KR20230107630A - Aldh2의 발현을 저해하기 위한 화학적 변형 - Google Patents

Aldh2의 발현을 저해하기 위한 화학적 변형 Download PDF

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밥 데일 브라운
헨리크 티. 두덱
우차브 삭세나
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다이서나 파마수이티컬, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 알코올 중독을 치료하기 위한, ALDH2 발현을 감소시키는 데 유용한 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드, 조성물 및 방법에 관한 것이다. ALDH2 발현의 감소를 위한 개시된 올리고뉴클레오타이드는 향상된 약리학적 특성을 위해 변형된다.

Description

ALDH2의 발현을 저해하기 위한 화학적 변형
기술분야
본 출원은 알코올 중독 및 관련된 병태의 치료를 위한 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
서열목록에 대한 참조
서열목록은 파일명이 DRNA074_ST25.txt이고, 생성일이 2020년 11월 13일이며, 용량이 19 킬로바이트인, ASCII 형식의 텍스트 파일로서 본 명세서와 동시에 제출된다. 서열목록의 전자 형식에서 정보는 본 명세서의 부분이며, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
알코올 중독은 알코올 남용, 알코올 사용 장애 또는 알코올 의존증으로서 분류될 수 있다. 알코올 사용 장애(AUD)는 미국 및 전세계적으로 대단히 만연해 있으며, 비용이 들고, 종종 치료되지 않는 병태를 나타낸다. 약물요법은 종종 AUD를 치료하고 이런 쇠약성 장애에 대한 임상 결과를 개선시키기 위한 유망한 방안을 제공한다. AUD를 치료하기 위한 신규한 의약에 대한 큰 요구가 있다. 본 개시내용은 알데하이드 탈수소효소 2(ALDH2) 저해를 통해 AUD를 치료하기 위한 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드를 제시한다.
본 발명은 지속 가능한 RNAi-기반 ALDH2 저해제를 생성하는 강력한 올리고뉴클레오타이드의 개발에 적어도 부분적으로 기반한다. 본 개시내용의 특정 양상은 대상체의 알코올 중독을 치료하기 위한 올리고뉴클레오타이드의 화학적 변형 및 관련된 방법에 관한 것이다.
AUD를 치료하기 위한 기존의 약제학적 접근은 알데하이드 탈수소효소-2(ALDH2) 저해제인 날트렉손, 아캄프로세이트 및 다이설피람을 포함한다. ALDH2는 보존된 해독 미토콘드리아 효소이며, 특히 알데하이드의 대사에 관련된다. 에탄올("알코올")의 전신 대사는 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase: ADH)에 의해 아세트알데하이드로 첫 번째 대사로 개시되고, 이어서, ALDH2에 의해 아세테이트로 된다. 추가적으로, ALDH2는 산화스트레스 하에 생성된 지질과산화 생성물, 예컨대, 4-하이드록시-2-노넨알 및 말론다이알데하이드를 산화시키는 데 중요한 역할을 한다. 주로 동아시아 혈통인 세계 인구의 약 8%는 기능하지 않는 ALDH2 효소를 암호화하는 ALDH2*2 대립유전자를 보유하여, 알코올 소비 후 혈액 및 기관, 예컨대, 간 및 뇌에서 아세트알데하이드 축적을 초래한다. 이들 개체에서, 아세트알데하이드 축적은 안면 홍조, 및 불쾌한 느낌, 예컨대, 구역, 두통, 심장 두근거림 및 전반적인 불편함을 야기한다. 대사의 이런 어려움으로 인해, ALDH2-결핍 개체는 AUD 발생 위험이 더 낮다. 이런 이유로, ALDH2 활성을 특이적 및 가역적으로 저해하는 것을 목표로 하는 접근은 AUD의 치료에 큰 관심을 가질 것이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드의 화학적 변형은 놀랍게 향상된 화학적 안정성 및 감소된 제조 비용을 제공한다. 특정 실시형태에서, 화학적 변형은 플루오린 함량을 감소시키는 것을 포함한다(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 Weimin Wang 등의 PCT/US20/53999 참조). 특정 실시형태에서, 감소된 플루오린 함량은 제조 수율을 증가시켜, 비용을 상당히 낮춘다. 특정 실시형태에서, 플루오린 함량의 감소는 탈플루오린(defluorination) 불순물을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 강력하고 안정적인 RNAi 올리고뉴클레오타이드는 ALDH2 활성을 감소시켜, 알코올 내성 및/또는 알코올 소비의 갈망을 감소시키는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오타이드는 선행 올리고뉴클레오타이드에 비해, 특징 중에서도, 효력 유지, 작용 지속기간의 유지 또는 증가, 높은 치료지수의 유지, 안정성 개선, 생체 이용 가능성 개선, 표적화 개선, 제조의 용이함, 더 낮은 독성 및/또는 다른 개선된 약리학적 특성을 갖는다.
알코올 대사에 관련된 주요 효소는 알코올 탈수소효소(ADH) 및 알데하이드 탈수소효소(ALDH)이다. 효소 둘 다 상이한 유전자에 의해 암호화되는 여러 형태로 생기며; 또한, 상이한 특징을 갖는 효소를 암호화하고 인종 집단에 의해 상이한 집단 분포를 갖는 이들 유전자 중 일부의 변이체(즉, 대립유전자)가 있다. 사람이 지니는 ADH 또는 ALDH 대립유전자는 그 또는 그녀의 알코올 소비 수준 및 알코올 중독 위험에 영향을 미친다. 지금까지 연구자들은 얻어진 효소의 변경된 동력학 특성과 연관된 ADH1B, ADH1C 및 ALDH2 유전자의 암호화 변이체를 주로 연구하였다.
본 개시내용의 일 양상은 ALDH2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오타이드, 즉, 5'에서 3'까지 UAAACUGAGUUUCAUCCACCGG(서열번호 1)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 5'에서 3'까지 GGUGGAUGAAACUCAGUUUAGCAGCCGAAAGGCUGC(서열번호 2)에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오타이드가 변형된다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2'-변형은 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸이다. 일부 실시형태에서, 다음의 위치: 센스 가닥의 1 내지 7번 및 12 내지 36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 6, 8 내지 13 및 15 내지 22번 위치 중 하나 이상은 2'-O-메틸에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 1 내지 7번 및 12 내지 36번 위치 및 안티센스 가닥의 1, 6, 8 내지 13 및 15 내지 22번 위치 모두는 2'-O-메틸에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 다음의 위치: 센스 가닥의 8 내지 11번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2 내지 5, 7 및 14번 위치 중 하나 이상은 2'-플루오로에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 8 내지 11번 위치 및 안티센스 가닥의 2 내지 5, 7 및 14번 위치 모두는 2'-플루오로에 의해 변형된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2번과 3번 위치, 안티센스 가닥의 3번과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20번과 21번 위치 및 안티센스 가닥의 21번과 22번 위치 중 하나 이상 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2번과 3번 위치, 안티센스 가닥의 3번과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20번과 21번 위치 및 안티센스 가닥의 21번과 22번 위치의 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 첫 번째 위치에서 유리딘은 포스페이트 유사체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 1번 위치에서 다음의 구조식을 포함한다:
Figure pct00001
.
일부 실시형태에서, 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 A 뉴클레오타이드의 각각은 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시형태에서, ademA GalNAc는 하기 구조식을 나타낸다:
Figure pct00002
일부 실시형태에서, ALDH2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오타이드는 5'에서 3'까지 UAAACUGAGUUUCAUCCACCGG(서열번호 1)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 5'에서 3'까지 GGUGGAUGAAACUCAGUUUAGCAGCCGAAAGGCUGC(서열번호 2)에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하되,
센스 가닥의 1 내지 7번 및 12 내지 36번 위치 및 안티센스 가닥의 1, 6, 8 내지 13 및 15 내지 22번 위치는 모두 2'-O-메틸에 의해 변형되고, 센스 가닥의 8 내지 11번 위치 및 안티센스 가닥의 2 내지 5, 7 및 14번 위치 모두는 2'-플루오로에 의해 변형되며;
올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2번과 3번 위치, 안티센스 가닥의 3번과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20번과 21번 위치 및 안티센스 가닥의 21번과 22번 위치의 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
올리고뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 1번 위치에서 다음의 구조식을 포함하고:
Figure pct00003
, 그리고
센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 아데노신(A) 뉴클레오타이드의 각각은 하기 구조식을 포함하는 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다:
Figure pct00004
.
본 개시내용의 다른 양상은 본 명세서에 기재된 임의의 올리고뉴클레오타이드 및 Na+ 반대이온을 포함하는 조성물을 제공한다.
도 3에 도시된 바와 같은 화학 구조식을 갖는 조성물이 또한 제공된다.
본 개시내용의 다른 양상은 본 개시내용의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에서 감소된 에탄올 내성을 초래한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에 의한 에탄올 섭취의 저해를 초래한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 에탄올 소비에 대한 대상체의 갈망 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 알코올 중독을 앓고 있다.
본 명세서에 혼입되고 본 명세서의 부분을 구성하는 수반하는 도면은 특정 실시형태를 예시하며, 기재된 설명과 함께, 조성물의 특정 양상 및 본 명세서에 개시된 방법의 비제한적 예를 제공하는 역할을 한다.
도 1은 GalNAc-접합 ALDH2 올리고뉴클레오타이드의 생체내 활성 평가에 대한 2'-OMe 치환의 영향을 나타내는 그래프이다. 올리고뉴클레오타이드는 0.5 ㎎/㎏로 마우스에게 피하로 투여되었다. 데이터는 PBS 대조군에 정규화된 투여 후 제4일에 남아있는 ALDH2 mRNA의 양을 나타낸다.
도 2는 비인간 영장류(NHP)에서 상이한 변형 패턴을 갖는 GalNAc-접합 ALDH2 올리고뉴클레오타이드의 지속 연구 결과를 나타내는 그래프이다. 단일 용량(3 ㎎/㎏)의 올리고뉴클레오타이드는 비인간 영장류에게 피하로 투여되었다. 데이터는 투여 전 ALDH2 mRNA의 양에 비해 투여 후 4-, 8-, 12- 및 16-주에 남아있는 ALDH2 mRNA의 양을 나타낸다.
도 3은 개시된 올리고뉴클레오타이드의 구조식 및 화학적 변형 패턴을 도시하는 개략도이다.
본 개시내용의 양상은 더 양호한 효력 및 지속성을 갖는 세포, 특히, 알코올 중독의 치료를 위한 간 세포(예를 들어, 간세포)에서 ALDH2 발현을 감소시키기 위한 화학적 변형 패턴을 포함하는 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, RNA 간섭 올리고뉴클레오타이드)를 제공한다. 따라서, 관련된 양상에서, 본 개시내용은 간에서의 ALDH2 유전자 발현을 선택적으로 감소시키는 단계를 수반하는 알코올 중독의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오타이드를 표적화하는 ALDH2는 대상체에서 알코올 중독을 치료하기 위해 표적 조직의 세포(예를 들어, 간 세포)에 전달되도록 설계되며, 올리고뉴클레오타이드는 축퇴에 대해 증가된 저항성을 갖고/갖거나 선택된 세포에서 증가된 지속기간을 나타낸다.
뇌를 포함하는 상이한 기관에 대한 섭취되는 알코올 음료(즉, 에탄올)의 효과는 달성되는 에탄올 농도 및 노출의 지속기간에 따른다. 변수 둘 다 차례로 혈류 및 조직에의 에탄올 흡수에 의해서 뿐만 아니라 에탄올 대사에 의해 영향받는다(Hurley et al., "The pharmacogenomics of alcoholism," In: Pharmacogenomics: The Search for Individualized Therapies., Weinheim, Germany: Wiley-VCH, pp. 417-441 (2002)). 에탄올 대사의 주된 부위는 간이지만, 일부 대사는 또한 다른 조직에서 일어나며, 거기서 국소 손상을 야기할 수 있다. 에탄올 대사의 주된 경로는 알코올 탈수소효소로 알려진 효소에 의해 매개되는(즉, 촉매되는) 반응인 에탄올의 아세트알데하이드로의 전환(즉, 산화)를 수반한다. 본 발명에 따르면, 이들 알코올 탈수소효소 중 하나 이상, 바람직하게는 ALDH2의 발현 저해는 알코올을 분해하는 대상체의 능력을 막거나 또는 제거하여 - 인간에서 이를 섭취하는 것과 관련된 '높음'의 예방으로 이어진다.
