KR20230103866A - CRISPR/Cas9 기반 irf3 특이적 sgRNA 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 irf3 유전자 교정용 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA), 상기 sgRNA를 포함하는 irf3 유전자 교정용 재조합 벡터, 상기 sgRNA 또는 재조합 벡터를 포함하는 irf3 유전자 교정용 조성물 및 상기 조성물을 세포에 도입시키는 유전자 교정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 sgRNA는 irf3 유전자를 특이적으로 표적할 수 있는 바, 이러한 sgRNA를 CRISPR/Cas9 시스템에 도입하여 A형 간염 바이러스의 검출 효율성을 높일 수 있다.
본 발명의 sgRNA는 irf3 유전자를 특이적으로 표적할 수 있는 바, 이러한 sgRNA를 CRISPR/Cas9 시스템에 도입하여 A형 간염 바이러스의 검출 효율성을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 irf3 유전자의 교정용 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA), 상기 sgRNA를 포함하는 irf3 유전자 교정용 재조합 벡터, 상기 sgRNA 또는 재조합 벡터를 포함하는 irf3 유전자 교정용 조성물 및 상기 조성물을 세포에 도입시키는 유전자 교정 방법에 관한 것이다.
A형 간염은 A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus) 감염에 의한 급성 간염 질환으로, 최근 우리나라에서 발생률이 급증하고 있다. A형 간염의 증상은 바이러스가 인체 내로 침입한 후 약 4주 정도의 잠복기 후에 발생하게 되는데 그 양상은 마치 감기 몸살 증세처럼 열이 나거나, 식욕이 감소하고, 구역질과 구토, 전신적인 쇠약감, 복통, 설사 등으로 나타난다.
50세 이상에서는 A형 간염의 증상이 심하게 나타나고 자반증, 신염, 관절통 등 간 외 증상의 합병증이 발생하며 치명적인 전격성 간염으로 발전하는 빈도가 급격히 늘어나는 것으로 알려져 있다.
A형 간염을 일으키는 A형 간염 바이러스는 피코르나바이러스과(Picornaviridae)의 헤파토바이러스(Hepatovirus)속으로 분류되며, 약 7500개의 뉴클레이티드로 구성된 양성 단일가닥 RNA를 유전체로 가진 바이러스로서 인간을 비롯한 척추동물을 숙주로 삼는다.
A형 간염 바이러스는 주로 대변 및 구강 경로를 통해 쉽게 전염되며, A형 간염 바이러스가 간세포에 증식하면 담즙을 통해 분비되어 대변으로 배출되며 물 또는 음식 등을 오염시켜 다른 사람을 감염시키게 된다. 또한, 최근에는 조개젓 등 젓갈류에 의한 A형 바이러스 감염이 급증하였으며, 어패류, 과일, 채소류 등의 식품이 A형 간염의 감염원으로 급부상하고 있다. 현재까지 A형 간염 바이러스를 치료하는 약은 개발되지 않았으며, 일반적으로 증상을 완화시키기 위한 대중요법이 주된 치료이다.
이러한 A형 간염의 진단은 인체의 경우 주로 혈액에서 A형 간염 바이러스에 대한 IgM 항체 검사를 통해 이루어지나, 식품 등에서 A형 간염 바이러스를 조기에 진단하는 방법에 대한 연구는 미진한 실정이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 A형 간염 바이러스를 보다 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, A형 간염바이러스 감염에 민감한 세포에서 항바이러스 작용에 관여하는 유전자를 CRISPR/Cas9 기술로 결손시켜 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 예시적 목적은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 irf3 유전자의 교정용 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 sgRNA를 포함하는 irf3 유전자 교정용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 sgRNA 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 irf3 유전자 교정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 유전자 교정용 조성물을 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 유전자 교정 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 irf3 유전자의 교정용 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA)를 제공한다.
본 발명의 용어 "유전자 교정"은 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입 또는 유도할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 결손 또는 넉인(knockin)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비코딩 DNA 서열에 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 출원의 목적상 상기 유전자 교정은 특히 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 동물 세포에 변이를 도입하는 것일 수 있으며, 유전자 편집(gene editing)이라는 용어와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "결손"은 표적 유전자의 유전자 서열 상의 변형에 의한 기능 저하를 의미한다. 상기 유전자 서열 상의 변형으로 인하여, 표적 유전자의 발현량이 감소하거나 또는 미발현될 수 있다.
