KR20230103481A

KR20230103481A - 복령 추출물 및 정제 뱀독을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20230103481A
Application number: KR1020210194394A
Authority: KR
Inventors: 양정규; 김진현; 강래윤; 이정환
Original assignee: 주식회사 제이앤바이오
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-07-07

Abstract

본 발명은 복령 추출물 및 정제 뱀독을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 복령 열수 추출물, 복령 에탄올 추출물 및 정제 뱀독을 포함하는 천연 성분만으로 이루어진 화장료 조성물로써 항산화, 피부 보습, 주름 개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

복령 추출물 및 정제 뱀독을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing extracts from Poria Cocos and purified snake venom}

복령(Poria cocos Wolf)은 소나무에 자생하는 대표적인 버섯으로, 죽은 소나무 뿌리에 기생하는 것으로 알려져 있으며, 일반적으로 소나무를 벌채한 뒤 3~10년이 지난 후 뿌리에서 기생하여 성장하며 그 형체가 일정하지 않다. 표면은 암갈색이고, 내부는 회백색의 육질과립상으로 신선한 냄새를 가진다. 종래부터 한약재로 빈번하게 쓰여왔으며, 과거 동의보감의 기록에 따르면 한약재 중 감초 다음으로 흔하게 쓰이는 약재였으며, 오장(위, 심장, 폐, 비장, 신장)의 치료, 이뇨, 위장병, 결핵, 당뇨 등 다양한 용도로 활용되어 왔다.

피부 기능성과 관련한 복령의 주요 약리성분으로는 β-glucan, triterpene, pachymaran 등이 보고되어 있다. 상기 약리 성분들은 생체조직 재생, 치유, 항산화, 항균, 항염증, 항바이러스, 항암 효과 등의 효능이 보고되어 있다. pachymaran은 pachyman의 β-1,3-glucan에서 β-1,6분지를 가지지 않은 복령 다당이다.

한편, 독(venom)은 현재 다양한 분야에서 기능성 원료로 활용되고 있다. Clostridium botulinum에서 추출한 생물학적 독성 단백질인 Botulinum Toxin(상표명 Botox^®)이 위의 대표적인 예시에 해당할 것이다. 독은 그 특성상 용도를 한정하고 그 투여량을 세밀하게 조절하거나 혹은 그 독성을 불활성화시킬 수 있는 수단을 병행하면, 여러 이로운 용도로의 활용이 가능하다. 따라서 현재 벌의 독(봉독), 거미의 독, 전갈의 독, 열대산 개구리의 독, 뱀독 등을 각종 기능성 원료로 활용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

뱀의 독(이하 본 명세서 전체에 걸쳐 '뱀독'으로 칭한다)은 생명체에 심각한 손상을 야기할 수 있으나 현재 그 약리학적 작용에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 대표적으로 1963년 Reid 등의 연구 결과 말레이시아산 홍구살모사의 독에서 추출한 항응혈물질인 Anti-thrombin을 협심증 또는 뇌혈관질환의 예방 및 치료용 성분으로 활용되고 있으며, 현재는 피부 주름 개선, 리프팅용 기능성 성분으로의 활용에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 뱀독은 연한 담황색 또는 무취의 투명한 액체로 종류에 따라 성분 및 함량이 매우 다양하며, 3~39%가 고형질이고, 그 중 46~91%가 단백질 성분인 것으로 알려져 있다. 뱀독은 효소군과 비효소군으로 구성되어 있고, 작용기전에 따라 혈액성 독소(Hematoxin), 세포성 독소(Cytolysin), 신경성 독소(Neurotoxin)으로 분류할 수 있으며, 이외에도 핵산분해효소, Hyaluronidase, 확산 효소 등으로 구성되어 있다. 뱀독은 성분에 포함된 여러 종류의 proteinase, phospholipase A2(PLA2) 등의 작용으로 출혈, 용혈, 괴사, 신경 손상 등의 작용을 한다. 이 중 phospholipase A2는 분자량 14~16kDa의 myotoxin으로 muscle necrosis 및 용혈에 중요한 작용을 한다. 따라서 위의 독성 작용을 중화시킬 수 있으면서 동시에 뱀독의 기능성을 극대화할 수 있는 방법이 절실한 실정이다.

현재 뱀독을 활용한 기능성 화장료에 관한 제품 시판 또는 연구는 주로 아래 특허문헌과 같이 Waglerin-1로부터 유래하여 인공적으로 제조된 뱀독-유사 펩타이드를 대상으로 행해지고 있으며, 천연 뱀독을 활용하는 경우는 미진한 상황이다.