에탄올 대사물질 아세트알데하이드의 해독작용을 위한 중요한 효소인 알데하이드 탈수소효소 2(ALDH2)는 알코올 사용 장애(AUD)를 치료하기 위한 잠재적인 치료적 표적으로서 인식되었다. 강력한 ALDH2 저해제인 다이설피람은 AUD의 치료를 위한 승인된 약물이지만, 이의 부작용으로 인해 임상적 제한이 있다. 기관계 기여에 관해, 간은 아세트알데하이드 대사를 초래하는 주된 기관이며, 다른 기관으로부터의 ALDH2의 누적효과는 또한 전신 아세트알데하이드 제거율에 기여할 가능성이 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따르면, siRNA를 통한 ALDH2 발현의 간-표적화된 넉다운은 알코올 선호를 감소시킬 수 있고, AUD의 치료를 위한 기초일 수 있다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 제조 동안 수율 증가 및 불순물 저하와 함께 ALDH2 표적화 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
추가 양상에서, ALDH2 표적화 올리고뉴클레오타이드는 감소된 플루오린 함량을 갖는다. 일부 양상에서, 피리미딘 염기의 플루오린 함량은 감소된다.
정의된 용어를 포함하는 개시내용의 추가 양상은 이하에 제공된다.
I. 정의
알코올 중독: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어, "알코올 중독"은 내성, 금단 및/또는 제어할 수 없는 알코올 소비 충동과 조합되거나 조합되지 않을 수 있는 재발성 역결과에도 불구하고 개체에 의한 에탄올의 반복적 사용을 지칭한다. 알코올 중독은 알코올 남용, 알코올 사용 장애 또는 알코올 의존증으로서 분류될 수 있다. 알코올 중독을 앓고 있는 개체를 확인하기 위해 다양한 접근이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세계보건기구는 의존성을 비롯한 잠재적 알코올 오용을 식별하기 위한 도구로서 알코올 사용 장애 식별 검사(Alcohol Use Disorders Identification Test: AUDIT)를 확립하였고, 미시간 알코올 선별 검사(Michigan Alcohol Screening Test: MAST)를 비롯한 다른 유사한 검사가 개발되었다. 실험실 검사는 감마-글루타밀 전이효소(GGT), 평균 적혈구 용적(적혈구 크기), 아스파르트산 아미노 전이효소(AST), 알라닌 아미노기 전이효소(ALT), 탄수화물-결핍 전달(CDT), 에틸 글루쿠로나이드(EtG), 에틸 설페이트(EtS) 및/또는 포스파티딜에탄올(PEth) 수준을 검출하기 위한 검사를 비롯하여, 알코올 음주의 만성 사용 및/또는 재발을 검출하기 위한 혈액 마커를 평가하는 데 사용될 수 있다. 알코올 중독의 동물 모델(예를 들어, 마우스 모델)이 확립되었다(예를 들어, 문헌[Rijk et al., "A mouse model of alcoholism," Physiol Behav., 1982, 29(5):833-39; Elizabeth Brandon-Warner, et al., "Rodent Models of Alcoholic Liver Disease: Of Mice and Men," Alcohol, 2012; 46(8):715-25; 및 Adeline Bertola, et al., "Mouse model of chronic and binge ethanol feeding (the NIAAA model)," Nature Protocols, 2013, 8:627-37] 참조).
ALDH2: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "ALDH2"는 알데하이드 탈수소효소 2 패밀리(미토콘드리아) 유전자를 지칭한다. ALDH2는 알데하이드 탈수소효소 패밀리에 속하고 에탄올로부터 아세테이트(아세트산)를 합성하는 알코올 대사 산화 경로의 제2 효소로서 작용하는 단백질을 암호화한다. ALDH2의 상동체는 인간, 마우스, 래트, 비-인간 영장류 종 및 기타를 포함하는 종 범위에 걸쳐 보존된다(예를 들어, NCBI HomoloGene: 55480 참조). ALDH2는 또한, 예를 들어, ALDH1A1을 비롯한 다른 알데하이드 탈수소효소 암호화 유전자와 상동성을 갖는다. 인간에서, ALDH2는 적어도 2개의 전사체, 즉, NM_000690.3(변이체 1) 및 NM_001204889.1(변이체 2)을 암호화하며, 각각은 상이한 아이소폼, 즉, 상이한 아이소폼인 NP_000681.2(아이소폼 1) 및 NP_001191818.1(아이소폼 2)를 각각 암호화한다. 전사체 변이체 2는 전사체 변이체 1에 비해 5' 암호화 영역에서 프레임 내 엑손을 결여하고, 아이소폼 1에 비해 더 짧은 아이소폼(2)을 암호화한다. ALDH2의 다형성이 확인되었다(예를 들어, 문헌[Chang et al., "ALDH2 polymorphism and alcohol-related cancers in Asians: a public health perspective," J Biomed Sci., 2017, 24(1):19] 참조).
대략: 관심의 하나 이상의 값에 적용되는 바와 같은 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값과 같은 값을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 달리 분명하지 않다면 언급된 참조 값의 방향 중 하나에서(더 큰 또는 더 작은) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 이내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외함).
투여하는: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 (예를 들어, 대상체에서 병태를 치료하기 위해) 약리학적으로 유용한 방식으로 대상체에게 물질(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)을 제공하는 것을 의미한다.
아시알로당단백질 수용체(ASGPR): 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "아시알로당단백질 수용체" 또는 "ASGPR"은 주로 48 kDa(ASGPR-1) 및 소수의 40 kDa 서브유닛(ASGPR-2)에 의해 형성되는 이분 C-형 렉틴을 지칭한다. ASGPR은 간세포 사인곡선 모양의 표면 상에서 주로 발현되고, 결합, 내재화, 및 후속적으로, 말단의 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기(아시알로당단백질)를 함유하는 순환 당단백질의 제거에서 주된 역할을 한다.
조합: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "조합 생성물", "병용 요법", "복합요법" 등은 한 가지 초과의 치료제 또는 한 가지 초과의 의약 또는 양상을 이용하여 질환 또는 장애의 치료를 위해 사용되는 요법을 지칭한다. 조합 생성물을 포함하는 치료제는 병행하여, 간헐적으로 또는 임의의 순서로 투약될 수 있다. 조합 생성물은, 예를 들어, 2개의 올리고뉴클레오타이드 또는 항체 또는 소분자 약물과 조합된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 요법의 경우, 환자 결과를 최적화 및/또는 향상시키기 위해 사용한 각 제제의 투약량은 달라질 수 있다.
상보성: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "상보성"은 뉴클레오타이드가 서로 염기쌍을 형성하는 것을 가능하게 하는 뉴클레오타이드(예를 들어, 마주보는 핵산 상의 또는 단일 핵산 가닥의 마주보는 영역 상의 두 뉴클레오타이드) 사이의 구조적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 마주보는 핵산의 피리미딘 뉴클레오타이드에 상보성인 하나의 핵산의 퓨린 뉴클레오타이드는 서로 수소 결합을 형성함으로써 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보성 뉴클레오타이드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 방식으로 또는 안정적인 듀플렉스의 형성을 가능하게 하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 두 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 서로 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 가져서 상보성 영역을 형성할 수 있다.
데옥시리보뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "데옥시리보뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드와 비교할 때 이의 펜토스 당의 2' 위치에 수소를 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드는 당, 포스페이트 기 또는 염기에서의 또는 이들의 변형 또는 치환을 포함하는, 2' 위치 이외에서의 하나 이상의 변형 또는 치환을 갖는 데옥시리보뉴클레오타이드이다.
이중가닥 올리고뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "이중가닥 올리고뉴클레오타이드"는 실질적으로 듀플렉스 형태인 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기 짝짓기는 공유적으로 별개인 핵산 가닥의 뉴클레오타이드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기 짝짓기는 공유적으로 연결된 핵산 가닥의 뉴클레오타이드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기 짝짓기는 (예를 들어, 헤어핀을 통해) 폴딩된 단일 핵산 가닥으로부터 형성되어 함께 염기쌍을 형성하는 뉴클레오타이드의 상보성 역평행 서열을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 서로 완전히 듀플렉스된 2개의 별개의 공유적으로 별개인 핵산 가닥을 포함한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 부분적으로 듀플렉스된, 예를 들어, 하나의 말단 또는 양말단에 돌출부를 갖는 2개의 공유적으로 별개인 핵산 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 부분적으로 상보성인 뉴클레오타이드의 역평행 서열을 포함하고, 따라서, 하나 이상의 미스매치를 가질 수 있으며, 이는 내부 미스매치 또는 말단 미스매치를 포함할 수 있다.
듀플렉스: 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)에 관해 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "듀플렉스"는 뉴클레오타이드의 2개의 역평행 서열의 상보성 염기쌍을 통해 형성된 구조를 지칭한다.
부형제: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "부형제"는, 예를 들어, 목적하는 일관성 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 비-치료제를 지칭한다.
간세포: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "간세포" 또는 "간세포들"은 간의 실질 조직 세포를 지칭한다. 이들 세포는 간 덩어리의 대략 70 내지 85%를 구성하고, 혈청 알부민, 피브리노겐, 및 응고 인자(인자 3 및 4를 제외)의 프로트롬빈 그룹을 생산한다. 간세포 계통의 세포에 대한 마커는 트란스타이레틴(Ttr), 글루타민 합성효소(Glul), 간세포 핵인자 1a(Hnf1a) 및 간세포 핵인자 4a(Hnf4a)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 성숙 간세포에 대한 마커는 사이토크롬 P450(Cyp3a11), 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소(Fah), 글루코스 6-포스페이트(G6p), 알부민(Alb) 및 OC2-2F8을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Huch et al., Nature, 2013, 494(7436):247-50]을 참조하며, 간세포 마커에 관한 이의 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
루프: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "루프"는, 적절한 혼성화 조건 하에서(예를 들어, 인산염 완충제 중, 세포에서), 짝지어지지 않은 영역에 측접하는 두 역평행 영역이 혼성화되어 듀플렉스("줄기"로 지칭됨)를 형성하도록, 서로 충분히 상보성인 핵산의 두 역평행 영역에 측접되는 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)의 짝지어지지 않은 영역을 지칭한다.
변형된 뉴클레오타이드간 결합: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "변형된 뉴클레오타이드간 연결"은 포스포다이에스터 결합을 포함하는 참조 뉴클레오타이드간 연결에 비해 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오타이드간 연결을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 비천연 유래 연결이다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오타이드간 연결은 변형된 뉴클레오타이드간 연결이 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드는 열안정성, 분해에 대한 저항성, 뉴클레오타이드 저항성, 가용성, 생체이용률, 생체활성, 감소된 면역원성 등을 개선시킬 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 아데닌 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 사이토신 리보뉴클레오타이드, 유라실 리보뉴클레오타이드, 아데닌 데옥시리보뉴클레오타이드, 구아닌 데옥시리보뉴클레오타이드, 사이토신 데옥시리보뉴클레오타이드 및 티미딘 데옥시리보뉴클레오타이드로부터 선택된 대응하는 참조 뉴클레오타이드에 비해 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 비천연 유래 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 이의 당, 핵염기 및/또는 포스페이트 기에서 하나 이상의 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 대응하는 참조 뉴클레오타이드에 접합된 하나 이상의 화학적 모이어티를 갖는다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드가 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드는 열안정성, 분해에 대한 저항성, 뉴클레오타이드 저항성, 가용성, 생체이용률, 생체활성, 감소된 면역원성 등을 개선시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 리보스 고리의 2' 위치에 2'-O-메틸 또는 2'-F 치환을 포함한다.
틈이 난(nicked) 테트라루프 구조: "틈이 난 테트라루프 구조"는, 2개의 가닥이 듀플렉스를 형성하도록 센스 가닥이 안티센스 가닥에 상보성인 영역을 갖고, 연장부가 테트라루프 및 2개의 자기-상보성 서열을 함유하여 테트라루프에 인접한 줄기 영역을 형성하는 듀플렉스로부터 가닥, 일반적으로 센스 가닥 중 적어도 하나가 연장되며, 테트라루프는 적어도 하나의 가닥의 자기-상보성 서열에 의해 형성되는 인접한 줄기 영역을 안정화시키도록 구성된, 별개의 센스(승객) 및 안티센스(가이드) 가닥의 존재를 특징으로 하는 RNAi 올리고뉴클레오타이드의 구조이다.
올리고뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 짧은 핵산, 예를 들어, 100개 미만의 뉴클레오타이드 길이를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 및/또는, 예를 들어, 변형된 리보뉴클레오타이드를 비롯한 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 듀플렉스 영역을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다. 비제한적 예의 세트로서, 올리고뉴클레오타이드는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 다이서(dicer) 기질 간섭 RNA (dsiRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 짧은 siRNA 또는 단일가닥 siRNA일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 RNAi 올리고뉴클레오타이드이다.
