KR20230140518A - 자연살해세포를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
자연살해세포를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 활성화된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환, 구체적으로 치매 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마우스 유래의 활성화된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 미세아교세포의 활성을 조절하고, 아밀로이드 베타 플라크의 침착을 억제하였다. 또한 치매 동물 모델에서 인지기능 개선에 뛰어난 효과를 나타내었다. 나아가, 인간 말초혈액단핵세포 유래 자연살해세포 및 인간 유도만능줄기세포 유래의 자연살해세포를 활성화시킨 경우, 미세아교세포의 활성을 회복시키는데 관여하는 일부 유전자의 발현이 마우스 유래의 활성화된 자연살해세포와 유사하거나 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 치매, 파킨슨병, 헌팅턴병과 같은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 및 인지장애 개선에 효과적으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 활성화된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
면역체계는 해로운 물질로부터 신체를 보호하는 역할을 하며, 면역체계가 반응하는 해로운 물질에는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포 또는 다른 개체의 혈액 및 조직 등이 있다.
최근, 면역체계가 작용하는 것으로 알려진 다양한 질병을 치료하기 위한 한 방법으로 면역체계의 활성을 조절하는 방법이 다수 연구되고 있다. 질병을 치료하는 또 다른 방법으로 면역체계를 구성하는 세포를 치료제로서 이용하는 방법도 연구되고 있으나, 대부분 암 치료에만 한정적으로 사용되고 있다.
한편, 치매(dementia)는 다양한 원인에 의해 후천적으로 기억, 언어, 판단력 등의 여러 영역의 인지 기능이 감소하여 일상생활을 제대로 수행하지 못하는 임상 증후군이다. 치매 환자는 불면증, 기억력 감퇴, 운동성 저하, 우울증, 의욕상실 등의 증상이 나타난다.
치매는 발생 원인에 따라 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(vascular dementia), 루이소체 치매(dementia with Lewy Body), 전두엽 치매(frontotemporal dementia) 등으로 구분된다. 알츠하이머성 치매는 기억 손상이 점진적으로 진행되며, 대뇌 피질 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)와 신경 섬유 얽힘을 특징으로 하는 치매로 치매 환자의 50-75%를 차지한다. 혈관성 치매는 기억 손상이 적고 집중력이 저하되며, 단계적으로 진행되는 뇌혈관 질환으로 주요 부위 단일 경색 또는 다중 경색으로 확산되는 특징을 갖는다(Breijyeh et al. Molecules, 25:5789 (2020)).
의학의 발전에 따라 평균수명이 증가하고 있지만 아직까지 확실한 치매 치료제는 개발되지 못했다. 이에 따라, 보다 효과적으로 치매를 예방하거나 치료할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.
Breijyeh et al. Molecules, 25:5789 (2020)
이에 본 발명자들은 퇴행성 뇌질환, 특히 치매에 효과적으로 치료 및 예방하기 위하여 연구한 결과, 체외에서 활성화된 자연살해세포가 치매 동물 모델의 뇌에서 아밀로이드 베타(amyloid β, Aβ) 플라크(plaque) 침착을 억제하고, 인지기능 행동 검사에서도 유의한 개선 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 면역조절기능이 함유된 자연살해세포를 투여 시, 유전자 서열분석을 통해 치매 뇌에 존재하는 비정상 미세아교세포의 면역대사능 및 탐식작용기능이 향상됨을 확인하였다. 이에 자연살해세포가 세포치료제로서 퇴행성 뇌질환 치료제로 활용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 마우스 유래의 활성화된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 미세아교세포의 활성을 조절하고, 아밀로이드 베타 플라크의 침착을 억제하였다. 또한 치매 동물 모델에서 인지기능 개선에 뛰어난 효과를 나타내었다. 나아가, 인간 말초혈액단핵세포 유래 자연살해세포 및 인간 유도만능줄기세포 유래의 자연살해세포를 활성화 시킨 경우, 미세아교세포의 활성을 회복시키는데 관여하는 GM-CSF, IFNG, GADD45G, HAVCR2, HNGB1 및 TNEN119 유전자의 발현이 마우스 유래의 활성화된 자연살해세포와 유사하거나 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 치매, 파킨슨병, 헌팅턴병과 같은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 및 인지장애 개선에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 마우스 유래 자연살해세포를 활성화시키는 배양 스케줄을 나타낸 도면이다.
도 2는 분리 직후(0일) 또는 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포의 자연살해세포 표면 마커 단백질 FACS 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면(상단) 및 그래프(하단)이다.
도 3은 4일 또는 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포의 형태학적 모양을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 분리 직후(0일) 또는 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포에서 분비된 IFN-gamma 및 GM-CSF의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 분리 직후(0일) 또는 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포의 유전자 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포(imNK 세포, immunomodulatory NK cells)의 치매 개선 효과를 확인하기 위한 동물 실험 스케줄을 나타낸 도면이다. normal; 정상 마우스(야생형 마우스), tg; 치매 동물 모델 마우스
도 7은 치매 동물 모델 마우스에서 imNK 세포 투여에 따른 아밀로이드 베타(Aβ) 플라크(plaque) 형성 억제효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 치매 동물 모델 마우스에서 imNK 세포 투여에 따른 미세아교세포 활성 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 치매 동물 모델 마우스에서 imNK 세포 투여 후, Y-maze 시험을 통해 인지기능 및 행동개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 치매 동물 모델 마우스 및 정상 마우스의 미세아교세포에 대한 전사체(상단), 및 치매 동물 모델 마우스에서 imNK 세포 투여군 및 치매 대조군의 미세아교세포의 전사체(하단)를 비교 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가되어 회복된 유전자의 heatmap을 나타낸 도면이다.
도 12는 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 증가되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 감소된 유전자의 heatmap을 나타낸 도면이다.
도 13은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 다시 회복되어 증가된 유전자 중 대사경로에 해당하는 유전자들의 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 대사경로 중 해당(glycolysis) 및 당신생합성(gluconeogenesis)에 관여하는 유전자의 발현이 정상화됨을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 신경신생성(neurogenesis)에 관여하는 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 면역반응(immune response)에 관여하는 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 자가소화작용(autophagy)에 관여하는 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 lysosomal acidification에 관여하는 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 lysosomal hydrolase 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20a 내지 도 20f는 인간 말초혈액단핵세포에서 분리한 직후(0일, 비활성, PB-NK) 및 14일간 활성화된(14일) 인간 말초혈액단핵세포 유래 자연살해세포(activated PBNK)의 전사체를 분석 결과 중, 효과기 기능(effector function) 및 면역 세포 활성(immune cell activation) 관련 유전자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21a 내지 도 21c는 14일간 활성화된 인간 말초혈액단핵세포 유래 활성 자연살해세포 및 21일간 활성화된 인간 유도만능줄기세포 유래 자연살해세포(EiNK, enhanced induced pluripotent stem cell derived natural killer cell)의 전사체를 분석한 결과 중, 발현이 유사하거나 EiNK에서 증가한 유전자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 인간 말초혈액단핵세포 유래 비활성 자연살해세포(PBNK), 활성화된 자연살해세포(activated PBNK, 14일) 및 인간 유도만능줄기세포 유래 활성화된 자연살해세포(EiNK, 21일)에서 GM-CSF, IFNG, GADD45G, HAVCR2, HNGB1 및 TNEN119의 유전자 발현을 q-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 분리 직후(0일) 또는 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포의 자연살해세포 표면 마커 단백질 FACS 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면(상단) 및 그래프(하단)이다.