(특허문헌) 등록특허공보 제10-1508614호(2015. 03. 30. 등록)"스파이더 실크 단백질, 거머리 추출물, 봉독 추출물 및 뱀독 유사 펩타이드 복합물로 제조된 포이즌 컴플렉스를 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물"

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,

본 발명은 복령과 뱀독을 포함하는 천연 성분으로만 이루어지며, 뱀독의 독성만을 불활성화시키면서도 동시에 탁월한 항산화, 피부 보습, 주름 개선 효능을 가지는 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명은 복령에 함유된 각종 기능성 성분의 추출 수율을 극대화할 수 있는 방법 및 이를 활용한 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

한편, 본 발명에 있어 명시되지 않은 또 다른 목적들은 하기의 과제 해결 수단, 발명의 효과 및 상세한 설명으로부터 용이하게 추론 가능한 범위 내에서 추가적으로 고려될 것이다.

본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위해서 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해서 구현된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 복령 열수 추출물, 복령 에탄올 추출물 및 정제 뱀독을 유효성분으로 함유하는, 주름 개선, 피부 보습 및 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 복령 열수 추출물은, 복령을 진공 상태 하 50 내지 70℃ 범위의 온도를 갖는 열수에서 추출한 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 복령 에탄올 추출물은, 상기 복령 열수 추출물을 제조하고 잔류하는 복령을 70% 에탄올에서 추출한 복령 에탄올 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 뱀독은, 칠점사(Agkistrodon saxatilis)의 독인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 상기 정제 뱀독 100 중량부에 대하여 상기 복령 열수 추출물 150 내지 250 중량부, 상기 복령 에탄올 추출물 50 내지 150 중량부로 이루어진 혼합물인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 개시한 과제의 해결 수단을 채용함으로써 하기와 같은 효과를 가진다.

본 발명은 복령과 뱀독을 포함하는 천연 성분으로만 이루어지며, 뱀독의 독성만을 불활성화시키면서도 동시에 탁월한 항산화, 피부 보습, 주름 개선 효능을 가지는 화장료 조성물을 제공하도록 하는 효과가 있다.

본 발명은 복령에 함유된 각종 기능성 성분의 추출 수율을 극대화할 수 있는 방법을 사용함으로써 보다 경제적이고 효능이 개선된 화장료 조성물을 제공하도록 하는 효과가 있다.

한편, 본 발명에 있어 명시적으로 언급되지 않은 효과들이라도 하기의 상세한 설명 등 명세서 전체의 기재에 있어 합리적으로 추론 가능한 범위 내에서 도출 가능한 효과라면 본 명세서에 기재된 것으로 취급할 수 있음은 물론이다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 화장료 조성물의 DPPH 소거능을 도시하는 그래프
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 화장료 조성물의 ABTS 소거능을 도시하는 그래프
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 조성물의 총 폴리페놀계 함량 측정 결과(흡광도 측정 결과)를 도시하는 그래프
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 조성물의 총 플라보노이드계 함량 측정 결과(흡광도 측정 결과)를 도시하는 그래프
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 화장료 조성물의 콜라겐 생성능을 도시하는 그래프
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 화장료 조성물의 cell viability를 도시하는 그래프
도 7은 양성대조군의 cell viability를 도시하는 그래프

이하에서는 본 발명에 따른 복령 추출물 및 정제 뱀독을 함유하는 화장료 조성물의 바람직한 실시예들을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 하기에서 본 발명을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하도록 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 복령 추출물 및 정제 뱀독을 함유하는 기능성 화장료 조성물은 복령 열수 추출물, 복령 에탄올 추출물 및 정제 뱀독을 유효성분으로 함유하며, 주름 개선, 피부 보습 및 항산화 효과를 제공한다.

상기 복령(Poria cocos Wolf)은 소나무에 자생하는 대표적인 버섯으로, 죽은 소나무 뿌리에 기생하는 것으로 알려져 있으며, 일반적으로 소나무를 벌채한 뒤 3~10년이 지난 후 뿌리에서 기생하여 성장하며 그 형체가 일정하지 않다. 표면은 암갈색이고, 내부는 회백색의 육질과립상으로 신선한 냄새를 가진다. 종래부터 한약재로 빈번하게 쓰여왔으며, 과거 동의보감의 기록에 따르면 한약재 중 감초 다음으로 흔하게 쓰이는 약재였으며, 오장(위, 심장, 폐, 비장, 신장)의 치료, 이뇨, 위장병, 결핵, 당뇨 등 다양한 용도로 활용되어 왔다.

