KR20230134516A

KR20230134516A - 복합체, 맥관 조영제, x선 조영제, 복합체의 제조 방법,및 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법

Info

Publication number: KR20230134516A
Application number: KR1020237027117A
Authority: KR
Inventors: 토모야 이노세; 타쿠무 타카세; 나루후미 키타무라; 코스케 곤다
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 도호쿠다이가쿠
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-09-21
Also published as: WO2022158377A1; CN116744980A; EP4282436A1; JPWO2022158377A1; US20240139347A1

Abstract

혈관 중에 소정 시간 체류하고, 그 후, 체외로 배설되는 X선 조영제를 제공하는 것을 과제로 한다. 금속 나노 입자 및 단백질을 포함하는 복합체로서, 복합체 중의 금속 나노 입자 부분은, 평균 입자경이 1㎚ 이상 5.5㎚ 이하인, 복합체에 의해 과제를 해결할 수 있다.

Description

복합체, 맥관 조영제, X선 조영제, 복합체의 제조 방법, 및 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법

본 출원에 있어서의 개시는, 복합체, 맥관 조영제, X선 조영제, 복합체의 제조 방법, 및 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법에 관한 것이다.

X선 CT 촬영은, 암 등의 생체의 병변 부위를 in vivo, 3차원에서 고분해능으로 가시화할 수 있는 매우 유용한 계측법이다. 뼈나 치아 등의 경조직은 X선을 잘 흡수하기 때문에 고(高)콘트라스트상을 얻을 수 있지만, 암세포나 통상 세포 등의 연조직은 X선 흡수의 차이가 작기 때문에 높은 콘트라스트가 얻어지지 않는다. 그 때문에, 연조직에서 높은 콘트라스트 화상을 얻기 위해서는, 일반적으로 조영제가 이용되고 있다.

X선 조영제로서는, 트리요오드페닐기를 수용성화한 화합물이 종래부터 사용되고 있다. 또한, 트리요오드페닐기 이외에는, 평균 입자경이 2.5㎚인 0가 천이 금속 미립자와 이것을 수중(水中)에서 분산 안정화하는 비이온성 친수성 배위자로 이루어지는 금속 미립자 복합체를 X선 조영제로서 이용하는 것이 알려져 있다(특허문헌 1 참조).

그러나, 트리요오드페닐기를 수용성화한 화합물로 제작한 X선 조영제 및 특허문헌 1에 기재된 X선 조영제는, 조직이나 질환 부위와의 상호작용하는 일 없이 관강(管腔) 부분으로부터 배출된다는 문제가 있다.

상기 문제점을 해결하는 X선 조영제로서, 트랜스페린과 반응한 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물과 0가 천이 금속 미립자를 포함하는 금속 미립자 복합체를 X선 조영제로서 이용함으로써, 특히 종양 부분에서는 조영 레벨을 지속할 수 있는 것이 알려져 있다(특허문헌 2 참조).

또한, X선 흡수 나노 입자와 형광 나노 입자를 결합함으로써, 암 등의 병소를 특이적으로 조영하는 X선 CT 조영제로서 기능함과 함께, 형광 표지제로서도 기능하는 X선 조영제도 알려져 있다(특허문헌 3 참조). 그리고 특허문헌 3에는, X선 CT 등을 이용하여 체외로부터 관찰 가능한 X선과, 감도가 높은 형광의 2개의 모드에서의 조영이 가능해지기 때문에, 수술 등의 처치를 행할 때에 고가의 PET 조영을 이용하지 않아도 리얼타임으로 병소의 위치·크기·범위를 특정하는 것이 가능해지며, 저렴하게 진단 및 처치를 행하는 것이 가능해지는 것이 기재되어 있다.

일본 특허공개 평 10-330288호 공보 일본 특허공개 2005-120034호 공보 국제공개 제2012／153820호

암 조직의 성장이나 전이에 종양 혈관은 중요한 역할을 하고 있다. 그 때문에, 종양 혈관의 구조를 정확하게 가시화하는 기술은, 암의 메카니즘 해명이나 항암제의 약효 평가에 있어서 매우 중요하다. 혈관의 X선 CT 촬영은, 일반적으로 점적(点滴)에 의해 조영제를 투여하고 최적의 타이밍에 촬영을 행하고 있다. 그런데, 마우스 등의 실험 동물의 혈관은 매우 가늘기 때문에, 혈관의 촬영에 마이크로 X선 CT 장치를 이용하는 경우가 많다. 이 마이크로 X선 CT 장치는, 고분해능과 대조적으로 촬영 시간을 필요로 한다. 그러나, 종래의 트리요오드페닐기를 수용성화한 화합물로 제작한 X선 조영제 및 특허문헌 1에 기재된 X선 조영제는, 혈액 중의 체류 시간이 짧기 때문에, 혈관의 X선 CT 화상이 얻어지기 어렵다는 문제가 있다.

한편, 특허문헌 3에 기재된 X선 조영제는, 종양 조직의 X선 CT 화상은 얻어진다. 그러나, X선 조영제는 체외로 배출되지 않고 혈관 외 누출 후에 종양 조직 내에 머무르기 때문에, 종양 혈관 유래의 X선의 콘트라스트 화상의 획득이 곤란해져, 결과적으로 종양 혈관의 경시적 구조 변화의 가시화가 어렵다는 문제가 있는 것을 새롭게 발견했지만, 현재 상태로는, 혈관 중에 소정 시간 체류하고, 그 후, 체외로 배설되는 X선 조영제는 알려져 있지 않다.

본 출원에 있어서의 개시는, 상기 문제를 해결하기 위해 이루어진 것이며, 예의(銳意) 검토를 행한 바, 신장 배설되는 사이즈의 금속 나노 입자여도 단백질을 이용하여 복합체를 형성함으로써, 혈관 등의 맥관의 X선 CT 촬영에 바람직한 조영제의 재료로서 사용할 수 있는 것을 새롭게 발견했다.

즉, 본 출원에 있어서의 개시의 목적은, 맥관의 X선 CT 촬영의 조영제의 재료로서 사용할 수 있는 복합체, 상기 복합체를 포함하는 맥관 조영제 및 X선 조영제, 복합체의 제조 방법, 그리고, 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법을 제공하는 것이다.

(1) 금속 나노 입자 및 단백질을 포함하는 복합체로서,

복합체 중의 금속 나노 입자 부분은, 평균 입자경이 1㎚ 이상 5.5㎚ 이하인,

복합체.

(2) 금속 나노 입자 및 단백질은, 링커를 통해 결합해 있는,

상기 (1)에 기재된 복합체.

(3) 복합체를 형성하기 전의 링커는, 티올기, 및 카르복시기 또는 아미노기를 갖는 화합물이며,

복합체 중에서,

티올기의 S 원자는 금속 나노 입자 중의 금속과 결합하고,

카르복시기 또는 아미노기는, 단백질의 아미노기 또는 카르복시기와 아미드 결합해 있는,

상기 (2)에 기재된 복합체.

(4) 단백질은, 기능 단백질로부터 선택되는,

상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 복합체.

(5) 혈중 반감기는, 1 ∼ 3시간인,

상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 복합체.

(6) 복합체 중에서, 단백질은 코어가 되고, 금속 나노 입자는 단백질 코어의 표면에 결합해 있는,

상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 복합체.

(7) 금속은, 금과, 백금과, 금 및 백금의 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는,

상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 복합체.

(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 복합체를 포함하는,

맥관 조영제.

(9) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 복합체를 포함하는,

X선 조영제.

(10) 금속 나노 입자와, 단백질과, 링커 화합물을 이용한 복합체의 제조 방법으로서,

상기 복합체 중의 금속 나노 입자 부분은, 평균 입자경이 1㎚ 이상 5.5㎚ 이하이며,

링커 화합물은, 티올기, 및 카르복시기 또는 아미노기를 갖고,

복합체의 제조 방법은,

금속 나노 입자와 링커 화합물을 반응시켜, 티올기의 S 원자를 금속 나노 입자 중의 금속에 결합시키는 링커 결합 금속 나노 입자 제작 공정과,

링커 결합 금속 나노 입자와 단백질을 반응시켜, 링커 결합 금속 나노 입자의 카르복시기 또는 아미노기와, 단백질의 아미노기 또는 카르복시기를 아미드 결합시키는 공정

을 포함하는, 복합체의 제조 방법.

(11) 금속 나노 입자 및 단백질을 포함하는 복합체로서,

복합체를 이용한 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법으로서,

촬영 방법은,

동물에게 복합체를 투여하고, X선 CT 촬영하며, 적절한 시간 경과 후, 새로운 복합체를 투여하고, X선 CT 촬영하는 촬영 공정을 포함하는,

맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법.

본 출원에서 개시하는 복합체를 조영제로서 이용하면, 맥관의 경시적 구조 변화를 가시화할 수 있다.