도 3은 4일 또는 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포의 형태학적 모양을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 분리 직후(0일) 또는 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포에서 분비된 IFN-gamma 및 GM-CSF의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 분리 직후(0일) 또는 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포의 유전자 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 7일간 활성화된 마우스 유래 자연살해세포(imNK 세포, immunomodulatory NK cells)의 치매 개선 효과를 확인하기 위한 동물 실험 스케줄을 나타낸 도면이다. normal; 정상 마우스(야생형 마우스), tg; 치매 동물 모델 마우스
도 7은 치매 동물 모델 마우스에서 imNK 세포 투여에 따른 아밀로이드 베타(Aβ) 플라크(plaque) 형성 억제효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 치매 동물 모델 마우스에서 imNK 세포 투여에 따른 미세아교세포 활성 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 치매 동물 모델 마우스에서 imNK 세포 투여 후, Y-maze 시험을 통해 인지기능 및 행동개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 치매 동물 모델 마우스 및 정상 마우스의 미세아교세포에 대한 전사체(상단), 및 치매 동물 모델 마우스에서 imNK 세포 투여군 및 치매 대조군의 미세아교세포의 전사체(하단)를 비교 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가되어 회복된 유전자의 heatmap을 나타낸 도면이다.
도 12는 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 증가되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 감소된 유전자의 heatmap을 나타낸 도면이다.
도 13은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 다시 회복되어 증가된 유전자 중 대사경로에 해당하는 유전자들의 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 대사경로 중 해당(glycolysis) 및 당신생합성(gluconeogenesis)에 관여하는 유전자의 발현이 정상화됨을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 신경신생성(neurogenesis)에 관여하는 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 면역반응(immune response)에 관여하는 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 자가소화작용(autophagy)에 관여하는 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 lysosomal acidification에 관여하는 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 정상 마우스에 비해 치매 동물 모델 마우스의 대조군에서 발현이 감소되었으나, imNK 세포 투여에 의해 발현이 증가된 유전자 중 lysosomal hydrolase 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20a 내지 도 20f는 인간 말초혈액단핵세포에서 분리한 직후(0일, 비활성, PB-NK) 및 14일간 활성화된(14일) 인간 말초혈액단핵세포 유래 자연살해세포(activated PBNK)의 전사체를 분석 결과 중, 효과기 기능(effector function) 및 면역 세포 활성(immune cell activation) 관련 유전자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21a 내지 도 21c는 14일간 활성화된 인간 말초혈액단핵세포 유래 활성 자연살해세포 및 21일간 활성화된 인간 유도만능줄기세포 유래 자연살해세포(EiNK, enhanced induced pluripotent stem cell derived natural killer cell)의 전사체를 분석한 결과 중, 발현이 유사하거나 EiNK에서 증가한 유전자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 인간 말초혈액단핵세포 유래 비활성 자연살해세포(PBNK), 활성화된 자연살해세포(activated PBNK, 14일) 및 인간 유도만능줄기세포 유래 활성화된 자연살해세포(EiNK, 21일)에서 GM-CSF, IFNG, GADD45G, HAVCR2, HNGB1 및 TNEN119의 유전자 발현을 q-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 일 측면은 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "자연살해세포(natural killer cell, NK cell)"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. 면역반응의 일익을 담당하는 림프구계 세포로, 정상인 혈액 내에 약 10~15%가량 존재하며, 비자기(non-self)와 반응할 때 높은 살해능을 가진다. 각종 바이러스에 감염된 세포나 세균 침투, 혹은 비정상 세포의 생성에 있어, 자연살해세포는 비특이적으로 즉각적으로 반응하여 이물질을 제거할 수 있다.
정상인의 체내에 존재하는 대부분의 자연살해세포는 비활성화 상태로 존재하며, 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화된다.
상기 자연살해세포는 개체로부터 수득할 수 있으며, 다양한 조직으로부터 수득할 수 있다. 또한, 상기 자연살해세포는 개체로부터 수득한 변형이 없는 자연살해세포를 포함하고, 성숙한 자연살해세포 뿐 아니라, 미성숙한 자연살해세포를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 자연살해세포는 조직, 조혈세포, 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포에서 분리하여 수득될 수 있다. 보다 구체적으로, 자연살해세포는 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 비장, 간 등으로부터의 조혈세포, 조혈 줄기 또는 전구체, 태반 또는 탯줄 유래 줄기세포, 유도만능줄기세포, 또는 이로부터 분화된 세포로부터 생성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 자연살해세포는 자가 또는 타가에서 수득한 세포일 수 있다. 또한, 자연살해세포는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물로부터 유래인 것일 수 있다. 일 구체예로 자연살해세포 치료를 받고자 하는 개체에서 수득한 것일 수 있다. 이때, 상기 자연살해세포는 개체의 혈액에서 직접 분리하여 사용하거나, 개체에서 수득한 미성숙 자연살해세포 또는 줄기세포를 분화시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 자연살해세포 혈액에서 수득한 자연살해세포일 수 있으며, 줄기세포 또는 유도만능줄기세포로부터 분화된 자연살해세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "줄기세포(stem cell)"는 상대적으로 발생이 덜된 미분화된 세포로서, 적합한 조건 하에서 특정 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 말한다. 상기 줄기세포는 자기 재생하여 미분화된 자신의 특성을 유지하는 능력을 지닌 딸세포를 생성할 수 있고, 동시에 특정 유형의 세포로 분화하는 딸세포를 생성할 수 있다. 상기 줄기 세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 유도만능줄기세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "유도만능줄기세포(iPSC, induced pluripotent stem cell)"는 다능성이 없는 체세포에 역분화를 유도하여 배아줄기세포와 같은 다능성을 갖도록 생성된 세포를 말한다. 유도만능줄기세포는 역분화 줄기세포라고도 불릴 수 있다. 상기 유도만능줄기세포는 태아, 신생아, 어린이, 또는 성인의 체세포를 이용하여 생성될 수 있다. 상기 유도만능줄기세포는 섬유아세포, 각질세포, 혈구 세포, 또는 신장 표피세포 유래일 수 있다. 상기 유도만능줄기세포는 체세포를 재프로그래밍함으로써 생산된 것일 수 있다. 체세포를 재프로그래밍하여 유도만능줄기세포로 제작하는 방법은 공지된 방법, 예컨대 Takahashi K, Yamanaka S(August 2006), Cell. vol.126, no.4, pp.663-676에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 상기 유도만능줄기세포는 1종 이상의 조직 또는 장기를 구성하는 모든 세포, 또는 바람직하게는 3개의 배엽층: 내배엽(내부 위 내막, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 골, 혈액, 비뇨생식기) 또는 외배엽(표피 조직 및 신경계) 중 어느 하나로 분화될 수 있다. 본 명세서에서 iPSC에서 분화된 자연살해세포를 "EiNK"로 지칭하였다.
