KR20230101729A - 항암 박테리아 및 자성 나노입자를 포함하는 마이크로 로봇 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암 박테리아 등이 탑재된 다공성 마이크로스피어 및 이의 용도에 관한 것이다.
일 양상에 따른 다공성 마이크로스피어는 박테리아 포자 봉입 효율이 우수하며, 함유된 자성 나노 입자로 인해 외부 자기장 유도 장치를 이용하여 종양 부위로의 표적능을 향상시키고 생체 이미징을 통해 인체 내 움직임을 모니터링 할 수 있다.

Description

항암 박테리아 및 자성 나노입자를 포함하는 마이크로 로봇 및 이의 제조방법{Micro-robot containing anti-cancer bacteria and magnetic nanoparticles, and method for manufacturing the same}

본 발명은 항암 박테리아 등을 탑재할 수 있는 다공성 마이크로스피어, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

암은 2008년에 760만명의 사망(모든 사망의 약 13%)을 차지하는, 전세계 사망의 주요 원인이다. 암은 신체의 특정 부위에 영향을 미칠 수 있는 질병의 거대 그룹에 대한 일반적인 용어이다. 사용된 다른 용어는 악성 종양 및 신생물이다. 암은 비정상적인 세포의 조절되지 않은 성장 및 확산이다. 성장은 흔히 주변 조직을 침해하여 먼 부위로 전이될 수 있다. 전이는 암에 의한 사망의 주요 원인이다. 전세계 암에 의한 사망은 지속적으로 증가되어 2030년에는 1310만명을 사망에 이르게 할 것으로 추정된다.

암 치료는 수술, 방사선치료요법 및/또는 화학치료요법과 같은 하나 이상의 중재의 조심스러운 선택을 필요로 한다. 당해 목표는 환자의 삶의 질을 개선시키는 한편 질병을 치유하거나 수명을 상당히 연장시키는 것이다. X-선, 감마-선, UV-선, 레이저 광, 극초단파, 전자 빔 및 예를 들면, 중성자, 탄소 이온 및 양성자의 입자 빔과 같은 다양한 형태의 방사선을 사용하여 악성 질병을 치료하여 왔다. 이러한 방사선 중 일부는 방사선 감작화제와 함께, 이러한 적용에 사용되어 왔다. 전자기 및 이온화 방사선은 실제로 세포의　DNA　분자를 파괴함으로써 성장 및 분화로부터 상기 세포를 보호할 수 있다. 당해 효과는 규정된 용적내에서 이동하여 당해 용적내로 에너지 침착물을 생성하는 전자 및 유리 라디칼을 방출하는 이온화를 생성할 입자 또는 파동의 작용에 의해 설명될 수 있다.

한편, 나노기술(Nano Technology; NT)은 10억분의 1미터인　나노미터　크기의 물질을 조작하는 기술이다.　원자,　분자　및 초분자 물질을 합성하고, 조립, 제어하며 혹은 그 성질을 측정, 규명하는 기술을 말한다.　나노 기술은 표면 과학(Surface Science), 유기 화학(Organic Chemistry), 분자 생물학(Molecular Biology), 반도체 물리학(Semiconductor Physics), 미세 제조(Microfabrication) 등의 다양한 과학 분야에 포함되어 이용 범위가 매우 넓다.　

이에, 본 발명자들은 항암 박테리아 및 자성 나노입자가 탑재된 다공성 마이크로스피어를 개발하였으며, 상기 마이크로스피어는 효과적인 암 치료를 위해 종양 부위를 표적 및 제어할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 생체적합성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는, 다공성 마이크로스피어를 제공한다.

다른 양상은 1) 생체적합성 고분자 및 기공형성제를 포함하는 제1 용액을 제조하는 단계; 2) 계면활성제를 포함하는 제2 용액 제조하는 단계; 3) 상기 제1 용액 및 제2 용액을 이용하여 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및 4) 상기 제조된 마이크로스피어에서 기공형성제를 제거하는 단계를 포함하는, 다공성 마이크로스피어 제조방법을 제공한다.

또 다른 양상은 상기 다공성 마이크로스피어 및 종양용해(oncolytic) 박테리아 또는 이의 포자를 포함하는, 항암 마이크로스피어를 제공한다.

또 다른 양상은 상기 항암 마이크로스피어를 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 상기 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

일 양상은 생체적합성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는, 다공성 마이크로스피어를 제공하는 것이다.

본 명세서에서의 용어 "마이크로스피어(microspheres)"는 일반적으로 1 내지 1000 ㎛의 직경을 가지는 구의 형태를 이루는 물질을 의미한다. 이때 구는 한 점에서 같은 거리에 있는 모든 점으로 이루어진 입체 모양이라는 수학적 정의의 구뿐 아니라, 외견상 둥글게 생긴 형상의 것을 모두 포괄하는 의미로 사용될 수 있다. 즉, 측정 내지 제조 과정에서 발생되는 오차 범위를 포함할 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "생체적합성 고분자(biocompatible polymer)"는 생체 내에 투여하였을 때 높은 세포독성 및 염증반응 등을 유발하지 않는 생체 내 안전성이 확보된 고분자를 의미하며, 생분해성 고분자를 의미하는 것일 수 있다.

