KR20230119635A - 백신 제조를 위한 효모 플랫폼 - Google Patents

백신 제조를 위한 효모 플랫폼 Download PDF

Info

Publication number
KR20230119635A
KR20230119635A KR1020237018075A KR20237018075A KR20230119635A KR 20230119635 A KR20230119635 A KR 20230119635A KR 1020237018075 A KR1020237018075 A KR 1020237018075A KR 20237018075 A KR20237018075 A KR 20237018075A KR 20230119635 A KR20230119635 A KR 20230119635A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
thr
ile
asn
ser
Prior art date
Application number
KR1020237018075A
Other languages
English (en)
Inventor
콘스탄체 멜가르텐
카린 브로이니히
레네 차벨
폴커 프랑케
카롤린 클라인딘스트
Original Assignee
세리문 이스트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 세리문 이스트 게엠베하 filed Critical 세리문 이스트 게엠베하
Publication of KR20230119635A publication Critical patent/KR20230119635A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12111—Orbivirus, e.g. bluetongue virus
    • C12N2720/12122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 이식유전자의 효율적이고 안정한 발현, 바람직하게 병원체로부터 유래되는 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드(들)의 발현을 위한 재조합 효모 세포의 제공에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 재조합 효모 세포를 포함하는 백신 조성물, 백신접종을 위한 방법에서 상기 재조합 효모 세포의 용도, 및 본 발명의 적어도 하나의 이배체 재조합 효모 세포를 포함하는 전체 효모 백신의 제조를 위한 방법에 관한 것이다. 야생형 효모 균주로부터 이배체 효모 세포의 제공을 위한 방법이 또한 포괄된다.

Description

백신 제조를 위한 효모 플랫폼
본 발명은 이식유전자의 효율적이고 안정한 발현, 바람직하게 병원체로부터 유래된 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드(들)의 발현을 위한 재조합 효모 세포, 재조합 효모 세포를 제조하는 방법 및 백신으로서 이의 용도에 관한 것이다.
바이러스 질환은 백신을 통해서 가장 효과적으로 퇴치된다. 고전적인 바이러스 백신 경우, 소위 생 백신 및 사멸 백신이 구분된다. 생 백신은 소위 "약독화" 바이러스, 즉 병독성이 감소된 변이체로서, 천연 변이체로서 단리될 수 있거나, 비-숙주 세포로부터 세포 배양에서 패신저를 통해 수득되거나, 또는 표적화된 돌연변이유발법을 통해서 유전자 조작될 수 있다. 생 백신의 특징적인 특성은 감소된 수준에도 불구하고, 복제되는 백신접종 바이러스의 능력이다. 대조적으로, 사멸 백신은 그들이 더 이상 번식될 수 없도록 불활성화 (예를 들어, 화학적 또는 물리적 처리에 의함)된 것인 바이러스를 기반으로 한다.
이러한 고전적인 백신이 광범위하게 사용되어 왔고, 사용되고 있지만, 지난 10년 동안 새로운 백신 유형의 개발을 독려하는 문제가 존재한다. 한편으로, 백신접종된 동물은 일반적으로 현장 바이러스로 감염된 동물과 구별될 수 없고, 다른 한편으로, 백신의 생산은 세포 배양 또는 계란에서 바이러스의 번식을 요구하고, 이것은 상당한 안전성 대책을 요구한다. 계란 또는 세포 배양에서 증식시킬 수 없는 바이러스, 예컨대 돼지 로타바이러스 C 유전자형 (PRVC)에 대한 고전적인 백신은 존재하지 않는다.
서브유닛 백신 (서브유닛 백신; 마커 백신)은 비리온 (조립된 바이러스 입자)의 오직 일부분, 일반적으로 바이러스 입자의 표면 상에 면역원성 성질을 갖는 구조적 단백질을 함유하는 백신이다. 서브유닛 백신은 생 백신에 비해서 상당히 더 안전하고 또한 사멸 백신에 비해서 더 안전한데, 이 백신은 복제를 가능하게 만들 수 있는 임의의 바이러스 유전 물질을 함유하지 않기 때문이다. 서브유닛 백신이 병원체의 면역원성 부분만을 함유하므로, 그들은 일반적으로 혈장 바이러스로 감염된 동물과 백신접종된 동물의 구별을 가능하게 한다. 이러한 능력은 일반적으로, "DIVA 능력", 즉 감염 및 백신접종 동물 간 구별 (Differentiating between Infected and Vaccinated Animals)이라고 한다. DIVA는 전염병 또는 모니터링 프로그램에서 매우 중요하다.
바이러스 서브유닛 (즉, 조립된 바이러스 입자의 일부)은 천연적으로 다량체 단백질 복합체에 통합된다. 조립된 바이러스 입자의 추가 부분, 즉, 천연 상호작용 파트너없는 합성은 잘못된 단백질 폴딩, 응집 및/또는 분해를 초래할 수 있어서 면역원성 효과를 약화시킬 수 있다. 개별 바이러스 성분의 보다 낮은 면역원성은 또한 바이러스 항원이 면역 세포에 의해 인식되도록 비리온 표면 상에서 모여있을 때가 아니라, 정제되고, 개별화된 단백질로서 있을 때 발생되는, 희석 효과로 인해 야기될 수 있다. 이러한 희석 효과를 상쇄시키기 위해서, 항원 또는 이로부터의 에피토프로 장식될 수 있는 다양한 기하학적 스캐폴드가 개발되었다. 가장 단순한 경우에, 바이러스 항원은 그 자체로 규칙적인 구조로 조립될 수 있어서 소위 VLP (바이러스-유사 입자)를 형성할 수 있다. 이러한 VLP는 최신 서브유닛 백신의 개발을 위한 유망한 접근법이다.
많은 RNA 바이러스의 게놈이 절편화되므로, 혈청형의 변화는 돌연변이뿐만 아니라, 소위 상동성 RNA 절편의 재배열에 의해서도 야기된다. 이것은 가능하게 성질이 변경된, 신규 항원 조합 (소위 최신 바이러스 변이체)을 생성시키고, 신규 백신의 신속한 개발을 필요로 할 수 있다.
오랫동안, 원핵생물 및 진핵생물 미생물 모두는 "세포 공장"으로서 확립되었는데, 그들이 산업적 규모로 원하는 생산물의 비교적 저렴한 배양 및 농축을 가능하게 하기 때문이다.
효모는 특히 VLP의 형태로, 서브유닛 백신의 개발을 위한 매우 유용한 플랫폼인 것으로 최근에 증명되었다. 그들은 개발 및 생산 비용 관점에서 미생물 발현 시스템의 장점을 진핵생물 발현 시스템에 의해 제공되는 장점과 조합한다. 박테리아와 대조적으로, 효모는 모든 동물 세포처럼, pH, 산화 환원 전위, 이온 강도 및 단백질 조성이 세포질과 상당히 상이한 막으로 둘러싸인 세포 소기관을 함유하는, 진핵생물 세포이다. 아마도 바이러스 및 숙주 단백질의 공-진화로 인해서, 많은 바이러스 단백질은 박테리아에 비해서 효모에서 더욱 잘 발현될 수 있거나 또는 합성될 수 있다. 단백질원성 바이러스 성분의 안정성 및 생화학적 성질은 그들 세포내 국재화에 의해서 상당히 영향받는다.
단백질 공장으로서 효모 세포의 사용은 일반적으로 효모의 대규모 배양에 이어서, 생화학적 방법을 사용한 세포 파괴 및 단백질의 정제를 포함한다. 이러한 경우에, 상응하는 숙주 세포의 단백질 합성 능력이 가장 중요하다. 또한, 효모 세포의 표면 성질이 주목받고 있다. 면역계의 수지상 세포는 효모 세포에 의해 활성화될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 효모 세포는 유리하게 신규한 부류의 백신으로서, 전체 효모(-기반) 백신 (WYV) 또는 전체 재조합 효모 (WRY), 특히 서브유닛 백신으로서 사용될 수 있다.
WYV의 특징은 세포 파괴 및 항원의 정제가 존재하지 않는다는 것이다. 전체 효모 세포는 불활성화되어서 백신접종에 사용된다. WYV의 한 장점은 VLP 또는 다른 면역원성 단백질 복합체가 생리적 환경에 남아있는다는 것이다. 면역원성 잠재성을 갖는 다수 단백질은 동일한 효모 세포에서 발현될 수 있고 이상적으로 이들 재조합적으로 발현된 항원은 효모 시토졸에서 자가-조립되어서 안정한 바이러스-유사 입자 (VLP), 서브바이러스 입자 또는 다른 고도의 면역원성 단백질 복합체를 형성한다.
지금까지, WYV의 투여 시 면역 반응이 고전적인 백신에 의해 초래되는 것과 상이한지 여부는 거의 알려져 있지 않다. 면역 세포, 예컨대 수지상 세포 또는 마크로파지에 의해 흡수되고 파괴되어서, 효모 세포의 세포질 단백질은 펩티드로 분해되어 MHC 분자에 의해 제시될 수 있다고 가정된다.
효모는 종종 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)와 동의어로 사용된다. 그러나, 용어 "효모"는 4억년 이상 동안 분기된 분류학적 계통에 속하는 수천 종을 포함하여, 자실체가 결여된 단세포 진균을 의미한다. 비교 유전체학은 기준 효모 시스템 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 및 이의 가장 가까운 동류가 전체 게놈 복제 (WGD) 사건에 이어서 대량 유전자 손실, 게놈 재배열 및 복제된 유전자의 가속화된 기능적 분기를 겪었다는 것을 밝혀주었다. 따라서, 이러한 분기군은 WGD를 겪지 않은 효모, 소위 pre-WGD 종과 많은 측면이 상이하다.
아문 사카로마이코티나 (Saccharomycotina) (에스. 세레비지아에 포함)의 구성원 중에서 유전적 다양성은 동물 및 식물의 것과 유사한 것으로 보인다. 유전적 구성은 물질대사, 생태적 특화, 표면 성질, 유전적 안정성, 형태 및 많은 다른 생물학적 성질을 결정한다. 다수의 효모-기반 생물공학 과정 경우에, 에스. 세레비지아에 이외의 효모 종이 우수한 것으로 증명되었다. 유전적 차이는 또한 전체 세포 효모 백신 (WYV)으로서 그들 용도와 관련된 성질에 영향을 미칠 것으로 예상된다.
소위 비-전통적인 효모 중에서, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 속이 생물공학에서 특히 흥미롭다. 충분히 연구된 2개 클루이베로마이세스 종인 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 및 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 둘 모두는 GRAS 상태 (일반적으로 안전한 것으로 간주됨) 및 락토스를 물질대사하는 능력을 가지며, 이것은 효모 중에서도 다소 드문 것이다.
로타바이러스는 비-외피형이지만 비교적 복잡한 캡시드 구조를 갖는다. 그러므로, VLP의 형태로, 돼지 로타바이러스 (PRV)같은, 로타바이러스의 몇몇 항원의 공-발현은 특히나 어렵다.
돼지 로타바이러스는 전세계적으로 어린 동물에서 바이러스성 위장염의 가장 흔한 원인이다. 나이 든 동물은 후속 면역력과 함께 생존 감염을 통해서, 또한 장의 생리적 변화를 통해서도 내성이 될 수 있다. 9가지의 공지된 로타바이러스 유전자형 (A-I) 중에서, 유전자형 A 및 C 는 특히 자돈에서 설사병과 연관되어 발생된다.
로타바이러스는 이중 가닥 RNA 바이러스로서, 60 내지 80 nm 크기이고 레오비리다에 과에 속한다. 바이러스는 낮은 숙주-특이성을 갖고, 매우 내성이며, 그들 장독소 형성 (NSP4)으로 인해서 중증 위장병을 초래한다. 로타바이러스는 비-외피형 RNA 바이러스에 속하고, 그들은 편재성이며, 거의 모든 성체 돼지가 로타바이러스 감염을 겪어서 상응하는 항체가 형성된다. 그들은 어린 동물에서 가장 중요한 병원체 중 하나이고, 많은 환경에서 오랫동안 감염성을 유지한다. 경구 섭취 후, 바이러스는 장 세포 (장세포)를 침투하여 그들 흡수 기능을 파괴한다.
소위 모계 백신으로 임신한 동물의 백신접종은 송아지 사육에서 성공적인 것으로 증명되었다. 이러한 백신은 모유 (초유)를 통해서 다량의 특이적 로타바이러스 항체를 신생아에게 공급하며, 따라서 생후 제1 주에 로타바이러스 감염으로부터 동물을 보호할 수 있다. 다양한 상업적으로 중요한 국가에서 암퇘지의 백신접종을 위해 승인된 로타바이러스 백신이 존재하지 않는다는 점을 고려하면, PRV에 대한 암퇘지에 적절한 백신에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다.
돼지 사육에 대해 심각한 경제적 영향과 종종 연관되는 돼지에 영향을 미치는 추가의 바이러스 감염성 질환은 약 5000 뉴클레오티드의 네거티브, 단일 가닥 DNA 게놈을 갖는 소형, 비-외피형 DNA 바이러스인, 돼지 파보바이러스 (PPV)에 의해 초래된다. 이것은 파보비리다에 과의 구성원으로서 최초로 인식되었다. 전세계적으로 이것은 SMEDI 증후군 (Stillbirths, Mummification, Embryonic Death, and Infertility)이라고 불리는 생식 장애의 가장 흔한 바이러스 원인물 중 하나이다. PPV 바이러스에 감염된 암퇘지에서 증상의 발생률 및 중증도는 병독성, 바이러스의 양 및 임신 단계에 의존적이다. 임신 70일 이전에 감염된 태아는 일반적으로 사망하는데 반해서, 발달 후기에 감염된 태아는 PPV에 대한 항체를 생산하여, 바이러스를 제거하고 감염에서 살아남는다.
PPV에 대한 백신접종은 바이러스 감염 및 배출을 예방할 수 없지만, SMEDI 질환으로부터 돼지를 보호한다. 비병원성 PPV-NADL-2 균주 (클러스터 1)는 불활성화된 전체-바이러스 백신의 생산을 위해 널리 사용된다. 상대적으로 새로운 백신 ReproCyc® ParvoFLEX (Boehringer Ingelheim)은 병독성 독일 현장 단리주 PPV 27a를 기반으로 한다. 여기서, 배큘로바이러스 발현 시스템은 바이러스-유사 입자 (VPL)로 자발적으로 조립되는 VP2 서브유닛 항원을 생산하는데 사용된다.
말과 (예를 들어, 말, 얼룩말, 또는 당나귀)는 전세계적으로 사육되고 일반적으로 감염성 바이러스 질환에 의해 영향을 받는 동물종의 다른 그룹을 대표한다. 말과에 영향을 미치는 일반적인 바이러스성 질환 중 하나는 AHS (아프리카 말병)로서, 큘리코이데스 (Culicoides) (흡혈 곤충) 종에 의해 전파되는 말과 (말, 얼룩말, 및 당나귀)에서의 고도로 감염성이고 종종 치명적인 바이러스 감염성 질환이다. 미경험 말에서, AHS 바이러스 (AHSV)는 미열에서 급성, 중증 형태에 이르기까지, 다양한 형태의 질환을 초래한다. 급성 형태는 고열, 숨가쁨, 및 무기력을 특징으로 하고 사망률이 90% 이상이다. AHS는 열대 및 사하라 이남 아프리카에서 풍토병이다. 분포 지역은 지구 온난화로 인해서 최근에 북쪽으로 상당히 확장되고 있는 것으로 보인다. 한편으로는 동물 이동 및 감염된 동물의 거래, 및 다른 한편으로 차량, 항공기 및 강풍에 의한 곤충의 확산을 통해서, 병원체가 언제든지 이전에 바이러스가 없던 지역으로 유입될 수 있다. 과거에는, 북아프리카, 남유럽을 비롯하여 중동 및 아라비아 반도의 국가들에서 AHSV가 정기적으로 발발하였다. 이들 사건이 향후에 증가될까봐 우려되고 있다.
AHSV 는 7개 구조적 단백질 (VP1 내지 VP7) 및 5개 비-구조적 단백질 NS1, NS2, NS3, NS3a 및 NSP4를 코딩하는 10개 절편을 함유하는 이중 가닥 RNA 게놈을 갖는 오르비바이러스 속의 비-외피형 바이러스이다. 바이러스 입자는 3개의 별개 단백질 층 (VP2, VP5 및 VP7)으로 이루어진다. VP2는 AHSV의 가장 가변적인 단백질로서, 외부 캡시드의 주요 성분이고 AHSV 혈청형의 결정인자이다. VP2는 혈청형 특이적 단백질이고, 바이러스-중화 항체의 주요 표적이다. VP2의 가변성은 바이러스의 항원성 다양성의 근간이고, 9개의 상이한 혈청형 (AHSV-1 내지 AHSV-9)으로 나뉜다. 대조적으로, VP7 (캡시드 중간층)은 모든 AHSV 혈청형 간에 고도로 보존되어 있고, 따라서 다양한 진단 AHSV 어세이에서 표적 단백질로서 제공된다.
도 1: 효모, 특히 케이. 마르시아누스 (K. marxianus)에서 선택마커 유전자로서 사용하고 발현 카세트의 게놈 통합을 위한 예시적인 염색체 유전자좌의 개략도.
도 2: 본 명세서에서 구축된 케이. 마르시아누스 돌연변이체의 개략적인 대표도. (1) ura3- (FOA 선택); (2) kat1Δ :: loxP-KanR-loxP / loxP (pSY15-R); (3) alpha3Δ :: loxP-KanR-loxP / loxP (pSY229-R); (4) ade2Δ :: ScURA3 / Scura3 (pSY109-R); (5) met5Δ :: loxP-KanR-loxP / loxP (pSY129-R); (6) leu2Δ :: loxP-HygR-loxP/loxP (pSY241-R); (7) his3Δ :: loxP-NrsR-loxP / loxP (pSY242-R); (8) lac4-lac12Δ :: ScURA3 / Scura3 (pSY102-R).
도 3: MATa-배경을 갖는 균주에서 ARO10-ADE2 유전자좌에 치환 및 ADE2 유전자의 복원을 갖는 재조합 케이. 마르시아누스 효모 세포의 생성 개략도.
케이. 마르시아누스 ARO10-ADE2 유전자좌 (1) 및 ade2Δ::ScURA3 로서 표시되는 ScURA3-기반 파괴 카세트의 통합 후 상응하는 게놈 영역 (2)의 개략적인 대표도. 각각 ARO10 및 ADE2 유전자의 위치, 및 전사 방향은 화살표로 표시된다. PRVA-VP4-3HA-opt 의 2개 카피를 발현하는 재조합 케이. 마르시아누스 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터 pSY147 (3)은 적절한 제한 효소 (LguI + KpnI)로 가수분해되고, 선형 단편이 SY267에 형질전환된다. 숙주 게놈으로 상동성 재조합은 ScURA3 유전자의 치환 및 이의 천연 프로모터 (P ADE2 )의 제어 하에서 ADE2 유전자의 복원을 일으킨다. 재조합 클론은 아데닌 (Ade+)을 합성하고 2개 이식유전자 (예를 들어, RVA-VP4-3HA-opt)를 발현하는데, 이의 발현은 양방향성 프로모터, 예를 들어, P LAC4-LAC12 중 하나 및 AgTEF1 종결자 (T)에 의해 제어된다 (예를 들어, 균주 SY277 & SY107) (4).
도 4: MATα 배경을 갖는 균주에서 ADE2 유전자 복원 대신에 선택을 위한 온전한 MET5 유전자의 통합을 갖는 재조합 케이. 마르시아누스 효모 세포의 생성 개략도.
케이. 마르시아누스 ARO10-ADE2 유전자좌 (1) 및 ade2Δ::ScURA3 으로서 표시되는 ScURA3-기반 파괴 카세트의 통합 후 상응하는 게놈 영역 (2)의 개략적인 대표도. 각각 ADE2 및 ARO10 유전자의 위치, 및 전사 방향은 화살표로 표시된다. PRVA-VP2-3HA-opt 의 2개 카피를 발현하는 재조합 케이. 마르시아누스 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터 pSY258 (3)은 적절한 제한 효소 (AatII + KpnI)로 가수분해되고, 선형 단편이 SY280에 형질전환된다. 숙주 게놈으로 상동성 재조합은 ADE2 유전자 대신에 이의 천연 프로모터 (P MET5 )의 제어 하에서 온전한 MET5 유전자의 통합을 일으킨다. 재조합 클론은 메티오닌 (Met+)을 합성하고 2개 이식유전자 (예를 들어, RVA-VP2-3HA-opt)를 발현하는데, 이의 발현은 각각 양방향성 프로모터, 예를 들어, P LAC4-LAC12 중 하나 및 AgTEF1 종결자 (T)에 의해 제어된다 (예를 들어, 균주 SY281 & SY102) (4).
도 5: MATα 배경을 갖는 균주에서 HIS3 유전자좌 상의 치환 및 HIS3 유전자의 복원을 갖는 재조합 케이. 마르시아누스 효모 세포의 생성 개략도. 케이. 마르시아누스 MRM1-HIS3-KLMA_50039 유전자좌 (1) 및 his3Δ::NsrR 로서 표시되는 노르세오트리신 내성 유전자 (NrsR)-기반 결실 카세트의 통합 후 상응하는 게놈 영역 (2)의 개략적 대표도. 각각 MRM1, HIS3 및 KLMA_50039 유전자의 위치, 및 전사의 방향은 화살표로 표시된다. PRVA-VP6-3HA-opt2 의 2개 카피를 발현하는 재조합 케이. 마르시아누스 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터 pSY250 (3)은 적절한 제한 효소 (PvuI + PaeI)로 가수분해되고, 선형 단편이 SY281에 형질전환된다. 숙주 게놈으로 상동성 재조합은 NrsR 유전자의 치환 및 이의 천연 프로모터 (P HIS3 )의 제어 하에서 HIS3 유전자의 복원을 일으킨다. 재조합 클론은 아데닌 (His+)을 합성하고, 2개 이식유전자 (예를 들어, RVA-VP6-3HA-opt2)를 발현하고, 이의 발현은 양방향성 프로모터, 예를 들어, P LAC4-LAC12 중 하나 및 AgTEF1 종결자 (T)에 의해 제어된다 (예를 들어, 균주 SY282 & SY167) (4).
도 6: MATa 배경을 갖는 균주에서 HIS3 유전자 대신에 온전한 LEU2 의 통합을 갖는 재조합 케이. 마르시아누스 효모 세포의 생성 개략도.
케이. 마르시아누스 MRM1-HIS3-KLMA_50039 유전자좌 (1) 및 his3Δ::NsrR 로 표시되는 노르세오트리신 내성 유전자 (NrsR)-기반 결실 카세트의 통합 후 상응하는 게놈 영역 (2)의 개략적인 대표도. 각각 MRM1, HIS3 및 KLMA_50039 유전자의 위치, 및 전사의 방향은 화살표로 표시된다. PRVA-VP7-3HA-opt 의 2개 카피를 발현하는 재조합 케이. 마르시아누스 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터 pSY275 (3)는 적절한 제한 효소 (BglI + PaeI)로 가수분해되고, 선형 단편이 SY277에 형질전환된다. 숙주 게놈으로 상동성 재조합은 NrsR 유전자의 치환 및 HIS3 유전자 대신에 이의 천연 프로모터 (P LEU2 )의 제어 하에서 온전한 LEU2 의 통합을 일으킨다. 재조합 클론은 메티오닌 (Leu+)을 합성하고 2개 이식유전자 (예를 들어, RVA-VP7-3HA-opt)를 발현하고, 이의 발현은 양방향성 프로모터, 예를 들어 P LAC4-LAC12 중 하나 및 AgTEF1 종결자 (T)에 의해 제어된다 (예를 들어, 균주 SY278 & SY171) (4).
도 7: 교잡 전에 SPRVA 항원을 발현하는 반수체 케이. 마르시아누스 효모 세포의 개략도.
도 8: 교잡 전에 PRVA 항원을 발현하는 반수체 케이. 마르시아누스 효모 세포의 개략도 (염색체 유전자좌).
도 9: 케이. 마르시아누스에서 재조합 단백질 발현에 대한 GAL80 결실의 영향. 글루코스 및 락토스에서 배양 후 양방향성 KmLAC4-LAC12 프로모터의 제어 하에서, PRVA-VP2-3HA-opt, PRVA-VP4-3HA-opt 및 PRVA-VP7-3HA-opt (A) 또는 PRVA-VP6-3HA-opt (B)를 발현하는, 염색체 GAL80 유전자 존재 (+) 및 부재(-)의 동종동계 효모 균주의 웨스턴 블롯 분석.
0.3 ODU (광학 밀도 단위)의 수확된 효모 배양물을 4-20% Mini-PROTEAN TGX 착색제 무함유 농도구배 겔 (Bio-Rad)에 로딩하였다. 1 ODU 는 세포 질량에 상응하고, 이것은 1 ml 부피에 재현탁되었을 때, 1의 광학 밀도 (OD) (OD600 nm = 1.0)를 제공한다. 에피토프 태그화된 단백질은 항-HA (F-7, sc-7392; 1:3000, Santa Cruz Biotechnology) 및 HRP-접합된 염소 항-마우스 2차 항체 (1:6000, Invitrogen)를 사용해 검출되었다. 항원은 화살표로 표시된다. 겔 레인 아래 숫자는 내부 표준 (MalE)을 사용하여 밴드 강도로부터 계산하고 Imagelab 6.0 소프트웨어 (Biorad)를 통해서 밀도계측으로 정량된 각 항원의 양 (mg 효모 건조 중량 당 μg)을 나타낸다.
온전한 GAL80 유전자 (-)의 결실은 락토스 배지에서 수득된 완전 유도 수준을 초과하는 수준까지, 글루코스 상에서 항원 발현을 일으킨다.
도 10: 효모 균주 SY102 (VP2), SY107 (VP4), SY167 (VP6) 및 SY171 (VP7)에서 개별적으로 발현된 4개 PRVA 항원의 면역원성 시험.
(A) 면역화 계획. 8주령 암컷 BALB/c 마우스는 VP2 (SY102), VP4 (SY107) 및 VP6 (SY167)을 사용하여 0일, 14일 및 28일에 2 내지 5 mg 효모 건조 중량으로 3회 또는 0일 및 14일에 2 mg의 VP7 (SY171)을 사용하여 2회 피하로 백신접종되었다. 대조군 동물은 항원없는 야생형 균주 SY41을 받았다. 혈청은 혈청전환을 측정하기 위해 각 백신접종 후 14일에 수집되었다.
(B) 마우스 혈청은 IgG ELISA 어세이를 통해서 VP2, VP4, VP6 및 VP7에 대한 PRVA-항원-특이적 항체의 존재에 대해서 분석되었다. 개별 점은 450 nm에서 개별 흡광도를 나타낸다. 데이터는 5마리 마우스의 평균 SEM 값 및 유사한 결과의 적어도 2회 독립 실험을 대표한다 (*** = p<0.001). ELISA에 대한 양성 대조군은 PRVA 감염된 돼지의 혈청이었고, 음성 대조군으로서 백신접종 전 0 혈청 (neg. 1) 또는 비-특이적 항체 (neg. 2)가 사용되었다.
재조합 반수체 효모 세포로 면역화 후에 개별 PRVA 항원을 발현하는 균주 각각은 항원 특이적 면역 반응을 유발하였다.
도 11: 이배체 세포의 배수성 상태의 PCR 확인 (아가로스 겔 전기영동). 표 6에 열거된 상이한 프라이머 세트를 사용하여서 이배체 균주에서 양쪽 교배형 대립유전자의 존재 및 예상되는 게놈 유전자좌에서 형질전환된 DNA 카세트의 통합을 확인하였다.
균주의 염색체 효모 DNA (SY41 = 레인 1; SY278 = 레인 2; SY282 = 레인 3; SYD4 = 레인 4-6)에 대해서 반수체 및 이배체 균주 배경에서 상이한 대립유전자의 존재 및 배수성 상태를 검증하는 특이적 프라이머 쌍을 사용한 PCR 분석이 수행되었다. SY41의 DNA는 야생형 대립유전자에 대한 기준으로서 사용되었다.
PCR 은 이배체 균주 SYD4가 양쪽 부모 반수체로부터의 유전적 구성요소를 함유한다는 것을 검증한다.
표 1: 아가로스 겔 전기영동이 수행된 PCR 샘플의 개요

도 12: 반수체 균주 (SY278, SY282) 및 2개 반수체 (SYD4)의 교배로 생성된 동종동계 이배체 균주 간에 성장 및 재조합 단백질 생산의 비교.
(A) 2% 글루코스를 함유하는 SD 배지에서 반수체 및 이배체 효모 균주의 성장 곡선. 성장은 600 nm에서 광학 밀도를 통해 측정되었다. 2회 독립 실험의 평균이 도시된다.
(B) 24시간 인큐베이션 후에 신선하게 수확된 효모 물질에서 VP2, VP4, VP6 및 VP7 단백질 수준의 웨스턴 블롯 정량. 0.3 OD (SY41), 0.15 OD (SY278), 0.075 OD (SY282) 및 0.019 OD 단위 (SYD4 -K1-K3)의 효모 배양물을 4-20% Mini-PROTEAN TGX 착색제 무함유 농도구배 겔 (Bio-Rad)에 로딩하였다. HA-태그화된 단백질은 항-HA (F-7, sc-7392; 1:3000, Santa Cruz Biotechnology) 및 HRP-접합된 염소 항-마우스 2차 항체 (1:6000, Invitrogen)를 사용해 검출되었다. PRVA 항원은 화살표로 표시된다. 겔 레인 위의 숫자는 내부 표준 (MalE)을 사용하여 밴드 강도로부터 계산되고, 로딩된 OD 단위를 고려하여 Imagelab 6.0 소프트웨어 (Biorad)를 통해서 밀도계측으로 정량된 각 항원의 양 (mg 효모 건조 중량 당 μg)을 나타낸다.
이배체 균주 SYD4가 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 더 높은 수준으로 발현하고 더 높은 성장률을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 13: 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV) 단백질 p12, p32, p62 및 p72 (SY255, SY262)를 발현하는 반수체 균주 및 교배를 통해 수득된 상응하는 동종동계 이배체 균주 SYD2 간 성장 및 재조합 단백질 생산의 비교.
(A) 2% 글루코스를 함유하는 SD 배지에서 반수체 및 이배체 효모 균주에 대한 성장 곡선. 광학 밀도는 600 nm에서 측정되었고, 값은 시간 경과에 따라 합성되었고 2회 독립 실험으로부터 평균 내었다.
(B) 24시간 인큐베이션 후에 신선하게 수확된 효모 물질에서 p12, p32, p62 및 p72 단백질 수준의 웨스턴 블롯 정량. 0.3 OD 단위의 각 효모 배양물을 4-20% Mini-PROTEAN TGX 착색제 무함유 농도구배 겔 (Bio-Rad)에 로딩하였다. 에피토프 태그화된 단백질은 항-HA (F-7, sc-7392; 1:3000, Santa Cruz Biotechnology) 및 HRP-접합된 염소 항-마우스 2차 항체 (1:6000, Invitrogen)를 사용하여 검출되었다. ASFV 항원은 화살표로 표시된다. 겔 레인 위의 숫자는 내부 표준 (MalE)을 사용하여 밴드 강도로부터 계산되고, 로딩된 OD 단위를 고려하여 Imagelab 6.0 소프트웨어 (Biorad)를 통해서 밀도계측으로 정량된 각 항원의 양 (mg 효모 건조 중량 당 μg)을 나타낸다.
이배체 균주 SYD2는 더 높은 분량으로 p12, p32, p62 및 p72를 발현하고 유리한 성장 특징을 갖는다는 것을 보여준다.
도 14: 유전적으로 표시된 반수체 균주의 교배 및 포자형성에 의한 신규한 선택가능한 항원 조합의 생성을 위한 개략적 작업 흐름도.
각각의 4개의 상이한 염색체가 유전자 마커에 커플링된 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 상이한 발현 카세트를 함유하는 반수체 균주는 발현 카세트를 코딩하는 4개의 추가적인 항원을 갖는 다른 반수체 균주와 교잡된다. 각각의 항원 코딩 발현 카세트에 연결된 최종 이배체 세포의 유전자 마커는 중간에 타원형으로 표시된다. 포자형성 시에, 이배체 세포는 감수분열을 겪고 각각의 포자는 각 염색체의 단일 카피를 물려받는다. MATa (흰색) 또는 MATα (회색) 카피의 유전은 무작위적으로 발생되므로, 항원 코딩 발현 카세트의 신규 조합 세트가 생성된다. 바람직한 조합은 각각의 발현 카세트에 연결된, 특이적 선택 마커 덕분에 선택적 배지 상에 도말하여 쉽게 확인될 수 있다. 개략적인 예에서, 2개 상동 염색체의 4개 세트는 24 =16 조합을 제공하고, 이들 중 2개는 부모 반수체의 유전자형을 갖는다. 따라서, 신규 조합의 수는 (24)-2=14이다. 8개 염색체를 갖는 케이. 마르시아누스의 경우에 28-2 = 256-2 = 254의 신규 조합이 생성될 수 있다. 연결된 마커는 그 마커에 대한 선택이 연결된 항원에 대한 선택과 동등하다는 것을 보장한다.
도 15: 본 명세서에서 사용되는 플라스미드의 플라스미드 맵: (A) pSY16, (B) pSY102, (C) pSY109, (D) pSY129, (E) pSY147, (F) pSY241, (G) pSY242, (H) pSY250, (I) pSY258, (J) pSY275, (K) pSY123, (L) pSY131, (M) pSY278, (N) pSY279, (O) pSY15 및 (P) pSY229.
도 16: PRVA 항원 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 발현하는 케이. 마르시아누스 균주의 면역원성 평가.
(A) 재조합 SY320 균주에 대한 면역화 계획. 8주령 암컷 BALB/c 마우스 (n = 5)는 SY320 (PRVA VP2, VP4, VP6 및 VP7 발현)을 사용하여 0일, 14일 및 28일에 2 mg 효모 건조 중량으로 3회 피하로 백신접종되었다. 대조군 동물 (n = 3)은 항원없는 야생형 균주 (SY41)를 받았다. 혈청은 혈청전환을 측정하기 위해 각 백신접종 후 14일에 수집되었다.
(B) 및 (C) SY320 균주를 사용한 마우스의 면역화에 대한 ELISA 어세이. 점은 백신접종 후 42일에 VP2, VP6, VP4 및 VP7에 대한 항체 유도를 나타내는 개별 마우스 혈청의 450 nm에서의 흡광도를 나타낸다. 데이터는 유사한 결과의 적어도 2회 독립 실험 및 5마리 마우스의 평균 SEM 값을 대표한다.
(D) 중화 항체 반응은 [Kang et al., J. Clin. Microbiol. 1989, 27(12), 2744-50]에 개시된 방법에 따라서 마지막 백신접종 후 2주에 측정되었다.
ELISA 및 SNT를 통해서 입증된 바와 같이, 4개 PRVA 항원 (VP2, VP4, VP6 및 VP7)을 공-발현하는, 균주 SY320의 재조합 반수체 효모 세포에 의한 면역화는 PRVA에 대한 보호적 중화 항체를 유도하였다.
도 17: PPV-VP2 항원을 발현하는 케이. 마르시아누스 균주의 면역원성 평가.
(A) 재조합 SY61 균주의 면역화 계획. 8주령 암컷 BALB/c 마우스 (n = 5)는 각각 반수체 MATa 균주 SY61 또는 PPV-VP2 발현 이배체 균주 (각각 2 mg 효모 건조 중량)의 단일 주사를 사용해 피하로 면역화되었다. 대조군 동물은 항원없는 야생형 균주 SY41을 받았다 (n = 3). 면역화 후 2주에 수집된 혈청은 간접 ELISA를 통해서 PPV-VP2-특이적 Ig 항체에 대해 분석되었다.
(B) SY61 균주를 사용한 마우스의 면역화에 대한 간접 IgG ELISA 어세이. 점은 450 nm에서의 흡광도를 나타낸다.
(C) 재조합 SY135 균주에 대한 면역화 계획. 8주령 암컷 BALB/c 마우스 (n = 5)는 각각 SY135 (PPV-VP2의 2개 카피 발현) 또는 상업적 백신 Porciles®Parvo (MSD, Tiergesundheit)을 사용하여, 0일, 14일 및 28일에 2 mg 효모 건조 중량으로 3회 피하로 면역화되었다. 대조군 동물 (n = 3)은 항원없는 야생형 균주 SY41을 받았다 (n = 3). 혈청은 혈청전환을 측정하기 위해 각 백신접종 후 14일에 수집되었다.
(D) SY135 균주를 사용한 면역화에 대한 간접 IgG ELISA 어세이. 개별 점은 450 nm에서 개별 흡광도를 나타낸다.
도 18: AHSV VP2 항원을 발현하는 케이. 마르시아누스 균주의 면역원성 평가.
(A) 재조합 SY338 균주에 대한 면역화 계획. 8주령 암컷 BALB/c 마우스는 SY338 (VP2-혈청형 4)을 사용하여 0일, 14일 및 28일에 2 mg 효모 건조 중량 (n = 5)으로 3회 피하로 백신접종되었다. 대조군 동물은 항원없는 야생형 균주 SY41을 받았다 (n = 3).
(B) 42일에 중화 적정가. 중화 항체는 표준 중화 어세이를 기반으로 100 TCID의 바이러스 존재 하에서 플라크 감소를 통해서 결정되었다. 중화 적정가는 플라크의 수가 혈청-무함유 대조군과 비교하여 50% 감소를 나타낸, 최대 희석의 역수값으로 계산되었다. 중화 시험은 이중으로 수행되었다.
본 발명은 이식유전자-코딩되는 유전자 생산물, 예컨대 면역원성 폴리펩티드의 매우 효율적인 발현을 위한 재조합 효모 세포, 재조합 효모 세포를 제조하는 방법, 및 백신으로서 재조합 효모 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 효모 세포는 적어도 하나의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 (i) 양방향성 프로모터 구성요소; (ii) 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자로서, 상기 제1 및 제2 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 반대쪽 말단에 위치하고, 각각의 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 한쪽 측면에 작동적으로 연결되는 것인 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자; (iii) 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자로서, 상기 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자의 바로 하류에 위치되고 상기 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자의 바로 하류에 위치되며; 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자에 작동적으로 연결되고 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자에 작동적으로 연결되는 것인 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자; 및 (iv) 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합체"는 "유전자 조작에 의해 제조되거나 또는 그의 결과"를 의미한다. 따라서, 재조합 미생물 또는 숙주 세포 (예를 들어, 효모 세포)는 적어도 하나의 "재조합 핵산", 즉, 유전자 조작에 의해 제조되었거나 또는 그의 결과인 핵산을 포함한다. 재조합 효모 세포는 특히 유전자 조작을 통해서 효모 세포 게놈으로 안정하게 통합된 발현 카세트를 포함한다.
용어 "발현 카세트"는 작동적으로 연결된 제어 서열 및 원하는 코딩 서열 (이식유전자)을 함유하는 핵산 분자를 의미하는 것으로서, 이들 서열로 형질전환된 숙주 세포가 이식유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 생산할 수 있게 된다. 유전적 안정성을 수득하기 위해서, 발현 카세트는 예를 들어, 상동성 재조합을 통해서 숙주 게놈에 통합된다 (즉, 게놈 통합된다).