본 발명에서 상기 자연살해세포는 인터페론 또는 대식 세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 자연살해세포는 "활성화 수용체" 및 "억제성 수용체"로 표지되는, 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 세포외 수용체를 포함한다.
본 발명에서 상기 자연살해세포는 GM-CSF, IFN-gamma, Gadd45g, zbtb32, P2RY14, TREM119, IL12RB1, CD55, Sema6D, Gzmb/c/d/e/f, Havcr2, CXCR6, HMGB1, IL-2, IL-10 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 특정 유전자가 과발현 되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factors)는 대식세포(macrophage), T 세포, 비만세포(mast cell), 자연살해세포, 내피세포(endothelial cell) 및 섬유아세포(fibroblast)에 의해 분비되는 단백질이다. 백혈구의 성장인자로 기능하는 사이토카인으로, 골수 전구세포의 분화와 증식을 조절하고, 성숙된 단핵구(monocyte)와 과립구(granulocyte)의 기능을 항진시키는 역할을 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IFN-gamma"는 자연살해세포, Th1 세포, cytotoxic T 세포 등에 의해 분비되는 사이토카인으로, 대부분의 면역세포의 기능과 선천 및 후천 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. IFN-gamma는 항바이러스 활성, 세포 또는 종양 성장 억제, B 세포의 면역글로불린 생산 세포로의 말단 분화 촉진 등과 같은 다양한 생물학적 효과가 알려져 있다. 또한, 대식세포를 활성화시키고 자연살해세포 및 T 세포의 세포독성을 증가시킨다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Gadd45g(growth arrest and DNA-damage 45-inducible gamma)는 CR6, DDIT2, GRP17 또는 OIG37로도 알려져 있으며, 성 발달, 인간 특이적 뇌 발달, 종양 억제, 세포 스트레스 반응 등을 조절한다. 헬퍼 T 세포(특히, Th1 세포)에서 MAP kinase를 활성화하며, IFN-gamma 생산 및 Gadd45b와 함께 항종양 면역반응에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "zbtb32(zinc finger and BTB domain containing 32)"는 활성화된 T 세포 및 B 세포에서 주로 발현되는 전사 억제자이다. zbtb32는 염증성 사이토카인에 의해 발현이 유도되어 자연살해세포의 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, CIITA(class II major histocompatibility complex transactivator) 유전자의 발현을 억제하여 면역반응을 조절한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "P2RY14(P2Y purinoceptor 14)"는 G-단백질 커플 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR) 패밀리에 속하는 수용체이다. 미세아교세포의 기능 항상성에 중요한 역할을 하며 IL-6를 감소시켜 항염증에 관여한다고 알려져 있다. 줄기세포 및 전구세포에서 세포 노화를 억제하고, P2RY14의 선택적 고친화성 길항제는 인간 호중구의 UDP-포도당 자극 화학주성(chemotaxis)을 억제하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "TREM119(transmembrane protein 119)"는 뇌에 존재하는 미세아교세포의 기능 항상성에 핵심적인 역할을 담당하는 표면단백질이다. 근모세포에서 골아세포로의 분화를 촉진하여 골 형성에 중요한 역할을 하는 단백질로도 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IL12RB1(interleukin-12 receptor subunit beta-1)"은 인터루킨(interleukin) 수용체로, 단독으로는 IL-12와 낮은 친화도로 결합한다. IL-12RB2와 결합하여 IL-12에 대해 고친화성 수용체를 형성하며, IL-23R와 결합하는 경우, IL-23의 수용체로 작용한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "CD55"는 complement decay-accelerating factor 또는 DAF로도 알려져 있으며, 세포 표면에서 보체 작용에 관여하는 단백질이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Sema6D(semaphorin-6D)"는 T 세포, B 세포 및 자연살해세포에서 발현되는 단백질로, 수지상세포(DC, dendritic cell)에 발현하는 plexin-A1와 결합하는 것으로 알려져 있다. Sema6D는 T 세포에서 수지상 세포의 plexin-A1에 결합하여 수지상 세포를 활성화시키고, B 세포에서 1형 인터페론의 생산을 촉진하며, 1차 면역반응 동안 T 세포의 활성을 조절한다. 또한, 자연살해세포를 파골 세포로 분화시키는데 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Gzm(granzyme)"은 세포독성 T 세포 및 자연살해세포 내의 세포질 과립에 의해 방출되는 세린 프로테아제(serine protease)이다. 상기 그랜자임은 퍼포린(perforin)과 함께 세포 독성 과립(granule)에 패킹되어 면역 표적화된 세포로 분비되어 표적 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도한다. 인간에서는 그랜자임 A, B, H, K 및 M이 발현되며, 이중 그랜자임 A 및 B가 가장 많이 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한, 그랜자임은 세포내 병원균(pathogen)을 제거하는 역할을 한다. 그랜자임 B는 caspase 의존적 및 비의존적으로 표적세포의 세포사멸을 유도한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Havcr2(hepatitis A virus cellular receptor 2)"는 TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3)로도 알려져 있으며, T 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, 비만세포, 자연살해세포 및 암세포의 표면에 발현한다. 면역관문 단백질로서 Gal-9, PtdSer, HMGB1 및 CEACAM1과 결합하여 면역세포의 활성을 억제한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "HMGB1(high mobility group box 1)"는 염색질(chromatin) 구성 단백질로, 핵에서 뉴클레오솜, 전사인자 및 히스톤과 결합하여 염색질 리모델링을 유도하여 전사를 조절한다. 또한, HMGB1은 단핵구, 대식 세포 및 수지상 세포 등과 같은 면역세포 또는 죽은 세포에서 분비되어 염증반응을 유도한다. 세포에서 분비된 HMGB1은 TLR2(toll like receptor 2) 및 TLR4와 결합하여 대식 세포에서 사이토카인 분비를 증가시켜 염증반응을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 반면, 면역관문 단백질 TIM-3와 결합하는 경우, 상기 TLR 신호 전달이 억제됨으로써 면역반응이 억제된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-2"는 T 세포 성장 인자(TCGF, T-cell growth factors)로도 불리며, 림프구 생성, 생존 및 항상성에서 중심 역할을 하는 구형의 당단백질이다. IL-2는 활성화된 T 세포 중 특히, 헬퍼 T 세포(helper T cell)에 의해 주로 합성된다. IL-2는 T 세포의 증식 및 분화를 자극하고, 세포독성 T 세포의 생성 및 말초혈 림프구의 세포독성 세포 및 림포카인-활성화 살해 세포(LAK cell, lymphokine activated killer cell)로의 분화를 유도한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-10"은 CSIF(human cytokine synthesis inhibitory factor)로도 알려져 있으며, 항염증성 사이토카인이다. 단핵구, Th2 세포, 비만세포, 조절 T 세포 및 활성화된 B 세포에서 주로 합성된다. IL-10은 NF-κB 활성 및 JAK-STAT 신호 전달 경로의 활성을 억제함으로써 면역반응을 억제한다. 또한, T 세포, B 세포, 자연살해세포, 항원제시세포(APC, antigen presenting cell), 비만세포 및 과립구 등 여러 면역세포의 증식과 분화를 조절한다.