상기 생체적합성 고분자는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리아미노산, 폴리락타이트, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리오르소에스테르, 폴리히드록시발레이트, 폴리히드록시부티레이트, 히아루론산, 셀룰로오스, 헤파린, 콜라겐, 알지네이트, 황산 콘드로이친, 풀루란 및 키토산 중에서 선택되는 어느 하나; 이들 둘 이상이 블랜딩된 고분자; 및 이들 둘 이상의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 폴리락트산(PLA)을 포함하는 것일 수 있다.

상기 다공성 마이크로스피어는 자성 나노 입자를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "자성 나노입자(hydrophilic amine-coated magnetic nanoparticle)"는 자성을 띄는 나노미터 크기의 구조 또는 물질을 의미한다. 상기 용어 "자성"은 물질이 나타내는 자기적인 성질을 의미한다. 모든 물질은 자기장(magnetic field)과 상호작용하여 인력(attractive force) 또는 척력(repulsive force)이 발생된다. 즉, 물질에 자기장을 가하면 자화(magnetization)되고, 상기 물체가 자화되는 양상에 따라 강자성체, 상자성체, 반자성체, 페리자성체 등으로 구분된다. 상기 용어 "나노입자"는 나노미터(nm)의 크기를 갖는 구조 또는 물질을 의미한다. 나노미터의 크기란 마이크론 미터(10-6) 크기를 1,000 분의 1로 축소한 것으로, 물질의 크기가 나노미터 수준으로 작아지면 다양하고 특이한 물리적, 화학적, 기계적 및 전자적 특성을 나타내게 된다.

상기 자성 나노입자는 철, 코발트, 니켈, 그의 산화물 및 그들의 합금으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 자성 나노입자는 철로 구성된 것으로서, Fe₂O₃, Fe₃O_4, Fe₄O_5, Fe₅O_6, Fe₅O_7, Fe₁₃O_19, 및 Fe₂₅O₃₂　중에서 선택된 산화철 및 CoFe₂O₄, 및 MnFe₂O₄중에서 선택된 페라이트(ferrite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 다공성 마이크로스피어는 양이온성 고분자를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 다공성 마이크로스피어의 표면은 양이온성 고분자로 코팅 또는 개질된 것일 수 있다.

상기 양이온성 고분자(cationic polymer)는 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine, PEI), 폴리아미도아민 (polyamidoamine, PAA), 폴리-L-라이신(PLL), 폴리-D-라이신(PDL), 프로타민(protamine), 폴리[2-(N,N-디메틸아미노)에틸 메타크릴산 에스테르(Poly[2-(N,N-dimethylamino)ethyl methacrylate], (PDMAEMA)), 폴리아미노에스테르(Poly(amino-co-ester, PAE), 키토산(Chitosan), 덱스트란(Dextran), 양이온성 젤라틴(Cationic gelatin), 양이온성 사이클로덱스트린(Cationic cyclodextrin) 및 폴리프로필렌이민(polypropylenimine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 구현예이 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine, PEI)일 수 있다.

상기 마이크로스피어는 다공성 구조를 갖는 다공성 마이크로스피어이다.

상기 다공성 마이크로스피어의 기공의 크기는 1 내지 10 ㎛일 수 있으며, 구체적으로 기공의 크기는 1 내지 10 ㎛, 1 내지 8 ㎛, 1 내지 6 ㎛, 1 내지 5 ㎛, 1 내지 4 ㎛, 1 내지 3 ㎛, 1 내지 2 ㎛, 2 내지 10 ㎛, 2 내지 8 ㎛, 2 내지 6 ㎛, 2 내지 5 ㎛, 2 내지 4 ㎛ 또는 2 내지 3 ㎛일 수 있다.

상기 다공성 마이크로스피어의 면적 100 ㎛² 당 열린 공극(open pore/area)의 수는 0.1 내지 6일 수 있으며, 구체적으로 0.1 내지 6, 0.1 내지 5, 0.1 내지 4, 0.1 내지 3, 0.1 내지 2, 0.1 내지 1, 0.5 내지 6, 0.5 내지 5, 0.5 내지 4, 0.5 내지 3, 0.5 내지 2, 0.5 내지 1, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2 또는 0.5 내지 1일 수 있다.

상기 다공성 마이크로스피어의 입자 크기(직경)는 50 내지 500 ㎛ 일 수 있으며, 구체적으로, 50 내지 500 ㎛, 50 내지 400 ㎛, 50 내지 300 ㎛, 50 내지 250 ㎛, 50 내지 200 ㎛, 100 내지 500 ㎛, 100 내지 400 ㎛, 100 내지 300 ㎛, 100 내지 250 ㎛, 100 내지 200 ㎛, 150 내지 500 ㎛, 150 내지 400 ㎛, 150 내지 300 ㎛, 150 내지 250 ㎛ 또는 150 내지 200 ㎛일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 마이크로스피어의 기공의 크기는 박테리아 또는 박테리아 포자가 봉입되기 충분한 크기일 수 있다.