본 발명에 따른 재조합 효모 세포는 하나 초과의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 2개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 재조합 효모 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함할 수 있다. 바람직하게, 재조합 효모 세포는 2, 4 또는 6개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 2개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다. 다른 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 4개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다. 또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 6개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 특히 반대 방향으로, 프로모터의 양쪽 측면 상에 위치된 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역에 작동적으로 연결된, 양방향성 프로모터 구성요소를 포함하고, 즉 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는, 각각이 상기 양방향성 프로모터 구성요소의 전사 제어 하에 있다. 양방향성 프로모터 구성요소는 천연적으로 이식유전자와 연관되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이식유전자"는 폴리펩티드를 포함하여, 예를 들어, 관심 단백질 (POI)을 코딩하는, 임의의 코딩 유전자를 의미한다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이식유전자는 숙주 세포에서 천연적으로 발생하지 않는 단백질, 즉 이종성 단백질을 코딩한다. 관심 단백질은 숙주 세포의 게놈으로 관심 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 하나 이상의 카피의 재조합 기술에 의한 통합 시 발현될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이식유전자의 핵산 서열은 코돈 최적화된 것이다. 용어 "코돈-최적화"는 종종 선택된 발현 시스템 (예를 들어, 재조합 효모 세포)에서 관심 단백질의 번역 효율을 개선시키는, 숙주 세포에서의 코돈 용법에 대한 코딩 서열의 디자인의 적합화를 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성 덕분에, 아미노산 서열로 뉴클레오티드 서열의 번역은 명료하지만 뉴클레오티드 서열로 아미노산 서열의 "역번역" 경우에 일부 아미노산은 하나 초과의 코돈에 의해 코딩되기 때문에 몇가지 옵션이 존재한다. 고도로 발현되는 단백질은 풍부한 tRNA 종을 사용하는 코돈에 의해서 코딩되는 경향이 있다. 밀접하게 관련된 유기체조차도 그들 게놈에서 이소억셉팅 tRNA 유전자 세트가 상이할 수 있으므로, 코돈 최적화를 위한 알고리즘은 숙주의 고도로 발현되는 유전자에서 코돈 용법 및 이소억셉팅 tRNA 유전자 세트에 대한 게놈 정보를 이용한다.
이식유전자는 다양한 관심 단백질을 코딩할 수 있다. 일 구현예에서, 각각의 이식유전자는 병원체, 또는 이의 면역원성 단편으로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드를 코딩한다. 병원체는 박테리아 병원체, 바이러스 병원체, 진균 병원체, 원충 병원체, 또는 다세포 기생충 병원체일 수 있다. 바람직하게, 병원체는 바이러스 병원체이다. 예시적인 바이러스 병원체는 가축에 영향을 미치는 바이러스 병원체, 예컨대 ASFV (아프리카 돼지 열병 바이러스), PPV (돼지 파보바이러스), PRV (돼지 로타바이러스), FMDV (구제역 바이러스), BTV (청설병 바이러스), PEDV (돼지 유행성 설사병 바이러스), PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스), PPRV (가성우역 바이러스), RVFV (리프트 밸리열 바이러스)를 포함한다. 추가의 예시적인 바이러스 병원체는 수산양식에서 발생되는 것들, 예컨대 IPNV (감염성 췌장 괴사 바이러스), HSMIV (심장 골격근 염증 바이러스), PDV (췌장 질환 바이러스), ISA (감염성 연어 빈혈 바이러스), CyHV-2 (잉어과 헤르페스바이러스 2)를 비롯하여 반려 동물에서 관련 바이러스 병원체, 예를 들어, AHSV (아프리카 말병 바이러스), WNV (웨스트 나일 바이러스), FIV (고양이 면역결핍 바이러스), EVA (말 바이러스 동맥염)를 포함한다. 특히 유리한 구현예에서, 바이러스 병원체는 다층 캡시드 및 하나 이상의 스파이크 단백질을 갖는 바이러스 병원체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성의" 또는 "면역원성"은 숙주 세포에서 면역 반응을 일으키는 병원체의 폴리펩티드, 핵산, 또는 다른 성분의 성질을 의미한다. 동물의 면역계 (항체, B 세포 및/또는 T 세포)에 의해 인식되어서 면역 반응을 유발시키는 특이적 서열을 갖는 짧은 펩티드 및/또는 특이적 형상을 갖는 분자 구조 (예를 들어, 폴리펩티드 사슬)는 에피토프라고 한다. 숙주 유기체의 면역 반응은 특이적일 수 있거나 또는 비-특이적일 수 있다. 일부 경우에, 병원체의 면역원성 폴리펩티드는 비-특이적 및 특이적 면역 반응 둘 모두를 야기한다. 바람직하게, 면역 반응은 적어도 하나의 게놈 통합된 발현 카세트에 포함된 각각의 이식유전자에 의해 코딩되는 면역원성 폴리펩티드, 또는 면역원성 폴리펩티드에 특이적인 면역 반응을 포함한다. 더 바람직하게, 면역 반응은 면역원성 폴리펩티드가 유래된 병원체에 대해 보호적이다. 면역 반응은 병원체, 또는 면역원성 폴리펩티드가 유래된 병원체에 의한 숙주 유기체 또는 환자의 감염으로 발생된 질환 또는 병태를 예방하거나 또는 약독화시킨다면 보호적이다.
일부 구현예에서, 이식유전자는 하나 초과의 병원체로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 단편을 코딩한다. 일 구현예에서, 이식유전자는 동일한 바이러스 병원체의 하나 초과의 균주로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 단편을 코딩한다. 다른 구현예에서, 이식유전자는 하나 초과의 바이러스 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 단편을 코딩한다.
천연 코딩 서열 및/또는 이의 코돈 최적화된 변이체이외에도, 이식유전자는 천연 면역원성 폴리펩티드의 변이체를 더 코딩할 수 있다. 천연 면역원성 폴리펩티드의 변이체는 면역원성 폴리펩티드의 천연 형태의 면역원성을 본질적으로 유지하거나 또는 증가시킨다. 이러한 변이체는 아미노산 (aa) 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 코딩 DNA 서열은 역번역을 통해서 디자인될 수 있고 DNA의 합성 조각으로서 또는 기존 유전자의 유전자좌의 DNA를 변형시켜서 발현 카세트에 도입된다. 일반적으로, 변형은 전사후 변형 부위 (예를 들어, 글리코실화)의 제거, 미스폴딩 또는 응집의 예방을 비롯하여, 면역원성의 증강을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 기능을 제공할 수 있다. 변이체 면역원성 폴리펩티드는 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩티드의 단편, 특히 면역원성 단편을 포함한다. 또한 단백질 가수분해적 분해에 대한 내성을 개선시키거나, 가용성을 증가시키거나, 또는 그들을 백신 조성물의 항원성 성분 또는 면역원으로서 더 적합하게 만들도록 변형시킨 면역원성 폴리펩티드를 포괄한다. 추가 변이체는 면역원성 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드의 세포내 국재화를 변화시키는 기능성 단편, 또는 에피토프 태그를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 병원체는 레오비리다에 과에 속하는 바이러스 병원체이다. 바람직하게, 바이러스 병원체는 로타바이러스이다. 예를 들어, 로타바이러스 A, B, C, D, E, F, G, H 또는 I이다. 보다 바람직하게, 바이러스 병원체는 돼지 로타바이러스, 예컨대 돼지 로타바이러스 A, B 또는 C이다. 보다 더 바람직하게, 바이러스 병원체는 돼지 로타바이러스 A (PRVA) 또는 돼지 로타바이러스 C (PRVC), 가장 바람직하게 돼지 로타바이러스 A (PRVA)이다. 다른 바람직한 구현예에서, 바이러스 병원체는 오르비바이러스, 가장 바람직하게 아프리카 말병 바이러스 (AHSV) 또는 청설병 바이러스 (BTV)이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 바이러스 병원체는 돼지 파보바이러스 (PPV)이다.
특히 바람직한 구현예에서, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 로타바이러스 A (PRVA) VP2, VP4, VP6, VP7, NSP2 및 NSP4 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게 돼지 로타바이러스 A (PRVA) VP2, VP4, VP6 및 VP7 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드를 포함한다. 특정 예에서, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 로타바이러스 A 균주 RVA/Pig-tc/ESP/OSU-C5111/2010/G5P[7]로부터 유래된다. 예를 들어, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 (PRVA VP2), SEQ ID NO: 2 (PRVA VP4), SEQ ID NO: 3 (PRVA VP6), SEQ ID NO: 4 (PRVA VP7), SEQ ID NO: 5 (PRVA NSP2) 및 SEQ ID NO: 6 (PRVA NSP4) 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 및 4 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드를 포함한다.
PRVA VP2, VP4, VP6, VP7, NSP2 및 NSP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7 (PRVA VP2, GenBank 등록 번호: KJ450843.1), SEQ ID NO: 8 (PRVA VP4, GenBank 등록 번호: KJ450845.1), SEQ ID NO: 9 (PRVA VP6, GenBank 등록 번호: KJ450847.1), SEQ ID NO: 10 (PRVA VP7, GenBank 등록 번호: KJ450849.1), SEQ ID NO: 11 (PRVA NSP2, GenBank 등록 번호: KJ450850.1), 및 SEQ ID NO: 12 (PRVA NSP4, GenBank 등록 번호: KJ450851.1)로 기재된다.
유리하게, 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. PRVA VP2, VP4, VP6, VP7, NSP2 및 NSP4를 코딩하는 바람직한 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 13 (PRVA VP2), SEQ ID NO: 14 (PRVA VP4), SEQ ID NO: 15 (PRVA VP6), SEQ ID NO: 16 (PRVA VP7), SEQ ID NO: 17 (PRVA NSP2) 및 SEQ ID NO: 18 (PRVA NSP4)로 기재된다. 임의로, 면역원성 폴리펩티드는 펩티드 태그, 예컨대 HA 태그를 포함한다. 각각이 HA 태그를 포함하는, 예시적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 19 (PRVA VP2), SEQ ID NO: 20 (PRVA VP4), SEQ ID NO: 21 (PRVA VP6), SEQ ID NO: 22 (PRVA VP7), SEQ ID NO: 23 (PRVA NSP2) 및 SEQ ID NO: 24 (PRVA NSP4)로 기재된다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 로타바이러스 A (PRVA) VP2, VP4, VP6 및 VP7로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편을 포함하고, 돼지 로타바이러스 A (PRVA) VP2, VP4, VP6 및 VP7을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 13 (PRVA VP2), SEQ ID NO: 14 (PRVA VP4), SEQ ID NO: 15 (PRVA VP6) 및 SEQ ID NO: 16 (PRVA VP7)으로 기재된다. 매우 바람직한 구현예에서, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 HA 태그를 더 포함하고, SEQ ID NO: 19 (PRVA VP2), SEQ ID NO: 20 (PRVA VP4), SEQ ID NO: 21 (PRVA VP6) 및 SEQ ID NO: 22 (PRVA VP7)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
추가의 특정 구현예에서, 병원체는 파보비리다에 과에 속하는 바이러스 병원체이다. 바람직하게, 바이러스 병원체는 프로토파보바이러스, 보다 바람직하게 돼지 파보바이러스 (PPV), 보다 더 바람직하게 유제류 프로토파보바이러스 1 (돼지 파보바이러스 1, PPV1이라고도 함) 또는 유제류 프로토파보바이러스 2 (PPV2)이다. 보다 더 바람직하게, 바이러스 병원체는 PPV1이다. 예시적인 PPV1 균주는 PPV1 균주 27a (AY684871.1), PPV1 균주 NADL-2 (L23427.1), PPV1 균주 Kresse (U44978.1), PPV1 균주143a (AY684867.1), PPV1 균주 WB631 (JQ249917.1), PPV1 균주 CC7 (MH091023) 및 PPV1 균주 Campinas (AY145500.1), 및 이들 균주 중 어느 하나의 면역원성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 균주를 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 파보바이러스 (예를 들어, PPV1) VP1, VP2, NS1 및 NS2로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편을 포함한다. 가장 바람직하게, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 파보바이러스 (예를 들어, PPV1) VP2 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 면역원성 단편을 포함한다.
PPV VP2 단백질은 바이러스-숙주 범위 및 항원성과 밀접하게 관련된다. 이것은 일반적으로 PPV 백신의 주요 면역원성 항원으로 간주되는데 중화 항체를 유발시키는데 핵심적인 B-세포 에피토프의 대부분을 함유하기 때문이다. 시험관내 발현된 PPV VP2 단백질은 캡시드를 형성하고 병원체 바이러스의 형상을 모방하도록 VLP로 자발적으로 자가-조립될 수 있다. 케이. 마르시아누스에서 생산된 PPV VLP는 높은 적정가의 IgG 항체 및 혈구응집 억제 항체를 유발시키는 것으로 관찰되었다.
또 다른 특별한 구현예에서, 병원체는 아프리카 말병 바이러스 (AHSV)이다. 예를 들어, 임의의 혈청형 AHSV-1, AHSV-2, AHSV-3, AHSV-4, AHSV-5, AHSV-6, AHSV-7, AHSV-8 또는 AHSV-9이다. 바람직한 구현예에서, AHSV 는 AHSV-4 (즉, AHSV 혈청형 4)이다. 바람직하게, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 아프리카 말병 바이러스 (AHSV) VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6, VP7, NS1, NS2, NS3, NS3a 및 NS4로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편을 포함한다. 보다 바람직하게, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 아프리카 말병 바이러스 (AHSV) VP2, VP3, VP5 및 VP7로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편을 포함한다. 보다 더 바람직하게, 면역원성 폴리펩티드는 아프리카 말병 바이러스 (AHSV) VP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편을 포함한다. 가장 바람직하게, 면역원성 폴리펩티드는 아프리카 말병 바이러스 혈청형 4 (AHSV-4) VP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 병원체는 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV), 예를 들어, ASFV 단리주 조지아/2007 (GenBank: FR682468.1)이다. 바람직하게, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV) 단백질 p12, p32, p62 및 p72로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 재조합 효모 세포는 2개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 하나의 면역원성 폴리펩티드를 코딩한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 3개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 하나의 면역원성 폴리펩티드를 코딩한다. 또한 추가의 구현예에서, 재조합 효모 세포는 4개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 하나의 면역원성 폴리펩티드를 코딩한다.
각각의 이식유전자는 바이러스 병원체 (예를 들어, PRVA)로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드 (또는 이의 면역원성 단편)를 코딩할 수 있다. 일 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드는 재조합 효모 세포 내부에서 바이러스-유사 입자 (VLP)로 조립될 수 있다. 이것은 면역원성 폴리펩티드(들)가 바이러스 병원체의 캡시드의 구조적 성분이고, 따라서 임의로 추가적인 면역원성 폴리펩티드와 조합하여, VLP의 조립에 참여할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 추가의 면역원성 폴리펩티드는 동일한 바이러스 병원체로부터 유래될 수 있거나, 또는 제1 바이러스 병원체와 밀접하게 관련된 추가 바이러스 병원체로부터 유래될 수 있다. 단순 대칭 캡시드를 갖는 바이러스 병원체의 경우에, 바이러스의 하나의 주요 구조적 단백질은 효모 세포에서 재조합적으로 발현될 때 바이러스-유사 입자 (VLP)를 형성할 수 있다.
재조합 효모 내부에서 복합체 VLP로 하나 이상의 구조적 단백질의 동종- 또는 이종-다량체화는 전체 효모 백신의 개발을 위해 매우 유리한 것으로 확인되었다. 구조적으로 단순한 바이러스 병원체 경우에, 캡시드가 단일 구조 단백질의 단일층으로 구성되는 경우, 숙주 유기체의 면역 반응은 구조적 단백질이 VLP로 조립될 때 실질적으로 증강된다는 것이 확인되었다. 그러나, 많은 바이러스의 캡시드 구조는 하나 초과의 층으로 하나 초과의 단백질로 구성되고, 이들 구조적 단백질 중 하나 초과는 개별 면역원성 성질을 보유한다.
로타바이러스는 최내층을 형성하는 VP2, 중간층을 형성하는 VP6 및 외부층의 일부로서 VP4 및 VP7로 구성된 복합 삼중층 캡시드 구조를 갖는다. 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)에서, 3개의 이들 항원, VP2, VP6 및 VP7의 공-발현은 로타바이러스-VLP (RLP)를 산출하는 것으로 확인되었다. 그러나, 항원은 하나 이상의 플라스미드(들)로부터 발현되었고, 이것은 번거로우며, 낮고 예측불가한 항원 발현을 초래한다.
효모에서 단일 면역원성 폴리펩티드로부터 VLP 형성을 위한 전제조건은 본질적으로 규칙적인 기하학적 구조로 자발적으로 회합되는 그 폴리펩티드의 능력이다. 일례는 파보바이러스의 캡시드 단백질이다. 일반적으로, 많은 바이러스 캡시드 구조는 보다 복잡하다 (예를 들어, 로타바이러스의 캡시드). 그들은 임의로 면역원성일 수 있거나 또는 면역원성이 아닐 수 있는 비-구조적 단백질과 회합된, 몇몇 상이한 구조적 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질 복합체를 형성할 수 있다. 효모에서 다-성분 VLP를 형성할 가능성은 단일 세포에서 필요한 폴리펩티드를 코딩하는 몇몇 이식유전자의 대등한 발현을 필요로 하는 것으로 확인되었다. 공-발현은 본 발명에 따른 양방향성 프로모터 구성요소 및 게놈 통합된 발현 카세트를 적용하여 상당히 촉진된다. 본 발명은 종종 고도의 면역원성 VLP 입자의 효율적인 조립을 위한 전제조건으로서, 재조합 효모 세포에서 높은 농도로 VLP 성분의 축적을 가능하게 한다.
바이러스 유사 입자 (VLP)는 일반적으로 임의로 인지질과 조합된 바이러스로부터의 하나 이상의 단백질을 함유한다. VLP는 일반적으로 비병원성, 비-복제성이고, 일반적으로 임의의 천연 바이러스 게놈을 함유하지 않는다. VLP는 복제할 수 없으므로, 그들은 백신 개발 또는 백신접종을 위해 약독화된 백신에 대한 더 안전한 대안을 제공한다. VLP는 본 발명의 재조합 효모 세포에서 생산될 수 있다. 그들의 비로솜-유사 구조 덕분에, VLP는 강력한 T 세포 및 B 세포 면역 반응을 유발할 수 있는 입체형태적 바이러스 에피토프가 존재하는 바이러스 표면 단백질의 반복적인, 고밀도 디스플레이를 함유한다. 일반 VLP의 작은 반경 (일반적으로, 20-200 nm)은 림프절로의 충분한 배출을 허용한다.
재조합 효모 세포는 적어도 하나의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 제1 및 제2 이식유전자를 포함한다. 각각의 발현 카세트는 이식유전자의 상이한 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 발현 카세트 내에서 동일하다. 다른 구현예에서, 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 발현 카세트 내에서 상이하다.
재조합 효모 세포는 하나의 게놈 통합된 발현 카세트, 또는 하나 초과의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 2개의 게놈 통합된 발현 카세트 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 게놈 통합된 발현 카세트)를 포함하고, 각각의 발현 카세트의 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 추가의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자와 상이하다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 각각의 발현 카세트의 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 추가의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자와 상이하고 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 발현 카세트 내에서 동일하다. 다른 특정 구현예에서, 각각의 발현 카세트의 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 추가의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자와 상이하고, 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 발현 카세트 내에서 상이하다.
재조합 효모 세포는 서로 동일한 이식유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 재조합 효모 세포는 서로 상이한 이식유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 재조합 효모 세포는 1개 유형의 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 2개의 상이한 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 3개의 상이한 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 4개의 상이한 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 5개의 상이한 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 6개의 상이한 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 7개의 상이한 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 8개의 상이한 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 9개의 상이한 이식유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 적어도 10개의 상이한 이식유전자를 포함한다.
특정 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 1개 카피를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 2개 카피를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 3개 카피를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 4개 카피를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 5개 카피를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 6개 카피를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 7개 카피를 포함한다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 8개 카피를 포함한다.
바람직하게, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 적어도 2개 카피를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 적어도 3개 카피를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 적어도 4개 카피를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 적어도 5개 카피를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 적어도 6개 카피를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 적어도 7개 카피를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 각각의 이식유전자의 적어도 8개 카피를 포함한다.
지금까지, 특히 진핵생물 유기체, 예컨대 효모에 대한 이종성 유전자 발현을 위한 프로모터의 선택은 단방향성 프로모터에 집중되었다. VLP의 조립 또는 병원체 바이러스의 분기된 혈청형/유전자형의 범위는 종종 하나의 (효모) 세포에서 수많은 면역원성 폴리펩티드 및 이의 변이체의 동시 발현을 요구한다. 고전적으로, 단방향성 프로모터는 이러한 적용에 사용되어 왔지만, 단방향성 프로모터는 다수유전자 공-발현 능력의 관점에서 제한적이다. 더 나아가서, 단방향성 프로모터 및 하나의 이식유전자를 포함하는 삽입부의 각각의 개별 염색체 통합은 하나의 선택 마커를 필요로 하고 ("소비하고"), 이러한 마커 유전자의 오직 제한된 개수만이 이용가능하다. 양방향성 프로모터 구성요소의 사용은 이식유전자의 쌍 당 오직 하나의 선택 마커 유전자가 필요하다.
추가적으로, 양방향성 프로모터 구성요소는 하나의 형질전환 단계에서 숙주 세포의 게놈으로 삽입된 이식유전자의 수를 두배로 늘리는 능력을 제공하여서, 올바른 재조합 사건의 검증에 대한 노력을 상당히 감소시킨다. 양방향성 프로모터 구성요소는 2개 이식유전자, 및 따라서 1개 제어 영역으로부터 2개 이종성 단백질의 조율된 발현을 허용한다. 양방향성 프로모터 사용의 주요 장점은 프로모터 활성에 대한 측접 서열의 영향에 대한 차폐 효과이다. 프로모터 구성요소의 염색질은 일반적으로 더 개방되어서 DNA 결합 단백질의 접근을 허용하는데 반해서, 전사 단위의 단백질 코딩 서열은 일반적으로 규칙적인 뉴클레오솜 어레이로 구성된다. 극도로 개방되거나 또는 폐쇄된 염색질 구조를 갖는 영역에 대한 프로모터 구성요소의 융합은 선택된 프로모터 구성요소의 활성에 대해 측접 영역의 원치 않는 영향을 가질 위험성이 있다. 진핵생물 게놈으로 무작위적으로 통합된 유전자의 발현에 대한 삽입 부위 특이적 영향의 이러한 충분히 보고된 현상은, 적어도 효모에서, 단백질 코딩 서열이 양방향성 프로모터의 양쪽 측면에 측접할 때, 감소된다. 또한, 양방향성 프로모터는 또한 발현 카세트에 대한 클로닝 노력을 감소시킨다.
게다가, 효모 게놈에서 상이한 선택 위치에 이러한 발현 카세트를 포함하는 교배 반수체 재조합 효모 세포는 다가 전체 효모 백신의 개발을 실질적으로 가속시키는데, 항원의 개수가 각 통합에 따라 2배만큼 증가하기 때문이다.
예를 들어, 2개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하는, 본 발명에 따른 반수체 재조합 효모 세포는 오직 2회의 형질전환 단계를 통해서 생성될 수 있다. 이러한 재조합 효모 세포는 최대 4개의 상이한 이식유전자, 예를 들어, 4개의 상이한 면역원성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 각각이 2개의 이식유전자를 포함하는, 2개 발현 카세트를 또한 포함하는, 추가 반수체 재조합 효모 세포와 상기 반수체 재조합 효모 세포의 교배는 최대 8개의 상이한 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는, 8개 이식유전자를 포함하는 이배체 재조합 효모 세포를 생성시키게 된다.
일반적으로, 양방향성 프로모터 구성요소는 양방향성 유전자 쌍의 5' 말단 사이의 유전자간 영역 내에 위치된다. "양방향성 유전자 쌍"은 반대 가닥 상에서 코딩되는 2개의 인접하고 분기적으로 (수렴적으로와 반대됨) 전사된 유전자를 의미한다. 천연적으로, 2개 유전자는 종종 기능적으로 관련되고, 그들의 공유된 상류 영역은 그들이 공-조절되고 따라서 공-발현되도록 허용한다. 양방향성 프로모터 구성요소는 양방향성 프로모터 구성요소의 반대 말단에 위치된 2개 이식유전자의 효율적이고 제어가능한 발현을 할 수 있게 하고, 각각의 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 한쪽 측면에 작동적으로 연결된다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터 구성요소"는 단백질 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 각 전사 단위에 대한 전사의 출발 부위(들) 및 방향을 결정하는 절편 및 조절 인자를 위한 결합 부위로서 제공되어서 프로모터에 작동적으로 연결된 유전자의 전사 속도 및 따라서 발현 수준을 제어하는데 기여하는 추가적인 구성요소로 이루어진다. 이러한 조절 인자는 세포외 또는 세포내 조건에 반응하여 프로모토 활성에 영향을 미친다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "전사 속도" 및 "전사 수준"은 상호교환적으로 사용된다. 양방향성 프로모터의 조절 서열은 GAL1-GAL10 또는 LAC4-LAC12 프로모터의 경우에서 처럼, 분기성 전사를 구동하는 2개의 코어 프로모터 구성요소에 대해 협력하여 작동될 수 있거나, 또는 2개 코어 프로모터 중 오직 하나에 대해서 단일방향으로 작용할 수 있다. 이들 상이한 유형의 조절 구성요소는 동일한 양방향성 프로모터 구성요소에서 공존할 수 있다. 본 발명에서 구축된 발현 카세트에서, 이식유전자의 단백질 코딩 영역 및 프로모터 구성요소에 대한 융합점은 번역 출발 코돈에 있거나 또는 그에 가깝다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된" (또는 "시스-작용성")은 단일 핵산 분자, 예를 들어, 발현 카세트 또는 벡터 상에서 뉴클레오티드 서열의 회합을 의미하는 것으로서, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 기능이 상기 핵산 분자 상에 존재하는 적어도 하나의 다른 뉴클레오티드 서열에 의해 영향받게 되는 방식으로의 회합이다. 예를 들어, 프로모터 구성요소는 코딩 서열의 발현을 실시할 수 있을 때, 이식유전자의 코딩 서열과 작동적으로 연결되는 것이다. 작동적으로 연결은 인-퓨전 클로닝 (In-Fusion Cloning) 같이, DNA 단편의 매끄러운 융합을 허용하는, 당업자에게 친숙한 재조합 방법 및 PCR 또는 편리한 제한 효소 부위에서 폴리뉴클레오티드의 결찰을 통해서 수행된다 (Zhu, Baogong; Cai, Guifang; Hall, Emily O.; Freeman, Gordon J. (2007), BioTechniques 43 (3), S. 354-359).
코어 진핵생물 전사 기구는 보존되어 있기 때문에, 프로모터 DNA 및 코딩 DNA는 동일하거나 또는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 게놈 통합된 발현 카세트에 포함된 양방향성 프로모터 구성요소는 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소이다. 이것은 양방향성 프로모터 구성요소가 효모에서 상동성 유전자 쌍의 전사를 제어하는 양방향성 프로모터 구성요소로서 자연적으로 또는 천연적으로 존재한다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 적어도 3개의 분기적으로 진화된 효모 속에서 진화적으로 보존된다 (Byrne, K. P. (2005), Genome Research 15 (10), p. 1456-1461; yeast gene order browser, http://ygob.ucd.ie 참조). 추가의 특정 구현예에서, 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 효모 속, 보다 특히 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 효모 종으로부터 유래된다.
유리한 구현예에서, 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 LAC4-LAC12 프로모터, GAL1-GAL10 프로모터, 및 GAP1-ADH2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 유리한 구현예에서, 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 케이. 마르시아누스 LAC4-LAC12 프로모터, 케이. 마르시아누스 GAL1-GAL10 프로모터, 및 케이. 마르시아누스 GAP1-ADH2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 유리한 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 하기 표 2에 열거된다 (Eriksson, Peter R.; Ganguli, D.; Nagarjavel, V.; Clark, David J. (2012), Genetics 191(1):7-20; Nishizawa, M; Komai, T. et al. (2008), Eukaryotic Cell 7(6), 949-957; Hu, Haiyan; Li, Xiaoman (2007), Genomics 90(4), 421-423).
표 2: 바람직한 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소.
이들 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 에스. 세레비지아에 (NCBI 등록 번호 CP020124에 따른 서열의 뉴클레오티드 278744 내지 279411), 케이. 락티스 (K. lactis) (NCBI 등록 번호 CR382126에 따른 서열의 뉴클레오티드 781010 내지 781507) 및 케이. 마르시아누스 (SEQ ID NO: 25)의 GAL1-GAL10 (P GAL1-GAL10 ) 프로모터 구성요소 (축약: GAL 프로모터), 및 케이. 락티스 (NCBI 등록 번호 CR382122에 따른 서열의 뉴클레오티드 1307691 내지 1310500) 및 케이. 마르시아누스 (SEQ ID NO: 26)의 LAC4-LAC12 (P LAC4-LAC12 ) 프로모터 구성요소 (축약: LAC 프로모터)를 포함하고, 이들은 전사 활성인자 Gal4p에 의해 조절된다. 바람직한 구현예에서, 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 SEQ ID NO: 25 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
이들 프로모터 구성요소에 의해 천연적으로 조절되는 GAL 및 LAC 유전자는 당류 갈락토스 및 락토스 (갈락토스-글루코스 이당류)의 물질대사에 필요하다. GAL 및 LAC 양방향성 프로모터 구성요소 내 결합 부위에 대한 공통 서열 (5'-CGGnnnA/TnnnCCG-3')은 보존되어 있어서, 상동성 Gal4p 변이체, 예를 들어, ScGal4p, KlGal4p (Lac9라고도 함) 및 KmGal4의 DNA-결합 도메인의 특이성이 또한 보존되어 있다는 것을 의미한다. GAL1-GAL10 및 LAC4-LAC12 프로모터 구성요소의 제어 하에서 천연 유전자 쌍의 발현은 Gal4p-조절된 양방향성 프로모터에 의한 대등하게 조절되고 갈락토스 또는 락토스 존재의 성장 배지의 보충을 통해서 유도될 수 있다. 유사하게, 이들 양방향성 프로모터 구성요소에 연결된 2개 (또는 4개) 이식유전자가 Gal4p에 의해 대등하게 조절된다.
글루코스 배지에서, LAC 및 GAL 프로모터 구성요소는 침묵화되어서, 항원 발현이 재조합 효모 세포에서 단백질-스트레스를 야기할 때 유리하다. 따라서, 재조합 효모 세포는 생물량 축적을 위해 글루코스 배지에서 먼저 배양된 다음에 락토스를 첨가하여 LAC4-LAC12 프로모터를 활성화시키고 이식유전자 발현을 유도한다. LAC 및 GAL 프로모터 구성요소의 전사 억제는 조절 단백질 Gal80p를 요구하는데, 직접 단백질-단백질 상호작용을 통해서 Gal4p의 전사 활성화 기능을 차단할 수 있다. LAC/GAL 프로모터를 조절하는 조절 네트워크는 알려진 가장 효과적인 진핵생물 전사 스위치 중 하나를 작동시킨다. 한편으로 Gal4p 제어된 유전자 발현은 작은 영양분, 갈락토스에 의해 조절될 수 있고, 다른 한편으로, 이의 조절인자 Gal80p 및 Gal4p의 비율에 의해 조절될 수 있다. 본 발명자는 이식유전자가 양방향성 LAC 및 GAL 프로모터 구성요소에 연결될 때, 다수의 이식유전자-코딩된 단백질, 예컨대 PRVA 항원의 세포내 농도가 KmGAL80 유전자의 결실 시 심지어 완전하게 유도된 수준 이상으로 실질적으로 상승될 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다.
따라서, 특히 유리한 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 LAC4-LAC12 프로모터 또는 GAL1-GAL10 프로모터로부터 선택되고, 재조합 효모 세포는 GAL80 의 결실 및/또는 파괴를 포함한다. 재조합 효모 세포가 하나 초과의 게놈 통합된 발현 카세트 (즉, 적어도 2개의 게놈 통합된 발현 카세트)를 포함하는 경우에, 각각의 카세트는 LAC4-LAC12 프로모터를 포함할 수 있거나, 각각의 카세트는 GAL1-GAL10 프로모터를 포함할 수 있거나, 또는 발현 카세트는 LAC4-LAC12 또는 GAL1-GAL10 프로모터 구성요소를 포함할 수 있고, 재조합 효모 세포는 GAL80 의 결실 및/또는 파괴를 포함한다.
또한 본 발명은 이식유전자 발현을 증가시키거나, 또는 상이한 자극을 사용하여 발현을 제어할 수 있거나 또는 높은 항상성 프로모터 활성을 제공하도록 적합화된 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소 (적합화된 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소)를 포괄한다.
특정 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소이다. 이러한 하이브리드 프로모터 구성요소는 상이한 단방향성 천연 (자연) 효모 또는 이종성 프로모터 구성요소 유래, 바람직하게 상이한 단방향성 자연 효모 프로모터 구성요소 유래의 부분으로 구성된다. 상기 단방향성 프로모터 구성요소는 천연적으로 양방향성 프로모터 구성요소의 일부일 수 있다. 양쪽 단방향성 프로모터 구성요소는 그들이 서로 방해하지 않도록 선택된다. 상이한 단방향성 프로모터 구성요소는 직접 대면 방식으로 융합되어서, 연결된 유전자의 양방향성 전사를 제어한다. 예를 들어, 에스. 세레비지아에 (및 잠재적으로 다른 효모 종)에서 사용을 위한 하이브리드 프로모터 구성요소는 이종성 조절 프로모터 모티프를 상동성 코어 프로모터와 조합하여 구성될 수 있다 (Hubmann, Georg; Thevelein, Johan M.; Nevoigt, Elke (2014), Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1152, S. 17-42). 하이브리드-조절된 양방향성 프로모터 구성요소에 의한 효율적이고 강력한 재조합 단백질 발현은 일부 효모 종에 대해 문헌에 이미 기술되어 있고, 예를 들어, P TDH3-ADH1 (Miller, C. A.; Martinat, M. A.; Hyman, L. E. (1998), Nucleic acids research 26 (15), S. 3577-3583); P GAL1 또는 GAL10-GPD (Li, Aimin; Liu, Zengshan; Li, Qianxue; Yu, Lu; Wang, Dacheng; Deng, Xuming (2008), FEMS yeast research 8 (1), S. 6-9); P TEF1-PGK1 (Partow, Siavash; Siewers, Verena; Bjorn, Sara; Nielsen, Jens; Maury, Jerome (2010), Yeast (Chichester, England) 27 (11), S. 955-964)이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 TDH3/ADH1 프로모터, GAL1/GAL10-GPD 프로모터, 및 TEF1/PGK1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 TDH3/ADH1 프로모터, 및 GAL1/GAL10-GPD 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
케이. 마르시아누스에서, LAC4-LAC12 프로모터의 서열은 균주 간에 상이할 수 있다. 따라서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 상이한 효모 균주, 특히 상이한 케이. 마르시아누스 균주로부터의 단방향성 프로모터 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 SEQ ID NO: 27로 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 특정 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 케이. 마르시아누스 균주 DSM5422의 LAC4-LAC12 프로모터의 LAC12 근위부를 케이. 마르시아누스 균주 NBRC1777의 LAC4 근위부와 융합시켜서 수득되었다.
추가의 특정 구현예에서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 양방향성 GAP1-ADH2 (예를 들어, KmGAP1-ADH2, SEQ ID NO: 28) 프로모터 (P GAP1-ADH2 )로서, 재조합 효모 세포가 정상기로 들어갈때 종료되지 않는다는 장점을 갖는다. 이러한 성질은 재조합 효모 세포에서 하나 이상의 이식유전자-발현된 폴리펩티드, 예컨대 면역원성 폴리펩티드의 축적을 위해 매우 유리하다. GAP1-ADH2 양방향성 프로모터 구성요소는 배양 배지에서 이용가능한 질소원에 의해 조절된다. 가장 강력한 유도 효과는 질소원으로서 프롤린 경우에 관찰되었다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 SEQ ID NO: 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
추가 구현예에서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소에 융합 시 유지되는 상이한 전사 강도 및/또는 조절의 2개 단방향성 프로모터 구성요소로 구성된다. 따라서, 제1 및 제2 이식유전자의 분기성 전사 속도는 배양 조건에 의존하여서 제1 또는 제2 이식유전자 또는 양쪽 이식유전자에 대해서 고/저 발현 수준을 제공하게 개별적으로 조절될 수 있다.
이식유전자가 재조합 효모 세포에 독성인 유전자 생산물을 코딩하는 경우에, 이식유전자-코딩되는 폴리펩티드의 발현 및 세포 성장을 분리시키는 것이 유리하다. 예를 들어, 독성 유전자 생산물을 코딩하는 이식유전자는 유도성/억제성 프로모터 구성요소의 제어 하에 위치되어서 초기 발효 단계에서 억제된 채로 유지되고, 생물량이 축적된 이후에 후기 단계에 탈억제되어서 독성 이식유전자 생산물에 의한 성장 억제와 무관하다.
따라서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 하나의 유도성 또는 억제성 단방향성 프로모터 구성요소 및 하나의 항상성 단방향성 프로모터 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소의 유도성 또는 억제성 부분은 GAL1, GAL10, GAL80, LAC4, LAC12, ADH2, CUP1, DAN1 및 MET3/MET17 프로모터 구성요소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소의 항상성 부분은 GAP1, GPD1, TEF1, PGK1, ACT1, HXT7, TDH2/TDH3, ADH1, TPI1 및 PYK1 프로모터 구성요소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 또한 기지의 프로모터 구성요소로부터의 조합된 서열 모티프를 포함하는 합성 프로모터 구성요소일 수 있고, 스페이서 영역은 무작위 서열로 채워진다 (Hubmann, Georg; Thevelein, Johan M.; Nevoigt, Elke (2014), Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1152, S. 17-42).
프로모터 활성은 전형적으로 이의 전사 효율, 또는 발현 수준을 통해서 평가된다. 리포터 유전자 어세이가 사용될 수 있고, 프로모터는 쉽게 정량할 수 있는 리포터 단백질 (예를 들어, β-갈락토시다제 또는 녹색 형광 단백질 (GFP))을 코딩하는 DNA 서열 (이식유전자)에 융합된다. β-갈락토시다제의 경우에 효소 활성의 형태로 또는 형광성 단백질, 예컨대 GFP의 경우에 형광 강도로 측정되는, 리포터 단백질 수준은 프로모터 활성에 대한 판독치로서 제공된다. 보다 직접적으로, 프로모터 활성은 예를 들어, 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR)을 통해서, 기능적으로 연결된 이식유전자의 (정상-상태) RNA 수준 (발현 수준)의 정량을 통해 평가될 수 있다. 시간 단위 당 전사 개시 사건의 수는 일반적으로 측정할 수 없으므로, 프로모터 강도는 일반적으로 긴 반감기를 갖는 소정 표준 RNA에 대한 RNA 수준으로서 표시된다. 발현 수준 분석은 예를 들어, 마이크로어레이, 노던 블롯, RNA 시퀀싱 또는 qRT-PCR을 적용하여, 정성적일 수 있거나, 정량적일 수 있거나, 또는 반-정량적일 수 있다. 소정 이식유전자의 유전자 발현을 정량하기 위해서, 일반적으로 단백질 수준 (예를 들어, 면역원성 폴리펩티드의 수준)이 과정 최적화를 위한 관련 매개변수이기 때문에, mRNA 수준 대신에, 일반적으로 단백질 생산물의 수준을 (예를 들어, 웨스턴 블롯을 통해) 결정하는 것으로 충분하다.
양방향성 프로모터 구성요소는 이것이 작동적으로 연결된 제1 및 제2 이식유전자의 유사하거나, 또는 본질적으로 동일한 발현 수준을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 양방향성 프로모터 구성요소는 이것이 작동적으로 연결된 제1 및 제2 이식유전자의 상이한 발현 수준을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자의 유사한 발현 수준을 가능하게 한다. 다른 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자의 상이한 발현 수준을 가능하게 한다.
본 명세서에서 사용되는, "유사한 발현 수준"은 제1 이식유전자의 발현 수준이 제2 이식유전자의 발현 수준으로부터 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하까지, 바람직하게 20% 이하까지 벗어난다는 것을 의미한다. "상이한 발현 수준"은 제1 이식유전자의 발현 수준이 제2 이식유전자의 발현 수준으로부터, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%, 바람직하게 적어도 50% 까지 벗어난다는 것을 의미한다. 발현 수준은 qRT-PCR, 웨스턴 블롯 또는 리포터 유전자 어세이를 통해서 판독치로서, 바람직하게 리포터 단백질을 사용하는 qRT-PCR 또는 리포터 유전자 어세이를 통해서 결정될 수 있다. 특히, 클루이베로마이세스 종에서, 내생성 β-갈락토시다제 유전자 LAC4 는 리포터 단백질로서 β-갈락토시다제의 사용을 방해한다.
프로모터 구성요소는 일반적으로 몇개 기능성 클래스로서 분류된다: 항상성 또는 조절성, 즉 유도성 또는 억제성 프로모터 구성요소. 억제성 프로모터 구성요소는 억제인자의 부재에 반응하여 전사 수준을 증가시키고, 유도성 프로모터는 활성인자의 부재 하에서 또는 배양 조건의 일부 변화에 반응하여 전사의 수준을 감소시켜서, 각각의 활성인자를 불활성이게 만든다.