본 발명에서 상기 유전자는 개체로부터 수득한 자연살해세포에 비하여 2배 이상 과발현된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개체로부터 수득한 자연살해세포"는 1종 이상의 마커(marker) 단백질, 예를 들어 CD56, CD16 및 KIR의 발현 수준으로 나타낸 바와 같은, 아직 성숙한 자연살해세포로 발전하지 않은 자연살해세포 계통의 세포를 의미한다. 구체적으로, 상기 개체로부터 유래된 추가적인 변형이 없는 자연살해세포 자체로 활성화를 유도하지 않은 세포 또는 배양 0일 차의 자연살해세포일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 의한 자연살해세포는 개체로부터 수득한 자연살해세포와 비교하여 상기 유전자의 발현이 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상 또는 약 6배 이상 과발현된 것일 수 있다.
본 발명에 의한 자연살해세포는 활성화된 자연살해세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "활성화된 자연살해세포"는 조혈세포, 자연살해 전구세포, iPSC 또는 줄기세포에서 NK 세포로 분화 유도된 또는 임의의 조직으로부터 유래된 추가적인 변형이 없는 자연살해세포에 비해 세포독성이 증가되거나, 자연살해세포의 본연의 면역조절능이 향상된 세포를 의미할 수 있다. 상기 활성화된 자연살해세포는 치료 대상 세포나 조직을 표적할 수 있는 수용체가 과량 발현되어 있는 세포일 수 있다. 상기 자연살해세포가 활성화되었는지 여부는 1종 이상의 기능적으로 관련된 마커, 예를 들어 CD161, NKp44, DNAM-1, 2B4, NKp46, CD107a 및 활성화 수용체의 NKG2 패밀리(예를 들어, NKG2D)를 검출함으로써 평가될 수 있다.
자연살해세포를 활성화시키기 위한 방법은 개체로부터 유래된 자연살해세포를 특정 조건에서 배양하거나, 유전적으로 변형시키거나, 자연살해세포의 활성을 증가시키는 물질을 처리하는 것일 수 있다.
본 발명에서 자연살해세포는 배지에서 배양되어 배양액에 포함된 것 또는 배지에서 배양된 후 배양액으로부터 분리된 것일 수 있다.
자연살해세포 배양은 당 분야에 공지된 통상의 동물세포배양 배지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예컨대 CellGro 배지(Cellgenix), AIM-V 배지, RPMI1640 배지, XVIVO 20, RPMI1640 등 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "자연살해세포의 활성을 증가시키는 물질"은 자연살해세포의 활성, 예를 들면, 자연살해세포의 세포독성을 증가시키거나, 활성화된 자연살해세포를 생성, 증가 또는 증식을 시킬 수 있는 임의의 물질을 의미한다.
자연살해세포의 활성을 증가시키는 물질은 면역 사이토카인, 자연살해세포 활성화 수용체의 작용제, 또는 자연살해세포 억제성 수용체의 길항제를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "사이토카인"은 신체 내 방어 체계를 제어하고 생체를 자극하는 신호 물질로서, 생리활성 조절 단백질을 의미할 수 있다. 사이토카인은 자가분비(autocrine), 파라크라인(paracrine) 작용을 통하여 다양한 세포에서 세포 활성화, 분화, 세포 이동, 노화, 사멸 유도 등 다양한 생물학적 활성을 조절한다.
사이토카인은 인터페론(IFN, interferon) 패밀리, 인터루킨 패밀리, 종양괴사인자(TNF, tumor necrosis factors) 패밀리 또는 이들의 조합일 수 있다.
인터페론은 1형 인터페론(예컨대 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-κ, 인터페론-ω), 2형 인터페론(예컨대 인터페론-γ), 3형 인터페론 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 인터루킨은 IL-2, IL-5, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 이때, TNF는 TNF-α, TNF-β 또는 TNF-γ등을 포함할 수 있다. 면역 사이토카인은 사이토카인-항체 복합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인터루킨-항-인터루킨 항체 복합체를 포함할 수 있다.
일 구체예로 본 발명의 자연살해세포는 개체에서 수득하거나 iPSC 세포에서 NK 세포로 분화 유도된 뒤 IL-15가 존재하는 배지에서 배양하여 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 자연살해세포는 비장 또는 말초혈액에서 수득한 자연살해세포를 IL-15가 포함되어 있는 배지에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일 또는 28일간 배양하여 수득할 수 있다. 상기 자연살해세포는 iPSC에서 분화된 자연살해세포를 IL-15가 포함되어 있는 배지에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일 또는 28일간 배양하여 수득할 수 있다. 이때, 배지에 포함되어 있는 IL-15의 농도는 10 ng/ml 내지 200 ng/ml일 수 있다.
일 구체예로 본 발명의 자연살해세포는 개체에서 수득하거나 iPSC 세포에서 NK 세포로 분화 유도된 뒤 IL-2가 존재하는 배지에서 배양하여 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 자연살해세포는 비장 또는 말초혈액에서 수득한 자연살해세포를 IL-2가 포함되어 있는 배지에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일 또는 28일간 배양하여 수득할 수 있다. 상기 자연살해세포는 iPSC에서 분화된 자연살해세포를 IL-2가 포함되어 있는 배지에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일 또는 28일간 배양하여 수득할 수 있다. 이때, 배지에 포함되어 있는 IL-2의 농도는 20 IU/ml 내지 200 IU/ml일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 IL-15에 의해 7일간 활성화된 비장에서 분리한 자연살해세포는 CD3-NKG2D+, CD3-DNAM-1+, CD3-CD107a+의 표현형을 나타내며(도 2), IL-15 처리 0일차에 비하여 INF-gamma 및 GM-CSF의 분비가 150배 이상 증가하였다(도 4).
본 발명의 자연살해세포를 포함하는 약학 조성물은 아밀로이드 베타(amyloid β, Aβ)의 제거를 유도할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "아밀로이드 베타"는 뇌에 축적되고 응집되어 플라크(plaque)를 형성하면 독성을 띠면서 신경세포의 신호전달 시스템인 시냅스(synapse)를 파괴할 수 있고, 이로 인해 치매증상을 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 아밀로이드 베타 플라크의 제거를 유도하여 치매 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 미세아교세포의 활성을 조절할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "미세아교세포(microglia)" 신경 아교 세포의 한 형태로 뇌와 척추 전역에 분포되어 있으며, 중추신경계 세포의 5~12%를 차지하고 있다. 이들은 뇌에 거주하고 있는 면역세포이며 뇌 항상성 및 병원체 등에 대한 숙주 방어에 밀접하게 관여하고 있다. 최근까지 미세아교세포는 CX3CR1, CD11b, Iba1 및 f4/80을 발현하는 골수성 기원의 선천성 면역세포로 정의하고 있다. 미세아교세포는 배아 단계에서 성인기 및 노화에 이르기까지 다양한 발달 단계에서 중요한 역할을 수행하고 있다. 특히, 중추신경계에 걸친 네트워크를 형성하여 항상성 유지 및 숙주 방어 기능을 위한 감지 기능을 수행하고 있고 시냅스 리모델링(중추신경계 발달, 항상성 및 신경 변성에 중요), 수초(myelin) 항상성 유지에도 중요한 역할을 수행한다. 또한 성상세포(astrocyte)와의 상호작용을 통하여 항상성 유지, 염증 및 신경 변성에 관여하고 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "퇴행성 뇌질환"은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서 뇌에서 발생하는 질환을 뜻한다. 현재까지 알려지지 않은 원인으로 뇌와 척수의 특정 뇌세포군이 서서히 그 기능을 잃고 뇌신경계의 정보전달에 가장 중요한 뇌신경세포의 사멸, 뇌신경세포와 뇌신경세포 사이의 정보를 전달하는 시냅스의 형성이나 기능상의 문제, 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증가나 감소로 인하여 야기되는 것으로 알려져 있다.
