KR20230141206A - Real time pcr primers for detection of genetically modified maize - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자변형(Genetically Modified, GM) 옥수수 검출용 조성물, 키트, 이를 이용한 검출방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition and kit for detecting genetically modified (GM) corn, and a detection method and screening method using the same.
Description
본 발명은 유전자변형(Genetically Modified, GM) 옥수수 검출용 조성물, 키트, 이를 이용한 검출방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition and kit for detecting genetically modified (GM) corn, and a detection method and screening method using the same.
옥수수(Zea mays spp.)는 세계 많은 지역에서 중요한 농작물이며, 주요 식품공급원이다. 작물학적 형질들 및 생산물 품질의 개선을 위해 생물공학 방법들이 옥수수에 적용되어왔다. 2020년 한국은 식용 및 농업용으로 유전자변형생물체를 1,197만 톤 수입하였으며, 이 중 90%인 1,078만 톤이 '유전자변형(Genetically Modified, GM) 옥수수'이다.Maize ( Zea mays spp.) is an important crop and a major food source in many parts of the world. Biotechnology methods have been applied to maize to improve agronomic traits and product quality. In 2020, Korea imported 11.97 million tons of genetically modified organisms for food and agricultural purposes, of which 10.78 million tons, or 90%, was 'Genetically Modified (GM) corn.'
한국은 쌀, 보리, 밀, 옥수수 등 주요 곡류의 해외 의존도가 높고, 특히 옥수수의 경우 자급률이 0.7% 수준으로 매년 100만 톤 이상을 미국, 브라질, 아르헨티나 등을 통해 수입하고 있는 실정이며, 이들 수출국의 대부분은 유전자변형 옥수수를 대량으로 생산하고 있는 국가이다.Korea is highly dependent on foreign countries for major grains such as rice, barley, wheat, and corn. In particular, in the case of corn, the self-sufficiency rate is at the level of 0.7%, and more than 1 million tons are imported every year through the United States, Brazil, and Argentina, and these export countries. Most of the countries are producing genetically modified corn in large quantities.
유전자변형식품에 대한 관리 및 소비자의 알 권리 보장을 위하여 한국을 포함한 세계 각 국은 표시제도를 시행하고 있으며, 이에 따라 유전자변형식품에 대한 검사를 진행하고 있다. 그러나, 점점 다양한 유전자변형 옥수수가 개발됨에 따라 기존 유전자변형 옥수수의 존재 유무를 판단할 수 있는 스크리닝 방법으로는 모든 유전자변형 옥수수를 검출하기 위한 목적 및 기능을 충족시키지 못하는 현실적인 한계가 있다.In order to manage genetically modified foods and guarantee consumers' right to know, countries around the world, including Korea, are implementing labeling systems and conducting tests on genetically modified foods accordingly. However, as more and more diverse genetically modified corns are developed, existing screening methods that can determine the presence or absence of genetically modified corn have realistic limitations in that they do not meet the purpose and function of detecting all genetically modified corn.
이에, 유전자변형 옥수수의 한국으로의 유입 및 유통을 엄격히 통제하고, 효율적인 관리 및 식품 내 표시 제도가 잘 이행되기 위해서는, 유전자변형 옥수수의 효과적인 탐지 및 사후 모니터링 방법이 요구되는 실정이다.Accordingly, in order to strictly control the introduction and distribution of genetically modified corn into Korea and implement efficient management and labeling systems in foods, effective detection and post-monitoring methods for genetically modified corn are required.
본 발명의 목적은 유전자변형(Genetically Modified, GM) 옥수수 검출용 조성물을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a composition for detecting genetically modified (GM) corn.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 포함하는 유전자변형 옥수수 검출용 키트 및 바이오 칩(chip)을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit and biochip for detecting genetically modified corn containing the above detection composition.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용해 대상 시료내 유전자변형 옥수수를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting genetically modified corn in a target sample using the detection composition.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용해 유전자변형 옥수수 포함 시료의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for screening samples containing genetically modified corn using the detection composition.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제1프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제2프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제3프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제4프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제5프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제6프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제7프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제8프라이머 및 프로브 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 유전자변형 옥수수 검출용 조성물에 관한 것이다. One aspect of the present invention includes a first primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3; A second primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6; A third primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9; A fourth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 12; A fifth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 15; A sixth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 18; A seventh primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 21; and an eighth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 24; a gene comprising at least one primer and probe set selected from the group consisting of It relates to a composition for detecting modified corn.
상기 검출용 조성물은 유전자변형 옥수수 검출용 양성표준물질로 제공될 수 있다.The detection composition can be provided as a positive standard for detecting genetically modified corn.
본 발명에서 용어 “유전자변형(Genetically Modified, GM)”된 작물 또는 유전자변형 농산물이란, 유전자변형 기술에 의해 자연에는 없는 새로운 성질을 부여한, 특히, 생산성이 향상되고 상품의 질을 강화한 작물이다.In the present invention, the term “genetically modified (GM)” crops or genetically modified agricultural products are crops that have been given new properties that do not exist in nature through genetic modification technology, especially with improved productivity and enhanced product quality.
GMO(Genetically Modified Organism)는 '유전자변형 생물체'의 약자이나 주로 농작물을 대상으로 하기 때문에 통상적으로 '유전자변형 작물'이라고 명명한다. 1994년 미국 칼젠(Calgene)사가 잘 물러지지 않는 토마토를 처음으로 상업화했고 1996년에는 몬산토사가 대두를, 노바티스사가 옥수수를 각각 상품화하였다. 유전자변형 작물은 일반 소비시장에 첫선을 보이기 시작한 이후 5년 만에 미국의 대두, 옥수수, 면화의 50% 이상을 차지하였다. 해충 및 질병에 강하고 소출량이 많아 식량난을 해소할 수 있다는 장점이 있으나, GMO를 반대하는 단체들로부터 지속적으로 식품의 안전성과 환경의 위해성에 대해 우려를 나타내고 있다.GMO (Genetically Modified Organism) is an abbreviation for 'genetically modified organism', but since it mainly targets agricultural crops, it is usually called 'genetically modified crop'. In 1994, the U.S. company Calgene commercialized hard-wearing tomatoes for the first time, and in 1996, Monsanto commercialized soybeans and Novartis commercialized corn. Genetically modified crops accounted for more than 50% of soybeans, corn, and cotton in the United States in the five years since they first appeared on the consumer market. It has the advantage of being resistant to pests and diseases and having a large yield, which can help alleviate food shortages, but groups opposing GMOs continue to raise concerns about food safety and environmental hazards.
