KR20230118753A - Diagnostic kit and diagnostic method capable of distinguishing HA and NA genotypes of Swine influenza virus - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HA 및 NA 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 H1, H3, N1 및 N2 유전형 감별이 가능한 유전자 진단용 조성물, 키트, 유전자 진단 방법을 이용하는 경우, 국내 및 해외 분리 돼지인플루엔자의 정확한 HA 및 NA 서브타이핑이 가능하여 인플루엔자 팬데믹에 대비하여 효과적인 돼지 인플루엔자의 예찰이 가능하다.The present invention relates to a composition for diagnosing swine influenza capable of distinguishing HA and NA genotypes, a kit, and a diagnostic method. When using the genetic diagnosis composition, kit, and genetic diagnosis method capable of distinguishing H1, H3, N1, and N2 genotypes of the present invention, accurate HA and NA subtyping of isolated domestic and overseas swine influenza is possible, which is effective in preparing for an influenza pandemic. Surveillance of swine influenza is possible.
Description
본 발명은 HA 및 NA 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 돼지인플루엔자의 H1, H3, N1 및 N2 유전형 감별이 가능한 유전자 진단용 조성물, 키트, 유전자 진단 방법에 관한 것으로, 국내 및 해외 분리 돼지인플루엔자의 정확한 HA 및 NA 서브타이핑이 가능하여 인플루엔자 팬데믹에 대비하여 효과적인 돼지 인플루엔자의 예찰이 가능하다.The present invention relates to a composition for diagnosing swine influenza capable of distinguishing HA and NA genotypes, a kit, and a diagnostic method. More specifically, it relates to a composition for genetic diagnosis, a kit, and a method for genetic diagnosis capable of distinguishing H1, H3, N1, and N2 genotypes of swine influenza, enabling accurate HA and NA subtyping of domestic and foreign isolated swine influenza to prevent influenza pandemic. In preparation for this, effective surveillance of swine influenza is possible.
현재까지 동물 인플루엔자가 종간전파를 통해 사람에 있어 팬데믹을 일으킨 사례는 총 4회로 알려져 있는데, 이중 3회는 조류 인플루엔자, 1회는 2009년 돼지 신종 인플루엔자(H1N1 pdm09)에 의한 팬데믹이었다. 당시 우리나라 농식품부는 인수공통전염병임을 사유로 돼지 H5, H7 및 신종 인플루엔자 A(H1N1)를 가축전염병예방법 상 제2종 가축전염병으로 지정하여 관리하였으며, 또한 검역본부는 산업체 공동연구를 통해 돼지 인플루엔자 RT-PCR법을 개발하여 보급한 바 있었다. 그러나 최근 이 키트를 사용시 i) H1N1의 경우 국내 바이러스가 변이됨에 따라 오진이 발생할 가능성 증가하였고, ii) 국내 발생 돼지 인플루엔자의 유전형이 H1N1 이외에도 H1N2와 H3N2가 있으나 subtyping이 불가능한 문제가 있었다. To date, a total of four cases have been known in which animal influenza caused a pandemic in humans through interspecies transmission, of which three were avian influenza and one was a pandemic caused by swine influenza in 2009 (H1N1 pdm09). At that time, the Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs of Korea designated swine H5, H7 and swine influenza A (H1N1) as the second type of livestock infectious disease under the Livestock Contagious Disease Prevention Act for the reason that they were zoonotic diseases, and the Quarantine Headquarters also conducted joint research with industries to control swine influenza RT- The PCR method was developed and disseminated. However, when using this kit recently, i) in the case of H1N1, the possibility of misdiagnosis increased as domestic viruses mutated, and ii) there were H1N2 and H3N2 genotypes in addition to H1N1, but subtyping was impossible.
특히, 2020년 6월 30일 중국에서는 2011∼2018년 도축장 등에서 3만건의 시료 중 검출된 179개의 돼지 인플루엔자 바이러스를 분리하여 분석한 결과, 2016년 이후 Eurasian avain-like(EA) H1N1 6가지 genotype중 G4의 검출율이 높아졌다는 연구결과가 발표된 바 있었다(Sun et al., 2020). 이에 따라 인플루엔자 EA H1N1 G4가 사람에 팬데믹을 일으킬 가능성이 높다고 제시하여 이를 모니터링할 필요성이 크게 제기되고 있다. In particular, on June 30, 2020, in China, as a result of isolating and analyzing 179 swine influenza viruses detected among 30,000 samples from slaughterhouses from 2011 to 2018, among the six genotypes of Eurasian avain-like (EA) H1N1 A study has been published that the detection rate of G4 has increased (Sun et al., 2020). Accordingly, it is suggested that influenza EA H1N1 G4 is highly likely to cause a pandemic in humans, and the need to monitor it is greatly raised.
본 발명자들은 본 발명은 HA 및 NA 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명의 조성물, 키트 및 진단 방법을 이용하면 국내 및 해외 분리 돼지인플루엔자의 정확한 HA 및 NA 서브타이핑이 가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. The inventors of the present invention made diligent research efforts to develop a swine influenza diagnostic composition, kit, and diagnostic method capable of distinguishing HA and NA genotypes. As a result, the present invention was completed by identifying that accurate HA and NA subtyping of domestic and foreign isolate swine influenza is possible using the composition, kit, and diagnostic method of the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 HA 및 NA 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for diagnosing swine influenza capable of distinguishing HA and NA genotypes.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지 인플루엔자 진단용 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing swine influenza comprising the composition.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 돼지 인플루엔자 진단 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing swine influenza using the composition or kit.
본 발명의 용어, "돼지 인플루엔자"는 A형 인플루엔자 바이러스가 주원인체로서 다른 세균이나 바이러스와 더불어 돼지 호흡기 질병 증후군(PRDC, Porcine Respiratory Disease Complex)을 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히, 돼지는 조류와 사람의 인플루엔자 A 바이러스와 결합하는 수용체를 모두 가지고 있어 이러한 새로운 재조합을 만들어낼 수 있는 혼합 용기(mixing vessels) 역할을 할 수 있다고 알려져 있다. 잠복기는 1~3일, 임상증상은 5~7일 그리고 바이러스 배출이 24시간 이내 시작되어 7~10일간 지속되는 것으로 보고되었다(OIE disease card). 돼지인플루엔자는 1918년 미국, 헝가리 및 중국에서 최초 보고 후 1930년 미국에서 최초 분리되었다. 우리나라를 포함하여 전세계적으로 주요하게 발생하는 아형(subtype)은 H1N1, H1N2 및 H3N2형 이다. 2009년 사람 신종인플루엔자 A(H1N1 pdm09)의 돼지 감염이 확인되면서 국내·외 모니터링과 연구가 강화되었고, 국내 돼지에서는 가축전염병예방법 상 신종 인플루엔자 A(H1N1), H5 및 H7 아형 바이러스는 제2종 가축전염병으로 관리되고 있다. 최근 중국에서 유라시아 조류 유사 (Eurasian avian like) EA H1N1 G4형이 보고되었으며, G4 H1N1은 사람 수용체에 잘 결합하고, 사람의 기도 상피 세포에서 잘 증식하며, 페렛 모델에서도 잘 감염되고 관련 업계 종사자에서 항체가가 높은 점을 들어 유행병(pandemic)으로 발전할 가능성이 높다고 보고되는 등 인수공통전염병으로서 공중보건학적으로 매우 중요한 질병이다. The term of the present invention, "swine influenza" is known to cause porcine respiratory disease syndrome (PRDC, Porcine Respiratory Disease Complex) along with other bacteria or viruses as the main cause of influenza A virus. In particular, it is known that pigs have receptors that bind to both avian and human influenza A viruses, and thus can serve as mixing vessels capable of creating these new recombinants. It has been reported that the incubation period is 1 to 3 days, clinical symptoms are 5 to 7 days, and viral shedding begins within 24 hours and lasts for 7 to 10 days (OIE disease card). Swine influenza was first isolated in the United States in 1930 after the first report in the United States, Hungary, and China in 1918. The major subtypes occurring worldwide, including Korea, are H1N1, H1N2, and H3N2. In 2009, as the infection of pigs with human influenza A (H1N1 pdm09) was confirmed, domestic and foreign monitoring and research were strengthened. It is managed as an infectious disease. Recently, an Eurasian avian like EA H1N1 G4 type was reported in China. G4 H1N1 binds well to human receptors, proliferates well in human airway epithelial cells, infects well in ferret models, and produces antibodies in related industries. It is a very important disease in terms of public health as a zoonosis, as it is reported that it has a high possibility of developing into an epidemic due to its high cost.
