KR20230104160A - 장기-작용성 데옥시리보뉴클레아제(dnase) - Google Patents

장기-작용성 데옥시리보뉴클레아제(dnase) Download PDF

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KR20230104160A
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일리야 루데르퍼
리아트 퍽스
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Abstract

적어도 2개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된 DNase 폴리펩티드를 포함하는, 변형된 DNase 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물이 본 명세서에 기재되어 있다. 변형된 DNase 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 추가로 기재되며, 상기 방법은 알데히드기에 부착된 폴리(알킬렌 글리콜)를 포함하는 작용제와 폴리펩티드를 접촉시켜 폴리펩티드와 작용제의 접합체를 얻는 단계; 및 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

Description

장기-작용성 데옥시리보뉴클레아제(DNASE)
관련 출원
본 출원은 2020년 10월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/088,496호의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열 목록 상태
2021년 10월 5일에 생성된 89420.txt라는 제목의 ASCII 파일은 16,384바이트로 구성되며, 본 출원의 제출과 동시에 제출되어 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명은, 일부 구체예에서, 요법(therapy)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 장기-작용성(long-acting) DNase에 관한 것이지만, 한정되는 것은 아니다.
데옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease, DNase) 단백질은 생화학적 특성 및 효소 활성에 따라, DNase I 및 DNase II의 두 가지 유형으로 분류된다. DNase I 단백질은 중성에 가까운 최적의 pH를 가지며, DNA 가수분해 시 5'-포스페이트 뉴클레오티드를 생성한다.
인간 DNase I은 포유류 DNase I 패밀리의 멤버(member)이다(EC 3.1.21.1). DNase I은 가수분해 활성이 2가 양이온의 존재에 따라 달라지는, Mg2+ 및 Ca2+ 의존성 엔도뉴클레아제 부류에 속한다. Mg2+ 이온은 포스포디에스테르 결합 절단의 친전자성 촉매 작용에 관여하는 반면, Ca2+는 최적의 효소 구조를 유지한다. DNase I은 피리미딘 뉴클레오티드에 인접한 포스포디에스테르 결합에서 우선적으로 DNA를 절단하여, 3' 위치에 자유 하이드록시기가 있는 5'-포스페이트-말단 폴리뉴클레오티드를 생성하고, 평균적으로 테트라뉴클레오티드를 생성한다. DNase I은 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 염색질에 작용한다.
DNase II(EC 3.1.22.1)는 포스포디에스테르 결합에서 우선적으로 DNA를 절단하여, 3'-포스페이트 및 5'-하이드록실 말단을 갖는 생성물을 생성한다. DNase II는 산성 pH에서 최적으로 기능하며 일반적으로 리소좀에서 발견된다.
인간 DNase의 주요 치료 용도는 폐 분비물에 존재하는 고분자량 DNA를 가수분해함으로써, 폐렴(pneumonia) 및 낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF)과 같은 질환에서 폐 분비물(점액 포함)의 점탄성(viscoelasticity)을 감소시켜, 호흡기 기도의 청소(clearing)를 돕는 것이다[Shak et al., PNAS 87:9188-9192 (1990)]. 점액은 또한 만성 기관지염(chronic bronchitis), 천식성 기관지염(asthmatic bronchitis), 기관지확장증(bronchiectasis), 폐기종(emphysema), 급성 및 만성 부비동염(sinusitis), 심지어 감기의 이환율(morbidity)에 기여한다. 이러한 질환을 가진 사람의 폐 분비물은 점액 당단백질(mucus glycoprotein), 점액다당류(mucopolysaccharide), 프로테아제(protease), 액틴(actin) 및 DNA를 포함하는 복잡한 물질이다. DNase는 또한 비-폐 장애(non-pulmonary disorder), 예를 들어, 남성 불임(male infertility) 및 자궁 장애(uterine disorder)의 치료(미국 특허 출원 공개 번호 제2007/0259367호 참조), 전이성 성장(metastatic growth)의 억제(미국 특허 번호 제7,612,032호 참조) 및 당뇨병성(diabetic) 상처 치유를 위한 국소 적용(topical application)을 위해 제안되었다.
도르나제 알파(Dornase alfa)는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포에서 발현되는 재조합 인간 DNase(rhDNase)로, 낭포성 섬유증의 치료에 사용되고, Pulmozyme®이라는 상품명으로 시판된다.
국제 특허 출원 공보 WO 2013/114374는 식물-발현 인간 재조합 DNase I 단백질, 및 DNase I의 흡입에 의해 폐 및/또는 호흡기 상태를 치료하기 위한 이의 용도를 기재한다.
국제 특허 출원 공보 WO 2016/108244는 동종의 변형되지 않은 DNase I 단백질에 비해 개선된 DNA 가수분해 활성을 나타내는 변형된 DNase I 단백질을 기재한다. 임상 시험을 거친 예시적인 변형된 DNase I 단백질은 "알리도르나제 알파(alidornase alfa)"로 언급된다.
Dwyer et al. [J Biol Chem 1999, 274:9738-9743]은 이량체 형태의 DNase I을 생성하는 DNase I-Fc 융합 단백질의 발현 및 정제를 기재한다. 이량체 DNase I-Fc 융합 단백질은 비록 단량체 DNase I보다 약 10배 적지만, 효소 DNA 소화 분석에서 기능적으로 활성화되었다.
국제 특허 출원 공보 WO 2015/107176은 12 kDa 이상의 분자량을 갖는 하나 이상의 PEG 모이어티로 호흡기 질환을 치료하기 위한 치료제의 PEG화를 기재한다. 특히, 이의 N-말단에 접합된 하나의 PEG 모이어티(20-40 kDa)를 갖는 도르나제 알파가 기재되어 있다.
러시아 특허 제2502803호는 10 kDa PEG-말레이미드와의 접합을 위해 시스테인 잔기를 DNase에 도입하여, 비-변형된 DNase의 효소 활성의 10-20 %를 나타내는 PEG화된 DNase를 생성하는 것을 기재한다.
Patel et al.[Appl Nanosci 2020, 10:563-575]은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 생물막 발달을 방지하기 위해 시프로플록사신이 탑재된 DNase-I 기능화된 키토산 나노입자를 기재한다.
Park et al.[Sci Transl Med 2016, 8:361ra131]은 전이를 억제하기 위해 DNase I로 코팅된 나노입자를 기재한다.
Meng et al.[Recent Pat Drug Deliv Formul 2018, 12:212-222]은 약간 감소된 효소 활성과 함께, 프로테아제 및 열 스트레스에 대한 안정성을 개선하기 위해 DNase I 또는 에리트로포이에틴의 폴리시알릴화를 기재한다.
미국 특허 제7,846,445호는 40개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 비구조화 재조합 중합체(unstructured recombinant polymer, URP)를 기재하며, 이는 혈청 배출 반감기를 연장하고, 및/또는 URP가 결합된 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다.
XL-protein GmbH는 DNase의 N-말단에 무질서한 폴리펩티드 사슬을 결합하여 반감기가 연장된 재조합 인간 DNase I의 생성을 보고했다[www(dot)rentschler-biopharma(dot)com/fileadmin/user_upload/Scientific-Posters/Rentschler_Poster_ESACT_2019_PASylated_human_DNase_I_final_screen].
호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular trap, NET)은 주로 병원체에 결합하는 호중구의 DNA로 구성되는 세포외 섬유 네트워크이다. NET 활성화 및 방출("NETosis"라고도 함)은 호중구 사멸(자살성 NETosis) 또는 호중구 사멸을 초래하지 않는 세포외 배출(바이탈(vital) NETosis)을 포함할 수 있다. NET는 미생물에 결합하고 병원체의 전파를 방지함으로써 선천성 면역에 기여할 수 있지만, 결과적으로 혈전증을 증가시키고 내피 및 기타 조직의 손상을 초래한다[Mai et al., Shock 2015, 44:166-172; McDonald et al., Cell Host Microbe 2012, 12:324-333; Papayannopoulos, Nat Rev Immunol 2018, 18:134-147].
Czaikoski et al.[PLoS One 2016, 11:e0148142]은 전신 재조합 인간 DNase 처리가 패혈증 마우스에서 혈청 NET 및 증가된 박테리아 부하를 감소시킨다고 보고했지만; DNase 치료와 항생제는 장기 손상을 약화시키고 생존율을 향상시켰다.
미국 특허 출원 공개 번호 제2020/0024585호는 NET를 포함하는 혈관 폐색과 같은, 호중구 세포외 트랩(NET) 축적 및/또는 방출을 특징으로 하는 상태를 치료하기 위한 조작된 DNase 단백질을 기재한다.
추가적인 배경 기술에는 Dwivedi et al.[Crit Care 2012; 16:R151]; Ehrlich et al.[J Mol Recognition 2009, 22:99-103]; Garay et al.[Expert Opin Drug Deliv 2012, 9:1319-1323]; Guichard et al.[Clin Sci(Lond) 2018, 132:1439-1452]; Lubich et al.[Pharm Res 2016, 33:2239-2249]; Moreno et al.[Cell Chem Biol 2019, 26:634-644]; Pressler[Biologics 2008, 2:611-617]; Rudmann et al. [Toxicologic Pathology 2013, 41:970-983]; Wan et al.[Process Biochemistry 2017, 52:183-191]; 및 Zhang et al.[J Control Release 2016, 244:184-193]; 및 미국 특허 번호 제8,431,123호, 제8,871,200호, 제8,916,151호, 제9,642,822호 및 제9,770,492호가 포함된다.
본 발명의 일부 구체예의 측면에 따르면, 적어도 2개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된 DNase 폴리펩티드를 포함하는 변형된 DNase 단백질이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예의 측면에 따르면, 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 변형된 DNase 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예의 측면에 따르면, 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따라 변형된 DNase 단백질의 제조방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 폴리펩티드를 알데히드기에 부착된 폴리(알킬렌 글리콜)를 포함하는 작용제(agent)와 접촉시켜, 폴리펩티드 및 작용제의 접합체(conjugate)를 얻는 단계; 및
(b) 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 적어도 2개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 약 10 kDa 이하, 임의로 약 7.5 kDa 이하, 및 임의로 약 5 kDa 이하의 분자량을 갖는다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 적어도 2개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 약 2 kDa 내지 약 5 kDa 범위의 분자량을 갖는다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리펩티드는 2 내지 7개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리펩티드는 적어도 3개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 3 내지 6개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리펩티드는 적어도 4개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 4 내지 6개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 단관능성(monofunctional) 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티이다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 폴리펩티드 내의 아민기의 질소 원자에 공유 결합되는 알킬렌기를 포함한다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 아민기는 라이신 잔기 측쇄 및/또는 N-말단에 포함된다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 라이신 잔기 측쇄 및 폴리펩티드의 N-말단에 포함되는 아민기의 적어도 80%, 및 임의로 약 100%는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 공유 결합된다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 화학식 I을 갖는다:
-L2-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
화학식 I
여기서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 탄화수소 모이어티이거나 부재하고;
R1은 수소 또는 탄화수소 모이어티이며;
m은 2 내지 10 범위의 정수이고; 및
n은 2 내지 1000 사이의 정수이다.
본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 화학식 I'을 갖는다:
-CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
화학식 I'
여기서:
L1은 탄화수소 모이어티이거나 부재하고;
R1은 수소 또는 탄화수소 모이어티이며;
m은 2 내지 10 범위의 정수이고; 및
n은 2 내지 1000 사이의 정수이다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, n은 20 내지 200, 임의로 30 내지 150의 범위이다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, L1은 비치환된(unsubstituted) 알킬렌이다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, L1은 길이가 1 내지 6개의 탄소 원자, 임의로 길이가 2개인 탄소 원자이다.
본 발명의 임의의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이다.
본 발명의 임의의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리펩티드는 재조합(recombinant) 폴리펩티드이다.
본 발명의 임의의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리펩티드는 식물 재조합 폴리펩티드이다.
본 발명의 임의의 구체예 중 일부에 따르면, DNase 단백질은 DNase I 단백질이다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, DNase I 단백질은 인간 DNase I 단백질에 대해 적어도 80% 상동성(homology)을 갖는다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, DNase I 단백질은 SEQ ID NO: 2에서 제시되는 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, DNase I 단백질은 SEQ ID NO: 1에서 제시되는 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물 또는 변형된 DNase 단백질은 DNase 활성이 유익한 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물 또는 변형된 DNase 단백질은 이를 필요로 하는 대상체의 체액, 분비물 또는 조직에서 과도한 세포외 DNA와 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, 질환 또는 장애는 호중구 세포외 트랩(NET)과 관련이 있다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, 질환 또는 장애는 혈전증 (thrombosis), 혈관 폐색(vascular occlusion), 염증성 질환 또는 장애, 자가면역 질환 또는 장애, 기관지 폐렴성 질환(bronchopulmonary disease), 심혈관 질환(cardiovascular disease), 대사 질환(metabolic disease), 암, 신경퇴행성 질환 또는 장애, 감염과 관련된 질환 또는 장애, 간 손상, 섬유증(fibrosis) 및 관 폐색(ductal occlusion)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, 질환 또는 장애는 급성 관상동맥 증후군(acute coronary syndrome), 급성 신장 손상(acute kidney injury), 급성 폐 손상(acute lung injury), 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 알레르기(allergies), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 무기폐(atelectasis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 조울증(bipolar disorder), 기관지확장증(bronchiectasis), 세기관지염(bronchiolitis), 기관지염(bronchitis) 및 기관기관지염(tracheobronchitis), 담관염(cholangitis), 만성신장질환(chronic kidney disease), 만성호중구증가증(chronic neutrophilia), 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 만성화농성폐질환 결막염(chronic suppurative lung disease conjunctivitis), 감기(common cold), 낭성섬유증(cystic fibrosis), 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis), 당뇨병(diabetes), 파종성혈관내응고(disseminated intravascular coagulation), 안구건조증(dry eye disease), 농흉(empyema), 심내막염(endocarditis), 여성 불임(female infertility), 통풍(gout), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease), 혈종(hematomas), 혈흉(hemothorax), 헤파린 유발성 혈소판감소증(heparin-induced thrombocytopenia), 간신증후군(hepatorenal syndrome), 헌팅턴병(Huntington's disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 담관내 혈전(intrabiliary blood clots), 허혈-재관류손상(ischemia-reperfusion injury), 카르테제너증후군(Kartegener's syndrome), 백혈병(leukemia), 백혈구울혈(leukostasis), 간경화증(liver cirrhosis), 홍반성 신장염(lupus nephritis), 남성불임(male infertility), 유선염(mastitis), 심근경색(myocardial infarction), 호중구감소증(neutropenia), 호중구응집(neutrophil aggregation), 정관폐색(obstruction of the vas deferens), 췌장염(pancreatitis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 폐렴(pneumonia), 외상후 빈혈(post-pneumatic anemia), 원발성 섬모 운동 이상증(primary ciliary dyskinesia), 건선(psoriasis), 횡문근융해증(rhabdomyolysis), 유육종증(sarcoidosis), 정신분열증(schizophrenia), 패혈증(sepsis), 낫형세포병(sickle cell disease), 부비동염(sinusitis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 연기로 인한 폐 손상(smoke-induced lung injury), 고형 종양(solid tumors) 및/또는 종양 전이(tumor metastasis), 뇌졸중(stroke), 외과적 유착(surgical adhesions), 외과적(surgical) 및/또는 외상성(traumatic) 조직 손상, 전신 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 전신 경화증(systemic sclerosis), 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy), 방사선 조사 및/또는 화학요법 치료와 관련된 조직 손상, 수혈 유발 폐 손상(transfusion-induced lung injury), 결핵(tuberculosis), 혈관염(vasculitis), 정맥 혈전색전증(venous thromboembolism), 바이러스(viral), 세균(bacterial), 진균(fungal) 및/또는 원충(protozoal) 감염, 및 상처(wound) 또는 궤양(ulcer)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면, 질환 또는 장애는 패혈증이다.
방법에 관한 본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 환원제는 피콜린 보란 착물(picoline borane complex) 및 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법에 관한 본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 작용제는 화학식 II를 갖는다:
HC(=O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
화학식 II
여기서:
L1은 탄화수소 모이어티이고;
R1은 수소 또는 탄화수소 모이어티이며;
m은 2 내지 10 범위의 정수이고; 및
n은 2 내지 1000 사이의 정수이다.
방법에 관한 본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 작용제 대 폴리펩티드의 몰비(molar ratio)는 10:1 내지 2,000:1 범위이다.
방법에 관한 본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계는 적어도 약 7의 pH에서 수행된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 구체예의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료는 하기에 기재된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 특허 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시일 뿐이며, 반드시 제한하려는 의도는 아니다.
본 발명의 일부 구체예는 첨부된 도면을 참조하여, 단지 실시예로서 본 명세서에서 설명된다. 도면을 구체적으로 참조하여, 도시된 세부 사항은 예시로서 그리고 본 발명의 구체예의 예시적인 논의를 위한 것임을 강조한다. 이와 관련하여, 도면과 함께 사용된 설명은 본 발명의 구체예가 실시될 수 있는 방법을 당업자에게 분명히 보여준다.
도면에서:
도 1은 CreativePEGWorks(1), NOF Europe(2) 및 JenKem Technology(3)로부터 입수한 PEG-Ald(5 kDa)로, 또는 Rapp Polymere(4) 및 Iris Biotech(5)로부터 입수한 PEG-NHS(5 kDa)로 변형 전(before modification, BM) 및 변형 시 DNase I을 가지는 SDS-PAGE(트리스 아세테이트(Tris acetate) 3-8 %) 겔의 이미지를 나타낸다(분자량 지표는 레인 M에 제공됨).
도 2는 200(1), 400(2) 및 600(3) 당량의 PEG-Ald(2000 Da)에 의한, 또는 200(4), 400(5) 및 600(6) 당량의 PEG-Ald(5000 Da)에 의한 각각 변형 전 및 변형 시의 DNase I을 가지는 SDS-PAGE(트리스 아세테이트 3-8 %) 겔의 이미지를 나타낸다.
도 3은 변형 전(BM) 및 PEG-Ald(5000 Da)에 의한 PEG화 시 식물 재조합(plant recombinant, pr) 인간 DNase I을 갖는 SDS-PAGE 겔의 이미지를 나타낸다(분자량 지표는 오른쪽 레인에 제공됨).
도 4는 5000 Da PEG로 변형된 예시적인 DNase I 1 mg/kg을 래트에 정맥내 주사한 후 시간의 함수로서 혈장에서 측정된 DNase 활성(데이터 포인트당 평균 5마리 동물)을 보여주는 그래프를 나타내며, 이는 메틸 그린 활성 분석(methyl green activity assay)에 의해 측정된다(또한 데이터 포인트와 관련 공식 및 R2 값에 가장 잘 맞는 것으로 표시됨).
도 5는 변형 전의 prh-DNase-1 및 400 당량의 PEG-Ald를 사용하여, 2000 Da PEG로 변형된 prhDNase I 또는 100(저(low)) 또는 200(고(high)) 당량의 PEG-Ald를 사용하여, 5000 Da PEG로 변형된 prhDNase I의 SDS-PAGE(트리스 아세테이트 3-8 %) 분석을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 메틸 그린 활성 분석에 의해 측정된 바와 같이, 2000 Da PEG 또는 5000 Da PEG(도 6a 및 6b)로 변형된 prhDNase I(식물 재조합 인간 DNase I), 또는 비-변형된 prhDNase I 또는 알리도르나제 알파(도 6b)의 1 mg/kg을 래트에 정맥내 주사한 후 시간의 함수로서 혈장 내 DNase I의 농도를(상이한 시간 척도에서) 보여주는 그래프를 나타낸다("고(high)"는 단백질당 약 4개의 PEG 모이어티를 나타내고, "저(low)"는 단백질당 약 3개의 PEG 모이어티를 나타낸다).
도 7은 2000 Da PEG 또는 5000 Da PEG로 변형된 prhDNase I 또는 비-변형된 prhDNase I 또는 알리도르나제 알파의 1 mg/kg을 래트에 정맥내 주사한 후 혈장 내 DNase I의 반감기를 나타내는 막대 그래프를 나타낸다("고(high)"는 단백질당 약 4개의 PEG 모이어티를 나타내고, "저(low)"는 단백질당 약 3개의 PEG 모이어티를 나타낸다).
도 8은 2000 Da PEG 또는 5000 Da PEG로 변형된 prhDNase I 또는 비-변형된 prhDNase I 또는 알리도르나제 알파의 1 mg/kg을 래트에 정맥내 주사한 후 혈장 중 DNase I의 AUC(곡선 아래 면적)를 보여주는 막대 그래프를 나타낸다("고(high)"는 단백질당 약 4개의 PEG 모이어티를 나타내고, "저(low)"는 단백질당 약 3개의 PEG 모이어티를 나타낸다).
도 9a 및 9b는 CLP(맹장 결찰 및 전차(cecal ligation and puncture))를 받고 CLP 1시간(3S) 또는 4시간(4S) 후 5000 Da PEG로 변형된 10 mg/kg의 장기-작용성(long-acting, LA) prhDNase I, CLP를 받고 1시간(1S) 또는 4시간(4S) 후 10 mg/kg의 비-변형 prhDNase I, 또는 식염수(5S)로 처리된 마우스의 사망까지의 평균 시간을 보여주는 사망률 곡선(도 9a) 및 막대 그래프(도 9b)를 나타낸다; Wilcoxon 방법을 사용하여 각 쌍에 대해 비모수(nonparametric) 비교를 적용하여 통계 분석(*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01; 각 그룹에서 n = 5).
도 10a 및 10b는 CLP를 받고 CLP 4시간 후, 5000 Da PEG, 또는 식염수로 변형된 10 mg/kg의 장기-작용성(LA) prhDNase I으로 처리된 마우스의 사망까지의 평균 시간을 보여주는 사망률 곡선(도 10a) 및 막대 그래프(도 10b)를 나타낸다; Wilcoxon 방법을 사용하여 각 쌍에 대해 비모수 비교를 적용하여 통계 분석(*p ≤ 0.05; 각 그룹에서 n = 5; 계산을 위해, 7일 후에도 여전히 살아있는 두 마리의 마우스는 7일 후에 죽은 것으로 간주됨).
도 11a 및 11b는 CLP를 받고 CLP 8시간 후, 5000 Da PEG로 변형된 10 mg/kg의 장기-작용성(LA) prhDNase I, 또는 식염수로 처리된 마우스의 사망까지의 평균 시간을 보여주는 사망률 곡선(도 11a) 및 막대 그래프(도 11b)를 나타낸다; Wilcoxon 방법을 사용하여 각 쌍에 대해 비모수 비교를 적용하여 통계 분석(*p ≤ 0.05; 각 그룹에서 n = 3-5; 계산을 위해 7일 후에도 여전히 살아있는 4마리의 마우스는 7일 후에 죽은 것으로 간주함).
도 12a 및 12b는 CLP를 받고 CLP 4시간 후, 5000 Da PEG로 변형된 0.1, 1, 5 또는 10 mg/kg의 장기-작용성(LA) prhDNase I, 또는 식염수로 처리된 마우스의 사망까지의 평균 시간을 보여주는 사망률 곡선(도 12a) 및 막대 그래프(도 12b)를 나타낸다; Wilcoxon 방법을 사용하여 각 쌍에 대해 비모수 비교를 적용하여 통계 분석(*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01; 각 그룹에서 n = 5; 계산을 위해 7일 후에도 여전히 살아있는 마우스는 7일 후에 죽은 것으로 간주됨).
본 발명은, 이의 일부 구체예에서, 요법, 및 보다 구체적으로, 장기-작용성 DNase에 관한 것이지만, 제한되지 않는다.
본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 하기 설명에 기재되거나 실시예에 의해 예시된 세부 사항에 대한 적용에 반드시 제한되는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 구체예가 가능하거나 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다.
본 발명자들은 다중 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 갖는 DNase 단백질의 변형이 DNase의 생체 내 반감기 및 결과적으로 효능을 상당한 정도로 향상시킬 수 있으며, 반감기는 변형 정도를 제어함으로써 쉽게 제어될 수 있음을 발견하였다.
본 발명을 실시하는 동안, 본 발명자들은 2-5 kDa의 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 예시적인 변형된 DNase가 아미드화에 의한 것보다 환원성 아민화에 의해 변형될 때 더 효소적으로 활성이고, 환원적 아민화가 변형을 수행하는 데 아민화보다 더 효과적이며, 변형된 DNase는 패혈증의 모델에서 치료적으로 효과적이라는 것을 보여주었다.