도 1은 도면 대용 사진으로, 도 1의 A는 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF의 TEM 사진, 도 1의 B는 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH의 TEM 사진, 도 1의 C는 비교예 2에서 제작한 AuNP-PEG의 TEM 사진이다.
도 2는 도면 대용 사진으로, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 콜로이드 용액 및 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 콜로이드 용액을 전기 영동한 후의 사진이다.
도 3은, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 콜로이드 용액 및 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 콜로이드 용액의 UV-VIS 스펙트럼 측정 결과이다.
도 4는 도면 대용 사진으로, 도 4의 a ∼ 도 4의 d는 마우스의 꼬리 정맥에 비교예 1에서 제작한 조영제를 투여한 후의 마이크로 X선 CT 화상이다.
도 5는 도면 대용 사진으로, 도 5의 A 및 도 5의 B는 마우스의 꼬리 정맥에 비교예 2에서 제작한 조영제를 투여한 후의 마이크로 X선 CT 화상이다.
도 6은 도면 대용 사진으로, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 조영제, 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 조영제, 및 비교예 3의 이오파미돌(iopamidol)의 정맥 투여 전후의 마우스 심장 CT 화상이다.
도 7은, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 조영제, 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 조영제, 및 비교예 3의 이오파미돌(iopamidol)의 정맥 투여 전후의 마우스 심장의 심실의 CT치의 변화를 경시적으로 계측한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8의 a는, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 조영제, 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 조영제, 및 비교예 2에서 제작한 15㎚ AuNP-PEG 조영제를 이용하여, 종양의 성장에 수반하는 동일 혈관의 변화를 가시화하는 실험의 개략을 나타내는 도면이다. 도 8의 b ∼ 도 8의 j는 도면 대용 사진으로, 종양 부분의 CT 화상이다.
도 9는 도면 대용 사진으로, 도 9의 a는 도 8의 i의 확대 화상, 도 9의 b는 도 8의 j의 확대 화상이다.
도 10은 도면 대용 사진으로, 실시예 2에서 제작한 sAu／GSH-hSA 1의 TEM 사진이다.
도 11은 도면 대용 사진으로, 실시예 2에서 제작한 콜로이드 용액(sAu／GSH-hSA 1), 실시예 3에서 제작한 콜로이드 용액(sAu／GSH-hSA 2) 및 비교예 1에서 제작한 콜로이드 용액(sAu／GSH)을 전기 영동한 후의 사진이다.
도 12는, 실시예 2에서 제작한 콜로이드 용액, 실시예 3에서 제작한 콜로이드 용액 및 비교예 1에서 제작한 콜로이드 용액의 UV-VIS 스펙트럼 측정 결과이다.
도 13은, 실시예 2에서 제작한 콜로이드 용액, 실시예 3에서 제작한 콜로이드 용액 및 비교예 1에서 제작한 콜로이드 용액의 등전점의 측정 결과이다.
도 14는 도면 대용 사진으로, 마우스의 꼬리 정맥에 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 제작한 조영제를 투여한 후의 마이크로 X선 CT 화상이다.
도 15는 도면 대용 사진으로, 마우스의 꼬리 정맥에 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 제작한 조영제를 투여한 후의 마이크로 X선 CT 화상(마우스 신장의 축방향 단면)이다.
도 16은 도면 대용 사진으로, 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 제작한 조영제의 정맥 투여 전후의 마우스 심장 CT 화상(마우스 심장의 축방향 단면)이다.
도 17은 도면 대용 사진으로, 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 제작한 조영제의 정맥 투여 전후의 마우스 심장 CT 화상(마우스 심장의 관상(冠狀) 단면)이다.
도 18은, 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 제작한 조영제의 정맥 투여 전후의 마우스 심장의 심실의 CT치의 변화를 경시적으로 계측한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 도면 대용 사진으로, 참고예 1에서 제작한 링커 결합 금 나노 입자 용액의 사진이다.

이하에, 본 출원에서 개시하는 복합체, 맥관 조영제, X선 조영제, 복합체의 제조 방법, 그리고, 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법에 대해서 상세하게 설명한다.

또, 본 명세서에서, 「∼」를 이용하여 표시되는 수치 범위는, 「∼」의 전후에 기재되는 수치를 하한치 및 상한치로서 포함하는 범위를 의미한다. 또한, 본 명세서에서, 수치, 수치 범위, 및 정성적인 표현(예를 들면, 「동일」, 「같음」 등의 표현)에 대해서는, 상기 기술분야에서 일반적으로 허용되는 오차를 포함하는 수치, 수치 범위 및 성질을 나타내고 있는 것으로 해석되어야 한다.

(복합체의 실시형태)

복합체의 실시형태는, 금속 나노 입자와 단백질을 포함한다.

(금속 나노 입자)

금속 나노 입자의 평균 입자경의 하한은, 1㎚ 이상이 바람직하고, 1.25㎚ 이상, 1.5㎚ 이상, 1.75㎚ 이상, 2㎚ 이상이어도 좋다. 평균 입자경이 1㎚ 미만이면, X선의 흡수량이 적어지기 때문에, 높은 콘트라스 화상이 얻어지기 어려워진다. 또한, 평균 입자경이 1㎚ 미만이면, 금속 나노 입자의 비표면적이 작아져, 단백질과의 복합체가 형성되기 어려워진다.

한편, 금속 나노 입자의 평균 입자경의 상한에 대해서, 본 발명자들은 후술하는 비교예의 결과로부터, 금속 나노 입자의 평균 입자경이 작은 경우는 신장 배출되지만, 금속 나노 입자의 평균 입자경이 큰 경우는 종양 조직 내에 머무르는 것을 확인했다. 평균 입자경이 큰 금속 나노 입자가 종양 조직 내에 머무르는 이유는, EPR 효과(Enhanced Permeation and Retention Effect)로 생각된다. 즉, 금속 나노 입자의 평균 입자경이 큰 경우는, 신장 배출되지 않기 때문에 혈액 중에 금속 나노 입자가 체류하고, 그 결과, EPR 효과를 나타냈다고 생각된다. 따라서, 혈관의 경시적 구조 변화를 가시화할 수 있도록 혈관을 X선 CT 촬영하기 위해서는, 금속 나노 입자가 체내로부터 신장 배출되는 사이즈로 할 필요가 있다.

신장 배설에 있어서 중요한 조직인 사구체는, 혈관, 사구체 여과막, 보먼낭으로 구성되어 있다. 그 중에서 여과 기능으로서 중요한 사구체막은, 당단백질, 내피세포, 사구체 기저막 및 족세포에 의한 복층 구조로 되어 있다. 내피세포, 사구체 기저막 및 족세포의 여과 기능의 슬릿 간격은, 각각 70 ∼ 90㎚, 2 ∼ 8㎚, 및 4 ∼ 11㎚이다. 그 때문에, 사이즈가 6㎚ 미만인 나노 입자나 단백질은, 사구체 여과막을 통과 가능하지만, 6㎚ 이상의 입자가 이 여과막을 통과하는 것은 곤란하다는 것이 알려져 있다(Bujie Du et al, "Transport and interactions of nanoparticles in the kidneys", Nat. Rev. Mater., 3(2018), pp.358-374).

상기 문헌에 기재된 신장 배출할 수 있는 입자의 사이즈는, 인간 신장의 경우이다. 인간을 상정한 경우는, 금속 나노 입자의 평균 입자경의 상한은, 6㎚ 미만이 바람직하고, 5.5㎚ 이하, 5.25㎚ 이하, 5㎚ 이하, 4.75㎚ 이하, 4.5㎚ 이하, 4.25㎚ 이하, 4㎚ 이하여도 좋다. 또, 동물의 사구체 여과막을 통과할 수 있는 입자의 사이즈는, 동물의 종류가 달라도 대폭적인 차이는 없다. 따라서, 금속 나노 입자의 평균 입자경의 상한은, 동물의 종류에 상관없이 상기와 같은 사이즈로 해도 좋고, 동물의 종류에 따라 상기 사이즈보다 약간 크거나 작아도 좋다. 금속 나노 입자의 상한은, 환언하면, 촬영 대상인 동물의 신장에서 배출할 수 있는 사이즈라고 해도 좋다.

또, 본 명세서에서 금속 나노 입자의 「평균 입자경」이란, 전자 현미경으로 촬영한 화상을 ImageJ／Fiji를 이용하여 해석한 다수의 금속 나노 입자의 입자 직경의 평균치를 의미한다.

금속 나노 입자를 형성하기 위한 원소는, X선을 흡수할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, X선의 흡수 성능이 높은 원소로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 일반적으로 원자 번호가 큰 원소일수록 X선의 흡수 성능이 높은 경향이 있기 때문에, 원자 번호가 큰 원소로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 주기율표의 제4 주기 이상에 속하는 원소를 들 수 있다. X선 흡수 성능이 높고, X선 조영을 실용적으로 행하는 것이 가능하기 때문에, 주기율표의 제5 주기 이상, 즉, 원자 번호로 대략 40 이상의 원소가, 금속 나노 입자를 구성하는 원소로서 바람직하게 이용된다. 이러한 원소의 보다 구체적인 예로서는, Ag, I, Ba, Au, Bi, Gd, Pt, Ru, Rh, Pd, Os, Ir 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 원자의 X선 감약 계수에서 볼 때 Au(금), Pt(백금), 금과 백금의 합금이 특히 바람직하다.

