KR20230104846A - 나사균 및 그의 피부 상태 개선 용도 - Google Patents

나사균 및 그의 피부 상태 개선 용도 Download PDF

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Abstract

신규한 미생물, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 및 이들의 피부상태 개선 용도에 관한 것이다.

Description

나사균 및 그의 피부 상태 개선 용도{NASA bacteria and improving skin condition uses of thereof}
신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 및 이들의 피부상태 개선 용도에 관한 것이다.
피부장벽은 죽은 각질세포와 세포간 지질로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 즉, 체내에서 지나친 수분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다. 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피에는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질형성세포는 분화를 통해 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다.
기능성 화장품 분야에서, 피부 노화를 지연시켜 피부의 주름개선에 도움을 주는 제품, 자외선 및 외부환경으로부터 피부를 보호하는 제품, 피부의 미백에 도움을 주는 제품에 대한 관심이 매우 높다. 이 중에서도 고령화 사회로 진입함에 따라, 피부 노화를 지연시키기 위한 주름 개선 화장품의 개발하기 위한 노력이 지속되고 있는 실정이다. 일반적으로 노화된 피부에서 나타나는 주름살과 피부의 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등은 대부분 진피에 존재하는 기질 단백질의 변화 때문이다. 진피는 피부 내에서 피부의 강도와 형태를 지지하는 역할을 하고 있기 때문에, 노화가 진행될 때 이 영역에서의 형태적인 변화가 일어나게 되면, 주름 생성 및 피부 쳐짐에 결정적인 역할을 하게 된다. 이러한 기질 단백질을 분해하는 효소로 Matrix metalloproteinases(MMPs)가 대표적이며, 한 번의 자외선 조사에도 피부 내의 MMPs 활성이 증가되고, 피부 내의 콜라겐 및 기타 기질단백질을 현저하게 분해시켜 피부 노화를 촉진하는데 주요한 요인으로 작용한다.
피부 노화 중 광노화는 피부의 가장 큰 노화 인자로 고려되고 있으며, 이에 따라 광노화를 예방하기 위한 제품이 많이 출시되고 있으나, 천연 소재를 이용한 광노화 방지 기술은 사용이 제한적이고 효능 검증시 여러가지 문제가 발생하는 경우가 많다는 한계점이 있다.
이에, 피부 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있는 신규한 균주의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 데이노코커스 속(Deinococcus sp.)에 속하는 데이노코커스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans) 균주를 제공한다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 양상은 데이노코커스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans) 균주를 제공한다.
상기 데이노코커스 균주는 기탁번호 KCCM12643P로 기탁된 균주일 수 있다.
상기 데이노코커스 균주는 서열번호 1의 16s rRNA를 포함하는 균주일 수 있다.
상기 균주는 피부 미용 개선 효과, 예를 들면, 항산화 효과, 피부 노화 억제, 피부 주름 억제, 피부 장벽 강화, 피부 미백, 또는 피부 보습 효과를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 소양증 또는 피부 염증을 개선하는 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 균주는 항노화 및 항주름 인자의 발현을 증가(예를 들면, COL1A1, 또는 엘라스틴(ELN)), 또는 감소(MMP-1)시키는 것일 수 있다. 상기 균주는 피부 장벽 및 피부 보습 관련 히알루론산 합성 효소 3(HAS3: Hyaluronan synthase　3) 또는 필라그린의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 균주는 염증성 사이토카인(예를 들면, IL-1β)의 발현을 억제하거나, 아토피 및 가려움증 관련 인자(예를 들면, TSLP)의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 균주는 피부 미백 관련 멜라닌 합성을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 균주는 자유라디칼 소거능을 가져 항산화 활성을 가지는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 데이노코커스 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 　한편, 상기　배양액　중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며,　배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의　균주　자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한　균주　자체 또는 상기　균주를 배양하여　배양액으로부터 분리한　균주를 포함한다. 상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
상기 배양액은 데이노코커스 균주를 배지(예를 들면, R2A 배지 또는 TSA 배지) 에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배양액은 MRS(De Man, Rogosa and Sharpe) 배지 또는 BCY 배지에서의 배양액인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배양액은 데이노코커스 균주를 MRS 배지 또는 BCY 배지에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
MRS 배지는 펩톤, 소고기 추출물, 효모 추출물, 포도당, 아세트산나트륨, 폴리소르베이트 80, 디포타슘 하이드로젠 포스페이트, 암모늄 시트레이트, 황산마그네슘, 황산망간, 아가 및 증류수로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나, 이들의 2 이상의 조합, 또는 이들 모두를 포함하는 것일 수 있다. 상기 언급된 배지 내 성분들의 농도는 적절히 변경가능하며, MRS 배지는 상업적으로 구매 가능한 MRS라 불리우는 모든 배지를 포함하는 개념일 수 있다.