본 발명자들은 상술한 돼지 인플루엔자 바이러스의 예찰을 위한 돼지인플루엔자 진단용 조성물 및 진단 키트를 개발하기 위하여, 2009년 팬데믹 이후 보고된 염기서열을 중심으로 유라시아, 북아메리카 지역의 재조합 돼지인플루엔자 바이러스 및 국내 분리 돼지인플루엔자 바이러스의 염기서열을 중심으로 M, HA, NA, NS 유전자들을 각각 정렬(Sequence alignment)하고, 비교함으로써, 각 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스를 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 프라이머/프로브 세트를 설계하였다. 이때, 각 유전형에 대해서 필요한 경우에는 2개 이상의 forward 및/또는 reverse primer와 그에 상응하는 probe를 설계함으로써, 검출시의 민감도 및 커버리지를 높이도록 하였다. In order to develop a swine influenza diagnostic composition and diagnostic kit for surveillance of the above-described swine influenza virus, the present inventors focused on nucleotide sequences reported after the 2009 pandemic, recombinant swine influenza virus in Eurasia and North America and isolated swine influenza in Korea We designed a primer/probe set that can specifically amplify and detect swine influenza viruses with each genotype by aligning and comparing M, HA, NA, and NS genes, respectively, based on the viral nucleotide sequence. . At this time, if necessary for each genotype, two or more forward and/or reverse primers and corresponding probes were designed to increase sensitivity and coverage at the time of detection.
이어서, 설계된 프라이머/프로브 세트를 합성한 다음 각 세트별로 실시간 PCR 반응에서 잘 작동하는지 확인하고 총 6종의 키트를 구성하였으며, 국내 분리주, 야외 임상 시료 및 표준 시료를 이용하여 높은 민감도를 확인하였으며, 다른 바이러스나 세균에는 교차반응성이 없어 특이도가 높음을 확인하였다. Subsequently, the designed primer/probe sets were synthesized, and each set was confirmed to work well in the real-time PCR reaction, and a total of 6 kits were constructed. High sensitivity was confirmed using domestic isolates, outdoor clinical samples and standard samples, There was no cross-reactivity to other viruses or bacteria, confirming high specificity.
구체적으로 상술한 프라이머 및 프로브의 설계 전략은 다음과 같은 사실을 기초로 검토되었다. Specifically, the above-described primer and probe design strategies were reviewed based on the following facts.
먼저 상기와 같이, 돼지 인플루엔자의 주요 유전형 감별과 EA H1N1 G4 및 신종인플루엔자A(H1N1) 유전자를 감별 할 수 있는 민감도 높은 qRT-PCR 시스템 개발을 위하여 유전적 정보 수집 및 분석하고, 주요 유전형별로 유전정보 확보 및 진단 타겟 부위를 비교 분석한 후, 적합한 프라이머/프로브를 설계한다. 돼지 인플루엔자 바이러스의 유전자형별 표준바이러스 양성 패널을 구축하고 설계된 프라이머/프로브 세트의 반응성을 평가한다. First, as described above, genetic information was collected and analyzed for the development of a highly sensitive qRT-PCR system capable of distinguishing major genotypes of swine influenza and EA H1N1 G4 and H1N1 influenza A (H1N1) genes, and genetic information for each major genotype After comparative analysis of secured and diagnostic target sites, suitable primers/probes are designed. A standard virus-positive panel for each genotype of swine influenza virus is constructed and the reactivity of the designed primer/probe set is evaluated.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 (a), (b), 또는 이들의 조합을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스의 유전형 진단용 조성물을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a composition for diagnosing the genotype of swine influenza virus, comprising the following (a), (b), or a combination thereof:
(a) 다음을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트:(a) a set of oligonucleotides for diagnosis of influenza H1 genotype comprising:
(a1) 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 또는 이들의 조합; 및(a1) a primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, a primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 A primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence shown, a primer for diagnosing influenza H1 genotype including the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20, or a combination thereof; and
(a2) 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 또는 이들의 조합; 및(a2) a primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, a primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, or a combination thereof; and
(b) 다음을 포함하는 인플루엔자 H3 유전형 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트:(b) a set of oligonucleotides for diagnosis of influenza H3 genotype comprising:
서열번호 23의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H3 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H3 유전형 진단용 프라이머, A primer for diagnosing influenza H3 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23, a primer for diagnosing influenza H3 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24,
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물의 (a)는 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브, 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함한다.In one embodiment of the present invention, (a) of the composition of the present invention is a probe comprising a nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, a probe comprising a nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 , or a combination thereof.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물의 (b)는 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함한다.In one embodiment of the present invention, (b) of the composition of the present invention further comprises a probe comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 H1 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스인 경우에는 본 발명의 (a)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 H1 유전자가 검출된다. In a specific embodiment of the present invention, when the virus contained in the sample is a swine influenza virus of the H1 genotype, the H1 gene is detected when detected using the composition comprising (a) of the present invention.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 H3 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스인 경우에는 본 발명의 (b)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 H3 유전자가 검출된다. In another specific embodiment of the present invention, when the virus contained in the specimen is a swine influenza virus of the H3 genotype, the H3 gene is detected when detected using the composition comprising (b) of the present invention.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상술한 (a), (b), 또는 이들의 조합에 더하여, 하기 (c), (d), 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스의 유전형 진단용 조성물을 제공한다:In one embodiment of the present invention, in addition to the above (a), (b), or a combination thereof, the swine influenza virus further comprising the following (c), (d), or a combination thereof A composition for genotype diagnosis is provided:
(c) 다음을 포함하는 인플루엔자 N1 유전형 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트:(c) a set of oligonucleotides for diagnosis of influenza N1 genotype comprising:
(c1) 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N1 유전형 진단용 프라이머, 또는 이들의 조합; 및(c1) a primer for diagnosing influenza N1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26, a primer for diagnosing influenza N1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27, or a combination thereof; and
(c2) 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N1 유전형 진단용 프라이머; 및(c2) a primer for diagnosing influenza N1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28; and
(d) 다음을 포함하는 인플루엔자 N2 유전형 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트:(d) a set of oligonucleotides for diagnosis of influenza N2 genotype comprising:
(d1) 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N2 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N2 유전형 진단용 프라이머, 또는 이들의 조합; 및(d1) a primer for diagnosing influenza N2 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31, a primer for diagnosing influenza N2 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32, or a combination thereof; and
(d2) 서열번호 33의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N2 유전형 진단용 프라이머.(d2) A primer for diagnosing influenza N2 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (c)는 서열번호 29의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브, 서열번호 30의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함한다.In one embodiment of the present invention, (c) is a probe comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29, a probe comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30, or a combination thereof additionally includes
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (d)는 서열번호 34의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함한다.In one embodiment of the present invention, (d) further comprises a probe comprising a nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 N1 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스인 경우에는 본 발명의 (c)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 N1 유전자가 검출된다. In a specific embodiment of the present invention, when the virus contained in the specimen is a swine influenza virus of the N1 genotype, the N1 gene is detected when detected using the composition comprising (c) of the present invention.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 N2 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스인 경우에는 본 발명의 (d)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 N2 유전자가 검출된다. In another specific embodiment of the present invention, when the virus contained in the sample is a swine influenza virus of the N2 genotype, the N2 gene is detected when detected using the composition comprising (d) of the present invention.
본 발명의 상술한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 돼지인플루엔자 바이러스 유전형 진단용 조성물은 다음을 추가적으로 포함한다:According to the above-described embodiment of the present invention, the composition for diagnosing swine influenza virus genotype of the present invention additionally includes:
(e) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 M 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 M 유전자 검출용 프라이머.(e) Primers for detecting the influenza M gene comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and primers for detecting the influenza M gene comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 M 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함한다.In one embodiment of the present invention, the composition of the present invention further comprises a probe for detecting M gene comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상술한 일 구현예에 따른 상기 조성물 중 (a), (b), (c), (d), (e), 또는 이들의 조합의 구성에 상응하는 프로브들은 서로 동일하거나 상이한 표지자로 표지된다.According to one embodiment of the present invention, (a), (b), (c), (d), (e), or a combination thereof in the composition according to the above-described embodiment of the present invention probes are labeled with the same or different markers.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 돼지인플루엔자 바이러스 검출을 위한 조성물의 조성은 실시간 원스텝 RT-PCR 반응당 프라이머에 해당하는 각 서열번호의 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이드를 2-8 pmole, 또는 3-9 pmole로 포함하고, 프로브에 해당하는 각 서열번호의 핵산을 0.5-4.5 pmole의 농도로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. In a specific embodiment of the present invention, the composition of the composition for detecting the swine influenza virus is 2-8 pmoles of nucleotides containing the nucleotide sequence of each SEQ ID NO corresponding to the primer per real-time one-step RT-PCR reaction, or 3- 9 pmoles, and includes nucleic acids of each sequence number corresponding to the probe at a concentration of 0.5-4.5 pmoles, but is not limited thereto.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 돼지인플루엔자 바이러스 검출을 위한 조성물의 조성은 실시간 원스텝 RT-PCR 반응당 프라이머에 해당하는 각 서열번호의 뉴클레오타이드를 5 pmole, 프로브에 해당하는 각 서열번호의 뉴클레오타이드를 1.5 pmole 또는 3.5 pmole 이 사용되도록 프라이머 및 프로브들을 혼합한 것이다.In a more specific embodiment of the present invention, the composition of the composition for detecting the swine influenza virus is 5 pmoles of nucleotides of each sequence number corresponding to the primer per real-time one-step RT-PCR reaction, nucleotides of each sequence number corresponding to the probe is a mixture of primers and probes so that 1.5 pmole or 3.5 pmole is used.