돌출부: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "돌출부"는 하나의 가닥 또는 영역과 함께 듀플렉스를 형성하는 상보성 가닥의 말단을 지나서 연장되는 하나의 가닥 또는 영역으로부터 초래되는 말단의 비-염기쌍 뉴클레오타이드(들)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 돌출부는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 듀플렉스 영역으로부터 연장되는 하나 이상의 짝지어지지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌출부는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 상의 3' 또는 5' 돌출부이다.
약제학적으로 허용 가능한: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 생물학적이지도 않고 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 화합물 또는 조성물을 지칭하며, 인간 약제 및 수의학적 용도로 허용 가능한 화합물 또는 조성물을 포함한다. 화합물 또는 조성물은 규제기관에 의해 승인되거나 또는 승인 가능하거나 또는 미국 약전 또는 인간을 비롯한 동물에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 염: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생리적 및 약제학적으로 허용 가능한 염: 즉, 모 올리고뉴클레오타이드의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 이에 대해 원치않는 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 아쥬반트: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 아쥬반트"는 적어도 1종의 치료제(예를 들어, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드)와 함께 대상체에게 투여될 수 있고, 이의 약리학적 활성을 파괴하지 않으며 일반적으로 안전하고, 비독성이며 치료적 양의 제제를 전달하는 데 충분한 용량으로 투여될 때 생물학적이지도 않고 달리 바람직하지 않은 것도 아닌 부형제, 담체 또는 아쥬반트를 지칭한다.
포스페이트 유사체: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "포스페이트 유사체"는 포스페이트 기의 정전기적 및/또는 입체적 특성을 모방하는 화학 모이어티를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 유사체는 종종 효소 제거에 민감한 5'-포스페이트를 대신해서 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 뉴클레오타이드에 위치된다. 일부 실시형태에서, 5' 포스페이트 유사체는 포스파타제-저항성 연결을 함유한다. 포스페이트 유사체의 예는 5' 포스포네이트, 예컨대, 5' 메틸렌포스포네이트(5'-MP) 및 5'-(E)-비닐포스포네이트(5'-VP)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단의 뉴클레오타이드에서 당("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)의 4'-탄소 위치에 포스페이트 유사체를 갖는다. 4'-포스페이트 유사체의 예는, 옥시메틸기의 산소 원자가 당 모이어티에(예를 들어, 이의 4'-탄소에) 또는 이의 유사체에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 예를 들어, 2017년 9월 1일자로 출원된 국제 특허 출원 공개 PCT/US2017/049909, 2016년 9월 2일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 제62/383,207호, 및 2016년 9월 12일자로 출원된 제62/393,401호를 참조하며, 포스페이트 유사체에 관한 이들 각각의 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단의 경우 다른 변형이 발생되었다(예를 들어, WO 2011/133871; 미국 특허 제8,927,513호; 및 문헌[Prakash et al., Nucleic Acids Res., 2015, 43(6):2993-3011]을 참조하며, 포스페이트 유사체에 관한 이들 각각의 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다).
감소된 발현: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 유전자의 "감소된 발현"은 적절한 참조 세포 또는 대상체에 비해, 유전자에 의해 암호화된 RNA 전사체 또는 단백질 양의 감소 및/또는 세포 또는 대상체에서의 유전자 활성량의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, ALDH2 mRNA 서열에 상보성인 안티센스 가닥을 갖는 것)로 세포를 치료하는 행동은 이중가닥 올리고뉴클레오타이드로 치료되지 않은 세포에 비해 RNA 전사체, 단백질 및/또는 효소 활성(예를 들어, ALDH2 유전자)의 양의 감소를 초래한다. 유사하게, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "발현을 감소시키는"은 유전자(예를 들어, ALDH2)의 감소된 발현을 초래하는 행동을 지칭한다.
상보성 영역: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "상보성 영역"은 적절한 혼성화 조건 하에서, 예를 들어, 포스페이트 완충제, 세포 등에서, 뉴클레오타이드의 두 서열 사이의 혼성화를 가능하게 하도록 뉴클레오타이드의 역평행 서열(예를 들어, mRNA 내의 표적 뉴클레오타이드 서열)에 충분히 상보성인 핵산의 뉴클레오타이드(예를 들어, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드)의 서열을 지칭한다. 상보성 영역은 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, mRNA 또는 이의 일부 내에 존재하는 표적 뉴클레오타이드 서열)에 완전히 상보성일 수 있다. 예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열에 완전히 상보성인 상보성 영역은 임의의 미스매치 또는 갭 없이 mRNA에 대응하는 서열에 상보성인 뉴클레오타이드의 인접한 서열을 갖는다. 대안적으로, 상보성 영역은 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, mRNA 또는 이의 일부에 존재하는 뉴클레오타이드 서열)에 부분적으로 상보성일 수 있다. 예를 들어, mRNA에 존재하는 뉴클레오타이드 서열에 부분적으로 상보성인 상보성 영역은 mRNA의 대응하는 서열에 비해 mRNA에서 대응하는 서열에 상보성이지만 하나 이상의 미스매치 또는 갭(예를 들어, 1, 2, 3개 이상의 미스매치 또는 갭)을 함유하는 뉴클레오타이드의 인접한 서열을 갖고, 단, 상보성 영역은 적절한 혼성화 조건 하에서 mRNA와 여전히 혼성화할 수 있다.
리보뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "리보뉴클레오타이드"는 2' 위치에 하이드록실기를 함유하는 리보스를 펜토스 당으로서 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 변형된 리보뉴클레오타이드는 리보스, 포스페이트 기 또는 염기에서의 또는 이들의 변형 또는 치환을 포함하는, 2' 위치 이외에서의 하나 이상의 변형 또는 치환을 갖는 리보뉴클레오타이드이다.
RNAi 올리고뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "RNAi 올리고뉴클레오타이드"는 (a) 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 부분이 표적 mRNA의 절단에서 Argonaute 2(Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 센스 가닥(승객) 및 안티센스 가닥(가이드)을 갖는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드, 또는 (b) 해당 안티센스 가닥(또는 안티센스 가닥의 부분)이 표적 mRNA의 절단에서 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는, 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 중 하나를 지칭한다.
가닥: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "가닥"은 뉴클레오타이드간 연결(예를 들어, 포스포다이에스터 연결, 포스포로티오에이트 연결)을 통해 함께 연결된 뉴클레오타이드의 단일 인접 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 가닥은 2개의 자유 말단, 예를 들어, 5'-말단 및 3'-말단을 갖는다.
대상체: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 마우스, 토끼 및 인간을 비롯한 임의의 포유류를 의미한다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 용어 "개체" 또는 "환자"는 인간 대상체를 지칭한다.
합성: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "합성"은 인공적으로 합성된(예를 들어, 기계(예를 들어, 고체 상태 핵산 합성기)를 이용하여) 또는 분자를 정상적으로 생성하는 천연 공급원(예를 들어, 세포 또는 유기체)으로부터 달리 유래되지 않은 핵산 또는 다른 분자를 지칭한다.
표적화 리간드: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "표적화 리간드"는 관심 조직 또는 세포의 동족 분자(예를 들어, 수용체)에 선택적으로 결합하고, 관심의 조직 또는 세포에 다른 물질을 표적화하는 목적을 위해 다른 물질에 접합 가능한 분자(예를 들어, 탄수화물, 아미노당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 관심의 특정 조직 또는 세포에 올리고뉴클레오타이드를 표적화하는 목적을 위해 올리고뉴클레오타이드에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 세포 표면 수용체에 선택적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 올리고뉴클레오타이드에 접합될 때, 세포 표면 상에서 발현되는 수용체에 대한 선택적 결합을 통한 특정 세포 내로의 올리고뉴클레오타이드의 전달, 및 올리고뉴클레오타이드, 표적화 리간드 및 수용체를 포함하는 세포에 의한 엔도솜 내재화를 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는, 올리고뉴클레오타이드가 세포에서 표적화 리간드로부터 방출되도록, 세포 내재화 후에 또는 세포 내재화 동안에 절단되는 링커를 통해 올리고뉴클레오타이드에 접합된다.
테트라루프: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "테트라루프"는 뉴클레오타이드의 측접 서열의 혼성화에 의해 형성되는 인접한 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 루프를 지칭한다. 안정성의 증가는, 평균적으로, 뉴클레오타이드의 무작위 선택된 서열로 이루어진 비슷한 길이의 루프 세트로부터 예상된 인접한 줄기 듀플렉스의 Tm 보다 더 높은 인접한 줄기 듀플렉스의 용융 온도(Tm)의 증가로서 검출 가능하다. 예를 들어, 테트라루프는 10 mM NaHPO4 중 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 용융 온도를 적어도 2개 염기쌍 길이의 듀플렉스를 포함하는 헤어핀에 부여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 테트라루프는 스태킹(stacking) 상호작용에 의해 인접한 줄기 듀플렉스에서 염기쌍을 안정화시킬 수 있다. 또한, 테트라루프에서 뉴클레오타이드 간의 상호작용은 비-왓슨-크릭 염기 짝짓기, 스태킹 상호작용, 수소 결합 및 접촉 상호작용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Cheong et al., Nature, 1990 346(6285):680-82; Heus and Pardi, Science, 1991, 253(5016):191-94). 일부 실시형태에서, 테트라루프는 3 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어지고, 전형적으로 4 내지 5개의 뉴클레오타이드이다. 특정 실시형태에서, 테트라루프는 변형될 수도 있고 변형되지 않을 수도 있는(예를 들어, 표적화 모이어티에 접합될 수도 있고 접합되지 않을 수도 있는) 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 테트라루프에서 임의의 뉴클레오타이드가 사용될 수 있으며, 이러한 뉴클레오타이드에 대한 표준 IUPAC-IUB 기호는 문헌[Cornish-Bowden, Nucl. Acids Res., 1985, 13:3021-3030]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 글자 "N"은 임의의 염기가 해당 위치에 있을 수 있다는 것을 의미하기 위해 사용될 수 있고, 글자 "R"은 A(아데닌) 또는 G(구아닌)가 해당 위치에 있을 수 있다는 것을 나타내기 위해 사용될 수 있으며, "B"는 C(사이토신), G (구아닌) 또는 T(티민)이 해당 위치에 있을 수 있다는 것을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 테트라루프의 예는 테트라루프의 UNCG 패밀리(예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리(예를 들어, GAAA) 및 CUUG 테트라루프를 포함한다(Woese et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1990, 87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19(21):5901-5). DNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리(예를 들어, d(GTTA)), 테트라루프의 d(GNRA) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리, 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리(예를 들어, d(TTCG))를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Nakano et al. Biochemistry, 2002, 41(48):14281-14292; Shinji et al., Nippon Kagakkai Koen Yokoshu, Vol 78th, No. 2, 페이지 731 (2000)]을 참조하며, 이들의 관련 개시내용에 대해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, 테트라루프는 틈이 난 테트라루프 구조 내에 함유된다.
치료하다: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다"는, 기존의 병태(예를 들어, 질환, 장애)에 대해 대상체의 건강상태 및/또는 웰빙을 개선시키기 위한 목적을 위해 또는 병태 발생의 가능성을 방지하거나 감소시키기 위해, 예를 들어, 치료제(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)의 투여를 통해 치료를 필요로 하는 대상체에게 보살핌을 제공하는 작용을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료는 대상체에 의해 경험되는 병태(예를 들어, 질환, 장애)의 적어도 하나의 징후, 증상 또는 기여 인자의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것에 관한 것이다.
II. 올리고뉴클레오타이드-기반 저해제
i. ALDH2 표적화 올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 서열 UAAACUGAGUUUCAUCCACCGG(서열번호 1)를 갖는 가이드(안티센스) 가닥을 갖는다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥이 제공된다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 이의 3' 말단에 줄기-루프를 포함한다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥은 (예를 들어, 이의 3'-말단에) S1-L-S2로 제시되는 줄기-루프를 포함하며, 이때 S1은 S2에 상보성이고, L은 2 내지 6개의 뉴클레오타이드 길이 범위에서 S1과 S2 사이에 루프를 형성한다. 일부 실시형태에서, S1과 S2 사이에 형성된 듀플렉스는 4, 5, 6, 7 또는 8개의 염기쌍 길이이다. 일부 실시형태에서, 줄기-루프의 루프(L)는 (예를 들어, 틈이 난 테트라루프 구조 내의) 테트라루프이다. 테트라루프는 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 전형적으로, 테트라루프는 4 내지 5개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 그러나, 일부 실시형태에서, 테트라루프는 3 내지 6개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이것으로 이루어지며, 전형적으로 4개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 테트라루프는 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열 GGUGGAUGAAACUCAGUUUAGCAGCCGAAAGGCUGC(서열번호 2)의 센스 가닥을 갖는다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 서열 UAAACUGAGUUUCAUCCACCGG(서열번호 1)의 안티센스 가닥 및 서열 GGUGGAUGAAACUCAGUUUAGCAGCCGAAAGGCUGC(서열번호 2)의 센스 가닥을 포함한다.
ii. 올리고뉴클레오타이드 변형
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 적합한 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 이의 염기(또는 핵염기), 당(예를 들어, 리보스, 데옥시리보스) 또는 포스페이트 기의 변형을 갖는다. 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오타이드의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 모두 또는 실질적으로 모두가 변형된다. 특정 실시형태에서, 절반 초과의 뉴클레오타이드가 변형된다. 특정 실시형태에서, 절반 미만의 뉴클레오타이드가 변형된다.