상기 마이크로스피어는 박테리아, 이의 사균체, 이의 건조물 및/또는 이의 포자를 봉입할 수 있는 것일 수 있으며, 상기 마이크로스피어의 기공에 봉입하는 것일 수 있다.

상기 박테리아는 항암 활성을 갖는 박테리아로서, 구체적으로, 종양 용해성(oncolytic) 박테리아일 수 있다.

상기 종양 용해성 박테리아는 클로스트리듐 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 히스토리시쿠스(Clostridium histolyticus), 클로스트리듐 부티리큠(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 온코리티큠(Clostridium oncolyticum), 클로스트리듐 스포로게네스(Clostridium sporogenes), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi) 및 클로스트리듐 노비-NT(Clostridium novyi-NT)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 클로스트리듐 노비-NT(Clostridium novyi-NT)일 수 있다.

상기 마이크로스피어는 자석 등의 외부 자기장에 의해 입자의 움직임 및/또는 위치가 제어되는 것일 수 있다. 또한, 상기 마이크로스피어는 자기공명영상(MRI)을 통해 식별이 가능하여 위치를 파악할 수 있으며, 구체적으로 생체 내에서의 식별 및/또는 위치 파악이 가능한 것일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 마이크로스피어는 자성 나노입자를 포함하고 있으므로, 외부 자기장에 의해 입자의 움직임이 제어될 수 있을 뿐만 아니라, 자기공명영상(MRI)를 통해 생체 내 위치의 파악이 가능하다는 장점이 있다.

상기 다공성 마이크로스피어는 분산액에 포함된 형태로 제공되는 것일 수 있으며, 상기 분산액은 마이크로스피어가 적절히 분산된 상태를 유지할 수 있는 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 분산액은 carboxymethyl cellulose (CMC) 및 알지네이트(alginate, Alg) 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 분산액의 농도는 3 wt% 이하일 수 있으며, 구체적으로 0.1 내지 3 wt%, 0.1 내지 2.5 wt%, 0.1 내지 2 wt%, 0.5 내지 3 wt%, 0.5 내지 2.5 wt%, 0.5 내지 2 wt%, 1 내지 3 wt%, 1 내지 2.5 wt% 또는 1 내지 2 wt%일 수 있다.

상기의 다공성 마이크로스피어는 하기에 기술된 방법으로 제조되는 것일 수 있다.

다른 양상은 1) 생체적합성 고분자 및 기공형성제를 포함하는 제1 용액을 제조하는 단계; 2) 계면활성제를 포함하는 제2 용액 제조하는 단계; 3) 상기 제1 용액 및 제2 용액을 이용하여 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및4) 상기 제조된 마이크로스피어에서 기공형성제를 제거하는 단계를 포함하는, 다공성 마이크로스피어 제조방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.

상기 방법에 있어서, 상기 1) 단계는 생체적합성 고분자 및 기공형성제를 유기 용매와 혼합하거나 및/또는 용해시켜 유상(제1 용액)을 제조하는 단계일 수 있다.

상기 유기 용매는 생체적합성 고분자 및 기공형성제를 혼합 및/또는 용해시킬 수 있는 것이면 제한없이 사용 가능하며, 바람직한 유기 용매로 소수성 및 휘발성이 강한 것을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 유기 용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 사용할 수 있다. 이때 유기 용매의 함량은 전체 유상의 중량 기준으로 1 내지 99 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 기공형성제는 최종적으로 제조되는 다공성 마이크로스피어에 열린 기공 구조를 부여하기 위해 첨가되는 것으로, 마이크로스피어를 제작한 후 제거될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

상기 기공형성제는 캄펜, 캠포르, 나프탈렌, 멘톨, 티몰, 쿠마린, 바닐린, 살리실아미드, 2-아미노피리딘, t-부탄올, 트리클로로-t-부탄올, 이미다졸, 디메틸설폰, 우레아, 2-아미도피리딘, 운데케인(undecane, UD)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 기공형성제는 운데케인일 수 있다.

상기 제1 용액은 0.1 내지 5 wt%(질량백분율)의 생체적합성 고분자를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 생체적합성 고분자는 0.1 내지 5 wt%, 0.1 내지 4 wt%, 0.1 내지 3 wt%, 0.1 내지 2 wt%, 0.1 내지 1 wt%, 0.5 내지 5 wt%, 0.5 내지 4 wt%, 0.5 내지 3 wt%, 0.5 내지 2 wt%, 0.5 내지 1 wt%, 0.6 내지 2 wt% 또는 0.6 내지 1 wt%의 농도로 포함되는 것일 수 있다.

