KR20230109549A - 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생체 친화적 고분자 및 생체 조직 염색용 색소를 포함하는 미립구 입자; 및 상기 미립구 입자의 표면에 코팅된 표면개질제;를 포함하고, 표지 부위 수술 중 목적 병변에 직접적으로 투여되어 실시간으로 목적 병변의 크기 및 위치를 확인하기 위한, 목적 병변 표지용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물은 목적 병변에 주사되면 수 개월까지 지속적으로 머물며 표지 병변의 위치, 크기 등을 수술 중에 실시간으로 검출할 수 있어, 목적 병변의 외과적 수술의 성공률을 향상시킬 뿐만 아니라, 정상조직의 과다한 손실을 방지할 수 있으므로, 효과적인 수술 표지자로서 널리 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 생체 친화적 고분자에 생체조직 염색용 색소와 생체단백질을 포함시킨 목적 병변 표지용 조성물, 상기 목적 병변 표지용 조성물을 이용하여 병변의 부위에 표지한 정보를 영상화하는 방법 및 체내 안정성과 영상 능력을 향상시키기 위하여 상기 목적 병변 표지용 조성물과 생체 고분자를 혼합한 목적 병변 수술용 표지제에 관한 것이다.
항암치료의 경우, 다양한 항암제를 이용하는 방법이 개발되고 있으나, 아직까지는 외과수술적인 방법을 통해 암세포를 제거하는 방법이 가장 많이 사용되고 있다. 그러나, 외과수술적인 방법을 사용할 경우, 수술 후 환자의 건강 및 복지를 위하여 수술 중에 수술범위를 최소화하는 기술이 필수적이다. 특히 유방암의 경우, 유방이 작은 국내여성의 수술 시 절제하는 병변이 다른 나라에 비해 적어야 유방보존적 치료법의 목표를 달성할 수 있다. 수술범위는 병변과 병변 주위의 가장자리 여분 부위로 결정된다. 집도의가 병변 부위와 범위를 정확히 알지 못하면 병변 주위의 가장자리 여분을 크게 두지 않을 수 없다. 왜냐하면 무작정 수술범위를 줄이다가는 종양이 절제면에 남을 수도 있기 때문이다. 그런데, 실제 임상수술에서는 수술집도의가 수술 중에 병변을 정확하게 실시간으로 확인하기 위한 방법이 많지 않다. 매우 정밀한 진단방법이 개발되었음에도 이러한 진단방법은 수술 중에는 사용하지 못해 실제 수술 중에는 주로 수술자의 촉감이나 시각에 의존하게 되는데 이 경우 병변이 뚜렷하게 구별되는 경우는 드물다. 특히 병변이 작은 경우는 더욱 구별되지 않는다. 미세침습수술 및 수술의 목적을 달성하기 위하여, 수술자에게 병변을 수술 중에 알려주는 기술이 필요하다.
종래의 종양제거 수술, 특히 유방암 수술 시에는 환자의 미세병변의 위치를 수술 전에 초음파, 맘모그라피, 혹은 자기공명영상으로 확인하고, 확인된 병변의 위치를 표시한 다음, 표시된 부위의 조직을 제거하게 되는데, 확인된 병변의 위치를 표시하는 방법으로는 피부표면에 그림을 그리는 방법, 와이어를 이용하는 방법, 차콜(charcoal)과 같은 검은 색소를 주사하는 방법 등이 사용되고 있다. 그러나, 병변 위치를 표시하기 위하여 피부 위에 펜을 이용하여 그림으로 그리는 방법은, 매우 유연한 유방조직의 특성상, 진단할 때와 수술장에서 유방의 모양이 많이 변화한다는 점, 유방심부의 병변인 경우에는 피부표면에 표시한 것만으로는 불충분하다는 점 등 때문에, 가장 용이하게 사용할 수 있지만 정확도가 가장 낮다는 단점이 있다. 다음으로, 와이어를 이용하여 유방병변에 찌르는 방법은, 본래 와이어를 피부표면으로 수직으로 삽입시켜야 하지만, 초음파 탐침에 영향을 줄 수 있기에 부득이하게 사선으로 삽입시켜야 한다는 점, 와이어의 위치가 유방의 움직임에 따라 이동할 수 있다는 점 등 때문에 예상보다 낮은 정확도를 나타내고, 삽입된 와이어는 수술에 방해가 되며, 와이어의 삽입부위를 추가로 절제하는 시술이 수행되어야 한다는 단점이 있다. 끝으로 차콜과 같은 색소를 주사하는 방법은, 주사된 색소가 병변에 결합하여 병변의 위치를 정확히 표지할 수 있다는 장점이 있는 반면, 유방심부의 병변인 경우 외부에서는 흑색의 색소를 확인할 수 없고, 색소에 의하여 수술부위가 오염될 수도 있다는 단점이 있다. 상기 열거한 단점은 유방암 이외의 암조직을 제거하기 위한 외과적 수술 시에도 공통적으로 적용될 수 있다.
이처럼 현재까지 개발된 기술로는 외과적으로 암병변을 제거하기 위한 수술범위를 정밀하게 결정하기 어렵기 때문에 아직까지는 외과적으로 암병변을 제거할 경우에는 절제범위가 필요이상으로 확대될 수 밖에 없고, 수술 후에도 병변이 정상적으로 제거되었는지를 확인하기 위한 검사가 수반되어야만 한다.
이러한 배경 하에서 본 발명자들은 암병변을 외과적으로 제거할 때 대응집 알부민에 생체조직 염색용 색소가 결합된 형태의 복합체를 표지자로 사용하는 표지자 (KR-10-2012-0153793)는 암의 병변에 효과적으로 흡착되어 병변의 위치를 정확히 표지할 수 있고, 수술중에 상기 색소를 실시간으로 추적하여 제거하고자 하는 병변의 범위를 정확하게 확인할 수 있음을 확인하였다.
일반적인 색소 등은 색소나 형광색소가 주사부위 오래 머물지 못하고 수 시간 이내에 주변으로 번지고 결국 체내로 배설되어서 병변을 표지하는 능력을 상실한다. 기존 발명(KR-10-2012-0153793)의 경우 기존의 일반적신 (형광)색소에 비해서는 오래 주사부위에 머무르지만 수일을 넘기기 어렵다. 특히 주사부위가 위장과 같은 계속 움직이거나 혈류가 많은 조직이거나 상대적으로 조직이 단단하지 않고 느슨한 곳에 주사되는 경우 특히 그러하다. 즉, 종래 표지자는 색소가 주사 부위에 오래 머물지 못하고 수시간 이내에 주변으로 확산됨에 따라, 병변을 표지하는 능력이 단기간에 상실된다는 문제가 존재하였다.
암환자 중에 병변이 커서 바로 수술을 할 수 없는 경우 등에 먼저 항암치료를 하고 이어서 암을 절제하는 수술을 진행하는 선행항암치료가 늘어나고 있다. 이때 수개월이 걸리는 항암치료 전에 미리 병변을 표시하고 이 부위를 항암치료 후 절제하게 된다. 이 때 항암치료에 종양이 잘 치료되어 미세한 크기로 줄어들 경우 수술 중에 암 부위를 잘 찾지 못하는 경우가 많다. 금속성 클립을 항암치료 중에 넣어 두는 방법으로 암 부위를 확인하지만 실제 수술에서 금속성 클립을 찾기가 용이하지 않고, 오랜 항암치료기간 중에 움직이는 경우가 드물지 않아 개선책이 필요하다. 형광색소등이 주사된 부위에서 수개월 머무를 수 있고 형광이나 색깔이 수개월 후에도 확인할 수 있다면 매우 유용하다.
(형광)색소가 주사부위에 오래 머무르기 위해서는 주변으로 퍼지지 않도록 적절한 크기의 입자이거나 그러한 입자에 결합하여야 하고(직경: 수 ~ 수백 마이크로미터), 색소가 오랜 기간 안정적이도록 생체반응으로 분해되거나 변성되어 색깔이나 형광을 잃어버리지 않아야 한다.
일반적인 마이크로미터 크기의 입자의 미립구는 다양한 재료로 개발되어 있다. (형광)색소를 담지할 수 있는 미립구로는 다양한 다공성 미립구가 개발되어 있으나 이는 주로 담지된 물질, 여기서는 (형광)색소를 천천히 통제된 속도로 배출하기 위한 용도이다. 주로 약물을 배출하지 않는 것이 아니라 적절히 배출하는 목적이라 요구되는 목적과 전혀 다르다. 즉 (형광)색소가 미립구에서 생체 내로 배출되지 않는 형태이어야 하고, 미립구는 생체에 사용 가능한 재료로 만들어져야 한다.
이러한 배경하에, 가장 쉽게 고안할 수 있는 방법은 생체친화적 고분자에 (형광)색소를 섞어 미립구를 만드는 방식이나, 일반적으로 단량체에서 합성하는 중합과정에서 열과 라디칼이 발생하고 (형광)색소를 변성시켜 색깔이나 형광이 없어져서 목적을 이룰 수가 없다.
본 발명은 생체적합한 고분자를 용매에 녹이고 이중 이멀션 방법을 활용하여 (형광)색소를 완전히 포매하여 봉입하는 방법을 고안하였고, 적절한 제작된 생체적합 고분자 미립구에 봉입된 색소는 흘러나오지 않아서 앞서의 단점을 해소할 수 있다.
또한 봉입되는 (형광)색소가 고분자 미립구내에서 오랜 기간 안정화될 수 있도록 하는 방법을 고안하였는 데, 색소 단독보다는 단백질과 결합 시킨다면 더욱 오래 색깔이나 형광을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
또한 표면을 히알루론산으로 개질하면 주사된 후 주변조직에 섬유아세포를 활성화 시켜 콜라겐 조직이 생성되어 잘 고착될 수 있다. 하지만 히알루론산은 유기용매에 녹지 않아, 고분자 미립구에 히알루론산를 일반적인 방법으로는 코팅하기가 어렵다. 미립구를 제조하는 과정의 수용성 용매에 히알루론산이나 콜라겐을 용해시키는 방법을 고안하여 생체적합성 고분자 미립구를 만드는 과정에서 히알루론산이나 콜라겐으로 코팅할 수 있는 제조법을 개발하였다.
