KR20230132036A - Yy2를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함하여 골다공증을 완화, 치료 또는 예방할 수 있는 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함하여 골다공증을 완화, 치료 또는 예방할 수 있는 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
뼈는 크게 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 라이닝세포(lining cell) 및 골세포(osteocyte)의 네 가지 세포로 구성되어 있다. 이때, 골수간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래하는 조골세포는 골기질을 합성하는 분화된 세포로서 골형성을 주도하며, 조혈모세포로부터 유래하는 파골세포는 골흡수를 주도한다. 골형성과 골손실의 균형은, 구체적으로 골기질(mineralized bone matrix)의 파골세포(osteoclasts)에 의한 파괴와 골아세포(osteoblasts)에 의한 골 형성의 기능적인 균형에 의하여 효과적으로 조절되는 프로세스로 균형이 유지된다(Harada and Rodan, 2003; Teitelbaum, 2000).
이처럼 뼈의 발달은 조골세포의 형성과 파골세포의 흡수 때문에 유지된다. 이 균형이 깨지고 최대 골량에 도달하지 못하거나 과도한 골흡수가 발생하면 골밀도와 골량이 감소하고 골강도가 약화하여 골절되기 쉬운 전신 질환인 골다공증이 발생한다. 따라서, 조골세포의 형성을 촉진하거나 파골세포의 과도한 흡수를 억제하는 것은 골다공증에 대한 중요하고 효과적인 치료 옵션이다.
조골세포는 간엽 줄기세포라고도 하는 다능성 간엽 기질 세포에서 유래하며, 이는 근아세포, 연골세포, 지방세포 또는 골아세포를 생성할 수 있다. MSC에서 조골세포로의 분화는 전사 조절자, 주로 Runx2(Cbfa1), Dlx5, Osterix(Osx)에 의해 제어된다.
Sp7으로도 알려진 Osx는 Sp/XKLF 계열에 속하는 징크 핑거 함유 전사 인자로 조골세포의 생성과 분화에 중요한 역할을 한다. 이전 연구에 따르면 조골세포 분화 과정에서 Osx 돌연변이가 있는 조골세포에서 Runx2의 발현은 야생형 조골세포에서와 유사하지만 Osx는 Runx2 결함이 있는 조골세포에서 발현되지 않는 것으로 알려져 Osx가 Runx2의 하위 전사 요소임을 시사한다.
Yin Yang 2(YY2)는 YY1의 파라로그이며 Yin Yang 가족에 속한다. YY2에는 4개의 C2H2 징크 핑거 구조 도메인이 있으며 징크 핑거 구조 도메인은 Yin Yang1과 거의 86.4% 동일성을 공유한다. 이 기능을 기반으로 YY2는 전사 활성화 및 억제 활성 모두에서 YY1과 기능적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 조골세포 분화에서 YY1의 역할은 Runx2 전사 활성을 하향 조절함으로써 조골세포 분화를 억제하는 것으로 알려지었지만, 조골세포 분화에서 YY2의 역할은 파악하기 어려운 상태로 남아 있다.
한편, 골다공증은 나이가 많아지게 됨에 따라 자연적으로 나타나지만, 특히 여성의 경우 폐경기 등 호르몬 분비의 이상에 의해서도 매우 심화된다. 남성도 여성보다는 덜하나 노화와 함께 대부분 골다공증이 생기게 되며 질병이나 면역계통의 약화를 통하여도 젊은 층에서도 나타나는 경우가 있다.
더욱이, 현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 비스포스포네이드(bisposphonate)계열의 약제들은 사용의 번거롭고 낮은 약효로 인해 사용에 많은 제한이 따르고 있다. 흡수율이 1-5％로 낮아서 복용 방법이 까다롭고, 식도 및 위장, 관에 궤양을 유발하는 부작용의 경우가 많다. 이처럼 현재 개발, 판매되고 있는 골질환 치료 약물의 경우 정도의 차이는 있으나 대부분 부작용을 갖고 있다.
따라서, 부작용이 적은 골다공증 치료제 개발 및 식품소재 개발이 매우 필요한 실정이다.
본 발명자들은 골다공증을 치료할 수 있는 약학조성물을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과 조골세포 분화를 촉진함으로써 골다공증을 예방 또는 치료할 수 있는 약학조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 YY2(Yin Yang 2) 단백질이 조골세포 분화를 촉진해 골다공증을 예방, 완화 및 치료할 수 있다는 새로운 용도를 이용하여 YY2를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피검물질을 처리한 세포에서 YY2 단백질의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 상세한 설명의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 목적 역시 당연히 포함될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 먼저 본 발명은 YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 YY2를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 cDNA 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 발현 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열번호 1과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 발현 단백질은 조골세포 분화를 촉진한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 발현 단백질은 BSP, ALP 및 OC의 프로모터 활성을 농도 의존적으로 증가시킨다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 발현 단백질은 Osterix의 mRNA 전사 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 증가시킨다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 발현 단백질의 함량은 0.1 ㎍/㎎ 내지 1 ㎎/㎎이다.
또한, 본 발명은 YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 YY2를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 cDNA 또는 이에 상보적인 염기 서열을 갖는 mRNA이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 발현 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드이다.
또한, 본 발명은 (a) YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자를 발현하는 세포 또는 인간을 제외한 동물을 배양하는 단계; (b) 피검물질을 상기 (a) 단계의 세포 또는 동물과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 세포 또는 동물에서 YY2 단백질의 발현 수준을, 피검물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유류의 골다공증 치료방법을 제공한다.
