KR20230105923A

KR20230105923A - 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 녹차 및 누에고치 복합 발효물

Info

Publication number: KR20230105923A
Application number: KR1020220001554A
Authority: KR
Inventors: 장미향; 신민관; 김향선; 진승하; 신지영
Original assignee: 장미향; (주)에프티앤스킨솔루션; 신지영
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2023-07-12

Abstract

본 발명은 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 녹차 및 누에고치 복합 발효물에 관한 것으로, 본 발명의 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 녹차 및 누에고치 혼합 추출물 또는 복합 추출물 보다 DPPH 라디칼 소거능이 증가하고, MMP-1 발현을 억제시키며, 타입 I 프로콜라겐 단백질의 함량을 증진시켜 우수한 항산화 효능과 피부주름 예방 및 개선 효과를 가진다.

Description

항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 녹차 및 누에고치 복합 발효물{Manufacturing method complex fermented product for green tea and silkworm cocoon and complex fermented product manufactured by the same}

본 발명은 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 녹차 및 누에고치 복합 발효물에 관한 것으로, 본 발명의 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 DPPH 소거능이 향상되어 우수한 항산화능을 갖고, MMP-1을 효과적으로 억제하고 타입 Ⅰ 프로콜라겐 발현을 증가시켜 증진된 피부주름 예방 및 개선 효능을 갖는다.

신체는 자외선 및 유해한 외부물질에 노출되어 있어, 그에 대항하기 위한 자연치유 능력을 가진다. 그 중, 생체 내에서 산화제 공격과 항산화제 방어는 밀접하게 조화를 이루고 있으나, 사실상 공격에 비하여 방어체제가 완벽하지 못하다. 따라서, 생체 구성성분인 지질, 단백질, 핵산 등의 생체분자들은 산화제인 자유 라디칼(freeradical)에 의해 지속적인 산화적 손상을 받으며, 이들 산화반응의 산물은 나이가 들어감에 따라 점차 체내에 축적된다.

활성산소는 몸속에 들어온 산소를 이용하는 대사과정에서 생기는 독성물질로 유해산소라고도 불리며 생체조직을 공격하고, 산화력이 강한 산소를 칭한다. 활성산소는 피부 노화의 주범으로, 호흡하는 과정에서 몸 속으로 들어간 산소가 생체조직을 공격하고 세포를 손상시키는 것으로 알려졌다. 구체적으로, 산소 공급을 통해 손상된 세포가 복구되는 과정 중에 활성산소의 공격으로 인해 세포가 온전히 복구되지 못하고 세포의 기능을 상실하거나 죽게되고, 이것이 피부 세포 재생에도 영향을 미쳐 피부 노화로 이어지게 되는 것이다.

인간의 피부 노화는 크게 두 가지로 연구되고 있으며, 누구에게나 생물학적 과정, 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인하여 시간이 지나면서 나타나는 “내적 노화(Intrinsic aging)”와 지속적인 자외선(빛) 노출, 스트레스, 공해(흡연) 등과 같은 외부 환경요인에 노출되어 나타나는 “외적 노화(Besides the aging of the human nature)”로 구분된다.