상기 제1 용액은 0.1 내지 10 wt%의 기공형성제를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 기공형성제는 0.1 내지 10 wt%, 0.1 내지 8 wt%, 0.1 내지 6 wt%, 0.1 내지 4 wt%, 1 내지 10 wt%, 1 내지 8 wt%, 1 내지 6 wt%, 1 내지 4 wt%, 2 내지 10 wt%, 2 내지 8 wt%, 2 내지 6 wt% 또는 2 내지 4 wt%의 농도로 포함되는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 기공형성제의 함량, 구체적으로는 기공형성제 및 생체적합성 고분자의 비율을 조절함으로써 다공성 마이크로스피어의 기공 구조를 조절할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 제1 용액은 기공형성제 및 생체적합성 고분자를 1:1 내지 6:1의 비율(w:w)로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 1:1 내지 6:1, 1:1 내지 5.83:1, 1:1 내지 5.5:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 4.5:1, 1:1 내지 4:1, 1:1 내지 3.5:1, 1:1 내지 3:1, 2:1 내지 6:1, 2:1 내지 5.83:1, 2:1 내지 5.5:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 4.5:1, 2:1 내지 4:1, 2:1 내지 3.5:1, 2:1 내지 3:1, 2.5:1 내지 6:1, 2.5:1 내지 5.83:1, 2.5:1 내지 5.5:1, 2.5:1 내지 5:1, 2.5:1 내지 4.5:1, 2.5:1 내지 4:1, 2.5:1 내지 3.5:1, 2.5:1 내지 3:1, 3:1 내지 6:1, 3:1 내지 5.83:1, 3:1 내지 5.5:1, 3:1 내지 5:1, 3:1 내지 4.5:1, 3:1 내지 4:1 또는 3:1 내지 3.5:1의 비율로 포함하는 것일 수 있다.

상기 제1 용액은 자성 나노입자를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 제1 용액은 0.01 내지 0.1 wt%의 자성 나노입자를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 자성 나노입자는 0.01 내지 0.1 wt%, 0.01 내지 0.08 wt%, 0.01 내지 0.06 wt%, 0.01 내지 0.04 wt%, 0.02 내지 0.1 wt%, 0.02 내지 0.08 wt%, 0.02 내지 0.06 wt% 또는 0.02 내지 0.04 wt%의 농도로 포함되는 것일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 제1 용액은 생체적합성 고분자, 기공형성제, 유기 용매 및 자성 나노입자를 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 2) 단계는 계면활성제를 친수성 용매와 혼합하거나 및/또는 용해시켜 수상(제2 용액)을 제조하는 단계일 수 있다.

상기 친수성 용매는 물, C1-4 알코올 또는 이의 혼합용매일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제2 용액은 수상으로서, 유상인 고분자 용액과 친수성 용매 사이의 계면을 조정하기 위해 계면활성제를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 hydrophilic-lipophilic balance (HLB) 값이 10 이상인 것이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다.

상기 계면활성제는 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티럴, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르 및 이들의 혼합물 등이 가능하며, 구체적으로, 폴리비닐알코올을 포함하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제의 사용량은 제조되는 다공성 마이크로스피어의 입경을 고려하여 수상 중 0.1 내지 10 중량%가 바람직할 수 있다.

상기 제2 용액은 0.1 내지 5 wt%의 계면활성제를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 계면활성제는 0.1 내지 5 wt%, 0.1 내지 4 wt%, 0.1 내지 3 wt%, 0.1 내지 2 wt%, 0.1 내지 1 wt%, 0.5 내지 5 wt%, 0.5 내지 4 wt%, 0.5 내지 3 wt%, 0.5 내지 2 wt%, 0.5 내지 1 wt%, 1 내지 5 wt%, 1 내지 4 wt%, 1 내지 3 wt% 또는 1 내지 2 wt%의 농도로 포함되는 것일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 제2 용액은 친수성 용매 및 게면활성제를 포함하는 것일 수 있다.

상기 1) 단계 및 2) 단계는 순차적으로, 역순으로 또는 동시에 수행될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 3) 단계는 상기 제1 용액 및 제2 용액을 이용하여 마이크로스피어를 제조하는 것으로서, 구체적으로 a) 상기 제1 용액 및 제2 용액을 혼합하여 에멀젼을 형성시키는 단계 및 b) 상기 에멀젼으로부터 마이크로스피어를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 a) 단계는 제1 용액을 불연속상으로 사용하고, 제2 용액을 연속상으로 사용하여 유체 장치에 흘려주어 수중유형 에멀젼(oil-in-water emulsions)을 제조하는 것일 수 있다.