본 발명에서 사용되는 용어 "다중 실시간 원스텝 RT-PCR (multiplexed real-time one-step RT-PCR)"은 각각의 의미를 가지는 PCR, RT-PCR, 원스텝 RT-PCR, 실시간 (RT-)PCR 및 다중 (RT-)PCR의 총합을 의미한다. 각각의 의미를 살펴보면, PCR은 DNA의 특정 영역을 시험관 내에서 대량으로 증폭하는 기술을 의미하며, RT-PCR은 시험관 내에서 RNA를 DNA로 역전사시킨 다음, 이렇게 만들어진 상보적 DNA (complementary DNA; cDNA)의 특정 영역을 대량으로 증폭하는 기술을 의미한다. 원스텝 RT-PCR은 cDNA를 만드는 역전사 과정과 cDNA의 특정 영역을 대량으로 복제하는 증폭 과정이 하나의 시험관 내에서 이루어지는 것을 의미하고, 실시간 (RT-)PCR은 특정 영역 증폭의 결과가 실시간으로 모니터링되는 것을 의미하며, 다중 (RT-)PCR은 한 번의 반응 수행으로 동시에 2개 이상의 다른 특정 영역들을 대량으로 증폭하는 것을 의미한다. 다중 실시간 원스텝 RT-PCR을 통해 경제적으로 빠르고 간편하게 돼지인플루엔자 바이러스 검출 여부 및 유전형의 감별 진단을 할 수 있다.As used herein, the term "multiplexed real-time one-step RT-PCR" means PCR, RT-PCR, one-step RT-PCR, real-time (RT-)PCR and Means the sum of multiplex (RT-)PCR. Looking at each meaning, PCR refers to a technique for amplifying a specific region of DNA in large quantities in vitro, and RT-PCR refers to reverse transcription of RNA into DNA in vitro, followed by complementary DNA (cDNA) made in this way. ) means a technology that amplifies a specific area in large quantities. One-step RT-PCR means that the reverse transcription process of making cDNA and the amplification process of mass-copying a specific region of cDNA are performed in one in vitro, and real-time (RT-)PCR means that the result of amplification of a specific region is monitored in real time. Multiple (RT-)PCR means amplifying two or more different specific regions in large quantities at the same time in one reaction. Through multiple real-time one-step RT-PCR, it is possible to diagnose swine influenza virus detection and genotype differential diagnosis economically, quickly and easily.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머 (primer)"는 주형 (template) 핵산에 상보적으로 결합하여 합성을 위한 시발점으로 기능하는 자유 3'-수산화기 (free 3'-hydroxyl group)를 가지는 짧은 핵산 단편을 의미한다. 프라이머는 적절한 반응 완충 용액 (buffer) 및 온도에서 중합 반응을 위한 효소 [DNA 중합 효소 (DNA polymerase), 역전사 효소 (reverse transcriptase) 등] 및 상이한 4가지 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs)의 존재 하에서 주형에 상보적인 가닥의 합성을 개시할 수 있는데, 프라이머 길이 및 반응 조건 등은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 프라이머는 필요할 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 표지의 예로는 효소, 방사선 동위원소, 형광성 분자, 화학 그룹 등이 있다.As used herein, the term "primer" refers to a short nucleic acid fragment having a free 3'-hydroxyl group that complementarily binds to a template nucleic acid and functions as a starting point for synthesis. it means. The primers are enzymes for polymerization reaction (DNA polymerase, reverse transcriptase, etc.) and four different deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) for polymerization reaction in an appropriate reaction buffer and temperature. ), the synthesis of a strand complementary to the template can be initiated in the presence of, and the primer length and reaction conditions can be modified based on those known in the art. If necessary, the primer may include a label that can be detected directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, or chemical means. Examples of the label include enzymes, radioactive isotopes, fluorescent molecules, chemical groups, etc. there is
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브 (probe)"는 혼성화 (hybridization)에 의해 상보적인 목적 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용되어지는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 또는 RNA 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 프로브는 해당 염기서열의 5'과 3'말단에 각각 검출에 이용되는 표지자를 포함할 수 있으며, 이러한 표지자로는 형광단 (fluorophore)과 소광체 (quencher)가 각각 5'과 3'말단에 표지될 수 있다. 이에 따라, 프로브에 형광단과 소광체가 서로 결합한 형태로 존재할 때에는 상호 간섭에 의해 발광이 억제되고, PCR 반응 등을 통해 프로브의 분해가 이루어지면 프로브에 표지된 형광단과 소광체 간의 간섭이 사라져 발광을 하게 된다. 상기 5'말단에 표지될 수 있는 형광단은 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광 물질이 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면 플루오레세인 (Fluorescein), 6-카르복시플루오레세인 (6-Carboxyfluorescein; FAM), 핵사클로로-6-카르복시플루오레세인 (Hexachloro-6-carboxyfluorescein; HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산 (5-(2'-Aminoethyl)amino naphthalene-1-sulfonic acid), 쿠마린 (Coumarin) 및 이의 유도체, 시아닌-5 (Cyanine-5; Cy5), 텍사스 레드 (Texas Red), 테트라메틸로다민 (Tetramethylrhodamine), 칼 플루오르 레드 610 (CAL Fluor Red 610), 엘씨 레드 610 (LC Red 610) 등이 사용될 수 있다. 상기 3'말단에 표지될 수 있는 소광체 또한 당업계에서 통상적으로 사용되는 소광제가 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면 테트라메틸로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민 (6-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 4-다이메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드 (4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide) 등이 사용될 수 있다. 이처럼 형광 물질이 표지된 프로브를 사용하여 실시간 (RT-)PCR을 수행하면, 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링할 수 있고, DNA 및 RNA의 정량이 가능하며, 전기영동이 필요 없어 빠르고 간편하게 정확한 진단이 가능하다는 장점을 갖는다.As used herein, the term "probe" refers to a DNA or RNA nucleic acid fragment corresponding to as short as several bases to as long as several hundred bases used to detect the presence of a complementary target nucleic acid sequence by hybridization. That is, it may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single-stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. The probe may include markers used for detection at the 5' and 3' ends of the corresponding nucleotide sequence, respectively. These markers include a fluorophore and a quencher at the 5' and 3' ends, respectively. It can be. Accordingly, when the fluorophore and the quencher are present in the probe in a combined form, light emission is suppressed by mutual interference, and when the probe is decomposed through a PCR reaction, the interference between the fluorophore and the quencher labeled on the probe disappears and emits light. do. As the fluorophore that can be labeled at the 5' end, any fluorescent material commonly used in the art may be used without limitation, for example, fluorescein, 6-carboxyfluorescein (FAM) ), hexachloro-6-carboxyfluorescein (Hexachloro-6-carboxyfluorescein; HEX), tetrachloro-6-carboxyfluorescein, VIC, JOE, 5-(2'-aminoethyl ) Amino naphthalene-1-sulfonic acid (5-(2'-Aminoethyl)amino naphthalene-1-sulfonic acid), Coumarin and its derivatives, Cyanine-5 (Cy5), Texas Red , tetramethylrhodamine, CAL Fluor Red 610, LC Red 610, and the like may be used. The quencher that can be labeled at the 3' end may also be used without limitation of a quencher commonly used in the art, for example, tetramethylrhodamine, 6-carboxytetramethylrhodamine (6-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ- 1, BHQ-2, BHQ-3, 4-dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide, and the like may be used. If real-time (RT-)PCR is performed using fluorescently labeled probes, amplified products can be monitored in real time, DNA and RNA can be quantified, and electrophoresis is not required, so accurate diagnosis can be made quickly and easily. It has the advantage of being possible.
상기 프라이머 및 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에서 목적으로 하는 돼지인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당업계에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 프라이머 및 프로브가 변형될 수 있다.It is possible for the primers and probes to incorporate additional features that do not alter the basic properties. That is, primers and probes may be modified using conventional means known in the art as long as they exhibit an effect capable of detecting the swine influenza virus of interest in the present invention.