본 발명은 상술된 문제점을 해결하기 위하여 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 색소 혹은 형광색소, 생체단백질을 포함하는 생체 친화적 고분자 합성물질을 포함하는 체내 병변 표지용 조성물을 제공하는 것이다.
구체적으로 본 발명의 목적은, (a) 체내 병변을 색깔이나 형광색소로 주사부위에서 수개월 이상 머물러 있는 방법을 제공하는 것, (b) 이러한 상기 체내 병변 표지용 합성물을 제조하는 방법과 주사물의 조성 (c) 이를 이용하여 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 수단으로, 본 발명은 생체 친화적 고분자 및 생체 조직 염색용 색소를 포함하는 미립구 입자; 및 상기 미립구 입자의 표면에 코팅된 표면개질제;를 포함하고, 표지 부위 수술 중 목적 병변에 직접적으로 투여되어 실시간으로 목적 병변의 크기 및 위치를 확인하기 위한, 목적 병변 표지용 조성물을 제공한다.
여기서 상기 생체 친화적 고분자는 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), PMMA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체(polylactic acid-polyglycolic acid copolymer, PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(poly-ε-caprolactone, PCL), 락트산-ε-카프로락톤 공중합체(lactic acid-ε-caprolactone copolymer, PLCL), 폴리다이옥산온(polydioxanone, PDO), 폴리트라이메틸렌카보네이트(polytrimethylene carbonate, PTMC), 폴리아미노산(polyamino acid), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리포스파진(polyphosphazene), 폴리이미노카보네이트(polyiminocarbonate), 폴리포스포에스테르(polyphosphoester), 폴리하이드록시발레이트(polyhydroxyvalate), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다.
여기서 상기 생체 조직 염색용 색소는 육안으로 확인 가능한 색소 또는 형광 색소일 수 있다.
여기서 상기 육안으로 확인 가능한 색소는 중성적, 나일청, 비스마르크브라운, 리튬카민, 트리판블루, 야누스그린, 메틸 바이올렛, 오-라민, 마라가이트 그린, 사프라닌, 에오신, 콩고레드, 에리스로신, 니그로신, 알시안블루 헤마톡실린, 아닐린블루, 라이트그린 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
여기서 상기 형광 색소는 근적외선 형광 색소일 수 있다.
여기서 상기 형광 색소는 인도시아닌그린(indocyanine green, ICG)일 수 있다.
여기서 상기 형광 색소는 단독으로 또는 생체 단백질과 컨쥬게이션(conjugation)되는 것을 특징으로 할 수 있다.
여기서 상기 표면개질제는 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen) 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다.
여기서 상기 미립구 입자는 생체 단백질을 더 포함할 수 있다.
여기서 상기 생체 단백질은 알부민(albumin)일 수 있다.
여기서 상기 미립구 입자는 직경이 10 내지 100 ㎛일 수 있다.
여기서 상기 조성물은 평균 밀도가 1 내지 3 g/mL일 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 목적을 달성하기 위한 수단으로, 생체 친화적 고분자가 첨가된 유기 용매와 생체 조직 염색용 색소가 첨가된 증류수를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합한 용액을 표면개질제가 첨가된 수용성 용매에 투입 후 교반하여 상기 미립구 입자를 형성하는 단계;를 포함하고, 상기 미립구 입자 표면에는 상기 표면개질제가 코팅되는 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
여기서 상기 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법은 상기 교반 용액을 세척하고 필터링하여 특정한 크기의 미립구 입자를 선택하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
여기서 상기 증류수는 생체 조직 염색용 색소-생체 단백질 결합체가 더 첨가된 것일 수 있다.
여기서 상기 유기 용매는 디클로로메테인(Dichloromethane, DCM), 오쏘크실렌(o-xylene), 메타크실렌(m-xylene), 파라크실렌(p-xylene) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
여기서 상기 생체 조직 염색용 색소의 농도는 1 내지 100 μM일 수 있다.
여기서 상기 수용성 용매는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidonem, PVP), 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA), 폴리아크릴아미드(polyacryl amide, PAAm), 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트(polyhydroxyethyl methacrylate, PHEMA), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
여기서 상기 수용성 용매의 농도는 0.1 내지 10 % w/w이고, 상기 표면개질제의 농도는 0.01 내지 0.3 % w/v일 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 목적을 달성하기 위한 수단으로, 제1항의 목적 병변 표지용 조성물; 및 평균 분자량이 0.5 내지 3.0 MDa인 히알루론산(Hyaluronic acid; HA) 를 포함하는, 목적 병변 표지용 주사제 조성물을 제공한다.
여기서 상기 주사제 조성물 100 중량%에 대하여, 히알루론산(hyaluronic acid; HA)은 0.3 내지 1 중량%로 포함될 수 있다.
여기서 상기 히알루론산(Hyaluronic acid; HA)는 상온에서 24 내지 1500 cps의 점도를 가지는 것일 수 있다.
여기서 상기 주사제 조성물이 주사된 목적 병변은 4 내지 12 개월 동안 표지가 유지될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 목적 병변 표지용 조성물을 목적 병변에 직접적으로 투여하는 단계; 및 상기 목적 병변 표지용 조성물이 투여된 조직으로부터 색이 변화되는 위치를 목적 병변으로 인지하여, 표지 부위 수술 중에 실시간으로 확인하는 단계;를 포함하는, 목적 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적 병변 표지용 조성물은 목적 병변에 주사되면 수 개월까지 지속적으로 머물며 표지 병변의 위치, 크기 등을 수술 중에 실시간으로 검출할 수 있어, 목적 병변의 외과적 수술의 성공률을 향상시킬 뿐만 아니라, 정상조직의 과다한 손실을 방지할 수 있으므로, 효과적인 수술 표지자로서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법을 구체적으로 나타낸 모식도이다.
도 3 (a)는 ICG와 HSA를 포함한 PMMA의 실제사진과 형광카메라로 찍은 사진이다.
도 3 (b)는 ICG와 HSA 포함유무에 따른 PMMA를 형광현미경으로 찍은 사진이다.
도 4는 증류수에 대한 본 발명의 미립구 입자 농도에 따른 밀도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 ICG와 알부민의 농도 변화에 따른 미립구의 근적외선형광 신호세기 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 주사제 조성물에 있어서, 히알루론산 농도에 따른 미립구 입자의 분산 정도를 나타내는 사진이다.
도 7은 in vitro 조건에서 ICG, ICG-HSA, ICG-HSA-PMMA 입자의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기의 변화 비교를 IVIS(Perkin Elmer, Hopkinton, MA)로 측정하여 나타내는 그래프이다.
도 8a는 ICG-HSA-PMMA 입자를 각각 HSA, 증류수에 넣고 시간의 경과에 따른 입자의 안정성 비교를 나타내는 사진이다.
도 8b는 ICG-HSA-PMMA 입자를 Agarose gel에 넣고 시간의 경과에 따른 입자의 안정성을 나타내는 사진이다.
도 9는 in vivo 조건에서 ICR 마우스에 주사된 ICG-HSA-PMMA 입자가 히알루론산 또는 증류수와 함께 주사되었을 때의 시간 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 변화를 IVIS로 측정 비교한 결과이다.
도 10은 in vivo 조건에서 ICR 마우스에 주사된 ICG-HSA-PMMA 입자가 히알루론산 또는 증류수와 함께 주사되었을 때의 시간 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 변화를 형광카메라로 촬영하여 Image J 프로그램으로 분석한 그래프와 mouse를 형광카메라로 찍은 결과이다.
도 2는 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법을 구체적으로 나타낸 모식도이다.
도 3 (a)는 ICG와 HSA를 포함한 PMMA의 실제사진과 형광카메라로 찍은 사진이다.
도 3 (b)는 ICG와 HSA 포함유무에 따른 PMMA를 형광현미경으로 찍은 사진이다.
도 4는 증류수에 대한 본 발명의 미립구 입자 농도에 따른 밀도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 ICG와 알부민의 농도 변화에 따른 미립구의 근적외선형광 신호세기 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 주사제 조성물에 있어서, 히알루론산 농도에 따른 미립구 입자의 분산 정도를 나타내는 사진이다.
도 7은 in vitro 조건에서 ICG, ICG-HSA, ICG-HSA-PMMA 입자의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기의 변화 비교를 IVIS(Perkin Elmer, Hopkinton, MA)로 측정하여 나타내는 그래프이다.
도 8a는 ICG-HSA-PMMA 입자를 각각 HSA, 증류수에 넣고 시간의 경과에 따른 입자의 안정성 비교를 나타내는 사진이다.
도 8b는 ICG-HSA-PMMA 입자를 Agarose gel에 넣고 시간의 경과에 따른 입자의 안정성을 나타내는 사진이다.
도 9는 in vivo 조건에서 ICR 마우스에 주사된 ICG-HSA-PMMA 입자가 히알루론산 또는 증류수와 함께 주사되었을 때의 시간 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 변화를 IVIS로 측정 비교한 결과이다.
도 10은 in vivo 조건에서 ICR 마우스에 주사된 ICG-HSA-PMMA 입자가 히알루론산 또는 증류수와 함께 주사되었을 때의 시간 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 변화를 형광카메라로 촬영하여 Image J 프로그램으로 분석한 그래프와 mouse를 형광카메라로 찍은 결과이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 발명의 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 요지를 통하여 다양한 응용을 할 수 있으므로, 본 발명의 권리범위는 이하의 실시예로 한정되지 않는다. 본 발명의 권리범위는 특허청구범위에 기재된 사항을 기초로 하여 본 발명의 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자가 종래 기술을 이용하여 용이하게 치환 또는 변경하는 것이 자명한 부분에까지 미친다.