이러한 RNAi 올리고뉴클레오타이드의 화학적 변형은 분자의 이런 부류의 치료적 잠재력을 완전히 이용하는 데 필수적이다. 이들의 약물동태학적 및 약력학적 특성을 개선시키기 위해(Deleavey and Damha, Chem Biol., 2012, 19:937-954), 그리고 선천성 면역 활성화를 차단하기 위해(Judge et al., Mol Ther., 2006, 13:494-505) 다양한 화학적 변형이 발생되고 RNAi 올리고뉴클레오타이드에 적용되었다. 가장 통상적인 화학적 변형 중 하나는 뉴클레아제 분해에서의 이의 개선 때문에 리보뉴클레오타이드의 푸라노스 당의 2'-OH에 대한 것이다. 전체 듀플렉스 전체적으로 2'-O-메틸(2'-OMe)과 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F)의 조합에 의해 완전히 화학적으로 변형된 siRNA가 보고되었고, 우수한 안정성 및 RNAi 활성이 입증되었다(Morrissey et al., Hepatology, 2005, 41:1349-1356; Allerson et al., J Med Chem., 2005, 48:901-904; Hassler et al., Nucleic Acid Res., 2018, 46:2185-2\196). 보다 최근에, N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 접합된 화학적으로 변형된 siRNA는 생체내 간 세포에 대한 효과적인 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)-매개 전달이 나타났다(Nair et al., J Am Chem Soc., 2014, 136:16958-961). GalNAc 다이서-기질 접합(GalXC) 플랫폼을 포함하는 여러 GalNAc 접합 RNAi 플랫폼은 매우 다양한 인간 질환을 치료하기 위해 임상 개발이 진행되었다.
RNAi GalNAc 접합체를 비롯한 올리고뉴클레오타이드-기반 치료제의 개발에서 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드 유사체를 이용하는 것에 관한 한 가지 주된 우려는 변형과 관련된 잠재적 독성이다. 치료적 올리고뉴클레오타이드는 환자에서 서서히 분해되어, 잠재적으로 인산화되고 세포의 DNA 또는 RNA에 혼입될 수 있는 뉴클레오사이드 유사체를 방출할 수 있었다. 항바이러스 치료제 분야에서, 다수의 소분자 뉴클레오타이드 저해제의 임상 개발 동안에 독성이 나타났다(Feng et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2016, 60:806-817). 완전히 인산화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 2'-F 변형은 세포의 단백질 감소 및 이중가닥 DNA 파손을 야기하여 생체내에서 급성 간독성을 야기하는 것으로 보고되었다(Shen et al., Nucleic Acid Res., 2015, 43:4569-4578; Shen et al., Nucleic Acid Res., 2018, 46:2204-2217). RNAi 올리고뉴클레오타이드와 관련하여 2'-F 변형의 이러한 골칫거리에 대해 지금까지 관찰된 증거는 없다(Janas et al., Nucleic Acid Ther., 2016, 26:363-371; Janas et al., Nucleic Acid Ther., 2016, 27:11-22). 또한, 2'-F siRNA는 임상시험에서 잘 용인되었다. 그럼에도 불구하고, 비천연 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대, 치료적 RNA 올리고뉴클레오타이드의 2'-F 변형 뉴클레오사이드의 사용을 최소화하는 것이 여전히 바람직하다.
2'-데옥시-2'-플루오로 RNA와 달리, 2'-O-메틸 RNA는 tRNA에서 발견되는 RNA의 천연 유래 변형 및 번역 후 변형으로서 생기는 다른 작은 RNA이다. 또한 더 큰 2'-O-메틸 변형이 덜 큰 2'-F 변형에 비해 더 양호한 대사 안정성을 보여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 2'-OMe는 안정성 및 내성에 관하여 2'-F보다 선호된다. 그러나, 더 큰 2'-OMe는 RNA 단백질 결합을 방해하는 것으로 나타났고, siRNA의 서열에 적절하게 위치되지 않는다면 RNAi 활성을 저해한다(Chiu et al., RNA, 2003, 9:1034-1048; Prakash et al., J. Med Chem., 2005, 48:4247-4253; Zheng et al., FASEB J., 2013, 27:4017-4026).
RNAi 활성을 손상시키는 일 없이 안정성 및 내성이 개선될 수 있도록 추가로 2'-F 함량을 감소시키고 2'-OMe 함량을 증가시키기 위해, 양호한 효력 및 지속기간이 이미 나타난 DsiRNA 접합체에서 2'-OMe 및 2'-F 위치의 미세한 조율(변형 패턴)이 필수적이다. 21/23량체 siRNA GalNAc 접합체 플랫폼의 변형 패턴을 최적화하기 위해 최근의 보고가 시도되었다(Foster et al., Mol Ther., 2018, 26:708-17). 그러나 해당 보고는 2'-OMe 치환에 불량한 내성을 갖는 위치를 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 높은 효력 및 지속기간을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 부여하는 2'-OMe 및 2'-F의 패턴을 확인하지 않았다. 또한 보고는 본 명세서에 개시된 바와 같은 트라이루프, 펜타루프 및 테트라루프 GalXC 플랫폼에 대해 특이적으로 최소 2'-F 함량을 갖는 진보된 설계를 확인하지 못하였다.
놀랍게도, 서열이 더 많은 플루오린(예를 들어, fU)을 함유할 때, 탈플루오린 불순물은 HPLC 상의 생성물에서 상승하는 것으로 나타났고, 플루오린 함량이 감소된 (주로 fU가 없음) 변형 패턴은 절단 및 탈보호 후 탈플루오린 부산물을 나타내지 않았으며, 따라서, 제조 수율을 예상치 못하게 향상시키고, 불순물을 향상시켰다는 것이 발견되었다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는, 표 1의 서열번호 3(DP11663P)의 센스 가닥, 및 서열번호 4(DP17232G), 5(DP16279G), 6(DP16281G) 및 7(DP13488G)로부터 선택된 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 8(DP11518P)의 센스 가닥 및 서열번호 9(DP11674G)의 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 3의 센스 가닥 및 서열번호 4의 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 3의 센스 가닥 및 서열번호 5의 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 3의 센스 가닥 및 서열번호 6의 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 3의 센스 가닥 및 서열번호 7의 안티센스 가닥을 포함한다.
Figure pct00005
특정 양상에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 하기의 센스 가닥:
Figure pct00006
하기의 안티센스 가닥:
Figure pct00007
을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드; 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이며,
여기서:
뉴클레오사이드 사이의 " -"는 뉴클레오사이드간 포스포다이에스터 연결을 나타내고;
뉴클레오사이드 사이의 "-S-"는 뉴클레오사이드간 포스포로티오에이트 연결을 나타내며;
mA는 2'-O-메틸아데노신 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
mG는 2'-O-메틸구아노신 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
mC는 2'-O-메틸사이티딘 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
mU는 2'-O-메틸유리딘 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
fA는 2'-플루오로-아데노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
fG는 2'-플루오로-구아노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
fC는 2'-플루오로-사이티딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
fU는 2'-플루오로-유리딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
[ademA-GalNAc]는
Figure pct00008
를 나타내고; 그리고
[Me포스포네이트-4O-mU]는
Figure pct00009
를 나타낸다.
특정 실시형태에서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 나트륨염이다.
a. 당 변형
일부 실시형태에서, 변형된 당(본 명세서에서 당 유사체로도 지칭됨)은 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 당에서 뉴클레오타이드 변형은 2'-변형을 포함한다. 2'-변형은 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산일 수 있다. 전형적으로, 변형은 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸이다. 일부 실시형태에서, 당에서의 변형은 당 고리의 변형을 포함하며, 이는 당 고리의 하나 이상의 탄소의 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 다음의 위치: 센스 가닥의 1 내지 7번 및 12 내지 36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 6, 8 내지 13 및 15 내지 22번 위치 중 하나 이상은 2'-O-메틸에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 1 내지 7번 및 12 내지 36번 위치 및 안티센스 가닥의 1, 6, 8 내지 13 및 15 내지 22번 위치 모두는 2'-O-메틸에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 다음의 위치: 센스 가닥의 8 내지 11번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2 내지 5, 7 및 14번 위치 중 하나 이상은 2'-플루오로에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 8 내지 11번 위치 및 안티센스 가닥의 2 내지 5, 7 및 14번 위치 모두는 2'-플루오로에 의해 변형된다.
일부 실시형태에서, 말단의 3'-말단기(예를 들어, 3'-하이드록실)는 포스페이트 기 또는, 예를 들어, 링커, 어댑터 또는 표지를 부착하기 위해 사용될 수 있는 다른 기이다.
b. 5' 말단의 포스페이트
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단의 포스페이트 기는 Argonaut 2와의 상호작용을 향상시킨다. 그러나, 5'-포스페이트 기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 포스파타제 또는 이들의 생체내 생체이용률을 제한할 수 있는 다른 효소를 통해 분해에 민감하게 될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 이러한 분해에 저항성인 5' 포스페이트의 유사체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 당("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)의 4'-탄소 위치에 포스페이트 유사체를 갖는다. 예를 들어, 2017년 9월 1일자로 출원된 국제 특허 출원 공개 번호 PCT/US2017/049909(발명의 명칭: 4'-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same)를 참조하며, 포스페이트 유사체에 관한 이의 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단의 뉴클레오타이드에서 4'-포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이트 유사체는, 옥시메틸기의 산소 원자가 당 모이어티에(예를 들어, 이의 4'-탄소에) 또는 이의 유사체에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 다른 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체는, 티오메틸기의 황 원자 또는 아미노메틸기의 질소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합되는 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이다. 특정 실시형태에서, 4'-포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트이다.
특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드에 부착된 포스페이트 유사체는 메톡시 포스포네이트(MOP)이다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드에 부착된 포스페이트 유사체는 5' 모노메틸 보호된 MOP이다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 유사체를 포함하는 다음의 유리딘 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 가이드(안티센스) 가닥의 첫 번째 위치에서 사용될 수 있다:
Figure pct00010
,
변형된 뉴클레오타이드는 [Me포스포네이트-4O-mU] 또는 5'-메톡시, 포스포네이트-4'-옥시- 2'-O-메틸유리딘으로 지칭된다.
c. 변형된 뉴클레오타이드간 연결
일부 실시형태에서, 포스페이트 변형 또는 치환은 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 5개의) 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드 중 어느 하나는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 중 어느 하나의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2번과 3번 위치, 안티센스 가닥의 3번과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20번과 21번 위치 및 안티센스 가닥의 21번과 22번 위치 중 하나 이상 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1번과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2번과 3번 위치, 안티센스 가닥의 3번과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20번과 21번 위치 및 안티센스 가닥의 21번과 22번 위치의 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
iii. 표적화 리간드
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드는 특정 조직, 세포 또는 기관의 표적화를 용이하게 하기 위해, 예를 들어, 간에 대한 올리고뉴클레오타이드의 전달을 용이하게 하기 위해 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드는 간의 간세포에 대한 올리고뉴클레오타이드의 전달을 용이하게 하도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 표적화 리간드에 접합된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적화 리간드는 하나 이상의 GalNAc 모이어티이다. GalNAc는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 대한 고친화도 리간드인데, 이는 간세포 사인곡선 모양의 표면 상에서 주로 발현되고, 결합, 내재화, 및 후속적으로, 말단의 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기(아시알로당단백질)를 함유하는 순환 당단백질의 제거에서 주된 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드에 대한 GalNAc 모이어티의 접합은 이들 간세포 상에서 발현되는 ASGPR에 이들 올리고뉴클레오타이드를 표적화하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 1가 GalNAc 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 2가 GalNAc, 3가 GalNAc 또는 4가 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 3가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 올리고뉴클레오타이드는, 아래에 제시되는 바와 같이, [ademA-GalNAc] 또는 2'-아미노다이에톡시메탄올-아데닌-GalNAc로도 지칭되는 아데닌 뉴클레오타이드에 부착된 1가 GalNAc를 포함한다.
