피하 투여를 제공하는 장치에 포함된, 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 환자에게 고정 용량의 글루코코티코이드 수용체 효능제를 전달하는, 장치.
  41. 염증 또는 자가면역의 치료, 예방 또는 저해를 필요로 하는 대상체에서 염증 또는 자가면역을 치료, 예방 또는 저해하기 위한 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 접합체 또는 ADC 또는 이를 함유하는 조성물의 용도.
  42. 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 반응의 치료, 예방 또는 저해를 필요로 하는 대상체에서 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 반응을 치료, 예방 또는 저해하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 접합체 또는 ADC 또는 이를 함유하는 조성물.
  43. 치료 및/또는 예방 방법으로서, 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 글루코코티코이드 효능제 화합물 또는 스테로이드-링커 접합체 또는 ADC 또는 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 이를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기, 자가면역, 이식, 유전자 요법, 염증, GVHD 또는 패혈증의 치료, 또는 인간 대상체에서 상기 병태 중 임의의 것과 연관된 염증, 자가면역 또는 알레르기 부작용의 치료 또는 예방을 위한, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 사용을 위한, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 사용을 위한, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 유지 요법을 위한, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 또는 만성 염증 및 이와 연관된 자가면역 및 염증 적응증의 치료 또는 예방을 위한 것이되, 병태는 선택적으로 특히 후천성 재생불량성 빈혈 +, 후천성 혈우병 +, 급성 파종성 뇌척수염(Acute disseminated encephalomyelitis: ADEM) +, 급성 출혈성 뇌백질염(Acute hemorrhagic leukoencephalitis: AHLE)/허스트병(Hurst's disease) +, 무감마글로불린혈증, 1차 +, 원형 탈모증 +, 강직성 척추염(AS), 항-NMDA 수용체 뇌염 +, 항인지질 증후군(APS) +, 동맥경화증, 자폐 스펙트럼 장애(ASD), 자가면역 애디슨병(AAD) +, 자가면역 자율신경실조증/자가면역 자율 신경절증(AAG), 자가면역 뇌염 +, 자가면역 위염, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA) +, 자가면역 간염(AIH) +, 자가면역 고지혈증, 자가면역 뇌하수체염/림프구성 뇌하수체염 +, 자가면역 내이 질환(AIED) +, 자가면역 림프증식 증후군(ALPS) +, 자가면역 심근염, 자가면역 난소염 +, 자가면역 고환염 +, 자가면역 췌장염(AIP)/면역글로불린 G4-관련 질환(IgG4-RD) +, 자가면역 다선성 증후군, 타입 I, II 및 III +, 자가면역 프로게스테론 피부염 +, 자가면역 돌발성 감각신경성 난청(SNHL)이완불능(Achalasia), 애디슨병, 성인형 스틸병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신장염, 항인지질 증후군, 자가면역 혈관부종, 자가면역 자율신경실조증, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막증, 자가면역 두드러기, 축삭 및 신경성 신경병증(AMAN), 발로병, 베체트병, 양성 점막 유천포창, 수포성 유천포창, 캐슬만병(CD), 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 척-스트라우스 증후군(CSS) 또는 호산구성 육아종증(EGPA), 반흔성 유사천포창, 코간 증후군(Cogan's syndrome), 한랭 응집소병, 선천성 심차단, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 당뇨병, 타입 1, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경 척수염), 원판성 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 식도염 (EoE), 호산성 근막염, 결절성 홍반, 진성 혼합 한냉글로불린혈증, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐렴, 섬유성 폐렴, 거대 세포 심근염, 사구체신염, 굿파스쳐 증후군, 육아종증 다발혈관염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쉔라인 자반병(HSP), 임신성 헤르페스 또는 임신성 유사천포창(PG), 화농성 한선염(HS)(역성 여드름), 저감마글로불린혈증, IgA 신장병, IgG4-관련 경화병, 면역 혈소판감소성자반병(ITP), 포함체 근육염(IBM), 간질성 방광염(IC), 소아 관절염, 소아 당뇨병(타입 1 당뇨병), 소아 근염(JM), 가와사키병, 램버트-이튼 증후군, 백혈구파괴 혈관염, 편평태선, 경화성 태선, 목질결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 루푸스(신장염 및 피부성 포함), 라임병 만성, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염(MPA), 혼합 결합 조직병(MCTD), 무렌 궤양, 무하-하버만병(Mucha-Habermann 질환), 다초점성 운동 신경병증(MMN) 또는 MMNCB, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 미엘린 희소돌기신경교 당단백질 항체 장애, 근염, 기면증, 신생아 루푸스, 시신경 척수염, 호중구감소증, 안반흔성 유사천포창(Ocular cicatricial pemphigoid), 시신경염, 안구간대경련-근간대경련 증후군(OMS), 재발성 류마티스(PR), PANDAS, 부신생물성 소뇌 변성(PCD), 발작성 야간 혈색뇨(PNH), 파리-롬버르그 증후군, 평면부염(말초 포도막염), 파르소니지-터너 증후군, 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈(PA), POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 다선성 증후군 타입 I, II, III, 류마티스성 다발성근육통, 다발성근염, 심근경색후 증후군, 심막절개술후 증후군, 원발성 담즙성 담관염, 원발 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선성 관절염, 순적혈구무형성증(PRCA), 괴저성 농피증, 레이노 증후군, 반응성 관절염, 반사성 교감신경이영양증, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군(RLS), 후복막 섬유증, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 슈미트증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 강직 인간 증후군(SPS), 아급성 박테리아성 심내막염(SBE), 스삭 증후군, 교감성 안염(SO), 타까야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성자반병(TTP), 갑상선 눈질환(TED), 톨로사-헌트 증후군(THS), 횡단 척수염, 타입 1 당뇨병, 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증, 보그트 고야나기 하라다병을 포함하는, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 또는 만성 염증 및 자가면역 및 염증 및 알레르기 적응증 또는 이와 연관된 부작용의 치료 또는 예방을 위한 것이되, 병태는 선택적으로 중증 천식, 거대 세포 동맥염, ANKA 혈관염 및 IBD(대장염 및 크론병)을 포함하는, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한 것인, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 환자에서의 치료 또는 예방을 위한 것인, 용도, 의약, 조성물 또는 방법:
    (i) 만성, 급성, 간헐적 알레르기, 염증 또는 염증 병태, 예를 들어, 만성, 급성, 간헐적, 완화형/재발성;
    (ii) 주로 고용량의 스테로이드로만 효과적으로 치료될 수 있는 병태, 선택적으로 류마티스성 다발성근육통 및/또는 거대 세포 동맥염, 환자는 선택적으로 고용량의 스테로이드로 치료된 적이 있거나 치료 중임;
    (iii) 스테로이드 사용을 제한하는 동반이환을 갖는 병태, 선택적으로 진성 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH), 병적 비만 무혈관성 괴사/골괴사증(AVN), 녹내장; 스테로이드-유도 고혈압, 심한 피부 취약성 및/또는 골관절염;
    (iv) 안전한 장기간 치료제가 사용 가능하지만 고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 바람직한 병태, 선택적으로 AAV, 다발성근염, 피부근염, 루푸스, 염증성 폐질환, 자가면역 간염, 염증성 장 질환, 면역 혈소판감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 통풍 환자(고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 치료적으로 타당함);
    (v) 선택적으로 불확실한 치료 또는 기간 및/또는 스테로이드 투여에 대한 효과적인 대안이 없는 장기간/단기간 치료가 요구되는 피부과적 병태, 선택적으로 스티븐슨 존슨, 다른 중증 약물 발진 병태, 광범위한 접촉 피부염을 포함하는 병태, 다른 중증 면역-관련 피부과적 병태, 예컨대, PG, LCV, 홍피증 등;
    (vi) 발적/재발에 대해 고용량 코티코스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 COPD, 천식, 루푸스, 통풍, 가성통풍;
    (vii) 면역-관련 신경학적 질환, 예컨대, 소-섬유 신경병증, MS(하위세트), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 중증 근무력증 등;
    (viii) 혈액학적/종양학 적응증, 선택적으로 고용량의 스테로이드가 치료적으로 타당하거나 유익할 것임;
    (ix) 안과적 병태, 선택적으로 포도막염, 홍채염, 공막염 등;
    (x) 영구적인 또는 장기간의 부신 기능부전 또는 2차 부신 기능부전, 선택적으로 의원성 애디슨병과 연관된 병태;
    (xi) 보통 장기간, 저용량 스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 루푸스, RA, psA, 혈관염 등.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 스테로이드 치료에서 독성 위험이 있는 특별한 부류에 속하는 환자, 예컨대, 임산부/수유기 여성, 소아 환자, 선택적으로 성장 장애 또는 백내장이 있는 환자에서의 치료 또는 예방을 위한 것이되, 상기 환자는 또 다른 활성제로 추가로 치료 중인, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  53. 제1 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 CTLA4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, B7-H4, B7-H3, VISTA 중 하나 이상을 표적으로 하는 면역저해 항체 또는 융합 단백질 및/또는 CD40, CD137, OX40, GITR, CD27, CD28 또는 ICOS 중 하나 이상을 표적으로 하는 효능작용 항체 또는 융합 단백질로부터 선택되는 면역조절 항체 또는 융합 단백질로 추가로 치료 중인, 용도 또는 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 T 세포 활성화의 인간 V-도메인 Ig 억제인자(인간 VISTA)("A")에 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하되, 상기 ADC는, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우, VISTA 발현 면역 세포, 선택적으로 단핵구, 골수 세포, T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 수지상 세포, 대식세포, 호산구 및 내피 세포 중 하나 이상에 우선적으로 전달되어, 항-염증제의 상기 면역 세포 중 하나 이상 내로의 기능적 내재화를 초래하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 생리 pH(약 7.5)에서 VISTA 발현 세포에 우선적으로 결합하는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되; 이것은 선택적으로 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 최대 70시간의 pK를 갖는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 생리 pH에서 VISTA 발현 세포에 결합하고 생리 pH에서 시노몰거스 마카크 또는 인간에서 최대 3.5±.5일, 보다 전형적으로는 최대 48시간, 최대 24시간, 최대 18시간 또는 최대 12시간의 pK를 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 생리 pH에서 시노몰거스 마카크 또는 인간에서 최대 2.8 또는 2.3 또는 1.5일 또는 1일 또는 12시간 또는 8시간±.5일의 pK를 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 이의 사용 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 생리 pH에서 인간 VISTA 설치류에서 최대 6 내지 12시간의 pK를 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 이의 사용 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 링커를 포함하는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 링커는 상기 ADC가 VISTA-발현 면역 세포, 선택적으로 T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, 골수 세포, 수지상 세포, 대식세포, 호산구 및 내피 세포 중 하나 이상 내로 내재화될 때 절단되어 상기 면역 세포에서 치료적 유효량의 항-염증제의 방출을 초래하고, 항-염증제는 항-염증 활성을 도출하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항-VISTA 항체 또는 항원 결합 단편은 생리 pH(약 pH 7.5)에서 영장류, 