KR20230135054A - 소아의 근시 진행 억제용 점안제 및 소아의 근시 진행억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

소아의 근시 진행 억제용 점안제 및 소아의 근시 진행억제제의 스크리닝 방법 Download PDF

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도시히데 구리하라
신이치 이케다
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가부시키가이샤 쓰보타 라보
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Abstract

[과제] PERK 경로 및/또는 ATF6 경로를 억제하는 성분을 탐색하는 스크리닝 방법, 및 그 스크리닝 방법에 의해 소아의 정상적인 안구의 성장(정시화)을 저해하지 않고 근시 진행을 억제하는 유효 성분을 얻어, 그 유효 성분을 포함하는 점안제 및 조성물을 제공한다. [해결수단] PERK(PKRK-like endoplasmic reticulum kinase) 경로 및/또는 ATF6(Activating transcription factor 6) 경로의 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 소아의 근시 진행 억제용 점안제에 의해 상기 과제를 해결한다. 안 유래의 세포에 후보 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 세포에 있어서의, PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 변화를 지표로 하여 후보 물질을 선택하는 공정을 포함하는, 소아의 근시 진행 억제제의 스크리닝 방법에 의해 상기 과제를 해결한다.

Description

소아의 근시 진행 억제용 점안제 및 소아의 근시 진행 억제제의 스크리닝 방법
본 발명은, 소아의 근시 진행의 억제를 위해서 이용되는 점안제 및 소아의 근시 진행 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은, 소아의 근시 진행의 원인 유전자인 ATF6 및/또는 PERK를 억제함으로써, 소아의 정상적인 안구의 성장(「소아의 정상적인 안구의 성장」을 「정시화(正視化)」라고 한다.)에 필요한 생리적 안축(眼軸) 신장을 억제하지 않고, 근시를 가져오는 병적 안축 신장만을 억제할 수 있는 유효 성분, 및 그 유효 성분을 포함하는 점안제 및 그 유효 성분의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
근시 및 강도 근시에 관한 최신의 연구에 의하면, 세계적으로 현저한 근시 인구의 증대가 예상되어, 2050년에는 근시는 약 50억명, 강도 근시는 약 10억명에 달한다고 예상되고 있다(비특허문헌 1을 참조).
또한, 2019년의 게이오기주쿠 대학 의학부의 역학 조사에 의하면, 도쿄도 내의 초등학생 689명의 근시 유병률은 76.5%이며, 특히 초등학교 1학년 시점에서의 근시 유병률은 이미 60%를 초과하고 있음이 분명해졌다. 또한, 동일한 도쿄도 내의 중학생 727명에 있어서의 근시 유병률은 94.9%이며, 어느 학년에서도 90%를 초과했다고 하는 결과였다(비특허문헌 2를 참조). 이것은, 동아시아의 타국의 기보(旣報)보다도 높은 유병률로, 일본에서의 소아의 근시는 극히 심각한 수준에 이르고 있다고 말할 수 있다.
인간의 눈은 탄생 직후에는 원시이며, 성장기(8세까지)의 전후 방향의 안축 신장에 의해 광축이 신장함으로써 원시의 정도가 작아져, 학동기(學童期)에 접어들면 적정한 안축 길이가 됨으로써 정시화된다. 이것을 「생리적 안축 신장」이라고 부르고, 이 생리적 안축 신장이 어떠한 원인으로 손상되면, 안축 신장이 부족함으로써 원시가 남아, 소아의 QOL(Quality of Life)를 현저하게 악화시킨다. 한편, 정시화 후에도 안축 신장이 멈추지 않고, 8세 이후에도 과잉으로 안축 길이가 신장되는 것을 「병적 안축 신장」이라고 부르고, 이것이 소아의 근시 진행의 요인이며, 그러므로 근시는 8세 이후의 학동기에 급격하게 진행되고, 일단 신장된 안축 길이를 원래로 되돌릴 수는 없다(비특허문헌 3을 참조).
소아의 근시 진행을 억제하려면, 이 과잉한 안축 신장(병적 안축 신장)을 억제할 필요가 있지만, 생리적 안축 신장까지 억제해 버리면, 근시로는 되지 않지만 원시가 남아 본말 전도이다. 그러므로, 적정한 소아의 근시 진행 억제 전략에 있어서는, 병적 안축 신장을 억제하면서 동시에 생리적 안축 신장까지는 억제하지 않는다고 하는, 상반되는 작용을 동시에 성립시키지 않으면 안 된다.
국제 공개 WO2018/164113
Brien A Holden, et. al., "Global prevalence of myopia and high myopia ando temporal trends from 2000 through 2050", Ophthalmology, Vol.123, Number 5, P.1036-1042(May 2016). 「소중학생의 근시 증가 경향에의 경종」, 게이오기주쿠 대학 의학부, 2019년 8월 19일 프레스 릴리스(https://oklens.co.jp/new/2019/08/21/). 후지카도 다카시, 「일본 안과 학회 전문의 제도 생애 교육 강좌 총설 54 소아의 근시의 진행 방지」, 일안회지, 117권, 4호, 397면∼406면(2013년 4월 10일). Jiang, X., et. al., A highly efficient murine model of experimental myopia. Scientific reports 8, 2026, doi: 10.1038/s41598-018-20272-w(2018). Mori, K., et. al., Oral crocetin administration suppressed refractive shift and axial elongation in a murine model of lens-induced myopia. Scientific reports 9, 295, doi: 10.1038/s41598-018-36576-w(2019). Xiangtian Zbou, et al., The Development of the Refractive Status and Ocular Growth in C57BL6 Mice. Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science, December 2008, Vol. 49, No. 12.
근년, 소아의 근시 진행(병적 안축 신장)에 관한 원인 인자가 밝혀져 왔다. 본 발명자들은, 이 인자군에 대해 예의 연구한 결과, 소포체 중의 이상 단백질인 절첩 부전 단백질에 응답하는 유전자(소포체 스트레스 응답 유전자)가 병적 안축 신장에 강하게 관여하고 있음을 발견했다(특허문헌 1을 참조). 이 유전자군에는, PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase), ATF6(Activating transcription factor 6), IRE1(Inositol requiring 1)의 3개가 알려져 있지만, 어느 유전자 경로를 억제해야 할 것인지, 모든 경로를 억제해도 좋은 것인지 등등, 상세한 각 경로의 기여율은 불명했다. 이들 유전자 경로의 억제가 부족하면 병적 안축 신장의 충분한 억제는 바랄 수 없고, 또는 과잉으로 억제하면 생리적 안축 신장까지 억제할 수도 있으므로, 병적 안축 신장과 생리적 안축 신장이 동시에 일어나고 있는 소아의 근시 진행의 억제는 극히 어렵다고 생각되고 있었다.
본 발명자들은, 병적 안축 신장에의 소포체 스트레스 응답 유전자(PERK, ATF6, IRE1)의 시그널 전달계(경로)의 관여도, 각각의 경로의 억제에 의한 안축 신장 억제에의 기여율, 또는 조합하여 억제했을 경우의 상승 효과를 검토했다. 그 결과, PERK 경로 및/또는 ATF6 경로를 억제함으로써 병적 안축 신장 억제 효과가 높아짐을 발견했다. 또한, 적어도 ATF6 경로를 선택적으로 억제하는 것이, 소아의 근시 진행을 억제하기 위해서 중요하고, PERK 경로 및 ATF6 경로의 양 경로를 억제함으로써 소아의 병적 안축 신장(근시 진행)을 충분히 억제하면서 생리적 안축 신장(정시화)은 억제하지 않음을 발견했다.
본 발명의 목적은, PERK 경로 및/또는 ATF6 경로를 억제하는 성분을 탐색하는 스크리닝 방법을 제공하는 것에 있다. 또한, 그 스크리닝 방법에 의해, 소아의 정상적인 안구의 성장(정시화)을 저해하지 않고 근시 진행을 억제하는 유효 성분을 얻고, 그 유효 성분을 포함하는 점안제를 제공하는 것에 있다. 더하여, 근시에 유효하다고 생각되는 각종 성분에 대해, 그 성분이, 병적 안축 신장과 생리적 안축 신장이 동시에 진행되고 있는 소아에게 있어 안전한지, 즉 신장 부족에 의한 원시나 과잉 신장에 의한 근시로 되지 않는지를 검증하는 방법을 제공하는 것에 있다.
즉, 본 발명은,
［1］ PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase) 경로 및/또는 ATF6(Activating transcription factor 6) 경로의 저해제를 유효 성분으로서 함유하는, 소아의 근시 진행 억제용 점안제.
［2］ 상기 저해제가, 페닐뷰티르산 및 그 약리학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 상기 ［1］에 기재된 점안제.