Figure pct00011
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드의 -GAAA-의 모두 3개의 아데노신 뉴클레오타이드는 각각 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시형태에서, 줄기-루프의 루프(L)의 3개의 뉴클레오타이드는 별개의 GalNAc에 각각 접합된다.
표적화 리간드를 뉴클레오타이드에 연결하기 위해 적절한 방법 또는 화학(예를 들어, 클릭 화학)이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 불안정한 링커이다. 그러나, 다른 실시형태에서, 링커는 더 안정적이다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 클릭 링커를 이용하여 뉴클레오타이드에 접합된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드에 표적화 리간드를 접합시키기 위해 아세탈-기반 링커가 사용된다. 아세탈-기반 링커는, 예를 들어, 2016년 6월 23일자로 공개된 국제 특허 출원 공개 번호 WO2016100401 A1에 개시되어 있으며, 이러한 링커에 관한 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 대상체 간의 간세포에 대한 ALDH2의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오타이드를 표적화하는 것이 바람직하다. 모이어티를 표적화하는 임의의 적합한 간세포는 본 목적을 위해 사용될 수 있다.
GalNAc는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 대한 고친화도 리간드인데, 이는 간세포 사인곡선 모양의 표면 상에서 주로 발현되고, 결합, 내재화, 및 후속적으로 말단의 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기(아시알로당단백질)를 함유하는 순환 당단백질의 제거에서 주된 역할을 한다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드에 대한 GalNAc 모이어티의 (간접적 또는 직접적) 접합은 이들 간세포 상에서 발현되는 ASGPR에 이들 올리고뉴클레오타이드를 표적화하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 1가 GalNAc에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 초과의 1가 GalNAc에 직접적 또는 간접적으로 접합된다(즉, 2, 3 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합되고, 전형적으로 3 또는 4개의 1가 GalNAc 모이어티에 접합됨). 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 2가 GalNAc, 3가 GalNAc 또는 4가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
III. 약제학적으로 허용 가능한 염
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태이다. 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 금속 또는 아민, 예컨대, 알칼리 및 알칼리토금속 또는 유기 아민에 의해 형성된다. 양이온으로서 사용되는 금속의 예는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등이다. 적합한 아민의 예는 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 다이사이클로헥실아민, 에틸렌다이아민, N-메틸글루카민 및 프로카인이다(예를 들어, 문헌[Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharma Sci., 1977, 66:1-19] 참조). 염기 부가염 형태는 통상적인 방식으로 염을 생성하기 위해 유리산 형태를 충분한 목적하는 염기와 접촉시킴으로써 제조될 수 있다. 유리산 형태는 염 형태를 산과 접촉시키고 통상적인 방식으로 유리산을 단리시킴으로써 재생될 수 있다. 유리산 형태는 극성 용매 중 가용성과 같은 특정 물리적 특성이 이들 각각의 염 형태와 다소 상이하지만, 다르게는 염은 본 발명의 목적을 위해 이들의 각각의 유리산과 동등하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약제학적 부가염"은 본 발명의 조성물의 구성성분 중 하나의 산 형태의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 이들은 아민의 유기 또는 무기산 염을 포함한다. 바람직한 산 염은 염산염, 아세트산염, 살리실산염, 질산염 및 인산염이다. 다른 적합한 약제학적으로 허용 가능한 염은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 다양한 무기산 및 유기산, 예를 들어, 무기산, 예를 들어, 염산, 브로민화수소산, 황산 또는 인산과의; 유기 카복실산, 설폰산, 설포산 또는 포스포산 또는 N-치환된 설팜산, 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 석신산, 말레산, 하이드록시말레산, 메틸말레산, 퓨마르산, 말산, 타르타르산, 락트산, 옥살산, 글루콘산, 글루카르산, 글루쿠론산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 2-페녹시벤조산, 2-아세톡시벤조산, 엠보산, 니코틴산 또는 아이소니코틴산과의; 그리고 아미노산, 예컨대, 천연에서 단백질의 합성에 수반된 20개의 알파-아미노산, 예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산과의, 또한 페닐아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 에탄-1,2-다이설폰산, 벤젠설폰산, 4-메틸벤젠설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 2- 또는 3-포스포글리세레이트, 글루코스-6-포스페이트, N-사이클로헥실설팜산과의(사이클라메이트의 형성에 의한), 또는 다른 산 유기 화합물, 예컨대, 아스코르브산과의 염기성 염을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 염 형태가 또한 약제학적으로 허용 가능한 양이온에 의해 제조될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 양이온은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 알칼리성, 알칼리토금속, 암모늄 및 4차 암모늄 양이온을 포함한다. 탄산염 또는 탄산수소가 또한 가능하다.
올리고뉴클레오타이드의 경우, 바람직한 약제학적으로 허용 가능한 염은 (a) 양이온, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예컨대, 스퍼민 및 스퍼미딘 등에 의해 형성된 염; (b) 무기산, 예를 들어 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산, 질산 등에 의해 형성된 산 부가염; (c) 유기산, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 석신산, 말레산, 퓨마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌다이설폰산, 폴리갈락투론산 등에 의해 형성된 염; 및 (d) 원소 음이온, 예컨대, 염소, 브로민 및 아이오딘으로부터 형성된 염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드의 나트륨 염 형태이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 나트륨 염의 형태이다.
IV. 제형
올리고뉴클레오타이드 사용을 용이하게 하기 위해 다양한 제형이 개발되었다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 분해를 최소화하고, 전달 및/또는 흡수를 용이하게 하는 제형을 이용하여 대상체 또는 세포환경에 전달될 수 있거나, 또는 제형 중 올리고뉴클레오타이드에 다른 유리한 특성을 제공한다. 일부 실시형태에서, ALDH2의 발현을 감소시키기 위해 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 단일가닥 또는 이중가닥 올리고뉴클레오타이드)를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 조성물은, 대상체에게 표적 세포의 근처의 환경에 또는 전신으로 투여될 때, 충분한 부분의 올리고뉴클레오타이드이 세포에 유입되어 ALDH2 발현을 감소시키도록 적합하게 제형화될 수 있다. 임의의 다양한 적합한 올리고뉴클레오타이드 제형은 본 명세서에 개시된 바와 같은 ALDH2의 감소를 위해 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 완충제 용액, 예컨대, 인산염-완충 식염수 용액, 리포솜, 마이셀 구조 및 캡시드에 제형화된다. 일부 실시형태에서, 네이키드 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 접합체는 수 중에 또는 수용액(예를 들어, pH를 조절한 물) 중에서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 네이키드 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 접합체는 염기성 완충 수용액(예를 들어, PBS) 중에 제형화된다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 이중가닥 올리고뉴클레오타이드; 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 제시하되, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥:
5'mG-S-mG-mU-mG-mG-mA-mU-fG-fA-fA-fA-mC-mU-mC-mA-mG-mU-mU-mU-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC 3'(서열번호 3), 및
안티센스 가닥:
5' [Me포스포네이트-4O-mU]-S-fA-S-fA-S-fA-fC-mU-fG-mA-mG-mU-mU-mU-mC-fA-mU-mC-mC-mA-mC-mC-S-mG-S-mG 3'(서열번호 6)을 포함하며,
여기서:
뉴클레오사이드 사이의 " -"는 뉴클레오사이드간 포스포다이에스터 연결을 나타내고;
뉴클레오사이드 사이의 "-S-"는 뉴클레오사이드간 포스포로티오에이트 연결을 나타내며;
mA는 2'-O-메틸아데노신 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
mG는 2'-O-메틸구아노신 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
mC는 2'-O-메틸사이티딘 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
mU는 2'-O-메틸유리딘 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
fA는 2'-플루오로-아데노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
fG는 2'-플루오로-구아노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
fC는 2'-플루오로-사이티딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
fU는 2'-플루오로-유리딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
[ademA-GalNAc]는
Figure pct00012
를 나타내며; 그리고
[Me포스포네이트-4O-mU]는
Figure pct00013
를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하게 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 진피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 전형적으로, 투여 경로는 정맥내 또는 피하이다.
주사 가능한 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성의 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉각적인 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 또는 피하 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, 뉴저지주 파시패니 소재) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 다수의 경우에, 조성물 중에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 및 염화나트륨을 포함하는 것이 선호될 것이다. 멸균 주사액은 위에 열거한 성분 중 하나 또는 조합물이 있는 선택된 용매 중에 필요한 양의 올리고뉴클레오타이드를 혼입하고, 필요한 경우, 이어서 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 약 0.1% 이상의 치료제(예를 들어, ALDH2 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오타이드)를 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 초 조성물의 중량 또는 용적의 약 1% 내지 약 80% 이상일 수 있다. 가용성, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관수명뿐만 아니라 기타 약리학적 고려사항과 같은 인자는 이러한 약제학적 제형을 제조하는 분야의 당업자에 의해 고려될 것이며, 이렇게 해서, 다양한 투약량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
여러 실시형태가 본 명세서에 개시된 임의의 올리고뉴클레오타이드의 간-표적화된 전달에 관한 것이지만, 다른 조직의 표적화가 또한 고려된다.
IV. 사용 방법
i. 세포에서의 ALDH2 발현의 감소
일부 실시형태에서, 세포에서 ALDH2의 발현을 감소시키는 목적을 위해 유효량의 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드 중 어느 하나를 세포에 전달하기 위한 방법이 제공된다. 본 명세서에 제공된 방법은 임의의 적절한 세포 유형에서 유용하다. 일부 실시형태에서, 세포는 ALDH2를 발현시키는 임의의 세포(예를 들어, 간세포, 대식세포, 단핵구-유래 세포, 전립선 암세포, 뇌 세포, 내분비 조직, 골수, 림프절, 폐, 담낭, 간, 십이지장, 소장, 췌장, 신장, 위장관, 방광, 지방조직 및 연조직 및 피부)이다. 일부 실시형태에서, 세포가 이의 천연 표현형 특성을 실질적으로 유지하도록, 세포는 대상체로부터 얻은 그리고 제한된 수의 계대를 겪는 1차 세포이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드가 전달되는 세포는 생체외 또는 시험관내이다(즉, 배양물 중의 세포에 또는 세포가 체류하는 유기체에 전달될 수 있다). 구체적 실시형태에서, 간세포에서만 ALDH2의 발현을 감소시키는 목적을 위해 유효량의 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드 중 어느 하나를 세포에 전달하기 위한 방법이 제공된다.
저해 결과는 세포 또는 대상체의 하나 이상의 특성을 평가하기 위해 적절한 분석에 의해, 또는 ALDH2 발현을 나타내는 분자(예를 들어, RNA, 단백질)를 평가하는 생화학적 기법에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오타이드가 ALDH2의 발현 수준을 감소시키는 정도는 발현 수준(예를 들어, ALDH2의 mRNA 또는 단백질 수준)을 적절한 대조군(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 전달된 적이 없거나 음성 대조군이 전달된 세포 또는 세포 집단에서의 ALDH2 발현 수준)과 비교함으로써 평가된다.
일부 실시형태에서, 대조군 수준이 매번 측정될 필요가 없도록, ALDH2 발현의 적절한 대조군 수준은 사전 결정된 수준 또는 값일 수 있다. 사전 결정된 수준 또는 값은 다양한 형태를 취할 수 있다. 일부 실시형태에서, 사전 결정된 수준 또는 값은 단일 컷오프 값, 예컨대, 중앙값 또는 평균일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드의 투여는 세포에서의 ALDH2 발현 수준 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, ALDH2 발현 수준 감소는 ALDH2의 적절한 대조군 수준에 비해 1% 이하, 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 또는 90% 이하까지의 감소일 수 있다. 적절한 대조군 수준은 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드와 접촉된 적이 없는 세포 또는 세포 집단에서의 ALDH2 발현 수준일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따른 세포에 대한 올리고뉴클레오타이드의 전달 효과는 한정된 기간 후에 평가된다. 예를 들어, ALDH2 수준은 세포 내로 올리고뉴클레오타이드의 도입 후 적어도 8시간, 12시간, 18시간, 24시간; 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 14일에 세포에서 분석될 수 있다.
ii. 치료 방법
개시내용의 양상은 대상체에서 알코올 중독의 치료를 위해 ADH1B, ADH1C 및 ALDH2 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 알코올 중독의 치료를 위해 ALDH2 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드 중 어느 하나의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 대상체에서 에탄올 내성을 감소시켜, (예를 들어, 에탄올을 소비하는 대상체의 갈망을 감소시킴으로써) 대상체에 의한 에탄올 흡수를 저해하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은 알코올 중독 및/또는 알코올 중독과 관련된 질환 또는 장애의 위험이 있는(또는 민감한) 대상체를 치료하는 예방적이며 치료적인 방법을 모두 제공한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 치료제(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 또는 이를 암호화하는 벡터 또는 이식유전자)를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료될 대상체는, 예를 들어, 간에서 ALDH2 단백질 양의 감소가 치료적으로 유리한 대상체이다.
