KR20230137394A - 트랜스포좀 결합된 비드 상의 긴 인덱싱된-연결된 판독 생성 - Google Patents

트랜스포좀 결합된 비드 상의 긴 인덱싱된-연결된 판독 생성 Download PDF

Info

Publication number
KR20230137394A
KR20230137394A KR1020237028950A KR20237028950A KR20230137394A KR 20230137394 A KR20230137394 A KR 20230137394A KR 1020237028950 A KR1020237028950 A KR 1020237028950A KR 20237028950 A KR20237028950 A KR 20237028950A KR 20230137394 A KR20230137394 A KR 20230137394A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
primer
amplification
beads
indexed
Prior art date
Application number
KR1020237028950A
Other languages
English (en)
Inventor
레나 크리스티안센
프랭크 제이. 스티머스
게리 슈로스
제루샤 토마스
디미트리 케이. 포콜록
Original Assignee
일루미나, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일루미나, 인코포레이티드 filed Critical 일루미나, 인코포레이티드
Publication of KR20230137394A publication Critical patent/KR20230137394A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/082—Active control of flow resistance, e.g. flow controllers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/543—Immobilised enzyme(s)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/155—Modifications characterised by incorporating/generating a new priming site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/191—Modifications characterised by incorporating an adaptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/101—Homogeneous assay format, e.g. one pot reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/159—Microreactors, e.g. emulsion PCR or sequencing, droplet PCR, microcapsules, i.e. non-liquid containers with a range of different permeability's for different reaction components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

본원에 제공된 시스템, 방법 및 조성물의 실시형태는 온 비드 태그먼트화 및 액적 인덱싱에 관한 것이다. 일부 실시형태는 핵산 서열분석, 인덱싱된 PCR, 핵산 라이브러리 준비, 메틸화 상태 결정, 게놈 변이 식별, 또는 단백질 분석을 포함하는 분할된 비드에 대한 공동 검정 수행을 포함한다.

