CN116744980A - 复合体、脉管造影剂、x射线造影剂、复合体的制造方法及捕捉脉管的结构变化的拍摄方法 - Google Patents

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Abstract

本发明以提供在血管中滞留预定时间之后被排出至体外的X射线造影剂为课题。课题能够通过复合体来解决，所述复合体是包含金属纳米颗粒以及蛋白质的复合体，其中，复合体中的金属纳米颗粒部分的平均粒径为1nm以上且5.5nm以下。

Description

复合体、脉管造影剂、X射线造影剂、复合体的制造方法及捕捉 脉管的结构变化的拍摄方法
技术领域
本申请中的公开涉及复合体、脉管造影剂、X射线造影剂、复合体的制造方法以及捕捉脉管的结构变化的拍摄方法。
背景技术
X射线CT拍摄是能够在in vivo(体内)、三维地将癌等的生物体的病变部位以高分辨率进行可视化的极其有用的测量法。由于骨、牙齿等硬组织有效地吸收X射线，因此能够获得高对比度影像，但是由于癌细胞、普通细胞等软组织的X射线吸收的差异小，因此不能获得高对比度。因此，为了在软组织获得高对比度图像，一般利用造影剂。
作为X射线造影剂，一直以来使用将三碘苯基水溶性化而成的化合物。另外，除三碘苯基以外，已知有将由平均粒径为2.5nm的零价过渡金属微粒与将该过渡金属微粒在水中分散稳定化的非离子性亲水性配体组成的金属微粒复合体作为X射线造影剂而使用。(参照专利文献1)。
然而，由将三碘苯基水溶性化而成的化合物制作的X射线造影剂以及专利文献1所记载的X射线造影剂存在没有与组织、患病部位进行相互作用的情况下被从管腔部分排出这一问题。
作为解决上述问题的X射线造影剂，已知有通过将包含化合物与零价过渡金属微粒的金属微粒复合体作为X射线造影剂而使用，尤其能够在肿瘤部分维持造影水平，上述化合物含有与转铁蛋白反应后的聚亚烷基二醇部分(参照专利文献2)。
另外，也已知有通过将X射线吸收纳米颗粒与荧光纳米颗粒结合，从而作为将癌等病灶特异性地造影的X射线CT造影剂而发挥功能，并且也作为荧光标记剂而发挥功能的X射线造影剂(参照专利文献3)。而且，在专利文献3中记载有如下内容：在能使用X射线CT等而能从体外观察的X射线、以及灵敏度高的荧光这两种模式下的造影成为可能，因而在进行手术等处置时即使不使用高价的PET造影也能实时确定病灶的位置、大小、范围，能低价地进行诊断以及处置。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10-330288号公报
专利文献2：日本特开2005-120034号公报
专利文献3：国际公开第2012/153820号
发明内容
发明所要解决的问题
肿瘤血管对癌组织的生长、转移起着重要的作用。因此，准确地将肿瘤血管的结构可视化的技术在癌的机理阐明、抗癌药的药效评价中极其重要。血管的X射线CT拍摄一般通过点滴将造影剂进行给药并在最佳时机进行拍摄。然而，因为小鼠等实验动物的血管非常细，所以将显微X射线CT装置用于血管的拍摄的情况较多。该显微X射线CT装置的高分辨率换来的是需要拍摄时间。然而，由以往的三碘苯基水溶性化而成的化合物制作的X射线造影剂以及专利文献1所记载的X射线造影剂在血液中的滞留时间短，因而存在很难获得血管的X射线CT图像这一问题。
另一方面，在专利文献3所记载的X射线造影剂能够获得肿瘤组织的X射线CT图像。然而，新发现了存在如下问题，由于X射线造影剂不被排出至体外而在漏出到血管外后留在肿瘤组织内，因此很难获得源自肿瘤血管的X射线的对比度图像，且作为其结果是，肿瘤血管的经时的结构变化难以可视化，在现状中，尚不知在血管中滞留预定时间并在之后被排泄至体外的X射线造影剂。
本申请中的公开是为了解决上述问题而完成的，进行深入研究后新发现了如下内容：即使是会被肾排泄的尺寸的金属纳米颗粒，也能通过使用蛋白质而形成复合体，从而能够作为适于血管等脉管的X射线CT拍摄的造影剂的材料而使用。
即，本申请中的公开的目的在于提供能够作为脉管的X射线CT拍摄的造影剂的材料而使用的复合体、包含该复合体的脉管造影剂以及X射线造影剂、复合体的制造方法以及捕捉脉管的结构变化的拍摄方法。
用于解决问题的手段
(1)一种复合体，其是包含金属纳米颗粒以及蛋白质的复合体，其中，
复合体中的金属纳米颗粒部分的平均粒径为1nm以上且5.5nm以下。
(2)上述(1)所述的复合体，其中，
金属纳米颗粒以及蛋白质经由连接子而结合。
(3)上述(2)所述的复合体，其中，
形成复合体前的连接子是具有巯基、以及羧基或氨基的化合物，
在复合体中，
巯基的S原子与金属纳米颗粒中的金属结合，
羧基或氨基与蛋白质的氨基或羧基酰胺结合。
(4)上述(1)至(3)中任一项所述的复合体，其中，
蛋白质选自功能蛋白质。
(5)上述(1)至(4)中任一项所述的复合体，其中，
血中半衰期为1～3小时。
(6)上述(1)至(5)中任一项所述的复合体，其中，
在复合体中，蛋白质成为核心，金属纳米颗粒结合于蛋白质核心的表面。
(7)上述(1)至(6)中任一项所述的复合体，其中，
金属选自由金、铂、金以及铂的合金组成的群组。
(8)一种脉管造影剂，其中，
所述脉管造影剂包含上述(1)至(7)中任一项所述的复合体。
(9)一种X射线造影剂，其中，
所述X射线造影剂包含上述(1)至(7)中任一项所述的复合体。
(10)一种复合体的制造方法，其是使用了金属纳米颗粒、蛋白质以及连接子化合物的复合体的制造方法，其中，
该复合体中的金属纳米颗粒部分的平均粒径为1nm以上且5.5nm以下，
连接子化合物具有巯基、以及羧基或氨基，
复合体的制造方法包括：
使金属纳米颗粒与连接子化合物反应，并使巯基的S原子与金属纳米颗粒中的金属结合的连接子结合金属纳米颗粒制作工序；以及
使连接子结合金属纳米颗粒与蛋白质反应，并使连接子结合金属纳米颗粒的羧基或氨基与蛋白质的氨基或羧基酰胺结合的工序。
(11)一种捕捉脉管的结构变化的拍摄方法，其是使用了复合体的捕捉脉管的结构变化的拍摄方法，所述复合体包含金属纳米颗粒以及蛋白质，复合体中的金属纳米颗粒部分的平均粒径为1nm以上且5.5nm以下，其中，
所述拍摄方法包括对动物进行复合体的给药、进行X射线CT拍摄，经过适当的时间后进行新的复合体的给药、进行X射线CT拍摄的拍摄工序。
发明效果
若将本申请公开的复合体作为造影剂而使用，则能够将脉管的经时的结构变化可视化。
附图说明
图1是附图代用照片，图1中的A是通过实施例1制作的sAu/GSH-LF的TEM照片，图1中的B是通过比较例1制作的sAu/GSH的TEM照片，图1中的C是通过比较例2制作的AuNP-PEG的TEM照片。
图2是附图代用照片，是将通过实施例1制作的sAu/GSH-LF胶体溶液以及通过比较例1制作的sAu/GSH胶体溶液进行电泳后的照片。