본 발명에 있어서 irf3(interferon regulatory factor 3)는 항바이러스 작용에 관여하는 인터페론 자극 유전자로서, irf3를 결손하여 발현을 억제시키면 제1형 인터페론 신호 경로가 차단되어 A형 간염 바이러스에 대한 민감도가 증가하므로, irf3 결손 세포를 특정 시료에 적용하여 A형 간염 바이러스의 검출 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, irf3 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 5와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 일부 서열을 포함할 수 있다.
A형 간염 바이러스가 감염될 수 있는 세포로는 FRhK-4 세포(레수스 원숭이 신장 세포), HepG2 세포, Huh7 세포 등이 일반적으로 알려져 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "단일 가이드 RNA(sgRNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 포함하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염 기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 단일 가이드 RNA와 특정 염기서열을 자르는 역할을 하는 Cas9 단백질로 구성된 CRISPR/CAS9 시스템은 특정한 유전체의 좌위에서 돌연변이를 유도할 수 있는 간편하고 쉬운 방법으로, 세포나 동물에서 특정 유전자의 기능을 억제할 수 있다. 즉, 가이드 RNA가 타겟 유전자를 인식하면 가이드 RNA에 Cas9 단백질이 결합하여 뉴클레아제로 작용하여 타겟 유전자의 하류 약 3 bp에 위치한 두 개의 구아닌 염기(GG)를 인식하여 절단함으로써 DNA 이중가닥 손상(DNA double strand break, DSB)을 유발한다.
본 발명에 있어서, 상기 sgRNA는 irf3 유전자 염기 서열의 적어도 일부에 상보적인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 sgRNA를 포함하는, irf3 유전자 교정용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 용어 "재조합 벡터"는 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 sgRNA 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 irf3 유전자 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 Cas9 단백질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "Cas9 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제로 작용할 수 있는 단백질이다. Cas9 단백질은 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기 디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로 스트렙토코커스 피요게네스 유래의 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에서는, FRhK-4 세포의 irf3 유전자 염기서열을 바탕으로 온라인 제작 툴 CHOPCHOP 및 E-Crispr를 이용하여 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 유전자 결손에 적합한 irf3 타겟 sgRNA 서열을 발굴하였으며, 상기 sgRNA 및 Cas9 단백질이 내포된 당단백질 나노베시클(gesicle) 복합체를 제작해 FRhK-4 세포에 도입하여 irf3 유전자가 결손되는 것을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 sgRNA 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 irf3 유전자 교정용 조성물을 세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 유전자 교정 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포는 FRhK-4 세포, HepG2 세포 또는 Huh7 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 세포에서 irf3 유전자의 염기서열의 적어도 하나 이상의 위치에서 염기의 치환, 결실 또는 삽입이 일어날 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 sgRNA는 FRhK-4 세포의 irf3 유전자를 특이적으로 표적할 수 있는 바, 이러한 sgRNA를 CRISPR/Cas9 시스템에 도입하여 A형 간염 바이러스의 검출 효율성을 높일 수 있다.
도 1은 FRhK-4 세포에서 sgRNA가 포함된 부위를 증폭한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 sgRNA 부위가 포함된 PCR 산물에 Cas9 단백질을 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 sgRNA 및 Cas9 단백질이 포함된 세포-유래 모사체(gesicle)를 나타낸 것이다. (a: 일반 현미경을 이용한 관찰, b: 형광 현미경으로 RFP 관찰)
도 4는 FRhK-4 세포 내 세포-유래 모사체의 도입 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 irf3 결손 FRhK-4 세포의 irf3 단백질 발현량을 확인한 결과이다.