금속 나노 입자는, 공지(公知)된 방법으로 제작하면 되고, 예를 들면, 금속 원소를 포함하는 용액을 환원함으로써 제작할 수 있다. 금 나노 입자에 관해서는, 후술하는 실시예에서 구체적인 합성 절차를 나타낸다. 또한, 백금 나노 입자에 대해서는, 예를 들면, William W. Bryan et al., "Preparation of THPC-generated silver, platinum, and palladium nanoparticles and their use in the synthesis of Ag, Pt, Pd, and Pt／Ag nanoshells", RSC Adv., 2016, 6, 68150-68159, 및 Hideyuki Nagao et al., "Synthesis of Platinum Nanoparticles by Reductive Crystallization Using Polyethyleneimine", Chem. Eng. Technol. 2017, 40, No.7, 1242-1246 등을 참조하여 제작하면 된다. 또한, 금과 백금의 합금 나노 입자에 대해서는, 예를 들면, Yi Cao et al., "Fe(II)-Assisted one-pot synthesis of ultra-small core-shell Au-Pt nanoparticles as superior catalysts towards the HER and ORR", Nanoscale, 2020, 12, 20456-20466 등을 참조하여 제작하면 된다. 금속 나노 입자의 사이즈는, 원료의 농도나 반응 시간에 따라 조정할 수 있다.

또, 금속으로 제작한 미립자에 관하여, 서브 나노 클러스터가 알려져 있다. 서브 나노 클러스터는, 비교적 소수의 원자로 구성된 사이즈가 1㎚ 이하인 서브 나노 오더의 미립자이다. 그러나, 서브 나노 클러스터는, 흡수와 발광에 있어서 분자와 같은 광학 천이를 나타내며, 구조와 물리적 특성의 양쪽에서, 같은 원소로 제작한 금속 나노 입자와는 대폭적으로 다르다. 따라서, 본 출원에서 개시하는 금속 나노 입자와 서브 나노 클러스터는, 물체로서 전혀 다른 것이다. 또한, 서브 나노 클러스터는 촉매 등의 용도에 이용되며, 본 출원에서 개시하는 X선 조영용의 용도와는 다른 것이다.

(단백질)

단백질은, 그 자체로는 신속하게 신장 배설되어 버리는 사이즈의 금속 나노 입자와 복합체를 형성함으로써, 금속 나노 입자의 신장 배설 시간을 지연시키기 위해 이용된다.

단백질은, 금속 나노 입자의 신장 배설 시간을 지연시킬 수 있으면 특별히 제한은 없지만, 기능 단백질로부터 선택되는 것이 바람직하다. 단백질은, (1) 뼈, 연골, 힘줄 등을 구성하는 콜라겐; 머리카락, 손톱 등을 구성하는 케라틴; 등의 생물체를 구성하는 구조 단백질, (2) 효소나 물질을 체내로 수송하는 등, 체내에서의 화학 반응에 관여하는 기능 단백질의 2종류로 크게 나눌 수 있다. 본 출원에서 개시하는 복합체는, 소정 시간 경과 후에 신장 배출될 필요가 있다. 따라서, 복합체에 이용하는 단백질은, 구조 단백질보다 분해되기 쉬운 기능 단백질이 바람직하다.

기능 단백질에는, 촉매 작용과 대사의 조절을 행하는 효소; 정보를 운반하는 호르몬·사이토카인; 물질의 수송·저장에 관여하는 수송 단백질·저장 단백질; 면역 기구를 구성하는 항체: 등이 알려져 있다. 그 중에서도, 혈액 중에 포함되는 수송 단백질은, 통상의 상태로 혈액에 포함되는 성분이기 때문에, 상기 성분을 포함하는 복합체를 생체 내에 투여했을 때에, 거절 반응을 일으키기 어렵다. 따라서, 생체 적합성의 관점에서는, 혈액 중에 포함되는 단백질이 바람직하다. 혈액 중에 포함되는 단백질의 대부분은 수송 단백질이다. 따라서, 수송 단백질이 바람직하다고 해도 좋다. 또한 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 출원에서 개시하는 복합체는, 혈중에서 단백질이 분해됨으로써 금속 나노 입자가 신장 배출된다. 따라서, 단백질로서는 혈중 분해성 단백질을 이용하는 것이 바람직하다고도 할 수 있다. 바람직한 단백질의 예로서는, 예를 들면, 알부민, 글로불린, 트랜스페린, 셀룰로프라스민, 락토페린 등을 들 수 있다. 또한, 혈액 중에 포함되는 단백질이나 수송 단백질 이외에 바람직한 단백질로서는, 아비딘, 스트렙토아비딘 등을 들 수 있다.

또, 상기의 단백질의 종류는, 단순히 구체적인 단백질의 예시로서, 예시한 단백질에 한정되는 것은 아니다. 본 출원에서 개시하는 복합체에 요구되는 기능을 발휘하는 것이면, 다른 단백질이어도 좋다. 또한, 본 출원에서 개시하는 복합체에 요구되는 기능을 발휘하는 범위 내이면, 상기에 예시한 단백질의 일부 배열을 치환 또는 결손한 단백질도, 구체예로서 든 단백질에 포함된다. 또한, 단백질은, 필요에 따라 조합하여 이용해도 좋다.

실시형태에 따른 복합체는, 금속 나노 입자와 단백질을 포함하면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 단백질을 구성하는 아미노산인 시스테인에는, 티올기(-SH)가 포함된다. 또한, 금속과 S 원자가 결합하는 것은 공지이다. 따라서, 시스테인의 티올기로부터 H 원자를 제외하고 금속에 S 원자를 결합함으로써, 금속 나노 입자와 단백질의 복합체를 형성할 수 있다.

상기와 같이, 금속 나노 입자 및 단백질을 직접 결합함으로써 복합체를 형성할 수 있지만, 금속 나노 입자 및 단백질은, 임의 부가적으로, 링커를 통해 결합해도 된다. 예를 들면, 티올기, 및 카르복시기 또는 아미노기를 갖는 링커 화합물을 이용함으로써, 금속 나노 입자 및 단백질이 링커를 통해 결합한다.

티올기(-SH) 및 카르복시기(-COOH)를 포함하는 링커 화합물을 이용한 경우, 티올기의 S 원자가 금속 나노 입자와 결합하고(배위 결합), 카르복시기가 단백질의 아미노기(-NH₂)와 아미드 결합한다. 그 결과, 금속 나노 입자와 단백질이 링커를 통해 결합함으로써 복합체를 형성할 수 있다.

티올기(-SH) 및 아미노기(-NH₂)를 포함하는 링커 화합물을 이용한 경우는, 티올기의 S 원자가 금속 나노 입자와 결합하고(배위 결합), 아미노기가 단백질의 카르복시기와 아미드 결합한다. 그 결과, 금속 나노 입자와 단백질이 링커를 통해 결합함으로써 복합체를 형성할 수 있다.

링커 화합물은, 티올기, 및 카르복시기 또는 아미노기를 포함하고, 금속 나노 입자 및 단백질과 결합할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없다. 티올기 및 카르복시기를 포함하는 링커 화합물의 구체예로서는, 예를 들면, 이하의 식(1)으로 표시되는 글루타티온(환원형), 식(2)으로 표시되는 메르캅토프로피온산, 식(3)으로 표시되는 폴리(에틸렌글리콜)2-메르캅토에틸에테르아세트산 등을 들 수 있다.

또, 식(3)으로 표시되는 폴리(에틸렌글리콜)2-메르캅토에틸에테르아세트산은, 분자량이 500 ∼ 7500 정도가 바람직하다. 식(3) 중의 n은, 상기 분자량이 되도록 적절히 조정하면 된다. 식(3)으로 표시되는 화합물의 구체예로서, 예를 들면, Sigma-Aldrich Co. LLC로부터 입수할 수 있는, HS-PEG3500-COOH 및 HS-PEG7500-COOH 등을 들 수 있다.

[화 1]

티올기 및 아미노기를 포함하는 링커 화합물의 구체예로서는, 예를 들면, 이하의 식(4)으로 표시되는 2-아미노에탄티올, 식(5)으로 표시되는 HS-PEG-NH₂(M.W. 400 ∼ 5000, Nanocs Inc. 제조 등), 식(6)으로 표시되는 HS-(CH2)₁₁-NH₂(염산염) 등을 들 수 있다.

[화 2]

본 출원에서 개시하는 복합체는, 금속 나노 입자 및 단백질을 포함함으로써, 혈액 중의 체류 시간을 조정할 수 있다. 그 때문에, 본 출원에서 개시하는 복합체는, 암 조직의 혈관 신생의 경시적 구조 변화를 촬영하는 조영제에 이용할 수 있다는 현저한 효과를 발휘하지만, 용도는 혈관 촬영에 한정되지 않는다. 혈관 촬영 이외의 용도로서는, X선 CT로 촬영할 수 있는 조직이면 제한은 없고, 예를 들면, 림프관의 촬영용 조영제로서 이용해도 된다. 환언하면, 본 출원에서 개시하는 복합체는, 맥관(혈관, 림프관)의 조영제로서 이용할 수 있다.

복합체의 사이즈는, 동맥, 정맥 및 모세혈관 등의 목적으로 하는 혈관의 사이즈, 림프관의 사이즈, 그리고, 인간이나 실험용 마우스 등의 촬영 대상에 따라, 적절히 조정하면 된다. 인간의 혈액에 포함되는 성분 중, 예를 들면, 적혈구는 직경이 약 7.5㎛인 대략 원반상이고, 림프구는 약 10 ∼ 15㎛ 정도이다. 따라서, 예를 들면, 복합체의 사이즈를 150㎚ 이하로 조정하면, 혈관이나 림프관이 막힐 우려가 없다. 복합체의 사이즈는, 후술하는 복합체의 제조 방법에 있어서, 링커 결합 금속 나노 입자와 단백질의 양을 바꿈으로써 조정할 수 있다.