图3是通过实施例1制作的sAu/GSH-LF胶体溶液以及通过比较例1制作的sAu/GSH胶体溶液的UV-VIS光谱测定结果。
图4是附图代用照片，图4中的a至图4中的d是对小鼠的尾静脉进行比较例1制作的造影剂的给药后的显微X射线CT图像。
图5是附图代用照片，图5中的A以及图5中的B是对小鼠的尾静脉进行比较例2制作的造影剂的给药后的显微X射线CT图像。
图6是附图代用照片，是实施例1制作的sAu/GSH-LF造影剂、比较例1制作的sAu/GSH造影剂以及比较例3的碘帕醇(iopamidol)的静脉给药前后的小鼠心脏CT图像。
图7是表示对实施例1制作的sAu/GSH-LF造影剂、比较例1制作的sAu/GSH造影剂以及比较例3的碘帕醇(iopamidol)的静脉给药前后的小鼠心脏的心室的CT值的变化进行经时地测量的结果的图表。
图8中的a是表示使用实施例1制作的sAu/GSH-LF造影剂、比较例1制作的sAu/GSH造影剂以及比较例2制作的15nm AuNP-PEG造影剂将伴随肿瘤的生长的相同血管的变化可视化的实验的概要的图。图8中的b至图8中的j是附图代用照片，是肿瘤部分的CT图像。
图9是附图代用照片，图9中的a是图8中的i的放大图像，图9中的b是图8中的j的放大图像。
图10是附图代用照片，是实施例2制作的sAu/GSH-hSA 1的TEM照片。
图11是附图代用照片，是对实施例2制作的胶体溶液(sAu/GSH-hSA 1)、实施例3制作的胶体溶液(sAu/GSH-hSA 2)以及比较例1制作的胶体溶液(sAu/GSH)进行电泳后的照片。
图12是实施例2制作的胶体溶液、实施例3制作的胶体溶液以及比较例1制作的胶体溶液的UV-VIS光谱测定结果。
图13是实施例2制作的胶体溶液、实施例3制作的胶体溶液以及比较例1制作的胶体溶液的等电点的测定结果。
图14是附图代用照片，是对小鼠的尾静脉进行实施例2、实施例3以及比较例1制作的造影剂的给药后的显微X射线CT图像。
图15是附图代用照片，是对小鼠的尾静脉进行实施例2、实施例3以及比较例1制作的造影剂的给药后的显微X射线CT图像(小鼠肾脏的轴向剖面)。
图16是附图代用照片，是实施例2、实施例3以及比较例1制作的造影剂的静脉给药前后的小鼠心脏CT图像(小鼠心脏的轴向剖面)。
图17是附图代用照片，是实施例2、实施例3以及比较例1制作的造影剂的静脉给药前后的小鼠心脏CT图像(小鼠心脏的冠状剖面)。
图18是表示对实施例2、实施例3以及比较例1制作的造影剂的静脉给药前后的小鼠心脏的心室的CT值的变化进行经时地测量的结果的图表。
图19是附图代用照片，是参考例1制作的连接子结合金纳米颗粒溶液的照片。
具体实施方式
以下，对在本申请公开的复合体、脉管造影剂、X射线造影剂、复合体的制造方法以及捕捉脉管的结构变化的拍摄方法进行详细地说明。
需要说明的是，在本说明书中，用“～”表示的数值范围是指将记载于“～”的前后的数值作为下限值以及上限值而包括在内的范围。另外，在本说明书中，对于数值、数值范围以及定性的表述(例如，“相同”、“相等”等表述)，解释为表示包括在该技术领域中一般允许的误差的数值、数值范围以及性质。
(复合体的实施方式)
复合体的实施方式包含金属纳米颗粒以及蛋白质。
(金属纳米颗粒)
金属纳米颗粒的平均粒径的下限优选为1nm以上，也可以是1.25nm以上、1.5nm以上、1.75nm以上、2nm以上。若平均粒径小于1nm，则因为X射线的吸收量变少，所以变得很难得到高对比度图像。另外，若平均粒径小于1nm，则金属纳米颗粒的比表面积变小，很难形成与蛋白质的复合体。
另一方面，对于金属纳米颗粒的平均粒径的上限，本发明的发明人根据后文所述的比较例的结果确认到，在金属纳米颗粒的平均粒径较小的情况下被肾排出，但是在金属纳米颗粒的平均粒径较大的情况下留在肿瘤组织内。据考虑，平均粒径较大的金属纳米颗粒留在肿瘤组织内的理由是EPR效应(Enhanced Permeation and Retention Effect：高通透性和滞留效应)。换句话说，据考虑在金属纳米颗粒的平均粒径较大的情况下，因为不被肾排出，所以金属纳米颗粒滞留在血液中，其结果是，示出了EPR效应。因此，为了以能够将血管的经时的结构变化可视化的方式对血管进行X射线CT拍摄，需要将金属纳米颗粒设为从体内被肾排出的尺寸。
作为肾排泄的重要的组织的肾小球由血管、肾小球滤过膜、肾小囊构成。其中，作为滤过功能而重要的肾小球膜成为基于糖蛋白、内皮细胞、肾小球基底膜以及足细胞的多层结构。内皮细胞、肾小球基底膜以及足细胞的滤过功能的狭缝间隔分别为70～90nm、2～8nm、以及4～11nm。因此，已知有尺寸小于6nm的纳米颗粒、蛋白质能够通过肾小球滤过膜，但是6nm以上的颗粒很难通过该滤过膜(Bujie Du et al，“Transport and interactionsof nanoparticles in the kidneys”，Nat.Rev.Mater.，3(2018)，pp.358-374)。
在上述文献所记载的能够肾排出的颗粒的尺寸是在人类的肾脏的情况下的尺寸。在假定人类的情况下，金属纳米颗粒的平均粒径的上限优选为小于6nm，也可以是5.5nm以下、5.25nm以下、5nm以下、4.75nm以下、4.5nm以下、4.25nm以下、4nm以下。需要说明的是，即使动物的种类不同，能够通过动物的肾小球滤过膜的颗粒的尺寸也没有大幅的差异。因此，金属纳米颗粒的平均粒径的上限可以不受动物的种类的影响而设为与上述尺寸相同的尺寸，也可以根据动物的种类而设为比上述尺寸略大或略小的尺寸。换言之，也可以说金属纳米颗粒的上限是能够由作为拍摄对象的动物的肾脏排出的尺寸。
需要说明的是，在本说明书中，金属纳米颗粒的“平均粒径”是指将通过电子显微镜拍摄到的图像使用ImageJ/Fiji进行解析后的多个金属纳米颗粒的颗粒直径的平均值。
用于形成金属纳米颗粒的元素只要是能够吸收X射线的元素，则没有特别的限制，但是优选由X射线的吸收性能高的元素构成。因为一般存在原子序数越大的元素，X射线的吸收性能越高的倾向，所以优选由原子序数大的元素构成。具体地说，可列举属于元素周期表的第四周期以上的元素。因为X射线吸收性能高并能实用地进行X射线造影，所以元素周期表的第五周期以上、即原子序数大概为40以上的元素优选作为构成金属纳米颗粒的元素而使用。作为上述元素的更具体的例子，可列举Ag、I、Ba、Au、Bi、Gd、Pt、Ru、Rh、Pd、Os、Ir等。其中，从原子的X射线衰减系数来看，特别优选Au(金)、Pt(铂)、金与铂的合金。