상기 a) 단계에서 불연속상의 유속은 0.01 내지 1 mL/min로 설정하여 수행하는 것일 수 있으며, 구체적으로 0.01 내지 1 mL/min, 0.01 내지 0.8 mL/min, 0.01 내지 0.5 mL/min, 0.01 내지 0.3 mL/min, 0.01 내지 0.2 mL/min, 0.01 내지 0.1 mL/min, 0.05 내지 1 mL/min, 0.05 내지 0.8 mL/min, 0.05 내지 0.5 mL/min, 0.05 내지 0.3 mL/min, 0.05 내지 0.2 mL/min, 0.05 내지 0.1 mL/min, 0.1 내지 1 mL/min, 0.1 내지 0.8 mL/min, 0.1 내지 0.5 mL/min, 0.1 내지 0.3 mL/min 또는 0.1 내지 0.2 mL/min로 설정하여 수행하는 것일 수 있다.

상기 a) 단계에서 연속상의 유속은 0.5 내지 5 mL/min로 설정하여 수행하는 것일 수 있으며, 구체적으로 0.5 내지 5 mL/min, 0.5 내지 4 mL/min, 0.5 내지 3 mL/min, 0.5 내지 2 mL/min, 0.5 내지 1.5 mL/min, 1 내지 5 mL/min, 1 내지 4 mL/min, 1 내지 3 mL/min, 1 내지 2 mL/min, 1 내지 1.5 mL/min, 1.3 내지 5 mL/min, 1.3 내지 4 mL/min, 1.3 내지 3 mL/min, 1.3 내지 2 mL/min 또는 1.3 내지 1.5 mL/min로 설정하여 수행하는 것일 수 있다.

상기 b) 단계는 상기 에멀젼으로부터 유기 용매를 제거하여 생체적합성 고분자 및 기공형성제를 포함하는 마이크로스피어를 제조하는 것으로서, 상기 유기 용매는 증발에 의해 제거되는 것일 수 있다.

상기 4) 단계는 생체적합성 고분자 및 기공형성제를 포함하는 마이크로스피어에서 기공형성제를 제거하여 마이크로스피어의 몸체 표면 및/또는 내부에 기공을 형성시키는 것을 포함하는 것일 수 있다.

상기 마이크로스피어로부터 기공형성제를 제거 및/또는 용출시키는 것은 동결건조, 대기조건에서의 승화 및/또는 기공형성제를 용해시킬 수 있는 용매를 이용할 수 있다.

또한, 상기 기공형성제를 제거하는 단계는 10분 내지 100시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법은 수득한 다공성 마이크로스피어를 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 건조는 동결건조를 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법은 제조된 마이크로스피어의 표면을 양이온성 고분자로 개질 또는 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법으로 제조된 마이크로스피어는 박테리아 또는 박테리아 포자를 효과적으로 봉입할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 박테리아 또는 박테리아 포자를 봉입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 1) 상기 다공성 마이크로스피어; 및 2) 종양 용해(oncolytic) 박테리아 또는 이의 포자를 포함하는, 항암 마이크로스피어를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 마이크로스피어에도 공히 적용된다.

상기 항암 마이크로스피어는 상기 다공성 마이크로스피어의 기공에 종양 용해 박테리아 및/또는 이의 포자가 봉입된 형태일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 다공성 마이크로스피어는 종양 용해 박테리아 및/또는 이의 포자의 봉입 효율이 우수하며, 종양 표적부위에서 방출 또한 효과적으로 수행될 수 있음을 확인하였다.

또 다른 양상은 상기 항암 마이크로스피어를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

본 명세서에서의 용어 "암"은 신체 조직의 조절되지 않는 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 종양, 또는 종양을 형성하는 병을 의미한다. 상기 암은 위암(장형 위암, 미만형 위암), 간암, 폐암, 췌장암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "치료"는, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 암 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서의 용어 "예방"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 암 질환 또는 질환의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.

상기 조성물은 분산액을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 분산액은 마이크로스피어가 적절히 분산된 상태를 유지할 수 있는 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 분산액은 carboxymethyl cellulose (CMC) 및 알지네이트(alginate, Alg) 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 분산액의 농도는 3 wt% 이하일 수 있으며, 구체적으로 0.1 내지 3 wt%, 0.1 내지 2.5 wt%, 0.1 내지 2 wt%, 0.5 내지 3 wt%, 0.5 내지 2.5 wt%, 0.5 내지 2 wt%, 1 내지 3 wt%, 1 내지 2.5 wt% 또는 1 내지 2 wt%일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 약학적 조성물에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 락토스, 덱스트로스, 말토 덱스트린, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 글리세롤, 에탄올, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 약학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 암 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본원의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 양상은 상기 항암 마이크로스피어 또는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 암 질환이 발병되거나 발병할 위험이 있는 개, 고양이, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류, 파충류, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있으며, 상기 개체는 인간일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다. 상기 항암 마이크로스피어 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 약학 조성물의 유효성분이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

일 양상에 따른 다공성 마이크로스피어는 박테리아 포자 봉입 효율이 우수하며, 함유된 자성 나노 입자로 인해 외부 자기장 유도 장치를 이용하여 종양 부위로의 표적능을 향상시키고 생체 이미징을 통해 인체 내 움직임을 모니터링 할 수 있다.