본 출원에서 개시하는 복합체는, 투여 후 X선 CT의 촬영이 종료될 때까지는 혈중에 체류하고, 다음 X선 CT 촬영까지는 신장 배출되는 것이 바람직하다. 따라서, 복합체의 혈중 반감기는, 0.5시간 ∼ 12시간 정도, 바람직하게는 0.75시간 ∼ 6시간 정도, 보다 바람직하게는 1시간 ∼ 3시간 정도로 조정하면 된다. 혈중 반감기를 상기의 시간으로 조정함으로써, 특히 암 조직의 혈관 신생의 경시적 구조 변화를 가시화할 수 있다. 물론, 경시적 구조 변화를 촬영하는 것이 아니라, 일시적인 구조를 촬영하거나, 통상의 X선 CT 촬영 장치를 이용하는 경우는, 상기 혈중 반감기보다 짧아도 좋고, 길어도 좋다. 혈중 반감기는, 단백질의 종류나 복합체의 크기를 바꿈으로써 조정할 수 있다. 또, 본 명세서에서 「혈중 반감기」란, 복합체의 X선 CT치가, 생체 투여 후의 최대치로부터 반감하는 시간을 의미한다. 단, 조영제 투여 후 X선 CT 촬영 개시 가능한 최단의 시간이 약 5min이기 때문에, 본 명세서에서는 조영제 투여 후 5min 후에 X선 CT 촬영을 개시했을 때의 측정치를 「생체 투여 후의 최대치」라고 정의한다.

(맥관 조영제 및 X선 조영제의 실시형태)

본 출원에서 개시하는 복합체는, 맥관 조영제로서 이용함으로써, 예를 들면 혈관의 경시적 구조 변화를 가시화할 수 있지만, 맥관 촬영용의 용도에 한정되지 않는다. 복합체는 X선을 흡수하는 금속 나노 입자를 포함하기 때문에, 맥관 이외를 대상으로 한 X선 조영제로서 이용할 수도 있다.

또, X선 조영제는, X선의 흡수가 원자 번호에 지수함수적으로 비례하며, 금속 나노 입자의 양이 많아질수록(같은 개수인 경우는, 금속 나노 입자의 사이즈가 커질수록) 높은 콘트라스트가 얻어진다. 한편, 조영제로서는 MRI 조영제도 알려져 있다. 그러나, MRI 촬영의 경우는, 조영제의 양과 콘트라스트 사이가 항상 상관되는 것은 아니다. 따라서, MRI 조영제와 X선 CT 조영제는, 개발의 방향성이 다른 상이한 기술이다.

복합체를 맥관 조영제 및／또는 X선 조영제로서 사용할 때에는, 복합체를, 물; 생리 식염수; Tris-HCl 완충액, 인산 완충액, 시트르산 완충액 등의 완충액; 등의 매체로 분산하면 된다. 또한, 필요에 따라, 염화나트륨 등의 염류; 만니톨, 글루코오스, 자당, 소르비톨 등의 당류를 첨가해도 된다. 상기 염류 및／또는 당류를 첨가함으로써, 조영제를 체내의 침투압에 대하여 등장(等張)시킬 수 있다.

(복합체의 제조 방법의 실시형태)

복합체는, 상기에 기재한 금속 나노 입자, 단백질, 링커 화합물을 이용하여 제조할 수 있다. 복합체의 제조 방법은,

(1) 금속 나노 입자와 링커 화합물을 반응시켜, 티올기의 S 원자를 금속 나노 입자에 결합시키는 링커 결합 금속 나노 입자 제작 공정과,

(2) 링커 결합 금속 나노 입자와 단백질을 반응시켜, 링커 결합 금속 나노 입자의 카르복시기 또는 아미노기와, 단백질의 아미노기 또는 카르복시기를 아미드 결합시키는 공정

을 포함한다.

또 본 명세서에서 「링커 결합 금속 나노 입자」란, 상기 반응으로부터 분명한 바와 같이, 링커 화합물 및 금속 나노 입자의 반응 생성물을 의미한다. 링커 결합 금속 나노 입자에서는, 링커 화합물의 티올기는 금속 나노 입자에 결합해 있지만, 링커 화합물의 카르복시기 또는 아미노기는 미반응인 상태로 존재하고 있다.

복합체의 제조 방법에서는, 먼저, 금속 나노 입자에 링커 화합물을 결합한다. 금속 나노 입자는 응집성이 높지만, 금속 나노 입자에 링커 화합물을 먼저 결합함으로써, 금속 나노 입자가 응집되기 어려워진다. 즉, 링커 화합물은, 금속 나노 입자와 단백질을 결합한다는 기능에 더해, 복합체를 제조할 때의 금속 나노 입자의 분산 안정제(응집 방지제)로서도 기능한다. 금속 나노 입자와 티올기와의 결합(배위 결합)은, 공지된 방법에 따라 실시하면 된다.

링커 화합물과 단백질의 결합 공정에서는, 카르복시기와 아미노기를 공유 결합할 수 있으면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 심플하고 간편하며 효율적인 커플링제(가교제)를 사용할 수 있는 아미드 결합을 이용하면 된다. 또, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 링커 화합물의 카르복시기 또는 아미노기와, 단백질의 측쇄의 아미드기 또는 카르복시기를 아미드 결합시킬 때에, 가교제의 양을 조정함으로써 복합체(조영제)의 혈중 체류 시간을 조정할 수 있다. 따라서, 링커 화합물과 단백질의 결합 공정을 실시하기 전에, 원하는 혈중 체류 시간을 갖는 복합체를 제작하기 위해, 가교제의 첨가량의 계산 공정을 실시해도 된다. 가교제의 첨가량은, 가교제의 첨가량을 바꾼 복수 종류의 복합체와 혈중 체류 시간의 상관관계를 미리 실험해 둠으로써 계산하면 된다. 가교제로서는, 축합제로서 이용되는 수용성 카르보디이미드(Water Soluble Carbodiimide: WSC. 또, EDC라고 불리는 경우도 있음), 및 카르복시산 활성화제로서 이용되는 N-히드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide: NHS)의 조합 등을 들 수 있다. 또, NHS는, 그 수용성 유사물인 Sulfo-NHS를 이용해도 된다. 가교제의 첨가량을 바꿀 때에는, WSC 및 NHS의 비를 동일하게 하여 첨가량을 바꾸어도 좋고, WSC 및 NHS의 비를 바꾸어도 좋다.

상기와 같이, 본 출원에서 개시하는 복합체의 제조 방법은, 먼저 금속 나노 입자와 링커 화합물을 결합하여 링커 결합 금속 나노 입자를 제작하는 공정을 실시하고, 그 다음에, 링커 결합 금속 나노 입자와 단백질을 결합하는 공정을 실시한다. 한편, 특허문헌 2에서는, 먼저 「Tf-PEG-SH」를 제작하는 공정을 실시하고, 그 다음에, 「Tf-PEG-SH」와 금속 미립자를 결합하는 공정을 실시하고 있다. 본 출원에서 개시하는 복합체의 제조 방법 및 특허문헌 2에 기재되어 있는 복합체의 제조 방법을 대비한 경우, 제조 공정의 순서가 다름으로써, 이하의 차이가 있다.

(1) 제조한 복합체의 구조의 차이

본 출원에서 개시하는 복합체는, 단백질이 코어(중심)가 되고 금속 나노 입자는 단백질 코어의 표면에 형성된다. 한편, 특허문헌 2에서는, 금속 미립자가 코어가 되고 금속 미립자의 표면에 「Tf-PEG-SH」가 형성된다. 그 때문에, 본 출원에서 개시하는 복합체는 단백질의 축합을 조정함으로써, 금속 나노 입자경을 변경하는 일 없이 복합체의 입자경을 조정할 수 있다. 한편, 특허문헌 2에 기재된 복합체의 입자경은, 금속 미립자의 입자경에 의존한다. 따라서, 특허문헌 2에 기재된 복합체는, 금속 미립자의 입자경을 크게 함으로써 복합체의 입자경을 조정할 수 있지만, 상기와 같이, 금속 미립자의 입자경을 지나치게 크게 하면, 신장 배설능이 상실된다.

(2) 제조 공정의 편리성의 향상

특허문헌 2의 「Tf-PEG-SH」는 산화 환원 반응에 의해, 2량체인 「Tf-PEG-S-S-PEG-Tf」가 형성될 가능성이 있다. 그 때문에, 제조 공정에서, 「Tf-PEG-SH」의 안정성에 유의할 필요가 있다. 한편, 본 출원에서 개시하는 제조 방법에서는, 링커 화합물이 금속 나노 입자에 결합한 후에는, 링커 결합 금속 나노 입자는 2량화하지 않는다. 따라서, 제조 공정의 편리성이 향상된다.

(맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법의 실시형태)

본 출원에서 개시하는 복합체를 이용함으로써, 맥관의 구조 변화를 촬영할 수 있다. 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법은, 동물에게 복합체를 투여하고, X선 CT 촬영하며, 적절한 시간 경과 후, 새로운 복합체를 투여하고, X선 CT 촬영하는 촬영 공정을 포함한다.

