KR20230134547A - 보호된 hdac(히스톤 디아세틸라제) 억제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Y, Ar1, Ar2, X, R1 및 R2가 본원에 정의되는 바와 같은, 식 I의 보호된 HDAC 억제제 화합물에 관한 것이다. 측면에서, 본 발명은 상기 화합물의 용도, 및 상기 화합물의 탈보호 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 보호된 HDAC 억제제 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 화합물의 용도, 및 상기 화합물의 탈보호 방법에 관한 것이다.
히스톤의 아세틸화/탈아세틸화는 진핵 세포의 전사 조절에서 중요한 역할을 한다. 히스톤 및 비-히스톤 단백질의 아세틸화 상태는 히스톤 디아세틸라제(HDACs) 및 히스톤 아세틸-트랜스퍼라제(HATs)에 의하여 결정된다. 히스톤 디아세틸라제(HDACs)는 히스톤 및 비-히스톤 단백질의 라이신기의 ε-아미노 부위로부터 아세틸기를 제거하는 효소류에 속한다. HDAC 억제제(HDACi)는 HDAC 효소의 활성을 억제하고, HDACs의 생물학적 중요성으로 인하여, 그의 억제는 상당한 임상적 의미를 가지며, HDAC 억제는 다른 것들 중에서도 암, 신경변성 질환, 염증성 질환, 및 신경 장애의 치료를 위한 중요한 치료 전략으로서 알려졌다.
HDAC 효소는 효소 히스톤 디아세틸라제에 대한 보조 도메인(accessory domains)에 대한 그들의 상동에 근거하여 분류되고, 현재 4개의 주요 클래스로 분류된다:
·HDAC1, -2, -3 및 -8을 포함하는 클래스 I은 효모 RPD3 디아세틸라제와 관련되고;
·HDAC4, -5, -7 및 -9를 포함하는 클래스 IIA; 클래스 IIB-6 및 -10은 효모 Hda1 (히스톤 디아세틸라제 1) 유전자와 관련되고;
·클래스 III(시루투인(sirtuins)으로도 알려짐)은 Sir2 유전자와 관련되고 SIRT1-7을 포함하고;
·HDAC11만을 함유하는 클래스 IV는 클래스 I 및 II 모두의 특징을 가진다.
전형적인 HDAC 억제제는 HDACs의 아연-함유 촉매 도메인에 결합함으로써 클래스 I, II 및 IV HDACs에 독점적으로 작용한다. 이들 HDAC 억제제는 (티올기와 아연 이온에 결합하는 시클릭 테트라펩타이드를 제외하고) 아연 이온에 결합하는 화학적 부위에 근거하여 더욱 분류될 수 있다. 예는 트리코스타틴(trichostatin) A와 같은, 히드록삼산(hydroxamic acid) (또는 히드록사메이트(hydroxamates)); 시클릭 테트라펩타이드 (트라폭신(trapoxin) B와 같은), 및 뎁시펩타이드(depsipeptides); 벤즈아미드; 친전자성 케톤, 및 페닐부티레이트 및 발프로산(valproic acid)과 같은 지방족산 화합물을 포함한다.
히드록삼산은 HDAC 억제제의 최대 클래스를 구성한다.
히드록삼산계 HDAC 억제제의 예는 보리노스탓(vorinostat) (수베로일아닐리드 히드록삼산(suberoylanilide hydroxamic acid), SAHA), 벨리노스탓(belinostat), 파노비노스탓(panobinostat), 기비노스탓(givinostat), 프라시노스탓(pracinostat), 퀴시노스탓(quisinostat) 및 아벡시노스탓(abexinostat)을 포함한다.
HDAC 억제제는 중요한 치료적 역할을 하나, 히드록삼산과 같은 HDAC 억제제의 불안정성은 저장 안정성, 용해도, 제제 및 제조 등의 측면에서 어려움을 야기한다.
본 발명의 목적은 상기 문제점들 중 하나 이상에 접근 또는 완화하는 것이다. 본 발명의 목적은 보호된 HDAC 억제제, 특히 보호된 히드록삼산을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 개선된 안정성을 나타낼 수 있는 보호된 HDAC 억제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 개선된 용해도를 나타낼 수 있는 보호된 HDAC 억제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 구현예들은 히드록삼산계 HDAC 억제제와 같은, HDAC 억제제의 보호 및/또는 탈보호 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 탈보호 단계는 세포 및 조직 내에서, 즉 내생 효소에 의하여 원 위치에서(in situ) 수행될 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 보호기로서 에스테르의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 HDAC 억제제에 대한 보호기로서 에스테르의 용도에 관한 것이다. 이 과정에서, 히드록삼산과 같은 HDAC 억제제의 작용기가 에스테르로서 보호된다. 그 후, 에스테르는 효소의 존재하에 제거될 수 있다. 상기 효소는 내생 효소일 수 있다. 에스테르의 제거는 작용기의 탈보호를 초래한다. 이러한 탈보호는 원 위치에서 일어날 수 있다, 즉 효소는 내생 효소일 수 있고, HDAC 억제제가 세포 내로 들어갈 때 탈보호가 일어날 수 있다. 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 구현예에서, HDAC 억제제가 보호 에스테르기 상의 내생 효소의 작용을 통하여 표적 세포에 들어갈 때 탈보호가 일어난다. 이는 HDAC 억제의 원 위치 "클린" 활성화를 초래할 수 있다.
따라서, 본 발명은 보호된 HDAC 억제제를 포함한다. 보호된 HDAC 억제제는 에스테르기에 의하여 보호될 수 있다. 이는 전구 약물(pro-drug)로서 작용할 수 있다. 이는 원 위치 탈보호 가능한 HDAC 억제제로서 작용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 보호된 HDAC 억제제는 투여 후 그의 활성 형태로 대사된다. 이는 저장, 제제 및 제조 등의 측면에서 상당한 이점을 가진다. 본원에 사용되는 용어 "전구 약물"은 비활성 형태로 투여되고, 화학적, 생화학적 및 생리학적 과정을 통하여 생체 내에서 그의 활성 형태로 전환되는 화합물 또는 화합물들을 의미한다.
유리하게, 에스테르는 효소적 제거를 통하여 표적 조직 내에서만 HDAC 억제의 활성화를 허용하도록 선택될 수 있다, 즉 보호기는 효소적 제거가 관심 있는 세포, 조직 또는 신체 부위, 즉 상보적 효소(complementary enzyme)를 함유하는 세포, 조직 또는 신체 부위 내에서만 일어나도록 선택될 수 있다. 상기 보호기는, 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이, 반감기, 용해도, 표적화 등과 같은 특징을 조절하여 표적 조직의 특징에 맞도록 더 조정될 수 있다.
적합한 보호기는, 이에 제한되지 않으나, 아세테이트 (C1-C9) 에스테르, 히드록시아세테이트 (C1-C9) 에스테르, 메톡시아세테이트 (C1-C9) 에스테르, 페닐아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 살리실레이트, 피루베이트, 락테이트 에스테르, 시트레이트 에스테르, PEG 에스테르, 글리세롤 에스테르, 펩타이드 에스테르, 예를 들어, 모노-, 디- 및 트리글리신 에스테르, 포스페이트 에스테르, 술포네이트 에스테르, 카보네이트, 예를 들어 테트라에틸렌 글리콜, O-글리코실 에테르, O-글리코실 에스테르를 포함한다.
구현예에서, 상기 보호기는 아세테이트 (C1-C9). 에스테르이다. 구현예에서, 상기 보호기는 아세테이트 C1 에스테르이다.
적합한 탈보호 효소는, 이에 제한되지 않으나, 리파아제(lipases), 락타아제(lactases), 에스테라아제(esterases), 아밀라아제(amylases), 시토크롬(cytochrome) P450s, 글리코시다아제(glycosidases) e.g. 베타-글루코로니다아제(beta-glucoronidases), 수크라아제(sucrases) 및 히알루로니다아제(hyaluronidases), 펩티다아제(peptidases), 포스파타아제(phosphatases) 및 술파타아제(sulfatases)를 포함한다.
구현예에서, 상기 효소는 리파아제 또는 락타아제이다.
구현예에서, 상기 HDAC 억제제는 광활성(photoactive) HDAC 억제제이나, 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 본 발명은 HDAC 억제제 및 HDAC 억제제 약물에 더 광범위하게 적용되는 것으로 이해된다.
구현예에서, 상기 HDAC 억제제는 광활성 HDAC 억제제이다. "광활성(photoactive) HDAC 억제제"라 함은 이중적 세포 조절 활성, 즉 생화학적 영향 및/또는 표적화와 같은 HDAC 억제 활성과 함께 광-활성화된(light-activated) 세포 사멸 활성을 가지는 HDAC 억제제를 의미한다.
그러한 화합물의 예시적 형태를 아래에 나타낸다:
이러한 HDAC 억제제의 예는 본원에 개시되는 화합물이다. 본 발명자들은 그러한 광활성 HDAC 억제제가 본 발명에 따라 보호될 때, 세포 사멸 기능이 유지됨을 입증하였다. 보호가 일어나는 동안 생물학적 활성이 지연되는 것으로 관찰되었다.