전술한 요인에 의하여 피부 세포와 세포막이 손상되면, 세포막의 투과성이 변화하여 세포 내의 이온 균형이 깨지게 되고, 이런 변화는 세포 내 대사물의 배출을 막고, 이 대사물을 제독하는 세포의 기능을 감퇴시킨다. 이와 같은 세포 수준의 변화가 지속되면, 피부 조직의 구조가 규칙성을 잃게 되고 진피(dermis)에 국소적인 상흔이 나타나며 콜라겐 섬유나 탄력섬유의 감소로 진피 두께가 줄어든다. 콜라겐 섬유끼리의 가교도 증가하며 탄력섬유의 미세한 구조도 손상되어 전체적으로 피부의 탄력 저하와 함께 피부주름이 발생하게 된다. 또한, 피부 진피층 기질을 이루는 중요한 성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 생성되는 주요 기질 단백질로써 세포 외 간질에 존재하고, 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱 등과 같은 중요한 기능을 수행한다고 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선과 같은 외부 자극에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 노화가 되면 콜라겐 자체의 합성이 줄어들 뿐 아니라 콜라겐을 포함한 결합조직을 분해하는 MMPs(세포외기질분해효소, matrix metalloproteinases)의 활성이 증가하여 피부조직 내의 콜라겐 분해를 촉진시켜 콜라겐의 함량이 저하되는 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 이러한 MMPs를 억제하는 내재성 억제제인 TIMP(Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinase)가 존재하는데 MMPs와 TIMP의 활성이 균형을 이루어 적절히 조절이 될 때에 생리적인 조직의 재구성과 항상성이 잘 유지되게 된다.

화장품 분야에서는 항산화 및 피부주름 개선 효과를 갖는 기능성 성분을 포함하는 화장품에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 피부 자극을 최소화하면서 피부 개선효능이 우수한 천연물 유래 화장품에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다.

특허문헌 1. 한국등록특허 제10-2255580호

본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 녹차 추출물 및 누에고치를 혼합한 후 열수 추출하여 제조된 복합 추출물을 유산균으로 발효시켜 항산화 및 피부주름 개선 효능이 현저하게 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (ⅰ) 녹차 및 용매를 1:1 내지 50 중량비로 혼합하고 열수 추출하여 녹차 추출물을 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 녹차 추출물 100 중량부에 대하여 누에고치 0.5 내지 50 중량부를 혼합하고 열수 추출하여 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 수득하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 유산균으로 발효시켜 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 수득하는 단계;를 포함하는 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법을 제공한다.

상기 (ⅰ) 단계는 60 내지 100 ℃에서 1 분 내지 3 시간 동안 수행되고, 상기 (ⅱ) 단계는 100 내지 150 ℃에서 30 분 내지 3 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.

상기 유산균은 락토바실루스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii), 락토바실러스 아밀로필러스(Lactobacillus amylophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobaccilus brevis), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 카테나포르미(Lactobacillus catenaforme) 및 락토바실러스 미누투스(Lactobacillus minutus) 중 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 발효는 상기 녹차 및 누에고치 복합 추출물과 상기 유산균을 혼합하여 20 내지 45 ℃에서 12 내지 60 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법에 따라 제조된 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 포함하는 항산화 및 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 복합 발효물은 타입 I 프로콜라겐 함량을 증가시키고, MMP-1의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

이하 본 발명을 첨부된 도면 및 실시예와 함께 더욱 구체적으로 설명하도록 한다.

본 발명은 (ⅰ) 녹차 및 용매를 1:1 내지 50 중량비로 혼합하고 열수 추출하여 녹차 추출물을 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 녹차 추출물 100 중량부에 대하여 누에고치 0.5 내지 50 중량부를 혼합하고 열수 추출하여 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 수득하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 유산균으로 발효시켜 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 수득하는 단계;를 포함하는 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법을 제공한다.

상기 (ⅰ) 단계에서 녹차 및 용매의 중량비는 1:1-50, 바람직하게는 1:5 내지 20일 수 있다. 녹차 및 용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나면, 수율이 낮아지거나, 녹차의 유효성분이 적은 양으로 추출되어 바람직하지 않다.

상기 녹차 추출물 100 중량부에 대하여 누에고치는 0.5 내지 50 중량부, 바람직하게는 0.7 내지 20 중량부로 혼합되는 것일 수 있다. 상기 녹차 추출물 100 중량부에 대하여 누에고치가 상기 하한치 미만으로 혼합되면, 항산화 및 피부 주름 개선 효능의 증가를 기대할 수 없고, 반대로 상기 상한치 초과로 포함되면 오히려 항산화 및 피부 주름 개선 효능이 저하될 수 있다.