도면을 참조하면, 도 1-3은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 의해 다양한 정도로 변형된 예시적인 DNase 단백질의 제조를 보여준다.
도 4는 래트에서 예시적인 변형된 DNase 단백질의 반감기는 약 10시간임을 보여준다(대조적으로 비-변형된 DNase 단백질의 경우 약 7분). 도 6a-7은 래트에서 예시적인 변형된 DNase 단백질의 반감기는 변형 정도에 따라, 약 4 내지 12.5시간임을 보여준다(대조적으로 비-변형된 DNase 단백질의 경우 몇 분). 도 8은 변형된 DNase 단백질의 상당히 증가된 반감기는 AUC(곡선 아래 면적)의 상당한 증가와 연관되어 있음을 보여준다.
도 9a-12b는 예시적인 변형된 DNase 단백질은 패혈증이 있는 마우스에서 치료 효과를 나타냄을 보여준다. 도 9a 및 9b는 변형된 DNase 단백질이 상응하는 비-변형된 DNase 단백질보다 더 강력함을 보여준다. 도 12a 및 12b는 변형된 DNase 단백질의 치료 효과가 용량-의존적(dose-dependent)임을 보여준다.
변형된 DNase 단백질:
본 발명의 일부 구체예의 측면에 따르면, 적어도 2개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된 DNase 폴리펩티드를 포함하는 변형된 DNase 단백질이 제공된다.
본 발명의 임의의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리펩티드는 2 내지 7개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 2 내지 6개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 2 내지 5개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 2 내지 4개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 및 임의로 2 내지 3개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된다.
본 발명의 구체예 중 일부에서, 폴리펩티드는 적어도 3개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 3 내지 7개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 3 내지 6개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 3 내지 5개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 및 임의로 3 내지 4개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된다.
본 발명의 구체예 중 일부에서, 폴리펩티드는 적어도 4개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 4 내지 7개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 임의로 4 내지 6개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티, 및 임의로 4 내지 5개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된다.
각각의 구체예 중 일부에서, 라이신 잔기 측쇄 및 DNase 폴리펩티드의 N-말단에 포함된 아민기의 적어도 10 %는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착되고(예를 들어, 라이신 잔기 측쇄에 부착되는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 관한 본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나에 따르면), 임의로 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 및 심지어 약 100 %의 라이신 잔기 측쇄 및 N-말단 아민기는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착된다.
여기에서, 변형된 DNase 단백질은 변형된 DNase 단백질의 개체군을 포함하고, 폴리펩티드에 부착된 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 수(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따르면) 및/또는 폴리 모이어티(알킬렌 글리콜)에 부착된 아민기의 백분율은 개체군의 평균(average)(예를 들어, 평균값(mean)) 수 및/또는 백분율을 의미한다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 일부에서, 변형된 DNase 단백질은 상응하는 비-변형된 DNase 단백질(즉, 본 명세서에 기재된 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티가 없음)보다 더 긴 생체 내 반감기를 특징으로 한다. 본 명세서에 기재된 이러한 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기보다 적어도 20 % 더 길다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기보다 적어도 50 % 더 길다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기보다 적어도 100 % - 즉, 적어도 두배 - 더 길다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기의 적어도 3배이다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기의 적어도 5배이다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기의 적어도 10배이다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기의 적어도 20배이다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기의 적어도 50배이다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기의 적어도 100배이다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기의 적어도 200배이다. 일부 구체예에서, 변형된 DNase 단백질의 반감기는 상응하는 비-변형된 DNase 단백질의 반감기의 적어도 500배이다.
(변형 및/또는 비-변형된) DNase 단백질의 반감기는, 예를 들어, 대상체(예를 들어, 인간, 래트 및/또는 마우스)에 테스트된 DNase 단백질을 주사한 후, 시간 경과에 따라 혈액(예를 들어, 혈장)에서 테스트된 DNase 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 본 명세서에 예시된 바와 같이, DNase 단백질의 양은 시간 경과에 따른 DNA 농도의 감소를 평가하기 위한 DNA 농도(예를 들어, 연어 정소 DNA를 사용) 분석, 예를 들어, DNA에 비-공유 결합된 메틸 그린 염료가 DNA 가수분해 시 색상을 변화시키는 분광검정법(spectrophotometric assay)을 사용하여 측정될 수 있다(예를 들어, 하기 실시예 섹션에 기재된 대로). 대안적으로 또는 추가적으로, DNase 단백질의 양은 적합한 항체를 사용하여, 예를 들어, ELISA 테스트로 측정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 일부에서, 변형된 DNase 단백질은 래트 및/또는 마우스에서 적어도 1시간의 혈장 반감기(예를 들어, 항체 인식 및/또는 효소 활성에 의해 측정됨)를 특징으로 한다. 일부 이러한 구체예에서, 반감기는 적어도 2시간이다. 일부 구체예에서, 반감기는 적어도 3시간이다. 일부 구체예에서, 반감기는 적어도 6시간이다. 일부 구체예에서, 반감기는 적어도 12시간이다. 일부 구체예에서, 반감기는 적어도 24시간이다. 일부 구체예에서, 반감기는 적어도 2일, 또는 적어도 3일, 또는 적어도 1주이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예에 따른 변형된 DNase 단백질의 더 긴 반감기는 임의로 변형된 DNase 단백질의 더 큰 분자량(예를 들어, 신장에서의 여과에 의해 혈류에서 제거되는 속도를 감소시킬 수 있음) 및/또는 변형된 DNase 단백질의 낮은 면역원성(면역계에 의한 비활성화 및/또는 사멸율을 감소시킬 수 있음)과 연관될 수 있다.
폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티:
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나에 따른 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 DNase 폴리펩티드에 대한 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 부착 특성과 관련하여 본 명세서에 기재된 임의의 방식으로, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나에 따른(예를 들어, 본 명세서의 각각의 섹션에서) DNase 폴리펩티드와 임의로 조합될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "폴리(알킬렌 글리콜)"라는 어구는 하기 일반식을 공유하는 폴리에테르 중합체 패밀리를 포함한다: -[O-(CH2)m]n-O-, 여기서 m은 각각의 알킬렌 글리콜 단위에 존재하는 메틸렌기의 수를 나타내고, n은 반복 단위의 수를 나타내며, 따라서 중합체의 크기 또는 길이를 나타낸다. 예를 들어, m = 2일 때, 중합체를 폴리에틸렌 글리콜이라고 하고, m = 3일 때 중합체를 폴리프로필렌 글리콜이라고 한다.
일부 구체예에서, m은 1보다 큰 정수이다(예를 들어, m = 2, 3, 4 등).
임의로, m은 폴리(알킬렌 글리콜) 사슬의 단위에 따라 다르다. 예를 들어, 폴리(알킬렌 글리콜) 사슬은 함께 연결된 에틸렌 글리콜(m = 2) 및 프로필렌 글리콜(m = 3) 단위를 모두 포함할 수 있다.
"폴리(알킬렌 글리콜)"라는 어구는 또한 산소 원자가, 예를 들어 S, -NH- 등과 같은 또 다른 헤테로원자로 대체된 이의 유사체를 포함한다. 이 용어는 중합체를 구성하는 하나 이상의 메틸렌기가 치환된 상기 유도체를 추가로 포함한다. 메틸렌기 상의 선택적 치환기의 예는 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 하이드록시, 옥소, 티올 및 티오알콕시 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 메틸렌기(존재하는 경우) 상의 치환체는 알킬, 임의로 C1-4-알킬, 및 임의로 메틸이다.
본 명세서에 사용된, "알킬렌 글리콜 단위"라는 어구는 폴리(알킬렌 글리콜)의 백본 사슬을 형성하는 -O-(CH2)m- 기 또는 이의 유사체를 포함하며, 여기서 (CH2)m(또는 이의 유사체)은 폴리(알킬렌 글리콜)(화학식 -[O-(CH2)m]n-O-로 표시됨) 또는 이의 헤테로원자 유사체, 또는 또 다른 알킬렌 글리콜 단위 또는 DNase 폴리펩티드(말단 단위의 경우)에 속하는 헤테로원자의 말단에 있는 산소 원자에 결합되고; O(또는 전술한 말단 산소 원자) 또는 이의 헤테로원자 유사체는 또 다른 알킬렌 글리콜 단위의 (CH2)m(또는 이의 유사체), 또는 DNase 폴리펩티드(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른)와 결합을 형성하는 작용기에 결합된다.
알킬렌 글리콜 단위는 3개 이상의 인접하는 알킬렌 글리콜 단위에 연결되도록 분지형일 수 있으며, 여기서 3개 이상의 인접하는 알킬렌 글리콜 단위 각각은 폴리(알킬렌 글리콜) 사슬의 일부이다. 이러한 분지형 알킬렌 글리콜 단위는 이의 헤테로 원자를 통해 하나의 인접하는 알킬렌 글리콜 단위에 연결되고, 나머지 인접하는 알킬렌 글리콜 단위의 헤테로원자는 각각 분지형 알킬렌 글리콜 단위의 탄소 원자에 연결된다. 또한, 헤테로원자(예를 들어, 질소)는 그것이 일부인, 알킬렌 글리콜 단위의 하나 이상의 탄소 원자와 결합하여, 분지형 알킬렌 글리콜 단위(예를 들어, [(-CH2)m]2N- 등)를 형성할 수 있다.
예시적인 구체예에서, 알킬렌 글리콜 단위의 적어도 50 %는 동일하며, 예를 들어, 이들은 서로 동일한 헤테로원자 및 동일한 m 값을 포함한다. 임의로, 알킬렌 글리콜 단위의 적어도 70 %, 임의로 적어도 90 %, 및 임의로 100 %는 동일하다. 예시적인 구체예에서, 동일한 알킬렌 글리콜 단위에 결합된 헤테로원자는 산소 원자이고 및/또는 알킬렌 글리콜 단위는 비-치환된다. 추가의 예시적인 구체예에서, 동일한 단위에 대해 m은 2이다.
각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유사체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은, 상기 정의된 바와 같이, 폴리(알킬렌 글리콜)을 기재하며, 여기서 알킬렌 글리콜 단위의 적어도 50 %, 적어도 70 %, 적어도 90 %, 및 바람직하게는 100 %는 -CH2CH2-O-이다. 유사하게, "에틸렌 글리콜 단위"라는 어구는 본 명세서에서 -CH2CH2O-의 단위로 정의된다.
각각의 구체예 중 일부에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유사체는 하기의 일반식을 갖는다:
-(Y1-CR1R2-CR3R4)n-Y2-
여기서 Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 O, S 또는 NR5(임의로 O)이고;
n은 정수이며, 임의로 2 내지 1000(임의로 10 내지 300, 임의로 30 내지 100)이지만, 더 높은 n 값도 고려되고; 및
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 하이드록시, 옥소, 티올 및/또는 티오알콕시이다.
각각의 구체예 중 일부에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬, 임의로 수소 또는 C1-4-알킬, 및 임의로 수소 또는 메틸이다. 예시적 구체예에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 수소이다.
폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유사체는, 예를 들어, 상기 화학식에서 Y1-CR1R2-CR3R4 단위가 모두 서로 동일하지 않은 공중합체(copolymer)를 임의로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, Y1-CR1R2-CR3R4 단위의 적어도 50 %는 동일하다. 임의로, Y1-CR1R2-CR3R4 단위의 70 % 이상, 임의로 90 % 이상, 임의로 100 %는 동일하다.
임의로, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는, 예를 들어, 상기 화학식에서 하나 이상의 Y1-CR1R2-CR3R4 단위에 대해 R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나가 -(Y1-CR1R2-CR3R4)p-Y2-인 분지형이고, 여기서 R1-R5 및 Y1 및 Y2는 상기 정의된 바와 같으며, p는 각각의 구체예 중 어느 하나에 따라 n에 대해 본 명세서에서 정의된 바와 같은 정수(예를 들어, 2 내지 1000)이다.
각각의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 임의로 DNase 폴리펩티드와 공유 결합을 형성하는 관능기(functional group)를 포함할 수 있다. 관능기의 예는 알킬렌기 및 카르보닐(-C(=O)-)을 포함한다. 알킬렌 또는 카르보닐은 임의로 폴리펩티드의 질소 원자(예를 들어, 아민기의)에 부착되어, 예를 들어, 함께 아민기 또는 아미드기를 각각 형성할 수 있다. 각각의 관능기는 임의로 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 직접적으로(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따라) 또는 연결기(linking group)를 통해 간접적으로 부착될 수 있으며, 임의로 여기서 연결기는 탄화수소 모이어티이다.
본 명세서에서 "연결기(linking group)"라는 어구는 화합물에서 2개 이상의 모이어티에 부착된 기(예를 들어, 치환기)를 기재하는 반면; "말단기(end group)"라는 어구는 하나의 원자를 통해 화합물의 단일 모이어티에 부착된 기(예를 들어, 치환기)를 기재한다.
각 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 독립적으로 하나 이상의 위치에서 DNase 폴리펩티드에 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 단관능성(monofunctional) 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티이다. "단관능성" 모이어티는 하나의 부위에 공유적으로 결합되는(그 이상은 결합되지 않는) 모이어티를 의미한다. 따라서, 선형 단관능성 모이어티는 공유 결합의 원위 말단(terminus distal)에서 본 명세서에 정의된 말단기(예를 들어, 수소 또는 탄화수소 모이어티, 임의로 메틸)에 의해 종결되는 반면; 분지형 단관능성 모이어티는 이러한 말단기를 갖는 2개 이상의 말단을 포함한다(여기서 상이한 말단에서의 관능기는 동일하거나 상이할 수 있음).
본 발명의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 화학식 I을 갖는다:
-L2-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
화학식 I
여기서:
L1 및 L2는 각각 독립적으로 탄화수소 모이어티이거나 부재하고;
R1은 수소 또는 탄화수소 모이어티이며;
m은 적어도 2의 정수, 임의로 2 내지 10의 범위이고; 및
n은 적어도 2의 정수이고, 임의로 2 내지 1000 범위이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 치환 또는 비-치환 알킬렌이고, 길이는 임의로 1 내지 6개의 탄소 원자, 길이는 임의로 1 내지 4개의 탄소 원자, 길이는 임의로 1 내지 3개의 탄소 원자, 길이는 임의로 1개 또는 2개의 탄소 원자이다. 일부 이러한 구체예에서, 알킬렌은 비-치환, 예를 들어, CH2 또는 CH2CH2이다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각에 대해, L2는 CH2이고, 따라서 모이어티는 화학식 I'을 갖는다:
-CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
화학식 I'
여기서 L1, R1, m 및 n은 화학식 I에 대해 정의된다(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름).
변수 m을 포함하는 화학식과 관련된 본 명세서의 일부 구체예에서, 2, 3 또는 4이다. 일부 구체예에서, m은 2 또는 3이다. 일부 실시예에서, m은 2이고, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(n개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)를 포함한다.
변수 n을 포함하는 화학식과 관련된 본 명세서의 일부 구체예에서, n은 적어도 10(예를 들어, 10 내지 300, 또는 10 내지 200, 또는 10 내지 150, 또는 10 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 10 내지 60)이다. 일부 이러한 구체예에서, n은 적어도 20(예를 들어, 20 내지 300, 또는 20 내지 200, 또는 20 내지 150, 또는 20 내지 100, 또는 20 내지 80, 또는 20 내지 60)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 30(예를 들어, 30 내지 300, 또는 30 내지 200, 또는 30 내지 150, 또는 30 내지 100, 또는 30 내지 80, 또는 30 내지 60)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 40(예를 들어, 40 내지 300, 또는 40 내지 200, 또는 40 내지 150, 또는 40 내지 100, 또는 40 내지 80, 또는 40 내지 60)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 50(예를 들어, 50 내지 300, 또는 50 내지 200, 또는 50 내지 150, 또는 50 내지 100, 또는 50 내지 80)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 60(예를 들어, 60 내지 300, 또는 60 내지 200, 또는 60 내지 150, 또는 60 내지 100, 또는 60 내지 80)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 70(예를 들어, 70 내지 300, 또는 70 내지 200, 또는 70 내지 150, 또는 70 내지 100)이다.
변수 m 및 n을 포함하는 화학식과 관련된 본 명세서의 구체예 중 일부에서, n은 적어도 10(예를 들어, 10 내지 300, 또는 10 내지 200, 또는 10 내지 150, 또는 10 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 10 내지 60)이고; m은 2, 3 또는 4, 바람직하게는 2 또는 3, 보다 바람직하게는 2이다. 일부 이러한 구체예에서, n은 적어도 20(예를 들어, 20 내지 300, 또는 20 내지 200, 또는 20 내지 150, 또는 20 내지 100, 또는 20 내지 80, 또는 20 내지 60)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 30(예를 들어, 30 내지 300, 또는 30 내지 200, 또는 30 내지 150, 또는 30 내지 100, 또는 30 내지 80, 또는 30 내지 60)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 40(예를 들어, 40 내지 300, 또는 40 내지 200, 또는 40 내지 150, 또는 40 내지 100, 또는 40 내지 80, 또는 40 내지 60)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 50(예를 들어, 50 내지 300, 또는 50 내지 200, 또는 50 내지 150, 또는 50 내지 100, 또는 50 내지 80)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 60(예를 들어, 60 내지 300, 또는 60 내지 200, 또는 60 내지 150, 또는 60 내지 100, 또는 60 내지 80)이다. 일부 구체예에서, n은 적어도 70(예를 들어, 70 내지 300, 또는 70 내지 200, 또는 70 내지 150, 또는 70 내지 100)이다.
본 발명의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜)(임의로 일관능성 폴리(알킬렌 글리콜)) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 폴리펩티드에서 아민기의 질소 원자; 예를 들어, 라이신 잔기 측쇄 및/또는 N-말단의 아민기에 공유 결합된 알킬렌기(예를 들어, 비-치환된 알킬렌기)를 포함한다. (질소 원자에 부착된) 알킬렌은 임의로, 예를 들어 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에 따르면, 화학식 I에 따른 L2, 화학식 I에 따른 L1(여기서 L2는 부재), 및/또는 화학식 I'에 따른 말단 CH2기(임의로 L1의 적어도 일부와 조합됨)일 수 있다.
본 명세서에 예시된 바와 같이, 질소 원자에 공유 결합된 이러한 알킬렌기는 임의로 환원제의 존재 하에(예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에 따라) 알데하이드기를 아민기와 반응시킴으로써 수득될 수 있다.
임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 폴리펩티드 질소 원자에 공유 결합된 알킬렌기를 통한 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 부착은 유리하게는 카보닐(-C(=O)-)기(임의로 카복실레이트기의 축합에 의해 유도됨) 및 폴리펩티드 아민기 사이에 아미드 결합을 형성하는 것과 같은, 공유 결합을 위한 대체 기술보다 덜 면역원성 및/또는 효소 활성에 덜 해로운 것으로 여겨진다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티(임의로 단관능성 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티)의 분자량은 약 10 kDa 이하이다. 이러한 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 7.5 kDa 이하이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 5 kDa 이하이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티(임의로 단관능성 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티)의 분자량은 적어도 약 1.5 kDa이다. 일부 이러한 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 10 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 7.5 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 5 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 3 kDa 범위이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티(임의로 일관능성 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티)의 분자량은 적어도 약 2 kDa이다. 일부 이러한 실시예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 10 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 7.5 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 5 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 3 kDa 범위이다. 일부 예시적인 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 2kDa이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티(임의로 단관능성 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티)의 분자량은 적어도 약 3 kDa이다. 일부 이러한 실시예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 3 kDa 내지 약 10 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 3 kDa 내지 약 7.5 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 3 kDa 내지 약 5 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 3 kDa 범위이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티(임의로 단관능성 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티)의 분자량은 적어도 약 4 kDa이다. 일부 이러한 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 4 kDa 내지 약 10 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 4 kDa 내지 약 7.5 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 4 kDa 내지 약 5 kDa 범위이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티(임의로 단관능성 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티)의 분자량은 적어도 약 5 kDa이다. 일부 이러한 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 7.5 kDa 범위이다. 일부 구체예에서, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 분자량은 약 5 kDa이다.
임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 생체 내 DNase 활성을 보호 및/또는 면역원성을 감소시키는 방식으로 면역계로부터 DNase 폴리펩티드를 마스킹할 수 있고, 과도하게 작은 폴리(알킬렌 글리콜) 알킬렌 글리콜) 모이어티 및/또는 적은 수(예를 들어, 하나)의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 폴리펩티드의 비효율적인 마스킹을 초래할 수 있는 것으로 여겨진다. 과도하게 큰 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 폴리펩티드의 비효율적인 마스킹을 초래할 수 있는데, 예를 들어, 큰 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 부착은 추가적인 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 부착을 입체적으로 억제하여 폴리펩티드의 마스킹에 갭을 남기는 것으로 여겨진다(예를 들어, 항체가 침투할 수 있음). 더 나아가 큰 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티는 그 자체로 더 짧은 모이어티보다 면역반응성이 더 있을 수 있다고 여겨진다[Rudmann et al., Toxicologic Pathology 2013, 41:970-983; Moreno et al., Cell Chem Biol 2019, 26:634-644; Garay et al., Expert Opin Drug Deliv 2012, 9:1319-1323; Wan et al., Process Biochemistry 2017, 52:183-191; Ehrlich et al., J Mol Recognition 2009, 22:99-103].
감소된 면역원성은 변형된 단백질의 반복 투여를 용이하게 및/또는 단백질의 효능을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 항-PEG 항체는 임상 치료 동안 PEG화 요산분해효소가 활성을 상실하는 원인으로 보고되었다[Zhang et al., J Control Release 2016, 244:184-193]. 더욱이, 급성 치료 옵션(acute treatment option)조차도 일반 개체군에 존재하는 것으로 보고된 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 대한 기존 항체의 존재로 인해 위험에 처할 수 있다[Lubich et al., Pharm Res 2016, 33:2239-2249].
또한, 상대적으로 짧은 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 사용은 임의로 변형 정도를 결정하는 데 더 많은 융통성(flexibility)을 허용함으로써(예를 들어, 본 명세서에 예시된 바와 같은, 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티 및/또는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티 크기), 변형된 DNase 단백질의 순환 시간(circulating time)에 대한 더 나은 제어를 가능하게 하여, 상이한 증상(different indication)의 특정 치료 요구에 대해 장기-작용성 변형된 DNase를 맞춤화하는 것을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 반감기(예를 들어, 약 1일 이하)는 급성 상태(예를 들어, 염증과 관련된 급성 상태)를 치료하는 데 가장 적합할 수 있는 반면; 더 긴 반감기는 만성 질환을 치료하는 데 가장 적합할 수 있다(예를 들어, 덜 빈번한 투여를 허용하기 위해).
DNase 폴리펩티드:
변형된 DNase 단백질이 명시적으로 언급된 경우를 제외하고, 다음 섹션은 구체예 중 임의의 하나에 따라, 본 명세서에 기재된 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 존재를 제외하고 본 명세서에 기재된 변형된 DNase 단백질에 상응하는 DNase 폴리펩티드를 기재한다.
비-변형된 단백질과 관련하여, "단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 변형된 단백질의 맥락에서, "폴리펩티드"라는 용어는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티와 반대로, 비-변형된 단백질로부터 유도된 변형된 단백질의 일부를 강조하기 위해 사용된 것일 뿐, 제한하려는 의도는 아니다.
당업자는 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 변형(예를 들어, PEG화)과 함께 이 섹션에 기재된 구체예 중 어느 하나에 따른 비-변형된 DNase를 고려함으로써, 본 발명의 일부 구체예에 따른 변형된 DNase 단백질의 구조를 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "DNase" 및 "DNase 단백질"은 데옥시리보뉴클레아제의 DNase I 및 DNase II 패밀리를 포함하는, 임의의 데옥시리보뉴클레아제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "DNase I" 및 "DNase I 단백질"은 데옥시리보뉴클레아제 I(EC 3.1.21.1) 폴리펩티드를 의미한다. DNase I은 DNA를 절단하여 5'-포스포디뉴클레오티드 및 5'-포스포올리고뉴클레오티드 최종 생성물을 생성하는, 엔도뉴클레아제로 분류되며, 이중 가닥 DNA 기질 및 알칼리성 pH 최적이 선호된다.