상기 복령 열수 추출물은 복령을 고온의 물로 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 이를 위하여, 상기 복령 열수 추출물은 복령에 대한 관능평가를 실시하여 선별하는 입고단계;, 상기 입고단계에서 선별된 복령의 불가식부위 및 이물질을 제거하고, 자연건조시키는 정선및자연건조단계;, 상기 정선및자연건조단계를 거친 복령을 깨끗이 세척하는 세척단계;, 상기 세척단계에서 세척한 복령을 파쇄하여 복령 파쇄물을 형성하는 파쇄단계;, 상기 파쇄물을 열풍에서 건조시켜 복령 건조물을 형성하는 열풍건조단계;, 상기 건조물을 열수로 추출하여 1차추출물을 형성하는 열수추출단계;, 상기 1차추출물을 여과 및 농축하여 열수 농축물을 형성하는 여과농축단계; 및 상기 농축물을 동결 건조하여 복령 열수 추출물을 형성하는 동결건조단계;를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다.

상기 입고단계는 복령에 대한 관능평가를 실시하여 선별하는 단계를 의미하며, 이때 원료로 들어온 복령을 기준과 규격에 따라 관능평가를 실시하고, 관능평가를 거친 복령 중 10개월 이상의 재배 기간을 증명할 수 있는 원료 확인서를 수령한 제품에 한하여 입고하도록 한다.

상기 정선및자연건조단계는 상기 입고단계에서 선별된 복령의 모든 불가식부위를 제거하고, 전수검사를 실시하여 잔존하는 이물질을 제거한 뒤, 불가식부위와 이물질이 모두 제거된 복령을 서늘하고 습기가 없는 곳에서 하룻밤에 걸쳐 자연 건조시키는 단계를 의미한다.

상기 세척단계는 상기 정선및자연건조단계를 거친 복령을 깨끗이 세척하는 단계를 의미하며, 이는 복령피에 묻은 이물질을 제거하고 미생물을 허용 가능한 수준까지 제어하기 위하여 흐르는 물에서 깨끗이 세척하는 것을 의미하고, 만일 상기 세척으로도 이물질 제거가 어려운 경우 복령의 균핵 덩어리만 남기고 나머지 부위(복령 피 등)는 모두 제거할 수 있다.

상기 파쇄단계는 상기 세척단계에서 세척한 복령을 파쇄하여 복령 파쇄물을 형성하는 단계를 의미하며, 이 때 복령피는 분말 형태로 파쇄하고, 복령의 균핵 덩어리는 얇은 절편을 형성하도록 파쇄한다.

상기 열풍건조단계는 상기 파쇄물을 열풍에서 건조시켜 복령 건조물을 형성하는 단계를 의미하며, 바람직하게는 상기 파쇄물을 열풍 건조기에서 40℃~60℃의 온도에서 18시간~30시간 동안 건조시킬 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 파쇄물을 열풍 건조기에서 50℃의 온도에서 24시간 동안 건조시킬 수 있으며, 상기 열풍 건조기는 열풍을 이용하여 대상물의 건조를 수행할 수 있는 수단이면 공지된 어떠한 수단에 해당하던지 특별히 제한되지 않는다.

이때, 상기 입고단계 내지 열풍건조단계를 모두 포함하는 단계를 전처리단계로 정의할 수 있다.

상기 열수추출단계는 상기 건조물을 열수로 추출하여 1차추출물을 형성하는 단계를 의미한다. 이때 상기 추출은, 상기 건조물을 진공 조건 하에서 50℃~70℃ 온도의 물로 추출하는 방법을 이용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 건조물을 진공 조건 하에서 60℃ 온도의 물로 추출하는 방법을 이용할 수 있다. 이러한 추출 방법은 진공냉각열수추출법으로 정의내릴 수 있으며, 이는 진공 조건에 가까워질수록 물의 끓는점이 낮아지는 현상을 이용한 것으로써, 종래의 90℃~100℃의 고온 열수로 복령의 추출을 수행하는 고온열수추출법에 비해 상기 진공냉각열수추출법은 약 60℃ 가량의 온도에서도 추출 수행이 가능하여, 고온에 의해 파괴되기 쉬운 복령에 함유된 각종 성분들의 파괴를 초래하지 않고, 더불어 추출 효율을 높일 수 있다.