촬영 대상인 동물은 맥관이 있으면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 원숭이 등을 들 수 있다. 또, 인간은 동물로부터 제외되어도 된다.

복합체의 동물 투여는, 일반적인 맥관 조영제의 투여와 마찬가지로 행하면 된다. 예를 들면, 주사에 의해 투여해도 좋고, 인젝터 등에 의해 계속적으로 투여해도 좋다.

촬영 공정은, 복합체를 투여하고, X선 CT 촬영하며, 적절한 시간 경과 후, 새로운 복합체를 투여하고, X선 CT 촬영함으로써 맥관의 구조 변화를 포착할 수 있으면 특별히 제한은 없다. 적절한 시간은, 촬영 대상 및 촬영 목적에 따라 적절히 선택하면 된다. 또, 본 명세서에서 「맥관의 구조 변화」란, 예를 들면, 종양 등에 있어서의 혈관의 신생, 기존의 혈관의 경시 변화 등, 혈관이나 림프관의 경시적인 형상의 변화를 의미한다. 촬영 공정의 횟수는 2회 이상이면 맥관의 구조 변화를 포착할 수 있다. 한편, 촬영 공정의 횟수의 상한은 특별히 없고, 촬영 대상이 되는 맥관의 구조 변화를 관찰할 수 있는 횟수이면 된다. 또한, X선 CT 촬영의 간격은, 맥관의 구조의 변화를 가시화할 수 있는 간격이면 특별히 제한은 없고, 촬영 대상의 맥관의 구조 변화에 따라 적절히 조정하면 된다. 예를 들면, 혈관의 신생을 촬영하는 경우는, 12시간 ∼ 48시간, 바람직하게는 18시간 ∼ 36시간, 보다 바람직하게는 24시간마다 촬영하면 좋다. 물론, 상기 시간은 단순한 일례이며, 촬영 공정의 간격은, 상기 시간보다 짧거나 길어도 좋다. 림프관의 가시화는 암 전이의 기전 해명이나 인간 암의 센티넬 림프절의 가시화에 있어서도 중요해진다. 림프관을 촬영하는 경우도 혈관과 마찬가지로, 촬영 대상의 림프관의 구조 변화에 따라 적절히 시간을 조정하면 된다. 또한, 상기와 같이, 본 출원에서 개시하는 조영제는, 혈중 체류 시간을 조정할 수 있다. 따라서, 복합체를 투여하기 전에, X선 CT 촬영하는 간격에 따라, 바람직한 혈중 체류 시간을 갖는 조영제를 선택하는 공정(또는 제작하는 공정)을 실시해도 된다.

이하에 실시예를 들어, 본 출원에서 개시하는 실시형태를 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 단순히 실시형태의 설명을 위한 것이다. 본 출원에서 개시하는 발명의 범위를 한정하거나, 혹은 한정하는 것을 나타내는 것은 아니다.

실시예

[복합체 및 조영제의 제작 1]

<실시예 1>

이하에 기재하는 절차로 복합체를 제작했다.

(1) 금 나노 입자의 합성

25℃, 0.001M HAuCl₄ 수용액 235.0mL에, 용시(用時) 조정한 0.07M 테트라키스(히드록시메틸)포스포늄 클로라이드(THPC) 수용액을 7.5mL 첨가하고, 그 다음에, 1.0M NaOH 수용액을 7.5mL 첨가했다. 15min 교반함으로써, 금 나노 입자(sAuNP)를 제작했다. 15min 후에 용액의 색이 갈색으로 변화했기 때문에, sAuNP 형성이 시사되었다. 또, HAuCl₄은, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, 99％를 이용하고, 환원제인 THPC는, Tokyo Chemical Industry(approximately 80％ in water)를 이용했다.

(2) 금 나노 입자와 링커 화합물의 결합

sAuNP 표면에, 링커 화합물인 글루타티온(GSH; FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)을 수식(결합)하기 위해, sAuNP 콜로이드 용액에 0.25M GSH 수용액을 2mL 더해, 12h 반응시킴으로써, sAu／GSH 콜로이드 용액을 조제했다. 반응 후, 에바포레이터에 의해 sAu／GSH 콜로이드 용액으로부터 용매 제거하여 총량을 약 1／10로 농축했다. 농축한 sAu／GSH 콜로이드 용액을, 12-14kDa 투석 튜브(Visking tube, AS ONE)를 이용하여 초순수 2L 중에서 24h 투석 세정했다. 세정한 sAu／GSH 콜로이드 용액을, 다시 에바포레이터를 이용하여 분산매를 제거함으로써 분체화(粉體化)했다. 다음으로, 분체화한 sAu／GSH를 PBS로 재분산시켰다. 이상의 과정에서, HAuCl₄이 모두 환원되고, 세정이나 농축 과정에서 손실이 없었다고 가정하면, 추정되는 최종 Au 농도는 0.5M이었다. 재분산된 용액은 주황색을 나타내고 있으며, 침전물 등은 확인되지 않았다.

또, 환원제로서 THPC를 사용하지 않고, HAuCl₄ 수용액과 글루타티온 수용액을 혼화하고, 교반함으로써 sAu／GSH를 제작할 수도 있지만, 반응에 약 2주간 필요하다. 한편, 실시예에서 개시하는 제조 방법에서는 환원제로서 THPC를 사용했기 때문에, 약 반나절 만에 sAu／GSH를 제작할 수 있었다. 환원제로서 THPC를 사용한 경우에는, 합성 효율이 매우 효율화된다.

(3) 링커 결합 금 나노 입자와 단백질의 결합

1mL의 농축한 sAu／GSH 콜로이드 용액에, 100㎎의 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride(EDC; DOJINDO, 98％)와 100㎎의 sulfo N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt(sulfo-NHS; Tokyo Chemical Industry, 98％)를 더하여, 37℃에서 30min 교반했다. 그 후, 80㎎／mL의 락토페린(LF, MW: 80kDa, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, 95％) PBS 용액을 1mL 첨가하여, 37℃에서 12h 반응시켰다. 반응 후, sAu／GSH와 마찬가지의 방법으로, 세정 및 농축함으로써 sAu／GSH-LF 콜로이드 용액(복합체)을 조제했다. 용액은 진한 주황색을 나타내고, 응집체나 침전물은 확인되지 않았다. 따라서, sAu／GSH와 LF를 공유 결합(아미드 결합)시켜 복합화한 후에도, 콜로이드 안정성이 높은 것을 알 수 있었다. 제작한 복합체의 콜로이드 용액을 그대로 조영제로서 이용했다.

<비교예 1>

실시예 1의 「(3) 링커 결합 금 나노 입자와 단백질의 결합」을 실시하지 않은 sAu／GSH의 콜로이드 용액을 그대로 비교예 1의 조영제로 했다.

<비교예 2>

99.4㎎의 사염화금(Ⅲ)산 사수화물(HAuCl₄·4H₂O)을 233mL의 초순수에 용해하고, 가열하여 비등시켰다. 염화금산 수용액을 끊임없이 교반하면서, 39mM 시트르산나트륨(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, 99％) 수용액을 28mL 첨가하고, 일정한 회전수로 30min 교반했다. 25℃로 냉각한 후, 금 나노 입자 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 수식하기 위해, 99.4mg HOOC-PEG-SH(thiol carboxylic PEG, MW: 5000, Nanocos Inc.)를 금 나노 입자 콜로이드 용액에 더해, 25℃에서 8h 교반함으로써, AuNP-PEG를 제작했다. 제작한 AuNP-PEG 콜로이드 용액을 15000rpm, 45min의 조건으로 원심 세정을 행했다. 그 후, 15000rpm, 60min의 조건으로 원심 농축을 복수 회 반복하여, 최종 Au 농도 0.5M의 AuNP-PEG 콜로이드 용액을 얻었다. 또, PEG는 금 나노 입자의 분산 안정제이다. 제작한 AuNP-PEG 콜로이드 용액을, 그대로 비교예 2의 조영제로 했다.

<비교예 3>

시판하는 요오드계 혈관 조영제인 이오파미돌(Bayer Yakuhin, Ltd. 제조 Iopamiron주 300)을 비교예 3으로 했다.

<제작한 나노 입자의 평가 방법 1>

200kV의 조건으로 TEM(JEM-2100, JEOL)을 이용하여 나노 입자의 형태를 평가했다. TEM 관찰용 시료는, 콜로디온으로 코팅된 구리 그리드(JEOL) 상에 콜로이드 용액을 적하하고, 용매를 증발시킴으로써 준비했다. 체적 평균 입자 사이즈는, ImageJ／Fiji를 사용하여 다수의 입자 직경을 측정하여 산출했다. 입자 콜로이드 용액의 UV-Vis 스펙트럼은, Ultrospec 700 분광 광도계(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 측정했다. 아가로오스 겔 전기 영동은, 50％ TAE 버퍼(Tris-acetate-EDTA; Nippon Gene) 중에서 1％ 아가로오스(Promega) 겔을 사용하여 실시했다(조작 조건: 100KV, 10min).