상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 (ⅰ) 단계는 60 내지 100 ℃에서 1 분 내지 3 시간 동안 수행되고, 상기 (ⅱ) 단계는 100 내지 150 ℃에서 30 분 내지 3 시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 (ⅰ) 단계는 65 내지 80 ℃에서 3 분 내지 30 분 동안 수행되고, 상기 (ⅱ) 단계는 110 내지 130 ℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 이때 상기 (ⅰ) 단계 또는 (ⅱ) 단계 중 어느 하나 이상의 온도 및 시간이 상기 하한치 미만이면, 항산화 및 피부 주름 개선 효능이 낮아질 수 있고, 반대로 상기 상한치 초과이면 녹차 및 누에고치 내 성분들이 변형될 수 있다.

상기 유산균은 락토바실루스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii), 락토바실러스 아밀로필러스(Lactobacillus amylophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobaccilus brevis), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 카테나포르미(Lactobacillus catenaforme) 및 락토바실러스 미누투스(Lactobacillus minutus) 중 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 락토바실루스 커바투스(Lactobacillus curvatus)일 수 있다. 특히, 락토바실루스 커바투스(Lactobacillus curvatus)를 사용할 때 현저하게 향상된 피부 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다.

상기 발효는 상기 유산균을 20 내지 45 ℃에서 36 내지 60 시간 동안, 바람직하게는 25 내지 40 ℃에서 40 내지 50 시간 동안 배양시켜 1X10⁹ 내지 5X10⁹ cfu/mL의 농도로 수득한 후 상기 녹차 및 누에고치 복합 추출물에 접종시키는 것일 수 있다. 이때 유산균의 농도가 상기 하한치 미만이면 제조되는 유산균 발효물의 항산화 및 피부주름 개선 효과를 기대하기 어려우며, 배양 조건을 달리하여도 상기 상한치를 초과하여 농도가 증가하지는 못한다.

상기 발효는 상기 복합 추출물 100 중량부에 대하여 1X10⁹ 내지 5X10⁹ cfu/mL 농도의 유산균 배양액을 0.5 내지 50 중량부, 바람직하게는 5 내지 15 중량부를 혼합하여 수행되는 것일 수 있다. 유산균이 상기 중량부 미만이면, 발효가 충분히 일어나지 않아 바람직하지 않고, 반대로 상기 상한치를 초과하는 경우에는 발효 효율이 저하되어 바람직하지 않다.

상기 발효는 상기 녹차 및 누에고치 복합 추출물과 상기 유산균을 혼합하여 20 내지 45 ℃에서 12 내지 60 시간 동안, 바람직하게는 25 내지 40 ℃에서 20 내지 40 시간 동안 발효시키는 것일 수 있다. 발효 온도 및 시간 중 어느 하나 이상이 상기 하한치 미만이면, 발효가 충분히 일어나지 않아 항산화 및 피부 주름 개선 효과가 거의 나타나지 않을 수 있고, 반대로 상기 상한치 초과이면, 유산균의 활성이 저하될 수 있어 바람직하지 않다.

상기 (ⅲ) 단계 이후에 상기 복합 발효물을 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이를 통해 상기 복합 발효물의 산화 및 변성을 방지할 수 있다. 상기 멸균은 100 내지 150 ℃에서 수행되는 고압멸균일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법에 따라 제조된 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 포함하는 항산화 및 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 “항산화”란 여러 원인으로 인한 산화반응 및 산화스트레스로부터 피부를 보호하는 것으로, 보다 구체적으로는 산화에 따른 자유라디칼 또는 활성산소종에 의한 세포의 산화를 억제하고, 이를 통해 세포의 손상이 감소되는 것을 의미한다.

본 발명의 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 DPPH(1,1-dipenyl-2-picrylhydrazyl) 자유라디칼 소거능을 가져 항산화 효과를 가질 수 있다.