도 2는 sgRNA 부위가 포함된 PCR 산물에 Cas9 단백질을 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 sgRNA 및 Cas9 단백질이 포함된 세포-유래 모사체(gesicle)를 나타낸 것이다. (a: 일반 현미경을 이용한 관찰, b: 형광 현미경으로 RFP 관찰)
도 4는 FRhK-4 세포 내 세포-유래 모사체의 도입 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 irf3 결손 FRhK-4 세포의 irf3 단백질 발현량을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: sgRNA 선정
A형 간염 바이러스에 감수성이 있으며 실험에 주로 사용되는 세포인 FRhK-4 (레수스 원숭이 신장 세포, Rhesus monkey kidney cell)를 표적 세포로 선정하였으며, 항바이러스 작용에 관여하는 것으로 알려진 인터페론 자극 유전자 irf3(interferon regulatory factor 3)을 표적 유전자로 선정하였다.
이후 NCBI 데이터베이스를 바탕으로 FRhK-4 세포의 irf3 염기서열(GenBank accession number: NC_041772.1, 서열번호 5)을 확보하였으며, CRISPR/Cas9 시스템을 통한 유전자 결손에 적합한 irf3 타겟 sgRNA 서열을 발굴하기 위하여 온라인 제작 툴 CHOPCHOP과 E-Crispr를 이용, GC 비율, 자기 상보성(self-complementarity), 미스매치를 고려해 4가지의 유전자 irf3의 타겟 sgRNA 서열을 선정하였다(표 1).
| 서열번호 | 명칭 | 제작 Tool | sgRNA 서열 (5′- 3′) |
| 2 | sgRNA1 | CHOPCHOP | AAG GAG GCG TGT TCG ACC TG |
| 3 | sgRNA2 | TAT ACG CGC AGG CCG GAC CA | |
| 1 | sgRNA3 | GCC ACT GGT GCG TAC GTT CC | |
| 4 | sgRNA4 | E-Crispr | GTA CCT GCC TGC CAG CAC TG |
그 후 표적 세포의 irf3 부위를 증폭하기 위한 프라이머를 개발하였다. (표 2). 상기 표 2의 프라이머로 irf3 내 표적 부위 증폭을 위한 1차 PCR을 Takara사의 PCR 키트(Cat No. 632635)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 그 결과, 서열번호 1의 sgRNA3과 프라이머 세트 8, 및 서열번호 4의 sgRNA4와 프라이머 세트 9번의 경우 각각 1개의 진한 밴드가 확인되어, irf3 내 표적 부위가 잘 증폭되었음을 확인하였다(도 1).
| sgRNA | 프라이머 세트 | 프라이머 서열(5′- 3′) | 서열번호 | |
| 1 | 1 | Forward | CTT CCA GCA GAC CAT CTC CT | 6 |
| Reverse | TTT GCC CTG AGC CCG TGG AA | 7 | ||
| 2 | Forward | ATT GGG TTC CGT TTC CTC AA | 8 | |
| Reverse | ACC GGG GCC GCC AAG TCT TC | 9 | ||
| 2 | 3 | Forward | CTA TAC TGG CGG AAT TGA GA | 10 |
| Reverse | CCC AGG ATT CAT TTC CTT TG | 11 | ||
| 4 | Forward | GCC CCA AAA CCC CAG GAT TC | 12 | |
| Reverse | GGG ATA CTT GCT TTC GAT GA | 13 | ||
| 3 | 5 | Forward | GGT CCA CAG GGA GAG GAC AA | 14 |
| Reverse | TTG CAG TGA GCT GAG CAT TC | 15 | ||
| 6 | Forward | GCC TTG AAT GCA GGG TGA AA | 16 | |
| Reverse | CCA GGG AGG CGG AAG TTG CA | 17 | ||
| 7 | Forward | AGG AGA CTG GAG CAG GAA CA | 18 | |
| Reverse | CCA GGG AGG CGG AAG TTG CA | 19 | ||
| 8 | Forward | CAA GTT GGA CTT GGA AGC CTG | 20 | |
| Reverse | TCC GGA GAG TAG TCT GGC TG | 21 | ||
| 4 | 9 | Forward | CTG CCA CAC ATA CTG GGC A | 22 |
| Reverse | GCG AAA CCC TAA GGG ACA TAG | 23 | ||
| 10 | Forward | GCC CTG CCC AGT AGA AAG C | 24 | |
| Reverse | ACA CAG CGA GAC TCC GTC TC | 25 | ||
이후 해당 증폭 산물에 Cas9 뉴클레아제를 처리한 후 2차 PCR을 Takara사의 PCR 키트(Cat No. 632635)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하여 sgRNA 및 Cas9 뉴클레아제가 잘 결합하여 irf3을 결손하는지 확인하였다. 그 결과, 서열번호 1의 sgRNA3과 프라이머 세트 8의 경우 2개의 밴드가 확인되어, 높은 결합 적합성으로 irf3을 결손시킴을 확인하였다(도 2).