DNase I은 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 염색질에 작용한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "DNase II" 및 "DNase II 단백질"은 데옥시리보뉴클레아제 II(EC 3.1.22.1) 폴리펩티드를 의미한다. DNase II는 최적의 산성 pH를 선호하는, 엔도뉴클레아제로 분류된다.
본 교시의 일부 구체예에 따른 DNase(즉, 비-변형된)는 액틴에 의해 억제된다.
본 교시의 일부 구체예에 따른 DNase(즉, 비-변형된)는 액틴에 의해 억제되지 않는다.
여기에서, "액틴에 의해 억제된"이라는 어구는 37 ℃에서 50 ㎍/mL 인간 비-근육 액틴(액틴의 부재에서의 활성에 비해)의 존재 하에 DNA 가수분해 활성(예를 들어, DNase 효소의)이 적어도 20 % 감소함을 의미한다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, DNase는 본 명세서에 정의된 바와 같은, DNase I이다.
특정 구체예에 따르면, DNase는 SEQ ID NO: 1에서 제시되는 인간 DNase I이다.
또한 DNase I 활성을 갖는 인간 DNase I의 상동체(homolog)(즉, 관능성 등가물(functional equivalents)) 및 동원체(ortholog)(예를 들어, 마우스 NM_010061.5 NO_034191.3)가 고려된다.
본 명세서에서, 주어진 폴리펩티드의 "상동체"는 주어진 폴리펩티드와 적어도 80 % 상동성, 바람직하게는 적어도 90 % 상동성, 더 바람직하게는 적어도 95 % 상동성, 더 바람직하게는 적어도 98 % 상동성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다(임의로 주어진 폴리펩티드에 대해 적어도 80 %, 적어도 90 % 동일성, 적어도 95 % 또는 적어도 98 % 서열 동일성을 나타냄). 일부 실시예에서, 주어진 폴리펩티드의 상동체는 주어진 폴리펩티드와 치료적 활성(therapeutic activity)을 추가로 공유한다. 상동성 백분율은 제1 폴리펩티드가 비교되는 제2 폴리펩티드 서열의 상응하는 잔기와 일치하는 제1 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기의 백분율을 의미한다. 일반적으로 폴리펩티드는 최대 상동성을 제공하도록 정렬된다. 예를 들어, 수동 정렬, 컴퓨터 보조 서열 정렬 및 이들의 조합을 포함하는, 동일성의 정도를 평가하기 위해 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 비교를 수행하기 위한 다양한 전략이 당업계에 공지되어 있다. 서열 정렬을 수행하기 위한 다수의 알고리즘(일반적으로 컴퓨터로 구현됨)이 널리 이용 가능하거나 당업자에 의해 생성될 수 있다. 대표적인 알고리즘은, 예를 들어, Smith 및 Waterman의 로컬 상동성 알고리즘[Adv Appl Math, 1981, 2:482]; Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘[J Mol Biol 1970, 48:443]; Pearson 및 Lipman의 유사성 검색 방법[PNAS 988, 85:2444]; 및/또는 이들 알고리즘의 전산화된 구현을 포함한다(예를 들어, Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA). 이러한 알고리즘을 포함하는 즉시 사용 가능한 컴퓨터 프로그램은, 예를 들어, BLASTN, BLASTP, Gapped BLAST, PILEUP, CLUSTALW 등을 포함한다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램의 기본 매개변수가 사용될 수 있다. 또는, 실무자는 자신의 실험 및/또는 기타 요구 사항에 따라 기본값이 아닌 매개 변수(parameter)를 사용할 수 있다(예를 들어, URL이 www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov인 웹 사이트 참조).
이러한 상동체는, 예를 들어, SEQ ID NO: 1과 적어도 80 %, 적어도 81 %, 적어도 82 %, 적어도 83 %, 적어도 84 %, 적어도 85 %, 적어도 86 %, 적어도 87 %, 적어도 88 %, 적어도 89 %, 적어도 90 %, 적어도 91 %, 적어도 92 %, 적어도 93 %, 적어도 94 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % 또는 100 % 동일하거나 Smith 및 Waterman 알고리즘을 사용하는 Wisconsin 서열 분석 패키지의 BestFit 소프트웨어를 사용하여 결정된 상동체(동일성+상동성)일 수 있으며, 여기서 갭 가중치(gap weight)는 50, 길이 가중치(length weight)는 3, 평균 일치(average match)는 10, 평균 불일치(average mismatch)는 -9이다.
본 발명의 구체예는 상기에서 기재된 핵산 서열; 이의 단편, 핵산 서열과 혼성화할 수 있는 서열, 핵산 서열과 상동적인 서열, 핵산 서열과 직교하는 서열, 상이한 코돈 사용빈도를 가진 유사한 폴리펩티드를 암호화하는 서열, 무작위로 또는 표적화된 방식으로 자연적으로 발생하거나 인간에 의해 유도된 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환과 같은 돌연변이를 특징으로 하는 변경된 서열을 포함하고, 이들 모두를 총칭하여 "실질적 상동체"라고 함).
변형된 DNase를 제공하기 위해 변형된 DNase 단백질의 아미노산 서열을 설명하기 위해 사용되는, 용어 "실질적 상동체"는 또한 본 명세서에서 상세히 기재된 바와 같은 DNase 단백질의 또 다른 아미노산 서열에 대해 적어도 80 % 상동성, 임의로 적어도 90 % 상동성, 임의로 적어도 95 % 상동성, 임의로 적어도 98 % 상동성, 및 임의로 적어도 99 % 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다.
엔도뉴클레아제의 DNase I 패밀리의 다른 멤버는 인간의 DNase X, DNase 감마, DNase 람다, DNase1L2, DNase1L3 및 눈물 리포칼린(tear lipocalin)이다. DNase I은 또한, 그 중에서도, 예를 들어, 소(Bos taurus)에서 알칼리성 DNase, 소 췌장(bp) DNase, DNase A, DNA 포스파타제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.
비-변형된 DNase는 자연적으로 발현되는 세포/조직에서 추출한 정제된 DNase일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, DNase는 재조합적으로 생성된다. 일부 구체예에서, DNase는 재조합적으로 생성된 DNase I이다. 일부 구체예에서, DNase(예를 들어, DNase I)는 식물 재조합 폴리펩티드, 즉, 식물 세포에 의해 재조합적으로 생성된 것이다.
재조합 발현을 위해, DNase를 인코딩하는 핵산 서열은 시스-작용 조절 요소, 예를 들어, 프로모터의 전사 조절 하에 핵산 발현 벡터에 결찰된다.
삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함하는 것 외에, 본 발명의 일부 구체예의 발현 구조물(construct)은 또한 발현된 펩티드의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 독성을 향상시키도록 조작된 서열을 포함할 수 있다. 다양한 원핵 또는 진핵 세포가 본 발명의 일부 구체예의 DNase를 발현하기 위한 숙주-발현 시스템으로 사용될 수 있다. 이들은 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus), CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 코딩 서열을 포함하는, Ti 플라스미드와 같은, 재조합 플라스미드 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 포유동물 발현 시스템은 또한 본 발명의 일부 구체예의 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있다.
박테리아 구성의 예는 대장균 발현 벡터의 pET 시리즈를 포함한다[Studier et al., Methods Enzymol 1990, 185:60-89].
효모에서, 미국 특허 출원 번호 제5,932,447호에 기재된 바와 같이, 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 벡터가 사용될 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA 서열의 효모 염색체로의 통합을 촉진하는 벡터가 사용될 수 있다.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우, 코딩 서열의 발현은 다수의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터와 같은 바이러스 프로모터[Brisson et al., Nature 1984, 310:511-514], 또는 TMV에 대한 외피 단백질 프로모터[Takamatsu et al., EMBO J 1987, 6 :307-311]가 사용될 수 있다. 대안적으로, RUBISCO의 작은 서브유닛과 같은 식물 프로모터[Coruzzi et al., EMBO J 1984, 3:1671-1680; Brogli et al., Science 1984, 224:838-843] 또는 열 충격 촉진제, 예를 들어 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B[Gurley et al., Mol Cell Biol 1986, 6:559-565]가 사용될 수 있다. 이들 구성은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 미세주사, 전기천공 및 당업자에게 잘 알려진 다른 기술을 사용하여 식물 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology (1988), Academic Press, NY, 섹션 VIII, pp 421-463 참조.
특정 구체예에 따르면, DNase는 국제 특허 출원 공보 WO 2013/114374에 기재된 바와 같이 식물 세포 현탁 배양에서 생성되며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
따라서, 인간 DNase I 단백질의 적어도 일부는 N-말단 글리신 잔기(SEQ ID NO: 2)를 갖는다. 일부 구체예에서, 인간 DNase I 단백질은 SEQ ID NO: 2에서 제시되는 DNase I 및 SEQ ID NO: 1에서 제시되는 DNase I의 혼합물을 포함한다.
이러한 단백질은 SEQ ID NO: 3에서 제시되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 Arabidopsis ABPI 소포체(endoplasmic reticulum) 타겟 신호 펩티드에 이의 N-말단에서 번역적으로 융합된 인간 DNase I을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성으로부터 발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "Arabidopsis ABPI 소포체(endoplasmic reticulum) 타겟 신호 펩티드"는 발현된 단백질을 식물 세포 내의 소포체로 향하게 할 수 있는, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 옥신 결합 단백질의 리더 펩티드 서열을 의미한다. 한 구체예에서, Arabidopsis ABPI 소포체 타겟 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 8에서 제시되는 33개 아미노산 폴리펩티드이다.
따라서, 일부 실시예에 따르면, N-말단에서 Arabidopsis ABPI 소포체 타겟 신호 펩티드에 인접하게 연결된 인간 DNase I 단백질 및 인간 DNase I 단백질은 SEQ ID NO: 9에서 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
인간 DNase I 단백질은 SEQ ID NO: 6에서 기재되는 핵산 서열에 의해 임의로 인코딩될 수 있다. Arabidopsis ABPI 소포체 타겟 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 3에서 기재되는 핵산 서열에 의해 임의로 인코딩될 수 있다. N-말단에서 Arabidopsis ABPI 소포체 타겟 신호 펩티드에 인접하게 연결된 인간 DNase I 단백질은 SEQ ID NO: 7에서 기재되는 핵산 서열에 의해 임의로 인코딩될 수 있다.
천연 신호 리더 펩티드를 포함하는 천연 인간 DNase I 단백질(SEQ ID NO: 5; GenBank: NM_005223, 서열(a))을 인코딩하는 천연 핵산 서열(SEQ ID NO: 4)이 본 명세서에 추가로 제시된다.
당업계에 잘 알려져 있고 이하 본 명세서에서 추가로 설명되는 곤충 및 포유동물 숙주 세포 시스템과 같은 다른 발현 시스템이 또한 본 발명의 일부 구체예에 의해 사용될 수 있다.
인간 DNase I과 관련하여 본 명세서에 기재된 구체예 중 일부에 따르면, DNase I은 성숙한 인간 DNase I이다. 일부 구체예에서, DNase I은 도르나제 알파(dornase alfa) DNase I(예를 들어, Pulmozyme®)이다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에 따르면, 인간 DNase I은 SEQ ID NO: 1에서 기재되는 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 1의 인간 DNase I 아미노산 서열과 상동성인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 적어도 80 % 상동성) 아미노산 서열을 갖는 DNase I 단백질은 임의로 인간 DNase I의 특징적인 구조 및/또는 기능을 유지할 수 있음을 이해할 것이다. 인간 DNase I 단백질의 아미노산 서열에 상동성인 아미노산 서열의 비-제한적인 한 예는 SEQ ID NO: 1과 매우 유사한 SEQ ID NO: 2이다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase 단백질은 변이체 인간 DNase I 단백질이며, 임의로 인간 DNase I의 자연 발생(적어도 일부 인간에서) 변이체이다. 변경된 액틴 친화도, 보조인자 요구사항, 최적 pH, 저장 시 증가된 저장 수명 등과 같은 변경된 촉매 및/또는 다른 생화학적 및 구조적 특성이 향상된 재조합 발현 또는 융합 단백질을 가지는, 변이체 인간 DNase 단백질이 개시되었다. 적절하게 변형된 DNase 폴리펩티드는 미국 특허 번호 제6,348,343호, 제6,391,607호, 제7,407,785호 및 제7,297,526호, 및 국제 특허 출원 공개 WO 96/26279, WO 2008/039989 및 WO 2013/114374에 개시된 DNase 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 이들 각각은 특히 DNase 폴리펩티드 및 이들의 제조 방법과 관련하여 전체가 참조로 포함된다.
일부 구체예에서, DNase는, 예를 들어, Bright Yellow-2(BY2) 세포 배양에서 발현되는 DNase I과 같이, 임의로 현탁 상태일 수 있는, 담배(예를 들어, Nicotiana tabacum 세포)에서 발현된다(예를 들어, 본 명세서에서 하기에 예시된 바와 같거나 및/또는 국제 특허 출원 공개 WO 2013/114374에 개시된 바와 같음).
일부 구체예에서, 아그로박테리움-매개 형질전환(Agrobacterium-mediated transformation)은 식물 세포 게놈에 외래 유전자를 도입하기 위해 사용된다. 이 기술은 전달 DNA(T-DNA)인 플라스미드 DNA 세그멘트를 숙주 세포 게놈으로 전달함으로써 식물 세포를 형질전환하는 아그로박테리움의 자연적 능력을 기반으로 한다. 이 접근법을 사용하여, 외래 유전자 및 이의 조절 요소로 구성되는 T-DNA 분자는 식물 게놈에 무작위로 도입된다. 유전자 삽입의 복제 수뿐만 아니라, 통합 부위는 제어되지 않으므로, 형질전환 과정은 다양한 수준의 트랜스진(transgene)의 발현을 갖는 세포로 구성되는 형질전환 세포의 "풀"을 생성한다. 형질전환 "풀"은 이후 클론 분리에 사용된다. 클론 분리로 인해 많은 단일 세포주가 확립되고, 이로부터 외래 유전자 발현 수준이 가장 높은 클론이 선택된다. 일부 구체예에서 아그로박테리움-매개 형질전환은 외래 유전자를 담배 세포, 예를 들어 Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow (BY-2) 세포의 게놈으로 도입하는데 사용되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase(예를 들어, 식물-재조합 인간 DNase I) 폴리펩티드의 분자량은 PAGE 및/또는 질량 분석법에 의해 측정했을 때 포유류 세포에서 발현된 재조합 인간 DNase I의 분자량과 유사하다(Pulmozyme® DNase I).
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase(예를 들어, 식물-재조합 인간 DNase I) 폴리펩티드는 SDS-PAGE로 측정 시 약 30 kDa, 질량 분석법으로 측정 시 약 32 kDa의 분자량을 갖는다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 비-변형된 DNase(예를 들어, 식물-재조합 인간 DNase I)는 글리코실화된다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변형된 DNase (예를 들어, 식물-재조합 인간 DNase I)는 글리코실화된다.
본 명세서에에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 글리코실화된 DNase(예를 들어, 식물-재조합 인간 DNase I) 단백질의 등전점(isoelectric point)은 포유동물 세포(Pulmozyme®)에서 발현되는 재조합 인간 DNase I의 pH보다 더 높은 pH이다.
일정 범위의 등전점이 발생하는 경우(예를 들어, 등전 포커싱(isoelectric focusing) 시 밴드가 관찰됨), 본 명세서에서 DNase의 "등전점"은 평균 등전점을 의미한다.
임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 포유동물 세포에서 발현되는 DNase(본 명세서에서 식물 재조합 DNase I로 예시됨)에 비해 더 높은 등전점(더 적은 음전하를 시사함) 및/또는 양으로 하전된 아민기(예를 들어, 환원성 아미노화 대 아미드 결합 형성과 같이)의 보유는 음으로 하전된 DNA에 대한 DNase의 친화성을 향상시켜 Michaelis 상수를 감소시킬 수 있다고 여겨진다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase(예를 들어, 식물-재조합 인간 DNase I)는 약 29 kDa의 분자량을 갖는 폴리펩티드 모이어티를 포함하는 글리코실화된 단백질이다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 변형 및/또는 비-변형된 DNase는, 임의로 적어도 85 %, 적어도 87 %, 적어도 90 %, 적어도 91 %, 적어도 91.5 %, 적어도 92 %, 적어도 92.5 %, 적어도 93 %, 적어도 93.1 %, 적어도 93.2 %, 적어도 93.3 %, 적어도 93.4 %, 적어도 93.5 %, 적어도 93.6 %, 적어도 93.7 %, 적어도 93.8 %, 적어도 93.9 %, 적어도 94 %, 적어도 94.5 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 적어도 99.1 %, 적어도 99.2 %, 적어도 99.3 %, 적어도 99.4 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.6 %, 적어도 99.7 %, 적어도 99.8 %, 적어도 99.9 %의 순도, 적어도 95.0-99.8 % 또는 100 % 순도 범위의 순도(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물 중 DNase I의)를 특징으로 하는, 정제된 단백질이다. 일부 구체예에서, 변형 및/또는 비-변형된 DNase 단백질의 순도는 HPLC에 의해 측정된다.
상기에서 기재한 순도는 낮은 수준의 불순물(또는 부재)을 의미한다. 변형 및/또는 비-변형된 DNase를 포함하는 조성물에 의도적으로 첨가된 성분(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물의 임의의 성분)은 본 명세서에서 DNase 단백질의 순도에 영향을 미치는 불순물로 간주되지 않는다.
일부 구체예에서, DNase는 재조합 DNase, 임의로 식물-재조합 인간 DNase이고, 상기 기재된 순도는 DNase 단백질이 분비되는 배지 및/또는 숙주 세포(예를 들어, 식물 숙주 세포), 예를 들어 핵산 및 폴리뉴클레오티드, 아미노산, 올리고펩티드 및 폴리펩티드, 글리칸 및 기타 탄수화물, 지질 등과 같으나 이에 제한되지 않는 낮은 수준(또는 부재)의 불순물을 의미한다. 일부 구체예에서 숙주 세포 유래 불순물은 효소와 같은, 생물학적 활성 분자를 포함한다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase 단백질(예를 들어, 식물-재조합 DNase, 예를 들어, 식물-재조합 DNase I)은 DNase 폴리펩티드가 폴리펩티드 분자 당 평균 적어도 0.2개, 임의로 0.5개, 임의로 적어도 1개, 임의로 적어도 2개, 임의로 적어도 3개 또는 임의로 적어도 4개 이상의 노출된 만노스 잔기를 가지도록 글리코실화된다.
여기서 "노출된" 잔기는 단 하나의 공유 결합에 의해 글리칸의 비-환원 말단에 부착된 단당류 잔기를 의미한다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase 단백질(예를 들어, 식물-재조합 DNase, 예를 들어, 식물-재조합 DNase I)은 DNase 폴리펩티드가 폴리펩티드 분자 당 평균 적어도 하나, 및 임의로 적어도 2개의 코어 자일로스(core xylose) 잔기를 가지도록 글리코실화된다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase 단백질(예를 들어, 식물-재조합 DNase, 예를 들어, 식물-재조합 DNase I)은 DNase 폴리펩티드가 폴리펩티드 분자 당 평균 적어도 0.2개, 임의로 적어도 0.5개, 임의로 적어도 1개, 및 임의로 약 2개의 코어 α-(1,3) 푸코스(fucose) 잔기를 가지도록 글리코실화된다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase 단백질(예를 들어, 식물-재조합 DNase, 예를 들어, 식물-재조합 DNase I)은 DNase 폴리펩티드가 폴리펩티드 분자 당 평균 적어도 하나의 코어 자일로스 잔기 및 적어도 하나의 α-(1,3) 푸코스 잔기를 가지도록 글리코실화된다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase 단백질(예를 들어, 식물-재조합 DNase, 예를 들어, 식물-재조합 DNase I)은 DNase 폴리펩티드가 폴리펩티드 분자 당 평균 적어도 하나의 노출된 만노스 잔기, 적어도 하나의 코어 자일로스 잔기 및 적어도 하나의 α-(1,3) 푸코스 잔기를 가지도록 글리코실화된다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase 단백질(예를 들어, 식물-재조합 DNase, 예를 들어, 식물-재조합 DNase I)은 DNase 폴리펩티드가 임의로 만노스 잔기의 외부 부분(폴리펩티드에서 먼 쪽)에서, 폴리펩티드 분자 당 평균 적어도 1개, 임의로 적어도 2개, 임의로 적어도 3개, 및 임의로 적어도 4개의 말단 N-아세틸 글루코사민 치환을 가지도록 글리코실화된다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, DNase 단백질(예를 들어, 식물-재조합 DNase, 예를 들어, 식물-재조합 DNase I)은 시알산(sialic acid) 잔기가 없다.
여기서 "시알산 잔기가 없다"는 글리칸의 1% 미만, 임의로 0.1% 미만, 및 임의로 0.01% 미만의 시알산 잔기를 포함함을 의미한다.
글리코실화에 관한 상기에서 언급된 특성 중 일부 또는 전부는 임의로 높은 만노스 글리코실화(예를 들어, 노출된 만노스 당(mannose sugar) 잔기 및/또는 글리칸 당 3개 이상의 만노스 잔기) 및 식물 특이적 글리칸 잔기를 나타낼 수 있는 식물-재조합 DNase(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나 따름)에서 얻어질 수 있다.
(폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 부착 이외의) 추가적인 변형은 본 명세서에 기재된 구체예의 어느 하나에 따라 임의로 DNase에 도입될 수 있으며, 임의로 액틴 저항성을 향상시키는 변형이 도입될 수 있다. 비-제한적 예는 국제 특허 출원 공보 WO 2016/108244에 개시된 바와 같은 변형(예를 들어, 카복실산 모이어티를 아미드 모이어티로 대체)을 포함하고, 이들의 내용, 특히 변형에 관한 내용, 및 보다 특히, 액틴 저항성을 향상시키기 위한 변형에 관한 내용은 본 명세서에 전체적으로 포함된다.
변형된 DNase의 제조:
본 발명의 일부 구체예의 측면에 따르면, 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에 따라 변형된 DNase 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 이들 실시예에 따른, 방법은 다음을 포함한다: (a) DNase 폴리펩티드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 구체예에 따른 DNase 단백질)를 알데히드(-C(=O)H)기에 부착된 폴리(알킬렌 글리콜)을 포함하는 작용제(agent)와 접촉시켜, 폴리펩티드 및 폴리(알킬렌 글리콜)를 포함하는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따라)의 접합체(conjugate)를 얻는 단계; 및 (b) 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 폴리(알킬렌 글리콜)는 1개 이하의 알데히드기를 포함한다.
방법에 관한 본 발명의 구체예 중 일부에 따르면, 폴리(알킬렌 글리콜)를 포함하는 작용제는 하기 화학식 II를 갖는다:
HC(=O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
화학식 II
여기서 L1은 탄화수소 모이어티이고; R1은 수소 또는 탄화수소 모이어티이며; m은 2 이상, 임의로 2 내지 10 범위의 정수이고; 및 n은 2 이상, 임의로 2 내지 1000 범위의 정수이다(예를 들어, 여기서 L1, R1, m 및/또는 n은 화학식 I 및/또는 또는 I'와 관련하여 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따라 정의된 바와 같다). 화학식 II의 작용제는, 예를 들어, 알데하이드기와 아민기의 반응(예를 들어, 이민(imine) 또는 헤미아미날(hemiaminal) 중간체를 형성하기 위해), 및 아민기를 형성하기 위한 환원시, 임의로 화학식 I 및/또는 I'에 따른 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 얻기 위해 사용될 수 있다(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름).
적절한 환원제의 예시는 보란(borane) 및 그의 착물(예를 들어, 피콜린 보란 착물(picoline borane complex)), 보로하이드라이드(borohydride)(예를 들어, 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride)), 트리아세톡시보로하이드라이드(triacetoxyborohydride)(예를 들어, 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride)), 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)(예를 들어, 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)), 및 임의의 다른 환원제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 환원성 아민화 방법에 적절한 것으로 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 환원제는 2-피콜린 보란 착물 및 소듐 시아노보로하이드라이드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
방법과 관련된 본 발명의 구체예 중 일부에서, 접합체를 환원제와 접촉시키는 것은 적어도 약 7, 및 임의로 적어도 약 8의 pH에서 수행된다. 예시적인 구체예에서, pH는 약 7이다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 더 높은 pH 값은 일반적으로 더 많은 DNase 아민기(예를 들어, 라이신 잔기의)가 활성화되고, 따라서 더 많은 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티가 DNase 폴리펩티드에 부착되는 것과 관련이 있는 것으로 여겨진다.