GMO 및 GMO 식품의 안전성과 환경 위해성에 대한 우려가 급증함에 따라, 국내에서는 식품위생법과 농산물품질관리법에 의거하여 GMO 표시제를 시행하고 있으며, 유전자재조합성분에 대한 정성 및 정량 분석을 제공한다.As concerns about the safety and environmental risks of GMOs and GMO foods rapidly increase, the GMO labeling system is being implemented in Korea in accordance with the Food Sanitation Act and the Agricultural Agricultural Products Quality Control Act, and qualitative and quantitative analysis of genetically modified ingredients is provided.
국내 GMO 분석은 다음과 같은 두 단계로 진행된다: 첫 번째 단계는 내재유전자와 GM 구조유전자(35S 프로모터, NOS 터미네이터)에 대한 특이적 프라이머로 PCR을 수행하여 1차 확인시험을 수행하는 것이다. 다음 단계는 스크리닝 검사결과에 따라 유전자재조합 이벤트에 대한 2차 확인시험을 실시하는 것이다. 이때, 1차 및 2차 확인시험에 의해 내재유전자와 도입된 재조합유전자 특이 PCR 산물이 모두 확인된 경우 '검출'로 판정되며, 내재유전자의 PCR 산물은 모두 검출되나 재조합유전자 특이 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는 '불검출'로 판정한다. 내재유전자의 PCR 산물이 검출되지 않는 경우에는 '검사불능'으로 판정한다.Domestic GMO analysis is carried out in two steps: The first step is to perform a primary confirmation test by performing PCR with specific primers for endogenous genes and GM structural genes (35S promoter, NOS terminator). The next step is to conduct a secondary confirmation test for genetic recombination events according to the screening test results. At this time, if both the endogenous gene and the introduced recombinant gene-specific PCR product are confirmed through the first and second confirmation tests, it is judged as 'detection'. All PCR products of the endogenous gene are detected, but no recombinant gene-specific PCR product is detected. If not, it is judged as ‘non-detection’. If the PCR product of the endogenous gene is not detected, the test is judged as ‘unable to test’.
최근 GMO에 삽입되는 유전자 요소가 다양해지면서 기존의 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터를 포함하고 있지 않은 이벤트가 증가하였고, 유전자변형 옥수수임에도 불구하고 기존 스크리닝 시험에서 음성결과가 나타나, 이벤트 분석을 위한 추가적인 시험 등이 실시되고 있다.Recently, as the genetic elements inserted into GMOs have become more diverse, the number of events that do not contain the existing 35S promoter and NOS terminator has increased, and even though it is genetically modified corn, negative results were shown in the existing screening test, so additional tests for event analysis are required. It is being implemented.
이에, 본 발명에서는 유전자변형 옥수수 스크리닝 시험법을 개선, 강화시키기 위한 새로운 모델을 확립하고, 이를 효율적으로 활용할 수 있는 프리-스폿-플레이트(Pre-Spotted Plate) 시험법을 개발하였다. 상기 발명은 스크리닝 단계에서 음성결과로 확인될 경우 2차 이벤트 확인시험이 필요 없이 바로 유전자변형 옥수수 불검출로 판정할 수 있어 신속하면서도 효율적으로 분석을 진행할 수 있다.Accordingly, in the present invention, we established a new model to improve and strengthen the genetically modified corn screening test method and developed a pre-spotted plate test method that can utilize it efficiently. In the above invention, if a negative result is confirmed in the screening stage, it is possible to immediately determine that genetically modified corn has not been detected without the need for a secondary event confirmation test, so the analysis can be carried out quickly and efficiently.
본 발명에서 “이벤트”는 “계통(系統)”과 동일한 의미로 사용되었으며, 이는 공통된 조상과 유전자형이 같은 개체군을 일컫는 용어로서, 보통 실험생물 중에서 공통 조상에서 유래하고 일정한 형질을 보유하면서 세대를 쌓아가는 개체군을 말한다.In the present invention, “event” is used in the same sense as “lineage,” which is a term referring to a population with the same common ancestor and genotype. Among experimental organisms, it is usually derived from a common ancestor and accumulates generations while retaining certain traits. refers to a thin population.
본 발명에서 “내재유전자”란 특정 작물의 게놈에 자연적으로 존재하고 전체 게놈 중에 단일 카피(single copy)로 존재하여 특정작물의 유전자 분석에서 특정 작물의 존재를 알려주는 양성 대조구로 이용될 수 있는 유전자를 의미한다.In the present invention, an “endogenous gene” refers to a gene that naturally exists in the genome of a specific crop and exists as a single copy in the entire genome, so that it can be used as a positive control to indicate the presence of a specific crop in genetic analysis of a specific crop. means.
본 발명에서 “프리-스폿-플레이트(Pre-Spotted Plate) 시험법”은 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time Polymerase chain reaction; qPCR)에 필요한 모든 구성요소를 프리믹스(premix) 형태로 플레이트에 고정화시킨 모델을 일컫는다(도 1).In the present invention, the “Pre-Spotted Plate test method” is a model in which all components necessary for real time polymerase chain reaction (qPCR) are immobilized on a plate in premix form. (Figure 1).
본 발명에서 “실시간 중합효소 연쇄반응(Real time Polymerase chain reaction; qPCR)”은 특이 프라이머와 형광물질이 연결된 프로브를 이용하여 PCR 증폭 시 프로브로부터 형광체가 해리되어 형광 발색의 양을 측정하는 원리이다. qPCR 법은 정성 PCR 법과 같이 도입 유전자의 특정 DNA를 검출하는 점은 동일하나, 식물의 내재유전자를 바탕으로 검출 유전자의 비를 측정하기 ?문에 정량적으로 도입 유전자의 양을 분석할 수 있는 장점이 있다. 실질적으로 qPCR법은 유전자변형 농산물의 혼입률 및 식품 가공품의 유전자변형체의 정량 검정에 이용될 수 있다.In the present invention, “real time polymerase chain reaction (qPCR)” is a principle of measuring the amount of fluorescence by dissociating the fluorescent substance from the probe during PCR amplification using a probe linked to a specific primer and a fluorescent substance. The qPCR method is the same as the qualitative PCR method in that it detects the specific DNA of the introduced gene, but it has the advantage of being able to quantitatively analyze the amount of the introduced gene because it measures the ratio of the detected genes based on the plant's endogenous genes. there is. In practice, the qPCR method can be used to quantitatively test the mixing rate of genetically modified agricultural products and genetically modified organisms in processed food products.