본 명세서에 기재된 방법은 전형적으로 올리고뉴클레오타이드의 유효량, 즉, 바람직한 치료 결과를 생성할 수 있는 양을 대상체에게 투여하는 단계를 수반한다. 치료적으로 허용 가능한 양은 질환 또는 장애를 치료할 수 있는 양일 수 있다. 임의의 한 명의 대상체에 대한 적절한 투약량은 대상체의 크기, 체표면적, 연령, 투여될 조성물, 조성물 중 활성 성분(들), 투여 시간 및 경로, 일반적 건강상태 및 병행하여 투여 중인 다른 약물을 포함하는 특정 인자에 따라 다를 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체에게는 장내로(예를 들어, 경구로, 위영양관에 의해, 십이지장 영양보급관에 의해, 위루형성술을 통해 또는 직장으로), 비경구로(예를 들어, 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입, 동맥내 주사 또는 주입, 근육내 주사), 국소로(예를 들어, 경피적, 흡입법, 점안액을 통해, 또는 점막을 통해) 또는 표적 기관(예를 들어, 대상체의 간)에 직접 주사에 의해 본 명세서에 개시된 조성물 중 어느 하나가 투여된다. 전형적으로, 본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드는 정맥내 또는 피하로 투여된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 0.1 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏(예를 들어, 1 ㎎/㎏ 내지 5mg/㎏) 범위의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 0.1 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏의 범위 또는 0.5 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏의 범위의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 올리고뉴클레오타이드는 단독으로 또는 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서의 올리고뉴클레오타이드는 병행하여, (임의의 순서로) 순차적으로 또는 간헐적으로 조합하여 투여된다. 예를 들어, 두 올리고뉴클레오타이드는 병행하여 공동 투여될 수 있다. 대안적으로, 하나의 올리고뉴클레오타이드가 투여될 수 있고, 임의의 시간 후에(예를 들어, 1시간, 1일, 1주 또는 1개월) 두 번째 올리고뉴클레오타이드의 투여가 이어졌다. 특정 실시형태에서, 본 명세서의 올리고뉴클레오타이드는 다이설피람과 병용하여 투여될 수 있다.
비제한적 세트의 예로서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 1년당 1회, 1년당 2회, 분기별로(3개월마다 1회), 2개월마다(2개월마다 1회), 1개월마다, 또는 매주 투여될 것이다.
일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 인간 또는 비인간 영장류 또는 다른 포유류 대상체이다. 다른 예시적인 대상체는 집짐승, 예컨대, 개 및 고양이; 가축, 예컨대, 말, 소, 돼지, 양, 염소 및 닭; 및 동물, 예컨대, 마우스, 래트, 기니피그 및 햄스터를 포함한다.
실시예
실시예 1: 생체내 효력에 대한 치환의 영향
생체내 뮤린 실험
마우스 간세포에서 ALDH2 발현의 감소를 위한 활성을 유지하면서 전달 특성을 개선시키는 변형 패턴을 분석하였다. 다양한 2'-OMe 변형 패턴을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 CD-1 마우스에 3 ㎎/㎏으로 피하로 투여함으로써 효력에 대해 분석하였다. 투여 후 제4일에 마우스를 안락사시켰다. 간 샘플을 얻었고, RNA를 추출하여 RT-qPCR에 의해 ALDH2 mRNA 수준을 평가하였다. PBS 대조군 mRNA와 비교되는 ALDH2 mRNA 백분율을 이들 측정에 기반하여 결정하였고, 도 1에 나타낸다.
실시예 2: 비인간 영장류(NHP)에서의 GalNAc-접합 ALDH2 올리고뉴클레오타이드의 지속기간 연구
상이한 변형 패턴(예를 들어, 안티-센스 가닥에서 상이한 수의 2'-플루오로 변형 및/또는 상이한 수의 포스포로티오에이트 연결을 갖는 변형 패턴)을 갖는 단일 용량의 GalNAc-접합 ALDH2 올리고뉴클레오타이드의 약력학을 평가하기 위해 이 연구를 설계하였다. 본 연구에서 시험한 GalNAc-접합 ALDH2 올리고뉴클레오타이드는 S585-AS595-M14, S585-AS595-M15, S585-AS595-M16, S585-AS595-M17, S587-AS597-M23 및 S587-AS597-M24였다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 참조에 의해 원용된 국제 특허 출원 공개 WO20119/143621에 개시되어 있다. 단일 용량의 GalNAc-접합 ALDH2 올리고뉴클레오타이드는 3 ㎎/㎏으로 비인간 영장류(각 그룹에 대해 n=4)에게 피하로 투여된다. 동물을 밤새 금식시키고, 다음날 아침을 공급하기 전에 혈청 샘플 및 간 생검을 수집하였다. 순응 동안 각 동물의 경우 1회의 투약 전 생검을 수집하였고, 투여 후 4, 8 또는 12-, 또는 16-주에 3회의 생검을 수집하였다. 생검을 2개의 부문으로 나누었고, 하나는 순간 냉동시켰고, -80℃에서 보관하고, 다른 하나를 나중에 RNA에서 처리하였고, mRNA 수준 분석을 위해 4℃에서 보관하였다.
투여 전 ALDH2 mRNA 양에 비해 투여 후 4-, 8-, 12- 또는 16-주에 남아있는 ALDH2 mRNA의 양을 정량적 PCR(qPCR)에 의해 분석하였고, 결과는 6개의 GalNAc-접합 ALDH2 올리고뉴클레오타이드 중 4개가 약 50%의 ALDH2 mRNA 억제를 달성하였고, 단일 3 ㎎/㎏의 용량 후에 3개월 동안 효과가 유지되었다는 것을 나타냈다(도 2). 결과는 인간에서 분기당 1회 이하의 제안된 투약 빈도를 뒷받침한다.
알라닌 아미노기 전이효소(ALT), 알칼리성 포스파타제(ALP) 락트산 탈수소효소(LDH), 감마 글루타밀 전이효소(GGT)를 포함하는 혈청 샘플은 보관된 간 기능 패널 검사에 대한 것이다.
물질
Tissuelyser II(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 이용하여 QIAzol 용해 시약(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아 소재)에 기반하여 0.75 ㎖ 페놀/구아니딘 중 간 샘플을 균질화시켰다. 파쇄액을 1-브로모-3-클로로프로판(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트루이스 소재)로 추출하였다. 제조업자의 지침에 따라 MagMax Technology(Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠주 월섬 소재)를 이용하여 0.2 ㎖의 수성상으로부터 RNA를 추출하였다. 260 및 280 ㎚에서 분광 분석을 이용하여 RNA를 정량화하였다. 대용량 cDNA 역전사 키트(Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. Integrated DNA Technologies(아이오와주 코랄빌 소재)로부터의 RT-qPCR 분석 및 Bio-Rad Laboratories(캘리포니아주 허큘러스 소재)로부터의 시약을 사용하여 내인성 하우스키핑 유전자에 대한 정규화에 따른 ALDH2 mRNA 수준을 측정하였다. ALDH2 mRNA 발현 정도를 PBS 그룹(마우스 연구)에 또는 투약 전 생검(NHP 연구)에 정규화시켰다.
실시예 3: 마우스에서의 피하 주사에 의한 DP11663P:DP16281G(DCR-A1203)의 5주 연구
개요
본 연구의 목적은 CD-1 마우스에서 DCR-A1203의 반복 용량(4주마다; 2 용량) 피하(SC) 투여의 잠재적 독성을 결정하고 임의의 결과의 잠재적 가역성을 평가하는 것이다. 또한, DCR-A1203의 독성동태(TK) 특징을 결정하였다.
단일 용량만을 투여받은 TK 기(제1일)에서 그룹 1의 3마리 동물/성별 및 그룹 2 내지 4의 15마리 동물/성별을 제외하고, 동물에게 SC 주사를 통해 4주마다(제1일 및 제29일) 1회 투약하였다. 표 2에 연구 설계를 제시한다.
Figure pct00014
모든 동물은 예정된 부검까지 생존하였다. 체중, 식품 소비, 임상 화학, 소변검사 또는 기관 중량에 대한 DCR-A1203-관련 임상 관찰 또는 효과는 없었다. DCR-A1203-관련 안과 또는 육안적 소견은 없었다.
말기 안락사에서 주목한 DCR-A1203-관련 부작용 없는 현미경적 소견에는 수컷 및 암컷의 모든 용량 수준에서 주사 부위에 최소 내지 경미한 소포성/과립형 대식세포, 수컷의 모든 용량 수준에서 그리고 암컷의 100 및 300 ㎎/㎏ 그룹에서 신장에 최소의 소포성/과립형 상피세포, 300 ㎎/㎏ 그룹 수컷 및 암컷에서 간에 최소의 소포성/과립형 간세포, 및 100 및/또는 300 ㎎/㎏ 그룹 수컷 및 300 ㎎/㎏ 그룹 암컷에서 림프절(겨드랑이, 아래턱 및 장간막)에 최소 소포성/과립형 대식세포를 포함하였다. 이들 현미경 소견은 올리고뉴클레오타이드 투여와 관련된 통상적인 조직병리학적 특징과 유사하였고, 독성을 시사하는 임의의 변화(예를 들어, 상피세포 또는 간세포의 변성/괴사, 또는 전염증 효과)가 없는 경우 유해하지 않은 것으로 간주하였다. 회복 안락사에서, 100 및 300 ㎎/㎏ 그룹 수컷 및 암컷의 주사 부위(최소 내지 경미한 소포성/과립형 대식세포) 및 100 및/또는 300 ㎎/㎏ 그룹 수컷 및 300 ㎎/㎏ 그룹 암컷의 림프절(겨드랑이, 아래턱 및 장간막)에서 DCR-A1203-관련 현미경적 변화가 여전히 주목되었지만; 그러나, 신장 및 간에서의 소견은 없었고, 이는 이들 조직의 변화가 부분적으로 해결되었다는 것을 나타낸다.
DCR-A1203 농도는 제1일, 제29일(투약 후 24시간) 및 제58일(말기 부검 동안 수집한 샘플)에 모든 용량 수준에서 간 및 신장 조직에서 정량 가능하였다. 간 농도는 모든 평가일에 30에서 300 ㎎/㎏까지 용량 수준이 증가함에 따라 용량보다 덜 비례하여 증가하였다. 신장 농도는 제1일 및 제29일에 거의 용량 비례적으로 증가되었고, 30에서 300 ㎎/㎏까지 용량 수준이 증가함에 따라 제58일에 용량보다 더 비례하여 증가되었다. DCR-A1203 농도는 평가한 모든 시점에 신장에서보다 간에서 더 높았다. ARC24hr 값에 의해 나타나는 바와 같이 제29일에 간 및 신장에서의 DCR-A1203의 축적은 관찰되지 않았다. 간 및 신장 DCR A1203 농도는 제29일 농도에 비해 제58일에 96% 초과만큼 감소되었다.
Figure pct00015
간은 DCR-A1203의 전달 및 활성을 위한 주된 표적 기관이었다. 간에서의 DCR-A1203 활성의 증거는 30, 100 및 300 ㎎/㎏을 투여한 제31일 연구 그룹에서 대조군에 비해 97% 초과만큼의 Aldh2 mRNA의 감소에 의해 입증되었다. 임의의 용량 수준에서 간에서의 Aldh2 mRNA 발현 회복은 없었다(표 3). 신장에서는 DCR-A1203 활성이 검출되지 않았고, 식도 및 골수에서의 활성은 제58일 그룹에서만 검출되었다. 식도 및 골수에서 Aldh2 mRNA의 감소는 제58일에 수집한 샘플에서만 관찰되었다. 제58일에 식도(11.7 내지 42.0%) 및 골수(42.8 내지 55.1%)에서 Aldh2 mRNA가 최소이지만 통계적으로 유의미한 감소가 있었고 제31일에는 감소 경향이 있었다. 이들 조직에서 ASGPR 발현의 결여, 간에 대한 Aldh2 mRNA의 감소의 최소 특성 및 이들 변화의 늦은 개시를 고려할 때 감소 메커니즘은 불분명하다. 수컷과 암컷 마우스 사이에서 Aldh2 mRNA 발현 또는 DCR-A1203 활성의 명백한 차이는 없었다.