［3］ 상기 저해제가, 페닐뷰티르산 나트륨인, 상기 ［1］ 또는 ［2］에 기재된 점안제.
［4］ 상기 저해제의 함유량이, 점안제 전량에 대해서, 0.01∼5질량%인, 상기 ［1］∼［3］ 중 어느 하나에 기재된 점안제.
［5］ 상기 소아의 근시 진행 억제가, 생리적 안축 신장을 억제하지 않는 것인, 상기 ［1］∼［4］ 중 어느 하나에 기재된 점안제.
［6］ 상기 소아의 근시 진행 억제가, 병적 안축 신장을 억제하는 것인, 상기 ［1］∼［5］ 중 어느 하나에 기재된 점안제.
［7］ 안 유래의 세포에 후보 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 세포에 있어서의, PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 변화를 지표로 하여 후보 물질을 선택하는 공정을 포함하는, 소아의 근시 진행 억제제의 스크리닝 방법.
본 발명에 의하면, PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계를 억제하는 성분을 탐색하는 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 그러한 스크리닝 방법에 의해, 소아의 생리적 안축 신장(정시화)을 저해하지 않고 근시 진행을 억제하는 유효 성분을 제공하는 것이 가능해져, 그 유효 성분을 포함하는 점안제 및 조성물을 제공할 수 있다.
[도 1] 유약(幼若) 마우스에 있어서의 근시 유도의 설명도이다. (a)는, 근시 유도의 모식적 구조도이며, (b)는, 근시 유도 유약 마우스의 사진이다.
[도 2] 근시 유도가 강막(强膜)에 있어서 안축 신장과 소포체 스트레스를 유발하는 것을 나타내는 그래프이다. (a)는, 마우스(n=4)에 있어서의 근시 유도 3주간의 안축 길이의 변화(*p＜0.05)이고, (b)는, 마우스(n=4)에 있어서의 근시 유도 3주간의 굴절의 변화(*p＜0.05)이다.
[도 3] 마우스(각 군 n=8)의 컨트롤안(백색 칼럼) 및 근시 유도안(회색 칼럼)의 강막에 있어서의 근시 유도 1주째 및 3주째의 정량적 PCR에 의해 측정한 소포체 스트레스 응답 유전자 발현 레벨이다(*p＜0.05).
[도 4] 소포체 스트레스 응답 유전자인 PERK 경로, ATF6 경로, IRE1 경로를 나타내는 설명도이다.
[도 5] 소포체 스트레스 응답 유전자인 PERK 경로, ATF6 경로, IRE1 경로 각각의 각종 저해제를 나타내는 설명도이다.
[도 6] 마우스에의 PERK 경로, ATF6 경로, IRE1 경로의 각종 저해제의 점안에 의한 안축 신장 및 굴절의 변화(근시화)를 나타내는 그래프이다. (a)는, STF080310(STF), GSK2656157(GSK) 및 넬피나비르(NFV)의 단독 점안이 안축 신장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이고(각 군 n=5), DMSO 점안 NL(=no lens)군과 비교한 결과(*p＜0.05)와, STF 점안 NL군 또는 -30D 렌즈 장착군과 비교한 결과(＃p＜0.05)이다. (b)는, STF, GSK 및 NFV의 단독 점안이 굴절의 근시화에 미치는 영향을 나타내는 결과이고(각 군 n=5), DMSO 점안 NL군과 비교한 결과(*p＜0.05)와, STF 점안 NL군 또는 -30D 렌즈 장착군과 비교한 결과(＃p＜0.05)이다. (c)는, STF, GSK 및 NFV의 병용 점안이 안축 신장에 미치는 영향을 나타내는 결과이고(각 군 n=4), DMSO 점안 NL군과 비교한 결과(*p＜0.05)이다. (d)는, STF, GSK 및 NFV의 병용 점안이 굴절의 근시화에 미치는 영향을 나타내는 결과이고(각 군 n=4), DMSO 점안 NL군과 비교한 결과(*p＜0.05)이다.
[도 7] 도 6과는 상이한 저해제에 있어서의, 마우스에의 PERK 경로, ATF6 경로, IRE1 경로의 각종 저해제의 점안에 의한 안축 신장 및 굴절의 변화(근시화)를 나타내는 그래프이다. (a)는, 4μ8C, GSK2606414 및 Ceapin-A7의 단독 점안이 안축 신장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이고(각 군 n=5), DMSO 점안 NL(=no lens)군과 비교한 결과(*p＜0.05)와, 4μ8C 점안 NL군 또는 -30D 렌즈 장착군과 비교한 결과(＃p＜0.05)이다. (b)는, 4μ8C, GSK2606414 및 Ceapin-A7의 단독 점안이 굴절의 근시화에 미치는 영향을 나타내는 결과이고(각 군 n=5), DMSO 점안 NL군과 비교한 결과(*p＜0.05)와, 4μ8C 점안 NL군 또는 -30D 렌즈 장착군과 비교한 결과(＃p＜0.05)이다.
[도 8] 마우스에 있어서의 근시 유도가 강막 소포체 스트레스를 유도하는 그래프로서, PBS의 복강내 주사(PBS) 및 페닐뷰티르산 나트륨의 투여(4-PBA; 200mg/kg/일)의 강막(각 군 n=6)에 있어서 소포체 스트레스 응답 유전자의 발현을 정량적 PCR에 의해 측정하고, 컨트롤안(백색 칼럼)에 대해 근시 유도안(회색 칼럼)에 있어서 유전자 발현이 항진하여, 4-PBA에 의한 그 억제를 나타내는 결과(*p＜0.05)이다.
[도 9] 마우스에 있어서의 근시 유도가 안축 신장 및 굴절의 근시화를 유도하는 그래프이다. (a)는, 안축 신장이 근시 유도(LIM) 1주째 및 3주째의 페닐뷰티르산의 복강내 주사(4-PBA; 200mg/kg/일)에 의해 억제되는 것을 나타내는 결과(각 군 n=6, *p＜0.05)이고, (b)는, 굴절의 근시화가 근시 유도(LIM) 1주째 및 3주째의 4-PBA 투여에 의해 억제되는 것을 나타내는 결과(각 군 n=6, *p＜0.05)이다.
[도 10] 마우스에 있어서의 근시 유도가 안축 신장 및 굴절의 근시화를 유도하는 그래프이다. (a)는, 4-PBA 점안이 용량 의존적으로 안축 신장을 억제하는 것을 나타내는 그래프(각 군 n=4, *p＜0.05)이고, (b)는, 4-PBA 점안이 용량 의존적으로 굴절의 근시화를 억제하는 것을 나타내는 그래프(각 군 n=4, *p＜0.05)이다.
[도 11] 마우스에 있어서의 근시 유도가 안축 신장 및 굴절의 근시화를 유도하는 그래프이다. (a)는, 굴절의 근시화가 타우로우르소데옥시콜산의 복강내 주사(TUDCA; 100mg/kg 체중)에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프(각 군 n=4, *p＜0.05)이고, (b)는, 안축 신장이 TUDCA에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프(각 군 n=4, *p＜0.05)이다.
[도 12] 소포체 스트레스 응답 유전자인 PERK 경로, ATF6 경로, IRE1 경로에 대한 4-PBA 및 TUDCA의 억제 메커니즘을 나타내는 설명도이다.
[도 13] 시험예 4에 있어서의, 소아의 근시 진행 억제에 있어서의 ATF6 경로의 관여를 평가한 그래프이다.
[도 14] 시험예 5에 있어서의, 근시 유도에 의한 수정체 비후(肥厚)에의 투여 형태의 차이에 의한 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은, 이하의 실시형태 및 실험예로 한정되지 않고, 본 발명의 요지를 포함하는 범위에서 여러 가지 변형예나 응용예를 포함한다.
［소아의 근시 진행 억제용 점안제］
본 발명에 따른 소아의 근시 진행 억제용 점안제는, PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase) 경로 및/또는 ATF6(Activating transcription factor 6) 경로의 저해제를 유효 성분으로서 함유한다.
본 명세서에 있어서, PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제란, PERK의 시그널 전달계(PERK 경로), 및/또는, ATF6의 시그널 전달계(ATF6 경로)에 대해서 저해 효과를 갖는 물질을 말한다. 이들의 시그널 전달계에의 저해 효과는, 후술하는 실시예와 같이, 공지된 방법에 따라, 이들의 시그널 전달계에 관여하는 유전자, 및/또는, 단백질의 변화를 지표로 하여 평가할 수 있다.
(PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제)
전술한 바와 같이, 소아의 근시 진행(병적 안축 신장)에 관한 인자로서, 소포체 중의 이상 단백질인 절첩 부전 단백질에 응답하는 유전자 경로가 병적 안축 신장에 관여하고 있다. 이 유전자 경로에는, PERK 경로, ATF6 경로 및 IRE1 경로의 3개가 알려져 있지만, 후술하는 실험예에서 나타나 있는 바와 같이, 적어도 ATF6 경로를 억제하는 것이 근시 억제에 필수임이 새롭게 발견되었다. 또한, 이들 3개의 경로 중, PERK 경로와 ATF6 경로를 억제함으로써 소아의 근시 진행 억제 효과가 더욱 높아짐이 새롭게 발견되었다. PERK 경로 또는 ATF6 경로의 어느 하나만을 억제했을 경우에는, 다른 쪽의 경로를 대상적(代償的)으로 활성화시켜 버리는 경우가 있음도 확인되었다. 따라서, 한정은 되지 않지만, 하나의 실시형태에 있어서는, PERK 경로와 ATF6 경로의 어느 것에 대해서도 저해 효과를 갖는 물질이 소아의 근시 진행 억제의 유효 성분이 될 수 있다.
즉, PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달에 관련되는 유전자나 단백질을 표적으로 하여, 이들을 저감시키는 화합물이나, PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 단백질 발현을 저감시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등의 핵산을, 소아의 근시 진행 억제에 유효한 성분으로서 점안제에 배합할 수 있다.
본 명세서에 있어서, PERK 경로 또는 ATF6 경로의 저해제란, 소포체에 있어서의 PERK의 시그널 전달계, 또는, ATF6의 시그널 전달계에 대해서 저해 효과를 갖는 물질을 말한다. 이들 시그널 전달계에의 저해 효과는, 후술하는 실험예에 기재된 방법에 의해, 또는 공지된 방법에 의해, 이들 시그널 전달계에 관여하는 유전자, 및/또는, 단백질의 변화를 지표로 하여 평가할 수 있다.
PERK의 시그널 전달계에 관련되는 인자의 유전자 발현, 또는, 단백질의 발현을 평가하는 경우, 후보 물질을 첨가하지 않는 컨트롤과 비교하여, 후보 물질에 의해 그 인자의 발현이 적어도 1% 변동하는 것에 의해 평가하는 것이 가능하다.
또한, ATF6의 시그널 전달계에 관련되는 인자의 유전자 발현, 또는, 단백질의 발현을 평가하는 경우, 후보 물질을 첨가하지 않는 컨트롤과 비교하여, 후보 물질에 의해 그 인자의 발현이 적어도 1% 변동하는 것에 의해 평가하는 것이 가능하다.
PERK는, 소포체막 관통형 키나제이며, 그 시그널 전달에 관련되는 인자로서는, 예를 들어, eIF2α(eukaryotic initiation factor 2α), ATF4(Activating transcription factor 4), CHOP(C/EBP homologous protein), GADD34(growth arrest DNA and damage protein 34) 등을 들 수 있다.
또한, ATF6은, CREB/ATF 패밀리에 속하는 막결합형 전사 인자이며, 그 시그널 전달에 관련되는 인자로서는, 예를 들어, BiP(Binding immunoglobulin protein, 「GRP78」이라고도 칭해진다), Txndc12(thioredoxin domain containing 12, 「ERp18」이라고도 칭해진다), S1P(site-1 protease), S2P(site-2 protease) 등을 들 수 있다.
후술하는 실험예에 있어서, PERK 경로와 ATF6 경로의 양쪽 모두를 억제할 수 있는 성분을 스크리닝함으로써, 페닐뷰티르산, 타우로우르소데옥시콜산 및 그 약리학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이 발견되어 있다. 그러나, 이들에 한정하지 않고, 새롭게, 적어도 ATF6 경로를 억제하는 성분으로서 특정되는 성분이나, 새롭게 PERK 경로와 ATF6 경로를 억제하는 성분으로서 특정되는 성분도 사용할 수 있다. ATF6 경로의 저해제로서는, 한정은 되지 않지만, 점안제에 있어서의 용해성의 관점에서, 페닐뷰티르산 나트륨이 바람직하다. 후술하는 실험예에 기재하는 바와 같이, 페닐뷰티르산 나트륨이면, ATF6 경로에 더하여, PERK 경로도 저해할 수 있기 때문에, 바람직하다. PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제는, 공지된 방법에 의해 합성하여 사용해도 되고, 시판품을 입수하여 사용해도 된다.
본 명세서에 있어서, 「약학적으로 허용할 수 있는 염」은, 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는, 유기산염, 무기산염, 유기 염기, 또는 무기 염기를 들 수 있다. 유기산염으로서는, 예를 들어, 아세트산염, 트라이플루오로아세트산염, 뷰티르산염, 팔미트산염, 스테아르산염 등의 모노카복실산염; 푸마르산염, 말레산염, 석신산염, 말론산염 등의 다가 카복실산염; 락트산염, 타르타르산염, 시트르산염 등의 옥시카복실산염; 메테인설폰산염, 톨루엔설폰산염, 토실산염 등의 유기 설폰 산염을 들 수 있다. 무기산염으로서는, 예를 들어, 염산염, 황산염, 질산염, 브로민화 수소산염, 인산염을 들 수 있다. 유기 염기와의 염으로서는, 예를 들어, 메틸아민, 트라이에틸아민, 트라이에탄올아민, 다이에탄올아민, 모폴린, 피페라진, 피롤리딘, 트라이피리딘, 피콜린, 에틸렌다이아민 등의 유기 아민과의 염을 들 수 있다. 무기 염기와의 염으로서는, 예를 들어, 암모늄염; 나트륨 또는 칼륨 등 알칼리금속, 칼슘 또는 마그네슘 등의 알칼리 토류 금속, 알루미늄 등의 금속과의 염 등의 각종의 염을 들 수 있다. 이들 염은, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 임의로 조합하여 사용해도 된다. 「약학적으로 허용되는 염」에는, 염의 용매화물 또는 수화물을 포함하고 있어도 된다.
PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제의 함유량은, 용법, 용량, 첨가제의 종류 등에 따라 적절히 변경될 수 있다. 예를 들어, 점안제 전량(전체 질량. 본 명세서에 있어서 동일.)에 대해서, 0.01질량% 이상이 바람직하고, 0.05질량% 이상이 보다 바람직하고, 0.1질량% 이상이 더 바람직하고, 0.2질량% 이상이 특히 바람직하다. 또한, PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제의 함유량은, 예를 들어, 점안제 전량에 대해서, 5질량% 이하가 바람직하고, 4질량% 이하가 보다 바람직하고, 3질량% 이하가 더 바람직하고, 2질량% 이하가 특히 바람직하다. 또한, PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제의 함유량은, 예를 들어, 점안제 전량에 대해서, 0.01∼5질량%가 바람직하고, 0.05∼4질량%가 보다 바람직하고, 0.1∼3질량%가 한층 더 바람직하고, 0.2∼2질량%가 특히 바람직하다.
PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제로서, 페닐뷰티르산 및 그 약리학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 이용하는 경우, 그 함유량은, 예를 들어, 점안제 전량에 대해서, 0.01∼5질량%가 바람직하고, 0.05∼4질량%가 보다 바람직하고, 0.1∼3질량%가 더 바람직하고, 0.2∼2질량%가 특히 바람직하다.
［용도］
본 발명에 따른 점안제는, 소아의 근시 진행 억제용으로서 이용된다. 본 명세서에 있어서, 소아란, 7세 이상, 15세 미만의 아동을 말한다. 눈의 굴절의 정도는, 출생 후는 경도의 원시이며, 학동기까지 거의 정시가 될 때까지 안축이 신장된다.
안축 길이는, 출생 후부터 2세경까지 급속히 신장되고, 그 후는 서서히 신장되게 된다. 이와 같은 성장에 수반하는 정시화까지의 안축 신장은, 「생리적 안축 신장」이라고 하고, 눈의 정상적인 성장에는 불가결한 현상이다. 그러나, 학동기 이후에 있어서도 안축 길이가 계속 신장되는 것은, 근시의 진행으로 이어지기 때문에, 「병적 안축 신장」이라고 생각되고 있다. 예를 들어, 병적 안축 신장에서는, 성인의 눈에서 1mm 안축 길이가 신장되는 것은, 약 3.0D의 근시도가 증가하는 것으로 이어지고, 또한 안축 신장은 원래로 돌아가지 않는다.