본 발명의 측면에서, 식 I의 화합물이 제공된다:
식 I
상기 식에서,
R1은 H 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이고;
R2는 P-Z이고, 여기서 P는 N 원자, -C=0, 및 -NHC=O 중 하나 이상으로 임의로 치환된, 1 내지 15개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이고;
Z는:
이고,
여기서 R3는 C1-C9 알킬, -CH2OH, -CH2OCH3, -Ph, -C6H4OH, -CH(CH3)OH, -C(CH2COOH)2OH, -C(=O)CH3, -CH2NH2, -CH2NH(C=O)CH2NH2, 또는 -CH2NH(C=O)CH2NH(C=O)CH2NH2이거나;
또는
R1 및 R2는 5 또는 6원을 가지고 P-Z로 치환된 헤테로시클릭기 Y의 일부를 형성하고, 여기서 P는 앞서 정의되는 바와 같고, Z는 앞서 정의되는 바와 같고;
Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 페닐, 피리딘, 피리미딘, 티오펜, 퓨란, 벤조퓨란 또는 티아졸기로부터 선택되고;
X는 -C=C-C(=O)OR4이고, 여기서 R4는 하나 이상의 O 원자로 임의로 치환된, 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이다.
본 발명의 화합물은 상기 식 I으로 나타내는 일반적 구조를 가진다.
용어 5 또는 6원을 가지는 헤테로시클릭기는 5 또는 6개의 고리원을 함유하고, 식 I 질소 원자 외에, N, S, SO, SO2, O2 및 O로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자를 임의로 함유하는 모노시클릭 고리기를 의미한다. 용어 "헤테로시클릭기"는 방향족, 특히 불포화 및 포화 고리 시스템을 포함한다. 비-방향족 기의 에는 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디옥시도티오모르폴리닐, 피롤리딘-1-일, 및 피롤리딘-3일기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 방향족 (헤테로아릴) 기의 예는 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 인돌릴 및 벤조티아디아졸릴기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, 상기 헤테로시클릭기는 포화 고리 시스템이다. 식 I에 따르면, 상기 고리 시스템은 P-Z로 치환된다. 구현예에서, P-Z는 식 I 질소 원자에 대하여 4-위치에 있다.
본원에 사용되는 용어 "알킬"은 완전히 포화된, 분지, 비분지 또는 환형 탄화수소 부분, 즉 1차, 2차 또는 3차 알킬, 또는 적절한 경우, 시클로알킬 또는 시클로알킬로 치환된 알킬을 의미한다. 달리 기재하지 않는 한, 알킬기는 1 내지 10개의 탄소 원자, 바람직하게 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 더 바람직하게 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 대표적인 알킬기는, 이에 제한되지 않으나, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, iso-부틸, tert-부틸, n-펜틸, iso-펜틸, neo-펜틸, n-헥실, 3-메틸헥실; 2,2-디메틸펜틸; 2,3-디메틸펜틸, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐 및 n-데실을 포함한다.
구현예에서, R3은 C1-C6 알킬이다.
구현예에서, R3은 C1-C6 알킬이다. 구현예에서, R3은 -CH3이다.
구현예에서, Ar1은 티아졸 또는 페닐기이다.
구현예에서, Ar2는 피리딘, 티오펜, 또는 퓨란기이다.
구현예에서, Ar1은 티아졸 또는 페닐기로부터 선택되고, Ar2는 피리딘, 티오펜, 또는 퓨란기로부터 선택된다.
구현예에서, R1 및 R2는 헤테로시클릭기 Y의 일부를 형성한다. 상기 헤테로시클릭기 Y는 P-Z로 치환되고, 여기서 P는 N 원자, -C=0, 및 -NHC=O 중 하나 이상으로 임의로 치환된, 1 내지 15개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이고;
Z는:
이고,
여기서 R3는 H, C1-C9 알킬, -CH2OH, -CH2OCH3, -Ph, -C6H4OH, -CH(CH3)OH, -C(CH2COOH)2OH, -C(=O)CH3, -CH2NH2, -CH2NH(C=O)CH2NH2, 또는 -CH2NH(C=O)CH2NH(C=O)CH2NH2이다.
구현예에서, 상기 치환체 P-Z는 식 I 질소 원자에 대하여 4-위치에 있다.
R1 및 R2가 헤테로시클릭기 Y의 일부를 형성하는 구현예에서, Y는 피페라진이다.
Y는:
일 수 있다.
Y가 피페라진일 때, P는 -C(=0)로 치환된 C1-C15 알킬기일 수 있다. 구현예에서, P는 -C(=O)(CH2)6이다.
식 I에서, X는 -C=C-C(=O)OR4이고, 여기서 R4는 하나 이상의 O 원자로 임의로 치환된, 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이다.
구현예에서, R4는 C1-C6 알킬기이다.
구현예에서, R4는 -CH3, -C(CH3)3 또는 -CH2CH(CH3)2이다.
임의로, R1 및 R2는 헤테로시클릭기 Y를 형성하지 않는다. 이러한 구현예에서, R1은 H 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이고; R2는 P-Z이고, 여기서 P는 N 원자, -C=0, 및 -NHC=O 중 하나 이상으로 임의로 치환된, 1 내지 15개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이고;
Z는:
이고,
여기서 R3는 H, C1-C9 알킬, -CH2OH, -CH2OCH3, -Ph, -C6H4OH, -CH(CH3)OH, -C(CH2COOH)2OH, -C(=O)CH3, -CH2NH2, -CH2NH(C=O)CH2NH2, 또는 -CH2NH(C=O)CH2NH(C=O)CH2NH2이다. 이러한 구현예에서, R1은 C1-C3 알킬일 수 있다. 구현예에서, R1은 -CH3이다.
R2가 P-Z일 때, P는 -NHC(=0)로 치환된 C1-C15 알킬일 수 있다.
구현예에서, P는 -(CH2)5NHC(=O)(CH2)6이다.
구현예에서, R4는 -(CH2CH2O)nCH3이고, 여기서 n은 1 내지 8 사이의 정수이다. 구현예에서, R4는 -(CH2CH2O)3CH3이다.
구현예에서, R4는 -(CH2CH2O)nCH3이고, 여기서 n은 1 내지 8 사이의 정수이고, 바람직하게 R4는 -(CH2CH2O)3CH3이고, R1 및 R2는 헤테로시클릭기를 형성하지 않는다.
구현예에서, 식 I의 화합물은 화합물 92, 93, 101 및 102로부터 선택된다:
본 발명에 따른 화합물은 본질적으로 형광성이다. 본 발명에 따르면, 상기 화합물은 형광 이미징에 사용될 수 있다.
측면에서, 본 발명은 상기 화합물이 빛에 의하여 활성화될 때 활성 산소종(ROS)의 생성에서 식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.
삼중항 상태 광감작제(photosensitizers (PS))는 전형적으로 광-수확(light-harvesting) 영역을 포함하고, 이는 일중항 상태의 전자가 삼중항 상태로 비-방사적으로 넘어가는 경우, 광-수확 및 항간 교차(intersystem crossing)의 이중 기능의 원인이다. 삼중항 여기 상태의 퀀칭(quenching)은 활성 산소종(ROS), 기저 상태 분자 산소로부터 라디칼의 형성, 또는 주위 분자와 직접적인 화학 반응을 초래할 수 있다. 국소화된 ROS 생성은 병원균 공격에 대하여 동물 및 식물 시스템 모두에서 사용되는 면역 방어 전략이다. 동물, 식물, 진균 및 세균 세포 내에서, ROS는 그들의 생성 속도 및 정도에 따라 다양한 조절 효과를 유발하고; 고농도에서 세포자연사(apoptosis)가 관찰되는 반면, 저농도에서, 자극 반응이 종종 관찰된다 (Guo et al. Stem Cells Dev. 2010, 19, 1321-1331).
광역학 요법(Photodynamic therapy (PDT))은 광감작제가 ROS를 생성하는, 전형적으로 암 세포, 병원성 미생물 및/또는 원치 않는 조직을 세포자연사에 의하여 파괴시키는 능력을 이용한다. 전형적으로, 광감작제 화합물은 특정 표적 조직 또는 상태 (예를 들어, 미생물 감염, 신생물(neoplasias), 종양 등) 근처/내부에서 여기되어, 다량의 ROS 생성 후 그 조직의 파괴를 야기한다. 낮은 수준의 ROS에서, 세포 증식이 유발되어, 상처 치유 또는 더 일반적인 조직 재생 요법에 적용으로 이어질 수 있다.
따라서, PDT는 광감작 화합물을 표적화하여 병적 조직의 세포와 같은 원하는 위치 내 축적, 및 국소적으로 광을 전달하여 ROS 생성을 활성화하는 것에 의존한다. PDT에 사용하기 위한 화합물은 공지되어 있으나, 이는 종종, 특히 광 침투가 달성되기 어려운 경우 부피가 큰 종양에 대하여, 광 활성화에서 어려움을 야기하는, 작은 흡광 피크; 연장된 기간의 후-처리에 대하여 피부 광과민증(photosensitivity)을 초래하는, 긴 생물학적 반감기; 좋지 않은 수 용해도와 같은 좋지 않은 약리학적 특성; 및 좋지 않은 표적화 능력 (즉, 상당한 오프-타겟 손상을 초래하는, 좋지 않은 특정 조직 또는 세포 내 표적화 및 축적 능력)을 포함하는, 다양한 불리점을 겪는다.
유리하게, 본 발명의 화합물은 비활성화 상태에서 생물학적으로 불활성이나, 중저 에너지 단파장 가시광선으로 조사될 때 ROS를 생성한다.