이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
<생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물>
상술한 목적을 달성하기 위한 수단으로, 본 발명은 생체 친화적 고분자 및 생체 조직 염색용 색소를 포함하는 미립구 입자; 및 상기 미립구 입자의 표면에 코팅된 표면개질제;를 포함하고, 표지 부위 수술 중 목적 병변에 직접적으로 투여되어 실시간으로 목적 병변의 크기 및 위치를 확인하기 위한, 목적 병변 표지용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 의해 표지되는 조직은 상기 조성물이 침투되어 고정될 수 있는 고형암 등 고형조직이 바람직하고, 보다 바람직하게는 전립선암, 유방암, 자궁암, 피부암, 자궁경부암, 폐암, 뇌종양, 위장관 종양, 간암, 연조직육종, 림프종 등이 될 수 있으나, 상기 합성물질이 침투되어 고정될 수 있는 조직을 내포하는 암이나 기타 양성 병변이라면 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "생체친화적 고분자"란, 체내에서 독성이 없거나 적어, 의료용으로 사용할 수 있는 고분자로서, 일례로 "폴리메틸메타크릴레이트 (Poly(methyl methacrylate), PMMA)"가 있다. 본 발명의 생체 친화적 고분자는 체내 병변 조직에 주입하여 표지한 후, 그 병변에 오랫동안 머물며 병변 조직의 크기 및 위치를 확인하는데 사용될 수 있다.
여기서 상기 생체 친화적 고분자는 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), PMMA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체(polylactic acid-polyglycolic acid copolymer, PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(poly-ε-caprolactone, PCL), 락트산-ε-카프로락톤 공중합체(lactic acid-ε-caprolactone copolymer, PLCL), 폴리다이옥산온(polydioxanone, PDO), 폴리트라이메틸렌카보네이트(polytrimethylene carbonate, PTMC), 폴리아미노산(polyamino acid), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리포스파진(polyphosphazene), 폴리이미노카보네이트(polyiminocarbonate), 폴리포스포에스테르(polyphosphoester), 폴리하이드록시발레이트(polyhydroxyvalate), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 생체 친화적 고분자는 본 발명에서 색소 혹은 형광색소를 포매(embedding)하므로 투명하여 빛이 잘 투과하는 성격을 가지는 특성을 가질 수 있다.
본 발명의 용어 "생체 조직 염색용 색소"란, 생체 조직에 결합하여 결합된 위치를 표지함으로써, 표지된 위치를 육안으로 또는 검출용 도구를 사용하여 확인할 수 있게 하는 물질을 의미한다. 여기서 상기 생체 조직 염색용 색소는 육안으로 확인 가능한 색소 또는 형광색소일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 생체조직 염색용 색소는 생체단백질과 결합된 형태로 생체 친화적 고분자 속에 포함되어 병변 부위를 표지하는 용도로 사용될 수 있는데, 바람직하게는 육안으로 확인 가능한 색소, 결합부위에서 형광을 발생시켜서 형광 카메라 등의 장비를 사용하여 검출할 수 있는 형광색소 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "육안으로 확인 가능한 색소"란, 생체조직에 결합한 표지물질이 가시광선 영역의 색을 나타내어 표지된 부위를 육안으로 확인할 수 있도록 하는 색소의 일종을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 육안으로 확인 가능한 색소는 체내 병변 부위에 주사하여 수술장에서 그 병변을 명확히 육안으로 확인할 수 있도록 하여, 수술의 성공률을 향상시키는 역할을 수행할 수 있다. 상기 육안으로 확인 가능한 색소는 바람직하게는 중성적, 나일청, 비스마르크브라운, 리튬카민, 트리판블루, 야누스그린, 메틸 바이올렛, 오-라민, 마라가이트 그린, 사프라닌, 에오신, 콩고레드, 에리스로신, 니그로신, 알시안블루 헤마톡실린, 아닐린블루, 라이트그린 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 목적 병변 조직을 확인할 수 있게 하는 한, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "형광색소"란, 일정 파장의 빛을 흡수하여 여기상태를 형성한 후, 빛의 침투거리가 최대가 되고, 수분에 의한 오류신호를 최소화할 수 있는 형광을 발생하는 유기화합물을 의미하는데, 바람직하게는 700nm 내지 3000nm, 보다 바람직하게는 750nm 내지 900nm의 근적외선 파장의 형광을 발생하는 유기 화합물인 근적외선 형광색소가 될 수 있다. 상기 근적외선 형광색소로부터 발생하는 근적외선 파장의 형광은 형광 카메라, 형광 센싱 프로브(PCT/KR2011/009271), 수술용 형광카메라 등의 장비를 이용하여 사진형태로 촬영하거나 실시간 모니터링할 수 있다. 본 발명의 근적외선 파장의 형광은 생체 내에서의 흡수가 다른 파장대에 비해 상대적으로 적어 비교적 생체내의 깊은 부위에서 발생하는 근적외선도 생체외부에서 검출이 가능하다. 본 발명의 목적상 상기 근적외선 영역 형광색소는 체내 병변 부위에 주사하여 수술장에서 그 병변을 형광영상장비를 이용하여 정확하게 확인할 수 있도록 하여, 수술의 성공률을 향상시키는 역할을 수행할 수 있다. 특히, 상기 육안으로 확인 가능한 색소와는 달리, 절개하여 직접적인 병변을 확인하기 전에 체외에서도 병변의 위치를 검출할 수 있으므로, 신속하고 정확한 수술의 수행을 도모할 수 있게 한다. 상기 근적외선 형광색소로는 바람직하게는 인도시아닌그린(indocyanine green, ICG) 등을 사용할 수 있으며, 인체에 사용 가능한 근적외선 형광색소인 한, 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
상기 근적외선 형광색소가 생체 친화적 고분자에 결합된 복합체는 목적 병변을 표지하는 것으로, 다른 물질에 근적외선 형광색소가 결합된 복합체에 비하여 검출되는 형광신호의 안정성 및 정확성이 우수하다는 장점을 나타내므로, 미세병변을 발견할 수 있는 비율이 높고, 병변 절제 정확도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "인도시아닌그린(indocyanine green, ICG)"이란, 생물학 또는 의학분야에서 널리 사용되는 근적외선 영역의 형광 영상용 염료를 의미하는데, 인체에 주입된 후 한 시간 정도 지나면 분해되어 없어지거나 대소변으로 배출되는 특성이 있어 인체에 사용 가능한 형광염료로 임상적 적용에 유리하다. 실제로, 인도시아닌그린을 이용하여 인체에 적용한 사례는 여러 논문에 보고된 바 있고, 일례로 유방암환자 18명에서 안전하게 임상적으로 사용하였음이 보고되었다(T. Kitai, et al., Breast Cancer, 12:211-215, 2005). 현재는 이미 임상적으로 널리 이용되고 있다.
인도시아닌그린 등의 형광색소는 조직에서 간으로 섭취되어 분해되어 담도계를 통해 배출된다. 인도시아닌그린 등 색소가 주변조직의 정맥이나 림프관으로 이동하지 않기 위해서는 일정한 크기(10 ~ 100 ㎛)의 비교적 큰 입자에 결합되는 것이 유리하다. 본 조성물의 미립구가 주사부위에서 수개월 머무르면서 형광을 계속 발생하도록 형광색소를 미립구에 완전히 봉입하는 형태로 제조될 수 있다. 이렇게 미립구에 보입된 수용성인 형광색소는 소수성의 고분자 미립구의 벽에 갇히게 되므로 주사부위에 오래도록 머무는 효과를 기대할 수 있다.
또한 형광색소가 미립구에 잘 봉입되어 주변으로 흘러가지 않더라도 색소가 지속적인 여기광에 의해 소광(quenching)되거나, 생체반응에 의해 분해되어 색소의 성질을 잃어버리지 않아야 한다. 여기서 소광이라 함은, 형광색소에 여기광을 쬐면 여기상태에서 형광을 발생하면서 안정상태로 떨어지지만 이때 발생하는 발생기 산소 등에 의해 분해되거나 이량체 등(diner, tetramer)을 형성하면서 형광을 발생하지 않게 되는 등 형광발생 능력을 잃어버리는 것을 의미한다. 소광이 일어나면 비록 색소가 주사부위에 있다고 하더라도 형광을 발생하지 않아 표지자의 역할을 수행할 수 없다. 따라서 형광색소가 수개월 걸쳐 유지되기 위해서는 인도시아닌그린 등의 형광색소가 주사한 자리에 머물도록 적절한 크기의 미립구에 포매되는 등 잘 결합되고, 또한 소광이 적게 일어나야만 한다.
여기서 상기 형광색소는 단독으로 사용하는 것도 가능하며, 생체 단백질과 컨쥬게이션(conjugation)되어 사용될 수도 있다. 즉, 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물에 있어서 상기 미립구 입자는 생체 단백질을 더 포함할 수 있다. 상기 형광색소가 상기 생체 단백질과 컨쥬게이션을 형성할 경우, 상기 형광색소를 단독으로 사용했을 때와 비교하여 보다 강한 형광을 나타낼 수 있으며, 보다 긴 지속시간을 나타낼 수 있다. 여기서 상기 생체 단백질은 일례로 알부민(Albumin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 형광색소와 컨쥬게이션 결합을 형성하는 한, 본 발명의 범위로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물은 상기 생체 단백질이 높은 농도로 포함될수록 형광의 강도가 강해질 수 있다. 보다 구체적으로 상기 생체 단백질은 상기 목적 병변 표지용 조성물에 대하여, 0.5 내지 20 % w/v의 농도로 포함될 수 있다. 상기 생체 단백질에 관한 구체적인 내용은 하단에서 보다 상세히 설명하도록 한다.
상기 표면개질제는 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen) 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 생체 친화적 고분자 및 생체 조직 염색용 색소를 포함하는 미립구 입자는 병변의 추적 관찰을 위해 생체 내에서 오랜 시간 머무르게 됨에 따라, 대식세포나 이물질 거대세포 등에 의한 이물반응(foreign body reaction) 등 부작용이 발생할 수 있으므로, 이러한 부작용의 발생을 줄이기 위하여, 생체 내에 광범위하게 존재하는 생체 고분자 물질인 히알루론산이나 콜라겐이 표면개질제로서 사용될 수 있다.
