KR20230143375A - 장기 모사 칩 구조체 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 장기 모사 칩 구조체에 이용하는 인서트의 제조방법, 장기 모사 칩 구조체 제조방법과 인서트 세포 배양 플레이트에 관한 것으로서, 다공성 막의 양측에 각각 상피세포와 내피세포를 손쉽게 배양할 수 있는 인서트 세포 배양 플레이트를 이용하여 인서트를 제조하는 방법과, 이와 같이 제조된 인서트를 이용하고 내피세포 측의 상부 유체채널의 단면적을 조절할 수 있는 상부 유체채널 유속 조절부를 포함하여 장기가 모사된 장기 모사 칩을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 장기 모사 칩 구조체에 이용하는 인서트의 제조방법, 장기 모사 칩 구조체 제조방법과 인서트 세포 배양 플레이트에 관한 것이다.
신약 개발은 엄청난 비용과 긴 시간이 요구되지만 성공률은 10% 이하로 매우 낮다. 이런 문제를 해결하기 위해 장기 칩 (Organ-on-a-chip) 연구가 활발하게 진행되고 있다.1 장기 칩은 동물실험을 하지 않고 사람의 조직을 대체할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다. 많은 장기 칩이 개발 및 실험되고 있으며 약물 투여 후 체내 흡수, 분포, 대사, 배설 과정을 모사할 수 있는 생체 모사 다중장기 조직칩도 개발되고 있으며,2, 3 이러한 다중장기 조직칩을 이용하면 장, 간, 신장 등을 통해 약물이 장기에서 일어나는 변화를 예측할 수 있어 신약개발에 용이하다.4 또, 생체 모사 다중장기 조직칩을 통해 특정 질병을 유도하고 약물의 체내 흡수, 분포, 대사, 배설 특성을 이용하여 질병에 대한 약물의 효과 예측과 분석을 할 수 있다. 그러나 생체 모사 다중 장기조직 칩은 공동의 배양액으로 여러 장기들의 고유 기능들이 체내와 유사하게 발현되도록 유지해야 하므로 단일 장기 조직칩 제조보다 기술적 난이도가 높다. 이러한 문제점은 단일 장기 조직을 인서트 (insert)에서 독립적으로 배양한 후 각 장기조직이 배양된 인서트들을 하나의 통합된 칩 상에 집적하여 약물 시험을 할 수 있는 다중 장기 생체조직칩을 제조함으로 해결될 수 있다.
생체 내 장기의 표면에는 생체 내로 들어오는 음식 및 소화액 등과 직접 접촉하는 상피세포가 있고, 상피세포를 통과하여 흡수된 성분은 장기 내측에 형성된 내피세포를 거쳐 혈액을 통해 간, 신장 등의 다른 기관으로 이동하고/하거나 분포, 대사, 배설 과정을 거치게 된다. 장, 간, 신장 등의 상피세포가 접하는 내강과 내피세포가 접하는 장기 내부는 서로 다른 환경을 이루며, 특히 다른 종류의 유체가 흐르게 된다. 예컨대, 소장의 내강에는 음식물, 소화액 등이 존재하며, 소장의 내측 내피세포가 접하는 쪽에는 혈액이 흐르고 있다.
그런데, 이와 같은 양측 유체가 흐르는 통로는 화학적 환경이 전혀 다를 뿐만 아니라, 물리적 조건 또한 전혀 다르다. 이뿐만 아니라, 이러한 현상은 개인 간에도 차이가 있다. 예컨대 고혈압 환자의 경우 내강 쪽에는 유체의 흐름이 활발하고 통로의 단면적이 넓은데 비해, 장기 내측에는 혈관의 단면적이 작아져 일반인에 비해 혈액이 매우 느리게 이동한다. 이러한 거동 특성으로 인하여 특정 시험대상 약물의 흡수, 분포, 대사, 배설 특성은 정상인에 비하여 다른 특징을 나타낼 수 있다.
나아가, 장기의 종류에 따라서 장기 내측에 미세한 혈관이 흐르는 구조가 있을 수 있다. 예컨대 신장의 사구체나 세뇨관은 여타 조직에 비하여 단면적이 매우 작은 혈관이 분포되어 있다.
위와 같이, 개인별 및/또는 장기 조직별 특성에 따라 장기 내측의 유체 통로 단면적을 조절함으로써 생체 내 장기와 더욱 유사한 장기 모사 칩을 제공할 수 있다.
M. Rothbauer et al., Micromachines (Basel), 2021, 12.
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Wu et al. BioMed Eng OnLine (2020) 19:9, https://doi.org/10.1186/s12938-020-0752-0
본 발명은 인체 장기의 상피세포와 내피세포를 쌍으로 공배양하여 장기를 통한 약물의 흡수, 분포, 대사, 배설 등의 약동학적 거동을 파악하므로써 전임상이나 임상시험을 거치지 않고 신약의 약효와 부작용등을 검증 하기위한 장기 모사 칩의 제조방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 장기 상피세포와 내피세포 (혈관세포)에 인가되는 유체의 전단응력이 인체내에서 서로 상이하기 때문에 각 세포층에 흐르는 유속을 다르게 조절할 수 있도록 설계된 장기 모사 칩의 제조방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 다공성 막을 중심으로 일측에는 상피세포, 타측에는 내피세포가 배양된 인서트를 제조하는 방법 및 이에 적합한 인서트 세포 배양 플레이트를 제공하려는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 인서트 (1)를 삽입하여 고정할 수 있는 인서트 세포 배양 플레이트 (5)를 이용하여 다공성 막 (112)이 형성된 인서트 (1)에서 다공성 막 (112)의 일측에는 상피세포를 형성한 후 플레이트 (5)를 뒤집어 타측에는 내피세포를 손쉽게 부착, 배양하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명자들은 장기 모사 칩 제조에 있어서 두 종류의 유체채널을 형성하고 내피세포에 해당하는 상부 유체채널에는 유속 조절부 (3)를 형성함으로써 장기 조직별로 유속을 조절할 수 있으며, 고혈압 환자 또는 개인별 특성에 따라 혈관의 단면적이 작은 경우에도 시험대상 약물의 흡수, 분포, 대사, 배설 거동을 좀 더 정확하게 시험해볼 수 있다. 본 발명에서 유속의 조절 방식에 특별한 제한은 없으며, 상부 유체채널과 접하는 탄성을 가진 칩 프레임의 일측이 아래쪽으로 눌리도록 하여 상부 유체채널의 단면적을 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 유체채널이 형성된 유연한 재질의 상부 채널 패턴층 (22) 위에 있는 칩 프레임 (21)에 나사구멍을 형성하고, 이 나사구멍에 조절나사 (3)를 넣어 조임으로써 상부 유체채널 (232)의 특정 부분 및/또는 칩 프레임 (21)의 특정 부분이 아래쪽으로 이동하는 방식으로 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절하여 상부 유체채널 (232)과 하부 유체채널 (242)의 유속을 다르게 만들 수 있다. 