따라서, 식 I의 화합물은 활성 산소종(ROS)를 생성하여 세포 발달을 조절, 세포 증식, 분화 및 자연사를 조절하는데 사용되어, 다양한 치료 및 비-치료 용도로 이어질 수 있다. 상기 식 I의 화합물은 더 적은 오프-타겟 효과로 이어질 수 있는 효율적인 표적화를 보이므로, ROS의 조절에 의하여 중재되는 적용에 사용하기에 특히 유리하다. 이는 또한 상이한 세포 유형에 조정되어, 선택적인 표적화 효과 달성을 허용한다.
따라서, 측면에서, 본 발명은 광역학 요법(PDT)에서 본 발명의 화합물 또는 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
ROS의 생성은, 예를 들어, 세포 제거를 위한 자연사 유도, 상처 치료에서 증식 야기, 또는 이의 조합에 의한, 치료적 필요성에 근거하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 상처 치료에서, 높은 수준의 ROS가 먼저 작동되어 세균 및/또는 진균 세포의 자연사를 초래한 후, 낮은 수준의 ROS가 피부 재생을 보조할 수 있을 것이다.
본 발명은 따라서, HDAC 억제로부터 이익을 받는 질환 또는 상태의 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 환자에서 치료적으로 효과적인 양의 식 I의 화합물 또는 그의 컨쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 식 I의 화합물은 생체 내에서 그의 활성 형태로 대사된다.
일 측면에서, 본 발명은, 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, 식 I의 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
유리하게, 식 I의 화합물은 에스테르로서 보호되고, 이는 상기 화합물에 안정성을 부여한다. 보호된 화합물은 더 용이하게 저장된다. 보호된 화합물은 개선된 용해도를 나타낸다. 상기 화합물의 활성화는 보호기의 제거를 수반한다.
본 발명의 일 측면은 식 I의 화합물을 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 식 I의 화합물의 탈보호 방법에 관한 것이다.
상기 효소는 내생 효소일 수 있다. 적합한 탈보호 효소는, 이에 제한되지 않으나, 리파아제, 락타아제, 에스테라아제, 아밀라아제, 시토크롬 P405s, 글리코시다아제, 예를 들어, 베타-글루코로니다아제, 수크라아제 및 히알루로니다아제, 펩티다아제, 포스파타아제, 설파타아제를 포함한다.
구현예에서, 상기 효소는 라파아제 또는 락타아제이다.
유리하게, 상기 에스테르 보호기는 효소적 제거를 통하여 표적 조직 내에서만 HDAC 억제의 활성화를 허용하도록 선택될 수 있다, 즉 상기 보호기는 효소적 제거가 관심 세포, 조직 또는 신체 부위, 즉 상보적 효소를 함유하는 세포, 조직 또는 신체 부위 내에서만 일어나도록 선택될 수 있다. 상기 보호기는 당업자에게 의하여 이해되는 바와 같이, 반감기, 용해도, 표적화 등과 같은 특징을 조절하여, 표적 조직의 특징에 맞도록 더 조정될 수 있다.
적합한 보호기는, 이에 제한되지 않으나: 아세테이트 (C1-C9) 에스테르, 히드록시아세테이트 (C1-C9) 에스테르, 메톡시아세테이트 (C1-C9) 에스테르, 페닐아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 살리실레이트, 피루베이트, 락테이트 에스테르, 시트레이트 에스테르, PEG 에스테르, 글리세롤 에스테르, 펩타이드 에스테르, 예를 들어, 모노-, 디- 및 트리글리신 에스테르, 포스페이트 에스테르, 술포네이트 에스테르, 카보네이트, 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, O-글리코실 에테르, O-글리코실 에스테르를 포함한다.
구현예에서, 상기 보호기는 아세테이트 (C1-C9) 에스테르이다. 상기 에스테르 보호기가 C1 아세테이트 에스테르일 때, 식 I의 화합물 내 R3는 -CH3이다.
본 발명의 측면에 따르면, 식 I의 화합물을 용매의 존재하에 염기와 반응시키는 단계를 포함하는, 식 I의 화합물의 탈보호 방법이 제공된다.
본 발명의 방법에 사용하기 적합한 염기는 NaOH, LiOH, KOH, Li2CO3, Na2CO3, K2CO3, Cs2CO3, LiOMe, NaOMe, KOMe, LiOEt, NaOEt, KOEt, LiO t Bu 및 KO t Bu를 포함한다.
상기 용매는 극성 용매일 수 있다. 적합한 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, n-알코올, iso-알코올, iso-.부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올, 물, 테트라하이드로퓨란, 1,4-디옥산, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 및 디메틸 술폭사이드를 포함한다.
상기 방법은 5 내지 100℃, 또는 15 내지 30℃에서 수행될 수 있다. 유리하게, 상기 방법은 실온에서 수행될 수 있다.
상기 반응은 30분 내지 48시간 동안 수행될 수 있다. 구현예에서, 상기 반응은 1 내지 12시간, 또는 2 내지 7시간 동안 수행된다.
일단 반응이 일어나면, 반응 혼합물을 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 워크업할 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물을 희석하고 조합된 유기물을 세척 및 건조하고 증발시켜 조(crude) 고체로서 탈보호된 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명은 따라서 보호된 HDAC 억제제에 관한 것으로, 그 예는 다음 화합물을 포함한다:
구현예에서, 상기 보호된 HDAC 억제제는 화합물 92, 화합물 93, 화합물 101 또는 화합물 102이다.
구현예에서, 상기 보호된 HDAC 억제제는 화합물 92, 화합물 93, 또는 화합물 101이다.
대조 화합물로서 사용 가능한 관련 화합물은 다음 화합물 12, 13 및 14를 포함한다:
본 발명의 일 측면은 식 I의 화합물의 탈보호 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 식 I의 화합물을 용매의 존재하에 염기와 반응시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 임의로 정제 단계를 포함한다.
본 발명은 에스테르로서 HDAC 억제제를 보호하고 에스테라아제를 이용하여 에스테르를 제거하여 HDAC 억제를 활성화하는 방법에 관한 것이다. 상기 에스테라아제는 내생 에스테라아제일 수 있다. 에스테라아제를 이용하여 에스테르의 제거는 생체 내에서(in vivo) 수행될 수 있다.
본 발명은 HDAC 억제에 의하여 중재되는 질환 또는 상태의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기재된 보호된 HDAC 억제제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 HDAC 억제제는 그 후 원 위치에서(in situ) 탈보호된다.
식 I의 화합물은 유리하게, 그의 탈보호된 대응물에 비하여, 증가된 용해도, 개선된 화학적 및 저장 안정성 및 제조 용이성을 나타낸다 (도 1).
본 발명은 보호된 HDAC 억제제, 특히 보호된 히드록삼산을 제공한다. 본 발명은 개선된 안정성을 나타낼 수 있는 보호된 HDAC 억제제를 제공한다. 본 발명은 개선된 용해도를 나타낼 수 있는 보호된 HDAC 억제제를 제공한다.
실시예:
본 발명을 첨부 도면을 참조로 하여 예시로서만 기재할 것이며, 여기서
도 1은 본 발명을 개략적으로 도시하며, PG는 보호기를 나타내고;
도 2는 아세테이트-보호된 히드록삼산(88)의 예시적 합성을 도시하고;
도 3은 본 발명에 따른 광-활성화된 세포-사멸 활성을 가지는 보호된 HDAC 억제제(92)의 예시적 합성을 도시하고;
도 4는 본 발명에 따른 광-활성화된 세포-사멸 활성을 가지는 대안적인 보호된 HDAC 억제제(93)의 예시적 합성을 도시하고;
도 5는 빌딩 블록 화합물(96)의 합성을 도시하고;
도 6은 빌딩 블록 화합물(99)의 합성을 도시하고;
도 7은 광-활성화된 화합물(100)의 합성을 도시하고;
도 8은 예시적 화합물(101)의 합성을 도시하고;
도 9는 조사와 함께 또는 조사 없이 화합물 92로 처리에 대한 HaCaT 각질 형성 세포(keratinocytes)의 생존률을 측정하는 플루오레세인 디아세테이트 세포 생존률 분석의 결과를 도시하고;
도 10은 화합물 92 및 EtOH로 처리되고, 아세틸화된 H3 히스톤의 존재하에 검출되는 항-아세틸-H3 1차 항체로 동시-처리된 HaCaT 각질 형성 세포의 면역형광 이미징을 도시하고;
도 11은 본 발명에 따른 화합물 93으로, 및 대조 화합물로 처리 15분 및 1시간 후 SCC-4 세포 내 아세틸-H3의 존재량을 도시하고;
도 12는 본 발명에 따른 화합물 93 및 화합물 101로, 및 대조 화합물로 처리 1시간 후 SCC-4 세포 내 아세틸-H3의 존재량을 도시하고;
도 13은 본 발명에 따른 화합물 92로, 및 대조 화합물로 처리 15분 후 SCC-4 세포 내 아세틸-H3의 존재량을 도시하고;
도 14는 광활성화 전후 50 nM 화합물 93 및 100 nM 화합물 93, vs 대조 화합물로 처리 후 HaCaT 세포 내 카스파제(caspase)-3의 발현 수준을 도시하고;
도 15는 화합물 101의 동시-국소화(co-localisation)를 나타내는 형광 현미경 사진이고;
도 16은 화합물 93의 동시-국소화를 나타내는 형광 현미경 사진이고;
도 17은 화합물 93의 예시적 탈보호를 도시한다.