DNase 폴리펩티드, 폴리(알킬렌 글리콜)을 포함하는 작용제, 및 환원제는 임의의 순서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 폴리(알킬렌 글리콜)을 포함하는 작용제는 폴리펩티드 및 환원제를 포함하는 혼합물에 임의로 첨가될 수 있거나, 폴리펩티드는 폴리(알킬렌 글리콜) 및 환원제를 포함하는 작용제를 포함하는 혼합물에 임의로 첨가될 수 있다(예를 들어, 폴리펩티드 및 폴리(알킬렌 글리콜)를 포함하는 작용제의 접합체는 접합체 형성 시 이미 환원제와 접촉하고 있다). 일부 구체예에서, DNase 폴리펩티드, 폴리(알킬렌 글리콜)를 포함하는 작용제, 및 환원제는 본질적으로 동시에(예를 들어, "원-포트 반응(one-pot reaction)"으로서) 조합된다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)와 접촉하는 DNase 폴리펩티드에 대한 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)의 몰비는 적어도 10:1이다. 일부 이러한 구체예에서, 몰비는 10:1 내지 10,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 10:1 내지 5,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 10:1 내지 2,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 10:1 내지 1,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 10:1 내지 500:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 10:1 내지 200:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 10:1 내지 100:1이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)와 접촉하는 DNase 폴리펩티드에 대한 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)의 몰비는 적어도 20:1이다. 일부 이러한 실시예에서, 몰비는 20:1 내지 10,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 20:1 내지 5,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 20:1 내지 2,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 20:1 내지 1,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 20:1 내지 500:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 20:1 내지 200:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 20:1 내지 100:1이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)와 접촉하는 DNase 폴리펩티드에 대한 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)의 몰비는 적어도 50:1이다. 일부 이러한 실시예에서, 몰비는 50:1 내지 10,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 50:1 내지 5,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 50:1 내지 2,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 50:1 내지 1,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 50:1 내지 500:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 50:1 내지 200:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 50:1 내지 100:1이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)와 접촉하는 DNase 폴리펩티드에 대한 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)의 몰비는 적어도 100:1이다. 일부 이러한 구체예에서, 몰비는 100:1 내지 10,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 100:1 내지 5,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 100:1 내지 2,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 50:1 내지 1,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 100:1 내지 500:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 100:1 내지 200:1이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)와 접촉하는 DNase 폴리펩티드에 대한 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)의 몰비는 적어도 200:1이다. 일부 이러한 구체예에서, 몰비는 200:1 내지 10,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 200:1 내지 5,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 200:1 내지 2,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 200:1 내지 1,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 200:1 내지 500:1이다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 일부에서, 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)와 접촉하는 DNase 폴리펩티드에 대한 작용제(본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따름)의 몰비는 적어도 500:1이다. 일부 이러한 실시예에서, 몰비는 500:1 내지 10,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 500:1 내지 5,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 500:1 내지 2,000:1이다. 일부 구체예에서, 몰비는 500:1 내지 1,000:1이다.
작용제의 분자량은 임의로 선택되어 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티 분자량과 관련하여 본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나에 따른 분자량을 가지는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 생성할 수 있다. 주어진 작용제의 분자량과 본 명세서에 기재된 방법에서 작용제로부터 생성된 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티 사이의 관계는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 화학식 II의 작용제는 전형적으로 화학식 I의 모이어티보다 15 Da 더 큰(예를 들어, 본질적으로 1 kDa 이상의 분자량에 대한 반올림 오차) 분자량을 가질 것이다(여기서 변수 L1, R1, m 및 n은 동일한 방식으로 정의되고, L2는 CH2이다).
본 발명의 일부 구체예의 측면에 따르면, 각각의 구체예 중 어느 하나에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있는 변형된 DNase 단백질이 제공된다.
적응증(Indications) 및 제형(formulation):
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물 또는 변형된 DNase 단백질은 임의로 DNase 활성이 유익한 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것 및/또는 과도한 DNA(예를 들어, 세포외 DNA, 또한 본 명세서에서 "세포-유리 DNA(cell-free DNA)"로도 상호교환적으로 지칭됨) 수준(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체의 체액, 분비물 또는 조직에서)과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에 기재된 일부 구체예의 측면에 따르면, DNase 활성이 유익한 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 및/또는 과도한 DNA(예를 들어, 세포외 DNA) 수준(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체의 체액, 분비물 또는 조직에서)과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 변형된 DNase 단백질의 용도가 제공된다.
본 명세서에 기재된 일부 구체예의 측면에 따르면, DNase 활성이 유익한 질환 또는 장애 및/또는 과도한 DNA(예를 들어, 세포외 DNA) 수준(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체의 체액, 분비물 또는 조직에서)과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물 또는 변형된 DNase 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 각각의 구체예 중 일부에 따르면(본 명세서에 기재된 측면 중 어느 하나에 따라), 질환 또는 장애는 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular trap, NET)과 같은, DNA-관련 개체(entity)와 관련이 있다. NET은 임의로, 예를 들어, 자살성 NETosis 및/또는 치명적인 NETosis와 관련된 NET일 수 있다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 변형된 DNase(본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나에 따른)는 천연 인간 DNase보다 생체 내에서 훨씬 더 긴 반감기를 나타낼 수 있고, 따라서 세포외 DNA, NET 및/또는 기타 DNA-관련 개체의 존재 또는 축적을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료에 우수한 효능을 제공할 수 있다고 여겨진다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 변형된 DNase를 이용하는 치료는 임의로 단독요법으로서 또는 현재 치료, 예를 들어, 혈전 관련 상태의 치료를 위한 스트렙토도르나제(streptodornase)와의 조합일 수 있다.
본 발명의 구체예에 따라 치료가능한 질환 또는 장애의 예는, 제한 없이, 만성 호중구증가증(chronic neutrophilia)(예를 들어, 호중구 수의 증가); 호중구 응집(neutrophil aggregation) 및 백혈구울혈(leukostasis); 혈전증(thrombosis) 및 혈관 폐색(vascular occlusion)(예를 들어, 낫형세포병(sickle cell disease)); 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury)(예를 들어, 중장 염전(midgut volvulus), 고환 비틀림(testicular torsion), 사지 허혈 재관류(limb ischemia reperfusion), 필수 기관 허혈-재관류(vital organ ischemia-reperfusion), 장기 이식(organ transplantation)); 외과 및 외상성 조직 손상; 급성 또는 만성 염증 반응 또는 질환; 자가면역 질환 또는 장애(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 루푸스 신염(lupus nephritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관염(vasculitis), 전신 경화증(systemic sclerosis), 건선(psoriasis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 통풍(gout), 류마티스성 관절염, 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome)); 심혈관 질환(예를 들어, 심근경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 정맥 혈전색전증(venous thromboembolism), 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis, DVT), 혈전용해 요법 포함, 관상동맥 질환); 대사 질환(예를 들어, 당뇨병(diabetes)); 전신 염증(예를 들어, 전신 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 패혈증(sepsis), 패혈증(septicemia), 패혈성 쇼크, 패혈증 관련 장기 부전, 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation, DIC) 및 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy, TMA)); 기도의 염증성 질환 및 장애(예를 들어, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 급성 폐 손상(acute lung injury, ALI), 연기-유발 폐 손상, 수혈 유발 폐 손상(transfusion-induced lung injury, TRALI), 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 천식(asthma), 축농증(empyema), 카르테제너 증후군(Kartegener's syndrome), 폐엽성무기폐(lobar atelectasis), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 기관지확장증(bronchiectasis), 원발성 섬모 운동 이상증(primary ciliary dyskinesia), 세기관지염(bronchiolitis), 흉막 감염(pleural infection)); 신장 염증성 질환(급성 신장 손상(acute kidney injury, AKI) 및 만성 신장 질환(chronic kidney disease, CKD)을 포함하는 급성 및 만성 신장 질환); 이식된 조직과 관련된 염증성 질환(예를 들어, 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)); 암(예를 들어, 백혈병(leukemia), 종양 전이(tumor metastasis) 및 고형 종양(solid tumors), 수술 후 종양 전이, 섬유증(fibrosis) 및 방사선 조사 및/또는 화학요법 치료와 관련된 추가적인 조직 손상); 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환 또는 장애; 바이러스 감염 관련 상태(예를 들어, COVID-19 및 인플루엔자 관련 상태, 바이러스 감염 관련 패혈증, AKI, ALI 또는 ARDS, 및/또는 바이러스 감염 관련 혈전증); 및 박테리아, 진균 및/또는 원충 감염(예를 들어, 패혈증, AKI, ALI 또는 ARDS 및/또는 혈전증)과 관련된 상태를 포함한다.
각각의 구체예 중 일부에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 환자의 혈액 또는 뇌척수액 또는 장에서 세포외 DNA(예를 들어, 원핵생물 및/또는 인간)의 증가된 수준과 연관되며, 이 수준은 대조군보다 더 높다(예를 들어, 건강한 연령의 개인의 혈액 또는 뇌척수액 또는 장의 세포외 DNA 수준 또는 여러 건강한 연령의 개인의 혈액 또는 뇌척수액 또는 장의 세포외 DNA의 평균 수준). 신경퇴행성 질환 및 장애의 비-제한적 예는, 예를 들어, 알츠하이머병(예를 들어, 후기 발병 알츠하이머병), 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅턴병, 및 신경계 기능 장애(예를 들어, 정신분열증(schizophrenia) 또는 양극성 장애(bipolar disorder))를 포함한다.
본 명세서에 기재된 구체예에 따른 변형된 DNase에 대한 추가적인 적용은 상처 세척 및 상처 치유 촉진, 및 궤양(예를 들어, 다리 궤양), 공압 후 빈혈(post-pneumatic anemia), 부비동염(sinusitis), 만성 혈종(chronic hematomas), 심내막염(endocarditis), 간신 증후군(hepatorenal syndrome), 혈흉(hemothorax), 담관 내 혈전, 간 손상, 간 감염, 횡문근 융해증(rhabdomyolysis), 유육종증(sarcoidosis), 간경변증(liver cirrhosis), 섬유증(fibrosis), 여성 불임(female infertility), 남성 불임(male infertility), 헤파린 유발 혈소판 감소증(heparin-induced thrombocytopenia), 안구 건조증, 급성 관상 동맥 증후군 및/또는 외상(수술, 부상), 예를 들어, 심폐 우회 수술 중 합병증, 수술 후 코 성형술(rhinoplasty)의 치료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
임의로, 변형된 DNase는 화학 요법, 급성 또는 만성 염증성 장애, 또는 급성 또는 만성 감염과 관련된 호중구 감소증을 예방하거나 개선하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 대상체는 덕트 시스템(ductal system)에서 덕트 폐색을 가지거나 가질 위험이 있다. 덕트 시스템 또는 덕트 시스템을 포함하는 기관 또는 조직의 비-제한적 예는 담관(bile duct), 눈물관(tear duct), 젖샘관(lactiferous duct), 낭성관(cystic duct), 간관(hepatic duct), 사정관(ejaculatory duct), 귀밑관(parotid duct), 턱밑관(submandibular duct), 주요설하관(major sublingual duct), 턱밑관, 바르톨린관(Bartholin's duct), 대뇌 수도관(cerebral aqueduct), 췌장(pancreas), 유선(mammary gland), 정관(vas deferens), 요관(ureter), 방광(urinary bladder), 담낭(gallbladder), 및 간을 포함한다. 이와 같이, 본 발명은 임의로 췌장염, 담관염, 결막염, 유선염, 안구 건조증, 정관 폐쇄 또는 신장 질환을 앓는 대상체를 치료하는데 유용하다.
다른 구체예에서, 대상체는 내피 표면(예를 들어, 외과적 유착), 피부(예를 들어, 상처/흉터, 궤양) 또는 윤활 관절(예를 들어, 통풍, 관절염)에 축적되는 NET를 가지거나 가질 위험이 있다. 예를 들어, NET는 외과적 유착(예를 들어, 침습적 의료 절차 후)에 기여할 수 있다. 본 발명은 외과적 유착의 형성을 예방하거나 억제하기 위해 수술 동안 임의로 투여될 수 있다.
다른 구체예에서, 변형된 DNase는 상처 및/또는 흉터를 예방 또는 치료하기 위해 국소적으로(예를 들어, 피부에) 투여될 수 있다. 대안적으로, 변형된 DNase는 통풍 및 관절염을 예방 또는 치료하기 위해 윤활 관절에 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 호흡기(예를 들어, 폐) 이상의 치료 및/또는 객담의 점도 감소(예를 들어, 전단 손실 계수 및/또는 전단 저장 계수의 감소로 나타냄)에 사용하기 위한 것이다. 본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따라 변형된 DNase I 단백질의 투여에 의해 치료될 수 있는 호흡기 이상 또는 질환은 급성 또는 만성 기관지폐 질환, 무기폐(예를 들어, 기관 또는 기관지 매복 및 기관절개술의 합병증으로 인한), 기관지염 또는 기관기관지염(예를 들어, 만성 기관지염, 천식성 기관지염), 낭포성 섬유증, 폐렴, 알레르기성 질환(예를 들어, 알레르기성 천식), 비알레르기성 천식, 결핵, 기관지폐 진균 감염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 기관지확장증(예를 들어, 비-낭포성 섬유증 기관지확장증), 폐기종, 급성 및 만성 부비동염, 및 감기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
DNase I 활성에 의해 치료가능한 질환 또는 장애에 관한 본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 질환 또는 장애는 화농성 질환 또는 장애이다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애는 화농성 폐 질환이다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애는 만성 화농성 폐 질환(chronic suppurative lung disease, CSLD), 예를 들어, 만성 젖은 기침 및 진행성 폐 손상을 특징으로 하는 질환 또는 장애이다. 본 발명의 구체예에 따라 치료가능한 CSLD는 임의로 낭포성 섬유증 또는 비-낭포성 섬유증 CSLD일 수 있다. 비-낭포성 섬유증 CSLD의 예는 비-낭포성 섬유증 기관지확장증 및 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disorder, COPD)(만성 기관지염 및 폐기종 포함)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애는 낭포성 섬유증이다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 명세서에 기재된 변형된 DNase 단백질의 더 긴 반감기는 비-변형된 DNase의 제거가 치료 유용성에 주요 장애물을 나타내는 전신 치료, 및 전신 투여가 유익할 수 있는 상태의 치료과 관련된 적용에 특히 유용할 수 있는 반면; 기도에 투여된 비-변형된 DNase는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 의해 극복될 수 있는 짧은 반감기에 의해 영향을 덜 받는다(예를 들어, 기도에서 단백질의 덜 빠른 제거로 인해)고 여겨진다.
치료와 관련하여 본 명세서에 기재된 구체예의 어느 하나의 일부 구체예에서, 치료될 대상체는 임의로 낭포성 섬유증과 같은, 본 명세서에 기재된 폐 질환 또는 이상에 더하여 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들어, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)) 폐 감염을 앓고 있다. 폐 감염을 앓고 있다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 변형된 DNase 단백질은 약학적 조성물을 생산하기 위해 사용될 수 있고, 및/또는 국제 특허 출원 공개 WO 2016/108244(본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나에 따름)에 개시된 것과 본질적으로 동일한 방식으로 사용 및/또는 투여될 수 있으며, 그 내용, 특히 약학적 조성물, 변형된 DNase I의 용도 및 폐 투여에 관한 내용이 본 명세서에 전체적으로 포함된다. 예를 들어, 투여는 전신성(systemic) 또는 국부적(local); 및/또는 흡입(inhalation), 국소(topical) 및/또는 주사(injection)를 통한 것일 수 있다.
본 출원으로부터 특허가 성숙하는 동안 DNA 및/또는 NET과 관련된 많은 관련 조건이 밝혀질 것으로 예상되며 용어 "치료" 및 그 문법적 변형의 범위는 이러한 모든 새로운 기술을 선험적으로 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 기재된 각각의 구체예 중 어느 하나에 따른 변형된 DNase 단백질은 임의로 그 자체로, 또는 대안적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물의 일부로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적 조성물"은 약학적으로 허용가능하고 적절한 담체 및 부형제(excipient)와 같은 다른 화학적 성분과 함께, 본 명세서에 기재된 변형된 DNase의 하나 이상의 종의 제조를 의미한다. 약학적 조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
이하, "약학적으로 허용가능한 담체"라 함은 유기체에 상당한 자극을 일으키지 않고, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제(diluent)를 의미한다. 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 식염수, 에멀젼 및 유기 용매와 물의 혼합물뿐만 아니라 고체(예를 들어, 분말) 및 기체 담체이며, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "부형제(excipient)"는 화합물의 투여를 추가로 용이하게 하기 위해 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘(calcium carbonate), 인산칼슘(calcium phosphate), 다양한 당 및 전분 유형, 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 젤라틴(gelatin), 식물성 오일(vegetable oils) 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 포함되며, 이에 한정되지 않는다.
약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 찾아볼 수 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은, 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 통상적인 혼합(mixing), 용해(dissolving), 과립화(granulating), 당의정 제조(dragee-making), 분말화(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화(encapsulating), 포획(entrapping) 또는 동결건조(lyophilizing) 방법에 의해 제조될 수 있다.
따라서 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 변형된 DNase 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제(auxiliary)를 포함하는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택한 투여 경로에 따라 다르다.
본 명세서에 기재된 변형된 DNase 단백질은, 예를 들어, 볼루스 주사(bolus injection) 또는 연속 주입(continuous infusion)에 의해 비경구(parenteral) 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사 또는 주입을 위한 제형은, 예를 들어, 앰플 또는 임의로 방부제(preservative)가 첨가된 다중 용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형 작용제(formulatory agents)를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 약학적 조성물은 수용성 형태의 변형된 DNase 제제의 수용액을 포함한다. 주사 또는 주입을 위해 변형된 DNase는 임의로 수용액, 바람직하게는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유기 용매가 있거나 없는 행크 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution), 또는 생리 식염수 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액으로 제형화될 수 있다.
추가로, 변형된 DNase 단백질의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액 및 에멀젼(예를 들어, 유중수형(water-in-oil), 수중유형(oil-in-water) 또는 유중유중수형(water-in-oil in oil) 에멀젼)으로 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레이트, 트리글리세리드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 소르비톨(sorbitol) 또는 덱스트란(dextran)과 같이, 현탁액의 점도를 증가시키는, 물질을 포함할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 변형된 DNase 단백질의 용해도를 증가시켜, 고농축 용액의 제조를 가능하게 하는 적절한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.
혈류로의 직접 주사 및/또는 주입(예를 들어, 정맥내 투여)은 혈액 내 세포외 DNA 및/또는 NET(이와 관련된 임의의 상태 포함)의 상승된 수준을 치료하는데 특히 적절할 수 있다. 혈류로의 투여는 변형된 DNase 단백질을 특정 조직으로 전달하기 위해 임의로 사용될 수도 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 변형된 DNase 단백질은, 예를 들어, 상승된 수준의 세포외 DNA 및/또는 NET에 의해 영향을 받는 조직에 국부적으로 주사될 수 있다. 조직은 임의로 염증과 관련된 조직이다.
경점막(transmucosal) 투여의 경우, 제형에 침투제가 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
경구 투여를 위해, 본 발명의 변형된 DNase 단백질은 변형된 DNase 단백질을 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 본 명세서에 기재된 변형된 DNase 단백질이 환자가 경구 섭취할 수 있도록 정제, 알약, 당의정(dragee), 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다. 고형 부형제를 사용하여 경구 사용을 위한 약리학적 제제를 만들 수 있고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적절한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 가공하여, 정제 또는 당의정 코어를 얻을 수 있다. 적합한 부형제는, 특히, 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는, 당과 같은 충전제; 셀룰로오스 제제, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 고무(gum tragacanth), 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)과 같은 생리학적으로 허용가능한 중합체와 같은 충전제이다. 원하는 경우, 가교화된 폴리비닐피롤리돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone), 한천, 또는 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이의 염과 같은 붕해제(disintegrating agent)가 첨가될 수 있다.
당의정 코어에는 적절한 코팅이 제공된다. 이러한 목적을 위해, 임의로 아라비아 검, 탈크(talc), 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티타늄(titanium dioxide), 래커 용액(lacquer solution) 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 변형 DNase 단백질 용량의 다양한 조합을 식별 또는 특성화하기 위해 염료(dyestuffs) 또는 안료(pigments)를 정제 또는 당의정 코팅에 첨가할 수 있다.
경구로 사용할 수 있는 약학적 조성물은 젤라틴으로 만든 푸시-핏 캡슐(push-fit capsule)뿐만 아니라 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은, 가소제(plasticizer)로 만든 연질, 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 변형된 DNase 단백질은 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은, 적절한 액체에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정제를 첨가할 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택된 투여 경로에 적절한 투여량이어야 한다.
본 발명의 구체예의 변형된 DNase 단백질은 또한, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 기제(suppository base)를 사용하여 좌약 또는 정체 관장(retention enema)과 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
경구 및/또는 직장 투여는 위장관의 질환 또는 장애, 예를 들어, 위장관의 염증과 관련된 상태(예를 들어, 염증성 장 질환 및/또는 위장염)를 치료하는 데 특히 적절할 수 있다.
협측 투여(buccal administration)를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해(예를 들어, 폐 질환 또는 장애를 치료하기 위해, 또는 전신 투여를 수행하기 위해), 약학적 조성물은 임의로, 예를 들어, 분사제(propellant)-함유 에어로졸(예를 들어, 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오로메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로-테트라플루오로에탄(dichloro-tetrafluoroethane) 또는 이산화탄소 분사제(carbon dioxide propellant)), 또는 무분사제 흡입 가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 변형된 DNase를 포함하는 무분사제 흡입용 용액이며, 예를 들어, 분무기(nebulizer)를 통해 대상체에게 투여하기에 적절하다. 다른 적절한 제제는 단백질 조성물을 포함하는 입자가 전달 장치에 대해 기재된 것과 일치하는 크기 범위, 예를 들어, 약학적 조성물의 건조 분말 형태로 전달되는 한 미스트, 증기 또는 스프레이 제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 조성물은 분무기를 통한 전달을 위해 제형화된다.
변형된 DNase 단백질은 임의로 적절한 분사제를 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태(전형적으로 분말, 액화 및/또는 기체 담체 포함)로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 흡입기(inhaler) 또는 취입기(insufflator)에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 변형된 DNase 단백질의 분말 혼합물 및, 이에 제한되지는 않지만, 락토스 또는 전분과 같은 적절한 분말 기제를 함유하여 제형화될 수 있다.
액체 용액 또는 현탁액이 전달 장치에 사용되는 경우, 분무기, 정량 흡입기, 또는 기타 적절한 전달 장치는, 단일 또는 다중 부분 용량으로, 폐 흡입에 의해, 약학적 유효량의 조성물을 예를 들어, 본 명세서에 기재된 동일한 입자 크기를 가지는 액적(droplets)으로 대상체의 폐에 전달한다. 액체 또는 현탁액으로 사용하기에 적절한 제형을 제조하고 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2011/004476에 교시된 오일-기반 매트릭스가 있다.
액체 약학적 조성물이 본 발명의 전달 방법에 사용되기 전에 동결건조되는 경우, 동결건조된 조성물을 가공하여 본 명세서에 기재된 원하는 크기 범위 내의 입자로 이루어진 미세 분할된 건조 분말을 얻을 수 있다. 액체 약학적 조성물의 건조 분말 형태를 얻기 위해 분무-건조가 사용되는 경우, 방법은 상기 언급된 원하는 크기 범위 내의 입자로 구성된 실질적으로 무정형의 미세 분할된 건조 분말을 생성하는 조건 하에서 수행된다. 유사하게, 출발 약학적 조성물이 이미 동결건조된 형태인 경우, 에어로졸 또는 폐 흡입에 적절한 다른 제제로서 후속 제조를 위한 건조 분말 형태를 얻기 위해 조성물을 가공할 수 있다. 출발 약학적 조성물이 분무-건조 형태인 경우, 조성물은 바람직하게는 본 발명의 폐 투여 방법에 따라 이미 수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액으로서 분배하기에 적절한 입자 크기를 갖는 건조 분말 형태가 되도록 제조되었다. 약학적 조성물의 건조 분말 형태를 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된, 국제 특허 출원 공개 WO 96/32149, WO 97/41833 및 WO 98/29096, 및 미국 특허 번호 제5,976,574호, 제5,985,248호 및 제6,001,336호를 참조한다.