보다 상세하게 상기 진공냉각열수추출법을 이용한 추출 과정을 설명하면, 추출기 내 잔존 공기를 모두 제거하여 진공 조건을 부여한 뒤, 이러한 진공 조건을 유지하면서 추출기에 상기 건조물 1 중량부에 대하여 20 중량부의 물을 투입하여 10시간~14시간, 바람직하게는 12시간 동안 추출을 진행하면 최종적으로 추출물을 얻게되며 이를 1차추출물로 정의한다. 이때 상기 물은 60℃의 온도를 유지하는 것이 바람직하다.

상기 여과농축단계는 상기 1차추출물을 필터에서 여과한 뒤 회전증발농축기를 이용하여 농축함으로써 농축물을 형성하는 단계를 의미한다.

상기 동결건조단계는 상기 농축물을 동결건조기를 사용하여 동결 건조함으로써 최종적으로 분말 형태의 복령 열수 추출물을 형성하는 단계를 의미하며, 상기 동결 건조 방법은 공지된 방법에 해당하면 어떠한 방법에 해당하던지 특별히 제한되지 않는다.

상기 복령 에탄올 추출물은 복령을 에탄올(Ethanol)로 추출하여 수득한 추출물을 의미하며, 바람직하게는 70% 에탄올을 이용하여 추출한 추출물을 의미할 수 있다.

상기 복령 에탄올 추출물은 상기 전처리단계를 모두 거친 복령을 에탄올로 추출한 추출물을 의미할 수도 있고, 상기 복령 열수 추출물의 추출물을 제조하고 잔류하는 복령 잔류물을 에탄올로 추출한 추출물을 의미할 수도 있으나, 본 발명에 따른 복령 에탄올 추출물은 바람직하게는 상기 복령 잔류물을 에탄올로 추출한 추출물을 의미한다.

이를 위하여, 상기 복령 에탄올 추출물은 상기 복령 잔류물을 에탄올로 추출하여 2차추출물을 형성하는 에탄올추출단계;, 상기 2차추출물을 여과 및 농축하여 에탄올 2차농축물을 형성하는 2차여과농축단계; 및 상기 2차농축물을 동결 건조하여 복령 에탄올 추출물을 형성하는 2차동결건조단계;를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다.

상기 에탄올추출단계는 상기 복령 잔류물을 에탄올로 추출하여 2차추출물을 형성하는 단계를 의미하며, 이때 상기 추출은 상온에서 상기 복령 잔류물 1 중량부에 대하여 10 중량부의 70% 에탄올을 투입하여 3시간~7시간, 바람직하게는 5시간 동안 추출을 진행하는 것을 의미하는 것이 바람직하며, 이로써 얻은 추출물을 2차추출물로 정의한다.

한편 상기 2차여과농축단계 및 2차동결건조단계의 세부적인 과정은 앞서 설명한 복령 열수 추출물의 제조 방법에서와 동일하므로 이하에서는 생략하도록 하며, 최종적으로 분말 형태의 복령 에탄올 추출물을 형성하게 된다.

상기 뱀독은 뱀독의 정제물을 의미하며, 상기 뱀독은 칠점사(Agkistrodon saxatilis, 까치살무사, 칠점살무사, 칠보사 등으로도 불리움)의 독을 의미하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 화장료 조성물은 상기 정제 뱀독 100 중량부에 대하여 상기 복령 열수 추출물 150 내지 250 중량부, 상기 복령 에탄올 추출물 50 내지 150 중량부로 이루어진 혼합물인 것을 특징으로 한다. 상기 수치범위로 상기 복령 열수 추출물, 상기 복령 에탄올 추출물 및 상기 정제 뱀독을 혼합함으로써, 복령 추출물에 의하여 뱀독의 독성이 불활성화되면서도, 상기 복령 추출물이 가지는 피부 보습 및 항산화 효과와, 상기 정제 뱀독이 가지는 주름 개선 효과가 극대화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물로 원활히 활용하기 위하여 상기 화장료 조성물 외에 공지된 보조제를 더 첨가할 수도 있으며, 이러한 방법으로 제조되는 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 이는 예컨대 유액, 크림, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 핸드크림, 모이스처크림, 에센스, 팩, 비누, 화장수, 밀크로션, 젤, 연고, 패취, 클렌징폼, 바디클린저, 아스트린젠트, 분무제의 제형을 포함한다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 시료의 준비

1. 복령 열수 추출물의 준비

선별하여 깨끗이 세척하고 파쇄한 뒤 잘 건조한 복령을 열수 추출기에 투입한 뒤, 진공 조건을 부여하고 투입한 복령 1 중량부 대비 20 중량부의 물을 투입하여 12시간 동안 추출하였다. 이때 물의 온도는 60℃를 유지하였다. 상기 추출로 수득한 추출물을 필터에 여과하고, 그 여과물을 회전증발농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조하여 최종적으로 분말 형태의 복령 열수 추출물을 얻었다.