Description

트랜스포좀 결합된 비드 상의 긴 인덱싱된-연결된 판독 생성
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 그 전체가 참조로 본원에 포함되는 2021년 2월 4일에 출원된 "LONG INDEXED-LINKED READ GENERATION ON TRANSPOSOME BOUND BEADS"라는 제목의 미국 임시 특허 제63/145,902호에 대하여 우선권을 주장한다.
서열 목록의 참조
본 출원은 전자 포맷의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2022년 2월 3일자로 생성되고 크기가 2.7 킬로바이트인 파일명이 Sequence_Listing_ILLINC_406WO인 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 포맷의 정보는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본원에 제공된 시스템, 방법 및 조성물은 공간 인덱스 서열분석 및 핵산 라이브러리 준비를 위한 조성물, 시스템 및 방법에 관한 것이다.
생물학적 샘플에 존재하는 특정 핵산 서열의 검출은 예를 들어 미생물 식별 및 분류, 전염병 진단, 유전적 이상 검출 및 특성화, 암과 관련된 유전적 변이 식별, 질환에 대한 유전적 감수성 연구 및 다양한 유형의 치료에 대한 반응 측정을 위한 방법으로 사용되어 왔다. 생물학적 샘플에서 특정 핵산 서열을 검출하는 통상적인 기술은 핵산 서열분석이다.
차세대 시퀀서는 서열분석 실행당 대량의 게놈 데이터를 생성하는 강력한 도구이다. 이 많은 양의 데이터를 해석하고 분석하는 것은 어려울 수 있다.
본 개시내용은 비드-결합된 트랜스포좀 및 액적 생성기를 사용하여 인덱싱된-연결된 판독을 제조하기 위한 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본원에 제공된 일부 실시형태는 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시스템은 복수의 인접 비드, 인덱싱된 프라이머 풀 및 서열분석 데이터를 수득하기 위한 검출기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 인접 비드는 트랜스포좀과 회합된다. 일부 실시형태에서, 각각의 인접 비드는 비드-결합된 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인덱싱된 프라이머 풀은 복수의 프라이머 비드 및 용액 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 프라이머 비드는 어댑터, 바코드 및 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인접 비드 및 프라이머 비드는 액적 내에서 함께 분할된다. 일부 실시형태에서, 프라이머는 P5 프라이머이다. 일부 실시형태에서, 용액 프라이머는 어댑터 및 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용액 프라이머는 B15 어댑터 및 P7 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀은 트랜스포사제 및 트랜스포존을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인접 비드 및/또는 프라이머 비드는 하이드로겔 중합체 및 가교제를 포함하는 하이드로겔 비드이다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아미드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy), PEG/폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(비닐술폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파르트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 알기네이트, 헤파린, 알기네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 히알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로오스 또는 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가교제가 비스아크릴아미드, 디아크릴레이트, 디알릴아민, 트리알릴아민, 디비닐 설폰, 디에틸렌글리콜 디알릴 에테르, 에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 트리메틸로프로포안 트리메타크릴레이트, 에톡실화 트리메틸올 트리아크릴레이트, 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 50,000개 이상의 염기쌍의 DNA 분자이다.
본원에 제공된 일부 실시형태는 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 플로우 셀 장치에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 장치는 복수의 분할된 액적을 포함하는 고체 지지체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분할된 액적은 트랜스포좀과 회합되고, 비드-결합된 핵산 분자 및 어댑터, 바코드 및 프라이머를 포함하는 프라이머 비드를 포함하는, 인접 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분할된 액적은 고체 지지체의 표면을 따라 분포된다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 표면 중합체로 작용화된다. 일부 실시형태에서, 표면 중합체는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM) 또는 실란 프리 아크릴아미드(SFA)이다. 일부 실시형태에서, 플로우 셀은 패턴화된 표면을 포함한다. 일부 실시형태에서, 패턴화된 표면은 웰을 포함한다. 일부 실시형태에서, 웰은 직경이 약 10 μm 내지 약 50 μm, 예컨대 직경이 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 또는 50 μm이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 이내이며, 웰은 깊이가 약 0.5 μm 내지 약 1 μm, 예컨대 깊이가 0.5 μm, 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm 또는 1 μm이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 이내이다. 일부 실시형태에서, 웰은 소수성 물질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 소수성 물질은 CYTOP, Fluoropel® 또는 Teflon®과 같은 비정질 플루오로중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 50,000개 이상의 염기쌍의 DNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀은 트랜스포사제 및 트랜스포존을 포함한다.
본원에 제공된 일부 실시형태는 핵산 인덱싱 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 각각의 비드가 트랜스포좀에 연결된 온 비드 태그먼트화를 위한 복수의 인접 비드를 생성하는 것을 포함하고, 비드-결합된 핵산 분자를 포함하고, 핵산 분자에 대해 태그먼트화 반응을 수행하고, 각각의 프라이머 비드가 어댑터, 바코드 및 프라이머를 포함하는, 복수의 프라이머 비드를 생성하고, 용액 프라이머를 사용하여 액적 내에 인접 비드 및 프라이머 비드를 함께 분할하고, 분할된 액적 내에서 핵산 분자를 증폭하고, 각 액적에서 핵산 분자를 인덱싱하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 50,000개 이상의 염기쌍의 DNA 분자이다. 일부　실시형태에서, 방법은　태그먼트화 반응을 수행하기 전에 핵산 분자에 대해 핵산 증폭을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 증폭 반응은 다중 변위 증폭(MDA)을 포함한다. 일부　실시형태에서, 태그먼트화 반응은 핵산을 어댑터 서열 및 트랜스포좀을 포함하는 트랜스포사제 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인덱싱은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행된다. 일부　실시형태에서, 액적은 900,000개 초과의 상이한 인덱싱된 PCR 구획으로 분할된다. 일부 실시형태에서, 방법은 고체 지지체 상에 액적을 분할하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 고체　지지체는　플로우 셀 장치이다.
도 1은 온 비드-트랜스포좀 상의 분할된 액적을 생성하기 위해 사용될 수 있는 미세유체 액적 생성기 시스템의 실시형태의 개략도이다.
도 2는 비드에 대한 연속성-보존 전위(transposition) 서열분석(CPT-seq)(단계 1), 분할/인덱싱된 PCR(단계 2) 및 인덱싱된-연결된 판독(단계 3)을 포함하여 연결된 긴 판독 인덱싱을 수행하기 위한 예시적인 방법에 대한 개략도를 도시한다.
도 3은 비드 상의 CPT-seq, 액적 구획화 및 인덱싱된 프라이머 풀 인덱싱을 포함하는 긴 판독 인덱싱을 수행하기 위한 예시적인 방법에 대한 개략도를 도시한다.
도 4는 본원에 기재된 방법을 사용한 염색체 수준 페이징 결과의 개략도를 도시한다.
도 5는 본원에 기재된 긴 판독 인덱싱 방법을 사용하여 아일랜드 길이와 비교한 아일랜드 수의 결과를 도시한다.
도 6은 10X 서열분석(오른쪽)과 비교하여 본원에 기재된 긴 판독 인덱싱 방법(왼쪽)을 사용한 변형 호출 및 페이징 블록의 결과를 도시한다.
도 7은 인간 백혈구 항원(HLA) 영역에서 수행된 본원에 기재된 긴 판독 인덱싱 방법의 결과를 도시한다.
도 8a 및 도 8b는 HLA-DPA1(도 8a) 및 HLA-A(도 8b) 영역에서 수행된 본원에 기재된 긴 판독 인덱싱 방법의 결과를 도시한다.
하기의 상세한 설명에서는 첨부 도면을 참조하며, 이들 도면은 본 명세서의 일부를 형성한다. 도면에서, 유사한 기호는, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 전형적으로 유사한 구성요소를 나타낸다. 상세한 설명, 도면, 및 청구범위에 기재된 예시적인 실시형태는 제한적인 것으로 의미되지 않는다. 본원에 제시된 발명 요지의 사상 또는 범주로부터 벗어남이 없이 다른 실시형태가 이용될 수 있고, 다른 변경이 이루어질 수 있다. 본 개시내용에 대체적으로 기재되고 도면에 예시된 바와 같은 본 발명의 양태는 각종 매우 다양한 구성으로 배열, 치환, 조합, 분리, 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 본원에서 명백하게 고려됨이 쉽게 이해될 것이다.
본원에 제공된 실시형태는 긴 판독 인덱싱 시스템, 장치 및 방법에 관한 것이다. 시스템은 온 비드 태그먼트화를 포함한다. 비드는 본원에 개시된 임의의 비드를 포함할 수 있고, 비드에 결합된 핵산 분자와 함께 트랜스포좀이 부착된 비드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비드는 트랜스포좀의 존재 하에 혼합되고 트랜스포좀에 결합된 비드를 형성하는 하이드로겔 중합체 및 가교제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 준비되고 나중에 비드에 결합되는 트랜스포좀과 혼합된다. 일부 실시형태에서, 비드는 비드 주위를 둘러싸거나 비드와 회합하는 핵산 분자의 존재 하에 준비된다. 일부 실시형태에서, 비드는 먼저 준비되고, 트랜스포좀과 혼합된 다음, 핵산 분자와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 비드는 인접성을 유지하면서 동일한 샘플에 대해 공동 검정이 수행될 수 있게 한다. 특히, 본원에 제공된 방법, 시스템 및 조성물은 비드에 결합된 생체 분자를 제한하고 접근할 수 있게 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 비드는 본원에서 인접 입자로 지칭된다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "인접 입자"는 연속성-보존 전위 서열분석(CPT-seq)에 사용되는 비드를 지칭한다.
본원에 기재된 인접 입자는 차세대 구획화 접근법에 사용될 수 있으며 핵산 분자에 대해 수행되는 다중 분석물 검정을 가능하게 한다. 본원에 기재된 인접 입자 및 사용 방법은 수백만 개의 핵산 분자가 개별적으로 분석되도록 효율적으로 허용하여 샘플 준비 비용을 줄이고 샘플 인접성을 유지하게 한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 에멀젼, 고정화 또는 다른 마이크로-구획과 같은 외부 구획화 전략(마이크로유체)을 사용하지 않고 인접성을 유지한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인접 입자는 관심 핵산 분자를 분석하기 위한 검정에서 사용될 수 있다. 핵산 분자에 대해 수행될 수 있는 검정은 예를 들어 DNA 분석, RNA 분석, 핵산 서열분석, 태그먼트화, 핵산 증폭, DNA 라이브러리 준비, 서열분석을 사용하여 트랜스포사제 액세스 가능한 크로마틱(chromatic)에 대한 검정(ATAC-seq), 연속성-보존 전위 서열분석(CPT-seq) 또는 순차적으로 수행되는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
핵산 분자에 대해 하나 이상의 검정을 수행하기 위한 인접 입자의 사용은 다수의 핵산 분자, 예를 들어 10,000개 내지 100만개의 핵산 분자, 예컨대 10,000개, 50,000개, 100,000개, 500,000개 또는 100만개의 핵산 분자에 대해 동시 검정을 수행하기 위해 다중 인접 입자에 대해 동시에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 페이징 및 어셈블리를 포함하는 다양한 적용을 위한 인덱싱된-연결된 판독을 제조하기 위한 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 온 비드 태그먼트화를 액적 인덱싱과 조합하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 액적 인덱싱은 에멀젼 또는 플레이트를 포함하는 임의의 물리적 구획 인덱싱을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 비드는 핵산 분자에 대한 온 비드 태그먼트화의 수행을 가능하게 하는 트랜스포좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 핵산 분자는 비드 주위를 감싸서 핵산 분자의 비드 결합 단편을 생성한다. 일부 실시형태에서, 방법은 인덱싱과 조합된다. 일부 실시형태에서, 방법은 비드를 액적으로 분할하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 법은 각각의 액적에서 인덱싱된 PCR을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개별 핵산 분자로부터의 각각의 단편은 동일한 바코드를 수용함으로써 인덱싱된-연결된 판독을 생성한다.
본원에 기재된 방법, 시스템 및 장치의 실시형태는 이전 방법에 비해 많은 이점을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법, 시스템 및 장치는 제어된 삽입 크기를 제공하고 DNA를 단편화하지 않고 DNA를 PCR에 의해 고유하게 인덱싱되는 물리적 파티션으로 전달한다. 또한, 비드 상의 CPT-seq는 900,000개 초과의 서로 다른 인덱싱된 PCR 구획에서 수행될 수 있다. 또한, 비드 상의 CPT-seq는 라이브러리 삽입(트랜스포좀 밀도)의 개선된 제어, 액적으로의 DNA 전달 효율 증가, 강력한 DNA 준비, 액적 이전에 수행될 수 있는 검정 단계(예를 들어, Tn5 제거 포함) 및 DNA 단편화 감소를 야기한다. 방법의 실시형태는 비드의 주형 용리를 허용하며, 이는 가열 후 액적에서 태그먼트화된 생성물의 프리 비오틴 용리를 야기한다. 또한, 방법과 관련된 효소는 가닥 치환 중합효소 및 증가된 양의 효소로 높은 증폭을 제공한다. 마지막으로, 본원에 제공된 방법의 실시형태는 DNA 품질을 증가시키고 용해물과의 호환성을 허용한다.
본원에 제공된 방법, 시스템 및 장치는 물리적 파티션으로의 태그먼트화된 핵산의 전달과 비드 상의 전위를 결합한다. 일부 실시형태에서, 긴 인덱싱된 판독 생성은 비드 결합된 트랜스포좀 및 액적 생성기의 생성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 액적 생성기는 미세유체 장치 또는 에멀젼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드 상의 전위는 핵산 태그먼트화 및 빈도를 포함하며, 이는 비드 상의 트랜스포좀의 밀도에 의해 제어될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드는 태그먼트화된 핵산을 물리적 파티션으로 옮기는 데 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "시약"은 샘플과 반응하거나, 샘플과 상호작용하거나, 샘플을 희석시키거나, 또는 샘플에 첨가하기에 유용한 작용제 또는 2개 이상의 작용제의 혼합물을 나타내고, 용해, 핵산 분석, 핵산 증폭 반응, 단백질 분석, 태그먼트화 반응, ATAC-seq, CPT-seq, 또는 SCI-seq 반응, 또는 다른 검정을 위한 작용제를 포함한 본원에 기재된 검정에 사용되는 작용제를 포함할 수 있다. 따라서, 시약은, 예를 들어 완충제, 화학물질, 효소, 중합효소, 50개 미만의 염기쌍 크기를 갖는 프라이머, 주형 핵산, 뉴클레오티드, 표지, 염료, 또는 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시약은 라이소자임, 프로테이나제 K, 랜덤 헥사머, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충제, 또는 2가 양이온을 포함한다.
인접 분자
일부 실시형태에서, 비드는 하이드로겔 조성물로부터 제조된 폴리머 쉘을 갖는다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "하이드로겔"은 유기 중합체(천연 또는 합성)가 공유 결합, 이온 결합, 또는 수소 결합을 통해 가교결합되어, 물 분자를 포획하여 겔을 형성하는 3차원 개방 격자 구조를 생성할 때 형성되는 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 생체적합성 하이드로겔일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "생체적합성 하이드로겔"은 생물학적 물질에 독성이 없는 겔을 형성하는 중합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 물질은 알기네이트, 아크릴아미드, 또는 폴리-에틸렌 글리콜(PEG), PEG-아크릴레이트, PEG-아민, PEG-카르복실레이트, PEG-디티올, PEG-에폭사이드, PEG-이소시아네이트, PEG-말레이미드, 폴리아크릴산(PAA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리스티렌(PS), 폴리스티렌 설포네이트(PSS), 폴리비닐피롤리돈(PVPON), N,N'-비스(아크릴로일)시스타민, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(비닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파르트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 헤파린, 알기네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 하이알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로오스, 콜라겐, 비스아크릴아미드, 디아크릴레이트, 디알릴아민, 트리알릴아민, 디비닐 설폰, 디에틸렌글리콜 디알릴 에테르, 에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 에톡실화 트리메틸올 트리아크릴레이트, 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 또는 이들의 조합 또는 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 알기네이트, 아크릴아미드, 또는 PEG 기반 물질이다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 아크릴레이트-디티올, 에폭사이드-아민 반응 화학 특성을 갖는 PEG계 재료이다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 PEG-말레이미드/디티올 오일, PEG-에폭사이드/아민 오일, PEG-에폭사이드/PEG-아민, 또는 PEG-디티올/PEG-아크릴레이트를 포함하는 중합체 쉘을 형성한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 물질은 세포내 생체분자를 손상시킬 가능성이 있는 자유 라디칼의 생성을 피하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 60 내지 90%의 유체, 예를 들어 물, 및 10 내지 30%의 중합체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하이드로겔의 물 함량은 약 70 내지 80%이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은, 수치 값을 수식할 때, 수치 값에서 발생할 수 있는 변동을 지칭한다. 예를 들어, 특정 기질 또는 구성요소의 제조상 차이로 인해 변동이 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 용어 "약"은 언급된 수치 값의 1%, 5%, 또는 최대 10% 이내를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 중합체 쉘은 비드의 중합체 표면이다. 본원에 기재된 비드의 특성으로 인해, 인접 입자는 다중 검정 후 유전 물질을 보유할 수 있고 물리적 힘, 화학 물질 분해에 의해 또는 중합체 쉘의 두께에 따라 삼투압 불균형을 생성함으로써 방출될 수 있다.
하이드로겔은 친수성 생체중합체 또는 합성 중합체를 가교결합함으로써 제조될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 가교제를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "가교제"는 적절한 베이스 단량체와 반응할 때 3차원 네트워크를 형성할 수 있는 분자를 지칭한다. 하나 이상의 가교제를 포함할 수 있는 하이드로겔 중합체의 예에는 하이알루로난, 키토산, 한천, 헤파린, 설페이트, 셀룰로오스, 알기네이트(알기네이트 설페이트를 포함함), 콜라겐, 덱스트란(덱스트란 설페이트를 포함함), 펙틴, 카라기난, 폴리라이신, 젤라틴(젤라틴 타입 A를 포함함), 아가로스, (메트)아크릴레이트-올리고락티드-PEO-올리고락티드-(메트)아크릴레이트, PEO-PPO-PEO 공중합체(플루로닉스(Pluronics)), 폴리(포스파젠), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(N-비닐피롤리돈), PL(G)A-PEO-PL(G)A 공중합체, 폴리(에틸렌 이민), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올, PEG-아크릴레이트, 아크릴아미드, N,N'-비스(아크릴로일)시스타민, PEG, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(비닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파르트산), 폴리(L-글루탐산), 비스아크릴아미드, 디아크릴레이트, 디알릴아민, 트라이알릴아민, 디비닐 설폰, 디에틸렌글리콜 디알릴 에테르, 에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 에톡실화 트리메틸올 트리아크릴레이트, 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 또는 이들의 조합이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 조합은 중합체 및 가교제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아미드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy), 또는 PEG/폴리프로필렌 옥사이드(PPO)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘은 4-아암(four-arm) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 4-아암 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 PEG-아크릴레이트, PEG-아민, PEG-카르복실레이트, PEG-디티올, PEG-에폭사이드, PEG-이소시아네이트, 및 PEG-말레이미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 가교제는 순간(instantaneous) 가교제 또는 저속(slow) 가교제이다. 순간 가교제는 하이드로겔 중합체를 즉각적으로 가교결합하는 가교제이며, 본원에서 클릭 화학(click chemistry)으로 지칭된다. 순간 가교제는 디티올 오일 + PEG-말레이미드 또는 PEG 에폭사이드 + 아민 오일을 포함할 수 있다. 저속 가교제는 하이드로겔 중합체를 천천히 가교결합하는 가교제이며, PEG-에폭사이드 + PEG-아민 또는 PEG-디티올 + PEG-아크릴레이트를 포함할 수 있다. 저속 가교제는 가교결합하는 데 수 시간 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간 초과가 걸릴 수 있다. 본원에 제공된 일부 실시형태에서, 인접 입자는 순간 가교제에 의해 제형화되고, 이로써 저속 가교제에 비해 핵산 분자의 상태를 더 잘 보존한다.