본 명세서에서는 프라이머 및 프로브의 염기서열을 나타냄에 있어 국제 생화학 연합 (International Union of Biochemistry; IUB) 중의성 코드 (ambiguity code)를 사용하였다. 염기서열에서 A는 아데닌 (adenine)을, C는 시토신 (cytosine)을, G는 구아닌 (guanine)을, T는 티민 (thymine)을, R은 아데닌과 구아닌 둘 다 가능한 자리를, Y는 시토신과 티민 둘 다 가능한 자리를, K는 구아닌과 티민 둘 다 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 염기서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용되었다.In the present specification, the International Union of Biochemistry (IUB) ambiguity code was used to represent the nucleotide sequences of primers and probes. In the sequence, A is for adenine, C is for cytosine, G is for guanine, T is for thymine, R is for both adenine and guanine, Y is for cytosine and A site capable of both thymine and K represents a site capable of both guanine and thymine. This was equally applied in presenting all nucleotide sequences in this specification.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 조성물을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스의 H1 및 H3 유전형 진단용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a kit for diagnosing H1 and H3 genotypes of swine influenza virus comprising the above-described composition of the present invention.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 조성물을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스의 H1/H3 유전형 및 N1/N2 유전형 진단용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a kit for diagnosing H1/H3 genotypes and N1/N2 genotypes of swine influenza virus comprising the above-described composition of the present invention.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상술한 조성물 중 (a), (b), (c), (d), (e), 또는 이들의 조합에 상응하는 프로브를 추가적으로 포함하는 돼지인플루엔자의 유전형 진단용 키트를 제공한다. In one embodiment of the present invention, the present invention further comprises a probe corresponding to (a), (b), (c), (d), (e), or a combination thereof in the above-described composition. Provided is a kit for diagnosing the genotype of
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 돼지인플루엔자 바이러스는 신종인플루엔자 A(H1N1), 유라시아 조류-유사 H1N1 인플루엔자(Eurasian avian-like H1N1, EA H1N1), G4 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스, 또는 EA H1N1 G4 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스 등 H1/H3 및 N1/N2 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the swine influenza virus is swine flu A (H1N1), Eurasian avian-like H1N1 influenza (Eurasian avian-like H1N1, EA H1N1), swine influenza virus of G4 genotype, or EA H1N1 G4 genotype It may be a swine influenza virus having H1 / H3 and N1 / N2 genotypes, such as swine influenza virus of, but is not limited thereto.
본 발명의 진단 키트는 상술한 각종 돼지인플루엔자 바이러스의 감염 여부 확인 및 유전형 감별을 경제적으로 빠르고 간편하게 수행하기 위한 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 진단 키트로서, 상기 조성물에 포함되는 1 이상의 프라이머 및 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.The diagnostic kit of the present invention is a multiple real-time one-step RT-PCR diagnostic kit for economically, quickly and easily performing the above-mentioned confirmation of infection and genotyping of various swine influenza viruses, including one or more primers and probes included in the composition, as well as analysis. One or more other component compositions, solutions or devices suitable for the method may be included.
구체적인 일례로서, 본 발명의 진단 키트는 역전사 반응 및 PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 진단 키트는 각 검출 부위에 대한 특이적인 각각의 프라이머/프로브 세트 외에도 돼지인플루엔자 바이러스 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, cDNA의 특정 영역을 대량으로 증폭하기 위한 DNA 중합 효소, 반응 완충 용액, dNTPs, RNA 분해 효소 억제제 (RNase inhibitor), 멸균수, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기 등을 포함할 수 있다.As a specific example, the diagnostic kit of the present invention may include essential elements required to perform reverse transcription and PCR analysis. In addition to each primer/probe set specific for each detection site, the diagnostic kit includes a reverse transcriptase for synthesizing cDNA from swine influenza virus RNA, a DNA polymerase for amplifying a specific region of cDNA in large quantities, a reaction buffer, and dNTPs. , RNase inhibitor, sterile water, a test tube or other suitable container, and the like.
본 발명에서 각 테스트 튜브에 포함되는 성분들로는, 이에 국한되지 않지만, 돼지인플루엔자 바이러스 동시 검사를 위한 다중 올리고 혼합 조성물, DNA 중합 효소, 역전사 효소, RNA 분해 효소 억제제, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Tris-HCl, MgCl2, KCl, BSA, 핵산 분해 효소 제거수 (nuclease-free water) 등이 있으며, 특정 반응을 위해 사용되는 성분 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.Components included in each test tube in the present invention include, but are not limited to, a multi-oligo mixture composition for simultaneous testing of swine influenza virus, DNA polymerase, reverse transcriptase, RNA degrading enzyme inhibitor, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Tris -HCl, MgCl2, KCl, BSA, nuclease-free water, etc., and the optimal amount of components or reactants used for a specific reaction can be determined by a person skilled in the art.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 진단키트를 이용하여 시료 중의 1종 또는 2종 이상의 돼지인플루엔자 바이러스를 동시에 검사하는 방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for simultaneously testing one or more swine influenza viruses in a sample using the diagnostic kit.
구체적으로 본 발명의 상기 돼지인플루엔자 바이러스를 검사하는 방법은, Specifically, the method for testing the swine influenza virus of the present invention,
(a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 조성물 또는 진단키트를 이용하여 실시간 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함한다. (a) isolating RNA from the sample; and (b) specifically amplifying and detecting a target sequence from the separated RNA through a real-time RT-PCR reaction using the composition or diagnostic kit according to one aspect of the present invention.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검체는 조류, 가축 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이로부터 분리된 혈액, 혈청, 혈장, 분변, 조직 등을 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the specimen may be selected from the group consisting of birds, livestock and humans, and includes blood, serum, plasma, feces, tissues, etc. isolated therefrom.
본 발명에 따르면, 당업계에서의 공지의 방법에 따라 검체에서 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA를 함유한 추출액에 본 발명의 프라이머/프로브 세트들로 이루어진 조성물을 포함하는 진단 키트를 이용하여 단일 튜브에서 다중 실시간 원스텝 RT-PCR을 실시한다. 증폭 및 검출의 결과는 실시간으로 확인되는데, 예를 들어 본 발명의 프로브들에 공통으로 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 돼지인플루엔자 바이러스가 존재하며 그 유전형을 확인할 수 있다. 즉, 검체 내의 돼지인플루엔자 바이러스 존재 여부와 함께 유전형에 대한 감별이 가능하다.According to the present invention, RNA is extracted from a specimen according to a method known in the art, and then a single tube is used using a diagnostic kit containing a composition consisting of the primer/probe sets of the present invention in an extract containing the extracted RNA. Multiple real-time one-step RT-PCR is performed at The results of amplification and detection are confirmed in real time. For example, if emission of a fluorescent substance commonly labeled with the probes of the present invention is confirmed, this indicates that swine influenza virus is present in the sample and its genotype can be confirmed. That is, it is possible to discriminate the genotype along with the presence or absence of swine influenza virus in the specimen.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 HA 및 NA 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법을 제공한다.(a) The present invention provides a diagnostic composition, kit, and diagnostic method for swine influenza capable of distinguishing HA and NA genotypes.
(i) 본 발명의 돼지인플루엔자의 H1, H3, N1 및 N2 유전형 감별이 가능한 유전자 진단용 조성물, 키트, 유전자 진단 방법을 이용하는 경우, 국내 및 해외 분리 돼지인플루엔자의 정확한 HA 및 NA 서브타이핑이 가능하여 인플루엔자 팬데믹에 대비하여 효과적인 돼지 인플루엔자의 예찰이 가능하다.(i) In the case of using the genetic diagnosis composition, kit, and genetic diagnosis method capable of distinguishing H1, H3, N1 and N2 genotypes of swine influenza of the present invention, accurate HA and NA subtyping of domestic and foreign isolated swine influenza is possible, thereby preventing influenza In preparation for a pandemic, effective surveillance of swine influenza is possible.
도 1은 신종플루, 2016-2019년에 동정된 SIV, G2, G4, G1, G3, G5, G6의 인플루엔자의 M 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 신종 인플루엔자(H1N1), N2 유전형을 가진 돼지인플루엔자, G1 내지 G6 유전형의 유라시아 돼지인플루엔자의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1)의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 EA H1N1 G4 유전형을 확인하기 위하여 G3, G4, G5, G6의 북아메리카 재조합 인플루엔자 바이러스, G1 유전형의 유라시아 인플루엔자 바이러스, G2 유전형의 신종플루 바이러스 등의 NS 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 H1 또는 H3 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 N1 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 N2를 비롯한 다양한 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8 내지 도 12는 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 5에서 선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 야외 시료(폐 시료: 50개)를 이용한 기존 진단 키트와 본 발명의 개발된 진단키트의 효능을 비교하여 나타낸 도이다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 돼지인플루엔자 진단용 키트의 조류(H5, H7, H9), 개(H3N2), 또는 말(H3N8) 인플루엔자 바이러스와 간섭 가능성을 확인하기 위하여 in silico 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the results of aligning the M genes of influenza identified in swine flu, SIV, G2, G4, G1, G3, G5, and G6 from 2016 to 2019.