상술된 본 발명에 따른 약학조성물은 조골세포 분화 특이적 전사 인자 Osterix의 프로모터의 활성을 상향 조절하고 조골세포 분화 동안 mRNA와 단백질에서 Osterix의 발현을 증가시켜 조골세포 분화를 촉진하므로, 골다공증 예방 및/또는 치료에 효과적이고, 세포독성이 나타나지 않는 안전성이 뛰어나 골다공증 완화, 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 이러한 기술적 효과들은 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 시행을 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.
도 1a 및 도 1b는 BMP 유도 ALP 발현에 대한 YY2의 효과를 보여주는 실험결과를 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 골 형성 마커의 발현에 대한 YY2의 영향을 조사한 결과가 도시된 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 루시퍼라제 분석을 통해 ALP, BSP 및 OC의 프로모터 활성을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 YY2 형질감염 후 C2C2 세포에서 Osterix의 mRNA 수준을 RT-PCR로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 Osx 프로모터 활성에 대한 YY2의 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 인간 Osterix 프로모터가 구축된 pGL3 벡터의 개략도(3kb)이고, HEK 293 세포에 pGL3-인간 Osterix 유전자(0.3ug) 및 베타-gal(0.05ug) 및 YY2의 양을 증가시키면서 형질 도입시킨 다음 48시간 후, 루시퍼라제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 YY1 결합 부위(2.1kb-luc, 1.4kb-luc, 0.7kb-luc)가 결여된 야생형 pGL3-Osterix 프로모터(3kb-luc) 벡터 및 pGL3-Osterix 프로모터 구축된 pGL3 벡터의 개략도이고, 도 7b는 빈 벡터 또는 YY2 형질 도입된 그룹에서 Osterix 프로모터 활성의 상대적 활성을 나타낸 것이다.
도 8a는 YY1 결합 부위에서 pGL3-Osterix 프로모터 돌연변이 형태의 개략도이고, 도 8b는 빈 벡터 또는 YY2 형질 도입된 그룹에서 Osterix 프로모터 활성의 상대적 활성을 나타낸 그래프이다(**P < 0.05 및 *P < 0.1 대조군과 비교).
도 9는 C2C12 세포를 대조군(pSuper-empty vector) 또는 증가하는 양의 YY2 shRNA 플라스미드(shYY2)로 형질 도입시키고 BMP4로 자극한 다음 ALP 활성에 대해 염색하여 얻어진 결과를 도시한 것이다.
도 10a 내지 도 10e는 YY2 녹다운이 조골세포 마커의 발현을 억제하는지 확인하기 위해 ALP, BSP, OC, Runx2 및 Osterix의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과 그래프이다.
도 11a 및 도 11b는 YY2 녹다운이 조골세포 특이적 리포터의 발현을 감소시키는지 확인한 결과 그래프이다.
도 12는 YY2 녹다운이 Runx2 및 Osterix 단백질의 수준을 감소시키는지 확인한 결과를 도시한 것이다.
도 13a 내지 도 13c는 YY2 녹다운이 Osterix의 전사 활성을 감소시키는지 보여주는 결과 그래프이다.
도 2a 내지 도 2c는 골 형성 마커의 발현에 대한 YY2의 영향을 조사한 결과가 도시된 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 루시퍼라제 분석을 통해 ALP, BSP 및 OC의 프로모터 활성을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 YY2 형질감염 후 C2C2 세포에서 Osterix의 mRNA 수준을 RT-PCR로 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 Osx 프로모터 활성에 대한 YY2의 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 인간 Osterix 프로모터가 구축된 pGL3 벡터의 개략도(3kb)이고, HEK 293 세포에 pGL3-인간 Osterix 유전자(0.3ug) 및 베타-gal(0.05ug) 및 YY2의 양을 증가시키면서 형질 도입시킨 다음 48시간 후, 루시퍼라제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 YY1 결합 부위(2.1kb-luc, 1.4kb-luc, 0.7kb-luc)가 결여된 야생형 pGL3-Osterix 프로모터(3kb-luc) 벡터 및 pGL3-Osterix 프로모터 구축된 pGL3 벡터의 개략도이고, 도 7b는 빈 벡터 또는 YY2 형질 도입된 그룹에서 Osterix 프로모터 활성의 상대적 활성을 나타낸 것이다.
도 8a는 YY1 결합 부위에서 pGL3-Osterix 프로모터 돌연변이 형태의 개략도이고, 도 8b는 빈 벡터 또는 YY2 형질 도입된 그룹에서 Osterix 프로모터 활성의 상대적 활성을 나타낸 그래프이다(**P < 0.05 및 *P < 0.1 대조군과 비교).
도 9는 C2C12 세포를 대조군(pSuper-empty vector) 또는 증가하는 양의 YY2 shRNA 플라스미드(shYY2)로 형질 도입시키고 BMP4로 자극한 다음 ALP 활성에 대해 염색하여 얻어진 결과를 도시한 것이다.
도 10a 내지 도 10e는 YY2 녹다운이 조골세포 마커의 발현을 억제하는지 확인하기 위해 ALP, BSP, OC, Runx2 및 Osterix의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과 그래프이다.