따라서, 본 발명에 따른 양방향성 프로모터 구성요소는 이것이 작동적으로 연결된 제1 및 제2 이식유전자의 항상성 또는 조절된 발현을 가능하게 할 수 있다. 조절된 발현은 유도성 또는 억제성 (예를 들어, 자극에 반응), 바람직하게 유도성 (예를 들어, 유도 인자의 첨가에 의함)인 발현을 의미한다. 양방향성 프로모터 구성요소의 한 방향 및 나머지 방향으로 전사를 조절하는 서열은 동일할 수 있거나, 또는 그들은 예를 들어, 제1 및 제2 이식유전자의 상이한 전사 또는 발현 수준 및 특별한 전사 또는 발현 비율을 수득하기 위해서, 예컨대 상이한 전사 활성 또는 강도의 프로모터 서열같이, 서열, 구조 및 기능이 상이할 수 있다. 또한, 양방향성 프로모터 구성요소의 한 방향 및 나머지 방향으로 전사를 조절하는 서열은 특이적 조절 프로파일로 차등적으로 조절될 수 있다.
이식유전자에 의해 코딩되는, 독성 유전자 생산물의 경우에, 초기에 이식유전자가 조절된 (예를 들어, 유도성) 프로모터의 제어 하에서 억제된 채로 유지되게 하여서 생물량 축적을 허용하고 발효의 종료시에만 프로모터를 활성화시키거나 또는 탈억제하여서 유전자 발현을 유도할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 세포 성장 및 증식에 필요한 유전자는 일반적으로 발효 시작부터 활성적인 항상성 프로모터의 제어 하에 있다.
따라서, 일 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 또는 제2 이식유전자의 유도성 또는 억제성 발현을 가능하게 한다. 추가 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 및 제2 이식유전자의 유도성 또는 억제성 발현을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 및 제2 이식유전자의 유도성 또는 억제성 발현을 가능하게 하고, 제1 및 제2 이식유전자에 대한 프로모터 활성의 유도인자 또는 억제인자는 상이하고, 예를 들어, 상이한 탄소원 (예컨대, 글루코스 대신 갈락토스), 또는 상이한 특별한 화학적 물질 (예를 들어, Cu2+ 이온의 첨가), 항생제 또는 환경 인자 (예컨대 저온/고온 또는 빛 강도)에 노출에 의한다. 다른 특정 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 및 제2 이식유전자의 유도성 또는 억제성 발현을 가능하게 하고, 제1 및 제2 이식유전자에 대한 프로모터 활성의 유도인자 또는 억제인자는 동일하다.
다른 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 또는 제2 이식유전자의 항상성 발현을 가능하게 한다. 추가 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 및 제2 이식유전자의 항상성 발현을 가능하게 한다. 또 다른 구현예에서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 이식유전자의 유도성 또는 억제성 발현 및 제2 이식유전자의 항상성 발현, 또는 그 반대도 가능하다.
재조합 효모 세포의 일부 구현예는 하나 초과 (즉, 적어도 2개) 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다. 이들 구현예에서, 각각의 게놈 통합된 발현 카세트는 동일한 양방향성 프로모터 구성요소를 포함할 수 있거나, 또는 각각의 게놈 통합된 발현 카세트는 본 명세서에 기술된 바와 같은, 상이한 양방향성 프로모터 구성요소를 포함할 수 있다. 대안적으로, 게놈 통합된 발현 카세트의 일부는 동일한 양방향성 프로모터 구성요소를 포함할 수 있고, 일부는 상이한 양방향성 프로모터 구성요소를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 효모 세포는 하나 초과의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 각각의 발현 카세트의 양방향성 프로모터 구성요소는 각각의 추가 발현 카세트의 양방향성 프로모터 구성요소와 상이하다. 이것은 각각의 코딩되는 이식유전자, 또는 이식유전자의 쌍에 대한 발현 수준의 개별 조절을 가능하게 한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 각각의 발현 카세트의 양방향성 프로모터 구성요소는 각각의 추가 발현 카세트의 양방향성 프로모터 구성요소와 동일하다. 대안적으로, 각각의 발현 카세트의 양방향성 프로모터 구성요소에 대한 프로모터 활성의 유도인자 또는 억제인자는 각각의 추가 발현 카세트의 양방향성 프로모터 구성요소에 대한 유도인자 또는 억제인자와 비교하여 동일하다 (예를 들어, 모든 양방향성 프로모터 구성요소는 갈락토스 또는 락토스의 부재 하에서 활성인자 Gal4p의 Gal80-매개 억제를 통해 조절됨). 이들 경우에, 숙주 세포에서, 이종이량체 또는 다량체 단백질 복합체, 예컨대 VLP의 다수 성분의 조율되거나, 또는 협동적인 공-발현은 이러한 이종이량체 또는 다량체 단백질 복합체, 예를 들어 VLP의 효율적인 발현 및 조립을 가능하게 한다. 이것은 유도 신호, 예를 들어, 배지에 갈락토스 첨가에 대한 반응일 수 있다.
재조합 효모 세포는 효모 세포 게놈으로 안정하게 통합되는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 효모 세포의 게놈 내에 다양한 염색체 유전자좌에서 통합될 수 있다. 발현 카세트의 게놈 통합을 위해 특히 유용한 염색체 유전자좌는 표 3에 열거된다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 발현 카세트는 재조합 효모 세포를 영양요구성으로 만드는 물질대사 효소를 코딩하는 유전자의 파괴를 야기하도록 선택된 염색체 유전자좌에 게놈 통합된다. 이것은 (물질대사 효소를 코딩하는 상주 유전자의 복원, 또는 신규 자가영양성 마커 유전자의 통합 형태로) 자가영양성의 복원을 위한 선택을 통해서 발현 카세트의 성공적인 통합을 위한 선택을 가능하게 한다.
표 2: 발현 카세트의 게놈 통합을 위한 예시적인 효모 염색체 유전자좌.
발현 카세트의 게놈 통합을 위해 바람직한 염색체 유전자좌의 다른 그룹은 탄소원 또는 질소원 물질대사에 관여되는 효소를 코딩하는 유전자이다. 예는 표 4에 열거된다. 이들 염색체 유전자좌의 파괴 또는 결실은 탄소 또는 질소의 단독 공급원으로서 특별한 대사산물을 이용하는 이의 능력을 효모 세포에서 박탈한다 (표 4 참조).
표 4: 발현 카세트의 게놈 통합을 위한 추가의 예시적인 효모 염색체 유전자좌.
따라서, 일 구현예에서, 각각의 발현 카세트는 ADE1, ADE2, ADE8, ECM31, HIS2, HIS3, HIS5, LEU1, LEU2, LYS2, LYS5, MET5, MET17, TRP1, TRP3, TRP4, TRP5, TYR1, URA3, URA5, FCY1, GAP1, LAC4 + LAC12, XYL1 및 XYL2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다. 바람직하게, 각각의 발현 카세트는 TYR1, ADE2, LEU2, LAC4-LAC12, MET5, HIS3, TRP1, XYL2, 및 LYS5로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게 ADE2, LEU2, MET5 및 HIS3 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다.
재조합 효모 세포가 하나 초과의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하는 경우에, 발현 카세트는 연결되지 않은 것이 바람직한데, 다시 말해서 그들은 바람직하게 상이한 염색체에 위치된 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다. 이것은 유사분열 시에 독립적인 분리를 보장하게 되어서 동일 세포에서 마커의 상이한 조합 (및 상이한 발현 카세트의 결과로서)을 생성시키는 쉬운 방식을 제공한다. 따라서, 적어도 2개 게놈 통합된 발현 카세트가 상이한 염색체에 위치된 염색체 유전자좌에서 각각 게놈 통합되는 것이 특히 바람직하고, 염색체 유전자좌는 ADE1, ECM31, HIS2, MET17, TYR1, URA3, URA5, GAP1, XYL1 (염색체 1); ADE2, LEU2, TRP4, TRP5 (염색체 2); ADE8, TRP3, LAC4-LAC12 (염색체 3); MET5 (염색체 4); HIS3, LEU1 (염색체 5); TRP1 (염색체 6), XYL2 (염색체 7) 및 HIS5, LYS2, LYS5, FCY1 (염색체 8)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 발현 카세트는 TYR1; ADE2, LEU2; LAC4-LAC12; MET5; HIS3; TRP1, XYL2 및 LYS5 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게 ADE2, LEU2, MET5 및 HIS3 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다.
게놈 통합된 발현 카세트는 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 일반적으로, 용어 "선택 마커" (또는 선택 마커 유전자)는 예를 들어, 형질전환 사건을 통해서, 그 유전자 (의 일부)를 받은 세포에게 선택가능한 성장 표현형 (물리적 성장 특징)을 부여하는 유전자 또는 유전자의 일부 (단편)를 의미한다. 선택 마커는 일반적으로 마커를 받은 세포에 대해서 선택가능한 성장 표현형을 부여하는 양성 선택가능 마커 유전자 또는 선택 마커를 포함하지 않는 (예를 들어, 선택 마커를 상실한) 세포만이 성장하게 하는, 즉 콜로니를 형성하게 하는 음성 선택가능 (역-선택가능) 마커를 포함한, 몇개 유형으로 분류된다. 음성 선택가능 마커의 경우에, 선택은 마커 함유 숙주 세포의 성장을 억제하는 성장 배지를 요구한다. 예를 들어, 뉴클레오염기 우라실에 대한 생합성 경로는 약물 5-플루오로-오로트산 (FOA)에 의해 억제된다. 이러한 플루오르화 오로트산 (오로트산은 우라실의 생합성 전구체임)은 URA3 유전자에 의해 코딩되는 효소에 의해서 독성 플루오로-우라실로 전환된다. Ura3 돌연변이체는 이 효소가 결여되고, 그러므로 5-FOA에 내성이고, 약물이 투여된 플레이트 상에서 선택될 수 있다. 온전한 URA3 유전자는 역-선택가능 또는 음성 선택 마커에 대한 드문 예 중 하나이다.
우세한 선택 마커, 예컨대 항생제 또는 다른 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자는 그들이 이배체 세포를 포함하여, 약물에 민감한 임의의 유전적 배경에서 선택에 사용될 수 있다는 장점을 갖는다. 선택 마커로서 항생제 내성 유전자를 포함하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 발현 카세트의 형질전환은 항생제를 포함하는 배지 상에서 또는 그 안에서 검출가능한 콜로니를 형성하는 이러한 세포의 능력을 통해서 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 재조합 효모 세포의 확인을 가능하게 한다. 콜로니 형성은 게놈 통합을 통해 획득되는, 우세한 선택 마커의 안정한 유전을 필요로 한다. 숙주 세포에서 자율 복제를 통한 마커의 유전을 가능하게 하는 벡터의 부재 하에서, 콜로니 형성은 발현 카세트의 게놈 통합에 대한 안전한 지시자이다.
본 명세서에 기술된 일부 선택 마커는 달리 영양요구성 효모 세포가 성장할 수 있게 하는, 즉 선택 배지 상에 콜로니를 형성시킬 수 있는 물질대사 선택 마커이다. 선택 배지는 세포에 필수적인 특별한 대사산물(들), 예를 들어, 우라실이 결여된다. 예를 들어, URA3 마커 유전자는 URA3-코딩된 효소의 활성을 통해서 필수 대사산물을 제공하여서 우라실 영양요구성을 보완할 수 있다. 대안적으로, 선택 배지는 선택에 특별한 영양분을 공급하고, 콜로니 형성은 상기 영양분이 성장에 필수적인 성분을 제공하도록 물질대사되는 것을 필요로 하고, 특별한 영양분의 물질대사는 선택 마커의 유전자 생산물에 의존한다. 예를 들어, 락토스는 β-갈락토시드를 개별 단당류로 가수분해하는데 필요한 효소, β-갈락토시다제를 선택하기 위한 특별한 대사산물로서 사용될 수 있다. 물질대사 선택 마커를 사용한 선택은 물질대사 효소를 코딩하는 유전자 (발현 카세트에 포함된 선택 마커), 또는 이의 단편의 게놈 통합을 기반으로 할 수 있고, 상기 물질대사 효소 (또는 기능성 동등물)를 코딩하는 개별 천연 유전자는 발현 카세트의 게놈 통합 이전에 결실, 돌연변이, 또는 파괴된 것이다. 발현 카세트의 상기 게놈 통합은 물질대사 효소를 코딩하는 유전자를 천연적으로 포함하는 염색체 유전자좌, 또는 상이한 염색체 유전자좌에서 일어날 수 있다. 달리 말해서, 발현 카세트의 게놈 통합은 상기 유전자의 천연 염색체 유전자좌에서 물질대사 효소를 코딩하는 유전자의 재구성을 일으킬 수 있거나, 또는 대안적인 유전자좌에서 물질대사 효소를 코딩하는 유전자의 도입을 일으킬 수 있고, 천연 유전자는 비기능성이 되었다. 천연 염색체 유전자좌에서 게놈 통합의 경우에, 물질대사 효소를 코딩하는 천연 유전자는 오직 부분적으로 결실될 수 있고 물질대사 선택 마커는 물질대사 효소를 코딩하는 상기 유전자의 결실된 단편을 포함할 수 있어서, 발현 카세트의 게놈 통합 시에 상기 유전자를 재구성할 수 있다.
적어도 하나의 선택 마커는 양방향성 프로모터 구성요소, 이식유전자 또는 전사 종결자의 기능을 방해하지 않도록 발현 카세트 내에 상주한다.
표 3 및 4에서 잠재적인 염색체 표적 유전자좌로서 열거된 유전자 (또는 이의 단편)은 영양요구성 선택 마커로서 제공될 수 있다. 물질대사 효소를 코딩하는 이들 예시적인 표적 유전자좌 중 하나에서 발현 카세트의 도입 이전에, 개별 유전자좌는 돌연변이되거나, 파괴되거나, 또는 결실되어서, 숙주 세포가 영양요구성이 되고, 따라서 양성 선택 마커로서 물질대사 효소 (또는 이의 단편)를 코딩하는 유전자를 사용하여 선택가능하게 된다.
추가의 예시적인 선택 마커는 표 5에 열거된다.
표 5: 예시적인 선택 마커 유전자.
따라서, 일 구현예에서, 선택 마커는 내성 마커 또는 물질대사 선택 마커, 바람직하게 물질대사 선택 마커이다. 특히 바람직한 구현예에서, 선택 마커는 ADE1, ADE2, ADE8, ECM31, HIS2, HIS3, HIS5 LEU1, LEU2, LYS2, LYS5, MET5, MET17, TRP1, TRP3, TRP4, TRP5, TYR1, URA3, URA5, FCY1, GAP1, LAC4 + LAC12, XYL1, XYL2, kanMX, hphMX6, natMX6, bleMX6, cat, dehH1, dsdA, mdr3, aroA, pat, R dhfr, CAN1 및 CUP1 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 유리한 구현예에서, 마커 유전자는 ADE2, MET5, HIS3, LEU2, URA3, kanMX, hphMX6 및 natMX6 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
유리하게, 게놈 통합된 발현 카세트의 선택 마커는 부위-특이적 재조합 서열의 쌍 사이에, 임의로 loxP 부위의 쌍 사이에 커플링되고 샌드위치된다. 쌍 형성된 부위-특이적 재조합 서열 사이에 개재된 선택 마커는 게놈 통합된 발현 카세트로부터 제거가능하도록 만들어 진다. 이들 부위-특이적 재조합 서열은 작용하게 되는 상응하는 효소 또는 조절 구성요소에 의해 인식가능한 특별한 폴리뉴클레오티드 서열이다. 부위-특이적 재조합 서열은 리콤비나제-매개 마커 회수를 수행하도록 Cre 리콤비나제 또는 다른 동등물과 반응할 수 있고 인식가능한 loxP 부위일 수 있다. Cre/loxP 재조합 시스템은 본래 에스. 세레비지아에에 대해 개발되었고 이후에 케이. 마르시아누스에 적합화되었다. 플라스미드로부터 Cre 리콤비나제의 발현은 2개 loxP 부위 사이의 DNA 서열, 예를 들어 선택 마커 유전자의 Cre 촉매된 절단을 일으킨다. 따라서, 마커는 이의 본래 부위가 이제 재조합 반응에 의해 남겨진 loxP 서열로 표시되지만 여러번 사용될 수 있다.
추가의 특별한 마커, 주로 약물 내성 마커 (kanMX, hphMX6, natMX6) 경우에, 유사한 재활용이 가능하다 (Goldstein, A. L.; McCusker, J. H. (1999), Yeast (Chichester, England) 15 (14), S. 1541-1553). URA3 영양요구성 마커는 녹아웃 카세트에 URA3 마커를 함유하는 균주에서 FOA 내성에 대한 선택을 통해서 재활용될 수 있다.
추가의 바람직한 구현예에서, 특별한 역-선택 마커는 또한 마커 회수를 촉진하기 위해서 쌍형성된 부위-특이적 재조합 서열 사이에 포함될 수 있다. 제빵 효모의 미토콘드리아 유래 I-Sce1의 메가뉴클레아제 인식 부위, 클라미도모나스 레인하르드티 (Chlamydomonas reinhardtii)의 엽록체 유래 I-CreI, 및 고세균 데술푸르코커스 모빌리스 (Desulfurcoccus mobilis) 유래 I-DmoI는 특별한 뉴클레아제에 의해 매개되는 부위-특이적 재조합을 통해서 쌍형성된 부위 사이에 위치된 DNA 구성요소의 제거를 통해서 마커 회수 및 역 선택을 가능하게 하여서 흥미로울 것이다. 대안적으로, 선택 마커에서 표적화하는 가이드 RNA를 사용하는 CRISPR/Cas9-매개 역-선택은 또한 완전한 마커 회수를 가능하게 하므로 흥미로울 수 있다.
게놈 통합된 발현 카세트는 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자를 포함하고, 상기 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자의 바로 하류에 위치되고, 상기 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자의 바로 하류에 위치되며; 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자에 작동적으로 연결되고, 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자에 작동적으로 연결된다. 전사 종결자 또는 종결자 서열은 펩티드 또는 단백질 번역을 위한 주형으로부터 전사의 종료 및 그로부터 전사된 mRNA의 방출을 의미하고 영향을 미친다. 특별한 구현예에서, 제1 및 제2 전사 종결자는 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii) 유래 TEF1 종결자 (SEQ ID NO: 29), 케이. 마르시아누스 유래 HIS5 종결자 (SEQ ID NO: 30), 케이. 마르시아누스 유래 CPS1 종결자 (SEQ ID NO: 31), 에스. 세레비지아에 유래 CYC1 종결자 (SEQ ID NO: 32) 및 에스. 세레비지아에 유래 ADH1 종결자 (SEQ ID NO: 33)로 이루어진 군으로부터 각각 선택된다. 특히 유리한 구현예에서, 제1 및 제2 전사 종결자 각각의 에이. 고시피 유래 TEF1 종결자이다.
게놈 통합된 발현 카세트는 전사 및 번역 조절 서열, 예컨대 인핸서 구성요소를 더 포함할 수 있다. 인핸서 구성요소는 코딩 서열에 작동적으로 연결될 때, 프로모터 활성을 증가시킬 수 있는, 조절 인자에 대한 결합 부위로서 제공된다. 인핸서 구성요소는 전사 속도를 증가시키도록 프로모터 구성요소에 작용할 수 있는 활성인자에 대한 결합 부위(들)로서 제공되는, 일반적으로 약 10 내지 300 bp인, DNA의 시스-작용성 구성요소이다. 전사 인핸서는 일반적으로 배향 및 위치 독립적이고, 인트론 내를 비롯하여, 코딩 서열 그 자체 내에서도, 전사 단위에 대해서 5' 및 3'에서 발견된다.
진핵생물 숙주 세포 (예컨대 효모 세포)에서 사용을 위한 발현 카세트는 일반적으로 전사의 종료 및 mRNA의 안정화에 필요한 추가 서열을 함유한다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵생물 또는 바이러스 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 비번역 영역 내에서 번역 종결 코돈에 대해 3'에 위치되고, mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 절편을 함유한다.
본 발명에 따른 재조합 효모 세포는 사카로마이세타세아에 (Saccharomycetaceae) 과의 구성원일 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 효모 세포는 안도지마 (Andozyma), 아스코보트리오지마 (Ascobotryozyma), 시테로마이세스 (Citeromyces), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 덱케라 (Dekkera), 에레모테시움 (Eremothecium), 이사트켄키아 (lssatchenkia), 카자크스타니아 (Kazachstania), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 코다마에아 (Kodamaea), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 파키솔렌 (Pachysolen), 피키아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 사투르니스포라 (Saturnispora), 테트라피시스포라 (Tetrapisispora), 토룰라스포라 (Torulaspora), 윌리옵시스 (Williopsis) 및 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속으로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 클루이베로마이세스 효모 속으로부터 유래된다. 보다 바람직하게, 재조합 효모 세포는 클루이베로마이세스 마르시아누스 효모 종으로부터 유래된다. 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주 NBRC1777로부터 유래된다.
에스. 세레비지아에의 유전적 레파토리는 높은 글루코스, 프룩토스, 또는 수크로스에 대한 적응 및 에탄올 발효에 대한 진화의 전문화를 밝혀주는데 반해서 클루이베로마이세스 효모 속으로부터 유래되는 재조합 효모 세포는 락토스같이, 저렴한 것을 포함하여 더 넓은 범위의 탄소원을 물질대사할 수 있다.
일 구현예에서, 재조합 효모 세포는 크랩트리-음성 효모 종으로부터 유래되고, 바람직하게, 재조합 효모 세포는 크랩트리-음성이다. 크랩트리-양성효모, 예컨대 에스. 세레비지아에는 호흡이 호기성 조건 하에서도 글루코스-억제되고, 에탄올이 ATP (아데노신 트리포스페이트)의 소비로 생산되기 때문에 더 많은 글루코스를 요구한다. 따라서, 크랩트리-음성 효모는 공급된 탄소원에 비해서 생물량 기반의 더 나은 수율을 제공한다. 클루이베로마이세스 속에 속하는 효모는 크랩트리-음성 효모로서 분류되고, 이것은 산업적 발효 공정에서 선호된다. 특히 케이. 마르시아누스는 강력하게 크랩트리-음성으로 관찰되었는데, 크랩트리-음성 특징은 케이. 락티스에 대해 관찰될 수 었는 것에 비해서 더 뚜렷하다.
케이. 마르시아누스는 많은 대안적인 효모 종과 비교하여, 상승된 온도에 대해 더 큰 내성을 보유하는 것으로 관찰되었고, 이것은 재조합 단백질 발현의 상황에서, 특히 재조합 효모 세포의 대규모 생산 상황에서, 유리하다. 게다가, 케이. 마르시아누스는 모든 진핵생물 세포 유형 또는 유기체의 최고로 보고된 세포 분열 속도를 보유하며, 예를 들어, 대규모 생산 환경에서, 케이. 마르시아누스 효모 배양의 보다 빠른 성장으로 번역된다.
일반적으로, 효모의 세포는 반수체, 이배체 또는 사배체 형태로 존재한다. 이배체 세포는 적절한 조건 하에서, 이배체 형태로 무한한 세대수 동안 증식될 수 있다. 유성 주기를 갖는 종에서, 이배체 세포는 또한 감수분열을 겪을 수 있고 포자 형성되어서 반수체 세포를 형성할 수 있다.
본 발명의 재조합 효모 세포는 반수체, 이배체, 또는 사배체일 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 효모 세포는 이배체 또는 사배체이다. 본 발명자는 이배체 또는 사배체 효모 세포가 견고성, 높은 성장률 및 단백질 생합성을 제공하고, 따라서 제1 및 제2 이식유전자에 의해 코딩되는 유전자 생산물의 고도로 효율적인 발현을 가능하게 한다는 점에서 특히 유리하다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "반수체"는 이의 정상 게놈 (염색체) 상보체의 각 염색체의 단일 카피를 갖는 세포를 의미한다. 용어 "이배체"는 이의 정상 게놈 상보체의 각 염색체의 2개 카피를 갖는 세포를 의미한다. 용어 "대립유전자"는 유전자의 특정 변이체를 의미한다. 일반적으로, 2개 부모 균주는 부모 대립유전자 (모계 대 부계-유래 또는 MATa-유래 대 MATα-유래) 간에 DNA 서열의 차이를 통해서 구별될 수 있다. 이배체는 2개의 교배-적격한 반수체 세포 간에 교배 과정을 통해 형성될 수 있다. 효모의 "교배"는 2개 반수체 효모 세포가 자연적으로 융합하여서 단일 핵을 갖는 하나의 이배체 효모 세포를 형성하는 유전적으로 제어된 과정을 설명한다. 2개 이배체 효모 세포가 자연적으로 융합될 때, 그들은 단일 핵을 갖는 하나의 사배체 효모 세포를 형성할 수 있다. 효모 세포는 교배 또는 스페로플라스트 융합을 통해서 추가 효모 세포와 융합할 수 있으면 "교배 적격"이다. 반수체 효모 세포의 교배는 이배체 효모 세포를 생성하고 순차적 교배는 영양요구성 이배체의 추가 교배를 통해서 사배체 균주를 추가로 생성시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 재조합 효모 세포는 반수체이다. 바람직하게, 반수체 재조합 효모 세포는 헤테로탈릭이고, 다시 말해서, 안정한 교배형을 갖는다. 다른 말로, 이의 교배형을 전환시킬 수 없다. 더 바람직하게, 효모 세포는 MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 또는 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함한다. 효모 세포는 또한 바람직하게 MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 및 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함할 수도 있다. 특정 구현예에서, 효모 세포는 KAT1 유전자 또는 ALPHA3 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 효모 세포는 KAT1 유전자 및 ALPHA3 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함한다. KAT1 유전자 또는 ALPHA3 의 결실 및/또는 돌연변이는 재조합 효모 세포를 헤테로탈릭이 되게 한다. 유리하게, 반수체 재조합 효모 세포는 교배 적격하다. 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 반수체이고, MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 또는 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자 (예를 들어, KAT1 유전자 또는 ALPHA3 유전자)를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함하고, 교배 적격하다. 추가의 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 반수체이고, MATa에서 MATα로 교배형 전환 및 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자 (예를 들어, KAT1 유전자 및 ALPHA3 유전자)를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함하고, 교배 적격하다.
특히 유리한 구현예에서, 효모 세포는 MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 또는 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함하고, 결실 및/또는 돌연변이를 포함하는 유전자는 추가 선택 마커, 바람직하게 내성 마커와 연결된다. 다른 특히 유리한 구현예에서, 효모 세포는 MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 및 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함하고, 결실 및/또는 돌연변이를 포함하는 유전자는 각각이 추가 선택 마커, 바람직하게 내성 마커와 연결된다.
매우 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 반수체이고, MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 또는 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자 (예를 들어, KAT1 유전자 또는 ALPHA3 유전자)를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함하고, 교배 적격하며, 결실 및/또는 돌연변이를 포함하는 유전자는 추가 선택 마커, 바람직하게 내성 마커와 연결된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 재조합 효모 세포는 반수체이고, MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 및 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자 (예를 들어, KAT1 유전자 및 ALPHA3 유전자)를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함하고, 교배 적격하고, 결실 및/또는 돌연변이를 포함하는 유전자는 각각이 추가 선택 마커, 바람직하게 내성 마커와 연결된다.
교배형 전환에 필요한 유전자에 연결된 (즉, 유전적으로 연결된, 즉 동일한 염색체에 위치된 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된) 선택 마커는 교배형 전환에 필요한 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 보유하는 이배체 세포의 반수체 자손의 선택을 허용한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같이 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득된 이배체 재조합 효모 세포에 관한 것이다. 일반적으로, 이배체 효모 세포는 교배 제1 및 제2 반수체 효모 세포를 교배하여 생성될 수 있고, 제1 및 제2 효모 세포는 상이한 교배형이며, 다시 말해, 제1 반수체 효모 세포는 교배형 MATa 이고, 제2 반수체 효모 세포는 교배형 MATα이거나, 또는 그 반대이다.
유리하게, 2개 헤테로탈릭 반수체 효모 세포의 교배를 통해서 발생된 이배체 재조합 효모 세포는 부분적으로 또는 오로지, 감수분열 및 포자형성을 통해서 헤테로탈릭 반수체 자손을 형성한다. 대조적으로, 2개 호모탈릭 반수체 효모 세포의 교배를 통해서 생성된 이배체 재조합 효모 세포는 오로지 호모탈릭 반수체 자손을 형성한다.
예를 들어, 케이. 마르시아누스를 포함한, 아스코마이세타로부터 유래되는, 교배 적격 반수체 효모 세포는 본 발명의 상황에서 몇가지 장점을 제공한다. 교배는 반대 교배형의 2개 반수체 재조합 효모 세포가 융합되어서 단일 핵을 갖는 이배체 재조합 효모 세포를 생성할 수 있게 하는 유전적 프로그램이다. 교배는 동일한 균주의 세포 간에, 그리고 상이한 균주의 세포 간에 일어나지만, 일반적으로 균주가 동일 종에 속하는 것이 요구된다. 최종 이배체 재조합 효모 세포는 반수체 부모의 각각으로부터 완전한 염색체 세트를 물려받고, 상이한 유전적 구성요소, 예를 들어, 상이한 발현 카세트, 유전 마커 및/또는 이식유전자를 보유하는 2개 반수체 재조합 효모 세포의 교배는 양쪽 부모 반수체로부터의 완전한 유전 정보를 함유하는 이배체 재조합 효모 세포를 제공하게 될 것이다. 그러므로, 교배 반수체 재조합 효모 세포는 재조합 효모 균주 구성 및 강화를 위한 편리하고 신속한 경로를 제공한다. 교배 후에 이배체 재조합 효모 세포를 선택하기 위해서, 적어도 하나의 선택가능 마커가 각각의 반수체 부모에서 필요하고, 바람직하게 각각의 반수체 재조합 효모 세포에서 영양요구성 마커가 필요하다. 유리하게, 마커는 2개 반수체 균주 간에 상보적이다.
이배체 균주는 반수체 균주에 비해서 더 큰 열안정성을 비롯하여 산, 에탄올, 및 다른 발효 억제제에 대해 더 높은 내성을 갖는 것으로 관찰되었다. 따라서, 효모 교배는 재조합 효모 균주 구성을 위한 효율적인 수단 및 반수체 재조합 효모 세포의 저장소로부터의 다수 이식유전자를 포함하는 반수체 재조합 효모 세포를 조합하는 다양한 가능성을 제공하며, 즉, 다양한 부모 균주의 신속하고 신뢰할만한 조합을 통해 시간을 절약해 준다. 또한, 최종 이배체 재조합 효모 세포는 우수한 성장 및 이식유전자 발현 특징 (예를 들어, 더 높은 가능한 세포 밀도, 억제성 화합물에 대해 더 높은 내성, 이식유전자-코딩된 유전자 생산물의 더 높은 수율)을 제공한다.
그러나, 유성 주기를 갖는 종의 이배체 재조합 효모 세포는 감수분열 및 포자형성을 겪고 종종 영양 스트레스 조건 하에서, 발아 및 증식하는 반수체 포자를 생성시킬 수 있다. 감수분열은 2개 상동 염색체 중 오직 하나에 존재하는 게놈 통합 서열 (예를 들어, 발현 카세트)의 상실을 초래할 수 있는, 상동 염색체 간 교잡 사건을 요구한다. 더욱이, 감수분열 재조합 및 교잡 사건은 재조합 생산 균주의 배양이 이배체 및 반수체의 혼합물을 함유하도록 이배체 선택 배지에서 성장할 수 있는 반수체 자손을 제공할 수 있다. 이러한 상황은 바람직하지 않은데 생산 균주의 유전적 안정성 및 발효 과정의 재현성에 영향을 미치기 때문이다. 또한 이식유전자에 의해 코딩되는 유전자 생산물 (예를 들어, 면역원성 폴리펩티드)의 생산 속도에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 특히 생물반응기 발효 과정에서, 이배체 안정성에 대한 우려로 인해서, 생산 균주로서 사용되는 이배체 재조합 효모 세포에서 효율적이고 재현가능한 이식유전자 발현뿐만 아니라 유전적 안정성을 제공하기 위한 전략이 필요하다. 생물공정에서 이러한 접근법의 성공은 발현 카세트에 대한 통합 부위의 신중한 선택, 적합한 마커 전략, 및 반수체 부모 세포 간에 높은 유전적 유사성을 기반으로 한다.
이배체의 배양 동안 반수체 세포의 농축은 자가영양성 마커 유전자에 각 발현 카세트를 연결하고, 각각 영양요구성이고 반수체 재조합 효모 세포의 성장을 위해 배지의 보충을 요구하는 2개 반수체 재조합 효모 세포를 사용하여 방지할 수 있다. 긴밀한 유전적 연결, 즉 이식유전자 및 선택 마커의 근접성은 이식유전자를 마커로부터 분리하는 상동성 재조합 사건이 극히 드물고 유전적 스크리닝을 통해서 인식될 수 있다는 것을 의미한다. 유리하게, 영양요구성 마커는 이배체 재조합 효모 세포가 반수체 재조합 효모 세포에 의해 요구되는 모든 보충물 (leu, his, met 및 ade, ura)의 부재 하에서 성장하게 되도록, 2개 반수체 균주 간에 상보적이다 (예를 들어, Ade- 및 His- 또는 Met- 및 Leu-).
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득되는 이배체 재조합 효모 세포는 상동 염색체 상에 위치되는 염색체 유전자좌에서 게놈 통합되는 적어도 2개 선택 마커를 포함한다. 유리하게, 상기 선택 마커는 게놈 통합된 발현 카세트(들)에 포함된다. 특정 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 영양요구성이고, 이배체 재조합 효모 세포는 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포가 감소된 성장 또는 증식을 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않는 선택 조건 하에서 성장할 수 있다. 이것은 제1 반수체 재조합 효모 세포의 영양요구성이 제2 재조합 효모 세포의 게놈에 의해 (부분적으로) 보완되고, 그 반대도 마찬가지임을 의미한다. 예를 들어, 제1 반수체 재조합 효모 세포는 물질대사 효소를 코딩하는 유전자의 (부분) 결실, 돌연변이 또는 파괴를 포함할 수 있고, 따라서 제1 반수체 재조합 효모 세포를 영양요구성이게 만든다. 제2 반수체 재조합 효모 세포가 상기 물질대사 효소를 코딩하는 온전한 (기능성) 유전자를 포함하는 경우에, 최종 이배체 재조합 효모 세포는 제1 반수체 재조합 효모 세포가 감소된 성장 또는 증식을 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않는 선택 조건 하에서 성장될 수 있다. 바람직하게, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 영양요구성이고, 이배체 재조합 효모 세포는 자가영양성이다. 더 바람직하게, 선택 마커는 물질대사 선택 마커이다. 더 바람직하게, 상동 염색체에 위치되는 염색체 유전자좌는 상동 염색체의 각각에서 동일한 염색체 유전자좌이다 (상동 염색체의 동등한 염색체 유전자좌).
이배체 재조합 효모 세포는 교배 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득될 수 있고, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 하나, 2개, 3개 또는 4개 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하여서, 2개, 4개, 6개 또는 8개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하는 이배체 재조합 효모 세포를 생성시킨다.
유리하게, 이배체 재조합 효모 세포는 상이한 발현 카세트, 즉, 상이한 이식유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득된다. 따라서, 본 발명에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포로부터 생성되는, 이배체 재조합 효모 세포의 바람직한 구현예에서, 각각의 발현 카세트의 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 추가의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자와 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 하나의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 제1 반수체 재조합 효모 세포의 게놈 통합된 발현 카세트는 이식유전자의 제1 쌍을 포함하고, 제2 반수체 재조합 효모 세포의 게놈 통합된 발현 카세트는 이식유전자의 제2 쌍을 포함하며, 이식유전자의 제1 및 제2 쌍은 상이하다. 추가 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 2개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 제1 반수체 재조합 효모 세포의 게놈 통합된 발현 카세트는 이식유전자의 제1 및 제2 쌍을 포함하고, 제2 반수체 재조합 효모 세포의 게놈 통합된 발현 카세트는 이식유전자의 제3 및 제4 쌍을 포함하고, 이식유전자의 제1, 제2, 제3, 및 제4 쌍은 상이하다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 3개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 제1 반수체 재조합 효모 세포의 게놈 통합된 발현 카세트는 이식유전자의 제1, 제2 및 제3 쌍을 포함하고, 제2 반수체 재조합 효모 세포의 게놈 통합된 발현 카세트는 이식유전자의 제4, 제5, 및 제6 쌍을 포함하고, 이식유전자의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 및 제6 쌍은 상이하다. 또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 4개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 제1 반수체 재조합 효모 세포의 게놈 통합된 발현 카세트는 이식유전자의 제1, 제2, 제3, 및 제4 쌍을 포함하고, 제2 반수체 재조합 효모 세포의 게놈 통합된 발현 카세트는 이식유전자의 제5, 제6, 제7, 및 제8 쌍을 포함하고, 이식유전자의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 쌍은 상이하다.
다른 유리한 구현예에서, 이배체 재조합 효모 세포는 본 발명에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득되고, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 동일한 개수의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 상동 염색체에 위치된 염색체 유전자좌에 게놈 통합된다. 바람직하게, 발현 카세트는 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포에서 동일한 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다. 이것은 상동 염색체에서 상응하는 (상동성) 유전자좌에서 게놈 통합되는 발현 카세트의 쌍을 포함하는 이배체 재조합 효모 세포를 생성시킨다.
일 특정 구현예에서, 이배체 재조합 효모 세포는 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득되고, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 동일한 개수의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 이배체 재조합 효모 세포가 ADE1, ADE2, ADE8, ECM31, HIS2, HIS3, HIS5, LEU1, LEU2, LYS2, LYS5, MET5, MET17, TRP1, TRP3, TRP4, TRP5, TYR1, URA3, URA5, FCY1, GAP1, LAC4 + LAC12, XYL1 및 XYL2 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상동 염색체의 상응하는 (상동성) 유전자좌에서 게놈 통합되는 발현 카세트의 쌍을 포함하도록, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포에서 동일한 염색체 유전자좌에 게놈 통합된다. 바람직하게, 염색체 유전자좌는 TYR1, ADE2, LEU2, LAC4-LAC12, MET5, HIS3, TRP1, XYL2, 및 LYS5 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게 ADE2, LEU2, MET5 및 HIS3 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
최종 이배체 재조합 효모 세포는 상동 염색체에서 상응하는 (상동성) 염색체 유전자좌에 통합되는 발현 카세트의 쌍 (예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개 쌍)을 포함하고, 상응하는 (상동성) 염색체 유전자좌는 ADE1, ADE2, ADE8, ECM31, HIS2, HIS3, HIS5, LEU1, LEU2, LYS2, LYS5, MET5, MET17, TRP1, TRP3, TRP4, TRP5, TYR1, URA3, URA5, FCY1, GAP1, LAC4 + LAC12, XYL1 및 XYL2 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게 TYR1, ADE2, LEU2, LAC4-LAC12, MET5, HIS3, TRP1, XYL2 및 LYS5 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게 ADE2, LEU2, MET5 및 HIS3 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 예시적인 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 ADE2 유전자좌에서 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다. 상기 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포의 교배는 상동성 ADE2 유전자좌의 각 하나에서 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하는 이배체 재조합 효모 세포를 생성시킨다. 그 결과로, 자매 염색분체 교환으로 인한 게놈 통합된 발현 카세트의 상실은 게놈 통합된 발현 카세트의 각각에 포함된 선택 마커 유전자에 대한 일정한 선택 압력 하에서 억제된다. 추가 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 ADE2 유전자좌에 하나, 및 HIS3 유전자좌에 하나씩, 2개 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 ADE2 유전자좌에 하나, HIS3 유전자좌에 하나, 및 MET5 유전자좌에 하나씩, 3개 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 ADE2 유전자좌에 하나, HIS3 유전자좌에 하나, MET5 유전자좌에 하나, 및 LEU2 유전자좌에 하나씩 4개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다.