여기서 상기 미립구 입자는 직경이 10 내지 100 ㎛일 수 있다. 보다 바람직한 직경으로는 30 내지 70 ㎛일 수 있으며, 평균적으로 40 ㎛의 직경을 나타낼 수 있다. 우리 몸의 조직은 수십 ~ 수백 nm 굵기의 collagen fiber, reticular fiber, elastic fiber로 촘촘히 구성되어 있고, 조직내로 통과하는 모세혈관벽과 림프관 벽의 pore size도 수십 nm이다. 본 발명의 미립구 입자(ICG-albumin-PMMA microsphere)가 조직 밖으로 흘러가지 않기 위해서는 조직내의 섬유나 모세혈관/림프관의 벽에 뚫린 pore size보다 큰 micrometer 크기가 적절하며 동물실험을 통하여 위의 입자크기가 효과적임을 확인하였다. 상기와 같은 미립구 입자 직경을 얻기 위해 상기 미립구는 필터링을 통해 수득될 수 있다.
여기서 상기 조성물은 평균 밀도가 1 내지 3 g/㎖일 수 있다. 이러한 조성물의 밀도는 상온에서의 증류수의 밀도(0.99821g/㎖) 보다 높은 값을 나타내며, 주사제로서 활용하기 위하여 증류수에 희석하게 되면, 침전이 발생하는 문제가 발생할 수 있다. 주사제에 있어서, 이러한 침전의 발생은 주사시 주사바늘이 막히는 문제가 발생하거나, 목적 병변에 본 발명의 조성물의 균일한 도입을 어렵게 만들 수 있다. 이에 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물을 포함하는 주사제 조성물은, 침전의 발생을 억제하기 위하여 추가적으로 상기 목적 병변 표지용 조성물과 히알루론산 등의 생체 적합 고분자를 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물에 관한 평균 밀도 및 주사제 조성물에 관한 구체적인 내용은 하단의 <목적 병변 표지용 주사제 조성물> 및 {실시예 및 평가} 단락에서 보다 상세히 설명하도록 한다.
<생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법>
본 발명은 상술한 목적을 달성하기 위한 수단으로, 목적 병변 표지용 조성물의 제조방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법은 생체 친화적 고분자가 첨가된 유기 용매와 생체 조직 염색용 색소가 첨가된 증류수를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합한 용액을 표면개질제가 첨가된 수용성 용매에 투입 후 교반하여 미립구 입자를 형성하는 단계;를 포함한다.
상기 형성된 미립구 입자 표면에는 상기 표면개질제가 코팅될 수 있다.
여기서 상기 유기 용매는 디클로로메테인(Dichloromethane, DCM), 오쏘크실렌(o-xylene), 메타크실렌(m-xylene), 파라크실렌(p-xylene) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기서 상기 수용성 용매는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA), 폴리아크릴아미드(polyacryl amide, PAAm), 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트(polyhydroxyethyl methacrylate, PHEMA), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기서 상기 증류수는 생체 조직 염색용 색소-생체 단백질 결합체가 더 첨가된 것일 수 있다.
본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법에 있어서, 상기 생체 친화적 고분자, 상기 생체 조직 염색용 색소, 상기 표면개질제 및 상기 생체 단백질은 상술한 바와 동일하다.
도 1은 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법을 나타내는 모식도이다. 보다 구체적으로, 상기 생체 친화적 고분자로서 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 상기 생체 조직 염색용 색소로서 인도시아닌그린(ICG), 상기 표면개질제로서 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 상기 생체 단백질로서 인혈청알부민(HSA)를 이용하여 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물을 제조하는 과정을 나타낸다.
도 1을 참조하면, 상술한 제조 방법에 따라 제조된 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물은 직경 크기가 10 내지 100 ㎛인 구형으로 나타나는 것을 확인할 수 있고, 육안으로는 흰색의 분말 형태를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
여기서 상기 생체 조직 염색용 색소의 농도는 1 내지 100 μM일 수 있다. 보다 바람직한 농도는 3 내지 30 μM일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 생체 조직 염색용 색소의 농도가 상술한 범위로 포함됨에 따라, 형광의 강도가 보다 강하게 나타날 수 있다. 상기 생체 조직 염색용 색소의 농도와 관련된 구체적인 내용은 하단의 {실시예 및 평가}에서 보다 상세히 설명하도록 한다.
여기서 상기 수용성 용매의 농도는 0.1 내지 10 % w/w이고, 상기 표면개질제의 농도는 0.01 내지 0.3 % w/v일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미립구 입자를 히알루론산이나 콜라겐으로 코팅하기 위해서는 히알루론산이나 콜라겐을 고분자 미립구의 원료에 첨가하는 방법이 있을 수 있지만 히알루론산은 가열 용융되지 않으며, 가열 용융과정에서 히알루론산이 변성될 가능성이 높다. 또한, 상기 히알루론산을 용매에 녹여 히알루론산 용액을 만들고 이를 미립구에 코팅하는 방법을 고려할 수 있지만 상기 히알루론산은 일반적인 유기용매에는 잘 녹지 않아 불가능하다. 본 발명에서는 미립구 입자를 만드는 단계에서 히알루론산이 잘 용해되는 용액을 제조하는 단계를 개발하여 히알루론산의 코팅을 제공하였다. 상기 히알루론산은 섬유아세포를 자극하여 콜라겐을 생성하는 효과가 알려져 있다. 이렇게 생성되는 콜라겐은 조직에 주사된 목적 병변 표지용 조성물이 주사부위에 잘 고착되어 수개월의 기간이 경과하여도 흘러가지 않는 효과를 기대할 수 있다.
여기서 상기 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법은 상기 교반 용액을 세척하고 필터링하여 특정한 크기의 미립구 입자를 선택하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상술한 대로, 인도시아닌그린 등 색소가 주변조직의 정맥이나 림프관으로 이동하지 않기 위해서는 일정한 크기(10 ~ 100 ㎛)의 비교적 큰 입자에 결합되는 것이 바람직하므로, 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법은 상기 교반 용액을 세척하고 필터링하여 10 내지 100 ㎛ 크기의 미립구 입자를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
<목적 병면 표지용 주사제 조성물>
나아가, 본 발명은 상술한 목적을 달성하기 위한 수단으로, 제1항의 목적 병변 표지용 조성물; 및 평균 분자량이 0.5 내지 3.0 MDa인 히알루론산(Hyaluronic acid; HA) 를 포함하는, 목적 병변 표지용 주사제 조성물을 제공한다.
본 발명의 생체 조직 염색용 색소가 포함된 생체 친화적 고분자의 생체 내 표지자로서의 활용성을 극대화하기 위하여, 생체 고분자를 사용하여 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물의 물성을 강화시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물은 생체 내의 병변 부위에 주입되어 병변을 표시함으로써 수술 시에 병변 부위를 명확히 인식할 수 있게 하는 역할을 수행하는데, 이 같은 조성물이 상술한 표지자로서의 목적을 원활하게 수행하기 위해서는 주입된 병변 부위에서 확산을 최대한 방지하고 높은 형광신호가 꾸준히 나올 수 있어야 한다. 이러한 목적을 달성하기 위한 하나의 수단으로서 "히알루론산(hyaluronic acid)"을 사용할 수 있다. 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물을 히알루론산 용액에 혼합할 경우, 상기 히알루론산 용액에 의하여 상기 조성물의 생체 내 잔류성이 향상될 수 있다.
또한 본 발명의 목적 병변 표지용 주사제 조성물에 있어서, 상기 히알루론산이 주사제에 추가로 혼합되는 경우, 미립구의 침전을 늦추거나 막아서 침전된 미립구에 의해 주사기 바늘이 막혀 주사를 실패하는 것을 예방해 줄 수 있다. 이와 관련된 내용은 하단의 {실시예 및 평가}에서 보다 상세히 설명하도록 한다.
여기서 상기 주사제 조성물 100 중량%에 대하여, 히알루론산(hyaluronic acid; HA)은 0.3 내지 1 중량%로 포함될 수 있다. 상기 히알루론산이 0.3 중량% 미만으로 포함되는 경우, 상기 목적 병변 표지용 조성물이 침전되어, 상기 침전된 조성물로 인해 주사기 바늘이 막히는 문제가 발생할 수 있다. 반면에, 상기 히알루론산이 1 중량%를 초과하는 경우, 상기 주사제 조성물에 과도하게 점성이 부여되어, 역시 주사 시에 불편을 야기하는 문제가 발생할 수 있다. 이에 따라, 상기 히알루론산은 본 발명의 주사제 조성물 100 중량%에 대하여, 0.3 내지 1 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 이와 관련된 구체적인 내용은 하단의 {실시예 및 평가}에서 보다 상세히 설명하도록 한다.
여기서 상기 히알루론산(Hyaluronic acid; HA)는 상온에서 24 내지 1500 cps의 점도를 가지는 것일 수 있다. 상기 히알루론산의 점도가 24 cps 미만인 경우, 본 발명의 주사제 조성물의 점도가 너무 낮아서 주사시에 주사량의 조절이 어렵거나, 침전이 발생하는 문제가 발생할 수 있다. 반면에 상기 점도가 1500 cps를 초과하는 경우, 너무 높은 점도로 인해 주사기에 걸리는 힘이 과도하게 필요하게 되므로, 주사가 용이하지 못하는 문제가 발생할 수 있다. 이에 따라 상기 히알루론산의 점도는 상온에서 24 내지 1500 cps 인 것이 바람직하다.