도 11a 및 도 11b는 YY2 녹다운이 조골세포 특이적 리포터의 발현을 감소시키는지 확인한 결과 그래프이다.
도 12는 YY2 녹다운이 Runx2 및 Osterix 단백질의 수준을 감소시키는지 확인한 결과를 도시한 것이다.
도 13a 내지 도 13c는 YY2 녹다운이 Osterix의 전사 활성을 감소시키는지 보여주는 결과 그래프이다.
본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시 예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 발명의 설명에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의된 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미가 있는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
구성 요소를 해석하면서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
시간 관계에 대한 설명일 경우, 예를 들어, '~후에', '~에 이어서', '~다음에', '~전에' 등으로 시간적 선후 관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 연속적이지 않은 경우도 포함한다.
어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않은 한, 단지 본 발명의 기재를 용이하게 하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석 되어서는 안 된다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시 예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시 예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성 요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 수많은 생물학적 생명 과정을 촉진하거나 억제하는 전사 인자로 작용하는 YY2(Yin Yang 2) 단백질이 조골세포 분화 촉진, 특히 조골세포 분화 특이적 전사 인자 Osterix의 프로모터의 활성을 상향 조절하고 조골세포 분화 동안 mRNA와 단백질에서 Osterix의 발현을 증가시켜 골다공증을 예방, 완화 및 치료할 수 있다는 새로운 용도를 발견하고, 이를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물을 개발한 것에 있다.
상술된 바와 같이 YY2는 YY1의 파라로그이며 Yin Yang 가족에 속하지만 아직 그 기능이 잘 알려져 있지 않다. 다만, YY2가 가진 4개의 C2H2 징크 핑거 구조 도메인은 YY1과 거의 86.4% 동일성을 공유하는 점에서 전사 활성화 및 억제 활성 모두에서 YY1과 기능적으로 유사한 것으로 밝혀져 있다. 그런데, 조골 세포 분화에서 YY1의 역할은 Runx2 전사 활성을 하향 조절함으로써 조골 세포 분화를 억제하는 것으로 알려진 점을 고려하면 YY2가 조골세포 분화를 촉진할 것으로 전혀 기대할 수 없기 때문이다.
그럼에도 불구하고, 본 발명에서는 YY2가 공지사실로부터 전혀 예측이 불가능한 조골세포 분화를 촉진한다는 점을 확인하고, 이를 골다공증의 완화, 치료 또는 예방 용도로 적용함으로써 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물은 YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함한다.
이때, "YY2를 코딩하는 유전자"는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 cDNA 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA일 수 있다.
"발현 단백질"은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 펩티드의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 여기서 "기능적 동등물"아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 80%이상의 서열상동성을 갖는 것일 수 있는데, 특히 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드일 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질일 수 있다.
본 발명의 YY2 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. YY2 단백질의 변이체란 YY2 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 때에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 YY2 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NewYork, USA, 2판, 1989).
YY2를 코딩하는 유전자 또는 YY2 단백질 또는 YY2 단백질과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 후술하는 실험 예에서 알 수 있듯이 조골세포 분화를 촉진한다. 특히, BMP 유도 조골세포 분화를 촉진하는데 BMP 유도 조골세포 분화 마커인 ALP, BSP 및 OC의 프로모터 활성을 농도 의존적으로 증가시켰다. 또한, 상기 펩티드는 Osterix의 mRNA 전사 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 증가시켰다.
이러한 결과는 YY2 단백질 또는 YY2 단백질과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드의 조골세포 분화를 촉진한다는 것을 분명히 보여준다.
따라서, 본 발명의 약학조성물은 YY2를 코딩하는 유전자 또는 YY2 단백질의 조골세포 분화 촉진 활성으로 인해 골다공증의 예방 또는 치료에 유효하게 작용할 수 있다. 이때, 골다공증은 글루코코르티코이드 유발성 골다공증, 갑상선 기능 항진성 골다공증, 고정 유발성 골다공증, 헤파린 유발성 골다공증, 면역 억제 유발성 골다공증, 신부전에 따른 골다공증, 염증성 골다공증, 쿠싱 증후군에 따른 골다공증 및 류머티스성 골다공증에서 선택된 어느 하나의 골다공증일 수 있으며, 본 발명의 약학조성물은 퇴행성 골다공증, 당뇨합병증으로 유발된 골다공증 등에도 유용할 수 있다.
본 발명의 YY2를 코딩하는 유전자 또는 YY2 단백질 또는 YY2 단백질과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 림프절주사, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다. 여기서, "환자"는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간을 의미할 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다. 일 구현예로서 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 특히, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 YY2를 코딩하는 유전자 또는 YY2단백질 또는 YY2단백질과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 0.1 ㎍/㎎ 내지 1 ㎎/㎎로 함유하는 것일 수 있고, 1 ㎍/㎎ 내지 0.5 ㎎/㎎로 함유하는 것일 수 있으며, 10 ㎍/㎎ 내지 0.1 ㎎/㎎의 함량으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 약학조성물의 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학조성물은 골다공증의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 YY2를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함하여 골다공증을 완화 또는 예방한다. YY2를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질에 대한 설명은 위에서 설명한 것과 중복되므로 기재를 생략한다.