본 발명에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포의 교배 또는 스페로플라스트 융합에 의한 이배체 재조합 효모 세포의 제공은 다수의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 따라서 다양한 상이한 이식유전자를 포함하는 이배체 재조합 효모 세포의 효율적인 생성을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 이식유전자는 하나 초과의 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 이식유전자는 동일한 바이러스 병원체의 하나 초과의 균주로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 대안적으로, 이식유전자는 상이한 바이러스 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
특정 구현예에서, 이배체 재조합 효모 세포는 본 발명에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득되고, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 동일한 개수의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 이배체 재조합 효모 세포가 상동 염색체에서 상응하는 (상동성) 유전자좌에서 게놈 통합된 발현 카세트의 상을 포함하도록, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포에서 동일한 염색체 유전자좌에서 게놈 통합되고, 각각의 이식유전자는 바이러스 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드 (또는 이의 면역원성 단편)를 코딩하고, 바람직하게 바이러스 병원체는 레오비리다에 과에 속하고, 보다 바람직하게 바이러스 병원체는 로타바이러스이고, 보다 더 바람직하게 바이러스 병원체는 돼지 로타바이러스 A (PRVA)이고, 가장 바람직하게 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 로타바이러스 A (PRVA) VP2, VP4, VP6, VP7, NSP2 및 NSP4 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 유리하게 SEQ ID NO: 1 (PRVA VP2), SEQ ID NO: 2 (PRVA VP4), SEQ ID NO: 3 (PRVA VP6), SEQ ID NO: 4 (PRVA VP7), SEQ ID NO: 5 (PRVA NSP2) 및 SEQ ID NO: 6 (PRVA NSP4) 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 및 4 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
유리하게, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 로타바이러스 A (PRVA) VP2, VP4, VP6 및 VP7 및 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하고, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NO: 13 (PRVA VP2), SEQ ID NO: 14 (PRVA VP4), SEQ ID NO: 15 (PRVA VP6) 및 SEQ ID NO: 16 (PRVA VP7)으로 기재된다. 발현 카세트의 각 쌍은 바람직하게 ADE1, ADE2, ADE8, ECM31, HIS2, HIS3, HIS5, LEU1, LEU2, LYS2, LYS5, MET5, MET17, TRP1, TRP3, TRP4, TRP5, TYR1, URA3, URA5, FCY1, GAP1, LAC4 + LAC12, XYL1 및 XYL2 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게 TYR1, ADE2, LEU2, LAC4-LAC12, MET5, HIS3, TRP1, XYL2 및 LYS5 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게 ADE2, LEU2, MET5 및 HIS3 으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상응하는 (상동성) 염색체 유전자좌에 게놈 통합된다.
추가의 특정 구현예에서, 이배체 재조합 효모 세포는 본 발명에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득되고, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 2개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포에서 동일한 염색체 유전자좌에서 게놈 통합되어서, 이배체 재조합 효모 세포가 발현 카세트의 2개 쌍 (즉, 4개 발현 카세트)을 포함하게 되고, 각각의 쌍은 상동 염색체에서 상응하는 (상동성) 유전자좌에서 게놈 통합되고, 제1 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자는 SEQ ID NO: 13 (PRVA VP2)의 핵산 서열을 포함하고, 제2 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자는 SEQ ID NO: 14 (PRVA VP4)의 핵산 서열을 포함하고, 제3 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자는 SEQ ID NO: 15 (PRVA VP6)의 핵산 서열을 포함하고, 제4 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자는 SEQ ID NO: 16 (PRVA VP7)의 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게, 발현 카세트의 각 쌍은 ADE1, ADE2, ADE8, ECM31, HIS2, HIS3, HIS5 LEU1, LEU2, LYS2, LYS5, MET5, MET17, TRP1, TRP3, TRP4, TRP5, TYR1, URA3, URA5, FCY1, GAP1, LAC4 + LAC12, XYL1 및 XYL2 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게 TYR1, ADE2, LEU2, LAC4-LAC12, MET5, HIS3, TRP1, XYL2 및 LYS5 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게 ADE2, LEU2, MET5 및 HIS3 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상응하는 (상동성) 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다.
이배체 재조합 효모 세포의 상기 언급된 구현예에서, 상응하는 (상동성) 염색체 유전자좌에서 발현 카세트의 각 쌍은 바람직하게 각 쌍의 제1 및 제2 발현 카세트에 상이한 선택 마커를 포함한다. 바람직하게, 상기 상이한 선택 마커는 각각 영양요구성 선택 마커이고, 영양요구성 마커는 각 쌍의 제1 및 제2 발현 카세트 간에 상보적이다. 결과적으로, 이배체 재조합 효모 세포는 자가영양성이고, 다시 말해서, 반수체 재조합 효모 세포에 의해 요구되는 모든 보충물의 부재 하에서 성장하게 되지만, 상기 반수체 재조합 효모 세포 (예를 들어, 포자형성으로 생성됨)의 성장은 동일한 조건 하에서 억제된다. 또한, 발현 카세트의 재배치 또는 상실을 일으킬 수 있는 유전적 교잡의 발생은 매우 낮아서, 유전적으로 매우 안정한 재조합 효모 균주가 생성된다. 생산 목적 (예를 들어, 전체 효모 백신의 생산)을 위해 이배체 재조합 효모 세포를 사용할 때 최종 반수체 재조합 효모 세포의 포자형성 사건 및 성장을 억제하는 것이 일반적으로 바람직하지만, 포자형성은 신규 항원-조합이 흥미롭다면 신속한 균주 구축에 유리할 수 있다는 것을 유의해야 한다 (도 14). 감수분열 재조합으로 생성된 신규 항원 조합의 가능한 개수는 식 C=(2n)-2 [C= 신규 항원-조합의 개수; n= 발현 카세트를 갖는 염색체의 개수]을 통해 계산할 수 있고, 발현 카세트가 상응하는 (상동성) 염색체 유전자좌에서 통합된다고 가정한다. 2개 반수체 효모 세포를 교배할 때, 각각은 염색체 1, 2, 3 및 4에 4개 발현 카세트를 보유하고 (예를 들어, MATa: Chr.1 TYR1::VP2; Chr. 2ADE2::VP6; Chr. 3LAC4::VP4[P7]; Chr.4 MET5::VP7[G5]/MATα: Chr.1 HIS3::VP4[P6]; Chr. 2::TRP1::VP4[P23]; Chr. 3 ::XYL2::VP4[P32]; Chr.4 ::LYS5::VP7[G9]), 최종 이배체 효모 세포는 8개 항원 (VP2; VP6; VP4[P7]; VP7[G5]; VP4[P6]; VP4[P23]; VP4[P32]; VP7[G9])을 발현한다. 유도된 포자형성을 통해서, 14개의 신규한 항원 배열이 선택 마커의 적합한 선택을 통해서 선택될 수 있고, 이것은 상응하는 발현 카세트에 포함되고 따라서 그에 유전적으로 밀접하게 연결된다.
각각의 염색체에 대해 적어도 하나의 통합 유전자좌가 이용가능하고, 신규한 항원 배열의 최대 개수 (n=8인 경우)는 254이다. 이것은 상응하는 반수체 효모 세포에서 254개 신규 항원 조합이 선택될 수 있다는 것을 의미한다. 발생하는 반수체는 원하는 항원 조합이 생성될 때까지 다시 교배 및 후속 포자형성에 사용될 수 있다.
일정 바이러스로부터의 모든 기지 혈청형 (예를 들어, 지금까지, 27개의 상이한 G- 및 37개의 P-유전자형이 A형의 로타바이러스 경우에 인간 및 동물 둘 모두에서 기술되어 있음)을 포괄하는 반수체 세트를 생성시켜서, 이 방법은 시간 소모적인 균주 구성 및 유전자 검증 (예를 들어, PCR, 서던 블롯, 웨스턴 블롯에 의함)없이, 신규한 순환성 혈청형 조합에 대한 신속한 반응을 가능하게 한다.
반수체 및 이배체, 바람직하게, 본 발명의 이배체 재조합 효모 세포는 유리하게 생산 목적 (예를 들어, 전체 효모 백신의 생산)을 위해서 배양될 수 있다. 이러한 생산 목적은 최소 배지에서 성장을 포함할 수 있고, 이러한 배지는 사전 형성된 아미노산, 및 다른 복합 생분자가 결여되고, 예를 들어, 배지는 질소원 (프롤린, 글루타민 또는 암모니아) 및 에너지 및 탄소원으로서 글루코스, 락토스 또는 갈락토스, 및 포스페이트, 칼슘 등의 공급원으로서 염을 포함한다. 바람직하게, 이러한 생산 배지는 선택제 예컨대 항생제, 아미노산, 푸린, 피리미딘 등이 결여된다. 이배체 재조합 효모 세포는 높은 세포 밀도, 예를 들어, 적어도 약 10 g/L, 적어도 약 25 g/L, 적어도 약 50 g/L, 적어도 약 75g/L 또는 적어도 약 100 g/L 건조 중량까지 성장될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 본 명세서에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 효모 세포를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 백신 조성물은 반수체, 이배체 또는 사배체 재조합 효모 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게, 백신 조성물은 이배체 재조합 효모 세포, 가장 바람직하게 본 발명에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득된 이배체 재조합 효모 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 백신 조성물에 포함된 재조합 효모 세포의 양 또는 용량은 다양할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 백신 조성물에 포함된 재조합 효모 세포의 양 또는 용량은 대상체에서 면역 반응을 유발시키기에 충분하고, 다시 말해서, 백신 조성물은 상기 본 명세서에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 효모 세포의 면역원성 양을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 감염성 질환에 대해서 대상체를 백신접종하는데 사용을 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환에 대해 대상체를 백신접종하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게 돼지이다. 추가의 특정 구현예에서, 감염성 질환은 바이러스 질환이고, 바람직하게 돼지 로타바이러스 A 또는 돼지 로타바이러스 C, 보다 바람직하게 돼지 로타바이러스 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 질환이다. 따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 돼지 로타바이러스 A 또는 돼지 로타바이러스 C, 특히 돼지 로타바이러스 A에 대해서 돼지를 백신접종하는데 사용을 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 관한 것이다.
추가의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 돼지 파보바이러스, 바람직하게 돼지 파보바이러스 1에 대해 돼지를 백신접종하는데 사용을 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 관한 것이다. 추가의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV)에 대해 돼지를 백신접종하는데 사용을 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 관한 것이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 대상체는 말과의 아과에 속한다. 예를 들어, 대상체는 말, 얼룩말, 또는 당나귀이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 아프리카 말병 바이러스, 특히 아프리카 말병 바이러스 혈청형 4에 대해서 말과의 아과에 속하는 대상체를 백신접종하는데 사용을 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 관한 것이다.
재조합 효모 세포 또는 백신 조성물의 투여는 임의로 통상적인 담체 및/또는 부형제와 조합하여, 비경구, 장, 근육내, 점막, 또는 경구일 수 있다. 바람직하게, 투여는 비경구, 가장 바람직하게 피하이다.
재조합 효모 세포 또는 백신 조성물은 감염성 질환을 초래하는 병원체에 대해서 보호적 면역 반응을 상승시키기 위해 적절하게, 1회 (예를 들어, 원-샷 투여 방식), 또는 1회 초과 (예를 들어, 프라임-부스트 투여 방식)로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물은 1회 투여된다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포는 또는 백신 조성물은 적어도 2회, 예를 들어, 2회 투여된다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물은 적어도 3회, 예를 들어, 3회 투여된다. 추가 구현예에서, 재조합 효모 포 또는 백신 조성물은 적어도 4회, 예를 들어, 4회 투여된다. 백신 조성물은 적어도 하나의 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제, 보강제, 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 재조합 효모 세포는 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 투여를 위해 백신 조성물 중 수성 염수 또는 완충액 중에 제조될 수 있다. 이러한 담체는 일반적인 약학 부형제, 예컨대 삼투압을 조정하기 위한 생리적으로 허용가능한 염, 완충제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, [Remington's Practice of Pharmacy, 13th edition and J. of. Pharmaceutical Science & Technology, Vol. 52, No. 5, Sept-Oct., pp. 238-311]에 알려져 있다.
재조합 효모 세포는 이식유전자의 배양 및 발현 이후, 및 백신 조성물에 도입 이전, 또는 백신접종 방법에서 사용 이전에 불활성화/사멸된다. 불활성화는 임의의 통상적으로 이용가능한 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 사용을 위해 특히 적합한 것은 액상 불활성화 (예를 들어, 68℃에서 3분 동안 액상 불활성화), 동결건조, 또는 감마 조사 (예를 들어, 25 또는 50 kGy)이다.
본 명세서에서 사용되는, "백신화" 또는 "백신접종"은 의학적 상태, 예컨대 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 의미한다. 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물은 동물 또는 인간 대상체, 바람직하게 동물에게, 대상체에서 면역 반응, 바람직하게 보호적 면역 반응을 유발시키기에 충분한 양으로 투여된다. 보다 바람직하게, 면역 반응은 적어도 하나의 게놈 통합된 발현 카세트에 포함된 각각의 이식유전자에 의해 코딩되는 면역원성 폴리펩티드 또는 면역원성 폴리펩티드들에 보호적이고 특이적인 면역 반응을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득되는 적어도 하나의 이배체 재조합 효모 세포를 포함하는 전체 효모 백신의 제조를 위한 방법으로서, 방법은 제1 및 제2 반수체 효모 세포의 교배를 통한 이배체 재조합 효모 세포의 생성 단계를 포함하고, 제1 효모 세포는 교배형 MATa이고, 제1 발현 카세트를 포함하고, 제2 효모 세포는 교배형 MATα이고, 제2 발현 카세트를 포함하고, 제1 및 제2 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈에 안정적으로 통합되고, 제1 및 제2 효모 세포는 반수체, 헤테로탈릭 및 교배 적격이고; 각각의 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드를 코딩한다.
전체 효모 백신의 제조를 위한 방법의 일 구현예에서, 교배형 MATa의 제1 효모 세포는 제3 발현 카세트를 포함하고, 교배형 MATα의 제2 효모 세포는 제4 발현 카세트를 포함하고, 제3 및 제4 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 임의로, 교배형 MATa의 제1 효모 세포는 제5 발현 카세트를 더 포함하고, 교배형 MATα의 제2 효모 세포는 제6 발현 카세트를 더 포함하고, 제5 및 제6 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈에 안정하게 통합된다. 또한 임의로, 교배형 MATa의 제1 효모 세포는 제7 발현 카세트를 더 포함하고, 교배형 MATα의 제2 효모 세포는 제8 발현 카세트를 더 포함하고, 제7 및 제8 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈에 안정하게 통합된다.
전체 효모 백신의 제조를 위한 방법에서, 상기 본 명세서에 기술된 게놈 통합된 발현 카세트를 비롯하여, 이식유전자, 양방향성 프로모터 구성요소, 선택 마커 유전자, 염색체 유전자좌, 전사 종결자 및/또는 효모 속, 종 또는 균주가 사용될 수 있다.
전체 효모 백신의 제조를 위한 방법의 바람직한 구현예에서, 제1 반수체 효모 세포에 포함된 선택 마커 유전자는 ADE2 이고, 제2 반수체 효모 세포에 포함된 선택 마커 유전자는 URA3 이거나, 또는 그 반대도 마찬가지이다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 배양 및 증식은 임의의 통상적으로 이용가능한 방법으로 수행될 수 있다. 특히 바람직한 것은 저비용으로 높은 세포 수율을 야기하는 방법이다. 이들은 발효 공정, 특히, 높은 세포 밀도 발효 공정을 포함한다. 유가식 발효 프로토콜을 사용한 발효는 특히 유리한 것으로 증명되었다.
다른 양태에서, 본 발명은 야생형 효모 균주로부터, 본 명세서에 기술된 바와 같은 이배체 재조합 효모 세포의 제조를 위한 방법에 관한 것으로서, (a) 제1 및 제2 효모 세포가 각각 헤테로탈릭, 동종동계 및 교배 적격이도록, 야생형 효모 균주로부터 교배형 MATa의 제1 효모 세포 및 교배형 MATα의 제2 효모 세포를 생성시키는 단계; (b) 적어도 하나의 결실 카세트로 제1 및 제2 효모 세포의 각각을 형질전환시켜서, 적어도 하나의 결실 카세트가 제1 및 제2 효모 세포에서 동일한 염색체 유전자좌에서 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되고, 효모 세포 게놈으로 안정한 통합이 필수 화합물의 합성에 필요한 유전자의 파괴를 야기하는 단계로서, 바람직하게 필수 화합물은 아미노산 또는 뉴클레오염기인 단계; (c) 적어도 하나의 발현 카세트로 단계 (b)에서 수득된 제1 및 제2 효모 세포의 각각을 형질전환시켜서, 적어도 하나의 발현 카세트가 단계 (b)의 결실 카세트를 포함하는 염색체 유전자좌에서 효모 세포 게놈에 안정하게 통합되어서, 단계 (b)의 필수 화합물을 합성하는 제1 및 제2 효모 세포의 능력을 복원시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 수득된 제1 및 제2 반수체 효모 세포의 교배 또는 스페로플라스트 융합을 통해 이배체 효모 세포를 생성시키는 단계를 포함하고; 야생형 효모 균주는 유전적 선택 마커를 포함하지 않고, 각각의 결실 카세트는 적어도 하나의 마커 유전자, 바람직하게 영양요구성 마커 유전자; 및 임의로 마커 유전자에 측접한 loxP 부위를 포함하고; 각각의 발현 카세트는 (i) 양방향성 프로모터 구성요소; (ii) 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자로서, 상기 제1 및 제2 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 반대 말단에 위치되고, 각각의 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 한 측면에 작동적으로 연결되는 것인 제1 이식 유전자 및 제2 이식유전자; (iii) 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자로서, 상기 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자의 바로 하류에 존재하고, 상기 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자의 바로 하류에 위치되고; 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자에 작동적으로 연결되고, 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자에 작동적으로 연결되는 것인 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자; 및 (iv) 적어도 하나의 선택 마커; 및 (v) 단계 (b)의 필수 화합물의 합성에 필요한 유전자를 복원시키기 위한 서열을 포함한다.
"필수 화합물"은 세포가 성장, 생합성 수행 및/또는 증식하는데 필요한 화합물 (예를 들어, 성장 인자 또는 대사산물)이다. 세포는 모든 필수 화합물을 생산할 수 있을 것이고, 이러한 경우에 이것은 자가영양성이다. 모든 필수 화합물을 생산할 수 없는 세포는 성장 배지에 필수 화합물의 보충을 요구하고, 다시 말해서, 상기 세포는 필수 화합물에 대해 영양요구성이다. 필수 화합물은 비타민, 아미노산, 뉴클레오시드, 뉴클레오염기 또는 이의 하나 이상의 물질대사 전구체일 수 있다. 바람직하게, 필수 화합물은 아미노산 또는 뉴클레오염기 또는 이의 하나 이상의 물질대사 전구체이다. 예를 들어, 필수 화합물은 아데닌, 우라실, 히스티딘, 류신, 리신, 메티오닌, 시스테인, 트립토판, 티로신 및 판토테산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "야생형"은 유전적 선택 마커를 포함하지 않는 효모 균주를 의미한다. 야생형 효모 균주는 이식유전자를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 야생형 효모 균주는 자연계에 존재하거나, 또는 자연 공급원으로부터 단리된 효모 균주, 즉 천연 발생 효모 균주에서 발견되지 않는 유전적 변형을 보유하지 않는 효모 균주이다.
특정 구현예에서, 야생형 효모 균주는 안도지마 (Andozyma), 아스코보트리오지마 (Ascobotryozyma), 시테로마이세스 (Citeromyces), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 덱케라 (Dekkera), 에레모테시움 (Eremothecium), 이사트켄키아 (lssatchenkia), 카자크스타니아 (Kazachstania), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 코다마에아 (Kodamaea), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 파키솔렌 (Pachysolen), 피키아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 사투르니스포라 (Saturnispora), 테트라피시스포라 (Tetrapisispora), 토룰라스포라 (Torulaspora), 윌리옵시스 (Williopsis) 및 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속, 바람직하게 클루이베로마이세스 효모 속으로부터 유래된다. 특히 바람직한 구현예에서, 야생형 효모 균주는 클루이베로마이세스 마르시아누스 효모 종으로부터 유래된다. 가장 바람직하게, 야생형 효모 균주는 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주 NBRC1777이다.
실시예
실시예 1: 항원 생산을 위한 부모 효모 균주의 생성
케이. 마르시아누스 야생 균주 NBRC1777 은 항원 생산을 위한 부모 효모 균주의 생성에 사용되었다. 케이. 마르시아누스 야생 균주 NBRC1777은 본래 일본에서 토양으로부터 단리되었고, NITE 생물 자원 센터 (Shibuya City, Tokyo Prefecture, Japan)에 등록 번호 NBRC1777로 수탁되었다. 이 균주의 DNA 서열 정보는 각각 염색체 1 내지 8에 대해 GenBank 등록 번호 AP014599 내지 AP014607로 입수가능하다.
NITE 카탈로그의 정보와 대조적으로, 케이. 마르시아누스 야생형 균주 NBRC1777 은 호모탈릭으로 관찰되었다. 대부분의 자연에서 단리된 케이. 마르시아누스 균주는 호모탈릭으로서, 다시 말해서, 그들은 "교배형 전환"을 통해서 자발적으로 그들 교배형을 변화시켜서 반수체 MATa 및 MATα, 및 이배체 MATa /MATα 세포의 혼합 개체군을 생성한다. 2-성분 교배형 전환 기전은 클루이베로마이세스 락티스에서 확인되었는데, MAT 전환을 위해 2개 트랜스포사제 (Kat1 및 Alpha3)가 필요하다. Alpha3 트랜스포사제는 MATα 유형 세포를 MATa 유형으로 전환시키고, Kat1 은 MATa 를 MATα 유형으로 전환시킨다. Cernak 등은 상호 BLASTp 검색에 이어서 분자-유전자 실험을 통해서 케이. 락티스 KAT1 및 ALPHA3 유전자의 케이. 마르시아누스 오솔로그를 동정하였다 (Cernak, Paul; Estrela, Raissa; Poddar, Snigdha; Skerker, Jeffrey M.; Cheng, Ya-Fang; Carlson, Annika K. et al. (2018), mBio 9 (5)).
케이. 마르시아누스 야생 균주 NBRC1777을 사용하여, ura3 균주 SY3 은 5-플루오로오로트산 (5-FOA) 내성에 대한 선택을 통해서 단리되었다 (Boeke, J. D.; LaCroute, F.; Fink, G. R. (1984), Molecular & general genetics: MGG 197 (2), p. 345-346). MATa 균주를 생성시키기 위해서, KAT1 유전자는 염색체 KAT1 유전자좌에 상동성인 서열이 측접된, 선택가능 마커 kanMX를 함유하는, pSY15-기반 선형 M13-F/-R-PCR 단편 (도 2-(2))의 삽입을 통해서 이후에 불활성화시켰다. KanR은 항생제 내성 유전자로서, 카나마이신 유도체 G418에 대한 내성을 부여하는 우성 마커 (표 5)이다. 게놈 통합은 G418-내성 효모 콜로니의 형성을 일으킨다. 카세트에서, kanMX 마커는 리콤비나제 Cre에 대한 2개 인식 부위 (loxP 부위)가 측접된다. Cre 리콤비나제의 발현을 통해서, kanMX 카세트는 매우 효율적으로 절단될 수 있다. 1개 loxP 서열은 삽입 돌연변이로서 남아있고, G418 내성에 대한 선택은 추가 게놈 유전자좌에서 유전적 변형을 위해 다시 사용될 수 있다.
교잡 실험을 위해 적합한 MATα 균주를 수득하기 위해서, ALPHA3 유전자는 유사한 방식으로 불활성화되어서 (도 2-(3)) 균주 SY41을 수득하였다. ALPHA3 은 α에서 a로 교배형 변화에 필수적이다. 이러한 균주 (MATa, kat1Δ, α3Δ)에서 pSY16으로부터 KmKAT1 유전자의 일시적 발현 이후에, MATa에서 MATα로 유전자형을 변화시킨 클론이 수득되었다. ALPHA3 유전자의 성공적인 불활성화 덕분에, 상호 변화는 더 이상 가능하지 않았다. 최종 균주는 SY11 및 SY41 (MATa, kat1Δ::loxP-kanMX-loxP, ura3- 및 MATa, kat1Δ::loxP, ura3-) 및 SY200 및 SY201 (MATα, kat1Δ::loxP, α3Δ::loxP-kanMX-loxP, ura3- 및 MATα, kat1Δ::loxP, α3Δ::loxP, ura3-)이다. 4개 균주는 동종동계로서, 그들이 SY11 및 SY41에서 MATa이고, SY200 및 SY201에서 MATα인, 최종 (안정한) 교배형 및 그들 트랜스포사제를 제외하고 유전적으로 동일하다는 것을 의미한다. 이것은 교잡이 동형접합 이배체를 생성하도록 허용한다. SY41 및 SY201은 본 명세서에 제공되는 케이. 마르시아누스 플랫폼을 위한 출발 균주로서 사용되었다.
선택 마커 유전자는 각 경우에 Cre 리콤비나제에 대한 인식 부위 (loxP)의 직접 반복부가 측접되었다. loxP 부위는 염색체 표적 유전자좌에 상동성인 서열이 측접되었다. 상동성 영역의 길이는 숙주로서 사용되는 효모 종에 의존적이다. 최대 30-50 bp의 영역은 단일 PCR 증폭 단계에서 프라이머를 연장시켜서 마커 카세트에 쉽게 첨가될 수 있으며, 염색체로 DNA의 부위-특이적 통합을 수득하기에 충분할 수 있다 (예를 들어, 에스. 세레비지아에). 케이. 마르시아누스의 경우에, 약 1000 bp의 상동성 영역이 추천된다. 치환, 파괴 또는 돌연변이 목적을 위한 통합 카세트의 클로닝은 선형화된 벡터로 다수 DNA 단편 (우선적 PCR-기반)의 융합을 필요로 한다. 이러한 목적을 위해서, 그들 말단에서 중복되는 상보적 염기쌍의 대략 15 내지 20 bp를 갖는 개별 PCR-생성 단편은 제조사 설명서에 따라서 인-퓨젼 클로닝 방법을 사용해 선형화된 pUC19 벡터에 동시에 클로닝되었다 (Takara Bio USA Inc).
인-퓨젼 클로닝 시스템은 리가제-독립적 기전을 통해서 기능한다. 먼저, 인-퓨전 효소 (VVpol, 백시니아 바이러스 DNA-폴리머라제)는 올리고/PCR 삽입부 말단에 단일 가닥 영역 및 선형화된 벡터를 생성시킨다. 이것은 삽입부 및 벡터 DNA 분자 상의 상보성 영역을 노출시킨 다음에 염기 쌍형성을 통해서 자발적으로 어닐링/융합된다. 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli)로 이러한 어닐링/융합된 DNA의 도입은 임의의 단일 가닥 갭을 필요로 하고, 올리고/PCR 삽입부를 함유하는 재조합 벡터의 합성을 일으킨다 (Irwin et al., Vaccinia Virus and Poxvirology: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 2012, vol. 890). 인-퓨젼 HD 클로닝 키트에 함유된 pUC19 는 암피실린 내성을 전달하는 이. 콜라이에서 통상적으로 사용되는 플라스미드 클로닝 벡터이다. 분자는 소형 이중 가닥 써클이고, 2686 염기쌍 길이이고, 이. 콜라이에서 높은 카피수를 갖는다. pUC19 는 13개 상이한 헥사뉴클레오티드-특이적 제한 엔도뉴클레아제에 고유한 부위를 함유하는 54 염기쌍 다수 클로닝 부위 폴리링커를 운반한다 (Yanisch-Perron, C.; Vieira, J.; Messing, J. (1985), Gene 33 (1), S. 103-119). pUC19는 효모에서 자율적으로 복제할 수 없다.
통합 카세트는 적합한 제한 효소 또는 PCR 증폭을 사용해 박테리아 벡터로부터 분리되었다. 최종 DNA 단편은 박테리아 서열을 함유하지 않는다. 숙주 효모 균주 (여기서는 케이. 마르시아누스)의 형질전환은 다음의 문헌에 기술된 프로토콜에 따라서 수행되었다 (Nonklang, Sanom; Abdel-Banat, Babiker M. A.; Cha-aim, Kamonchai; Moonjai, Nareerat; Hoshida, Hisashi; Limtong, Savitree et al. (2008), Applied and environmental microbiology 74 (24), S. 7514-7521). 형질전환체는 각각 PCR 및 서던 블롯 분석을 통해서 검증되었다.
실시예 2: 케이. 마르시아누스 게놈으로 표적화된 통합을 위한 게놈 부위의 유전적 표시
균주 SY41 (MATa, kat1Δ::loxP, ura3-) 및 SY201 (MATa, kat1Δ::loxP, α3Δ::loxP, ura3-)은 상기 기술된 바와 같이, 선택가능 마커 카세트를 함유하는 선형 단편으로 형질전환되었다.
더 많은 유전자 결실은 다양한 마커 유전자 (자가영양성 마커 유전자 (URA3) 또는 약물 내성 마커 (kanMX, hphMX6, natMX6))의 이러한 통합의 반복 사이클로 연속적으로 수행되었다.
유전자 결실을 시험하기 위한 선택 단계에 대한 일반 절차는 하기와 같았다:
a) Phusion DNA 폴리머라제 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 50 μl의 최종 부피로 pUC19-특이적 프라이머 (M13-전방향/-역방향)를 사용한 통합을 위한 카세트 (즉, 치환, 결실, 파괴 또는 돌연변이를 위한 카세트)의 증폭 단계.
b) YPD 플레이트 또는 냉동 스톡의 세포를 YPD 배지로 옮기고 밤새 30℃ (120 rpm)에서 진탕 인큐베이션하여 사전-접종 효모 배양물을 제조하는 단계.
c) 0.1의 600 nm (OD 600)에서의 광학 밀도에 도달하도록 밤샘 배양물로부터 정해진 세포 계수를 옮겨서 주배양을 접종하는 단계. OD 600 0.8-1.0에 도달할 때까지 진탕 (120 rpm)하면서 30℃에서 배양물을 인큐베이션하는 단계.
d) 원하는 숙주 효모 균주로 결실 카세트의 형질전환 단계.
e) 선택적 SD 또는 YPD-약물 플레이트 (YPD-G418, YPD-ClonNat, YPD-하이그로마이신) 상에 세포 현탁물의 도말 및 48시간 동안 30℃에서 인큐베이션하여 형질전환체를 선택하는 단계.
f) 콜로니를 선택하고, 신선한 선택적 SD 플레이트 및 적절한 YPD-약물 플레이트 (YPD-G418, YPD-ClonNat, YPD-하이그로마이신)로 옮기고 24시간 동안 30℃에서 인큐베이션하는 단계. YPD-약물 플레이트에서 성장한 콜로니만을 추가 분석에 사용하였다.
g) 콜로니 PCR을 위한 콜로니 선택 단계.
h) PCR 분석 및 후속 서던 블롯 분석에 의한 기술된 결실/파괴의 확인 단계.
하기 케이. 마르시아누스 균주는 이 방법을 통해서 생성되었다.
ADE2 유전자좌 - 결실 ( ade2Δ :: ScURA3 ):
케이. 마르시아누스에서, 정의된 ade2Δ 대립유전자는 주형 플라스미드 pSY109 및 M13-F/M13-R 프라이머 쌍을 사용해 생성된 PCR 단편의 형질전환 이후에 수득되었다.
ADE2 유전자좌에서 영역 0 bp 내지 +99 bp 는 상동성 재조합을 통해서 에스. 세레비지아에 URA3 (ScURA3) 마커 유전자로 치환되었다 (도 2). 결과적으로, ADE2 유전자는 비기능성이다. 균주는 아데닌 영양요구성이 되고, 아데닌 생합성의 중간체의 축적으로 인해 콜로니의 붉은색을 나타낸다. ade2Δ 균주는 녹아웃 카세트의 마커가 ScURA3 유전자이기 때문에 우라실을 합성할 수 있다. 이러한 균주는 이제 ade2 돌연변이체 표현형으로 표시되고, ADE2 유전자좌에서 외래 유전자의 통합을 허용한다. 적합한 통합 벡터 예컨대 pSY147 (도 3) 및 pSY258 (도 4)이 사용되면, 파괴 카세트는 상동성 재조합을 통해 치환되어서 온전한 ADE2 유전자가 재구성되거나 (도 3) 또는 온전한 MET5 가 통합되고 (도 4) ScURA3 마커 유전자가 상실된다. 이것은 하기에 더욱 상세하게 기술된다. ScURA3 의 상실은 5-FOA 역선택을 통해서 제2 선택 단계를 가능하게 하고 비-상동성 재조합을 통해서 제2 부위 통합을 확인해야 하는 노력을 감소시킨다.
MET5 유전자좌 - 결실 ( met5Δ :: KanR )
케이. 마르시아누스에서, 정의된 met5Δ 대립유전자는 주형 플라스미드 pSY129 및 M13-F/M13-R 프라이머 쌍을 사용해 생성된 PCR 단편의 형질전환 후 수득되었다.
MET5 유전자좌에서 영역 -883 bp 내지 +299 bp는 상동성 재조합을 통해서 이. 콜라이 카나마이신-내성 유전자 (KanR)로 치환되었다 (도 2). 결과적으로, met5Δ 유전자는 비기능성이다. 균주는 메티오닌 영양요구성이 되었지만, 항생제 G418의 존재 하에서 성장될 수 있다. 이러한 met5Δ 균주는 메티오닌 성장에 대한 선택을 통해서 MET5 유전자좌에서 외래 유전자의 통합을 허용한다. 적합한 통합 벡터가 사용되면, met5 유전자좌에서 파괴 카세트는 상동성 재조합을 통해서 치환될 수 있고, MET5 는 KanR 내성 마커 유전자의 상실을 통해서 재구성된다 (하기 기술된 바와 같음).
더 나아가서, loxP 부위는 플라스미드-기반 Cre 리콤비나제 발현 (플라스미드 pSY16, pKATUC4-기반 케이. 락티스 플라스미드)을 통해서 효모 게놈으로부터 KanR 내성 카세트의 재활용을 허용한다.
LEU2 유전자좌 - 결실 ( leu2Δ :: HygR )
케이. 마르시아누스에서, 정의된 leu2Δ 대립유전자는 주형 플라스미드 pSY241 및 M13-F/M13-R 프라이머 쌍을 사용해 생성된 PCR 단편의 형질전환 후에 수득되었다.
LEU2 유전자좌에서 영역 -455 bp 내지 +942 bp 는 상동성 재조합을 통해서 이. 콜라이 하이그로마이신-B 내성 유전자 (HygR)로 치환되었다 (도 2). 결과적으로, LEU2 유전자는 비기능성이다. 균주는 류신 영양요구성이 되지만 항생제 하이그로마이신-B의 존재 하에서 성장될 수 있다. 이러한 leu2Δ 균주는 류신 성장에 대한 선택을 통해서 LEU2 유전자좌에서 외래 유전자의 통합을 허용한다. 적합한 통합 벡터가 사용되면, 파괴 카세트는 상동성 재조합을 통해 치환되어서 온전한 LEU2 유전자가 HygR 내성 유전자의 상실로 재구성된다 (하기 기술된 바와 같음).
더 나아가서, loxP 부위는 플라스미드-기반 Cre 리콤비나제 발현 (플라스미드 pSY16)를 통해서 효모 게놈으로부터 HygR 내성 카세트 (hphMX6 마커 유전자 포함)의 재활용을 허용한다.
HIS3 유전자좌 - 치환 카세트의 결실 ( his3 Δ :: NrsR ) 및 통합
케이. 마르시아누스에서, 정의된 his3Δ 무효 대립유전자는 주형 플라스미드 pSY242 및 M13-F/M13-R 프라이머 쌍을 사용해 생성된 PCR 단편의 형질전환 이후에 수득되었다.
HIS3 유전자좌에서 영역 -260 bp 내지 +108 bp은 상동성 재조합을 통해서 스트렙토마이세스 노르세이 (Streptomyces noursei) 노르세오트리신 (ClonNAT) 내성 유전자 (NrsR)에 의해 치환되었다 (도 2). 결과적으로, HIS3 유전자는 비기능성이 된다. 균주는 히스티딘 영양요구성이 되지만, 항생제 노르세오트리신의 존재 하에서 성장될 수 있다. 이러한 his3Δ 균주는 HIS3 유전자좌에서 외래 유전자의 통합을 허용한다. 적합한 통합 벡터 예컨대 pSY275 (도 6) 및 pSY250 (도 5)이 사용되면, 파괴 카세트는 상동성 재조합을 통해 치환되어서 온전한 HIS3 유전자가 재구성되거나 (도 5) 또는 온전한 LEU2 유전자가 통합되고 (도 6) NrsR 마커 유전자는 상실된다 (하기 기술된 바와 같음). 더 나아가서, loxP 부위는 플라스미드-기반 Cre 리콤비나제 발현 (플라스미드 pSY16)에 의해서 효모 게놈으로부터 NrsR 내성 카세트 (NrsR 마커 유전자를 포함함)의 재활용을 허용한다.
LAC4-LAC12 유전자좌 - 결실 ( lac4Δ-lac12Δ:: ScURA3 )
케이. 마르시아누스에서, 정의된 lac4Δ-lac12Δ 대립유전자는 주형 플라스미드 pSY102 및 M13-F/M13-R 프라이머 쌍을 사용해 생성된 PCR 단편의 형질전환 이후에 수득되었다.
LAC4 의 영역 +205 bp 내지 LAC12 의 +183 bp는 상동성 재조합을 통해서 에스. 세레비지아에 URA3 마커 유전자에 의해 치환되었다 (도 2). 결과적으로, LAC4-LAC12 유전자는 비기능성이고, 균주는 단독 탄소원으로서 락토스에서 성장할 수 없지만 통합된 ScURA3 유전자 덕분에 우라실을 합성할 수 있다. 이러한 lac4-lac12Δ 균주는 락토스 성장에 대한 선택을 통해서 LAC4-LAC12 유전자좌에서 외래 유전자의 통합을 허용한다. 적합한 통합 벡터가 사용되면 파괴 카세트는 상동성 재조합을 통해서 치환되어서 각각 온전한 LAC4 및 LAC12 유전자는 ScURA3 마커 유전자의 상실로 재구성된다 (하기 기술된 바와 같음).
실시예 3: PRVA 항원의 코돈 최적화 및 유전자 합성
돼지 로타바이러스 A 균주 RVA/Pig-tc/ESP/OSU-C5111/2010/G5P[7]의 천연 VP2, VP4, VP6 및 VP7 유전자의 케이. 마르시아누스의 코돈 용법에 대한 적합화는 다음의 문헌 (Villada, Juan C.; Brustolini, Otavio Jose Bernardes; Batista da Silveira, Wendel (2017), DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 24 (4), S. 419-434)에 따르고 tRNA 유전자 예측을 함유하는 게놈 tRNA 데이터베이스 GtRNAdb를 사용해 분석되었다. 코돈의 번역 효율은 tRNA 적합화 지수 (tAI5)로부터 수득되었고, 여기서 코돈 상대 적합도 (w)는 상이한 가능한 tRNA 및 워블 쌍형성 규칙을 도입한 게놈에서 이용가능한 동족 tRNA의 풀에 대한 코돈의 적합도이다 (Villada et al. 2017).
VP2, VP4, VP6 및 VP7 유전자는 코돈 최적화되었고, 각 유전자의 코딩된 단백질 아미노산 서열을 변화되지 않은 채로 남겨졌다. 코돈 최적화된 VP2, VP4, VP6 및 VP7 유전자는 모두 링커 및 C-말단 3HA 에피토프를 가지며, GENSCRIPT 회사에서 합성하였고, 이후에 pUC19 클로닝 벡터에 클로닝하여서 pUC19-PRVA-VP2-opt, pUC19-PRVA-VP4-opt, pUC19-PRVA-VP6-opt2 및 pUC19-PRVA-VP7-opt 를 수득하였다. 합성 유전자 서열이 올바르다는 확인은 시퀀싱을 통해 수행하였다.
PRVA VP2 유전자의 GenBank 등록 번호: KJ450843.1: SEQ ID NO: 7
PRVA VP4 유전자의 GenBank 등록 번호: KJ450845.1: SEQ ID NO: 8
PRVA VP6 유전자의 GenBank 등록 번호: KJ450847.1: SEQ ID NO: 9
PRVA VP7 유전자의 GenBank 등록 번호: KJ450849.1: SEQ ID NO: 10
언급된 모든 사용된 항원성 서열은 바이러스 균주 로타바이러스 A 균주 RVA/Pig-tc/ESP/OSU-C5111/2010/G5P[7]로부터 유래된다.