2. 복령 에탄올 추출물의 준비

상기 <실시예 1>의 1에서 수득한 복령 열수 추출물의 잔류물을 모아 주정 추출기에 투입한 뒤, 투입한 잔류물 1 중량부 대비 10 중량부의 70% 에탄올을 투입하여 상온에서 5시간 동안 추출하였다. 상기 추출로 수득한 추출물을 필터에 여과하고, 그 여과물을 회전증발농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조하여 최종적으로 분말 형태의 복령 에탄올 추출물을 얻었다.

3. 조정제 뱀독의 준비

제주산 칠점사들로부터 독을 추출한 후, 추출한 독의 1 중량부 대비 100 중량부의 알칼리 용액을 투입하고 4주 간 방치한 뒤 100℃의 온도로 가열하여 최종적으로 조정제 뱀독을 얻었다.

4. 시료의 준비

(1) 시료 1

상기 <실시예 1>의 1, 2 및 3에서 각각 얻은 상기 복령 열수 추출물, 복령 에탄올 추출물 및 조정제 뱀독을 2:1:1의 중량비로 혼합하여 최종적으로 시료 1을 형성하였다.

(2) 시료 2

상기 <실시예 1>의 1에서 얻은 상기 복령 열수 추출물만으로 구성된 시료 2를 형성하였다.

(3) 시료 3

선별하여 깨끗이 세척하고 파쇄한 뒤 잘 건조한 복령을 열수 추출기에 투입한 뒤, 대기압 중에서 투입한 복령 1 중량부 대비 20 중량부의 물을 투입하여 12시간 동안 추출하였다. 이때 물의 온도는 95~100℃를 유지하였다. 상기 추출로 수득한 추출물을 필터에 여과하고, 그 여과물을 회전증발농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조하여 최종적으로 분말 형태의 복령 열수 추출물을 얻었으며, 이로써 시료 3을 형성하였다.

(4) 시료 4

상기 <실시예 1>의 2에서 얻은 상기 복령 에탄올 추출물만으로 구성된 시료 4를 형성하였다.

(5) 시료 5

선별하여 깨끗이 세척하고 파쇄한 뒤 잘 건조한 복령을 주정 추출기에 투입한 뒤, 투입한 복령 1 중량부 대비 10 중량부의 70% 에탄올을 투입하여 상온에서 5시간 동안 추출하였다. 상기 추출로 수득한 추출물을 필터에 여과하고, 그 여과물을 회전증발농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조하여 최종적으로 분말 형태의 복령 에탄올 추출물을 얻었으며, 이로써 시료 5를 형성하였다.

(6) 시료 6

상기 <실시예 1>의 1, 2 및 3에서 각각 얻은 상기 복령 열수 추출물, 복령 에탄올 추출물 및 조정제 뱀독을 1:1:1의 중량비로 혼합하여 최종적으로 시료 6을 형성하였다.

(7) 시료 7

상기 <실시예 1>의 1 및 3에서 각각 얻은 상기 복령 열수 추출물 및 조정제 뱀독을 1:1의 중량비로 혼합하여 최종적으로 시료 7을 형성하였다.

<실시예 2> DPPH radical 소거능 확인

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) assay는 항산화 활성 측정법을 의미하며 DPPH 그 자체로써 매우 안정한 radical이다. 517nm에서 특징적인 광 흡수를 나타내는 자색의 혼합물이며, 항산화 물질에 의해 환원되면 본래의 색을 잃게된다. Free radical인 DPPH 용액이 항산화 활성을 가진 물질과 반응하여 radical이 소거되는 정도를 분광강도계를 이용하여 항산화 효과를 측정할 수 있다.

이를 토대로, DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)(Sigma, USA)를 이용하여 기준시료의 radical 소거능을 측정하였다(Nara et al., 2006). 상기 실시예 1에서 준비한 시료 1을 농도별로 용해시킨 시료액에 0.2mM DPPH를 혼합하여 15분 가량 암실에서 반응시킨 후, 517nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 소거능은 시료 첨가군과 비첨가군을 비교하여 백분율로 나타내어 측정하였으며(DPPH(%)=100-((b-b')/(a-a'))*100, a: 시료비첨가군의 반응 후 흡광도, b: 시료액의 반응후 흡광도, a', b': 각각에서 DPPH 대신 완충액을 넣은 경우의 흡광도), 양성대조군으로는 ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였다. 그 결과를 도 1과 하기 표 1에 나타내었으며, 양성대조군의 IC₅₀(흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도)값은 20.8μg/mL이었다.