도 1은 UD/PLA 비율에 따른 마이크로스피어의 SEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 2는 상기 마이크로스피어의 크기 및 기공 크기를 나타낸 도면이다 (n = 100, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, not significant).
도 3은 UD/PLA 비율에 따른 마이크로스피어 기공의 SEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 4의 A는 상기 마이크로스피어의 기공 크기를 나타낸 도면이고, B는 상기 마이크로스피어의 면적 100 ㎛² 당 열린 공극 수를 나타낸 도면이다 (n = 100, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, not significant).
도 5는 Percoll 밀도 구배에 의해 분리된 C. novyi-NT 포자의 명시야 이미지 및 SEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6은 자성 나노입자를 포함하는 마이크로스피어의 자석에 대한 반응성을 나타낸 도면이다.
도 7은 자성 나노입자를 포함하는 마이크로스피어의 자석에 의한 이동성을 나타낸 도면이다.
도 8은 자성 나노입자를 포함하는 마이크로스피어의 T2 강조 자기공명(MR) 팬텀 이미지를 나타낸 도면이다.
도 9는 자성 나노입자를 포함하지 않은 마이크로스피어의 T2 강조 자기공명(MR) 팬텀 이미지를 나타낸 도면이다.
도 10은 자성 나노입자를 포함하는 마이크로스피어의 종양내 주사 전(위쪽) 및 후(아래쪽)의 CT26 종양 보유 마우스의 T2 강조 MR 이미지를 나타낸 도면이다. 빨간색 화살표는 종양 부위에서 마이크로스피어의 MR 신호를 나타낸다.
도 11은 마이크로스피어의 CMC에서의 분산력을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 마이크로스피어의 알지네이트에서의 분산력을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 양이온성 고분자 개질에 따른 박테리아 포자 봉입 효율을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (MS: 비다공성 마이크로스피어, PMS: 다공성 마이크로스피어, PEI-PMS: 양이온성 고분자로 개질된 다공성 마이크로스피어) (n = 100, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, not significant).
도 14는 FITC-표지된 박테리아 포자의 봉입 효율을 형광 이미지를 통해 관찰한 도면이다(MS: 비다공성 마이크로스피어, PMS: 다공성 마이크로스피어, PEI-PMS: 양이온성 고분자로 개질된 다공성 마이크로스피어).
도 15는 박테리아 포자가 봉입된 마이크로스피어에서의 24시간 후 포자 발아 효율을 확인한 도면이다.
도 16은 마이크로스피어에서 방출된 포자의 콜로니 수준을 확인한 도면이다.
도 17의 A는 PEI-PMS의 CT26 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이고, B는 C. novyi-NT 상청액의 CT26 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이고, C는 C. novyi-NT 상청액의 RAW264.7 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (n = 100, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, not significant).
도 18의 A는 E. coli DH5α 상청액의 CT26 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이고, B는 열처리하여 불활성화된 C. novyi-NT 상청액의 CT26 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (n = 100, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, not significant).
도 19는 CT26 세포에 C. novyi-NT 상청액 처리에 따른 살아있는 세포(live) 및 죽은 세포(dead) 이미지를 나타낸 도면이다.
도 20의 A 및 B는 C. novyi-NT 상청액 처리에 따른 CT26 세포의 세포 생존능(cell viability)을 콜로니 형성 어세이로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 C. novyi-NT 상청액 처리에 의한 CT26 세포의 세포사멸/괴사(apoptotic/necrotic) 세포 집단(%)을 유세포 분석 결과로 나타낸 도면이다.
도 22는 C. novyi-NT 상청액 처리에 의한 CT26 세포의 세포사멸/괴사(apoptotic/necrotic) 세포 집단(%) 결과를 그래프로 나타낸 도면이다.
도 23의 A는 CT26 세포에 C. novyi-NT 상청액 처리에 따른 방출된 ATP를 분석한 결과를 나타낸 도면이고, B는 CRT(calreticulin) 발현된 세포를 분석한 결과를 나타낸 도면이다 (n = 100, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, not significant).
도 24의 A는 CT26 세포 및 RAW264.7 세포의 간접적 공배양에서 C. novyi-NT 상청액 처리에 따른 CD80이 발현된 세포를 분석한 결과를 나타내고, B는 CD86이 발현된 세포를 분석한 결과를 나타내고, C는 CD80 및 CD86이 발현된 세포를 분석한 결과를 나타낸다 (n = 100, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, not significant).
도 25는 C. novyi-NT 포자에 의한 면역 반응 개시에 대한 개략도를 나타낸 도면이다.
도 26은 양이온성 고분자와 박테리아 포자 사이의 정전기적 인력을 이용한 마이크로스피어에 대한 개략도를 나타낸 도면이다.
도 27은 본 발명의 마이크로스피어의 외부 자기장에 의한 종양 표적화 기능성을 나타낸 도면이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 다기능성을 갖는 다공성 마이크로스피어 제작

본 발명의 다기능성을 갖는 다공성 마이크로스피어 제작하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 마이크로스피어를 제작하기 위한 유체 장치(fluidic device)를 Tygon tube (내부직경 1/32 인치, 외부직경 3/32 인치), 유리 모세관 (5922-10, 5 IN PIPETS microcapillary, Ace Glass, USA), 및 니들 (30 G)을 이용하여 제작하였다.