선택적으로 시노몰거스 마카크에서 약 2.3일의 생체내 혈청 반감기를 갖는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 갖되, 상기 항-VISTA 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 VISTA 넉-인 설치류에서 생리 pH(약 pH 7.5)에서 70시간 이하, 60시간 이하, 50시간 이하, 40시간 이하, 30시간 이하, 24시간 이하, 22 내지 24시간 이하, 20 내지 22시간 이하, 18 내지 20시간 이하, 16 내지 18시간 이하, 14 내지 16시간 이하, 12 내지 14시간 이하, 10 내지 12시간 이하, 8 내지 10시간 이하, 6 내지 8시간 이하, 4 내지 6시간 이하, 2 내지 4시간 이하, 1 내지 2시간 이하, 0.5 내지 1.0시간 이하 또는 0.1 내지 0.5시간 이하의 생체내 혈청 중 혈청 반감기를 갖는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 생체내에서 사용되는 경우 상기 ADC의 PD/PK 비율은 인간 VISTA 넉-인 설치류 또는 인간 또는 비-인간 영장류, 선택적으로 시노몰거스 마카크에서 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 28:1 또는 그 초과인, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 ADC의 PD는 설치류 중 임의의 하나에서 또는 인간 또는 비-인간 영장류, 선택적으로 시노몰거스 마카크에서 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 28일, 2 내지 3주, 1개월, 2개월 또는 그 초과인, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항-인간 VISTA 항체는 손상된 FcR 결합 또는 온전한 FcR 결합을 갖는 Fc 영역을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항체 또는 항체 단편은 손상된 FcR 결합 또는 온전한 FcR 결합을 갖는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항체 또는 항체 단편은 손상된 FcR 결합을 갖는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 적어도 2종의 천연 인간 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 손상시키거나 제거하도록 변형된 인간 또는 비-인간 영장류 불변 또는 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 다음 FcR: hFcγRI(CD64), FcyRIIA 또는 hFcyRIIB,(CD32 또는 CD32A) 및 FcγRIIIA(CD16A) 또는 FcγRIIIB(CD16B) 중 임의의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 모두에 대한 결합을 손상시키거나 제거하도록 변형된 인간 또는 비-인간 영장류 불변 또는 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 선택적으로 상기 Fc 영역에 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 침묵 돌연변이를 갖는, 인간 IgG2 카파 골격을 포함하는, 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 상기 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이 및 선택적으로 보체(C1Q) 결합을 손상시킨 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 선택적으로 상기 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이 및 E269R 및 E233A 돌연변이를 갖는, 인간 IgG1/카파 골격을 포함하는, 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, VISTA 발현 면역 세포에 대한 상기 항-VISTA 항체 또는 항원 결합 단편의 결합은 면역에 대한 VISTA-매개 효과를 직접적으로 효능작용하거나 길항작용하지 않는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 내인성 FcR 결합은 손상되지 않은, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 천연(비변형된) 인간 IgG2 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 24℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 결정된 .0001nM 내지 10.0nM, .001 내지 1.0nM 또는 .01 내지 .7 또는 그 미만의 KD를 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 24℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 결정된 .13 내지 .64nM의 KD를 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 선택적으로 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 약물 항체 비율은 1:1 내지 12:1 범위인, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 선택적으로 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 약물 항체 비율은 2 내지 12:1, 2 내지 8:1, 4 내지 8:1 또는 6 내지 8:1 범위인, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 약물 항체 비율은 약 8:1(n =8) 또는 약 4:1(n =4)인, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 선택적으로 단핵구, 골수 세포, T 세포, Treg, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 대식세포, NK 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, B 세포 및 호중구 중 하나 이상에 내재화하는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 B 세포에 인식 가능하게 내재화하지 않는, 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항체 또는 항체 단편은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 네이키드(접합되지 않은) 형태로 투여된 동일한 투여량의 항-염증제에 비해서, 효능을 촉진시키고/시키거나 유해 부작용, 예컨대, 항-염증제와 연관된 독성을 감소시키는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 글루코코티코이드는 선택적으로 쇄간 이황화물을 통해 항체 또는 항원-결합 단편에 접합되는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 에스터라제 감응성 링커를 포함하는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 절단 가능한 링커는 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스터라제-유도 절단, 및 이황화 결합 절단 중 하나 이상에 민감성인, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 ADC에 포함된 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2 또는 scFv 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 ADC에 포함된 상기 항-VISTA 항체 또는 항체 단편은 도 8, 도 10 또는 도 12의 서열을 갖는 항체와 동일한 CDR을 포함하거나 선택적으로 하기의 것으로부터 선택되는 것인, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물, 또는 방법:
    (i) 서열번호 100, 101 및 102의 VH CDR 및 서열번호 103, 104 및 105의 VL CDR을 포함하는 것;
    (ii) 서열번호 110, 111 및 112의 VH CDR 및 서열번호 113, 114 및 115의 VL CDR을 포함하는 것;
    (iii) 서열번호 120, 121 및 122의 VH CDR 및 서열번호 123, 124 및 125의 VL CDR을 포함하는 것;
    (iv) 서열번호 130, 131 및 132의 VH CDR 및 서열번호 133, 134 및 135의 VL CDR을 포함하는 것;
    (v) 서열번호 140, 141 및 142의 VH CDR 및 서열번호 143, 144 및 145의 VL CDR을 포함하는 것;
    (vi) 서열번호 150, 151 및 152의 VH CDR 및 서열번호 153, 154 및 155의 VL CDR을 포함하는 것;
    (vii) 서열번호 160, 161 및 162의 VH CDR 및 서열번호 163, 164 및 165의 VL CDR을 포함하는 것;
    (viii) 서열번호 170, 171 및 172의 VH CDR 및 서열번호 173, 174 및 175의 VL CDR을 포함하는 것;
    (ix) 서열번호 180, 181 및 182의 VH CDR 및 서열번호 183, 184 및 185의 VL CDR을 포함하는 것;
    (x) 서열번호 190, 191 및 192의 VH CDR 및 서열번호 193, 194 및 195의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xi) 서열번호 200, 201 및 202의 VH CDR 및 서열번호 203, 204 및 205의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xii) 서열번호 210, 211 및 212의 VH CDR 및 서열번호 213, 214 및 215의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xiii) 서열번호 220, 221 및 222의 VH CDR 및 서열번호 223, 224 및 225의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xiv) 서열번호 230, 231 및 232의 VH CDR 및 서열번호 233, 234 및 235의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xv) 서열번호 240, 241 및 242의 VH CDR 및 서열번호 243, 244 및 245의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xvi) 서열번호 250, 251 및 252의 VH CDR 및 서열번호 253, 254 및 255의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xvii) 서열번호 260, 261 및 262의 VH CDR 및 서열번호 263, 264 및 265의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xviii) 서열번호 270, 271 및 272의 VH CDR 및 서열번호 273, 274 및 275의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xix) 서열번호 280, 281 및 282의 VH CDR 및 서열번호 283, 284 및 285의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xx) 서열번호 290, 291 및 292의 VH CDR 및 서열번호 293, 294 및 295의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxi) 서열번호 300, 301 및 302의 VH CDR 및 서열번호 303, 304 및 305의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxii) 서열번호 310, 311 및 312의 VH CDR 및 서열번호 313, 314 및 315의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxiii) 서열번호 320, 321 및 322의 VH CDR 및 서열번호 323, 324 및 325의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxiv) 서열번호 330, 331 및 332의 VH CDR 및 서열번호 333, 334 및 335의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxv) 서열번호 340, 341 및 342의 VH CDR 및 서열번호 343, 344 및 345의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxvi) 서열번호 350, 351 및 352의 VH CDR 및 서열번호 353, 354 및 355의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxvii) 서열번호 360, 361 및 362의 VH CDR 및 서열번호 363, 364 및 365의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxviii) 서열번호 370, 371 및 372의 VH CDR 및 서열번호 373, 374 및 375의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxix) 서열번호 380, 381 및 382의 VH CDR 및 서열번호 383, 384 및 385의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxx) 서열번호 390, 391 및 392의 VH CDR 및 서열번호 393, 394 및 395의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxi) 서열번호 400, 401 및 402의 VH CDR 및 서열번호 403, 404 및 405의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxii) 서열번호 410, 411 및 412의 VH CDR 및 서열번호 413, 414 및 415의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxiii) 서열번호 420, 421 및 422의 VH CDR 및 서열번호 423, 424 및 425의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxiv) 서열번호 430, 431 및 432의 VH CDR 및 서열번호 433, 434 및 435의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxv) 서열번호 440, 441 및 442의 VH CDR 및 서열번호 443, 444 및 445의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxvi) 서열번호 450, 451 및 452의 VH CDR 및 서열번호 453, 454 및 