본 발명을 첨부 도면을 참조로 하여 예시로서만 기재할 것이며, 여기서
도 1은 본 발명을 개략적으로 도시하며, PG는 보호기를 나타내고;
도 2는 아세테이트-보호된 히드록삼산(88)의 예시적 합성을 도시하고;
도 3은 본 발명에 따른 광-활성화된 세포-사멸 활성을 가지는 보호된 HDAC 억제제(92)의 예시적 합성을 도시하고;
도 4는 본 발명에 따른 광-활성화된 세포-사멸 활성을 가지는 대안적인 보호된 HDAC 억제제(93)의 예시적 합성을 도시하고;
도 5는 빌딩 블록 화합물(96)의 합성을 도시하고;
도 6은 빌딩 블록 화합물(99)의 합성을 도시하고;
도 7은 광-활성화된 화합물(100)의 합성을 도시하고;
도 8은 예시적 화합물(101)의 합성을 도시하고;
도 9는 조사와 함께 또는 조사 없이 화합물 92로 처리에 대한 HaCaT 각질 형성 세포(keratinocytes)의 생존률을 측정하는 플루오레세인 디아세테이트 세포 생존률 분석의 결과를 도시하고;
도 10은 화합물 92 및 EtOH로 처리되고, 아세틸화된 H3 히스톤의 존재하에 검출되는 항-아세틸-H3 1차 항체로 동시-처리된 HaCaT 각질 형성 세포의 면역형광 이미징을 도시하고;
도 11은 본 발명에 따른 화합물 93으로, 및 대조 화합물로 처리 15분 및 1시간 후 SCC-4 세포 내 아세틸-H3의 존재량을 도시하고;
도 12는 본 발명에 따른 화합물 93 및 화합물 101로, 및 대조 화합물로 처리 1시간 후 SCC-4 세포 내 아세틸-H3의 존재량을 도시하고;
도 13은 본 발명에 따른 화합물 92로, 및 대조 화합물로 처리 15분 후 SCC-4 세포 내 아세틸-H3의 존재량을 도시하고;
도 14는 광활성화 전후 50 nM 화합물 93 및 100 nM 화합물 93, vs 대조 화합물로 처리 후 HaCaT 세포 내 카스파제(caspase)-3의 발현 수준을 도시하고;
도 15는 화합물 101의 동시-국소화(co-localisation)를 나타내는 형광 현미경 사진이고;
도 16은 화합물 93의 동시-국소화를 나타내는 형광 현미경 사진이고;
도 17은 화합물 93의 예시적 탈보호를 도시한다.
실험예:
일반 방법론:
모든 광 조사를 5분에 걸쳐 405 nm에서 29 mW/cm2의 파워로 빛을 방출하는 수정된 PhotoReact 365TM를 사용하여 수행하였다. 모든 이미지 분석을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, 모든 곡선을 Prism을 이용하여 작성하였다.
세포 생존률 분석:
불투명-벽의 96-웰 플레이트를 웰당 20,000 SCC-4 세포로 시딩하였다. 다음 날, 플레이트를 "광" 처리된 플레이트의 조사 전 1시간 동안 농도 (100 pM - 1 μM) 범위의 관심 화합물로 처리하였다. 다음 날, 플레이트를 다음 중 하나로 처리하였다:
·10분 동안 프로피듐 아이오다이드(PI) 및 플루오레세인 디아세테이트(FDA)로 처리 후, 형광을 PI에 대하여 535/617 nm에서 FDA에 대하여 485/520 nm에서 측정하기 전에 PBS 내에 세척.
·오비탈 쉐이커 상에서 DMSO 내에 용해하고 540 nm에서 흡광도를 측정하기 전 2시간 동안 12 mM MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 용액으로 처리.
·PBS로 세척하고 650 nm에서 흡광도를 측정하기 전 4시간 동안 XTT (2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카르복스아닐리드) 표지 시약 및 전자 커플링 시약으로 처리.
·루미네선스(luminescence) 측정 전 오비탈 쉐이커 상에서 50분 동안 CellTitre-GloTM 시약으로 처리하여 세포 용해.
현미경 검사 절차:
동시-국소화(co-localisation)
SCC-4 세포를 8-웰 체임버 슬라이드 상에 웰 당 50,000 세포로 시딩하고 다음날 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정 또는 라이브 셀 이미징 용액에 대한 배지 교체 전 1시간 동안 관심 화합물 1 μM로 처리하였다. Zeiss LSCM 880 상에서 이미징하기 전에 동시-염색제(co-stains) (예를 들어, MitoTracker, Bodipy ER Tracker 또는 LipidSpot 610)를 적용하였다.
면역형광법
HaCaT 또는 SCC-4 세포를 6-웰 플레이트를 함유하는 살균 커버슬립 내에 웰 당 50,000 세포로 시딩하였다. 다음 날, 세포를 30분 동안 관심 화합물로 처리한 후, "광" 처리된 세포에 조사하였다. 다음 날, 세포를 4% PFA를 사용하여 고정하고, Triton X-100/Twenn 20을 사용하여 투과화시키고, (항체에 따라) BSA/염소 혈청 내에서 블록킹하고, 1차 다음 2차 항체로 염색한 후, 커버슬립을 슬라이드 상에 탑재하고 Zeiss LSCM 880 상에서 이미징하였다.
면역침강법
SCC-4 세포를 6-웰 플레이트의 웰 당 350,000 세포로 시딩하고, 다음날, 세포를 관심 화합물로 처리하였다. 요구되는 인큐베이션 후, "광" 처리 세포를 조사하고 모든 세포를 RIPA 완충액을 사용하여 용해시켰다. SDS-PAGE를 수행하고, 단백질을 니트로셀룰로오스/PVDF 막 상으로 옮긴 후, 블록킹 및 1차 다음 2차 항체 염색하였다. 화학 루미네선스(chemiluminescence) 신호를 iBright 이미징 시스템을 사용하여 이미징하였다.
실시예 1: 아세테이트-보호된 히드록삼산, 88의 합성
예시적 아세테이트-보호된 히드록삼산, 88의 합성을 도 2에 도시하고, 아래 실시예 1.1 내지 1.4에 더 기재한다.
실시예 1.1
1-
Tert
-부틸 8-메틸 옥탄디오에이트, 85의 합성
화합물 47 (33.0 g, 175 mmol)을 tert-부탄올 (250 mL) 내에 용해하고 0℃로 냉각하고, 디-tert-부틸 디카보네이트 (57.3 g, 262.5 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (6.4 g, 52.5 mmol)을 이에 첨가하고 결과 현탁액을 2시간 동안 RT에서 빠르게 교반하였다. 상기 용액을 5% HCl로 희석하고 디클로로메탄 (DCM)으로 추출하였다 (3x). 유기물을 sat. NH4Cl 및 H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 적색 오일(58.9 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트(EtOAc)), 9:1)에 의하여 정제하여 화합물 85를 무색 오일로서 얻었다 (29.06 g, 68%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.28 - 1.35 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.54 - 1.65 (m, 4H), 2.19 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.65 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 24.7, 24.9, 28.1, 28.7, 28.8, 34.0, 35.5, 51.4, 79.9, 173.1, 174.2.
실시예 1.2
Tert-부틸-7-(히드록시카르바모일)헵타노에이트, 86의 합성
화합물 85 (6.1 g, 25.0 mmol)를 메탄올 (MeOH) (21 mL) 내에 용해하고, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔 (DBU) (11.2 mL, 75.0 mmol) 및 히드록시아민 (NH2OH ) (50% aq., 15.3 mL, 250 mmol)을 이에 첨가하고, 결과 용액을 실온 (RT)에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄 (DCM)으로 희석하고 유기물을 NH4Cl 및 H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 노란색 오일 (3.23 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올, 9:1)에 의하여 정제하여 화합물 86을 무색 오일로서 얻었다 (2.34 g, 38%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.26 - 1.37 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.52 - 1.68 (m, 4H), 2.14 (s, 2H), 2.19 (t, J = 6.9 Hz, 2H).
실시예 1.3
Tert-부틸 7-[(아세틸옥시)카르바모일]헵타노에이트, 87의 합성
화합물 86 (2.3 g, 9.37 mmol)을 디클로로메탄 (40 mL) 내에 용해하고, 아세틸 클로라이드 (0.8 mL, 11.24 mmol) 및 트리에틸아민 (1.56 mL, 11.24 mmol)을 이에 첨가하고, 결과 용액을 실온 (RT)에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 유기물을 NH4Cl 및 H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 노란색 오일 (2.75 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올, 9:1)에 의하여 정제하여 화합물 87을 무색 오일로서 얻었다 (1.65 g, 61%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.24 - 1.37 (m, 4H), 1.39 (s, 9H), 1.48 - 1.58 (m, 2H), 1.59 - 1.69 (m, 2H), 2.13 - 2.19 (m, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.18 - 2.23 (m, 2H), 9.64 (s, 1H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 18.2, 24.7, 28.0, 28.4, 28.5, 32.6, 35.3, 80.1, 168.7, 173.3; MS(ES): m/z = 288.2 [M+H]+; HRMS (ES) calcd. for C14H26NO5 [M+H]+: 288.1805, found 288.1801.