일부 실시형태에서, 가교제는 하이드로겔 중합체 내에 디설파이드 결합을 형성하여 하이드로겔 중합체를 연결한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 기공을 갖는 하이드로겔 매트릭스(예를 들어, 다공성 하이드로겔 매트릭스)를 형성한다. 이러한 기공은 중합체 쉘 내에 추출된 핵산과 같은 충분히 큰 입자를 보유할 수 있지만 시약과 같은 다른 물질이 기공을 통과하여 비드 안팎으로 통과할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘의 기공 크기는 중합체의 농도 대 가교제의 농도의 비를 변화시킴으로써 미세하게 조정된다. 일부 실시형태에서, 중합체 대 가교제의 비는 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 또는 1:30이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 비에 의해 정의되는 범위 내의 비이다. 일부 실시형태에서, 상이한 응용의 요건을 충족시키기 위해 추가 기능, 예컨대 DNA 프라이머 또는 하전된 화학 기가 중합체 매트릭스에 그래프팅될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "다공도"는 개방 공간, 예를 들어 기공 또는 다른 개구로 구성된 하이드로겔의 부피 분율(무차원)을 의미한다. 따라서, 다공도는 물질 내의 공극 공간의 척도이며, 0 내지 100%의 백분율(또는 0 내지 1)로서의, 총 부피에 대한 공극의 부피의 분율이다. 하이드로겔의 다공도는 0.5 내지 0.99, 약 0.75 내지 약 0.99, 또는 약 0.8 내지 약 0.95의 범위일 수 있다.
중합체 쉘은 핵산을 부수적으로 유지하면서 시약의 충분한 확산을 허용하는 모든 기공 크기를 가질 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "기공 크기"는 기공 단면의 직경 또는 유효 직경을 지칭한다. 용어 "기공 크기"는 또한 복수의 기공의 측정에 기초한 기공 단면의 평균 직경 또는 평균 유효 직경을 지칭할 수 있다. 원형이 아닌 단면의 유효 직경은 비원형 단면의 단면적과 동일한 단면적을 갖는 원형 단면의 직경과 동일하다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 하이드로겔이 수화될 때 팽윤될 수 있다. 이어서, 하이드로겔 내의 물 함량에 따라 기공 크기가 변할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔의 기공은 하이드로겔의 무결성을 유지하지만 시약이 통과하도록 하기에 충분한 크기의 기공을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 의 내부는 수성 환경이다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘과 회합된 핵산 분자는 중합체 쉘과의 상호작용이 없고/없거나 중합체 쉘과 접촉하지 않는다.
일부 실시형태에서, 인접 입자는 약 20 μm 내지 약 200 μm, 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μm의 직경, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 내의 직경을 갖는다. 인접 입자의 크기는 환경적 요인으로 인해 변할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인접 입자는 연속 오일상으로부터 분리되어 수성상 중에 침지될 때 팽창된다. 일부 실시형태에서, 인접 입자의 팽창은 유전 물질에 대한 검정 수행의 효율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 인접 입자의 팽창은 인덱싱된 삽입체가 PCR 동안 증폭될 더 큰 환경을 생성하며, 이는 그렇지 않으면 현재의 세포 기반 검정에서 제한될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기공 크기는 추출된 핵산이 중합체 쉘을 통해 확산되도록 한다. 일부 실시형태에서, 인접 입자의 기공 크기는 가교 화학을 변경함으로써 제어될 수 있다. 최종 가교 기공 크기는 예를 들어 염 농도, pH 또는 온도를 변경하여 인접 입자의 환경을 변경함으로써 고정된 분자가 인접 입자로부터 방출되도록 함으로써 추가로 변경될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가교제는 가역적 가교제이다. 일부 실시형태에서, 가역적 가교제는 하이드로겔 중합체를 가역적으로 가교결합할 수 있으며 절단제의 존재 하에서 가교결합이 풀릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교제는 환원제의 존재에 의해, 승온에 의해, 또는 전기장에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가역적 가교제는 적합한 환원제의 존재 하에서 디설파이드 결합이 끊어질 수 있는, 폴리아크릴아미드 겔을 위한 가역적 가교제인 N,N'-비스(아크릴로일)시스타민일 수 있다. 비드 다공도는 온도 또는 화학적 수단에 의해 증가될 수 있으며, 이에 의해 가교제를 환원제와 접촉시키는 것을 해제하여 가교제의 이황화 결합을 절단하여 비드를 분해할 수 있다. 비드는 분해되어, 그 안에 유지된 핵산과 같은 내용물을 방출한다. 일부 실시형태에서, 가교제는 온도를 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100℃ 초과로 증가시킴으로써 절단된다. 일부 실시형태에서, 가교제는 비드를 환원제와 접촉시킴으로써 절단된다. 일부 실시형태에서, 환원제는 포스핀 화합물, 수용성 포스핀, 질소 함유 포스핀 및 이의 염 및 유도체, 디티오에리트리톨(DTE), 디티오트레이톨(DTT)(2,3-다이하이드록시-1,4-디티올부탄의 각각 시스 및 트랜스 이성질체), 2-메르캅토에탄올 또는 β-메르캅토에탄올(BME), 2-메르캅토에탄올 또는 아미노에탄티올, 글루타티온, 티오글리콜레이트 또는 티오글리콜산, 2,3-다이메르캅토프로판올, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THP), 또는 P-[트리스(하이드록시메틸)포스핀] 프로피온산(THPP)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 온도를 상승시켜 확산을 증가시키거나 환원제와 접촉시키는 것은 가교제를 분해시킨다.
일부 실시형태에서, 가교제의 가교결합은 인접 입자 내에 기공을 확립한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘의 기공 크기는 조절 가능하고 트랜스포좀과 회합하도록 제형화된다. 온 비드 트랜스포좀은 약 300개 염기쌍보다 큰 핵산과 회합하도록 제형화된다. 일부 실시형태에서, 온 비드 트랜스포좀 및 핵산은 다양한 반응의 수행을 위해 다양한 시약에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시약은 유전 물질 처리를 위한 시약, 예를 들어 세포로부터 핵산을 단리하기 위한 시약, 핵산을 증폭, 바코딩 또는 서열분석하기 위한 시약, 또는 핵산 라이브러리의 제조를 위한 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은, 예를 들어, 라이소자임, 프로테이나제 K, 랜덤 헥사머, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 작용 효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충제, 또는 2가 양이온을 포함한다.
인접 입자의 제조 방법
본원에 제공된 일부 실시형태는 트랜스포좀이 회합된 인접 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 인접 입자는 마이크로유체 장치를 필요로 하지 않고 마이크로웰/마이크로어레이 방법 또는 미세해부 방법과 같은 정적 수단에 의해 제조된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 인접 입자는 장치 없는 방법에 의해 제조된다. 중합 개시는 막 단백질, 글리칸 또는 기타 작은 분자의 특정 모이어티를 갖는 단량체 단위의 활성 기의 화학 반응에 의해 발생할 수 있다. 단량체 중합의 초기 단계는 정전기력 또는 소수성 힘에 의해 촉진되는 단량체 단위 침착의 1회 또는 여러 라운드가 뒤따를 수 있다. 일부 단량체 층은 비오틴 또는 트랜스포좀과의 특정 회합을 위해 나중에 사용할 수 있는 다른 리간드와 같은 작용기를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 인접 입자는 동적 수단, 예컨대 볼텍스 보조 에멀젼(vortex assisted emulsion), 미세유체 액적 생성, 또는 밸브 기반 미세유체학에 의해 제조된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 볼텍스 보조 에멀젼은 튜브, 바이알 또는 반응 용기와 같은 용기에서 트랜스포좀과 하이드로겔 중합체를 볼텍싱하는 것을 지칭한다. 성분들은 예를 들어 수동 또는 기계적 볼텍싱 또는 진탕에 의해 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수동 혼합은 트랜스포좀과 회합하는 비드를 생성하며, 여기서 비드는 직경 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μm의 크기, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 내의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 비드의 크기는 불균일하며, 따라서 비드의 크기는 다양한 직경의 비드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인접 입자는 미세유체 유동 기술에 의해 제조된다. 미세유체 흐름은 도 1에 도시된 바와 같이 보조 겔 에멀젼 생성을 위한 미세유체 장치의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세유체 장치는 원하는 크기의 인접 입자를 생성하도록 구성되고 원하는 밀도에서 트랜스포좀과 회합하도록 구성된 마이크로채널을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세유체 장치는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μm의 높이, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 내의 높이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 미세유체 장치는 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세유체 장치는 중합체에 도입된 트랜스포좀, 핵산 등과 같은 인접 입자와 회합될 시약을 도입하기 위한 채널, 가교제를 도입하기 위한 채널 및 비혼화성 유체를 위한 채널을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 채널의 폭은 동일하다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 채널의 폭은 상이하다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 채널의 폭은 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 또는 150 μm이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 내의 폭이다. 채널의 너비와 높이는 반드시 본원에 설명된 값으로 제한되지 않으며 당업자는 인접 입자의 크기가 미세유체 장치의 채널 크기에 부분적으로 의존할 것임을 인식할 것이다. 따라서, 인접 입자의 크기는 채널의 크기를 수정하여 부분적으로 조정될 수 있다. 미세유체 장치의 크기와 채널의 폭 외에도 채널의 유속도 인접 입자의 크기에 영향을 미칠 수 있으며 각 인접 입자와 회합된 트랜스포좀의 밀도에도 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세유체 채널을 통한 중합체 내의 트랜스포좀의 유량은 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150 μL/분, 또는 전술한　값들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 유량이다. 일부 실시형태에서, 미세유체 채널 내 가교제의 유량은 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 μL/분이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 내의 유량이다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 채널 내의 비혼화성 유체의 유량은 20, 30, 50, 80, 100, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 또는 400 μL/분이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 내의 유량이다. 일부 실시형태에서, 중합체 및 가교제와 혼합된 트랜스포좀은 비혼화성 유체 상류의 미세유체 액적 생성기에서 서로 접촉한다. 인접 입자는 가교제와 접촉할 때 형성되기 시작하고 트랜스포좀과 회합한다. 형성하는 인접 입자는 비혼화성 유체의 유속보다 낮은 유속으로 스페이서 오일 및/또는 가교 오일과 같은 비혼화성 유체로 미세유체 액적 생성기를 통해 계속 흘러 액적을 형성한다. 일부 실시형태에서, 비혼화성 유체는 도 1에 도시된 바와 같이 2단계로 도입되며, 스페이서 오일 및 가교제 오일을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서 오일은 미네랄 오일, 탄화수소 오일, 실리콘 오일, 플루오로카본 오일, 또는 폴리디메틸실록산 오일, 또는 이들의 혼합물이다. 본원에서 사용되는 스페이서 오일은 채널 수성-오일 계면에서 중합체의 가교결합을 피하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 인접 입자는 순간 가교제와의 가교에 의해 순간적으로 형성된다. 예를 들어, 트랜스포좀은 미세유체 액적 생성기를 사용하여 4-암 PEG 말레이미드 또는 에폭사이드와 같은 중합체와 비드와 회합될 수 있으며, 미네랄 오일 또는 HFE-7500과 같은 플루오로카본 오일과 같은 오일에 용해 가능한 가교제를 사용하여 순간적으로 가교되어 가교 오일을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교 오일은 톨루엔, 아세톤, 디티올을 함유하는 테트라하이드로푸란, 톨루엔 3,4 디티올의 경우와 같은 아민 작용기, 2,4 디아미노톨루엔, 헥산디티올을 포함하며, 이는 형성하는 액적으로 쉽게 확산되어 인접 입자를 순간적으로 가교한다.
일부 실시형태에서, 인접 입자는 균일한 크기 분포로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 인접 입자의 크기는 마이크로유체 장치의 크기, 하나 이상의 채널의 크기, 또는 미세유체 채널을 통한 유량을 조정함으로써 미세하게 조정된다. 일부 실시형태에서, 생성된 인접 입자는 20 내지 200 μm 범위의 직경, 예를 들어 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μm의 직경을 갖거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 내의 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 인접 입자의 크기 및 균일성은 입자 형성 전의 하이드로겔 중합체를 유체 개질제, 예를 들어 이소프로필 알코올을 비롯한 알코올과 접촉시킴으로써 추가로 제어될 수 있다. 이소프로필 알코올이 없을 때 인접 입자는 이소프로필 알코올이 있을 때 형성된 인접 입자보다 더 큰 직경으로 형성된다. 이소프로필 알코올은 하이드로겔 중합체의 유체 특성에 영향을 미쳐 인접 입자의 크기를 조절할 수 있다.
당업자가 인식하는 바와 같이, 도 1에 도시된 미세유체 장치는 3채널 미세유체 장치의 예시이지만, 미세유체 장치는 특정 크기의 인접 입자를 생성하거나 다양한 하이드로겔 물질 또는 가교제로부터 형성된 인접 입자를 생성하도록 수정, 변형 또는 변경될 수 있다.
일부 실시형태에서, 볼텍스 보조 에멀젼 또는 미세유체 관성 흐름 보조 에멀젼에 의해 제조된 인접 입자. 일부 실시형태에서, 인접 입자와 회합된 트랜스포좀의 밀도는 입력된 샘플 내의 트랜스포좀을 함유하는 용액을 희석 또는 농축함으로써 제어될 수 있다. 트랜스포좀을 포함하는 샘플은 하이드로겔 중합체와 혼합되고, 트랜스포좀을 함유하는 하이드로겔 중합체는 본원에 기재된 바와 같이 볼텍스 보조 에멀젼 또는 미세유체 유동 보조 에멀젼을 받게 된다.
일부 실시형태에서, 인접 입자는 뉴클레오티드로 작용화된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리T 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드는 인접 입자에 결합되고, 작용화된 인접 입자는 관심 뉴클레오티드의 표적화된 포획을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀과 회합된 인접 입자는 단일 인접 입자에 대한 다중 공동 검정 수행을 지속하도록 경화되며, 이는 다중 완충제 세척, 다중 시약 교환 및 수행되는 검정에 기초한 다중 분석을 포함한다. 표면-개시 중합 기술, 볼텍싱을 포함하는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 제조되거나 미세유체 기술에 의해 제조된 제형화된 인접 입자는 패턴화된 플로우 셀, 마이크로어레이, 웰이 있는 플레이트, 에칭된 표면, 미세유체 채널, 비드, 칼럼, 또는 다수의 동시 검정을 수행하기 위한 다른 표면 상에 로딩되거나 시딩될 수 있다.
연결된 긴 판독 인덱싱 방법
본원에 제공된 일부 실시형태는 온 비드 태그먼트화된 인접 입자를 사용하여 연결된 긴 판독 인덱싱을 수행하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 인접 입자를 수득하는 것, 입자를 트랜스포좀 및 핵산 분자와 회합시키는 것, 온 비드 태그먼트화를 수행하는 것, 태그먼트화된 비드 상의 분할을 수행하는 것, 및 인덱싱된 PCR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 도 2에 요약된 바와 같은 단계를 포함하며, 이는 비드에 대한 연속성-보존 전위(transposition) 서열분석(CPT-seq)(단계 1), 분할/인덱싱된 PCR(단계 2) 및 인덱싱된-연결된 판독(단계 3)을 포함하여 연결된 긴 판독 인덱싱을 수행하기 위한 예시적인 방법에 대한 개략도를 도시한다. 단계 1의 비드는 트랜스포존과 트랜스포사제를 포함하는 트랜스포좀과 회합된다. 핵산 분자는 트랜스포사제와 회합하고, 예를 들어 CPT-seq와 같은 태그먼트화를 겪는다. 태그먼트화 후 온 비드 태그먼트화 생성물은 액적 생성기 또는 기타 방법을 사용하여 분할된다. 비드 상의 전위된 DNA의 이러한 분할된 샘플은 전위된 DNA를 인덱싱하는 용액 프라이머 및 인덱싱된 프라이머 비드에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인덱싱된 DNA는 인덱싱된 PCR에 적용되고 인덱싱된-연결된 판독이 수득된다.
인접 입자(본원에서 인접 비드라고도 함)에 추가하여 프라이머 비드도 준비했다. 프라이머 비드는 인접 입자와 관련하여 본원에 기재된 물질, 조성물 및 제형의 하이드로겔 비드를 포함할 수 있지만, 트랜스포좀과 회합되는 대신 프라이머(예컨대 P5 프라이머), 바코드 및 어댑터(예컨대 Nextera 어댑터)를 포함한다. 단일 프라이머 비드는 분할된 액적 내의 단일 인접 입자와 함께 그리고 어댑터(예컨대 B15 어댑터) 및 프라이머(예컨대 P7 프라이머)를 포함할 수 있는 프라이머 용액 혼합물과 함께 분할될 수 있다. 분할된 액적은 900,000개 초과의 인덱싱된 바코드의 비드 풀과 함께 바코딩된 인덱싱에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 도 3에 요약된 바와 같은 단계를 포함하며, 이는 비-바코딩된 전위를 사용하여 비드 상의 CPT-seq, 액적 구획화 및 인덱싱된 프라이머 풀 인덱싱을 포함하는 긴 판독 인덱싱을 수행하기 위한 예시적인 방법에 대한 도식적 표현을 도시한다.
일부 실시형태에서, 인접 입자는 본원에 기재된 바와 같이 제조되고, 액적은 플로우 셀 장치, 플레이트의 웰, 슬라이드 또는 패턴화된 표면과 같은 표면 상에 분할된다. 일부 실시형태에서, 표면은 플로우 셀 장치이고, 플로우 셀 장치에서 공간 인덱싱을 위한 인접 입자의 분포를 위한 어레이에 마이크로웰 또는 마이크로기둥을 갖는 삽입물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 액적은 각각의 웰에 단일 인접 입자를 갖는 웰 플레이트 상에 분할된다. 웰 플레이트는 예를 들어 12웰 플레이트, 24웰 플레이트, 48웰 플레이트, 96웰 플레이트, 384웰 플레이트, 1536웰 플레이트, 3456웰 플레이트, 또는 9600웰 플레이트, 또는 단일 인접 입자를 갖는 플레이트의 임의 개수의 웰을 포함할 수 있고 인접 입자를 핵산 인덱싱을 위한 액적 인덱싱으로 분할할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인접 입자는, 예를 들어 완충제 세척, 용해, DNA 분석, RNA 분석, 단백질 분석, 태그먼트화, 핵산 증폭, 핵산 서열분석, DNA 라이브러리 준비, 서열분석을 사용한 트랜스포사제 접근가능 크로마틱 검정(ATAC-seq), 연속성-보존 전위 서열분석(CPT-seq) 또는 이들의 임의의 조합을 순차적으로 수행하는 것을 포함하는 순서대로 다중 공동 검정에 적용된다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀과 회합된 인접 입자는 관심 핵산을 회합하도록 처리된다. 일부 실시형태에서, 관심 핵산은 세포로부터 단리된다. 예를 들어, 세포는 용해 완충액과 접촉할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "용해"는 세포 RNA 또는 DNA에 대한 접근 또는 그의 방출을 촉진하는 세포벽 또는 바이러스 입자에 대한 섭동(perturbation) 또는 변경을 의미한다. 세포벽의 완전한 붕괴 또는 파괴 중 어느 것도 용해에 필수적인 요건은 아니다. 용어 "용해 완충제"는 적어도 하나의 용해제를 함유하는 완충제를 의미한다. 전형적인 효소적 용해제에는 라이소자임, 글루콜라제(glucolase), 자이몰로스(zymolose), 라이티카제(lyticase), 프로테이나제 K, 프로테이나제 E, 및 바이러스 엔도라이신 및 엑소라이신이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 세포의 용해는 라이소자임 및 프로테이나제 K와 같은 용해제를 도입함으로써 수행될 수 있다. 그런 다음 세포로부터의 gDNA가 인접 입자와 회합된다. 일부 실시형태에서, 용해 처리 후, 단리된 핵산은 인접 입자 상에 유지되고 추가 처리를 위해 사용될 수 있다.