상기 조절나사는 제2 배양액 챔버가 있는 일측에만 하나 이상 형성할 수 있고, 제2 배양액 챔버가 있는 일측과 제2 배양액 출구가 있는 타측에 모두 각각 하나 이상의 조절나사를 형성할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 유체채널이 형성된 유연한 재질의 상부 채널 패턴층 위에 있는 칩 프레임에 홀을 형성하고 홀 내부에 중량체 (예컨대 분동과 같은 단위 중량체)를 하나 이상 넣음으로써 상부 유체채널 (232)의 특정 부분 및/또는 칩 프레임 (21)의 특정 부분이 아래쪽으로 이동하는 방식으로 상부 유체채널의 단면적을 조절하여 상부 유체채널 (232)과 하부 유체채널 (242)의 유속을 다르게 만들 수 있다. 중량체는 하나 이상의 단위 중량체를 사용하는 것이 바람직하다. 단위 중량체의 숫자를 늘리거나 또는 무거운 단위 중량체를 넣음으로써 상부 유체채널 (232)의 단면적과 유속을 조절할 수 있다. 유속 조절부 (3)의 일종으로서 상기 중량체를 넣는 홀은 제2 배양액 챔버가 있는 일측에만 하나 이상 형성할 수 있고/있거나, 제2 배양액 챔버가 있는 일측과 제2 배양액 출구가 있는 타측에 모두 각각 하나 이상의 중량체를 넣는 홀을 형성할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 상부 유체채널 (232)의 아래쪽에는 영구자석을 설치하고 이에 대응되는 상부 유체채널(232)의 위쪽 즉, 상부 유체채널 (232)의 특정 부분 및/또는 칩 프레임 (21)의 특정 부분에는 전자석을 설치하여 필요에 따라 전자석에 강하거나 약한 전기를 인가하거나 인가하지 않음으로써 전자석의 자력을 조절하여 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절하여 유속을 조절할 수 있다. 유속 조절부 (3)의 일종으로서 상기 전자석은 제2 배양액 챔버가 있는 일측에만 하나 이상 형성할 수 있고/있거나, 제2 배양액 챔버가 있는 일측과 제2 배양액 출구가 있는 타측에 모두 각각 하나 이상 형성할 수 있다.
위와 같이 유속 조절부 (3)는 다양한 형태 및/또는 방식으로 형성할 수 있으며, 위에 제시된 구체예들은 예시적인 것일 뿐 본 발명의 유속 조절부가 이에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 본 발명에서는 다공성 막을 사용하여 다공성 막의 양측에 각각 내피세포와 상피세포를 배양하고 여기에 전단 응력을 가하여 인체 장기를 모사한 칩을 제공한다.
본 발명의 장기 모사 칩에서 유체채널을 통해 흐르는 유체의 흐름은 펌프와 같은 장치를 이용하여 형성할 수 있고, 바람직하게는 중력을 이용하여 장기 모사 칩을 특정 각도로 기울여 별도의 동력을 가하지 않고도 유체의 흐름을 만들 수 있을 뿐만 아니라, 펌프와 칩을 연결하는 관을 사용하지 않아도 되므로 관을 통한 공기방울의 유입이나 오염에 의한 감염을 방지할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 장기 모사 칩의 구조는 다음과 같다.
기판 (25), 하부 채널 패턴층 (24), 중간 분리 패턴층 (23), 상부 채널 패턴층 (22), 칩 프레임 (21) 순서대로 쌓아올려 칩 (2)을 만든다.
유체의 흐름은 중력기반시스템을 사용하여 형성하였다.
하부 유체채널에 제공되는 배지 (또는 제1 배양액)(240)는 제1 배양액 챔버 (241)에서 하부 유체채널 (242)을 통해 반대편의 제1 배양액 출구 (243)로 나온다.
상부 유체채널에 제공되는 배지 (또는 제2 배양액)(230)는 제2 배양액 챔버 (231)에서 상부 유체채널 (232)을 통해 반대편의 제2 배양액 출구 (233)로 나온다.
상부 유체채널을 통해 배지가 흐를 때 인서트에는 상부 유체 채널 연결구멍 (13)을 통해 유체가 흐르게 된다.
제1 배양액 챔버 (241)로부터 하부 유체채널 (242)을 통해 흐르는 배지는 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 바닥에 시딩된 세포에 영양분을 공급한다.
제2 배양액 챔버 (231)로부터 상부 유체채널 (232)을 통해 흐르는 배지는 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 시딩된 세포에 영양분을 공급한다.
상부 유체채널 유속 조절부 (3)는 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절함으로써 유속을 조절한다.
기판은 재질에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 하부 유체채널을 통해 흐르는 배양액 또는 시험대상 물질과 화학반응을 일으키지 않는 재질이면 가능하다. 바람직하게는 유리 재질을 사용할 수 있다.
제1 배양액 챔버 (241), 하부 유체채널 (242), 제1 배양액 출구 (243), 제2 배양액 챔버 (231), 상부 유체채널 (232), 제2 배양액 출구 (233)는 배양액 또는 시험대상 물질과 반응하지 않는 재질이면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 금속 몰드를 사용하여 PDMS 재질로 제작할 수 있다.
칩 프레임 (21)은 배양액 또는 시험대상 물질과 반응하지 않는 재질이면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 폴리카보네이트 또는 폴리스타이렌 재질일 수 있다.
중간 분리 패턴층 (23)은 상부 채널 패턴층 (22)과 하부 채널 패턴층 (24) 사이에 위치하여 두 층을 분리하는 기능을 하나, 필수적인 구성요소는 아니다.
또한, 하부 채널 패턴층 (24)과 상부 채널 패턴층 (22)은 별도의 판재로 형성하지 않고, 하나의 판재에 상부 유체채널 (232), 하부 유체채널 (242) 등을 형성하는 것도 가능하다.
또한, 하부 채널 패턴층 (24), 중간 분리 패턴층 (23)과 상부 채널 패턴층 (22)은 별도의 판재로 형성하지 않고, 하나의 판재에 상부 유체채널 (232), 하부 유체채널 (242) 등을 형성하는 것도 가능하다.