결론적으로, Crl:CD1(ICR) 마우스에 피하 주사를 통해 4주마다 1회(총 2회 용량; 제1일 및 제29일) 30, 100 및 300 ㎎/㎏ 용량 수준에서 DCR-A1203의 투여는 사망 또는 부작용 소견 없이 용인되었다. 부작용 없음 소견은 말기 안락사에서 주사 부위에 최소 내지 경미한 소포성/과립형 대식세포, 신장에 최소 소포성/과립형 상피세포, 간에 최소 소포성/과립형 간세포 및 겨드랑이, 아래턱 및 장간막 림프절에 최소 소포성/과립형 대식세포의 현미경적 소견으로 제한되지만, 주사 부위 및 림프절에서의 소견만이 회복 안락사에서 여전히 존재하였다. 이들 결과에 기반하여, 관찰된 부작용 수준 없음(no-observed-adverse-effect level: NOAEL)은 300 ㎎/㎏이었다. 이 용량은 391,000 hr*ng/㎖의 평균 AUClast 값 및 제29일에 조합된 성별에 대한 134,000 ng/㎖의 평균 Cmax 값에 대응하였다.
실시예 4: 원숭이에서의 피하 주사에 의한 DP11663P:DP16281G(DCR-A1203)의 5주 연구
개요
본 연구의 목적은 사이노몰거스 원숭이에 대해 총 2회 용량의 경우 28일마다 1회 피하로 투여했을 때 DCR-A1203의 잠재적 독성을 결정하는 것, 및 4주의 회복 기간에 걸쳐 임의의 소견의 잠재적 가역성을 평가하는 것이었다. 또한, DCR-A1203의 독성동태 특징을 결정하였다.
연구 설계는 다음과 같았다:
Figure pct00016
본 연구에서 다음의 파라미터 및 종점을 평가하였다: 사망률, 임상 관찰, 체중, 식품 소비, 전기 심장 시험(electrocardiology exam), 임상 병리 파라미터(혈액학, 응고, 임상 화학 및 소변검사), 생분석 및 독성동태 파라미터, 조직 약력학 분석(표적 mRNA 발현), 보체(C3a 및 Bb), 사이토카인 및 케모카인, 기관 중량 및 육안 및 현미경적 시험.
DCR-A1203의 반복 용량 투여는 임상 관찰, 체중, 정량적 식품 소비, 안과 파라미터, 전기 심장 파라미터, 응고 파라미터, 보체 인자 C3a 및 Bb, 또는 연구 동안의 육안 부검 관찰에서의 변화를 생성하지 않았다.
100 ㎎/㎏/용량 이상에서 혈액학 및 임상 화학 파라미터에서의 DCR-A1203-관련 변화가 관찰되었고, 최소 내지 적당히 증가된 호중구(1.98x 내지 7.55x 기준선[제2일 내지 제30일 범위]), 경미하게 감소된 호산구(100 ㎎/㎏/용량에서 수컷을 제외하고 제30일에 0.15x 내지 0.28x 기준선)를 포함하였고, 알칼리성 포스파타제(1.38x 내지 1.75x[제2일 내지 제30일 범위])를 증가시켰다. 추가적으로, 300 ㎎/㎏/용량의 단일 암컷 동물에서 DCR-A1203-관련하여 알라닌 아미노기 전이효소가 약간 증가되었고, 이는 최소 단일 세포 간세포 괴사의 현미경 소견과 상관관계가 있었다. 회복까지, 임상 병리 파라미터에서의 DCR-A1203-관련 그룹 변화는 대조군 값에 근사하였고, 이는 가역성을 나타낸다. 임상 병리 변화는 유해한 것으로 간주하지 않았다.
제1일 및 제29일에 투약 후 8 및/또는 24시간에, 양 성별 모두 30 ㎎/㎏/용량 이상에서 대조군 평균에 비해 평균 인터류킨(IL)-6 농도가 증가되었고, 이는 제29일의 투약 전 시점까지 완전히 해결되었다. 이런 증가는 일반적으로 30 내지 100 ㎎/㎏/용량 규모에서 비슷하였지만, 300 ㎎/㎏/용량에서 더 확연하였다. IL-6의 증가를 제1일 및 제29일 투약 후 8시간에 최소 내지 경미하고(1.7x 내지 7.6x의 범위) 그리고 제1일 및 제29일에 투약 후 24시간에 최소 내지 중간으로(2.0x 내지 47.5x의 범위) 간주하였다. 이들은 전형적으로 제1일 및 제29일에 투약 후 8시간에 모든 용량 수준의 수컷에서, 그리고 300 ㎎/㎏/용량의 수컷에서(각 투약 후 8 및 24시간) 확연하였지만, 암컷에서는 제1일 및 제29일 투약 후 24시간에 30 및 100 ㎎/㎏/용량에서 더 확연하였다. 증가된 IL-6은 전염증 반응을 나타냈고, 제2일 및 제30일에 100 ㎎/㎏/용량 이상은 최소로 증가된 알칼리성 포스파타제 활성의 증가된 발생률과 상관관계가 있었다. IL-6의 증가는 유해한 것으로 간주하지 않았다.
말기 안락사에서, 300 ㎎/㎏/용량을 투여한 수컷에서 DCR-A1203-관련된 보다 높은 평균 절대값 및/또는 상대적 (뇌에 대해) 간 중량이 관찰되었고; 현미경적 상관관계로서 간세포 비대가 관찰되었다. 회복 안락사에서, DCR-A1203-관련 기관 중량 차이는 관찰되지 않았고, 이는 회복을 입증한다.
말기 안락사에서, 간, 림프절(배액, 아래턱 및 장간막), 및 피하 투여 부위에서 DCR-A1203-관련 현미경적 소견이 관찰되었다. 간에서, 현미경적 소견은 100 ㎎/㎏/용량 이상을 투여한 동물의 소포성/과립형 쿠퍼 세포(최소 내지 경미한), 300 ㎎/㎏/용량을 투여한 수컷의 간세포 비대(최소) 및 300 ㎎/㎏/용량을 투여한 암컷의 단일 세포 괴사(최소)를 포함하였다. 림프절 및/또는 피하 투여 부위에서, 30 ㎎/㎏/용량 이상을 투여한 동물에서 소포성/과립형 대식세포(최소 내지 경미)가 관찰되었다. 이들 소견은 문헌에서 보고한 유사한 siRNA 플랫폼을 이용하는 다른 치료에 의한 관찰과 일치된다.
회복 안락사에서, 간, 림프절, 및 피하 투여 부위에서 DCR-A1203-관련 현미경적 소견이 다시 관찰되었다. 간에서, 현미경적 소견은 100 ㎎/㎏/용량 이상을 투여한 동물에서 그리고 림프절 및/또는 피하 투여 부위에서 소포성/과립형 쿠퍼 세포(최소)를 포함하였고, 100 ㎎/㎏/용량 이상을 투여한 동물에서 소포성/과립형 대식세포(최소 내지 경미)가 관찰되었다. (말기 안락사와 비교할 때) 회복 안락사에서 관찰된 소견의 낮은 발생률 및/또는 중증도는 진행 중인 아직 불완전한 회복을 입증하였다.
제1일 및 제29일에 투약 후 1 내지 12시간의 범위에 걸쳐 피크 혈장 DCR-A1203 농도가 관찰되었다. Cmax 후, DCR-A1203 농도는 일반적으로 제1일 및 제29일에 수컷 및 암컷에서 48시간(수집한 마지막 시점) 내내 감소되었다. 혈장 DCR-A1203 농도는 제57일에 100 및 300 ㎎/㎏/용량에 회복 동물에서 정량 가능하였다.
DCR-A1203 노출은, 투약 후 0 내지 48시간 및 혈장 중 DCR-A1203의 최대 측정 농도의 농도 시간 곡선 하 면적(AUC)에 관해, 용량 수준에 따라 증가되었다. 투약 후 0 내지 48시간의 AUC는 용량 수준의 10배 증가에 비해, 제1일에 대략 18배, 제29일에 대략 15배만큼 증가되었으며, 이는 평가일 둘 다에 대해 용량-비례 증가보다 더 크다는 것을 나타낸다. 혈장 중 DCR-A1203의 최대 측정 농도는 제1일에 대략 9배 및 제29일에 대략 7배만큼 증가되었고, 이는 평가일 둘 다에 대해 대략의 용량-비례 증가를 나타낸다. 전반적으로, 혈장 노출은 제1일 및 제29일에 거의 동일하였고, 축적의 징후는 없었다. 투약 후 0 내지 48시간에 걸쳐 평균 반감기를 결정하였고, 제1일에 3.76 내지 4.12시간 및 제29일에 4.01 내지 5.21시간의 범위에 있었다. 투약 후 0 내지 48시간에 걸쳐 결정되었고 DCR-A1203 농도는 투약 후 최대 28일(제57일)까지 혈장에서 정량화 가능하였기 때문에, 계산된 반감기를 주의해서 해석해야 한다. AUC(0-48hr) 및 Cmax에 관해 DCR-A1203 노출은 평가일 둘 다에 대해 수컷과 암컷 원숭이 간에 유사하였고(1.6배 이하); 따라서, 조합한 수컷과 암컷에 대한 데이터를 제시한다.
Figure pct00017
제31일(제29일에 대한 투약 후 48시간)에 모든 용량 수준에서 간 및 신장에서 DCR-A1203 농도를 정량화 가능하였고; 간 농도는 용량보다 덜 비례하여 증가되었고, 신장 농도는 거의 용량 비례하여 증가되었다. DCR-A1203 농도는 제57일에 용량 수준(100 및 300 ㎎/㎏) 둘 다에서 간 및 신장에서 정량화 가능하였고; 간 농도는 100 내지 300 ㎎/㎏ 용량 수준에 걸쳐 거의 용량 비례하여 증가되었고(2배), 신장 농도는 암컷의 100과 300 ㎎/㎏ 사이에서 거의 용량 비례하여 증가되었지만(2배), 수컷의 농도는 100과 300 ㎎/㎏ 사이에서 감소되었다. DCR-A1203 농도는 신장에서보다 간에서 더 높았다. 간 농도는 84% 및 98%였고, 신장 농도는 100 및 300 ㎎/㎏ 그룹의 경우 각각 회복 부검(제57일) 시 말기 부검 수준(제31일)의 65% 및 8%였다. 결과적으로, 간-대-신장비는 일반적으로 제31일에 비해 제57일에 더 높았다. DCR-A1203 농도는 말기 부검(제31일) 시 신장에서보다 간에서 8 내지 38배 더 높았고, 평균비에 관해 회복 부검(제57일) 시 신장에서보다 간에서 79- 내지 94-배 더 높았다(표 6).
Figure pct00018
간에서의 DCR-A1203 활성의 증거는 30, 100 및 300 ㎎/㎏ DCR-A1203을 투여한 주된 연구 그룹에서 대조군에 비해 85% 초과만큼의 ALDH2 mRNA의 감소에 의해 입증되었다. 수컷과 암컷 사이의 ALDH2 mRNA 발현에 분명한 차이가 없었다. 100 또는 300 ㎎/㎏/용량 회복 그룹 중 하나에서 간에서의 ALDH2 감소의 회복이 없었다(30 ㎎/㎏/용량에서 회복을 평가하지 않았음). 주요 또는 회복 연구 그룹 중 하나에서 임의의 시험한 간외 조직(신장, 식도 및 골수)에서 DCR-A1203 활성은 검출되지 않았다.
결론적으로, 30, 100 및 300 ㎎/㎏/용량 수준에서 사이노몰거스 원숭이에 대해 총 2회 용량의 경우 28일마다 1회 피하 주사에 의한 DCR-A1203의 투여는 잘 용인되었다. 여러 임상 병리 파라미터(100 ㎎/㎏/용량 이상)에서 그리고 간(100 ㎎/㎏/용량 이상) 및 림프절 및 용량 투여 부위(30 ㎎/㎏/용량 이상)의 현미경적 병리학에서 DCR-A1203-관련, 유해하지 않은 변화가 발생되었다. 임상 병리에서 모든 DCR-A1203-관련 변화는 가역적이었고, 현미경적 변화는 회복으로 향하는 경향이 있었다. 이 연구 조건 하에서, 관찰된 부작용 수준 없음(NOAEL)은 300 ㎎/㎏/용량인 것으로 결정되었고, 이는 1,480,000 ng*hr/㎖의 AUC(0-48hr) 및 61,200 ng/㎖의 Cmax(수컷과 암컷을 조합함, 제29일)과 관련되었다.
실시예 5: 의식이 있는, 전파 원격 측정 기기를 갖춘 사이노몰거스 원숭이에 대한 피하 주사 투여 후 DP11663P:DP16281G(DCR-A1203)의 심혈관, 호흡기 및 중추 신경계 평가
본 연구의 목적은 호흡기 파라미터, 동맥 혈압, 심박수, 체온 및 리드 II 심전도(ECG)에 대한 DCR-A1203의 피하 주사의 잠재적인 급성 효과뿐만 아니라 의식이 있는, 전파 원격 측정 기기를 갖춘 수컷 사이노몰거스 원숭이의 총 거동, 생리학적 및 신경학적 상태에 대한 효과를 평가하는 것이었다.