이러한 결과에 따라 FRhK-4 세포의 유전자 irf3 결손을 위한 sgRNA로 서열번호 1의 sgRNA3을 선정하였다.
실시예 2.
irf
3 결손 FRhK-4 세포주 제작
HEK 293T 세포를 이용하여 서열번호 1의 sgRNA3 및 Cas9 뉴클레아제가 포함된 세포-유래 모사체(Cell-derived nanovesicle, Gesicle)를 제작하였다.
구체적으로, CRISPR/Cas9 Gesicle Production System (Takara, cat No. 632613)을 사용하였으며, sgRNA3 서열을 삽입한 pGuide-it-sgRNA1 벡터(Takara, Cat No. 632612) 10μg을 뉴클레아제가 없는 증류수에서 600μL로 희석하여 Gesicle Packaing Mix(Takara)에 첨가하였다. 이후 전체 혼합물을 HEK293T 세포에 적가하고, 이를 100mm dish(SPL Life Science)에서 4.5 x 106 세포로 플레이팅하였다. 형질감염 48시간 후, 배지를 수집하고 0.45 μm 시린지(Sartorirus, Palaiseau, France)로 필터한 후 초원심분리기(Beckman-Coulter, Brea, CA, USA)로 4℃, 8000g 조건으로 16시간 스핀다운하였다. 펠렛을 PBS로 재현탁한 후 사용을 위해 분취하였으며, 293T 세포막에 글리코단백질이 생성됨을 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이 현미경을 통해 gesicle의 형성을 확인하였다.
그 후 FRhK-4 세포(ATCC Inc, Cat No. CRL-1688)에 gesicle을 도입하여 유전자 편집을 수행하였다. 유전자 편집은 Guide-itTM CRISPR/Cas9 Gesicle Production System(Takara Inc, Cat No. 632613) 제품을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
구체적으로, iDimerize 기술에 의하여 Cas9 단백질/sgRNA 복합체와 CherryPicker 형광단백질이 Gesicle내에서 상호작용하게 되어, Gesicle 내로 봉입된 후 세포 외로 방출되었다. 이후 배양액으로부터 회수한 Geiscle을 FRhK-4 세포에 첨가하여 형광현미경을 통해 도 4에 나타낸 바와 같이 표적 FRhK-4 세포내로 gesicle이 도입되었음을 확인하였다.
이후 웨스턴 블랏을 통해 야생형 FRhK-4 대비 gesicle이 도입된 FRhK-4 세포에서 irf3의 발현이 저하됨을 확인하였다(도 5).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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ggaaacccaa aaaagggcat aggggcgggg acagccccgg gccccgcggg ccgtccgttc 60
ggctccgggg tgtgttaccc aaagaatgat aaagttggtt ttatttcaag aagtcgatcg 120
aaaagaaagc ctcagcgtct agagttcagc tgacgggaaa gggggtgcgc agcctcgagt 180
ttgagagcta tccggagccc caaaacaggg gtgggcgcca gctccctgca cgccctgagc 240
ttctatcgta ggtaacgcgg aagagcctgg gagagcgtta gtggcgtccg agagcgagga 300
gcgggaaaca ggatgggtct gcacggagag tggaaaggca ggctgtgtac tctggggaaa 360
gtggagcaag gaaggagcta cagtggccga cgctggaggt cggctggaga aaaactagaa 420
aaagtaggga ggaaagagga aaacaggagg cgtctacact gaggggttct acagagggaa 480
ggatggactc cgtacatggg tgtagttcac tcccgaaacc tgaggcgtgc tctgtcctgg 540
aggagggggg ctggcagtcg aggaggaatt ggatggaagt tctgtgttgg aaatgtttcg 600
ggggatcttc tgtaggggga ctggggaagg ggatctacac tggggtaaat agcaggagat 660
agaggcttac acgtgaatcg attctgcact gaaataacta gggaaagagg atgctaccct 720
gaaagtgggg atacttgctt tcgatgatgt cggggagaga ggaggtctat actggcggaa 780
ttgagagagt ggagggtctg cactgaagac actggggaag ggtatgccat ggatatggga 840
aggaacccta gcggattaag gagcctctcg ggaagatggg aggatgggaa gaggaggttt 900
cctgtttgta cccccgaaaa tatgggtgaa ggacctgtgc cgtggcccgt gagagggagg 960
gttctgggtg cggaaactcc aggccaggtg ggtccggggg aggccggtcg cgcccagaaa 1020
atgccctata cgcgcaggcc ggaccatggg aaccccaaag ccacggatcc tgccctggct 1080
ggtgtcgcag ctggacctgg ggcaactgga gggcgtggcc tgggtgaacg agagccgcac 1140
gcgcttccgc atcccttgga agcacggcct acggcaggat gcacaggagg aggatttcag 1200