또한, 하부 채널 패턴층 (24), 중간 채널 패턴층 (23), 상부 채널 패턴층 (22)과 칩 프레임 (21)은 별도의 판재로 형성하지 않고, 하나의 판재에 상부 유체채널 (232), 하부 유체채널 (242) 등을 형성하는 것도 가능하다.
위와 같은 층의 구분은 칩 제작의 편의를 위한 것일 뿐 필수적인 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
인서트 (1)에 다공성 막 (112)을 붙이고, 인서트 (1)와 칩 (2) 사이에 오링 (12)을 끼워 누수를 방지한다. 다공성 막 (112)의 위쪽과 아래쪽에는 모두 세포를 부착하여 배양한다. 인서트 (1)와 칩 (2)의 벽면 간 결합 방식에 특별한 제한은 없으나, 억지끼움 하거나 또는 스크류 형식으로 돌려끼울 수 있다.
본 발명의 장기 모사 칩은 신장, 간, 위, 소장, 대장, 폐를 비롯한 다양한 장기를 모사하는 칩으로 이용할 수 있다.
본 발명의 장기 모사 칩 구조체는
각각에서 세포가 배양된 하나 이상의 인서트 (1) 모듈; 및
상기 인서트 (1) 모듈의 삽입 배치가 가능한 칩을 포함하되,
상기 칩에 상기 복수의 인서트 (1) 모듈이 삽입되어 장기 모사 칩을 형성하고,
상기 장기 모사 칩은 상부 유체채널 (232)과 하부 유체채널 (242) 및 상기 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절할 수 있는 상부 유체채널 유속 조절부 (3)를 포함한다.
또한, 상기 장기 모사 칩 구조체는
기판 (25), 상기 기판 (25) 위에 적층되는 하부채널 패턴층 (24), 상기 하부채널 패턴층 (24) 위에 적층되는 상부채널 패턴층 (22), 및 상기 상부채널 패턴층 (22) 위에 적층되는 칩 프레임 (21)을 포함하도록 형성되고,
제1 배양액 챔버 (241); 제2 배양액 챔버 (231); 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각을 삽입할 수 있도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성되는 하나 이상의 인서트 결합부 (26); 제1 배양액 출구 (243); 제2 배양액 출구 (233);
상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 인서트 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243) 사이에서 제1 배양액 (240)의 이동이 가능하도록 상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 인서트 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243)를 연결하는 하부 유체채널 (242)을 포함하며,
상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 인서트 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233) 사이에서 제2 배양액 (230)의 이동이 가능하도록 상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 인서트 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233)를 연결하는 상부 유체채널 (232)을 포함하며,
인서트 (1)는 상기 칩 프레임 (21), 상기 상부채널 패턴층 (22), 상기 하부 채널 패턴층 (24)을 관통하여 수직 방향으로 형성되며, 인서트 세포배양 챔버 (111)가 내부에 형성되며, 상기 인서트 (1)의 일측에 다공성 막 (112)이 형성되며, 상기 다공성 막 (112)의 양측 표면에 각각 상피 세포와 내피 세포가 배양되며,
상부 유체채널 유속 조절부 (3)는 상기 칩 프레임 (21)에 형성되며, 상기 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절하여 상부 유체채널 (232)의 유속을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 장기 모사 칩 구조체는 (가) 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈에 동일한 종류의 장기가 모사된 것이거나 또는 (나) 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈에 각각 다른 종류의 장기가 모사된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 장기 모사 칩 구조체의 상기 칩 프레임 (21)은 탄성 재질로 형성될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 장기 모사 칩 구조체에서 상기 상부 유체채널 유속 조절부 (3)는 나사, 중량체 또는 탄성체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 장기 모사 칩 구조체에서 상기 하부 유체채널 (242)은 장기의 내강을 모사하고, 상기 상부 유체채널 (232)은 장기의 내측을 모사하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 장기 모사 칩 구조체에서 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각에 공급되는 배지의 성분 및 양은, 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각에서 배양되는 세포별 배양 요구조건을 고려하여 개별적으로 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 장기 모사 칩 구조체는 시험대상 약물의 약동학 거동을 시험하는 용도로 이용할 수 있다.
본 발명은 인서트에 세포를 배양하는 방법에 있어서,
(a) 다공성 막 (112)을 포함하는 하나 이상의 인서트 (1)를 준비하는 단계;
(b) 상측에 하나 이상의 배양액 주입구 (51)와 이에 대응하는 하측에 하나 이상의 인서트 삽입구 (52)가 구비된 배양 플레이트 (5)에 다공성 막 (112)이 위쪽으로 향하도록 인서트 (1)를 인서트 삽입구 (52)에 장착하는 단계;
(c) 배양 플레이트 (5)에 장착한 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층 (6)을 형성하는 단계;
(d) 콜라겐 층 (6) 위에 상피세포 (41)를 시드하고 배양액 주입구 (51)에 배양액을 가하는 단계;
(e) 배양액이 있는 상태에서 상피세포 (41)를 배양하여 상피세포층을 형성하는 단계;
(f) 배양 플레이트 (5)를 뒤집어 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층을 형성하는 단계; 및
(g) 콜라겐 층 위에 내피세포 (42)를 시드하고 배양액을 가하고 배양하여 내피세포층을 형성하는 단계;를 포함하는, 인서트에 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인서트에 세포를 배양하는 방법에 있어서,
(a) 다공성 막 (112)을 포함하는 하나 이상의 인서트 (1)를 준비하는 단계;
(b) 상측에 하나 이상의 배양액 주입구 (51)와 이에 대응하는 하측에 하나 이상의 인서트 삽입구 (52)가 구비되며, 배양액 주입구 (51)와 인서트 삽입구 (52)가 서로 연결되어 형성된 배양 플레이트 (5)에 다공성 막 (112)이 위쪽으로 향하도록 인서트 (1)를 인서트 삽입구 (52)에 장착하는 단계;
(c) 배양 플레이트 (5)의 하측에 장착한 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층 (6)을 형성하는 단계;
(d) 콜라겐 층 (6) 위에 상피세포 (41)를 시드하고 배양액 주입구 (51)에 배양액을 가하는 단계;
(e) 배양액이 있는 상태에서 상피세포 (41)를 배양하여 상피세포층을 형성하는 단계;
(f) 상피세포층이 형성된 인서트 (1)를 배양 플레이트 (5)로부터 분리하여 칩 (2)의 인서트 결합부 (26)에 삽입, 고정하는 단계;
(g) 칩 (2)에 고정된 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층을 형성하는 단계; 및
(h) 상기 (g) 단계에서 형성된 콜라겐 층 위에 내피세포 (42)를 시드하고 배양액을 가하고 배양하여 내피세포층을 형성하는 단계;를 포함하는, 인서트에 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 장기 모사 칩 제조 방법에 있어서,
(a) 다공성 막 (112)과 세포배양 챔버 (111)를 포함하는 하나 이상의 인서트 (1)를 준비하고, 상기 하나 이상의 인서트 (1) 각각에서 다공성 막 (112)의 양측에 상피세포와 내피세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 인서트 (1)를 삽입할 수 있는 칩을 준비하는 단계;