455의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxvii) 서열번호 460, 461 및 462의 VH CDR 및 서열번호 463, 464 및 465의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxviii) 서열번호 470, 471 및 472의 VH CDR 및 서열번호 473, 474 및 475의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xxxix) 서열번호 480, 481 및 482의 VH CDR 및 서열번호 483, 484 및 485의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xl) 서열번호 490, 491 및 492의 VH CDR 및 서열번호 493, 494 및 495의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xli) 서열번호 500, 501 및 502의 VH CDR 및 서열번호 503, 504 및 505의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlii) 서열번호 510, 511 및 512의 VH CDR 및 서열번호 513, 514 및 515의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xliii) 서열번호 520, 521 및 522의 VH CDR 및 서열번호 523, 524 및 525의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xliv) 서열번호 530, 531 및 532의 VH CDR 및 서열번호 533, 534 및 535의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlv) 서열번호 540, 541 및 542의 VH CDR 및 서열번호 543, 544 및 545의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlvi) 서열번호 550, 551 및 552의 VH CDR 및 서열번호 553, 554 및 555의 VL CDR 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlvii) 서열번호 560, 561 및 562의 VH CDR 및 서열번호 563, 564 및 565의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xlviii) 서열번호 570, 571 및 572의 VH CDR 및 서열번호 573, 574 및 575의 VL CDR을 포함하는 것;
    (xlix) 서열번호 580, 581 및 582의 VH CDR 및 서열번호 583, 584 및 585의 VL CDR을 포함하는 것;
    (l) 서열번호 590, 591 및 592의 VH CDR 및 서열번호 593, 594 및 595의 VL CDR을 포함하는 것;
    (li) 서열번호 600, 601 및 602의 VH CDR 및 서열번호 603, 604 및 605의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lii) 서열번호 610, 611 및 612의 VH CDR 및 서열번호 613, 614 및 615의 VL CDR을 포함하는 것;
    (liii) 서열번호 620, 621 및 622의 VH CDR 및 서열번호 623, 624 및 625의 VL CDR을 포함하는 것;
    (liv) 서열번호 630, 631 및 632의 VH CDR 및 서열번호 633, 634 및 635의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lv) 서열번호 640, 641 및 642의 VH CDR 및 서열번호 643, 644 및 645의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lvi) 서열번호 650, 651 및 652의 VH CDR 및 서열번호 653, 654 및 655의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lvii) 서열번호 660, 661 및 662의 VH CDR 및 서열번호 663, 664 및 665의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lviii) 서열번호 670, 671 및 672의 VH CDR 및 서열번호 673, 674 및 675의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lix) 서열번호 680, 681 및 682의 VH CDR 및 서열번호 683, 684 및 685의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lx) 서열번호 690, 691 및 692의 VH CDR 및 서열번호 693, 694 및 695의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxi) 서열번호 700, 701 및 702의 VH CDR 및 서열번호 703, 704 및 705의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxii) 서열번호 710, 711 및 712의 VH CDR 및 서열번호 713, 714 및 715의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxiii) 서열번호 720, 721 및 722의 VH CDR 및 서열번호 723, 724 및 725의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxiv) 서열번호 730, 731 및 732의 VH CDR 및 서열번호 733, 734 및 735의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxv) 서열번호 740, 741 및 742의 VH CDR 및 서열번호 743, 744 및 745의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxvi) 서열번호 750, 751 및 752의 VH CDR 및 서열번호 753, 754 및 755의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxvii) 서열번호 760, 761 및 762의 VH CDR 및 서열번호 763, 764 및 765의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxviii) 서열번호 770, 771 및 772의 VH CDR 및 서열번호 773, 774 및 775의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxix) 서열번호 780, 781 및 782의 VH CDR 및 서열번호 783, 784 및 785의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxx) 서열번호 790, 791 및 792의 VH CDR 및 서열번호 793, 794 및 795의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxxi) 서열번호 800, 801 및 802의 VH CDR 및 서열번호 803, 804 및 805의 VL CDR을 포함하는 것;
    (lxxii) 서열번호 810, 811 및 812의 VH CDR 및 서열번호 813, 814 및 815의 VL CDR을 포함하는 것.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 VSTB92, VSTB56, VSTB95, VSTB103 및 VSTB66 중 어느 하나와 동일한 CDR을 포함하는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC).