따라서, 소아의 근시 진행 억제에 있어서는, 생리적 안축 신장(정시화)은 억제하지 않고, 병적 안축 신장(근시 진행)을 억제하는 것이 요구된다. 후술하는 실험예에 있어서, 적어도 ATF6 경로를 억제하는 것이 근시 억제에 필수임이 새롭게 발견되었다. PERK 경로 또는 ATF6 경로의 어느 하나만을 억제했을 경우에는, 다른 쪽의 경로를 대상적으로 활성화시켜 버리는 경우가 있음도 확인되었다. 따라서, 한정은 되지 않지만, 하나의 실시형태에 있어서는, PERK 경로와 ATF6 경로의 양쪽 모두를 억제함으로써 병적 안축 신장 억제 효과가 상승적으로 높아짐이 발견되었다. 이와 같은 메커니즘에 의하면, 생리적 안축 신장(정시화)을 억제하지 않고, 소아의 근시 진행을 억제하는 것이 가능해진다.
(제형)
본 발명에 따른 조성물은, 점안제로서 이용된다. 본 발명에 있어서, 소아의 근시 진행 억제용 점안제의 제형은, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 수성 점안제, 용시(用時) 용해 점안제, 현탁성 점안제, 유성 점안제, 안연고제 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 본 발명의 효과를 현저하게 발휘하는 관점에서, 수성 점안제인 것이 바람직하다.
점안제에는, 전술한 성분에 더하여, 그 외의 유효 성분(약리 활성 성분, 생리 활성 성분 등)을 배합할 수 있다. 이와 같은 성분의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 충혈 제거 성분, 안근 조절약 성분, 항염증약 성분, 수렴약 성분, 항히스타민약 성분, 항알레르기약 성분, 비타민류, 아미노산류, 항균약 성분, 당류, 고분자 화합물 또는 그 유도체, 셀룰로스 또는 그 유도체, 국소 마취약 성분 등을 들 수 있다.
점안제에는, 추가로 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서, 그 용도나 형태에 따라서, 통상적 방법에 따라, 다양한 성분이나 첨가물을 적절히 선택하여, 1종 또는 2종 이상을 병용하여 함유시킬 수 있다. 그들의 성분 또는 첨가물로서, 예를 들어, 액제 등의 조제에 일반적으로 사용되는 담체, 향료 또는 청량화제, 방부제, 살균제 또는 항균제, pH 조절제, 킬레이트제, 안정화제, 등장화제, 완충제, 점조화제 등의 각종 첨가제를 들 수 있다. 이하에, 점안제에 사용되는 대표적인 성분을 예시하지만, 이들로 한정되지 않는다.
담체로서는, 예를 들어, 물, 함수 에탄올 등의 수성 용매를 들 수 있다. 한편, 각종 성분이 수성 용매에 녹기 어려운 경우에는, 가용화제를 이용해도 된다. 가용화제로서는, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 스테아르산 폴리옥실 40, 포비돈, 폴리소르베이트 80 등을 들 수 있다.
향료 또는 청량화제로서는, 예를 들어, 테르펜류(구체적으로는, 아네톨, 유제놀, 캠퍼, 게라니올, 시네올, 보르네올, 멘톨, 리모넨, 용뇌(龍腦) 등. 이들은 d체, l체 또는 dl체의 어느 것이어도 된다.), 정유(회향유, 쿨민트유, 계피유, 스피어민트유, 박하수, 박하유, 페퍼민트유, 베르가모트유, 유칼리유, 로즈유 등) 등을 들 수 있다.
방부제, 살균제 또는 항균제로서는, 예를 들어, 염화 폴리드로늄, 염산 알킬 다이아미노에틸글리신, 벤조산 나트륨, 에탄올, 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 글루콘산 클로르헥시딘, 클로로뷰탄올, 소르브산, 소르브산 칼륨, 데하이드로아세트산 나트륨, 파라옥시벤조산 메틸, 파라옥시벤조산 에틸, 파라옥시벤조산 프로필, 파라옥시벤조산 뷰틸, 황산 옥시퀴놀린, 페네틸 알코올, 벤질 알코올, 바이구아나이드 화합물(구체적으로는, 폴리헥사메틸렌바이구아나이드 또는 그의 염산염 등), 글로킬(로디아사제의 상품명) 등을 들 수 있다.
pH 조절제로서는, 예를 들어, 염산, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘, 수산화 마그네슘, 트라이에탄올아민, 모노에탄올아민, 다이아이소프로판올아민, 황산, 인산 등을 들 수 있다.
킬레이트제로서는, 예를 들어, 아스코르브산, 에데트산 사나트륨, 에데트산 나트륨, 시트르산 등을 들 수 있다.
안정화제로서는, 예를 들어, 에데트산 나트륨 수화물, 포비돈, 폴리소르베이트 80, 다이뷰틸하이드록시톨루엔, 트로메타몰, 나트륨 폼알데하이드 설폭실레이트(롱가리트), 토코페롤, 피로아황산 나트륨, 모노에탄올 아민, 모노스테아르산 알루미늄, 모노스테아르산 글리세린 등을 들 수 있다.
등장화제로서는, 예를 들어, 염화 칼륨, 염화 나트륨, 진한 글리세린, 포도당, D-만니톨 등을 들 수 있다.
완충제로서는, 예를 들어, 시트르산 나트륨 수화물, 아세트산 나트륨 수화물, 탄산수소 나트륨, 트로메타몰, 붕산, 붕사, 인산수소 나트륨 수화물, 인산이수소 나트륨 등을 들 수 있다.
점조화제로서는, 예를 들어, 카복시바이닐 폴리머, 포비돈, 폴리바이닐 알코올(부분 비누화물), 하이드록시에틸셀룰로스, 하이프로멜로스, 메틸셀룰로스, 글리세린 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 점안제에 있어서, 첨가제는, 본 발명의 효과를 기대하여, 또는 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 배합할 수 있다. 그 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 점안제 전량에 대해서, 0.001∼1질량% 정도인 것이 바람직하다.
점안제의 pH는, 3∼10으로 하면 되고, 4∼9가 사용감의 관점에서 바람직하고, 5∼8.5가 사용감의 관점에서 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 점안제를 수용하는 용기로서는, 공지된 점안 용기를 제한 없이 사용할 수 있다. 점안 용기로서는, 통상, 눈에 점안제를 적하할 수 있는 형상, 예를 들어 노즐을 구비하고, 노즐의 끝에 용기구(容器口)를 구비하는 형상의 것을 사용할 수 있다. 또한, 점안 용기로서는, 용기에 그것과는 별도로 성형된 노즐이 장착되어 있는 구조의 것, 및 노즐부(액의 주출부)와 용기 본체가 일체 성형된 구조의 것(예를 들어, 1회용 타입의 점안 용기 등)의 어느 것이어도 된다.
점안 용기는, 통상, 플라스틱 용기로 하면 된다. 플라스틱 용기의 구성 재료에 대해서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리아릴레이트, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이미드의 어느 1종, 이들의 공중합체, 또는 이들의 2종 이상의 혼합체를 들 수 있다. 특히 압출의 가감 등으로 본 발명의 효과를 발휘하기 쉬운 점에서, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리아릴레이트, 폴리에틸렌 나프탈레이트 또는 이들의 공중합체, 또는 이들의 2종 이상의 혼합체가 바람직하다.
점안제는, 이와 같은 재료를 주재료로 하는 투명 용기(이물을 관찰하는 데 지장 없을 정도의 투명성을 구비한 용기)에 충전되어도 되고, 차광된 용기에 충전되어도 된다. 차광은, 예를 들어 투명 용기 재료에 착색제를 첨가하는 것에 의해 행해도 되고, 용기를 수축 필름이나 외부상자 등으로 덮는 것에 의해 차광해도 된다. 또한, 용기의 용량은, 압출의 가감 등으로 본 발명의 효과를 보다 한층 발휘하기 쉽게 하기 위해서, 0.5∼50mL 정도가 바람직하고, 3∼20mL 정도가 보다 바람직하다.
또한, 점안 용기에 구비되어 있는 노즐에 대해서도, 그 구조나 구성 재료에 대해서는 특별히 제한되는 것은 아니다. 노즐의 구조에 대해서는, 점안 용기의 노즐로서 일반적으로 채용되고 있는 구조이면 된다. 또한, 노즐의 구성 재료에 대해서는, 예를 들어, 상기 플라스틱 용기의 구성 재료와 마찬가지의 것이 예시된다. 점안제의 액절(液切)을 한층 양호하게 시키고, 적하량의 불균형도 억제한다고 하는 관점에서는, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌을 구성 재료로서 포함하는 노즐이 호적하다. 폴리에틸렌의 종류로서는, 고밀도 폴리에틸렌, 저밀도 폴리에틸렌 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 저밀도 폴리에틸렌을 구성 재료로서 포함하는 노즐이 호적하다.
(점안제의 제조 방법)
본 발명에 따른 점안제는, 당업자에게 관용 또는 공지된 방법으로 조제할 수 있다. 예를 들어, 각 성분을 물 등의 담체에 분산시킨 후, 필요하면 가용화제를 첨가하고, 필요에 따라서 가온하고, 호모 믹서 등을 이용하여 균일화, 용해 또는 유화시키고, pH 조정제로 pH를 조정하는 것에 의해 조제하면 된다. 또한, 제제의 멸균 방법으로서는, 전자선 멸균, 오토클레이브 멸균, 여과 멸균 등의 방법을 선택할 수 있다.