폴리락트산(poly lactic acid, PLA), 운데케인(undecane, UD) 및 자성나노입자로서 산화철 나노입자(0.03 wt%)를 포함하는 디클로로메탄 (dichloromethane, DCM) 용액을 불연속상 (discontinuous phase)으로 주입하였다. 또한, 2 wt% 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA) 수용액은 연속상(continuous phase) 및 수집상(collection phase)에 사용하였다. PLA, UD 및 자성나노입자(IONP)의 비율은 하기 표 1에 구체적으로 기재하였다.

UD/PLA ratio (w:w)	UD (wt.%)	PLA (wt.%)	IONP (wt.%)
0	0	1	0.03
3	3	1
3.5	3.5	1
4.375	3.5	0.8
5	3.5	0.7
5.83	3.5	0.6

다음으로, 수중유형 에멀젼(oil-in-water emulsions)을 제조하기 위해, 실린지 펌프를 사용하여 불연속상 및 연속상의 유속을 각각 0.1 mL/min 및 1.5 mL/min로 설정하여 수행하였다.

수집상(collection phase)에 모아진 에멀젼은 DCM을 밤새 증발시켜 UD/PLA 마이크로스피어가 되었으며, 상기 마이크로스피어를 탈이온수(DW)로 3회 세척하여 잔여 UD 및 PVA를 제거했다. 다음으로, UD/PLA 마이크로스피어를 에탄올과 함께 부드럽게 교반하여 에탄올에 침투시켜 UD를 용해시켜 제거하였다. 이 후 상기 마이크로스피어를 동결건조시켜 최종적으로 다공성 PLA 마이크로스피어를 제조하였다.

실시예 2: 자성 나노입자 합성

자성 나노입자를 제작하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 자성 나노입자로서, 산화철 나노입자(Iron oxide nanoparticle, IONP)를 합성하기 위해 철(III) 아세틸아세토네이트(iron(III) acetylacetonate) 423.6 mg과 염화아연 120 mg을 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 그리고 올레산(oleic acid) 1.2 mL와 올레일아민(oleylamine) 4.8 mL, 트리옥틸아민(trioctylamine) 4.8 mL를 플라스크에 넣었다. 플라스크 주입구를 질소 가스 유입구에 연결하고 300 rpm에서 3분 동안 교반하였다. 가열 맨틀에 연결된 플라스크를 200 ℃에서 25분 동안 점차적으로 가열하고, 200 ℃의 일정한 온도에서 1시간 동안 유지하였다. 그 후, 다시 330 ℃에서 1시간 동안 서서히 가열하고 330 ℃에서 1시간 동안 유지하였다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 천천히 냉각시켰다. 반응 후 1.92 mL의 톨루엔과 30 mL의 에탄올을 용액에 첨가하였다. 용액을 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 1600 g에서 원심분리한 후, 상청액을 버리고 8 mL의 톨루엔과 30 uL의 올레일아민을 첨가하여 펠렛을 재분산시켰다. 분산된 용액을 실온에서 3분 동안 650 g에서 원심분리하고 상청액을 수집한 후, 상기 상청액에 에탄올 4 mL를 넣고 상온에서 5분 동안 1600g에서 원심분리하였다. 이 후, 상등액을 버리고 4 mL의 DCM에 재분산하여 최종 입자를 얻었다.

실시예 3: 다공성 마이크로스피어 특성 평가

상기 실시예 1에서 제작한 다공성 마이크로스피어의 특성을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 도 1은 유체 장치를 사용하여 O/W 에멀젼 방법으로 균일한 다공성 마이크로스피어를 제조했음을 보여준다. 또한, 마이크로스피어의 크기 및 기공 크기는 UD/PLA의 비율을 통해 조절할 수 있음을 알 수 있으며, 구체적으로 UD/PLA에서 UD의 비율이 증가할수록 마이크로스피어의 크기 및 기공의 크기가 증가하였음을 알 수 있다(도 2).

다만, UD/PLA 비율이 5.83을 초과하면(PLA 0.6%, UD 3.5%), 공극이 너무 많아 마이크로스피어의 기계적 물성에 악영향을 미쳐 형태적 불안정성을 초래하는 것을 확인하였다. 또한, UD의 비율이 증가할수록 면적 100 ㎛² 당 열린 공극의 수가 증가하였음을 알 수 있다(도 3 및 도 4A 내지 4B).