실시예 4: 숙주 게놈으로 유도성 항원성 유전자 발현을 허용하는 통합 벡터의 생성
모든 변형은 선택/역-선택 전략을 사용하여 본질적으로 2개 단계로 수행되었다. 유전적 변형은 2 단계로 수행되었다: 파괴/결실 카세트 (예를 들어, ScURA3, kanMX, natMX6, hphMX6, 도 2 참조)가 표적화된 게놈 위치에 삽입된, 선택 단계 (상기 기술된 바와 같음), 및 녹 아웃 카세트가 발현 카세트에 의해 치환되어서 원하는 유전적 변형 (예를 들어, 양방향성 프로모터 및 전사 종결자를 갖는 2개 항원성 서열 (이식유전자))을 생성하는 특별한 역-선택 단계.
발현 카세트에 대한 통합 벡터는 하기와 같이 생성되었다. 치환을 위한 발현 카세트의 클로닝은 선형화된 벡터로 방향적으로 다수 DNA 단편의 융합 (우선적 PCR-기반)을 필요로 한다. 이러한 목적을 위해서, 독립적 PCR-생성 단편 (예를 들어, PCR 단편 1: GOI1-3HA-opt, PCR 단편 2: 양방향성 프로모터, PCR 단편 3: GOI2-3HA-opt)은 그들 말단에서 15 또는 20 bp 중복부의 적절한 상보적 말단을 가지며, 제조사 설명서에 따라서 인-퓨젼 클로닝 방법을 사용해 상동성 재조합을 위한 적절한 표적 염색체 유전자좌에 대한 상동성 서열을 갖는 선형화된 pUC19-기반 표적 벡터로 동시에 클로닝되었다 (Takara Bio USA Inc).
실시예 5: 숙주 염색체로 발현 카세트의 통합
일반 전략은 반수체 균주 중 하나에서, 삽입 부위를 표시한 돌연변이된 유전자는 이식유전자를 포함하는 발현 카세트의 삽입을 통해서 복원되는 한편 나머지 반수체 균주에서, 신규한 선택적 마커는 오래된 영양요구성 마커 유전자를 신규한 자가영양성마커에 연결하고 양쪽 마커 유전자를 항원 코딩 서열을 함유하는 발현 카세트에 연결하는 발현 카세트의 일부로서 도입된다는 것을 의미한다. 이것은 이들 균주의 교잡시에, 이배체 재조합 효모 세포는 선택을 통해서 반수체로부터 분리될 수 있다는 장점을 갖는다. 각각의 이식유전자가 선택가능한 마커 유전자(들)에 긴밀하게 연결되므로, 플레이트 상에서 그들 표현형을 통해서 반수체와 이배체 자손을 구별하는 것이 가능하다. 반수체는 상동 염색체 간에 상호 교환을 일으키는 감수분열 재조합과 연관된, 감수분열을 통해서 이배체로부터 발생될 수 있으므로, 원한다면, 항원 유전자의 신규 조합을 갖는 감수분열 분리체를 찾거나 또는 감수분열 분리체에 대해 역-선택하는 것이 생성된 균주의 안정성에 중요하다.
녹아웃 카세트의 제거를 시험하기 위해 역-선택 단계에 따른 발현 카세트의 삽입의 일반 절차:
a) 각각 제한 효소를 사용한 분해 또는 PCR을 통한 pUC19 기반 벡터로부터 치환 카세트의 분리 단계.
b) 다음의 문헌에 기술된 바와 같이 원하는 숙주 효모 균주에서 치환 카세트의 형질전환 단계 (Nonklang, Sanom; Abdel-Banat, Babiker M. A.; Cha-aim, Kamonchai; Moonjai, Nareerat; Hoshida, Hisashi; Limtong, Savitree et al. (2008), Applied and environmental microbiology 74 (24), S. 7514-7521).
c) 선택적 SD 플레이트 상에 세포 현탁물의 도말 및 48시간 동안 30℃에서 인큐베이션에 의한 형질전환체의 선택 단계.
d) 콜로니를 선택하고 신선한 선택적 SD 플레이트 및 적절한 YPD-약물 플레이트 (YPD-G418, YPD-ClonNat, YPD-하이그로마이신)로 옮기고 24시간 동안 30℃에서 인큐베이션하는 단계. YPD-약물 플레이트에서 성장하지 않은 콜로니만이 추가 분석에 사용되었다.
e) SD 플레이트에서 성장하고 콜로니 PCR을 위해 적절한 약물 물질에 민감한 콜로니의 선택 단계.
f) PCR 생산물을 시퀀싱하여 발현 카세트의 성공적인 통합의 확인 단계.
하기 케이. 마르시아누스 재조합 효모 세포는 이러한 방법을 통해서 생성되었다.
MATa-배경을 갖는 균주에서 ADE2 유전자의 복원으로 ADE2 유전자좌 상에서 치환
pUC19 기반 벡터 pSY147의 발현 카세트는 항상적 ARO10, ARO10 프로모터 (P ARO10 ), 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii) 유래 TEF1 종결자 (T AgTEF1 ), PRVA-VP4-3HA-opt (SEQ ID NO: 35), 양방향성 프로모터 (P LAC4-LAC12 ), PRVA-VP4-3HA-opt (SEQ ID NO: 35), T AgTEF1 , ADE2 프로모터 (P ADE2 ), ADE2 및 ORF KLMA_20599' (특징규명 안됨)을 함유한다. 재조합 케이. 마르시아누스 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터는 적절한 제한 효소 (LguI & KpnI)로 선형화되었고, SY267에 형질전환되었다. 숙주 게놈의 염색체 ADE2 영역으로 성공적인 상동성 재조합 후에, URA3 유전자는 치환되고 ADE2 유전자는 복원된다. 최종 균주 (SY277)는 아데닌 (Ade+)을 합성할 수 있고, 우라실-영양요구성이고, FOA에 내성이고 (ura-, FOAR), 각각 양방향성 프로모터 (P LAC4-LAC12 )의 제어 하에서 PRVA-VP4-3HA-opt 의 2개 카피를 발현한다 (도 3).
MATα-배경을 갖는 균주에서 ADE2 대신 온전한 MET5 의 통합으로 ADE2 유전자좌 상에서 치환
pUC19 기반 벡터 pSY258의 발현 카세트는 항상적ARO10, P ARO10 , T AgTEF1 , PRVA-VP2-3HA-opt (SEQ ID NO: 34), P LAC4-LAC12 , PRVA-VP2-3HA-opt (SEQ ID NO: 34), T AgTEF1 , MET5 프로모터 (P MET5 ), MET5 및 ORF KLMA20599 (특징규명되지 않음)를 함유한다. 재조합 케이. 마르시아누스 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터는 적절한 제한 효소 (AatII & KpnI)를 사용해 선형화시키고 SY280에 형질전환된다. 숙주 게놈의 염색체 ADE2 영역으로 성공적인 상동성 재조합 후에, URA3 유전자는 치환되고 MET5 유전자가 통합된다. 최종 균주 (SY281)는 메티오닌 (Met+)을 합성할 수 있고, 우라실-영양요구성이고, FOA에 내성이고 (ura-, FOAR), 각각 양방향성 프로모터 (P LAC4-LAC12 )의 제어 하에서 PRVA-VP2-3HA-opt 의 2개 카피를 발현한다 (도 4).
MATα-배경을 갖는 균주에서 HIS3 의 복원으로 HIS3 유전자좌 상에서 치환
pUC19 기반 벡터 pSY250의 발현 카세트는 항상적 MRM1, P MRM1 , T AgTEF1 , PRVA-VP6-3HA-opt2 (SEQ ID NO: 36), P LAC4-LAC12 , PRVA-VP6-3HA-opt2 (SEQ ID NO: 36), T AgTEF1 , HIS3 프로모터 (P HIS3 ), HIS3, ORF KLMA_50039 (특징규명되지 않음)를 함유한다. 재조합 케이. 마르시아누스 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터는 적절한 제한 효소 (PvuI & PaeI)로 선형화되고 SY281에 형질전환된다. 숙주 게놈의 염색체 HIS3 영역으로 성공적인 상동성 재조합 후에, 노르세오트리신 내성 유전자 (NrsR)는 치환되고 HIS3 유전자가 통합된다. 최종 균주 (SY282)는 히스티딘 (His+)을 합성하고, 노르세오트리신에 민감하고 각각 양방향성 프로모터 (P LAC4-LAC12 )의 제어 하에서 PRVA-VP6-3HA-opt2 의 2개 카피를 발현한다 (도 5).
MATa-배경을 갖는 균주에서 HIS3 대신에 온전한 LEU2 의 통합으로 HIS3 유전자좌 상에서 치환
pUC19 기반 벡터 pSY275의 발현 카세트는 항상적 MRM1, P MRM1 , T AgTEF1 , PRVA-VP7-3HA-opt (SEQ ID NO: 37), P LAC4-LAC12 , PRVA-VP7-3HA-opt (SEQ ID NO: 37), T AgTEF1 , LEU2 프로모터 (P LEU2 ), LEU2, ORF KLMA50039 (특징규명되지 않음)를 함유한다. 재조합 케이. 마르시아누스 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터는 적절한 제한 효소 (BglI & PaeI)로 선형화되고 SY277에 형질전환된다. 숙주 게놈의 염색체 HIS3 영역으로 성공적인 상동성 재조합 후에, 노르세오트리신 내성 유전자 (NrsR)는 치환되고 LEU2 유전자는 통합된다. 최종 균주 (SY278)는 류신 (Leu+)을 합성할 수 있고, 노르세오트리신에 민감하고, 그의 발현이 양방향성 프로모터 (P LAC4-LAC12 ) 중 하나에 의해 제어되는 PRVA-VP7-3HA-opt 의 2개 카피를 발현한다 (도 6).
실시예 6: GAL80 유전자좌의 변형에 의한 면역원성 폴리펩티드 생산의 최적화
P LAC4-LAC12 및 P GAL1-GAL10 의 제어 하에서 이식유전자 발현에 대한 gal80 결실의 효과를 평가하였다. PRVA-유래 면역원성 폴리펩티드 (VP2, VP4, VP6 및/또는 VP7)를 발현하는 상이한 케이. 마르시아누스 균주는 억제인자 단백질 Gal80을 코딩하는 유전자의 결실을 통해서 변형되었다. P LAC4-LAC12 및 P GAL1-GAL10 의존적 면역원성 폴리펩티드 생산에서 gal80 결실의 효과는 웨스턴 블롯팅을 통해서 평가되었다. 야생형 GAL80 을 갖는 상응하는 효모 균주가 기준 균주로서 사용되었다. gal80 결실의 존재 (+) 또는 부재 (-)는 위에 표시된다.
웨스턴 블롯은 약 0.3 ODE 단위의 신선하게 수확된 효모 배양물이 로딩된 4-20% Mini-PROTEAN TGX 착색제 무함유 농도구배 겔 (Bio-Rad, CA)을 사용하여 수행되었다. 로딩 대조군으로서, 겔은 Bio-Rad Chemidoc MP 이미저를 사용하여 45초 동안 UV 노출에 의해서 착색제 무함유 총 단백질 염색을 위해 활성화되었다. 후속하여, 단백질은 Transblot Turbo 장비 (Bio-Rad)를 사용하여 니트로셀룰로스 막 (Bio-Rad)으로 옮겨졌다. 막은 TBST (tween, 0.05 M Tris, pH 7.4, 0.1 M NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20 존재의 Tris-완충 염수 (TBS)) 중 5% (w/v) 탈지유로 1시간 동안 차단한 다음에 항-HA (F-7, sc-7392; 1:3000, Santa Cruz Biotechnology)와 1시간 동안 인큐베이션되었다. 막은 3회 10분 동안 세척한 다음에 염소 항-마우스 홀스래디쉬 퍼옥시다제 항체 (1:3000, Invitrogen)와 1시간 동안 인큐베이션되었다. 막은 다시 TBST로 3회 10분 동안 세척한 다음에 Clarity 화학발광 기질 (Bio-Rad)과 인큐베이션하고, Chemidoc MP 장치에서 이미지화하였다. 밴드 강도는 Imagelab 6.0 소프트웨어 (Biorad)를 통해서 정량하였고, 로딩된 OD 단위를 고려하여 내부 표준 (MalE)을 사용해 계산되었다.
gal80 의 결실은 면역원성 폴리펩티드의 농도에서 상당한 증가를 야기시킨다 (도 9). 효과는 글루코스 함유 배지에서 특히 두드러진다.
실시예 7: 마우스의 면역화 및 혈청학적 검사
전체 효모 백신 (WYV)으로서 재조합 반수체 효모 세포의 면역원성 잠재성을 시험하였다. 실시예 5 및 6에서 수득된 세포는 마우스에서 피하 적용에 사용되었다. WYV 현탁물에 대한 체중 증량 또는 동물 행동에서 이상은 이전의 내성 연구에서 관찰되지 않았다.
도 10은 실시예 5 및 6에서 생성된 케이. 마르시아누스 균주의 열-불활성화된, 전체 효모 세포, 즉, 개별적으로 PRVA VP2, VP4, VP6 또는 VP7을 발현하는 반수체 재조합 케이. 마르시아누스 효모 세포를, 피하로 적용한 마우스에서의 백신접종을 기술한다.
면역화 연구는 돼지 로타바이러스 A의 적용된 항원에 대해 특이적 항체를 유도하는지 여부에 대한 질문을 다루었다.
면역화 실험은 5 개체의 그룹에서 8주령 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River Laboratories)를 사용해 수행되었다. 면역화/부스트 적용마다, 100 μl 현탁액 (생리적 NaCl 용액 중 1.0 내지 5.0 mg 효모 건조 중량 함유)이 마우스 당 주사되었다. 주사 과정 동안, 마우스는 1.5% 이소플루란으로 마취되었다.
면역화는 도 10A에 도시된 일정에 따라서 수행되었다. 초기 주사 후에, 마우스는 2주 간격 (즉, 각각 14일 및 28일)으로 2회 부스트 주사되었다. 마지막 적용 후 2주에, 마우스는 1.5% 이소플루란으로 안락사되었고, 혈액 샘플을 채취하였다. 마우스 혈청 샘플은 간접 IgG ELISA를 사용하여 항-PRVA 특이적 항체 (VP2, VP4, VP6 및 VP7)의 존재에 대해서 검정되었다.
간접 ELISA 어세이
혈청 (쥐, 돼지 등) 중 PRVA-특이적 항체의 검출을 위한 간접 IgG ELISA를 개발하고 평가하였다. 이러한 목적을 위해서, 발현 벡터 pET15b 및 이. 콜라이 균주 Rosetta(DE3)pLysS (Novagen)가 C-말단 6xHIS 에피토프를 갖는 재조합 VP2, VP4, VP6 (각각 105.5 kDa, 88.6 kDa 및 46.6 kDa의 전체 길이 단백질로서 발현) 및 VP7 (33.6 kDa의 aa50D N-말단 절두된 변이체로서 발현)의 발현에 사용되었다. 단백질 발현 및 정제는 하기 기술된 대로 수행되었다.
PRVA 발현 벡터 (pET15b, C-말단 직렬 6xHis)를 보유하는 이. 콜라이 배양물을 ∼2의 OD600 까지 37℃에서 성장시켰다. 단백질 발현은 1.0 mM IPTG를 사용해 유도하였고, 추가로 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 원심분리를 통해서 수확되었다. 박테리아는 용해 완충액 (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 1 mM β-머캅토에탄올, 프로테아제 억제제 정제 (Roche), 1/10(v/v) 리소자임 [10 mg/ml])에 재현탁하였고 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션되었다. 10% Triton X-100의 1/10 부피를 첨가하였고 용해물은 추가 시간 동안 4℃에서 진탕 인큐베이션하였다. 다음으로, DNA 침전을 위해 5% 수성 프로타민술페이트의 1/15 (v/v)을 첨가하였고 20분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 용해물은 원심분리 (15　000 g, 1시간, 4℃)를 통해 청징화시켰고, 상청액을 NiNTA 수지와 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 결합된 단백질을 1회 용해 완충액, 1회 고염 완충액 (50 mM Tris pH 7.8, 1M NaCl, 1, 5% 글리세롤, 1mM mM β-머캅토에탄올), 1회 고 이미다졸 완충액 (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 40 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 1 mM β-머캅토에탄올)으로 세척하였고, 용리 완충액 (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, 1 mM β-머캅토에탄올)으로 최종적으로 용리하였다. 용리 분획은 밤새 저장 완충액 (25 mM Tris pH 7.8, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1 mM β-머캅토에탄올)으로 투석하였다.
폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 (Nunc-Immuno™ MicroWell™ 96웰 고체 플레이트, Sigma-Aldrich)를 100 μl 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)에 희석된, 웰 당 50 ng의 재조합 PRVA 단백질 (최대 부피: 400 μl)로 코팅하였고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 TBST (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween-20, pH 7,5, Thermo Fisher Scientific)로 세척한 다음에 웰 당 200 μl의 차단 완충액 (0,05% Tween 20 존재의 Tris-완충 염수 pH 7.4, Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 차단하고 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 차단 후에, 플레이트를 3회 TBST로 세척하였고, 차단 완충액에 1:250으로 희석된, 혈청 표본의 100 μl 분취액을 웰에 첨가하였다. 이 어세이에 대한 항원 농도 및 혈청 희석 수준은 민감도 및 특이성에 대한 최적 조건에 도달하도록 적정하여 결정되었다 (데이터 미도시). 4℃에서 2시간 인큐베이션 후에, 플레이트는 3회 TBST로 세척되었다. 차단 완충액 중에 1:2500으로 희석된, HRP-접합된 (HRP = 홀스래디쉬 퍼옥시다제) 염소 항-마우스 IgG (Invitrogen)는 100 μl 분취액으로 웰에 첨가되었고, 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션되었다. 플레이트는 상기 기술된 대로 세척하였다. 특이적 항체의 결합은 100 μl/웰의 1-단계™ Ultra TMB-ELISA 기질 용액 (Thermo Fisher Scientific)의 첨가를 통해서 가시화하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 후에, 반응은 50　μL/웰의 1 N 황산을 첨가하여 중지시켰고, 광학 밀도 (OD)는 450 nm (기준 필터 540 nm)에서 측정하였다.
마지막 피하 적용 후 2주에, 마우스 혈청은 이 연구에서 확립된 간접 IgG ELISA를 사용하여서, 각각 항-VP2, -VP4, -VP6 및 -VP7 항체의 존재에 대해 분석되었다. 케이. 마르시아누스 균주 SY41을 발현하는 비-PRVA로 처치된 동물과 비교하여, 모든 백신 균주는 각각 PRVA 특이적 항체 항-VP2, -VP4, -VP6 및 -VP7의 상당히 증가된 수준을 보였다.
PRVA-양성 돼지 혈청은 양성 대조군으로서 제공되었다. 백신접종 전 0 혈청 또는 비-특이적 항체는 음성 대조군으로서 사용되었다. ELISA의 결과는 도 10에 도시된다.
실시예 5 및 6의 재조합 반수체 효모 세포를 사용하여, 모든 4개 이식유전자-발현된 PRVA 항원에 대한 성공적인 면역화를 획득할 수 있었다.
실시예 8: 교배를 통한 PRVA 항원을 발현하는 이배체 재조합 효모 세포의 생성
다수 이식유전자를 포함하는 이배체 재조합 효모 세포는 이전에 생성된 반수체 재조합 효모 세포의 교배를 통해서 수득되었다. 이 실시예에서 사용된 영양요구성 균주는 SY278 (MATa, kat1Δ, ADE2::2xVP4-3HA-opt, met5Δ, his3::LEU2::2xVP7-3HA-opt, leu2Δ, gal80, ura3) 및 SY282 (MATα, kat1Δ, a3Δ, ade2::MET5::2xVP2-3HA-opt, met5Δ, HIS33::2xVP6-3HA-opt, leu2Δ, gal80) (도 7 및 8)로서, 성장을 위해서, 각각 메티오닌, 히스티딘 및 우라실 또는 아데닌 및 류신의 보충을 필요로 한다.
원칙적으로, 표 3 및 4로부터 선택된 염색체 유전자좌에서 게놈 통합으로부터 생성된 영양요구성 균주의 임의의 2개 상보적 세트는 이배체 균주의 구성 및 유지에 사용될 수 있었다. 이 실시예에서 사용되는 반수체 재조합 효모 세포는 2개 이유때문에 이 방법에서 특히 적합하다. 첫째로, 그들은 그들 교배 또는 융합의 결과로 이배체 균주에 비해서 더 느리게 성장한다. 따라서, 소수의 반수체 세포가 감수분열 또는 다른 기전을 통해서 발생하는 경우에, 이배체 균주는 배양에서 그들을 능가할 것이다. 둘째로, 모든 영양요구성 마커 (LEU, MET, HIS, ADE, URA)를 함유하는 플레이트 대 임의의 이들 보충물없는 플레이트 상에 배양물을 스트리킹하여서 배수성 상태를 모니터링하는 것이 용이하다. 양쪽 플레이트 유형을 비교하는 상이한 개수의 콜로니는 배양에 존재하는 반수체의 백분율 계산을 허용한다.
이배체 균주는 반수체 균주의 교배에 이어서, 임의의 아미노산 또는 염기없는 플레이트 상에서 선택을 통해서 구성되었다. 양쪽 발현 카세트가 ADE2 및HIS3 유전자좌에 통합되었으므로, 이배체 포자형성으로 생성된 반수체 자손은 상동 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된 4개 발현 카세트 중 2개만을 함유할 수 있었다. 결론적으로, 모든 5개 자가영양성 유전자 (ADE2, MET5, HIS3, LEU2, URA3)를 포함하는 이배체 세포만이 대사산물 보충물없이 성장할 수 있었고, 모든 면역원성 폴리펩티드, PRVA-VP2, -VP4, VP6 및 VP7을 동시에 발현할 수 있었다.
(Kutyna, Dariusz R.; Cordente, Antonio G.; Varela, Cristian (2014), Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1152, S. 157-168)의 기술에 따른 반수체 부모 균주의 교배를 위한 일반 절차:
a) YPD 플레이트 또는 냉동 스톡으로부터 2개 반수체 균주를 YPD 배지 (5 mL)에 접종하고 밤새 30℃에서 진탕 (120 rpm) 인큐베이션하는 단계.
b) 100 μL의 각 (반수체) 배양물을 동일한 멸균 1.5-2.0 mL 미세원심분리 튜브에 옮기고 와류 또는 피펫팅을 통해서 완전하게 혼합하는 단계.
c) 혼합된 배양물을 신선한 선택적 SD 플레이트에 옮기고, 공기-건조하고, 30℃에서 인큐베이션하는 단계. 이러한 인큐베이션 기간 동안, 반대 교배형의 세포를 융합시켜서 이배체를 생성시킨다.
d) 단일 콜로니를 선택하고, 교배 혼합물의 몇개 연속 희석물을 선택적 SD 플레이트에 도말하고 단일 콜로니가 완전하게 발생될 때까지 30℃에서 인큐베이션하는 단계.
e) 교배형 PCR 프라이머를 사용하여 세포의 배수성 검증 단계.
이배체의 형성은 MAT 유전자좌 (각각 MATa 및 MATα)를 비롯하여, ADE2 및 HIS3 유전자좌에 통합된 4개 항원성 서열에 특이적인 프라이머 세트를 사용한 콜로니 PCR (cPCR)을 통해서 확인하였다 (도 11). 프라이머 서열은 표 6에 열거된다. 안정한 이배체 개체군은 균주 SYD4에서 관찰되었다.
표 6: PCR-기반 배수성 분석에 사용되는 프라이머.
이배체 균주는 웨스턴 블롯 분석을 통해서 성장 및 항원 발현에 대해 조사되었다. 웨스턴 블롯은 상기 기술된 바와 같이 수행되었다.
성장 거동 및 재조합 단백질 발현 패턴은 VP2, VP4, VP6 및 VP7 발현 반수체 케이. 마르시아누스 균주 및 그들 동종동계 이배체 대응물 간에 비교되었다. 이배체 케이. 마르시아누스는 이의 반수체 대응물과 비교하여 더 높은 단백질 생산을 제공한다 (도 12). 그러므로, 재조합 단백질 발현 (예컨대 면역원성 폴리펩티드)을 위한 숙주로서 이배체 균주의 사용은 건조 효모 중량 또는 배양 부피 당 재조합 단백질의 수율을 증가시킨다.
이배체 재조합 효모 균주 안정성 분석: 개체군 중 이배체 세포의 백분율은 선택적 배지 상에 도말하고 48시간의 배양 (진탕 플라스크 배양)을 후속하여 결정하였다. 수백개 콜로니를 콜로니 PCR을 통해서 분석하여서, 선택 배지 상에서 성장하는 콜로니의 98% 초과가 이배체인 것을 밝혀주었다 (데이터 미도시). 대조군으로서, leu- 및 ade- 또는 met- 및 his- 영양요구성을 보유하는 부모 반수체 균주는 모든 4개 영양분 (각각 아미노산 또는 뉴클레오염기)이 누락된 선택 플레이트 상에서 어떠한 콜로니도 형성하지 않았다. 그러므로, 발효 동안 간헐적 포자형성 사건에도 불구하고, 대부분의 효모 개체군은 이배체 상태로 유지되었다는 것을 관찰하였다.
실시예 9: 교배에 의한 ASFV 항원을 발현하는 이배체 재조합 효모 세포의 생성
각각이 3HA 에피토프 태그를 갖는, 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV) 단백질 p12, p32, p62 및 p72를 발현하는 추가의 이배체 재조합 효모 균주는 하기와 같이 생성되었다.
코돈 최적화된 유전자 O61R (단백질 p12를 코딩); CP204L (p32를 코딩); CP530R (p62를 코딩) 및 B646L (p72를 코딩)의 전체 길이 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 ASFV 단리주 조지아/2007 (GeneBank: FR682468.1)를 기반으로 합성되었고, 통상의 플라스미드 벡터 pUC19 (GENESCRIPT)에 클로닝되었다. 합성 유전자 서열의 확인은 시퀀싱을 통해서 수행되었다.
숙주 게놈으로 항원성 유전자 발현을 허용하는 통합 벡터는 상기 기술된 바와 같은 인-퓨젼 클로닝 방법을 사용해 생성되었다 (실시예 4).
재조합 균주의 생성을 위해서, pUC19-기반 벡터 (pSY123, pSY131, pSY278, pSY279)는 적절한 제한 효소로 선형화시켰고, 단계적으로 반수체 케이. 마르시아누스 균주 (MATa 또는 MATα)에 형질전환되었다. 숙주 게놈으로 통합은 염색체 LAC4-LAC12, ADE2, LEU2 영역 (SY255, MATα) 또는 LAC4-LAC12, ADE2, HIS3 영역 (SY262, MATa)으로 상동성 재조합을 통해서 발생되었다 (표 7, 도 13). 각각의 최종 균주는 ASFV 유전자의 6개 카피를 발현하고, 이의 발현은 양방향성 프로모터 (P LAC4-LAC12 또는 P GAP1-ADH2 ) 중 하나에 의해 제어된다. 재조합 유전자의 무결성 및 올바른 통합은 PCR, 서던 블롯을 비롯하여 웨스턴 블롯 분석을 통해서 확인하였다.
표 7: 이 실시예에서 사용되는 반수체 및 이배체 재조합 효모 세포
면역원성 폴리펩티드 생산의 최적화는 GAL80 유전자좌의 결실을 통해서 획득되었다.
다수 이식유전자를 포함하는 이배체 재조합 효모 세포 SYD2는 이전에 생성된 반수체 재조합 효모 세포의 교배에 이어서 임의의 아미노산 또는 염기없는 플레이트 상에서 선택, 즉 자가영양성 균주에 대한 선택을 통해서 수득되었다. 이배체의 확인은 MAT 유전자좌 (각각 MATa 및 MATα)를 비롯하여, LAC4-LAC12, ADE2, LEU2 및 HIS3 유전자좌에서 통합된 4개 항원성 서열에 특이적인 프라이머 세트를 사용한 콜로니 PCR (cPCR)에 의해 수행되었다. 안정한 이배체 개체군은 균주 SYD2에서 관찰되었다. 후속하여, 반수체 균주 (SY255, SY262) 및 교배를 통해 수득된 그들 동종동계 이배체 균주 SYD2 간 성장 및 재조합 단백질 생산의 비교를 결정하였다 (도 13).
실시예 10: 4개 PRVA 항원 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 발현하는 케이. 마르시아누스 균주로 마우스의 면역화
이 실시예에서 면역화에 사용된 케이. 마르시아누스 균주는 실시예 5 및 6에 기술된 일반 절차에 따라서 생산되었다.
표 8: 이 실시예에서 사용되는 재조합 효모 세포
VP7Δ50 은 전체 길이 VP7의 50개 아미노산 N-말단 절두형 변이체로서, 소포체 및 막 앵커에 대한 이의 유입 신호 펩티드가 결여되어 있다. 결과적으로, 단백질은 시토졸에 제한된다.
8주령 암컷 BALB/c 마우스는 SY320 (VP2, VP4, VP6 및 VP7)을 사용하여 0일, 14일 및 28일에 2 mg 효모 건조 중량으로 3회 피하로 백신접종되었다 (도 16 A). 대조군 동물은 항원없는 야생형 균주 SY41을 받았다. 혈청은 혈청전환을 측정하기 위해 각 백신접종 후 14일에 수집되었다.
마우스 혈청은 VP2 및 VP6 (혈청 1:500 희석) (도 16 B) 및 VP4 및 VP7 (혈청 1:100 희석) (도 16 C)에 대한 PRVA-항원-특이적 항체의 존재에 대해서 IgG ELISA 어세이를 통해 분석되었다. 개별 점은 450 nm에서 개별 흡광도를 나타낸다. 데이터는 5마리 마우스의 평균 SEM 값 및 유사한 결과의 적어도 2회 독립 실험을 대표한다. ELISA에 대한 양성 대조군은 PRVA 감염된 돼지의 혈청이었고, 음성 대조군으로서 백신접종 전 0 혈청 (neg. 1) 또는 비-특이적 항체 (neg. 2)가 사용되었다 (데이터 미도시).
중화 항체 반응은 Kang 등에 따라서 마지막 백신접종 후에 2주에 측정되었다 (도 16 D).
ELISA 및 SNT를 통해 입증한 바와 같이 4개 PRVA 항원을 공-발현하는 균주의 재조합 반수체 효모 세포에 의한 면역화는 PRVA에 대한 보호 중화 항체를 유도하였다.
실시예 11: PPV-VP2 항원을 발현하는 케이. 마르시아누스 균주에 의한 마우스의 면역화
이 실시예에서 면역화에 사용되는 케이. 마르시아누스 균주는 실시예 5 및 6에 기술된 일반 절차에 따라서 생산되었다.
표 9. 이 실시예에서 사용되는 반수체 및 이배체 재조합 효모 세포
8주령 암컷 BALB/c 마우스의 그룹 (n = 5)은 각각 SY61-반수체 또는 이배체 균주 (각각 2 mg 효모 건조 중량)의 단일 주사로 피하로 면역화되었다 (도 17 A). 대조군 동물은 항원없는 야생형 균주 SY41을 받았다 (n = 3). 면역화 후 2주에 혈청을 수집하였고 간접 ELISA를 통해서 PPV-VP2-특이적 IgG 항체에 대해 분석하였다 (도 17 B).
NADL-2 균주 (NP_757372.1)의 코돈-최적화된 VP2 변이체의 2개 카피를 각각 발현하는 케이. 마르시아누스의 반수체 또는 이배체 세포로 면역화된 마우스는 비슷한 면역 반응을 촉발하였다.
8주령 암컷 BALB/c 마우스의 그룹 (n = 5)은 각각 SY135 (PPV-VP2의 2개 카피를 발현) 또는 상업적 백신 Porciles®Parvo (MSD, Tiergesundheit)를 사용하여, 0일, 14일 및 28일에 2 mg 효모 건조 중량으로 3회 피하로 면역화되었다 (도 17 C). 대조군 동물은 항원없는 야생형 균주 SY41을 받았다 (n = 3). 혈청은 혈청전환을 측정하기 위해 각 백신접종 후 14일에 수집되었다. PPV-VP2-특이적 IgG 항체 적정가는 간접 ELISA를 통해 결정되었다 (도 17 D). 데이터는 적어도 2회 독립 실험의 한 대표적인 결과이다. 비교는 스튜던트 t-검정 (독립, 양측)을 통해서 수행되었다.
14일, 28일 및 42일에, PPV-VP2 유전자의 2개 카피를 발현하는 케이. 마르시아누스 균주 SY135로 면역화된 마우스에서 PPV-VP2-특이적 IgG의 평균 적정가는 상업적 백신 Porciles®Parvo (MSD, Tiergesundheit)으로 면역화된 마우스에서 관찰된 것에 비해서 유의하게 더 높았다.
실시예 12: AHSV VP2 항원을 발현하는 케이. 마르시아누스 균주에 의한 마우스의 면역화
이 실시예에서 면역화에 사용되는 케이. 마르시아누스 균주는 실시예 5 및 6에 기술된 일반 절차에 따라서 생산되었다.
표 10: 이 실시예에서 사용되는 재조합 효모 세포
이 실시예에서, 혈청형 4의 재조합 VP2 단백질 (케이. 마르시아누스에 대해 코돈-최적화됨)은 케이. 마르시아누스 발현 시스템 (PRVA에 대해 기술된 바와 같음)을 통해서 개별적으로 발현되었고, 면역원성은 단일 VP2에 의한 마우스의 면역화를 통해 연구되었다. 50% 플라크 감소 어세이를 통해서 측정된 상동성 중화 항체는 VP2 단백질에 대해서 10 내지 20의 적정가 정도를 보였다.
결과는 AHSV VP2 서브유닛 백신이 개별적으로 또는 다수-혈청형 칵테일에서 면역 반응을 높이는데 효율적이라는 것을 의미한다.
8주령 암컷 BALB/c 마우스는 효모 균주 SY338 (AHSV-혈청형 4 VP2의 2개 카피를 발현)을 사용하여 0일, 14일 및 28일에 2 mg 효모 건조 중량으로 3회 피하로 백신접종되었다 (도 18 A). 대조군 동물은 항원없는 야생형 균주 SY41을 받았다.
실험의 종료 시, 42일에 수집된 마우스 혈청은 표준 중화 어세이를 기반으로 바이러스의 100 TCID (Tissue Culture Infection Dose)의 존재 하에서 플라크 감소에 의해 중화 항체에 대해 조사되었다 (도 18 B). 중화 적정가는 플라크의 수가 혈청-무함유 대조군과 비교하여 50% 감소를 나타낸, 최대 희석의 역수값으로 계산되었다. 중화 시험은 이중으로 수행되었다.
본 발명의 항목
본 명세서에서 제공하는 개시의 관점에서, 본 발명은 또한 하기 항목을 포괄한다는 것을 이해할 것이다.
1. 적어도 하나의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하는 재조합 효모 세포로서, 각각의 발현 카세트는
(i) 양방향성 프로모터 구성요소;
(ii) 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자로서, 상기 제1 및 제2 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 반대 말단에 위치되고, 각각의 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 한 측면에 작동적으로 연결되는 것인 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자;
(iii) 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자로서, 상기 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자의 바로 하류에 위치되고, 상기 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자의 바로 하류에 위치되며, 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자에 작동적으로 연결되고 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자에 작동적으로 연결되는 것인 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자; 및
(iv) 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다.
2. 항목 1에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 적어도 2개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 임의로 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함한다.
3. 항목 1 내지 2 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 각각의 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 단편을 코딩한다.
4. 항목 3에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 병원체는 바이러스 병원체이다.
5. 항목 4에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 바이러스 병원체는 다층 캡시드 및 하나 이상의 스파이크 단백질을 갖는 바이러스 병원체이다.
6. 항목 4에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 바이러스 병원체는 레오비리다에 과에 속한다.
7. 항목 6에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 바이러스 병원체는 로타바이러스, 바람직하게 돼지 로타바이러스 A (PRVA) 또는 돼지 로타바이러스 C (PRVC), 보다 바람직하게 돼지 로타바이러스 A (PRVA)이다.
8. 항목 6에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 바이러스 병원체는 오르비바이러스, 바람직하게 아프리카 말병 바이러스 (AHSV) 또는 청설병 바이러스 (BTV)이다.
9. 항목 4에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 바이러스 병원체는 파보비리다에의 과에 속하고, 바람직하게 바이러스 병원체는 프로토파보바이러스, 보다 바람직하게 돼지 파보바이러스 (PPV), 보다 더 바람직하게 돼지 파보바이러스 1 (PPV1) 또는 PPV2이다.
10. 항목 9에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 파보바이러스 (예를 들어, PPV1) VP1, VP2, NS1 및 NS2 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하고, 바람직하게 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 파보바이러스 (예를 들어, PPV1) VP2 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 면역원성 단편을 포함한다.
11. 항목 3 내지 7 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 돼지 로타바이러스 A (PRVA) VP2, VP4, VP6, VP7, NSP2 및 NSP4, 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함한다.
12. 항목 11에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 각각의 면역원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 (PRVA VP2), SEQ ID NO: 2 (PRVA VP4), SEQ ID NO: 3 (PRVA VP6), SEQ ID NO: 4 (PRVA VP7), SEQ ID NO: 5 (PRVA NSP2) 및 SEQ ID NO: 6 (PRVA NSP4), 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 및 4로 기재된 아미노산 서열, 및 하나 이상의 이의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아미노산 서열을 포함한다.
13. 항목 4에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 바이러스 병원체는 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV)이다.
14. 항목 4 내지 13 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 상기 면역원성 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드는 재조합 효모 세포 내에서 바이러스-유사 입자 (VLP)로 조립될 수 있다.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각 발현 카세트 내에서 동일하다.
16. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 발현 카세트 내에서 상이하다.
17. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는 적어도
a) 2개의 상이한 이식유전자;
b) 3개의 상이한 이식유전자;
c) 4개의 상이한 이식유전자;
d) 5개의 상이한 이식유전자;
e) 6개의 상이한 이식유전자;
f) 7개의 상이한 이식유전자;
g) 8개의 상이한 이식유전자
h) 9개의 상이한 이식유전자; 또는
i) 10개의 상이한 이식유전자를 포함한다.
18. 항목 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는
a) 각각의 이식유전자의 1개 카피;
b) 각각의 이식유전자의 2개 카피;
c) 각각의 이식유전자의 3개 카피;
d) 각각의 이식유전자의 4개 카피;
e) 각각의 이식유전자의 5개 카피;
f) 각각의 이식유전자의 6개 카피;
g) 각각의 이식유전자의 7개 카피; 또는
h) 각각의 이식유전자의 8개 카피를 포함한다.
19. 항목 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는
a) 각각의 이식유전자의 적어도 2개 카피;
b) 각각의 이식유전자의 적어도 3개 카피;
c) 각각의 이식유전자의 적어도 4개 카피;
d) 각각의 이식유전자의 적어도 5개 카피;
e) 각각의 이식유전자의 적어도 6개 카피;
f) 각각의 이식유전자의 적어도 7개 카피; 또는
g) 각각의 이식유전자의 적어도 8개 카피를 포함한다.
20. 항목 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는 적어도 2개의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 각각의 발현 카세트의 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 추가의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자와 상이하다.
21. 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 양방향성 프로모터 구성요소는 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소이다.
22. 항목 21에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 LAC4-LAC12 프로모터, GAL1-GAL10 프로모터, 및 GAP1-ADH2 프로모터로 이루어진 군으로부터, 바람직하게 케이. 마르시아누스 LAC4-LAC12 프로모터, 케이. 마르시아누스 GAL1-GAL10 프로모터, 및 케이. 마르시아누스 GAP1-ADH2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
23. 항목 21에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소는 SEQ ID NO: 25 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
24. 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 양방향성 프로모터 구성요소는 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소이다.
25. 항목 24에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 TDH3/ADH1 프로모터, GAL1/GAL10-GPD 프로모터, 및 TEF1/PGK1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
26. 항목 24에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소는 SEQ ID NO: 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
27. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자의 유사한 발현 수준을 가능하게 한다.
28. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자의 상이한 발현 수준을 가능하게 한다.
29. 항목 1 내지 28 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 및/또는 제2 이식유전자의 유도성 또는 억제성 발현을 가능하게 한다.
30. 항목 1 내지 28 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 및/또는 제2 이식유전자의 항상성 발현을 가능하게 한다.
