KR20230110501A - 육탄당 인산염과 접합된 약물 및 이를 제조하고 사용하는 방법 - Google Patents

육탄당 인산염과 접합된 약물 및 이를 제조하고 사용하는 방법 Download PDF

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박주연
서근석
이승서
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미시시피 주립대학
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Abstract

항균제를 비-대사성 육탄당 인산염과 접합시켜 육탄당 인산연 수송체(UhpT)를 통해 기존 항생제 기반의 활성 항균제를 전달하는 약물 접합체, 조성물 및 방법. 항균제로서로서 비-대사성 육탄당 인산염과 항생제를 공동 투여하는 방법도 개시되어 있다. 비-대사성 육탄당 인산염은 항생제의 효능 및/또는 항균 범위를 크게 개선하는 UhpT의 발현을 구성적이고 강력하게 유도할 수 있다. 이 약물 접합체, 조성물 및 방법은 현재 낮은 효능 및/또는 병원체에 의한 이들 항생제에 대한 내성으로 인해 폐기되거나 사용되지 않는 많은 FDA 승인 항생제의 재사용을 허용할 것이다.

Description

육탄당 인산염과 접합된 약물 및 이를 제조하고 사용하는 방법
본 출원은 2020년 10월 11일에 출원된 미국 가출원 제63/086,546호의 이익을주장하며, 그 전체 개시는 본 명세서에 참조로 구체적으로 포함된다.
본 개시는 항균제를 불소화 육탄당 인산염과 접합시킴으로써 항균제와 같은 약물의 약동학적 특성 중 하나 이상을 개선하는 약물 접합체(drug conjugate), 약물 조성물, 방법 및 항생제와 같은 항균제를 불소화 육탄당 인산염과 접합시켜 육탄당 인산염 수송체를 사용하여 항균제와 같은 약물을 전달하는 방법에 관한 것이다.
항생제의 발견은 지난 75년 동안 수많은 생명을 구하였다. 그러나 항생제 시대의 황금기는 사라지고 항생제 이후의 암흑기에 접어들고 있다. 매년 미국에서만, 다중약물 내성 ESKAPE 병원체(엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 엔테로박터(Enterobacter) 종)에 의해 발생하는 200만 건 이상의 병원 획득 감염으로 인해 약 200억 달러 초과 건강관리 비용이 발생한다. 이러한 ESKPE 병원체는 클렙시엘라 뉴모니아에 카바페네마제 (KPC) 생성 박테리아, 슈도모나스 에어루기노사, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA), 및 반코마이신 내성 엔테로코카이 (VRE)으로 진화하여 치료 옵션이 남아 있지 않다. 현재 항생제 내성 위기에도 불구하고 주요 제약사들은 평균 약 8000억 달러의 개발 비용과 10년 이상의 개발 시간 때문에 새로운 항균제 개발을 꺼리고 있다. 또한 병원체는 곧 새로운 항균제에 대한 내성을 갖게 된다. 이러한 문제점을 감안하여 본 개시는 새로운 항균제를 개발하기 보다는 현존하는 항균제를 보강하여 그 효능을 개선하고 활성의 범위를 확장시키는 유용한 옵션을 제시하고자 한다.
본 개시는 항생제를 불소화 육탄당 인산염과 접합시키고 이러한 접합된 항생제를 육탄당 인산염 수송체(UhpT)의 흡수를 통해 박테리아에 전달함으로써 항생제와 같은 약물의 약동학적 특성 중 하나 이상을 개선하는 약물 접합체, 약물 조성물, 방법 및 항생제와 같은 항균제를 불소화 육탄당 인산염과 접합시켜 육탄당 인산염 수송체를 사용하여 항균제와 같은 약물을 전달하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 본 개시는 박테리아 UhpT의 발현이 육탄당 인산염에 의해 조절되는 메커니즘을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 UhpT를 통해 항균제를 수송하기 위한 담체 분자로서 불소화 육탄당 인산염을 사용하는 항생제와 같은 항균제의 약동학적 특성 중 하나 이상을 개선한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 높은 수준의 UhpT 발현을 안정적으로 유도하는 비-대사성 불소화 육탄당 인산염을 합성하는 방법을 제공한다.
하나의 특정 구현예에서, 본 개시는 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산에 접합된 약물을 포함하는 접합 약물을 제공한다.
본 개시의 약물 성분은 항생제와 같은 항균제의 접합체일 수 있다. 항생제는 바람직하게는 리네졸리드 및 포스포마이신으로부터 선택될 수 있다.
본 개시의 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 3-데옥시-3,3-디플루오로글루코스, 2-데옥시-2-플루오로글루코스, 화학식 (B2)의 2-데옥시-2-플루오로글루코스의 2,2-이불소화 유도체:
2,3-디데옥시-2,3-디플루오로글루코스, 화학식 (C2)의 2,3-디데옥시-2,2,3,3-테트라불소화 유사체:
화학식 (D1)의 1DG6P:
화학식 (D2)의 상응하는 3-불소화 유사체:
및
4-데옥시-4-플루오로글루코스, 및 화학식 (F1) 및 F2)의 인산염 유사체로부터 선택된다:
본 개시의 불소화 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트 또는 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트로부터 선택될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 비접합 형태의 동일한 약물의 흡수와 비교하여 변형된 약물의 UhpT 흡수를 향상시키기 위해 약물을 변형시키기 위해 HptARS 조절 시스템을 구성적으로 활성화시키고 육탄당 인산염 수송체 (UhpT)의 발현을 유도하는 비-대사성 육탄당 인산염을 사용하는 방법을 제공한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 개시는 비접합 형태의 동일한 약물의 흡수와 비교하여, 접합 약물의 UhpT 흡수를 향상시키기 위해 비-대사성 육탄당 인산염을 약물에 접합시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 약물을 비-대사성 육탄당 인산염과 반응시키는 단계를 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 약물 성분은 항균제일 수 있으며 바람직하게는 항생제이다. 바람직하게는, 항생제는 리네졸리드 및 포스포마이신으로부터 선택된다.
본 개시의 방법에 사용되는 비-대사성 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-페닐화된 포스페이트 및 4-플루오로-글루코스-6-페닐화된 포스페이트로부터 선택될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 개시는 염기의 존재 하에서 3-플루오로-글루코스를 디페닐 클로로포스페이트와 반응시키는 단계를 포함하는 3-플루오로-글루코스-6-페닐화 포스페이트를 제조하는 방법을 제공한다.
3-플루오로-글루코스-6-포스페이트의 제조 방법은 3-플루오로-글루코스를 효소적 인산화에 적용하여 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
효소적 인산화는 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트를 형성하기 위해 아데노신 트리포스페이트(ATP)로부터 3-플루오로-글루코스의 6'-OH 기로 포스페이트 기를 수송하기 위해 헥소키나제를 사용하여 수행될 수 있다.
3-플루오로-글루코스는 다음 단계에 의해 형성될 수 있다:
(a) 용매 중에서 1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-α-D-글루코푸라노스를 (디에틸아미노)황 트리플루오라이드 (DAST)과 반응시켜 3-플루오로-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-α-D-글루코푸라노스를 생성하는 단계, 및
(b) 3-플루오로-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-α-D-글루코푸라노스를 트리플루오로아세트산(TFA)과 반응시켜 이소프로필리덴 보호기를 제거하여 3-플루오로-글루코스를 생성하는 단계.