상기 qPCR에 필요한 구성요소는 프라이머, 프로브 외에 템플릿, DNA 중합효소(예: AmpliTaq Gold DNA 중합효소 등), dNTP, 최적화된 버퍼(Optimized buffer components) 예컨대 PCR 완충용액(트리스-HCL(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등), 물(dH2O), 패시브 참조 염료(예: ROX 염료) 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니고 qPCR에 필요한 구성요소는 제한없이 포함할 수 있다.Components required for the qPCR include primers, probes, templates, DNA polymerase (e.g., AmpliTaq Gold DNA polymerase, etc.), dNTPs, and optimized buffer components such as PCR buffer (Tris-HCl). , MgCl 2 , KCl, etc.), water (dH 2 O), passive reference dye (e.g. ROX dye), etc., but is not limited thereto and may include components required for qPCR without limitation.
본 발명에서 “프라이머 세트(primer set)”는 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 합쳐 동시에 지칭하는 용어로 사용하였다. 프라이머의 설계는 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3 회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따른다. 그 외에 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.In the present invention, “primer set” is used to refer simultaneously to forward and reverse primers. The design of primers is subject to various restrictions, such as A, G, C, and T content ratio, prevention of primer complex (dimer) formation, and prohibition of repeating the same base sequence more than three times. In addition, conditions such as the amount of template DNA, concentration of primers, concentration of dNTPs, concentration of Mg 2+ , reaction temperature, and reaction time must be appropriate.
상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다.The primer is a short nucleic acid sequence containing a free 3' terminal hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary nucleic acid template and copies the strand of the nucleic acid template. It can serve as a starting point for
상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 물질에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 표적 물질의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.The primer can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization at an appropriate buffer solution and temperature, and hybridizes with the nucleic acid present in the target material to select a specific gene of the target material. Can be used for amplification.
상기 혼성화는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 상기 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 상기 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 제어될 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화 온도가 높으면 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면 일부 미스매치가 존재하더라도 혼성화가 일어날 수 있다.The hybridization means that two single-stranded nucleic acids form a duplex structure by pairing complementary base sequences. The hybridization may occur when the complementarity between single-stranded nucleic acid sequences is perfect (perfect match) or when some mismatched bases exist. The degree of complementarity required for the hybridization may vary depending on the hybridization reaction conditions and may be particularly controlled by temperature. In general, if the hybridization temperature is high, hybridization is likely to occur in the case of a perfect match, and if the hybridization temperature is low, hybridization may occur even if some mismatches exist.
상기 프라이머 세트는 표적 원료에 존재하는 특정 유전자에 혼성화될 수 있으며, 시료 내에 목적하는 원료가 존재하는 경우 중합효소 연쇄반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 중폭되므로 상기 증폭된 산물(amplicon)을 통해 상기 원료의 존부를 판단할 수 있다.The primer set can hybridize to a specific gene present in the target raw material, and when the target raw material is present in the sample, the base sequence of the characteristic gene is amplified by polymerase chain reaction, thereby producing the amplified product (amplicon). Through this, the presence or absence of the raw materials can be determined.
상기 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 해당 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.The primers may incorporate additional features without changing the basic properties. That is, the nucleic acid sequence can be modified using many means known in the art. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a nucleotide with one or more homologs, and uncharged linkages such as phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, or carbamates, or phosphorothioates or phosphorodithioates. Modification of nucleotides into charged linkages such as In addition, nucleic acids may contain one or more nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, proteins such as poly L lysine, intercalating agents such as acridine or psoralen, chelating agents such as metals, radioactive metals, iron oxidizing metals, and alkylating agents. May have additional covalently linked residues.
또한 상기 프라이머 서열은 검출 가능한 신호를 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.Additionally, the primer sequence can be modified using a label that can directly or indirectly provide a detectable signal. The primer may contain a label that can be detected using spectroscopy, photochemistry, biochemistry, immunochemistry or chemical means. Useful labels include 32 P, fluorescent dyes, electron dense reagents, enzymes (commonly used in ELISA), biotin or haptens, and proteins for which antisera or monoclonal antibodies are available.
상기 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.The primers were obtained by cloning of appropriate sequences, restriction enzyme digestion, phosphotriester method by Narang et al. (1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), and diethylphosphoramidite method by Beaucage et al. (1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), and any other well-known method, including direct chemical synthesis methods such as the solid support method of U.S. Pat. No. 4,458,066.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"란, 올리고뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드 서열)를 말하는 것으로, 자연적으로 발생하거나, 합성적으로, 재조합적으로, 또는 PCR 증폭에 의해 생산되는 것으로, 목적하는 다른 올리고뉴클레오타이드에 대해 최소 부분에 결합할 수 있다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 서열의 검출, 정의 및 분리에 유용하다. 바람직한 양태로서, 본 발명에 사용된 프로브는 형광성, 방사성, 및 발광성 시스템을 포함할 수 있고, 다른 검출 시스템에서 검출할 수 있도록 "리포트 분자"로 표지될 수 있다. 본 발명은 특별한 검출 시스템 또는 라벨에 제한되지 않는다. The term "probe" used in the present invention refers to an oligonucleotide (i.e., nucleotide sequence) that occurs naturally, is produced synthetically, recombinantly, or by PCR amplification, and is used to Can bind to a minimal portion of another oligonucleotide. Probes may be single stranded or double stranded. Probes are useful for detection, definition, and isolation of specific sequences. In preferred embodiments, the probes used in the present invention may comprise fluorescent, radioactive, and luminescent systems and may be labeled with “report molecules” for detection by other detection systems. The present invention is not limited to any particular detection system or label.
구체적으로, 상기 검출용 조성물은 제1프라이머 및 프로브 세트; 및 제2프라이머 및 프로브 세트 내지 제8프라이머 및 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 검출용 조성물은 제1프라이머 및 프로브 세트 내지 제8프라이머 및 프로브 세트를 모두 포함할 수 있다.Specifically, the detection composition includes a first primer and a probe set; And it may include one or more primer and probe sets selected from the group consisting of the second primer and probe set to the eighth primer and probe set. More specifically, the detection composition may include all of the first to eighth primer and probe sets.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 제1프라이머 및 프로브 세트 내지 제8프라이머 및 프로브 세트; 및 qPCR 에 필요한 구성요소를 플레이트에 분배하고 qPCR 분석을 실시한 결과, 유전자변형 옥수수에 대한 특이성 및 민감도가 모두 우수함을 확인하였다(표 2 및 표 3).In one embodiment of the present invention, the first to eighth primer and probe sets; And as a result of distributing the components required for qPCR on plates and performing qPCR analysis, it was confirmed that both specificity and sensitivity for genetically modified corn were excellent (Tables 2 and 3).
본 발명의 일 실시예에서 추가로 유전자변형 옥수수를 포함한 가공 식품에 대하여 스크리닝 분석을 수행함으로써, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함한 검출용 조성물이 식품 및/또는 사료에서 유전자변형 물질을 성공적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(표 4).In one embodiment of the present invention, by additionally performing a screening analysis on processed foods containing genetically modified corn, the detection composition including the primers and probes of the present invention can successfully detect genetically modified substances in food and/or feed. It was confirmed that this was possible (Table 4).