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후군, 아밀로이드성 뇌졸증(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(friedrich's ataxia), 마차도-조셉 병(machado-joseph's disease), 루이 소체 치매(lewy body dementia), 혈관성 치매(vascular dementia), 근육긴장이상(dystonia), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 및 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 노인성 질환의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 상기 자연살해세포는 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 1×102 내지 1×1010 개, 1×103 내지 1×109 개, 1×104 내지 1×108 개 또는 1×105 내지 1×107 개의 활성화된 자연살해세포를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 약학 조성물은 2×106 개의 활성화된 자연살해세포를 포함할 수 있다.
여기서 "유효량"은 항노화 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 의미한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나, 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제(예를 들어 DMSO, 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-d 에리스리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-솔비톨, i-이노시톨, D-락토스, 콜린클로라이드, 에피라이프(Epilife®) 세포동결배지(cascade biologics)가 동결 전 세포에 첨가될 수 있다.
본 발명의 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 세포치료제 형태로 적용될 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화 될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포치료제"는 대상체로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다. 본 발명에 있어서, 상기 세포치료제는 체세포치료제일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에 있어서, 세포치료제로서 포함할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 질병 부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서도 투여 가능하다. 여기서, "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물은 경우에 따라서는 상기 자연살해세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다.
따라서 본 발명의 약학 조성물은 국소(협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구(피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 발병부위에 직접 투여할 수 있다. 일 구체예로서 자연살해세포를 적합한 희석제에 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입 시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 뇌척수액 등이 있을 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
본 명세서에서 사용한 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 세포 기준으로 1일 약 1×103 개/kg 내지 약 1×109 개/kg 또는 약 1×104 개/kg 내지 약 1×108 개/kg일 수 있다.
다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하다. 본 발명의 약학 조성물은 1회 내지 3회/일, 1회 내지 3회/주 또는 1회 내지 10회/월로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 상기 약학 조성물은 1회 내지 9회/월, 1회 내지 8회/월, 1회 내지 7회/월, 1회 내지 6회/월, 1회 내지 5회/월, 1회 내지 4회/월, 1회 내지 3회/월 또는 1회 내지 2회/월 투여될 수 있다. 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 명세서에서 사용한 용어, "개체"는 본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 치매가 발병하였거나 발병할 수 있는 대상을 의미하며, 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물일 수 있다. 바람직하게는, 인간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 필요에 따라, 본 발명의 약학 조성물은 공지의 치매 예방 또는 치료 효과를 나타내는 물질을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 전술한 자연살해세포의 활성을 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 종래에 알려져 있는 치매의 예방 또는 치료 물질과 병용하여 투여될 수 있다. 이때, 상기 자연살해세포, 치매 예방 또는 치료 효과를 나타내는 물질 및/또는 자연살해세포의 활성을 증가시키는 물질은 동시 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 약학 조성물의 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 용도를 제공한다. 이때, 약학 조성물, 퇴행성 뇌질환, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 약학 조성물, 퇴행성 뇌질환, 투여 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
상기 개체는 치매가 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물일 수 있다. 바람직하게는, 인간일 수 있다.
상기 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 세포 기준으로 1일 약 1×103 개/kg 내지 약 1×109 개/kg 또는 약 1×104 개/kg 내지 약 1×108 개/kg일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 마우스 유래 자연살해세포의 배양
실시예 1.1. 마우스 유래 자연살해세포의 분리
Balb/c 6주령 수컷 마우스의 비장에서 비장세포를 채취한 뒤, NK cell isolation kit(마우스)(Miltenyi Biotec, 130-115-818)를 이용하여 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)를 분리하였다. 분리된 자연살해세포를 5×106 세포/5 ml(T-25 플라스크)로 접종하여 10% 우태아혈청(FBS)(Gibco, 10100147), 1% 항생제/항균제(Gibco, 15240-062), 1% L-글루타민(Gibco, 25030081), β-mercaptoethanol(Sigma, M3148) 및 재조합 인간 IL-15 단백질(R&D Systems, 247-ILB)이 포함된 RPMI-1640(Cytiva, SH30027) 배지에 배양하였다(표 1). 배양 시작 4일째부터 매일 배지를 추가하면서 7일간 배양하여 마우스 유래 자연살해세포(imNK 세포)를 수득하였다(도 1).
| T-25 플스크 | T-75 플라스크 | T-150 플라스크 | ||||
| Day 0 | Day 3 | Day 4 | Day 5 | Day 6 | Day 7 | |
| RPMI1640 media | 5 ml | 5 ml | 10 ml | 20 ml | 40 ml | 50 ml |
| 10 % FBS | 500 μl | 500 μl | 1 ml | 2 ml | 4 ml | 5 ml |
| 1 % 항생제-항균제 | 50 μl | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 400 μl | 500 μl |
| 1 % L-glutamine | 50 μl | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 400 μl | 500 μl |
| IL-15 | 2.5 μl | 2.5 μl | 5 μl | 10 μl | 20 μl | 25 μl |
| β-mercaptoethanol | 5 μl | 5 μl | 10 μl | 20 μl | 40 μl | 50 μl |
| Total volume | 5 ml | 10 ml | 20 ml | 40 ml | 80 ml | 130 ml |
상기 방법으로 수득된 imNK 세포의 형질을 확인하기 위하여, 자연살해세포의 표면 마커 발현(도 2) 및 세포의 형태(도 3)를 확인하였다.
세포 표면 마커의 발현은 항-CD3 항체(Invitrogen, 11-0031-82), 항-NKG2D 항체(ebioscience, 25-5882-81), 항-DNAM1 항체(Biolegend, 128814) 및 항-CD107a 항체(BD bioscience, 560646)로 염색하여 FACS 분석을 실시하였다. 그 결과, 상기 imNK 세포는 활성화된 자연살해세포임을 확인할 수 있었다(도 2). 또한, 형태학적으로도 IL-15 처리 4일째에도 자연살해세포 모양을 유지하고 있음을 확인하였고, IL-15 처리 7일째에는 4일째와 비교하여 증식률이 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 1.2. 자연살해세포의 배양 기간에 따른 분비되는 사이토카인
확인
상기 실시예 1.1의 방법과 동일하게 분리 및 배양하는 동안, 0일 및 7일에 배양 배지를 채취하여 배지 내 IFN-gamma 및 GM-CSF를 Mouse IFN-gamma Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, SMIF00) ELISA kit 및 Mouse GM-CSF Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, MGM00)를 이용하여 각각 측정하였다. 이때, 수득한 배양액은 각각 원액, 1/10, 1/100 및 1/500의 비율로 희석하여 사용하였다.