다른 구현예에서, 본 개시는 하기의 단계를 포함하는, (S)-N-[[3-[3-플루오로-4-(N-1-피페라지닐)페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]아세트아미드를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 3,4-디니트로벤젠과 피페라진을 반응시켜 1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페라진을 얻는 단계,
(b) 1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페라진 내지 1-(2-플루오로-4-아미노페닐)피페라진을 수소화하는 단계,
(c) 벤질 클로로포르메이트와의 반응에 의해 1-(2-플루오로-4-아미노페닐)피페라진의 아미노기를 보호하여 화학식 (5)의 보호된 1-(2-플루오로-4-아미노페닐)피페라진을 제공하는 단계:
(d) 화학식 (5)의 보호된 1-(2-플루오로-4-아미노페닐)피페라진을 리튬화하여 리튬화되고 보호된 1-(2-플루오로-4-아미노페닐)피페라진을 제공하는 단계,
(e) 리튬화되고 보호된 1-(2-플루오로-4-아미노페닐)피페라진을 (R)-글리시딜 부티레이트와 반응시켜 화학식 (7)의 보호된 옥사졸리디닐 유도체를 얻는 단계:
(f) 화학식 (7)의 보호된 옥사졸리디닐 유도체를 토실 클로라이드와 반응시켜 화학식 (8)의 O-토실화된 생성물을 제공하는 단계:
(g) 화학식 (8)의 O-토실화 생성물을 칼륨 프탈이미드로 치환 반응시켜 (R)-N-[[3-[3-플루오로-4-[N-1-(4-카보벤족시) 피페라지닐]-페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]프탈이미드를 얻는 단계,
(h) (R)-N-[[3-[3-플루오로-4-[N-1-(4-카보벤족시) 피페라지닐]-페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]프탈이미드를 탈보호하여 일차 아민을 형성하는 단계,
(i) 단계 (h)의 일차 아민을 아세테이트로 보호하여 화학식 (10)의 N-아세틸 생성물을 제공하는 단계:
및
(j) 선택적으로 탄소 상의 팔라듐 촉매를 사용하는 수소화에 의해 화학식 (10)의 N-아세틸 생성물을 탈보호하여 화학식 (11)의 (S)-N-[[3-[3-플루오로-4-(N-1-피페라지닐)페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]아세트아미드를 제공하는 단계:
본 개시는 또한 리네졸리드를 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트 또는 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트와 접합시킴으로써 리네졸리드의 하나 이상의 약동학적 특성을 개선하는 방법의 예를 제공한다. 이 방법은 리네졸리드의 항균 활성을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 포스포마이신을 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트 또는 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트와 접합시킴으로써 포스포마이신의 하나 이상의 약동학적 특성을 개선하는 방법의 예를 제공한다. 이 방법은 포스포마이신의 항균 활성을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
3-플루오로-글루코스-6-포스페이트를 리네졸리드와 접합하기 위한 본 개시의 한 방법은 하기의 단계를 수반한다:
화학식 (11)의 (S)-N-[[3-[3-플루오로-4-(N-1-피페라지닐)페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]아세트아미드:
을 γ-부티로락톤과 반응시켜 화학식 (14)의 아미드를 제공하는 단계:
및
화학식 (14)의 아미드를 화학식 (13)의 3-플루오로-글루코스-6-페닐화 포스페이트:
과, 산-촉매 글리코실화 반응으로 커플링하여 화학식 (15)의 생성물을 생성하는 단계:
, 및
화학식 (15)의 생성물의 탈보호하여 화학식 (16)의 접합 생성물을 제공하는 단계:
본 개시는 또한 상기 구현예 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 접합된 항생제를 함유하는 조성물을 상기 박테리아가 감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 개시는 박테리아 감염의 치료를 위한, 상기 구현예 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 접합된 항생제의 용도에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 개시는 박테리아 감염을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 비-대사성 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염과 함께 하나 이상의 항생제를 공동 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 박테리아 감염 치료를 위한, 항생제와 조합한 비-대사성 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염의 용도에 관한 것이다.
이전 단락의 각각의 구현예에서, 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 3-데옥시-3,3-디플루오로글루코스, 2-데옥시-2-플루오로글루코스, 화학식 (B2)의 2-데옥시-2-플루오로글루코스의 2,2-이불소화 유도체:
2,3-디데옥시-2,3-디플루오로글루코스, 화학식 (C2)의 2,3-디데옥시-2,2,3,3-테트라불소화 유사체:
화학식 (D1)의 1DG6P:
화학식 (D2)의 상응하는 3-불소화 유사체:
및
4-데옥시-4-플루오로글루코스, 및 화학식 (F1) 및 F2)의 인산염 유사체로부터 선택되고:
여기서 F/OH는 치환기가 -F 또는 -OH일 수 있음을 나타내며, 단 이들 화학식의 각각의 화합물은 -F인 치환기를 적어도 하나 가져야 한다.
본 개시의 약물 접합체, 조성물 및 방법이 본 명세서의 도면 및 설명에 상세히 예시되고 기재되어 있지만, 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트(3FG6P) 또는 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트 또는 (4FG6P)와 접합된 리네졸리드 또는 포스포마이신을 사용한 도면 및 이들의 설명은 예시적인 것으로 간주되며 특성상 제한되지 않고; UhpT의 발현을 유도하고/하거나 UhpT를 통한 접합 항생제 수송을 용이하게 하기 위해 불소화 육탄당 인산염 모이어티를 이용하는 모든 변경 및 수정이 본 발명의 범위 내에 있음이 이해된다.
도 1은 UhpT의 발현이 육탄당 인산염(HP)에 의해 조절되는 메커니즘을 예시한다. HptA 막 단백질은 HptS의 자가인산화를 유도하는 세포외 육탄당 인산염을 감지한다. 이어서, HptS는 HptR의 이량체화를 야기하는 HptR을 인산화시킨다. 그 다음 이량체화 HptR은 uhpT 유전자의 프로모터 영역에 결합하고 UhpT의 발현을 유도하여 UhpT에 의한 인산염의 흡수를 용이하게 한다.
도 2는 일반적으로 UhpT를 통해 수송할 수 없는 항생제의 UhpT 수송을 용이하게 하기 위해 육탄당 인산염 모이어티를 사용하는 것을 예시한다. 항생제(HP-AB)와 접합된 육탄당 인산염 모이어티는 UhpT의 발현을 유도한 다음, 포스페이트 모이어티의 존재로 인해 UhpT를 통해 육탄당 인산염(AB-HP)과 접합된 항생제의 박테리아로의 수송을 용이하게 한다. 이는 다음과 같은 효과를 제공한다:
1) 적절한 수송 시스템이 결여된 항생제 등의 항균제를 UhpT를 통해 박테리아로 수송하여 항균 활성의 범위를 넓히고, 그리고
2) UhpT의 발현을 증가시켜 항균 내성을 회피하고 잠재적으로 제거함으로써 항생제와 같은 항균제의 약동학적 특성 중 하나 이상을 개선한다.
도 3은 합성된 육탄당 인산염이 육탄당 인산염 탈수소효소에 의해 대사되는 것을 방지하기 위해 불소화 육탄당 인산염을 합성하는 화학효소적 방법의 일례를 보여준다.