BCY 배지는 아세트산나트륨, 황산마그네슘, 황산망간, 디포타슘포스페이트, 카세인 췌장 소화물(Pancreatic digest of casein), 대두의 파파익 소화물(펩톤 S)(Papaic digest of soybean)(Peptone S), 덱스트로스, 및 소듐클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나, 이들의 2 이상의 조합, 또는 이들 모두를 포함하는 것일 수 있다. 상기 언급된 배지 내 성분들의 농도는 적절히 변경가능하다.
일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 데이노코커스 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 데이노코커스 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 그의 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 균주의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료, 피부 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 노화 억제 또는 개선, 항 주름, 피부 미백, 피부 장벽 강화, 또는 피부 보습일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다.
상기 균주 또는 이의 배양액은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.
상기 노화는 광노화일 수 있다. 용어 "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.
본 명세서에서 용어 "주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 색소 침착은 체내에 있는 색소의 양이 비정상적인 경우 또는 색소가 나타나는 장소에 이상이 있는 상태를 의미하며, 예를 들면 기미 및 주근깨 등인 것일 수 있다. 상기 "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 미백"은　멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미할 수 있다.
상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "항염증"이란 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증일 수 있다. 용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.
상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 염증성 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.00001 중량% 내지 60 중량%, 0.00001 중량% 내지 40 중량%, 0.00001 중량% 내지 30 중량%, 0.00001 중량% 내지 20 중량%, 0.00001 중량% 내지 10 중량%, 0.00001 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물을 포함할 수 있다.
용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.
상기 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 또는 염증과 관련된 상태일 수 있다.
용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 미백, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 염증 억제, 소양증 억제, 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.00001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.00001 mg 내지 500 mg, 0.00001 mg 내지 100 mg, 0.00001 mg 내지 50 mg, 0.00001 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 신규 데이노코커스 균주에 의하면, 피부 관련 상태 또는 염증 관련 상태의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 자외선 비처리 및 균주 배양액 비처리군; (-): 자외선 처리 및 균주 배양액 비처리군; BCY: 자외선 처리 및 균주 배양액 미함유 BCY 배지 처리군; BCY NASA: BCY 배지를 사용한 나사균 배양액 10%(w/w) 처리군.
도 2는 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 자외선 비처리 및 균주 배양액 비처리군; (-): 자외선 처리 및 균주 배양액 비처리군; Deinococcus radiodurans: TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
도 3은 일 구체예에 따른 균주가 ELN의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 자외선 비처리 및 균주 배양액 비처리군; (-): 자외선 처리 및 균주 배양액 비처리군; BCY: 자외선 처리 및 균주 배양액 미함유 BCY 배지 처리군; BCY NASA: BCY 배지를 사용한 나사균 배양액 10%(w/w) 처리군.
도 4는 일 구체예에 따른 균주가 ELN의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 자외선 비처리 및 균주 배양액 비처리군; (-): 자외선 처리 및 균주 배양액 비처리군; Deinococcus radiodurans: TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
도 5은 일 구체예에 따른 균주가 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 자외선 비처리 및 균주 배양액 비처리군; (-): 자외선 처리 및 균주 배양액 비처리군; Deinococcus radiodurans: TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
도 6은 일 구체예에 따른 균주가 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 비처리군; MRS control: 균주 배양액 미함유 MRS 배지 처리군; MRS NASA: MRS 배지를 사용한 나사균 배양액 10%(w/w) 처리군; BCY control: 균주 배양액 미함유 BCY 배지 처리군; BCY NASA: BCY 배지를 사용한 나사균 배양액 10%(w/w) 처리군; RA: 레티노산 1 uM을 처리한 양성대조군.
도 7은 일 구체예에 따른 균주가 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 비처리군; RA: 레티노산 1 uM을 처리한 양성대조군; Deinococcus radiodurans: TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