(c) 배양된 세포를 가진 상기 하나 이상의 인서트 (1)를 상기 칩에 삽입 배치하여 인서트 모듈 결합 칩을 형성하는 단계; 및
(d) 장기가 모사된 장기 모사 칩 구조체를 형성하도록 상기 인서트 모듈 결합 칩에 대해 제1 배양액과 제2 배양액을 가하는 단계;를 포함하며,
상기 장기 모사 칩은
기판 (25), 상기 기판 위에 적층되는 하부채널 패턴층 (24), 상기 하부채널 패턴층 (24) 위에 적층되는 상부채널 패턴층 (22), 및 상기 상부채널 패턴층 (22) 위에 적층되는 칩 프레임 (21)을 포함하도록 형성되고,
제1 배양액 챔버 (241); 제2 배양액 챔버 (231); 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각을 삽입 가능하도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성되는 하나 이상의 인서트 결합부 (26); 제1 배양액 출구 (243); 제2 배양액 출구 (233);를 포함하도록 형성되며,
상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243) 사이에서 제1 배양액 (240)의 이동이 가능하도록 상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243)를 연결하는 하부 유체채널 (242)을 포함하도록 형성되며,
상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233) 사이에서 제2 배양액 (230)의 이동이 가능하도록 상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233)를 연결하는 상부 유체채널 (232)을 포함하도록 형성되며,
제1 배양액 챔버 (241)는 상기 칩 프레임 (21)부터 상부채널 패턴층 (22), 하부채널 패턴층 (24)을 상하 방향으로 관통한 후 하부채널 패턴층 내에 수평 방향으로 형성된 하부 유체채널 (242)과 연결되고, 상기 하부 유체채널 (242)은 제1 배양액 출구 (243)와 연결되고,
제2 배양액 챔버 (231)는 상기 칩 프레임 (21)부터 상부채널 패턴층 (22)을 상하 방향으로 관통한 다음 상부채널 패턴층 (22) 내에 수평 방향으로 형성된 상부 유체채널 (232)과 연결되고, 상기 상부 유체채널 (232)은 제2 배양액 출구 (233)와 연결되고,
인서트 (1)는 상기 칩 프레임 (21), 상기 상부채널 패턴층 (22), 상기 하부 채널 패턴층 (24)을 관통하여 수직 방향으로 형성되며,
상부 유체채널 유속 조절부 (3)는 상기 칩 프레임 (21)에 형성되며, 상기 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절하여 상부 유체채널 (232)의 유속을 조절하도록 형성된 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 장기 모사 칩 제조 방법에 있어서,
(a) 다공성 막 (112)을 포함하는 하나 이상의 인서트 (1)를 준비하는 단계;
(b) 상측에 하나 이상의 배양액 주입구 (51)와 이에 대응하는 하측에 하나 이상의 인서트 삽입구 (52)가 구비되며, 배양액 주입구 (51)와 인서트 삽입구 (52)가 서로 연결되어 형성된 배양 플레이트 (5)의 인서트 삽입구 (52)에 다공성 막 (112)이 위쪽으로 향하도록 인서트 (1)를 장착하는 단계;
(c) 장착한 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층 (6)을 형성하는 단계;
(d) 콜라겐 층 (6) 위에 상피세포 (41)를 시드하고 배양액 주입구 (51)에 배양액을 가하는 단계;
(e) 배양액이 있는 상태에서 상피세포 (41)를 배양하여 상피세포층을 형성하는 단계;
(f) 상기 하나 이상의 인서트 (1)를 삽입할 수 있는 칩을 준비하는 단계;
(g) 칩 (2)의 인서트 결합부 (26)에 상피세포층이 형성된 인서트 (1)를 배양 플레이트 (5)로부터 분리하여 상피세포층이 인서트 (1)의 다공성 막 아래에 위치하도록 삽입, 고정하는 단계;
(h) 칩 (2)에 고정된 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층을 형성하는 단계;
(i) 상기 (g) 단계에서 형성된 콜라겐 층 위에 내피세포 (42)를 시드하고 배양액을 가하고 배양하여 내피세포층을 형성하는 단계; 및
(j) 장기가 모사된 장기 모사 칩 구조체를 형성하도록 상기 인서트가 삽입, 고정된 칩에 대해 제1 배양액과 제2 배양액을 가하는 단계;를 포함하며,
상기 (j) 단계의 장기 모사 칩 구조체는
기판 (25), 상기 기판 위에 적층되는 하부채널 패턴층 (24), 상기 하부채널 패턴층 (24) 위에 적층되는 상부채널 패턴층 (22), 및 상기 상부채널 패턴층 (22) 위에 적층되는 칩 프레임 (21)을 포함하도록 형성되고,
제1 배양액 챔버 (241); 제2 배양액 챔버 (231); 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각을 삽입 가능하도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성되는 하나 이상의 인서트 결합부 (26); 제1 배양액 출구 (243); 제2 배양액 출구 (233);를 포함하도록 형성되며,
상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243) 사이에서 제1 배양액 (240)의 이동이 가능하도록 상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243)를 연결하는 하부 유체채널 (242)을 포함하도록 형성되며,
상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233) 사이에서 제2 배양액 (230)의 이동이 가능하도록 상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233)를 연결하는 상부 유체채널 (232)을 포함하도록 형성되며,
제1 배양액 챔버 (241)는 상기 칩 프레임 (21)부터 상부채널 패턴층 (22), 하부채널 패턴층 (24)을 상하 방향으로 관통한 후 하부채널 패턴층 내에 수평 방향으로 형성된 하부 유체채널 (242)과 연결되고, 상기 하부 유체채널 (242)은 제1 배양액 출구 (243)와 연결되고,
제2 배양액 챔버 (231)는 상기 칩 프레임 (21)부터 상부채널 패턴층 (22)을 상하 방향으로 관통한 다음 상부채널 패턴층 (22) 내에 수평 방향으로 형성된 상부 유체채널 (232)과 연결되고, 상기 상부 유체채널 (232)은 제2 배양액 출구 (233)와 연결되고,
인서트 (1)는 상기 칩 프레임 (21), 상기 상부채널 패턴층 (22), 상기 하부 채널 패턴층 (24)을 관통하여 수직 방향으로 형성되며,
상부 유체채널 유속 조절부 (3)는 상기 칩 프레임 (21)에 형성되며, 상기 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절하여 상부 유체채널 (232)의 유속을 조절하도록 형성된 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 장기 모사 칩 구조체가 (가) 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈에 동일한 종류의 장기 세포를 배양한 것 또는 (나) 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈에 각각 다른 종류의 장기 세포를 배양한 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 칩 프레임 (21)이 탄성 재질로 형성되는 것을 특징으로 하는, 장기 모사 칩 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상부 유체채널 유속 조절부 (3)가 나사, 중량체 또는 전자석을 포함하여 제작된 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각에 공급되는 배지의 성분 및 양은, 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각에서 배양되는 세포별 배양 요구조건을 고려하여 개별적으로 조절하는 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 칩 구조체 제조방법에 있어서, 칩에 제1 배양액과 제2 배양액을 가하는 단계 이후 상부 유체채널 유속 조절부 (3)를 조절하는 단계;가 부가되는 것을 특징으로 하는 장기 모사 칩 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
이뿐만 아니라, 본 발명은 일정 두께의 판상 프레임의 일측에 인서트를 끼우는 하나 이상의 인서트 삽입구 (52)가 형성되고, 인서트 삽입구 (52)의 맞은편인 판상 프레임의 타측에 배양액 주입구 (51)가 형성되며, 배양액 주입구 (51)와 인서트 삽입구 (52)가 서로 연결된 인서트 세포 배양용 플레이트 (5)에 관한 것이다.