aatcttccag gtgcgtgaga cgaccgggga cgctggaaac cctgagctgc gcgcggggca 1260
gaaaggactc ctagcgggcc gggctgagac ggcggaggta tcgcccgagg ggctggctcg 1320
tgccaacgtt ggtgggtggg gctagaacgg gaggggcggg gctagccgga tcagctgact 1380
gatggtggga cgcaagcagg gttggagctg cccggttacg gcaataaaac cgggaaagcc 1440
ggttagtacg caaaggaaat gaatcctggg gttttggggc tctctagggg ccggggctct 1500
tggttgtagg atagatactg ggggatggtt tttgaaacat cagaggtgag acctggagcc 1560
ccaaatctgg ggttcctaac cactgaatta gtatatgcca gaggtggtaa acagtgtgag 1620
gggcggggtt atcacagagg gtgtcgcggg gcaggtggtg cacggggtta gacaccaagt 1680
tggacttgga agcctggctt agaaagaaga gttttttggg ccgggcgccg tggttcacac 1740
ctgtaatccc agcactttgg gaggccgagg cgggctatca cctgaggtca ggagtttgag 1800
accagcctgg ccaacatggt gaaaatacaa aatcattggt gaaaatacaa aattatctac 1860
taaaaataca aaacttagcc aggtgcggtg gtgcccgcct gtaatgccag ctactcagga 1920
ggctgagaca ggagaattgc ttgaaccagg gaggcggaag ttgcagtgag ctgagattgc 1980
gccattgcat tccagcctgg gtgacaagag tgaaactcca tctcaaaaag aaaaaaaggc 2040
ttttaaaaac tcgaggtggg ggatggaggt agataggacg gggggatttg gggatggaac 2100
ttgcagactt agaacttgcc agggaaagag ggtggtgtta ggatccagga gacagggtta 2160
gggccccagg agcaggatct aagtcgtcct cccccactat cctgacacca ctgttgcccc 2220
aggcctgggc cgaggccact ggtgcgtacg ttcccgggag ggataagcca gacctgccaa 2280
cctggaagag gaatttccgt tctgccctca accgcaaaga tgtgtgttta gcagaggacc 2340
ggagcaagga ccctcacgac ccacataaga tctacgagtt tgtgaactca ggtctgccag 2400
atcggggttc atgtgggagg ctggggtccc aagggttcct ggcaccccta ctcccctcac 2460
cacctttctc aacaggagtt ggggactttt cccagccaga ctactctccg gacaccaatg 2520
gcggaggcag tacttctgat acccaggtga gaatgtgccc aaccttcatg cccctcagtc 2580
tctgtcgtgt ccccatgggc cttgtcctct ccctgtggac catccccccg cttccctgcc 2640
tccagcctgc cccttacctg agccagtggt ggccctgtct gttcctgctc cagtctcctc 2700
aggagaaaat tccgagtttt caccctgcat tcaaggccct agcacacctt cccaggattt 2760
catggacttc ggcagggggc tgtcagcctc ttgggaactg aaaactccct caccttgatc 2820
ctgctgaggc ctgagctggg ggagcatccc ctctgaaatt ctacccagcc tgccccgccc 2880
aggtcttacc tgcatagagc caggtccttg ggttggaatg gtagcacctg gcgttcatta 2940
gagtgtttgg ctgttgatgc catggctggc tctgtcccca tgctggaagc cccttgaagg 3000
cagagctcaa gcctgacctc cctgcattgc tgagaacaga cctggtccat atgaagtctc 3060
cagaaaagac tatggaaatg cctgattctc tttctttgtt tccctccagg aaaacattct 3120
ggatgagtta ctgggtaaca tggtgttggc cccactgcca gatccaggac ccccaagcct 3180
ggctgtagcc cctcagcact tgcagagccc cagcttggac agtcccactc ccttcccaaa 3240
cctggagccc tctgagaacc cactgaagcg gctgttggtg ccgggggaag gtgagtgtca 3300
gctgcaggct gggagggctg aggtctgggc ggcagcccct gattctcaat ctctctcccc 3360
ttcacacggc tgctgccact gctcagagtg ggagttcgag gtgacagcct tctaccgggg 3420
ccgccaagtc ttccagcaga ccatctcctg cccggagggc ctgcggctgg tggggtccga 3480
agtgggcgac aggacgctgc ctggatggcc aatcacactg ccagaccctg gcatgtccct 3540