골손실의 완화 또는 예방용 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 예로는 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방제품, 유제품 음료(dairy drink) 및 우유 음료, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 효모 제품, 케이크 및 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
건강기능식품은 이는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등으로 제형화하여 사용할 수 있고, 보통 건강기능식품을 그대로 또는 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 넣어 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 입상으로 만들고 될 수 있는 대로 입자를 고르게 한 것이며, 필요에 따라 착향료, 교미제 등을 넣을 수 있다. 건강기능식품이 음료 제형의 건강기능식품인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 녹용추출물, 배변활동과 칼슘의 흡수를 도와주는 프락토올리고당, 아카시아꿀, 천연 보존제인 복합황금추출물, 침전개선 점증제인 젤란검 등의 기능성 원료도 부가할 수 있으나, 이에 한정하지는 않고 건강기능식품에 적합한 성분을 적절하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자를 발현하는 세포 또는 인간을 제외한 동물을 배양하는 단계; (b) 피검물질을 상기 (a) 단계의 세포 또는 동물과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 세포 또는 동물에서 YY2 단백질의 발현 수준을, 피검물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 골다공증 치료방법은 YY2를 코딩하는 유전자 또는 그 발현단백질을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 특히 골다공증으로부터 유래되는 인간을 제외한 포유류의 골손실 치료에 유효하다.
실시예
1. 세포 배양 및 형질감염
마우스 전-근형성 세포주 C2C12 세포와 293개의 인간 배아 신장 세포를 37℃에서 5% CO2에서 배양하고 10% FBS 및 1% 항생제 항진균제를 함유하는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 유지시켰다. 모든 소모품은 Invitrogen에서 구입했다. 일시적 형질감염은 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences)-매개 방법을 사용하여 수행하였고, 각 군에서 형질감염된 플라스미드의 총량은 빈 벡터를 첨가하여 정규화하였다.
2. ALP 염색
C2C12 세포는 분화 72시간 후 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척하고 4% 포름알데히드에서 15분 동안 고정한 후 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척하고 마지막으로 BCIP/NBT 발색 기질(Sigma -Aldrich) RT에서 15분 동안. 염색의 정량화는 480 nm의 흡광도에서 수행하였다.
3 루시퍼라제 분석
C2C12 세포를 24웰 플레이트에 2 x 104 세포/웰의 밀도로 시딩했다. 세포를 CMV 프로모터 구동 β-갈락토시다제 리포터 유전자(pCMV-β-gal) 0.05ug 및 루시퍼라제 리포터 유전자 0.3ug으로 형질 도입시키고, 세포 용해물을 형질감염 36시간 후에 루시퍼라제 활성에 대해 분석하였다. 루시퍼라제 리포터 유전자 분석 키트(Promega)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하고 모든 실험을 3중으로 수행했다.
4. RNA 준비 및 반정량적 RT-PCR
RNAiso Plus(Total RNA Extraction Reagent; TaKaRa, Tokyo, Japan)를 사용하여 배양된 C2C12 세포로부터 총 mRNA를 추출하였다. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 cDNA는 총 1ug의 RNA에서 (dT) 프라이머와 역전사효소(Promega)를 사용하여 합성되었다. cDNA는 CFX96 실시간 PCR 시스템에서 SYBR Premix Ex Taq 키트(TaKaRa)를 사용하여 합성되었다. PCR은 다음 조건을 사용하여 수행되었다: 94℃에서 3분 동안 초기 변성; 30초 동안 94℃에서 변성, 30초 동안 각 프라이머 쌍에 대해 최적화된 온도에서 어닐링, 72℃에서 30초 동안 확장의 39 사이클; 및 72℃에서 10분 동안 최종 확장. PCR에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다. :
ALP (F) 5′??ATC TTT GGT CTG GCT CCC ATG??3′ (R) 5′??TTT CCC GTT CAC CGT CCA C??3′
BSP (F) 5′??AAG CAG CAC CGT TGA GTA TGG??3′ (R) 5′??CCT TGT AGT AGC TGT ATT CGT CCT C??3′
Runx2 (F) 5′??AAA TGC CTC CGC TGT TAT GAA??3′ (R) 5'??GCT CCG GCC CAC AAA TCT??3′
Osterix (F) 5′??AGC GAC CAC TTG AGC AAA CAT??3′ (R) 5′??GCG GCT GAT TGG CTT CTT CT??3′
GAPDH (F) 5′??ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC??3′ (R) 5′??TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA??3′
5.면역블롯팅(IB)
세포 침전물을 인산염 완충 식염수로 2회 세척하고 얼음처럼 차가운 용해 용액(25mM HEPES(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.25% 소듐 데옥시콜레이트, 10% 글리세롤, 25mM NaF, 1mM EDTA, 1mM Na3VO4, 250μM PMSF, 10μg/ml leupeptin, 10μg/ml peptidase 및 10ug/ml Aprotinin)을 15분간 용해한 후 4℃에서 13,000rpm으로 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 동일한 양의 단백질을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮겼다. 막은 Runx2(sc-390351, Santa Cruz), Osterix(sc-393325, Santa Cruz), Myc(9E10)(Santa Cruz Biotechnology), HA(12CA5; Roche Applied Science) 및 a-에 대한 막과 혼합되었다. tubulin(DM1A, Cell Signaling Technology)을 적절한 1차 항체와 함께 배양했다. 적절한 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 이차 항체로 세척 및 인큐베이션한 후, 향상된 화학발광에 의해 시각화를 수행했다.