생성된 건조 분말 형태의 조성물은 폐 흡입을 통해 대상체에게 전달되는 에어로졸 또는 다른 적절한 제제로서 후속 제조를 위해 적절한 전달 장치 내에 임의로 배치된다.
건조 분말 형태의 약학적 조성물이 수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액으로서 제조되고 분배되는 경우, 정량 흡입기 또는 다른 적절한 전달 장치가 임의로 사용된다.
본 발명의 일부 구체예에 따른 약학적 조성물의 건조 분말 형태는 분무기, 정량 흡입기, 또는 다른 적절한 전달 장치를 사용하여 수용액 에어로졸로서 후속 전달을 위해 임의로 수용액으로 재구성될 수 있다. 분무기의 경우, 유체 저장소(fluid reservoir) 내에 수용된 수용액은 수성 스프레이로 변환되며, 그 중 작은 부분만이 주어진 시간에 대상체에게 전달하기 위해 분무기에서 배출된다.
남은 스프레이는 분무기 내의 유체 저장소로 다시 배수되며, 여기에서 다시 수성 스프레이로 에어로졸화 된다. 이 방법은 유체 저장소가 완전히 제공될 때까지 또는 에어로졸 스프레이의 투여가 종료될 때까지 반복된다. 분무기의 예는 본 명세서에 기재되어 있다.
대안적으로, 변형된 DNase 단백질은 사용 전에, 적절한 비히클, 예를 들어 멸균 주사용 증류수(sterile, pyrogen-free water)로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용하기에 적합한 약학적 조성물은 활성 성분이 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 치료적 유효량은 질환의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나 치료받는 대상체의 생존을 연장시키는데 효과적인 변형된 DNase 단백질의 양을 의미한다.
본 발명의 구체예에 따라 사용되는 임의의 변형된 DNase 단백질에 대해, 치료적 유효량 또는 투여량은 초기에 동물에서의 활성 분석으로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 활성 분석에 의해 결정된 바와 같이 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다(예를 들어, 변형된 DNase 단백질의 생물학적 활성의 반-최고치 증가(half-maximal increase)를 달성하는, 테스트 단백질 구조의 농도). 이러한 정보는 인간의 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.
다음 실시예 섹션에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 구체예의 변형된 DNase 단백질에 대한 치료적 유효량은 약 0.1 ㎍/kg body weigh(체중) 내지 약 500 mg/kg body weigh(체중) 범위일 수 있다.
본 명세서에 기재된 변형된 DNase 단백질의 독성 및 치료 효능은 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해, 예를 들어 대상체 단백질 구조에 대한 EC50, IC50 및 LD50(테스트된 동물의 50 %에서 사망을 유발하는 치사량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이러한 활동 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에게 사용할 투여량 범위를 제형화하는 데 사용할 수 있다.
투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사가 선택할 수 있다(예를 들어, Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1 참조).
최소 유효 농도(minimal effective concentration, MEC)라고 하는, 원하는 효과를 유지하기에 충분한 활성 DNase의 혈장 수준을 제공하기 위한 투여량 및 간격을 개별적으로 조정할 수 있다. MEC는 각 제제에 따라 다르지만, 시험관 내 데이터, 예를 들어, 시험관 내에서 원하는 수준의 활성을 달성하는 데 필요한 농도로부터 추정할 수 있다. MEC 달성에 필요한 투여량은 개인의 특성과 투여 경로에 따라 다르다. HPLC 분석 또는 생물학적 분석을 사용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다.
투약 간격은 MEC 값을 사용하여 결정할 수도 있다. 제제는 시간의 10-90 %, 바람직하게는 30-90 %, 가장 바람직하게는 50-90 % 동안 MEC 이상의 혈장 수준을 유지하는 요법을 사용하여 투여해야 한다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 명세서에서 기재된 변형된 DNase 단백질은 체내에서 긴 반감기를 나타낼 수 있다. 이러한 특성은 상대적으로 드문 투여의 사용(투여가 주사와 같은 불편한 경로에 의한 경우 특히 유리할 수 있음) 및/또는 상대적으로 낮은 투여량의 투여(이는 변형된 DNase 단백질에 대한 독성 및/또는 잠재적인 면역 반응을 감소시키는 데 특히 유리할 수 있음)를 허용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 일부에서, 변형된 DNase 단백질의 투여 용량(예를 들어, 성인 인간 대상체에 주사)은 한달에 변형된 DNase 단백질 200 mg 이하가 되도록 투여 빈도 및 투여당 용량이 선택된다(예를 들어, 3개월 간격으로 600 mg을 투여하면 한 달에 20 mg의 용량으로 간주된다). 일부 이러한 실시예에서, 투여량은 1개월당 100 mg 이하이다. 일부 구체예에서, 투여량은 1개월당 50 mg 이하이다. 일부 구체예에서, 투여량은 1개월당 20 mg 이하이다. 일부 구체예에서, 투여량은 1개월당 10 mg 이하이다. 일부 구체예에서, 투여량은 1개월당 5 mg 이하이다. 일부 구체예에서, 투여량은 1개월당 2 mg 이하이다. 일부 구체예에서, 투여량은 1개월당 1 mg 이하이다.
치료할 상태의 중증도 및 반응성에 따라, 투여량은 또한 단일 투여일 수 있고, 임의로 상기 기재된 서방형 조성물을 수일에서 수주까지 지속되는 치료 과정과 함께 또는 치유가 이루어지거나 질환이 감소될 때까지 투여할 수 있다.
투여되는 조성물의 양은 물론 치료받는 대상체, 고통의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 조성물은, 만약 원하는 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는, FDA(미국 식품의약국) 승인 키트와 같은, 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치로 제공될 수 있다. 팩은, 예를 들어, 블리스터 팩 또는 가압 용기(흡입용)와 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여 지침이 수반될 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형식으로 용기와 관련된 통지가 수반될 수 있으며, 이 통지는 인간 또는 동물(veterinary) 투여를 위한 조성물의 형식에 대한 기관의 승인을 반영한다. 예를 들어, 이러한 통지는 처방약에 대해 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 라벨링 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다. 적절한 약학적 담체에 제형화된 본 발명의 구체예 중 어느 하나의 변형된 DNase 단백질을 포함하는 조성물은 또한 본 명세서에 상세히 기재된 바와 같이, 제조되고, 적절한 용기에 배치되며, 지시된 상태 또는 진단의 치료를 위해 라벨링될 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체예에 따르면, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 포장재로 포장되고, 상기에서 기재된 바와 같이, 변형된 DNase 단백질의 활성이 유익한 상태의 치료에 사용하기 위해 포장재 내 또는 포장재 상에 인쇄물로 식별된다.
추가 정의:
여기서, "탄화수소" 및 "탄화수소 모이어티"라는 용어는, 기본 골격으로서, 주로 수소 원자로 치환된 탄소 원자 사슬을 포함하는 유기 모이어티를 기재한다. 탄화수소는 포화되거나 비-포화될 수 있고, 지방족(aliphatic), 지환족(alicyclic) 또는 방향족(aromatic) 모이어티로 구성될 수 있고, 임의로 하나 이상의 치환기(수소 제외)로 치환될 수 있다. 치환된 탄화수소는 하나 이상의 치환기를 가질 수 있으며, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로, 예를 들어, 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로알리시클릭(heteroalicyclic), 할로(halo), 하이드록시(hydroxy), 알콕시(alkoxy), 아릴옥시(aryloxy), 티오하이드록시(thiohydroxy), 티오알콕시(thioalkoxy), 티오아릴옥시(thioaryloxy), 설피닐(sulfinyl), 설포닐(sulfonyl), 설포네이트(sulfonate), 설페이트(sulfate), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아지드(azide), 포스포닐(phosphonyl), 포스피닐(phosphinyl), 옥소(oxo), 이민(imine), 옥심(oxime), 히드라존(hydrazone), 카르보닐(carbonyl), 티오카르보닐(thiocarbonyl), 우레아기(urea group), 티오우레아기(thiourea group), O-카르바밀(O-carbamyl), N-카르바밀(N-carbamyl), O-티오카르바밀(O-thiocarbamyl), N-티오카르바밀(N-thiocarbamyl), S-티오카르바밀(S-thiocarbamyl), C-아미도(C-amido), N-아미도(N-amido), C-카르복시(C-carboxy), O-카르복시(O-carboxy), 술폰아미도(sulfonamido), 구아닐(guanyl), 구아니디닐(guanidinyl), 히드라진(hydrazine), 히드라지드(hydrazide), 티오히드라지드(thiohydrazide), 및 아미노(amino)일 수 있으며, 이들 용어는 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 탄화수소는 이들 용어가 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 말단기 또는 연결기일 수 있다. 바람직하게는, 탄화수소 모이어티는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 예를 들어, "1 내지 20"과 같은 수치 범위가 본 명세서에서 언급될 때마다, 이는 기(group), 이 경우 탄화수소가, 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등, 최대 20개의 탄소 원자를 포함할 수 있음을 의미한다. 임의로, 탄화수소는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 탄화수소이다. 임의로, 탄화수소는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된, 용어 "알킬"은 직쇄(straight chain) 및 분지쇄(branched chain) 기를 포함하는 임의의 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 바람직하게는, 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 예를 들어, "1 내지 20" 과 같은 수치 범위가 본 명세서에서 언급될 때마다, 이는 기(group), 이 경우 탄화수소가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등, 최대 20개의 탄소 원자를 포함할 수 있음을 의미한다. 보다 바람직하게는, 알킬은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알킬이다. 가장 바람직하게는, 달리 나타내지 않는 한, 알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬이다. 알킬기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환기는, 예를 들어 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 이민, 옥심, 히드라존, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드, 및 아미노일 수 있으며, 이들 용어는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
여기서, 용어 "알케닐"은 직쇄 및 분지쇄 기를 포함하는, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 불포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 바람직하게는, 알케닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 보다 바람직하게는, 알케닐은 2 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 중간 크기의 알케닐이다. 가장 바람직하게는, 달리 나타내지 않는 한, 알케닐은 2 내지 4개의 탄소 원자를 가지는 저급 알케닐이다. 알케닐기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 알케닐은 하나 이상의 치환기를 가질 수 있으며, 여기서 각 치환기는 독립적으로, 예를 들어, 알키닐, 사이클로알킬, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 이민, 옥심, 히드라존, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "알키닐"은 직쇄 및 분지쇄 기를 포함하는, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 불포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 바람직하게는, 알키닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 보다 바람직하게는, 알키닐은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알키닐이다. 가장 바람직하게는, 달리 나타내지 않는 한, 알키닐은 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 저급 알키닐이다. 알키닐기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 알키닐은 하나 이상의 치환기를 가질 수 있으며, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로, 예를 들어, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 이민, 옥심, 히드라존, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S- 티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있다.
용어 "알킬렌"은, 알킬렌이 말단기가 아니라 연결기라는 점에서만(이러한 용어는 본 명세서에 정의됨), 본 명세서에서 정의된 바와 같은, 알킬기(포화될 때) 또는 알케닐 또는 알키닐기(불포화될 때)와 다른 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소 연결기를 기재한다.
"알킬렌" 기는 불포화된 전-탄소(all-carbon) 모노사이클릭 또는 융합된 고리(즉, 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리)에서 포화된 기(group)를 말하며, 여기서 하나 이상의 고리는 완전히 공액된 파이-전자계(conjugated pi-electron system)를 갖지 않는다. 시클로알킬기의 예는, 제한 없이, 시클로프로판(cyclopropane), 시클로부탄(cyclobutene), 시클로펜탄(cyclopentane), 시클로펜텐(cyclopentene), 시클로헥산(cyclohexane), 시클로헥사디엔(cyclohexadiene), 시클로헵탄(cycloheptane), 시클로헵타트리엔(cycloheptatriene), 및 아다만탄(adamantane)이다. 시클로알킬기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 이민, 옥심, 히드라존, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C- 아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있고, 이들 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 사이클로알킬기가 불포화된 경우, 이는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 및/또는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함할 수 있다.
"아릴" 기는 완전히 공액된 파이-전자계를 가지는 전체-탄소 모노시클릭 또는 융합-고리 폴리시클릭(즉, 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리)을 의미한다. 아릴기의 예는, 제한 없이, 페닐, 나프탈레닐 및 안트라세닐이다. 아릴기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 이민, 옥심, 히드라존, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C- 아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있고, 이들 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"헤테로아릴" 기는, 예를 들어, 질소, 산소 및 황과 같은, 하나 이상의 원자를 고리(들)에 가지고, 추가로, 완전히 공액된 파이-전자계를 가지는 모노시클릭 또는 융합된 고리(즉, 인접한 원자 쌍을 공유하는 고리)를 의미한다. 헤테로아릴기의 예는, 제한 없이, 피롤(pyrrole), 푸란(furan), 티오펜(thiophene), 이미다졸(imidazole), 옥사졸(oxazole), 티아졸(thiazole), 피라졸(pyrazole), 피리딘(pyridine), 피리미딘(pyrimidine), 퀴놀린(quinoline), 이소퀴놀린(isoquinoline) 및 퓨린(purine)을 포함한다. 헤테로아릴기는 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 이민, 옥심, 히드라존, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C- 아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있고, 이들 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"헤테로알리사이클릭" 기는 고리(들)에 질소, 산소 및 황과 같은 하나 이상의 원자를 갖는 모노사이클릭 또는 융합된 고리 기(group)를 의미한다. 고리는 또한 하나 이상의 이중 결합을 가질 수 있다. 그러나, 고리에는 완전히 공액된 파이-전자계가 없다. 헤테로알리시클릭은 치환되거나 비-치환될 수 있다. 치환된 경우, 치환된 기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 할로, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오하이드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 설피닐, 설포닐, 설포네이트, 설페이트, 시아노, 니트로, 아지드, 포스포닐, 포스피닐, 옥소, 이민, 옥심, 히드라존, 카르보닐, 티오카르보닐, 우레아기, 티오우레아기, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, S-티오카르바밀, C- 아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술폰아미도, 구아닐, 구아니디닐, 히드라진, 히드라지드, 티오히드라지드 및 아미노일 수 있고, 이들 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 대표적인 예는 피페리딘(piperidine), 피페라진(piperazine), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 테트라히드로피란(tetrahydropyran), 모르폴린(morpholine) 등이다.
여기서, 용어 "아민" 및 "아미노"는 각각 -NR'R'' 기 또는 -N+R'R''R''' 기를 의미하며, 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 수소, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같이, 치환 또는 비-치환 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로알리시클릭(고리 탄소를 통해 아민 질소에 연결됨), 아릴, 또는 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 아민 질소에 연결됨)이다. 임의로, R', R'' 및 R'''은 수소 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는 알킬이다. 임의로, R' 및 R''(및 R''', 존재하는 경우)은 수소이다. 치환될 때, 아민의 질소 원자에 결합된 R', R'' 또는 R''' 탄화수소 모이어티의 탄소 원자는 옥소에 의해 치환되지 않으며(명시적으로 달리 나타내지 않는 한), R', R'' 및 R'''는 (예를 들어) 카르보닐, C-카르복시 또는 아미드가 아니며, 이들 기는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"아지드" 기는 -N=N+=N- 기를 의미한다.
"알콕시" 기는 본 명세서에 정의된 바와 같은, -O-알킬, -O-알케닐, -O-알키닐, -O-사이클로알킬, 및 -O-헤테로알리시클릭 기 중 임의의 것을 의미한다.
"아릴옥시" 기는 본 명세서에 정의된 바와 같은, -O-아릴 및 -O-헤테로아릴 기 모두를 의미한다.
"하이드록시" 기는 -OH 기를 의미한다.
"티오하이드록시" 또는 "티올" 기는 -SH 기를 의미한다.
"티오알콕시" 기는 본 명세서에 정의된 바와 같은, -S-알킬, -S-알케닐, -S-알키닐, -S-사이클로알킬, 및 -S-헤테로알리시클릭 기 중 임의의 것을 의미한다.
"티오아릴옥시" 기는 본 명세서에 정의된 바와 같은, -S-아릴 및 -S-헤테로아릴 기 모두를 의미한다.
"카르보닐" 또는 "아실" 기는 -C(=O)-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 상기 정의된 바와 같다.
"티오카르보닐" 기는 -C(=S)-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"C-카르복시" 기는 -C(=O)-O-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"O-카르복시" 기는 R'C(=O)-O- 기를 의미하며, 여기서 R'은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"카복실산" 기는 -C(=O)OH 기를 의미한다.
"옥소" 기는 =O 기를 의미한다.
"이민" 기는 =N-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본원에서 정의된 바와 같다.
"옥심" 기는 =N-OH 기를 의미한다.
"히드라존" 기는 =N-NR'R" 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R"는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"할로" 기는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
"설피닐" 기는 -S(=O)-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"설포닐" 기는 -S(=O)2-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"설포네이트" 기는 -S(=O)2-O-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"설페이트" 기는 -O-S(=O)2-O-R' 기를 의미하며, 여기서 R'은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"설폰아미드" 또는 "설폰아미도" 기는 본 명세서에서 정의된 바와 같이, S-설폰아미도 및 N-설폰아미도 기를 모두 포함한다.
"S-설폰아미도" 기는 -S(=O)2-NR'R'' 기를 의미하며, R' 및 R'' 각각은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"N-설폰아미도" 기는 R'S(=O)2-NR''- 기를 의미하며, 여기서 R' 및 R'' 각각은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"O-카르바밀" 기는 -OC(=O)-NR'R'' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"N-카르바밀" 기는 R'OC(=O)-NR''- 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"O-티오카르바밀" 기는 -OC(=S)-NR'R'' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"N-티오카르바밀" 기는 R'OC(=S)NR''- 기를 의미하며, 여기서 R' 및 R'' 각각은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"S-티오카르바밀" 기는 -SC(=O)-NR'R'' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"아미드" 또는 "아미도" 기는 본 명세서에서 정의된 바와 같이, C-아미도 및 N-아미도 기를 포함한다.
"C-아미도" 기는 -C(=O)-NR'R'' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R' 및 R''는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"N-아미도" 기는 R'C(=O)-NR''- 기를 의미하며, 여기서 R' 및 R'' 각각은 본명세서에서 정의된 바와 같다.
"우레아 기"는 -N(R')-C(=O)-NR''R''' 기를 의미하며, 여기서 R', R'' 및 R'' 각각은 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"티오우레아 기"는 -N(R')-C(=S)-NR''R''' 기를 의미하며, 여기서 각각의 R', R'' 및 R''는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"니트로" 기는 -NO2 기를 의미한다.
"시아노" 기는 -C≡N 기를 의미한다.
용어 "포스포닐" 또는 "포스포네이트"는 -P(=O)(OR')(OR'') 기를 의미하며, 여기서 R' 및 R''는 상기 정의된 바와 같다.
용어 "포스페이트"는 -O-P(=O)(OR')(OR'') 기를 의미하며, 각각의 R' 및 R''는 상기 정의된 바와 같다.
용어 "포스피닐"은 같은 -PR'R'' 기를 의미하며, 각각의 R' 및 R''는 상기 정의된 바와 같다
용어 "하이드라진"은 -NR'-NR"R''' 기를 의미하며, R', R" 및 R"'는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "히드라지드"는 -C(=O)-NR' NR"R"' 기를 의미하며, 여기서 R', R" 및 R'"는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "티오히드라지드"는 -C(=S)-NR' NR"R"' 기를 의미하며, 여기서 R', R" 및 R'"는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"구아니디닐" 기는 -RaNC(=NRd)-NRbRc 기를 의미하며, 여기서 Ra, Rb, Rc 및 Rd는 각각 R' 및 R''에 대해 본 명세서에서 정의된 바와 같을 수 있다.
"구아닐" 또는 "구아닌" 기는 RaRbNC(=NRd)- 기를 의미하며, 여기서 Ra, Rb 및 Rd는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
본 명세서에 기재된 화합물 및 구조는 특정 입체이성질체가 구체적으로 표시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 화합물의, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체를 포함하는 임의의 입체이성질체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "거울상이성질체(enantiomer)"는 서로의 완전한 반전(inversion)/반사(reflection)(거울상)에 의해서만 대응물에 대해 중첩될 수 있는 화합물의 입체이성질체를 의미한다. 거울상 이성질체는 오른손 및 왼손처럼 서로를 의미하기 때문에 "좌우상(handedness)"이 있다고 한다. 거울상 이성질체는 모든 살아있는 시스템과 같이, 그 자체로 좌우상이 있는 환경에 존재할 때를 제외하고 동일한 화학적 및 물리적 특성을 갖는다. 본 구체예의 맥락에서, 화합물은 각각 (R) 또는 (S) 배열 및 임의의 조합을 나타내는 하나 이상의 키랄 중심(chiral center)을 나타낼 수 있고, 본 발명의 일부 구체예에 따른 화합물은, (R) 또는 (S) 배열을 나타내는 임의의 키랄 중심을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "부분입체이성질체"는 서로 거울상이성질체가 아닌 입체이성질체를 의미한다. 부분입체이성질체는 화합물의 2개 이상의 입체이성질체가 하나 이상에서 다른 배열을 갖지만, 모든 동등한(관련) 입체중심이 아니고 서로 거울상이 아닐 때 발생한다. 2개의 부분입체이성질체가 하나의 입체중심에서만 서로 다를 때 이들은 에피머(epimers)이다. 각각의 입체 중심(키랄 중심)은 두 가지 다른 배열을 야기하므로 두 가지 다른 입체 이성질체를 생성한다. 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 구체예는 입체-배열의 임의의 조합, 즉 임의의 부분입체이성질체에서 발생하는 다수의 키랄 중심을 갖는 화합물을 포함한다.
본 명세서에 기재된 구체예 중 어느 하나에 대해, 본 명세서에 기재된 화합물은 염의 형태, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 전구약물(prodrug)의 형태일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 염"이라는 어구는 모 화합물 및 그의 반대 이온의 하전된 종을 말하며, 이는 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 방해하지 않으면서, 모 화합물의 용해도 특성을 변형시키고 및/또는 모 화합물에 의한 유기체에 대한 임의의 상당한 자극을 감소시키기 위해 전형적으로 사용된다. 본 명세서에 기재된 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 대안적으로 화합물의 합성 중, 예를 들어, 반응 혼합물로부터 화합물을 분리하거나 화합물을 재-결정화하는 과정에서 형성될 수 있다.
본 구체예의 일부의 맥락에서, 본 명세서에 기재된 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 임의로 산 부가염 및/또는 염기 부가염일 수 있다.
산 부가 염은 약학적으로 허용가능한 염을 형성하는, 선택된 산으로부터 유도된, 적어도 하나의 반대 이온과 함께 양전하 형태(예를 들어, 여기서 염기성 기가 양성자화됨)인 화합물의 적어도 하나의 염기성(예를 들어, 아민 및/또는 구아니디닐) 기 포함한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 화합물의 산 부가염은 화합물의 하나 이상의 염기성 기와 하나 이상의 산 등가물(equivalents) 사이에 형성된 착물일 수 있다.
염기 부가 염은 약학적으로 허용가능한 염을 형성하는, 선택된 염기로부터 유도된, 적어도 하나의 반대 이온과 함께 음전하 형태(예를 들어, 여기서 산성 기가 탈양성자화됨)인 화합물의 적어도 하나의 산성(예를 들어, 카복실산) 기를 포함한다. 따라서 본 명세서에 기재된 화합물의 염기 부가염은 화합물의 하나 이상의 산성 기와 염기의 하나 이상의 염기 등가물 사이에 형성된 착물일 수 있다.
화합물의 하전된 기(들)와 염의 반대 이온 사이의 화학양론적 비율(stoichiometric proportion)에 따라, 산 부가염 및/또는 염기 부가염은 단일-부가염(mono-addition salt) 또는 다중-부가염(poly-addition salt)이 될 수 있다.
본 명세서에 사용되는, "단일-부가염"이라는 어구는 화합물의 반대이온과 하전된 형태 사이의 화학양론적 비가 1:1인 염을 의미하며, 이러한 부가염은 화합물 1몰당량당 반대이온의 1몰당량을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "다중-부가 염"이라는 어구는 화합물의 반대이온과 하전된 형태 사이의 화학양론적 비가 1:1보다 크고, 예를 들어, 2:1, 3:1, 4:1 등인 염을 의미하며, 이러한 부가염은 화합물 1몰당량당 2몰당량 이상의 반대이온을 포함한다.