농도(μg/mL)	31.25	62.5	125	250	500	1000	IC50(μg/mL)
DPPH radical 소거능(%)	13.8	23.0	37.3	54.3	73.6	82.5	437.4

도 1 및 상기 표 1을 보면, 시료 1을 투입할 경우 농도 의존적으로 활성이 증가함을 확인할 수 있으며, 437.4μg/mL의 IC₅₀ 값을 가져 항산화 활성이 우수함을 확인할 수 있다.

<실시예 3> ABTS radical 소거능 확인

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical 소거능 확인법은 시료 중에 항산화 활성을 갖는 물질이 존재하면 청록색의 ABTS cation radical(ABTS·+)이 소거되면서 탈색되는 원리를 이용하여 측정하는 방법이다.

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(Sigma, USA) radical 소거능 확인 방법은 Re 등의 방법을 사용하였다(Re et al., 2006). ABTS 용액은 7.0mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(Sigma, USA)과 2.45mM potassium persulfate(Sigma, USA)를 혼합하여 24시간 동안 ABTS radical을 형성시킨 후 증류수로 희석하여 흡광도 값이 0.70이 되도록 희석하였다. 상기 시료 1을 농도별로 용해시킨 시료액을 위에서 제조한 ABTS 용액과 혼합하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 700nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거능은 시료 첨가군과 비첨가군을 비교하여 백분율로 나타내어 측정하였으며(ABTS(%)=100-((b-b')/(a-a'))*100, a: 시료비첨가군의 반응 후 흡광도, b: 시료액의 반응후 흡광도, a', b': 각각에서 ABTS 대신 완충액을 넣은 경우의 흡광도), 양성대조군으로는 ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였다. 그 결과를 도 2와 하기 표 2에 나타내었으며, 양성대조군의 IC₅₀(흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도)값은 11.4μg/mL이었다.

농도(μg/mL)	31.25	62.5	125	250	500	1000	IC50(μg/mL)
DPPH radical 소거능(%)	12.2	22.2	41.8	71.6	92.6	99.0	164.3

도 2 및 상기 표 2를 보면, 시료 1을 투입할 경우 농도 의존적으로 활성이 증가함을 확인할 수 있으며, 164.3μg/mL의 IC₅₀ 값을 가져 항산화 활성이 우수함을 확인할 수 있다.

<실시예 4> 총 폴리페놀계 함량 측정

총 폴리페놀계 함량은 Folin-Denis 방법에 따라 Gallic acid(Sigma, USA)를 표준물질로 사용하여 측정하였다(Gutfinger, 1981). 농도를 동일하게 설정한 상기 시료 4 및 시료 5에 증류수와 1N Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma, USA)를 첨가하여 실온에서 3분간 반응시키고, 이에 10% Na₂CO₃ 용액과 증류수를 가하여 1시간 동안 반응시킨 후 700nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 이용하여 표준검정곡선을 작성한 후 총 폴리페놀계 함량을 구하였으며, 그 결과를 도 3 및 하기 표 3에 나타내었다. 도 3의 그래프는 시료 4에 대한 폴리페놀계 함량 분석(흡광도 측정 결과)을 나타낸 그래프이다.

	Polyphenol(mg GAE/g)
시료 4	24.3 ±0.49
시료 5	19.4 ±0.37

도 3 및 상기 표 3을 보면, 복령의 열수 추출 잔류물을 70% 에탄올로 추출한 추출물인 시료 4에 함유된 폴리페놀계의 함량이 일반적인 복령의 에탄올 추출물인 시료 5에 함유된 폴리페놀계의 함량보다 높은 것을 확인할 수 있어, 단위 당 항산화 활성 물질의 수율이 보다 높은 것을 확인할 수 있다.

<실시예 5> 총 플라보노이드계 함량 측정

총 플라보노이드계 함량은 Davis 등의 방법을 응용하여 측정하였다(Davis et al. 1983). 시료 4 및 시료 5를 농도별로 용해시킨 시료액에 1M Al(NO₃)₃와 CH₃O₂K를 첨가한 후 30분 동안 암반응 시킨 후, 415nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 Quercetin을 이용하여, 농도에 따른 표준검정곡선을 작성한 후 총 플라보노이드계 함량을 구하였으며, 그 결과를 도 4 및 하기 표 4에 나타내었다. 도 4의 그래프는 시료 4에 대한 플라보노이드계 함량 분석(흡광도 측정 결과)을 나타낸 그래프이다.