본 발명의 다른 측면은 상기 검출용 조성물을 포함하는, 유전자변형 옥수수 검출용 키트에 관한 것일 수 있다.Another aspect of the present invention may relate to a kit for detecting genetically modified corn, including the detection composition.
상기 검출용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.The detection kit may have the form of a solution, lyophilized powder, frozen solution, or strip, and each form can be formulated by a conventional method in the art. For example, a kit for detection in the form of a solution can be formulated by separately or mixing proteins or primers in buffer solutions such as sodium-phosphate, potassium-phosphate, Tris-hydrochloric acid, and various other types of buffers, depending on need. It can also be frozen or freeze-dried.
상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 측방유동분석법은 항원-항체 반응과 같은 두 물질 간의 특이적인 반응을 기본으로 하는 것으로, 민감도와 특이성이 높고, 빠른시간 내에 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있어 질병의 진단 및 빠른 예방 조치를 가능하게 한다. The detection kit may be one using an immunolateral flow strip method. Lateral flow assay is a method for detecting proteins or nucleic acids based on chromatography. This lateral flow analysis method is widely used in various fields such as pregnancy diagnosis, cancer diagnosis, the presence of other specific proteins or genes, or microorganism detection. Lateral flow analysis is based on a specific reaction between two substances, such as an antigen-antibody reaction. It has high sensitivity and specificity, and has the advantage of being able to confirm results in a short time, making it possible to diagnose diseases and take rapid preventive measures. .
상기 검출용 키트는 qRT-PCR 키트일 수 있다. 구체적으로, 상기 검출용 키트에는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 유전자변형 옥수수를 검출하는데 필요한 실험(예: qPCR) 및 결과 확인에 필요한 기기(예: 형광 광도계 등)를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 qPCR 프라이머 및 프로브 세트 외에 적당량의 DNA 중합효소(예: AmpliTaq Gold DNA 중합효소 등), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCL(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.The detection kit may be a qRT-PCR kit. Specifically, the detection kit may additionally include experiments required to detect genetically modified corn using the primer and probe set of the present invention (e.g., qPCR) and instruments required to confirm the results (e.g., fluorescence photometer, etc.). there is. Specifically, the composition may include an appropriate amount of DNA polymerase (eg, AmpliTaq Gold DNA polymerase, etc.), dNTP, PCR buffer solution, and water (dH 2 O) in addition to the qPCR primer and probe set. The PCR buffer solution may include Tris-HCl, MgCl 2 , KCl, etc.
또한 상기 키트는 qRT-PCR 구성요소를 포함한 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속 및 이들의 조합일 수 있다.Additionally, the kit may further include appropriate reagents and tools used in the analysis, in addition to a composition containing qRT-PCR components. These reagents and tools include suitable carriers, labels capable of producing a detectable signal, solubilizers, detergents, etc. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester. , polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, and combinations thereof.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 검출용 조성물을 포함하는, 유전자변형 옥수수 검출용 바이오 칩(chip)에 관한 것일 수 있다.Another aspect of the present invention may relate to a biochip for detecting genetically modified corn, including the detection composition.
본 발명에서, 상기 “바이오 칩(chip)”은 DNA 칩이라고도 불리우며, 매우 작은 DNA 조각들이 고체 표면에 집적된 것으로, 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 투명 또는 반투명한 재질로 이루어진 기판에 시료용액과 시약을 수용할 수 있는 챔버 및 채널을 포함한 형태일 수 있다.In the present invention, the “biochip” is also called a DNA chip, and is composed of very small DNA fragments integrated on a solid surface. Sample solution and reagents are placed on a substrate made of a transparent or translucent material such as plastic, glass, or silicon. It may have a form including a chamber and a channel that can accommodate.
바이오 칩은 두께가 얇고 투명하며 히터블록과의 접촉면적이 넓기 때문에 PCR 시간을 크게 단축할 수 있고, 동시에 최소한 수백 개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점이 있다. 또한, 고형체를 사용함으로써 아주 적은 양의 유전 물질을 고밀도로 붙일 수 있으며, 동시에 많은 수의 유전자를 검색할 수 있으며, 많은 양의 유전자의 발현 정도를 동시에 측정하거나 게놈의 다양한 부분의 유전자형을 파악하기 위해 사용할 수 있다.Biochips are thin and transparent, and have a large contact area with the heater block, so they can greatly shorten PCR time and have the advantage of being able to search for at least hundreds of genes in a short time. In addition, by using solid materials, very small amounts of genetic material can be attached at high density, large numbers of genes can be searched simultaneously, the expression levels of large amounts of genes can be measured simultaneously, or genotypes of various parts of the genome can be identified. It can be used to do this.
바이오 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA(complementary DNA)칩과 올리고뉴클레오티드 칩(oligonucleotide)으로 분류될 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500bp 이상의 유전자(full-length open reading frame 또는 EST)가 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 칩에는 10 내지 50개, 구체적으로는 10 내지 30개, 더욱 구체적으로는 15 내지 20개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 접착될 수 있고, 칩 내에 포함되는 용액에 포함될 수 있으나, 상기 형태에 한정되지 않으며 필요에 따라 적절히 변형할 수 있다.Biochips can be classified into cDNA (complementary DNA) chips and oligonucleotide chips depending on the size of the genetic material attached. A cDNA chip may contain a gene (full-length open reading frame, or EST) of at least 500 bp. An oligonucleotide consisting of 10 to 50 bases, specifically 10 to 30 bases, and more specifically 15 to 20 bases may be attached to the oligonucleotide chip, and may be contained in a solution contained within the chip, but in the form described above. It is not limited and can be appropriately modified as needed.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 검출용 조성물을 포함하는 qPCR 플레이트(plate)에 대상 시료를 첨가하는 단계;를 포함하는 유전자변형 옥수수 검출방법에 관한 것일 수 있다.Another aspect of the present invention may relate to a method for detecting genetically modified corn, including adding a target sample to a qPCR plate containing the detection composition.
상기 qPCR 플레이트는 프리-스폿 플레이트, 즉 qPCR에 필요한 모든 구성요소를 프리믹스(premix) 형태로 고정화된 플레이트를 포함할 수 있다.The qPCR plate may include a pre-spot plate, that is, a plate in which all components required for qPCR are immobilized in premix form.