6.인간 Osterix 결실된 프로모터 및 돌연변이된 프로모터의 클로닝
3.0kb 5' 플랭킹 영역은 5'-GGGGTACCCTCCGAGATAGTAGGGTTCG-3'을 사용하여 PCR에 의해 얻었고, 이 영역의 직렬 5' 절단은 센스 프라이머(2.1kb GGG GTA CCC CTT GGG TTC CCA GAG TTC CT ; 1.4kb GGG GTA CCC CAA AGA GGT TAG GTG TCG GC의 경우, 0.7kb GGG GTA CCC CTT TTC CCT CCT GTT CCT TC) 및 공통 안티센스 프라이머 5'-CCGCTCGAGGGGGGTAGAGAGAGAAAAGG-3를 사용한 PCR에 의해 수행되었다. 3kb 프로모터에서 추정되는 YY1 억제인자 부위를 돌연변이시키기 위해 aacctCCATattccttgtc(sense:5'GGTAACTGACAAGGAATCTTGAGGTTAGG3';안티센스: 5'CCTAACCTCAAGATTCCTTGTCAGTTACC3')에 대한 돌연변이 프라이머 및 ctgctCCATttgctgagct(sense:5'GAGCTCAGCAACTTGAGCAGGAAATTTGG3'; antisense: 5'CCAAATTTCCTGCTCAAGTTGCTGAGCTC3')에 대한 프라이머는 일반 3kb 프로모터의 증폭에 사용된 프라이머와 조합하여 사용하였고, 돌연변이유발에는 오버랩-신장 PCR 방법을 사용하였다. Kpn1 및 Xho1 제한 부위를 도입하여 각 프로모터 산물을 pGL3-기본 벡터에 삽입하여 여러 프로모터-반딧불이 루시페제 구성체를 생성했다.
7.녹다운 실험
작은 간섭 RNA(siRNA)용 올리고뉴클레오티드는 마우스 YY2 유전자의 22개 염기 서열(GTA GTA GAG ATC ATG ATA A)을 표적으로 하여 생성되었다. 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 pSuper-retro 벡터(Oligoengine)에 연결했다.
8. 통계 분석
모든 실험은 독립적인 샘플로 3번, 최소 2번 반복하여 질적으로 동일한 결과를 생성했다. 결과는 평균의 평균 표준 오차로 제공된다. 스튜던트 t-검정은 데이터를 분석하는 데 사용되었으며 p <0.05는 유의성을 나타낸다.
9. 결과
후술하는 실험예에서 알 수 있듯이 YY2가 조골 세포 분화 특이적 전사 인자 Osterix의 프로모터의 활성을 상향 조절하고 조골 세포 분화 동안 mRNA와 단백질에서 Osterix의 발현을 향상시켰다.
실험예 1
조골 세포 분화에서 YY2의 역할을 설명하기 위해 먼저 C2C12 세포에서 ALP 염색을 사용하여 BMP 유도 ALP 발현에 대한 YY2의 효과를 다음과 같이 조사하고 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타냈다. 즉 YY2는 C2C12 세포를 DMEM 배지를 함유하는 10% FBS로 배양하고 빈 벡터 또는 YY2의 양이 증가된 플라스미드로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 성장배지에서 제거하고 2% FBS를 함유하는 분화 배지를 유지하여 BMP4로 처리하고, ALP 활성에 대해 염색하였다.
도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이 YY2의 과발현은 용량 의존적 방식으로 BMP 유도 ALP 활성을 유의하게 향상시켰음을 알 수 있다.
실험예 2
C2C12 세포에서 YY2가 골형성 마커 유전자의 mRNA 수준을 증가시켜 조골 세포 분화를 촉진하는지 확인하기 위해 YY2 또는 빈 벡터-형질감염된 C2C12 세포는 BMP4로 자극되었다. 그 후 YY2가 조골 세포 분화 관련 전사 인자에 미치는 영향을 조사하기 위해 ALP, BSP, OC, Runx2 및 Osterix의 발현이 RT-PCR에 의해 비교되었으며, 그 결과 그래프를 도 2a 내지 도 2c에 나타냈다.
골 형성 마커의 발현에 대한 YY2의 영향을 조사한 결과가 도시된 도 2a 내지 도 2c로부터, YY2의 과발현은 BMP4 처리 2일 후 ALP, BSP 및 OC의 mRNA 수준을 증가시켰음을 알 수 있다.
실험예 3
루시퍼라제 분석을 통해 ALP, BSP 및 OC의 프로모터 활성을 다음과 같이 조사하고, 그 결과를 도 3a 내지 도 3c에 나타냈다. C2C12 세포에 ALP, BSP, OC-luc 리포터 유전자(0.3ug) 및 베타-겔(0.05ug)을 형질감염시킨 다음, YY2의 처리량이 증가된 cells를 BMP4로 36시간 동안 자극하고 루시페라제 활성을 측정하였다. **P < 0.05 및 *P < 0.1 대조군과 비교.
도 3a 내지 도 3c에 나타난 바와 같이, YY2는 ALP, BSP 및 OC의 프로모터 활성을 용량 의존적으로 향상시켰다. 이러한 결과는 YY2의 과발현이 조골세포 분화를 촉진함을 시사한다.
실험예 4
YY2가 Osterix의 발현을 증가시키는지 다음과 같이 분석하고 그 결과를 도 4a 내지 도 4c에 나타냈다.