(사용 방법)
본 발명에 따른 점안제의 용법 및 용량은, 환자의 증상 등에 따라 변동하지만, 통상, 1일 약 1∼6회, 1회 약 1∼2적을 점안하면 된다.
본 발명에 따른 점안제는, 소아에 대해서 적용될 수 있다. 한정은 되지 않지만, PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제로서, 페닐뷰티르산 및 그 약리학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유시킨 점안제를 이용하는 경우, 예를 들어, 점안제를 1일 1∼2회, 1회 1∼2적으로 점안하는 것이 가능하고, 1일 1회, 1회 1적으로 점안하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 효과를 현저하게 발휘하는 관점에서, 본 발명에 따른 점안제는, 소아에 대해서, 예를 들어, 낮잠 전, 취침 전 등의 활동이 활발하지 않은 시간대에 이용하는 것이 가능하다.
［소아의 근시 진행 억제제의 스크리닝 방법］
본 발명에 있어서, 소아의 근시 진행 억제제의 스크리닝 방법은, 안 유래의 세포에 후보 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 세포에 있어서의, PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 변화를 지표로 하여 후보 물질을 선택하는 공정을 포함한다. 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 후보 물질의 존재하 또는 부존재하에서 세포에 접촉시켜, 후보 물질에 의한 PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 변화를 측정하여 비교하는 것에 의해 후보 물질의 스크리닝이 행해질 수 있다.
안 유래의 세포로서는, 한정은 되지 않지만, 본 발명의 효과를 현저하게 발휘하는 관점에서, 강막에 있어서의 세포인 것이 바람직하고, 강막 섬유아세포가 보다 바람직하다.
한정은 되지 않지만, 안 유래의 세포는, 근시를 유도한 동물 모델에서 유래하는 세포인 것이 바람직하다. 이와 같은 근시 유도 모델로서는, 공지된 동물 모델을 이용하는 것이 가능하다.
한정은 되지 않지만, 근시 유도 모델로서는, 마이너스 렌즈를 장용(裝用)시켜 근시를 유도한 동물 모델, 근시 유도제를 투여하는 것에 의해 근시 유도한 동물 모델 등을 들 수 있다.
이와 같은 마이너스 렌즈로서는 -20∼-40디옵터(D)의 것을 이용할 수 있고, 바람직하게는 -25∼-35디옵터(D)이다. 마이너스 렌즈의 장용 방법은, 공지된 방법을 이용할 수 있고, 한정은 되지 않지만, 동물의 눈 앞에 고정구를 이용하여 마이너스 렌즈를 고정하는 것 등을 들 수 있다.
마이너스 렌즈의 장용 기간은, 예를 들어, 적어도 1주간으로 할 수 있고, 2주간 이상이 바람직하고, 3주간 이상이 보다 바람직하다.
또한, 근시 유도제로서는, 공지된 물질을 이용하는 것이 가능하지만, 예를 들어, 근시 유도제로서, 후술하는 실험예에서 평가하고 있는 바와 같이, 튜니카마이신, 탑시가르긴 등을 이용하는 것이 가능하다. 또한, 근시 유도제로서는, PERK 경로의 활성화제나, ATF6 경로의 활성화제를 조합하여 이용하는 것도 가능하다. PERK 경로의 활성화제로서는, CCT020312 등을 들 수 있고, ATF6 경로의 활성화제로서는, AA147 등을 들 수 있고, 이들을 단제 투여, 또는 혼합 투여하는 것이 가능하고, 이들을 혼합 투여하는 것이 바람직하다.
이와 같은 근시 유도제는, 한정은 되지 않지만, 강막 등의 눈의 세포에 작용시키는 관점에서, 예를 들어, 주사제, 또는, 점안제로서 투여하는 것이 가능하고, 점안제로서 투여하는 것이 바람직하다. 튜니카마이신을 점안제로서 이용하는 경우는, 예를 들어, 10∼100μg/mL로 할 수 있고, 20∼80μg/mL가 바람직하고, 40∼60μg/mL가 보다 바람직하다.
탑시가르긴을 점안제로서 이용하는 경우는, 예를 들어, 1∼100μM로 할 수 있고, 2∼60μM이 바람직하고, 5∼30μM이 보다 바람직하다.
동물에의 근시 유도의 개시 시기에 대해서는, 소아에의 적용을 상정한 동물 모델로 하는 관점에서, 유약(幼若)한 주령의 동물을 이용하는 것이 바람직하다. 한정은 되지 않지만, 마우스인 경우, 이유 시기에 마이너스 렌즈를 장용 개시하는 것이 바람직하고, 3주령 마우스인 것이 보다 바람직하다. C57BL6 등의 마우스에서는, 3주령으로부터 6주령에 걸쳐 생리적 안축 신장이 생긴다. 따라서, 3주령으로부터 근시를 유도하는 것에 의해, 생리적 안축 신장에 더하여, 과잉한 안축 신장을 촉진시킬 수 있기 때문에, 병적 안축 신장을 생기게 하는 것이 가능해진다. 예를 들어, 3주령 마우스에 대해서, 근시 유도를 행하기 전후, 또는, 근시 유도를 행하고 있는 기간에, 후보 물질을 적용하는 것이 바람직하다. 당해 수법에 의하면, 후보 물질이, 생리적 안축 신장이나 병적 안축 신장에 주는 영향을 평가하는 것이 가능하다. 또한, 동물로서 백색 레그혼을 이용하는 경우는, 소아에의 적용을 상정한 동물 모델로 하는 관점에서, 예를 들어, 5일령의 백색 레그혼 병아리를 이용하는 것이 바람직하다.
한정은 되지 않지만, 후보 물질을 안 유래의 세포에 접촉시키는 스텝은, 당해 후보 물질을 경구, 복강내 주사 또는 점안에 의해 투여하는 것이 바람직하고, 점안에 의해 투여하는 것이 보다 바람직하다. 예를 들어, 강막에 있어서의 세포에 있어서 평가하는 경우는, 후보 물질을 점안제에 함유시켜 투여하는 것이 가능하다.
후보 물질에 의한 PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 변화를 측정하는 스텝에서는, 공지된 평가 방법을 이용하는 것이 가능하다. 한정은 되지 않지만, 유전자의 발현이나 단백질의 발현 또는 분비는, 마이크로어레이, 리얼타임 PCR법, PCR법, 웨스턴 블롯법, ELISA법, 면역 조직 염색 등의 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다.
예를 들어, PERK 또는 ATF6의 시그널 전달계의 유전자의 변화를 측정하는 경우, 배양 세포로부터 공지된 RNA 추출 방법을 이용하여 RNA를 추출하고, mRNA의 발현을 정량 분석하는 스텝에 제공하는 것이 가능하다.
mRNA의 발현을 정량 분석하는 스텝은, 한정은 되지 않지만, 리얼타임 PCR법을 이용하는 것이 바람직하다. 리얼타임 PCR법으로 측정하는 마커로서는, (PERK 경로 및 ATF6 경로의 저해제)의 항목에서 전술한, 시그널 전달에 관련되는 인자를 측정 항목으로 하는 것이 가능하다.
PERK 경로에 관련되는 인자로서는, 예를 들어, CHOP, ATF4, GADD34 등을 들 수 있다.
ATF6 경로에 관련되는 인자로서는, 예를 들어, GRP78, GRP94, PDI, Cnex, HYOU, ERdj3 등을 들 수 있다.
후보 물질에 의한 PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 발현이 억제되어 있는 경우, 당해 후보 물질을 PERK 경로 및/또는 ATF6 경로의 저해제로서 선정하여, 소아의 근시 진행 억제제로서 이용하는 것이 가능하다.
본 발명은, 이하의 태양으로도 있을 수 있다.