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 각각 다음 VH 폴리펩타이드 및 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체의 서열과 적어도 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 보유하는 VH 폴리펩타이드 및 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항-VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 추가로 CDR은 변형되지 않은, 항체 약물 접합체(ADC):
    (i) 서열번호 106 동일성의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 108의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (ii) 서열번호 116의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 118의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (iii) 서열번호 126의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 128의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (iv) 서열번호 136의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 138의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (v) 서열번호 146의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 148의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (vi) 서열번호 156의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 158의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (vii) 서열번호 166의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 168의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (viii) 서열번호 176의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 178의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (ix) 서열번호 186의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 188의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (x) 서열번호 196의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 198의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xi) 서열번호 206의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 208의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xii) 서열번호 216의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 218의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xiii) 서열번호 226의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 228의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xiv) 서열번호 236의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 238의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xv) 서열번호 246의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 248의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xvi) 서열번호 256의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 258의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xvii) 서열번호 266의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 268의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xviii) 서열번호 276의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 278의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xix) 서열번호 286의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 288의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xx) 서열번호 296의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 298의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxi) 서열번호 306의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 308의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxii) 서열번호 316의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 318의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxiii) 서열번호 326의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 328의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxiv) 서열번호 336의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 338의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxv) 서열번호 346의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 348의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxvi) 서열번호 356의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 358의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxvii) 서열번호 366의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 368의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxviii) 서열번호 376의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 378의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxix) 서열번호 386의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 388의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxx) 서열번호 396의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 398의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxi) 서열번호 406의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 408의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxii) 서열번호 416의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 418의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxiii) 서열번호 426의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 428의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxiv) 서열번호 436의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 438의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxv) 서열번호 446의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 448의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxvi) 서열번호 456의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 458의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxvii) 서열번호 466의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 468의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxviii) 서열번호 476의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 478의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xxxix) 서열번호 486의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 488의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xl) 서열번호 496의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 498의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xli) 서열번호 506의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 508의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlii) 서열번호 516의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 518의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xliii) 서열번호 526의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 528의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xliv) 서열번호 536의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 533, 534 및 535의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlv) 서열번호 546의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 548의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlvi) 서열번호 556의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 558의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlvii) 서열번호 566의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 568의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlviii) 서열번호 576의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 578의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (xlix) 서열번호 586의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 588의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (l) 서열번호 596의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 598의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (li) 서열번호 606의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 608의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lii) 서열번호 616의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 618의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (liii) 서열번호 626의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 628의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (liv) 서열번호 636의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 638의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lv) 서열번호 646의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 648의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lvi) 서열번호 656의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 658의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lvii) 서열번호 666의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 668의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lviii) 서열번호 676의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 678의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lix) 서열번호 686의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 688의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lx) 서열번호 696의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 698의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxi) 서열번호 706의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 708의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxii) 서열번호 716의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 718의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxiii) 서열번호 726의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 728의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxiv) 서열번호 736의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 738의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxv) 서열번호 746의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 748의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxvi) 서열번호 756의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 758의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxvii) 서열번호 766의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 768의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxviii) 서열번호 776의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 778의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxix) 서열번호 786의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 788의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxx) 서열번호 796의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 798의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxxi) 서열번호 806의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 808의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것;
    (lxxii) 서열번호 816의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호 818의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 것.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항-VISTA 항체 또는 항체 단편은 VSTB92, VSTB56, VSTB95, VSTB103 및 VSTB66 중 하나와 동일한 가변 영역을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 및 방법.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 선택적으로 도 8, 도 10 또는 도 12의 것의 CDR 또는 가변 서열을 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항-VISTA 항체 또는 항체 단편은 상기 Fc 영역에 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG2 카파 골격을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 선택적으로 도 8, 도 10 또는 도 12의 것의 CDR 또는 가변 서열을 갖는 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편을 포함하되, 상기 항-VISTA 항체 또는 항체 단편은 상기 Fc 영역에 L234A/L235A 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1/카파 골격을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC), 용도 또는 방법.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코코티코스테로이드 효능제 또는 링커 접합체는 이의 쇄간 이황화물을 통해서 항체 또는 항체 단편, 선택적으로 항-인간 VISTA 항체 또는 항체 단편에 접합된, ADC.
  94. 치료적 유효량의 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항의 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 스테로이드 효능제 또는 스테로이드-링커 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  95. 제94항에 있어서, 주사 경로, 선택적으로 정맥내, 근육내, 척추강내 또는 피하를 통해서 투여 가능한, 조성물.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 피하로 투여 가능한, 조성물.
  97. 주사기, 주사 장치, 주입 펌프, 인젝터 펜, 무바늘 장치, 오토인젝터 및 피하 패치 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 피하 투여를 제공하는, 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항의 글루코코티코스테로이드 효능제, 링커 접합체, ADC, 조성물 또는 의약을 포함하는, 장치.
  98. 제97항에 있어서, 환자에게 고정 용량의 상기 글루코코티코이드 수용체 효능제 또는 이의 기능성 유도체를 전달하는, 장치.
  99. 제97항 또는 제98항의 장치를 포함하는 키트로서, 환자에게 내부에 포함된 상기 ADC 조성물을 투여하는 방법 및 투여 요법을 설명하는 설명서를 더 포함하는, 키트.
  100. 치료 및/또는 예방 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 스테로이드 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 따른 장치에 존재할 수 있는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 알레르기, 자가면역, 이식, 유전자 요법, 염증, GVHD 또는 패혈증의 치료, 또는 인간 대상체에서 상기 병태 중 임의의 것과 연관된 염증, 자가면역 또는 알레르기 부작용의 치료 또는 예방에 사용되는, 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 염증은 암 또는 감염, 선택적으로 바이러스 또는 박테리아 감염과 연관된, 방법.