인서트 (1)를 플레이트 (5)의 인서트 삽입구 (52)에 삽입하는 방식에 특별한 제한은 없으나, 억지끼움 하거나 또는 스크류 형식으로 돌려끼워 쉽게 빠지지 않고 안정적으로 고정되도록 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인서트 세포 배양용 플레이트 (5)가 상피세포 (41) 또는 내피세포 (42) 배양시 플레이트 (5)를 뒤집어서 사용 가능한, 인서트 세포 배양용 플레이트 (5)에 관한 것이다. 상기 인서트 세포 배양용 플레이트 (5)는 상피세포 또는 내피세포 배양시 플레이트 (5)를 뒤집어서 사용할 수 있으므로, 인서트 (1)의 다공성 막 (112)의 위쪽과 아래쪽에 각각 상피세포와 내피세포를 용이하게 배양할 수 있다.
본 발명의 장기 모사 칩 제조방법은 인서트 세포 배양용 플레이트를 이용함으로써 인서트의 다공성 막 위쪽과 아래쪽으로 각각 상피세포와 내피세포를 손쉽게 배양할 수 있어 생체의 장기 조직과 좀 더 유사한 환경을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 장기 모사 칩 제조방법은 모사 대상 장기에 따라 및/또는 고혈압과 같은 특정 질병에 따라 및/또는 환자의 개별 특징에 따라 유체채널의 단면적을 간단한 방법으로 조절할 수 있으므로 장기별 및/또는 질병별 및/또는 개인별 특성에 따른 시험대상 약물의 약동학을 좀 더 정확하게 시험할 수 있다.
도 1a와 도 1b는 생체조직 모사 칩의 측면 모식도이다. 도 1a는 단일 장기 조직 칩이고, 도 1b는 다중 장기 조직 칩이다.
도 2a와 도 2b는 인서트를 장기 조직 칩에 장착한 모습을 나타낸 것이다. 좌측은 아래에서부터 차례로 하부 채널 패턴층, 중간 분리 패턴층, 상부 채널 패턴층 및 칩 프레임의 평면도이다. 도 2a는 단일 장기 조직 칩에 인서트를 장착한 모양이고, 도 2b는 다중 장기 조직 칩에 인서트를 장착한 모양이다.
도 3은 세포가 배양된 인서트가 장착된 장기 조직 칩에 제1 배양액과 제2 배양액을 넣은 상태를 나타낸다. (a) 인서트 배양 플레이트, (b) 인서트 배양 플레이트에 인서트를 뒤집은 상태로 끼우고, 다공성 막 위에 콜라겐층을 형성하고, 그 위에 상피세포를 부착 및 배양하는 모식도, (c) 상피세포가 배양된 인서트를 장기 조직 칩에 끼워넣고 다공성 막 위에 콜라겐 층을 형성하고, 그 위에 내피세포를 부착 및 배양한 상태를 나타낸 모식도.
도 4는 인서트 배양 플레이트의 3D 모식도이다.
도 5는 인서트 배양 플레이트에 인서트를 끼운 상태 사진이다. 왼쪽 위 사진은 인서트 배양 플레이트 아래쪽에 인서트를 끼운 상태이며, 오른쪽 위 사진은 인서트에 배양액 (핑크색 액체)을 넣은 상태의 사진이고, 아래쪽 사진은 인서트를 끼운 상태의 인서트 배양 플레이트의 측면 사진이다.
도 2a와 도 2b는 인서트를 장기 조직 칩에 장착한 모습을 나타낸 것이다. 좌측은 아래에서부터 차례로 하부 채널 패턴층, 중간 분리 패턴층, 상부 채널 패턴층 및 칩 프레임의 평면도이다. 도 2a는 단일 장기 조직 칩에 인서트를 장착한 모양이고, 도 2b는 다중 장기 조직 칩에 인서트를 장착한 모양이다.
도 3은 세포가 배양된 인서트가 장착된 장기 조직 칩에 제1 배양액과 제2 배양액을 넣은 상태를 나타낸다. (a) 인서트 배양 플레이트, (b) 인서트 배양 플레이트에 인서트를 뒤집은 상태로 끼우고, 다공성 막 위에 콜라겐층을 형성하고, 그 위에 상피세포를 부착 및 배양하는 모식도, (c) 상피세포가 배양된 인서트를 장기 조직 칩에 끼워넣고 다공성 막 위에 콜라겐 층을 형성하고, 그 위에 내피세포를 부착 및 배양한 상태를 나타낸 모식도.
도 4는 인서트 배양 플레이트의 3D 모식도이다.