본 명세서에서 “피부 주름”이란 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 이러한 피부주름의 원인으로는 유전자, 콜라겐의 감소, 외부 환경 등을 들 수 있다. 본 명세서에서 “피부 주름 개선”이란 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나 이미 생긴 주름을 완화시키는 것을 의미한다.

피부 섬유아세포의 주된 기능으로 세포외기질 합성과 증식을 통한 손상된 피부 조직 재생 등을 들 수 있는데, 광노화와 같은 외인성 노화 요인 또는 유리 산소에 의한 손상 누적, 텔로미어 단절로 인한 세포 노화 등에 따른 내인성 노화 요인들은 진피층 내에 있는 피부섬유아세포의 생리 활성 기능을 저하시키게 된다. 피부 세포외기질 중 95% 이상을 차지하고, 세포의 부착분자(adhesion molecule) 및 세포 골격(cytoskeleton) 등과의 상호 작용과 신호 교류를 통해 섬유아세포의 생리 활성에 매우 주요한 부분을 담당하는 타입 I 콜라겐의 합성이 저하될 경우, 피부 조직 내 콜라겐 양이 감소되고, 이에 따라 표면 장력이 감소되어 피부 탄력이 저하되고 피부 주름이 형성될 뿐만 아니라, 세포의 증식 및 재생 기능을 포함하는 생리 활성 기능이 감소하는 악순환의 원인이 된다. 이에 피부섬유아세포의 콜라겐은 피부 탄력, 주름 형성 및 피부 손상 시 조직의 수복 또는 재생과 직접적인 관련이 있다. 즉 피부섬유아세포의 콜라겐 또는 프로콜라겐의 합성이 촉진되거나, 콜라겐을 분해하는 기질 단백질 분해효소(matrix metallo-proteinase, 이하 'MMP'라 함)의 합성이 저해되면, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생 및 피부 노화 방지 등의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 MMP-1 발현을 억제시키며, 타입 I 프로콜라겐 단백질의 생성을 증가시킨다. 이에 본 발명의 화장료 조성물은 피부 탄력 개선, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생 및 피부 노화 방지 등의 효과를 가져 피부 주름 개선의 효과를 가질 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 화장료 조성물 내에사 항산화 및 피부주름 개선 효능을 제공하기에 바람직한 임의의 함량으로 조성물에 존재할 수 있다. 일 양태에 따르면, 상기 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 화장료 조성물 전체 100 중량%에 대하여 0.0001 내지 30 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 정제수나 추가의 유상성분, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 배합성분의 구쳬예로는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 자외선 흡수제, pH 조정제, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 항산화 및 피부주름 개선 효과를 갖는 화장품 또는 세안제 등에 다양하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스와 같은 화장품류와 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저같은 세안제류를 들 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 발효물 외에 피부학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다.

상기 보습제는 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 솔비톨, 헥실렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 디글리세린,1,2-헥산디올, 판테놀, 베타인, 스쿠알란, 바셀린, 유동파라핀 및 하이드롤라이즈드 밀 글루텐 중 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 녹차 및 누에고치 복합 발효물

녹차 가루와 증류수를 1:10 중량비로 혼합한 후 70 ℃에서 5 분 동안 추출하여 녹차 추출물을 수득하였다. 그 다음 상기 녹차 추출물과 누에고치를 100:1 중량비로 혼합하고 121 ℃에서 1 시간 30 분 동안 추출하여 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 제조하였다.

그 다음 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus Curvatus)를 유산균 MRS 고체 배지에서 30 ℃에서 24 시간 동안 1차 배양한 후 MRS 액체 배지에서 30 ℃에서 24 시간 동안 2차 배양하여 4X10⁹ cfu/mL 농도의 락토바실러스 커바투스 배양액을 수득하였다.