동물은 증량 설계에서 0(비히클; 0.9% 식염수), 30, 100 또는 300 ㎎/㎏의 단일 피하 용량을 투여받았다. 연구 설계는 다음과 같았다:
Figure pct00019
본 연구에서 다음의 파라미터 및 종점을 평가하였다: 임상 징후, 정량적 식품 소비, 심박률, 동맥 혈압(수축기, 확장기 및 평균 동맥 혈압), 맥압, 체온, 및 ECG 파형(이로부터 ECG 간격 PR, QRS, QT, 및 심박수-보정 QT[QTcB 및 QTcL]를 유도함), 호흡 파라미터(호흡률, 일회 환기량 및 분당호흡량), 신경학적 검사 및 생분석.
30, 100 및 300 ㎎/㎏의 용량 수준에서 수컷 사이노몰거스 원숭이에 대한 증량 설계에서 DCR-A1203의 단일 피하 투여는 DCR-A1203-관련 심혈관, 호흡 또는 신경학적 효과는 야기하지 않았다.
따라서, 관찰된 효과 수준 없음(NOEL)은 300 ㎎/㎏이었다.
결론
30, 100 및 300 ㎎/㎏의 용량 수준에서 수컷 사이노몰거스 원숭이에 대한 증량 설계에서 DCR-A1203의 단일 피하 투여는 DCR-A1203-관련 심혈관, 호흡 또는 신경학적 효과는 야기하지 않았다. 따라서, 관찰된 효과 수준 없음(NOEL)은 300 ㎎/㎏이었다.
본 명세서에 예시적으로 기재된 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 구성요소 또는 구성요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 각각의 예에서, 임의의 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)" 및 "이루어진(consisting of)"은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용되며, 제한하는 것이 아니고, 이러한 용어 및 표현의 사용에서 나타내고 기재된 특징 또는 이의 일부의 임의의 균등물을 제외하려는 의도는 없지만, 특허청구한 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시형태에 의해 구체적으로 개시되었지만, 개시된 본 명세서의 개념의 선택적 특징, 변형 및 변화는 당업자에 의존할 수 있다는 것과, 이러한 변형 및 변화는 설명 및 첨부하는 청구범위에 의해 규정되는 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다는 것이 이해되어야 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양상이 마쿠쉬 그룹 또는 대안의 다른 그룹화에 관해 기재된 경우, 당업자는 이에 의해 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 개개 구성원 또는 구성원의 하위그룹에 관해 기재된다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 서열목록에 제시된 서열이 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 핵산의 구조를 설명하는 데 언급될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 이러한 실시형태에서, 실제 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 핵산은 명시된 서열과 본질적으로 동일 또는 유사한 상보성 특성을 유지하면서 명시된 서열에 비해 하나 이상의 대안의 뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 뉴클레오타이드의 RNA 상대 또는 RNA 뉴클레오타이드의 DNA 상대) 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드간 연결 및/또는 하나 이상의 다른 변형을 가질 수 있다.
본 발명의 설명과 관련하여(특히 다음의 청구범위와 관련하여) 단수 용어의 사용 및 유사한 지시대상은 본 명세서에 달리 표시되거나 문맥에 의해 분명하게 모순되지 않는 한, 단수와 복수를 둘 다 아우르는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는", "포함하는(including)" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는 한, 확장 가능한 용어(즉, "포함하지만, 이들로 제한되지 않는"을 의미함)로서 해석되어야 한다. 본 명세서의 값의 범위의 열거는 본 명세서에서 달리 표시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 별개 값을 개개로 언급하는 약칭의 방법으로서 작용하는 것으로만 의도되며, 각각의 별개의 값은 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 원용된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에 달리 표시되지 않는 한 또는 다르게는 문맥에 의해 분명하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 모든 실시예 또는 예시적인 표현(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 양호하게 설명하기 위한 의도이며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 제한을 제거하지 않는다. 본 명세서의 어떤 표현도 임의의 청구되지 않은 구성요소를 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 실시형태를 본 명세서에 기재한다. 해당 실시형태의 변형은 앞서 언급한 설명을 읽을 때 당업자에게 분명하게 될 것이다.
발명자는 당업자가 이러한 변형을 적절하게 사용할 것을 예상하며, 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실행되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용되는 법률에 허용되는 경우 본 명세서에 첨부된 청구범위에 인용된 대상의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 본 명세서에 달리 표시되거나 또는 다르게는 문맥과 분명하게 모순되지 않는 한, 이의 모든 가능한 변형에 상기 기재한 구성요소의 임의의 조합이 포괄된다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 구체적 실시형태에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> Dicerna Pharmaceuticals, Inc. <120> Chemical Modifications for Inhibiting Expression of ALDH2 <130> WO/2022/104366 <140> PCT/US2021/072370 <141> 2021-11-12 <150> US 63/113,689 <151> 2021-11-13 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 uaaacugagu uucauccacc gg 22 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 gguggaugaa acucaguuua gcagccgaaa ggcugc 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> modified by phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 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<220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-O-methyladenosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(22) <223> modified by phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <400> 7 uaaacugagu uucauccacc gg 22 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> modified by phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-fluoro-uridine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-fluoro-guanosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-O-methyladenosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-fluoro-guanosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-O-methyladenosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-fluoro-adenosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-methyladenosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-fluoro-guanosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-fluoro-adenosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-fluoro-uridine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-O-methyladenosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-O-methyladenosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (28)..(28) <223> ademA-GalNAc <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> ademA-GalNAc <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> ademA-GalNAc <220> <221> modified_base <222> (31)..(31) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (32)..(32) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (33)..(33) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (34)..(34) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (35)..(35) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (36)..(36) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <400> 8 gguggaugaa acucaguuua gcagccgaaa ggcugc 36 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5'-methoxy, phosphonate-4'-oxy-2'-O-methyluridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> modified by phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-fluoro-adenosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-fluoro-adenosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-fluoro-adenosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-fluoro-cytidine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-fluoro-guanosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-O-methyladenosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-fluoro-uridine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-fluoro-adenosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O-methyluridine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-fluoro-cytidine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-methylcytidine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-O-methyladenosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-fluoro-cytidine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-fluoro-cytidine deoxyribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(22) <223> modified by phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-O-methylguanosine ribonucleotide <400> 9 uaaacugagu uucauccacc gg 22

Claims (22)

  1. ALDH2의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오타이드로서, 5'에서 3'까지 UAAACUGAGUUUCAUCCACCGG(서열번호 1)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 5'에서 3'까지 GGUGGAUGAAACUCAGUUUAGCAGCCGAAAGGCUGC(서열번호 2)에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드; 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 모두 변형된, 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸 변형을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 다음의 위치: 상기 센스 가닥의 1 내지 7번 및 12 내지 36번 위치 및/또는 상기 안티센스 가닥의 1, 6, 8 내지 13 및 15 내지 22번 위치는 2'-O-메틸에 의해 변형되는, 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제3항에 있어서, 다음의 위치: 상기 센스 가닥의 8 내지 11번 위치 및/또는 상기 안티센스 가닥의 2 내지 5, 7 및 14번 위치는 2'-플루오로에 의해 변형되는, 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결인, 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 상기 센스 가닥의 1번과 2번 위치, 상기 안티센스 가닥의 1번과 2번 위치, 상기 안티센스 가닥의 2번과 3번 위치, 상기 안티센스 가닥의 3번과 4번 위치, 상기 안티센스 가닥의 20번과 21번 위치 및 상기 안티센스 가닥의 21번과 22번 위치 중 하나 이상 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는, 올리고뉴클레오타이드.
  9. 이중가닥 올리고뉴클레오타이드로서, 하기의 센스가닥:
    5'mG-S-mG-mU-mG-mG-mA-mU-fG-fA-fA-fA-mC-mU-mC-mA-mG-mU-mU-mU-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC 3' (서열번호 3), 및
    하기의 안티센스 가닥:
    5' [Me포스포네이트-4O-mU]-S-fA-S-fA-S-fA-fC-mU-fG-mA-mG-mU-mU-mU-mC-fA-mU-mC-mC-mA-mC-mC-S-mG-S-mG 3'(서열번호 6)
    을 포함하는, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드; 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염,
    (여기서:
    뉴클레오사이드 사이의 " -"는 뉴클레오사이드간 포스포다이에스터 연결을 나타내고;
    뉴클레오사이드 사이의 "-S-"는 뉴클레오사이드간 포스포로티오에이트 연결을 나타내며;
    mA는 2'-O-메틸아데노신 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    mG는 2'-O-메틸구아노신 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    mC는 2'-O-메틸사이티딘 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    mU는 2'-O-메틸유리딘 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    fA는 2'-플루오로-아데노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    fG는 2'-플루오로-구아노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    fC는 2'-플루오로-사이티딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    fU는 2'-플루오로-유리딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    [ademA-GalNAc]는
    Figure pct00021
    를 나타내며; 그리고
    [Me포스포네이트-4O-mU]는
    Figure pct00022
    를 나타냄).
  10. 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 나트륨 염으로서, 하기의 센스가닥:
    5' mG-S-mG-mU-mG-mG-mA-mU-fG-fA-fA-fA-mC-mU-mC-mA-mG-mU-mU-mU-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC 3' (서열번호 3) 및
    하기의 안티센스 가닥:
    5' [Me포스포네이트-4O-mU]-S-fA-S-fA-S-fA-fC-mU-fG-mA-mG-mU-mU-mU-mC-fA-mU-mC-mC-mA-mC-mC-S-mG-S-mG 3' (서열번호 6)
    을 포함하는, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드의 나트륨 염:
    (여기서:
    뉴클레오사이드 사이의 " -"는 뉴클레오사이드간 포스포다이에스터 연결을 나타내고;
    뉴클레오사이드 사이의 "-S-"는 뉴클레오사이드간 포스포로티오에이트 연결을 나타내며;
    mA는 2'-O-메틸아데노신 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    mG는 2'-O-메틸구아노신 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    mC는 2'-O-메틸사이티딘 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    mU는 2'-O-메틸유리딘 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    fA는 2'-플루오로-아데노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    fG는 2'-플루오로-구아노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    fC는 2'-플루오로-사이티딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    fU는 2'-플루오로-유리딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    [ademA-GalNAc]는
    Figure pct00023
    를 나타내며; 그리고
    [Me포스포네이트-4O-mU]는
    Figure pct00024
    를 나타냄).
  11. 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물로서, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오타이드는 하기 센스 가닥:
    5' mG-S-mG-mU-mG-mG-mA-mU-fG-fA-fA-fA-mC-mU-mC-mA-mG-mU-mU-mU-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC 3'(서열번호 3) 및
    하기 안티센스 가닥:
    5' [Me포스포네이트-4O-mU]-S-fA-S-fA-S-fA-fC-mU-fG-mA-mG-mU-mU-mU-mC-fA-mU-mC-mC-mA-mC-mC-S-mG-S-mG 3'(서열번호 6); 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 조성물:
    (여기서:
    뉴클레오사이드 사이의 " -"는 뉴클레오사이드간 포스포다이에스터 연결을 나타내고;
    뉴클레오사이드 사이의 "-S-"는 뉴클레오사이드간 포스포로티오에이트 연결을 나타내며;
    mA는 2'-O-메틸아데노신 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    mG는 2'-O-메틸구아노신 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    mC는 2'-O-메틸사이티딘 리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    mU는 2'-O-메틸유리딘 리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    fA는 2'-플루오로-아데노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    fG는 2'-플루오로-구아노신 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    fC는 2'-플루오로-사이티딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고;
    fU는 2'-플루오로-유리딘 데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내며;
    [ademA-GalNAc]는
    Figure pct00025
    를 나타내며; 그리고
    [Me포스포네이트-4O-mU]는
    Figure pct00026
    를 나타냄).
  12. 제11항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 아쥬반트를 더 포함하는, 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 상기 올리고뉴클레오타이드의 나트륨 염인, 조성물.
  14. 올리고뉴클레오타이드를 대상체에 전달하는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 대상체에서 에탄올 내성을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 대상체에 의한 에탄올 섭취를 저해하는 방법으로서, 제10항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 에탄올을 대사하는 대상체의 능력을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 대상체는 알코올 중독을 앓고 있는, 방법.
  19. 대상체의 ADH1B, ADH1C 및 ALDH2 수준을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 대상체의 ALDH2 수준을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 알코올 중독을 앓고 있는 대상체의 치료 방법으로서, 다른 ALDH2 저해제와 조합된 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 다른 ALDH2 저해제는 다이설피람인, 방법.
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