도 8은 일 구체예에 따른 균주가 필라그린의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 비처리군; Deinococcus radiodurans: TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
도 9는 일 구체예에 따른 균주가 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 비처리군; (+): Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 균주 배양액 비처리군; MRS control: Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 균주 배양액 미함유 MRS 배지 처리군; MRS NASA: Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 MRS 배지를 사용한 나사균 배양액 10%(w/w) 처리군; BCY control: Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 균주 배양액 미함유 BCY 배지 처리군; BCY NASA: Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 BCY 배지를 사용한 나사균 배양액 10%(w/w) 처리군; Dex: Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 덱사메타손 1 uM을 처리한 양성대조군.
도 10은 일 구체예에 따른 균주가 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 비처리군; (-): Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 균주 배양액 비처리군; Deinococcus radiodurans: Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
도 11은 일 구체예에 따른 균주가 아토피 및 가려움증 관련 인자인 TSLP의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. None: 비처리군; (-): Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 균주 배양액 비처리군; Deinococcus radiodurans: Poly I:C 및 IL-4 처리, 및 TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
도 12는 일 구체예에 따른 균주의 멜라닌 합성 억제 활성을 나타낸 그래프이다. None: 비처리군; Veh.: α-MSH 처리군; Deinococcus radiodurans: α-MSH 처리 및 TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
도 13은 일 구체예에 따른 균주의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다. None: 비처리군; AA: 아스코르빈산 처리군; Deinococcus radiodurans: TSB 배지를 사용한 나사균 배양액 1%(w/w) 처리군.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 나사균의 분리 및 동정
나사균을 분리 및 동정하기 위해, 여의도 공원 근처의 한강 상층수를 멸균된 병에 500ml 담아서 채집하였다. 이후에, 5kGy 감마선을 조사하였고, 감마선 조사를 마친 시료를 연속희석법으로 희석한 후, 현탁액을 R2A agar(Difco) 배지에 도말하여 27℃에 3일간 배양하는 과정으로 균을 선별하였다. 배양이 완료된 집락에 대해 PCR 증폭을 수행하였고, 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석 하였을 때 상동성 99% 이하의 데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) 균주(이하 '나사균'이라 함)를 선별하였다. 선별된 나사균을 2019년 12월 18일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM12643P를 부여 받았으며, 나사균은 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 서열을 갖는다.
실시예 2. 나사균 배양액의 제조
실시예 1의 나사균을 다양한 종류의 배지에서 배양하여 나사균 배양액을 제조하였다.
(1) BCY 배지를 사용한 나사균 배양액의 제조
배양액으로 BCY 배지(성분: 아세트산나트륨(Sodium acetate), 황산마그네슘(Magnesium sulphate), 황산망간(Manganese sulphate), 디포타슘포스페이트(Dipotassium phosphate), 카세인 췌장 소화물(Pancreatic digest of casein), 대두의 파파익 소화물(Papaic digest of soybean), 덱스트로스(Dextrose), 소듐클로라이드(Sodium chloride) 함유)를 사용하여 나사균 배양액을 제조하였다. 이렇게 제조된 나사균 배양액은 BCY NASA로 명명하였다.
(2) MRS 배지를 사용한 나사균 배양액의 제조
배양액으로 MRS 배지(De Man, Rogosa and Sharpe; 구입처: HiMedia Laboratories; 카탈로그 No.: M369-500G; 제품명: Lactobacillus MRS Broth; 성분: 아세트산나트륨(Sodium acetate), 황산마그네슘(Magnesium sulphate), 황산망간(Manganese sulphate), 디포타슘포스페이트(Dipotassium phosphate))를 사용하여 나사균 배양액을 제조하였다. 이렇게 제조된 나사균 배양액은 MRS NASA로 명명하였다.
(3) TSB 배지를 사용한 나사균 배양액의 제조
배양액으로 TSB(tryptic soy broth; BC, USA) 배지를 사용하여 50 ml tube에서 나사균을 증균 배양하여 나사균 배양액을 제조하였다. 이때 증균 배양은 100rpm/min으로 균주를 현탁하여 배양하였으며, 상기 배양기간 동안의 온도는 약 25℃였고, 약 72시간 배양 후 배양을 종료하였다. 이후, 상기 배양액은 0.45 필터를 사용하여 필터 멸균을 수행하였다. 이렇게 제조된 나사균 배양액은 TSB NASA로 명명하였다.
실험예 1. 항노화 및 항주름 활성 분석
실시예에서 제조한 나사균 배양액의 피부 노화 및 주름 억제 활성을 분석하였다.
구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68) 를 6 웰 플레이트에 3.5x105로 분주한 후, 37 ℃ 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)를 넣은 후 12 mJ/cm2의 UVB를 조사하거나, 조사하지 않았다. UVB 조사 직후 DPBS를 제거하고 FBS(fetal bovine serum)가 없는 배지로 갈아 준 후, 실시예 2의 BCY NASA 10%(w/w) 또는 TSB NASA 1%(w/w)를 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다.