PERK(PKRK-like endoplasmic reticulum kinase) 경로 및/또는 ATF6(Activating transcription factor 6) 경로의 저해제를 유효 성분으로서 함유하는, 소아의 근시 진행 억제용 점안제;
소아의 근시 진행 억제에 있어서의 사용을 위한, PERK(PKRK-like endoplasmic reticulum kinase) 경로 및/또는 ATF6(Activating transcription factor 6) 경로의 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 점안제;
PERK(PKRK-like endoplasmic reticulum kinase) 경로 및/또는 ATF6(Activating transcription factor 6) 경로의 저해제의, 소아의 근시 진행 억제용 점안제의 제조를 위한 사용;
PERK(PKRK-like endoplasmic reticulum kinase) 경로 및/또는 ATF6(Activating transcription factor 6) 경로의 저해제를, 사람에게 유효량 섭취시키는 것을 포함하는, 소아의 근시 진행 억제 방법;
상기 저해제가, 적어도 ATF6 경로를 선택적으로 억제하는 것을 포함하는, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 저해제가, PERK 경로 및 ATF6 경로의 양 경로의 저해제인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 저해제가, 페닐뷰티르산 및 그 약리학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 저해제가, 페닐뷰티르산 나트륨인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 저해제의 함유량이, 점안제 전량에 대해서, 0.01∼5질량%인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 저해제의 함유량이, 점안제 전량에 대해서, 0.1∼3질량%인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 저해제의 함유량이, 점안제 전량에 대해서, 0.2∼2질량%인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 소아의 근시 진행 억제가, 생리적 안축 신장을 억제하지 않는 것인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 소아의 근시 진행 억제가, 병적 안축 신장을 억제하는 것인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 소아가, 7세 이상, 15세 미만의 아동을 포함하는, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 점안제가, 수성 점안제인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 점안제가, 1일 1∼2회의 점안에서 이용되는 것인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 점안제가, 1일 1∼2회의 점안에서 이용되는 것인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
상기 점안제가, 낮잠 전, 또는, 취침 전에 이용되는 것인, 상기에 기재된 점안제, 사용, 또는 방법;
안 유래의 세포에 후보 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 세포에 있어서의, PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 변화를 지표로 하여 후보 물질을 선택하는 공정을 포함하는, 소아의 근시 진행 억제제의 스크리닝 방법;
상기 안 유래의 세포가, 근시를 유도한 동물 모델에서 유래하는 세포인, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
상기 동물 모델이, 마이너스 렌즈를 장용시켜 근시를 유도한 동물 모델, 또는, 근시 유도제를 투여하는 것에 의해 근시 유도한 동물 모델인, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
상기 마이너스 렌즈가, -20∼-40디옵터(D)의 렌즈인, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
상기 마이너스 렌즈의 장용 기간이, 적어도 1주간인, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
상기 근시 유도제가, 튜니카마이신, 및/또는, 탑시가르긴을 포함하는, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
상기 튜니카마이신의 점안 투여의 경우의 농도가, 10∼100μg/mL인, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
상기 탑시가르긴의 점안 투여의 경우의 농도가, 1∼100μM인, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
상기 동물 모델이, 이유 시기에 마이너스 렌즈를 장용 개시하는 것인, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
상기 안 유래의 세포에 후보 물질을 접촉시키는 공정이, 상기 후보 물질을 경구, 복강내 주사 또는 점안에 의해 투여하는 것을 포함하는, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
후보 물질에 의한 PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 발현이 억제되고 있는 경우, 당해 후보 물질을 소아의 근시 진행 억제제로서 선택하는 것을 포함하는, 상기에 기재된 스크리닝 방법;
후보 물질에 의한 PERK 및 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 발현이 억제되고 있는 경우, 당해 후보 물질을 소아의 근시 진행 억제제로서 선택하는 것을 포함하는, 상기에 기재된 스크리닝 방법.
실시예
이하에 실험 결과를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다.
［실험 방법］
본 실험에 있어서의 모든 동물 실험은, 게이오기주쿠 대학 동물 실험 위원회의 승인을 받고, 게이오기주쿠 대학 동물 실험에 관한 시설 가이드라인, 안과·시각 연구에 있어서의 동물의 사용에 관한 ARVO 성명, 동물 연구: 연구에 있어서의 동물의 사용에 관한 in vivo 실험의 보고(ARRIVE) 가이드라인을 준수했다.
(근시 유도 유약 마우스의 특징)
비특허문헌 3에 기재되어 있는 바와 같이, 인간의 눈은 출생 직후는 원시이며, 그 후에 안축이 신장(즉 근시화)되어, 학동기(8세경)에 정시화된다. 또한, 비특허문헌 6에 기재되어 있는 바와 같이, 마우스(C57BL6)의 3 내지 6주령의 기간도 성장에 수반하여 안축이 신장되고 있다. 따라서, 이 근시 유도 유약 마우스는, 근시 진행의 동태라고 하는 점에서 인간의 8세 전후에 상당하고, 그것은 실질 유아·소아(학동기)에 상당한다. 이 동물 모델을 이용함으로써, 인간 소아의 근시 진행에 있어서의 메커니즘 해명과, 소아의 근시 진행 치료제의 스크리닝이 가능하다.
마이너스 렌즈를 장용시켜 축성 근시가 유도되는 기구를 도 1(a)에 모식적으로 나타냈다. 정시(正視)는 눈에 들어오는 평행 광선이 망막 상에서 상을 맺으므로, 상이 뚜렷하게 보이는 상태를 말한다. 한편, 축성 근시는, 안축 길이가 길어져 있기 때문에 눈에 들어오는 평행 광선이 망막의 앞에서 상을 맺기 때문에, 뚜렷하게 보이지 않는 상태를 말한다. 인간을 포함하여 동물의 눈은 성장과 함께 커진다. 유약한 마우스에게 마이너스 렌즈를 장용시키면, 마이너스 렌즈를 장용하고 있을 때 상을 맺는 위치, 즉 마이너스 렌즈 장용 시에는 뚜렷하게 보이는 상태까지 안축이 신장된다. 그 결과, 안축이 신장되어, 축성 근시와 마찬가지의 눈 상태를 만들어 낼 수 있다.
(근시 유도 유약 마우스의 제작)
구체적으로는 이하와 같이 하여 근시 유도 유약 마우스를 제작한다. 한편, 근시 유도, 안축 길이 및 굴절의 계측은 비특허문헌 4, 5와 마찬가지의 방법으로 행했다. 우선, 웅성 C57BL6J 마우스를, 12시간의 명암 사이클하에서 온도 제어 클린룸에서 표준 투명 케이지에 수용했다. 동물에는, 표준 사료와 고압 증기 멸균한 수돗물을 자유 섭취시켰다. 이유 직후의 3주령의 마우스를 도미토르(닛폰 젠야쿠 공업주식회사), 베토르팔(Meiji Seika 파르마 주식회사), 미다졸람(산도 주식회사)의 3종 혼합 마취로 마취하고, 가위로 두개를 노출시킨다. 도 1(b)에 나타내는 바와 같이, 두개에 지주를 입설하고, 치과용 시멘트(Super-Bond, 산메디칼 주식회사)로 고정한다. 지주는, 후술하는 조절 기구를 너트로 고정할 수 있도록 나사산이 마련되어 있다.
근시를 유도하기 위해서 -30디옵터(diopter, D)의 마이너스 렌즈(레인보우 컨택트, 주식회사 레인보우 옵티컬 연구소)를 우안(근시 유도안)에, 컨트롤로서 0D의 렌즈, 또는 프레임만을 좌안(컨트롤안)에 장착시킨다. 렌즈는 마우스에 장착시켰을 때에, 마우스가 앞다리 등에 의해 흠집을 내지 않도록, 렌즈 하부의 프레임부에 측방으로 돌출된 형상의 프로텍터가 접착되어 있다. 프로텍터에 의해, 마우스는 렌즈를 건드릴 수 없어, 렌즈에 흠집이 나지 않는다. 프로텍터는 여기에서는 프레임부에 접착하여 일체가 된 것을 사용하고 있지만, 마우스의 행동에 의해 렌즈에 흠집이 나지 않으면 되고, 렌즈와 일체가 되어 있을 필요는 없다. 예를 들어, 외상을 입은 동물이 장용하는 엘리자베스 칼라와 같은 형상의 것이어도 된다.
렌즈 상방의 프레임부에는, 마우스의 성장에 맞추어, 장착한 렌즈의 폭이나 각도를 조절하기 위한 조절 기구가 접착되어 있다. 조절 기구는 「<」자 형상으로 절곡되어 있고, 한쪽은 렌즈가 접착되어 있고, 다른 쪽은 두부에 입설된 지주에 장착할 수 있도록 긴 구멍이 마련되어 있다. 긴 구멍을 지주에 통과시키고, 너트로 나사 고정하는 것에 의해 마우스의 두 눈의 주연(周緣)을 압박하지 않고, 피부에 밀착시켜 고정할 수 있다. 지주, 너트, 조절 기구의 3점으로 이루어지는 조절 기구에 의해, 마우스의 성장에 맞추어 폭, 각도를 조절하여, 마우스의 눈의 위치에 렌즈가 오도록 조정할 수 있다. 또한, 렌즈의 제거가 가능하므로, 안축 길이, 굴절치의 경시적인 변화를 계측하는 것이 가능하다.