FIG. 2 is a diagram showing the results of aligning NA genes of novel influenza (H1N1), swine influenza with N2 genotype, and Eurasian swine influenza with G1 to G6 genotypes.
3 is a diagram showing the results of aligning the HA gene of Eurasian avian-like (EA) H1N1 and H1N1 influenza A (H1N1).
4 is a diagram showing the results of aligning NS genes such as G3, G4, G5, and G6 North American recombinant influenza viruses, G1 genotype Eurasian influenza viruses, and G2 genotype H1N1 influenza viruses to confirm the EA H1N1 G4 genotype.
5 is a diagram showing the results of aligning the HA gene of swine influenza virus having H1 or H3 genotype.
6 is a diagram showing the result of aligning the NA gene of the swine influenza virus having the N1 genotype.
7 is a diagram showing the results of aligning NA genes of swine influenza viruses having various genotypes, including N2.
8 to 12 are views showing the evaluation results of the reactivity and detection limit of the primers/probes selected in Examples 1 to 5 of the present invention.
13 is a diagram showing a comparison of the efficacy of an existing diagnostic kit using outdoor samples (lung samples: 50 pieces) and the diagnostic kit developed according to the present invention.
14 and 15 show the results of in silico analysis to confirm the possibility of interference with avian (H5, H7, H9), dog (H3N2), or equine (H3N8) influenza viruses of the swine influenza diagnostic kit of the present invention. is the diagram shown.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
본 발명자들은 돼지 인플루엔자의 주요 유전형을 감별할 수 있고, 최근 유행하는 EA H1N1 G4 및 신종인플루엔자 A(H1N1)의 검출을 위한 진단법을 개발하고자 하였다.The present inventors attempted to develop a diagnostic method capable of discriminating major genotypes of swine influenza and detecting EA H1N1 G4 and swine flu A (H1N1), which are currently prevalent.
실시예 1: 돼지 인플루엔자 양성 여부 확인을 위한 공통 M gene과 신종인플루엔자(NF)에 특이적인 NA gene을 검출하기 위한 Primer/probe 디자인 및 선발 Example 1: Primer/probe design and selection for detecting a common M gene for swine influenza positivity and an NA gene specific for swine influenza (NF)
실시예 1-1. M gene 내에서 신종인플루엔자 특이적 primer/probe 디자인 및 선발Example 1-1. H1N1 influenza specific primer/probe design and selection within the M gene
도 1은 신종 인플루엔자, 2016-2019년에 동정된 SIV, G2 및 G4 유전형의 신종 인플루엔자, G1, G3, G5 및 G6 유전형의 유라시아 돼지인플루엔자의 M 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the results of aligning the M genes of new influenza, SIV, G2 and G4 genotypes of swine flu, Eurasian swine influenza of G1, G3, G5 and G6 genotypes identified in 2016-2019.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 얼라인먼트를 통하여 상기다양한 돼지인플루엔자들을 공통적으로 검출할 수 있는 Forward/Reverse 프라이머 및 프로브를 도출하였다. As shown in FIG. 1, the present inventors derived forward/reverse primers and probes that can commonly detect the various swine influenza viruses through the alignment.
실시예 1-2. NA gene 내에서 신종인플루엔자A(H1N1) 특이적 primer/probe 디자인 및 선발Example 1-2. Influenza A (H1N1) specific primer/probe design and selection within the NA gene
도 2는 신종 인플루엔자(H1N1), N2 유전형을 가진 돼지인플루엔자, G1 내지 G6 유전형의 유라시아 돼지인플루엔자의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.FIG. 2 is a diagram showing the results of aligning NA genes of novel influenza (H1N1), swine influenza with N2 genotype, and Eurasian swine influenza with G1 to G6 genotypes.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 얼라인먼트를 통하여 신종인플루엔자(H1N1)의 N1 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 Forward/Reverse 프라이머 및 프로브를 도출하였다. As shown in FIG. 2, the present inventors derived forward/reverse primers and probes capable of specifically detecting the N1 gene of swine flu (H1N1) through the alignment.
상기와 같이, Alignment 분석결과를 토대로 신종인플루엔자 A(H1N1)에 특이적인 M gene과 NA gene을 target으로 하여 신종인플루엔자 A일 경우 두 gene이 모두 증폭되도록 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.As described above, based on the results of the alignment analysis, primers and probes were designed to amplify both genes in the case of H1N1 influenza A by targeting the M gene and NA gene specific to H1N1. The results are shown in Table 2 below.
(M/NA)SIV-NF
(M/NA)
실시예 2: HA 유전자 내에서 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1) 구분을 위한 primer/probe 디자인 및 선발 Example 2: Primer/probe design and selection for distinguishing between Eurasian avian-like (EA) H1N1 and H1N1 influenza A (H1N1) within the HA gene
본 발명자들은 HA 유전자 내에서 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1) 구분을 위한 프라이머 및 프로브를 선발하고자 다음과 같이 HA 유전자를 얼라인하고, 적합한 영역을 선택하였다. To select primers and probes for distinguishing between Eurasian avian-like (EA) H1N1 and swine flu A (H1N1) within the HA gene, the present inventors aligned the HA gene and selected a suitable region as follows.
도 3은 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1)의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다. 3 is a diagram showing the results of aligning the HA gene of Eurasian avian-like (EA) H1N1 and H1N1 influenza A (H1N1).
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 얼라인먼트를 통하여 HA 유전자 내에서 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1)를 구분할 수 있는 각각의 forward primer와 probe 를 아래와 같이 디자인하였다. 이때 EA H1N1과 신종 인플루엔자 A (H1N1)의 HA 유전자를 검출하는 reverse primer는 공유하여 동일하게 사용하였다. As shown in FIG. 3, the present inventors designed each of the forward primers and probes capable of distinguishing between Eurasian avian-like (EA) H1N1 and swine flu A (H1N1) within the HA gene through the alignment as follows. At this time, reverse primers for detecting the HA gene of EA H1N1 and swine flu A (H1N1) were shared and used identically.
결과는 표 3에 나타내었다.The results are shown in Table 3.
(EA/NF)SIV HA
(EA/NF)
실시예 3: EA H1N1 G4 확인을 위한 G4 검출용 primer/probe 디자인 및 선발Example 3: Primer/probe design and selection for G4 detection for EA H1N1 G4 confirmation
도 4는 EA H1N1 G4 유전형을 확인하기 위하여 G3, G4, G5, G6의 북아메리카 재조합 인플루엔자 바이러스, G1 유전형의 유라시아 인플루엔자 바이러스, G2 유전형의 신종플루 바이러스 등의 NS 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.4 is a diagram showing the results of aligning NS genes such as G3, G4, G5, and G6 North American recombinant influenza viruses, G1 genotype Eurasian influenza viruses, and G2 genotype H1N1 influenza viruses to confirm the EA H1N1 G4 genotype.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 G2 내지 G6 유전형을 가진 북아메리카 재조합 인플루엔자 바이러스의 NS 유전자의 얼라인먼트를 통하여 EA G4 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 디자인 하였다. As shown in FIG. 4, the present inventors designed primers and probes capable of specifically detecting the EA G4 genotype through alignment of the NS genes of the North American recombinant influenza virus having the G2 to G6 genotypes.
결과는 표 4에 나타내었다. The results are shown in Table 4.
실시예 4: HA 유전자(H1/H3) subtyping용 primer/probe 디자인 및 선발Example 4: Primer/probe design and selection for HA gene (H1/H3) subtyping
도 5는 H1 또는 H3 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.5 is a diagram showing the results of aligning the HA gene of swine influenza virus having H1 or H3 genotype.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 H1 또는 H3 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스에서 H1 또는 H3으로 HA 유전자의 서브타이핑이 가능하도록 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. As shown in FIG. 5, the present inventors designed primers and probes to enable subtyping of the HA gene to H1 or H3 in swine influenza virus having the H1 or H3 genotype.
결과는 표 5에 나타내었다.The results are shown in Table 5.
(H1/H3)SIV HA
(H1/H3)
실시예 5: NA유전자(N1/N2) subtyping용 primer/probe 디자인 및 선발Example 5: Primer/probe design and selection for NA gene (N1/N2) subtyping
실시예 5-1. N1 특이적 primer/probe 디자인 및 선발Example 5-1. N1 specific primer/probe design and selection
도 6은 N1 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.6 is a diagram showing the result of aligning the NA gene of the swine influenza virus having the N1 genotype.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 돼지인플루엔자 바이러스에서 N1으로 서브타이핑이 가능하도록 프라이머 및 프로브를 디자인 하였다. As shown in FIG. 6, the present inventors designed primers and probes to enable subtyping from swine influenza virus to N1.