金属纳米颗粒只要通过公知的方法制作即可，例如能够通过将包含金属元素的溶液进行还原来制作。关于金纳米颗粒，通过后文所述的实施例示出具体的合成步骤。另外，对于铂纳米颗粒，例如只要参照William W.Bryan et al.，“Preparation of THPC-generated silver，platinum，and palladium nanoparticles and their use in thesynthesis of Ag，Pt，Pd，and Pt/Ag nanoshells”，RSC Adv.，2016，6，68150-68159，以及Hideyuki Nagao et al.，“Synthesis of Platinum Nanoparticles by ReductiveCrystallization Using Polyethyleneimine”，Chem.Eng.Technol.2017，40，No.7，1242-1246等来制作即可。另外，对于金与铂的合金纳米颗粒，例如只要参照Yi Cao et al.，“Fe(II)-Assisted one-pot synthesis of ultra-small core-shell Au-Pt nanoparticlesas superior catalysts towards the HER and ORR”，Nanoscale，2020，12，20456-20466等来制作即可。金属纳米颗粒的尺寸能够通过原料的浓度、反应时间来调整。
需要说明的是，关于由金属制作的微粒，已知有亚纳米团簇。亚纳米团簇是由比较少数的原子构成的尺寸为1nm以下的亚纳米量级的微粒。然而，亚纳米团簇在吸收与发光的方面表现出如分子那样的光学跃迁，在结构与物理特性两方面与由相同的元素制作的金属纳米颗粒大不相同。因此，本申请中公开的金属纳米颗粒与亚纳米团簇作为物质是完全不同的物质。另外，亚纳米团簇用于催化等用途，与在本申请公开的X射线造影用的用途不同。
(蛋白质)
蛋白质用于通过与保持原样则会迅速被肾排泄的尺寸的金属纳米颗粒形成复合体而延迟金属纳米颗粒的肾排泄时间。
蛋白质只要能够延迟金属纳米颗粒的肾排泄时间，则没有特别的限制，但是优选为选自功能蛋白质。蛋白质能够大致分为以下两种：(1)构成骨、软骨、腱等的胶原蛋白、构成毛发、指甲等的角蛋白等的、构成生物体的结构蛋白质；(2)将酶、物质向体内输送等、与体内的化学反应有关的功能蛋白质。在本申请公开的复合体需要在经过预定时间后被肾排出。因此，用于复合体的蛋白质优选为比结构蛋白质容易分解的功能蛋白质的一方。
对于功能蛋白质，已知有进行催化作用与代谢的调节的酶、传送信息的激素、细胞因子、与物质的输送、储存有关的输送蛋白质、储存蛋白质、构成免疫机构的抗体等。其中，因为包含于血液中的输送蛋白质在通常的状态下是包含于血液的成分，所以在将包含该成分的复合体对生物体内进行给药时，不易引起排斥反应。因此，从生物体适合性的观点出发，优选为包含于血液中的蛋白质。包含于血液中的蛋白质大多为输送蛋白质。因此，可以说优选为输送蛋白质。另外，如后文所述的实施例所示，在本申请公开的复合体中，蛋白质在血中分解从而金属纳米颗粒被肾排出。因此，也可以说优选使用血中分解性蛋白质作为蛋白质。作为优选的蛋白质的例子，例如可列举白蛋白、球蛋白、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、乳铁蛋白等。另外，作为包含于血液中的蛋白质、输送蛋白质以外的优选的蛋白质，可列举亲和素、链霉亲和素等。
需要说明的是，上述的蛋白质的种类仅是具体的蛋白质的例示，不限于所例示的蛋白质。只要是能起到对在本申请公开的复合体追求的功能，也可以是其它蛋白质。另外，只要是在起到对在本申请公开的复合体追求的功能的范围内，则取代或者缺损了在上述例示的蛋白质的一部分序列的蛋白质也包含于作为具体例而列举过的蛋白质中。另外，蛋白质也可以根据需要而组合使用。
实施方式所涉及的复合体只要包含金属纳米颗粒与蛋白质，则没有特别的限制。例如，在作为构成蛋白质的氨基酸的半胱氨酸中包含巯基(-SH)。另外，金属与S原子结合是公知的。因此，通过从半胱氨酸的巯基除去H原子并使S原子与金属结合，能够形成金属纳米颗粒与蛋白质的复合体。
如上所述，虽然能够通过将金属纳米颗粒以及蛋白质直接结合而形成复合体，但是金属纳米颗粒以及蛋白质也可以任意附加地经由连接子而结合。例如，通过使用具有巯基、以及羧基或氨基的连接子化合物，使金属纳米颗粒以及蛋白质经由连接子而结合。
在使用了包含巯基(-SH)以及羧基(-COOH)的连接子化合物的情况下，巯基的S原子与金属纳米颗粒结合(配位结合)，羧基与蛋白质的氨基(-NH2)酰胺结合。其结果是，金属纳米颗粒与蛋白质经由连接子结合从而能够形成复合体。
在使用了包含巯基(-SH)以及氨基(-NH2)的连接子化合物的情况下，巯基的S原子与金属纳米颗粒结合(配位结合)，氨基与蛋白质的羧基酰胺结合。其结果是，金属纳米颗粒与蛋白质经由连接子结合从而能够形成复合体。
连接子化合物包含巯基、以及羧基或氨基，只要能够与金属纳米颗粒以及蛋白质结合，则没有特别的限定。作为包含巯基以及羧基的连接子化合物的具体例，例如可列举以下的以式(1)表示的谷胱甘肽(还原型)、以式(2)表示的巯基丙酸、以式(3)表示的聚(乙二醇)2-巯基乙醚乙酸等。
需要说明的是，以式(3)表示的聚(乙二醇)2-巯基乙醚乙酸优选为分子量为500～7500左右。式(3)中的n以成为该分子量的方式来适当调整即可。作为以式(3)表示的化合物的具体例，例如可列举能够从Sigma-Aldrich公司获得的HS-PEG3500-COOH以及HS-PEG7500-COOH等。
[化1]
作为包含巯基以及氨基的连接子化合物的具体例，例如可列举以下的以式(4)表示的2-氨基乙硫醇、以式(5)表示的HS-PEG-NH2(M.W.400～5000，NANOCS公司制造等)、以式(6)表示的HS-(CH2)11-NH2(盐酸盐)等。
[化2]
在本申请公开的复合体能够通过包含金属纳米颗粒以及蛋白质来调整血液中的滞留时间。因此，在本申请公开的复合体起到能够用于拍摄癌组织的血管新生的经时的结构变化的造影剂这一显著效果，但是用途不限于血管拍摄。作为血管拍摄以外的用途，只要是能够通过X射线CT拍摄的组织则没有限制，例如，可以作为淋巴管的拍摄用的造影剂而使用。换言之，本申请公开的复合体能够作为脉管(血管、淋巴管)的造影剂而使用。
复合体的尺寸根据动脉、静脉以及毛细血管等的作为目标的血管的尺寸、淋巴管的尺寸以及人、实验用小鼠等拍摄对象来适当调整即可。在包含于人的血液的成分中，例如，红血球是直径为约7.5μm的大致圆盘状，淋巴细胞为约10～15μm左右。因此，例如，如果将复合体的尺寸调整为150nm以下，则无需担心血管、淋巴管堵塞。复合体的尺寸能够在后文所述的复合体的制造方法中通过改变连接子结合金属纳米颗粒与蛋白质的量来调整。