31. 항목 1 내지 30 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 각각의 발현 카세트는 ADE1, ADE2, ADE8, ECM31, HIS2, HIS3, HIS5, LEU1, LEU2, LYS2, LYS5, MET5, MET17, TRP1, TRP3, TRP4, TRP5, TYR1, URA3, URA5, FCY1, GAP1, LAC4 + LAC12, XYL1 및 XYL2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다.
32. 항목 31에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 각각의 발현 카세트는 ADE2, LEU2, MET5 및 HIS3 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다.
33. 항목 1 내지 32 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 선택 마커는 내성 마커 또는 물질대사 선택 마커, 바람직하게 물질대사 선택 마커이다.
34. 항목 1 내지 33 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 제1 및 제2 전사 종결자는 각각이 아시비아 고시피 유래 TEF1 종결자 (SEQ ID NO: 29), 케이. 마르시아누스 유래 HIS5 종결자 (SEQ ID NO: 30), 케이. 마르시아누스 유래 CPS1 종결자 (SEQ ID NO: 31), 에스. 세레비지아에 유래 CYC1 종결자 (SEQ ID NO: 32), 및 에스. 세레비지아에 유래 ADH1 종결자 (SEQ ID NO: 33)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
35. 항목 1 내지 34 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는 안도지마 (Andozyma), 아스코보트리오지마 (Ascobotryozyma), 시테로마이세스 (Citeromyces), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 덱케라 (Dekkera), 에레모테시움 (Eremothecium), 이사트켄키아 (lssatchenkia), 카자크스타니아 (Kazachstania), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 코다마에아 (Kodamaea), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 파키솔렌 (Pachysolen), 피키아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 사투르니스포라 (Saturnispora), 테트라피시스포라 (Tetrapisispora), 토룰라스포라 (Torulaspora), 윌리옵시스 (Williopsis) 및 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속으로부터 유래된다.
36. 항목 1 내지 35 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는 크랩트리-음성 효모 종으로부터 유래된다.
37. 항목 35 또는 36 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는 클루이베로마이세스 효모 속으로부터 유래된다.
38. 항목 37에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는 클루이베로마이세스 마르시아누스 효모 종으로부터 유래된다.
39. 항목 38에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 재조합 효모 세포는 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주 NBRC1777로부터 유래된다.
40. 항목 1 내지 39 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 효모 세포는 반수체이다.
41. 항목 40에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 효모 세포는 헤테로탈릭이다.
42. 항목 41에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 효모 세포는 MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 또는 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이, 바람직하게 KAT1 유전자 또는 ALPHA3 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함한다.
43. 항목 41에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 효모 세포는 MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 및 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이, 바람직하게 KAT1 유전자 및 the ALPHA3 유전자를 비기능성이게 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함한다.
44. 항목 42 또는 43 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 결실 및/또는 돌연변이를 포함하는 유전자 또는 유전자들은 각각이 추가 선택 마커, 바람직하게 내성 마커와 연결된다.
45. 항목 40 내지 44 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 효모 세포는 교배 적격이다.
46. 항목 1 내지 39 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포에 있어서, 효모 세포는 이배체 또는 사배체이다.
47. 항목 40 내지 45 중 어느 하나에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득된 이배체 재조합 효모 세포.
48. 항목 47에 따른 이배체 재조합 효모 세포에 있어서, 상동 염색체에 위치된 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된 적어도 2개 선택 마커를 포함하고, 바람직하게 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 영양요구성이고, 이배체 재조합 효모 세포는 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포가 감소된 성장 또는 증식을 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않는 선택 조건 하에서 성장될 수 있다.
49. 항목 47 또는 48 중 어느 하나에 따른 이배체 재조합 효모 세포에 있어서, 각각의 발현 카세트의 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자는 각각의 추가의 발현 카세트의 제1 및 제2 이식유전자와 상이하다.
50. 항목 47 내지 49 중 어느 하나에 따른 이배체 재조합 효모 세포에 있어서, 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포는 각각이 동일한 개수의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포에서 동일한 염색체 유전자좌에서 게놈 통합된다.
51. 항목 1 내지 50 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 재조합 효모 세포를 포함하는 백신 조성물.
52. 감염성 질환에 대해서 대상체를 백신접종하는데 사용을 위한, 항목 1 내지 50 중 어느 하나에 따른 재조합 효모 세포, 또는 항목 51에 따른 백신 조성물.
53. 항목 52에 따라서 사용을 위한 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 있어서, 대상체는 포유동물, 바람직하게 돼지이다.
54. 항목 52에 따라서 사용을 위한 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 있어서, 대상체는 말과의 아과에 속하고, 바람직하게 대상체는 말, 얼룩말, 또는 당나귀이다.
55. 항목 52 또는 53 중 어느 하나에 따라서 사용을 위한 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 있어서, 감염성 질환은 바람직하게 돼지 로타바이러스 A 또는 돼지 로타바이러스 C로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 질환이고, 보다 바람직하게 감염성 질환은 돼지 로타바이러스 A이다.
56. 항목 52 또는 53 중 어느 하나에 따라서 사용을 위한 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 있어서, 감염성 질환은 돼지 파보바이러스, 보다 바람직하게 돼지 파보바이러스 1에 의한 감염이다.
57. 항목 52 또는 53 중 어느 하나에 따라서 사용을 위한 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 있어서, 감염성 질환은 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV)에 의한 감염이다.
58. 항목 52 또는 54 중 어느 하나에 따라서 사용을 위한 재조합 효모 세포 또는 백신 조성물에 있어서, 감염성 질환은 아프리카 말병 바이러스, 바람직하게 아프리카 말병 바이러스 혈청형 4에 의한 감염이다.
59. 항목 47에 따른 적어도 하나의 이배체 재조합 효모 세포를 포함하는 전체 효모 백신의 제조를 위한 방법으로서, 방법은
제1 및 제2 반수체 효모 세포의 교배에 의한 이배체 재조합 효모 세포의 생성 단계를 포함하고;
제1 효모 세포는 교배형 MATa 이고, 제1 발현 카세트를 포함하고, 제2 효모 세포는 교배형 MATα이고, 제2 발현 카세트를 포함하고, 제1 및 제2 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈으로 안정하게 통합되고, 제1 및 제2 효모 세포는 반수체, 헤테로탈릭 및 교배 적격이고;
각각의 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드를 코딩한다.
60. 항목 59에 따른 전체 효모 백신의 제조를 위한 방법으로서, 교배형 MATa의 제1 효모 세포는 제3 발현 카세트를 포함하고, 교배형 MATα의 제2 효모 세포는 제4 발현 카세트를 포함하고, 제3 및 제4 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈으로 안정하게 통합되고;
임의로 교배형 MATa의 제1 효모 세포는 제5 발현 카세트를 더 포함하고, 교배형 MATα의 제2 효모 세포는 제6 발현 카세트를 더 포함하고, 제5 및 제6 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈으로 안정하게 통합되고;
또한 임의로 교배형 MATa의 제1 효모 세포는 제7 발현 카세트를 더 포함하고, 교배형 MATα의 제2 효모 세포는 제8 발현 카세트를 더 포함하고, 제7 및 제8 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈으로 안정하게 통합된다.
61. 야생형 효모 균주로부터 항목 47에 따른 이배체 재조합 효모 세포의 제조를 위한 방법으로서,
(a) 제1 및 제2 효모 세포가 각각 헤테로탈릭, 동종동계 및 교배 적격이도록, 야생형 효모 균주로부터 교배형 MATa의 제1 효모 세포 및 교배형 MATα의 제2 효모 세포의 생성 단계;
(b) 적어도 하나의 결실 카세트로 제1 및 제2 효모 세포의 각각을 형질전환시켜서, 적어도 하나의 결실 카세트가 제1 및 제2 효모 세포에서 동일한 염색체 유전자좌에서 숙주 세포 게놈에 안정하게 통합되어서, 효모 세포 게놈으로 안정한 통합이 필수 화합물의 합성에 필요한 유전자의 파괴를 일으키고, 바람직하게 필수 화합물은 비타민, 아미노산, 뉴클레오시드, 뉴클레오염기 또는 이의 하나 이상의 물질대사 전구체인 단계;
(c) 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 핵산 분자로 단계 (b)에서 수득된 제1 및 제2 효모 세포의 각각을 형질전환시켜서, 적어도 하나의 발현 카세트는 단계 (b)의 결실 카세트를 포함하는 염색체 유전자좌에서 효모 세포 게놈으로 안정하게 통합되어서, 단계 (b)의 필수 화합물을 합성하는 제1 및 제2 효모 세포의 능력이 복원되는 것인 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득된 제1 및 제2 반수체 효모 세포의 교배 또는 스페로플라스트 융합에 의해 이배체 효모 세포를 생성시키는 단계를 포함하고;
야생형 효모 균주는 유전적 선택 마커를 포함하지 않고, 각각의 결실 카세트는 적어도 하나의 마커 유전자, 바람직하게 영양요구성 마커 유전자; 및 임의로 마커 유전자에 측접된 loxP 부위를 포함하고, 각각의 발현 카세트는
(i) 양방향성 프로모터 구성요소;
(ii) 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자로서, 상기 제1 및 제2 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 반대 말단에 위치되고, 각각의 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 한 측면에 작동적으로 연결되는 것인 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자;
(iii) 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자로서, 상기 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자의 바로 하류에 위치되고, 상기 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자의 바로 하류에 위치되고, 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자에 작동적으로 연결되고, 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자에 연결되는 것인 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자; 및
(iv) 적어도 하나의 선택 마커; 및
(v) 단계 (b)의 필수 화합물의 합성에 필요한 유전자의 복원을 위한 서열을 포함한다.
62. 항목 61에 따른 방법에 있어서, 야생형 효모 균주는 안도지마 (Andozyma), 아스코보트리오지마 (Ascobotryozyma), 시테로마이세스 (Citeromyces), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 덱케라 (Dekkera), 에레모테시움 (Eremothecium), 이사트켄키아 (lssatchenkia), 카자크스타니아 (Kazachstania), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 코다마에아 (Kodamaea), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 파키솔렌 (Pachysolen), 피키아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 사투르니스포라 (Saturnispora), 테트라피시스포라 (Tetrapisispora), 토룰라스포라 (Torulaspora), 윌리옵시스 (Williopsis) 및 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속으로부터 유래된다.
63. 항목 62에 따른 방법에 있어서, 야생형 효모 균주는 클루이베로마이세스 효모 속으로부터 유래된다.
64. 항목 63에 따른 방법에 있어서, 야생형 효모 균주는 클루이베로마이세스 마르시아누스 효모 종으로부터 유래된다.
65. 항목 64에 따른 방법에 있어서, 야생형 효모 균주는 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주 NBRC1777이다.
<110> SerYmun Yeast GmbH <120> YEAST PLATFORM FOR THE PRODUCTION OF VACCINES <130> SER24286EP <160> 50 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 890 <212> PRT <213> Reoviridae <400> 1 Met Ala Tyr Arg Lys Arg Gly Ala Lys Arg Glu Asn Ser Ser Gln Gln 1 5 10 15 Asn Glu Arg Leu Gln Glu Lys Glu Val Glu Lys Asn Ile Asp Ala Ser 20 25 30 Met Glu Asn Lys Ala Asn Asn Lys Lys Gln Gln Leu Pro Asp Lys Val 35 40 45 Leu Ser Gln Lys Glu Glu Ile Ile Thr Asp Ala Gln Asp Asp Val Lys 50 55 60 Ile Thr Asp Glu Val Lys Lys Ser Ser Lys Glu Glu Ser Lys Gln Leu 65 70 75 80 Leu Glu Ile Leu Lys Thr Lys Glu Asp His Gln Lys Glu Ile Gln Tyr 85 90 95 Glu Ile Leu Gln Lys Thr Ile Pro Thr Phe Glu Pro Lys Glu Ser Ile 100 105 110 Leu Lys Lys Leu Glu Asp Ile Lys Pro Glu Gln Ala Lys Lys Gln Thr 115 120 125 Lys Leu Phe Arg Ile Phe Glu Pro Arg Gln Leu Pro Ile Tyr Arg Ala 130 135 140 Asn Gly Glu Arg Glu Leu Arg Asn Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Arg 145 150 155 160 Asp Thr Leu Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Glu Tyr Phe Leu Asn 165 170 175 Leu Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys 180 185 190 Asp Met Ala Val Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lys Val Val 195 200 205 Asp Ser Glu Thr Ala Ser Ile Cys Asp Ala Ile Phe Gln Asp Glu Glu 210 215 220 Thr Glu Gly Val Ile Arg Arg Phe Ile Ala Asp Met Arg Gln Gln Val 225 230 235 240 Gln Ala Asp Arg Asn Val Val Asn Tyr Pro Ser Ile Leu His Pro Ile 245 250 255 Asp His Ala Phe Asn Glu Tyr Phe Leu Asn His Gln Leu Val Glu Pro 260 265 270 Leu Asn Asn Glu Ile Ile Phe Asn Tyr Ile Pro Glu Arg Ile Arg Asn 275 280 285 Asp Val Asn Tyr Ile Leu Asn Met Asp Met Asn Leu Pro Ser Thr Ala 290 295 300 Arg Tyr Ile Arg Pro Asn Leu Leu Gln Asp Arg Leu Asn Leu His Asp 305 310 315 320 Asn Phe Glu Ser Leu Trp Asp Thr Ile Thr Thr Ser Asn Tyr Ile Leu 325 330 335 Ala Arg Ser Val Val Pro Asp Leu Lys Glu Lys Glu Leu Val Ser Thr 340 345 350 Glu Ala Gln Ile Gln Lys Met Ser Gln Asp Leu Gln Leu Glu Ala Leu 355 360 365 Thr Ile Gln Ser Glu Thr Gln Phe Leu Ala Gly Ile Asn Ser Gln Ala 370 375 380 Ala Asn Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Ala Ala Met Leu Ser Gln Arg 385 390 395 400 Thr Met Ser Leu Glu Phe Val Thr Thr Asn Tyr Met Ser Leu Ile Ser 405 410 415 Gly Met Trp Leu Leu Thr Val Ile Pro Asn Asp Met Phe Leu Arg Glu 420 425 430 Ser Leu Val Ala Cys Glu Leu Ala Ile Ile Asn Thr Ile Val Tyr Pro 435 440 445 Ala Phe Gly Met Gln Arg Met His Tyr Arg Asn Gly Asp Pro Gln Thr 450 455 460 Pro Phe Gln Ile Ala Glu Gln Gln Ile Gln Asn Phe Gln Val Ala Asn 465 470 475 480 Trp Leu His Phe Ile Asn Asn Asn Arg Phe Arg Gln Val Val Ile Asp 485 490 495 Gly Val Leu Asn Gln Thr Leu Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly Gln Val 500 505 510 Ile Asn Gln Leu Met Glu Ala Leu Met Gln Leu Ser Arg Gln Gln Phe 515 520 525 Pro Thr Met Pro Val Asp Tyr Lys Arg Ser Ile Gln Arg Gly Ile Leu 530 535 540 Leu Leu Ser Asn Arg Leu Gly Gln Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Leu 545 550 555 560 Ser Tyr Asn Tyr Glu Thr Leu Met Ala Cys Ile Thr Met Asn Met Gln 565 570 575 His Val Gln Thr Leu Thr Thr Glu Lys Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr 580 585 590 Ser Leu Cys Met Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Ile Pro Ser Pro Gln 595 600 605 Thr Leu Phe His Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Phe His Ser Asn Tyr 610 615 620 Asn Glu Arg Ile Asn Asp Ala Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Asn Arg 625 630 635 640 Leu Asn Leu Tyr Gln Lys Lys Met Lys Ser Ile Val Glu Glu Phe Leu 645 650 655 Lys Arg Leu Gln Ile Phe Asp Val Pro Arg Val Pro Asp Asp Gln Met 660 665 670 Tyr Arg Leu Arg Asp Arg Leu Arg Leu Leu Pro Val Glu Arg Arg Arg 675 680 685 Leu Asp Ile Phe Asn Leu Ile Leu Met Asn Met Glu Gln Ile Glu Arg 690 695 700 Ala Ser Asp Lys Ile Ala Gln Gly Val Ile Ile Ala Tyr Arg Asp Met 705 710 715 720 Gln Leu Glu Arg Asp Glu Met Tyr Gly Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asn 725 730 735 Leu Asp Gly Tyr Gln Gln Ile Asn Leu Glu Glu Leu Met Arg Thr Gly 740 745 750 Asp Tyr Gly Gln Ile Thr Asn Met Leu Leu Asn Asn Gln Pro Val Ala 755 760 765 Leu Val Gly Ala Leu Pro Phe Val Thr Asp Ser Ser Val Ile Ser Leu 770 775 780 Ile Ala Lys Leu Asp Ala Thr Val Phe Ala Gln Ile Val Lys Leu Arg 785 790 795 800 Lys Val Asp Thr Leu Lys Pro Ile Leu Tyr Lys Ile Asn Ser Asp Ser 805 810 815 Asn Asp Phe Tyr Leu Val Ala Asn Tyr Asp Trp Ile Pro Thr Ser Thr 820 825 830 Thr Lys Val Tyr Lys Gln Val Pro Gln Pro Phe Asp Phe Arg Ala Ser 835 840 845 Met His Met Leu Thr Ser Asn Leu Thr Phe Thr Val Tyr Ser Asp Leu 850 855 860 Leu Ala Phe Val Ser Ala Asp Thr Val Glu Pro Ile Asn Ala Val Ala 865 870 875 880 Phe Asp Asn Met Arg Ile Met Asn Glu Leu 885 890 <210> 2 <211> 776 <212> PRT <213> Reoviridae <400> 2 Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val 1 5 10 15 Asn Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Ala Lys Ser Gln Asp 20 25 30 Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Gly Tyr Ala Pro Val 35 40 45 Asn Trp Gly Ala Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu 50 55 60 Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr 65 70 75 80 Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr 85 90 95 Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val 100 105 110 Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu 115 120 125 Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr His Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser 130 135 140 Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser 145 150 155 160 Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr 165 170 175 Tyr Asn Gly Thr Thr Pro Asn Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr 180 185 190 Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile 195 200 205 Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu 210 215 220 Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Val Ser Leu Ser Ala 225 230 235 240 Arg Glu Ile Val His Thr Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Val Val 245 250 255 Ser Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Cys Asn Arg Asp Ile Thr 260 265 270 Ile Arg Phe Lys Phe Asp Arg Thr Ile Ile Lys Ala Gly Gly Leu Gly 275 280 285 Tyr Lys Trp Ser Glu Ile Ser Phe Lys Pro Ile Thr Tyr Gln Tyr Thr 290 295 300 Tyr Ala Arg Asp Gly Glu Gln Ile Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val 305 310 315 320 Asn Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp 325 330 335 Phe Ala Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Phe Val Tyr 340 345 350 Ile Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Gln Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val 355 360 365 Arg Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Thr Val Thr Cys Thr Gly Gly Ser 370 375 380 Tyr Ser Phe Ala Leu Pro Leu Gly His Tyr Pro Val Met Thr Gly Gly 385 390 395 400 Thr Val Ser Leu His Pro Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr 405 410 415 Asp Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Arg Leu Thr Val 420 425 430 Gly Glu Pro Ser Phe Ser Ile Thr Arg Thr Arg Val Ser Arg Leu Tyr 435 440 445 Gly Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gln Arg Glu Tyr Tyr Glu Ile 450 455 460 Ser Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Ser Asn Asp Asp Tyr 465 470 475 480 Gln Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg 485 490 495 Gln Leu Gly Glu Leu Arg Asp Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Gln Ile 500 505 510 Ala Ile Ser Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe 515 520 525 Ser Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Ala Ala Lys Ser Met 530 535 540 Ala Thr Asn Val Met Lys Arg Phe Lys Arg Ser Asn Leu Ala Ser Ser 545 550 555 560 Val Ser Thr Leu Thr Asp Ala Met Ser Asp Ala Ala Ser Ser Ile Ser 565 570 575 Arg Ser Ser Ser Ile Arg Ser Ile Gly Ser Ser Ala Ser Ala Trp Thr 580 585 590 Glu Val Ser Asn Ser Ile Ala Asp Val Ser Thr Thr Val Asp Thr Val 595 600 605 Ser Thr Gln Thr Ala Thr Ile Ala Lys Arg Leu Arg Leu Lys Glu Ile 610 615 620 Ala Thr Gln Thr Asp Gly Met Asn Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val 625 630 635 640 Leu Lys Thr Lys Ile Asp Lys Ser Val Gln Ile Thr Pro Asn Thr Leu 645 650 655 Pro Glu Ile Val Thr Glu Ala Ser Glu Lys Phe Ile Pro Asn Arg Thr 660 665 670 Tyr Arg Val Ile Asn Asn Asp Glu Val Phe Glu Val Gly Met Asp Gly 675 680 685 Lys Phe Phe Ala Tyr Arg Val Asp Thr Phe Asp Glu Ile Pro Phe Asp 690 695 700 Val Gln Lys Phe Ala Asp Leu Val Thr Asp Ser Pro Val Ile Ser Ala 705 710 715 720 Ile Ile Asp Leu Lys Thr Leu Lys Asn Leu Lys Asp Asn Tyr Gly Ile 725 730 735 Ser Lys Gln Gln Ala Phe Asp Leu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Val Leu 740 745 750 Arg Glu Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu 755 760 765 Asn Leu Ile Met Gln Cys Arg Leu 770 775 <210> 3 <211> 397 <212> PRT <213> Reoviridae <400> 3 Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp 1 5 10 15 Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Ile Ser Asp Leu Ile Gln 20 25 30 Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp Phe Gln Thr 35 40 45 Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly 50 55 60 Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Ile Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn 65 70 75 80 Ala Arg Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys 85 90 95 Met Asp Glu Met Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln 100 105 110 Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn 115 120 125 Phe Asp Asn Ser Ser Asp Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg 130 135 140 Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Leu Pro Tyr 145 150 155 160 Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu 165 170 175 Met Gly Thr Met Trp Ile Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly 180 185 190 Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Phe Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe 195 200 205 Glu His Val Val Pro Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr 210 215 220 Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser 225 230 235 240 Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Ile Arg Pro 245 250 255 Ser Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr 260 265 270 Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile 275 280 285 Arg Leu Ser Phe Gln Leu Val Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val 290 295 300 Ala Asn Leu Phe Pro Gln Ala Pro Pro Phe Ile Phe His Ala Thr Val 305 310 315 320 Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala 325 330 335 Asp Ala Ser Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu 340 345 350 Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr 355 360 365 Glu Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg 370 375 380 Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys 385 390 395 <210> 4 <211> 326 <212> PRT <213> Reoviridae <400> 4 Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Ser Leu 1 5 10 15 Val Phe Val Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val Thr Arg Thr Met Asp Phe 20 25 30 Ile Ile Tyr Arg Phe Leu Leu Val Ile Val Val Leu Ala Pro Leu Ile 35 40 45 Lys Ala Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp 50 55 60 Thr Pro Tyr Met Asn Ser Thr Thr Ser Glu Thr Phe Leu Thr Ser Thr 65 70 75 80 Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Asn Glu Ala Ala Thr Glu Ile Ala Asp Thr 85 90 95 Lys Trp Thr Glu Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro 100 105 110 Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Gly Tyr Ala Asp Ile Ala Ser Phe Ser 115 120 125 Val Glu Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Ile Val Leu Met Lys Tyr 130 135 140 Asp Gly Asn Leu Gln Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu 145 150 155 160 Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Met Leu Tyr Tyr Tyr Gln 165 170 175 Gln Thr Asp Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Thr Ser Cys Thr 180 185 190 Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Ser 195 200 205 Thr Thr Asp Ile Asn Ser Phe Glu Thr Val Ala Asn Ala Glu Lys Leu 210 215 220 Ala Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn His Lys Leu Asp Val Thr 225 230 235 240 Thr Ser Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu 245 250 255 Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Pro Asn Ile Leu Asp Ile Thr 260 265 270 Ala Asp Pro Thr Thr Ala Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Ile Asn 275 280 285 Trp Lys Arg Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Val Asn 290 295 300 Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asp Ser Ala 305 310 315 320 Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 325 <210> 5 <211> 317 <212> PRT <213> Reoviridae <400> 5 Met Ala Glu Leu Ala Cys Phe Cys Tyr Pro His Leu Glu Asn Asp Ser 1 5 10 15 Tyr Lys Phe Ile Pro Phe Asn Asn Leu Ala Ile Lys Cys Met Leu Thr 20 25 30 Ala Lys Val Asp Lys Lys Asp Gln Asp Lys Phe Tyr Asn Ser Ile Val 35 40 45 Tyr Gly Ile Ala Pro Pro Pro Gln Phe Lys Lys Arg Tyr Asn Thr Ser 50 55 60 Asp Asn Ser Arg Gly Met Asn Tyr Val Thr Thr Met Phe Asn Lys Val 65 70 75 80 Ala Ile Leu Ile Cys Glu Ala Leu Asn Ser Ile Lys Val Thr Gln Ser 85 90 95 Asp Val Ala Asn Val Leu Ser Arg Val Val Ser Val Arg His Leu Glu 100 105 110 Asn Leu Val Leu Arg Lys Glu Asn His Gln Asp Val Leu Phe His Ser 115 120 125 Lys Glu Leu Leu Leu Lys Ser Val Leu Ile Ala Ile Gly Gln Ser Lys 130 135 140 Glu Ile Glu Thr Thr Ala Thr Ala Glu Gly Gly Glu Ile Val Phe Gln 145 150 155 160 Asn Ala Ala Phe Thr Met Trp Lys Leu Thr Tyr Leu Asp His Lys Leu 165 170 175 Met Pro Ile Leu Asp Gln Asn Phe Thr Glu Tyr Lys Ile Thr Leu Asn 180 185 190 Glu Asp Lys Pro Ile Ser Asp Val Cys Val Lys Glu Leu Val Ala Glu 195 200 205 Leu Arg Trp Gln Tyr Asn Arg Phe Ala Val Ile Thr His Gly Lys Gly 210 215 220 His Tyr Arg Val Val Lys Tyr Ser Ser Val Ala Asn His Ala Asp Arg 225 230 235 240 Val Phe Ala Thr Tyr Lys Asn Asn Ala Lys Ser Gly Asn Val Thr Asp 245 250 255 Phe Asn Leu Leu Asp Gln Arg Ile Ile Trp Gln Asn Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Thr Ser Ser Met Lys Gln Gly Asn Thr Leu Asp Val Cys Lys Lys Leu 275 280 285 Leu Phe Gln Lys Met Lys Gln Glu Lys Asn Pro Phe Lys Gly Leu Ser 290 295 300 Thr Asp Arg Lys Met Asp Glu Val Ser His Val Gly Ile 305 310 315 <210> 6 <211> 175 <212> PRT <213> Reoviridae <400> 6 Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser Val Ile Thr Leu 1 5 10 15 Met Asn Asp Thr Leu His Ser Ile Ile Gln Asp Pro Gly Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Pro Tyr Ile Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe Thr Leu His Lys 35 40 45 Ala Ser Ile Pro Thr Met Lys Ile Ala Leu Lys Thr Ser Lys Cys Ser 50 55 60 Tyr Lys Val Ile Lys Tyr Cys Met Val Thr Ile Ile Asn Thr Leu Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln Val Thr Thr Lys Asp Glu Ile Glu 85 90 95 Gln Gln Met Asp Arg Ile Ile Lys Glu Met Arg Arg Gln Leu Glu Met 100 105 110 Ile Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu Ile Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys 115 120 125 Arg Ile His Asp Lys Leu Ala Ala Arg Ser Val Asp Ala Ile Asp Met 130 135 140 Ser Lys Glu Phe Asn Gln Lys Asn Ile Arg Thr Leu Asp Glu Trp Glu 145 150 155 160 Ser Gly Lys Asn Pro Tyr Glu Pro Ser Glu Val Thr Ala Ser Met 165 170 175 <210> 7 <211> 2676 <212> DNA <213> Reoviridae <400> 7 tactaacagt tataccaaac gacagctaaa cgtgaaaact catcacaaca gaatgaacgt 60 ctgcaagaaa aagaagttga aaagaacata gacgcatcta tggagaataa agctaataat 120 aaaaagcaac aattacctga taaagtgtta tcacaaaaag aagagataat aactgacgca 180 caagatgatg ttaagataac tgatgaggtt aagaaatcat caaaagaaga atcgaaacag 240 cttttggaga tattgaaaac taaagaagat catcagaaag agatacaata tgaaatttta 300 cagaaaacga taccaacttt tgaaccaaaa gaatcaattt tgaaaaaatt agaagacata 360 aaaccagaac aggcaaaaaa acaaactaaa ttgtttagaa tatttgaacc aagacaatta 420 ccaatttatc gggcaaatgg tgagagagaa ttgagaaata gatggtattg gaaattgaaa 480 agagacacgc tgccagatgg agattatgat gtccgagaat acttcttaaa tttatatgat 540 cagatattga tagaaatgcc agattattta ttattgaaag atatggcagt ggagaataaa 600 aattctaggg atgctggtaa agtcgtggat tccgagacag caagtatttg tgatgccata 660 tttcaagatg aggaaacaga gggagtcatt agaaggttca ttgcagatat gaggcaacaa 720 gttcaagctg acagaaatgt tgttaactat ccatcaattt tacatccaat tgatcatgca 780 ttcaatgaat actttttaaa tcaccaatta gttgaaccat taaataatga aataattttt 840 aattatatac cagaaaggat aagaaacgat gttaattaca ttctaaacat ggatatgaat 900 ctaccatcaa cagctagata tattagacca aatttgctgc aagatagact aaatttgcat 960 gataattttg aatcattatg ggatacgata acaacatcaa actatatatt agctagatca 1020 gttgtgcctg atctgaagga aaaggagtta gtgtcaaccg aagctcaaat acagaaaatg 1080 tcccaagatt tgcaacttga agcactaact atacaatctg aaacgcagtt tctggctggt 1140 ataaattcac aagcagcaaa tgattgtttt aaaacgctaa tagcagccat gttaagccaa 1200 cgtacaatgt cattagaatt tgtgactaca aattacatgt cacttatatc tggtatgtgg 1260 ttactaacag ttataccaaa cgacatgttt cttcgtgaat cgctagttgc atgcgagttg 1320 gctataataa acactattgt ttatccagcg ttcggaatgc aaaggatgca ttatagaaat 1380 ggtgatccac agactccatt ccaaatagca gaacagcaga tacaaaattt tcaagtagct 1440 aattggctac actttatcaa caataataga tttagacaag ttgtgatcga cggagtgttg 1500 aatcaaacac ttaatgataa tattagaaat ggacaagtta ttaatcagtt gatggaagcg 1560 ttaatgcaac tatctagaca acagtttcca actatgccag ttgattataa aagatcaata 1620 caaagaggaa tattactatt gtcaaacaga ttaggtcaat tagttgactt aacaagacta 1680 ttatcatata actatgaaac actgatggct tgcataacca tgaatatgca acatgtacaa 1740 actcttacta ctgaaaaatt acaattaact tctgttacat ctttgtgtat gttaattgga 1800 aatactacag ttattccaag tccacaaaca ttgtttcact attacaatgt aaatgtaaat 1860 tttcattcaa actataacga acggattaac gatgcagtag caattattac agcagccaat 1920 agactgaatt tatatcagaa gaagatgaag tcaatagttg aagaattttt gaagaggctg 1980 caaattttcg atgtgccacg agtgcccgat gatcaaatgt atagactgag agatagactt 2040 agattgttgc cggttgaaag acggagactt gatatattca atttaatatt aatgaatatg 2100 gagcagatcg agcgagcttc agataaaatt gcacaaggtg taataattgc ttatagagat 2160 atgcaactag agagagatga aatgtatgga tacgtcaata ttgctagaaa tctggatgga 2220 taccaacaaa ttaatttaga agaattaatg aggacaggag attatggtca aattactaac 2280 atgctattga acaaccagcc agtggctcta gtaggagcat tgccattcgt aacagactca 2340 tcagttatat cactcattgc taagctggat gctacagttt tcgcccagat agtcaaactt 2400 aggaaagtag ataccttaaa accgatattg tataaaataa actctgattc taatgatttc 2460 tatttagttg caaattacga ttggatacca acttccacta caaaagtgta caaacaggta 2520 ccgcaaccct ttgactttag agcgtcaatg catatgttaa catctaacct cacttttact 2580 gtttattccg atttgttagc ttttgtttct gcagatacag ttgaaccgat caacgcagtt 2640 gcttttgaca atatgcgcat tatgaacgaa ctgtaa 2676 <210> 8 <211> 2331 <212> DNA <213> Reoviridae <400> 8 atggcttcgc tcatttatag acaactactt actaattcat acacagtcaa tctttctgac 60 gaaattcaag agattggatc ggctaagtca caggatgtta ctataaatcc tggtccattc 120 gcacaaacag gttatgcacc agttaattgg ggagcaggtg agactaatga ctccacaact 180 gtcgagccgt tattagatgg tccataccaa ccaaccactt tcaatccacc aacaagctat 240 tgggtactac ttgcgccaac tgtagagggc gtaattattc aaggaacaaa caataccgat 300 agatggttgg ccactatact aattgaacca aacgtacaaa caactaacag aatatacaat 360 ctttttggtc agcaagtaac tttatcggtg gagaatacgt cacagacaca ttggaagttc 420 attgatgtga gtacaactac gccaacagga agttatacgc agcacggacc attgttctct 480 acaccaaaat tatacgctgt aatgaaattc agtggtagaa tatatacata taatggaacc 540 acaccaaacg caacaacagg atactattca actactaatt atgacacagt aaatatgaca 600 tcattttgtg atttttatat tataccaaga aatcaagaag aaaaatgtac tgagtatatc 660 aatcatggat tacctcctat acaaaataca aggaatgttg tgccagtatc tttatcggct 720 agagagatag tgcacacaag agctcaagtt aatgaggata ttgttgtttc aaaaacttca 780 ctttggaaag aaatgcaatg caacagagac ataaccataa gattcaaatt tgatagaaca 840 attattaaag ctggaggatt aggatacaaa tggtcagaaa tatcttttaa gccaattact 900 tatcagtaca catacgctag agatggagaa caaattacag cgcacaccac atgctcagtt 960 aatggagtta acaattttag ttacaatggc ggttcgctgc cgacggactt cgccatatca 1020 agatatgaag tgattaaaga aaattcattt gtttacattg attactggga tgattcacaa 1080 gcattcagaa acatggtata tgttcggtca cttgctgcta atttgaatac agtaacgtgt 1140 actggtggta gttacagctt cgcgttgcct ttaggtcatt atccagttat gactggtggt 1200 acagtttcac tacacccagc tggagttaca ttatctaccc aattcactga tttcgtatct 1260 cttaattcat tacgctttag attcaggtta actgtaggag aaccttcatt ttctataacg 1320 aggactaggg taagtaggtt atacggactt ccagcagcta atccaaacaa ccaaagagaa 1380 tattatgaaa taagcggtag gttttcatta atatcattag tgccatcaaa tgatgattat 1440 caaacaccaa ttatgaattc agttactgtg aggcaagatc tagagagaca attgggagag 1500 ctacgagatg agttcaattc attgtcacag caaatagcga tatcacaatt gattgatctg 1560 gctctattgc cattagatat gttttcaatg ttctcaggaa ttaaaagtac aatagatgct 1620 gcgaaatcca tggcaacgaa cgtgatgaaa agatttaaac ggtcaaacct agccagctca 1680 gtttctacat taactgatgc aatgtctgat gcagcatcgt ctatttcaag aagttcatca 1740 atacgatcaa taggatcatc agcatccgct tggacggaag tgtcaaattc gatcgcagat 1800 gtttctacga cagttgatac agtatcaacg caaactgcta ctattgctaa gcggttacga 1860 ttgaaagaga ttgcaactca aaccgatggt atgaattttg atgacatatc tgcagcagtg 1920 ttaaaaacga aaattgacaa atccgtgcaa ataacaccaa atacattacc ggaaatagtt 1980 actgaagctt ctgagaaatt tatcccaaat agaacatata gggttattaa caatgatgaa 2040 gtatttgaag ttggaatgga tggtaagttt ttcgcatatc gtgtagacac attcgatgaa 2100 ataccatttg atgtacagaa attcgcagat ttagttacag attcaccagt catttctgca 2160 ataattgatc ttaagacgtt aaaaaatctg aaagataatt atggaataag taagcagcaa 2220 gcttttgact tactacgatc agatccaagg gtattacgtg aatttatcaa tcagaataat 2280 ccaataatac gaaatagaat tgaaaactta atcatgcaat gtagactgta a 2331 <210> 9 <211> 1194 <212> DNA <213> Reoviridae <400> 9 atggaggttc tgtactcatt gtcaaaaacc ttgaaagatg ctagagataa aattgttgaa 60 ggtacattat actcaaatat aagtgattta attcaacaat tcaatcaaat gatagttacc 120 atgaatggaa atgattttca aacgggagga ataggaaatt tgccaatcag aaactggaat 180 tttgatttcg gattacttgg cactacttta cttaatatag atgcaaatta tgttgaaaat 240 gctagaacta ccattgaata tttcattgat tttatagata atgtgtgtat ggatgaaatg 300 gctagagagt cgcaacgaaa cggaatagct ccacaatctg aagcactgag aaagctgtca 360 ggtattaagt ttaagagaat taattttgac aattcatctg attacattga gaattggaat 420 ttacaaaata gacgacagcg tactggattc gtgttccata agccaaatat acttccatac 480 tcagcatcat tcactttgaa tagatcacag ccggcacatg ataatttaat ggggactatg 540 tggattaacg ctggatcaga aattcaggtg gctggatttg attattcgtg tgcttttaat 600 gcaccggcaa atattcagca gtttgaacat gtcgtgccat taagacgtgc acttacgaca 660 gctacaatta ctttgctacc agatgctgag aggttcagtt tcccaagagt gattaattca 720 gctgatggcg ctactacatg gtacttcaat ccagttatca taagaccaag taatgttgaa 780 gttgaatttt tgttgaatgg gcaaataatt aatacgtacc aagcgcgatt tggaaccatc 840 atagctagaa attttgatac tattcggtta tcatttcaat tagtacgacc accgaatatg 900 acaccagcag ttgcaaacct atttccgcaa gcaccaccat ttatatttca tgctacagtt 960 ggactcacac tacgaattga atctgcagtt tgtgaatctg tgcttgcgga cgcttccgaa 1020 actttattgg caaatgtgac tgcagttcgt caagagtatg ctataccggt agggccagtg 1080 ttcccaccag gtatgaattg gacagaattg attaccaatt attcaccttc aagagaagat 1140 aacttgcaac gtgttttcac agtagcttcc attagaagca tgttgattaa gtga 1194 <210> 10 <211> 981 <212> DNA <213> Reoviridae <400> 10 atgtatggta ttgaatatac cacagttcta acttttttga tatcgcttgt atttgtcaat 60 tatatactga aatcagttac tagaacaatg gactttatca tttatagatt cttattggtt 120 atagtcgtac ttgcaccgct cattaaagct caaaattacg gaattaattt accaataact 180 ggatctatgg atacgccata tatgaattca actacaagtg aaacattttt gacttcgaca 240 ttatgtctat attatccaaa tgaagcagct acagaaattg cagatacaaa atggacagaa 300 acattgtcgc agttgttttt aacaaaagga tggccaacag ggtcagttta ttttaaagga 360 tatgcagata ttgcgtcatt ttctgtagaa ccgcagttat actgcgacta taatattgta 420 ctaatgaaat atgatggaaa