여기서 상기 주사제 조성물이 주사된 목적 병변은 수개월 이상 표지가 유지될 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 주사제 조성물을 통한 목적 병변의 표지는 4 내지 12 개월 유지되는 것이 바람직할 수 있다. 선행항암치료(수술 전 항암치료) 전에 상기 조성물을 목적 병변에 주사한 후에, 상기 목적 병변의 추적 관찰이 가능하도록 상기 조성물은 선행항암치료 후에도 계속 형광이 유지되어야 한다. 상기 선행항암치료의 구체적인 기간은 기간은 암의 종류와 항암치료의 종류에 따라 다르고, 항암치료의 발전에 따라 변화될 수는 있으나, 일반적으로 4 내지 8개월 정도의 기간 동안 수행될 수 있다. 이에 따라, 상기 목적 병변 표지용 주사제 조성물이 주사된 목적 병변은 표지(형광)가 4개월 이상 유지되는 것이 바람직하고, 6개월 이상 유지되는 것이 보다 바람직하고, 8개월 이상 유지되는 것이 보다 더 바람직하다. 상기 주사제 조성물의 목적 병변 내에서의 안정성과 관련된 구체적인 내용은 하단의 {실시예 및 평가}에서 보다 상세히 설명하도록 한다.
<목적 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법>
또한, 본 발명은 상술한 목적 병변 표지용 조성물을 이용하여, 목적 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법에 대하여 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 목적 병변 표지용 조성물을 목적 병변 또는 목적 병변 주변에 직접적으로 투여하는 단계; 및 상기 목적 병변 표지용 조성물이 투여된 조직으로부터 색이 변화되는 위치를 목적 병변으로 인지하여, 표지 부위 수술 중에 실시간으로 확인하는 단계;를 포함하는, 목적 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 목적 병변 표지용 조성물을 생체 내의 병변 조직에 투여할 경우, 병변의 위치를 색깔, 근적외선 형광 또는 이들의 조합을 통하여 표지할 수 있고, 상기 표지를 검출함으로써 목적 병변의 위치, 크기 등을 수술 중에 실시간으로 검출할 수 있으므로, 외과적인 목적 병변의 제거시 정확성을 향상시킬 수 있고, 정상조직의 과다한 손실을 방지할 수 있다.
아울러, 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물은 생체 친화적 고분자를 포함함에 따라, 다른 물질에 생체조직 염색용 색소를 결합시킨 복합체에 비하여, 생체내의 주사 병변에서 높은 형광신호를 보이면서 장기간 동안 잔류할 수 있으므로, 목적 병변의 외과적인 절제 정확도를 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, 수술전 미세병변의 위치에 본 발명의 조성물을 주입하고, 수 일 ~ 수 주 후의 수술 중에서도 육안 및 형광카메라 등을 통하여 안정하고 정확하게 병변 부위를 확인할 수 있다.
이하, 첨부한 도면 및 실시예들을 참조하여 본 명세서가 청구하는 바에 대하여 더욱 자세히 설명한다. 다만, 본 명세서에서 제시하고 있는 도면 내지 실시예 등은 통상의 기술자에 의하여 다양한 방식으로 변형되어 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 본 발명에서의 기재사항은 본 발명을 특정 개시 형태에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 균등물 내지 대체물을 포함하고 있는 것으로 보아야 한다. 또한, 첨부된 도면은 본 발명을 통상의 기술자로 하여금 더욱 정확하게 이해할 수 있도록 돕기 위하여 제시되는 것으로서 실제보다 과장되거나 축소되어 도시될 수 있다.
{실시예 및 평가}
<실시예>
제조예 1. 인도시아닌그린(ICG)에 인혈청알부민(HSA)이 결합된 용액 제조
25 ㎎의 인도시아닌그린(ICG)을 증류수 10 ㎖에 용해시켜 제조한 3.2 mM 농도의 용액을 준비한다. 이 10 ㎖용액에서 312.5 ㎕를 1.5 ㎖ Eppendorf tube에 옮겨 담고 증류수 687.5 ㎕를 희석해주면 ICG가 78 ㎍ 포함된 0.1 mM 용액 1 ㎖가 제조된다. 한편 20% 인혈청알부민(HSA) 용액 0.4 ㎖를 준비하여 증류수 0.6 ㎖와 희석해 주면 부피 1 ㎖인 8%의 용액이 제조된다. 제조된 0.1 mM ICG 1 ㎖와 8% HSA 1 ㎖ 두 종류 용액에서 각각 125 ㎕씩 하나의 1.5 ㎖ Eppendorf tube에 옮겨 담게 되면 최종적으로 50 ㎛ ICG와 4% HSA가 결합된 용액 0.25 ㎖이 제조된다.
제조예 2. 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 용액 제조
ACRYPET 폴리메틸메타크릴레이트 비드(PMMA bead, 롯데 MRC) 300 ㎎(15 개)을 Dichloromethane(DCM) 용액 3 ㎖에 완전히 용해시켜 제조하였다.
제조예 3. 히알루론산(Hyaluronic acid) 을 포함하는 폴리비닐피롤리돈(PVP) 현탁안정제 용액 제조
폴리비닐피롤리돈(PVP) 4 g을 100 ㎖ 증류수에 완전히 용해시켜 4% 농도의 폴리비닐피롤리돈(PVP) 용액을 제조한 다음, 히알루론산(Hyaluronic acid)를 0.15 g을 첨가하여, 현탁안정제 용액을 제조하였다.
제조예 4. 인도시아닌그린(ICG)-인혈청알부민(HSA)과 결합된 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미립구 입자 제작
상기 제조예 1에서 제조된 ICG-HSA 수용액 0.25 ㎖와 제조예 2에서 제조된 PMMA 용액 3 ㎖를 15 ㎖ tube에 넣고 homogenizer를 이용하여 실온에서 7500 rpm의 속도로 20분 동안 수용액층과 유기용액층이 서로 격렬하게 혼합 되도록 한다. 이 혼합액을 실온에서 900 rpm으로 교반 중인 현탁안정제 용액 40 ㎖(제조예 3)에 넣어준다. 90분 동안 교반하여 유기용매 기체가 날아가게 한 후, 이 혼합물을 2 ㎖ Eppendorf tube에 각각 나눠 담고 원심분리기를 이용하여 2000 rpm 속도로 10 분간 세 번 세척한다. 분산된 ICG-HSA-PMMA 미립구 입자를 한 개의 tube에 모두 합한다. 이 물질을 70 ㎛와 30 ㎛ 크기의 filter로 걸러내어 30-60 ㎛ 크기의 결과물로 얻어낸다. Filter 후 상온 건조된 가루상태의 ICG-HSA-PMMA를 gamma irradiator에 넣고 17 초 동안 75 Gy 세기로 소독하여 얻는다.
상기 실시예의 과정을 도 2에 도식화하여 나타내었다. 도 2는 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법을 구체적으로 나타낸 모식도이다. 상술한 실시예 및 도 2를 참조하여, 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 조성물을 제조하였다.
<평가>
1. ICG-HSA-PMMA의 물성 평가
1-1. 물성 평가
도 3 (a)는 ICG와 HSA를 포함한 PMMA의 실제사진과 형광카메라로 찍은 사진이고, 도 3 (b)는 ICG와 HSA 포함유무에 따른 PMMA를 형광현미경으로 찍은 사진이다. 도 3 (a) 및 도 3 (b)를 참조하면, 본 발명의 목적 병변 표지용 조성물은 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있고, 또한 상기 조성물은 생체 적합 고분자(PMMA)를 포함함에 따라, 구형의 미립구 입자를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
1-2. 밀도 평가
수용액 상태에서 실제 사용형태로 밀도를 직접 측정하기는 어려워서 간접적으로 농도에 따른 밀도의 변화를 참고로 하여 미립구의 밀도를 측정하였다. 상기에서 제조한 대표적인 ICG 6.5 μM 4% HSA의 미립구를 이용하여 밀도를 측정하였으며, 약 20 ㎎/㎖ ~ 200 ㎎/㎖(2 ~ 20 %(w/v)) 농도의 미립구를 이용하여, 하기와 같이 밀도를 간접적으로 측정하였다.
보다 구체적으로, 상온에서, 투명용기에 20 ㎖의 증류수를 채운 후, 상술한 미립구를 투여하여, 상기 미립구를 포함하는 수용액의 변화되는 밀도를 측정하였으며, 특히, 미립구의 농도에 따라 변화되는 밀도를 측정하였다. 참고로, 미립구를 증류수에 투여 후 증류수에 쉽게 용해되지 않고 진탕 혼합하면 백색의 현탁성을 띄는 것을 확인할 수 있었고 재빨리 측정을 하지 않으면 바닥으로 입자가 가라앉기 시작하여 수 분이 지나면 입자가 모두 가라앉게 되었다.
표 1은 미립구를 포함하는 증류수에 대한 밀도를 나타낸 표이며, 상기 미립구가 포함되는 농도에 따른 밀도를 기재하였다.
| 미립구 % (w/v) | 밀도 (g/㎖) |
| 25.23 | 1.0621 |
| 18.66 | 1.0469 |
| 12.61 | 1.0309 |
| 10.69 | 1.0251 |
| 9.525 | 1.0231 |
| 5.35 | 1.0112 |
| 2.16 | 1.0021 |
표 1을 참조하여 선형회귀분석으로 선형회귀식을 구하였으며, 외삽으로 100%일 때의 밀도를 측정하였다.
[식]
도 4는 증류수에 대한 본 발명의 미립구 입자 농도에 따른 밀도를 나타내는 그래프이다. 도 4를 참조하면, 상술한 식에 따라 상기 미립구의 밀도는 1.2574 g/㎖ 로 추정되었다. 아울러, 20분 후 증류수에 상기 미립구를 용해한 증류수를 확인하여 보니, 용기 아래 부분에 하얀색의 현탁액이 가라 앉아있는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 상기 미립구의 밀도는 1.2574 g/㎖ 로 상온에서의 증류수의 밀도(0.99821 g/㎖) 보다 높다는 것으로 판단하였다.
1-3. 형광 평가
근적외선형광을 나타내는 ICG-Albumin-PMMA 미립구 형광표지자의 최적 ICG농도와 albumin 농도를 확인하기 위해 다양한 ICG농도와 알부민농도로 제작된 미립구의 근적외선형광을 측정하였다.