약학적으로 허용가능한 염의 예는, 제한 없이, 암모늄 양이온 또는 구아니디늄 양이온 및 이의 산 부가염, 및/또는 카르복실레이트 음이온 및 이의 염기 부가염일 것이다.
염기 부가염은 약학적으로 허용가능한 염을 형성하는 나트륨(sodium), 칼륨(potassium), 암모늄(ammonium), 칼슘(calcium), 마그네슘(magnesium) 등과 같은 양이온 반대 이온을 포함할 수 있다.
산 부가염은 염산 부가염을 제공하는 염산(hydrochloric acid), 브롬화수소산 부가염을 제공하는 브롬화수소산(hydrobromic acid), 아세트산 부가염을 제공하는 아세트산(acetic acid), 아스코르브산 부가염을 제공하는 아스코르브산(ascorbic acid), 베실레이트 부가염을 제공하는 벤젠술폰산(benzenesulfonic acid), 캄포설폰산 부가염을 제공하는 캄포설폰산(camphorsulfonic acid), 시트르산 부가염을 제공하는 시트르산(citric acid), 말레산 부가염을 제공하는 말레산(maleic acid), 말산 부가염을 제공하는 말산(malic acid), 메탄설폰산(메실레이트) 부가염을 제공하는 메탄설폰산(methanesulfonic acid), 나프탈렌설폰산 부가염을 제공하는 나프탈렌설폰산(naphthalenesulfonic acid), 옥살산 부가염을 제공하는 옥살산(oxalic acid), 인산 부가염을 제공하는 인산(phosphoric acid), p-톨루엔술폰산 부가염을 제공하는 톨루엔설폰산(toluenesulfonic acid), 숙신산 부가염을 제공하는 숙신산(succinic acid), 황산 부가염을 제공하는 황산(sulfuric acid), 타르타르산 부가염을 제공하는 타르타르산(tartaric acid) 및 트리플루오로아세트산 부가염을 제공하는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)과 같은 다양한 유기산 및 무기산을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 산 부가염 각각은 이들 용어가 본 명세서에 정의된 바와 같이, 단일-부가염 또는 단일-부가염일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전구약물"은 체내에서 활성 화합물(예를 들어, 상기 기재된 화학식의 화합물)로 전환되는 화합물을 의미한다. 전구약물은 통상적으로, 예를 들어, 흡수를 향상시킴으로써 투여를 용이하게 하도록 설계된다. 전구약물에는, 예를 들어, 에스테르 기로 변형된 활성 화합물이 포함될 수 있으며, 예를 들어, 화합물의 하이드록실 기들 중 어느 하나 이상이 아실 기, 임의로 (C1-4)-아실(예를 들어, 아세틸) 기에 의해 변형되어 에스테르 기를 형성하고 및/또는 화합물의 카르복실산 기들 중 어느 하나 이상이 알콕시 또는 아릴옥시 기, 임의로 (C1-4)-알콕시(예를 들어, 메틸, 에틸) 기에 의해 변형되어 에스테르 기를 형성한다.
또한, 이들의 염을 포함하는, 본 명세서에 기재된 각각의 화합물은, 이들의 용매화물 또는 수화물 형태일 수 있다.
용어 "용매화물"은 용질(본 명세서에 기재된 헤테로사이클릭 화합물)과 용매에 의해 형성되는 가변 화학량론(variable stoichiometry)의 복합체(예를 들어, 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-, 헥사- 등)을 의미하며, 이때 상기 용매는 상기 용질의 생물학적 활성을 방해하지 않는다.
용어 "수화물"은 상기 정의된 바와 같은, 용매화물을 의미하며, 여기서 용매는 물이다.
본 명세서에 기재된 화합물은 다형체(polymorph)로서 사용될 수 있고, 본 구체예는 화합물의 임의의 동형체(isomorph) 및 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 이의 유사체(본 명세서에서 하기 기재된 바와 같음)에 의해, 및 임의로 펩티드 결합 그 자체에 의해서만 연결된 적어도 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 중합체를 의미한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 적어도 20개의 아미노산 잔기 또는 이의 유사체를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 적어도 30개의 아미노산 잔기 또는 이의 유사체를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 적어도 50개의 아미노산 잔기 또는 이의 유사체를 포함한다.
용어 "폴리펩티드"는 천연 단백질, 천연 단백질의 단편 및 천연 단백질의 상동체(homologs) 및/또는 이의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 천연 폴리펩티드(예를 들어, 분해 산물, 합성된 폴리펩티드 및/또는 재조합 폴리펩티드)를 포함하며; 뿐만 아니라 펩티도미메틱(peptidomimetic)(일반적으로, 합성된 폴리펩티드) 및 폴리펩티드 유사체인 펩토이드(peptoid) 및 세미펩토이드(semipeptoid)는, 예를 들어, 체내에 있는 동안 또는 세포 내로 더 잘 침투할 수 있는 동안 폴리펩티드를 보다 안정적으로 만드는 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형은 N-말단 변형, C-말단 변형, 펩티드 결합 변형, 백본 변형 및 잔기 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 펩티도미메틱 화합물을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press(1992)에 명시되어 있고, 본 명세서에서 완전히 설명된 것처럼 참조로 포함된다. 이와 관련하여 더 자세한 내용은 하기에 제공된다.
폴리펩티드 내의 펩티드 결합(-CO-NH-)은, 예를 들어, N-메틸화 아미드 결합(-N(CH3)-CO-), 에스테르 결합(-C(=O)-O-), 케토메틸렌 결합(-CO-CH2-), 설피닐메틸렌 결합(-S(=O)-CH2-), α-아자 결합(-NH-N(R)-CO-), 여기서 R은 임의의 알킬(예를 들어, 메틸)이고, 아민 결합(-CH2-NH-), 설파이드 결합(-CH2-S-), 에틸렌 결합(-CH2-CH2-), 하이드록시에틸렌 결합(-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 결합(-CS-NH-), 올레핀 이중 결합(-CH=CH-), 플루오르화 올레핀 이중 결합(-CF=CH-), 레트로 아미드 결합(-NH-CO-), 펩티드 유도체(-N(R)-CH2-CO-)에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 R은 탄소 원자에 자연적으로 존재하는 "정상" 측쇄이다.
이러한 변형은 폴리펩티드 사슬을 따라 있는 모든 결합에서 발생할 수 있으며 심지어 동시에 여러(2-3) 결합에서도 발생할 수 있다.
천연 방향족 아미노산인 Trp, Tyr 및 Phe는 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid, Tic), 나프틸알라닌(naphthylalanine), Phe의 고리-메틸화 유도체, Phe 또는 O-메틸-Tyr의 할로겐화 유도체와 같은 비천연 방향족 아미노산으로 대체될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예의 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 변형된 아미노산 또는 하나 이상의 비-아미노산 단량체(예를 들어, 지방산, 복합 탄수화물 등)를 포함할 수 있다.
용어 "아미노산" 또는 "아미노산들"은 20개의 자연 발생 아미노산을 포함하고; 예를 들어, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 포스포세린(phosphoserine) 및 포스포트레오닌(phosphothreonine)을 포함하는 이들 아미노산은 종종 번역 후 생체 내에서 변형되며; 및 2-아미노아디프산(2-aminoadipic acid), 하이드록시라이신(hydroxylysine), 이소데스모신(isodesmosine), 노르-발린(nor-valine), 노르-류신(nor-leucine) 및 오르니틴(ornithine)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 기타 특이한 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "아미노산"이라는 용어는 D- 및 L-아미노산을 모두 포함한다.
하기 표 1 및 2는 본 발명의 일부 구체예와 함께 사용될 수 있는 자연 발생 아미노산(표 1), 및 비-통상적 또는 변형된 아미노산(예를 들어, 합성, 표 2)을 나열한다.
아미노산(Amino Acid) 3글자 약어(Three-Letter Abbreviation) 한글자 기호(One-letter Symbol)
알라닌(Alanine) Ala A
아르기닌(Arginine) Arg R
아스파라긴(Asparagine) Asn N
아스파라긴산(Aspartic acid) Asp D
시스테인(Cysteine) Cys C
글루타민(Glutamine) Gln Q
글루탐산(Glutamic Acid) Glu E
슬리신(Glycine) Gly G
히스티딘(Histidine) His H
이소류신(Isoleucine) Ile I
류신(Leucine) Leu L
라이신(Lysine) Lys K
메티오닌(Methionine) Met M
페닐알라닌(Phenylalanine) Phe F
프롤린(Proline) Pro P
세린(Serine) Ser S
트레오닌(Threonine) Thr T
트립토판(Tryptophan) Trp W
티로신(Tyrosine) Tyr Y
발린(Valine) Val V
상기와 같은 아미노산(Any amino acid as above) Xaa X
비-통상적 아미노산(Non-conventional amino acid) 코드(Code) 비-통상적 아미노산(Non-conventional amino acid) 코드(Code)
오르니틴(ornithine) Orn 히드록시프롤린(hydroxyproline) Hyp
α-아미노부티르산(α-aminobutyric acid) Abu 아미노노보닐-카르복실레이트(aminonorbornyl-carboxylate) Norb
D-알라닌(D-alanine) Dala 아미노시클로프로판-카르복실레이트(aminocyclopropane-carboxylate) Cpro
D-아르기닌(D-arginine) Darg N-(3-구아니디노프로필)글리신(N-(3-guanidinopropyl)glycine) Narg
D-아스파라긴(D-asparagine) Dasn N-(카르바밀메틸)글리신(N-(carbamylmethyl)glycine) Nasn
D-아스파르트산(D-aspartic acid) Dasp N-(카르복시메틸)글리신(N-(carboxymethyl)glycine) Nasp
D-시스테인(D-cysteine) Dcys N-(티오메틸)글리신N-(thiomethyl)glycine) Ncys
D-글루타민(D-glutamine) Dgln N-(2-카르바밀에틸)글리신(N-(2-carbamylethyl)glycine) Ngln
D-글루탐산(D-glutamic acid) Dglu N-(2-카르복시에틸)글리신(N-(2-carboxyethyl)glycine) Nglu
D-히스티딘(D-histidine) Dhis N-(이미다졸릴에틸)글리신(N-(imidazolylethyl)glycine) Nhis
D-이소류신(D-isoleucine) Dile N-(1-메틸프로필)글리신(N-(1-methylpropyl)glycine) Nile
D-류신(D-leucine) Dleu N-(2-메틸프로필)글리신(N-(2-methylpropyl)glycine) Nleu
D-라이신(D-lysine) Dlys N-(4-아미노부틸)글리신(N-(4-aminobutyl)glycine) Nlys
D-메티오닌(D-methionine) Dmet N-(2-메틸티오에틸)글리신(N-(2-methylthioethyl)glycine) Nmet
D-오르니틴(D-ornithine) Dorn N-(3-아미노프로필)글리신(N-(3-aminopropyl)glycine) Norn
D-페닐알라닌(D-phenylalanine) Dphe N-벤질글리신(N-benzylglycine) Nphe
D-프롤린(D-proline) Dpro N-(히드록시메틸)글리신(N-(hydroxymethyl)glycine) Nser
D-세린(D-serine) Dser N-(1-히드록시에틸)글리신(N-(1-hydroxyethyl)glycine) Nthr
D-트레오닌(D-threonine) Dthr N-(3-인돌릴에틸)글리신(N-(3-indolylethyl) glycine) Nhtrp
D-트립토판(D-tryptophan) Dtrp N-(p-히드록시페닐)글리신(N-(p-hydroxyphenyl)glycine) Ntyr
D-티로신(D-tyrosine) Dtyr N-(1-메틸에틸)글리신(N-(1-methylethyl)glycine) Nval
D-발린(D-valine) Dval N-메틸글리신(N-methylglycine) Nmgly
D-N-메틸알라닌(D-N-methylalanine) Dnmala L-N-메틸알라닌(L-N-methylalanine) Nmala
D-N-메틸아르기닌(D-N-methylarginine) Dnmarg L-N-메틸아르기닌(L-N-methylarginine) Nmarg
D-N-메틸아스파라긴(D-N-methylasparagine) Dnmasn L-N-메틸아스파라긴(L-N-methylasparagine) Nmasn
D-N-메틸아스파라테이트(D-N-methylasparatate) Dnmasp L-N-메틸아스파르트산(L-N-methylaspartic acid) Nmasp
D-N-메틸시스테인(D-N-methylcysteine) Dnmcys L-N-메틸시스테인(L-N-methylcysteine) Nmcys
D-N-메틸글루타민(D-N-methylglutamine) Dnmgln L-N-메틸글루타민(L-N-methylglutamine) Nmgln
D-N-메틸글루타메이트(D-N-methylglutamate) Dnmglu L-N-메틸글루탐산(L-N-methylglutamic acid) Nmglu
D-N-메틸히스티딘(D-N-methylhistidine) Dnmhis L-N-메틸히스티딘(L-N-methylhistidine) Nmhis
D-N-메틸이소류신(D-N-methylisoleucine) Dnmile L-N-메틸이소류신(L-N-methylisolleucine) Nmile
D-N-메틸류신(D-N-methylleucine) Dnmleu L-N-메틸류신(L-N-methylleucine) Nmleu
D-N-메틸라이신(D-N-methyllysine) Dnmlys L-N-메틸라이신(L-N-methyllysine) Nmlys
D-N-메틸메티오닌(D-N-methylmethionine) Dnmmet L-N-메틸메티오닌(L-N-methylmethionine) Nmmet
D-N-메틸오르니틴(D-N-methylornithine) Dnmorn L-N-메틸오르니틴(L-N-methylornithine) Nmorn
D-N-메틸페닐알라닌(D-N-methylphenylalanine) Dnmphe L-N-메틸페닐알라닌(L-N-methylphenylalanine) Nmphe
D-N-메틸프롤린(D-N-methylproline) Dnmpro L-N-메틸프롤린(L-N-methylproline) Nmpro
D-N-메틸세린(D-N-methylserine) Dnmser L-N-메틸세린(L-N-methylserine) Nmser
D-N-메틸트레오닌(D-N-methylthreonine) Dnmthr L-N-메틸트레오닌(L-N-methylthreonine) Nmthr
D-N-메틸트립토판(D-N-methyltryptophan) Dnmtrp L-N-메틸트립토판(L-N-methyltryptophan) Nmtrp
D-N-메틸티로신(D-N-methyltyrosine) Dnmtyr L-N-메틸티로신(L-N-methyltyrosine) Nmtyr
D-N-메틸발린(D-N-methylvaline) Dnmval L-N-메틸발린(L-N-methylvaline) Nmval
L-노르류신(L-norleucine) Nle L-N-메틸노르류신(L-N-methylnorleucine) Nmnle
L-노르발린(L-norvaline) Nva L-N-메틸노르발린(L-N-methylnorvaline) Nmnva
L-에틸글리신(L-ethylglycine) Etg L-N-메틸-에틸글리신(L-N-methyl-ethylglycine) Nmetg
L-t-부틸글리신(L-t-butylglycine) Tbug L-N-메틸-t-부틸글리신(L-N-methyl-t-butylglycine) Nmtbug
L-호모페닐알라닌(L-homophenylalanine) Hphe L-N-메틸-호모페닐알라닌(L-N-methyl-homophenylalanine) Nmhphe
α-나프틸알라닌(α-naphthylalanine) Anap N-메틸-a-나프틸알라닌(N-methyl-a-naphthylalanine) Nmanap
페니실라민(penicillamine) Pen N-메틸페니실라민(N-methylpenicillamine) Nmpen
γ-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) Gabu N-메틸-γ-아미노부티레이트(N-methyl-γ-aminobutyrate) Nmgabu
사이클로헥실알라닌(cyclohexylalanine) Chexa N-메틸-시클로헥실알라닌(N-methyl-cyclohexylalanine) Nmchexa
사이클로펜틸알라닌(cyclopentylalanine) Cpen N-메틸-시클로펜틸알라닌(N-methyl-cyclopentylalanine) Nmcpen
α-아미노-α-메틸부티레이트(α-amino-α-methylbutyrate) Aabu N-메틸-a-아미노-a-메틸부티레이트(N-methyl-a-amino-a-methylbutyrate) Nmaabu
α-아미노이소부티르산(α-aminoisobutyric acid) Aib N-메틸-a-아미노이소부티레이트(N-methyl-a-aminoisobutyrate) Nmaib
D-α-메틸아르기닌(D-α-methylarginine) Dmarg L-a-메틸아르기닌(L-a-methylarginine) Marg
D-α-메틸아스파라긴(D-α-methylasparagine) Dmasn L-a-메틸아스파라긴(L-a-methylasparagine) Masn
D-α-메틸아스파르테이트(D-α-methylaspartate) Dmasp L-a-메틸아스파르테이트(L-a-methylaspartate) Masp
D-α-메틸시스테인(D-α-methylcysteine) Dmcys L-a-메틸시스테인(L-a-methylcysteine) Mcys
D-α-메틸글루타민(D-α-methylglutamine) Dmgln L-a-메틸글루타민(L-a-methylglutamine) Mgln
D-α-메틸글루탐산(D-α-methyl glutamic acid) Dmglu L-a-메틸글루타메이트(L-a-methylglutamate) Mglu
D-α-메틸히스티딘(D-α-methylhistidine) Dmhis L-a-메틸히스티딘(L-a-methylhistidine) Mhis
D-α-메틸이소류신(D-α-methylisoleucine) Dmile L-a-메틸이소류신(L-a-methylisoleucine) Mile
D-α-메틸류신(D-α-methylleucine) Dmleu L-a-메틸류신(L-a-methylleucine) Mleu
D-α-메틸라이신(D-α-methyllysine) Dmlys L-a-메틸라이신(L-a-methyllysine) Mlys
D-α-메틸메티오닌(D-α-methylmethionine) Dmmet L-a-메틸메티오닌(L-a-methylmethionine) Mmet
D-α-메틸오르니틴(D-α-methylornithine) Dmorn L-a-메틸오르니틴(L-a-methylornithine) Morn
D-α-메틸페닐알라닌(D-α-methylphenylalanine) Dmphe L-a-메틸페닐알라닌(L-a-methylphenylalanine) Mphe
D-α-메틸프롤린(D-α-methylproline) Dmpro L-a-메틸프롤린(L-a-methylproline) Mpro
D-α-메틸세린(D-α-methylserine) Dmser L-a-메틸세린(L-a-methylserine) Mser
D-α-메틸트레오닌(D-α-methylthreonine) Dmthr L-a-메틸트레오닌(L-a-methylthreonine) Mthr
D-α-메틸트립토판(D-α-methyltryptophan) Dmtrp L-a-메틸트립토판(L-a-methyltryptophan) Mtrp
D-α-메틸티로신(D-α-methyltyrosine) Dmtyr L-a-메틸티로신(L-a-methyltyrosine) Mtyr
D-α-메틸발린(D-α-methylvaline) Dmval L-a-메틸발린(L-a-methylvaline) Mval
N-시클로부틸글리신(N-cyclobutylglycine) Ncbut L-a-메틸노르발린(L-a-methylnorvaline) Mnva
N-시클로헵틸글리신(N-cycloheptylglycine) Nchep L-a-메틸에틸글리신(L-a-methylethylglycine) Metg
N-시클로헥실글리신(N-cyclohexylglycine) Nchex L-a-메틸-t-부틸글리신(L-a-methyl-t-butylglycine) Mtbug
N-시클로데실글리신(N-cyclodecylglycine) Ncdec L-α-메틸-호모페닐알라닌(L-α-methyl-homophenylalanine) Mhphe
N-시클로도데실글리신(N-cyclododecylglycine) Ncdod α-메틸-α-나프틸알라닌(α-methyl-α-naphthylalanine) Manap
N-시클로옥틸글리신(N-cyclooctylglycine) Ncoct α-메틸페니실라민(α-methylpenicillamine) Mpen
N-시클로프로필글리신(N-cyclopropylglycine) Ncpro α-메틸-γ-아미노부티레이트(α-methyl-γ-aminobutyrate) Mgabu
N-시클로운데실글리신(N-cycloundecylglycine) Ncund α-메틸-시클로헥실알라닌(α-methyl-cyclohexylalanine) Mchexa
N-(2-아미노에틸)글리신(N-(2-aminoethyl)glycine) Naeg α-메틸-시클로펜틸알라닌(α-methyl-cyclopentylalanine) Mcpen
N-(2,2-디페닐에틸)글리신(N-(2,2-diphenylethyl)glycine) Nbhm N-(N-(2,2-디페닐에틸)카르바밀메틸-글리신(N-(N-(2,2-diphenylethyl)carbamylmethyl-glycine) Nnbhm
N-(3,3-디페닐프로필)글리신(N-(3,3-diphenylpropyl)glycine) Nbhe N-(N-(3,3-디페닐프로필)카르바밀메틸-글리신(N-(N-(3,3-diphenylpropyl)carbamylmethyl-glycine) Nnbhe
1-카르복시-1-(2,2-디페닐에틸아미노)시클로프로판(1-carboxy-1-(2,2-diphenyl ethylamino)cyclopropane) Nmbc 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid) Tic
포스포세린(phosphoserine) pSer 포스포트레오닌(phosphothreonine) pThr
포스포티로신(phosphotyrosine) pTyr O-메틸-티로신(O-methyl-tyrosine)
2-아미노아디프산(2-aminoadipic acid) 하이드록시라이신(hydroxylysine)
본 발명의 일부 구체예의 폴리펩티드는 바람직하게는 선형 형태로 이용되지만, 고리화가 폴리펩티드 특성을 심각하게 방해하지 않는 경우에는 폴리펩티드의 고리 형태도 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 폴리펩티드가 가용성 형태일 것을 요구하는 치료 또는 진단에 이용되기 때문에, 본 발명의 일부 구체예의 폴리펩티드는 바람직하게는 히드록실-함유 측쇄로 인해 폴리펩티드 용해도를 증가실킬 수 있는 세린 및 트레오닌을 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 비-천연 또는 천연 극성 아미노산을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 폴리펩티드는 펩티드 합성 분야의 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 합성될 수 있다. 고상 펩티드 합성의 경우, 많은 기술의 요약은 J. M. Stewart 및 J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 및 J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973에서 찾을 수 있다. 고전적인 용액 합성에 대해서는 G. Schroder 및 K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academic Press(New York), 1965를 참조한다.
일반적으로, 이들 방법은 하나 이상의 아미노산 또는 적절하게 보호된 아미노산을 성장하는 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다. 보통, 첫 번째 아미노산의 아미노 또는 카복실기는 적절한 보호기로 보호된다. 그런 다음 보호되거나 유도체화된 아미노산은 불활성 고체 지지체에 부착되거나 아미드 연결을 형성하기에 적합한 조건 하에서, 적합하게 보호된 상보적(아미노 또는 카복실) 기를 가지는 서열의 다음 아미노산을 첨가함으로써 용액에서 이용될 수 있다. 이어서 새로 추가된 아미노산 잔기에서 보호기를 제거하고 다음 아미노산(적절하게 보호됨)을 추가하는 등의 작업을 수행한다. 원하는 모든 아미노산이 적절한 순서로 연결된 후, 나머지 보호기(및 모든 고체 지지체)는 순차적으로 또는 동시에 제거하여, 최종 폴리펩티드 화합물을 얻는다. 이 일반 절차를 간단하게 변형하면, 예를 들어, 탈보호 후, 펜타펩티드 등을 형성하기 위해 (키랄 중심을 라세미화하지 않는 조건에서)적절하게 보호된 디펩티드와 보호된 트리펩티드를 결합함으로써, 성장하는 사슬에 한 번에 하나 이상의 아미노산을 추가할 수 있다. 펩티드 합성에 대한 추가 설명은 미국 특허 제6,472,505호에 개시되어 있다.
본 발명의 일부 구체예의 폴리펩티드 화합물을 제조하는 바람직한 방법은 고상 펩티드 합성을 포함한다.
대규모 펩티드 합성은 Andersson[Biopolymers 2000, 55(3):227-50]에 의해 설명되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 ± 20 %를 의미하고, 임의의 실시예에서 ± 10 %를 의미한다.
용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)", "포함하는(including)", "가지는(having)" 및 이들의 활용형은 "포함하지만 이에 제한되지 않는(including but not limited to)"을 의미한다.
용어 "으로 이루어진(consisting of)"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는(including and limited to)"을 의미한다.