도 5는 인서트 배양 플레이트에 인서트를 끼운 상태 사진이다. 왼쪽 위 사진은 인서트 배양 플레이트 아래쪽에 인서트를 끼운 상태이며, 오른쪽 위 사진은 인서트에 배양액 (핑크색 액체)을 넣은 상태의 사진이고, 아래쪽 사진은 인서트를 끼운 상태의 인서트 배양 플레이트의 측면 사진이다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
장치 제작
본 발명의 일 실시예에 의한 장기 모사 칩은 기판, PDMS (Polydimethylsiloxane)로 제조된 상부 채널 패턴층, 중간 분리 패턴층 및 하부 채널 패턴층, PC (Polycarbonate)로 제조된 칩 프레임 및 인서트를 포함한다 (도 1a, 도 1b). 양각된 알루미늄 금속 몰드를 사용하여 폭 0.25 mm, 높이 0.2 mm인 미세유체 채널이 패턴된 PDMS 층 (하부채널 패턴층, 상부채널 패턴층, 중간분리 패턴층)을 제작하였다. PDMS는 실리콘 탄성 주제 (Silicone Elastomer Base)와 실리콘 탄성 경화제 (Silicone Elastomer Curing Agent; Sylgard 184, K1 solution)를 10:1로 섞어 사용하였다. 몰드에 들어있는 PDMS의 윗면을 밀어 평평하게 만들어 주었다. PDMS 층 위에 PET 필름을 기포가 생기지 않도록 얹었다. 무게가 있는 중량체로 덮고 양쪽 사이드를 클립으로 고정한 후 80 ℃ 오븐에서 1시간 동안 열을 가하여 굳혔다. 몰드로부터 PDMS를 떼어내고 필요한 부분에 바이오 펀치로 홀을 형성하였다.
PC 층 (칩 프레임)은 PC 기판을 기계적으로 가공하여 배지를 넣을 수 있는 배지챔버와 인서트를 끼울 수 있는 인서트 챔버로 제작하였다.
O2 플라즈마 처리를 통해 유리 기판과 PDMS 3개의 층 즉, 하부채널 패턴층, 중간 분리 패턴층, 상부채널 패턴층을 부착하였다.
PC 층 (칩 프레임)에 양면테이프를 기포가 생기지 않게 붙인 후 필요한 부분에 바이오 펀치로 홀을 형성하였다. 칩 프레임의 양면테이프를 제거하고 상부채널 패턴층에 단단하게 붙였다.
인서트 세포배양 챔버에 오링을 끼운 후 오토클레이브에서 121 ℃로 5분간 처리하였다.
칩 구조체 한 쪽 끝에 위치한 제1 배양액 챔버, 제2 배양액 챔버 및 다른 쪽 끝에 위치한 제1 배양액 출구 및 제2 배양액 출구는 PDMS 층에 형성된 상부 유체채널 및 하부 유체채널을 통하여 기울인 상태에서 중력에 의해 높은 쪽 챔버에서 낮은 쪽 출구로 배지가 흐름에 따라 그 사이에 위치한 인서트들의 다공성 막을 통과하여 흐르게 된다.
인서트 세포배양 챔버 내 측면에는 인서트를 나사식으로 고정할 수 있도록 스크류 와 오링을 끼울 수 있는 홈을 만들었다. 인서트도 PC 재질을 사용할 수 있으며, 인서트 외부 측면에도 칩에 끼울 수 있도록 스크류 가공을 하고, 세포 배양을 위해 기공 직경이 0.45 μm이고, 기공 밀도가 3.5x106 pores/cm2인 다공성 막 (Polyester Membrane filter, It4ip)을 에폭시 (Resin + hardener, 하이템프코리아)를 사용하여 인서트 하단부에 부착하고, 24시간 건조한 후 칩 프레임에 조립하였다.
세포배양 및 배양 조건
에폭시가 굳기 전에 인서트 위에 에폭시를 얇게 바른 후 다공성 막 (0.4 μm, 5.6mm)을 붙이고 하루 동안 굳힌 후 오토클레이브 (121도, 5분)로 처리하였다.
콜라겐 1 (5mg/ml) : NaHCO3 : HEPES = 8 : 1 : 1로 섞어 콜라겐 용액을 만들었다.
인서트 (1)를 인서트 세포 배양 플레이트 (5)에 끼운 후 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위쪽에 콜라겐 용액을 5 ul씩 골고루 펴지게 넣고 30분간 인큐베이터 (37 ℃, 5%)에 넣어 코팅하였다.
내피세포의 일종으로서 HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells; 3 X 106 cell/ml)을 100 ul씩 콜라겐 용액 코팅으로 콜라겐 층 (6)이 형성된 인서트에 넣고 1시간 동안 5% CO2, 37 ℃ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 배지로는 시판 중인 내피세포 성장 배지를 사용하였고 실험에는 계대번호 6~8번의 세포가 사용되었다.
칩의 하부 유체채널과 상부 유체채널을 PBS로 1회, 배지로 1회 이상 세척하였다. 상부 유체채널은 REGM (Renal epithelial cell growth medium)으로, 하부 유체채널은 EGM2 (Epithelial cell growth medium 2)로 세척하였다.
시딩이 끝난 인서트 (1)는 플레이트 (5)에 장착된 상태로 하루 동안 배양하였다. 하루 뒤 플레이트 (5)에서 인서트 (1)를 회수하여 칩의 인서트 결합부 (26)와 오링 (12)이 장착된 칩 (2)에 끼운 후 세포배양 챔버 (111)에 배지를 조금 가하고 하부 유체채널 (242)에 EGM2를 추가하였다. 인서트의 다공성 막 (112) 위쪽으로 올라온 용액을 제거하고, 인서트 다공성 막 (112) 위쪽에 콜라겐 용액을 5 ul씩 골고루 펴지게 넣고 30분간 37 ℃, 5% CO2로 배양하였다.
상피세포의 일종으로서 RPTEC (renal primary tubule epithelail cell, Lonza)은 5% CO2, 37 ℃ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. RPTEC의 배양 배지는 REGM(REBM 500mL, hEGF 0.5mL, Insulin 0.5mL, Hydrocortisone 0.5mL, GA-1000 0.5%, FBS 2.5mL Transferrin 0.5mL, Triiodothyronine 0.5mL, Epinephrine 0.5mL)을 사용하였고 실험에는 계대번호 6~8번 정도의 세포가 사용되었다.
RPTEC (3 × 106 cells/ml)을 100 ul씩 인서트에 넣고 1시간 동안 배양하였다. 인서트에 REGM 배지, 인서트 세포배양 챔버에 각기 알맞은 배지를 채워 장기 모사 칩 구조체를 완성하였다. rocker에 10°, 500초 간격으로 3, 7, 14일간 배양하였다.