가장 강한 근적외선형광을 나타낼 수 있는 ICG와 알부민의 혼합비를 결정하기 위하여, 1.3 내지 1032 μM의 ICG와 0 내지 1 % w/v (10 ㎎/㎖)의 알부민를 다양한 비율로 반응시켜서 각각의 ICG-albumin-PMMA 미립구를 제작하고, 상기 제작된 미립구에서 나타나는 근적외선형광의 신호세기를 측정하여, 표 2에 나타내었다.
| Albumin (% w/v) | ||||||||
| ICG μM | 0 | 0.05 | 0.25 | 0.5 | 0.7 | 1 | 10 | 20 |
| 1.3 | 6 | 14 | 79 | 99 | 140 | 177 | 467 | 577 |
| 3.9 | 40 | 18 | 123 | 153 | 197 | 293 | 730 | 953 |
| 6.5 | 71 | 13 | 148 | 170 | 240 | 327 | 767 | 974 |
| 9 | 104 | 11 | 152 | 154 | 224 | 284 | 574 | 734 |
| 12.9 | 137 | 9 | 121 | 125 | 143 | 193 | 330 | 484 |
| 25.8 | 153 | 4 | 85 | 90 | 113 | 150 | 200 | 317 |
| 38.7 | 142 | 5 | 54 | 60 | 77 | 107 | 133 | 157 |
| 51.6 | 133 | 3 | 34 | 42 | 50 | 83 | 97 | 117 |
| 64.5 | 125 | 5 | 25 | 32 | 40 | 60 | 64 | 84 |
| 77.4 | 111 | 5 | 18 | 25 | 33 | 37 | 37 | 50 |
| 103 | 80 | 8 | 13 | 20 | 27 | 31 | 33 | 37 |
| 258 | 40 | 10 | 5 | 12 | 20 | 20 | 22 | 22 |
| 516 | 24 | 4 | 1 | 8 | 15 | 16 | 18 | 20 |
| 774 | 13 | 2 | 1 | 7 | 11 | 14 | 17 | 16 |
| 1032 | 10 | 2 | 1 | 6 | 7 | 8 | 9 | 8 |
상기 표 2의 결과를 그래프로 하여 도 5에 나타내었다. 도 5는 ICG와 알부민의 농도 변화에 따른 미립구의 근적외선형광 신호세기 변화를 나타내는 그래프이다.
상기 표 2 및 도 5를 참조하면, 알부민을 추가하지 않은 경우 미립구의 근적외선형광의 강도는 25.8μM의 ICG가 가장 높은 값의 근적외선형광 신호세기를 나타내는 것을 확인할 수 있고, 0.05 %w/v (0.5 ㎎/㎖)의 알부민을 처리한 경우에는 3.9μM의 ICG가 가장 높은 값의 근적외선형광 신호 세기를 나타내었으나 전체적으로 형광이 현저히 낮은 것을 확인할 수 있다. 0.25 %w/w (2.5 ㎎/㎖)의 알부민을 처리한 경우에는 9 μM의 ICG가 가장 높은 값의 근적외선형광 신호세기를 나타내었고, 알부민의 농도가 더 높은 경우, 0.5 %w/v (5 ㎎/㎖), 0.7 %w/v (7 ㎎/㎖), 1 %w/v (10 ㎎/㎖), 10 %w/v (100 ㎎/㎖), 20 %w/v (200 ㎎/㎖)의 알부민을 처리한 경우에는 6.5 μM의 ICG가 가장 높은 값의 근적외선형광 신호세기를 나타낼 수 있다.
상기 실험 결과로 보아 동일한 알부민농도에서 형광의 강도가 가장 강한 ICG의 농도는 6.5 내지 25.8 μM이었다. 따라서 본 발명에 있어서 상기 ICG 농도 범위는 1내지 100 uM인 것이 바람직하고, 3 내지 30 μM인 것이 보다 바람직할 것이다.
또한 동일한 ICG 농도에서 형광의 강도는 실험에서 사용한 최고 알부민 농도인 20 % w/v까지는 계속 증가하였다. 현실적으로 미립구 제조에 필요한 인혈청알부민의 최대농도가 20 %w/v 이어서 더 높은 알부민농도로 미립구를 제작하지는 못하였다. 따라서 실험결과로는 형광의 강도가 최대가 되는 알부민의 농도는 확정하지는 못하였으나, 실험으로 확인한 결과에서 알부민이 0.5%인 미립구부터 알부민을 포함하지 않는 미립구보다 최대형광이 커지기 시작하는 것을 확인할 수 있으므로, 따라서 미립구 제작에 사용하는 알부민은 0.5 % w/v 이상이 이상적이며 실험적으로 가능한 최고 알부민 농도인 20 %w/v까지 미립구 제작에 적합할 수 있다.
2. ICG-HSA-PMMA의 주사제 조성물의 유용성 평가
2-1. 히알루론산의 유용성 평가
주사제 조성물로서의 히알루론산의 유용성을 판단하기 위하여, 히알루론산의 농도에 따른 ICG-Albumin-PMMA/히알루론산 조성물의 현탁성 유지 시간을 측정하였다. ICG-Albumin-PMMA는 2㎎/㎖의 농도를 이용하였으며, ICG-Albumin-PMMA 미립구의 최종 주사물은 히알루론산 조성물에 완전히 용해되면 매우 연한 녹색 혹은 흰색의 현탁액의 성상을 보인다.
보다 구체적으로, ICG-Albumin-PMMA 주사제 조성물이 제조된 후에 현탁성을 유지하는 시간을 측정하였으며, 추가되는 히알루론산의 농도에 따른 현탁성을 유지하는 측정하였다. 여기서, 현탁성은 500nm 빛의 투과도 20%를 기준으로 가라앉는 부위와 부유 부위가 구분되는 기준이 보이는 시점으로 현탁성 유지시간을 정의하였다. 그리고, 그 결과를 표 2에 기술하였다.
표 3은 ICG-Albumin-PMMA 미립구 주사물이 제조된 후에 현탁성이 유지되는 시간을 히알루론산 용제의 농도별로 나타낸 표이다.
| 히알루론산 용제의 농도 (%, w/v) | 현탁성 유지 시간 |
| 0 (단순주사용수, 증류수) | 10분 이내 |
| 0.1 | 60분 이내 |
| 0.2 | 3시간 이내 |
| 0.3 | 4시간 이내 |
| 0.4 | 12시간 이내 |
| 0.5 | 24시간 이내 |
| 1.0 | 24시간 이상 |
| 1.5 | 24시간 이상 |
| 2.0 | 24시간 이상 |
| 2.5 | 24시간 이상 |
표 3을 참조하면, 히알루론산이 첨가되지 않은 주사제 조성물은 히알루론산이 첨가된 조성물보다 현탁성 유지 시간이 비교적 짧았으며, 히알루론산이 첨가되는 비율이 증가할수록 현탁성 유지 시간이 길어지는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 0.1%의 히알루론산 주사제 조성물에 첨가되었을 때, 현탁성 유지 시간이 60분 이내로 증가하였으나, 히알루론산의 농도가 0.2% (w/v)부터 현탁성이 1~3시간이었으며, 히알루론산의 농도가 0.3% (w/v)부터는 현탁성이 3시간을 넘는 것을 확인하였다. 실제 임상에서 주사를 하는 경우 주사제를 준비하고 실제 주사하는 시간이 1시간이내이므로, 0.2% (w/v)부터 실제 주사용 제제로 효과적인 것으로 판단되었다.
도 6은 본 발명의 생체 친화적 목적 병변 표지용 주사제 조성물에 있어서, 히알루론산 농도에 따른 미립구 입자의 분산 정도를 나타내는 사진이다. 보다 구체적으로, 상기에서 제조한 ICG-HSA-PMMA/hyaluronic acid 주사제를 준비 직후, 30, 60, 120 분이 지난 후에 촬영한 사진으로, 왼쪽 a)는 주사용수(증류수)에 미립구를 혼합한 주사제이며 오른쪽 b)는 0.3% 히알루론산으로 조제된 미립구 주사제 사진이다.
도 6을 참조하면, 주사용수에 조제된 주사제 조성물은 빠르게 가라앉는데 반해, 0.3%의 히알루론산이 첨가된 주사제 조성물은 장시간 동안 (120분까지) 완전히 가라앉지 않음을 알 수 있었다. 즉, 도 3의 결과로부터, 미립구에 0.3%의 히알루론산이 첨가된 ICG-HSA-PMMA/hyaluronic acid 주사제 조성물은 주사 준비 중에 빠르게 가라앉지 않을 것이므로 주사제 조성물로서 매우 유용하다는 것을 의미한다.
2-2. 주사제 조성물로서의 유용성 평가
히알루론산의 농도에 따라 주사시 손가락에 걸리는 힘(gliding force, N)를 여러 조건에서 측정하고, 주사제 조성물로서 ICG-Albumin_PMMA/히알루론산의 유용성을 판단하였다.
보다 구체적으로, 최종 제조된 주사물을 주사제로 사용하는 경우 주사의 용이성을 21G, 22G, 23G, 26G 바늘 (Kovax, 주)한국백신), 20G spinal needle 바늘(천자침, 태창산업㈜)과 7Fr 내시경주사기를 각각 장착한 3cc 일회용 주사기 (3cc, BD, Luer-Lock Tip, Singapore) 를 이용하여 평가하였다 (20G (바늘내경: 0.603mm), 21G (바늘내경: 0.495mm), 22G (바늘내경: 0.394mm), 23G (바늘내경: 0.318mm), 26G (바늘내경: 0.241mm))
각 주사바늘 별로 주사기 손잡이에 가해지는 힘 (주사시 손가락에 걸리는 힘, N)을 측정하였다. 아울러, 1.8m의 연결도관이 있는 내시경 주사기(7 Fr, 길이 180 cm, MTW, Germany)를 이용하여 저항을 측정하였다.