本申请公开的复合体优选为到给药后X射线CT的拍摄结束为止滞留在血中并在下一次X射线CT拍摄前被肾排出。因此，复合体的血中半衰期调整为0.5小时～12小时左右，优选调整为0.75小时～6小时左右，更优选调整为1小时～3小时左右即可。通过将血中半衰期调整为上述的时间，从而尤其能够将癌组织的血管新生的经时的结构变化可视化。当然，在不拍摄经时的结构变化，而是拍摄暂时的结构或使用一般的X射线CT拍摄装置的情况下，血中半衰期可以设为比上述血中半衰期短，也可以设为比上述血中半衰期长。血中半衰期能够通过改变蛋白质的种类、复合体的大小来调整。需要说明的是，在本说明书中，“血中半衰期”是指复合体的X射线CT值从生物体给药后的最大值减半的时间。其中，由于造影剂给药后能开始X射线CT拍摄的最短的时间约为5min，因此在本说明书中将造影剂给药后5min后开始了X射线CT拍摄时的测定值定义为“生物体给药后的最大值”。
(脉管造影剂以及X射线造影剂的实施方式)
本申请公开的复合体通过作为脉管造影剂而使用，从而例如能够将血管的经时的结构变化可视化，但是不限定于脉管拍摄用的用途。因为复合体包含吸收X射线的金属纳米颗粒，所以也能够作为以脉管以外作为对象的X射线造影剂而使用。
需要说明的是，X射线造影剂中，X射线的吸收与原子序数以指数函数关系成比例，金属纳米颗粒的量变得越多(在相同个数的情况下，金属纳米颗粒的尺寸变得越大)越能得到高的对比度。另一方面，作为造影剂，还已知有MRI造影剂。然而，在MRI拍摄的情况下，造影剂的量与对比度之间并不总是相关。因此，MRI造影剂与X射线CT造影剂是开发的方向性不同的不同技术。
在将复合体作为脉管造影剂和/或X射线造影剂而使用时，将复合体分散于水、生理盐水、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等缓冲液等的介质中即可。另外，也可以根据需要添加氯化钠等盐类、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇等糖类。通过添加该盐类和/或糖类，能够使造影剂相对于体内的浸透压等渗。
(复合体的制造方法的实施方式)
复合体能够使用上述记载的金属纳米颗粒、蛋白质、连接子化合物来制造。复合体的制造方法包括：
(1)使金属纳米颗粒与连接子化合物反应，并将巯基的S原子与金属纳米颗粒结合的连接子结合金属纳米颗粒制作工序；以及
(2)使连接子结合金属纳米颗粒与蛋白质反应，并使连接子结合金属纳米颗粒的羧基或氨基与蛋白质的氨基或羧基酰胺结合的工序。
需要说明的是，在本说明书中“连接子结合金属纳米颗粒”从上述反应可知是指连接子化合物以及金属纳米颗粒的反应生成物。在连接子结合金属纳米颗粒中，连接子化合物的巯基与金属纳米颗粒结合，但是连接子化合物的羧基或氨基以未反应的状态存在。
在复合体的制造方法中，首先，将连接子化合物与金属纳米颗粒结合。金属纳米颗粒的凝结性高，但是通过将连接子化合物先与金属纳米颗粒结合，使金属纳米颗粒变得不易凝结。换句话说，连接子化合物在将金属纳米颗粒与蛋白质结合的功能的基础上，也作为制造复合体时的金属纳米颗粒的分散稳定剂(抗凝剂)而发挥功能。金属纳米颗粒与巯基的结合(配位结合)通过公知的方法来实施即可。
在连接子化合物与蛋白质的结合工序中，只要能将羧基与氨基共价结合，则没有特别的限定。例如，利用能够使用简单且简便并高效的偶联剂(交联剂)的酰胺结合即可。需要说明的是，如后文所述的实施例所示，在将连接子化合物的羧基或氨基与蛋白质的侧链的酰胺基或羧基酰胺结合时，通过调整交联剂的量而能够调整复合体(造影剂)的血中滞留时间。因此，为了制作具有所希望的血中滞留时间的复合体，也可以在实施连接子化合物与蛋白质的结合工序前实施交联剂的添加量的计算工序。交联剂的添加量通过对改变了交联剂的添加量的多种复合体与血中滞留时间的相关关系事先进行实验来计算即可。作为交联剂，可列举作为缩合剂而使用的水溶性碳化二亚胺(Water Soluble Carbodiimide：WSC。需要说明的是，有时也称为EDC。)、以及作为羧酸活性剂而使用的N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide：NHS)的组合等。需要说明的是，NHS也可以使用作为其水溶性类似物的Sulfo-NHS。在改变交联剂的添加量时，可以使WSC以及NHS之比相同而改变添加量，也可以改变WSC以及NHS之比。
如上所述，在本申请公开的复合体的制造方法中，首先实施将金属纳米颗粒与连接子化合物结合而制作连接子结合金属纳米颗粒的工序，接着实施将连接子结合金属纳米颗粒与蛋白质结合的工序。另一方面，在专利文献2中，首先实施制作“Tf-PEG-SH”的工序，接着实施将“Tf-PEG-SH”与金属微粒结合的工序。在将本申请公开的复合体的制造方法以及专利文献2所记载的复合体的制造方法进行对比的情况下，由于制造工序的顺序不同而存在以下的差异。
(1)所制造的复合体的结构的差异
在本申请公开的复合体中，蛋白质成为核心(中心)且金属纳米颗粒形成于蛋白质核心的表面。另一方面，在专利文献2中，金属微粒成为核心并在金属微粒的表面形成“Tf-PEG-SH”。因此，对于本申请公开的复合体，通过调整蛋白质的缩合，能够在不变更金属纳米粒径的情况下调整复合体的粒径。另一方面，专利文献2所记载的复合体的粒径取决于金属微粒的粒径。因此，对于专利文献2所记载的复合体，虽然能够通过扩大金属微粒的粒径而调整复合体的粒径，但是如上所述，若过度扩大金属微粒的粒径，则丧失肾排泄功能。
(2)制造工序的便利性的提高
专利文献2的“Tf-PEG-SH”有可能因氧化还原反应而形成作为二聚体的“Tf-PEG-S-S-PEG-Tf”。因此，需要在制造工序中留意“Tf-PEG-SH”的稳定性。另一方面，在本申请公开的制造方法中，在连接子化合物与金属纳米颗粒结合后，连接子结合金属纳米颗粒不会二聚化。因此，制造工序的便利性提高。
(捕捉脉管的结构变化的拍摄方法的实施方式)
通过使用本申请公开的复合体，能够拍摄脉管的结构变化。捕捉脉管的结构变化的拍摄方法包括对动物进行复合体的给药、进行X射线CT拍摄，经过适当的时间后进行新的复合体的给药、进行X射线CT拍摄的拍摄工序。
作为拍摄对象的动物只要有脉管，则没有特别的限定。例如可列举人、小鼠、大鼠、兔子、猪、猴等。需要说明的是，人也可以被移除至动物之外。
对动物的复合体的给药与一般的脉管造影剂的给药同样地进行即可。例如，可以通过注射给药，也可以通过注射器等持续性地给药。