도 4는 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트 (3FG6P)가 일차 개 방광 상피 세포에 의해 대사되지 않음을 보여준다. 3FG6P(500μM)를 RPMI1640 세포 배양 배지에 재현탁하고 24시간 동안 일차 개 방광 세포의 존재 및 부재에서 인큐베이션하였다. 배양 배지의 메탄올 추출물을 질소 가스 하에서 증발 건조시킨 다음, 100 μL의 1:1(v/v) 아세토니트릴/수성 25 mM 포름산암모늄으로 재구성하였다. 2 μL의 각 샘플을 Waters UPLC 및 Thermo Quantum 삼중 사중극자 질량 분광계(전자분무 이온화)에 커플링된 2.1 mm x 100 mm HILIC 컬럼에 주입하였다. 3FG6P(m/z 261.0 > 79.3)의 질량 전이는 크로마토그래피 실행 전체에서 모니터링되었다(도 참조). 방광 세포에 의한 3FG6P 대사의 증거는 나타나지 않았다.
도 5는 3FG6P에 의한 UhpT 발현의 강력하고 안정적인 유도와 생물발광 광 신호를 측정하여 UhpT의 발현을 모니터링하기 위한 LuxABCDE 리포터 시스템을 예시한다. LuxABCDE 리포터 시스템을 보유하는 S. 아우레우스(S. aureus) LAC 균주는 500 μM 글루코스 (Glc), 글루코스-6-포스페이트 (G6P), 및 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트 (3FG6P)가 보충된 뇌 심장 주입 액체배지에서 배양되었고 생물발광 신호는 Cytation 5를 사용하여 모니터링되었다. G6P가 일시적으로 생물발광 신호를 유도하는 반면, 3FG6P는 구성적 생물발광 신호를 유도하였다. 글루코스는 생물발광 신호를 유도하지 않았다. 이러한 결과는 비-대사성 3FG6P가 안정적으로 HptARS 시스템을 활성화하고 UhpT의 발현을 유도함을 나타낸다.
도 6은 S. 아우레우스 LAC 균주가 3FG6P를 효율적으로 차지한 반면, UhpT(ΔUhpT)가 없는 S. 아우레우스 LAC 균주는 3FG6P를 효율적으로 차지하지 않았음을 보여준다.
도 7은 리네졸리드 모이어티를 합성하는 방법을 보여준다.
도 8은 3FG6P 모이어티를 합성하는 방법을 보여준다.
도 9는 리네졸리드 모이어티를 3FG6P와 접합시키는 방법을 보여준다.
도 10a 내지 10d는 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 25923 (도 10a), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) ATCC 35657 (도 10b), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) ATCC BAA1605 (도 10c) 및 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) ATCC 25922 (도 10d)에 대한 리네졸리드 및 3FG6P와 접합된 리네졸리드의 항균 활성을 비교한 것이다. 각 도 10a 내지 10d는 각 도면의 두 그래프 모두에 적용된다.
도 11a 내지 11c는 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) ATCC 13047 (도 11a), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) ATCC13048 (도 11b), 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) ATCC 14028 (도 11c)와 접합된 리네졸리드의 항균 활성을 비교한 것이다. 각 도 11a 내지 11c는 각 도면의 두 그래프 모두에 적용된다.
도 12a 및 도 12b는 3FG6P와 접합된 리네졸리드의 치료가 E. 콜라이에 의해 유발된 요로 감염을 성공적으로 제거한 반면, 비접합 리네졸리드로의 치료는 감염을 통제하지 못했음을 보여준다. C57BL/6 마우스에 생물발광 E. 콜라이 균주를 요도를 통해 접종하고 접종 후 2, 24, 및 48시간에 PBS, 리네졸라이드 (80 mg/kg), 및 3FG6P와 접합된 리네졸라이드 (80 mg/kg)로 처리하였다. 접종 72시간 후, IVIS Lumina XR 작은 동물 이미징 시스템을 사용하여 감염 진행을 모니터링하고 플레이트 카운팅 방법으로 신장 및 방광의 박테리아 부하를 결정하였다.
도 13a 내지 13d는 포스포마이신 내성 E. 콜라이 임상적 격리에 대한 포스포마이신 단독 (도 13a) 및 3FG6P 또는 4FG6P와 접합된 포스포마이신 (도 13b), 및 S. 아우레우스 COL 균주에 대한 포스포마이신 단독 (도 13c) 및 3FG6P 또는 4FG6P와 접합된 포스포마이신 (도 13d)의 항균 활성의 비교를 보여준다. 도 13d의 키(key)는 도 13a 내지 13d의 모든 그래프에 적용된다.
도 14a 및 도 14b는 포스포마이신 또는 4FG6P와 접합된 포스포마이신의 생체내 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스(n=3)를 생물발광 S. 아우레우스 COL 균주로 복강내 감염시켰다. 감염 후 2시간 및 24시간 후, 동물을 포스포마이신 (3 mg/kg) 단독, 4FG6P와 접합된 포스포마이신 (50μg/kg) 또는 대조군으로서 PBS로 처리하였다. 48시간 후, IVIS Lumina XR 작은 동물 이미징 시스템을 사용하여 감염 진행을 모니터링하였다. 복막 세척 및 조직의 박테리아 부담을 결정하였다.
항균제에 대한 내성은 두 가지 주요 메커니즘의 결과로 발생한다. 하나의 메커니즘은 유전적 돌연변이(들)에 의해 항생제가 작용하는 표적의 변형을 수반한다. 다른 메커니즘은 항생제 유출 펌프를 발현하고, 막의 투과성을 감소시키고/거나 항생제를 파괴함으로써 항생제가 충분히 높은 농도에서 표적에 도달하는 것을 방지한다. 전자의 메커니즘은 새로운 표적에 작용할 수 있는 새로운 항생제를 개발해야만 해결할 수 있다. 후자의 메카니즘은 본 발명에서와 같이 항생제의 하나 이상의 약동학적 특성을 개선함으로써 해결될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "육탄당 인산염"는 구체적으로 육탄당 인산염 또는 일반적으로 육탄당 인산염 및 불소화 육탄당 인산염을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약동학적 특성"은 약물 전달, 약물 흡수, 약물 분포, 약물 대사 및 약물 배출 중 하나 이상을 지칭한다.
최근에 박테리아 유전자 조절 시스템(HptARS)이 특성화되었다. HptARS는 스타필로코쿠스 아우레우스로부터 육탄당 인산염 수송체 (UhpT)의 흡수 발현을 제어한다(도 1). HptA는 세포외 육탄당 인산염(HP)을 감지하는 막 단백질이다. HptA에 의한 HP의 인식은 HptS 다음에 HptR의 순차적 인산화를 유도한다. HptR은 UhpT 유전자의 프로모터 영역에 결합하고 UhpT의 발현을 유도하여 인산화된 육탄당 분자를 박테리아와 같은 미생물로 흡수하는 것을 촉진하는 전사 조절인자이다.
중요한 것은 박테리아 게놈 서열 분석에서 UhpT 시스템이 ESKAPE 병원체를 포함한 많은 그람 양성 및 그람 음성 병원체에서 고도로 보존되어 있음을 보여주었다. 이러한 발견으로 인해 낮은 효능 및/또는 그러한 병원체에 대한 좁은 범위의 활성으로 인해 사용이 권장되지 않는 항생제를 수송하기 위해 HptARS 및 UhpT 시스템을 활용하는 개념을 개발하게 되었다. 보다 구체적으로, 이들 항생제는 육탄당 인산염(HP) 또는 불소화 육탄당 인산염과 접합되어 육탄당 인산염 접합 항생제(AB-HP)를 제공한다. 육탄당 인산염 접합된 항생제는 HptARS 시스템을 활성화하고 UhpT의 발현을 유도한다. 이것은 UhpT를 통해 AB-HP의 흡수를 용이하게 한다. 육탄당 인산염 모이어티가 없는 비접합 항생제(AB)는 적절한 수송 시스템이 없기 때문에 UhpT를 통해 또는 다른 방식으로 박테리아로 수송될 수 없다. 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염과의 접합은 그러한 항생제의 효능을 증가시키고 항균 활성의 범위를 확장한다. 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산과의 이러한 접합은 현재 낮은 효능 및/또는 좁은 범위의 항균 활성으로 인해 사용이 포기되거나 권장되지 않는 많은 항생제에 적용할 수 있다.