1: 인서트 11: 인서트 구조물
111: 인서트 세포배양 챔버 112: 다공성 분리막
12: 오링 13: 상부 유체채널 연결구멍
2: 칩 21: 칩 프레임
22: 상부 채널 패턴층 23: 중간 분리 패턴층
230: 제2 배양액 231: 제2 배양액 챔버
232: 상부 유체채널 233: 제2 배양액 출구
24: 하부 채널 패턴층 240: 제1 배양액
241: 제1 배양액 챔버 242: 하부 유체채널
243: 제1 배양액 출구 25: 기판
26: 인서트 결합부 3: 유속 조절부
41: 상피세포 42: 내피세포
5: 인서트 세포 배양 플레이트 51: 배양액 주입구
52: 인서트 삽입구 6: 콜라겐 층
111: 인서트 세포배양 챔버 112: 다공성 분리막
12: 오링 13: 상부 유체채널 연결구멍
2: 칩 21: 칩 프레임
22: 상부 채널 패턴층 23: 중간 분리 패턴층
230: 제2 배양액 231: 제2 배양액 챔버
232: 상부 유체채널 233: 제2 배양액 출구
24: 하부 채널 패턴층 240: 제1 배양액
241: 제1 배양액 챔버 242: 하부 유체채널
243: 제1 배양액 출구 25: 기판
26: 인서트 결합부 3: 유속 조절부
41: 상피세포 42: 내피세포
5: 인서트 세포 배양 플레이트 51: 배양액 주입구
52: 인서트 삽입구 6: 콜라겐 층
Claims (11)
- 인서트에 세포를 배양하는 방법에 있어서,
(a) 다공성 막 (112)을 포함하는 하나 이상의 인서트 (1)를 준비하는 단계;
(b) 상측에 하나 이상의 배양액 주입구 (51)와 이에 대응하는 하측에 하나 이상의 인서트 삽입구 (52)가 구비된 배양 플레이트 (5)에 다공성 막 (112)이 위쪽으로 향하도록 인서트 (1)를 인서트 삽입구 (52)에 장착하는 단계;
(c) 배양 플레이트 (5)에 장착한 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층 (6)을 형성하는 단계;
(d) 콜라겐 층 (6) 위에 상피세포 (41)를 시드하고 배양액 주입구 (51)에 배양액을 가하는 단계;
(e) 배양액이 있는 상태에서 상피세포 (41)를 배양하여 상피세포층을 형성하는 단계;
(f) 배양 플레이트 (5)를 뒤집어 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층을 형성하는 단계; 및
(g) 콜라겐 층 위에 내피세포 (42)를 시드하고 배양액을 가하고 배양하여 내피세포층을 형성하는 단계;를 포함하는, 인서트에 세포를 배양하는 방법.
- 인서트에 세포를 배양하는 방법에 있어서,
(a) 다공성 막 (112)을 포함하는 하나 이상의 인서트 (1)를 준비하는 단계;
(b) 상측에 하나 이상의 배양액 주입구 (51)와 이에 대응하는 하측에 하나 이상의 인서트 삽입구 (52)가 구비되며, 배양액 주입구 (51)와 인서트 삽입구 (52)가 서로 연결되어 형성된 배양 플레이트 (5)의 인서트 삽입구 (52)에 다공성 막 (112)이 위쪽으로 향하도록 인서트 (1)를 장착하는 단계;
(c) 장착한 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층 (6)을 형성하는 단계;
(d) 콜라겐 층 (6) 위에 상피세포 (41)를 시드하고 배양액 주입구 (51)에 배양액을 가하는 단계;
(e) 배양액이 있는 상태에서 상피세포 (41)를 배양하여 상피세포층을 형성하는 단계;
(f) 상피세포층이 형성된 인서트 (1)를 배양 플레이트 (5)로부터 분리하여 칩 (2)의 인서트 결합부 (26)에 삽입, 고정하는 단계;
(g) 칩 (2)에 고정된 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층을 형성하는 단계; 및
(h) 상기 (g) 단계에서 형성된 콜라겐 층 위에 내피세포 (42)를 시드하고 배양액을 가하고 배양하여 내피세포층을 형성하는 단계;를 포함하는, 인서트에 세포를 배양하는 방법.
- 장기 모사 칩 제조 방법에 있어서,
(a) 다공성 막 (112)과 세포배양 챔버 (111)를 포함하는 하나 이상의 인서트 (1)를 준비하고, 상기 하나 이상의 인서트 (1) 각각에서 다공성 막 (112)의 양측에 상피세포와 내피세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 인서트 (1)를 삽입할 수 있는 칩을 준비하는 단계;
(c) 배양된 세포를 가진 상기 하나 이상의 인서트 (1)를 상기 칩에 삽입 배치하여 인서트 모듈 결합 칩을 형성하는 단계; 및
(d) 장기가 모사된 장기 모사 칩 구조체를 형성하도록 상기 인서트 모듈 결합 칩에 대해 제1 배양액과 제2 배양액을 가하는 단계;를 포함하며,
상기 장기 모사 칩은
기판 (25), 상기 기판 위에 적층되는 하부채널 패턴층 (24), 상기 하부채널 패턴층 (24) 위에 적층되는 상부채널 패턴층 (22), 및 상기 상부채널 패턴층 (22) 위에 적층되는 칩 프레임 (21)을 포함하도록 형성되고,
제1 배양액 챔버 (241); 제2 배양액 챔버 (231); 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각을 삽입 가능하도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성되는 하나 이상의 인서트 결합부 (26); 제1 배양액 출구 (243); 제2 배양액 출구 (233);를 포함하도록 형성되며,
상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243) 사이에서 제1 배양액 (240)의 이동이 가능하도록 상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243)를 연결하는 하부 유체채널 (242)을 포함하도록 형성되며,
상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233) 사이에서 제2 배양액 (230)의 이동이 가능하도록 상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233)를 연결하는 상부 유체채널 (232)을 포함하도록 형성되며,
제1 배양액 챔버 (241)는 상기 칩 프레임 (21)부터 상부채널 패턴층 (22), 하부채널 패턴층 (24)을 상하 방향으로 관통한 후 하부채널 패턴층 내에 수평 방향으로 형성된 하부 유체채널 (242)과 연결되고, 상기 하부 유체채널 (242)은 제1 배양액 출구 (243)와 연결되고,
제2 배양액 챔버 (231)는 상기 칩 프레임 (21)부터 상부채널 패턴층 (22)을 상하 방향으로 관통한 다음 상부채널 패턴층 (22) 내에 수평 방향으로 형성된 상부 유체채널 (232)과 연결되고, 상기 상부 유체채널 (232)은 제2 배양액 출구 (233)와 연결되고,
인서트 (1)는 상기 칩 프레임 (21), 상기 상부채널 패턴층 (22), 상기 하부 채널 패턴층 (24)을 관통하여 수직 방향으로 형성되며,
상부 유체채널 유속 조절부 (3)는 상기 칩 프레임 (21)에 형성되며, 상기 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절하여 상부 유체채널 (232)의 유속을 조절하도록 형성된 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조 방법.