gacagacagg ggagtgatga gctacgtgag gcacgtgctg agctccctgg gtgggggact 3600
ggctctgcgg cgggccgggc agcggctctg ggcccagcgg ctggggcact gccacacata 3660
ctgggcagtg agcgaggagc tgctcaacag cgggcatggg cctgatggcg aggtccccaa 3720
ggacaaggaa ggaggcgtgt tcgacctggg gcccttcatt gtaggtgagt gagatggggg 3780
cttcgccctg cccagtagaa agcagactgc acagtggtta agaactcagg attggccggg 3840
cacggtggct cacgcctgta gtcccagcac tttgggaggc cgaggcgggc agatgacgtg 3900
gtcaggagtt tgagaccagc ctggccaaca tagtgaaacc ccatctctac taaagataca 3960
aacaaatagt cgggcatggt ggcacacgcc tgtaatccca gctactcggg aggctgaggc 4020
aggagaatca cttgaaccag ggagggagag gttaaagtga gccgagatcg caccactaca 4080
ctctagcctg gtgacagagc cagactctgt ctcaaacaac aacaacaaaa actcaggatt 4140
aggactgaat tcagaccctg gctgcccttg gcccactgta taacccaagg caaaggactt 4200
tgccctgagc ccgtggaatc cgaggacggt ctcctctctg tacctgcctg ccagcactgg 4260
ggtgagacac aggcccagta cacagcatgc tcggggaatt agctgccgct gtcatcatta 4320
tcgtaactaa tgatggtgga cagaccaata gcaggaaagc tatgtccctt agggtttcgc 4380
tgtgcggtgg cactttctgc catgatggaa atgacagtca cctgcactgt ccggtacagc 4440
agccactagc cacaagggcc gagcacttgg gtgaggcgag tgccaccagg acacgattcg 4500
ttttttttgt ttgtttgttt tttttgagac ggagtctcgc tgtgtctccc aggctggagt 4560
gcagtggtgt gatctcagct cactgcaagc tccgcctccc gggttcacgc cattctcccg 4620
cctcagcctc ccaagtagct gagactacag gcgcccgcca cctcgcccgg ctagtttttt 4680
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tcgtgatccg cccgtctcag cctcccaaag tgctgggatt acaggcttga gccaccgcgc 4800
ccggcctacg attcgtttta attgattaca atttaaactg aaatgacctc acatgactaa 4860
tggctgcagt tggacagtgc ggcctcagag gggactgaat gccaaccagc ttctcctcca 4920
gattcactgg catccttgga agcctgggcc ccctactctg ggcctgttgt gaatgctgag 4980
gcttgggggc ttgcgggggt gggggacctt ccaacaaccc caccatgatg ggagggaggg 5040
agggaaggag gaggaagtat acaaacagaa tcatggggac tttccccaaa caagcagtcc 5100
tctgggcgag gcagcagagg gccttaggtc aggggaaatg gtggggattg ccattcaagt 5160
ttacggggaa gggcgtgtag agggtcctct tctcatcact gactagactc ctgggccccc 5220
agatctgatc accttcacag aaggaagtgg acgctcacca cgctatgccc tctggttctg 5280
tgtgggggaa tcatggcccc aggaccagcc atggaccaag aggctcgtga tggtcaaggt 5340
gcctgcagac ctgagtccct ggggctgaga ggggtggcct tacagaggga agaggttgct 5400
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ataaccagtt tttcatcccc gggagctcct tcccacggcc tcacctgcag aacctgcttt 5520
gaactctcta aaccagtggt ccccaagctg ttcggcacca gggaccagtc tcacgaaaga 5580
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tcaggcatta gattctccta aggagcagcc tagatccctc gcgtgtgcag ttcacgatga 5700
gttcgtgctc ctctgagaat ctaatgttgc cgctgatctg acagcaggca gagctcaggc 5760
agtaatattc cctcacccgc tgctcacatc ctgctgggca acctgattcc taacaggccg 5820
tggggggttg gggacccctg ctctaaacca tgtcgaagct ggtggacttc aagttttagc 5880
tgccattgtg aggccatggc tgtggctccc acgagttgag atcacagact gctcagccct 5940