tttacagtta gacatgtctg aattggctga tttaatattg 480 aatgaatggc tatgtaatcc aatggatata atgctatatt attatcagca aacagatgaa 540 gctaataaat ggatatcaat gggtacatca tgtacgatta aagtatgtcc tctaaatacg 600 cagactctcg ggataggatg ttcgactaca gacataaatt catttgaaac agtggccaat 660 gcagagaaat tagctataac tgatgttgtc gatggagtca atcataaatt agacgtaaca 720 acgagtacat gtactataag aaattgtaaa aaacttggac caagagaaaa tgtcgctgta 780 attcaggtag gaggtccaaa catactcgac ataacagctg atccaacaac tgcaccacaa 840 actgaaagaa tgatgcgtat aaattggaag agatggtggc aagtctttta tacaatagtt 900 gattatgtca atcaaattgt acaagtcatg tccaagcgat cacgctcctt agattctgct 960 gccttttatt accgagtcta g 981 <210> 11 <211> 954 <212> DNA <213> Reoviridae <400> 11 atggctgagc tagcttgctt ttgttatcct catttggaga acgatagcta taaatttatt 60 ccttttaata atttagcaat aaaatgcatg ttgacagcta aagtggataa aaaagatcaa 120 gataaatttt acaattctat tgtttatgga attgcgccac caccacaatt taaaaaacgt 180 tataatacta gtgataattc aaggggcatg aattatgtaa cgactatgtt taataaggtg 240 gccatcttaa tttgtgaagc gctcaattca attaaagtta cccaatctga cgttgctaat 300 gttctttcaa gagtggtttc cgttagacat ttggaaaatt tggtgttaag aaaagaaaac 360 catcaagatg tgctgtttca ttcgaaagaa ctactcttaa aatctgtttt gatagctatt 420 ggtcaatcaa aagaaattga aactactgcc actgctgaag gaggagaaat agtatttcag 480 aatgcagctt ttactatgtg gaaattgacg tatttagatc ataaattgat gcctattttg 540 gatcagaact tcactgaata taaaattaca ttgaatgaag ataaaccaat ttcagatgta 600 tgtgttaaag aacttgtcgc tgaattgaga tggcagtaca acagatttgc tgtaataaca 660 catggtaaag gtcactatag agttgttaaa tattcatcag ttgctaatca tgcagacaga 720 gtgtttgcta catataaaaa taatgctaag agtggcaatg ttactgactt taacttgttg 780 gaccaaagaa ttatttggca aaattggtat gcttttacat cctcaatgaa acaaggtaat 840 acacttgatg tatgtaagaa actgctcttc caaaagatga aacaggagaa aaatccgttc 900 aaaggactgt caactgatag aaaaatggat gaagtttcac atgttggaat ttaa 954 <210> 12 <211> 528 <212> DNA <213> Reoviridae <400> 12 atggataagc ttgccgacct caattacaca ttgagcgtaa tcactttaat gaatgacaca 60 ctacactcta ttattcaaga tccaggaatg gcgtattttc catatattgc atctgttctg 120 actgttttat ttactctaca taaagcatca attccaacaa tgaaaatagc gttaaaaacg 180 tcaaagtgtt cgtacaaagt aattaaatat tgcatggtta caatcattaa tactcttctg 240 aagttggctg gttataaaga acaggttact actaaggatg aaattgaaca acagatggac 300 agaattatta aagagatgag acgtcaactg gaaatgattg acaaattgac aactcgtgaa 360 attgaacagg ttgaattact taaacgtata catgacaaat tagctgctag atcagttgac 420 gctatagata tgtcgaaaga atttaatcag aaaaatattc gaacgctaga tgaatgggaa 480 agtggaaaaa atccatatga accgtcggaa gtaactgcgt ctatgtga 528 <210> 13 <211> 2673 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP2 optimized <400> 13 atggcataca gaaagagagg tgcaaaaaga gaaaactcat cacaacaaaa cgaaagatta 60 caagaaaagg aagtagaaaa gaacattgat gcatctatgg aaaataaggc taacaataag 120 aaacaacaat tgccagataa ggttttgtca caaaaggaag aaatcatcac tgatgctcaa 180 gatgatgtta agatcacaga tgaagttaag aaatcttcaa aagaagaatc taagcaattg 240 ttggaaattt tgaagactaa agaagatcat caaaaagaaa ttcaatacga aattttacaa 300 aagactatcc caacattcga accaaaggaa tcaatcttga agaaattgga agatatcaag 360 ccagaacaag ctaagaaaca aactaagttg tttagaatct tcgaaccaag acaattgcca 420 atctatagag ctaatggtga aagagaattg agaaacagat ggtactggaa gttgaagaga 480 gatacattgc cagatggtga ctatgatgtt agagaatact ttttgaattt gtacgatcaa 540 attttaatcg aaatgccaga ttatttgttg ttgaaggata tggcagttga aaataagaac 600 tctagagatg ctggtaaagt tgttgattct gaaactgcat caatctgtga tgctatcttc 660 caagatgaag aaacagaagg tgttattaga agattcattg cagatatgag acaacaagtt 720 caagctgata gaaacgttgt taactaccca tctatcttgc atccaatcga tcatgctttt 780 aatgaatact ttttgaacca tcaattggtt gaaccattga acaacgaaat cattttcaat 840 tacattccag aaagaattag aaatgatgtt aattatattt tgaatatgga tatgaatttg 900 ccatctactg ctagatacat tagaccaaat ttgttgcaag atagattgaa tttgcatgat 960 aacttcgaat cattgtggga tactatcact acatctaact acatcttggc aagatcagtt 1020 gttccagatt tgaaggaaaa ggaattagtt tctacagaag ctcaaatcca aaagatgtca 1080 caagatttgc aattggaagc attgactatc caatctgaaa cacaattctt ggctggtatt 1140 aattcacaag ctgcaaacga ttgtttcaag actttgatcg ctgcaatgtt gtctcaaaga 1200 acaatgtcat tggaattcgt tactacaaac tacatgtctt tgatttcagg catgtggttg 1260 ttgactgtta ttccaaacga tatgttcttg agagaatctt tggttgcttg tgaattggca 1320 attattaaca ctatcgttta cccagctttc ggtatgcaaa gaatgcatta cagaaatggt 1380 gacccacaaa caccatttca aattgcagaa caacaaatcc aaaacttcca agttgctaac 1440 tggttgcatt tcatcaacaa caacagattc agacaagttg ttattgatgg tgttttgaac 1500 caaactttga acgataacat cagaaatggt caagttatta atcaattgat ggaagctttg 1560 atgcaattgt ctagacaaca attcccaaca atgccagttg attacaagag atcaatccaa 1620 agaggtatct tattgttgtc aaacagattg ggtcaattgg ttgatttgac tagattgttg 1680 tcatacaact acgaaacttt gatggcttgt atcacaatga acatgcaaca tgttcaaaca 1740 ttgactacag aaaagttgca attgacttct gttacatcat tgtgtatgtt gatcggtaac 1800 actacagtta ttccatctcc acaaactttg ttccattact acaacgttaa cgttaacttc 1860 cattcaaatt acaatgaaag aattaatgat gctgttgcaa tcatcacagc tgcaaacaga 1920 ttgaatttgt accaaaagaa aatgaaatct attgttgaag aatttttaaa aagattgcaa 1980 atttttgatg ttccaagagt tccagatgat caaatgtaca gattgagaga tagattgaga 2040 ttgttgccag ttgaaagaag aagattggat atttttaatt tgatcttgat gaatatggaa 2100 caaatcgaaa gagcatctga taagatcgct caaggtgtta ttatcgcata cagagatatg 2160 caattggaaa gagatgaaat gtacggttac gttaacatcg ctagaaattt ggatggttac 2220 caacaaatta atttggaaga attgatgaga actggtgact atggtcaaat cacaaacatg 2280 ttgttgaaca accaaccagt tgctttggtt ggtgcattgc cattcgttac tgattcttca 2340 gttatttctt tgatcgctaa gttggatgca actgttttcg ctcaaatcgt taagttgaga 2400 aaagttgata cattgaaacc aatcttgtac aagattaatt ctgattcaaa tgatttttac 2460 ttagttgcaa attatgattg gatcccaaca tcaactacaa aggtttacaa gcaagttcca 2520 caaccattcg atttcagagc ttctatgcat atgttgactt caaatttgac ttttacagtt 2580 tactctgatt tgttggcatt tgtttcagct gatacagttg aaccaattaa tgctgttgca 2640 ttcgataaca tgagaatcat gaacgaattg tga 2673 <210> 14 <211> 2331 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP4 optimized <400> 14 atggcttctt tgatctatag acaattgttg actaactcat acacagttaa tttgtctgat 60 gaaatccaag aaatcggttc tgctaagtct caagatgtta ctattaatcc aggtccattt 120 gctcaaacag gttacgcacc agttaattgg ggtgcaggtg aaactaatga ttctactaca 180 gttgaaccat tgttagatgg tccataccaa ccaactactt ttaatccacc aacttcttat 240 tgggttttgt tagctccaac agttgaaggt gttattatcc aaggtacaaa caacactgat 300 agatggttgg caactatctt gatcgaacca aacgttcaaa ctacaaacag aatctataat 360 ttgtttggtc aacaagttac attgtcagtt gaaaacacat ctcaaactca ttggaagttt 420 attgatgttt caactacaac tccaactggt tcttacacac aacatggtcc attattttca 480 actccaaagt tgtacgctgt tatgaaattt tctggtagaa tctatacata caatggtaca 540 actccaaatg caacaactgg ttactactca acaactaact acgatactgt taacatgaca 600 tctttctgtg atttctacat tattccaaga aaccaagaag aaaagtgtac tgaatacatc 660 aaccatggtt taccaccaat ccaaaacaca agaaacgttg ttccagtttc attgtctgct 720 agagaaattg ttcatactag agcacaagtt aacgaagata tcgttgtttc aaagacatct 780 ttatggaaag aaatgcaatg taacagagat atcactatca gattcaaatt cgatagaaca 840 attattaagg ctggtggttt gggttataaa tggtcagaaa tctcttttaa accaatcact 900 taccaataca catacgctag agatggtgaa caaattactg cacatacaac ttgttctgtt 960 aacggtgtta acaacttctc atacaacggt ggttctttgc caacagattt cgctatctca 1020 agatacgaag ttattaaaga aaattctttt gtttacattg attattggga tgattcacaa 1080 gcttttagaa acatggttta cgtcagatct ttggctgcaa atttgaatac agttacttgt 1140 acaggtggtt catactcttt tgctttgcca ttaggtcatt atccagttat gacaggtggt 1200 actgtttcat tacatccagc aggtgttaca ttgtctactc aattcactga tttcgtttca 1260 ttgaactctt tgagattcag attcagatta actgttggtg aaccatcatt ttctatcact 1320 agaacaagag tttctagatt gtacggttta ccagctgcaa atccaaacaa ccaaagagaa 1380 tactacgaaa tctcaggtag attttcattg atctctttgg ttccatctaa cgatgattac 1440 caaactccaa tcatgaactc agttacagtt agacaagatt tggaaagaca attgggtgaa 1500 ttgagagatg aattcaattc attgtctcaa caaatcgcta tctctcaatt gatcgatttg 1560 gcattgttgc cattggatat gttctcaatg ttctctggta ttaaatcaac tatcgatgct 1620 gcaaagtcta tggctacaaa cgttatgaag agattcaaaa gatcaaattt ggcttcttca 1680 gtttctactt tgacagatgc aatgtcagat gctgcatctt caatctctag atcttcatct 1740 atcagatcaa ttggttcatc tgcttctgca tggactgaag tttcaaattc tatcgctgat 1800 gtttcaacaa ctgttgatac agtttctact caaacagcta ctatcgcaaa gagattgaga 1860 ttgaaggaaa tcgcaacaca aactgatggt atgaacttcg atgatatctc tgctgcagtt 1920 ttgaagacta agatcgataa gtcagttcaa attactccaa atacattgcc agaaatcgtt 1980 actgaagctt ctgaaaagtt tattccaaac agaacataca gagttattaa taacgatgaa 2040 gttttcgaag ttggtatgga tggtaaattt ttcgcttaca gagttgatac tttcgatgaa 2100 atcccattcg atgttcaaaa gttcgctgat ttggttactg attcaccagt tatttctgca 2160 atcatcgatt tgaagacatt gaaaaatttg aaagataatt atggtatctc aaagcaacaa 2220 gctttcgatt tgttaagatc tgatccaaga gttttgagag aattcattaa ccaaaacaac 2280 ccaatcatca gaaatagaat tgaaaatttg attatgcaat gtagattgta a 2331 <210> 15 <211> 1194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP6 optimized <400> 15 atggaagttt tgtactcttt gtccaagact ttgaaggatg ccagagataa gatcgttgaa 60 ggtactttgt actctaacat ttctgatttg atccaacaat tcaaccaaat gattgttacc 120 atgaacggta acgacttcca aactggtggt atcggtaact tgccaattag aaactggaac 180 ttcgacttcg gtttgttggg taccactttg ttgaacatcg atgctaacta cgttgaaaac 240 gctagaacca ctatcgaata cttcatcgac ttcatcgata acgtttgtat ggatgaaatg 300 gctagagaat ctcaaagaaa cggtatcgct ccacaatctg aagccttgag aaagttgtcc 360 ggtatcaagt tcaagagaat taacttcgac aactcttccg attacatcga aaactggaac 420 ttgcaaaaca gaagacaaag aaccggtttc gttttccaca agccaaacat tttgccatac 480 tctgcttcct tcaccttgaa cagatcccaa ccagctcacg acaacttgat gggtactatg 540 tggatcaacg ctggttctga aattcaagtt gctggtttcg attactcctg tgctttcaac 600 gctccagcta acatccaaca attcgaacac gttgttccat tgagaagagc tttgaccact 660 gctaccatca ctttgttgcc agacgctgaa agattctctt tcccaagagt tattaactcc 720 gctgatggtg ctaccacttg gtacttcaac ccagttatca ttagaccatc taacgttgaa 780 gttgaatttt tgttgaacgg tcaaatcatt aacacctacc aagctagatt cggtactatc 840 attgctagaa acttcgacac catcagattg tccttccaat tggttagacc accaaacatg 900 actccagctg ttgctaactt gttcccacaa gctccaccat tcatcttcca cgctaccgtt 960 ggtttgactt tgagaattga atctgctgtt tgtgaatccg ttttggctga tgcttctgaa 1020 accttgttgg ctaacgttac tgctgttaga caagaatacg ctatcccagt tggtccagtt 1080 ttcccaccag gtatgaactg gaccgaattg attactaact actctccatc cagagaagac 1140 aacttgcaaa gagttttcac cgttgcttct atcagatcca tgttgatcaa gtaa 1194 <210> 16 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP7 optimized <400> 16 atgtacggta tcgaatacac tacagttttg acatttttga tttctttggt tttcgttaac 60 tacatcttga agtcagttac tagaacaatg gattttatta tctatagatt tttgttagtt 120 attgttgttt tggctccatt gattaaagca caaaactacg gtattaattt gccaatcact 180 ggttctatgg atacaccata catgaactct actacatcag aaacattttt gacttcaaca 240 ttgtgtttgt actacccaaa cgaagctgca actgaaattg ctgatacaaa gtggactgaa 300 acattgtctc aattgttttt aactaaaggt tggccaacag gttcagttta cttcaagggt 360 tacgctgata tcgcatcttt ttcagttgaa ccacaattgt actgtgatta caacatcgtt 420 ttgatgaaat atgatggtaa tttgcaattg gatatgtctg aattggctga tttgatcttg 480 aacgaatggt tgtgtaaccc aatggatatc atgttgtact actaccaaca aactgatgaa 540 gcaaataagt ggatctctat gggtacttca tgtacaatta aagtttgtcc attgaatact 600 caaacattgg gtattggttg ttctactaca gatatcaact cattcgaaac tgttgctaac 660 gcagaaaagt tggctatcac agatgttgtt gatggtgtta accataagtt ggatgttact 720 acatcaactt gtacaatcag aaactgtaag aaattgggtc caagagaaaa tgttgcagtt 780 attcaagttg gtggtccaaa tattttggat attactgctg atccaactac agcaccacaa 840 acagaaagaa tgatgagaat taattggaag agatggtggc aagttttcta tactatcgtt 900 gattacgtta accaaatcgt tcaagttatg tctaagagat ctagatcatt ggattcagct 960 gcattttact atagagttta a 981 <210> 17 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA NSP2 optimized <400> 17 atggccgaat tagcatgttt ctgttacccc cacttagaga atgatagtta caagtttata 60 cccttcaaca atctggcaat taagtgtatg cttacagcca aagtggacaa gaaggatcaa 120 gataagttct ataatagcat agtctatggt atagcccctc ctcctcagtt caaaaagagg 180 tataatactt cggataactc aagaggcatg aactatgtaa ccaccatgtt caacaaggtg 240 gccattttga tttgcgaggc tctaaactca attaaagtga cacagagcga tgttgcaaat 300 gtgttatcaa gggtagtctc agtgaggcac cttgaaaacc tggtgttgag gaaagagaac 360 catcaggatg tactgttcca ctcaaaagaa ctactactta agtctgtttt gatagcaata 420 ggacaatcga aagaaataga aacaactgct acggccgagg gcggtgagat cgtgtttcag 480 aatgctgctt tcacaatgtg gaagctaaca tacctagacc ataaactgat gcctatttta 540 gatcagaatt ttaccgagta taagattact cttaacgagg ataagccaat cagtgatgta 600 tgtgtaaagg agttggttgc tgagcttcgt tggcaatata acagattcgc cgttataacc 660 cacggcaaag gacattacag agtcgtgaag tatagctcag tcgctaacca tgccgacagg 720 gtatttgcca cctataagaa taacgcaaaa tctggcaatg ttacagattt caacttgcta 780 gaccagagga taatatggca aaattggtac gcttttacgt cctccatgaa acagggaaat 840 acgctagatg tctgcaagaa attgcttttc cagaaaatga agcaggagaa gaaccccttt 900 aagggactat cgaccgatag aaaaatggac gaggtctccc acgtaggcat ttga 954 <210> 18 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA NSP4 optimized <400> 18 atggataaac ttgctgacct gaattatacc ttgtcggtta taacgttaat gaatgacacc 60 ttgcattcta ttatccaaga ccccggtatg gcctacttcc cttacattgc atcagtgtta 120 accgtgctat tcacgttgca caaagcatcc atacccacga tgaaaatagc attaaagacc 180 tccaagtgtt cgtataaagt cattaagtac tgtatggtca ctatcatcaa tactcttcta 240 aaattggctg gatacaaaga gcaggtcacc acgaaagatg aaatagaaca gcagatggat 300 aggattatca aagaaatgcg taggcagtta gaaatgatcg acaagttaac aacgcgtgaa 360 atcgaacagg tagaattgct aaagagaata catgacaagt tagccgctag gtccgttgac 420 gcaatagata tgtcgaagga gttcaatcaa aagaacatca ggactctgga cgagtgggaa 480 agcggaaaga acccctacga gccaagtgag gtaactgcct cgatgtag 528 <210> 19 <211> 934 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP2 modified <400> 19 Met Ala Tyr Arg Lys Arg Gly Ala Lys Arg Glu Asn Ser Ser Gln Gln 1 5 10 15 Asn Glu Arg Leu Gln Glu Lys Glu Val Glu Lys Asn Ile Asp Ala Ser 20 25 30 Met Glu Asn Lys Ala Asn Asn Lys Lys Gln Gln Leu Pro Asp Lys Val 35 40 45 Leu Ser Gln Lys Glu Glu Ile Ile Thr Asp Ala Gln Asp Asp Val Lys 50 55 60 Ile Thr Asp Glu Val Lys Lys Ser Ser Lys Glu Glu Ser Lys Gln Leu 65 70 75 80 Leu Glu Ile Leu Lys Thr Lys Glu Asp His Gln Lys Glu Ile Gln Tyr 85 90 95 Glu Ile Leu Gln Lys Thr Ile Pro Thr Phe Glu Pro Lys Glu Ser Ile 100 105 110 Leu Lys Lys Leu Glu Asp Ile Lys Pro Glu Gln Ala Lys Lys Gln Thr 115 120 125 Lys Leu Phe Arg Ile Phe Glu Pro Arg Gln Leu Pro Ile Tyr Arg Ala 130 135 140 Asn Gly Glu Arg Glu Leu Arg Asn Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Arg 145 150 155 160 Asp Thr Leu Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Glu Tyr Phe Leu Asn 165 170 175 Leu Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys 180 185 190 Asp Met Ala Val Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lys Val Val 195 200 205 Asp Ser Glu Thr Ala Ser Ile Cys Asp Ala Ile Phe Gln Asp Glu Glu 210 215 220 Thr Glu Gly Val Ile Arg Arg Phe Ile Ala Asp Met Arg Gln Gln Val 225 230 235 240 Gln Ala Asp Arg Asn Val Val Asn Tyr Pro Ser Ile Leu His Pro Ile 245 250 255 Asp His Ala Phe Asn Glu Tyr Phe Leu Asn His Gln Leu Val Glu Pro 260 265 270 Leu Asn Asn Glu Ile Ile Phe Asn Tyr Ile Pro Glu Arg Ile Arg Asn 275 280 285 Asp Val Asn Tyr Ile Leu Asn Met Asp Met Asn Leu Pro Ser Thr Ala 290 295 300 Arg Tyr Ile Arg Pro Asn Leu Leu Gln Asp Arg Leu Asn Leu His Asp 305 310 315 320 Asn Phe Glu Ser Leu Trp Asp Thr Ile Thr Thr Ser Asn Tyr Ile Leu 325 330 335 Ala Arg Ser Val Val Pro Asp Leu Lys Glu Lys Glu Leu Val Ser Thr 340 345 350 Glu Ala Gln Ile Gln Lys Met Ser Gln Asp Leu Gln Leu Glu Ala Leu 355 360 365 Thr Ile Gln Ser Glu Thr Gln Phe Leu Ala Gly Ile Asn Ser Gln Ala 370 375 380 Ala Asn Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Ala Ala Met Leu Ser Gln Arg 385 390 395 400 Thr Met Ser Leu Glu Phe Val Thr Thr Asn Tyr Met Ser Leu Ile Ser 405 410 415 Gly Met Trp Leu Leu Thr Val Ile Pro Asn Asp Met Phe Leu Arg Glu 420 425 430 Ser Leu Val Ala Cys Glu Leu Ala Ile Ile Asn Thr Ile Val Tyr Pro 435 440 445 Ala Phe Gly Met Gln Arg Met His Tyr Arg Asn Gly Asp Pro Gln Thr 450 455 460 Pro Phe Gln Ile Ala Glu Gln Gln Ile Gln Asn Phe Gln Val Ala Asn 465 470 475 480 Trp Leu His Phe Ile Asn Asn Asn Arg Phe Arg Gln Val Val Ile Asp 485 490 495 Gly Val Leu Asn Gln Thr Leu Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly Gln Val 500 505 510 Ile Asn Gln Leu Met Glu Ala Leu Met Gln Leu Ser Arg Gln Gln Phe 515 520 525 Pro Thr Met Pro Val Asp Tyr Lys Arg Ser Ile Gln Arg Gly Ile Leu 530 535 540 Leu Leu Ser Asn Arg Leu Gly Gln Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Leu 545 550 555 560 Ser Tyr Asn Tyr Glu Thr Leu Met Ala Cys Ile Thr Met Asn Met Gln 565 570 575 His Val Gln Thr Leu Thr Thr Glu Lys Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr 580 585 590 Ser Leu Cys Met Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Ile Pro Ser Pro Gln 595 600 605 Thr Leu Phe His Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Phe His Ser Asn Tyr 610 615 620 Asn Glu Arg Ile Asn Asp Ala Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Asn Arg 625 630 635 640 Leu Asn Leu Tyr Gln Lys Lys Met Lys Ser Ile Val Glu Glu Phe Leu 645 650 655 Lys Arg Leu Gln Ile Phe Asp Val Pro Arg Val Pro Asp Asp Gln Met 660 665 670 Tyr Arg Leu Arg Asp Arg Leu Arg Leu Leu Pro Val Glu Arg Arg Arg 675 680 685 Leu Asp Ile Phe Asn Leu Ile Leu Met Asn Met Glu Gln Ile Glu Arg 690 695 700 Ala Ser Asp Lys Ile Ala Gln Gly Val Ile Ile Ala Tyr Arg Asp Met 705 710 715 720 Gln Leu Glu Arg Asp Glu Met Tyr Gly Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asn 725 730 735 Leu Asp Gly Tyr Gln Gln Ile Asn Leu Glu Glu Leu Met Arg Thr Gly 740 745 750 Asp Tyr Gly Gln Ile Thr Asn Met Leu Leu Asn Asn Gln Pro Val Ala 755 760 765 Leu Val Gly Ala Leu Pro Phe Val Thr Asp Ser Ser Val Ile Ser Leu 770 775 780 Ile Ala Lys Leu Asp Ala Thr Val Phe Ala Gln Ile Val Lys Leu Arg 785 790 795 800 Lys Val Asp Thr Leu Lys Pro Ile Leu Tyr Lys Ile Asn Ser Asp Ser 805 810 815 Asn Asp Phe Tyr Leu Val Ala Asn Tyr Asp Trp Ile Pro Thr Ser Thr 820 825 830 Thr Lys Val Tyr Lys Gln Val Pro Gln Pro Phe Asp Phe Arg Ala Ser 835 840 845 Met His Met Leu Thr Ser Asn Leu Thr Phe Thr Val Tyr Ser Asp Leu 850 855 860 Leu Ala Phe Val Ser Ala Asp Thr Val Glu Pro Ile Asn Ala Val Ala 865 870 875 880 Phe Asp Asn Met Arg Ile Met Asn Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 885 890 895 Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr 900 905 910 Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro 915 920 925 Asp Tyr Ala Ala Gln Lys 930 <210> 20 <211> 820 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP4 modified <400> 20 Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val 1 5 10 15 Asn Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Ala Lys Ser Gln Asp 20 25 30 Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Gly Tyr Ala Pro Val 35 40 45 Asn Trp Gly Ala Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu 50 55 60 Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr 65 70 75 80 Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr 85 90 95 Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val 100 105 110 Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu 115 120 125 Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr His Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser 130 135 140 Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser 145 150 155 160 Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr 165 170 175 Tyr Asn Gly Thr Thr Pro Asn Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr 180 185 190 Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile 195 200 205 Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu 210 215 220 Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Val Ser Leu Ser Ala 225 230 235 240 Arg Glu Ile Val His Thr Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Val Val 245 250 255 Ser Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Cys Asn Arg Asp Ile Thr 260 265 270 Ile Arg Phe Lys Phe Asp Arg Thr Ile Ile Lys Ala Gly Gly Leu Gly 275 280 285 Tyr Lys Trp Ser Glu Ile Ser Phe Lys Pro Ile Thr Tyr Gln Tyr Thr 290 295 300 Tyr Ala Arg Asp Gly Glu Gln Ile Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val 305 310 315 320 Asn Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp 325 330 335 Phe Ala Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Phe Val Tyr 340 345 350 Ile Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Gln Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val 355 360 365 Arg Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Thr Val Thr Cys Thr Gly Gly Ser 370 375 380 Tyr Ser Phe Ala Leu Pro Leu Gly His Tyr Pro Val Met Thr Gly Gly 385 390 395 400 Thr Val Ser Leu His Pro Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr 405 410 415 Asp Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Arg Leu Thr Val 420 425 430 Gly Glu Pro Ser Phe Ser Ile Thr Arg Thr Arg Val Ser Arg Leu Tyr 435 440 445 Gly Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gln Arg Glu Tyr Tyr Glu Ile 450 455 460 Ser Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Ser Asn Asp Asp Tyr 465 470 475 480 Gln Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg 485 490 495 Gln Leu Gly Glu Leu Arg Asp Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Gln Ile 500 505 510 Ala Ile Ser Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe 515 520 525 Ser Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Ala Ala Lys Ser Met 530 535 540 Ala Thr Asn Val Met Lys Arg Phe Lys Arg Ser Asn Leu Ala Ser Ser 545 550 555 560 Val Ser Thr Leu Thr Asp Ala Met Ser Asp Ala Ala Ser Ser Ile Ser 565 570 575 Arg Ser Ser Ser Ile Arg Ser Ile Gly Ser Ser Ala Ser Ala Trp Thr 580 585 590 Glu Val Ser Asn Ser Ile Ala Asp Val Ser Thr Thr Val Asp Thr Val 595 600 605 Ser Thr Gln Thr Ala Thr Ile Ala Lys Arg Leu Arg Leu Lys Glu Ile 610 615 620 Ala Thr Gln Thr Asp Gly Met Asn Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val 625 630 635 640 Leu Lys Thr Lys Ile Asp Lys Ser Val Gln Ile Thr Pro Asn Thr Leu 645 650 655 Pro Glu Ile Val Thr Glu Ala Ser Glu Lys Phe Ile Pro Asn Arg Thr 660 665 670 Tyr Arg Val Ile Asn Asn Asp Glu Val Phe Glu Val Gly Met Asp Gly 675 680 685 Lys Phe Phe Ala Tyr Arg Val Asp Thr Phe Asp Glu Ile Pro Phe Asp 690 695 700 Val Gln Lys Phe Ala Asp Leu Val Thr Asp Ser Pro Val Ile Ser Ala 705 710 715 720 Ile Ile Asp Leu Lys Thr Leu Lys Asn Leu Lys Asp Asn Tyr Gly Ile 725 730 735 Ser Lys Gln Gln Ala Phe Asp Leu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Val Leu 740 745 750 Arg Glu Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu 755 760 765 Asn Leu Ile Met Gln Cys Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 770 775 780 Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr 785 790 795 800 Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr 805 810 815 Ala Ala Gln Lys 820 <210> 21 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP6 modified <400> 21 Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp 1 5 10 15 Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Ile Ser Asp Leu Ile Gln 20 25 30 Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp Phe Gln Thr 35 40 45 Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly 50 55 60 Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Ile Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn 65 70 75 80 Ala Arg Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys 85 90 95 Met Asp Glu Met Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln 100 105 110 Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn 115 120 125 Phe Asp Asn Ser Ser Asp Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg 130 135 140 Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Leu Pro Tyr 145 150 155 160 Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu 165 170 175 Met Gly Thr Met Trp Ile Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly 180 185 190 Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Phe Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe 195 200 205 Glu His Val Val Pro Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr 210 215 220 Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser 225 230 235 240 Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Ile Arg Pro 245 250 255 Ser Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr 260 265 270 Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile 275 280 285 Arg Leu Ser Phe Gln Leu Val Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val 290 295 300 Ala Asn Leu Phe Pro Gln Ala Pro Pro Phe Ile Phe His Ala Thr Val 305 310 315 320 Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala 325 330 335 Asp Ala Ser Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu 340 345 350 Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr 355 360 365 Glu Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg 370 375 380 Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys Gly Gly Gly 385 390 395 400 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr 405 410 415 Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Tyr Pro Tyr 420 425 430 Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Gln Cys 435 440 <210> 22 <211> 370 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP7 modified <400> 22 Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Ser Leu 1 5 10 15 Val Phe Val Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val Thr Arg Thr Met Asp Phe 20 25 30 Ile Ile Tyr Arg Phe Leu Leu Val Ile Val Val Leu Ala Pro Leu Ile 35 40 45 Lys Ala Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp 50 55 60 Thr Pro Tyr Met Asn Ser Thr Thr Ser Glu Thr Phe Leu Thr Ser Thr 65 70 75 80 Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Asn Glu Ala Ala Thr Glu Ile Ala Asp Thr 85 90 95 Lys Trp Thr Glu Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro 100 105 110 Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Gly Tyr Ala Asp Ile Ala Ser Phe Ser 115 120 125 Val Glu Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Ile Val Leu Met Lys Tyr 130 135 140 Asp Gly Asn Leu Gln Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu 145 150 155 160 Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Met Leu Tyr Tyr Tyr Gln 165 170 175 Gln Thr Asp Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Thr Ser Cys Thr 180 185 190 Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Ser 195 200 205 Thr Thr Asp Ile Asn Ser Phe Glu Thr Val Ala Asn Ala Glu Lys Leu 210 215 220 Ala Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn His Lys Leu Asp Val Thr 225 230 235 240 Thr Ser Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu 245 250 255 Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Pro Asn Ile Leu Asp Ile Thr 260 265 270 Ala Asp Pro Thr Thr Ala Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Ile Asn 275 280 285 Trp Lys Arg Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Val Asn 290 295 300 Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asp Ser Ala 305 310 315 320 Ala Phe Tyr Tyr Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 325 330 335 Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val 340 345 350 Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala 355 360 365 Gln Lys 370 <210> 23 <211> 361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA NSP2 modified <400> 23 Met Ala Glu Leu Ala Cys Phe Cys Tyr Pro His Leu Glu Asn Asp Ser 1 5 10 15 Tyr Lys Phe Ile Pro Phe Asn Asn Leu Ala Ile Lys Cys Met Leu Thr 20 25 30 Ala Lys Val Asp Lys Lys Asp Gln Asp Lys Phe Tyr Asn Ser Ile Val 35 40 45 Tyr Gly Ile Ala Pro Pro Pro Gln Phe Lys Lys Arg Tyr Asn Thr Ser 50 55 60 Asp Asn Ser Arg Gly Met Asn Tyr Val Thr Thr Met Phe Asn Lys Val 65 70 75 80 Ala Ile Leu Ile Cys Glu Ala Leu Asn Ser Ile Lys Val Thr Gln Ser 85 90 95 Asp Val Ala Asn Val Leu Ser Arg Val Val Ser Val Arg His Leu Glu 100 105 110 Asn Leu Val Leu Arg Lys Glu Asn His Gln Asp Val Leu Phe His Ser 115 120 125 Lys Glu Leu Leu Leu Lys Ser Val Leu Ile Ala Ile Gly Gln Ser Lys 130 135 140 Glu Ile Glu Thr Thr Ala Thr Ala Glu Gly Gly Glu Ile Val Phe Gln 145 150 155 160 Asn Ala Ala Phe Thr Met Trp Lys Leu Thr Tyr Leu Asp His Lys Leu 165 170 175 Met Pro Ile Leu Asp Gln Asn Phe Thr Glu Tyr Lys Ile Thr Leu Asn 180 185 190 Glu Asp Lys Pro Ile Ser Asp Val Cys Val Lys Glu Leu Val Ala Glu 195 200 205 Leu Arg Trp Gln Tyr Asn Arg Phe Ala Val Ile Thr His Gly Lys Gly 210 215 220 His Tyr Arg Val Val Lys Tyr Ser Ser Val Ala Asn His Ala Asp Arg 225 230 235 240 Val Phe Ala Thr Tyr Lys Asn Asn Ala Lys Ser Gly Asn Val Thr Asp 245 250 255 Phe Asn Leu Leu Asp Gln Arg Ile Ile Trp Gln Asn Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Thr Ser Ser Met Lys Gln Gly Asn Thr Leu Asp Val Cys Lys Lys Leu 275 280 285 Leu Phe Gln Lys Met Lys Gln Glu Lys Asn Pro Phe Lys Gly Leu Ser 290 295 300 Thr Asp Arg Lys Met Asp Glu Val Ser His Val Gly Ile Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr 325 330 335 Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Tyr Pro Tyr 340 345 350 Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Gln Cys 355 360 <210> 24 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA NSP4 modified <400> 24 Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser Val Ile Thr Leu 1 5 10 15 Met Asn Asp Thr Leu His Ser Ile Ile Gln Asp Pro Gly Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Pro Tyr Ile Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe Thr Leu His Lys 35 40 45 Ala Ser Ile Pro Thr Met Lys Ile Ala Leu Lys Thr Ser Lys Cys Ser 50 55 60 Tyr Lys Val Ile Lys Tyr Cys Met Val Thr Ile Ile Asn Thr Leu Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln Val Thr Thr Lys Asp Glu Ile Glu 85 90 95 Gln Gln Met Asp Arg Ile Ile Lys Glu Met Arg Arg Gln Leu Glu Met 100 105 110 Ile Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu Ile Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys 115 120 125 Arg Ile His Asp Lys Leu Ala Ala Arg Ser Val Asp Ala Ile Asp Met 130 135 140 Ser Lys Glu Phe Asn Gln Lys Asn Ile Arg Thr Leu Asp Glu Trp Glu 145 150 155 160 Ser Gly Lys Asn Pro Tyr Glu Pro Ser Glu Val Thr Ala Ser Met Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro 180 185 190 Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Tyr 195 200 205 Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Gln Cys 210 215 <210> 25 <211> 1612 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 25 attagctggt taataggtat aataataata ataataataa taacaatagc aaattatagt 60 agaaacgcta ttctatttct attttaattt ttgatttgat tttttagggt agcacactag 120 acacgcttct gaaaagatgt gtgtatgtgt ctcttcttgt ttgacagttt gatatgacta 180 agtgtctatt ttctgtttct gaagttctcc cccataaaaa taacacaact gacaacaaca 240 catgtcaaat cccgtcatga tcccactccc ggtctccagg tccccaatgc tcaaacaccc 300 atgtctttta tatcttttgc gctgcccatt ttacaaagaa accttgtacc tttaaaaagt 360 gatatgacga aaaaaagaac aaattaaaaa acagtggggc cctccaaaga atcagtcaat 420 aatcacaaaa cttacattac agcacggcac agagcgcatg ccgcatagta gaaggggagc 480 tacagaagag aaaaaaaaaa aaaaaaaaca aaaaaaaaaa aactaaggta acgtaaagta 540 agtataataa aaataatctc atgagcacca ccaccgctcg ccgcgatata caaggtggga 600 tgggatggga ttattccagg atgcggcgcg gcgcggcgta ggaaagcagt agcaagcccg 660 gtactagact gtactagact gtactaacta accccagccg atcgccaatg gaacaatggc 720 atgcggggac ggcccactgt gttccgctta cacgtgatca aattcggccg cgtactcccc 780 gggttcggac aggtatggtc cgtgcgcacc cggtgcactc caccccgcgc gcggcccact 840 gccttccgga aaaccaaacc aaaaaccaaa accaaaacca aaaccaaaac caaagaaacc 900 aaaacacata cctaaaccac ccagaaaagc ccgcgcaaga aaccgtttct ccccctctct 960 ctctgccccg ggtttccagg tattctcact caaggcatcc caattccagg cttcgcttct 1020 agcagcacct gtggtgctgc ttgctggtgt ggtaccagcg tttctttacg cctggccact 1080 gggcactgtg cgccgaaacg cgcaagaaca gtagtagtag tagtggcaca ttagcaagct 1140 tttctgctgt gaatgtgatt gatggatgga tgattggcac tccatccgtt ccttgcttac 1200 gcaagctggc atatggcaat gtgtatgtgt gtgccccgaa gtataggcag ctaagcatat 1260 gatagttggc tcgctctgcc tttgcagtgt cagatataca cagtatataa ggagttgcct 1320 gaatcttgtc agccggttct tagaagtctt cagaaacact ttcgattcgg gcacgttgta 1380 taaataagtg tgttgtgttt cagtttggag agagtgttgt tattactatt attattattc 1440 