그 결과, 배양 0일째의 자연살해세포의 배양액에서는 IFN-gamma 및 GM-CSF가 각각 0±0.18 pg/ml 및 0±3.50 pg/ml로 검출되어, IFN-gamma 및 GM-CSF는 거의 분비되지 않는 것으로 확인되었다.
반면 세포의 배양 및 증식이 진행되어 세포의 활성화가 이루어짐에 따라 배양이 완료된 7일째에는 IFN-gamma(296.16±10.87 pg/ml) 및 GM-CSF(176.19±7.03 pg/ml)가 유의하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 1.3. 자연살해세포의 배양 기간에 따른 유전자 발현 변화 확인
상기 실시예 1.1의 방법과 동일하게 분리 및 배양된 마우스 유래 자연살해세포를 배양 0일 및 배양 7일째에 채취하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 이용하여 QuantSeq 3` mRNA-Seq으로 mRNA 시퀀싱(sequencing)을 진행하여 유전자 발현을 확인하였다.
그 결과, 총 23,183개의 유전자 발현을 확인하였으며, 분리 직후(0일)에 비하여 배양 완료(7일째) 후에 발현이 증가한 유전자는 515개로 확인되었다. 이 중 fold change가 6 이상인 유전자는 104개로 확인되었으며, 상기 104개의 유전자를 fold change가 높은 순으로 정리하였다. 확인된 104개의 유전자 중 관심있는 몇 가지 유전자들의 기능을 확인하면 하기와 같았다(도 5).
Gadd45g는 Th1 세포에서 MAP kinase를 활성화하며, IFN-gamma 생산에 관여하고, Gadd45b와 함께 항종양 면역반응의 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. Gzmc는 핵 및 미토콘드리아 표적을 공격하여 표적 세포 사멸을 신속하게 유도하며, Zbtb32는 CIITA(class II major histocompatibility complex transactivator) 유전자의 발현을 억제하여 면역체계 억제한다. Sema6D는 1차 면역반응 동안 T 세포의 후기 활성 조절하는 역할을 하며, Havcr2 및 Klra2는 KIR 신호전달 억제에 관여한다. 또한 TREM119는 항상성에 관여하며, P2RY14는 면역반응을 조절하는 역할을 하고, CXCR6는 간조직 내의 자연살해세포의 항상성을 조절한다. HMGB1는 비히스톤 핵단백질과 세포외 염증성 사이토카인의 이중 기능을 담당하고 있으며, CD55는 보체 활성화 조절하는 역할을 한다.
실시예 2. imNK 세포의 치매 예방 및 치료 효과 확인
유전자 변이 치매 모델 마우스(APP/PS1 마우스, Jackson laboratory)를 이용하여, 상기에서 제조한 체외 활성된 마우스 유래 자연살해세포(이하, imNK 또는 imNK 세포)의 치매 치료 효과를 확인하였다.
치매 모델 마우스에 마리당 imNK 세포를 2×106 세포/100 μl의 농도로 7일에 1번 총 5회 정맥투여 하였다. 치매 모델 마우스에 대한 대조군으로 야생형 마우스(normal, 정상 마우스)을 사용하였으며, 각 대조군에는 vehicle(PBS)을 정맥투여 하였다(도 6).
실시예 2.1. imNK 세포 투여에 따른 치매 모델 마우스의 인지기능 및 행동 개선 효과 확인
상기와 동일한 방법으로 imNK 세포를 투여한 30일 후, imNK 세포 투여에 의한 마우스의 인지기능 개선 효과를 확인하기 위하여 Y-maze 시험을 수행하였다.
그 결과, 정상 마우스군(normal, 정상군)은 Y 모양의 미로를 헤매며 돌아다니면서 나가는 길을 본능적으로 찾아내지만, 치매 모델 마우스군(sham, 질환군)은 미로를 헤매며 돌아다니는 횟수가 적은 것을 확인하였다. 이에 비해 imNK 세포 투여군(treatment, 치료군)은 정상 마우스군(정상군)과 유사하게 Y 모양의 미로를 헤매며 돌아다니면서 나가는 길을 본능적으로 찾아내는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해 imNK 세포 투여를 통해 치매 모델 마우스의 인지기능 및 행동이 개선됨을 확인할 수 있었다(도 9).
실시예
2.2. imNK 세포 투여에 따른 치매 모델 마우스의 아밀로이드 베타 플라크 형성 억제 효과 확인
아밀로이드 베타(amyloid β, Aβ) 단백질은 서로 뭉쳐 플라크를 형성할 수 있고 형성된 플라크가 독성을 나타내어 신경세포의 신호전달 시스템인 시냅스를 파괴함으로써 치매증상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서, imNK 세포의 치매 치료 효과를 확인하기 위해 imNK 세포 투여에 의한 아밀로이드 베타 플라크 형성 변화를 확인하였다.
상기와 동일한 방법으로 imNK 세포를 치매 모델 마우스에 투여 후 40일째, 마우스의 뇌를 적출하여 아밀로이드 베타에 특이적으로 결합하는 항체(cell signaling technology, 8243)를 이용해 적출된 뇌조직 절편에서 면역염색법을 실시하였다.
그 결과, 정상 마우스(normal)와 비교하여 치매 모델 마우스(Tg+PBS)의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 플라크 형성이 증가한 것을 확인함으로써 치매 모델이 잘 확립된 것을 확인할 수 있었다. 반면, imNK 세포 투여군(Tg+imNK)의 경우, 뇌의 피질영역에서 아밀로이드 베타 플라크 형성이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 7, 적색(Aß): 아밀로이드 베타, 청색(DAPI): 세포핵). 상기 결과를 통해, imNK 세포가 아밀로이드 베타 플라크 형성을 억제함으로써 치매 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2.3. imNK 투여에 따른 치매 모델 마우스의 미세아교세포의 활성 저해 효과 확인
일반적으로 뇌에는 뇌의 면역세포로 알려진 미세아교세포가 존재하고 치매 마우스의 뇌에서 미세아교세포가 활성화되어 있는 것으로 보고되어 있다. 따라서, imNK 세포의 치매 치료 효과를 확인하기 위해 imNK 세포 투여에 의한 미세아교세포 활성 변화를 확인하였다.
상기와 동일한 방법으로 imNK 세포를 치매 모델 마우스에 투여 후 40일째, 마우스의 뇌를 적출하여 미세아교세포 마커인 Iba1에 특이적으로 결합하는 항체(Abcam 153696)를 이용해 적출된 뇌조직 절편에서 면역염색법을 실시하였다.