  103. 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 환자는 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선으로부터 선택된 병태를 포함하는, 방법.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 하기 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    (i) 만성, 급성, 간헐적 알레르기, 염증 또는 염증 병태, 예를 들어, 만성, 급성, 간헐적, 완화형/재발성;
    (ii) 주로 고용량의 스테로이드로만 효과적으로 치료될 수 있는 병태, 선택적으로 류마티스성 다발성근육통 및/또는 거대 세포 동맥염, 환자는 선택적으로 고용량의 스테로이드로 치료된 적이 있거나 치료 중임;
    (iii) 스테로이드 사용을 제한하는 동반이환을 갖는 병태, 선택적으로 진성 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH), 병적 비만 무혈관성 괴사/골괴사증(AVN), 녹내장; 스테로이드-유도 고혈압, 심한 피부 취약성 및/또는 골관절염;
    (iv) 안전한 장기간 치료제가 사용 가능하지만 고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 바람직한 병태, 선택적으로 AAV, 다발성근염, 피부근염, 루푸스, 염증성 폐질환, 자가면역 간염, 염증성 장 질환, 면역 혈소판감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 통풍 환자(고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 치료적으로 타당함);
    (v) 선택적으로 불확실한 치료 또는 기간 및/또는 스테로이드 투여에 대한 효과적인 대안이 없는 장기간/단기간 치료가 요구되는 피부과적 병태, 선택적으로 스티븐슨 존슨, 다른 중증 약물 발진 병태, 광범위한 접촉 피부염을 포함하는 병태, 다른 중증 면역-관련 피부과적 병태, 예컨대, PG, LCV, 홍피증 등;
    (vi) 발적/재발에 대해 고용량 코티코스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 COPD, 천식, 루푸스, 통풍, 가성통풍;
    (vii) 면역-관련 신경학적 질환, 예컨대, 소-섬유 신경병증, MS(하위세트), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 중증 근무력증 등;
    (viii) 혈액학적/종양학 적응증, 선택적으로 고용량의 스테로이드가 치료적으로 타당하거나 유익할 것임;
    (ix) 안과적 병태, 선택적으로 포도막염, 홍채염, 공막염 등;
    (x) 영구적인 또는 장기간의 부신 기능부전 또는 2차 부신 기능부전, 선택적으로 의원성 애디슨병과 연관된 병태;
    (xi) 보통 장기간, 저용량 스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 루푸스, RA, psA, 혈관염 등; 및
    (xii) 특별한 부류의 환자, 예컨대, 임산부/수유기 여성, 소아 환자, 선택적으로 성장 장애 또는 백내장이 있는 환자.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 또 다른 활성제로 추가로 치료 중인, 방법, 의약 또는 용도.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 CTLA4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, B7-H4, B7-H3, VISTA 중 하나 이상을 표적으로 하는 면역저해 항체 또는 융합 단백질 및/또는 CD40, CD137, OX40, GITR, CD27, CD28 또는 ICOS 중 하나 이상을 표적으로 하는 효능작용 항체 또는 융합 단백질로부터 선택되는 면역조절 항체 또는 융합 단백질로 추가로 치료 중인, 방법, 의약 또는 용도.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 따른 ADC 또는 스테로이드의 생체외 용도로서, 환자 또는 공여자로부터의 면역 세포가 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 따른 ADC 또는 스테로이드와 접촉되고, 그 다음 이를 필요로 하는 환자, 예를 들어, 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 식별된 병태 중 하나 이상을 갖는 환자에게 주입되는, 생체외 용도.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 양, 음 또는 중성으로 하전된 절단 가능한 펩타이드, 선택적으로 에스터라제 절단 가능한 펩타이드인, ADC.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 항체 비율은 1 내지 12:1 또는 1 내지 10:1 범위인, ADC.
  110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 항체 비율은 2 내지 8:1, 4 내지 8:1 또는 6 내지 8:1 범위인, ADC.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 항체 비율은 4:1(n =4), 6:1(n =6), 8:1(n =8), 10:1(n =10), 12:1(n =12)이거나, n은 12 또는 그 초과이고, 12 내지 50 범위인, ADC.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 또는 비-활성화된 단핵구, 골수 세포, B 세포, NK 세포, T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, 호산구, 수지상 세포, 비만 세포, 대식세포 및 호중구 중 하나 이상에 내재화하는, ADC.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 또는 비-활성화된 B 세포에 인식 가능하게 내재화하지 않는, ADC.
  114. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 네이키드(접합되지 않은) 형태로 투여된 동일한 투여량의 항-염증제에 비해서 효능을 촉진시키고/시키거나 글루코코티코이드 수용체 효능제와 연관된 유해 부작용을 감소시키는, ADC.
  115. 제1항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코코티코이드 수용체 효능제는 상기 쇄간 이황화물 통해서 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 접합된, 항체 약물 접합체(ADC).
  116. 제1항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 에스터라제 감응성 링커를 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC).
  117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스터라제-유도 절단, 및 이황화 결합 절단 중 하나 이상에 민감성인, 항체 약물 접합체(ADC).
  118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스터라제-유도 절단 및 이황화 결합 절단 중 하나 이상에 실질적으로 저항성인 절단 가능하지 않은 링커를 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC).
  119. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC에 포함된 상기 항-VISTA 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2 또는 scFv 항체 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC).