拍摄工序只要能够通过进行复合体的给药、进行X射线CT拍摄，经过适当的时间后进行新的复合体的给药、进行X射线CT拍摄而捕捉脉管的结构变化，则没有特别的限定。适当的时间根据拍摄对象以及拍摄目的来适当选择即可。需要说明的是，在本说明书中“脉管的结构变化”是指例如肿瘤等中的血管的新生、现有的血管的经时变化等、血管、淋巴管的经时的形状的变化。拍摄工序的次数只要是两次以上，就能捕捉脉管的结构变化。另一方面，拍摄工序的次数没有特别的上限，是能够观察成为拍摄对象的脉管的结构变化的次数即可。另外，X射线CT拍摄的间隔只要是能够将脉管的结构的变化可视化的间隔，则没有特别的限制，根据拍摄对象的脉管的结构变化来适当调整即可。例如，在拍摄血管的新生的情况下，每隔12小时～48小时，优选为每隔18小时～36小时，更优选为每隔24小时进行拍摄即可。当然，上述时间仅是一个例子，拍摄工序的间隔也可以比上述时间短或长。淋巴管的可视化在癌转移的机理阐明、人类的癌的前哨淋巴结的可视化中也很重要。在拍摄淋巴管时也与血管同样地根据拍摄对象的淋巴管的结构变化来适当调整时间即可。另外，如上所述，本申请公开的造影剂能够调整血中滞留时间。因此，可以在进行复合体的给药前，根据进行X射线CT拍摄的间隔来实施选择具有合适的血中滞留时间的造影剂的工序(或者制作的工序)。
以下列举实施例对本申请公开的实施方式进行具体地说明，但是该实施例仅用于实施方式的说明。不限定或表示限定本申请公开的发明的范围。
实施例
[复合体以及造影剂的制作1]
＜实施例1＞
通过在以下记载的步骤而制作了复合体。
(1)金纳米颗粒的合成
在25℃下，向235.0mL的0.001M HAuCl4水溶液添加7.5mL的进行了用时调整的0.07M四(羟甲基)氯化磷(THPC)水溶液，接着添加了7.5mL的1.0MNaOH水溶液。搅拌15min，从而制作了金纳米颗粒(sAuNP)。溶液的颜色在15min后变为了茶色，由此启示了sAuNP形成。需要说明的是，HAuCl4使用了FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，99％，作为还原剂的THPC使用了Tokyo Chemical Industry(大约80％的水溶液)。
(2)金纳米颗粒与连接子化合物的结合
为了将作为连接子化合物的谷胱甘肽(GSH；FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation)修饰(结合)在sAuNP表面，向sAuNP胶体溶液加入2mL的0.25MGSH水溶液，反应12h，从而制备了sAu/GSH胶体溶液。反应后，用蒸发器从sAu/GSH胶体溶液除去溶剂而将总量浓缩为了约1/10。使用12-14kDa透析管(Visking tube，AS ONE)在2L超纯水中将浓缩后的sAu/GSH胶体溶液进行了24h透析清洗。再次用蒸发器将分散介质除去而将清洗后的sAu/GSH胶体溶液粉碎。接着，将粉碎后的sAu/GSH再分散于PBS。在以上的过程中，若假定HAuCl4全部被还原且在清洗、浓缩过程中没有损失，则预估的最终Au浓度为0.5M。再分散后的溶液呈橙色，未确认到沉淀物等。
需要说明的是，也能够不使用THPC作为还原剂而将HAuCl4水溶液与谷胱甘肽水溶液混合并搅拌而制作sAu/GSH，但是反应需要约2周。另一方面，因为在通过实施例公开的制造方法中作为还原剂而使用了THPC，所以用约半天制作了sAu/GSH。在作为还原剂而使用了THPC的情况下，合成效率非常高效化。
(3)连接子结合金纳米颗粒与蛋白质的结合
向1mL的浓缩后的sAu/GSH胶体溶液加入100mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC；DOJINDO，98％)与100mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺磺酸钠盐(sulfo-NHS；Tokyo Chemical Industry，98％)而在37℃下搅拌了30min。之后，添加1mL的80mg/mL的乳铁蛋白(LF，MW：80kDa，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，95％)PBS溶液而在37℃下反应了12h。反应后，通过以与sAu/GSH同样的方法清洗以及浓缩而制备了sAu/GSH-LF胶体溶液(复合体)。溶液呈深橙色，未确认到凝结体、沉淀物。因此可知在使sAu/GSH与LF共价结合(酰胺结合)而复合化后，胶体稳定性也高。将制作的复合体的胶体溶液直接作为造影剂而进行了使用。
＜比较例1＞
将没有实施实施例1的“(3)连接子结合金纳米颗粒与蛋白质的结合”的sAu/GSH的胶体溶液直接作为了比较例1的造影剂。
＜比较例2＞
将99.4mg的四氯金酸(III)四水合物(HAuCl4·4H2O)溶解于233mL的超纯水并加热而使其沸腾。一边不停地搅拌氯金酸水溶液，一边添加28mL的39mM柠檬酸钠(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation，99％)水溶液，以恒定的转速搅拌了30min。在冷却至25℃后，为了将聚乙二醇(PEG)修饰于金纳米颗粒表面，向金纳米颗粒胶体溶液加入99.4mg的HOOC-PEG-SH(thiol carboxylic PEG，MW：5000，Nanocos Inc.)并在25℃下搅拌8h，从而制作了AuNP-PEG。在15000rpm、45min的条件下对制作的AuNP-PEG胶体溶液进行了离心清洗。之后，在15000rpm、60min的条件下反复进行多次离心浓缩，最终得到了Au浓度为0.5M的AuNP-PEG胶体溶液。需要说明的是，PEG是金纳米颗粒的分散稳定剂。将制作的AuNP-PEG胶体溶液直接作为了比较例2的造影剂。
＜比较例3＞
将作为市售的碘类血管造影剂的碘帕醇(Bayer药品公司制造的碘帕醇注射液300)作为了比较例3。
＜制作的纳米颗粒的评价方法1＞
在200kV的条件下利用TEM(JEM-2100，JEOL)评价了纳米颗粒的形态。通过将胶体溶液滴加在被胶棉包覆的铜栅(JEOL)上，使溶剂蒸发而准备了TEM观察用试样。使用ImageJ/Fiji测定多个颗粒直径而计算了体积平均颗粒尺寸。使用Ultrospec700分光光度计(GE Healthcare Life Sciences)测定了颗粒胶体溶液的UV-Vis光谱。在50％ TAE缓冲液(Tris-acetate-EDTA；Nippon Gene)中使用1％琼脂糖(Promega)凝胶而实施(操作条件：100KV，10min)了琼脂糖凝胶电泳。
图1中的A表示实施例1制作的sAu/GSH-LF的TEM照片，图1中的B表示比较例1制作的sAu/GSH的TEM照片，图1中的C表示比较例2制作的AuNP-PEG的TEM照片。实施例1制作的sAu/GSH-LF的平均粒径为17.3±2.8nm。需要说明的是，实施例1因为金纳米颗粒与蛋白质形成了复合体所以不会成为球状。因此，基于图1中的A的箭头所示的金纳米颗粒聚集的复合体部分的长轴方向的长度计算了平均粒径。确认到比较例1的sAu/GSH是平均粒径为2.2±0.7nm的单分散的大致球形。确认到比较例2的AuNP-PEG也是平均粒径为15.1±nm的单分散的大致球形。