상기 검출방법에 사용하는 대상 시료는 유전자변형 옥수수가 발견될 수 있는 모든 물질에서 수득할 수 있다. 구체적으로, 상기 대상 시료는 당업계에서 통상적으로 사용되는 DNA 추출방법을 통해 수득할 수 있으며, 예컨대 알카라인 추출법, 열수추출법, 컬럼 추출법 및 페놀/클로로포름 추출법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The target sample used in the above detection method can be obtained from any material in which genetically modified corn can be found. Specifically, the target sample can be obtained through a DNA extraction method commonly used in the art, such as alkaline extraction, hot water extraction, column extraction, and phenol/chloroform extraction, but is not limited thereto.
상기 검출방법은 대상 시료 내 존재하는 유전자변형 옥수수의 DNA를 검출할 수 있는 특정 방법들을 의미하는 것으로, DNA 서열 분석 방법; 프로브 하이브리드화 방법; 구조 특이적인 절단 분석; 효소 미스매치 절단 방법(enzyme mismatch cleavage method); 중합효소 연쇄 반응(PCR); 측쇄 하이브리드화 방법; 롤링 서클 복제(rolling circle replication); 핵산서열기반 증폭(Nucleic acid sequence based amplification, NASBA); 분자 비콘 기술(molecular beacon technology); E-센서 기술(미국 특허 제6,248,229호 등); 사이클링 프로브 기술(cycling probe technology); 데이드 베링(Dade Behring) 시그날 증폭 방법; 리가제 연쇄 반응; 및 샌드위치 하이브리드화 방법 또는 서던 블로팅(southern blotting)을 이용하는 것 일 수 있다.The detection method refers to specific methods that can detect DNA of genetically modified corn present in a target sample, including a DNA sequence analysis method; Probe hybridization method; Structure-specific cleavage analysis; enzyme mismatch cleavage method; polymerase chain reaction (PCR); side chain hybridization method; rolling circle replication; Nucleic acid sequence based amplification (NASBA); molecular beacon technology; E-sensor technology (US Patent No. 6,248,229, etc.); cycling probe technology; Dade Behring signal amplification method; ligase chain reaction; And it may be using a sandwich hybridization method or southern blotting.
상기 검출방법은 상기 조성물을 이용하여 특정 DNA를 증폭시킨 후, 특정 DNA의 증폭 반응을 확인하는 단계를 통해 수행될 수 있으며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 검출방법의 반응산물이 전기 영동 등을 통하여 예상되는 DNA 산물의 크기와 일치하는지를 확인함으로써 수행될 수 있다.The detection method may be performed by amplifying specific DNA using the composition and then confirming the amplification reaction of the specific DNA. The step of checking whether the specific DNA is amplified is performed by amplifying the specific DNA using the composition. This can be performed by confirming whether the size of the DNA product matches the expected size through electrophoresis, etc.
구체적으로, 상기 검출방법은 실시간 중합효소 연쇄반응(real time Polymerase Chain Reaction; qPCR)을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. Specifically, the detection method may additionally include the step of performing real time Polymerase Chain Reaction (qPCR).
상기 qPCR에 대한 설명은 전술한 바와 동일하다.The description of qPCR is the same as described above.
상기 qPCR은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 반응 조건에 따라 수행되거나, 또는 일부 변형되어 수행될 수 있다. 또한, 상기 qPCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 이의 수행을 위한 설명서를 포함할 수 있다.The qPCR may be performed according to general reaction conditions using conventional PCR equipment known in the art, or may be performed with some modification. Additionally, the qPCR reaction mixture may include a reaction buffer, dNTPs, and DNA polymerase, and may include instructions for its performance.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 1종 또는 복수의 유전자변형 옥수수를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 구축하였으며, 상기 프라이머 및 프로브 세트의 특이성 및 민감도가 높아 매우 낮은 수준의 타겟 DNA 농도에서도 효과적으로 타겟 DNA를 증폭할 수 있음을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, a set of primers and probes capable of detecting one or more types of genetically modified corn was constructed, and the specificity and sensitivity of the primer and probe set are high, so that they effectively target even at a very low target DNA concentration. It was confirmed that DNA could be amplified.
본 발명의 또 다른 측면은 a) 검출용 조성물을 포함하는 qPCR 플레이트(plate)에 대상 시료를 처리하는 단계; 및 b) 상기 시료 내에 유전자변형 옥수수 포함 여부를 확인하는 단계;를 포함하는, 유전자변형 옥수수 포함 시료의 스크리닝 방법으로서, 상기 검출용 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제1프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제2프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제3프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제4프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제5프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제6프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제7프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제8프라이머 및 프로브 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 것인, 유전자변형 옥수수 포함 시료의 스크리닝 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention includes the steps of a) processing a target sample on a qPCR plate containing a detection composition; and b) confirming whether the sample contains genetically modified corn, wherein the detection composition comprises a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and a sequence A first primer and probe set consisting of a probe consisting of base sequence number 3; A second primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6; A third primer and probe set consisting of primers consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9; A fourth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 12; A fifth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 15; A sixth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 18; A seventh primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 21; And an eighth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 24; comprising at least one primer and probe set selected from the group consisting of , relates to a screening method for samples containing genetically modified corn.
구체적으로, 상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.Specifically, it may further include performing the real-time polymerase chain reaction.
상기 qPCR 플레이트는 프리-스폿 플레이트, 즉 qPCR에 필요한 모든 구성요소를 프리믹스(premix) 형태로 고정화된 플레이트를 포함할 수 있다.The qPCR plate may include a pre-spot plate, that is, a plate in which all components required for qPCR are immobilized in premix form.
상기 스크리닝 방법은 특별한 제한없이 당업계에 공지된 방법에 의해 수행되는 모든 유전자 스크리닝 방법을 통해 수행되는 것일 수 있다.The screening method may be performed through any genetic screening method performed by methods known in the art without particular limitation.
본 발명의 유전자변형 옥수수 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 검출용 조성물은 프리-스폿-플레이트(Pre-Spotted Plate) 시험법을 통해 정확성 및 재현성을 향상시킬 수 있다.The detection composition containing the primer and probe set for detecting genetically modified corn of the present invention can improve accuracy and reproducibility through the Pre-Spotted Plate test method.
또한, 본 발명은 기존의 유전자변형 옥수수 스크리닝 시험방법을 대체하여 유전자변형 옥수수 분석 시 소요되는 시간을 단축하고, 편의성 증대 및 분석 비용 절감 등의 효과를 얻을 수 있으며, 양성표준물질을 제공하여 시험의 신뢰성을 확보할 수 있다.In addition, the present invention can replace the existing genetically modified corn screening test method to shorten the time required for genetically modified corn analysis, increase convenience and reduce analysis costs, and provide positive standard materials for testing. Reliability can be secured.
본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The effects of the present invention are not limited to the above effects, and should be understood to include all effects that can be inferred from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.