  120. 치료 및/또는 예방 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 적어도 1종의 항체 약물 접합체(ADC) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 제1항 또는 제119항에 따른 장치에 존재할 수 있는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 알레르기, 자가면역, 이식, 유전자 요법, 염증, GVHD 또는 패혈증의 치료, 또는 인간 대상체에서 상기 병태 중 임의의 것과 연관된 염증, 자가면역 또는 알레르기 부작용의 치료 또는 예방에 사용되는, 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 상기 환자는 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선으로부터 선택된 병태를 포함하는, 방법.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 하기 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    (i) 주로 고용량의 스테로이드로만 효과적으로 치료될 수 있는 병태, 선택적으로 류마티스성 다발성근육통 및/또는 거대 세포 동맥염, 환자는 선택적으로 고용량의 스테로이드로 치료된 적이 있거나 치료 중임;
    (ii) 스테로이드 사용을 제한하는 동반이환을 갖는 병태, 선택적으로 진성 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH), 병적 비만 무혈관성 괴사/골괴사증(AVN), 녹내장; 스테로이드-유도 고혈압, 심한 피부 취약성 및/또는 골관절염;
    (iii) 안전한 장기간 치료제가 사용 가능하지만 고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 바람직한 병태, 선택적으로 AAV, 다발성근염, 피부근염, 루푸스, 염증성 폐질환, 자가면역 간염, 염증성 장 질환, 면역 혈소판감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 통풍 환자(고용량의 스테로이드로의 수 개월의 유도가 치료적으로 타당함);
    (iv) 선택적으로 불확실한 치료 또는 기간 및/또는 스테로이드 투여에 대한 효과적인 대안이 없는 장기간/단기간 치료가 요구되는 피부과적 병태, 선택적으로 스티븐슨 존슨, 다른 중증 약물 발진 병태, 광범위한 접촉 피부염을 포함하는 병태, 다른 중증 면역-관련 피부과적 병태, 예컨대, PG, LCV, 홍피증 등;
    (v) 발적/재발에 대해 고용량 코티코스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 COPD, 천식, 루푸스, 통풍, 가성통풍;
    (vi) 면역-관련 신경학적 질환, 예컨대, 소-섬유 신경병증, MS(하위세트), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 중증 근무력증 등;
    (vii) 혈액학적/종양학 적응증, 선택적으로 고용량의 스테로이드가 치료적으로 타당하거나 유익할 것임;
    (viii) 안과적 병태, 선택적으로 포도막염, 홍채염, 공막염 등;
    (ix) 영구적인 또는 장기간의 부신 기능부전 또는 2차 부신 기능부전, 선택적으로 의원성 애디슨병과 연관된 병태;
    (x) 보통 장기간, 저용량 스테로이드로 치료되는 병태, 선택적으로 루푸스, RA, psA, 혈관염 등; 및
    (xi) 특별한 부류의 환자, 예컨대, 임산부/수유기 여성, 소아 환자, 선택적으로 성장 장애 또는 백내장이 있는 환자.
  124. 제120항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 또 다른 활성제로 추가로 치료 중인, 방법.
  125. 제120항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 CTLA4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, B7-H4, B7-H3, VISTA 중 하나 이상을 표적으로 하는 면역저해 항체 또는 융합 단백질 및/또는 CD40, CD137, OX40, GITR, CD27, CD28 또는 ICOS 중 하나 이상을 표적으로 하는 효능작용 항체 또는 융합 단백질로부터 선택되는 면역조절 항체 또는 융합 단백질로 추가로 치료 중인, 방법.
  126. 제120항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 이와 연관된 급성 또는 만성 염증 및 자가면역 및 염증 적응증의 치료 또는 예방을 위한 것이되, 병태는 선택적으로 중증 천식, 거대 세포 동맥염, ANKA 혈관염 및 IBD(대장염 및 크론병)을 포함하는, 용도, 의약, 조성물 또는 방법.
  127. 제115항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 성인 크론병, 소아 크론병, 궤양성 대장염, 판상형 건선, 화농성 한선염, 포도막염, 베체트병, 척추관절병증 또는 건선으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한 것인, 방법.
  128. 글루코코티코스테로이드의 T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, NK 세포, B 세포, 호중구, 단핵구, 골수 세포, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포 및 대식세포 내로의 내재화를 달성하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 ADC를 투여하거나, 대상체로부터 얻은 세포를 생체외에서 상기 ADC와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 생체외에서 달성되고, 면역 세포를 포함하거나 또는 B 세포, T 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, 골수 세포, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포 및 대식세포로부터 선택된 특정 유형 또는 유형들의 면역 세포를 포함하는 정제된 또는 농축된 조성물이 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항에 따른 ADC와 생체외에서 접촉되고, 그 다음 이를 필요로 하는 환자에게 도입되는, 방법.
  130. B 세포, T 세포, Treg, NK 세포, 호중구, 단핵구, 골수 세포, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포 및 대식세포 중 임의의 것 중 하나 이상과 관련된 염증 또는 자가면역 또는 알레르기 병태의 치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제129항 중 어느 한 항에 따른 ADC를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  131. 제1항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어지지 않은, 글루코코티코이드 효능제, 이를 함유하는 조성물 또는 방법:
    .
  132. 제1항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코코티코이드 효능제 화합물은 도 9에 도시되고/되거나 하기 구조를 갖는 화합물로 이루어지지 않은, 글루코코티코이드 효능제, 이를 함유하는 조성물 또는 방법:

    상기 식에서,
    R=H이거나
    R = 이거나,
    R = 이거나,
    R = 이거나,
    R = 이거나,
    R = 이거나,
    R = 이거나,
    R = 이다.
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