도 1의 A에 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF의 TEM 사진, 도 1의 B에 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH의 TEM 사진, 도 1의 C에 비교예 2에서 제작한 AuNP-PEG의 TEM 사진을 나타낸다. 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF의 평균 입자경은 17.3 ± 2.8㎚였다. 또, 실시예 1은, 금 나노 입자가 단백질과 복합체를 형성하고 있기 때문에 구상(球狀)은 되지 않는다. 그 때문에, 도 1의 A의 화살표로 나타내는 금 나노 입자가 모여 있는 복합체 부분의 장축 방향의 길이에 기초하여 평균 입자경을 계산했다. 비교예 1의 sAu／GSH는, 평균 입자경이 2.2 ± 0.7㎚인 단분산의 대략 구형인 것을 확인했다. 비교예 2의 AuNP-PEG도, 평균 입자경이 15.1 ± ㎚인 단분산의 대략 구형인 것을 확인했다.

도 2에, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 콜로이드 용액 및 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 콜로이드 용액을 전기 영동한 후의 사진을 나타낸다. 도 3에, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 콜로이드 용액 및 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 콜로이드 용액의 UV-VIS 스펙트럼 측정 결과를 나타낸다.

도 2에서 분명한 바와 같이, sAu／GSH-LF는 sAu／GSH보다 양극 측(도 2의 사진 방향 하측)으로 이동하지 않았다. 즉, sAu／GSH-LF는 sAu／GSH와 비교하여, 입경 증가 또는 표면 전하가 변화한 것을 의미하고 있다. 따라서, 실시예 1에 의해, 복합체가 형성된 것을 확인했다. 또한, 도 3에서 분명한 바와 같이, sAu／GSH-LF 및 sAu／GSH의 소쇠 스펙트럼은 유사하며, 또한, 표면 플라즈몬 공명 흡수(SPR) 피크로 귀속되는 피크는 확인되지 않았다. 따라서, 금 나노 입자에 링커 화합물을 결합한 sAu／GSH에 단백질을 결합시키는 조작에 의해, 금 나노 입자가 응집되거나, 침전물을 형성하지 않는 것을 확인했다.

[마우스에의 조영제의 투여 실험 1]

<모델 마우스의 제작>

(1) 세포 배양

BALB／c 유래의 결장암 세포 colon-26(CT26: RIKEN BioResource Research Center, RCB2657)를 10％의 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 RPMI-1640(Life Technologies Corporation)에서, 5％ CO₂, 37℃의 조건하에서 보습 배양했다.

(2) 담암 모델 마우스의 제작

5 ∼ 11주령의 야생형 마우스인 BALB／c(Charles River Laboratories Japan)의 수컷 마우스를 이용했다. 상기 (1)에서 배양한 1 Х 10⁷의 colon-26 세포를 피하 이식했다. 사용한 동물은, TOHOKU UNIVERSITY에서의 실험 동물 위원회에 의해 승인된 가이드 라인에 따라 취급되었다.

<마이크로 X선 CT 촬영>

관전압 50kV, 관전류 500μA, 35㎛／voxel or 18㎛／voxel or 9㎛／voxel의 조건으로 마이크로 X선 CT 장치(SkyScan 1176, Bruker)를 사용하여 촬영했다. In vitro에서는, 실시예 1 그리고 비교예 1 및 2에서 합성한 조영제를 촬영했다. In vivo에서는, 마취 처치한 마우스에 각 조영제를 꼬리 정맥으로부터 200μL 주입하고, 1 ∼ 2회 CT 촬영했다. 슬라이스 화상과 볼륨 렌더링 화상은, CTAn(Bruker) 및 CTvox 각각을 사용하여 취득했다. CT치는, 공기와 물의 Hounsfield Units(HU)의 값을 각각 -1000 및 0으로 정의하여, 산출했다.

<비교예 1의 조영제를 마우스에 투여했을 때의 신장 배출의 확인>

도 4에, 마우스의 꼬리 정맥에 비교예 1에서 제작한 조영제를 투여한 후의 마이크로 X선 CT 화상을 나타낸다. 도 4의 (a)는 조영제의 투여 전의 화상, 도 4의 (b)는 조영제를 투여 후 5min 후부터 촬영한 화상, 도 4의 (c)는 조영제를 투여 후 60min 후부터 촬영한 화상, 도 4의 (d)는 조영제를 투여 후 24h 후부터 촬영한 화상이다. 도면 중의 화살표는 신장, 파선의 원은 방광이다. 도 4의 (b)에 나타내는 바와 같이, 투여 후 5min에는 선명하게 신장과 방광을 가시화할 수 있었다. 또한, 투여 후 60min에서는 신장의 화상이 거의 사라졌기 때문에 혈중의 조영제는 거의 분해되어, 대부분의 금 나노 입자가 방광에 집적되고(도 4의 (c)), 24h에서는 생체 외로 조영제가 배설된 것을 확인했다(도 4의 (d)).

<비교예 2의 조영제를 마우스에 투여했을 때의 암 조직의 화상>

도 5에, 마우스의 꼬리 정맥에 비교예 2에서 제작한 조영제를 투여한 후의 마이크로 X선 CT 화상을 나타낸다. 도 5의 A는 조영제를 투여 직후, 도 5의 B는 조영제를 투여 후 3일 후의 화상이다. 도면 중의 파선의 타원 부분은 종양 형성 개소이다. 도 5의 A 및 B에서 분명한 바와 같이, 비교예 2의 조영제를 이용한 경우는, EPR 효과에 의해 조영제가 종양 조직의 간질(間質)에 도입되어 그곳에 체류 하기 때문에, 혈관 영역의 콘트라스트가 악화되고, 결과적으로 종양 형성 개소의 혈관의 경시적 구조 변화를 가시화할 수 없는 것을 확인했다.

도 4 및 도 5에 나타내는 결과로부터, (1) 금 나노 입자의 입경이 작은 경우는 신속하게 신장으로부터 배출되는 것, (2) 반대로, 금 나노 입자의 입경이 큰 경우는 신장에서 금 나노 입자를 분리할 수 없어 EPR 효과에 의해 종양 조직의 간질에 금 나노 입자가 체류하여, 종양 형성 개소의 혈관의 경시적 구조 변화의 가시화가 곤란한 것이 분명해졌다.

<실시예 1, 비교예 1 및 3의 조영제를 마우스에 투여했을 때의 혈중 반감기의 측정>

도 6에, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 조영제, 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 조영제, 및 비교예 3의 이오파미돌(iopamidol)의 정맥 투여 전후의 마우스 심장 CT 화상을 나타낸다. 모든 조영제 투여군에 있어서, 투여 후 5min부터 촬영한 화상에서는 좌우의 심실을 구별할 수 있는 레벨의 선명한 화상을 취득할 수 있었다. 투여 후 60min부터 촬영한 화상에서는, sAu／GSH-LF 투여 마우스만이 좌우의 심실이 판별 가능했다. 심실의 CT치의 변화를 경시적으로 계측한 결과를 도 7에 나타낸다. 조영제를 투여 전의 화상을 0min(Before injection)으로 했다. sAu／GSH-LF 투여군의 CT치는, 0, 5, 60, 180, 360min, 및 24h에서, 각각, 71, 337, 217, 166, 126, 75HU였다. sAu／GSH 투여군의 CT치는, 0, 5, 60, 180, 360min, 및 24h에서, 각각, 76, 256, 132, 115, 83, 55HU였다. 이오파미돌 투여군의 CT치는, 0, 5, 60, 180, 360min, 및 24h에서, 각각 72, 291, 130, 75, 87, 72HU였다. 도 7에 나타내는 결과로부터 각 조영제의 혈중 반감기를 산출하면, sAu／GSH-LF는 120min이었다. 대조적으로, sAu／GSH 및 이오파미돌의 혈중 반감기는, 모두 60min 미만이었다.

이상의 결과로부터, (1) sAu／GSH와 이오파미돌의 양자가 혈관 내에서 유사한 거동을 나타낸 것, (2) sAu／GSH에 락토페린을 결합하여 제작한 sAu／GSH-LF는, sAu／GSH와 비교하여 혈중 반감기를 길게 할 수 있는 것, (3) sAu／GSH-LF는, 혈관 조영제로서 종래부터 알려져 있는 sAu／GSH 및 이오파미돌과 비교하여, 혈관 조영능이 높은 것을 확인했다.

<실시예 1, 비교예 1 및 2의 조영제를 마우스에 투여했을 때의 암 조직 혈관의 경시적 화상>

도 8에, 실시예 1에서 제작한 sAu／GSH-LF 조영제, 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH 조영제, 및 비교예 2에서 제작한 15㎚ AuNP-PEG 조영제를 이용하여, 종양의 성장에 수반하는 동일 혈관의 변화를 가시화할 수 있는지 확인했다. 도 8의 a는 실험의 개략을 나타내는 도면이다. 담암 마우스의 정맥 내에 조영제를 투여하고, 5min 후에 1회째의 X선 CT 촬영을 실시하고, 3일 후(72h)에 조영제를 1회째와 마찬가지로 투여하고 5min 후에 2회째의 X선 CT 촬영을 실시했다.

도 8의 b ∼ j는, 종양 부분의 CT 화상이다. 도 8의 b ∼ d에 나타내는 바와 같이, 15㎚ AuNP-PEG 조영제를 투여한 경우, 최초의 투여 후에 종양 혈관이 명확하게 관찰되었지만(도 8의 c), 2회째의 CT 화상에서는 종양 부분 전체가 새하얗게 되어 종양 혈관의 가시화는 불가능하며, 종양 혈관의 며칠 단위의 구조 변화를 관찰할 수 없었다(도 8의 d). 금 나노 입자의 사이즈가 15㎚이기 때문에, 혈액으로부터의 배출 경로가 없어, 금 나노 입자가 피부나 종양의 조직에 집적되었기 때문이라고 생각된다.