대조군으로 자외선 처리 및 균주 배양액 비처리군, 및 자외선 처리 및 균주 배양액 미함유 배지 처리군을 사용하였다. 그 후 각 시료의 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 COL1A1(collagen, type I, alpha 1), 엘라스틴(ELN), 및 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)에 대하여 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과는 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주가 ELN의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 균주가 ELN의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5은 일 구체예에 따른 균주가 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 자외선에 의해 감소된 COL1A1의 발현을 유의적으로 증가시킴을 알 수 있었다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 자외선 조사에 의해 감소된 ELN의 발현을 유의적으로 증가시킴을 알 수 있었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 유의적으로 감소시킴을 알 수 있었다.
이러한 결과는 일 구체예에 따른 균주가 노화(예를 들면, 광노화) 및 주름을 개선할 수 있는 효과가 있음을 의미한다.
실험예 2. 피부 장벽 강화 및 피부 보습 활성 분석
실시예에서 제조한 나사균 배양액의 피부 장벽 강화 및 피부 보습 활성을 분석하였다.
구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃ 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 실시예 2의 MRS NASA 10%(w/w), BCY NASA 10%(w/w), 또는 TSB NASA 1%(w/w)를 각각 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 양성대조군으로는 레티노산(Retinoic Acid: RA) 1 uM을 사용하였다. 피부 장벽 강화 및 보습과 관련된 인자인 HAS3(히알루론산 합성 효소) 및 필라그린(filaggrin)에 대한 프라이머를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 HAS3 및 필라그린의 발현량을 측정하였다. 그 결과는 각각 도 6 내지 도 8에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 균주가 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 균주가 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 균주가 필라그린의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 HAS3 및 필라그린의 발현량을 유의적으로 증가시킴을 알 수 있었다.
이러한 결과는 일 구체예에 따른 균주가 피부 장벽 강화 및 피부 보습에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실험예 3. 항염증, 항아토피 및 항소양증 활성 분석
실시예에서 제조한 나사균 배양액의 항염증, 항아토피 및 항소양증 활성을 분석하였다.
구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃ 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 배지는 3~4일마다 교환해 주며 세포가 과다하게 증식되었을 때는 계대배양 하였다. 이후에 상기 세포를 5x105/웰로 분주하고 배양 24시간 후, 인산 완충 식염수 용액(PBS)으로 세척하였다. FBS를 넣지 않은 DMEM 배지가 들어있는 각 웰에 세포를 분주하고, Poly I:C 10 μg/ml, 및 IL-4 10 ng/ml을 첨가하였다. 다음으로 실시예 2의 MRS NASA 10%(w/w), BCY NASA 10%(w/w), 또는 TSB NASA 1%(w/w)을 각각 처리하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 양성대조군으로는 덱사메타손 1 uM을 사용하였다. IL-1β 및 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)에 대한 프라이머를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 IL-1β 및 TSLP의 발현량을 분석하였고, 그 결과는 도 9 내지 도 11에 나타내었다.
도 9는 일 구체예에 따른 균주가 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 일 구체예에 따른 균주가 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 일 구체예에 따른 균주가 아토피 및 가려움증 관련 인자인 TSLP의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 무처리 대조군 대비 현저하게 염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현을 감소시킴을 알 수 있었다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 무처리 대조군 대비 아토피 및 가려움증 관련 인자인 TSLP의 발현을 감소시킴을 알 수 있었다.
이러한 결과는 일 구체예에 따른 나사균이 피부 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 특히 아토피의 예방, 개선, 또는 치료, 또는 소양증(가려움증)의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실험예 4. 피부 미백 활성 분석
실시예에서 제조한 나사균 배양액의 피부 미백 활성을 분석하였다.
구체적으로, 마우스의 색소세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 실시예 2의 TSB NASA 배양액에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였다. 먼저 murine melanoma(B16 F10) 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM에 현탁시켜 1 Х 105 세포/웰로 6-well plate에 접종하여 웰 바닥에 부착될 때까지 배양하였다. 멜라닌 생성 유도를 위하여, 100 nM α-MSH를 처리하고, 이후 실시예 2의 TSB NASA 1%(w/w)를 첨가한 후 3일간 배양하였다. 배양한 세포는 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고 트립신(trypsin)으로 회수하였다. 회수한 세포를 혈구계(hematocytometer)로 계수하여 1Х106 cells/mL로 동일한 세포수가 되도록 모아 1000rpm, 10분간 원심분리하여 세포만을 얻었다. 회수된 세포를 60℃에서 1시간 건조시켜 10% DMSO가 포함된 1M NaOH용액 100 ㎕을 넣어 세포 내의 멜라닌을 얻었다. 이 멜라닌 액을 Microplate reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 평가하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12는 일 구체예에 따른 균주의 멜라닌 합성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 12에 나타낸 바와 같이, α-MSH로 인해 증가된 멜라닌 합성이 나사균의 배양액 처리에 의해 현저하게 감소된 것을 알 수 있었다.