DNA 분석은 DNA를 증폭, 서열분석, 또는 달리 분석하는 데 사용되는 임의의 기법을 지칭한다. DNA 증폭은 PCR 기술 또는 파이로서열분석(pyrosequencing)을 사용하여 달성될 수 있다. DNA 분석은 또한 비표적화된, 비-PCR 기반 DNA 서열분석(예를 들어, 메타게놈학) 기법을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, DNA 분석은 16S rDNA(리보솜 DNA)의 초가변 영역의 서열분석 및 DNA를 통한 종 확인을 위한 서열분석의 사용을 포함할 수 있다.
RNA 분석은 RNA를 증폭, 서열분석, 또는 달리 분석하는 데 사용되는 임의의 기법을 지칭한다. DNA를 분석하는 데 사용되는 것과 동일한 기법이 RNA를 증폭 및 서열분석하는 데 사용될 수 있다. DNA보다 덜 안정한 RNA는 자극에 반응하여 DNA의 번역을 수행한다. 따라서, RNA 분석은 군집의 대사적으로 활성인 구성원의 더 정확한 그림을 제공할 수 있으며, 샘플 내의 유기체의 군집 기능에 대한 정보를 제공하는 데 사용될 수 있다. 핵산 서열분석은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 분자의 서열에서 뉴클레오티드들의 순서를 결정하기 위하여 서열분석을 사용하는 것을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "서열분석"은 폴리뉴클레오티드의 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드의 동일성(예를 들어, 적어도 20개, 적어도 50개, 적어도 100개 또는 적어도 200개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드의 동일성)이 수득되는 방법을 지칭한다.
용어 "차세대 서열분석" 또는 "고처리량 서열분석" 또는 "NGS"는 일반적으로 고처리량 서열분석 기술을 지칭하는데, 이러한 기술에는 대량 병렬 시그니처 서열분석, 고처리량 서열분석, 결찰에 의한 서열분석(예를 들어, SOLiD 서열분석), 양성자 이온 반도체 서열분석, DNA 나노볼 서열분석, 단분자 서열분석, 및 나노기공 서열분석이 포함되지만 이로 한정되지 않으며, Illumina, Life Technologies, 또는 Roche 등에 의해 현재 사용되는 병렬화된 합성에 의한 서열분석(parallelized sequencing-by-synthesis), 결찰에 의한 서열분석(sequencing-by-ligation) 플랫폼을 지칭할 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 또한 나노기공 서열분석 방법 또는 Life Technologies에서 상용화한 Ion Torrent 기술 또는 Pacific Biosciences에서 상용화한 단일 분자 형광 기반 방법과 같은 전자 검출 기반 방법을 포함할 수 있다.
단백질 분석은 단백질의 연구를 지칭하며, 프로테옴 분석, 관심 단백질의 번역후 변형의 결정, 단백질 발현 수준의 결정, 또는 다른 단백질 또는 핵산을 포함한 다른 분자와의 단백질 상호작용의 결정을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "태그먼트화"는 트랜스포존 말단 서열을 포함하는 어댑터와 복합체화된 트랜스포사제 효소를 포함하는 트랜스포좀 복합체에 의한 DNA의 변형을 지칭한다. 태그먼트화는 DNA의 단편화와 동시에 듀플렉스 단편의 양쪽 가닥의 5' 말단에의 어댑터의 결찰을 유도한다. 트랜스포사제 효소를 제거하기 위한 정제 단계 후, 예를 들어 PCR, 결찰, 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 적합한 방법에 의해 조작된 단편의 말단에 추가 서열이 부가될 수 있다.
본 발명의 방법은 트랜스포사제 말단 서열을 수용하고 표적 핵산을 단편화할 수 있는 임의의 트랜스포사제를 사용할 수 있으며, 전달된 말단은 부착하지만 전달되지 않은 말단은 부착하지 않는다. "트랜스포좀"은 적어도 트랜스포사제 효소 및 트랜스포사제 인식 부위로 구성된다. "트랜스포좀"이라고 불리는 일부 이러한 시스템에서, 트랜스포사제는 전위 반응을 촉매할 수 있는 트랜스포존 인식 부위와 기능적 복합체를 형성할 수 있다. 트랜스포사제 또는 인테그라제는 트랜스포사제 인식 부위에 결합하고 때때로 "태그먼트화"라고 하는 과정에서 트랜스포사제 인식 부위를 표적 핵산에 삽입할 수 있다. 일부의 이러한 삽입 이벤트에서, 트랜스포사제 인식 부위의 하나의 가닥이 표적 핵산으로 전달될 수 있다.
표준 샘플 제조 방법에서, 각각의 주형은 인서트의 어느 한 말단에 어댑터를 포함하며, 종종 DNA 또는 RNA를 변형시키고, 원하는 변형 반응 생성물을 정제하는데 다수의 단계가 필요하다. 이들 단계는, 표면에 공유적으로 부착된 프라이머의 말단에 혼성화된 단편을 복사하는 프라이머 연장 반응에 의해 표면에 결합된 플로우 셀에 적응된 단편을 첨가하기 전에 용액 중에서 수행된다. 이어서, 이들 '시딩' 주형은 여러 사이클의 증폭을 통해 복사된 주형의 단일 클론 클러스터를 생성한다.
클러스터 형성 및 서열분석 준비가 완료된 용액 중에서 DNA를 어댑터 변형된 주형으로 변환하는 데 필요한 단계의 수는 트랜스포사제 매개 단편화 및 태깅을 사용하여 최소화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 트랜스포존 기반 기술은, 예를 들어 NexteraTM DNA 샘플 제조 키트(Illumina, Inc.)의 워크플로우에 예시된 바와 같이 DNA를 단편화하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 게놈 DNA는 입력 DNA를 단편화하고 동시에 태그 지정("태그먼트화")하는 조작된 트랜스포좀에 의해 단편화되어, 단편의 말단에 고유한 어댑터 서열을 포함하는 단편화된 핵산 분자 집단을 생성할 수 있다.
일부 실시형태는 과활성 Tn5 트랜스포사제 및 Tn5형 트랜스포사제 인식 부위(문헌[Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998)]), 또는 MuA 트랜스포사제와, R1 및 R2 말단 서열을 포함하는 Mu 트랜스포사제 인식 부위(문헌[Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, H, et al., EMBO J., 14: 4893, 1995])의 사용을 포함할 수 있다. 과활성 Tn5 트랜스포사제와 복합체를 형성하는 예시적인 트랜스포사제 인식 부위(예를　들어, EZ-Tn5TM 트랜스포사제, Epicentre Biotechnologies, Madison, Wis.).
본원에 제공된 특정 실시형태와 함께 사용될 수 있는 전위 시스템의 추가 예는 하기를 포함한다: 황색포도상구균 Tn552(문헌[Colegio et al., J. Bacteriol., 183: 2384-8, 2001]; 문헌[Kirby C et al., Mol. Microbiol., 43: 173-86, 2002]), Ty1(문헌[Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994] 및 국제 공개 WO 95/23875호), 트랜스포존 Tn7(문헌[Craig, N L, Science. 271: 1512, 1996]; 문헌[Craig, N L, Review in: Curr Top Microbiol Immunol., 204:27-48, 1996]), Tn/O 및 IS10(문헌[Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204:49-82, 1996]), 마리너 트랜스포사제(문헌[Lampe D J, et al., EMBO J., 15: 5470-9, 1996]), Tc1(문헌[Plasterk R H, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 204: 125-43, 1996]), P 요소(문헌[Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260: 97-114, 2004]), Tn3(문헌[Ichikawa & Ohtsubo, J Biol. Chem. 265:18829-32, 1990]), 박테리아 삽입 서열(문헌[Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996]), 레트로바이러스(문헌[Brown, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989]), 및 효모의 레트로트랜스포존(문헌[Boeke & Corces, Annu Rev Microbiol. 43:403-34, 1989]). 더 많은 예에는 IS5, Tn10, Tn903, IS911, 및 트랜스포사제 패밀리 효소의 조작된 버전이 포함된다(문헌[Zhang et al., (2009) PLoS Genet. 5:e1000689. Epub 2009 Oct. 16]; 문헌[Wilson C. et al (2007) J. Microbiol. Methods 71:332-5]).
서열분석을 사용하는 트랜스포사제-접근가능 염색질에 대한 검정(ATAC-seq)은 통합적인 에피게놈 분석의 신속하고 민감한 방법을 지칭한다. ATAC-seq는 개방 염색질 부위를 포획하고, 뉴클레오티드 분해능을 사용하여 개방 염색질의 게놈 영역, DNA 결합 단백질, 개별 뉴클레오솜, 및 조절성 영역에서의 더 고차의 압밀 사이의 상호작용을 밝혀낸다. 뉴클레오솜을 엄격하게 회피하거나, 그에 대해 참을 수 있거나, 그와 중첩하는 경향이 있는 DNA 결합 인자의 부류가 발견되었다. ATAC-seq를 사용하여, 휴지기 인간 T 세포의 연속된 일일 에피게놈을 측정하고, 표준 채혈을 통해 프로 밴드(pro band)로부터 평가하였으며, 이는 건강 및 질환을 모니터링하기 위한 임상 시간스케일에서 개인 에피게놈의 판독에 대한 실현가능성을 입증하였다. 더 구체적으로는, ATAC-seq는 세포로부터의 염색질을 삽입 효소 복합체로 처리하여 게놈 DNA의 태깅된 단편을 생성함으로써 수행될 수 있다. 이 단계에서, 염색질은, 염색질 내의 개방 영역 내의 게놈 DNA를 절단하고 단편의 양쪽 말단에 어댑터를 부가하는 삽입 효소, 예컨대 Tn5 또는 MuA를 사용하여 태그먼트화된다(예를 들어, 동일한 반응에서 단편화되고 태깅된다).
일부 경우에, 조건은 염색질에서의 삽입의 바람직한 수준(예를 들어, 개방 영역에서 평균 매 50 내지 200개의 염기쌍마다 일어나는 삽입)을 획득하도록 조정될 수 있다. 본 방법에 사용되는 염색질은 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵이 단리되고 용해될 수 있으며, 염색질은, 예를 들어 핵피막(nuclear envelope)으로부터 추가로 정제될 수 있다. 다른 실시형태에서, 염색질은 단리된 핵을 반응 완충액과 접촉시킴으로써 단리될 수 있다. 이들 실시형태에서, 단리된 핵은 그것이 반응 완충액(이는 삽입 효소 복합체 및 다른 필요한 시약을 포함함)과 접촉하게 될 때 용해될 수 있으며, 이는 삽입 효소 복합체가 염색질에 접근할 수 있게 한다. 이들 실시형태에서, 본 방법은 세포 집단으로부터 핵을 단리하는 단계; 및 단리된 핵을 트랜스포사제 및 어댑터와 배합하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 배합은 핵을 용해시켜 상기 염색질을 방출시키는 것 및 게놈 DNA의 어댑터-태깅된 단편을 생성하는 것 둘 모두를 가져온다. 염색질은 다른 방법(예를 들어, ChIP-SEQ 방법)에서와 같이 가교결합을 필요로 하지 않는다.
염색질이 단편화되고 태깅되어 게놈 DNA의 태깅된 단편을 생성한 후에, 어댑터-태깅된 단편들 중 적어도 일부를 서열분석하여 복수의 서열 리드를 생성한다. 단편은 임의의 적합한 방법을 사용하여 서열분석될 수 있다. 예를 들어, 단편은 Illumina의 가역적 종결자 방법, Roche의 파이로서열분석 방법(454), Life Technologies의 결찰에 의한 서열분석(SOLiD 플랫폼) 또는 Life Technologies의 Ion Torrent 플랫폼을 사용하여 서열분석할 수 있다. 그러한 방법의 예는 하기 참고문헌: 문헌[Margulies et al. (Nature 2005 437: 376-80)]; 문헌[Ronaghi et al. (Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9)]; 문헌[Shendure et al. (Science 2005 309: 1728-32)]; 문헌[Imelfort et al. (Brief Bioinform. 2009 10:609-18)]; 문헌[Fox et al. (Methods Mol Biol. 2009;553:79-108)]; 문헌[Appleby et al. (Methods Mol Biol. 2009; 513:19-39)] 및 문헌[Morozova et al. (Genomics. 2008 92:255-64])에 기재되어 있으며, 이들은 모든 출발 생성물, 라이브러리 제조 방법, 시약, 및 각각의 단계에 대한 최종 생성물을 비롯한, 본 방법 및 본 방법의 특정 단계의 일반적인 설명에 대해 본원에 참고로 포함된다. 명백한 바와 같이, 선택된 차세대 서열분석 플랫폼과 양립가능한 정방향 및 역방향 서열분석 프라이머 부위가 증폭 단계 동안 단편의 말단에 부가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편은, 단편에 부가된 태그에 혼성화되는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있으며, 여기서 PCR에 사용되는 프라이머는 특정 서열분석 플랫폼과 양립가능한 5' 테일(tail)을 갖는다. ATAC-seq의 수행 방법은 국제출원 PCT/US2014/038825호에 기재되어 있으며, 이것은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "염색질"은 진핵 세포의 핵에서 발견되는 바와 같은, 단백질 및 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA, RNA)를 포함한 분자들의 복합체를 지칭한다. 염색질은 뉴클레오솜, 게놈 DNA, 및 게놈 DNA에 일반적으로 결합되는 다른 DNA 결합 단백질(예를 들어, 전사 인자)을 형성하는 히스톤 단백질로 부분적으로 구성된다.
연속성-보존 전위 서열분석(CPT-seq)은 표적 핵산 내에서 인접한 주형 핵산 단편들의 회합을 유지하도록 트랜스포사제를 사용함으로써 연속성 정보를 보존하면서 서열분석하는 방법을 지칭한다. 예를 들어, CPT는 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA에 대해 수행될 수 있다. CPT-핵산은, 특유의 지수 또는 바코드를 갖고 고체 지지체 상에 고정화된 상보적 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 의해 포획될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체 상에 고정화된 올리고뉴클레오티드는 바코드에 더하여, 프라이머-결합 부위, 특유의 분자 인덱스를 추가로 포함할 수 있다. 유리하게는, 단편화된 핵산들의 물리적 근접성을 유지하도록 하는 트랜스포좀의 그러한 사용은 동일한 원래 분자, 예를 들어 염색체로부터의 단편화된 핵산들이 고체 지지체 상에 고정화된 올리고뉴클레오티드로부터의 동일한 특유의 바코드 및 인덱스 정보를 수용할 가능성을 증가시킨다. 이는 특유의 바코드들을 갖는 연속적으로 연결된(contiguously-linked) 서열분석 라이브러리를 생성할 것이다. 연속적으로 연결된 서열분석 라이브러리를 서열분석하여 연속 서열(contiguous sequence) 정보를 도출할 수 있다. 본원에 기재된 인접 입자는 세포로부터 추출된 핵산에 대한 CPT-seq의 수행을 위해 CPT-seq 시약과 접촉될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "연속성 정보"는 공유된 정보에 기초한 2개 이상의 DNA 단편 사이의 공간적 관계를 지칭한다. 정보의 공유된 양상은 인접한, 구획 및 원거리 공간적 관계와 관련될 수 있다. 이러한 관계에 관한 정보는 DNA 단편으로부터 도출된 서열 리드들의 계층적 조립 또는 맵핑을 용이하게 한다. 이러한 연속성 정보는 그러한 조립 또는 맵핑의 효율 및 정확성을 개선하는데, 그 이유는, 통상적인 샷건 서열분석과 관련되어 사용되는 전통적인 조립 또는 맵핑 방법은 개별 서열 리드의 상대 게놈 기점 또는 좌표를 고려하지 않기 때문으로, 이때 이들은 개별 서열 리드가 도출된 2개 이상의 DNA 단편 사이의 공간적 관계와 관련되어 있다.
따라서, 본원에 기재된 실시형태에 따르면, 연속성 정보를 포획하는 방법은 인접한 공간적 관계를 결정하기 위한 단거리 연속성 방법, 구획 공간적 관계를 결정하기 위한 중거리 연속성 방법, 또는 원거리 공간적 관계를 결정하기 위한 장거리 연속성 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법은 DNA 서열 조립 또는 맵핑의 정확성 및 품질을 촉진시키며, 임의의 서열분석 방법, 예컨대 본원에 기재된 것들과 함께 사용될 수 있다.
연속성 정보는 개별 서열 리드의 상대 게놈 기점 또는 좌표를 포함하는데, 이때 이들은 개별 서열 리드가 도출된 2개 이상의 DNA 단편 사이의 공간적 관계와 관련되어 있다. 일부 실시형태에서, 연속성 정보는 비중첩 서열 리드로부터의 서열 정보를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열의 연속성 정보는 하플로타입(haplotype) 정보를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열의 연속성 정보는 게놈 변이체를 나타낸다.
단일 세포 조합 인덱스 서열분석(SCI-seq)은 체세포 카피수 변이 검출을 위한 수천 개의 저역(low-pass) 단일 세포 라이브러리를 동시에 생성하기 위한 서열분석 기술이다.
따라서, 본원에 기재된 검정을 포함하여, 핵산을 분석하기 위한 목적으로 연속 입자에 대해 다중 공동 검정을 단독으로 또는 임의의 다른 검정과 조합으로 수행될 수 있다.
인덱싱된 인접 입자는 또한 포스트/마이크로웰 어레이를 통해 고정된 플로우 셀에 직접 로딩될 수 있다. 인접 입자(화학물질/온도 방출)에서 방출된 인덱싱된 라이브러리는 플로우 셀에 결합한다. 이는 첫 번째 수준의 인덱싱이 공간 위치에서 나온 후 다음 수준의 인덱싱이 단일 인접 입자의 인덱싱된 라이브러리에서 나오는 강력한 인덱싱 접근 방식을 허용한다. 대안적으로, 인접 입자에서 추출한 인덱싱된 라이브러리는 플로우 셀에 집합적으로 로딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인접 입자는 핵산 프로세싱을 위한 하나 이상의 시약과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 시약은 용해제, 핵산 정제제, DNA 증폭제, 태그먼트화제, PCR 제제, 또는 유전 물질 처리에 사용되는 기타 제제를 포함할 수 있다. 따라서, 인접 입자는 핵산의 제어된 반응을 위한 미세 환경을 제공한다.
일부 실시형태에서, 전체 DNA 라이브러리 준비는 중합체 쉘 내에 gDNA 및 이의 라이브러리 생성물을 유지하면서 다공성 하이드로겔을 통과함으로써 다중 시약 교환으로 인접 입자 내부에서 매끄럽게 달성될 수 있다. 하이드로겔은 최대 95℃의 고온에서 수 시간 동안 저항성일 수 있어서 상이한 생화학 반응을 지지할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된", "단리하기 위한", "단리", "정제된", "정제하기 위한", "정제" 및 이들의 문법적 등가표현은 달리 명시되지 않는 한, 물질이 단리되는 공급원(예를 들어, 세포)으로부터의 또는 샘플로부터의 적어도 하나의 오염물(예컨대, 단백질 및/또는 핵산 서열)의 양의 감소를 지칭한다. 따라서, 정제는 "풍부화", 예를 들어, 샘플 내의 바람직한 단백질 및/또는 핵산 서열의 양의 증가를 초래한다.
핵산의 용해 및 단리 후에, 특히 단일 세포로부터 소량의 DNA를 증폭시키기 위해 널리 사용되는 기술인 다중 변위 증폭(MDA)과 같은 증폭이 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 핵산 라이브러리의 제조를 위해 증폭되거나, 서열분석되거나, 또는 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같이,　핵산 또는 핵산 반응과 관련하여 사용되는 "증폭시키다" 또는 "증폭된", "증폭시키는"라는 용어는 예를 들어 본 발명의 실시형태에 의해 표적 핵산 또는 인접 입자와 회합된 핵산과 같은 특정 핵산의 사본을 만드는 인　비트로 방법을 지칭한다. 핵산을 증폭시키는 다수의 방법이 당업계에 알려져 있으며, 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 가닥 변위 증폭 반응, 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification) 반응, 다중 어닐링 및 루핑 기반 증폭 사이클(multiple annealing and looping based amplification cycle, MALBAC), 전사-매개 증폭 방법, 예컨대 NASBA, 루프 매개 증폭 방법(예를 들어, 루프-형성 서열을 사용하는 "LAMP" 증폭)을 포함한다. 증폭되는 핵산은 변형된 DNA 및/또는 RNA를 비롯하여, DNA 또는 RNA, 또는 DNA와 RNA의 혼합물을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로부터 유래된 DNA일 수 있다. 출발 핵산이 DNA이든, RNA이든 또는 둘 모두이든, 핵산 분자 또는 분자들의 증폭으로부터 생성되는 생성물(예를 들어, "증폭 생성물")은 DNA 또는 RNA 중 어느 하나, 또는 DNA 및 RNA 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 둘 모두의 혼합물일 수 있거나, 또는 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "복사본"은 반드시 표적 서열에 대한 완벽한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 복사본은 데옥시이노신 또는 데옥시우리딘과 같은 뉴클레오티드 유사체, 의도적인 서열 변경(예컨대 표적 서열에 혼성화가능하지만 상보적이지 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입된 서열 변경), 및/또는 증폭 동안 일어나는 서열 오류를 포함할 수 있다.
인접 입자와 회합된 핵산은 당업계에 알려진 임의의 적합한 증폭 방법론에 따라 증폭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 인접 입자 상에서 증폭된다. 일부 실시형태에서, 인접 입자는 고체 지지체 상에 포획되고 분해되며, 여기서 핵산은 고체 지지체 상에 방출되고 핵산은 고체 지지체 상에서 증폭된다.
본원에 기재되거나 당업계에 일반적으로 알려진 임의의 증폭 방법은 범용 또는 표적-특이적 프라이머와 함께 이용되어 핵산을 증폭시킬 수 있음이 이해될 것이다. 증폭에 적합한 방법은, 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제8,003,354호에 기재된 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 변위 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 증폭 방법을 이용하여 하나 이상의 관심 핵산을 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 멀티플렉스(multiplex) PCR, SDA, TMA, NASBA 등을 포함하는 PCR을 이용하여 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 핵산에 특이적으로 지시된 프라이머가 증폭 반응에 포함된다.