그 다음 상기 복합 추출물 100 중량부에 상기 배양액 10 중량부를 접종하고 30 ℃에서 24 시간 동안 발효시킨 후 0.5 ㎛ 여과지로 여과하여 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 수득하였다.

비교예 1. 녹차 및 누에고치 복합 추출물

상기 실시예 1의 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 그대로 사용하였다.

비교예 2. 녹차 및 누에고치 혼합 추출물

녹차 및 누에고치가 10:1 중량비로 혼합된 혼합물과 증류수를 1:10 중량비로 혼합한 후 70 ℃에서 5 분 동안 추출하여 녹차 및 누에고치 혼합 추출물을 수득하였다.

비교예 3. 녹차 및 누에고치 혼합 추출물

121 ℃에서 1 시간 30 분 동안 추출한 것을 제외하고, 상기 비교예 2와 동일한 방법으로 녹차 및 누에고치 혼합 추출물을 수득하였다.

시험예

모든 통계 분석은 SPSS 버전 18.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었다. Duncan의 post-hoc test를 이용한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 실험군 간의 평균값의 차이(p <0.05)를 결정하였다. 각각의 실험데이터는 평균±표준 편차(SD)로 표시하였다.

시험예 1. MTT assay를 이용한 세포독성 평가

배양된 HaCaT 세포를 DMEM 배지에 잘 혼합한 후 1x10⁵ cells/mL로 조정한 다음, 24-well 배양판에 준비된 세포를 1 mL씩 첨가한 후 3-4일 배양하였다. 세포가 80% 정도 성장했을 때 우태아 혈청과 항생제를 첨가하지 않은 배지에 다양한 농도의 시료(0.01 및 0.05 μg/mL)로 처리한 후, 24시간 더 배양을 하고, 배양이 끝난 세포의 생존율은 MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 환원 방법을 이용하여 측정하였다.

각 well에 MTT 용액(5 mg/mL)을 성장배지 부피의 10분의 1 가량 가한 후, 다시 37 ℃에서 4시간 더 배양하였다. 그리고, MTT를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 따라 나가지 않도록 조심하며 배지를 제거하고, 남아 있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30 분간 방치한 후 DMSO를 이용하여 시료를 용해시킨 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 하기 수학식 1과 같이 계산한 후, 하기 표 1에 나타내었다.

[수학식 1]

세포 생존율(%)=(A/B)x100

(A: 시료처리군의 흡광도, B: 대조군의 흡광도)

	세포 생존율(%)
	시험액 농도(㎍/mL)
	0.5	5	10
대조군	100±1.1
실시예 1	123±1.3	120±1.8	131±0.7
비교예 1	132±0.9	124±1.3	127±1.5
비교예 2	114±2.3	128±0.7	125±2.1
비교예 3	124±1.7	113±0.7	128±1.1

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 인간 피부에 안전하게 사용될 수 있다.

시험예 2. 항산화능 평가

(1) DPPH 라디칼 제거능

상기 실시예 및 비교예의 추출물을 다양한 농도로 희석한 시험액 100 μL와 DPPH 용액(0.1 mM, ethanol) 900 μL를 혼합하고 실온에서 20 분 동안 반응시킨 후 에탄올에 의해 생긴 불순물을 원신분리를 통해(10,000×g, 5 min) 제거한 후 spectrophotometer를 통해 517 nm에서 흡광도를 측정하고 하기 수학식 2에 따라 DPPH radical 소거활성을 계산하여 그 결과를 표 2에 나타내었으며, 양성 대조군으로는 L-아스코르브산 30 ㎍/mL를 이용하였다.