용어 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 추가의 성분들, 단계들 및/또는 부분들이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적이고 신규한 특성들을 실질적으로 변형시키지 않는 경우에만 상기 조성물, 방법 또는 구조가 추가의 성분들, 단계들 및/또는 부분들을 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물(a compound)" 또는 "적어도 하나의 화합물(at least one compound)"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구체예는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서 범위에 대한 설명은 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라, 해당 범위 내의 개별 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
본 명세서에서 수치 범위가 표시되는 경우, 표시된 범위 내에서 나열된 모든 숫자(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 첫 번째로 표시된 수와 두 번째로 표시된 수 "사이의 범위에 있는/범위에 있다(ranging/ranges between)"라는 어구 및 첫 번째로 표시된 수"부터" 두 번째로 표시된 수"까지"의 "범위에 있는/범위에 있다"라는 어구는 본 명세서에서 혼용되어 사용되며, 첫 번째로 표시된 수와 두 번째로 표시된 수 및 이들 사이에 있는 모든 분수와 정수를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "방법"은 주어진 작업을 수행하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 의미하며, 여기에는 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 종사자들에게 공지되어 있거나, 또는 이들에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 쉽게 개발되는 이러한 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료하는"이라는 용어는 상태의 진행을 폐지(abrogating), 실질적으로 억제, 둔화 또는 역전시키는 것, 상태의 임상적 또는 미적 증상의 실질적으로 개선 또는 상태의 임상적 또는 미적 증상의 출현을 실질적으로 방지하는 것을 포함한다.
특정 서열 목록을 참조할 때, 이러한 참조는 예를 들어, 시퀀싱 오류, 클로닝 오류, 또는 염기 치환, 염기 결실 또는 염기 추가를 초래하는 기타 변경으로 인한 사소한 서열 변이를 포함하는 것과 같이 이의 상보적 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 또한 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 단 이러한 변이의 빈도는 50개 뉴클레오티드 중 1개 미만, 또는 100개 뉴클레오티드 중 1개 미만, 또는 200개 뉴클레오티드 중 1개 미만, 또는 500개 뉴클레오티드 중 1개 미만, 또는 1000개 뉴클레오티드 중 1개 미만, 또는 5,000개 뉴클레오티드 중 1개 미만, 또는 10,000개 뉴클레오티드 중 1개 미만이어야 한다.
명료함을 위해 개별 구체예의 맥락에서 설명된 본 발명의 특정 특징은 단일 구체예로 조합하여 제공될 수도 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해, 단일 구체예의 맥락에서 설명되는 본 발명의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 설명된 구체예에 적절하게 제공될 수도 있다. 다양한 구체예의 맥락에서 설명된 특정 특징들은 구체예가 이러한 요소 없이 작동하지 않는 경우를 제외하고는 이러한 구현예의 필수 특징들로 간주되지 않아야 한다.
상기에서 기술되고 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 구체예 및 측면은 하기 실시예에서 실험적 뒷받침된다.
실시예
이제, 상기 설명과 함께 본 발명의 일부 구체예를 비-제한적인 방식으로 예시하는 하기 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 명명법 및 본 발명에서 사용되는 실험실 절차는 분자, 생화학적, 미생물 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 철저히 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); " Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley 및 Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York(1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birrenet al. (eds) " Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998); Hermanson, "Bioconjugate Techniques", 2nd Edition, Elsevier Inc., Burlington, MA (2008); 미국 특허 번호 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 설명된 방법론; " Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); " Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stiteset al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman 및 Co., New York (1980); 이용가능한 면역분석법은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기재되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. ( 1986), "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986), "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) 및 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols": A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA(1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press(1996)를 참조하고; 이들 모두는 본 명세서에서 완전히 설명된 것처럼 참고로 포함된다. 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며 독자의 편의를 위해 제공된다. 여기에 포함된 모든 정보는 참조로 포함된다.
재료 및 방법
재료:
수소화붕소나트륨(NaBH3CN), Methyl Green, 완충액 성분, CaCl2, MgCl2 및 기타 화학물질은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
단관능성 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드(PEG-Ald) 시약은 Creative PEGWorks, NOF 및 JenKem Technology USA Inc.에서 구입하였다.
폴리에틸렌 글리콜 비스-N-하이드록시숙신이미드 비스-NHS-PEG 시약은 Rapp Polymere GmbH 및 Iris Biotech GmbH에서 구입하였다.
식물 재조합 인간 DNase I:
식물 재조합 인간 DNase I은 국제 특허 출원 공보 WO 2013/114374에서 설명된 대로 트랜스제닉 Nicotiana tabacum Bright Yellow-2(BY2) 세포 배양에서 발현되고 세포외 배지에서 정제되어 제조되었다. DNase I은 일반적으로 아미노산 서열의 혼합물을 포함하고 있으며, 대부분은 SEQ ID NO: 1을 가지고, 작은 분획은 SEQ ID NO: 2를 가진다.
DNase I 유전자와 네오마이신 포스포트란스페라아제(neomycin phosphotransferase NPTII) 선택 유전자를 포함하는 벡터를 운반하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주와 함께, BY2 현탁 배양물을, 48시간 동안 공동-배양하였다.
이어서, 세포를 50 mg/L 카나마이신(kanamycin) 및 250 mg/L 세포탁심(cefotaxime)으로 보충된 배지에 보관하였다. NPTII 유전자는 카나마이신에 대한 저항성을 부여하므로, NPTII 양성 BY2 세포만 이 선택 배지에서 생존하였다. 세포탁심은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 선택적으로 죽이는 데 사용되었으며, 식물 세포는 이 항생제에 내성이 있었다. 잘 성장하는 트랜스제닉 세포 현탁액이 확립되면, 개별 세포주를 스크리닝하고 분리하는 데 사용하였다. 고도로 희석된 세포 현탁액의 부분표본(aliquot)을 고체 BY2 배지에 도포하여 개별 세포주를 선택하였다. 이어서 작은 캘러스가 발달할 때까지 세포를 성장시켰다. 그런 다음 각 캘러스를 액체 배양액에 재현탁하였다. 이어서 배지를 샘플링하고 DNase I 수준에 대해 평가하였다. 상대적으로 높은 DNase I 수준을 분비하는 라인을 추가로 재분석하고 DNase I 수준에 대해 비교하여, 후보 DNase I 발현 라인의 최종 선택을 하였다.
인간 DNase I 단백질을 발현하는 형질전환된 BY2 세포의 배지 샘플을 수집하고 필요한 경우, Amicon™ Ultra 원심분리 필터(10 kDa 컷오프)로 x5 농축하였다. 세포 배지에서 DNase I 촉매 활성은 DNA-메틸 그린 분석으로 측정하고, 효소 결합 면역흡착 분석으로 측정한 총 DNase I 양과 비교하였다.
식물 재조합 인간 DNase I(prh-DNase I)을 이온 교환 및 소수성 상호작용을 포함한 4개의 크로마토그래피 단계와 2개의 한외여과(ultra-filtration) 단계를 사용하여 정제하였다. 고순도의 prh-DNase I을 5 mg/mL의 농도로 얻었다.
PEG-NHS와의 반응
DNase I을 MES 완충액(100 mM, pH 7)에 희석하고 CaCl2를 반응 혼합물에 첨가하였다. PEG-N-히드록시숙신이미드(PEG-N-hydroxysuccinimde, PEG-NHS)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. DNase I 대 PEG-NHS는 1:200의 몰비로 반응에 사용하였다. 최종 농도는 2 mg/mL 단백질 및 10 mM CaCl2이었다. 30 kDa 컷오프가 있는 Amicon™ 필터(Merck)를 사용하여, 제형 완충제로 투석하여 반응을 중단시켰다.
DNase와 PEG-프로피온알데히드(PEG-propionaldehyde, PEG-Ald)의 반응
MES(2-(N-모폴리노)에탄술폰산(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)) 완충액(100 mM, pH 7)에 희석된 PEG-프로피온알데히드(PEG-Ald)에 DNase I을 첨가하고 반응 혼합물에 CaCl2를 첨가한 후 MES 완충액(100mM, pH 7)에 새로 준비한 NaBH3CN을 첨가하였다. 반응에 사용된 몰비는 단백질에 대해 계산되었으며 범위는 1:100 내지 1:600(단백질 : PEG-Ald)이었다. 최종 농도는 2 mg/mL 단백질, 10 mM CaCl2 및 100 mM NaBH3CN이었다. 반응은 부드럽게 교반하면서 실온에서 밤새(적어도 10시간) 수행하였다. 30 kDa 컷오프(Merck)가 있는 Amicon™ 필터를 사용하여, 제형 또는 로딩 완충액에 대한 투석에 의해 반응을 중단시켰다.
광학 밀도
정제된 단백질의 정량은 NanoDrop™ 2000 장치(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여, 280 nm에서의 흡광도(흡광 계수(extinction coefficient) 1.43 cm-1(gr/liter)-1)에서 얻어졌다.
메틸 그린-기반 활성 분석에 의한 단백질 함량 및 활성 평가:
DNase I 및 변형된 DNase I 종의 활성을 기질로서 메틸 그린과 복합체를 형성한 연어 정소의 DNA를 사용하는, 메틸 그린 효소 활성 분석에 의해 평가하였다. 염료 메틸 그린은 이중 가닥 DNA의 적층된 염기 사이에 삽입되었다. 긴 DNA 분자가 DNase I 활성의 결과로 가수분해되면, DNA에서 메틸 그린이 분리되었다. 자유 메틸 그린은 아마도 염료의 호변이성(tautomerization)의 결과로 자발적으로 탈색되었다.
DNase I 활성의 평가를 위해, 시험된 DNase I 변이체를 제형 완충액(150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 6.1-6.5)에 대한 투석에 의해 정제하였다. 0.3 내지 20 ng/mL 범위의 농도에서 2배 연속 희석으로 활성 완충액(25 mM HEPES-NaOH, 4 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 0.1 % 소혈청 알부민, 0.05 % TWEEN-20, pH 7.5)에 비-변형된 표준 DNase I을 희석하여 표준 곡선을 작성하였다. 샘플 및 대조군을 유사한 방식으로 희석하였다. 약동학(pharmacokinetic) 분석을 위해, 표준 곡선 및 대조군을 샘플 희석에 따라 스파이크하였다.
100 μL의 DNA-메틸 그린 기질이 포함된 96-웰 플레이트(NUNC)에 100 μL의 표준, 대조군 및 샘플을 이중으로 첨가하고 내용물을 완전히 혼합하였다. 그 다음 플레이트를 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한 다음 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 표준 농도에 대해 플로팅되었고 데이터는 Marquardt의 비선형 회귀 방법에 의해 4-파라미터 로지스틱 모델에 맞춰졌다. 그 다음 DNase 및 DNase 변이체의 농도를 계산하였다.
MALDI-TOF(매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)) 질량 분석법:
샘플 제조: 매트릭스 용액은 375 μL의 2,5-DHAP(2,5-디히드록시아세토페논 (2,5-dihydroxyacetophenone)) 20 mg/mL 에탄올 용액과 125 μL의 18 mg/mL DAC(구연산수소이암모늄(diammonium hydrogen citrate)) 수용액을 혼합하여 제조하였다. 2 μL의 샘플 용액을 2 μL의 2 % TFA 용액과 혼합한 다음 2 μL의 매트릭스 용액을 혼합하였다. 그런 다음 삼원 혼합물(ternary mixture)을 결정화가 시작될 때까지 위아래로 피펫팅하여, 이전에 투명했던 혼합물이 불투명해졌다. 이 혼합물 0.5 μL의 부피를 MALDI 강철 타겟 플레이트에 적용하였다. 용매를 증발시킨 후, 타겟을 질량분석기에 삽입하였다.
질량 분석법: MALDI-TOF/TOF Autoflex?? 속도 질량 분석기(Bruker Daltonilk GmbH)를 사용하여 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 획득하였다. 질량 분석기에는 Smartbeam™-II 고체 레이저(변형된 Nd:YAG 레이저) λ = 355 nm가 장착되어 있고, 20000 내지 200000 m/z 또는 60000 내지 200000 m/z의 질량 범위 내에서 양이온 선형 모드로 작동되었다. 레이저 유창성(Laser fluency)은 각 샘플에 대해 최적화되었다. 레이저는 2 킬로헤르츠의 주파수에서 작동되었고 스펙트럼은 총 2000개의 샷으로, 1000개의 레이저 샷의 배수로 축적되었다.
SDS-PAGE:
DNase I 및 변형된 DNase 종을 SDS-PAGE로 분석하였다. 제조사의 지침에 따라 쿠마시 브릴리언트 블루 염색(Coomassie brilliant blue staining, Bio-Rad)으로 단백질을 검출하였다.
실시예 1
PEG-변형이 식물 재조합 인간 DNase I(prh-DNase I) 활성에 미치는 영향
식물 재조합 인간 DNase I(prh-DNase I)을 1:200 (단백질 : PEG) 몰비로 3개의 다른 공급자로부터의 PEG-Ald(PEG-프로피온알데히드(PEG-propionaldehyde)) 및 2개의 다른 공급자로부터의 PEG-NHS(메톡시-PEG-N-석신이미딜 활성 에스테르(methoxy-PEG-N-succinimidyl active ester))를 사용하여, 상기 재료 및 방법 섹션에 기재된 절차에 따라 PEG(5 kDa)로 변형하였다. 이어서, 반응 혼합물을 1 mM CaCl2 및 150 mM NaCl을 포함하는 제형 완충액으로 투석(30 kDa 컷오프를 갖는 필터 사용)하여 정제하였다. 생성물을 SDS-PAGE로, 광학 밀도(OD)로 분석하여 단백질 함량을 측정하고, 메틸 그린-기반 분석으로 상기에 기재된 바와 같이, 효소 활성을 측정하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, prh-DNase I은 분자량이 약 32 kDa이며, SDS-PAGE에서 해당 위치로 이동하며; 여기서 PEG화된 prh-DNase I 종은 더 높은 분자량을 나타내며, PEG-Ald(5000 Da)에 의해 PEG화된 경우, 밴드의 주요 부분이 95 kDa 마커 위에서 관찰되었다. PEG가 SDS-PAGE에서 분자량에 해당하는 정도의 약 2배로 이동하기 때문에, 겉보기 분자량의 60 kDa 증분은 각각 5 kDa인 약 6개의 PEG 모이어티에 의한 변형에 해당하였다. 여기에 추가로 나타낸 바와 같이, PEG-NHS에 의한 변형은 덜 효율적이었고 아마도 상이한 시약 품질로 인해 두 공급자로부터의 PEG-NHS 간에 효율이 다양하였다. 대부분의 밴드는 95 kDa 마커 미만이었다. 1-5개의 PEG 모이어티에 의해 변형된 PEG화된 DNase 변이체가 관찰되었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, PEG-Ald에 의해 변형된 prh-DNase I은 85% 이상의 효소 활성을 유지한 반면에; PEG-NHS-변형된 prh-DNase I(도 1에 도시된 바와 같이, 더 낮은 수준의 변형을 가짐에도 불구하고)은 변형된 단백질의 효소 활성에 상당히 큰 영향을 미쳤으며, 단지 23-27 % 활성만이 유지되었다.
5000 Da PEG로 PEG화된 prh-DNase I의 단백질 함량 및 효소 활성, % 활성을 나타내는 함량 및 활성 사이의 비율.
prh-DNase I 변형 내용물 (OD280) 효소 활성 % 활성
평균 (mg/mL) 평균 (mg/mL) SD (mg/mL)
mPEG-Ald(5 kDa PEG) 1.09 1.02 0.07 93.5
1.25 1.07 0.08 85.5
1.07 0.96 0.09 89.7
mPEG-NHS (5 kDa PEG) 2.35 0.63 0.04 27.0
1.48 0.34 0.00 23.2
표 4에 나타낸 바와 같이, 2000 Da PEG-Ald에 의해 변형된 prh-DNase I은 2000 Da PEG-NHS에 의해 변형된 prh-DNase I보다 상당히 더 큰 효소 활성을 유지하였으며, 이는 5000 Da PEG에서 얻은 상기에서 언급한 결과와 유사하였다.
2000 Da PEG로 PEG화된 prh-DNase I의 단백질 함량 및 효소 활성, % 활성을 나타내는 함량 및 활성 사이의 비율.
prh-DNase I 변형 내용물 (OD280) 효소 활성 % 활성
평균 (mg/mL) 평균 (mg/mL) SD (mg/mL)
mPEG-aldehyde (2 kDa PEG) 1.55 1.43 0.03 92.2
mPEG-NHS (2 kDa PEG) 1.76 0.34 0.04 19.6
임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 활성의 차이는 아미드화(PEG-NHS 사용)가 양전하를 띤 아민기를 중성 아미드기로 변화시키는 반면, 환원적 아민화(PEG-Ald 사용)에서는, 양전하를 띤 아민기가 남아 음전하를 띤 기질(DNA)과의 상호작용을 촉진할 수 있었다.
DNase I 변형에 대한 PEG화 조건 및 PEG화 정도의 효과는 상기 기재된 절차에 따라 prh-DNase I을 다양한 양의 PEG화 시약, 즉 200, 400 및 600 몰 당량 대 단백질과 반응시켜 평가하였다. 생성물을 SDS-PAGE 및 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석하여 변형 시 분자량의 변화를 측정하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, prh-DNase I은 각각, 200, 400 및 600 몰 당량의 2000 Da PEG-Ald와 반응시 평균 2, 3 및 4개의 PEG 모이어티로; 및 각각, 200, 400 및 600 몰당량의 5000 Da PEG-Ald(SDS-PAGE 분석에 의해 결정됨)와 반응시 평균 4, 5 및 6 개의 PEG 모이어티로 변형되었다.
MALDI-TOF 질량 분석법(데이터는 나타내지 않음)에 의해 측정된, PEG 모이어티의 수는 SDS-PAGE 분석에 의해 측정된 수(상기 기재된 바와 같음)와 유사하였다.
이러한 결과는 DNase의 PEG 변형 정도가 제어 가능한 방식으로 DNase에 대한 PEG화 시약의 비율과 상관관계가 있음을 나타낸다.
실시예 2
래트에서 예시적인 PEG화 DNase I의 약동학
Pulmozyme® 재조합 인간 DNase는 정맥 투여 후 전신 순환계에서 빠르게 제거되었다. 래트에서 prh-DNase I의 약동학 조사에서도 효소의 짧은 반감기가 입증되었다(1 mg/kg body weight(체중)을 정맥 주사했을 때, 7.1분; 데이터는 표시되지 않음).
DNase I에 대한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PEG화의 효과를 평가하기 위해, prh-DNase I을 200 몰 당량의 PEG-Ald를 사용하여, 상기 기재된 절차에 따라 PEG-Ald(5000 Da PEG)에 의해 PEG화하고, 분취용 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)를 사용하여 정제하였다. 효소 활성 분석에 의해 측정된 바와 같이, PEG화된 prh-DNase I은 변형되지 않은 prh-DNase I의 초기 활성의 약 63 %를 유지하였다(본 명세서에서는 "변형 전" 또는 "prh-DNase I" 그 자체로도 지칭됨).
도 3에 도시된 바와 같이, DNase는 SDS-PAGE 분석에 의해 측정된 바와 같이, 3-5개의 PEG 사슬에 의해 변형되었다.
5마리의 Wistar 래트에게 PEG화된 DNase I을 1 mg/kg body weight(효소 활성을 기준으로 정량화)의 용량으로 정맥 주사하였다. IV 주사 후 10분 및 0.5, 1, 2, 8, 16 및 24시간 후에 혈액 샘플을 헤파린 튜브에 채취하고, 혈액의 혈장 분획을 분리하였다. 혈장 샘플을 상기 기재된 절차에 따라, 메틸 그린 기반 활성 분석에 의해 평가하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 혈액 내 DNase 활성은 약 10.2시간의 반감기(제거와 관련됨)로, PEG화 DNase I 주입 시 점차 감소하였다.
이러한 결과는 본 명세서에 기재된 바와 같은 DNase의 변형이 혈액 내 DNase 활성의 지속 시간을 상당히 연장하고 제거율을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
추가 연구에서, 3개의 PEG화된 prh-DNase 변이체(상기 기재된 절차에 따라 제조됨) 및 2개의 비-PEG화된 변이체의 약동학을 다음과 같이 비교하였다:
그룹 A: 비-변형된 DNase I(prh-DNase I);
그룹 B: 알리도르나제 알파(국제 특허 출원 공개 WO 2016/108244에 기재된 바와 같이, 에틸렌 디아민으로 아미드화에 의해 변형된 비-PEG화된 prh-DNase I);
그룹 C: 400 당량의 PEG-Ald(2 kDa PEG)를 사용하여 제조된 2 kDa PEG(MALDI-TOF 질량 분광법으로 측정한, 약 8 kDa의 접합된 PEG의 평균 총 질량)의 단백질당 약 4개의 모이어티를 갖는 변형된 DNase I(prh-DNase I);
그룹 D: 100 당량의 PEG-Ald(5 kDa PEG)를 사용하여 제조된, 5 kDa PEG(MALDI-TOF 질량 분석법으로 측정한, 15 kDa의 접합된 PEG의 평균 총 질량)의 단백질당 약 3개의 모이어티를 갖는 변형된 DNase I(prh-DNase I); 및
그룹 E: 100 당량의 PEG-Ald(5 kDa PEG)를 사용하여 제조된, 5 kDa PEG(MALDI-TOF 질량 분광법으로 측정한, 20 kDa의 접합된 PEG의 평균 총 질량)의 단백질당 약 4개의 모이어티를 갖는 변형된 DNase I(prh-DNase I).
도 5에 도시된 바와 같이, PEG가 실제 질량의 두배인 SDS-PAGE의 겉보기 질량과 연관되어 있다는 점을 고려할 때, 3개의 변형된 DNase I 변이체(그룹 C, D 및 E)에 대한, SDS-PAGE에 의해 측정된, 질량 증가는 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 질량 증가와 일치하였다.
다양한 몰 당량의 PEG(2 또는 5kDa)로 PEG화된 prh-DNase I의 단백질 함량 및 효소 활성(평균 ± 표준 편차), % 활성을 나타내는 함량 및 활성 사이의 비율
샘플 효소 활성 (mg/mL) 단백질 함량 (mg/mL) 활성(%)
2 kDa PEG의 약 4개 모이어티가 있는 DNase Ⅰ 1.77 ± 0.10 2.02 ± 0.01 87.9
5 kDa PEG 의 약 3개 모이어티가 있는 DNase Ⅰ 1.87 ± 0.10 2.04 ± 0.01 91.9
5 kDa PEG의 약 4개 모이어티가 있는 DNase Ⅰ 1.47 ± 0.11 1.87 ± 0.00 78.9
DNase I 변이체를 Sprague Dawley 래트(8주령)에 1 mg/kg body weight(여기서 농도는 활성에 따라 측정됨, 표 5 참조)의 용량으로, 각 테스트 그룹에 대해 6마리의 동물을 정맥 주사하였다. 혈액 샘플은 주입 전 리튬 헤파린 튜브에 수집되었고 IV 주입 후 다른 시간 간격으로 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플에서 활성 DNase의 양을 메틸 그린 기반 활성 분석으로 평가하였다.
도 6a-8에 나타난 바와 같이, PEG화된 DNase I은 비-PEG화된 DNase I(비-변형된 DNase I 또는 알리도르나제 알파)보다 상당히 더 긴 반감기(도 6a-7) 및 더 높은 곡선하 면적(AUC)(도 8)을 나타냈으며, 반감기 및 AUC는 PEG 모이어티의 수 및 PEG 모이어티의 크기와 양의 상관관계가 있었다.
이러한 결과는 다중 PEG 모이어티를 갖는 PEG화는 생체 내에서 DNase I의 활성을 연장시키는데 매우 효과적이며 DNase 활성은 PEG화 정도를 제어함으로써 제어될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
맹장 결찰(cecal ligation) 및 천자(puncture) 동물 모델에서 패혈증에 대한 예시적인 장기-작용형 DNase의 효과
맹장 결찰 및 천자에 의해 수컷 C57BL/6 마우스에서 유도된 패혈증의 마우스 모델에서 추가 연구를 위해 실시예 2에 기재된 바와 같은 5 kDa PEG의 약 4개 모이어티를 갖는 DNase I(여기에 기재된 가장 긴 반감기를 가지는 예시적인 변형된 DNase I)을 선택하였다.