핵산의 증폭을 위한 다른 적합한 방법은 올리고뉴클레오티드 연장 및 결찰, 롤링 서클 증폭(RCA)(본원에 포함된 문헌[Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)]) 및 올리고뉴클레오티드 결찰 검정(OLA) 기술(일반적으로 미국 특허 제7,582,420호, 제5,185,243호, 제5,679,524호 및 제5,573,907호; 유럽 특허 EP 0 320 308 B1; 유럽 특허 EP 0 336 731 B1; 유럽 특허 EP 0 439 182 B1; 국제공개 WO 90/01069호; 국제공개 WO 89/12696호; 및 국제공개 WO 89/09835호 참조, 이들 모두는 참고 포함됨)을 포함할 수 있다. 이들 증폭 방법은 핵산을 증폭시키도록 설계될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 향하는 프라이머를 함유하는 결찰 프로브 증폭 또는 올리고뉴클레오티드 결찰 분석(OLA) 반응을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 방법은, 관심 핵산에 특이적으로 관련되며 하이드로겔 기공을 통과할 수 있는 프라이머를 포함하는 프라이머 연장-결찰 반응을 포함할 수 있다. 관심 핵산을 증폭시키도록 특이적으로 설계될 수 있는 프라이머 연장 및 결찰 프라이머의 비제한적인 예로서, 각각 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,582,420호 및 제7,611,869호에 의해 예시되는 바와 같이, 증폭은 골든게이트(GoldenGate) 검정에 사용되는 프라이머(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 Illumina, Inc.)를 포함할 수 있다. 기재된 각각의 방법에서, 핵산 반응에 관여하는 시약 및 성분은 인접 입자 내에 핵산 자체를 유지하면서 인접 입자의 기공을 통과할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산은 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 개시내용에 의해 예시된 바와 같은 클러스터 증폭 방법을 사용하여 증폭되며, 상기 특허들 각각의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 혼입된 물질은 고정화된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위해 증폭 산물이 고체 지지체에 고정화되도록 하는 핵산 증폭 방법을 기술한다. 이러한 어레이 상의 각각의 클러스터 또는 콜로니는 복수의 동일한 고정화된 폴리뉴클레오티드 가닥과 복수의 동일한 고정화된 상보적 폴리뉴클레오티드 가닥으로 형성된다. 이와 같이 형성된 어레이는 일반적으로 "클러스터화 어레이"로 본원에서 지칭된다. 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호에 기재된 것과 같은 고체상 증폭 반응의 생성물은 고정된 폴리뉴클레오티드 가닥과 고정된 상보적 가닥의 쌍의 어닐링에 의해 형성된 소위 "브리지된(bridged)" 구조이며, 두 가닥은 모두 5' 말단에서, 바람직하게는 공유 부착을 통해 고체 지지체 상에 고정된다. 클러스터 증폭 방법은, 고정화된 핵산 주형을 사용하여 고정화된 앰플리콘을 생성하는 방법의 예이다. 다른 적합한 방법론이 또한 본원에 제공된 방법에 따라 제작된, 고정된 DNA 단편으로부터 고정된 앰플리콘을 제작하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 각 쌍의 증폭 프라이머의 한쪽 또는 양쪽 프라이머가 고정되어 있는지 여부에 관계없이, 고체상 PCR을 통해 하나 이상의 클러스터 또는 콜로니가 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 인접 입자 상에서 증폭된 다음, 어레이 또는 클러스터 내의 고체 지지체 상에 침착된다.
추가적인 증폭 방법은 등온 증폭(isothermal amplification)을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 등온 증폭 방법은, 예를 들어 문헌[Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)]에 의해 예시된 바와 같은 다중 변위 증폭(MDA) 또는 예를 들어, 미국 특허 제6,214,587호에 의해 예시된 등온 가닥 변위 핵산 증폭을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않으며, 이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 본 개시내용에 사용될 수 있는 다른 비-PCR 기반 방법에는, 예를 들어 문헌[Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995]; 미국 특허 제5,455,166호, 및 제5,130,238호, 및 문헌[Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)]에 기재된 가닥 치환 증폭(SDA) 또는 예를 들어 문헌[Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003)]에 기재된 초분지(hyperbranched) 가닥 치환 증폭을 포함하며, 이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 등온 증폭 방법은 게놈 DNA의 랜덤 프라이머 증폭을 위해 가닥 치환 Phi 29 중합효소 또는 Bst DNA 중합효소 대형 단편, 5'→3' exo-와 함께 사용될 수 있다. 이들 중합효소의 사용은 그들의 높은 진행성(processivity) 및 가닥 이동 활성을 이용한다. 높은 진행성은 중합효소가 10 내지 20 kb의 길이인 단편을 제작하도록 한다. 상기 제시된 바와 같이, Klenow 중합효소와 같은 낮은 진행성 및 가닥 이동 활성을 갖는 중합효소를 사용하여 등온 조건 하에서는 보다 작은 단편이 제작될 수 있다. 증폭 반응, 조건 및 구성요소에 대한 추가 설명은 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,670,810호의 개시내용에 상세히 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 증폭 반응을 수행하는 데 필요한 중합효소, 시약 및 성분은 인접 입자의 기공을 통과하여 핵산과 상호 작용할 수 있고, 이로써 인접 입자 내의 핵산을 증폭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 랜덤 헥사머는 변성된 DNA에 어닐링된 후, 촉매 효소 파이 29의 존재 하에 일정한 온도에서 가닥 변위 합성된다. 이는 MDA 후 형광 강도의 증가(DNA는 SYTOX로 염색됨)에 의해 확인된 바와 같이 인접 입자 내에서 DNA 증폭을 야기한다. 독립적으로, Nextera 태그먼테이션 및 PCR 후의 인접 입자 내의 형광 강도의 상당한 증가에 의해 나타나는 바와 같은 용해 및 클린 업(clean up) 후 Nextera 기반 태그먼테이션 및 PCR을 통한 후속 gDNA 증폭이 또한 수행될 수 있다. 이 Nextera 라이브러리 준비 후 인접 입자를 3분 동안 80℃로 가열하여 인접 입자의 내용물, 즉 세포에서 서열분석 준비된 라이브러리 산물을 방출할 수 있다.
본 개시내용에 유용한 다른 핵산 증폭 방법은, 예를 들어 전체적으로 본원에 참고로 포함된 문헌[Grothues, et al. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)]에 기재된 불변(constant) 5' 영역 다음에 랜덤 3' 영역을 갖는 2-도메인 프라이머의 집단을 사용하는 태깅된 PCR이다. 랜덤으로 합성된 3' 영역으로부터의 개별 혼성화에 기초하여 열 변성 DNA에 대한 다수의 개시를 허용하도록 제1 증폭 라운드가 수행된다. 3' 영역의 특성으로 인해, 개시 부위는 게놈 전체에 걸쳐 랜덤한 것으로 고려된다. 그 후에, 비결합 프라이머는 제거될 수 있고 불변 5' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 추가의 복제가 일어날 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산은 인접 입자 상에서 전체적으로 또는 부분적으로 서열분석된다. 핵산은 임의의 적합한 서열분석 방법, 예를 들어 합성에 의한 서열분석, 결찰에 의한 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석, 나노기공 서열분석 등을 포함하는 직접 서열분석에 따라 서열분석될 수 있다.
한 가지 서열분석 방법은 합성에 의한 서열분석(SBS)이다. SBS에서, 핵산 주형(예를 들어, 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘)을 따라 핵산 프라이머의 연장은 주형 내의 뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위해 모니터링된다. 근본적 화학적 공정은 중합(예를 들어, 중합효소에 의해 촉매 작용됨)일 수 있다. 특정 중합효소-기반 SBS 실시형태에서, 형광 표지된 뉴클레오티드를 주형 의존적 방식으로 프라이머에 첨가하여(이로 인해 프라이머를 연장시킴), 프라이머에 첨가된 뉴클레오티드의 순서 및 유형의 검출을 사용하여 주형의 서열을 결정할 수 있다.
하나 이상의 증폭된 핵산은 사이클에서 시약의 반복된 전달을 수반하는 SBS 또는 다른 검출 기술을 거칠 수 있다. 예를 들어, 제1 SBS 사이클을 개시하기 위하여, 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드, DNA 중합효소 등이 하나 이상의 증폭된 핵산 분자를 수용하는 인접 입자 내로/인접 입자를 통해 흐를 수 있다. 프라이머 연장으로 인해 표지된 뉴클레오티드가 혼입되는 이들 부위가 검출될 수 있다. 선택적으로, 일단 뉴클레오티드가 프라이머에 첨가되었다면, 뉴클레오티드는 추가 프라이머 연장을 종결시키는 가역적 종결 속성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 유사체가 프라이머에 첨가될 수 있으며, 탈블로킹제(deblocking agent)가 상기 모이어티를 제거하기 위해 전달될 때까지, 후속 연장이 발생할 수 없도록 한다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 실시형태의 경우, 탈블로킹 시약은 (검출이 일어나기 전에 또는 후에) 플로우 셀로 전달될 수 있다. 다양한 전달 단계들 사이에 세척이 수행될 수 있다. 이어서, 사이클을 n번 반복하여 n개의 뉴클레오티드만큼 프라이머를 연장하여, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 앰플리콘과 함께 사용하기 위해 용이하게 조정될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템, 및 검출 플랫폼이, 예를 들어 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], 국제공개 WO 04/018497호; 미국 특허 제7,057,026호; 국제공개 WO 91/06678; 국제공개 WO 07/123744; 미국 특허 제7,329,492호; 미국 특허 제7,211,414호; 미국 특허 제7,315,019호; 미국 특허 제7,405,281호, 및 미국 특허출원공개 제2008/0108082호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
순환 반응을 사용하는 다른 서열분석 절차, 예컨대 파이로서열분석이 사용될 수 있다. 파이로서열분석은 특정 뉴클레오티드가 초기 핵산 가닥에 혼입됨에 따라 무기 피로포스페이트(PPi)가 방출되는 것을 검출한다(문헌[Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996)]; 문헌[Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001)]; 문헌[Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998)]; 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호 및 미국 특허 제6,274,320호, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨). 파이로서열분석에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼릴라제(sulfurylase)에 의해 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제(luciferase)-생성 광자를 통해 검출될 수 있다. 따라서, 서열분석 반응은 발광 검출 시스템을 통해 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템에 사용되는 여기 방사선 공급원은 파이로서열분석 절차에는 필요하지 않다. 본 개시내용에 따라 생성된 앰플리콘에 파이로서열분석을 적용하도록 조정될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차가, 예를 들어, 국제출원 PCT/US11/57111호, 미국 특허출원공개 제2005/0191698 A1호, 미국 특허 제7,595,883호, 및 미국 특허 제7,244,559호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시형태는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 수반하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 혼입은 형광단-함유 중합효소와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오티드 사이의 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 상호작용을 통해, 또는 제로 모드 도파관(zero mode waveguide, ZMW)을 이용하여 검출될 수 있다. FRET-기반 서열분석을 위한 기술 및 시약은, 예를 들어 문헌[Levene et al. Science 299, 682-686 (2003)]; 문헌[Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)]; 문헌[Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)]에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 SBS 실시형태는 뉴클레오티드의 연장 생성물 내로의 도입 시에 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열분석은 상업적으로 이용가능한 전기 검출기 및 관련 기술을 사용할 수 있다. 그러한 서열분석 시스템의 예는 파이로서열분석(예를 들어, Roche의 자회사인 454 Life Sciences로부터 구매가능한 플랫폼), γ-포스페이트-표지된 뉴클레오티드를 사용한 서열분석(예를 들어, Pacific Biosciences로부터 구매가능한 플랫폼) 및 양성자 검출을 사용한 서열분석(예를 들어, Life Technologies의 자회사인 Ion Torrent로부터 구매가능한 플랫폼) 또는 미국 특허출원공개 제2009/0026082 A1호; 미국 특허출원공개 US 2009/0127589 A1호; 미국 특허출원공개 US 2010/0137143 A1호; 또는 미국 특허출원공개 US 2010/0282617 A1호(상기 문헌들은 각각 본원에 참조로 인용됨)에 기재된 서열분석 방법 및 시스템이다. 역학적 배제(kinetic exclusion)를 사용하여 표적 핵산을 증폭하기 위한 본원에 제시된 방법은 양성자를 검출하는 데 사용되는 기재에 용이하게 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 제시된 방법은 양성자를 검출하기 위해 사용되는 앰플리콘의 클론 집단을 제작하는 데 사용될 수 있다.
다른 서열분석 기술은 나노기공 서열분석이다(예를 들어, 문헌[Deamer et al. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)]; 문헌[Deamer et al. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)]; 문헌[Li et al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003)] 참조, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). 일부 나노기공 실시형태에서, 표적 핵산 또는 표적 핵산으로부터 제거된 개별 뉴클레오티드는 나노기공을 통과한다. 핵산 또는 뉴클레오티드가 나노기공을 통해 통과할 때, 각각의 뉴클레오티드 유형은 기공의 전기 전도도의 변동을 측정함으로써 식별될 수 있다. (미국 특허 제7,001,792호; 문헌[Soni et al. Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)]; 문헌[Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007)]; 문헌[Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)], 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).
본 개시내용에 따른 검출에 적용될 수 있는 어레이-기반 발현 및 유전자형 분석을 위한 예시적인 방법은 미국 특허 제7,582,420호; 제6,890,741호; 제6,913,884호 또는 제6,355,431호 또는 미국 특허출원공개 2005/0053980 A1호; 2009/0186349 A1호 또는 2005/0181440 A1호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 본원에 참조로 인용된다.
본원에 기재된 바와 같은 핵산 단리, 증폭, 및 서열분석 방법에서, 다양한 시약이 핵산 단리 및 제조를 위해 사용된다. 그러한 시약은, 예를 들어, 라이소자임, 프로테이나제 K, 랜덤 헥사머, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 작용 효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충제, 또는 2가 양이온을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 인접 입자의 기공을 통과하는 반면 유전 물질은 인접 입자 내에 유지된다. 본원에 기재된 방법의 장점은 인접 입자 상의 핵산 처리를 위한 미세환경을 제공한다는 점이다.
어댑터는 서열분석 프라이머 부위, 증폭 프라이머 부위, 및 인덱스를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 "인덱스"는, 핵산을 태그하고/하거나 핵산의 공급원을 식별하도록 분자 식별자 및/또는 바코드로서 사용될 수 있는 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인덱스가 단일 핵산, 또는 핵산의 하위집단을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 라이브러리가 중합체 비드 내에서 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 세포는 인접 입자와 회합될 핵산을 수득하기 위해 처리될 수 있고, 이어서 예를 들어 인접성 보존 전위 서열분석(CPT-seq) 접근법을 사용하여 핵산의 조합 인덱싱에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 세포로부터의 DNA는 바코딩된 트랜스포존으로 WGA 증폭 후 단일 세포의 캡슐화에 의해 바코딩될 수 있다.
본원에 기재된 "공간 인덱싱" 방법 및 기술의 실시형태는 데이터 분석을 단축시키며, 단일 세포 및 긴 DNA 분자로부터의 라이브러리 제조 공정을 단순화한다. 단일 세포 서열분석을 위한 기존의 프로토콜은 세포를 효율적으로 물리적으로 분리하고, 각각의 단리된 세포를 고유하게 바코딩하고, 모든 것을 함께 다시 풀링(pooling)하여 서열분석을 수행하는 것을 필요로 한다. 합성의 긴 판독을 위한 현재의 프로토콜은 또한 번거로운 바코딩 단계, 및 서열분석을 위해 각각의 바코딩된 단편을 함께 풀링하고 데이터 분석이 각각의 바코딩된 세포로부터 유래하는 유전 정보를 구별하게 하는 것을 필요로 한다. 이러한 긴 프로세스 동안, 또한 서열에서 탈락(dropout)을 유발하는 유전 물질의 손실이 존재한다. 본원에 기재된 실시형태는 공정을 단축시킬 뿐만 아니라 단일 세포에 대한 데이터 분해능을 증가시킬 수 있다. 더욱이, 본원에 제공된 실시형태는 새로운 유기체의 게놈의 조립을 단순화한다. 본원에 기재된 실시형태는 돌연변이의 희귀 유전자 변형 및 공동 발생을 드러나게 하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인접 입자 내에 갇힌 DNA 라이브러리는 방출될 때까지 방출 공정 및 하이드로겔 제형을 제어함으로써 표면 상에서 방출되는 단편의 크기를 제어할 기회를 제공한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는 어댑터 서열 내의 프라이머 부위를 사용하여 증폭될 수 있고, 어댑터 서열내의 서열분석 프라이머 부위를 사용하여 서열분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터 서열은 핵산의 공급원을 식별하기 위해 인덱스를 포함할 수 있다. 후속 증폭 단계의 효율은 프라이머-이량체의 형성에 의해 감소될 수 있다. 후속 증폭 단계의 효율을 증가시키기 위하여, 결찰되지 않은 단일-가닥 어댑터가 결찰 생성물로부터 제거될 수 있다.
인접 입자로 핵산 라이브러리 준비
본원에 제공된 시스템, 방법 및 조성물의 일부 실시형태는 어댑터가 표적 핵산에 결찰되는 방법을 포함한다. 어댑터는 서열분석 프라이머 결합 부위, 증폭 프라이머 결합 부위, 및 인덱스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어댑터는 P5 서열, P7 서열 또는 이들의 상보체를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 P5 서열은 SEQ ID NO: 1(AATGATACGGCGACCACCGA)에 의해 정의되는 서열을 포함하고 P7 서열은 SEQ ID NO: 2(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)에 의해 정의되는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, P5 또는 P7 서열은 1 내지 20개, 예컨대 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개의 뉴클레오티드, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있는 스페이서 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 10T 스페이서와 같은 폴리T 스페이서이다. 스페이서 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 포함될 수 있는데, 이는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과의 결합을 통해 적합한 지지체에 부착될 수 있다. 부착은, 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 존재하는, 포스포로티오에이트와 같은, 황-함유 친핵체를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리T 스페이서 및 5' 포스포로티오에이트 기를 포함할 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, P5 서열은 5'포스포로티오에이트-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3'(SEQ ID NO: 3)이고, 일부 실시형태에서, P7 서열은 5´포스포로티오에이트-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'(SEQ ID NO: 4)이다.
인덱스는 핵산 분자의 공급원을 식별하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 예를 들어 일측 또는 양측 단부에서 어댑터의 연장을 방지하는 블로킹 기의 첨가에 의해, 콘카테머(concatemer)의 형성을 방지하도록 변형될 수 있다. 3' 블로킹 기의 예에는 3'-스페이서 C3, 다이데옥시뉴클레오티드, 및 기질에 대한 부착이 포함된다. 5' 블로킹 기의 예에는 탈인산화된 5' 뉴클레오티드, 및 기질에 대한 부착이 포함된다.