본 개시는 링커를 통한 육탄당 인산염 모이어티에 대한 항생제와 같은 항균제의 접합에 관한 것이다. 링커는 항생제 분자와 같은 다양한 약물 어레이와 함께 다용도 사용을 보장하기 위해 약물에 비교적 쉽게 접합되도록 선택될 수 있다. 링커는 절단 가능한 링커 또는 절단 불가능한 링커일 수 있다. 바람직하게는, 링커는 절단 가능한 링커인데, 이는 많은 경우에 항생제 분자가 원하는 효과를 제공하기 위해 박테리아 내부에서 일단 방출될 필요가 있기 때문이다. 그러나 항생제 분자의 SAR에 따라, 향상된 안정성을 제공하기 위해 절단 불가능한 링커를 사용할 수 있다.
하기 표 1은 본 개시의 예시적인 적합한 항생제 및 절단 가능한 링커의 목록을 보여준다.
접합 약물의 세 번째 요소는 바람직하게는 대사되지 않도록 안정화되는 글루코스-6-포스페이트(G6P) 단위이다. 3FG6P는 충분히 활성일 뿐만 아니라 대사에 내성이 있는 적합한 모이어티의 한 예이다. 4FG6P 및 기타 FG6P도 사용할 수 있다. 적합한 불소화 육탄당 인산염는 또한 3-데옥시-3,3-디플루오로글루코스 (A), 2-데옥시-2-플루오로글루코스 (B1), 의 2-데옥시-2-플루오로글루코스의 2,2-이불소화 유도체 (B2), 2,3-디데옥시-2,3-디플루오로글루코스 (C1) 및 2,3-디데옥시-2,2,3,3-테트라불소화 유사체 (C2)를 포함한다. 1-위치에서의 탈산소화는 당분해 및 오탄당 인산염 경로를 모두 방지하므로 4-데옥시-4-플루오로글루코스(E)와 마찬가지로 1DG6P(D1) 및 상응하는 3-불소화 유사체(D2)도 적합할 수 있다.
폴리불소화 화합물의 합성에 적합한 방법은 문헌에서 입수할 수 있다. 헥소키나제는 단일 불소화 글루코스를 인산화할 수 있다. 헥소키나제로 변환할 수 없는 기질의 경우 화학적 인산화를 사용할 수 있다.
두 번째 유형의 적합한 유사체는 6-포스페이트 기(F)을 포함한다. 당 고리의 불소화는 세 번째 대사 경로인 인산염 기의 가수분해에 영향을 미치지 않는다. 이것은 메틸렌(F1) 또는 불소화 메틸렌 기(F2)로 인산염의 가교 산소를 대체하여 비-가수분해성 인산염 유사체의 합성을 통해 해결할 수 있다.
아래 화학식에서 치환기가 "F/OH"로 표시되는 경우, 이는 치환기가 -F 또는 -OH일 수 있음을 나타내며, 단 이들 화학식의 각각의 화합물은 -F인 치환기를 적어도 하나 가져야 한다.
육탄당 인산염은 박테리아와 숙주 세포에 에너지를 제공하는 고도 대사성 영양소이다. 따라서 정상적인 육탄당 인산염은 반감기가 매우 짧다. 육탄당 인산염의 약력학을 개선하기 위해서는, 박테리아와 숙주 세포에 의해 쉽게 대사되지 않는 육탄당 인산염의 개발이 필요하다. 불소화는 분자의 전자 특성을 조절하며, 리간드의 불소화는 대부분의 경우 단백질에 대한 탄수화물의 결합 친화력을 유리하게 조절할 수 있는 단백질 잔기와 매력적인 상호작용을 허용하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구에서는 불소화 탄수화물이 마이코박테리움의 효소적 분해로부터 보호를 제공할 수 있음을 입증하였다. 문헌[Marriner GA, Kiesewetter DO, D'Hooge F, Lee SS, Boutureira O, Raj R, Khan N, Via LE, Barry CE, Davis BG. Evaluation of Trehalose Derivatives as Radiotracers Specific for Tuberculosis in Animal Models of Disease. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 2015;58(S1):S250. doi: 10.1002/jlcr.3302_2] 참조.
다른 양태에서, 본 개시는 항생제를 불소화 육탄당 인산염과 접합시키고 이러한 접합된 항생제를 육탄당 인산염 수송체(UhpT)의 흡수를 통해 박테리아에 전달함으로써 항생제와 같은 약물의 약동학적 특성 중 하나 이상을 개선하는 방법 및 항생제와 같은 항균제를 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염과 접합시켜 육탄당 인산염 수송체를 사용하여 항균제와 같은 약물을 전달하는 방법을 제공한다. 리네졸리드 또는 포스포마이신을 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트 또는 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트와 접합시킴으로써 리네졸리드 및 포스포마이신의 하나 이상의 약동학적 특성을 개선하는 방법의 예는 상기에 기재되어 있다. 이들 방법은 리네졸리드 및 포스포마이신의 항균 활성을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 박테리아 UhpT의 발현이 육탄당 인산염에 의해 조절되는 메커니즘을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 높은 수준의 UhpT 발현을 안정적으로 유도하는 비-대사성 불소화 육탄당 인산염을 합성하는 방법을 제공한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 개시는 상기 구현예 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 염기의 존재 하에서 3-플루오로-글루코스를 디페닐 클로로포스페이트와 반응시키는 단계를 포함하는 3-플루오로-글루코스-6-페닐화 포스페이트를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 상기 구현예 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 접합된 항생제를 함유하는 조성물을 상기 박테리아가 감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 개시는 박테리아 감염의 치료를 위한, 상기 구현예 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 접합된 항생제의 용도에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 개시는 박테리아 감염을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 비-대사성 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염과 함께 하나 이상의 항생제를 공동 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 박테리아 감염 치료를 위한, 항생제와 조합한 비-대사성 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염의 용도에 관한 것이다.
이전 단락의 각각의 구현예에서, 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 3-데옥시-3,3-디플루오로글루코스, 2-데옥시-2-플루오로글루코스, 화학식 (B2)의 2-데옥시-2-플루오로글루코스의 2,2-이불소화 유도체:
2,3-디데옥시-2,3-디플루오로글루코스, 화학식 (C2)의 2,3-디데옥시-2,2,3,3-테트라불소화 유사체:
화학식 (D1)의 1DG6P:
화학식 (D2)의 상응하는 3-불소화 유사체:
및
4-데옥시-4-플루오로글루코스, 및 화학식 (F1) 및 F2)의 인산염 유사체로부터 선택되고:
여기서 F/OH는 치환기가 -F 또는 -OH일 수 있음을 나타내며, 단 이들 화학식의 각각의 화합물은 -F인 치환기를 적어도 하나 가져야 한다.
실시예
실시예 1: 3 - 플루오로 - 글루코스 -6- 포스페이트의 합성
첫 번째 단계에서, 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트가 합성되어 글루코스 고리의 세 번째 탄소에 있는 하이드록실 기가 불소 원자로 대체된다. 이 합성의 첫 번째 단계는 3-플루오로-글루코스를 제조하는 것이다. 이 단계에서, 1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-α-D-글루코푸라노스는 디클로로메탄에서 (디에틸아미노)황 트리플루오라이드 (DAST)와 반응하여 3' 위치에서 입체특이성 불소화를 일으켜 3-플루오로-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-α-D-글루코푸라노스를 생성한다. 3-플루오로-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-α-D-글루코푸라노스를 트리플루오로아세트산(TFA)과 반응시켜 이소프로필리덴 보호기를 제거하여 3-플루오로-글루코스를 얻었다. 3-플루오로-글루코스를 플래쉬 크로마토그래피로 정제하고 효소적 인산화에 적용하여 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트를 형성하였다. 이 반응에서, 헥소키나제는 포스페이트 기를 ATP로부터 3-플루오로-글루코스의 6'-OH 기로 수송한다 (도 3). 그 다음 생성물인 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트를 음이온 교환 컬럼이 장착된 HPLC로 정제하고 사용할 때까지 동결건조하였다.