그 결과, 치매 모델 마우스(Tg+PBS)의 뇌 치상회(dentate gyrus) 및 피질(cortex)에서 IBA1의 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 이를 통해 미세아교세포가 활성화된 것을 확인할 수 있었다. 반면, imNK 세포 투여군(Tg+imNK)에서는 미세아교세포의 활성이 감소한 것을 확인하였다(도 8, 적색: IBA1, 청색: 세포핵(DAPI)). 상기 결과를 통해, imNK 세포가 우수한 치매 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2.4. imNK 투여에 따른 치매 모델 마우스의 미세아교세포 내 유전자 변화 양상 확인
상기와 동일한 방법으로 imNK 세포를 치매 모델 마우스에 투여 후 40일째, 마우스의 뇌를 적출한 뒤 percoll을 이용하여 밀도 구배 방법을 통해 뇌세포를 채취하였다. 채취된 뇌세포는 MACS sorting을 통해 미세아교세포(microglia) 및 비-미세아교세포(non-microglia)를 구분하여 분리하였다. 분리된 미세아교세포 및 비-미세아교세포에서 RNA를 추출하고 전사체 분석을 실시하였다.
총 23,282개의 유전자에 대하여 biological process에 해당하는 유전자(총 6,836개)들의 변화를 확인하였다. 이들 중, 정상 마우스군(normal, 정상군)에 비하여 치매 모델 마우스군(sham, 질환군)에서 발현이 감소하였으나 imNK 세포 투여군(cell-treated, 치료군)에서 발현이 회복된 유전자는 1,115개로 분석되었고(도 11), 치매 모델 마우스군(질환군)에서 증가하였으나 imNK 세포 투여군(치료군)에서 발현이 감소된 유전자는 406개로 분석되었다(도 12).
또한, 상기 biological process에 해당하는 gene ontology 중 노화(aging), 혈관신생성(angiogenesis), 세포주기(cell cycle), 세포이동(cell migration), DNA 수선(DNA repair), 면역반응(immune response)에 해당하는 유전자들의 변화 양상을 확인하였다. 그 결과, 정상 마우스군(normal, 정상군)에 비하여 치매 모델 마우스(sham, 질환군)에서 해당 gene ontology에 관여되어 있는 유전자의 발현이 감소하는 경향을 확인할 수 있었다(도 10 상단). 반면, imNK 세포 투여군(treated, 치료군)과 치매 유발 대조군(sham, 질환군)을 비교하면 치매 유발에 의해 감소되었던 gene ontology에 관여되어 있는 유전자들의 발현이 증가하는 경향을 확인할 수 있었다(도 10 하단).
상기 결과를 통해, 치매 발생에 의해 생물학적 기능에 관련된 주요 유전자의 발현이 감소되며, imNK 세포 투여는 상기 치매에 의해 감소된 유전자의 발현을 회복시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2.4.1. imNK 투여에 따른 치매 모델 마우스의 미세아교세포 내 대사경로 관련
유전자 변화 양상 확인
실시예 2.4의 전사체 분석 결과 중 대사경로(metabolic process)에 관하여 총 2,370개의 유전자가 변화한 것으로 확인되었다. 이 중 1,694개의 유전자가 치매 유발(sham, 질환군)에 의해 발현이 감소하였으나 imNK 세포 투여(treated, 치료군)에 의해 발현이 회복된 것으로 확인되었다. 상기 변화된 유전자 중 Top 30개의 유전자의 변화 양상을 도 13에 나타내었다. 또한, 대사 경로에 관여하는 유전자 중 해당(glycolysis)/당신생합성(gluconeogenesis)에 해당하는 유전자는 9개로 분석되었으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
실시예 2.4.2. imNK 투여에 따른 치매 모델 마우스의 미세아교세포 내 면역반응
관련
유전자 변화 양상 확인
실시예 2.4의 전사체 분석 결과 중 면역반응(immune response)에 관하여 총 178개의 유전자가 변화한 것으로 확인되었다. 이 중 120개 유전자가 치매 유발(sham, 질환군)에 의해 발현이 감소하였으나 imNK 세포 투여(treated, 치료군)에 의해 발현이 회복된 것으로 확인되었다. 상기 변화된 유전자 중 Top 30개의 유전자 변화 양상을 도 16a 내지 도 16d에 나타내었다.
실시예 2.4.3. imNK 투여에 따른 치매 모델 마우스의 미세아교세포 이외의 세포 내 신경신생성
관련
유전자 변화 양상 확인
실시예 2.4의 미세아교세포 이외의 세포에서 분석된 전사체 분석 결과 중 신경신생성(neurogenesis)에 관하여 총 226개의 유전자가 변화한 것으로 확인되었다. 이 중 172개 유전자가 치매 유발(sham, 질환군)에 의해 발현이 감소하였으나 imNK 세포 투여(treated, 치료군)에 의해 발현이 회복된 것으로 확인되었다. 상기 변화된 유전자 중 Top 30개의 유전자 변화 양상을 도 15에 나타내었다.
실시예 2.4.4. imNK 투여에 따른 치매 모델 마우스의 미세아교세포 내 자가소화작용 관련 유전자 변화 양상 확인
실시예 2.4의 미세아교세포 이외의 세포에서 분석된 전사체 분석 결과 중 자가소화작용(autophagy)에 관여하는 유전자를 확인하였다. 이 중 97개의 유전자가 치매 유발(sham, 질환군)에 의해 발현이 감소하였으나 imNK 투여(treated)에 의해 발현이 회복된 것으로 확인되었다. 상기 유전자 중 Atp6v1d, Vps72, ulk1, Mdk, Il15 및 Vps28의 발현 변화 양상을 확인한 결과를 도 17에 나타내었다.
또한, lysosome과 관련하여 lysosomal acidification 또는 lysosomal hydrolase에 해당하는 유전자 발현에 대한 변화 양상을 확인하여 도 18 및 도 19에 나타내었다.
실시예 3. 비활성 및 활성화된 자연살해세포의 유전자 발현 비교
실시예 3.1. 인간 말초혈액단핵세포 유래 자연살해세포 활성화 유도
인간 말초혈액단핵세포 유래 자연살해세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell derived natural killer cell)를 배지와 1:1로 혼합한 후, 피콜(ficoll)을 넣어둔 tube에 상기 혼합물을 로딩하였다(Ficoll:혈액:배지=1:1:1). 혼합액이 로딩된 튜브를 400g에서 30분 30초 동안(ACC:4, DEC:0) 원심분리하여 백혈구층(두번째층)을 수거하였다. 상기 수거된 층의 세포는 2% 인간 AB 혈청, 1% L-Glutamine, 50 ng/ml IL-15, 3 ng/ml IL-12 및 30 ng/ml IL-18이 포함되어 있는 자연살해세포 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 5일차가 되었을 때, T-25 플라스크에서 세포를 T-75 플라스크로 옮긴 뒤, 배지 10 ml 당 1% L-Glutamine, 2% 인간 AB 혈청, 500 IU/ml IL-2 및 1 ng/ml IL-15가 함유되도록 처리하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 14일차에 세포를 수거하여 활성화된 PBMC 유래 자연살해세포(이하, PBNK 또는 PBNK 세포)로 사용하였다.