어댑터는 핵산, 예컨대 단일-가닥 핵산을 포함한다. 어댑터는 약 5개의 뉴클레오티드, 10개의 뉴클레오티드, 20개의 뉴클레오티드, 30개의 뉴클레오티드, 40개의 뉴클레오티드, 50개의 뉴클레오티드, 60개의 뉴클레오티드, 70개의 뉴클레오티드, 80개의 뉴클레오티드, 90개의 뉴클레오티드, 100개의 뉴클레오티드 미만, 초과, 또는 동일한 길이, 또는 전술한 크기 중 임의의 2개 사이의 범위의 길이를 갖는 짧은 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 인접 입자의 기공을 통과하기에 충분한 크기를 갖는다. 표적 핵산은 DNA, 예를 들어, 게놈 또는 cDNA; RNA, 예컨대 mRNA, sRNA 또는 rRNA; 또는 DNA와 RNA의 혼성체를 포함한다. 핵산은 단일 세포로부터 단리될 수 있다. 핵산은 포스포다이에스테르 결합을 함유할 수 있고, 예를 들어 포스포르아미드, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트 및 펩티드 핵산 골격 및 결합을 포함하는 다른 유형의 골격을 포함할 수 있다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 임의의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔타닌, 하이포잔타닌, 이소시토신, 이소구아닌, 및 염기 유사체, 예컨대 니트로피롤(3-니트로피롤을 포함함) 및 니트로인돌(5-니트로인돌을 포함함)을 포함한 염기들의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 적어도 하나의 무차별적 염기(promiscuous base)를 포함할 수 있다. 무차별적 염기는 하나 초과의 상이한 유형의 염기와 염기쌍을 형성할 수 있으며, 예를 들어, 게놈 DNA 샘플과 같은 복합 핵산 샘플에서 랜덤 혼성화를 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 삽입물 내에 포함될 때 유용할 수 있다. 무차별적 염기의 예에는 아데닌, 티민, 또는 시토신과 쌍을 형성할 수 있는 이노신이 포함된다. 다른 예에는 하이포잔틴, 5-니트로인돌, 아실릭 5-니트로인돌, 4-니트로피라졸, 4-니트로이미다졸 및 3-니트로피롤이 포함된다. 적어도 2, 3, 4개 이상의 유형의 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 무차별성 염기가 사용될 수 있다.
표적 핵산은 샘플 내의 핵산의 평균 크기가 약 2 kb, 1 kb, 500 bp, 400 bp, 200 bp, 100 bp, 50 bp 미만, 초과, 또는 동일한 크기, 또는 전술한 크기 중 임의의 2개 사이의 범위인 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 내의 핵산의 평균 크기는 약 2000개의 뉴클레오티드, 1000개의 뉴클레오티드, 500개의 뉴클레오티드, 400개의 뉴클레오티드, 200개의 뉴클레오티드, 100개의 뉴클레오티드, 50개의 뉴클레오티드 미만, 초과, 또는 동일한 크기, 또는 전술한 크기 중 임의의 2개 사이의 범위이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 인접 입자의 기공을 통과할 수 없도록 인접 입자 내에 핵산이 포획되기에 충분한 크기이다.
예시적인 방법은 후속 결찰 단계에서 콘카테머의 형성을 방지하기 위해 표적 핵산의 5' 말단을 탈인산화하는 단계; 탈인산화된 표적의 3' 말단에 리가제를 사용하여 제1 어댑터를 결찰하는 단계(제1 어댑터의 3' 말단은 블로킹됨); 결찰된 표적의 5' 말단을 재인산화하는 단계; 탈인산화된 표적의 5' 말단에 단일 가닥 리가제를 사용하여 제2 어댑터를 결찰하는 단계(제2 어댑터의 5' 말단은 비인산화됨)를 포함한다.
다른 예는 단일 가닥 3' 오버행(overhang)을 갖는 이중 가닥 핵산을 형성하기 위한 5' 엑소뉴클레아제에 의한 핵산의 부분 절단(digestion)을 포함한다. 3' 오버행을 갖는 이중 가닥 핵산의 3' 말단에 3' 블로킹 기를 함유하는 어댑터가 결찰될 수 있다. 결찰된 어댑터를 갖는 3' 오버행을 갖는 이중 가닥 핵산은 탈혼성화되어 단일 가닥 핵산을 형성할 수 있다. 비-인산화된 5' 말단을 함유하는 어댑터는 단일-가닥 핵산의 5' 말단에 결찰될 수 있다.
핵산의 5' 뉴클레오티드와 같은 핵산을 탈인산화하는 방법은 핵산을 포스파타제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 포스파타제의 예에는 송아지 장 포스파타제, 새우 알칼리 포스파타제, 남극 포스파타제, 및 APEX 알칼리 포스파타제(에피센트리(Epicentre))가 포함된다.
핵산을 결찰하는 방법은 핵산을 리가제와 접촉시키는 것을 포함한다. 리가제의 예에는 T4 RNA 리가제 1, T4 RNA 리가제 2, RtcB 리가제, 메타노박테리움(Methanobacterium) RNA 리가제, 및 TS2126 RNA 리가제(서클리가제(CIRCLIGASE))가 포함된다.
핵산의 5' 뉴클레오티드와 같은 핵산을 인산화하는 방법은 핵산을 키나제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 키나제의 예에는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제가 포함된다.
본원에 제공된 실시형태는 핵산 라이브러리가 단일 반응 부피로 제조되도록 인접 입자 내에서 핵산 라이브러리를 제조하는 것에 관한 것이다.
본원에 제공된 시스템 및 방법의 실시형태는 인접 입자를 제조하기 위한 하이드로겔 중합체, 가교제 또는 미세유체 장치 중 임의의 하나 이상을 함유하고, 세포 용해, 핵산 증폭 및 서열분석을 위한 시약, 또는 리소자임, 프로티네이즈 K, 무작위 육량체, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액, 또는 본원에 기술된 바와 같은 2가 양이온, 및 각각의 유전 물질의 처리에 사용되는 것들을 비롯한 핵산 라이브러리 제조를 위한 시약을 비롯하여, 유전 물질의 처리에 유용한 구성성분을 추가로 포함하는, 키트를 포함한다.
실시예
실시예 1 - 인접 입자의 제조
하기 실시예는 미세유체 액적 생성기를 사용하여 트랜스포좀과 회합된 인접 입자를 제조하는 실시형태를 보여준다.
-80℃에 보관된 세포를 함유하는 샘플을 실온에서 해동했다. 각 샘플 100 μL를 멸균된 1.7 mL 튜브에 옮기고 샘플을 1 mL 0.85% NaCl로 1회 세척했다. 샘플을 펠렛화하고 세척 용액을 제거하였다. 세포 펠렛을 하이드로겔 용액과 혼합하여 하이드로겔 용액에 세포를 재현탁시켰다.
균일한 크기 분포의 인접 입자를 생성하기 위해, 도 1에 도시된 생성기와 같은 미세유체 액적 생성기를 사용하였다. 미세유체 액적 생성기의 첫 번째 채널에 하이드로겔 중합체와 세포를 함유하는 용액을 도입하였다. 두 번째 채널에는 스페이서 오일로 사용되는 미네랄 오일을, 그리고 세 번째 채널에는 가교제를 첨가하였다. 세 번째 채널에서 가교제와 접촉하면 하이드로겔은 즉시 트랜스포좀과 회합된 인접 입자를 형성했다. 가교 오일의 유형은 표 1에 나타낸 바와 같이 저속 가교제 또는 순간 가교제를 포함하여 가교의 신속성을 조정하기 위해 선택되었다:
실시예 2 - 인접 입자에 대해 수행된 공동 검정
하기 예는 SCI-seq, ATAC-seq, 조합 인덱싱 및 단일 세포 전체 게놈 증폭을 포함하여 실시예 1의 인접 입자에 대해 수행된 예시적인 검정을 보여준다.
실시예 1로부터의 인접 입자를 수득하고 단일 인접 입자가 단일 웰에 침착되도록 웰을 갖는 플레이트 상에 침착시켰다. 용해 완충액을 도입하여 세포를 용해시킨 후 세척하여 세포로부터 핵산을 추출하였다. 이어서 용해된 세포와의 인접 입자를 하기 기재된 바와 같은 일련의 검정에 노출시켰다.
인덱싱된 트랜스포좀(TSM)은 게놈 DNA를 태그먼트하여 ATAC-seq 단편을 생성하는 데 사용되었다. 단백분해효소/SDS 처리 후 TSM과 동일한 인덱스의 올리고T를 각각의 웰에 첨가하여 역전사(RT)에 의한 cDNA 합성을 개시하였다. 다른 쪽 끝에 있는 PCR 어댑터는 랜더머(randomer) 확장에 의해 도입되었다. 이는 인덱스 1을 생성하였다. 각 웰의 인접 입자를 함께 풀링한 다음 인덱스 PCR 플레이트로 분할하여 인덱스 2를 생성했다. 이 2-티어 인덱싱은 최대 150,000개(384x384) 세포까지 스캐일 업될 수 있다; 최종적으로 생성된 라이브러리는 ATAC-seq와 RNA-seq의 혼합물로, 동일한 세포의 gDNA와 cDNA가 동일한 인덱스로 그룹화되었으며, 올리고T-UMI 패턴은 RNA 신호와 ATAC 신호를 구별하는 내부 마커 역할을 했다.
또한, 전체 길이 RNA-seq에는 랜덤 확장도 사용되었다. 이 경우 TSM의 인덱스는 랜더머의 인덱스와 상이하다. 이 2개의 인덱스 세트 간의 1:1 매칭은 단일 세포의 판독과 차별화된 DNA 및 RNA 신호를 식별하는 데 도움이 되었다. 판독 분석의 정확성을 향상시키기 위해 UMI도 이 방법에 적용되었다.
3-티어 조합 인덱싱 검정도 두 라운드의 인덱싱된 스플린트-결찰 및 한 라운드의 인덱싱된 PCR을 사용하여 수행되었다. 이 방법에서, TSM과 올리고T는 범용이며 둘 모두 스플린트1 단편을 포함하며 스플린트-결찰에 의한 인덱스 첨가를 가능하게 한다. 3-티어 인덱싱은 최대 1백만 세포 처리량(96x96x96)을 달성했다. 세포 처리량을 늘리기 위해 인덱싱된 TSM을 사용하여 ATAC-seq에 대한 또 다른 3-티어 조합 인덱싱을 수행했다. 범용 TSM을 사용하는 대신 TSM은 B7G 및 A7G 측에 고유 인덱스를 함유했다. 인덱싱된 PCR에 필요한 인덱싱된 어댑터를 부착하기 위해 두 개의 상이한 스플린트를 사용했다. 인덱싱에는 다음 구성 요소가 포함되었다: 함께 B15_N6_Link1 서열(GTCTCGTGGGCTCGGNNNNNNGACTTGTC; SEQ ID NO: 11)을 형성하는 B15 어댑터 서열(GTCTCGTGGGCTCGG; SEQ ID NO: 5), N6, 및 Link1; 함께 Phos_Link2_A7G_ME 서열 (TAGAGCATNNNNNNTGGTAGAGAGGGTGAGATGTGTATAAGAGACAG; SEQ ID NO: 12)을 형성하는 Phos_Link2, A7G 서열(TGGTAGAGAGGGTG; SEQ ID NO: 9), 및 ME 서열(AGATGTGTATAAGAGACAG; SEQ ID NO: 7); 함께 A14_N6_Link1 서열(TCGTCGGCAGCGTCNNNNNNGTAATCAC; SEQ ID NO: 13)을 형성하는 A14 어댑터 서열(TCGTCGGCAGCGTC; SEQ ID NO: 6), N6, 및 Link1; 및 함께 Phos_Link2_B7G_ME 서열(CATCATCCNNNNNNTACTACTCACCTCCCAGATGTGTATAAGAGACAG; SEQ ID NO: 14)을 형성하는 Phos_Link2, B7G(TACTACTCACCTCCC; SEQ ID NO: 10), 및 ME 서열(AGATGTGTATAAGAGACAG; SEQ ID NO: 7). 이 실시예는 또한 ME 상보적 서열(TCTACACACATTCTCTGTC; SEQ ID NO: 8), 스플린트 1 서열(ATGCTCTAGACAAGT; SEQ ID NO: 15) 및 스플린트 2 서열(GGATGATGGTGATTA; SEQ ID NO: 16)을 제공한다. 서열에서 N은 A, C, T 또는 G이다.
인접 입자를 사용하여 단일 세포 전체 게놈 증폭도 수행하였다. 이는 개별 웰에서 인접 입자의 인덱싱된 T7 전위 이어서 T7 인 비트로 전사(IVT) 선형 증폭을 통한 풀링 및 확장을 사용하여 수행된다. 인덱싱된 랜덤 확장을 위해 비드를 다시 분리하고 최종 인덱싱된 PCR을 위해 풀링하고 다시 분할했다.
인접 입자는 FAM 표지된 트랜스포좀에 의해 표적화되었을 때 효율적인 태그먼트화를 보였다. 핵은 Hoechst(청색 방출 DNA 염색)로 염색되었고 전위된 핵은 FAM(형광 염료)으로 형광 녹색으로 염색되었다. 세포를 SDS로 용해하면 인접 입자의 배경 형광이 증가한 반면 세포가 없는 인접 입자에서는 신호가 보이지 않았다. 결과는 ATAC-seq 라이브러리가 태그먼트화로부터 짧은 단편의 누출의 작은 부분만을 갖는 인접 입자와 회합된 핵산 분자에 대해 생성될 수 있음을 입증한다.
실시예 3 - 인접 입자에서 핵산 라이브러리 제조
다음 실시예는 인접 입자를 사용하는 핵산 준비 방법을 보여준다.
실시예 1에서 제조된 인접 입자를 수득하였다. 인접 입자(CP)를 45 μm 셀 스트레이너에 로딩하고 PBS 또는 Tris-Cl로 여러 번 세척하여 캡슐화되지 않은 세포를 제거했다. 인접 입자에 세포를 캡슐화하는 한 가지 이점은 세포를 취급하고 처리하는 능력이 개선된다는 것이다. 이를 수행하는 한 가지 간단한 방법은 스핀 컬럼 또는 필터 플레이트를 사용하는 것이다. 필터의 기공 크기는 비드 직경보다 작을 수 있다. 필터 플레이트의 예에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 기공 크기가 20, 40, 60 μm인 Millipore's MultiScreen-Mesh Filter Plates, 8.0 μm 기공의 Millipore's MultiScreen Migration Invasion and Chemotaxis Filter Plate, 또는 수성 여과를 위한 30 내지 40 μm 기공의 Pall's AcroPrep Advance 96-Well Filter Plates. 이 필터 플레이트를 사용하면 비드 캡슐화 세포가 용액에서 쉽게 분리되어 여러 버퍼 교환이 가능하다.
세척된 비드를 완충액에 현탁시키고 필터에서 제거하였다. 비드의 최종 농도, 세포 로딩 효율을 평가하고 캡슐화되지 않은 세포가 남아있지 않도록 보장하기 위해 비드의 분취량을 현미경으로 시각화했다.
Nextera 태그먼트화를 수행하기 위해 Millipore의 20 μm 나일론 MultiScreen-Mesh 필터 플레이트를 사용했다. 비드가 필터에 달라붙는 것을 제한하기 위해 Pluronic F-127로 미리 적셨다. 500 g에서 30초 동안 플레이트를 원심분리한 후 필터를 통과한 완충액이 비드를 유지할 것이다. 비드를 200 μL의 Tris-Cl 완충액으로 2회 세척한 다음 용해 완충액(0.1% SDS)에 현탁했다. 비드를 원심분리에 의해 제거하기 전에 1분 동안 용해 완충액에서 배양하였다. 잔류 용해 완충액을 제거하기 위해 200 μL Tris-Cl 세척을 추가로 2회 수행했다. 다음으로 세포를 위아래로 피펫팅하여 45 μL의 1x 태그먼트화 완충액에 현탁한 다음 스트립 튜브로 옮겼다. 45 μL의 비드에 5 μL의 태그먼트화 DNA 효소(TDE, Illumina Inc.)을 첨가하고 RT에서 1시간, 55℃에서 30분 동안 열 순환기에서 배양하였다. 대안적으로, 태그먼트화 마스터 믹스에 비드 캡슐화 세포를 현탁하고 열 블록에서 배양하여 필터 플레이트에서 태그먼트화를 수행할 수 있다. 태그먼트화 후, 비드의 분취량을 Hoechst 염료로 염색하고 현미경으로 시각화했다. 시각화는 DNA가 비드에 남아 있음을 확인했다.
태그먼트화된 비드(25 μL)는 Illumina의 Nextera PCR MM(NPM, Illumina) 및 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 증폭되었다. 마스터 PCR 믹스에 0.1% SDS를 첨가하여 DNA에 결합된 Tn5를 제거했다. SDS의 존재 하에서 Tn5 제거를 돕기 위해 75℃에서 사전 배양을 수행했다. 11번의 PCR 사이클을 수행하여 최종 라이브러리를 생성했다. PCR 후 라이브러리는 0.9x SPRI를 사용하여 정제하고 dsDNA 큐비트 및/또는 BioAnalyzer를 사용하여 정량화하고 MiSeq 및/또는 NextSeq에서 서열분석했다.
이 실시에 기재된 방법은 sciSEQ와 유사한 접근 방식을 사용하여 단일 세포 서열분석을 수행하도록 스캐일 업될 수 있다(문헌[Vitak et al. Nat Meth. 2017;14:302-308]). 예를 들어, 96개의 인덱싱-태그먼트화 반응을 동시에 수행하기 위한 96-웰 필터 플레이트의 사용은 스케일 업 방법에서 수행될 수 있다. 비드를 플레이트에 첨가한 후 연속 완충액을 첨가한 다음 원심분리 또는 진공으로 제거한다. 태그먼트화 후, 비드를 필터에서 수집하여 풀링한다. 풀링된 비드는 다중 PCR을 위해 두 번째 96웰 PCR 플레이트에 재분배된다. 이 이중 수준 인덱싱 체계(태그먼트화 및 PCR 인덱싱)에서 단일 비드 캡슐화 세포의 모든 DNA 단편은 세포의 게놈을 재구성하기 위해 디컨볼루션될 수 있는 동일한 바코드를 수신한다.
이 실시예에 설명된 단계는 Millipore의 MultiScreen HTS 진공 매니폴드 또는 Orochem의 96웰 플레이트 진공 매니폴드와 같은 진공 매니폴드를 추가하여 액체 취급 플랫폼에서 자동화할 수 있다. 이러한 진공 매니폴드는 Biomek FX, Microlab Star, Tecan Genesis 등을 포함하는 많은 액체 취급 플랫폼에 추가될 수 있다. 필터 플레이트를 열 블록으로 옮기면 태그먼트화를 자동화할 수 있다. 그런 다음 플레이트를 태그먼트화 후 세척을 위해 진공 매니폴드로 다시 옮긴다.
실시예 4 - 긴 판독 인덱싱
하기 실시예는 본원에 제공된 긴 판독 인덱싱 방법 및 시스템을 사용하는 방법 염색체 수준 페이징을 보여준다.
회합된 트랜스포좀을 갖는 인접 입자(본원에서 인접 비드로도 지칭됨)를 제조하고, 인간 백혈구 항원(HLA)에 대해 분석할 때 본원에 기재된 연결된 긴 판독 방법에 적용하였다. 인접 입자에 더하여, 또한 각각 어댑터, 바코드 및 프라이머를 갖는 프라이머 비드를 준비하였다. 인접 비드 및 프라이머 비드는 어댑터 및 프라이머를 포함하는 용액 프라이머 혼합과 함께 액적(액적당 하나의 인접 비드 및 하나의 프라이머 비드) 내에서 함께 분할되었다. 900,000개 초과의 바코드가 있는 비드 풀을 인덱싱하기 위해 분할된 액적을 사용하여 온 비드 태그먼트화, 증폭 및 인덱싱을 수행했으며, 각 바코드는 상대적으로 동일하게 표시되었다.
도 4에 도시된 바와 같이, HLA에 대해 염색체 수준 페이징을 수득하였다. 이 검정을 사용하여 최대 26 Mb 염색체 수준 페이징이 달성되었으며 50 Mb 길이 스위치 오류 중 1개만 발생하고 SNP의 99% 초과를 포함한다. 10X 서열분석에 필요한 일반적인 2일 검정과 비교하여 검정에는 하루(5.7시간 동안)의 분석이 필요했다. 또한, 도 5에 도시된 바와 같이, 본원에 기재된 긴 판독 인덱싱 방법을 사용하여 아일랜드 길이와 비교한 아일랜드의 수는 페이징 메트릭에서 높은 DNA 품질을 나타낸다.
도 6은 10X 서열분석(오른쪽)과 비교하여 본원에 기재된 긴 판독 인덱싱 방법(왼쪽)을 사용한 변형 호출 및 페이징 블록의 결과를 도시한다. 이러한 결과는 본원에 제공된 방법이 10X 서열분석을 초과하고 더 큰 INDEL 정밀도를 갖는 평균 범위를 초래한다는 것을 나타낸다.
마지막으로, 도 7 및 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, HLA 영역(도 7), HLA-DPA1(도 8a) 및 HLA-A(도 8b)에서 수행된 본원에 기재된 긴 판독 인덱싱 방법의 방법이 있다. 10X 서열분석과 비교하여 본원에 기재된 긴 인덱싱된 판독 방법의 상세한 결과는 표 2에 제공된다:
본원에 기재된 실시형태, 실시예 및 도면은 용해에서 라이브러리 생성까지의 과정 동안 물리적으로 한정된 공간에 유전 물질을 유지하기 위한 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시형태는 한정된 공간에서 플로우 셀의 표면 상에 방출될 단일의 긴 DNA 분자 또는 단일 세포로부터 유래된 라이브러리를 제공한다. 일단 개별 구획들 내의 단일 DNA 분자 또는 단일 세포로부터의 라이브러리가 플로우 셀의 표면으로 방출되면, 각각의 구획으로부터의 라이브러리가 서로 매우 근접하여 시딩된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는", 또는 "특징으로 하는"과 동의어이며, 포괄적 또는 개방형(open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
설명은 본 발명의 몇몇 방법 및 재료를 개시한다. 본 발명은 그러한 방법 및 재료에 있어서의 변형뿐만 아니라, 제조 방법 및 장비의 변경도 용이하다. 이러한 변형은 본 개시내용의 고려로부터 또는 본원에 개시된 본 발명의 실시로부터 당업자에게 명백하게 될 것이다. 결과적으로, 본 발명은 본원에 개시된 구체적인 실시형태로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 본 발명의 진정한 범주 및 사상 내에 있는 모든 변형 및 대안을 포함하는 것으로 의도된다.
공개 및 비공개 출원, 특허, 및 서적 참고문헌을 포함하지만 이로 한정되지 않는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 전체적으로 본원에 참고로 포함되며, 이로써 본 명세서의 일부를 구성한다. 참고로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 한에 있어서, 본 명세서는 임의의 그러한 모순된 자료를 대체하고/하거나 그보다 우선되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Illumina, Inc. <120> LONG INDEXED-LINKED READ GENERATION ON TRANSPOSOME BOUND BEADS <130> ILLINC.406WO <150> PCT/US2022/015113 <151> 2022-02-03 <150> US 63/145,902 <151> 2021-02-04 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 caagcagaag acggcatacg a 21 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 tttttttttt aatgatacgg cgaccaccga 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 4 tttttttttt caagcagaag acggcatacg a 31 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B15 adaptor sequence <400> 5 gtctcgtggg ctcgg 15 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A14 adaptor sequence <400> 6 tcgtcggcag cgtc 14 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ME adaptor sequence <400> 7 agatgtgtat aagagacag 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ME complement <400> 8 tctacacaca ttctctgtc 19 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A7G <400> 9 tggtagagag ggtg 14 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B7G <400> 10 tactactcac ctccc 15 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 16-21 <223> n = a, c, t, or g <223> B15_N6_Link1 <400> 11 gtctcgtggg ctcggnnnnn ngacttgtc 29 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 9-14 <223> n = a, c, t, or g <223> Phos_Link2_A7G_ME <400> 12 tagagcatnn nnnntggtag agagggtgag atgtgtataa gagacag 47 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 15-20 <223> n = a, c, t, or g <223> A14_N6_Link1 <400> 13 tcgtcggcag cgtcnnnnnn gtaatcac 28 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 9-14 <223> n = a, c, t, or g <223> Phos_Link2_B7G_ME <400> 14 catcatccnn nnnntactac tcacctccca gatgtgtataa gagacag 47 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splint 1 <400> 15 atgctctaga caagt 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splint 2 <400> 16 ggatgatggt gatta 15