3-플루오로-글루코스-6-포스페이트 (3FG6P)가 숙주 세포에 의해 대사되는지 여부를 테스트하기 위해, 3FG6P(500μM)를 RPMI1640 세포 배양 배지에 재현탁하고 24시간 동안 일차 개 방광 세포의 존재 및 부재에서 인큐베이션하였다. x를 함유하는 배양 배지의 메탄올 추출물을 질소 가스 하에서 증발 건조시킨 다음, 100 μL의 1:1(v/v) 아세토니트릴/수성 25 mM 포름산암모늄으로 재구성하였다. 2 μL의 각 샘플을 Waters UPLC 및 Thermo Quantum 삼중 사중극자 질량 분광계(전자분무 이온화)에 커플링된 2.1 mm x 100 mm HILIC 컬럼에 주입하였다. 3FG6P(m/z 261.0 > 79.3)의 질량 전이는 크로마토그래피 실행 전체에서 모니터링되었다. 개 방광 상피 세포의 존재 하에서 세포 배양 배지로부터의 3FG6P 피크의 강도는 개 방광 상피 세포의 부재 하에서 동일한 세포 배양 배지에 대한 피크와 다르지 않았으며, 이는 3FG6P가 방광 상피 세포에 의해 대사되지 않는다는 것을 나타낸다(도 4).
실시예 2: UhpT에 대한 3- 플루오로 - 글루코스 -6- 포스페이트의 효과
3FG6P가 UhpT의 발현을 유도할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, uhpT의 프로모터 영역이 프로모터가 없는 LuxABCDE 오페론에 융합된 생물발광 리포터 플라스미드를 생성하였다(도 5). 생물발광 광 신호를 측정하여 UhpT의 발현을 모니터링하기 위해 문헌[Francis KP, Joh D, Bellinger-Kawahara C, Hawkinson MJ, Purchio TF, Contag PR. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and immunity. 2000;68(6):3594-600. Epub 2000/05/19. PubMed PMID: 10816517; PMCID: PMC97648 and Karsi A, Lawrence ML. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 2007;57(3):286-95. Epub 2007/01/09. doi: 10.1016/j.plasmid.2006.11.002. PubMed PMID: 17207855] 참조.
글루코스-6-포스페이트는 일시적으로 8시간 동안 생물발광 광 신호를 유도하는 반면, 3FG6P는 18시간 초과 동안 훨씬 더 높은 생물발광 광 신호를 유도한다(도 5). 예상대로 글루코스은 생물발광 신호를 유도하지 않았다. 이러한 결과는 3FG6P가 안정적이고 강력하게 HptARS 시스템을 활성화시키고 UhpT의 발현을 유도함을 나타낸다.
3FG6P를 박테리아로 항생제를 수송하기 위한 수송체 분자로 사용하려면 항생제에 접합된 후에도 3FG6P가 UhpT에 의해 인식되어야 한다. 이를 테스트하기 위해, uhpT 유전자(ΔUhpT)가 결여된 스타필로코쿠스 아우레우스 LAC를 생성했으며, 그 결과 육탄당 인산염을 수송할 수 없다. 3FG6P(500 μM)를 함유하는 PBS를 S. 아우레우스 LAC 야생형 (WT) 균주 및 S. 아우레우스 LAC ΔUhpT 균주 모두의 존재 하에, 그리고 S. 아우레우스(PBS 대조군)의 부재 하에 6시간 동안 인큐베이션하였다. 전술된 바와 같이 Waters UPLC 및 Thermo Quantum 삼중-사중극자 질량 분광계에 커플링된 HILIC 컬럼을 사용하여 3FG6P의 농도를 결정하였다. S. 아우레우스 LAC 야생형 (WT) 균주와 함께 2시간 동안 인큐베이션한 경우, 3FG6P 농도는 PBS 대조군에 대해 약 40%로 급격히 감소하였고, 6시간 후에 PBS에서 완전히 사라졌다(도 6). 대조적으로, S. 아우레우스 LAC ΔUhpT 균주와 함께 인큐베이션한 경우, 3FG6P의 100%가 2시간 동안 남아있었고 이후 3FG6P의 농도가 점차 감소하여 6시간 후에 PBS 대조군으로 대략 60%까지 감소하였다. 이러한 결과는 3FG6P가 UhpT에 의해 S. 아우레우스 WT 균주로 효율적으로 수송됨을 입증한다.
총체적으로, 이러한 결과는 불소화 육탄당 인산염(3FG6P)이 UhpT의 안정적이고 강력한 발현을 유도할 수 있고, 불소 변형에도 불구하고 불소화 육탄당 인산염(3FG6P)이 여전히 효과적으로 인식되고 UhpT에 의해 박테리아 세포로 수송된다는 것을 입증한다. 이러한 결과는 불소화 육탄당 인산염이 UhpT를 통해 박테리아 세포로 항생제를 수송하는 수송체 분자로 사용될 수 있다는 개념을 입증한다. 이를 통해 현재 낮은 효능 및/또는 좁은 범위의 항균 활성으로 인해 선호되지 않는 항생제를 재사용할 수 있다.
실시예 3: 3FG6P와의 접합에 의한 리네졸리드의 항균 활성 확장
리네졸리드는 옥사졸리디논 고리의 5번 위치에 부착된 아세트아미도메틸 기와 페닐 기의 3번 위치에 불소 치환을 갖는 3-아릴-2-옥사졸리디논 계열의 구성원이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 리네졸리드는 (S)-N-[[3-[3-플루오로-4-(N-1-피페라지닐)페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]아세트아미드를 지칭한다. 리네졸리드는 매우 초기 단계에서 박테리아의 리보솜 단백질 합성을 억제한다. 리네졸리드는 50S 리보솜 서브유닛의 23S에 결합하여 30S 서브유닛, fMet-RNA, 개시 인자 IF2 및 IF3, 및 mRNA와 기능적 70S 개시 복합체의 형성을 방지한다.
리네졸리드는 모든 임상적으로 중요한 그람-양성 박테리아 예컨대 1 내지 4 범위의 MIC90 및 2 μg/ml를 갖는 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA), 1 내지 4의 MIC90 및 1μg/ml을 갖는 스타필로코쿠스 에피더미디스 (MRSE), 1 내지 4의 MIC90 및 2 μg/ml를 갖는 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 (VRE) 파에칼리스 및 패슘에 대해 효과적이다. 그러나 리네졸리드는 빠른 유출 메커니즘으로 인해 호기성 그람 음성 병원체에 대해 덜 효과적이다. 리네졸리드는 아시네토박터 spp, 에스케리치아 콜라이, 클렙시엘라 뉴모니아에, 프로테우스 펜네리, 슈도모나스 에어루기노사, 및 스테노트로포모나스 말토필리아에 대해 활성이 없다. 리네졸리드는 16 μg/ml의 MIC90으로 하에모필루스 인플루엔자 및 나이세리아 고노리아에 대해 최소한의 활성을 나타낸다. 문헌[Jones RN, Johnson DM, Erwin ME. In vitro　antimicrobial activities and spectra of U-100592 and U-100766, two novel fluorinated oxazolidinones. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40(3):720-726 and Zhanel GG, Karlowsky JA, Low DE, Hoban DJ. Antibiotic resistance in respiratory tract isolates of Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis collected from across Canada in 1997-1998. J Antimicrob Chemother 2000; 45(5):655-66] 참조.
3FG6P와 접합된 리네졸리드의 합성