도 8의 e ∼ g에 나타내는 바와 같이, sAu／GSH 조영제를 투여한 경우는, 종양 혈관의 가시화는 곤란했다. 이것은, 조영제의 투여 직후에 sAu／GSH가 소변으로 배설되었기 때문이라고 생각된다.

상기의 2종류의 조영제와는 달리, 도 8의 h ∼ j에 나타내는 바와 같이, sAu／GSH-LF 조영제를 투여한 경우, 최초의 투여 후의 CT 화상에서 종양 혈관을 가시화할 수 있고(도 8의 j), 또한, 2회째의 조영제의 투여 후에 있어서도 동일한 종양 혈관을 가시화할 수 있었다(도 8의 i 및 j의 화살표). 도 9의 a는 도 8의 i의 확대 화상, 도 9의 b는 도 8의 j의 확대 화상이다. 불과 72h 만에, 동일한 종양 혈관의 사행(蛇行)의 정도와 직경은 크게 변화했다(도 9의 a 및 b의 점선으로 둘러싸인 혈관). 사행의 정도(사행도)를, 실제의 길이를 2점간의 직선으로 나누었을 때의 값으로서 정의하여 산출한 결과, 동일 혈관의 사행도는 약 1.1에서 1.4로 변화하고 있는 것이 확인되었다. 또한, 혈관의 최대경은 420㎛에서 515㎛로 변화한 것이 확인되었다. 또, 조영제 투여 후의 최초의 CT 화상에서 가시화할 수 있었던 종양 혈관의 수는, sAu／GSH-LF(도 8의 i)가 AuNP-PEG(도 8의 c)보다 적었다. 그 이유로서는, 세밀 충전되어 있는 15㎚ AuNP-PEG의 Au 원자의 밀도가 크고, 15㎚ AuNP-PEG 쪽의 조영능이 높기 때문이라고 생각된다.

이상의 결과로부터, 신장 배출 가능한 사이즈의 금속 나노 입자에 단백질을 결합함으로써 제작한 복합체를 조영제에 이용함으로써, 동일 종양 혈관의 경시적 구조 변화를 가시화할 수 있는 것을 확인했다.

또, 이번 실험에서, 단백질로서 이용한 락토페린 단체(單體)의 혈중 반감기는, 약 7.8min인 것이 알려져 있다(Y.Nojima et al., "Lactoferrin conjugated with 40-kDa branched poly(ethylene glycol) has an improved circulating half-life", Pharm. Res., 26(2009), pp.2125-2132). 상기 실시예에 나타내는 바와 같이, 복합체의 혈중 반감기는, 1 ∼ 3시간이다. 따라서, 본 출원에 있어서의 개시는, sAu／GSH 및 락토페린은, 각각, 단체로는 신속하게 혈중으로부터 배출되지만, 양자를 조합함으로써, 혈중의 체류 시간이 대폭적으로 길어진다는 예기치 못한 효과에 기초하여 이루어진 것이다.

종양은 급속히 성장하기 위해 많은 영양과 산소를 필요로 한다. 종양 조직에의 영양과 산소의 공급을 늘리기 위해, 암세포는 혈관 신생 인자를 생성하여 종양 혈관을 급속히 구축한다. 따라서, 급속히 구축된 종양 신생 혈관은, 불규칙한 형상을 나타내거나 확장하고 있어, 누출성이 항진됨과 함께 취약하다. 또한, 종양에서는 림프 네트워크 시스템이 미성숙하기 때문에, 종양 혈관으로부터 누출된 물질은, 종양 부위로부터 용이하게 제거되지 않는다. 그 때문에, 약 150㎚ 이하의 나노 입자나 약물은 종양 혈관에 침투하여, 종양 조직에 용이하게 유지된다. 이 현상은 EPR(enhanced permeability and retention) 효과라고 불리고 있다. 비교예 2의 조영제를 투여한 경우에는, 도 5 및 도 8에 나타내는 바와 같이, EPR 효과에 의해 금속 나노 입자가 종양 조직에 축적되어 버려, 혈관의 경시적 구조 변화는 가시화할 수 없었다.

한편, 실시예 1의 복합체인 sAu／GSH-LF의 사이즈는 17.3 ± 2.8㎚이고, 비교예 2의 AuNP-PEG의 15㎚와 거의 동등한 사이즈이지만, Au 원자량이 적기 때문에 마찬가지의 EPR 효과가 일어나고 있어도 가시화되기 어려운 것, 또한 sAu／GSH-LF가 분해되기 때문에, EPR 효과의 영향은 거의 보이지 않았다. 이는, 도 8의 j에 나타내는 화상이, 도 8의 d와 같이 종양 조직 전체가 하얗게 촬영되지 않았기 때문에 분명하다. 따라서, 본 출원에서 개시하는 복합체는, (1) 신장 배출되지 않는 사이즈임에도 불구하고 EPR 효과를 거의 받지 않으며, (2) 종양 조직의 혈관을 촬영하는데 충분한 혈중 반감기를 갖는다는 기능을 구비하기 때문에, 혈관의 경시적 구조 변화를 가시화할 수 있다는 현저한 효과를 발휘한다.

[복합체 및 조영제의 제작 2]

<실시예 2>

실시예 1의 락토페린 PBS 용액으로 바꾸고, 50㎎／mL의 알부민(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) PBS 용액을 1mL 첨가한 것 이외는 실시예 1과 마찬가지의 절차로 복합체(sAu／GSH와 인간 혈청 알부민을 복합체화한 콜로이드 용액)를 제작했다. 또, 실시예 2에서 제작한 복합체(콜로이드 용액 또는 조영제라고 기재하는 경우도 있음)를 「sAu／GSH-hSA 1」이라고 기재하는 경우가 있다.

<실시예 3>

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride(EDC; DOJINDO, 98％)의 첨가량을 400㎎ 및 sulfo N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt(sulfo-NHS; Tokyo Chemical Industry, 98％)의 첨가량을 400㎎으로 한 것 이외는, 실시예 2와 마찬가지의 절차로 복합체(sAu／GSH와 인간 혈청 알부민을 복합체화한 콜로이드 용액)를 제작했다. 또, 실시예 3에서 제작한 복합체(콜로이드 용액 또는 조영제라고 기재하는 경우도 있음)를 「sAu／GSH-hSA 2」라고 기재하는 경우가 있다.

<제작한 나노 입자의 평가 방법 2>

실시예 2 및 실시예 3에서 제작한 복합체를, 상기 <제작한 나노 입자의 평가 방법 1>과 마찬가지의 절차(단, 전기 영동의 시간은 20min으로 변경)로 평가했다. 도 10은, 실시예 2에서 제작한 sAu／GSH-hSA 1의 TEM 사진을 나타낸다. 또, 실시예 3에서 제작한 sAu／GSH-hSA 2의 TEM 사진에 대해서는 생략한다. 도 10의 좌측은 제작한 금 나노 입자에 포커스를 맞춘 사진이고, 우측은 금 나노 입자의 포커스면으로부터 포커스 시프트한 사진이다. 도 10의 좌측의 사진으로부터 분명한 바와 같이, 실시예 2에서 제작한 sAu／GSH-hSA 1은, 실시예 1(도 1의 A)과 마찬가지로 금 나노 입자가 응집되어 있었다. 또한, 포커스 시프트 후의 우측의 사진에서는, 금 나노 입자의 주위에 저(低)콘트라스트의 물질을 확인할 수 있었기 때문에, 실시예 2에서도, 금 나노 입자와 단백질이 복합체를 형성하고 있음을 확인했다.

도 11에, 실시예 2에서 제작한 콜로이드 용액(sAu／GSH-hSA 1), 실시예 3에서 제작한 콜로이드 용액(sAu／GSH-hSA 2) 및 비교예 1에서 제작한 콜로이드 용액(sAu／GSH)을 전기 영동한 후의 사진을 나타낸다. 도 12에, 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 제작한 콜로이드 용액의 UV-VIS 스펙트럼 측정 결과를 나타낸다.

도 11에 나타내는 바와 같이, 실시예 2에서 제작한 sAu／GSH-hSA 1 및 실시예 3에서 제작한 sAu／GSH-hSA 2는, 실시예 1과 마찬가지로, 비교예 1의 sAu／GSH보다 양극 측(도 11의 사진 방향 하측)으로 이동하지 않았다. 따라서, 실시예 2 및 3에서는, 복합체가 형성된 것을 확인했다. 또한, 도 12에 나타내는 바와 같이, sAu／GSH-hSA 1, sAu／GSH-hSA 2 및 sAu／GSH의 소쇠 스펙트럼은 유사하며, 또한, 표면 플라즈몬 공명 흡수(SPR) 피크로 귀속되는 피크는 확인되지 않았다. 따라서, 실시예 2 및 실시예 3의 복합체는, 실시예 1과 마찬가지로, 금 나노 입자가 응집되거나, 침전물을 형성하지 않는 것을 확인했다.