HEK293 세포는 HA-Osterix(왼쪽 패널) 또는 HA-Runx2(오른쪽 패널)로 형질감염되었고 Myc-YY2의 양이 증가했다. 48시간 후, 세포 용해물이 웨스턴블랏에 의해 측정되었다. 튜불린은 로딩 대조군으로 사용되었다. 또한, Osterix의 mRNA 수준을 RT-PCR로 비교했다. 표적 단백질은 웨스턴 블롯팅으로 검출했다.
도 4a 내지 도 4c는 Osterix mRNA 발현이 YY2 형질감염 후 C2C2 세포에서 분화하는 동안 점진적으로 향상되었지만 Runx2 발현은 약간 증가했음을 보여준다. 또한, YY2의 과발현은 조골세포 분화 동안 Osterix 단백질 발현을 향상시켰다. 이러한 결과는 조골세포 분화에 대한 YY2의 효과가 특정 전사 인자 Osterix의 발현의 상향 조절을 통한 것임을 나타낸다.
실험예 5
YY2가 Osterix 발현을 조절하는 메커니즘을 보여주기 위해 pGL3 벡터에 삽입된 3kb Osterix 프로모터 영역을 구성하고 Osx 프로모터 활성에 대한 YY2의 효과를 다음과 같이 확인하고 그 결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타냈다. C2C12 세포는 ALP, BSP, OC-luc 리포터 유전자(0.3ug) 및 beta-gal(0.05ug) 단독으로 또는 YY2(0.5ug)로 형질감염되고 Osterix(0.5ug)를 발현하는 플라스미드 구축물과 조합으로 형질감염되었다. 그런 다음 세포를 BMP4로 48시간 동안 자극하고 루시페라제 활성을 측정했다. **P < 0.05 및 *P < 0.1 대조군과 비교.
도 5a 내지 도 5c에 나타난 바와 같이, YY2의 과발현이 용량 의존적으로 Osx 프로모터 활성을 유의하게 향상시킨다는 것을 보여주며, 이로부터 YY2가 Osterix 프로모터에 대한 자극 효과를 통해 조골 세포 분화 동안 Osterix 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.
실험예 6
YY2가 Osterix 프로모터의 활성을 자극하는지 실험하고 그 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타냈다. 도 6a는 인간 Osterix 프로모터가 구축된 pGL3 벡터의 개략도(3kb)이고, 도 6b는 HEK 293 세포에 pGL3-인간 Osterix 유전자(0.3ug) 및 베타-gal(0.05ug) 및 YY2의 양을 증가시키면서 형질감염시킨 다음 48시간 후, 루시퍼라제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b로부터, YY2가 용량 의존적으로 osx 프로모터 활성을 상당히 향상시켰음을 알 수 있다.
실험예 7
Osterix에 대한 YY2의 효과는 YY1 결합 모티프에서 발생하는지 확인하고 그 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타냈다. 도 7a는 YY1 결합 부위(2.1kb-luc, 1.4kb-luc, 0.7kb-luc)가 결여된 야생형 pGL3-Osterix 프로모터(3kb-luc) 벡터 및 pGL3-Osterix 프로모터 구축된 pGL3 벡터의 개략도이다. 즉, Osterix의 프로모터 영역은 ??2788 ~ -2808, -1577 ~ -1595에서 YY1(yinyang1)에 대한 두 개의 인식 사이트를 포함한다. 이전에 보고된 바와 같이 YY2는 YY1의 상동 파라로그이고 YY2의 징크 핑거 구조 도메인은 yinyang1과 거의 86.4% 동일성을 공유하며 기능적으로 YY1과 유사하다. 특히, YY1과 YY2에 의해 결합된 대부분의 DNA는 알려진 YY1 컨센서스 모티프(CGCCATnT)를 포함한다.
Osterix에 대한 YY2의 영향이 YY1 인식 부위에서 발생하는지 여부를 입증하기 위해, 크기가 다른 3kb Osterix 프로모터를 삭제하고 2.1kb, 1.4kb 및 0.7kb의 단일 yinyang1 인식 부위를 포함하는 3개의 플라스미드를 얻었다.
도 7b는 단일 인식 부위를 갖는 1.4kb 및 0.7kb 플라스미드의 프로모터 활성이 2개의 인식 부위를 갖는 3kb 플라스미드의 프로모터 활성보다 현저히 낮다는 것을 보여주는데, 이것은 Osterix에 대한 YY2의 영향이 YY1 인식 부위에서 발생함을 시사한다.
실험예 8
돌연변이 그룹에서 YY2의 효과가 야생형보다 osx 프로모터에 대해 유의하게 덜 효과적이었는지 확인하고 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다. 도 8a는 YY1 결합 부위에서 pGL3-Osterix 프로모터 돌연변이 형태의 개략도이고, 도 8b는 빈 벡터 또는 YY2 형질감염된 그룹에서 Osterix 프로모터 활성의 상대적 활성을 나타낸 그래프이다(**P < 0.05 및 *P < 0.1 대조군과 비교).
YY2에 대한 YY1 인식 유전자좌의 중요성을 추가로 입증하기 위해 두 유전자좌를 모두 돌연변이시키고 두 유전자좌를 구별하기 위해 y1 유전자좌에 대해 ??2788 ~ -2806, y2에 대해 ??1577 ~ -1595를 나눈 다음 각각 단일 돌연변이 또는 이중 돌연변이를 수행했다.