	Flavonoid(mg QE/g)
시료 4	10.2 ±0.41
시료 5	8.6 ±0.35

도 4 및 상기 표 4를 보면, 복령의 열수 추출 잔류물을 70% 에탄올로 추출한 추출물인 시료 4에 함유된 플라보노이드계의 함량이 일반적인 복령의 에탄올 추출물인 시료 5에 함유된 플라보노이드계의 함량보다 높은 것을 확인할 수 있어, 단위 당 항산화 활성 물질의 수율이 보다 높은 것을 확인할 수 있다.

<실시예 6> 베타글루칸(β-glucan) 함량 측정

베타글루칸(β-glucan)은 버섯, 효모 등의 세포벽에서 관찰되는 다당류로, 각종 피부 기능성이 알려져 있고 천연 화장료로 사용될 경우의 강력한 보습효과 및 기타 항염작용 등이 보고되어 있다. 따라서 시료에 포함되어 있는 베타글루칸의 함량 분석을 통해 해당 시료가 가지는 보습 효과를 평가할 수 있다.

베타글루칸의 함량을 측정하고 이를 비교하기 위하여, 상기 시료 2 및 시료 3 각 100mg에 다음과 같은 실험을 각기 수행하였다. 이는 Megazyme kit(mushroom and yeast β-glucan assay procedure kit)를 이용하여 수행하였다. 시료 100mg에 37% HCl 1.5mL를 넣고 30℃로 물중탕하여 45분간 교반한 후, 3차 증류수 10mL를 가하고 100℃로 물중탕하여 다시 2시간동안 교반하였다. 상온에서 위 반응액에 2N KOH 10mL를 가하여 혼합한 후 0.2M 아세트산소듐 완충용액(sodium acetate buffer, pH 5.0)을 가하여 100mL로 정용해주었다. 정용한 시료는 원심분리(2,000g, 5분)해주어 상층액을 얻고, 얻은 상층액 0.1mL에 exo-1,3-β-glucanase 20 U/mL와 β-glucosidase 4 U/mL의 혼합용액 0.1mL를 첨가한 후 40℃로 물중탕하여 1시간 동안 반응시켰다. 위 반응액에 포도당 산화효소/과산화효소(glucose oxidase/peroxidase, GOPOD) 시약 3mL를 넣고 20분간 반응시킨 후 510nm 파장에서 흡광도를 측정하여 총 글루칸 함량을 구하였다. 상기 총 글루칸 함량으로부터 알파글루칸(α-glucan) 함량을 제외한 값으로 베타글루칸의 함량을 계산하였으며, 총 글루칸과 알파글루칸의 흡광도는 표준물질인 포도당(glucose) 용액을 GOPOD 시약과 반응시킨 반응액의 흡광도를 이용하여 mg/100g으로 계산하였고, 이 계산 과정은 식품의약품안전처 고시 표준 계산식에 의거하여 계산하였다. 이를 통해 측정된 베타글루칸의 함량을 하기 표 5에 도시하였다.

	β-glucan(mg/g)
시료 2	3.9 ±0.57
시료 3	2.6 ±0.44

상기 표 5를 보면, 상기 진공냉각열수추출법으로 추출한 추출물인 시료 2에 함유된 베타글루칸의 함량이 일반적인 고온열수추출법으로 추출한 추출물인 시료 3에 함유된 베타글루칸의 함량보다 높은 것을 확인할 수 있어, 단위그램 당 천연보습 물질의 수율이 증대되는 것을 확인할 수 있으며, 단위그램 당 천연보습 물질의 함량이 높은 것을 확인할 수 있다.

<실시예 7> 세포 내 콜라겐 합성(Collagen contents) 측정

피부 주름의 발생 원인으로 피부교원질(콜라겐, collagen)의 결핍과 엘라스틴(elastin)의 구조 변형이 제시되고 있다. 콜라겐과 엘라스틴을 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조와 탄력을 유지하는 역할을 한다. 콜라겐은 나이가 들어 갈수록 생성이 감소하나 분해속도가 증가하게 된다. 한편, 엘라스틴은 자외선이 조사되면 활성이 증가된 분해효소 엘라스타제(elastase)에 의해 3차원 구조가 뒤틀려지는 것이 알려져 있다. 이러한 현상은 피부 진피층 함몰로 이어져 피부 주름이 생성되는 것으로 알려져 있다. 따라서 콜라겐의 생성, 분해정도와 엘라스타제의 억제정도를 실험하여 피부 주름개선 물질의 효력을 뒷받침할 수 있다.