도 1은 qPCR 어레이 레이아웃을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 qPCR 어레이와 결합된 예측 시스템을 나타낸 것이다(A: 결과 섹션, B: 유전자 정보 섹션).
도 3은 유전자변형 옥수수 검출에 사용하는 양성표준플라스미드(pUC-GM maize_screening)의 맵(map) 및 해당 염기서열(서열번호 25)을 도식화하여 나타낸 것이다.Figure 1 schematically shows the qPCR array layout.
Figure 2 shows the prediction system combined with the qPCR array (A: Results section, B: Genetic information section).
Figure 3 schematically shows the map and corresponding base sequence (SEQ ID NO: 25) of the positive standard plasmid (pUC-GM maize_screening) used to detect genetically modified corn.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1. 시료 준비Example 1. Sample preparation
특이성 테스트를 위해 한국에서 승인된 27개의 유전자변형(Genetically Modified, GM) 옥수수 이벤트(3272, Bt10, Bt11, Bt176, DAS40278-9, DAS59122-7, DP004114-3, DP098140-6, GA21, MIR162, MIR604, MON810, MON863, MON87403, MON87411, MON87419, MON87427, MON87460, MON88017, MON89034, MZHG0JG, MZIR098, NK603, 5307, T25, TC1507, VCO-01981-5)를 음성 및 양성 대조군으로 선정하였다.For specificity testing, 27 genetically modified (GM) maize events (3272, Bt10, Bt11, Bt176, DAS40278-9, DAS59122-7, DP004114-3, DP098140-6, GA21, MIR162, MIR604) approved in Korea. , MON810, MON863, MON87403, MON87411, MON87419, MON87427, MON87460, MON88017, MON89034, MZHG0JG, MZIR098, NK603, 5307, T25, TC1507, VCO-01981-5) as negative and positive It was selected as a control group.
GM옥수수의 인증표준물질(CRM) (27건)은 기준 물질 측정 연구소(IRMM, 벨기에 Geel) 및 미국 석유 화학자 협회(AOCS, 미국 일리노이 주, 어바나)에서 구매하거나 개발사로부터 제공받았다.Certified reference materials (CRMs) for GM corn (27 cases) were purchased from the Reference Materials Measurement Laboratory (IRMM, Geel, Belgium) and the American Society of Petroleum Chemists (AOCS, Urbana, Illinois, USA) or provided by the developers.
실시예 2. DNA 추출Example 2. DNA extraction
상기 시료의 유전체 DNA는 Fast genomic DNA 추출 키트(Pinucle, Yongin, Korea)를 사용하여, 옥수수 및 가공 식품 시료의 CRM에서 게놈 DNA를 추출하고 Quant-iT™dsDNA HS 분석 키트 및 Qubit Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 정량화하였다. 추출된 게놈 DNA의 순도는 NanoDropTM One UV-Vis 분광 광도계(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 측정하였다. 추출된 DNA를 20 ng/μL로 희석하고 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다The genomic DNA of the sample was extracted from the CRM of corn and processed food samples using a Fast genomic DNA extraction kit (Pinucle, Yongin, Korea), and analyzed with the Quant-iT™dsDNA HS analysis kit and Qubit Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad). , CA, USA) was used to quantify it. The purity of the extracted genomic DNA was measured using a NanoDrop TM One UV-Vis spectrophotometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Extracted DNA was diluted to 20 ng/μL and stored at -20°C until use.
실시예 3. 특이적 프라이머 및 프로브Example 3. Specific primers and probes
pmi-nos 및 P-rAct1에 대한 표적 특이적 프라이머 세트 및 프로브는 Primer Designer 프로그램 버전 3.0 (Scientific and Educational Software, Durham, NC, USA)을 사용하여 설계하였다. 다른 프라이머 세트 및 프로브는 표준 탐지 방법으로 한국식품공전에 채택된 것을 사용하였다. 모든 프라이머 세트와 프로브는 Bionics (서울, 한국)에서 합성하였다. 프라이머 및 프로브의 서열 및 기준은 하기 표 1에 나타내었다.Target-specific primer sets and probes for pmi-nos and P-rAct1 were designed using the Primer Designer program version 3.0 (Scientific and Educational Software, Durham, NC, USA). Other primer sets and probes were used as standard detection methods adopted by the Korean Food Code. All primer sets and probes were synthesized by Bionics (Seoul, Korea). The sequences and standards of primers and probes are shown in Table 1 below.
* F: 정방향 프라이머(forward primer), R: 역방향 프라이버(reverse primer), P: 프로브(probe)* F: forward primer, R: reverse primer, P: probe
실시예 4. PCR 조건Example 4. PCR conditions
TaqMan® 프로브를 사용한 GM옥수수 특이 스크리닝 방법을 개발하기 위하여 Viia7 실시간 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. UNG(적용된 바이오 시스템), 각 프라이머 500 nM, 프로브 200 nM 및 게놈 DNA 50 ng와 함께 1 x TaqManTM Universal Master Mix II를 사용하여 최종 부피 25 μL에서 스크리닝 PCR 분석을 수행하였다.Viia7 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was used to develop a GM maize-specific screening method using TaqMan ® probes. Screening PCR assays were performed in a final volume of 25 μL using 1
qPCR 조건은 50 ℃에서 2 분, 95 ℃에서 10 분 1 회, 95 ℃에서 30 초 및 60 ℃에서 1 분 45 회이며, QuantaStudioTM Real-Time PCR software로 데이터를 분석하였다.qPCR conditions were 50°C for 2 min, 95°C for 10 min once, 95°C for 30 s and 60°C for 45 times for 1 min, and data were analyzed with QuantaStudio ™ Real-Time PCR software.
실시예 5. 예측 시스템Example 5. Prediction system
스크리닝 단계에서 양성 신호가 관찰되면, 다음 단계는 신원 및 권한 부여 상태를 평가하는 것이다. 스크리닝 결과를 분석을 위한 예측 시스템을 개발하였다.If positive signals are observed during the screening phase, the next step is to assess identity and authorization status. A prediction system was developed to analyze screening results.
도 2에 나타낸 바와 같이 상기 시스템은 다른 특별한 프로그램이 없더라도 엑셀(Excel) 시스템으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 파일은 두 부분으로 구성된다. 하나는 스크리닝 결과를 입력하는 [결과] 섹션이고, 다른 하나는 유전자변형 옥수수 이벤트의 유전자 정보 섹션이다. 사용자는 [결과] 섹션에서 양의 신호가 관찰된 스크리닝 대상에 1을 입력하며, 이후, [No. 이벤트] 셀에서 여러 GM 이벤트를 확인할 수 있다. 마지막으로 유전자 정보 섹션에서 “이벤트”라고 표시된 예상 GM 이벤트를 확인할 수 있다.As shown in Figure 2, the system can be configured as an Excel system even without any other special programs. Specifically, the file consists of two parts. One is the [Results] section where screening results are entered, and the other is the genetic information section of the genetically modified corn event. In the [Results] section, the user enters 1 for the screening target for which a positive signal was observed, and then enters [No. You can check various GM events in the [Event] cell. Finally, you can check the predicted GM events labeled “Events” in the Genetic Information section.