실시예 1.4
7-[(아세틸옥시)카르바모일]헵탄산, 88의 합성
화합물 87 (1.65 g, 5.74 mmol)을 디클로로메탄 (60 mL) 내에 용해하고, 트리플루오로아세트산 (TFA) (5 mL, 65 mmol)을 이에 첨가하고, 결과 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 증발시키고, 조(crude) 잔사를 SiO2 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올, 95:5)에 의하여 정제하여 화합물 88을 백색 고체로서 얻었다 (1.10 g, 83%): 1H NMR (700 MHz, DMSO-d 6) δ 1.23 - 1.28 (m, 4H), 1.45 - 1.52 (m, 4H), 2.09 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.18 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 11.53 (br, 1H), 11.95 (br, 1H); 13C NMR (176 MHz, DMSO-d 6) δ 18.1, 24.3, 24.6, 28.1, 28.2, 31.8, 33.6, 168.5, 169.7, 174.4; MS(ES): m/z = 232.1 [M+H]+; HRMS (ES) calcd. for C10H18NO5 [M+H]+: 232.1179, found 232.1167.
실시예 2: 보호된 HDAC 억제제, 92의 합성
광-활성화 세포-사멸 활성을 가지는 예시적 보호된 HDAC 억제제, 92의 합성을 도 3에 도시하고 다음 실시예 2.1 내지 2.4에 더 기재한다.
실시예 2.1:
Tert-부틸 4-(5-브로모-1,3-티아졸-2-일)피페라진-1-카르복실레이트, 89의 합성
2.5-디브로모-1,3-티아졸 (10 g, 41.2 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) (100 mL) 내에 용해하고, 1-Boc-피페라진 (10 g, 53.5 mmol) 및 K2CO3 (7.40 g, 53.5 mmol)을 이에 첨가하고, 결과 용액을 70℃에서 72시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 냉각하고, H2O로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기물을 H2O 및 염수(brine)로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 오일을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피(페트롤리움 에테르/에틸 아세테이트, 8:2)로 정제하여 화합물 89를 연한 노란색 고체로서 얻었다 (10.5 g, 74%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.46 (s, 9H), 3.38 - 3.41 (m, 4H), 3.52 - 3.55 (m, 4H), 7.06 (s, 1H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 28.3, 48.0, 80.4, 95.2, 140.4, 154.5, 171.5.
실시예 2.2:
1-(5-브로모-1,3-티아졸-2-일)피페라진, 90의 합성
화합물 89 (10.45 g, 30.0 mmol)를 디클로로메탄 (100 mL) 내에 용해하고, 트리플루오로아세트산 (9.2 mL, 120.0 mmol)을 이에 첨가하고 결과 용액을 RT에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 증발시켜 조(crude) 노란색 오일 (23 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올, 95:5)에 의하여 정제하여 원하는 화합물의 트리플루오로아세트산 염 (10.7 g)을 얻었다. 그 후, 이를 디클로로메탄 내에 용해하고 sat. NaHCO3와 0.5시간 동안 빠르게 교반하였다. 유기물을 H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 화합물 90을 백색 고체로서 얻었다 (6.15 g, 83%): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 2.73 - 2.77 (m, 4H), 3.24 - 3.27 (m, 4H), 7.18 (s, 1H); MS(ES): m/z = 248.0, 250.0 [M + H]+; HRMS (ES) calcd for C7H11N3SBr [M + H]+: 247.9852, found 247.9850.
실시예 2.3
메틸 2(
E)
-3-(5-{2-[2-(피페라진-1-일)-1,3-티아졸-5-일]에티닐}피리딘-2-일)프로프-2-에노에이트, 91의 합성
트리에틸아민 (Et3N)(200 mL)을 Ar로 1시간 동안 스파징(sparging)하여 탈기시켰다. 그 다음, 화합물 90 (2.80 g, 11.3 mmol), 화합물 42 (2.32 g, 12.41 mmol), Pd(PPh3)2Cl2 (390 mg, 0.18 mmol) 및 CuI (107 mg, 0.18 mmol)을 Ar 하에 첨가하고, 결과 현탁액을 60℃에서 72시간 동안 교반하였다. 그 다음, 상기 용액을 증발시켜 조(crude) 고체를 얻었고, 이를 SiO2 크로마토그래피 (95:5 내지 9:1, 디클로로메탄/메탄올, 1% 트리에틸아민)으로 2회 정제하여 화합물 91을 밝은 오렌지색 고체로서 얻었다 (2.28 g, 57%): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 2.75 - 2.82 (m, 4H), 3.35 - 3.41 (m, 4H), 3.75 (s, 3H), 6.91 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.69 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 8.72 (dd, J = 2.2, 0.9 Hz, 1H); MS (ES) m/z = 355.1 [M+H]+; HRMS (ES) calcd. for C18H19N4O2S [M+H]+: 355.1223, found 355.1223.
실시예 2.4:
메틸 (2E)-3-(5-{2-[2-(4-{7-[(아세틸옥시)카르바모일]헵타노일}피페라진-1-일)-1,3-티아졸-5-일]에티닐}피리딘-2-일)프로피-2-에노에이트, 92의 합성
화합물 88 (0.39 g, 1.69 mmol) 및 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진 (0.32 g, 1.85 mmol)을 0℃에서 디클로로메탄 (30 mL) 내에 용해하고, 4-메틸모르폴린 (0.20 mL, 1.85 mmol)을 5분에 걸쳐 이에 적가하였다. 결과 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 화합물 91 (0.5 g, 1.41 mmol) 및 4-메틸모르폴린 (0.19 mL, 1.68 mmol)을 이에 첨가하고, 상기 혼합물을 RT에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 노란색 오일 (1.7 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (99:1, 디클로로메탄/메탄올)로 정제하고, 아세토니트릴 (MeCN)로부터 더 재결정화하여 화합물 92를 노란색 고체로서 얻었다 (0.53 g, 66%): 1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.35 - 1.44 (m, 4H), 1.64 - 1.68 (m, 2H), 1.69 - 1.73 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 2.26 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.39 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.50 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.58 - 3.65 (m, 4H), 3.78 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 6.93 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 8.2, 0.9 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.66 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1H), 8.69 (dd, J = 2.1, 0.8 Hz, 1H), 9.32 (s, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 18.3, 24.7, 28.1, 28.3, 32.5, 32.8, 40.6, 44.7, 48.0, 48.4, 51.9, 85.4, 91.2, 106.6, 120.7, 122.5, 123.5, 138.3, 142.7, 146.0, 151.3, 151.9, 167.1, 171.5, 171.8; MS(ES): m/z = 568.2 [M+H]+; HRMS (ES) calcd for C28H34N5O6S [M+H]+: 568.2224, found 568.2220.
실시예 3: 보호된 HDAC 억제제, 93의 합성
Tert-부틸 (2E)-3-(5-{2-[4-(4-{7-[(아세틸옥시)카르바모일]헵타노일}피페라진-1-일)페닐]에티닐}티오펜-2-일)프로프-2-에노에이트, 93의 합성을 도 4에 도시하고, 아래 상세히 기재한다.
화합물 88 (2.89 g, 12.5 mmol) 및 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진 (2.39 g, 13.6 mmol)을 0℃에서 디클로로메탄 (100 mL) 내에 용해하고, 4-메틸모르폴린 (1.5 mL, 13.6 mmol)을 5분에 걸쳐 이에 적가하였다. 결과 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 화합물 27 (4.11 g, 10.41 mmol) 및 4-메틸모르폴린 (1.36 mL, 12.4 mmol)을 이에 첨가하고, 상기 혼합물을 RT에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 노란색 오일 (1.7 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (97:3, 디클로로메탄/메탄올)로 정제하고, 아세토니트릴로부터 더 재결정화하여 화합물 93을 노란색 고체로서 얻었다 (2.51 g, 40%): 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 1.32 - 1.45 (m, 4H), 1.50 (s, 9H), 1.63 (p, J = 7.1 Hz, 2H), 1.69 (p, J = 7.1 Hz, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.25 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.21 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.24 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.55 - 3.66 (m, 2H), 3.75 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 6.11 (dd, J = 15.6, 1.1 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.03 - 7.14 (m, 2H), 7.36 - 7.44 (m, 2H), 7.58 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 9.91 (s, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 18.3, 24.8, 28.1, 28.2, 28.4, 32.4, 32.7, 41.1, 45.2, 48.1, 48.4, 53.4, 80.6, 81.3, 96.0, 112.9, 115.3, 119.2, 126.1, 130.6, 132.0, 132.7, 135.4, 140.2, 150.6, 165.9, 168.7, 171.8.
실시예 4. 빌딩 블록 화합물, 96의 합성
N-(5-아미노펜틸)-4-아이오도-N-메틸아닐린, 96의 합성을 도 5에 도시하고 아래 상세히 기재한다.
실시예 4.1:
5-클로로-
N
-(4-아이오도페닐)-
N
-메틸펩탄아미드, 94의 합성
N-메틸-4-아이오도아닐린 (24.04 g, 103 mmol)을 디클로로메탄 (300 mL) 내에 용해하고, 상기 용액을 0℃로 냉각하였다. 5-클로로발레릴 클로라이드 (14.6 mL, 113.3 mmol), 그 다음 피리딘 (9.16 mL, 113.3 mmol)을 첨가하고, 결과 용액을 RT에서 16시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 디클로로메탄으로 희석하고 유기물을 sat. NH4Cl 및 H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 갈색 오일 (40 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (7:3 시클로헥산/에틸 아세테이트)에 의하여 정제하여 화합물 94를 노란색 오일로서 얻었다 (35.16 g, 97%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.57 - 1.79 (m, 4H), 1.98 - 2.19 (m, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.35 - 3.52 (m, 2H), 6.93 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
실시예 4.2:
5-아지도-
N
-(4-아이오도페닐)-
N
-메틸펜탄아미드, 95의 합성
화합물 94 (35.0 g, 99.5 mmol)를 N,N-디메틸포름아미드 (200 mL) 내에 용해하고, 소듐 아지드 (13.53 g, 208.95 mmol)를 첨가하고, 상기 용액을 80℃에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액을 냉각하고, H2O로 희석한 다음, EtOAc로 추출하였다. 유기물을 H2O 및 염수로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 오렌지색 오일 (37.6 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (7:3 시클로헥산/에틸 아세테이트)에 의하여 정제하여 화합물 95를 오렌지색 오일로서 얻었다 (33.4 g, 94%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.45 - 1.59 (m, 2H), 1.61 - 1.69 (m, 2H), 1.91 - 2.20 (m, 2H), 3.10 - 3.36 (m, 5H), 6.85 - 7.02 (m, 2H), 7.67 - 7.84 (m, 2H).