실시예 3.2. 비활성화 및 활성화된 PBNK의 유전자 발현 비교 분석
상기 실시예 3.1의 방법과 동일하게 배양된 PBNK를 배양 0일(비활성 PBNK) 및 배양 14일째(활성화 PBNK)에 채취하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 이용하여 QuantSeq 3` mRNA-Seq으로 mRNA 시퀀싱(sequencing)을 진행하여 유전자 발현을 분석하였다. ExDEGA를 이용하여 유전자 발현양의 변화를 확인한 결과 중, fold change가 2 이상이고, normalized data(Log2)가 4 이상의 발현양을 나타낸 유전자를 선별하여 선별하였고 biological process에 해당하는 gene ontology의 분포를 확인하였다. 각 gene ontology에 변화된 유전자의 경향은 하기와 같다:
노화(aging, upstream: 30, 10.49%), 혈관신생성(angiogenesis, upstream: 24, 7.55%), 세포사멸 과정(apoptotic process, upstream: 135, 14.45%), 세포주기(cell cycle, upstream: 332, 24.76%), 세포사멸(cell death, upstream: 145, 13.07%), 세포분화(cell differentiation, upstream: 323, 8.42%), 세포이동(cell migration, upstream: 83, 9.13%), DNA 수선(DNA repair, upstream: 128, 25.75%), 세포외 기질(extracellular matrix, upstream: 30, 5.20%), 면역반응(immune response, upstream: 190, 9.97%), 염증반응(inflammatory response, upstream: 56, 9.98%), 신경세포생성(neurogenesis, upstream: 142, 8.22%), RNA 스플라이싱(RNA splicing, upstream: 54, 12.95%), 분비(secretion, upstream: 114, 9.95%).
특히, 상기 gene ontology 관련 유전자 중, 비활성화 PBNK와 비교하여 활성화된 PBNK에서 면역반응에 관련된 유전자 중 190개의 유전자의 발현이 증가하였음을 확인하였다. 이들 유전자 중 86개의 효과기 기능(effector function) 및 면역 세포 활성(immune cell activation)에 관련된 유전자의 발현을 비교 분석하여 도 20a 내지 도 20f에 나타내었다.
실시예 4. 활성화 PBNK 및 활성화 유도만능줄기세포 유래 자연살해세포의 유전자 발현 비교
실시예 4.1. 인간 유도만능줄기세포로부터 자연살해세포 생산 방법
본 실시예에 사용된 CMC-009 인간 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 세포주는 국립줄기세포재생센터의 국가줄기세포은행에서 분양받았다. 해당 세포주는 세포외 기질인 iMatrix-511(Nippi, 892012)이 도포된 세포 배양용기에서 StemFit Basic04 배양액(Ajinomoto, AJBASIC04)하에서 배양하였다.
구체적으로, 2 uM CHIR-99021(Peprotech, 2520691), 80 ng/ml BMP4(R&D Systems, 314-BP/CF) 및 80 ng/ml VEGF(R&D Systems, 293-VE/CF)가 추가로 함유된 무혈청 줄기세포배양액 Essential 8TM(Gibco, 1517001)으로 배양하였다. 2일 후 상기 배양액을 제거하고 2 uM SB-431542(Peprotech, 3014193), 50 ng/ml SCF(R&D Systems, 255-SC/CF) 및 80 ng/ml VEGF가 추가로 함유된 무혈청 세포배양액 Essential 6TM(Gibco, 1516401)에서 배양하여 중배엽성세포로의 분화를 유도하고, 그 후, 추가적으로 조혈모세포의 분화를 유도하였다. 8일 후 상기 배양액을 제거한 후 자연살해세포로의 분화를 유도하였다.
실시예 4.2. EiNK의 활성화 유도
실시예 4.1의 방법으로 수득된 인간 유도만능줄기세포 유래 자연살해세포(이하, EiNK 또는 EiNK 세포)를 배양 배지(complete media, 1% L-Glutamine, 15% 인간 AB 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 50 IU/ml IL-2, 10 ng/ml IL-15, 5 ng/ml Sodium selenite를 포함한 RPMI1640)를 첨가하여 추가 배양하였다. 배양 21일차에 세포를 회수하여 활성화된 EiNK로 사용하였다.
실시예 4.3. 활성화된 PBNK 및 활성화된 EiNK의 유전자 발현 분석
상기 실시예 3.1 방법으로 활성화시킨 PBNK 및 실시예 4.2와 동일한 방법으로 활성화시킨 EiNK에서 14일간 활성화된 PBNK에서 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 이용하여 QuantSeq 3` mRNA-Seq으로 mRNA 시퀀싱(Sequencing)을 진행하여 유전자 발현을 분석하였다. ExDEGA를 이용하여 유전자 발현양의 변화를 확인한 결과 중, fold change가 2 이상인 유전자 41개를 선별하여 도 21a 내지 도 21c에 나타내었다.
상기 41개의 유전자는 면역반응과 관련된 유전자로, 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 인간 EiNK가 알츠하이머 질환을 치료할 수 있는 가능성을 제시하였다.
또한, 상기 세 종류의 NK 세포에서 상기 전사체 분석을 통해 imNK에서 발현이 증가된 것으로 확인된 유전자인 CSF2(GM-CSF), IFNG, GADD45G, Zbtb32, P2RY14, IL12RB1, CD55, SEMA6D, GZMB, HAVCR2, CXCR6, HMGB1, IL2, IL10 및 TMEM119의 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, 비활성 PBNK와 비교하여 활성화 PBNK 뿐만 아니라 활성화 EiNK에서도 GM-CSF, IFNG, GADD45G, HAVCR2, HNGB1 및 TNEN119 유전자의 발현이 증가하였다.
상기 결과를 통해, 면역조절에 중요한 상기 6종의 유전자 발현이 마우스 유래의 자연살해세포 뿐만 아니라 인간 유래의 자연살해세포(PBNK 및 EiNK)에서도 증가하였음 확인할 수 있었다. 또한, 상기 결과는 본 발명에 의한 인간 유래의 자연살해세포도 상기 마우스 유래의 자연살해세포와 유사하게 알츠하이머 또는 치매 질환에 있어서 중요한 역할을 하는 미세아교세포의 대사 및 기능을 정상화시킬 수 있는 가능성을 시사하는 것으로 사료된다.
Claims (9)
- 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 자연살해세포는 GM-CSF, IFN-gamma, Gadd45g, zbtb32, P2RY14, TREM119, IL12RB1, CD55, Sema6D, Gzmb/c/d/e/f, Havcr2, CXCR6, HMGB1, IL-2, IL-10 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 특정 유전자가 과발현되는 것인, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 유전자는 개체 내에 존재하는 자연살해세포에 비하여 2배 이상 발현이 증가된 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 유전자는 개체로부터 수득한 자연살해세포를 1일 내지 28일 동안 배양시 발현이 증가되는 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 자연살해세포는 IL-15, IL-2 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나가 존재 하에 배양하는 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 자연살해세포는 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 비장, 간 및 만능유도줄기세포(iPSC)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나에서 수득되는 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 자연살해세포는 활성화된 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 활성화된 자연살해세포는 개체 내에 존재하는 자연살해세포에 비하여 분비되는 INF-gamma 및/또는 GM-CSF의 분비가 2배 이상 증가하는 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후군, 아밀로이드성 뇌졸증(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(friedrich's ataxia), 마차도-조셉 병(machado-joseph's disease), 루이 소체 치매(lewy body dementia), 혈관성 치매(vascular dementia), 근육긴장이상(dystonia), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 및 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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