실험에 사용한 주사제는 ICG-Albumin-PMMA 미립구 2㎎/㎖의 농도를 이용하였으며 최종 주사물의 히알루론산의 농도는 0.1 ~ 3.0 % (w/v)로 정하였다. 주사제를 주사기에 주입한 이후 미립구가 가라앉지 않도록 즉시 실험을 시행하였고, 최종 주사제를 0.1 cc/sec 속도로 주사하는 동안 Strain-ga㎍e dynamometer를 이용하여 측정하였다 (Digital Force Ga㎍e DPU-500N, IMADA, Toyohashi, Japan). 그리고, 그 결과를 아래의 표 4에 기술하였다.
| N | Blank 주사기 |
증류수 | 히알루론산 (% (w/v)) [ICG-Albumin-PMMA 미립구 2㎎/㎖] | |||||||||||||
| 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3 | |||
| 26G | 1.2 | 2.9 | 3.0 | 3.3 | 3.5 | 4.3 | 4.9 | 5.2 | 5.9 | 6.1 | 6.5 | 6.6 | 7.9 | 9.9 | 12.6 | 15.8 |
| 23G | 1.9 | 2.3 | 2.4 | 2.5 | 2.7 | 3.0 | 3.5 | 3.8 | 4.1 | 4.2 | 4.4 | 4.6 | 6.5 | 8.6 | 10.2 | 12.8 |
| 22G | 1.6 | 1.8 | 1.8 | 2.2 | 2.6 | 2.7 | 3.1 | 3.3 | 3.6 | 3.9 | 3.8 | 4.0 | 6.6 | 8.3 | 9.1 | 11.8 |
| 21G | 1.8 | 1.9 | 1.9 | 2.2 | 2.5 | 2.7 | 2.7 | 2.9 | 3.1 | 3.2 | 3.4 | 3.5 | 4.6 | 6.6 | 7.9 | 9.5 |
| 20G | 1.8 | 1.7 | 1.8 | 2.5 | 3.1 | 3.4 | 3.5 | 3.8 | 3.9 | 4.5 | 4.7 | 4.9 | 8.4 | 12.8 | 17.6 | 19.6 |
| 7Fr | 1.9 | 3.3 | 3.4 | 7.5 | 12.1 | 17.8 | 21.6 | 25.4 | 27.2 | 33.4 | 36.9 | 39.5 | 측정불가 | 측정불가 | 측정불가 | 측정불가 |
일반적으로 임상에서 주사를 하는 경우 0.6에서 1.4 N의 힘이 주사시에 손가락에 가해졌다. 일반성인의 악력이 400 N이고 손가락으로 감당할 수 있는 악력은 이보다 약하며 주사량을 조절하는 등 섬세한 조정을 하기 위해서는 훨씬 적은 힘이 들어야 한다. 남녀 각 10명에서 엄지와 검지/중지사이에 force ga㎍e를 설치하고 최대 힘을 주었을 때의 최대 힘(MaxPower)과 편하게 주사할 때의 힘(EasyPower)을 측정하였다. 최대 힘(MaxPower)은 성인남성 98.1 N (113.5 ~ 78.2, 표준편차 9.8), 성인여성 43.1 N (50.6 ~ 34.2, 표준편차 6.1)이었고 편하게 힘을 줄 때 성인남성 25.4 N(29.7 ~ 20.1 표준편차 3.3), 성인여성 14.5 N (18.3 ~ 11.5 표준편차 2.2)이었다. 여성성인의 주사 시 최대 압력 43 N과 편하게 힘을 주는 경우 14.5 N을 기준으로 이상적인 주사제의 저항을 판단하였다. 즉 주사가 가능한 최대힘은 40 N이고 편하게 이상적으로 주사할 수 있는 저항성은 10 N로 판단하였다.
일반적인 주사바늘 (21 ~ 26G)을 이용하여 주사하는 경우 히알루론산 1% 농도까지는 주사시 저항이 10N으로 크지 않아 사용에 어려움이 없었다. 20G 바늘굵기에 다른 바늘보다 훨씬 긴 천자침의 경우도 1%에서 10N을 넘지 않았다.
반면, 도관의 길이가 길어 저항이 많이 걸리는 내시경용 주사기 바늘(7Fr, 180cm)을 이용하는 경우, 주사용수는 1.9 N의 힘이 들었고, 히알루론산의 농도가 1% (w/v) 일 경우는 39.5 N의 힘이 걸려서 현저히 높은 압력이 가해져야 주사가 가능하였고 주사량을 조절하거나 속도를 조절하는 것을 불가능하였다.
개인차가 있지만 40 N의 힘이 손가락에 걸리면 조직에 주사하는 것이 어려움을 느껴 정밀하게 주사하는 것은 어렵다. 한편, 내시경용 주사기 바늘(7Fr, 180cm)을 이용하였을 때, 히알루론산 1 %을 넘으면 저항이 커져 (> 40N) 맨손으로는 주사할 수가 없었다.
최대한의 힘으로 손으로 주사가 가능한 조건(40N 이하의 저항력)에서는 히알루론산 3 %(w/v)이상까지 주사가 가능하였으며, 바늘이 긴 천자침 (20G)의 경우도 3 %(w/v)까지 가능하였다. 주사기에서 바늘까지 가는 도관으로 연결된 극도로 길이가 긴 특수주사기(내시경 주사기)의 경우에도 1.0 %(w/v)까지 어려움없이 주사할 수 있었다.
한편, 조직과 직접적으로 맞닿는 일반적인 주사기(26G ~ 20G)를 이용하는 경우에는 조직에 부드럽게 주사하는 것이 바람직하며 10N 미만의 힘이 걸리는 것이 이상적이다. 히알루론산의 경우 일반바늘 (21 ~ 26G)에서 2%(w/v) 까지는 10N 미만의 힘으로 주사가 가능하였고 천자침 (20G)의 경우도 1.5 %(w/v)까지 가능하였다. 내시경 주사기는 0.2 ~ 0.3 %(w/v) 까지 어려움없이 주사할 수 있었다.
2-3. 침전에 따른 주사기 압력 변화 평가
히알루론산이 첨가되는 주사제 조성물을 바로 주사하는 경우의 압력(A)과 상기 주사제 조성물을 120분 방치한 후 조성물이 침전한 다음 주사 시작시의 주사기에 걸리는 압력(B)와 주사가 진행되는 중간의 압력(C)을 측정하여 아래의 표에 기술하였다.
이때, 실험에 사용한 주사제는 ICG-Albumin-PMMA 미립구 2㎎/㎖의 농도를 이용하였으며 최종 주사물의 히알루론산의 농도는 0.1 ~ 3.0 % (w/v)로 정하였다. 주사기는 26G를 사용하였고 주사기에 걸리는 압력의 단위는 N으로 측정하였다. 아울러, 활주력의 단위는 N으로 측정하였다 (Digital Force Ga㎍e DPU-500N, IMADA, Toyohashi, Japan).
| 26G | 증류수 | 히알루론산 (% (w/v)) | |||||||||||||
| 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3 | ||
| A | 2.9 | 2.9 | 3.1 | 3.5 | 4.2 | 4.7 | 5.3 | 5.8 | 6.2 | 6.3 | 6.7 | 7.7 | 9.7 | 12.4 | 15.6 |
| B | ND | 45.2 | 34.7 | 3.7 | 4.3 | 4.8 | 5.4 | 5.7 | 6.3 | 6.5 | 6.9 | 7.5 | 9.8 | 12.2 | 15.8 |
| C | ND | 3.5 | 3.6 | 3.5 | 4.2 | 4.3 | 5.2 | 5.3 | 6.0 | 6.2 | 6.5 | 7.3 | 9.5 | 12.5 | 15.8 |
| B-A | ND | 42.3 | 33.6 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | -0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | -0.2 | 0.1 | -0.2 | 0.2 |
표 5를 참조하면, 주사제 조성물을 바로 주사하는 경우의 압력(A)과 상기 주사제 조성물을 120분 방치한 후 조성물이 침전한 다음 주사기에 걸리는 압력(B)은 히알루론산의 농도가 높아질수록, 압력(A, B)이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. A, B의 차이는 0.3 % 이후 거의 없었다 (-0.2 ~ 0.2 N).히알루론산의 농도가 0.3% 보다 높아질수록 주사제 조성물을 120분 방치한 후에 주사기에 걸리는 압력(B)과 주사제 조성물을 바로 주사하는 경우의 압력(A)과 차이가 거의 나지 않았다. 히알루론산의 농도가 0.3% (w/v)일 때부터 3.0% (w/v) 일 때까지 평균 B-A 값은0.07N 이였으며, 이에 따른 표준편차는 0.15 N이었다.
표 5에서 히알루론산의 농도가 0.1%, 0.2% 인 자료를 보면 2시간 방치 후 압력이 45.2, 34.7 N으로 주사가 힘든 압력이 걸리는 것은 주사제에 의해 주사바늘이 막혀있는 것을 의미한다. 주사제가 움직이고 나서는 압력이 급격하게 줄어서 주사제를 바로 주사할 때의 압력(A)와 차이가 없었다.
즉, 히알루론산을 적정량 (0.3% 이상) 첨가함으로써, 침전속도를 늦출 수 있었으며, 침전된 조성물에 의해 주사바늘이 막혀 과도한 힘을 가해야 주사가 시작되는 단점을 해결할 수 있었다.
한편, 히알루론산의 농도가 1%(w/v)를 초과하는 경우에는 히알루론산의 점도 때문에 주사시 압력이 증가하는 것을 확인할 수 있는데, 이렇게 압력이 증가하게 되면, 주사시에 저항감 역시 증가하게 되므로 주사제로서의 사용에 불편을 초래할 수 있다.
3. ICG-HSA-PMMA의 안정성 평가
근적외선 형광신호를 발생시킬 수 있는 ICG와 HSA가 결합된 PMMA 미립구 입자는 생체 내에서 보다 안정적으로 작용하는 표지자 역할을 할 수 있을 것으로 예상되었으므로, 상기 미립구 입자를 제작하고 이를 in vitro, in vivo 두 조건에서 안정성을 확인하였다.