실시예 4.3:
N
-(5-아미노펜틸)-4-아이오도-
N
-메틸아닐린,96의 합성
화합물 95 (5.24 g, 14.6 mmol)을 톨루엔 (80 mL) 및 BH3 내에 용해하였다. Me2S (톨루엔 내 2.0 M, 16.8 mL, 33.6 mmol)을 첨가하고, 상기 용액을 환류에서 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 냉각한 다음, 10% w/v aq. Na2CO3와 0.5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기물을 H2O 및 염수로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 노란색 오일 (4.21 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (9:1 디클로로메탄/메탄올, 2% 트리에틸아민)에 의하여 정제하여 화합물 96을 투명한 오일로서 얻었으며, 이를 다음 단계로 즉시 운반하였다 (1.76 g, 38%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.28 - 1.39 (m, 2H), 1.43 - 1.53 (m, 2H), 1.53 - 1.61 (m, 2H), 1.97 (s, 2H), 2.70 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.88 (s, 3H), 3.21 - 3.32 (m, 2H), 6.41 - 6.47 (m, 2H), 7.39 - 7.46 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 24.3, 26.4, 33.1, 38.2, 41.9, 52.5, 76.4, 114.3, 137.6, 148.7.
실시예 5: 빌딩 블록 화합물, 99의 합성
2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸 (2E)-3-(5-에티닐티오펜-2-일)프로프-2-에노에이트의 합성을 도 6에 도시하고, 아래 상세히 기재한다.
실시예 5.1:
5-아이오도티오펜-2-카르발데히드, 24의 합성
50℃에서 에탄올 (50 mL) 내 2-티오펜카르복스알데히드 (9.34 mL, 100.0 mmol)의 용액에 N-아이오도숙신이미드 (24.75 g, 110.0 mmol) 및 para-톨루엔술폰산 모노하이드레이트 (1.90 g, 10.0 mmol)를 첨가하고, 결과 용액을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 1.0 M HCl (80 mL)를 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, sat. Na2S2O3, H2O 및 염수로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 화합물 24를 천천히 결정화하는 노란색 오일로서 얻었다 (25.26 g, >100%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.39 (s, 2H), 9.77 (s, 1H).
실시예 5.2:
5-[2-(트리메틸실릴)에티닐]티오펜-2-카르발데히드, 97의 합성
트리에틸아민 (300 mL)을 1시간 동안 아르곤으로 스파징하여 탈기시켰다. 그 다음, 화합물 24 (25 g, 105 mmol), 트리메틸실릴아세틸렌 (16.0 mL, 115.5 mmol), Pd(PPh3)2Cl2 (740 mg, 1.05 mmol) 및 CuI (200 mg, 1.05 mmol)를 아르곤 하에 첨가하고, 결과 현탁액을 RT에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 디에틸에테르로 희석하고 셀라이트/SiO2를 통과시켜 조(crude) 갈색 오일 (17.7 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피에 의하여 정제하여 화합물 97을 천천히 결정화하는 오렌지색 오일로서 얻었다 (12.79 g, 58%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.25 (s, 9H), 7.24 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 9.83 (s, 1H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ -0.5, 26.9, 96.3, 104.6, 132.5, 133.1, 135.7, 143.8, 182.4; IR (ATR) v max/cm-1 2960w, 2899w, 2833w, 2148m, 1666s, 1438s, 1249s, 1223s, 1207s, 838s; MS (ES) m/z = 209.0 [M+H]+; HRMS (ES) calcd. for C10H13SOSi [M+H]+: 209.0451, found 209.0454.
실시예 5.3:
메틸 (2E)-3-{5-[2-(트리메틸실릴)에티닐]티오펜-2-일}프로프-2-에노에이트, 98의 합성
트리메틸포스포노아세테이트 (14.0 mL, 86.4 mmol) 및 LiCl (3.66 g, 86.4 mmol)을 0℃에서 무수 테트라하이드로퓨란 (250 mL)에 첨가하고, 결과 용액을 15분 동안 교반하고, 화합물 97 (15.0 g, 72 mmol)을 이에 첨가하였다. 상기 용액에 1,6-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔 (12.9 mL, 86.4 mmol)을 서서히 첨가하고, 결과 슬러리를 RT에서 16시간 동안 교반하였다. 이를 쇄빙(crushed ice)에 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기물을 H2O 및 염수로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 갈색 오일 (21 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (9:1 시클로헥산/에틸 아세테이트)에 의하여 정제하여 화합물 98을 연한 노란색 고체로서 얻었다 (17.23 g, 91%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.24 (s, 9H), 3.78 (s, 3H), 6.19 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.05 - 7.14 (m, 2H), 7.67 (d, J = 15.7 Hz, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -0.3, 51.7, 97.0, 101.9, 117.3, 125.8, 130.6, 133.3, 136.5, 140.4, 166.9; IR (ATR) v max/cm-1 2953w, 2899w, 2144m, 1715s, 1621s, 1516w, 1432m, 1391w, 1301s, 1269s, 1202s, 1161s, 838s; MS(ES): m/z = 265.1 [M+H]+; HRMS (ES) calcd for C13H17O2SSi [M+H]+: 265.0713, found 265.0713.
실시예 5.4:
2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸 (2E)-3-(5-에티닐티오펜-2-일)프로프-2-에노에이트, 99의 합성
화합물 98 (13.03 g, 49.3 mmol)을 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 (50 mL) 내에 용해하고, 20% aq. w/v NaOH (1.3 mL)를 이에 첨가하였다. 결과 혼합물을 RT에서 16시간 동안 교반하고, 상기 용액을 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기물을 H2O 및 염수로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 다크 오일 (16 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (1:1 시클로헥산/에틸 아세테이트)에 의하여 정제하여 화합물 99를 빨리 어두워지는 노란색 오일로서 얻었다 (8.18 g, 51%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.36 (s, 3H), 3.46 (s, 1H), 3.50 - 3.56 (m, 2H), 3.61 - 3.69 (m, 6H), 3.72 - 3.79 (m, 2H), 4.26 - 4.38 (m, 2H), 6.24 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 15.7, 0.6 Hz, 1H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 59.0, 63.8, 69.1, 70.5, 70.6, 71.9, 83.7, 117.7, 124.6, 130.5, 133.8, 136.5, 140.8, 166.3; IR (ATR) v max/cm-1 3241br, 3089w, 2874br, 2098w, 1705s, 1622s, 1516m, 1445m, 1342m, 1301m, 1264s, 1165s, 1100s, 807s; MS(ES): m/z = 325.1 [M+H]+; HRMS (ES) calcd for C16H21O5S [M+H]+: 325.1104, found 325.1100.
실시예 6: 광-활성화된 화합물, 100의 합성
광-활성화된 화합물 100의 합성을 도 7에 도시하고 아래 상세히 기재한다.
2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸(2E)-3-[5-(2-{4-[(5-아미노펜틸)(메틸)아미노]페닐}에티닐)티오펜-2-일]프로프-2-에노에이트, 100의 합성
화합물 96 (1.70 g, 5.34 mmol) 및 화합물 99 (2.42 g, 7.48 mmol)를 트리에틸아민 (80 mL) 내에 용해하고, 상기 용액을 1시간 동안 아르곤으로 스파징하여 탈기시켰다. 그 다음, Pd(PPh3)2Cl2 (372 mg, 0.53 mmol) 및 CuI (100 mg, 0.53 mmol)를 아르곤 하에 첨가하고, 결과 현탁액을 60℃에서 72시간 동안 교반하였다. 결과 현탁액을 디클로로메탄으로 희석하고, sat. NaHCO3 및 물로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 다크 오일 (3.75 g)을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (95:5 디클로로메탄/메탄올, 1% 트리에틸아민)에 의하여 정제하여 화합물 100을 연한 오렌지색 고체로서 얻었다 (0.47 g, 17%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.32 - 1.41 (m, 2H), 1.54 - 1.64 (m, 4H), 2.81 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.95 (s, 3H), 3.30 - 3.35 (m, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.53 - 3.56 (m, 2H), 3.64 - 3.69 (m, 6H), 3.75 - 3.79 (m, 2H), 4.29 - 4.39 (m, 2H), 6.20 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 6.56 - 6.65 (m, 2H), 7.07 - 7.14 (m, 2H), 7.31 - 7.40 (m, 2H), 7.70 (dd, J = 15.7, 0.6 Hz, 1H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 24.2, 26.5, 31.0, 38.3, 41.1, 52.2, 59.0, 63.7, 69.2, 70.6, 70.6, 71.9, 80.6, 97.7, 108.3, 111.4, 116.4, 127.6, 131.3, 131.5, 132.8, 137.0, 139.4, 149.2, 166.7; IR (ATR) v max/cm-1 2925m, 2871m, 2189w, 1738m, 1712m, 1604s, 1530s, 1511m, 1376m, 1196m; MS(ASAP): m/z = 515.2 [M+H]+; HRMS (ASAP) calcd for C28H39N2O5S [M+H]+: 515.2574, found 515.2569.