[수학식 2]

DPPH radical scavenging activity(%)={1-(A/B)}x100

(A: 시료처리군의 흡광도, B: 대조군의 흡광도)

	DPPH 라디칼 소거 활성(%)
	시험액 농도(㎍/mL)
	0.5	5	10
양성대조군	85.4±2.5
실시예 1	66.1±0.5	75.7±0.7	83.2±1.6
비교예 1	31.5±1.2	42.7±0.3	53.8±2.1
비교예 2	12.5±0.7	17.8±0.7	23.1±1.9
비교예 3	20.1±0.4	23.4±0.5	27.5±0.4

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 녹차 및 누에고치 혼합 추출물(비교예 2 내지 3) 보다 비교예 1의 녹차 및 누에고치 복합 추출물에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 더 향상된 것을 알 수 있다. 한편, 녹차 및 누에고치 복합 발효물(실시예 1)은 비교예 1 내지 비교예 3 보다 DPPH 라디칼 소거 활성이 현저하게 증가하였을 뿐 아니라, 고농도일 때 양성 대조군과 동등 수준의 DPPH 소거능을 보이는 것을 확인하였다.

이를 통해 본 발명의 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 피부의 노화를 진행시키는 산화 스트레스를 강력하게 억제할 수 있어 우수한 항산화능을 가짐을 확인할 수 있다.

시험예 3. 피부주름 개선 효과

HS68 세포 배양

HS68 세포는 DMEM 배지 (Welgene)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포 배양액 (complete DMEM 배양액)을 사용하여 37 ℃ 습윤한 CO₂ 배양기 (5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 trypsin-2.65 mM EDTA를 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.

콜라게나이즈(MMP-1) 억제 효과

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포 외 간질에 존재하고, 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로 타입 I 콜라겐이 대부분을 차지하며 타입 Ⅱ collagen 및 fibronectin 등으로 구성되며, 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 콜라겐은 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부 (진피)에 그 함유량이 높다. 피부 내 콜라겐의 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면 진피 매트릭스의 성분이 증가되어 주름개선, 탄력증진, 피부강화, 상처치유의 효과를 기대할 수 있다.

한편, 노화가 진행되면 섬유아세포의 작용과 세포수가 감소하여 콜라게나이즈의 작용이 증가하게 된다. 콜라게나이즈(Collagenase)는 체내 콜라겐을 분해하여 피부 주른 생성 및 탄력저하를 일으키는 효소로서, 코라게나이즈의 작용이 증가하면 콜라겐의 가교된 형태를 증가시켜 피부의 매끄러움, 수분 및 탄력을 감소시켜 피부에 주름이 생기게 된다.

체내에서 생성되는 콜라게나이제 효소 중 MMP-1 활성을 억제하면 콜라겐 분해를 감소시켜 피부조직의 탄력을 유지하고 주름 생성을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이에 시험예 3에서는 상기 실시예 및 비교예의 MMP-1 활성 억제능을 확인하였다.

보다 구체적으로, HS68 세포를 1 × 10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 시험물질을 다양한 농도로 함유한 serum-free 세포배양액으로 교환하여 세포를 24시간 배양하였다. 세포를 24 시간 배양한 후 세포배양액을 수거하여 Human MMP-1 ELISA Kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 MMP-1 함량을 측정하고 하기 수학식 2에 따라 MMP-1 저해활성을 계산하여 하기 표 3에 나타내었으며, 양성대조군으로는 TGF-β(10 ㎍/mL)을 사용하였다.

[수학식 2]

MMP-1 저해 활성(%)=[1-(A/B)]X100

(A: 시료 첨가구의 흡광도, B: 무처리구의 흡광도)

	MMP-1 저해 활성(%)
	시험액 농도(㎍/mL)
	1	5	10	15
양성대조군	71.7±1.2
실시예 1	61.2±1.7	63.8±0.6	67.1±1.9	73.2±0.4
비교예 1	23.5±0.3	27.1±1.6	32.7±0.8	38.6±1.8
비교예 2	9.17±1.5	11.35±2.3	16.98±1.3	20.36±2.1
비교예 3	12.3±1.9	13.78±1.1	14.19±2.3	16.91±2.7