图2表示将实施例1制作的sAu/GSH-LF胶体溶液以及比较例1制作的sAu/GSH胶体溶液进行电泳后的照片。图3表示实施例1制作的sAu/GSH-LF胶体溶液以及比较例1制作的sAu/GSH胶体溶液的UV-VIS光谱测定结果。
从图2可知，sAu/GSH-LF没有比sAu/GSH向阳极侧(图2的照片方向下侧)移动。换句话说，意味着sAu/GSH-LF与sAu/GSH相比，颗粒直径增加或者表面电荷发生了变化。因此，根据实施例1，确认到形成了复合体。另外，从图3可知，sAu/GSH-LF以及sAu/GSH的消光光谱类似，并且未确认到属于表面等离子体共振吸收(SPR)峰的峰。因此，确认到通过使蛋白质与连接子化合物和金纳米颗粒结合而成的sAu/GSH结合的操作，金纳米颗粒不凝结，不形成沉淀物。
[对小鼠的造影剂的给药实验1]
＜模型小鼠的制作＞
(1)细胞培养
对源自BALB/c的结肠癌细胞colon-26(CT26：RIKEN BioResource ResearchCenter，RCB2657)以包含10％的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640(Life TechnologiesCorporation)，在5％ CO2、37℃的条件下进行了保湿培养。
(2)载癌模型小鼠的制作
使用了作为5～11周龄的野生型小鼠的BALB/c(Charles River LaboratoriesJapan)的雄性小鼠。对通过上述(1)培养的1×107的colon-26细胞进行了皮下移植。根据东北大学的实验动物委员会承认的准则对使用的动物进行了处理。
＜显微X射线CT拍摄＞
在管电压50kV、管电流500μA、35μm/voxel或18μm/voxel或9μm/voxel的条件下使用显微X射线CT装置(SkyScan1176，Bruker)进行了拍摄。在体外(In vitro)，对实施例1以及比较例1及比较例2合成的造影剂进行了拍摄。在体外，对进行麻醉处理的小鼠从尾静脉注入200μL的各造影剂而进行了1～2次CT拍摄。分别使用CTAn(Bruker)以及CTvox而获得了切片图像与体绘制图像。将空气与水的Hounsfield Units(亨氏单位)(HU)的值分别定义为-1000以及0而计算出了CT值。
＜将比较例1的造影剂对小鼠进行给药时的肾排出的确认＞
将对小鼠的尾静脉进行比较例1制作的造影剂的给药后的显微X射线CT图像示于图4。图4中的(a)是造影剂的给药前的图像，图4中的(b)是从进行造影剂给药后5min后拍摄的图像，图4中的(c)是从进行造影剂给药后60min后拍摄的图像，图4中的(d)是从进行造影剂给药后24h后拍摄的图像。图中的箭头为肾脏，虚线的圆为膀胱。如图4中的(b)所示，在给药后5min，能够清晰地可视化肾脏与膀胱。进一步地，在给药后60min时，肾脏的图像几乎消失，因此确认到血中的造影剂几乎分解，大部分的金纳米颗粒集聚于膀胱(图4中的(c))，在24h时造影剂被排泄至生物体外(图4中的(d))。
＜对小鼠进行比较例2的造影剂的给药时的癌组织的图像＞
图5表示对小鼠的尾静脉进行比较例2制作的造影剂的给药后的显微X射线CT图像。图5中的A是刚进行造影剂的给药后的图像，图5中的B是进行造影剂的给药后3天后的图像。图中的虚线的椭圆部分是肿瘤形成部位。从图5中的A以及图5中的B可知，确认到在使用了比较例2的造影剂的情况下，由于因EPR效应而导致造影剂被摄入到肿瘤组织的间质并滞留于此，因此血管区域的对比度变差，其结果是，不能将肿瘤形成部位的血管的经时的结构变化可视化。
根据图4以及图5所示的结果可知：(1)在金纳米颗粒的粒径较小的情况下迅速从肾脏被排出；(2)相反地，在金纳米颗粒的粒径较大的情况下，金纳米颗粒不能在肾脏处分离且金纳米颗粒因EPR效应而滞留于肿瘤组织的间质，肿瘤形成部位的血管的经时的结构变化的可视化很困难。
＜对小鼠进行实施例1、比较例1以及比较例3的造影剂的给药时的血中半衰期的测定＞
将实施例1制作的sAu/GSH-LF造影剂、比较例1制作的sAu/GSH造影剂以及比较例3的碘帕醇(iopamidol)的静脉给药前后的小鼠心脏CT图像示于图6。在全部的造影剂给药组中，在从给药后5min拍摄到的图像中获得了能够区分左右的心室的水平的鲜明的图像。在从给药后60min拍摄到的图像中，仅能辨别sAu/GSH-LF给药小鼠的左右的心室。将经时地测量了心室的CT值的变化的结果示于图7。将造影剂给药前的图像设为了0min(注射前)。sAu/GSH-LF给药组的CT值在0、5、60、180、360min以及24h时分别为71、337、217、166、126、75HU。sAu/GSH给药组的CT值在0、5、60、180、360min以及24h时分别为76、256、132、115、83、55HU。碘帕醇给药组的CT值在0、5、60、180、360min以及24h时分别为72、291、130、75、87、72HU。若根据图7所示的结果计算各造影剂的血中半衰期，则sAu/GSH-LF为120min。作为对照，sAu/GSH以及碘帕醇的血中半衰期均小于60min。
根据以上结果，确认到：(1)sAu/GSH与碘帕醇这两者在血管内显示出类似的举动；(2)将乳铁蛋白结合于sAu/GSH而制作的sAu/GSH-LF与sAu/GSH相比，能够延长血中半衰期；(3)sAu/GSH-LF与一直以来作为血管造影剂而已知的sAu/GSH以及碘帕醇相比，血管造影性能高。
＜对小鼠进行实施例1、比较例1以及比较例2的造影剂的给药时的癌组织血管的经时的图像＞
在图8中使用实施例1制作的sAu/GSH-LF造影剂、比较例1制作的sAu/GSH造影剂以及比较例2制作的15nm AuNP-PEG造影剂，确认了能否将伴随肿瘤的生长的相同的血管的变化可视化。图8中的a是表示实验的概要的图。对载癌小鼠的静脉内进行造影剂的给药，5min后实施了第一次X射线CT拍摄，三天后(72h)与第一次同样地进行造影剂的给药，5min后实施了第二次X射线CT拍摄。
图8中的b至图8中的j是肿瘤部分的CT图像。如图8中的b至图8中的d所示，在进行15nm AuNP-PEG的造影剂的给药的情况下，在最初的给药后明确地观察到了肿瘤血管(图8中的c)，但是在第二次的CT图像中肿瘤部分整体变纯白，未能实现肿瘤血管的可视化，未能观察到肿瘤血管的以几天为单位的结构变化(图中的8d)。据考虑是因为由于金纳米颗粒的尺寸为15nm，因此没有从血液的排出路线，金纳米颗粒集聚于皮肤、肿瘤的组织。
如图8中的e至图8中的g所示，在进行sAu/GSH造影剂的给药的情况下，肿瘤血管的可视化很困难。据考虑这是因为在刚进行造影剂的给药后sAu/GSH被排泄到了尿中。