(안축 신장과 굴절의 계측)
컨트롤안은 프레임만, 근시 유도안은 -30D 렌즈를 3주간 장용시키고, 굴절치, 안축 길이를 측정하여, 장용 전후의 차를 구했다. 굴절치는 굴절계(Infrared photorefractor for mice, Tubingen 대학 Schaeffel 교수 제작), 안축 길이는 SD-OCT(Spectral-domain OCT, 스펙트럴 도메인 광 간섭 단층 촬영, Envisu R4310, bioptigen Inc.)에 의해 계측했다.
(피험약의 조제)
페닐뷰티르산 나트륨(Cayman Chemical, MI, USA) 및 타우로우르소데옥시콜산(시그마·알드리치, 도쿄, 일본)은 PBS에 용해했다. IRE1 저해제인 STF080310(셀렉·바이오테크, 도쿄, 일본) 또는 4μ8C(셀렉·바이오테크), PERK 저해제인 GSK2656157(셀렉·바이오테크) 또는 GSK2606414(셀렉·바이오테크), ATF6 저해제인 넬피나비르 메시스테레이트 하이드레이트(도쿄 화학공업, 도쿄, 일본) 또는 Ceapin-A7(시그마·알드리치)은 DMSO로 용해하고, 1:1000으로 PBS에 의해 희석하여 점안 시험에 이용했다.
(점안)
0.2% 또는 2%의 페닐뷰티르산 나트륨의 PBS 용액(4-PBA), 60μM의 STF080312(STF), 100μM의 4μ8C(4μ8C), 100μM의 GSK2656157(GSK), 100μM의 GSK2606414(GSK2606414), 100μM의 넬피나비르 메시스테레이트 하이드레이트(NFV), 100μM의 Ceapin-A7(Ceapin)을 근시 유도 중에, 10일간, 매일, 1일 1회, 저녁, 양 눈에 점안했다.
(복강내 주사)
페닐뷰티르산 나트륨 PBS 용액(4-PBA; 200mg/kg 체중) 또는 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA; 100mg/kg 체중)을 근시 유도 기간을 통하여 매일 복강내 주사(i.p.)했다.
(웨스턴 블롯법에서의 농도 측정 분석)
강막의 단백질(10μg/웰)은, SDS-PAGE에 의해 분리되어, PVDF막(미국 MA주, Merck Millipore)에 옮겨지고, Blocking One(도쿄, Nacalai Tesque)로 블록되고, 항ATF6(바이오아카데미아 주식회사), 인산화-IRE1(Ser724, Abcam, Cambridge, UL), IRE1, 인산화-eIF2α, eIF2α, 및 β-액틴(Cell Signaling Technologies Japan, 도쿄, 일본) 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이트되었다. 막을 적절한 HRP 결합 2차 항체와 인큐베이트하고, EzWestLumi plus(ATTA, 도쿄 일본)를 이용하여 가시화했다. SDS-PAGE는 10% 아크릴아마이드 겔에서 단백 사이즈 마커(MagicMark XP Western Protein Standard, ThermoFisher Scientific)를 이용하여 행했다. ImageJ 소프트웨어를 이용하여 농도 측정 분석을 행했다.
(정량적 PCR)
정량적 real-time PCR은, StepOnePlus 리얼타임 PCR 시스템을 이용하여 PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems, CA, USA)로 행했다. 발현 레벨은 β-액틴에 의해 표준화했다.
(통계 해석)
실험에서 얻은 데이터는, 모두 평균치±표준 편차로 나타낸다. 군간차는, Student의 t 검정 또는 일원 배치 분산 분석 또는 일반화 추정 방정식에 의해 해석했다. ANOVA가 유의차를 나타냈을 경우, 다음에 Tukey HSD를 행하여, 각 평균치간의 차의 유의성을 판정했다. p치가 0.05 미만인 경우는, 통계학적 유의차를 나타낸다.
［실험 결과］
＜시험예 1 근시 유도 유약 마우스의 강막에 있어서의 소포체 스트레스 응답 유전자의 발현 변화＞
소포체 스트레스 응답 유전자 경로인 PERK 경로, ATF6 경로, IRE1 경로의 소아의 근시 진행에의 관여를 평가하기 위해서, 소아 근시 진행을 모의하고 있는 마우스의 강막에 있어서의 유전자 발현을 상기 ［실험 방법］의 기재에 따라 평가했다.
도 2에, 3주간의 근시 유도 후의 안축 신장(a) 및 굴절 변화(b)를 나타내고, 그 때의 강막에 있어서의 유전자 발현 변화를 도 3에 나타낸다. 또한, 소포체 스트레스 응답 유전자의 경로를 도 4에 나타낸다. 그 결과, 근시 유도 유약 마우스의 강막에 있어서, 소포체 스트레스 응답의 주요 유전자(도 4)인 PERK, ATF6, IRE1의 하류의 유전자 발현이 유의하게 항진하고 있었다(도 3).
이들 결과로부터, 소아의 근시 진행에 수반하여, PERK 경로, ATF6 경로, IRE1 경로의 유전자 발현이 항진함이 확인되었다.
＜시험예 2 소포체 스트레스 응답 유전자의 각종 저해제에 의한 근시 진행 억제＞
시험예 1에 있어서 소아의 근시 진행에 PERK, ATF6, 및 IRE1이 관여하고 있음이 시사되었으므로, 이 시험예 2에서는, 이들 유전자의 기지 저해제에 의해 근시 진행이라고 하는 표현형이 어떻게 영향을 받는지를 평가했다. 한편, PERK 저해제로서 GSK2656157(GSK), GSK2606414, ATF6 저해제로서 넬피나비르 메시스테레이트 하이드레이트(NFV), Ceapin-A7, IRE1 저해제로서 STF080312(STF), 4μ8C를 이용했다(도 5).
도 6-a, b에, 마우스의 근시 유도 기간에 60μM의 STF, 100μM의 GSK, 100μM의 NFV를 10일간 매일 1회 점안한 후의 안축 신장(a) 및 굴절 변화(b)를 나타냈다. 도 6-c, d에, 이들 저해제의 조합(STF＋GSK: S＋G, GSK＋NFV: G＋N, NFV＋STF: N＋S, STF＋GSK＋NTF: S＋G＋N)을 마찬가지로 점안한 후의 안축 신장(c) 및 굴절 변화(d)를 나타냈다. 또한, 도 7에, 각각 100μM의 GSK2606414, Ceapin-A7, 4μ8C를 마찬가지로 점안한 후의 안축 신장(a) 및 굴절 변화(b)를 나타냈다.
그 결과, 근시 유도 유약 마우스의 강막에 있어서, 소포체 스트레스 응답의 주요 유전자인 PERK, ATF6, IRE1의 각각의 저해제의 단독 점안에 의해, 예상에 반해 안축 신장 억제도 굴절의 근시화의 억제도 인정되지 않았다(도 6-a, b). 오히려, STF를 제외한 저해제 단독의 점안에 의해, 근시 유도하고 있지 않는 컨트롤안의 안축이 DMSO 점안과 비교하여 유의하게 신장되어 굴절이 근시화되고 있었다. 또한, 이들을 조합하여 점안하면, PERK 저해제와 ATF6 저해제의 적어도 2종이 존재할 때(G＋N, S＋G＋N)만 안축 길이가 유의하게 억제되어, 굴절의 근시화가 억제되고, 단독 점안에서 인정된 컨트롤안의 안축 신장도 인정되지 않았다(도 6-c, d). 더욱이, 도 6과는 상이한 저해제 GSK2606414, Ceapin-A7, 4μ8C의 단독 점안에 의한 안축 길이 및 굴절의 변화는 도 6의 결과와 완전히 마찬가지이며, 안축 신장도 굴절 근시화도 억제되지 않고, 4μ8C 이외의 단독 점안에서는 컨트롤안의 안축까지 신장되고 있었다(도 7).
이들 결과로부터, 소포체 스트레스 경로의 주요 유전자(PERK, ATF6, IRE1) 중, 적어도 PERK와 ATF6을 양쪽 모두 억제했을 경우에 안축 신장이 억제되어, 굴절의 근시화가 억제됨이 확인되었다. PERK 단독, ATF6 단독, PERK와 IRE1, ATF6과 IRE1의 억제에서는, 성장에 수반하는 안축의 신장을 넘어 병적인 안축 신장을 가져옴이 확인되었다. 이것은, PERK 경로와 ATF6 경로의 억제가 근시 억제에는 중요하다고 생각되었다. 또한, 한정은 되지 않지만, 소아의 근시 진행 억제제를 탐색하는 관점에서, PERK 경로와 ATF6 경로를 양쪽 모두 억제할 수 있는 성분을 탐색하는 것이 유효하다고 생각되었다.