불소화 육탄당 인산염이 리네졸리드의 효능 및/또는 항균 활성 범위를 개선할 수 있음을 입증하기 위해 리네졸리드를 3FG6P와 접합하였다. 3FG6P(17)와 접합된 리네졸리드의 합성은 먼저 일련의 8단계로 3,4-디니트로벤젠 (1)로부터 리네졸리드 모이어티 (S)-N-[[3-[3-플루오로-4-(N-1-피페라지닐)페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]아세트아미드 (11)의 합성에 의해 세 부분으로 수행되었다. 3,4-디니트로벤젠(1)을 먼저 피페라진과 반응시켜 1-(2-플루오로-4-니트로페닐)피페라진을 얻었고, 이어서 반응시켜 N-보호된 유도체(5)를 얻었다. N-보호된 유도체(5)를 n-BuLi를 사용하여 리튬화한 다음, (R)-글리시딜 부티레이트(6)와 반응시켜 옥사졸리디닐 유도체(7)를 얻은 다음, 토실 클로라이드와 반응시켜 O-토실화 생성물(8)을 제공하였다. O-토실화 생성물(8)을 칼륨 프탈이미드로 치환 반응시켜 (R)-N-[[3-[3-플루오로-4-[N-1-(4-카보벤족시) 피페라지닐]-페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]프탈이미드(9)을 얻었다. (9)를 일차 아민으로 탈보호하고 아세테이트로 추가로 보호하여 N-아세틸 생성물(10)을 얻었고, 이를 H2 및 탄소 상 팔라듐으로 탈보호하여 도 7에 표시된 원하는 생성물(11)을 얻었다.
3-플루오로-글루코스-6-페닐화 포스페이트 모이어티(13)의 합성은 염기인 4-디메틸아미노 피리딘(DMAP)의 존재 하에 3-플루오로-글루코스를 디페닐 클로로포스페이트와 반응시켜 수행하였다(도 8).
그 다음 생성물(11)을 γ-부티로락톤과 반응시켜 중간체 아미드(14)를 생성하고, 이어서 산-촉매 글리코실화 반응을 통해 3-플루오로-글루코스-6-페닐화 포스페이트 모이어티(13)와 커플링하여 생성물(15)를 얻었다. 최종 탈보호는 원하는 생성물(16)을 얻는다(도 9).
실시예 4: 리네졸리드 및 3FG6P와 접합된 리네졸리드의 시험관내 항균 활성
그람-양성 및 그람-음성 병원체에 대한 리네졸리드 및 3FG6P와 접합된 리네졸리드 (Lzd-3FG6P)의 향균 활성을 테스트하기 위해, 병원체 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 25923, 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC 35657, 아시네토박터 바우마니 ATCC BAA1605, 에스케리치아 콜라이 ATCC 25922, 엔테로박터 클로아카에 ATCC 13047, 엔테로박터 에어로게네스 ATCC13048, 및 살모넬라 타이피뮤리움 ATCC 14028을 사용하였다. 문헌[Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) document M07-A9 (Clinical and Laboratory Standards Institute. 2012. M07-A9. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: approved standard, 9th ed. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA)]의 지침에 따라 액체배지 미량희석을 사용하여 최소 억제 농도(MIC)를 결정하였다. 간략하게, 이들 박테리아 균주를 지수 파아지(OD600 <1.0)가 될 때까지 Muller Hinton 액체배지(MHB)에서 성장시켰다. 기하급수적으로 성장한 테스트 박테리아를 MHB에서 0.01의 OD600으로 희석하고 96웰 플레이트에 분취하였다. 리네졸리드 (Lzd) 및 3FG6P와 접합된 리네졸리드 (Lzd-3FG6P)의 스톡을 DMSO에서 10mg/ml로 준비하고 이를 64 μg/ml 내지 2 μg/ml(최종 농도)로 2-배 연속 희석액으로 희석하고 96웰 플레이트에 첨가하였다. DMSO 대조군(도에서 0 μg/ml)이 포함되었다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고 Cytation 5 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 OD600을 측정하여 박테리아의 성장을 모니터링하였다.
리네졸리드는 그람 양성 병원체인 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 25923의 MIC 2 μg/ml 미만의 성장을 성공적으로 억제한 반면, 리네졸리드는 64 μg/ml의 농도에서도 그람 음성 병원체의 증식을 억제하지 못하였다(도 10). 대조적으로, 3FG6P와 접합된 리네졸리드 (Lzd-3FG6P)는 2 내지 8 μg/ml의 농도 범위에서 그람 양성 및 그람 음성 병원체의 성장을 성공적으로 억제하였다(도 10 및 아래 표 2). 이러한 결과는 리네졸리드의 항균 활성이 3FG6P와 접합하여 그람 음성 병원체로 확장되었음을 명확하게 입증한다.
실시예 5: 리네졸리드 및 3FG6P와 접합된 리네졸리드의 생체내 항균 활성
리네졸리드 및 3FG6P와 접합된 리네졸리드의 생체내 항균 활성을 테스트하기 위해, pLuxABCDE 플라스미드를 사용하여 생물발광 광 신호를 구성적으로 발현하는 임상 E. 콜라이 균주를 구축하였다. 감염의 진행을 실시간 모니터링하기 위한 문헌[Karsi A, Lawrence ML. road host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 2007;57(3):286-95. Epub 2007/01/09. doi: 10.1016/j.plasmid.2006.11.002. PubMed PMID: 17207855] 참조. 6주령에서 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 Harlan 실험실에서 구입하여 Mississippi State University의 동물실험윤리위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수용하고 유지하였다. 동물(n=6/그룹)을 PBS(2Х109 CFU/ml)에 현탁시킨 50 μL의 생물발광 E. 콜라이 균주로 경요도로 감염시켰다. 감염 후 2, 24 및 48시간에 리네졸리드 (80 mg/kg), 3FG6P와 접합된 리네졸리드 (80 mg/kg) 또는 PBS 대조군의 복강내 주사로 동물을 처리하였다. IVIS Lumina XR 작은 동물 이미징 시스템을 사용하여 생물발광 광 신호를 측정하여 감염 진행을 모니터링하였다. 감염 72시간 후, 동물을 인도적으로 안락사시키고 방광 및 신장 샘플을 수집하고, 균질화하고, 연속 희석하고, 연속 희석액을 혈액 한천에 플레이팅하여 박테리아 부담을 측정하였다. E. 콜라이의 경요도 접종은 항생제 치료 없이 신장과 방광에 지속적인 감염을 일으켰다(PBS 대조군). 신장과 방광의 평균 박테리아 수는 각각 log106.328±0.132 및 log106.171±0.155 CFU/g였다(도 12). 리네졸리드에 의한 치료는 신장과 방광의 박테리아 수를 감소시키지 않은 반면, 3FG6P와 접합된 리네졸리드 (Lzd-3FG6P)에 의한 치료는 신장의 감염을 완전히 제거했고 방광의 감염을 거의 완전히 제거하였다. 이러한 결과는 3FG6P의 컨쥬게이션이 리네졸리드를 E. 콜라이에 의해 유발된 요로 감염의 제어에 매우 효과적으로 만든다는 것을 명확하게 입증한다.
실시예 6: 4FG6P 또는 3FG6P와의 공동 투여에 의한 포스포마이신의 항균 활성 개선
포스포마이신은 대부분의 박테리아에 잘 보존된 글리세롤-3-포스페이트 수송체 (GlpT) 시스템 및 글루코스-6-포스페이트 수송체 (UhpT) 시스템을 통해 수송되기 때문에 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 모두에 대해 광범위한 범위 활성을 갖는 살균 항생제이다. 문헌[Sastry S, Doi Y. 2016. Fosfomycin: Resurgence of an old companion. J Infect Chemother 22:273-80; Kahan FM, Kahan JS, Cassidy PJ, Kropp H. 1974. The mechanism of action of fosfomycin (phosphonomycin). Ann N Y Acad Sci 235:364-86; Park JY, Kim JW, Moon BY, Lee J, Fortin YJ, Austin FW, Yang SJ, Seo KS. 2015. Characterization of a novel two-component regulatory system, HptRS, the regulator for the hexose phosphate transport system in Staphylococcus aureus. Infect Immun 83:1620-8; and Sit B, Crowley SM, Bhullar K, Lai CC, Tang C, Hooda Y, Calmettes C, Khambati H, Ma C, Brumell JH, Schryvers AB, Vallance BA, Moraes TF. 2015. Active Transport of Phosphorylated Carbohydrates Promotes Intestinal Colonization and Transmission of a Bacterial Pathogen. PLoS Pathog 11:e1005107] 참조.