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 녹차 및 누에고치 혼합 추출물(비교예 2 내지 3)은 MMP-1 저해 활성이 낮았으며, 녹차 및 누에고치 복합 추출물(비교예 1)은 그에 비해 MMP-1 저해 활성이 증가하였지만, 양성대조군에 비하여 훨씬 낮은 MMP-1 저해 활성을 나타내었다. 반면, 실시예 1의 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 비교예에 비하여 현저하게 향상된 MMP-1 저해 활성을 나타내었다. 특히, 녹차 및 누에고치 복합 추출물(비교예 1) 보다 약 2배의 MMP-1 저해 활성을 나타내어 우수한 피부 주름 개선 효능을 위해서는 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 유산균으로 발효하여 사용하는 것이 중요함을 알 수 있었다.

이를 통해, 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 화장료 조성물에 적용되어 MMP-1를 저해하여 피부 주름을 효과적으로 개선 및 예방할 수 있음을 알 수 있었다.

타입 I 프로콜라겐 함량 측정

섬유아세포를 48 well plate에 1X10⁴ cells/well의 밀도로 분주하고, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후에, 실시예 또는 비교예의 시료를 첨가하고 무혈청 배지에서 24시간 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 procollagen type I C-peptide EIA kit(MK101, Takara, Japan)을 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.

	타입 I 프로콜라겐 함량(%)
	시험액 농도(㎍/mL)
	1	5	10	15
대조군	100
실시예 1	150.39±1.5	161.54±0.5	173.25±1.5	183.25±0.7
비교예 1	117.28±1.7	126.68±2.1	135.82±1.8	141.23±1.3
비교예 2	101.54±0.9	103.12±1.8	104.41±0.7	106.55±2.6
비교예 3	108.55±2.3	113.62±0.7	117.63±2.1	121.67±1.5

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 녹차 및 누에고치 혼합 추출물은 타입 I 프로콜라겐 함량이 대조군에 비하여 크게 증가하지 못하여 피부 주름 개선 효능이 낮음을 알 수 있다. 반면, 녹차 및 누에고치 복합 발효물은 비교예에 비하여 타입 I 프로콜라겐의 함량을 크게 증가시켜 피부 주름 예방 및 개선에 매우 유용한 성분임을 알 수 있었다.

이하, 본 발명을 적용하기에 적합한 화장료 조성물의 제조예를 제시하기로 한다.

제조예 1. 화장수

실시예 1의 복합 발효물 6 중량 %, 글리세린 7 중량 %, 1,3-부틸렌글라이콜 3중량 %, 피이지1500 1중량 %, 알라토인 0.1 중량 %, DL-판테놀 0.3 중량 %, EDTA-2Na 0.02 중량 %, 벤조페논-9 0.04 중량 %, 소듐하이알루로네이트 5중량 %, 에탄올 10 중량 %, 폴리소르베이트20 0.3 중량 % 및 잔량의 증류수를 혼합하여 실시예 1의 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 포함하는 화장수를 제조하였다.

제조예　2. 로션

실시예 1의 복합 발효물 3 중량 %, 프로필렌글리콜 1.5 중량 %, 글리세린 4 중량 %, 트리에탄올아민 1.2 중량 %, 토코페릴아세테이트 3 중량 %, 유동 파라핀 5 중량 %, 스쿠알란 3 중량 %, 마카다미너트오일 2 중량 %, 폴리소르베이트 60 1.5 중량 %, 소르비탄세스퀴올레이트 1 중량 %, 카르복시비닐폴리머 1 중량 %, 방부제, 향, 색소 미량 및 잔량의 증류수를 혼합하여 실시예 1의 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 포함하는 로션을 제조하였다.