- 장기 모사 칩 제조 방법에 있어서,
(a) 다공성 막 (112)을 포함하는 하나 이상의 인서트 (1)를 준비하는 단계;
(b) 상측에 하나 이상의 배양액 주입구 (51)와 이에 대응하는 하측에 하나 이상의 인서트 삽입구 (52)가 구비되며, 배양액 주입구 (51)와 인서트 삽입구 (52)가 서로 연결되어 형성된 배양 플레이트 (5)의 인서트 삽입구 (52)에 다공성 막 (112)이 위쪽으로 향하도록 인서트 (1)를 장착하는 단계;
(c) 장착한 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층 (6)을 형성하는 단계;
(d) 콜라겐 층 (6) 위에 상피세포 (41)를 시드하고 배양액 주입구 (51)에 배양액을 가하는 단계;
(e) 배양액이 있는 상태에서 상피세포 (41)를 배양하여 상피세포층을 형성하는 단계;
(f) 상기 하나 이상의 인서트 (1)를 삽입할 수 있는 칩을 준비하는 단계;
(g) 칩 (2)의 인서트 결합부 (26)에 상피세포층이 형성된 인서트 (1)를 배양 플레이트 (5)로부터 분리하여 상피세포층이 인서트 (1)의 다공성 막 아래에 위치하도록 삽입, 고정하는 단계;
(h) 칩 (2)에 고정된 인서트 (1)의 다공성 막 (112) 위에 콜라겐 층을 형성하는 단계;
(i) 상기 (g) 단계에서 형성된 콜라겐 층 위에 내피세포 (42)를 시드하고 배양액을 가하고 배양하여 내피세포층을 형성하는 단계; 및
(j) 장기가 모사된 장기 모사 칩 구조체를 형성하도록 상기 인서트가 삽입, 고정된 칩에 대해 제1 배양액과 제2 배양액을 가하는 단계;를 포함하며,
상기 (j) 단계의 장기 모사 칩 구조체는
기판 (25), 상기 기판 위에 적층되는 하부채널 패턴층 (24), 상기 하부채널 패턴층 (24) 위에 적층되는 상부채널 패턴층 (22), 및 상기 상부채널 패턴층 (22) 위에 적층되는 칩 프레임 (21)을 포함하도록 형성되고,
제1 배양액 챔버 (241); 제2 배양액 챔버 (231); 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈 각각을 삽입 가능하도록 상측이 개구된 상태로 하향 함몰 형성되는 하나 이상의 인서트 결합부 (26); 제1 배양액 출구 (243); 제2 배양액 출구 (233);를 포함하도록 형성되며,
상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243) 사이에서 제1 배양액 (240)의 이동이 가능하도록 상기 제1 배양액 챔버 (241)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제1 배양액 출구 (243)를 연결하는 하부 유체채널 (242)을 포함하도록 형성되며,
상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233) 사이에서 제2 배양액 (230)의 이동이 가능하도록 상기 제2 배양액 챔버 (231)와 상기 하나 이상의 세포배양 챔버 (111)와 상기 제2 배양액 출구 (233)를 연결하는 상부 유체채널 (232)을 포함하도록 형성되며,
제1 배양액 챔버 (241)는 상기 칩 프레임 (21)부터 상부채널 패턴층 (22), 하부채널 패턴층 (24)을 상하 방향으로 관통한 후 하부채널 패턴층 내에 수평 방향으로 형성된 하부 유체채널 (242)과 연결되고, 상기 하부 유체채널 (242)은 제1 배양액 출구 (243)와 연결되고,
제2 배양액 챔버 (231)는 상기 칩 프레임 (21)부터 상부채널 패턴층 (22)을 상하 방향으로 관통한 다음 상부채널 패턴층 (22) 내에 수평 방향으로 형성된 상부 유체채널 (232)과 연결되고, 상기 상부 유체채널 (232)은 제2 배양액 출구 (233)와 연결되고,
인서트 (1)는 상기 칩 프레임 (21), 상기 상부채널 패턴층 (22), 상기 하부 채널 패턴층 (24)을 관통하여 수직 방향으로 형성되며,
상부 유체채널 유속 조절부 (3)는 상기 칩 프레임 (21)에 형성되며, 상기 상부 유체채널 (232)의 단면적을 조절하여 상부 유체채널 (232)의 유속을 조절하도록 형성된 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조 방법.
- 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
상기 장기 모사 칩 구조체는
(가) 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈에 동일한 종류의 장기 세포를 배양한 것 또는
(나) 상기 하나 이상의 인서트 (1) 모듈에 각각 다른 종류의 장기 세포를 배양한 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조방법.
- 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
상기 칩 프레임 (21)은 탄성 재질로 형성되는, 장기 모사 칩 구조체의 제조방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상부 유체채널 유속 조절부 (3)는 나사, 중량체 또는 전자석을 포함하여 제작된 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조방법.
- 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
상기 하나 이상의 인서트 (1) 각각에 공급되는 배지의 성분 및 양은, 상기 하나 이상의 인서트 (1) 각각에서 배양되는 세포별 배양 요구조건을 고려하여 개별적으로 조절하는 것인, 장기 모사 칩 구조체의 제조방법.
- 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
칩에 제1 배양액과 제2 배양액을 가하는 단계 이후 상부 유체채널 유속 조절부 (3)를 조절하는 단계;가 부가되는 것을 특징으로 하는 장기 모사 칩 구조체의 제조방법.
- 일정 두께의 판상 프레임의 일측에 인서트를 끼우는 하나 이상의 인서트 삽입구 (52)가 형성되고, 인서트 삽입구 (52)의 맞은편에 하나 이상의 배양액 주입구 (51)가 형성되며, 배양액 주입구 (51)와 인서트 삽입구 (52)가 서로 연결되어 형성된 인서트 세포 배양용 플레이트 (5).
- 청구항 10에 있어서,
상기 인서트 세포 배양용 플레이트 (5)는 상피세포 (41) 또는 내피세포 (42) 배양시 플레이트 (5)를 뒤집어서 사용 가능한, 인서트 세포 배양용 플레이트 (5).
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023195689A1 (ko) | 2023-10-12 |
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