Claims (28)

  1. 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템으로서,
    각각의 인접 비드는 트랜스포좀과 회합되고 비드-결합된 핵산 분자를 포함하는 복수의 인접 비드;
    인덱싱된 프라이머 풀로서,
    각각의 프라이머 비드가 어댑터, 바코드 및 프라이머를 포함하는, 복수의 프라이머 비드; 및
    용액 프라이머를 포함하는, 인덱싱된 프라이머 풀;
    여기서 인접 비드 및 프라이머 비드는 액적 내에서 함께 분할됨; 및
    서열분석 데이터를 수득하기 위한 검출기
    를 포함하는, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 인접 비드 및/또는 프라이머 비드는 하이드로겔 중합체 및 가교제를 포함하는 하이드로겔 비드인, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아미드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy), PEG/폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(비닐술폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파르트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 알기네이트, 헤파린, 알기네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 히알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로오스 또는 콜라겐을 포함하는, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  4. 제2항에 있어서, 가교제가 비스아크릴아미드, 디아크릴레이트, 디알릴아민, 트리알릴아민, 디비닐 설폰, 디에틸렌글리콜 디알릴 에테르, 에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 트리메틸로프로포안 트리메타크릴레이트, 에톡실화 트리메틸올 트리아크릴레이트, 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트를 포함하는, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 핵산은 50,000개 이상의 염기쌍의 DNA 분자인, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 프라이머는 P5 프라이머인, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 용액 프라이머는 어댑터 및 프라이머를 포함하는, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 용액 프라이머는 B15 어댑터 및 P7 프라이머를 포함하는, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 트랜스포좀은 트랜스포사제 및 트랜스포존을 포함하는, 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 시스템.
  10. 핵산 인덱싱된 증폭을 위한 플로우 셀 장치로서,
    복수의 분할된 액적을 포함하는 고체 지지체를 포함하되, 상기 고체 지지체는,
    트랜스포좀과 회합되고 비드-결합된 핵산 분자를 포함하는 인접 비드; 및
    어댑터, 바코드 및 프라이머를 포함하는 프라이머 비드
    를 포함하고; 복수의 분할된 액적은 고체 지지체의 표면을 따라 분포되는, 플로우 셀 장치.
  11. 제10항에 있어서, 고체 지지체가 표면 중합체로 작용화되는, 플로우 셀 장치.
  12. 제11항에 있어서, 표면 중합체는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM) 또는 실란 프리 아크릴아미드(SFA)인, 플로우 셀 장치.
  13. 제10항에 있어서, 플로우 셀은 패턴화된 표면을 포함하는, 플로우 셀 장치.
  14. 제13항에 있어서, 패턴화된 표면은 웰을 포함하는, 플로우 셀 장치.
  15. 제14항에 있어서, 웰은 직경이 약 10 μm 내지 약 50 μm, 예컨대 직경이 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 또는 50 μm이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 이내이며, 웰은 깊이가 약 0.5 μm 내지 약 1 μm, 예컨대 깊이가 0.5 μm, 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm 또는 1 μm이거나, 또는 전술한 값들 중 임의의 2개의 값에 의해 정의되는 범위 이내인, 플로우 셀 장치.
  16. 제14항에 있어서, 웰은 소수성 물질로 구성되는, 플로우 셀 장치.
  17. 제15항에 있어서, 소수성 물질은 CYTOP, Fluoropel® 또는 Teflon®과 같은 비정질 플루오로중합체를 포함하는, 플로우 셀 장치.
  18. 제10항에 있어서, 핵산은 50,000개 이상의 염기쌍의 DNA 분자인, 플로우 셀 장치.
  19. 제10항에 있어서, 트랜스포좀은 트랜스포사제 및 트랜스포존을 포함하는, 플로우 셀 장치.
  20. 핵산 인덱싱 방법으로서,
    각각의 비드가 트랜스포좀에 연결되고 비드-결합된 핵산 분자를 포함하는 온 비드 태그먼트화를 위한 복수의 인접 비드를 생성하는 단계;
    핵산 분자에 태그먼트화 반응을 수행하는 단계;
    각각의 프라이머 비드가 어댑터, 바코드 및 프라이머를 포함하는, 복수의 프라이머 비드를 생성하는 단계;
    인접 비드와 프라이머 비드를 함께 액적 내에서 용액 프라이머로 분할하는 단계;
    분할된 액적 내에서 핵산 분자를 증폭하는 단계; 및
    각 액적에서 핵산 분자를 인덱싱하는 단계
    를 포함하는, 핵산 인덱싱 방법.
  21. 제20항에 있어서, 핵산은 50,000개 이상의 염기쌍의 DNA 분자인, 핵산 인덱싱 방법.
  22. 제20항에 있어서, 태그먼트화 반응을 수행하기 전에 핵산 분자에 대해 핵산 증폭을 수행하는 것을 추가로 포함하는, 핵산 인덱싱 방법.
  23. 제22항에 있어서, 증폭 반응이 다중 변위 증폭(MDA)을 포함하는, 핵산 인덱싱 방법.
  24. 제20항에 있어서, 태그먼트화 반응이 핵산을 어댑터 서열 및 트랜스포좀을 포함하는 트랜스포사제 혼합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 핵산 인덱싱 방법.
  25. 제20항에 있어서, 인덱싱은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행되는, 방법.
  26. 제20항에 있어서, 액적이 900,000개 초과의 상이한 인덱싱된 PCR 구획으로 분할되는, 핵산 인덱싱 방법.
  27. 제20항에 있어서, 고체 지지체 상에 액적을 분할하는 것을 추가로 포함하는, 핵산 인덱싱 방법.
  28. 제27항에 있어서, 고체 지지체는 플로우 셀 장치인, 핵산 인덱싱 방법.
KR1020237028950A 2021-02-04 2022-02-03 트랜스포좀 결합된 비드 상의 긴 인덱싱된-연결된 판독 생성 KR20230137394A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163145902P 2021-02-04 2021-02-04
US63/145,902 2021-02-04
PCT/US2022/015113 WO2022169972A1 (en) 2021-02-04 2022-02-03 Long indexed-linked read generation on transposome bound beads