＜시험예 3 4-PBA 및 TUDCA에 의한 소포체 스트레스 경로의 저해＞
시험예 2에 있어서, 소아의 근시 진행 억제제 탐색에는, PERK 경로와 ATF6 경로를 양쪽 모두 억제하는 성분을 탐색하는 것이 유효하다고 생각되었으므로, 이 시험예 3에서는, 이미 안축 신장을 억제함이 알려져 있는 성분(페닐뷰티르산 나트륨{4-PBA}, 타우로우르소데옥시콜산{TUDCA})에 대해, 소포체 스트레스 경로의 억제 프로파일을 평가했다.
도 8에, 4-PBA를 마우스의 근시 유도 기간을 통해 매일 복강내 주사한 후의 유전자 발현 변화를 나타냈다. 도 9에, 4-PBA 투여에 의한 근시 유도 1주째, 3주째의 안축 신장(a)과 굴절 변화(b)를 나타냈다. 또한, 도 10에, 0.2%와 2% 4-PBA를 근시 유도 중 마우스에 점안한 후의 안축 신장(a)과 굴절 변화(b)를 나타냈다. 또한, 도 11에, TUDCA를 근시 유도 기간을 통해 매일 복강내 주사한 후의 안축 신장(b)과 굴절 변화(a)를 나타냈다.
그 결과, 근시 유도 유약 마우스에 있어서 항진하고 있던 PERK 경로와 ATF6 경로의 하류(도 4)에 있는 유전자 발현이, 2% 4-PBA 점안에 의해 유의하게 억제되었다(도 8). 또한, 2% 4-PBA 점안 1주째와 3주째의 안축 신장은 동일한 정도로 유의하게 억제되고, 굴절의 근시화도 또한 동일한 정도로 유의하게 억제되었다. 또한, 동시에 근시 유도되지 않았던 컨트롤안의 안축 신장(생리적 안축 신장)까지는 억제하지 않고, 근시 유도안의 병적 안축 신장만을 억제했다(도 9). 더욱이, 0.2%와 2% 4-PBA의 안축 신장과 굴절 변화를 비교한 바, 용량 의존적인 유효성이 인정되었다(도 10). 또한, 마찬가지로, 소포체 스트레스 억제제로서 알려져 있는 TUDCA의 투여에서도 4-PBA와 마찬가지로 생리적 안축 신장은 억제하지 않고, 병적 안축 신장만을 억제했다(도 11).
이들 결과로부터, 4-PBA나 TUDCA는 소포체 스트레스 경로에 있어서, 소아의 근시 진행 억제의 메커니즘인 PERK 경로와 ATF6 경로를 억제함으로써(도 12), 정상적인 눈의 성장에 수반하는 생리적 안축 신장은 억제하지 않고, 병적 안축 신장만을 억제함이 확인되었다. 즉, 4-PBA, TUDCA, PERK 저해제와 ATF6 저해제의 조합과 같이 PERK와 ATF6의 양쪽 모두를 억제하는 성분은, 소아의 원시로부터 정시에의 정상적인 굴절 변화는 저해하지 않고, 그것을 넘은 근시 진행만을 억제함이 확인되었다.
시험예 1∼3의 결과로부터, 인간 소아의 정시화에 잇달아 일어나는 근시 진행을 시뮬레이트한 근시 유도 유약 마우스에 의한 평가에 의해, 그 병적 안축 신장의 메커니즘(소포체 스트레스에 기인하는 PERK 경로와 ATF6 경로의 항진)이 분명해지고, 그것에 기초한 소아의 근시 진행 억제제의 탐색 방법이 발견되었다. 그리고, 4-PBA 및 TUDCA에는, 단순한 안축 신장 억제 효과뿐만 아니라, PERK 경로와 ATF6 경로를 억제하는 것에 의해 생리적 안축 신장을 억제하지 않고 병적 안축 신장만을 억제한다고 하는 효과가 확인되었다. 즉, PERK 경로 및 ATF6 경로의 동시 저해제가 소아의 근시 진행을 적절히 예방·치료할 수 있음이 in vivo로 확인되었다.
＜시험예 4 소아의 근시 진행 억제에 있어서의 ATF6 경로의 관여＞
소아의 근시 진행 억제에 있어서, PERK 경로와 ATF6 경로의 양 경로 중, ATF6 경로가 어느 정도 관여하고 있는지를 추가로 검토했다. 상기 ［실험 방법］의 기재에 따라 웨스턴 블롯법에서의 농도 측정 분석을 행하여, ATF6의 활성화 form(ATF6-N)양, 및, ATF6의 precosor form(ATF6-P)양을 구했다. 근시 유도 유약 마우스의 강막에 있어서의, PERK, ATF6, IRE1의 각각의 저해제의 단독 점안 방법, 또는, 저해제의 조합에 의한 점안 방법 등은, 시험예 2의 기재에 준한다.
ATF6의 활성화 form(ATF6-N)양을 ATF6의 precosor form(ATF6-P)양으로 나눈 값을 활성화의 지표로 하여, 도 13에 나타냈다.
도 13에 나타내는 바와 같이, ATF6의 ATF6-N의 양을 ATF6의 ATF6-P의 양으로 나눈 값은 몇몇 군에서 유의하게 높은 값을 나타냈다. 특히 2개의 저해제를 조합한 경우, 활성형 ATF6이 높은 값을 나타낸 군은, 도 6c 및 도 6d에서 각각 나타난 병적 안축 신장 및 굴절치의 저하가 인정된 군과 일치하고 있었다. 즉, 근시 유도안(LIM안)에 있어서 ATF6이 비활성화되어 있는 경우는, 근시화가 억제되고 있음이 나타났다. 이 상관 관계가, 도 6c-d와 도 13을 대비하는 것에 의해 나타나지만, 정리하면 하기 표 1과 같다. 표 1 중의 「STF」 또는 「S」는 IRE1 저해제를 나타내고, 「GSK」 또는 「G」는 PERK 저해제를 나타내고, 「NFV」 또는 「N」은 ATF6 저해제를 나타내고 있는 것은, 지금까지의 시험예와 마찬가지이다. 표 1에 정리된 결과는, 근시안의 강막에 있어서 ATF6 경로의 활성화가 트리거가 되어 안축 신장에 수반하는 굴절치 저하가 야기되는 것, 그 반대로, ATF6 경로의 비활화에 의해 안축 신장에 수반하는 굴절치 저하가 억제되는 것을 나타내고 있다. 소아의 근시 진행의 치료·예방에는, 이 약효·약리를 갖는 약제(4-PBA)가 유효하다.
＜시험예 5 근시 유도에 의한 수정체 비후에의 점안제 투여의 영향＞
근시 유도(LIM)에 의해, 수정체가 근소하게 두꺼워지는 경향이 확인되고 있다. 4-PBA의 투여 형태의 차이에 따라, 수정체의 변화에 영향이 있는지 여부를 검토했다. 상기 ［실험 방법］의 기재에 따라, 근시 유도 유약 마우스에 4-PBA를 점안, 또는, 복강내 투여하고, 안축 길이의 계측과 마찬가지로, SD-OCT를 이용하여 수정체의 두께를 계측했다.
도 14(A)에 나타내는 바와 같이, DMSO 점안 NL(=no lens)군과 비교하여, -30D 렌즈 장착군에서는, 근시 유도(LIM)에 의해, 수정체가 두꺼워짐이 확인되었다. 4-PBA를 복강내 투여했을 경우는, 수정체의 비후에 영향을 주지 않았다. 한편, 도 14(B)에 나타내는 바와 같이, 4-PBA를 점안으로 투여했을 경우는, -30D 렌즈 장착군에 있어서 수정체의 비후는 인정되지 않았다. 즉, 4-PBA의 투여 방법으로서는, 타겟 조직에의 도달성의 점에서 점안이 호적하다는 것이 나타났다.

Claims (7)

  1. PERK(PKRK-like endoplasmic reticulum kinase) 경로 및/또는 ATF6(Activating transcription factor 6) 경로의 저해제를 유효 성분으로서 함유하는, 소아의 근시 진행 억제용 점안제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 저해제가, 페닐뷰티르산 및 그 약리학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 점안제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 저해제가, 페닐뷰티르산 나트륨인, 점안제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 저해제의 함유량이, 점안제 전량에 대해서, 0.01∼5질량%인, 점안제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소아의 근시 진행 억제가, 생리적 안축 신장을 억제하지 않는 것인, 점안제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소아의 근시 진행 억제가, 병적 안축 신장을 억제하는 것인, 점안제.
  7. 안 유래의 세포에 후보 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 세포에 있어서의, PERK 및/또는 ATF6의 시그널 전달계의 단백질, 및/또는, 유전자의 변화를 지표로 하여 후보 물질을 선택하는 공정을 포함하는, 소아의 근시 진행 억제제의 스크리닝 방법.
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