실시예 5-2. N2 특이적 Oligo design alignmentExample 5-2. N2 specific oligo design alignment
도 7은 N2를 비롯한 다양한 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.7 is a diagram showing the results of aligning NA genes of swine influenza viruses having various genotypes, including N2.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 돼지인플루엔자 바이러스에서 N2으로 서브타이핑이 가능하도록 프라이머 및 프로브를 디자인 하였다. As shown in FIG. 7, the present inventors designed primers and probes to enable subtyping with N2 in swine influenza virus.
결과는 표 6에 나타내었다. The results are shown in Table 6.
(N1/N2)SIV NA
(N1/N2)
실시예 6: 선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계 평가Example 6: Evaluation of reactivity and detection limit of selected primers/probes
본 발명자들은 상기 실시예 1 내지 5에서 선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계를 평가하기 위하여 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 돼지인플루엔자 바이러스 시료를 사용하였다. The present inventors used swine influenza virus samples as shown in Table 7 below to evaluate the reactivity and detection limit of the primers/probes selected in Examples 1 to 5.
상기 실시예 1 내지 5에서 선발한 primer/probe를 이용하기 위한 qRT-PCR 조건은 표 8에 나타내었다. The qRT-PCR conditions for using the primers/probes selected in Examples 1 to 5 are shown in Table 8.
선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계 평가 결과는 도 8 내지 도 12에 나타내었다. The results of evaluating the reactivity and detection limit of the selected primer/probe are shown in FIGS. 8 to 12.
선발된 primer와 probe를 이용하여 상기 표 6에 나타낸 돼지인플루엔자 8개의 표준주를 검사한 결과, 검출용으로 적합한 것으로 판단되었으며, 해당 oligo 조합으로 plasmid DNA를 이용하여 이론적 검출한계를 확인한 결과, 1 copy/ul까지 각각 검출이 가능함을 확인하였다.As a result of examining the 8 standard strains of swine influenza shown in Table 6 using the selected primers and probes, it was judged to be suitable for detection, and as a result of confirming the theoretical detection limit using plasmid DNA with the corresponding oligo combination, 1 copy It was confirmed that each detection was possible up to /ul.
실시예 7: 시제품 제작 및 진단 키트 효능 평가Example 7: Prototyping and Evaluation of Diagnostic Kit Efficacy
실시예 7-1. 시제품 제작Example 7-1. prototyping
본 발명자들은 상기 표 1 내지 5에 나타낸 primer/probe 세트를 이용하여, 아래의 표 9와 같은 구성의 시제품을 총 6종 제작하여 돼지인플루엔자 국내분리주 및 야외시료에서 효능 평가를 수행하였다. Using the primer/probe sets shown in Tables 1 to 5, the present inventors produced a total of 6 prototypes having the configuration shown in Table 9 below, and evaluated efficacy in domestic isolates of swine influenza and outdoor samples.
NS(TR)NS-SIV-34
NS(TR)
실시예 7-2. 진단 키트의 효능 평가Example 7-2. Efficacy evaluation of diagnostic kits
1) 국내 분리주에서 제작된 진단 키트 효능 평가1) Efficacy evaluation of diagnostic kits produced from domestic isolates
본 발명자들은 '09년~'20년 국내분리주(총 50주※)를 대상으로 제작된 진단 키트의 효능평가를 실시하였다. The present inventors conducted an efficacy evaluation of the diagnostic kit produced for domestic isolates from '09 to '20 (total of 50 strains※).
※ H1N1(10주), 신종인플루엔자(20주), H1N2(10주), H3N2(10주) ※ H1N1 (10 weeks), H1N1 (10 weeks), H1N2 (10 weeks), H3N2 (10 weeks)
결과는 표 10에 나타내었다.The results are shown in Table 10.
엔자(20)swine flu
Enza (20)
& G4new species
& G4
(NF qRT-PCR,
HA qRT-PCR,
NS qRT-PCR) NF, EA MP qRT-PCR
(NF qRT-PCR,
HA qRT-PCR;
NS qRT-PCR)
※ NF, EA MP qRT-PCR (신종 H1N1과 G4 검출키트로 3종류 qRT-PCR 분석 후 최종 판단)※※ NF: New Flu, MP: Multi-Plex※ NF, EA MP qRT-PCR (Final decision after analyzing three types of qRT-PCR with new H1N1 and G4 detection kits) ※※ NF: New Flu, MP: Multi-Plex
표 10에 나타낸 바와 같이, 기존의 common M RT-PCR 키트의 경우 50주 모두 양성이었으며, Newflu M RT-PCR 키트의 경우 신종인플루엔자 외에 H1N1 8주, H1N2 7주, H3N2 4주 역시 양성으로 검출하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 기존의 키트로는 신종 인플루엔자를 정확하게 측정할 수 없다는 점을 확인할 수 있었다. As shown in Table 10, in the case of the existing common M RT-PCR kit, all 50 weeks were positive, and in the case of the Newflu M RT-PCR kit, in addition to swine flu, 8 weeks of H1N1, 7 weeks of H1N2, and 4 weeks of H3N2 were also detected as positive. could confirm that Therefore, it was confirmed that the existing kits could not accurately measure the new influenza.
또한, 상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들에 의해 개발된 진단 키트는 기존 키트보다 의양성을 줄이고 subtyping이 가능함을 확인하였다. 구체적으로 기존 키트는 민감도 100%, 특이도 37% 였으나, 본 발명의 개발된 키트는 민감도 100%, 특이도 100% 였다. In addition, as shown in Table 10, it was confirmed that the diagnostic kit developed by the present inventors reduced false positives and was capable of subtyping compared to existing kits. Specifically, the existing kit had 100% sensitivity and 37% specificity, but the developed kit of the present invention had 100% sensitivity and 100% specificity.
2) 돼지 인플루엔자 감염 의심 야외 시료(비즙)을 이용한 진단 키트 효능 평가2) Efficacy evaluation of diagnostic kits using outdoor samples (spleen juice) suspected of swine influenza infection
본 발명자들은 또한 2021년 수집된 돼지 인플루엔자 감염 의심 야외 시료(비즙) 44점(충북 음성군 소재 4개 농장)과 야외 시료에서 분리된 돼지 인플루엔자 바이러스 2주(H1N2)를 대상으로 개발된 진단 키트의 효능을 평가하였다. The present inventors also tested the efficacy of a diagnostic kit developed for 44 swine influenza infection suspected outdoor samples (spleen) collected in 2021 (four farms in Eumseong-gun, Chungcheongbuk-do) and 2 swine influenza virus strains (H1N2) isolated from outdoor samples. was evaluated.
결과는 표 11에 나타내었다.The results are shown in Table 11.
& G4new species
& G4
(1개 의양성)15
(1 positive)
표 11에 나타낸 바와 같이, 기존의 common M RT-PCR 키트의 경우 46개 모두 양성으로 확인되었다. 그러나, 개발된 common M qRT-PCR 키트는 기존 키트의 결과 중 46개 중 31개가 의양성이었고, 실제로는 음성(양성은 15개)이라는 점을 확인하였다. 또한, 기존의 Newflu M RT-PCR 키트의 경우, 6개를 신종인플루엔자 A(H1N1) 양성으로 검출하였다. 그러나, 본 발명의 신종 인플루엔자 진단 키트에서는 기존 키트의 6개가 모두 의양성이었고, 실제로는 전부 음성이라는 점을 확인함으로써 본 발명의 신규 키트는 기존의 키트에 비하여 신종 인플루엔자의 의양성 검출율을 현저하게 낮추었다는 점을 알 수 있었다. As shown in Table 11, in the case of the existing common M RT-PCR kit, all 46 were confirmed as positive. However, in the developed common M qRT-PCR kit, it was confirmed that 31 out of 46 results of the existing kit were false positives, and in fact negative (15 positives). In addition, in the case of the existing Newflu M RT-PCR kit, 6 were detected as swine flu A (H1N1) positive. However, in the new influenza diagnostic kit of the present invention, it was confirmed that all 6 of the existing kits were false positive and actually all were negative, so that the new kit of the present invention had a significantly higher false positive detection rate of new influenza compared to the existing kit. It was found that lowered
또한, 본 발명의 신규 키트의 M 유전자가 양성으로 나타난 15개의 subtyping 결과 12개에서 H1N2인점을 확인하였다(3개는 subtyping 확인 불가). In addition, as a result of subtyping of 15 cases in which the M gene of the new kit of the present invention was positive, 12 were confirmed to be H1N2 (subtyping could not be confirmed for 3 cases).