gacatctggg aatactctag cctcatatga gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 6000
gtgtagaggg aaatctacaa ctcccagcag ccctgggcct atggttcatc ctgggttata 6060
gcagaggctg caggaagttg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 6120
tttcatcctg ggttacagca gaggctgcag gaagttgtag agtgtgtgtg tgtgtgtgtg 6180
tgtgtgtgtg tgtttcatcc tgggttacag cgggggctgc agggagttgt agttctccca 6240
gccctgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tttcatcctg 6300
ggttacagcg ggggctgcag ggagttgtag ttctcccagc cctgtgtgtg tgtgtgtgtg 6360
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt tcatcctggg ttacagcggg ggctgcaggg 6420
agttgtagtt ctcccagccc tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tttcatcctg ggttacagcg 6480
ggggctgcag ggacttgtag ttctcccagc cctgtgtgtg tgtgtgtgtt tcatcctggg 6540
ttacagcggg ggctgcaggg acttgtagtt ctcccagccc tgactcctac cttggtggac 6600
actggccggg tgttttccct gactcctgtc ccaggaaggg ggtgggtggg tgggtgggtg 6660
ggtgggtggg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtttc atcctgggtt acagcggggg 6720
ctgcagggac ttgtagttct cccagccctg actcctacct tggtggacac tggccgggtg 6780
ttttccctga ctcctgtccc cacttccccc gcaggttgtg cccacgtgcc tcagggcctt 6840
ggtagaaatc gcccgggtag ggggtgcctc ctccctggag aacactgtgg acctgcacat 6900
ttccaacagc cacccactgt ccctcacctc tgaccagtac aaggcctacc tgcaggacct 6960
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ggcctctaac ctccccaccc cccaccacct caaccaataa actggttcct gctatgatca 7080
7080
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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acacagcgag actccgtctc 20
Claims (9)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 irf3 유전자의 교정용 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA).
- 제1항에 있어서,
상기 irf3 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것인, sgRNA.
- 제1항에 있어서,
상기 sgRNA는 irf3 유전자 염기 서열의 적어도 일부에 상보적인 것인, sgRNA.
- 제1항의 sgRNA를 포함하는, irf3 유전자 교정용 재조합 벡터.
- 제1항의 sgRNA 또는 제4항의 재조합 벡터를 포함하는 irf3 유전자 교정용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 조성물은 Cas9 단백질을 더 포함하는 것인 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 조성물.
- 제1항의 sgRNA 또는 제4항의 재조합 벡터를 포함하는 irf3 유전자 교정용 조성물을 세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 유전자 교정 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 세포는 FRhK-4 세포, HepG2 세포 또는 Huh7 세포인, 유전자 교정 방법.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|---|
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-
2022
- 2022-05-02 KR KR1020220054127A patent/KR20230103866A/ko unknown
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20190093171A (ko) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | 서울대학교산학협력단 | CRISPR/Cas9 시스템을 통한 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류의 제조방법 |
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