이러한 결과는 일 구체예에 따른 균주의 배양액이 피부 미백 효능이 있음을 의미한다.
실험예 5. 항산화 활성 분석
실시예에서 제조한 나사균 배양액의 항산화 활성을 분석하였다.
구체적으로, 자유라디칼 소거 활성은　DPPH를 이용하여 측정하였다.　DPPH는 시그마사(Sigma Co., Ltd, 미국)에서 구입하여 사용하였다. 먼저, 1.5 mM(0.06mg/mL)의 표준　DPPH　에탄올 용액을 만들었다. 다음으로, 상기 TSB NASA 1%(w/w)과 양성대조군인 아스코르빈산(5ppm)에 각각 에탄올을 가하여 시료를 만들었다. 그 다음, 상기 시료와 표준　DPPH　용액을 같은 비율로 첨가하여 잘 교반한 후, 37 ℃에서 30 분간 반응시키고 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 상기 대조군은 시료 대신 에탄올을 첨가한 것을 사용하였다. 무첨가 대조군의 자유라디칼 소거능 대비, 상기 균주의 자유라디칼 소거능을 계산하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13은 일 구체예에 따른 균주의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 양성대조군인 아스코르브산과 유사한 수준의 항산화 활성을 가짐을 알 수 있었다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12643P 20191218
SEQUENCE LISTING <110> COSMAX, INC. <120> NASA bacteria and improving skin condition uses of thereof <130> PN132115KR1 <150> KR 10-2020-0024629 <151> 2020-02-27 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1282 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 1 ctgacctacc cagaagtcac gaataactgg ccgaaaggtc cgctaatacg tgatgtggtg 60 atgcaccgtg gtgcatcact aaagatttat cgcttctgga tggggttgcg ttccatcagc 120 tggttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg acgacggata gccggcctga gagggtggcc 180 ggccacaggg gcactgagac acgggtccca ctcctacggg aggcagcagt taggaatctt 240 ccacaatggg cgcaagcctg atggagcgac gccgcgtgag ggatgaaggt tttcggatcg 300 taaacctctg aatctgggac gaaagagcct tagggcagat gacggtacca gagtaatagc 360 accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt tacccggaat 420 cactgggcgt aaagggcgtg taggcggaaa tttaagtctg gttttaaaga ccggggctca 480 acctcgggga tggactggat actggatttc ttgacctctg gagaggtaac tggaattcct 540 ggtgtagcgg tggaatgcgt agataccagg aggaacacca atggcgaagg caagttactg 600 gacagaaggt gacgctgagg cgcgaaagtg tggggagcaa accggattag atacccgggt 660 agtccacacc ctaaacgatg tacgttggct aagcgcagga tgctgtgctt ggcgaagcta 720 acgcgataaa cgtaccgcct gggaagtacg gccgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac 780 gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 840 caggtcttga catgctagga actttgcaga gatgcagagg tgcccttcgg ggaacctaga 900 cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 960 cgagcgcaac ccttgccttt agttgtcagc attcagttgg acactctaga gggactgcct 1020 atgaaagtag gaggaaggcg gggatgacgt ctagtcagca tggtccttac gtcctgggcg 1080 acacacgtgc tacaatgggt aggacaacgc gcagcaaacc cgcgagggta agcgaatcgc 1140 taaaacctat ccccagttca gatcggagtc tgcaactcga ctccgtgaag ttggaatcgc 1200 tagtaatcgc gggtcagcat accgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1260 gtcacgccat gggattagat tt 1282

Claims (4)

  1. 기탁번호 KCCM12643P로 기탁된, 데이노코커스 속(Deinococcus sp.)에 속하는 데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) 균주로서,
    상기 균주는 (i) 히알루론산 합성 효소 3(HAS3) 및 필라그린 중 1종 이상의 발현을 증가시키거나, 또는 (ii) 염증성 사이토카인 IL-1β의 발현을 감소시키는 것인 균주.
  2. 청구항 1의 균주의 배양액.
  3. 청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 장벽 개선 또는 보습용 화장료 조성물.
  4. 청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 이들의 혼합물을 포함하며, 염증성 사이토카인 IL-1β의 발현을 감소시키는 것인, 피부 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020230085970A 2020-02-27 2023-07-03 나사균 및 그의 피부 상태 개선 용도 KR102654213B1 (ko)

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KR101927701B1 (ko) * 2018-02-23 2018-12-11 아이큐어 주식회사 디이노코커스 라디오두란스 추출물의 제조방법 및 이의 응용

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