포스포마이신은 간에서 대사되지 않고 주로 사구체 여과에 의해 소변에서 변화하지 않고 배출된다. 문헌[Segre G, Bianchi E, Cataldi A, Zannini G. 1987. Pharmacokinetic profile of fosfomycin trometamol (Monuril). Eur Urol 13 Suppl 1:56-63] 참조. 따라서 합병증이 없는 요로 감염(UTI)을 치료하기 위한 경구 투여용으로 FDA의 승인을 받았다. 포스포마이신은 독성이 낮고 혈청, 신장, 방광벽, 폐, 염증 조직, 뼈, 뇌척수액, 농양액 및 심장 판막에 잘 분포된다. 문헌[Schintler MV, Traunmuller F, Metzler J, Kreuzwirt G, Spendel S, Mauric O, Popovic M, Scharnagl E, Joukhadar C. 2009. High fosfomycin concentrations in bone and peripheral soft tissue in diabetic patients presenting with bacterial foot infection. J Antimicrob Chemother 64:574-8] 참조. 포스포마이신은 조기 펩티도글리칸 전구체의 합성을 촉매하는 MurA 효소를 차단하여 펩티도글리칸 합성의 첫 번째 단계를 억제한다 (6). 이 고유한 작용 메커니즘은 베타-락탐, 아미노글리코시드 및 플루오로퀴놀론과 같은 다른 항생제와 함께 ESAPKE 병원체에 대한 포스포마이신의 시너지 효과를 부여한다. 문헌[astry S, Doi Y. 2016. Fosfomycin: Resurgence of an old companion. J Infect Chemother 22:273-80] 참조. 11. 문헌[Falagas ME, Kastoris AC, Karageorgopoulos DE, Rafailidis PI. 2009. Fosfomycin for the treatment of infections caused by multidrug-resistant non-fermenting Gram-negative bacilli: a systematic review of microbiological, animal and clinical studies. Int J Antimicrob Agents 34:111-20; Walsh CC, Landersdorfer CB, McIntosh MP, Peleg AY, Hirsch EB, Kirkpatrick CM, Bergen PJ. 2016. Clinically relevant concentrations of fosfomycin combined with polymyxin B, tobramycin or ciprofloxacin enhance bacterial killing of Pseudomonas aeruginosa, but do not suppress the emergence of fosfomycin resistance. J Antimicrob Chemother 71:2218-29; and Ferrara A, Dos Santos C, Cimbro M, Gialdroni Grassi G. 1997. Effect of different combinations of sparfloxacin, oxacillin, and fosfomycin against methicillin-resistant staphylococci. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 16:535-7] 참조.
이러한 특성으로 인해 포스포마이신은 MDR ESAPKE 병원체에 대한 중요한 치료 옵션이 된다. 따라서 MDR 병원체(Ref-KSS)에 의해 유발되는 다른 적응증을 치료하기 위해 포스포마이신의 확장된 사용을 탐색하는 데 관심이 증가하고 있다. 그러나, 포스포마이신의 경구 투여는 30-37%의 낮은 경구 생체이용률을 보였고 방광보다 다른 조직으로의 분포가 더 낮았다. 또한, 포스포마이신의 최소 억제 농도(MIC) 중단점은 다른 항생제보다 상대적으로 높고(엔테로박테리아세아에의 경우 8-32 mg/리터), 포스포마이신 변형 효소(FosA, FosB 및 FosX)를 생성하는 포스포마이신 내성 균주는 선별될 수 있고 빠르게 확산될 수 있다.
3FG6P 및 4FG6P가 포스포마이신의 효능을 증강시킬 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, fosA 유전자 및 S. 아우레우스 COL 균주를 보유하는 임상 포스포마이신 내성 UTI E. 콜라이 단리물을 수득하였다. 이들 박테리아의 밤새 배양은 0.5의 McFarland 탁도로 희석된 뇌 심장 주입 (BHI) 액체배지에서 성장시키고 다양한 농도의 포스포마이신 단독 또는 E. 콜라이에 대한 3FG6P 또는 S. 아우레우스에 대한 4FG6P가 보충된 포스포마이신(50 μM)가 보충된 신선한 BHI 액체배지에 접종하였다.
도 13a 내지 도 13d에 나타낸 바와 같이, 포스포마이신 내성 E. 콜라이 및 S. 아우레우스 둘 다는 최대 128 μg/ml의 포스포마이신이 보충된 BHI에서 성장을 허용하였다. 대조적으로, 50 μM의 3FG6P 또는 4FG6P가 보충된 BHI에서 두 박테리아의 성장은 낮은 농도의 포스포마이신에서 상당히 억제되었다. 특히, 50 μM의 3FG6P에서는, 2 μg/ml의 포스포마이신에서도 E. 콜라이의 성장이 완전히 억제되었다. 유사하게, 포스포마이신 내성 S. 아우레우스의 성장은 32 μg/ml의 포스포마이신에서 완전히 억제되었고 낮은 농도에서 상당히 지연되었다.
이러한 결과는 3-성분 조절 시스템을 활성화함으로써 UhpT 발현의 유도가 포스포마이신 변형 효소에 의한 내성 메커니즘을 역전시키기에 충분한 수준으로 포스포마이신 효능을 상당히 향상시켰다는 것을 명확하게 입증하였다.
실시예 7: 3FG6P와 공동 투여된 포스포마이신 및 포스포마이신의 생체 내 항균 활성
포스포마이신 및 4FG6P와 공동 투여된 포스포마이신의 생체내 항균 활성을 테스트하기 위해, 감염 진행의 실시간 모니터링을 위해 pLuxABCDE 플라스미드를 사용하여 생물발광 광 신호를 구성적으로 발현하는 S. 아우레우스 COL 균주를 생성하였다. 6주령에서 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 Harlan 실험실에서 구입하여 Mississippi State University의 동물실험윤리위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수용하고 유지하였다.
동물(n=3/그룹)을 PBS(2Х109 CFU/ml)에 현탁시킨 50 μL의 생물발광 S. 아우레우스 균주로 복강내로 감염시켰다. 감염 후 2시간 및 24시간에 포스포마이신 (3 mg/kg) 단독 또는 4FG6P와 공동 투여된 포스포마이신 (50μg/kg) 또는 PBS 대조군의 복강내 주사로 동물을 처리하였다. IVIS Lumina XR 작은 동물 이미징 시스템을 사용하여 생물발광 광 신호를 측정하여 감염 진행을 모니터링하였다.
감염 48시간 후, 동물을 인도적으로 안락사시키고 폐, 신장, 간, 비장 및 복막 세척의 박테리아 부담을 측정하였다. PBS 또는 포스포마이신 단독으로 처리된 동물은 각각 5.34±0.154 내지 6.47±0.115 CFU/g 범위의 평균 박테리아 수를 보여주었다. 대조적으로, 4FG6P와 공동 투여된 포스포마이신의 치료는 복막 세척, 폐 및 신장에서 감염을 완전히 제거하고 간 및 비장에서 4 로그 스케일 초과로 박테리아 부하를 상당히 감소시켰다(도 14).