3) 야외 시료(폐 시료: 50개)에서 시제품 평가 3) Prototype evaluation in outdoor samples (lung samples: 50)
본 발명자들이 소속된 농림축산검역본부 질병진단과에 2021년에 의뢰가 들어온 돼지 폐 시료(50개)를 이용하여 야외 시료에서의 시제품의 효능을 평가하였다. The efficacy of the prototype in outdoor samples was evaluated using pig lung samples (50 pieces) requested in 2021 to the Disease Diagnosis Division of the Agriculture, Forestry and Livestock Quarantine Headquarters to which the present inventors belonged.
결과는 표 12에 나타내었다. The results are shown in Table 12.
& G4new species
& G4
NS qRT-PCR(G4)
NS qRT-PCR
표 12에 나타낸 바와 같이, 상기 야외 시료(폐 시료: 50개)를 이용한 기존 진단 키트와 개발된 진단키트의 효능을 구체적으로 확인한 결과는 도 13에 나타내었다.그 결과, 돼지인플루엔자가 25개 양성으로 확인이 되었고 신종 인플루엔자/G4는 음성으로 확인된 바 있었다. 또한, 상기 돼지인플루엔자 양성(25개)을 subtyping 한 결과 H1N1(10), H1N2(10), H3N2(5)으로 최종 확인되었다. As shown in Table 12, the results of specifically confirming the efficacy of the existing diagnostic kit and the developed diagnostic kit using the outdoor samples (lung samples: 50) are shown in FIG. 13. As a result, 25 swine influenza were positive. , and swine flu/G4 was confirmed negative. In addition, as a result of subtyping the swine influenza positive (25), H1N1 (10), H1N2 (10), and H3N2 (5) were finally confirmed.
또한, 상기 양성시료 25개를 확인한 결과 신종인플루엔자 시퀀스가 여러 gene에 삽입되어 있음을 확인하였으며, G4는 확인되지 않았다. In addition, as a result of confirming the above 25 positive samples, it was confirmed that the H1N1 influenza sequence was inserted into several genes, and G4 was not confirmed.
4) 개발 키트의 표준 시료에서 특이도 및 정확도 평가4) Evaluation of specificity and accuracy in the standard sample of the development kit
본 발명자들은 표준 시료로 분리주 50주 및 양성시료(폐시료) 25점에 대한 시제품 평가를 수행하였다 The present inventors performed prototype evaluation on 50 isolates and 25 positive samples (waste samples) as standard samples.
결과는 표 13에 나타내었다. The results are shown in Table 13.
& G4new species
& G4
(NF qRT-PCR,
HA qRT-PCR,
NS qRT-PCR) NF, EA MP qRT-PCR
(NF qRT-PCR,
HA qRT-PCR;
NS qRT-PCR)
표 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 개발키트는 특이도 100%, 정확도 100%인 것으로 확인되었다. As shown in Table 13, the development kit of the present invention was confirmed to have 100% specificity and 100% accuracy.
5) 개발한 돼지인플루엔자 subtyping primer & probe의 in silico 분석 5) In silico analysis of developed swine influenza subtyping primer & probe
본 발명자들은 본 발명의 개발된 돼지인플루엔자 subtyping kit의 primer를 HA gene 및 NA gene에서 in silico 분석한 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다. The present inventors showed the results of in silico analysis of the primers of the swine influenza subtyping kit developed in the present invention on the HA gene and NA gene in FIGS. 14 and 15.
도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 돼지인플루엔자 진단용 키트는 조류(H5, H7, H9)와 개(H3N2), 말(H3N8) 인플루엔자 바이러스와 간섭 가능성이 없으며 돼지 인플루엔자 특이적이라는 확인하였다. As shown in FIGS. 14 and 15, the swine influenza diagnostic kit of the present invention has no possibility of interference with avian (H5, H7, H9), dog (H3N2), and equine (H3N8) influenza viruses, and it was confirmed that it is specific for swine influenza. .
6) 개발한 돼지인플루엔자 subtyping primer & probe의 특이도 분석6) Specificity analysis of developed swine influenza subtyping primer & probe
본 발명자들은 본 발명의 개발된 돼지인플루엔자 진단용 키트가 돼지에서 전염성 질병을 일으키는 바이러스 원인체 (11종), 세균성 원인체 (14종)을 대상으로 비특이 반응을 나타내는지 여부를 확인하였다. The present inventors confirmed whether the swine influenza diagnostic kit developed according to the present invention exhibits non-specific reactions to viral agents (11 types) and bacterial agents (14 types) that cause infectious diseases in pigs.
각각의 바이러스 원인체, 세균성 원인체는 다음과 같았다.Each viral and bacterial causative agent was as follows.
바이러스 원인체: CSFV(Classical Swine Fever Virus, 돼지열병바이러스), PRRSV(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, 돼지생식기호흡 기증후군바이러스), PCV2(Porcine Circovirus 2, 돼지써코바이러스 2형), PEDV(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, 돼지유행성설사바이러스), TGEV(Transmissinble Gastroenteritis Virus, 전염성위장염바이러스), PPV (Porcine Parvovirus, 돼지파보바이러스), ADV (Aujesky Virus, 오제스키바이러 스), JEV(Japanese Encephalitis Virus, 일본뇌염바이러스), EMCV (Encephalomyocarditis Virus 뇌심근염 바이러스), PDCoV(Porcine Deltacoronavirus, 돼 지델타코로나바이러스), PCV3(Porcine Circovirus 3, 돼지써코바이러스 3형).Viruses: CSFV (Classical Swine Fever Virus), PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus), PCV2 (Porcine Circovirus 2, Porcine Circovirus Type 2), PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea) Virus, swine epidemic diarrhea virus), TGEV (Transmissinble Gastroenteritis Virus), PPV (Porcine Parvovirus), ADV (Aujesky Virus), JEV (Japanese Encephalitis Virus) , EMCV (Encephalomyocarditis Virus), PDCoV (Porcine Deltacoronavirus), PCV3 (Porcine Circovirus 3, Porcine Circovirus type 3).
세균성원인체: ST(Salmonella Typhimurium, 살모넬라감염증), SEP(swine enzootic pneumonia, 돼지유행성폐렴), Hps(Haemophilus parasuis, 글래스병), Pm(Pasteurella multocida, 파스튜렐라폐렴), App(Actinobacillus pleuropneumoniae, 흉막폐렴), S. suis(Streptococcus suis, 연쇄상구균감염증), CpA(Clostridium perfringens A, 클로스트리디움 퍼프린젠스 A), Law(Lawsonia intracellularis, 로소 니아), SD(Swine Dysentery, 돼지적리), SE(Swine Erysipelas, 돼지단독), Cd(Clostridium difficile, 클로스트리디움 디피실), A. suis(Actinobacillus suis), S. hyicus(Staphylococcus hyicus, 삼출성 표피염).Bacterial causative agents: ST ( Salmonella Typhimurium, Salmonella infection), SEP (swine enzootic pneumonia , swine epidemic), Hps ( Haemophilus parasuis, glass disease), Pm ( Pasteurella multocida, Pasteurella pneumonia), App ( Actinobacillus pleuropneumoniae, pleuropneumoniae) ), S. suis ( Streptococcus suis, streptococcal infection), CpA ( Clostridium perfringens A, Clostridium perfringens A), Law ( Lawsonia intracellularis, Lawsonia), SD (Swine Dysentery), SE (Swine Erysipelas, only swine), Cd ( Clostridium difficile, Clostridium difficile), A. suis ( Actinobacillus suis), S. hyicus (Staphylococcus hyicus , exudative dermatitis).
이와 같이, 본 발명자들은 2009년 신종인플루엔자 A(H1N1)의 유행으로 바이러스질병과 전신성질병연구실에서 산업체공동연구로 개발한 conventional RT-PCR을 국내 돼지 인플루엔자 유행주 변이에 따라 real-time RT-PCR로 개량하고, 그간 국내 유행하는 아형(H1N1, H1N2 및 H3N2)을 감별할 수 있는 HA(H1, H3) 및 NA(N1, N2) subtyping real-time RT-PCR을 개발하였다. As such, the inventors of the present invention developed the conventional RT-PCR, which was developed as an industrial joint research at the Viral Disease and Systemic Disease Laboratory in response to the outbreak of swine influenza A (H1N1) in 2009, by real-time RT-PCR according to the domestic swine influenza epidemic strain variation. We developed HA (H1, H3) and NA (N1, N2) subtyping real-time RT-PCR that can discriminate domestic prevalent subtypes (H1N1, H1N2, and H3N2).