<제작한 나노 입자의 평가 방법 3>

다음으로, 실시예 2에서 제작한 sAu／GSH-hSA 1, 실시예 3에서 제작한 sAu／GSH-hSA 2 및 비교예 1에서 제작한 sAu／GSH의 등전점을 측정했다. 실험 절차는, 제작한 sAu／GSH-hSA 콜로이드 용액의 pH를 2 내지 12의 범위에서 변화시키고, 동적 광산란법에 의해 측정한 전기 이동도로부터 제타 전위를 산출하는 방법을 이용했다. 용액의 pH 조정은 수산화나트륨, 또는 염산으로 행하고, 제타 전위가 제로가 되는 pH치를 등전점으로 했다.

도 13에, 등전점의 측정 결과를 나타낸다. 도 13에서 분명한 바와 같이, 등전점의 이동이 인정되었기 때문에, sAu／GSH와 인간 혈청 알부민이 복합체를 형성하고 있는 것이 시사되었다. 또한, 실시예 2와 실시예 3에서 등전점이 다르기 때문에, 링커 화합물과 단백질을 아미드 결합시키는 공정에서 사용하는 가교제(EDC 등의 축합제 및 NHS 등의 카르복시산 활성화제)의 양을 조정함으로써, 복합체의 구조가 변화하는(구조가 다른) 것이 시사되었다.

[마우스에의 조영제의 투여 실험 2]

<실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1의 조영제를 마우스에 투여했을 때의 신장 배출의 확인>

실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 제작한 조영제를 이용하고, 조영제를 투여 후의 촬영 시간을, 5min, 60min, 180min, 360min, 24hour로 한 것 이외는, 상기 [마우스에의 조영제의 투여 실험 1]과 마찬가지의 절차로, 조영제를 투여한 후의 신장 배출의 확인을 행했다. 도 14 및 도 15에 마이크로 X선 CT 화상을 나타낸다. 또, 도 14는, 상기 [마우스에의 조영제의 투여 실험 1]과 마찬가지로, 마우스를 복부 방향으로 본 CT 화상을 나타낸다. 또한, 도 15는, 마우스 신장의 축방향 단면(Axial cross section of the kidney)의 CT 화상을 나타낸다. 도 14 중의 화살표는 신장(신우)을 나타내고, 대략 원형의 선은 방광을 나타내고 있다. 또한, 도 15의 대략 원형의 점선은 신장(신우)의 윤곽을 나타내고, 점선 내의 흰 조영 영역은 신장의 신우를 나타내고 있다.

도 14 및 도 15에서 분명한 바와 같이, 비교예 1의 조영제와 비교하여, 실시예 2 및 실시예 3의 조영제가, 투여 후 5 min의 신장을 선명하게 가시화할 수 있었다. 따라서, 실시예 2 및 실시예 3의 조영제는, 비교예 1의 조영제보다 혈중의 체류 시간이 길어지는 것을 확인했다. 또한, 실시예 2 및 실시예 3을 대비하면, 실시예 2의 조영제의 혈중 체류 시간이 길었기 때문에, 링커 화합물과 단백질을 아미드 결합시키는 공정에서 사용하는 가교제의 첨가량을 변화시킴으로써, 조영제의 혈중 체류 시간을 조정할 수 있음을 확인했다.

<실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1의 조영제를 마우스에 투여했을 때의 혈중 반감기의 측정>

실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 제작한 조영제를 이용한 것 이외는, 상기 [마우스에의 조영제의 투여 실험 1]과 마찬가지의 절차로, 조영제의 혈중 반감기의 측정을 행했다. 도 16 및 도 17은, 조영제의 정맥 투여 전후의 마우스 심장 CT 화상을 나타낸다. 또, 도 16은, 상기 [마우스에의 조영제의 투여 실험 1]과 마찬가지로, 마우스 심장의 축방향 단면(Axial cross section of the heart)의 CT 화상을 나타낸다. 도 17은, 마우스 심장의 관상 단면(Coronal cross section of the heart)의 CT 화상을 나타낸다. 또한, 도 16 및 도 17의 점선의 원은 심장의 윤곽을 나타내고, 화살표(백색 및 흑색)의 선단(先端)은 심장의 중격(中隔)의 위치를 나타내고 있다.

도 16 및 도 17에 나타내는 결과로부터, 신장 배출의 실험과 마찬가지로, 실시예 2 및 실시예 3에서 제작한 조영제가, 비교예 1에서 제작한 조영제의 혈중 체류 시간보다 긴 것을 확인했다. 또한, 실시예 2에서 제작한 조영제가, 실시예 3에서 제작한 조영제의 혈중 체류 시간보다 긴 것을 확인했다. 도 18은, 심실의 CT치의 변화를 경시적으로 계측한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 18에 나타내는 결과로부터 각 조영제의 혈중 반감기를 산출하면, 실시예 2의 sAu／GSH-hSA 1은 약 180min, 실시예 3의 sAu／GSH-hSA 2는 약 100min이었다. 대조적으로, 비교예 1의 sAu／GSH는 60min 미만이었다.

이상의 결과로부터, 링커 화합물과 단백질을 아미드 결합시키는 공정에서 사용하는 가교제의 첨가량을 변화시킴으로써, 조영제의 혈중 체류 시간을 조정할 수 있음을 확인했다.

<참고예 1, 링커 결합 금 나노 입자의 제작>

상기 [복합체 및 조영제의 제작 1]의 「(1) 금 나노 입자의 합성」과 마찬가지의 절차로 금 나노 입자를 합성했다. 그 후, 글루타티온으로 바꾸어, 0.25M 2-아미노에탄티올(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.(TCI) 제조, A0648, 2-Aminoethanethiol(＞95％)) 용액을 8mL 첨가하고 12시간 반응시킨 후, pH 조정을 행한 것 이외는, 상기 「(2) 금 나노 입자와 링커 화합물의 결합」과 마찬가지의 절차로, 링커 결합 금 나노 입자를 제작했다. 도 19는, 참고예 1에서 제작한, 2-아미노에탄티올이 결합한 금 나노 입자 용액의 사진이다. 도 19에 나타내는 바와 같이 맑은 액체가 얻어지고, 침전물 등은 확인되지 않았다. 글루타티온을 금 나노 입자에 결합하면 금 나노 입자의 표면에는 카르복시기가 노출되지만, 2-아미노에탄티올을 금 나노 입자에 결합하면 금 나노 입자의 표면에는 아미노기가 노출된다. 단백질은 종류에 따라, 측쇄의 아미노기와 카르복시기의 수가 다르다. 따라서, 복합체를 제작할 때에는, 바람직한 아미드 결합이 얻어지도록, 링커 화합물과 단백질의 조합을 설계하면 된다.

본 출원에서 개시하는 복합체로 조영제를 제작함으로써, 혈관의 경시적 구조 변화를 가시화할 수 있다. 따라서, 의료 산업에 있어서 유용하다.

Claims

금속 나노 입자 및 단백질을 포함하는 복합체로서,
복합체 중의 금속 나노 입자 부분은, 평균 입자경이 1㎚ 이상 5.5㎚ 이하인, 복합체.
제1항에 있어서,
금속 나노 입자 및 단백질은, 링커를 통해 결합해 있는, 복합체.
제2항에 있어서,
복합체를 형성하기 전의 링커는, 티올기, 및 카르복시기 또는 아미노기를 갖는 화합물이며,
복합체 중에서,
티올기의 S 원자는 금속 나노 입자 중의 금속과 결합하고,
카르복시기 또는 아미노기는, 단백질의 아미노기 또는 카르복시기와 아미드 결합해 있는, 복합체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
단백질은, 기능 단백질로부터 선택되는, 복합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
혈중 반감기는, 1 ∼ 3시간인, 복합체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
복합체 중에서, 단백질은 코어가 되고, 금속 나노 입자는 단백질 코어의 표면에 결합해 있는, 복합체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
금속은, 금과, 백금과, 금 및 백금의 합금으로 이루어지는 군에서 선택되는, 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는, 맥관 조영제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는, X선 조영제.
금속 나노 입자와, 단백질과, 링커 화합물을 이용한 복합체의 제조 방법으로서,
상기 복합체 중의 금속 나노 입자 부분은, 평균 입자경이 1㎚ 이상 5.5㎚ 이하이며,
링커 화합물은, 티올기, 및 카르복시기 또는 아미노기를 갖고,
복합체의 제조 방법은,
금속 나노 입자와 링커 화합물을 반응시켜, 티올기의 S 원자를 금속 나노 입자 중의 금속에 결합시키는 링커 결합 금속 나노 입자 제작 공정과,
링커 결합 금속 나노 입자와 단백질을 반응시켜, 링커 결합 금속 나노 입자의 카르복시기 또는 아미노기와, 단백질의 아미노기 또는 카르복시기를 아미드 결합시키는 공정을 포함하는, 복합체의 제조 방법.
금속 나노 입자 및 단백질을 포함하는 복합체로서,
복합체 중의 금속 나노 입자 부분은, 평균 입자경이 1㎚ 이상 5.5㎚ 이하인,
복합체를 이용한 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법으로서,
촬영 방법은,
동물에게 복합체를 투여하고, X선 CT 촬영하며, 적절한 시간 경과 후, 새로운 복합체를 투여하고, X선 CT 촬영하는 촬영 공정을 포함하는, 맥관의 구조 변화를 포착하는 촬영 방법.