Claims (20)

  1. 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염에 접합된 약물을 포함하는 접합 약물.
  2. 제1항에 있어서, 약물은 항균제인, 접합 약물.
  3. 제2항에 있어서, 약물은 하기로부터 선택되는, 접합 약물: 리네졸리드, 포스포마이신, 스트렙토조토신, 플록수리딘, 하기 화학식의 니트로푸라닐아미드:

    (여기서 R1=H, R2=H, R3=H 및 R4=H); 하기 화학식의 퀴나졸린디아민:

    (여기서 R1=2-(테트라하이드로푸릴), R2=OCH3 및 R3=H); 하기 화학식의 니트로푸아닐에테닐:

    (여기서 R1=벤즈이미다졸-2-일 및 R2=CN); 하기 화학식의 벤질페닐에틸아민:
    및
    (여기서 R1=OCH3, R2=OCH3 및 R3=F, R4=H); 및 하기 화학식의 살리실아닐라이드:

    (여기서 R1-R3=Br, R4=H 및 R5-R7=Cl).
  4. 제2항에 있어서, 약물은 리네졸리드 및 포스포마이신으로부터 선택되는, 접합 약물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 3-데옥시-3,3-디플루오로글루코스, 2-데옥시-2-플루오로글루코스, 화학식 (B2)의 2-데옥시-2-플루오로글루코스의 2,2-이불소화 유도체:

    2,3-디데옥시-2,3-디플루오로글루코스, 화학식 (C2)의 2,3-디데옥시-2,2,3,3-테트라불소화 유사체:

    화학식 (D1)의 1DG6P:

    화학식 (D2)의 상응하는 3-불소화 유사체:
    및
    4-데옥시-4-플루오로글루코스, 및 화학식 (F1) 및 F2)의 인산염 유사체로부터 선택되고:

    여기서 F/OH는 치환기가 -F 또는 -OH일 수 있음을 나타내며, 단 이들 화학식의 각각의 화합물은 -F인 치환기를 적어도 하나 가져야 하는, 접합 약물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트인, 접합 약물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염은 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트인, 접합 약물.
  8. 약물의 비접합 형태의 흡수와 비교하여 약물의 UhpT 흡수를 향상시키는 방법으로서, HptARS 조절 시스템을 구성적으로 활성화시키고 육탄당 인산염 수송체 (UhpT)의 발현을 유도하는 비-대사성 육탄당 인산염을 약물에 접합시키는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 비접합 형태의 약물의 흡수와 비교하여 접합된 약물의 UhpT 흡수를 향상시키기 위해 비-대사성 육탄당 인산염을 약물에 접합시키는 방법으로서, 약물을 비-대사성 육탄당 인산염과 반응시키는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약물은 항생제인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항생제는 리네졸리드 및 포스포마이신으로부터 선택되는, 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 비-대사성 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-페닐화 포스페이트인, 방법.
  13. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 비-대사성 육탄당 인산염은 4-플루오로-글루코스-6-페닐화 포스페이트인, 방법.
  14. 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트 모이어티를 리네졸리드 모이어티와 접합시키는 방법으로서, 하기를 포함하는, 방법:
    화학식 (11)의 (S)-N-[[3-[3-플루오로-4-(N-1-피페라지닐)페닐]-2-옥소-5-옥사졸리디닐]메틸]아세트아미드:

    을 γ-부티로락톤과 반응시켜 화학식 (14)의 아미드를 제공하는 단계:
    및
    화학식 (14)의 아미드를 화학식 (13)의 3-플루오로-글루코스-6-페닐화 포스페이트:

    과, 산-촉매 글리코실화 반응으로 커플링하여 화학식 (15)의 생성물을 생성하는 단계:
    , 및
    화학식 (15)의 생성물의 탈보호하여 화학식 (16)의 접합 생성물을 제공하는 단계:
  15. 박테리아 감염을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 접합된 항생제를 포함하는 조성물을 상기 박테리아가 감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 박테리아 감염의 치료를 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 접합 항생제의 용도.
  17. 박테리아 감염을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 비-대사성 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염과 함께 하나 이상의 항생제를 공동 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 3-데옥시-3,3-디플루오로글루코스, 2-데옥시-2-플루오로글루코스, 화학식 (B2)의 2-데옥시-2-플루오로글루코스의 2,2-이불소화 유도체:

    2,3-디데옥시-2,3-디플루오로글루코스, 화학식 (C2)의 2,3-디데옥시-2,2,3,3-테트라불소화 유사체:

    화학식 (D1)의 1DG6P:

    화학식 (D2)의 상응하는 3-불소화 유사체:
    및
    4-데옥시-4-플루오로글루코스, 및 화학식 (F1) 및 F2)의 인산염 유사체로부터 선택되고:

    여기서 F/OH는 치환기가 -F 또는 -OH일 수 있음을 나타내며, 단 이들 화학식의 각각의 화합물은 -F인 치환기를 적어도 하나 가져야 하는, 방법.
  19. 박테리아 감염 치료를 위한, 항생제와 조합한 비-대사성 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염의 용도.
  20. 제19항에 있어서, 육탄당 인산염 또는 불소화 육탄당 인산염은 3-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 4-플루오로-글루코스-6-포스페이트, 3-데옥시-3,3-디플루오로글루코스, 2-데옥시-2-플루오로글루코스, 화학식 (B2)의 2-데옥시-2-플루오로글루코스의 2,2-이불소화 유도체:

    2,3-디데옥시-2,3-디플루오로글루코스, 화학식 (C2)의 2,3-디데옥시-2,2,3,3-테트라불소화 유사체:

    화학식 (D1)의 1DG6P:

    화학식 (D2)의 상응하는 3-불소화 유사체:
    및
    4-데옥시-4-플루오로글루코스, 및 화학식 (F1) 및 F2)의 인산염 유사체로부터 선택되고:

    여기서 F/OH는 치환기가 -F 또는 -OH일 수 있음을 나타내며, 단 이들 화학식의 각각의 화합물은 -F인 치환기를 적어도 하나 가져야 하는, 용도.
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