제조예 3. 영양크림

실시예 1의 복합 발효물 1.0 중량 %, 친유형 모노스테아린산글리세린 1.5 중량 %, 세테아릴 알코올 1.5 중량 %, 스테아린산 1.0 중량 %, 폴리소르베이트 60 1.5 중량 %, 소르비탄 스테아레이트 0.6 중량 %, 이소스테아릴이소스테아레이트 5.0 중량 %, 스쿠알란 5.0 중량 %, 광물유 35.0 중량 %, 디메치콘 0.5 중량 %, 하이드록시에칠셀룰로오스 0.12 중량 %, 글리세린 6.0 중량 %, 트리에탄올아민 0.7 중량 %, 방부제, 향, 색소 미량 및 잔량의 증류수를 혼합하여 영양크림을 제조하였다.

제조예　4. 에센스

실시예 1의 복합 발효물 1.5 중량 %, 글리세린 10.0 중량 %, 베타인 5.0 중량 %, PEG 1500 2.0 중량 %, 알란토인 0.1 중량 %, DL-판테놀 0.3 중량 %, EDTA-2Na 0.02 중량 %, 벤조페논-9 0.04 중량 %, 하이드록시에칠셀룰로오스0.1 중량 %, 소듐하이알루로네이트 8.0 중량 %, 카르복시비닐폴리머 0.2 중량 %, 트리에탄올아민 0.18 중량 %, 옥틸도데칸올 0.3 중량 %, 옥틸도데세스-16 0.4 중량 %, 에탄올 6.0 중량 %, 방부제, 향, 색소 미량 및 잔량의 증류수를 혼합하여 에센스를 제조하였다.

실시예 5. 마스크팩용 유액

실시예 1의 복합 발효물 1.0 중량 %, 폴리비닐알코올 15.0 중량 %, 셀룰로오스 검 0.15 중량 %, 글리세린 3.0 중량 %, PEG 1500 2.0 중량 %, 사이클로덱스트린 0.15 중량 %, DL-판테놀 0.4 중량 %, 알란토인 0.1 중량 %, 글리시리진산모노암모늄 0.3 중량 %, 니코틴아마이드 0.5 중량 %, 에탄올 6.0 중량 %, PEG 40 경화 피마자유 0.3 중량 %, 방부제, 향, 색소 미량 및 잔량의 증류수를 혼합하여 마스크 팩용 유액을 제조하였다.

본 연구에 대한 연구비 및 출원 비용은 지역 활성화 품목 마케팅 활성화 지원사업을 통하여 전라남도와 순천시로부터 지원 받았으며, 주제는 지역 특화품목 발굴·상품개발 및 차문화·산업의 활성화 ((사)고려천태국제선차연구보존회 주관)이다.

Claims

(ⅰ) 녹차 및 용매를 1:1 내지 50 중량비로 혼합하고 열수 추출하여 녹차 추출물을 수득하는 단계;
(ⅱ) 상기 녹차 추출물 100 중량부에 대하여 누에고치 0.5 내지 50 중량부를 혼합하고 열수 추출하여 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 수득하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 녹차 및 누에고치 복합 추출물을 유산균으로 발효시켜 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 수득하는 단계;를 포함하는 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (ⅰ) 단계는 60 내지 100 ℃에서 1 분 내지 3 시간 동안 수행되고,
상기 (ⅱ) 단계는 100 내지 150 ℃에서 30 분 내지 3 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실루스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii), 락토바실러스 아밀로필러스(Lactobacillus amylophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobaccilus brevis), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 카테나포르미(Lactobacillus catenaforme) 및 락토바실러스 미누투스(Lactobacillus minutus) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 발효는 상기 녹차 및 누에고치 복합 추출물과 상기 유산균을 혼합하여 20 내지 45 ℃에서 12 내지 60 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따라 제조된 항산화 및 피부주름 개선 효능이 증진된 녹차 및 누에고치 복합 발효물을 포함하는 항산화 및 피부주름 개선용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 복합 발효물은 타입 I 프로콜라겐 함량을 증가시키고, MMP-1의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 피부주름 개선용 화장료 조성물.