도 8b에 도시된 바와 같이, 돌연변이된 유전자좌에서 YY2의 과발현은 야생형보다 Osx 프로모터에서 유의하게 덜 효과적이었다. 이러한 결과로부터 Osterix 발현의 YY2 상향 조절이 yinyang1 억제 작용 부위에서 발생한다는 것이 분명하다.
실험예 9
YY2 Knockdown이 조골 세포 분화에 미치는 효과를 조사하고, 그 결과를 도 9 내지 도 13c에 나타냈다.
도 9는 C2C12 세포를 대조군(pSuper-empty vector) 또는 증가하는 양의 YY2 shRNA 플라스미드(shYY2)로 형질감염시키고 BMP4로 자극한 다음 ALP 활성에 대해 염색하여 얻어진 결과 사진이다. 도 9로부터 YY2 녹다운은 조골세포 분화를 억제하는 것을 알 수 있다.
도 10a 내지 도 10e는 YY2 녹다운이 조골세포 마커의 발현을 억제하는지 확인하기 위해 ALP, BSP, OC, Runx2 및 Osterix의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과 그래프이다. 즉 C2C12 세포를 대조군(pSuper-empty vector) 또는 shYY2로 형질감염시킨 다음 BMP4로 48시간 동안 자극하였다. 그 후 ALP, BSP, OC, Runx2 및 Osterix의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 도 10a 내지 도 10e로부터 YY2 녹다운이 조골세포 마커의 발현을 억제하는 것을 알 수 있다.
도 11a 및 도 11b는 YY2 녹다운이 조골세포 특이적 리포터의 발현을 감소시키는지 확인한 결과그래프이다. 즉, C2C12 세포를 ALP, BSP, OC-Luc 리포터 유전자(0.3ug) 및 베타-갈(0.05ug) 단독 또는 대조군(pSuper-empty vector) 또는 shYY2로 형질감염시켰다. 그런 다음 세포를 36시간 동안 BMP4로 처리하고 루시페라제 활성을 측정했다(**P < 0.05 대조군과 비교). 도 11a 및 도 11b는 YY2 녹다운이 조골세포 특이적 리포터의 발현을 감소시키는 것을 보여준다.
도 12는 YY2 녹다운이 Runx2 및 Osterix 단백질의 수준을 감소시키는지 확인한 결과이다. C2C12 세포는 조골 세포 분화 동안 대조군(pSuper-empty 벡터) 또는 shYY2로 형질감염되었다. 숫자는 분화 유도 시점을 나타낸다. 세포 용해물을 웨스턴블랏으로 분석했다. 도 12로부터 YY2 녹다운이 Runx2 및 Osterix 단백질의 수준을 감소시키는 것을 알 수 있다.
도 13a 내지 도 13c는 YY2 녹다운이 Osterix의 전사 활성을 감소시키는지 보여주는 결과그래프이다. C2C12 세포를 ALP, BSP 또는 OC-Luc 리포터 단독으로 또는 Osterix 및 shYY2의 지시된 조합으로 형질감염시킨 다음 36시간 후 BMP4로 자극하고 루시퍼라제 활성을 측정하였다(**P < 0.05 및 *P < 0.1 대조군과 비교). 도 13a 내지 도 13c로부터 YY2 녹다운이 Osterix의 전사 활성을 감소시키는 것을 알 수 있다.
상술된 바와 같이, YY2의 녹다운은 BMP 유도 ALP 활성을 유의하게 억제했고, 조골세포 분화 마커인 ALP, BSP 및 OC의 mRNA 발현을 유의하게 감소시켰다. 또한, YY2의 녹다운은 ALP, BSP 및 OC를 포함하는 프로모터 영역의 형광 활성을 억제했고, 전사인자 Osterix의 단백질과 mRNA의 발현을 억제하였다. 이러한 결과는 YY2의 녹다운이 Osterix의 전사 활성을 감소시켜 조골세포 분화를 억제하는 것을 분명히 보여준다.