실시예 7: 보호된 HDAC 억제제 화합물, 101의 합성
광-활성화 세포 사멸 활성을 가지는 보호된 HDAC 억제제 화합물 101의 합성을 도 8에 도시하고 아래 상세히 기재한다:
2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸(2E)-3-[5-(2-{4-[(5-{7-[(아세틸옥시)카르바모일]헵탄아미도}펜틸)(메틸)아미노]페닐}에티닐)티오펜-2-일]프로프-2-에노에이트, 101의 합성
화합물 100 (128 mg, 0.25 mmol)을 디클로로메탄 (10 mL) 내에 용해하고, 상기 용액을 0℃로 냉각하고, 4-메틸모르폴린 (0.055 mL, 0.5 mmol), 화합물 88 (76 mg, 0.33 mmol) 및 프로필포스폰산 무수물 (에틸 아세테이트 내 50% wt., 0.32 mL, 0.5 mmol)을 첨가하고, 결과 혼합물을 RT에서 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 노란색 오일을 얻었다. 이를 SiO2 크로마토그래피 (95:5, 디클로로메탄/메탄올)에 의하여 정제하여 화합물 101을 노란색 오일로서 얻었다 (141 mg, 77%): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.30 - 1.42 (m, 6H), 1.46 - 1.55 (m, 2H), 1.55 - 1.63 (m, 4H), 1.64 - 1.72 (m, 2H), 2.11 - 2.17 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.23 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.95 (s, 3H), 3.17 - 3.26 (m, 2H), 3.33 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.51 - 3.57 (m, 2H), 3.63 - 3.70 (m, 6H), 3.71 - 3.80 (m, 2H), 4.26 - 4.40 (m, 2H), 5.64 (s, 1H), 6.20 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 7.31 - 7.41 (m, 2H), 7.70 (dd, J = 15.7, 0.6 Hz, 1H), 9.55 (s, 1H);13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 18.3, 24.3, 24.7, 25.3, 26.5, 26.9, 28.0, 28.2, 29.5, 32.5, 36.2, 38.3, 39.3, 52.2, 53.4, 59.0, 63.7, 69.2, 70.5, 70.6, 70.6, 71.9, 77.0, 80.7, 97.6, 111.4, 116.4, 127.5, 131.3, 131.5, 132.8, 137.0, 139.4, 148.2, 166.7, 168.8, 173.3; IR (ATR) v max/cm-1 3304br, 2927m, 2860m, 2189m, 1708m, 1645m, 1619s, 1603s, 1529s, 1512m, 1367m, 1242m, 1193s, 1137s, 1110m, 852m; MS(ES): m/z = 728.3 [M+H]+; HRMS (ES) calcd for C38H54N3O9S [M+H]+: 728.3575, found 728.3578.
실시예 8: 플루오레세인 디아세테이트 세포 생존률 분석
조사(광) 없이 및 (광) 조사시 (광) 화합물 92 처리에 대한 HaCaT 각질 형성 세포의 생존률을 측정하는 플루오레세인 디아세테이트 세포 생존률 분석을 다음과 같이 수행하였다:
HaCaT 각질 형성 세포를 두 개의 96 웰 플레이트 내에 시딩하고 37℃ 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 배지를 제거하고, 디메틸 술폭사이드 (DMSO) 대조군과 함께 화합물 92를 다양한 농도로 첨가한 다음, 세포를 37℃ 5% CO2에서 1시간 인큐베이션하고, 하나의 플레이트를 5분 동안 405 nm으로 조사하였다 (72 mW/cm2). 그 다음, 두 플레이트를 모두 37℃ 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 세포를 1X 인산 완충 식염수(PBS)로 세척한 다음, 플루오레세인 디아세테이트(FDA)를 첨가하고, 세포를 어두운 곳에서 RT에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플루오레세인 디아세테이트 착색제(stain)를 제거하고, 세포를 1X 인산 완충 식염수로 세척하였다. 플레이트를 485/520 nm에서 판독하여 광 노출과 함께/없이 화합물 92의 다양한 처리 농도에서 세포 생존률을 결정하였다. 결과를 도 9에 나타내며, 이는 광 활성화가 낮은 농도에서 세포사를 야기함을 입증한다 (IC50 = 0.69 μM). 효소 대사에 대한 HDAC 억제 활성으로 인하여 세포 생존률은 광 활성화 없이 더 높은 농도에서 감소된다 (IC50 = 5.50 μM).
실시예 9: 면역형광 이미징
화합물 92 (5 μM) 및 에탄올 (EtOH)로 처리되고, 아세틸화된 H3 히스톤의 존재를 검출하는 항-아세틸-H3 1차 항체로 동시-처리된 HaCaT 각질 형성 세포의 면역형광 이미징을 다음과 같이 수행하였다:
50,000 HaCaT 세포를 커버슬립 상에 플레이팅하고 2일 동안 성장시킨 후, 화합물 92 (5 μM)를 첨가하고 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 인산 완충 식염수 내에 세척한 다음 4% PFA 내에 고정하였다. 세포를 다시 인산 완충 식염수로 세척한 후, 인산 완충 식염수 내 0.3% 트리톤 100-X/5% 염소 혈청으로 60분 동안 블로킹 및 침투화하였다. 그 다음, 세포를 인산 완충 식염수로 세척하고 항-아세틸-히스톤 3 항체를 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 2차 항체 (Alexa-594 anti-rabbit)를 45분 동안 첨가한 후, 세포를 다시 세척하고 이미징을 위하여 탑재하였다.
결과를 도 10에 도시한다. 이로부터, 화합물 92가 10분 후 제한된 활성을 나타내지만, 1시간 후, 세포는 특징적 핵환 표현형을 나타냄을 알 수 있으며, 이는 HDAC 효소의 억제에 대한 아세틸화된 H3의 빌드업을 나타낸다. 화합물 92가 활성 형태로 효소적으로 대사되므로, 이러한 지연된 거동은 초기 유도기(lag phase)를 나타낸다. 에탄올-처리된 세포는 어떤 시점에서도 이러한 핵환 표현형을 나타내지 않는다.
실시예 10: 처리된 SCC-4 세포 내 아세틸-H3 존재량
SCC-4 세포 내 아세틸-H3 단백질 존재량을 측정하기 위하여, 세포를 6-웰 플레이트에 350,000 세포/웰로 시딩하였다. 다음날, 세포를 화합물 또는 대조군으로 처리하였다. 처리 15분 후 및/또는 1시간 후, 세포를 RIPA 완충액 내에 용해하였다. 세포 용해물 상에서 Any kDTM Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Protein Gels를 사용하여 SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 분리하였다. 그 후, 단백질을 PVDF 막 (Macherey-Nagel) 상으로 옮기고, 5% 밀크 및 2.5% 피쉬 스킨 젤라틴을 함유하는 TBST 내에 블록킹하였다. 1차 (아세틸-H3, 9677S, CST 및 α-튜뷸린, T5168, Sigma) 및 2차 항체 (염소 항-토끼 IgG, A6154, Sigma 및 염소 항-마우스, SA00001-1, Proteintech)를 블록킹 완충액 내에 희석하고 단계 사이에 TBST 세척하면서 실온에서 각각 1시간 동안 염색하였다. iBright imager (Invitrogen)를 사용하여 케미루미네선스 신호를 측정하였다. 아세틸-H3 수준을 정규화하고, 결과 덴시토메트리(densitometry) 측정 (ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정)을 도 11 내지 13에 나타낸다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행하였다.
도 11은 배지, DMSO (디메틸 술폭사이드), SAHA (수베로일 아닐리드 히드록삼산), 화합물 27 및 화합물 93으로 처리 15분 및 1시간 후 아세틸-H3의 덴시토메트리 측정을 나타낸다. 아세틸-H3 수준은 α-튜뷸린 (15분) 및 AC-40 (1시간)에 대하여 정규화되었다.
도 12는 배지, DMSO (디메틸 술폭사이드), SAHA (수베로일 아닐리드 히드록삼산), 화합물 27, 화합물 93 및 화합물 101로 처리 1시간 후 아세틸-H3의 덴시토메트리 측정을 나타낸다. 아세틸-H3 수준은 α-튜뷸린에 대하여 정규화되었다.
도 13은 배지, DMSO (디메틸 술폭사이드), SAHA (수베로일 아닐리드 히드록삼산), 화합물 27 및 화합물 92로 처리 15분 후 아세틸-H3의 덴시토메트리 측정을 나타낸다. 아세틸-H3 수준은 α-튜뷸린에 대하여 정규화되었다.