실험예 1. qPCR을 통한 특이성(specificity) 확인Experimental Example 1. Confirmation of specificity through qPCR
개발된 모든 유전자변형 옥수수 이벤트를 검출하기 위해, 3개의 유전적 요소 [P-35S, 쌀 액틴1 프로모터(P-rACT1) 및 pmi-nos 유전자], 4개의 유전자변형 옥수수 이벤트(DP098140-6, DAS40278-9, MON87419 및 VCO01981-5) 및 옥수수의 내인성 기준 유전자(hmg 유전자)를 선별하여 총 8개의 스크리닝 에세이(hmg, P-35S, pmi-nos, P-rAct1, DAS40278-9, DP098140-6, MON87419 및 VCO01981-5)를 준비하였다. 시료 분석을 위해 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 8개의 타겟을 분배하고, 상기 에세이를 하나의 세트로 하여 총 5개의 샘플을 이중 테스트하였다(도 1). 한국에서 승인된 27개의 유전자변형 옥수수 이벤트를 테스트하여, 스크리닝 분석(screening assays)의 특이성을 평가하였다.To detect all developed transgenic maize events, three genetic elements [P-35S, rice actin1 promoter (P-rACT1) and pmi-nos gene], four transgenic maize events (DP098140-6, DAS40278) -9, MON87419, and VCO01981-5) and an endogenous reference gene ( hmg gene) in maize, resulting in a total of eight screening assays ( hmg , P-35S, pmi-nos, P-rAct1, DAS40278-9, DP098140-6, MON87419 and VCO01981-5) were prepared. For sample analysis, 8 targets were distributed to each well of a 96-well PCR plate, and a total of 5 samples were tested in duplicate using the above assay as one set (Figure 1). The specificity of the screening assays was evaluated by testing 27 genetically modified maize events approved in Korea.
이벤트genetic recombination
event
그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이 모두 양성 신호가 나타났으며, 특히 본 발명에서 개발된 pmi-nos 및 P-rAct1을 이용한 선별 방법에서 성공적으로 증폭되었음을 확인하였다.As a result, as shown in Table 2 above, all positive signals appeared, and in particular, it was confirmed that amplification was successful in the selection method using pmi-nos and P-rAct1 developed in the present invention.
실험예 2. qPCR을 통한 민감도(sensitivity) 확인Experimental Example 2. Confirmation of sensitivity through qPCR
총 복제된 반응의 95% 이상이 양성 신호로 나타났을 때, GM 비율이 다른 27개의 GM 이벤트 복제를 테스트하고 결정하였다(Kim, Yoo, Lee, Hong, & Kim, 2016). 각각의 스크리닝 분석의 LOD(limit of detection)는 0.1 % GM 함량이었고, 50 ng의 게놈 DNA에서 옥수수 게놈의 18개 카피(copies)에 상응하였다.When more than 95% of the total replicated responses resulted in positive signals, replication of 27 GM events with different GM ratios was tested and determined (Kim, Yoo, Lee, Hong, & Kim, 2016). The limit of detection (LOD) for each screening assay was 0.1% GM content, corresponding to 18 copies of the maize genome in 50 ng of genomic DNA.
민감도 확인을 위한 DNA 혼합물은 GM 비율(ratio) 0.1%로 제조하였으며, 3 명의 다른 실험자들과 함께 상기 LOD 테스트를 3번 수행하였다.The DNA mixture for sensitivity confirmation was prepared at a GM ratio of 0.1%, and the LOD test was performed three times with three different experimenters.
그 결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, LOD 결과는 한국과 EU에 대한 GMO의 라벨링 요건을 충족시킴을 확인하였다(농림 수산부, 2000; 유럽위원회, 2003).As a result, as shown in Table 3 above, the LOD results were confirmed to meet the GMO labeling requirements for Korea and the EU (Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, 2000; European Commission, 2003).
실험예 3. 가공식품을 이용한 적용성 테스트Experimental Example 3. Applicability test using processed food
스크리닝 분석의 적용 가능성을 시험하기 위해 옥수수를 함유한 18개의 가공식품을 수집하였다. 곡물 분말, 전분, 스낵 등 18개 가공식품을 온라인 마켓을 통해 구매하였다. 수집된 가공식품은 옥수수 분말, 옥수수 전분, 콘플레이크, 콘그리츠, 콘스낵과 같이 제품의 종류에 따라 5개 그룹으로 나눴다.To test the applicability of the screening analysis, 18 processed foods containing corn were collected. Eighteen processed foods, including grain powder, starch, and snacks, were purchased through an online market. The collected processed foods were divided into five groups according to the type of product: corn powder, corn starch, corn flakes, corn grits, and corn snacks.
정확한 검출을 위하여, 8개의 스크리닝 분석법(screening assays)에 대해 시료를 이중으로 분석하였다. 하나의 웰에서 증폭되고 40 보다 큰 Ct 값을 갖는 시료는 음성으로 결정하였다.For accurate detection, samples were analyzed in duplicate for eight screening assays. Samples that were amplified in one well and had a Ct value greater than 40 were determined to be negative.
no.sample
no.