맹장은 맹장 끝에서 약 1 cm 아래에서 결찰하고 18-게이지 바늘을 사용하여, 두 번 천자하고, 약 1 cm의 대변(fecal matter)을 압출하였다. 모든 동물은 수술 직후 1 mL의 식염수로 피하주사 하였고, 수술 1시간 후, 그 후 매 12시간마다 최대 48시간까지 항생제 요법(피하 에르타페넴 나트륨(ertapenem sodium), 30 mg/kg)을 하였다. 액체 소생술(Liquid resuscitation)(식염수 1 ml)은 수술 후 4시간 후에 시행되었고 그 이후에는 항생제가 투여되었다.
패혈증 모델의 타당성은 CLP 후 24시간, 요소, 혈청 글루타민-옥살로아세트산 트랜스아미나제(SGOT, 일명 아스파르트산 트랜스아미나제 또는 AST), 크레아틴 포스포키나제 및 혈청 글루타민 피루브산 트랜스아미나제(SGPT, 일명 알라닌 트랜스아미나제 또는 ALT) (American Medical Laboratories 중앙 실험실 서비스에서 측정됨), 및 세포-유리 DNA의 혈청 수준(백그라운드 신호를 줄이기 위해 55 ℃에서 30분 동안 1.8 mg/ml 단백질분해효소 K와 함께 인큐베이션 하여, 제조업체의 지침에 따라 Quant-iT™ PicoGreen™ 이중 가닥 DNA 분석 키트(Invitrogen)을 사용하여 측정됨)이 비처리된 대조군 마우스와 비교하여 상당히 증가했다는 것을 측정함으로써 확인하였다(데이터는 표시되지 않음).
CLP 후 1, 4 또는 8시간 후에 변형된 DNase I(또는 대조군) 10 mg/kg을 마우스에 정맥 주사하고, 실험군당 5마리씩, 생존률을 12시간마다 측정하였다. 식염수 및 비-변형된 prhDNase I를 각각 대조군으로 사용하였다:
도 9A 및 9B에 도시된 바와 같이, 수술 후 1 또는 4시간에 단일 용량의 DNase I(비변형 또는 변형)의 투여는 식염수와 비교하여 생존을 향상시켰고, 변형된 DNase I은 비-변형된 DNase I보다 더 큰 정도로 생존을 향상시켰다. 여기에 추가로 나타낸 바와 같이, 수술 4시간 후 투여 또는 변형된 DNase I은 수술 1시간 후에 투여한 것보다 더 큰 정도로 생존을 향상시켰다.
이러한 결과는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 DNase가 항생제가 함께 투여되는 경우에도, 패혈증에 대한 향상된 치료 효과를 제공함을 나타낸다. 이러한 결과는 또한 DNase 투여 시기가 치료 효과에 중요한 영향을 미칠 수 있음을 나타내며, 이는 패혈증 손상에 대한 초기 면역 반응에서 NET의 역할 때문일 수 있다[Mai et al., Shock 2015, 44:166- 172].
변형된 DNase I의 효과는 수술 4시간 후 및 8시간 후에 변형된 DNase I 투여 시 동일한 모델(대조군으로 식염수 사용)에서 다시 테스트되었다.
도 10A 및 10B에 도시된 바와 같이, 수술 4시간 후에 변형된 DNase I의 단일 용량의 투여는 식염수와 비교하여 생존을 상당히 향상시켰다.
도 11A 및 11B에 도시된 바와 같이, 수술 8시간 후에 변형된 DNase I의 단일 용량 투여는 식염수와 비교하여 생존을 향상시키는 데 매우 효과적이었다.
이러한 결과는 패혈증 유도 약 8시간 후의 DNase 투여가 패혈증에 대한 치료 효과를 제공하는 데 특히 효과적이라는 것을 나타낸다.
또한, CLP 4시간 후 10, 5, 1 및 0.1 mg/kg body weigh의 변형된 DNase I 용량을 투여하여 패혈증 모델에서 투여량의 효과를 평가하였다(상기 기재된 절차에 따름).
도 12A 및 12B에 도시된 바와 같이, 변형된 DNase I의 각각의 테스트 용량은 사망률을 감소시켰지만, 사망률 감소는 용량 의존적이었고, 최고 용량(10 mg/kg) 투여시 CLP 7일 후에 사망률이 관찰되지 않았다.
이들 결과는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 DNase가 패혈증에 대한 치료 효과를 제공한다는 것을 추가로 확인시켜주었다.
실시예 4
맹장 결찰 및 천자 패혈증 모델에서 예시적인 장기-작용성 DNase의 추가 연구
실시예 3에 기재된 절차에 따라, 패혈증을 마우스에서 맹장 결찰 및 천자(CLP)에 이어, 항생제 치료 및 변형된 DNase I(비-변형 DNase I 및/또는 식염수를 대조군으로 사용) 투여(예를 들어, CLP 후 4시간)에 의해 유발하였다.
이어서 혈청을 수집하고(예를 들어, CLP 후 24시간), 변형된 DNase I이 세포-유리 DNA 수준을 감소시키는 능력을 평가하기 위해, 당업계에 공지된 적절한 기술을 사용하여, 혈액 내 장기 손상 바이오마커(예를 들어, 크레아틴 포스포키나제(creatine phosphokinase), 요소(urea), 혈청 글루타민-옥살로아세틱 트랜스아미네이즈(serum glutamic-oxaloacetic transaminase, SGOT), 혈청 글루타민 피루베이트 트랜스아미네이즈(serum glutamic pyruvic transaminase, SGPT) 및/또는 엔도칸(endocan)), 순환 세포-유리 DNA/NET(예를 들어, 실시예 3에 기재된 바와 같은 Quant-iT?? PicoGreen?? 이중 가닥 DNA 분석 키트 및/또는 항-이중 가닥 DNA 항체에 기초한 ELISA 분석을 사용함), TNF, IL-6, 및 폐 조직에서 마이엘로퍼록시데이즈(myeloperoxidase, MPO)(예를 들어, ELISA 분석을 사용함), 및/또는 혈액 내 박테리아 수준을 임의로 평가하였다.
실시예 5
바이러스 감염에 대한 예시적인 장기-작용성 DNase의 효과
마우스를 치사량의 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 바이러스의 약 500 플라크 형성 단위)로 공격하였다.
대안적으로 또는 추가적으로, American Type Culture Collection(Manassas, VA)으로부터 입수한 인플루엔자 A 바이러스 A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8)을 37 ℃에서 72시간 동안 발육란(embryonated egg)에서 증식시키고, 요막액(allantoic fluid)을 채취하였다.
상기 각각의 구체예 중 어느 하나에 기재된 바와 같이, PEG화에 의해 제조된, 예시적인 장기-작용성 DNase(및 이들의 임의의 조합)의 효과(임의로 1 mg/kg으로 투여됨)를 동일 투여량 및 식염수 조절에서 비-변형된 DNase의 효과와 비교하였다. 특히, NET(호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular trap))/DNA 관련 실체의 생존 및/또는 사후 BALF(기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid)) 함량에 대한 예시적인 장기-작용성 DNase의 효과를 평가하였다(예를 들어, Narasarju et al.[Am J Pathol 2011, 179:199-210]에 기재된 바와 같음).
바이러스 역가(Virus titer)는 Lin et al.[PLoS ONE 2017, 12:e0172299]에 의해 기재된 것과 같은 절차에 따라, 임의로 원위세뇨관 세포(Madin-Darby canine kidney cell)의 감염을 통한 플라크 분석에 의해 측정하였다.
de Buhr & von Kockritz-Blickwede[Detection, Visualization, and Quantification of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) and NET Markers, pp. 425-442, in: Quinn M., DeLeo F. (Eds) Neutrophil. Methods in Molecular Biology, vol 2087. Humana, New York, NY]에 기재된 것과 같은 절차에 따라 NET(호중구 세포외 트랩)를 임의로 측정하였다.
치사율(mortality), 바이러스 역가, BALF 함량 및/또는 NET 함량을 감소시키는 장기-작용성 DNase의 능력(예를 들어, 비-변형된 DNase에 비해)을 평가하였다.
실시예 6
뇌졸중에 대한 예시적인 장기-작용성 DNase의 효과
뇌졸중 환자를 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator, tPA) 및/또는 다른 현행 표준 진료 관행과 함께, 상기 기재된 바와 같이 제조되는, 예시적인 장기-작용성 DNase의 단일 용량으로 치료하였다.
tPA 사용을 위한 치료 범위, 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury)으로 인한 2차 손상 및/또는 뇌졸중으로 인한 장애를, 예를 들어, 예시적인 장기-작용성 DNase 없이 투여된 tPA와 비교하여 임의로 평가하였다.
임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 예시적인 장기-작용성 DNase 및 tPA의 병용-투여는 혈전 용해(clot dissolution)에 필요한 시간을 감소시키고, tPA에 의해 용해되지 않는 혈전의 수를 감소시켜, 혈관내 절차(endovascular procedure)의 필요성을 줄이고, tPA 사용을 위한 치료 범위를 증가시키는 것으로 여겨진다.
실시예 7
심근 경색에 대한 예시적인 장기-작용성 DNase의 효과
야생형 C57BL6/J 마우스(예를 들어, 8주령)는 좌하행 관상동맥(left descending coronary artery)의 영구 결찰을 실시하여 Michael et al.[Am J Physiol 1995, 269:H2147-H2154]에 의해 기재된 것과 같은 절차에 따라, 심근 경색(myocardial infarction, MI)을 유도하고, 모의 수술(sham operation)을 대조군으로 하였다. 처리 그룹은 임의로: 예시적인 장기-작용성 DNase(정맥내 주사, 1 mg/kg); 비-변형 prh-DNase(정맥 주사, 1 mg/kg); 및 식염수이다. 치료를 재관류(reperfusion) 전에 한 번 수행하였다.
경색 부위(infarction area), 좌심실 재형성(left ventricular remodeling), 염증 마커(TNF-α 및/또는 기타 전-염증성 사이토카인) 및/또는 혈장 세포-유리 DNA는, 예를 들어, 경색 부위, 염증 마커 및/또는 혈장 세포-유리 DNA를 감소, 및/또는 좌심실 재형성을 증가시키는 예시적인 장기-작용성 DNase의 능력(예를 들어, 비-변형 DNase 및/또는 식염수에 비해)을 평가하기 위해, 임의로 평가하였다.
좌심실 재형성은 Vogel et al.[Basic Res Cardiol 2015, 110:15]에 기재된 것과 같은 절차에 따라 임의로 평가하였다. 세포-유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)는 Alborelli et al.[Cell Death Dis 2019, 10:534]에 기재된 것과 같은 절차에 따라 임의로 수집하고 평가하였다. 염증 마커는 상업적으로 이용 가능한 ELISA-기반 키트를 사용하여 임의로 평가하였다.
실시예 8
리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)로 유도된 패혈증 동물 모델에서 예시적인 장기-작용성 DNase의 효과
마우스를 4개의 그룹(예를 들어, 각각 5마리씩)으로 나누고 다음과 같이 처리하였다.
1) 대조(나이브(naive)),
2) 리포폴리사카라이드(LPS) + 식염수(피하 식염수로 치료한 LPS-유도 내독성(endotoxic) 쇼크),
3) 리포폴리사카라이드(LPS) + prh-DNase I(prh-DNase I로 처리된 LPS-유도 내독성 쇼크).
4) 리포폴리사카라이드(LPS) + 예시적인 장기-작용성 prh-DNase(예시적인 장기-작용성 DNase로 처리된 LPS-유도 내독성 쇼크, 상기 기재된 것과 같은 절차에 따라 제조됨).
내독성 쇼크 10분 전 및 8시간 후에 준-치사량(sub-lethal dose)의 LPS 및 식염수 또는 DNase(10 mg/kg, 정맥 주사)로 마우스를 처리하였다. 내독성 쇼크 유도 12시간 후, 장기 손상 바이오마커(예를 들어, 크레아틴 포스포키나제(creatine phosphokinase), 혈액 요소 질소(blood urea nitrogen, BUN) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase, AST)), 순환 유리 DNA, TNF-α 및 폐 조직의 미엘로페록시다제(myeloperoxidase, MPO)의 혈중 농도를 임의로 평가하였다. 추가로, 내독성 쇼크 유도 12시간 후 신장 조직에서의 NET 침착을 임의로 평가하였다.
실험군 간의 바이오마커 수준의 비교는 염증 반응을 감소시키는 DNase의 능력에 대한 PEG화의 효과를 입증할 수 있었다.
생존에 대한 DNase PEG화의 효과를 평가하기 위해, 마우스를 3일까지 매 8시간마다, 치사량의 LPS를 사용하는 것을 제외하고, 상기 기재된 바와 같이 처리하였다.
실시예 9
화학 요법 후 호중구 감소증의 동물 모델에서 예시적인 장기-작용성 DNase의 효과
화학요법-유도 호중구 감소증에 대한, 상기 기재된 절차에 따라 제조된, 예시적인 장기-작용성 DNase의 효과는 Mittra et al.[Annals of Oncology 2017, 28:2119-2127]에 의해 기재된 것과 같은 절차에 따라 평가하였다.
간단히 말해서, 아드리아마이신(adriamycin)(10 mg/kg)을 1회 주사한 후 10일 동안 매일 혈구 수를 측정하였다. 마우스 및/또는 래트를 3개의 그룹(예를 들어, 각각 5마리씩)으로 나누고 다음과 같이 처리하였다.
1) 아드리아마이신(10 mg/kg, 복강내);
2) 아드리아마이신(10 mg/kg, 복강내) + prh-DNase(1 mg/kg, 정맥내);
3) 아드리아마이신(10 mg/kg, 복강내) + 예시적인 장기-작용성 prh-DNase(1 mg/kg, 정맥내);
혈구수를 개선 및/또는 염증 바이오마커를 감소시키는 예시적인 장기-작용성 DNase의 능력을 평가하기 위해 혈구수 및 염증 바이오마커(예를 들어, TNF-α 및 기타 전-염증성 사이토카인)를 평가하였다(예를 들어, 상기 기재된 바와 같음).
실시예 10
염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD) 및 대장염(colitis)의 동물 모델에서 예시적인 장기-작용성 DNase의 효과
대장염의 진행에 대한 NET 분해 및 호중구 감소(neutrophil depletion)의 영향을 연구하기 위해, 유도된 대장염 마우스 모델을 Li et al.[J Crohn's Colitis ,2020, 14:240-253)에 기재된 것과 같은 절차에 따라 사용하였다.
마우스(예를 들어, 8주령, 수컷)에 5일 동안 식수에 3 %(w/v) 덱스트란 설페이트 나트륨(dextran sulfate sodium, DSS, 예를 들어: MW 36-40 kDa)을 공급한 다음 8일까지 일반 식수를 공급하였다. 동물의 체중을 매일 측정하고 고통의 징후가 있는지 모니터링하였다. 마우스를 3개의 그룹(예를 들어, 각각 5마리씩)으로 나누고 다음과 같이 처리하였다:
(1) DSS + 식염수;
(2) DSS + prh-DNase;
(3) DSS + 예시적인 장기-작용성 prh-DNase;
DNase 변이체는 모델 유도에서 5일째에 5 mg/kg의 단일 용량으로 정맥내 투여하였다. 체중 감소, 질병 활동 지수, 결장 단축 수준 및/또는 염증의 조직학적 징후와 함께 NET 형성 및 세포-유리 DNA 수준을 평가하였다. DSS 개시 후 4일 및 6일째에 DSS-유도 대장염에서 혈청 세포-유리 DNA 및 NET 형성의 증가뿐만 아니라 NET 형성, 세포-유리 DNA, 체중 감소, 질병 활동 지수, 결장 단축, 및/또는 염증의 조직학적 징후 감소, 및/또는 생존을 증가(예를 들어, 비-변형 DNase와 비교하여) 시키는 예시적인 장기-작용성 DNase의 능력을 측정하였다.
본 발명이 이의 특정 구체예와 관련하여 설명되었지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것임이 명백하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 정신 및 넓은 범위에 속하는 이러한 모든 대안, 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 또한, 본 출원에서 임의의 참조문헌의 인용 또는 식별은 이러한 참조문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 본 출원의 임의의 우선권 문서(들)는 이의(이들의) 전문이 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Protalix Ltd. RUDERFER, Ilya FUX, Liat HAYON, Yael <120> LONG-ACTING DNASE <130> 89420 <150> US 63/088,496 <151> 2020-10-07 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr Phe Gly Glu Thr Lys Met 1 5 10 15 Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser Arg Tyr 20 25 30 Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Thr Ala Val 35 40 45 Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His 50 55 60 Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr 65 70 75 80 Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser Ala Val Asp Ser Tyr Tyr 85 90 95 Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg Glu 100 105 110 Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu Phe 115 120 125 Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu Ile 130 135 140 Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly Leu 145 150 155 160 Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly 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Lys Trp Gly 180 185 190 Leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr 195 200 205 Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr 210 215 220 Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr 225 230 235 240 His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly 245 250 255 Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gln Ala Ala Tyr 260 265 270 Gly Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser Asp His Tyr Pro Val 275 280 285 Glu Val Met Leu Lys 290

Claims (34)

  1. 적어도 2개의 폴리(알킬렌 글리콜(alkylene glycol)) 모이어티(moiety)에 부착된 DNase 폴리펩티드를 포함하는 변형된 DNase 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부(portion), 또는 각각(each)은, 약 10 kDa 이하의 분자량을 가지는 변형된 DNase 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 약 2 kDa 내지 약 5 kDa 범위의 분자량을 가지는 변형된 DNase 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 2 내지 7개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착되는 변형된 DNase 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 적어도 3개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착되는 변형된 DNase 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 적어도 4개의 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 부착되는 변형된 DNase 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 단관능성(monofunctional) 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티인 변형된 DNase 단백질.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 상기 폴리펩티드 내의 아민기의 질소 원자에 공유 결합되는 알킬렌기를 포함하는 변형된 DNase 단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 아민기는 라이신 잔기 측쇄(lysine residue side chain) 및/또는 N-말단(N-terminus)에 포함되는 변형된 DNase 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 내의 라이신 잔기 측쇄 및 N-말단에 포함되는 아민기의 적어도 80 %는 상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티에 공유 결합되는 변형된 DNase 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 하기 화학식 I을 가지는 변형된 DNase 단백질:
    -L2-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
    화학식 I
    여기서:
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 탄화수소 모이어티이거나 부재하고;
    R1은 수소 또는 탄화수소 모이어티이며;
    m은 2 내지 10 범위의 정수이고; 및
    n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 화학식 I'을 가지는 변형된 DNase 단백질:
    -CH2-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
    화학식 I'
    여기서:
    L1은 탄화수소 모이어티이거나 부재하고;
    R1은 수소 또는 탄화수소 모이어티이며;
    m은 2 내지 10 범위의 정수이고; 및
    n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
  13. 제11항에 있어서,
    n은 20 내지 200 범위인 변형된 DNase 단백질.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1은 비치환된(unsubstituted) 알킬렌인 변형된 DNase 단백질.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1은 길이가 1 내지 6개의 탄소 원자인 변형된 DNase 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티의 적어도 일부, 또는 각각은, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 모이어티인 변형된 DNase 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 재조합(recombinant) 폴리펩티드인 변형된 DNase 단백질.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 식물 재조합 폴리펩티드인 변형된 DNase 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNase 단백질은 DNase I 단백질인 변형된 DNase 단백질.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 DNase I 단백질은 인간 DNase I 단백질과 적어도 80 % 상동성(homology)을 가지는 변형된 DNase 단백질.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 DNase I 단백질은 SEQ ID NO: 2에서 제시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 가지는 변형된 DNase 단백질.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 DNase I 단백질은 SEQ ID NO: 1에서 제시되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 가지는 변형된 DNase 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 변형된 DNase 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  24. DNase 활성이 유익한 질환(disease) 또는 장애(disorder)를 치료하는데 사용하기 위한, 제23항의 조성물 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 변형된 DNase 단백질.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는 혈전증(thrombosis), 혈관 폐색(vascular occlusion), 염증성 질환 또는 장애, 자가면역 질환 또는 장애, 기관지 폐렴성 질환(bronchopulmonary disease), 심혈관 질환(cardiovascular disease), 대사 질환(metabolic disease), 암, 신경퇴행성 질환 또는 장애, 감염과 관련된 질환 또는 장애, 간 손상, 섬유증(fibrosis) 및 관 폐색(ductal occlusion)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물 또는 변형된 DNase 단백질.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는 급성 관상동맥 증후군(acute coronary syndrome), 급성 신장 손상(acute kidney injury), 급성 폐 손상(acute lung injury), 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 알레르기(allergies), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 무기폐(atelectasis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 조울증(bipolar disorder), 기관지확장증(bronchiectasis), 세기관지염(bronchiolitis), 기관지염(bronchitis) 및 기관기관지염(tracheobronchitis), 담관염(cholangitis), 만성신장질환(chronic kidney disease), 만성호중구증가증(chronic neutrophilia), 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 만성화농성폐질환 결막염(chronic suppurative lung disease conjunctivitis), 감기(common cold), 낭성섬유증(cystic fibrosis), 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis), 당뇨병(diabetes), 파종성혈관내응고(disseminated intravascular coagulation), 안구건조증(dry eye disease), 농흉(empyema), 심내막염(endocarditis), 여성 불임(female infertility), 통풍(gout), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease), 혈종(hematomas), 혈흉(hemothorax), 헤파린 유발성 혈소판감소증(heparin-induced thrombocytopenia), 간신증후군(hepatorenal syndrome), 헌팅턴병(Huntington's disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 담관내 혈전(intrabiliary blood clots), 허혈-재관류손상(ischemia-reperfusion injury), 카르테제너증후군(Kartegener's syndrome), 백혈병(leukemia), 백혈구울혈(leukostasis), 간경화증(liver cirrhosis), 홍반성 신장염(lupus nephritis), 남성불임(male infertility), 유선염(mastitis), 심근경색(myocardial infarction), 호중구감소증(neutropenia), 호중구응집(neutrophil aggregation), 정관폐색(obstruction of the vas deferens), 췌장염(pancreatitis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 폐렴(pneumonia), 외상후 빈혈(post-pneumatic anemia), 원발성 섬모 운동 이상증(primary ciliary dyskinesia), 건선(psoriasis), 횡문근융해증(rhabdomyolysis), 유육종증(sarcoidosis), 정신분열증(schizophrenia), 패혈증(sepsis), 낫형세포병(sickle cell disease), 부비동염(sinusitis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 연기로 인한 폐 손상(smoke-induced lung injury), 고형 종양(solid tumors) 및/또는 종양 전이(tumor metastasis), 뇌졸중(stroke), 외과적 유착(surgical adhesions), 외과적(surgical) 및/또는 외상성(traumatic) 조직 손상, 전신 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 전신 경화증(systemic sclerosis), 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy), 방사선 조사 및/또는 화학요법 치료와 관련된 조직 손상, 수혈 유발 폐 손상(transfusion-induced lung injury), 결핵(tuberculosis), 혈관염(vasculitis), 정맥 혈전색전증(venous thromboembolism), 바이러스(viral), 세균(bacterial), 진균(fungal) 및/또는 원충(protozoal) 감염, 및 상처(wound) 또는 궤양(ulcer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물 또는 변형된 DNase 단백질.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는 패혈증(sepsis)인 조성물 또는 변형된 DNase 단백질.
  28. 치료를 필요로 하는 대상체의 체액, 분비물 또는 조직에서 과도한 세포외 DNA(excess extracellular DNA)와 관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 제23항의 조성물 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 변형된 DNase 단백질.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NETs)과 관련된 조성물 또는 변형된 DNase 단백질.
  30. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 변형된 DNase 단백질의 제조방법으로서,
    (a) 상기 폴리펩티드를 알데히드기에 부착된 폴리(알킬렌 글리콜)를 포함하는 작용제(agent)와 접촉시켜, 상기 폴리펩티드 및 상기 작용제의 접합체(conjugate)를 얻는 단계; 및
    (b) 상기 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 환원제는 피콜린 보란 착물(picoline borane complex) 및 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    상기 작용제는 하기 화학식 II를 가지는 방법으로:
    HC(=O)-L1-[O-(CH2)m]n-O-R1
    화학식 II
    여기서:
    L1은 탄화수소 모이어티이고;
    R1은 수소 또는 탄화수소 모이어티이며;
    m은 2 내지 10 범위의 정수이고; 및
    n은 2 내지 1000 범위의 정수이다.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 작용제 대 상기 폴리펩티드의 몰비(molar ratio)는 10:1 내지 2,000:1 범위인 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체를 환원제와 접촉시키는 단계는 적어도 약 7의 pH에서 수행되는 방법.
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