실시예 11: 처리된 HaCaT 세포 내 카스파아제-3의 발현
HaCaT 세포를 6-웰 플레이트 내 커버슬립 상에 웰당 50,000 세포로 시딩하였다. 다음 날, 세포를 50nM 및 100nM의 화합물 93으로 30분 동안 처리하였다. DMSO를 대조군으로 사용하였다. 405 nm에서 5분에 걸쳐 29 mW/cm2로 빛을 방출하도록 수정된 PhotoReact 365를 사용하여 광 활성화를 수행하였다. 다음날, 세포를 4% PFA를 사용하여 고정하고, Triton X-100/Tween 20를 사용하여 투과화하고, 블록킹 완충액 (PBS 내 5% BSA 및 0.1% Tween 20) 내 블록킹하였다. 1차 (카스파아제-3, ab13847, Abcam) 및 2차 항체 (염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 594)를 5% 염소 혈청 및 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS 내 희석하였다. 커버슬립을 슬라이드에 첨가하고 Zeiss LSCM 880 상에서 이미징하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행하였다. 도 14는 DMSO, 50nM 화합물 93 및 100nM 화합물 93으로 처리된 HaCaT 세포 내 카스파아제-3 발현 및 발현 수준의 정량을 나타낸다.
실시예 12: SCC-4 세포 내 화합물들의 동시-국소화
SCC-4 세포를 8-웰 체임버 슬라이드 상에 50,000 세포/웰로 시딩하였다. 다음 날, 세포를 1 μM 화합물 101 및 1 μM 화합물 93으로 1시간 동안 처리하였다. 세포를 라이브 셀 이미징 용액 배지로 교체하였다. 이미징 30분 전에 동시-염색제(co-stains) (MitoTracker, Bodipy ER Tracker, LipidSpot 610 또는 LysoTracker)를 세포에 첨가하였다. Zeiss LSCM 880을 사용하여 이미징을 수행하고, 이미지 분석을 ImageJ 상에서 수행하였다.
도 15는 SCC-4 세포의 미토콘드리아 (MitoTracker), 액적 (LipidSpot610) 및 산성 소기관 (LysoTracker)으로 화합물 101의 동시-국소화를 도시한다. 피어슨 상관 계수(Pearson's Coefficient)를 계산하여 화합물 국소화 및 동시-염색제 국소화 간의 상관 관계를 입증하고 결과를 표 1에 나타낸다.
| 동시 염색제 | N |
피어슨 R 값
(한계값 없음) |
피어슨 R 값
(한계값 위) |
| MitoTracker | 3 | 0.55 +/- 0.04 | 0.30 +/- 0.11 |
| LipidSpot 610 | 1 | 0.30 | 0.08 |
| LysoTracker | 1 | 0.64 | 0.54 |
도 16은 SCC-4 세포의 미토콘드리아 (MitoTracker), 소포체 (Bodipy ER Tracker), 액적 (LipidSpot610) 및 산성 소기관 (LysoTracker)으로 화합물 93의 동시-국소화를 도시한다. 피어슨 상관 계수(Pearson's Coefficient)를 계산하여 화합물 국소화 및 동시-염색제 국소화 간의 상관 관계를 입증하고 결과를 표 2에 나타낸다.
| 동시 염색제 | N |
피어슨 R 값
(한계값 없음) |
피어슨 R 값
(한계값 위) |
| MitoTracker | 3 | 0.27 +/- 0.03 | -0.13 +/- 0.07 |
| LipidSpot 610 | 3 | 0.10 +/- 0.02 | -0.13 +/- 0.02 |
| Bodipy ER-Tracker Red | 3 | 0.36 +/- 0.09 | 0.0 +/- 0.1 |
| LysoTracker | 2 | 0.27 +/- 0.02 | 0.13 +/- 0.05 |
실시예 13: 화합물 93의 탈보호
화합물 93을 탈보호하여 Tert-부틸 (2E)-3-{5-[2-(4-{4-[7-(히드록시카르바모일)헵타노일]피페라진-1-일}페닐)에티닐]티오펜-2-일}프로프-2-에노에이트, 103을 제공함을 도 17에 나타내고, 아래 기재한다.
화합물 93 (500 mg, 0.82 mmol)을 메탄올 (30 mL). 내에 용해하고, NaOH (32 mg, 0.82 mmol, H2O 내 용액으로서, 1 mL)를 첨가하고 결과 용액을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 유기물을 H2O로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 증발시켜 조(crude) 노란색 고체를 얻었다. 이를 아세토니트릴로부터 재결정화하여 정제하여 화합물 103을 노란색 고체로서 얻었다 (170 mg, 36%): 1H NMR (700 MHz, 디메틸 술폭사이드-d 6) δ 1.22 - 1.29 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.47 - 1.52 (m, 4H), 1.94 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.20 - 3.25 (m, 2H), 3.25 - 3.29 (m, 2H), 3.55 - 3.60 (m, 4H), 6.18 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 6.91 - 7.00 (m, 2H), 7.31 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.37 - 7.44 (m, 2H), 7.48 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 8.64 (s, 1H), 10.32 (s, 1H); 13C NMR (176 MHz, 디메틸 술폭사이드-d 6) δ 24.6, 25.0, 27.8, 28.4, 28.5, 32.1, 32.2, 40.5, 44.4, 46.8, 47.2, 80.1, 80.9, 96.6, 110.2, 114.7, 118.9, 125.3, 132.1, 132.4, 132.7, 135.5, 139.6, 150.7, 165.0, 169.1, 170.7; IR (ATR) v max/cm-1 3207br, 2977w, 2930w, 2858w, 2194w, 1698m, 1619s, 1603s, 1526m, 1508m, 1231s, 1145s, 754m; MS (ASAP) m/z = 566.2 [M+H]+; HRMS (ASAP) calcd. for C31H40N3O5S [M+H]+: 566.2683, found 566.2683.
본 명세서에 개시된 모든 특징들 (첨부하는 청구항, 요약서 및 도면을 포함), 및/또는 개시되는 방법 또는 공정의 모든 단계는, 그러한 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징 (첨부하는 청구항, 요약서 및 도면을 포함)은, 달리 분명히 기재되지 않는 한, 동일, 균등 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적일 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 분명히 기재되지 않는 한, 각각의 개시된 특징은 동등 또는 유사한 특징의 총칭 시리즈의 하나의 예일 뿐이다. 본 발명은 전술한 구현예(들)의 세부 사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 본 명세서(첨부하는 청구항, 요약서 및 도면을 포함)에 개시된 특징들 중 신규한 것, 또는 신규한 조합, 또는 개시된 방법 또는 공정의 단계 중 신규한 것 또는 신규한 조합에 연장된다.
Claims (20)
- 식 I의 화합물:
(상기 식에서,
R1은 H 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이고;
R2는 P-Z이고, 여기서 P는 N 원자, -C=0, 및 -NHC=O 중 하나 이상으로 임의로 치환된, 1 내지 15개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이고;
Z는:
이고,
여기서 R3는 C1-C9 알킬, -CH2OH, -CH2OCH3, -Ph, -C6H4OH, -CH(CH3)OH, -C(CH2COOH)2OH, -C(=O)CH3, -CH2NH2, -CH2NH(C=O)CH2NH2, 또는 -CH2NH(C=O)CH2NH(C=O)CH2NH2이거나;
또는
R1 및 R2는 5 또는 6원을 가지고 P-Z으로 치환된 헤테로시클릭기 Y의 일부를 형성하고, 여기서 P는 앞서 정의되는 바와 같고, Z는 앞서 정의되는 바와 같고;
Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 페닐, 피리딘, 피리미딘, 티오펜, 퓨란, 벤조퓨란 또는 티아졸기로부터 선택되고;
X는 -C=C-C(=O)OR4이고, 여기서 R4는 하나 이상의 O 원자로 임의로 치환된, 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기임). - 제1항에 있어서,
R3는 C1-C3 알킬인, 식 I의 화합물. - 제2항에 있어서,
R3은 -CH3인, 식 I의 화합물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
Ar1은 티아졸 또는 페닐인, 식 I의 화합물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
Ar2는 피리딘, 티오펜 또는 퓨란인, 식 I의 화합물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
R1 및 R2는 헤테로시클릭기 Y의 일부를 형성하고, 선택적으로 Y는 피페라진인, 식 I의 화합물. - 제6항에 있어서,
P는 -C(=O)로 치환된 C1-C15 알킬기인, 식 I의 화합물. - 제7항에 있어서,
P는 -C(=O)(CH2)6인, 식 I의 화합물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
R4는 알킬기인, 식 I의 화합물. - 제9항에 있어서,
R4는 -CH3, -C(CH3)3 또는 -CH2CH(CH3)2인, 식 I의 화합물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
R1은 C1-C3 알킬이고, 선택적으로 R1은 CH3인, 식 I의 화합물. - 제1항 내지 제5항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
R2는 P-Z이고, 여기서 P는 -NHC(=O)로 치환된 C1-C15 알킬인, 식 I의 화합물. - 제12항에 있어서,
P는 -(CH2)5NHC(=O)(CH2)6인, 식 I의 화합물. - 제1항 내지 제5항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
R4는 -(CH2CH2O)nCH3이고, 여기서 n은 1 내지 8 사이의 정수이고, 선택적으로 R4는 -(CH2CH2O)3CH3인, 식 I의 화합물. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물은 화합물 92, 화합물 93, 화합물 101 및 화합물 102로부터 선택되는, 식 I의 화합물:
- 광역학 요법(photodynamic therapy)에서의, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 식 I의 화합물의 용도.
- 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합되는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 식 I의 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
- 식 I의 화합물을 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 식 I의 화합물의 탈보호 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 효소는 내생 효소인, 식 I의 화합물의 탈보호 방법. - 식 I의 화합물을 용매의 존재하에 염기와 반응시키는 단계를 포함하는, 식 I의 화합물의 탈보호 방법.
Applications Claiming Priority (5)
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