그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이 18개의 가공 식품 중에 5개의 시료에서 양성 신호가 관찰되었다.상기와 같은 실험을 통해 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트가 식품 및 사료에서의 유전자변형 물질을 성공적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in Table 4, positive signals were observed in 5 samples out of 18 processed foods. Through the above experiments, the primer and probe set of the present invention successfully detected genetically modified substances in food and feed. It was confirmed that it could be detected.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.The description of the present invention described above is for illustrative purposes, and those skilled in the art will understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical idea or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. For example, each component described as unitary may be implemented in a distributed manner, and similarly, components described as distributed may also be implemented in a combined form.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the claims described below, and all changes or modified forms derived from the meaning and scope of the claims and their equivalent concepts should be construed as being included in the scope of the present invention.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry of Food and Drug Safety) PINUCLE Incorporated <120> REAL TIME PCR PRIMERS FOR DETECTION OF GENETICALLY MODIFIED MAIZE <130> 22PP30051 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MaiJ-F2 (F) <400> 1 ttggactaga aatctcgtgc tga 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mhmg-rev (R) <400> 2 gctacatagg gagccttgtc ct 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mhmg-probe (P) <400> 3 caatccacac aaacgcacgc gta 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35S 1-5'(F) <400> 4 caatccacac aaacgcacgc gta 23 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35S 1-3' (R) <400> 5 cctctccaaa tgaaatgaac ttcct 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35S-Taq (P) <400> 6 cccactatcc ttcgcaagac ccttcct 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pminos-F1 (F) <400> 7 tattgccgcc aacgaatcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pminos-R1 (R) <400> 8 ggatcgagct cccagcttag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pminos-P2 (P) <400> 9 tgactgtcaa aggccacggc 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P-rAct1-PF2 (F) <400> 10 ggaggatcgc gagccagc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P-rAct1-PR2 (R) <400> 11 ggggggtatg tatatagtgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P-rAct1-PP3 (P) <400> 12 ctccgcttcc aaagaaacgc 20 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DP098-f6 (F) <400> 13 gtgtgtatgt ctctttgctt ggtctt 26 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DP098-r2 (R) <400> 14 gattgtcgtt tcccgccttc 20 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DP098-p5 (P) <400> 15 ctctatcgat ccccctcttt 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<211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS40278-9 5'-r4 (P) <400> 24 agctaacctt cattgtattc cg 22 <210> 25 <211> 392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC-GM maize_screening <400> 25 ttggactaga aatctcgtgc tgattaattg ttttacgcgt gcgtttgtgt ggattgtagg 60 acaaggctcc ctatgtagca ctagtattga tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac 120 gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg 180 gagaggtatt gccgccaacg aatcaccggt gactgtcaaa ggccacggcc gtttagcgcg 240 tgtttacaac aagctgtaag agcttactga aaaaattaac atctcttgct aagctgggag 300 ctcgatccgg aggatcgcga gccagcgacg aggccggccc tccctccgct tccaaagaaa 360 cgccccccat cgccactata tacatacccc cc 392 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University REPUBLIC OF KOREA (Management: Ministry of Food and Drug Safety) PINUCLE Incorporated <120> REAL TIME PCR PRIMERS FOR DETECTION OF GENETICALLY MODIFIED MAIZE <130> 22PP30051 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MaiJ-F2 (F) <400> 1 ttggactaga aatctcgtgc tga 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mhmg-rev (R) <400> 2 gctacatagg gagccttgtc ct 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mhmg-probe (P) <400> 3 caatccacac aaacgcacgc gta 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35S 1-5'(F) <400> 4 caatccacac aaacgcacgc gta 23 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35S 1-3' (R) <400> 5 cctctccaaa tgaaatgaac ttcct 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35S-Taq (P) <400> 6 cccactatcc ttcgcaagac ccttcct 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pminos-F1 (F) <400> 7 tattgccgcc aacgaatcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pminos-R1 (R) <400> 8 ggatcgagct cccagcttag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>pminos-P2 (P) <400> 9 tgactgtcaa aggccacggc 20 <210> 10 <211> 18 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<400> 18 tgtgcgccag tcagcatcat cacacc 26 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCO-01981-5 primer F (F) <400> 19 ccactgaacg tcaccaagaa ga 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCO-01981-5 primer R (R) <400> 20 gccgctactc gagggattta 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCO-01981-5 probe (P) <400> 21 cagtactcaa acactgatag 20 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS40278-9 5'-f1 (F) <400> 22 cacgaaccat tgagttacaa tc 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS40278-9 5'-S1 (R) <400> 23 tggttcattg tattctggct ttg 23 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS40278-9 5'-r4 (P) <400> 24 agctaacctt cattgtattc cg 22 <210> 25 <211> 392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>pUC-GM maize_screening <400> 25 ttggactaga aatctcgtgc tgattaattg ttttacgcgt gcgtttgtgt ggattgtagg 60 acaaggctcc ctatgtagca ctagtattga tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac 120 gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg 180 gagaggtatt gccgccaacg aatcaccggt gactgtcaaa ggccacggcc gtttagcgcg 240 tgtttacaac aagctgtaag agcttactga aaaaattaac atctcttgct aagctgggag 300 ctcgatccgg aggatcgcga gccagcgacg aggccggccc tccctccgct tccaaagaaa 360 cgcccccccat cgccactata tacatacccc cc 392
Claims (8)
서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제2프라이머 및 프로브 세트;
서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제3프라이머 및 프로브 세트;
서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제4프라이머 및 프로브 세트;
서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제5프라이머 및 프로브 세트;
서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제6프라이머 및 프로브 세트;
서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제7프라이머 및 프로브 세트; 및
서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제8프라이머 및 프로브 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 유전자변형 옥수수 검출용 조성물.A first primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3;
A second primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6;
A third primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9;
A fourth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 12;
A fifth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 15;
A sixth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 18;
A seventh primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 21; and
An eighth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 24; Genetic modification comprising at least one primer and probe set selected from the group consisting of Composition for detecting corn.
상기 검출용 조성물은 제1프라이머 및 프로브 세트; 및
제2프라이머 및 프로브 세트 내지 제8프라이머 및 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 것인, 유전자변형 옥수수 검출용 조성물.According to paragraph 1,
The detection composition includes a first primer and a probe set; and
A composition for detecting genetically modified corn, comprising at least one primer and probe set selected from the group consisting of the second primer and probe set to the eighth primer and probe set.
실시간 중합효소 연쇄반응(Real time Polymerase chain reaction; qPCR)을 수행하는 단계;를 추가로 포함하는, 유전자변형 옥수수 검출방법.According to clause 5,
A method for detecting genetically modified corn, further comprising the step of performing real time polymerase chain reaction (qPCR).
b) 상기 시료 내에 유전자변형 옥수수 포함 여부를 확인하는 단계;를 포함하는, 유전자변형 옥수수 포함 시료의 스크리닝 방법으로서,
상기 검출용 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제1프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제2프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제3프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제4프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제5프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제6프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제7프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프로브로 구성된 제8프라이머 및 프로브 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 것인, 유전자변형 옥수수 포함 시료의 스크리닝 방법.a) processing a target sample on a qPCR plate containing a detection composition; and
b) confirming whether the sample contains genetically modified corn; a method for screening a sample containing genetically modified corn, comprising:
The detection composition includes a first primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3; A second primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6; A third primer and probe set consisting of primers consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9; A fourth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 12; A fifth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 15; A sixth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 18; A seventh primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 21; And an eighth primer and probe set consisting of a primer consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 24; comprising at least one primer and probe set selected from the group consisting of , Screening method for samples containing genetically modified corn.
실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계;를 추가로 포함하는, 유전자변형 옥수수 포함 시료의 스크리닝 방법.In clause 7,
A method for screening a sample containing genetically modified corn, further comprising the step of performing a real-time polymerase chain reaction.
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