Procollagen type Ⅰ C-Peptide Elisa Kit를 이용하여 이에 관한 실험을 수행하였다. 콜라겐 표준품에 물을 넣어 녹여 각각 0, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640ng/mL가 되도록 희석하였다. CCD-986sk Cell을 배양접시의 바닥에 접종한 후 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL), 10% FBS를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하여 보관하였다. CCD-986sk Cell을 48-well plate에 well 당 5×10⁴개로 분주한 다음 24시간 배양하였다. 배지를 버리고 10% PBS로 세척한 다음 각 농도별로 희석한 상기 시료 1 및 새로운 배지를 넣고 24시간 동안 배양하였다. Antibody-PoD conjugation solution 100μL를 well에 넣은 다음 1/5로 희석한 배양액 및 표준액 20μL를 넣고 37℃에서 3시간 동안 배양하였고, well에서 배양액을 제거한 다음 인산염완충액(PBS) 400μL로 4회 씻어주었다. 여기에 발색시약 100μL를 넣고 상온에서 15분간 배양하고 1N 황산 100μL를 넣어주었으며, 이를 450nm에서 ELISA reader로 측정하였다. 측정 결과를 도 5 및 도 6에 도시하였다.

상기 도 5를 보면, 시료 1의 경우 0.3μg/mL에서부터 농도의존적으로 콜라겐 생성이 증가되는 것을 알 수 있으며, 최대 143%, 151% 콜라겐 생성을 증가시켰다. 이는 천연물 또는 기존에 알려진 리프팅 성분의 콜라겐 합성능에 비할 수 있을만큼 콜라겐 생성능이 탁월함을 확인할 수 있다. 한편 상기 도 6을 보면, 시료 1의 경우 농도와 무관하게 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 화장료 조성물의 경우 독성이 중화된 뱀독으로도 높은 주름 개선 효능을 보유하고 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 8> 세포 독성 평가

본 발명에 따른 화장료 조성물의 뱀독 불활성화 효능을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 RAW264.7 cell을 2.0×10⁵ cell/well이 되도록 동일하게 분주하고 18시간 동안 전배양한 후, 기존의 배지를 제거하고, 새 배지 및 농도에 따른 시료를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. MTT 시약을 새 배지에 희석하여 호일로 감싸두었다가, well에 있는 배지를 제거한 후, 시료 1, 시료 6, 시료 7 및 양성대조군(GGA)인 코브라독 원액(NNAV), 정제 코브라독(CTX), 까치살무사독 원액(SAL)에 각각 100μL씩 시약을 처리한 후 37℃에서 3~4시간 동안 incubation을 수행하였다. 이후 MTT 시약을 제거한 후 DMSO를 well 당 100μL씩 넣어주고, DMSO에 formazan이 골고루 녹아 보라색으로 발색되면 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 EZ-cytox 키트를 사용하여 WST에 의한 재평가를 진행하였다. 하기 표 6에 시료별 cell viability를 나타내었으며, 도 7은 양성대조군의 cell viability를 도시한 그래프이다. 상기 cell viability는 control의 세포 생존능력을 100%로 보았을 때의 상대값을 나타낸다.

control	cell viability(control 대비 상대값, %)
control	양성대조군 평균	시료 7	시료 6	시료 1
100	67	71	83	99

상기 표 6을 보면, 양성대조군 평균의 경우 강력한 독성을 나타내었는데, 본 발명에 따른 화장료 조성물인 시료 1의 경우 거의 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있다. 이는 복령 추출물과의 혼합, 특히 복령 에탄올 추출물과의 혼합이 뱀독의 독성을 불활성화시킬 수 있음을 나타내는 것이며, 특히 본 발명에 따라 특징적인 배합비를 갖는 화장료 조성물의 경우 특이적으로 독성의 불활성화가 이루어질 수 있음을 확인할 수 있는 것이다.

이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

복령 열수 추출물, 복령 에탄올 추출물 및 정제 뱀독을 유효성분으로 함유하는, 주름 개선, 피부 보습 및 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 복령 열수 추출물은
복령을 진공 상태 하 50 내지 70℃ 범위의 온도를 갖는 물에서 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 복령 에탄올 추출물은
상기 복령 열수 추출물을 제조하고 잔류하는 복령을 70% 에탄올에서 추출한 복령 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 뱀독은
칠점사(Agkistrodon saxatilis)의 독인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은
상기 정제 뱀독 100 중량부에 대하여 상기 복령 열수 추출물 150 내지 250 중량부, 상기 복령 에탄올 추출물 50 내지 150 중량부로 이루어진 혼합물인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.