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) MEDIAN Diagnostics Inc. <120> Diagnostic kit and diagnostic method capable of distinguishing HA and NA genotypes of Swine influenza virus <130> PN220012 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NF J1972F <400> 1 ggctagcact acggcaaa 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NF J1973R <400> 2 gctaggatga gtcccaatag t 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NF J2044P <400> 3 atggaggttg ctaatyagac taggc 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NF J1945F <400> 4 gaacggatgg actgggacag a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NF J1946R <400> 5 caatccagcc ctgttagttc t 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NF J1947P <400> 6 agtggtcagg atatagcggg agt 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1961F <400> 7 agattttggc gatctactcc ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1962R <400> 8 gacccattag arcacatcca 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1964P <400> 9 ccagttccct ggtcttrtta gtctc 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1960F <400> 10 agattttggc gatctattca ac 22 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1963P <400> 11 ccagttcatt ggtactggta gtctc 25 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV TR(NS) J1965F <400> 12 tacctacttc gcgctacata 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV TR(NS) J1966R <400> 13 cctggtccat tcgaacacaa 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV TR(NS) J1967P <400> 14 cctcgaggar atgtcacgag actg 24 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1960F <400> 15 agattttggc gatctattca ac 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1989F <400> 16 agattttggc gatctactcy ac 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1962R <400> 17 gacccattag arcacatcca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1994R <400> 18 gacccattgg arcacatcca 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1992F <400> 19 ggattctgtc gatctactca ac 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1993F <400> 20 atatyctggc gatctactca ac 22 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1990P <400> 21 ccagttcatt ggtactgkta gtctc 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1991P <400> 22 tagtctcyct gggggcaatc agct 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1995F <400> 23 tatggatttc ctttgccaya tca 23 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1996R <400> 24 attaatgcay tcaaatgcaa atgtt 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1997P <400> 25 ctaatgttgc cyttttggca ggccc 25 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J1998F <400> 26 cagcatatcy ttttgtggtg t 21 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J1999F <400> 27 agcggaagca gcatttcttt ytgtg 25 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2000R <400> 28 tacttgtcaa tggtraatgg ca 22 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2001P <400> 29 tggtcttggc cagacggtgc tgag 24 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2002P <400> 30 ctggtcrtgg ccagacggag ctgat 25 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2003F <400> 31 aagtctggtg gachtcaaac a 21 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2006F <400> 32 agtatggtgg acctcaaaya gta 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2004R <400> 33 gcttatatag gcatgadatt gat 23 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2005P <400> 34 tggaacaggc tcatggcctg atgg 24 <110> REPUBLIC OF KOREA (Animal and Plant Quarantine Agency) MEDIAN Diagnostics Inc. <120> Diagnostic kit and diagnostic method capable of distinguishing HA and NA genotypes of Swine influenza virus <130> PN220012 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NF J1972F <400> 1 ggctagcact acggcaaa 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NF J1973R <400> 2 gctaggatga gtcccaatag t 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NF J2044P <400> 3 atggaggttg ctaatyagac taggc 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NF J1945F <400> 4 gaacggatgg actgggacag a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NF J1946R <400> 5 caatccagcc ctgttagttc t 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NF J1947P <400> 6 agtggtcagg atatagcggg agt 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1961F <400> 7 agattttggc gatctactcc ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1962R <400> 8 gacccattag arcacatcca 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1964P <400> 9 ccagttccct ggtcttrtta gtctc 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1960F <400> 10 agattttggc gatctattca ac 22 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (EA/NF) J1963P <400> 11 ccagttcatt ggtactggta gtctc 25 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV TR(NS) J1965F <400> 12 tacctacttc gcgctacata 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV TR(NS) J1966R <400> 13 cctggtccat tcgaacacaa 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV TR(NS) J1967P <400> 14 cctcgaggar atgtcacgag actg 24 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1960F <400> 15 agattttggc gatctattca ac 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1989F <400> 16 agattttggc gatctactcy ac 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1962R <400> 17 gacccattag arcacatcca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1994R <400> 18 gacccattgg arcacatcca 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1992F <400> 19 ggattctgtc gatctactca ac 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1993F <400> 20 atatyctggc gatctactca ac 22 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1990P <400> 21 ccagttcatt ggtactgkta gtctc 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1991P <400> 22 tagtctcyct gggggcaatc agct 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1995F <400> 23 tatggatttc ctttgccaya tca 23 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1996R <400> 24 attaatgcay tcaaatgcaa atgtt 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV HA (H1/H3) J1997P <400> 25 ctaatgttgc cyttttggca ggccc 25 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J1998F <400> 26 cagcatatcy ttttgtggtg t 21 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J1999F <400> 27 agcggaagca gcatttcttt ytgtg 25 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2000R <400> 28 tacttgtcaa tggtraatgg ca 22 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2001P <400> 29 tggtcttggc cagacggtgc tgag 24 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2002P <400> 30 ctggtcrtgg ccagacggag ctgat 25 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2003F <400> 31 aagtctggtg gachtcaaac a 21 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2006F <400> 32 agtatggtgg acctcaaaya gta 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2004R <400> 33 gcttatatag gcatgadatt gat 23 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SIV NA (N1/N2) J2005P <400> 34 tggaacaggc tcatggcctg atgg 24
Claims (10)
(a) 다음을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트:
(a1) 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 또는 이들의 조합; 및
(a2) 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H1 유전형 진단용 프라이머, 또는 이들의 조합; 및
(b) 다음을 포함하는 인플루엔자 H3 유전형 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트:
서열번호 23의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H3 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 H3 유전형 진단용 프라이머,
A composition for diagnosing the genotype of swine influenza virus comprising the following (a), (b), or a combination thereof:
(a) a set of oligonucleotides for diagnosis of influenza H1 genotype comprising:
(a1) a primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, a primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 A primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence shown, a primer for diagnosing influenza H1 genotype including the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20, or a combination thereof; and
(a2) a primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, a primer for diagnosing influenza H1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, or a combination thereof; and
(b) a set of oligonucleotides for diagnosis of influenza H3 genotype comprising:
A primer for diagnosing influenza H3 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23, a primer for diagnosing influenza H3 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24,
The method of claim 1, wherein (a) further comprises a probe comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, a probe comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22, or a combination thereof. To, a composition for diagnosing the genotype of swine influenza virus.
The genotyping composition of claim 1, wherein (b) further comprises a probe comprising a nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25.
(c) 다음을 포함하는 인플루엔자 N1 유전형 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트:
(c1) 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N1 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N1 유전형 진단용 프라이머, 또는 이들의 조합; 및
(c2) 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N1 유전형 진단용 프라이머; 및
(d) 다음을 포함하는 인플루엔자 N2 유전형 진단용 올리고뉴클레오타이드 세트:
(d1) 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N2 유전형 진단용 프라이머, 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N2 유전형 진단용 프라이머, 또는 이들의 조합; 및
(d2) 서열번호 33의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 N2 유전형 진단용 프라이머.
The composition for diagnosing the genotype of swine influenza virus according to claim 1, further comprising the following (c), (d), or a combination thereof:
(c) a set of oligonucleotides for diagnosis of influenza N1 genotype comprising:
(c1) a primer for diagnosing influenza N1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26, a primer for diagnosing influenza N1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27, or a combination thereof; and
(c2) a primer for diagnosing influenza N1 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28; and
(d) a set of oligonucleotides for diagnosis of influenza N2 genotype comprising:
(d1) a primer for diagnosing influenza N2 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31, a primer for diagnosing influenza N2 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32, or a combination thereof; and
(d2) A primer for diagnosing influenza N2 genotype comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33.
The method of claim 1, wherein (c) further comprises a probe comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29, a probe comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30, or a combination thereof. To, a composition for diagnosing the genotype of swine influenza virus.
The composition for diagnosing genotype of swine influenza virus according to claim 1, wherein (d) further comprises a probe comprising a nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34.
(e) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 M 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 M 유전자 검출용 프라이머.
The composition for diagnosing swine influenza virus genotype according to any one of claims 1 to 6, further comprising:
(e) Primers for detecting the influenza M gene comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and primers for detecting the influenza M gene comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
The composition for diagnosing swine influenza virus genotype according to claim 1, further comprising a probe for detecting M gene comprising the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
A kit for diagnosing H1 and H3 genotypes of swine influenza virus, comprising the composition of any one of claims 1 to 3.
A kit for diagnosing H1/H3 genotypes and N1/N2 genotypes of swine influenza virus, comprising the composition of any one of claims 4 to 6.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101729977B1 (en) | 2015-10-30 | 2017-04-25 | 경북대학교 산학협력단 | Compositions for detecting swine influenza virus and method for detecting swine influenza virus using the same |
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2022
- 2022-02-04 KR KR1020220015132A patent/KR20230118753A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101729977B1 (en) | 2015-10-30 | 2017-04-25 | 경북대학교 산학협력단 | Compositions for detecting swine influenza virus and method for detecting swine influenza virus using the same |
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