gtgtgtatgt ccatttgaaa gtatatatat atatatatat gtatatatgt ctggttagtt 1500 tgtttgtcta taacaaccaa aaggtaaaat agtaatagtc tggagaccct aaaagtatag 1560 gattccaagc aaactagaaa aaaccaaaaa aaacatcaag aacaatcaag aa 1612 <210> 26 <211> 3193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 26 atctttcagt tctcgatgag tatgtgtgtt tatttttttt tttttttgcc aaattctgct 60 ctttcctaaa tttcaagtgt taagcgcttt tgtctcttca ccttttccaa ctacaagcgc 120 aacataagaa aaggataata attctactag gaaacacaaa cctcatatac ctttcgagtt 180 agggaagaac accttcacaa tgataacaca ttgattcgag ctattaaata cctttttctc 240 aatcgaaatc tcaagtaaaa cagcgatgaa aacattacgt aactaatggt gttcaccact 300 agaaatcata cccttcacac tcgacttcaa gtagtgaatg gtgtagcaac aaagtccaaa 360 tgccaatatc aaccaagtaa ccaaccgcgc tactagagaa agacgctgtt gctcggacca 420 caaatttccg ctacactttt cacaactata ctgaatatac aaaaaaacgt ttgtgtgggt 480 atggctggct accaggtcgc ctggttaaac caagtcaacg tgatacatat gtacattcca 540 acactaagcc taccctaagt tttagctcac aggctaggct attattaaca tacaagacaa 600 gggagaagca aagaaaagac caaccgaaag ccaccagagc accctgaact ttgcggtgaa 660 cagaattccg caacatatct gaggattcca tgatctcggt ttcctactcc aaatgggaat 720 cacccactgt tgtccgtaaa tatgactaaa ttcctacctt gattcctcac gaacaatcgc 780 agtccgaaaa gccgttccaa aagccagtcc acagttcatc gattggtatg attattgttt 840 ttttgttcaa actgacacac taacggtgtt gtatgcgaag agtgagctta cccttctcct 900 ctttgctagc actacttgcc tacctaccta ctctactcta ctacgctgcc atattgtcta 960 acattctgct ttctctattt ctacctggcc tggatggctc cgtctcgccc gcctcacacg 1020 cacacacata caaacacatt ccttccccct ctcgcctgcc ccataataat taaactagtt 1080 aacaaaaggc tttacgtctt ccgctacctc tccaatctca tacgactctc ctttcatccg 1140 acttacccaa gaagatgcag gatctaagtc aaagatcctg cctgccctgg ctgttgtcta 1200 ctgtacacac gagatttgga aggccagggg actgtcgcat gattattcgc cgggaacccg 1260 gaagttccct gttcttacct ttcaaactag gcagcaaacc aggtgaacac attttgatgt 1320 agtaggcctt tgaagattcg gggagctagc tagccacgcg aatgtaacaa cagaacattt 1380 atttttgtgg gggtggaaaa gtcgattatg atcttgcagc acagaaactg cgcaggggct 1440 tttttcatct tggagaagca actggctaaa ttcgacacaa acaaaaactg aaaaatggaa 1500 aataaaaaat gaaaaagcaa gctgaattcg aagaagggag aattccgcct tctgcaacca 1560 cactaatggt tggtagtcaa tggatacgca ttagaaggtg actattttat gagtcgatcc 1620 ccgcggaaat ttaggaattt taaacttggg cttgatatac gtaggtatag tgtatctggt 1680 atttttgcca atggttcctg tgcccgtgcc catgtccgtg tgctcatgcg atgcactgtg 1740 actactgctt ggcaaggcaa atcggcggcc tgcggccgta ctctaaagcc ggacaggcat 1800 ggtggggtgc cttttcggtc cataagtgta gctagatagc tagctagcta cacgtatgtt 1860 ctgtgcgaag atggtaaagg ttgcatacag tcaggctgct gtctttggac ctggtctgac 1920 ctgacctagc ataatattgc atagcgtata cccacttgga tggatgcagg agtgctacaa 1980 atcggcgaac agttctcctt gtttgttttt ggtcatagtc acgtccggct acacacaaga 2040 tattgcacag tatgtgtaga tacgagcgaa ggtacggctg gaaaacaggt gggttttgga 2100 tgatagacag aaggcaagag ggtgggcaag aagtcgggca cacaggcaag tattagcatg 2160 gtcaaaccag attaaggtct aggccaagaa caattttcgg ccccccactg actcccgcca 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacctaattt gacagtctcg gaattttatc tatctgttcc 2280 tttcatttgg taactagtat cgtcactttt tttttggaat tggcaagcta cctgcatggc 2340 cgtataccga atgaacccca gaaaatggta tagctaagct ttcgtacgac ggaaatatgt 2400 agagcgaagg gttcttggtc tgtgaaaggg gttttctgta ctacgtaaag aggggtcttc 2460 attatagctt ttcaatggat tcgaaatgga agtaagcgta agagaatgaa aaacaagaaa 2520 atagttagaa ataaaaaaaa aaaaaaacac ttggctgtct gccggacttg tcttgtcttg 2580 gtggaaatca ttactccttg gcgggcgatg aatgtgcttc tgcttctttt cattaataca 2640 taccgtcatt ggtagtattc tgatttcatt tctccacacc attttttttg cgttagtcgt 2700 ctgcggtata tgcgaccctg gccgttcggt gcgccgagtg cgtttacctg tgtaggcgct 2760 tttgtaagag agaaactcgg gtctgggtgg gcctgcaacg tgacttagca atacccgcgc 2820 gtcagattta acatattcgg gattcttccc tccgtagtag aaagttgaca ataagatgtc 2880 catactgttg ttgatacctt gctactctag ctcattatta caaggacagc cggttaattg 2940 gaggcctaaa tggtgtatca aggtatataa agccaataac tttcaatgtt gagttgggct 3000 gtagttcaag gtggttgtag cttgtggaac atatatatgc tattcaatat agctagaaag 3060 tgtaagctaa acagcaagct aaacagcaaa caaaagtctg tgtgtgttgt cttataatta 3120 tatccttcag tcagtgttaa taattaaaga cagaattacg aaaaataaaa caggacgata 3180 atcagttttc ata 3193 <210> 27 <211> 2822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 27 atctttcagt tctcgatgag tatgtgtgtt tatttttttt tttttttgcc aaattctgct 60 ctttcctaaa tttcaagtgt taagcgcttt tgtctcttca ccttttccaa ctacaagcgc 120 aacataagaa aaggataata attctactag gaaacacaaa cctcatatac ctttcgagtt 180 agggaagaac accttcacaa tgataacaca ttgattcgag ctattaaata cctttttctc 240 aatcgaaatc tcaagtaaaa cagcgatgaa aacattacgt aactaatggt gttcaccact 300 agaaatcata cccttcacac tcgacttcaa gtagtgaatg gtgtagcaac aaagtccaaa 360 tgccaatatc aaccaagtaa ccaaccgcgc tactagagaa agacgctgtt gctcggacca 420 caaatttccg ctacactttt cacaactata ctgaatatac aaaaaaacgt ttgtgtgggt 480 atggctggct accaggtcgc ctggttaaac caagtcaacg tgatacatat gtacattcca 540 acactaagcc taccctaagt tttagctcac aggctaggct attattaaca tacaagacaa 600 gggagaagca aagaaaagac caaccgaaag ccaccagagc accctgaact ttgcggtgaa 660 cagaattccg caacatatct gaggattcca tgatctcggt ttcctactcc aaatgggaat 720 cacccactgt tgtccgtaaa tatgactaaa ttcctacctt gattcctcac gaacaatcgc 780 agtccgaaaa gccgttccaa aagccagtcc acagttcatc gattggtatg attattgttt 840 ttttgttcaa actgacacac taacggtgtt gtatgcgaag agtgagctta cccttctcct 900 ctttgctagc actacttgcc tacctaccta ctctactcta ctacgctgcc atattgtcta 960 acattctgct ttctctattt ctacctggcc tggcctgcag gggctccgtc tcgcccgcct 1020 cacacacata cattcctccc cctctcgcct gccccataat aattaaacaa gttaacaaaa 1080 ggcgttacct cttccgcatc ctctccaatc tcatacgatt cccctttcat ccgacttacc 1140 caacaagata caggatctca gtgaaagatc cttcctgccc tccctgtctg ttgtctactc 1200 tacatgcgac ttggaaggcc aaaggactat cgcatgatta ttcgccggga acccgcgagt 1260 tccctgctct tttctttcaa accaggcagc aaaccaggtg aacacactct gatgtagtgc 1320 agtccctaag tcctttgaag attcggggag ctagctaccc acgcgaatgt aacaaaagaa 1380 catttacttt tgtggggggt ggaaaagtcg attaggatct tgcagcacag aaactgcgca 1440 ggggtttttt tcatcttgga gaagcaactg gctaaattcg acacaaacaa aaactgaaaa 1500 atggaaaata aaaaatgaaa aagcaagctg aattcgaaga agggagaatt ccgccttctg 1560 caaccacact aatggttggt agtcaataga tacgcattag aaggttacta ttttatgagt 1620 cgatccccgc ggaaatttag gaattttaaa cttgggcttg atatacgtcg gtatagtgta 1680 tctggtattt ttgccaatgg ttcctgtgcc cgtgcccgtg cccgtgtgct catgcgatgc 1740 attgtgacta ctgcttggca aggcaaatca gcggtctgcg gccgtactct aaagccggac 1800 agacatggtg gggtgccttt tcggtccata agtgtaacta gctagctaca agtatgttct 1860 gtgcaaagat ggtaaaggtt gcatacagtc aagttgctgt ccttggacct ggtctgacct 1920 gacctagctt aacattgcat agcgcatacc cacttggatg gatgcaggag tgttacaaat 1980 cggcgaacag ttctccttgt ttgtttttgg tcatagtcac gtccggctac acacaagata 2040 tggcacagta tgtgtagatg cgagcgaaga tacggctgga aaacaggtgg gttttgaagg 2100 atagacagaa ggcaagaggg tgggcaaaaa gtcgggcact caggcaagta ttggcatgat 2160 caaaccagat taagttctag gccaagaaca tatttcggcc cactgactcc cgccaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaacctaatt tgacagtctc ggaattttat ctatctgttc ctttcctttg 2280 gttactagta tcgtcattta attttttttg gaattggcaa gctacctgcg tggctctata 2340 ccgaatgaac cccgaccctg gccgttcggt gcaccgagcg cgtttacgta tgtacacgct 2400 tttgtaagaa agaaactcgg gtctgcgtgg gcctgcaacg tgacttagca atacccgcgc 2460 gtcagattta acatattccg gattcttccc tccgtactag aaagttgaca ataagatgtc 2520 catactgttg ttgatacctt gctactctag ctcattatga caaggacaat cggttaattg 2580 gaggtctaaa tggtgtatca aggtatataa aggcagtaac tttcaatgtt gagttgggct 2640 gtagttcaag gtggttgtag cttctggaac atatatatgc tattcaatat agctggaaag 2700 tgtaagctaa acagcaaaca aaagtctctg tgtgttgtct tataattata tccttcagtc 2760 agtgttaatg attaaagaca gaattacgaa aaaataaaac aggacgataa tcagttttca 2820 ta 2822 <210> 28 <211> 2361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 28 ttctagttgt tggttgttgt ttttggagtt agtttgtagc tagcgtttta atgcttgatt 60 gctggtgttt gtagttcaaa agatattata attgagaaac aatgggacaa gtaacgagat 120 gggttaggat tggattgttg taaattgggt caatttgctg gtccttatat acagattgaa 180 cgacgaagat gttggatctc gttcctcaaa gtgttgccga tatgttgggg caagcaaaca 240 agcaggcagg caggctgcca ggcgggcagc cagtcagtca atcagtcagt cagttagcca 300 gccatcagct gtccaatatt agctacctta gcttaaggca aacacaaaca cacacggttt 360 ccgcgcggga agcccaaagc ccagtaaacg cagcagtacc tgcgtgagca tgtaagaagc 420 actaagacgt gatcttgatc ttgaacttga actactacca ctgcagcgcc tgctgcccgt 480 ctgtttgggt tttggcttgg cttttgggct tcgaaggaag cattgggctt tcacagacaa 540 ccgcgtagac ccctcacttg tggtcaaaaa agaacccttc gaaaaacaaa acagggaaaa 600 atggaaaaaa aaaccgtatg agaaaaaggt atggttccac tcaatcaccg gccatctcgc 660 actggtgatc tcacaaagag gaagtgtttg agaacgaata aaaaaaaaat ccgagcccag 720 tgcacgccct gcagtaggtg ttgtagcagt gggtgggtgg gtattgctta aacggaaaaa 780 cttacgagaa tcaacggaaa aaaaaaaaat taacaaaacc aaaccaaaca aacctgggtc 840 tgagatagga tagggcaggc agtgagtatt tggttggttg gtgggtgggt ggttacgagc 900 cagcagcacc agggaaacga gaggagtaat gagaaatgaa gactgcgaac cacttctgga 960 agaaacaaca tacacggacg agagagatca ggttacttaa aagaggaagc tgcgggccag 1020 ctgatttcgg actacaggaa gctgaaggtg tgttttcaag gaatccggag aggaggccgc 1080 cagaggctag gccagaggct aggccagagg cgaggcaaaa ggcgaagcta aaaaaaagga 1140 atccggacaa ctctcctacc cccctattat ttgcaatact ggaacccagg ctggtgagcg 1200 agcgcgagta cgtgtgctct ctttagtgga acccaccgga actcactgga agccagcttc 1260 ctgtcacgtg acaggaagcc agaacccctc ctcgcctctc cttgccccct ccaataagaa 1320 tcgttacata ccaacaaaaa cacccacacc cacacaccca caactacact cctatcgcac 1380 aggaagccag gactccgaac agctagctgc ttgcttgctg ctcgcttgtt gcctgcttgc 1440 tgcctgccta caaaccaacc aaccttaaaa cgctctctgt tgccttctac caccgcacca 1500 gcccagaacc ccacgcacca ccagtggcac catctccgag aatcgtccct cccccggacg 1560 tccttaagtc ataccactgc aaccactcaa ctctgaaacg cacctggctt ccacttttct 1620 gcacaggctc ccagctacca catttcccca gaaattctcc catccatgcc cctacaatta 1680 aaaatcacct tcccacaact ccgcagagaa ccagagcaca tgattggcat ccctagcccc 1740 catcactact ggattctcgg ttgttacact gcaacgtgca ttcttctatg ccactctacg 1800 ctgtggtttc ctagtgtttc caaaccagat ttcttggtgt ttcgtggcga tttcctgatt 1860 tcctgatttc ctggtttcct gattccttcc ttccttcctg gtggtgtctc tctttctgtg 1920 tgttttttct ttctttcttt ctttattgct tgcttgctgc catgctgcta ccttaattct 1980 tcttttttcc taccctaatt cttgtaattt gtaatgaaag acaagaccac catacataca 2040 cacatacatg atatcgtggc attgtgccat ggcaccatgg aatgggatat gggatatatg 2100 gcaccgtctt tacttagctc cgaagctttg aggatccgaa atttggtata taaggggtgg 2160 aacattgtca gaaagaagca atccatccaa gttgtcttga tgtcagtttt agtttagatg 2220 tttcagcatt tagttttagt gttagcttgt ctactctccc caaggaacaa ggacactttt 2280 tcatacaaag tcttctgttt gcacgaattt aattgcgtac gttctccccc acacacaact 2340 caactcagat aattttaaaa g 2361 <210> 29 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator Sequence <400> 29 tcagtactga caataaaaag attcttgttt tcaagaactt gtcatttgta tagttttttt 60 atattgtagt tgttctattt taatcaaatg ttagcgtgat ttatattttt tttcgcctcg 120 acatcatctg cccagatgcg aagttaagtg cgcagaaagt aatatcatgc gtcaatcgta 180 tgtgaatgct ggtcgctata ctgctgtcga ttcgatacta acgccgccat ccagtgtcga 240 aaacgagctc 250 <210> 30 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator Sequence <400> 30 aagtgtcgaa cttgaaaata tcaatggaaa agaatcaatc agtggattcg aagaaagttc 60 tactttctaa ctcagcttca cccgtacctc tagtcgaaac cacattggag ctaaacatta 120 gaagccagtt aggagatttc ttttcttcaa gggtaggatg ttagtgtaat atatttatat 180 tcatacatat atatatatgt atttacgagt gttttaaggt gatatgaaat tccttatcaa 240 acctatcaat 250 <210> 31 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator Sequence <400> 31 atagtttgtc caaatctgtc gttaacaaaa actatacaaa ccagattttt atgagctttc 60 tgtaaaaaaa taacaatata aatgttttca aaacgagtaa gcagtctaac tctgcttgga 120 acctatatat acgcgtctct tgtaaacacc atatgtagtg tcagaataac ttgtcagctc 180 aactgaaata gtactaggat ttataaaaaa aatataataa ccgggtaaca aattttgttc 240 tggtcgtttt tg 252 <210> 32 <211> 190 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator Sequence <400> 32 atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 60 ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 120 gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 180 acgctcgaag 190 <210> 33 <211> 188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator Sequence <400> 33 gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60 tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttgttctt gagtaactct 120 ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc 180 tctaccgg 188 <210> 34 <211> 2805 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP2 modified sequence <400> 34 atggcataca gaaagagagg tgcaaaaaga gaaaactcat cacaacaaaa cgaaagatta 60 caagaaaagg aagtagaaaa gaacattgat gcatctatgg aaaataaggc taacaataag 120 aaacaacaat tgccagataa ggttttgtca caaaaggaag aaatcatcac tgatgctcaa 180 gatgatgtta agatcacaga tgaagttaag aaatcttcaa aagaagaatc taagcaattg 240 ttggaaattt tgaagactaa agaagatcat caaaaagaaa ttcaatacga aattttacaa 300 aagactatcc caacattcga accaaaggaa tcaatcttga agaaattgga agatatcaag 360 ccagaacaag ctaagaaaca aactaagttg tttagaatct tcgaaccaag acaattgcca 420 atctatagag ctaatggtga aagagaattg agaaacagat ggtactggaa gttgaagaga 480 gatacattgc cagatggtga ctatgatgtt agagaatact ttttgaattt gtacgatcaa 540 attttaatcg aaatgccaga ttatttgttg ttgaaggata tggcagttga aaataagaac 600 tctagagatg ctggtaaagt tgttgattct gaaactgcat caatctgtga tgctatcttc 660 caagatgaag aaacagaagg tgttattaga agattcattg cagatatgag acaacaagtt 720 caagctgata gaaacgttgt taactaccca tctatcttgc atccaatcga tcatgctttt 780 aatgaatact ttttgaacca tcaattggtt gaaccattga acaacgaaat cattttcaat 840 tacattccag aaagaattag aaatgatgtt aattatattt tgaatatgga tatgaatttg 900 ccatctactg ctagatacat tagaccaaat ttgttgcaag atagattgaa tttgcatgat 960 aacttcgaat cattgtggga tactatcact acatctaact acatcttggc aagatcagtt 1020 gttccagatt tgaaggaaaa ggaattagtt tctacagaag ctcaaatcca aaagatgtca 1080 caagatttgc aattggaagc attgactatc caatctgaaa cacaattctt ggctggtatt 1140 aattcacaag ctgcaaacga ttgtttcaag actttgatcg ctgcaatgtt gtctcaaaga 1200 acaatgtcat tggaattcgt tactacaaac tacatgtctt tgatttcagg catgtggttg 1260 ttgactgtta ttccaaacga tatgttcttg agagaatctt tggttgcttg tgaattggca 1320 attattaaca ctatcgttta cccagctttc ggtatgcaaa gaatgcatta cagaaatggt 1380 gacccacaaa caccatttca aattgcagaa caacaaatcc aaaacttcca agttgctaac 1440 tggttgcatt tcatcaacaa caacagattc agacaagttg ttattgatgg tgttttgaac 1500 caaactttga acgataacat cagaaatggt caagttatta atcaattgat ggaagctttg 1560 atgcaattgt ctagacaaca attcccaaca atgccagttg attacaagag atcaatccaa 1620 agaggtatct tattgttgtc aaacagattg ggtcaattgg ttgatttgac tagattgttg 1680 tcatacaact acgaaacttt gatggcttgt atcacaatga acatgcaaca tgttcaaaca 1740 ttgactacag aaaagttgca attgacttct gttacatcat tgtgtatgtt gatcggtaac 1800 actacagtta ttccatctcc acaaactttg ttccattact acaacgttaa cgttaacttc 1860 cattcaaatt acaatgaaag aattaatgat gctgttgcaa tcatcacagc tgcaaacaga 1920 ttgaatttgt accaaaagaa aatgaaatct attgttgaag aatttttaaa aagattgcaa 1980 atttttgatg ttccaagagt tccagatgat caaatgtaca gattgagaga tagattgaga 2040 ttgttgccag ttgaaagaag aagattggat atttttaatt tgatcttgat gaatatggaa 2100 caaatcgaaa gagcatctga taagatcgct caaggtgtta ttatcgcata cagagatatg 2160 caattggaaa gagatgaaat gtacggttac gttaacatcg ctagaaattt ggatggttac 2220 caacaaatta atttggaaga attgatgaga actggtgact atggtcaaat cacaaacatg 2280 ttgttgaaca accaaccagt tgctttggtt ggtgcattgc cattcgttac tgattcttca 2340 gttatttctt tgatcgctaa gttggatgca actgttttcg ctcaaatcgt taagttgaga 2400 aaagttgata cattgaaacc aatcttgtac aagattaatt ctgattcaaa tgatttttac 2460 ttagttgcaa attatgattg gatcccaaca tcaactacaa aggtttacaa gcaagttcca 2520 caaccattcg atttcagagc ttctatgcat atgttgactt caaatttgac ttttacagtt 2580 tactctgatt tgttggcatt tgtttcagct gatacagttg aaccaattaa tgctgttgca 2640 ttcgataaca tgagaatcat gaacgaattg ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttca 2700 ggttatccat acgatgttcc agattatgct ggttatccat acgatgtccc tgattatgct 2760 ggttcttatc cttacgatgt ccctgactat gctgctcaaa agtga 2805 <210> 35 <211> 2463 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP4 modified sequence <400> 35 atggcttctt tgatctatag acaattgttg actaactcat acacagttaa tttgtctgat 60 gaaatccaag aaatcggttc tgctaagtct caagatgtta ctattaatcc aggtccattt 120 gctcaaacag gttacgcacc agttaattgg ggtgcaggtg aaactaatga ttctactaca 180 gttgaaccat tgttagatgg tccataccaa ccaactactt ttaatccacc aacttcttat 240 tgggttttgt tagctccaac agttgaaggt gttattatcc aaggtacaaa caacactgat 300 agatggttgg caactatctt gatcgaacca aacgttcaaa ctacaaacag aatctataat 360 ttgtttggtc aacaagttac attgtcagtt gaaaacacat ctcaaactca ttggaagttt 420 attgatgttt caactacaac tccaactggt tcttacacac aacatggtcc attattttca 480 actccaaagt tgtacgctgt tatgaaattt tctggtagaa tctatacata caatggtaca 540 actccaaatg caacaactgg ttactactca acaactaact acgatactgt taacatgaca 600 tctttctgtg atttctacat tattccaaga aaccaagaag aaaagtgtac tgaatacatc 660 aaccatggtt taccaccaat ccaaaacaca agaaacgttg ttccagtttc attgtctgct 720 agagaaattg ttcatactag agcacaagtt aacgaagata tcgttgtttc aaagacatct 780 ttatggaaag aaatgcaatg taacagagat atcactatca gattcaaatt cgatagaaca 840 attattaagg ctggtggttt gggttataaa tggtcagaaa tctcttttaa accaatcact 900 taccaataca catacgctag agatggtgaa caaattactg cacatacaac ttgttctgtt 960 aacggtgtta acaacttctc atacaacggt ggttctttgc caacagattt cgctatctca 1020 agatacgaag ttattaaaga aaattctttt gtttacattg attattggga tgattcacaa 1080 gcttttagaa acatggttta cgtcagatct ttggctgcaa atttgaatac agttacttgt 1140 acaggtggtt catactcttt tgctttgcca ttaggtcatt atccagttat gacaggtggt 1200 actgtttcat tacatccagc aggtgttaca ttgtctactc aattcactga tttcgtttca 1260 ttgaactctt tgagattcag attcagatta actgttggtg aaccatcatt ttctatcact 1320 agaacaagag tttctagatt gtacggttta ccagctgcaa atccaaacaa ccaaagagaa 1380 tactacgaaa tctcaggtag attttcattg atctctttgg ttccatctaa cgatgattac 1440 caaactccaa tcatgaactc agttacagtt agacaagatt tggaaagaca attgggtgaa 1500 ttgagagatg aattcaattc attgtctcaa caaatcgcta tctctcaatt gatcgatttg 1560 gcattgttgc cattggatat gttctcaatg ttctctggta ttaaatcaac tatcgatgct 1620 gcaaagtcta tggctacaaa cgttatgaag agattcaaaa gatcaaattt ggcttcttca 1680 gtttctactt tgacagatgc aatgtcagat gctgcatctt caatctctag atcttcatct 1740 atcagatcaa ttggttcatc tgcttctgca tggactgaag tttcaaattc tatcgctgat 1800 gtttcaacaa ctgttgatac agtttctact caaacagcta ctatcgcaaa gagattgaga 1860 ttgaaggaaa tcgcaacaca aactgatggt atgaacttcg atgatatctc tgctgcagtt 1920 ttgaagacta agatcgataa gtcagttcaa attactccaa atacattgcc agaaatcgtt 1980 actgaagctt ctgaaaagtt tattccaaac agaacataca gagttattaa taacgatgaa 2040 gttttcgaag ttggtatgga tggtaaattt ttcgcttaca gagttgatac tttcgatgaa 2100 atcccattcg atgttcaaaa gttcgctgat ttggttactg attcaccagt tatttctgca 2160 atcatcgatt tgaagacatt gaaaaatttg aaagataatt atggtatctc aaagcaacaa 2220 gctttcgatt tgttaagatc tgatccaaga gttttgagag aattcattaa ccaaaacaac 2280 ccaatcatca gaaatagaat tgaaaatttg attatgcaat gtagattggg tggtggtggt 2340 tctggtggtg gtggttccgg ttacccatat gatgttccag attacgctgg ttatccttat 2400 gatgttccag attatgcagg ttcctatcca tacgacgttc cagattatgc tgcacaaaaa 2460 taa 2463 <210> 36 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP6 modified sequence <400> 36 atggaagttt tgtactcttt gtccaagact ttgaaggatg ccagagataa gatcgttgaa 60 ggtactttgt actctaacat ttctgatttg atccaacaat tcaaccaaat gattgttacc 120 atgaacggta acgacttcca aactggtggt atcggtaact tgccaattag aaactggaac 180 ttcgacttcg gtttgttggg taccactttg ttgaacatcg atgctaacta cgttgaaaac 240 gctagaacca ctatcgaata cttcatcgac ttcatcgata acgtttgtat ggatgaaatg 300 gctagagaat ctcaaagaaa cggtatcgct ccacaatctg aagccttgag aaagttgtcc 360 ggtatcaagt tcaagagaat taacttcgac aactcttccg attacatcga aaactggaac 420 ttgcaaaaca gaagacaaag aaccggtttc gttttccaca agccaaacat tttgccatac 480 tctgcttcct tcaccttgaa cagatcccaa ccagctcacg acaacttgat gggtactatg 540 tggatcaacg ctggttctga aattcaagtt gctggtttcg attactcctg tgctttcaac 600 gctccagcta acatccaaca attcgaacac gttgttccat tgagaagagc tttgaccact 660 gctaccatca ctttgttgcc agacgctgaa agattctctt tcccaagagt tattaactcc 720 gctgatggtg ctaccacttg gtacttcaac ccagttatca ttagaccatc taacgttgaa 780 gttgaatttt tgttgaacgg tcaaatcatt aacacctacc aagctagatt cggtactatc 840 attgctagaa acttcgacac catcagattg tccttccaat tggttagacc accaaacatg 900 actccagctg ttgctaactt gttcccacaa gctccaccat tcatcttcca cgctaccgtt 960 ggtttgactt tgagaattga atctgctgtt tgtgaatccg ttttggctga tgcttctgaa 1020 accttgttgg ctaacgttac tgctgttaga caagaatacg ctatcccagt tggtccagtt 1080 ttcccaccag gtatgaactg gaccgaattg attactaact actctccatc cagagaagac 1140 aacttgcaaa gagttttcac cgttgcttct atcagatcca tgttgatcaa gggtggtggt 1200 ggttctggtg gtggtggttc cggttaccca tacgacgttc cagattacgc tggttaccca 1260 tacgatgttc cagactacgc cggttcctac ccatacgatg ttccagacta cgctgcccaa 1320 aagtaa 1326 <210> 37 <211> 1113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRVA VP7 modified sequence <400> 37 atgtacggta tcgaatacac tacagttttg acatttttga tttctttggt tttcgttaac 60 tacatcttga agtcagttac tagaacaatg gattttatta tctatagatt tttgttagtt 120 attgttgttt tggctccatt gattaaagca caaaactacg gtattaattt gccaatcact 180 ggttctatgg atacaccata catgaactct actacatcag aaacattttt gacttcaaca 240 ttgtgtttgt actacccaaa cgaagctgca actgaaattg ctgatacaaa gtggactgaa 300 acattgtctc aattgttttt aactaaaggt tggccaacag gttcagttta cttcaagggt 360 tacgctgata tcgcatcttt ttcagttgaa ccacaattgt actgtgatta caacatcgtt 420 ttgatgaaat atgatggtaa tttgcaattg gatatgtctg aattggctga tttgatcttg 480 aacgaatggt tgtgtaaccc aatggatatc atgttgtact actaccaaca aactgatgaa 540 gcaaataagt ggatctctat gggtacttca tgtacaatta aagtttgtcc attgaatact 600 caaacattgg gtattggttg ttctactaca gatatcaact cattcgaaac tgttgctaac 660 gcagaaaagt tggctatcac agatgttgtt gatggtgtta accataagtt ggatgttact 720 acatcaactt gtacaatcag aaactgtaag aaattgggtc caagagaaaa tgttgcagtt 780 attcaagttg gtggtccaaa tattttggat attactgctg atccaactac agcaccacaa 840 acagaaagaa tgatgagaat taattggaag agatggtggc aagttttcta tactatcgtt 900 gattacgtta accaaatcgt tcaagttatg tctaagagat ctagatcatt ggattcagct 960 gcattttact atagagttgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttcagg ttacccatat 1020 gatgttccag attacgctgg ttatccttat gatgttccag attatgcagg ttcctatcca 1080 tacgacgttc cagattatgc tgcacaaaaa taa 1113 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 primer <400> 38 caaatgttgt ggctgcacct ac 22 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 primer <400> 39 caaacgtatg cgtacgaaat c 21 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3 primer <400> 40 ctcaggatat aggaaacatg aagg 24 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P200 primer <400> 41 aagaagactt agccatggca 20 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P204 primer <400> 42 gaagaaccaa taatgttaat atgac 25 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P162 primer <400> 43 tatgaaaact gattatcgtc ctgt 24 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P532 primer <400> 44 tatgtctgct ttggagcaca 20 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P512 primer <400> 45 gttgacgtta acatgattgg a 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P118 primer <400> 46 atctttcagt tctcgatgag 20 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P375 primer <400> 47 cggcaaaaaa acgcaggatc tg 22 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P172 primer <400> 48 attgagaatc acctaaacca aacacgg 27 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P533 primer <400> 49 actgcagtta agattccagc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P514 primer <400> 50 gccagaaata caacacctct 20

Claims (15)

  1. 적어도 하나의 게놈 통합된 발현 카세트를 포함하는 재조합 효모 세포로서, 각각의 발현 카세트는
    (i) 양방향성 프로모터 구성요소;
    (ii) 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자로서, 상기 제1 및 제2 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 반대 말단에 위치되고, 각각의 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 한쪽 측면에 작동적으로 연결되는 것인 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자;
    (iii) 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자로서, 상기 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자의 바로 하류에 위치되고, 상기 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자의 바로 하류에 위치되며; 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자에 작동적으로 연결되고, 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자에 작동적으로 연결되는 것인 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자; 및
    (iv) 적어도 하나의 선택 마커
    를 포함하고,
    각각의 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하고, 재조합 효모 세포는 반수체 및 헤테로탈릭인, 재조합 효모 세포.
  2. 제1항에 있어서, 병원체는 바이러스 병원체인, 재조합 효모 세포.
  3. 제2항에 있어서, 병원체는 레오비리다에 과에 속하는 바이러스 병원체이고, 바람직하게 상기 바이러스 병원체는
    a) 로타바이러스, 바람직하게 돼지 로타바이러스 A (PRVA) 또는 돼지 로타바이러스 C (PRVC); 또는
    b) 오르비바이러스, 바람직하게 아프리카 말병 바이러스 (AHSV) 또는 청설병 바이러스 (BTV)인, 재조합 효모 세포.
  4. 제2항에 있어서, 바이러스 병원체는
    a) 돼지 파보바이러스 (PPV), 바람직하게 돼지 파보바이러스 1 (PPV1) 또는 PPV2; 또는
    b) 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV)인, 재조합 효모 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 양방향성 프로모터 구성요소는
    a) 임의로 LAC4-LAC12 프로모터, GAL1-GAL10 프로모터 및 GAP1-ADH2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 천연 양방향성 효모 프로모터 구성요소; 또는
    b) 임의로 TDH3/ADH1 프로모터, GAL1/GAL10-GPD 프로모터 및 TEF1/PGK1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하이브리드 양방향성 프로모터 구성요소인, 재조합 효모 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 양방향성 프로모터 구성요소는 제1 및/또는 제2 이식유전자의 유도성 또는 억제성 발현을 가능하게 하는 것인, 재조합 효모 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 발현 카세트는 ADE1, ADE2, ADE8, ECM31, HIS2, HIS3, HIS5, LEU1, LEU2, LYS2, LYS5, MET5, MET17, TRP1, TRP3, TRP4, TRP5, TYR1, URA3, URA5, FCY1, GAP1, LAC4 + LAC12, XYL1 및 XYL2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 염색체 유전자좌에서 게놈 통합되는 것인, 재조합 효모 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 선택 마커는 내성 마커 또는 물질대사 선택 마커, 바람직하게 물질대사 선택 마커인, 재조합 효모 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 효모 세포는 MATa에서 MATα로 교배형 전환에 필요한 유전자 또는 MATα에서 MATa로 교배형 전환에 필요한 유전자를 비기능성으로 만드는 결실 및/또는 돌연변이를 포함하는 것인, 재조합 효모 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 제1 및 제2 반수체 재조합 효모 세포를 교배하여 수득되는 것인 이배체 재조합 효모 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상동 염색체에 위치된 염색체 유전자좌에서 게놈 통합되는 적어도 2개의 선택 마커를 포함하는 것인, 이배체 재조합 효모 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 따른 적어도 하나의 재조합 효모 세포를 포함하는 백신 조성물.
  13. 감염성 질환에 대해서 대상체를 백신접종하는데 사용을 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 효모 세포, 또는 제12항에 따른 백신 조성물.
  14. 제10항에 따른 적어도 하나의 이배체 재조합 효모 세포를 포함하는 전체 효모 백신을 제조하기 위한 방법으로서, 방법은
    제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 제1 및 제2 반수체 효모 세포의 교배를 통한 이배체 재조합 효모 세포의 생성 단계를 포함하고,
    제1 효모 세포는 교배형 MATa이고, 제1 발현 카세트를 포함하고, 제2 효모 세포는 교배형 MATα이고, 제2 발현 카세트를 포함하고, 제1 및 제2 발현 카세트는 동일한 염색체 유전자좌에서 제1 및 제2 효모 세포의 게놈으로 안정하게 통합되고, 제1 및 제2 효모 세포는 반수체, 헤테로탈릭 및 교배 적격이고;
    각각의 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 것인, 제조 방법.
  15. 야생형 효모 균주로부터 이배체 재조합 효모 세포를 제조하기 위한 방법으로서,
    (a) 제1 및 제2 효모 세포가 각각 헤테로탈릭, 동종동계 및 교배 적격이도록, 야생형 효모 균주로부터 교배형 MATa의 제1 효모 세포 및 교배형 MATα의 제2 효모 세포를 생성시키는 단계;
    (b) 적어도 하나의 결실 카세트로 제1 및 제2 효모 세포의 각각을 형질전환시켜서, 적어도 하나의 결실 카세트가 제1 및 제2 효모 세포에서 동일한 염색체 유전자좌에서 숙주 세포 게놈에 안정하게 통합되고, 효모 세포 게놈으로 안정한 통합은 필수 화합물의 합성에 필요한 유전자의 파괴를 야기하고, 바람직하게 필수 화합물은 비타민, 아미노산, 뉴클레오시드, 뉴클레오염기 또는 이의 하나 이상의 물질대사 전구체인, 단계;
    (c) 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 핵산 분자로 단계 (b)에서 수득된 제1 및 제2 효모 세포의 각각을 형질전환시켜서, 적어도 하나의 발현 카세트가 단계 (b)의 결실 카세트를 포함하는 염색체 유전자좌에서 효모 세포 게놈에 안정하게 통합되어, 단계 (b)의 필수 화합물을 합성하는 제1 및 제2 효모 세포의 능력을 복원시키는 것인 단계; 및
    (d) 단계 (c)에서 수득된 제1 및 제2 반수체 효모 세포의 교배 또는 스페로플라스트 융합을 통해서 이배체 효모 세포를 생성시키는 단계를 포함하고,
    야생형 효모 균주는 유전자 선택 마커를 포함하지 않고, 각각의 결실 카세트는 적어도 하나의 마커 유전자, 바람직하게 영양요구성 마커 유전자; 및 임의로 마커 유전자에 측접된 loxP 부위를 포함하고; 각각의 발현 카세트는
    (i) 양방향성 프로모터 구성요소;
    (ii) 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자로서, 상기 제1 및 제2 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 반대 말단에 위치되고, 각각의 이식유전자는 양방향성 프로모터 구성요소의 한쪽 측면에 작동적으로 연결되는 것인 제1 이식유전자 및 제2 이식유전자;
    (iii) 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자로서, 상기 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자의 바로 하류에 위치되고, 상기 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자의 바로 하류에 위치되며, 제1 전사 종결자는 제1 이식유전자에 작동적으로 연결되고 제2 전사 종결자는 제2 이식유전자에 작동적으로 연결되는 것인 제1 전사 종결자 및 제2 전사 종결자; 및
    (iv) 적어도 하나의 선택 마커; 및
    (v) 단계 (b)의 필수 화합물의 합성에 필요한 유전자를 복원시키기 위한 서열을 포함하고,
    각각의 이식유전자는 병원체로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 것인, 제조 방법.
KR1020237018075A 2020-11-13 2021-11-12 백신 제조를 위한 효모 플랫폼 KR20230119635A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20207352.4 2020-11-13
EP20207352.4A EP4001417A1 (en) 2020-11-13 2020-11-13 Yeast platform for the production of vaccines
PCT/EP2021/081604 WO2022101456A1 (en) 2020-11-13 2021-11-12 Yeast platform for the production of vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230119635A true KR20230119635A (ko) 2023-08-16

Family

ID=73448813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237018075A KR20230119635A (ko) 2020-11-13 2021-11-12 백신 제조를 위한 효모 플랫폼

Country Status (5)

Country Link
EP (2) EP4001417A1 (ko)
KR (1) KR20230119635A (ko)
CA (1) CA3197962A1 (ko)
MX (1) MX2023005618A (ko)
WO (1) WO2022101456A1 (ko)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030044866A1 (en) * 2001-08-15 2003-03-06 Charles Boone Yeast arrays, methods of making such arrays, and methods of analyzing such arrays
US20150147774A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 National University Of Singapore Expression construct for yeast and a method of using the construct
US10787661B2 (en) * 2014-10-30 2020-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Scalable method for isolation and sequence-verification of oligonucleotides from complex libraries
CN105087406B (zh) * 2015-07-22 2019-03-05 天津大学 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
EP3635123A1 (en) * 2017-06-02 2020-04-15 Firmenich SA Method for producing albicanol and/or drimenol
DE102017012109A1 (de) * 2017-12-27 2019-06-27 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Optimiertes Wirts-/Vektorsystem zur Erzeugung protektiver mono- und multivalenter subunit-Vakzine auf Basis der Hefe Kluyveromyces lactis

Also Published As

Publication number Publication date
MX2023005618A (es) 2023-08-04
EP4244363A1 (en) 2023-09-20
CA3197962A1 (en) 2022-05-19
WO2022101456A1 (en) 2022-05-19
EP4001417A1 (en) 2022-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102666575B (zh) 分枝杆菌疫苗
KR20210149060A (ko) Tn7-유사 트랜스포존을 사용한 rna-유도된 dna 통합
US8142771B2 (en) Use of coccidian
JPH07506240A (ja) コレラトキシンの免疫原性無毒化変異体およびトキシンｌｔの免疫原性無毒化変異体，それらの調製，ならびにワクチンの調製のためのそれらの使用
CN113845576B (zh) 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用
CN111808176B (zh) 牛疱疹病毒抗原组合物及其应用
CN108602858A (zh) 嵌合rsv、免疫原性组合物以及使用方法
CN113073106B (zh) 新型冠状病毒b.1.525尼日利亚突变株rbd的基因及其应用
CA2859231C (en) Vaccination by means of recombinant yeast by creation of a protective humoral immune response against defined antigens
KR101765394B1 (ko) 돼지 유행성설사 바이러스의 에피토프 단백질, 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 이를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 돼지 유행성설사 바이러스 예방 또는 치료용 조성물
Zhang et al. Recombinant hemagglutinin protein and DNA-RNA-combined nucleic acid vaccines harbored by yeast elicit protective immunity against H9N2 avian influenza infection
CN115427071A (zh) 包含ltb和病原性抗原的组合物及其用途
JP6538071B2 (ja) 非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）及び使用する方法
KR20230119635A (ko) 백신 제조를 위한 효모 플랫폼
CN114107304B (zh) 一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法
CN107488676B (zh) 奶牛乳房炎致病菌三联表位基因与石斑鱼c型溶菌酶基因重组腺病毒的构建方法和应用
WO2022071492A1 (ja) インフルエンザウイルス抑制用の融合タンパク質およびこれを含む医薬組成物
CN116024247B (zh) 一种鳜蛙虹彩病毒疫苗及其制备方法和应用
KR102536927B1 (ko) 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질-8을 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 백신
CN111732667B (zh) 小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗
KR102568329B1 (ko) 조류인플루엔자 뉴라미니다아제를 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 범용 백신
KR101803088B1 (ko) 스트렙토코커스 파라우베러스 세포막 단백질을 이용한 백신 조성물
CN115029291A (zh) 表达鸭圆环病毒抗原Cap蛋白的重组禽多杀性巴氏杆菌，其制备方法和应用
CN117018174A (zh) 用于副鸡禽杆菌a型的酿酒酵母口服疫苗及应用
CN112592410A (zh) 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用