如图8中的h至图8中的j所示，与上述的两种造影剂不同，在进行sAu/GSH-LF造影剂的给药的情况下，能够在最初的给药后的CT图像中将肿瘤血管可视化(图8中的j)，进一步地，在第二次的造影剂的给药后中，相同的肿瘤血管也能够可视化(图8中的i以及图8中的j的箭头)。图9中的a是图8中的i的放大图像，图9中的b是图8中的j的放大图像。在仅仅72h中，相同的肿瘤血管的弯曲的程度与直径就大幅变化(被图9中的a以及图9中的b的虚线包围的血管)。将弯曲的程度(弯曲度)定义为用实际的长度除以2点间的直线时的值而计算的结果是，确认到相同的血管的弯曲度从约1.1变化为了1.4。另外，确认到血管的最大直径从420μm变化为了515μm。需要说明的是，对于在造影剂给药后的最初的CT图像中能够可视化的肿瘤血管的数量，sAu/GSH-LF(图8中的i)比AuNP-PEG(图8中的c)少。作为其理由，据考虑因为被细密填充的15nm AuNP-PEG的Au原子的密度大，所以15nm AuNP-PEG的一方的造影性能高。
根据以上结果，确认到将通过将蛋白质结合于能够肾排出的尺寸的金属纳米颗粒而制作的复合体用于造影剂，由此能够将相同肿瘤血管的经时的结构变化可视化。
需要说明的是，在这次的实验中，已知作为蛋白质而使用的乳铁蛋白单体的血中半衰期为约7.8min(Y.Nojima et al.，“Lactoferrin conjugated with 40-kDa branchedpoly(ethylene glycol)has an improved circulating half-life”，Pharm.Res.，26(2009)，pp.2125-2132)。如上述实施例所示，复合体的血中半衰期为1～3小时。因此，本申请中的公开是基于如下的不能预期的效果而完成的：若sAu/GSH以及乳铁蛋白分别以单体使用，则会迅速从血中被排出，但是通过将二者组合，由此血中的滞留时间大幅变长。
肿瘤为了迅速生长而需要较多的营养与氧气。为了增加向肿瘤组织的营养与氧气的供给，癌细胞生成血管新生因子而迅速构筑肿瘤血管。因此，迅速构筑而成的肿瘤新生血管显示出不规则的形状或扩张，漏出性亢进并且脆弱。进一步地，由于在肿瘤中淋巴网络系统不成熟，因此从肿瘤血管漏出的物质不容易从肿瘤部位被除去。因此，约150nm以下的纳米颗粒、药物浸透至肿瘤血管，容易保持于肿瘤组织。该现象被称为EPR效应(enhancedpermeability and retention：高通透性和滞留效应)。如图5以及图8所示，在进行比较例2的造影剂的给药的情况下，因EPR效应导致金属纳米颗粒蓄积于肿瘤组织，未能可视化血管的经时的结构变化。
另一方面，作为实施例1的复合体的sAu/GSH-LF的尺寸为17.3±2.8nm，是与比较例2的AuNP-PEG的15nm几乎等同的尺寸，但是由于Au原子量少，因此即使发生同样的EPR效应也几乎没有观察到难以可视化的现象，另外，由于sAu/GSH-LF被分解，因此EPR效应的影响也几乎观察不到。这一点可以通过以下情况得以明确：图8中的j所示的图像没有被拍摄成如图8中的d那样的肿瘤组织整体白。因此，本申请公开的复合体因为具备如下的功能而能够起到将血管的经时的结构变化可视化的显著的效果：(1)即使是不被肾排出的尺寸也几乎不受EPR效应的影响；以及(2)具有对于拍摄肿瘤组织的血管而言充分的血中半衰期。
[复合体以及造影剂的制作(2)]
＜实施例2＞
除代替实施例1的乳铁蛋白PBS溶液而添加了1mL的50mg/mL的白蛋白(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation)PBS溶液以外，通过与实施例1同样的步骤而制作了复合体(将sAu/GSH与人血清白蛋白复合体化而成的胶体溶液)。需要说明的是，有时将实施例2制作的复合体(有时也记载为胶体溶液或者造影剂。)记载为“sAu/GSH-hSA 1”。
＜实施例3＞
除将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC；DOJINDO，98％)的添加量设为400mg以及将N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS；Tokyo Chemical Industry，98％)的添加量设为400mg以外，通过与实施例2同样的步骤而制作了复合体(将sAu/GSH与人血清白蛋白复合体化而成的胶体溶液)。需要说明的是，有时将实施例3制作的复合体(有时也记载为胶体溶液或者造影剂。)记载为“sAu/GSH-hSA 2”。
＜制作的纳米颗粒的评价方法2＞
通过与上述＜制作的纳米颗粒的评价方法1＞同样的步骤(其中，电泳的时间变更为20min)对实施例2以及实施例3制作的复合体进行了评价。图10表示实施例2制作的sAu/GSH-hSA 1的TEM照片。需要说明的是，省略关于实施例3制作的sAu/GSH-hSA 2的TEM照片。图10的左侧是将焦点对准于制作的金纳米颗粒的照片，右侧是从金纳米颗粒的焦点面进行了焦点位移的照片。从图10的左侧的照片可知，实施例2制作的sAu/GSH-hSA 1与实施例1(图1中的A)同样地，金纳米颗粒进行了凝结。另外，在焦点位移后的右侧的照片中，根据在金纳米颗粒的周围确认到低对比度的物质这一情况也确认到在实施例2中，金纳米颗粒与蛋白质也形成了复合体。
将实施例2制作的胶体溶液(sAu/GSH-hSA 1)、实施例3制作的胶体溶液(sAu/GSH-hSA 2)以及比较例1制作的胶体溶液(sAu/GSH)进行电泳后的照片示于图11。将实施例2、实施例3以及比较例1制作的胶体溶液的UV-VIS光谱测定结果示于图12。
如图11所示，实施例2制作的sAu/GSH-hSA 1以及实施例3制作的sAu/GSH-hSA 2与实施例1同样，没有比比较例1的sAu/GSH向阳极侧(图11的照片方向下侧)移动。因此，在实施例2以及实施例3中，确认到形成了复合体。另外，如图12所示，sAu/GSH-hSA 1、sAu/GSH-hSA 2以及sAu/GSH的消光光谱类似，并且未确认到属于表面等离子体共振吸收(SPR)峰的峰。因此，实施例2以及实施例3的复合体与实施例1同样，确认到金纳米颗粒不凝结，不形成沉淀物。
＜制作的纳米颗粒的评价方法3＞
接着，测定了实施例2制作的sAu/GSH-hSA 1、实施例3制作的sAu/GSH-hSA 2以及比较例1制作的sAu/GSH的等电点。实验步骤使用了使制作的sAu/GSH-hSA胶体溶液的pH在2至12的范围变化并由通过动态光散射法测定的电迁移率来计算zeta电位的方法。溶液的pH调整通过氢氧化钠或者盐酸来进行，设zeta电位为0的pH值为等电点。