3-1. in vitro 근적외선 형광신호 안정성 확인
도 7은 in vitro 조건에서 ICG, ICG-HSA, ICG-HSA-PMMA 입자의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기의 변화 비교를 IVIS(Perkin Elmer, Hopkinton, MA)로 측정하여 나타내는 그래프이다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 실시예에 의하면, ICG-HSA와 결합된 PMMA 미립구 (ICGHSA-PMMA)의 제조시 높은 수준의 근적외선 형광신호를 나타내는 미립구 입자를 제조하기에 적합한 혼합비율은 50μM의 ICG를 4%의 HSA와 결합하여 300 ㎎의 PMMA beads에 혼합하는 것임을 확인하였다. 이렇게 알부민과 같은 생체고분자에 결합할 경우, ICG 단독으로 미립구에 포매된 경우에 비해 더 강한 형광과 지속시간을 보여준다.
상기 제조예 4에서 제작한 ICG-HSA-PMMA 입자를 in vitro 조건에서 5 달 동안 방출하는 근적외선 형광신호의 세기를 IVIS로 측정한 결과를 도 8에 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 8 (a)는 ICG-HSA-PMMA 입자를 각각 HSA, 증류수에 넣고 시간의 경과에 따른 입자의 안정성 비교를 나타내는 사진이다. 도 8 (b)는 ICG-HSA-PMMA 입자를 Agarose gel에 넣고 시간의 경과에 따른 입자의 안정성을 나타내는 사진이다.
도 8 (a)를 참조하면, PMMA가 포함된 입자들이 근적외선 형광신호의 세기가 감소하는 폭이 비교적 작으면서 안정성을 보였다. 또한 도 8 (b)를 참조하면, 제작한 입자를 각각 (a) 20% HSA, 증류수 및 (b) Agarose gel에 넣고 17주간 방출하는 근적외선 형광신호를 형광 카메라로 측정하여 육안으로도 안정성을 나타내는 것을 확인하였다.
3-2. in vivo 근적외선 형광신호 안정성 확인
상기 제조예 4에서 제작한 ICG-HSA-PMMA 미립구 입자를 히알루론산(hyaluronic acid) 용액 또는 증류수에 넣어서 ICR 마우스의 등에 각각 100 ㎕씩 주사하고, 4 달 동안 각 마우스에서 발생하는 근적외선 형광신호의 세기를 IVIS 및 형광카메라 장비를 이용하여 측정하였다.
도 9는 in vivo 조건에서 ICR 마우스에 주사된 ICG-HSA-PMMA 입자가 히알루론산 또는 증류수와 함께 주사되었을 때의 시간 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 변화를 IVIS로 측정 비교한 결과이다
도 9를 참조하면, IVIS 관찰 결과, ICG-HSA-PMMA/hyaluronic acid 혼합물은 높은 세기의 근적외선 형광신호를 보이며 안정성을 유지하였으나 증류수에 섞은 혼합물은 매우 낮은 형광신호를 보였다.
도 10은 in vivo 조건에서 ICR 마우스에 주사된 ICG-HSA-PMMA 입자가 히알루론산 또는 증류수와 함께 주사되었을 때의 시간 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 변화를 형광카메라로 촬영하여 Image J 프로그램으로 분석한 그래프와 mouse를 형광카메라로 찍은 결과이다.
도 10을 참조하면, 형광카메라의 경우, 촬영 후 Image J 프로그램으로 측정하여 형광세기를 측정하였고 두 혼합물 모두 높은 세기의 근적외선 형광신호가 나타났으나 시간이 지남에 따라서 ICG-HSA-PMMA/hyaluronic acid 혼합물은 안정성이 유지되는 반면 증류수 혼합물은 점차 낮아지는 형광신호를 보였다.
또한, 도 9 및 도 10을 참조하면, ICG-HSA-PMMA 미립구 입자를 히알루론산 용액에 혼합할 경우, 상기 용액에 의하여 미립구 입자의 생체내 조직 잔류성이 향상되는 것을 확인할 수 있다. 상기 히알루론산은 생체 내에 주입된 복합체를 서로 모아주고 형광 신호를 증가시켜주는 역할을 수행하여, 생체에 주입된 복합체가 확산되는 것을 최대한 방지할 수 있으며 수 개월까지 높은 형광신호를 얻게 해준다. 따라서 본 발명의 복합체의 주사제 조성은 히알루론산을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 목적 병변 표지용 조성물은 목적 병변에 주사되면 수 개월까지 지속적으로 머물며 표지 병변의 위치, 크기 등을 수술 중에 실시간으로 검출할 수 있어, 목적 병변의 외과적 수술의 성공률을 향상시킬 뿐만 아니라, 정상조직의 과다한 손실을 방지할 수 있으므로, 효과적인 수술 표지자로서 널리 활용될 수 있다. 실험에서 최대 20주의 촬영결과만을 개시하였으나, 이는 동물복지 관련 실험규정에 따른 실험종료 등 기타사정에 의한 것이었으며, ICG-HAS-PMMA 미립구의 형광은 25주까지도 잘 유지됨을 확인할 수 있었다. 추가로 그래프에 표현하지 않았으나 미립구의 형광은 in vitro상태에서는 1년이상 지속됨을 확인하였다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다.
따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (24)
- 생체 친화적 고분자 및 생체 조직 염색용 색소를 포함하는 미립구 입자; 및
상기 미립구 입자의 표면에 코팅된 표면개질제;를 포함하고,
표지 부위 수술 중 목적 병변에 직접적으로 투여되어 실시간으로 목적 병변의 크기 및 위치를 확인하기 위한, 목적 병변 표지용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 생체 친화적 고분자는 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), PMMA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체(polylactic acid-polyglycolic acid copolymer, PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(poly-ε-caprolactone, PCL), 락트산-ε-카프로락톤 공중합체(lactic acid-ε-caprolactone copolymer, PLCL), 폴리다이옥산온(polydioxanone, PDO), 폴리트라이메틸렌카보네이트(polytrimethylene carbonate, PTMC), 폴리아미노산(polyamino acid), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리포스파진(polyphosphazene), 폴리이미노카보네이트(polyiminocarbonate), 폴리포스포에스테르(polyphosphoester), 폴리하이드록시발레이트(polyhydroxyvalate), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 생체 조직 염색용 색소는 육안으로 확인 가능한 색소 또는 형광 색소인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 육안으로 확인 가능한 색소는 중성적, 나일청, 비스마르크브라운, 리튬카민, 트리판블루, 야누스그린, 메틸 바이올렛, 오-라민, 마라가이트 그린, 사프라닌, 에오신, 콩고레드, 에리스로신, 니그로신, 알시안블루 헤마톡실린, 아닐린블루, 라이트그린 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 형광 색소는 근적외선 형광 색소인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 형광 색소는 인도시아닌그린(indocyanine green, ICG)인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 형광 색소는 단독으로 또는 생체 단백질과 컨쥬게이션(conjugation)되는 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 표면개질제는 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen) 및 이들의 혼합물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 미립구 입자는 생체 단백질을 더 포함하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 생체 단백질은 알부민(albumin)인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 미립구 입자는 10 내지 100 ㎛의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 평균 밀도가 1 내지 3 g/㎕인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물. - 생체 친화적 고분자가 첨가된 유기 용매와 생체 조직 염색용 색소가 첨가된 증류수를 혼합하는 단계; 및
상기 혼합한 용액을 표면개질제가 첨가된 수용성 용매에 투입 후 교반하여 미립구 입자를 형성하는 단계;를 포함하고,
상기 미립구 입자 표면에는 상기 표면개질제가 코팅되는 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법. - 제13항에 있어서,
상기 교반 용액을 세척하고 필터링하여 특정한 크기의 미립구 입자를 선택하는 단계;를 더 포함하는, 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법. - 제13항에 있어서,
상기 증류수는 생체 조직 염색용 색소-생체 단백질 결합체가 더 첨가된 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법. - 제13항에 있어서,
상기 유기 용매는 디클로로메테인(Dichloromethane, DCM), 오쏘크실렌(o-xylene), 메타크실렌(m-xylene), 파라크실렌(p-xylene) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법. - 제13항에 있어서,
상기 생체 조직 염색용 색소의 농도는 1 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법. - 제13항에 있어서,
상기 수용성 용매는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidonem, PVP), 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA), 폴리아크릴아미드(polyacryl amide, PAAm), 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트(polyhydroxyethyl methacrylate, PHEMA), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법. - 제13항에 있어서,
상기 수용성 용매의 농도는 0.1 내지 10 % w/w이고, 상기 표면개질제의 농도는 0.01 내지 0.3 % w/v인 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 조성물의 제조 방법. - 제1항의 목적 병변 표지용 조성물; 및
평균 분자량이 0.5 내지 3.0 MDa인 히알루론산(Hyaluronic acid; HA)를 포함하는, 목적 병변 표지용 주사제 조성물. - 제20항에 있어서,
상기 주사제 조성물 100 중량%에 대하여, 히알루론산(hyaluronic acid; HA)은 0.3 내지 1 중량%로 포함되는 것인, 목적 병변 표지용 주사제 조성물. - 제20항에 있어서,
상기 히알루론산(Hyaluronic acid; HA)는 상온에서 24 내지 1500 cps의 점도를 가지는 것인, 목적 병변 표지용 주사제 조성물. - 제20항에 있어서,
상기 주사제 조성물이 주사된 목적 병변은 4 내지 12 개월 동안 표지가 유지되는 것을 특징으로 하는, 목적 병변 표지용 주사제 조성물. - 제1항의 목적 병변 표지용 조성물을 목적 병변 또는 목적 병변 주변에 직접적으로 투여하는 단계; 및
상기 목적 병변 표지용 조성물이 투여된 조직으로부터 색이 변화되는 위치를 목적 병변으로 인지하여, 표지 부위 수술 중에 실시간으로 확인하는 단계;를 포함하는, 목적 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법.
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