그 결과, YY2가 조골 세포 분화 특이적 전사 인자 Osterix의 프로모터의 활성을 상향 조절하고 조골 세포 분화 동안 mRNA와 단백질에서 Osterix의 발현을 향상시키는 것이 분명하므로, 본 발명의 YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자 또는 그 발현단백질을 유효성분으로 포함하는 약학조성물 및 건강기능식품은 골다공증 예방 또는 치료에 적합하다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
<110> Industry Foundation of Chonnam National University
<120> Pharmaceutical Composition comprising YY2 for Preventing or
Treating of Bone Related Diseases
<130> DPP-2022-0006-KR
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1137
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA of Mouse YY2
<400> 1
atggcctctg agacagagaa acttctgtgt cttaacacag aaagcgcaga gattcctgct 60
gattttgtgg agctgctgcc accggataat atcggtgata tcgaggcggt ttctctggaa 120
accagcgtag gccaaaccat cgaagtatat ggagatgtag gtgtcgattg ggcgcatggt 180
agccaatacc actctcctgt tattgctctg cagccgcttg tgggcagcag cctgagtagt 240
agagatcatg ataaggaaat gtttgtcgtt cagacacgag aggaggaggt ggtgggctac 300
caagactcag acaacctact attcagtcct gaatttggaa gccagatggt tttgccagtt 360
aatgaagacg actatctcca gccgaccact gcctctttta cgggctttct ggcggcagag 420
aatggtcaag gtgagctcag cccctatgaa gggaatctct gtggtttgac gacctttata 480
gaggccggtg cagaagaaag cgtgaacgct gacctgggtg acaaacagtg ggagcagaag 540
cagatcgatg gtcttgatgg cgaatttccc ttcaccatgt gggacgatgt taatgaaaaa 600
gaagatccca tagctgaaga acaggctggt gagtcacccc ccgattattc tgagtatatg 660
acaggaaaga aatttcctcc tgaaggaata cctggcattg atctttctga tcccaaacaa 720
ctggcagaat ttactagcat gagacccaaa aagccaaaag gagactttcc aagacctata 780
gcatgctctc ataaaggctg cgagaagatg ttcaaagata attctgctat gagaaagcac 840
ttgcacatcc atgggccgag agtgcatgtc tgtgcagaat gtggcaaagc ttttgttgag 900
agttccaagc tgaaacgtca tcagcttgtt cacactggag agaaacccta ccagtgtacc 960
tttgaaggct gtgggagacg cttttccctg gatttcaatt tgcgcacaca tgtgcgaatc 1020
catactggag acaaaccttt cgtgtgtcca tttgatgcct gcaacaagaa gtttgcacag 1080
tcaacaaacc tgaaatcgca tatcttaacc catgttaaga acaagaatga ccagtaa 1137
<210> 2
<211> 378
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Ala Ser Glu Thr Glu Lys Leu Leu Cys Leu Asn Thr Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Ile Pro Ala Asp Phe Val Glu Leu Leu Pro Pro Asp Asn Ile Gly
20 25 30
Asp Ile Glu Ala Val Ser Leu Glu Thr Ser Val Gly Gln Thr Ile Glu
35 40 45
Val Tyr Gly Asp Val Gly Val Asp Trp Ala His Gly Ser Gln Tyr His
50 55 60
Ser Pro Val Ile Ala Leu Gln Pro Leu Val Gly Ser Ser Leu Ser Ser
65 70 75 80
Arg Asp His Asp Lys Glu Met Phe Val Val Gln Thr Arg Glu Glu Glu
85 90 95
Val Val Gly Tyr Gln Asp Ser Asp Asn Leu Leu Phe Ser Pro Glu Phe
100 105 110
Gly Ser Gln Met Val Leu Pro Val Asn Glu Asp Asp Tyr Leu Gln Pro
115 120 125
Thr Thr Ala Ser Phe Thr Gly Phe Leu Ala Ala Glu Asn Gly Gln Gly
130 135 140
Glu Leu Ser Pro Tyr Glu Gly Asn Leu Cys Gly Leu Thr Thr Phe Ile
145 150 155 160
Glu Ala Gly Ala Glu Glu Ser Val Asn Ala Asp Leu Gly Asp Lys Gln
165 170 175
Trp Glu Gln Lys Gln Ile Asp Gly Leu Asp Gly Glu Phe Pro Phe Thr
180 185 190
Met Trp Asp Asp Val Asn Glu Lys Glu Asp Pro Ile Ala Glu Glu Gln
195 200 205
Ala Gly Glu Ser Pro Pro Asp Tyr Ser Glu Tyr Met Thr Gly Lys Lys
210 215 220
Phe Pro Pro Glu Gly Ile Pro Gly Ile Asp Leu Ser Asp Pro Lys Gln
225 230 235 240
Leu Ala Glu Phe Thr Ser Met Arg Pro Lys Lys Pro Lys Gly Asp Phe
245 250 255
Pro Arg Pro Ile Ala Cys Ser His Lys Gly Cys Glu Lys Met Phe Lys
260 265 270
Asp Asn Ser Ala Met Arg Lys His Leu His Ile His Gly Pro Arg Val
275 280 285
His Val Cys Ala Glu Cys Gly Lys Ala Phe Val Glu Ser Ser Lys Leu
290 295 300
Lys Arg His Gln Leu Val His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Thr
305 310 315 320
Phe Glu Gly Cys Gly Arg Arg Phe Ser Leu Asp Phe Asn Leu Arg Thr
325 330 335
His Val Arg Ile His Thr Gly Asp Lys Pro Phe Val Cys Pro Phe Asp
340 345 350
Ala Cys Asn Lys Lys Phe Ala Gln Ser Thr Asn Leu Lys Ser His Ile
355 360 365
Leu Thr His Val Lys Asn Lys Asn Asp Gln
370 375
Claims (12)
- YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 YY2를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 cDNA 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 발현 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열번호 1과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 발현 단백질은 조골세포 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 4 항에 있어서,
상기 발현 단백질은 BSP, ALP 및 OC의 프로모터 활성을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 4 항에 있어서,
상기 발현 단백질은 Osterix의 mRNA 전사 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 4 항에 있어서,
상기 발현 단백질의 함량은 0.1 ㎍/㎎ 내지 1 ㎎/㎎인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제 8 항에 있어서,
상기 YY2를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 cDNA 또는 이에 상보적인 염기 서열을 갖는 mRNA인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제 8 항에 있어서,
상기 발현 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- (a) YY2(Yin Yang 2)를 코딩하는 유전자를 발현하는 세포 또는 인간을 제외한 동물을 배양하는 단계;
(b) 피검물질을 상기 (a) 단계의 세포 또는 동물과 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 세포 또는 동물에서 YY2 단백질의 발현 수준을, 피검물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 골다공증 예방 또는 치료용 약학조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유류의 골다공증 치료방법.
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