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230137394A true KR20230137394A (ko) 2023-10-04

Family

ID=80461205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237028950A KR20230137394A (ko) 2021-02-04 2022-02-03 트랜스포좀 결합된 비드 상의 긴 인덱싱된-연결된 판독 생성

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240018584A1 (ko)
EP (1) EP4288562A1 (ko)
JP (1) JP2024506304A (ko)
KR (1) KR20230137394A (ko)
CN (1) CN116829731A (ko)
AU (1) AU2022215582A1 (ko)
CA (1) CA3208854A1 (ko)
IL (1) IL304605A (ko)
WO (1) WO2022169972A1 (ko)

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU622426B2 (en) 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
CA1341584C (en) 1988-04-06 2008-11-18 Bruce Wallace Method of amplifying and detecting nucleic acid sequences
AU3539089A (en) 1988-04-08 1989-11-03 Salk Institute For Biological Studies, The Ligase-based amplification method
JP2801051B2 (ja) 1988-06-24 1998-09-21 アムジエン・インコーポレーテツド 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
DE68926504T2 (de) 1988-07-20 1996-09-12 David Segev Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
US5185243A (en) 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
WO1991006678A1 (en) 1989-10-26 1991-05-16 Sri International Dna sequencing
KR950013953B1 (ko) 1990-01-26 1995-11-18 애보트 래보라토리즈 리가제 연쇄 반응에 적용가능한 표적 핵산의 증폭 방법
US5573907A (en) 1990-01-26 1996-11-12 Abbott Laboratories Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
CA2182517C (en) 1994-02-07 2001-08-21 Theo Nikiforov Ligase/polymerase-mediated primer extension of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
KR100230718B1 (ko) 1994-03-16 1999-11-15 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 등온 가닥 변위 핵산 증폭법
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
ATE364718T1 (de) 1997-04-01 2007-07-15 Solexa Ltd Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäure
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20050244870A1 (en) 1999-04-20 2005-11-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
AU2001238068A1 (en) 2000-02-07 2001-08-14 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
AU2001282881B2 (en) 2000-07-07 2007-06-14 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
US7211414B2 (en) 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
DK3587433T3 (da) 2002-08-23 2020-05-18 Illumina Cambridge Ltd Modificerede nukleotider
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
US20050053980A1 (en) 2003-06-20 2005-03-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US7302146B2 (en) 2004-09-17 2007-11-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for analysis of molecules
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
SG170802A1 (en) 2006-03-31 2011-05-30 Solexa Inc Systems and devices for sequence by synthesis analysis
EP2089517A4 (en) 2006-10-23 2010-10-20 Pacific Biosciences California POLYMERASEENZYME AND REAGENTS FOR ADVANCED NUCKIC ACID SEQUENCING
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
CA2672315A1 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
WO2018118971A1 (en) * 2016-12-19 2018-06-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna
GB201704402D0 (en) * 2017-03-20 2017-05-03 Blacktrace Holdings Ltd Single cell DNA sequencing
JP2022513561A (ja) * 2018-11-30 2022-02-09 イルミナ インコーポレイテッド 単一アッセイを使用した複数の分析物の分析
WO2020167866A1 (en) * 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transposon loading
CA3128098A1 (en) * 2019-02-14 2020-08-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Haplotagging - haplotype phasing and single-tube combinatorial barcoding of nucleic acid molecules using bead-immobilized tn5 transposase

Also Published As

Publication number Publication date
CA3208854A1 (en) 2022-08-11
AU2022215582A1 (en) 2023-08-24
US20240018584A1 (en) 2024-01-18
CN116829731A (zh) 2023-09-29
JP2024506304A (ja) 2024-02-13
EP4288562A1 (en) 2023-12-13
IL304605A (en) 2023-09-01
AU2022215582A9 (en) 2023-09-07
WO2022169972A1 (en) 2022-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7282942B2 (ja) ヌクレオチド配列決定のためのヒドロゲルビーズ
EP3887540B1 (en) Analysis of multiple analytes using a single assay
AU2018201836B2 (en) Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic DNA samples
KR102481869B1 (ko) 단일 세포를 캡슐화하는 방법, 캡슐화된 세포 및 이의 용도
KR20220123327A (ko) 하이드로겔 비드를 사용한 dna 서열분석
CN113272449B (zh) 调整聚合物小珠以进行dna处理
US20240018584A1 (en) Long indexed-linked read generation on transposome bound beads
RU2793717C2 (ru) Способы инкапсулирования одиночных клеток, инкапсулированные клетки и способы их применения
KR20240052875A (ko) 단일 세포를 캡슐화하는 방법, 캡슐화된 세포 및 이의 용도