将等电点的测定结果示于图13。从图13可知，根据确认到等电点的迁移这一情况，启示了sAu/GSH与人血清白蛋白形成了复合体。另外，根据实施例2与实施例3中等电点不同这一情况，启示了通过调整在使连接子化合物与蛋白质酰胺结合的工序中使用的交联剂(EDC等缩合剂以及NHS等羧酸活性剂)的量，复合体的结构变化(结构不同)。
[对小鼠的造影剂的给药实验2]
＜对小鼠进行实施例2、实施例3以及比较例1的造影剂的给药时的肾排出的确认＞
除使用实施例2、实施例3以及比较例1制作的造影剂，将进行造影剂给药后的拍摄时间设为5min、60min、180min、360min、24hour以外，通过与上述[对小鼠的造影剂的给药实验1]同样的步骤，进行了将造影剂进行给药后的肾排出的确认。将显微X射线CT图像示于图14以及图15。需要说明的是，图14与上述[对小鼠的造影剂的给药实验1]同样地，表示从腹部方向观察小鼠的CT图像。另外，图15表示小鼠肾脏的轴向剖面(Axial cross section ofthe kidney)的CT图像。图14中的箭头表示肾脏(肾盂)，大致圆形的线表示膀胱。另外，图15的大致圆形的虚线表示肾脏(肾盂)的轮廓，虚线内的白色造影区域表示肾脏的肾盂。
根据图14以及图15可知，与比较例1的造影剂相比，实施例2以及实施例3的造影剂的一方，给药后5min的肾脏能够清晰地可视化。因此，确认到实施例2以及实施例3的造影剂与比较例1的造影剂相比，血中的滞留时间变长。进一步地，若将实施例2以及实施例3对比，则确认到因为实施例2的造影剂的血中滞留时间的一方长，所以通过改变在使连接子化合物与蛋白质酰胺结合的工序中使用的交联剂的添加量，能够调整造影剂的血中滞留时间。
＜对小鼠进行实施例2、实施例3以及比较例1的造影剂的给药时的血中半衰期的测定＞
除使用了实施例2、实施例3以及比较例1制作的造影剂以外，通过与上述[对小鼠的造影剂的给药实验1]同样的步骤，进行了造影剂的血中半衰期的测定。图16以及图17表示造影剂的静脉给药前后的小鼠心脏CT图像。需要说明的是，图16与上述[对小鼠的造影剂的给药实验1]同样地，表示小鼠心脏的轴向剖面(Axial cross section of the heart)的CT图像。图17表示小鼠心脏的冠状剖面(Coronal cross section of the heart)的CT图像。另外，图16以及图17的虚线的圆表示心脏的轮廓，箭头(白色以及黑色)的前端表示心脏的中隔的位置。
根据图16以及图17所示的结果确认到，与肾排出的实验同样地，实施例2以及实施例3制作的造影剂的一方比比较例1制作的造影剂的血中滞留时间长。另外，确认到实施例2制作的造影剂的一方比实施例3制作的造影剂的血中滞留时间长。图18是表示经时地测量了心室的CT值的变化的结果的图表。若根据图18所示的结果来计算各造影剂的血中半衰期，则实施例2的sAu/GSH-hSA 1为约180min，实施例3的sAu/GSH-hSA 2为约100min。作为对照，比较例1的sAu/GSH小于60min。
根据以上的结果确认到，通过改变在使连接子化合物与蛋白质酰胺结合的工序中使用的交联剂的添加量，能够调整造影剂的血中滞留时间。
＜参考例1、连接子结合金纳米颗粒的制作＞
通过与上述[复合体以及造影剂的制作1]的“(1)金纳米颗粒的合成”同样的步骤合成了金纳米颗粒。之后，除代替谷胱甘肽而添加8mL的0.25M 2-胺基乙硫醇(东京化成工业(TCI)公司制造，A0648，2-Aminoethanethiol(＞95％))溶液并使其反应12小时后，进行了pH调整以外，通过与上述“(2)金纳米颗粒与连接子化合物的结合”同样的步骤，制作了连接子结合金纳米颗粒。图19是参考例1制作的、2-氨基乙硫醇结合后的金纳米颗粒溶液的照片。得到了如图19所示那样澄清的液体，未确认到沉淀物等。若将谷胱甘肽结合于金纳米颗粒，则在金纳米颗粒的表面露出羧基，若将2-氨基乙硫醇结合于金纳米颗粒，则在金纳米颗粒的表面露出氨基。蛋白质根据种类而侧链的氨基与羧基的数量不同。因此，在制作复合体时，以能够得到合适的酰胺结合的方式设计连接子化合物与蛋白质的组合即可。
[产业实用性]
通过以本申请公开的复合体来制作造影剂，能够将血管的经时的结构变化可视化。因此，对医疗产业很有用。

Claims (11)

1.一种复合体，其是包含金属纳米颗粒以及蛋白质的复合体，其中，
复合体中的金属纳米颗粒部分的平均粒径为1nm以上且5.5nm以下。
2.根据权利要求1所述的复合体，其中，
金属纳米颗粒以及蛋白质经由连接子而结合。
3.根据权利要求2所述的复合体，其中，
形成复合体前的连接子是具有巯基、以及羧基或氨基的化合物，
在复合体中，
巯基的S原子与金属纳米颗粒中的金属结合，
羧基或氨基与蛋白质的氨基或羧基酰胺结合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的复合体，其中，
蛋白质选自功能蛋白质。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的复合体，其中，
血中半衰期为1～3小时。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合体，其中，
在复合体中，蛋白质成为核心，金属纳米颗粒结合于蛋白质核心的表面。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的复合体，其中，
金属选自由金、铂、金以及铂的合金组成的群组。
8.一种脉管造影剂，其中，
所述脉管造影剂包含权利要求1至7中任一项所述的复合体。
9.一种X射线造影剂，其中，
所述X射线造影剂包含权利要求1至7中任一项所述的复合体。
10.一种复合体的制造方法，其是使用了金属纳米颗粒、蛋白质以及连接子化合物的复合体的制造方法，其中，
该复合体中的金属纳米颗粒部分的平均粒径为1nm以上且5.5nm以下，
连接子化合物具有巯基、以及羧基或氨基，
复合体的制造方法包括：
使金属纳米颗粒与连接子化合物反应，并使巯基的S原子与金属纳米颗粒中的金属结合的连接子结合金属纳米颗粒制作工序；以及
使连接子结合金属纳米颗粒与蛋白质反应，并使连接子结合金属纳米颗粒的羧基或氨基与蛋白质的氨基或羧基酰胺结合的工序。
11.一种捕捉脉管的结构变化的拍摄方法，其是使用了复合体的捕捉脉管的结构变化的拍摄方法，所述复合体包含金属纳米颗粒以及蛋白质，复合体中的金属纳米颗粒部分的平均粒径为1nm以上且5.5nm以下，其中，
所述拍摄方法包括对动物进行复合体的给药、进行X射线CT拍摄，经过适当的时间后进行新的复合体的给药、进行X射线CT拍摄的拍摄工序。
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