한편, 박테리아 포자의 크기는 일반적으로 약 1.5 um임을 확인하였는 바 (도 5), 기공 크기가 안정적이고 균일하며 충분한 포자 봉입이 가능한 기공 크기를 갖는, UD/PLA 비율이 3인 마이크로스피어(UD/PLA 3)가 적합하다는 것을 알 수 있다.

실시예 4: 다공성 마이크로스피어의 자성 평가

상기 실시예 1에서 제작한 다공성 마이크로스피어의 자성을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 다공성 마이크로스피어를 증류수에 분산시킨 후 영구 자석을 이용하여 상기 다공성 마이크로스피어가 자성을 갖는 것을 확인하였으며(도 6), 3D 프린터 (Ender-5, China, Creality)를 사용하여 제조한 미로에 자성을 가진 다공성 마이크로스피어를 놓고, 자석을 이용하여 원하는 대로 움직일 수 있음을 확인하였다(도 7).

다음으로, 자기 공명(MR) 이미징 및 정량적 평가를 위해 상기 다공성 마이크로스피어를 아가로즈 겔에 다양한 농도로 분산시켰다. 그 결과, 자성 나노입자가 포함되지 않은 마이크로스피어에서는 T2 강조 MR 신호(T2-weighted MR signal)가 검출되지 않는 반면(도 8), 자성 나노입자를 포함하는 다공성 마이크로스피어에서는 입자 농도가 증가함에 따라 T2 강조 MR 신호가 증가하는 것을 확인하였다(도 9).

다음으로, 생체 내에서 상기 다공성 마이크로스피어의 자기 공명 영상 성능을 평가하고자 하였다. 이를 위해, CT26 대장암 세포를 마우스에 피하 접종하여 마우스 종양 모델을 제작하였으며, 8일 후 종양이 자라면 자성 나노 입자 포함한 다공성 마이크로스피어를 종양 내 주사한 다음 자기 공명 영상화를 수행하였다. 그 결과, 자성 나노입자를 포함하는 다공성 마이크로스피어를 종양에 주입한 경우 T2 강조 신호가 보이는 것을 확인하였다(도 10).

실시예 5: 다공성 구조를 갖는 마이크로스피어의 분산력 평가

상기 실시예 1에서 제작한 다공성 마이크로스피어의 균일한 주입을 위해, 분산된 상태를 유지하고 작은 주사바늘을 통과하는 적절한 분산액 농도를 찾기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, UD/PLA 3 마이크로스피어를 이용하여 분산력 확인 실험을 수행하였다. 상기 마이크로스피어는 70% 에탄올에 24시간동안 침윤시켜 멸균하였으며, 에탄올을 증류수로 치환하여 초음파를 통해 에탄올을 씻어내는 과정을 3번 반복하였고, 최종적으로 다양한 농도의 carboxymethyl cellulose (CMC), 알지네이트(alginate, Alg) 용액에 10 mg/mL 농도의 마이크로스피어를 분산시켰다.

그 결과, 3 wt% 및 4 wt%의 CMC와 3 wt% 및 5 wt%의 Alg 분산액에서 마이크로스피어는 볼텍싱(voltexing) 방식을 통해 분산이 불가능하였으며, 초음파를 통해 분산시켰다. 초음파를 사용할 경우 추후 박테리아 봉입 시 박테리아가 탈락될 우려가 있기 때문에 CMC 와 알지네이트의 농도는 최대 2% 이하로 진행하여야 하는 것을 확인하였다. 또한, 분산 상태의 마이크로스피어가 가라앉기 시작하는 시간을 나타내었으며(빨간 화살표 표시), 분산액의 농도가 높을수록 가라앉는 시간이 늦춰지는 것을 확인하였다(도 11 및 도 12).

실시예 6: 양이온성 고분자로 코팅된 다공성 마이크로스피어 제작

상기 실시예 1에서 제작한 다공성 마이크로스피어를 양이온성 고분자로 코딩하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 양이온성 고분자의 예로서 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine, PEI)을 사용하였으며, 다공성 마이크로스피어를 10wt% PEI 수용액에 분산시키고 상온에서 1시간 동안 코팅하였다. PEI 코팅된 다공성 마이크로스피어를 증류수로 5회 세척하였다. 마이크로스피어의 표면 형태는 주사전자현미경(S-4800, HITACHI, JAPAN)으로 관찰하였으며, ImageJ 소프트웨어(USA)를 사용하여 각 샘플에 대해 최소 100개의 마이크로스피어를 분석하여 입자 및 기공의 평균 크기를 계산했다.

실시예 7: 양이온성 고분자로 개질된 다공성 마이크로스피어의 박테리아 봉입 효율 및 방출능 평가

양이온성 고분자로 개질한 마이크로스피어의 박테리아 포자의 봉입능과 봉입된 박테리아 포자의 방출 거동을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이때, 박테리아 포자보다 큰 기공을 갖는 균일한 다공성 마이크로스피어를 제조하기 위해 UD/PLA 3 조건을 캐리어 모델로 결정하였다. 또한, 구체적으로, 비다공성 마이크로스피어(MS)를 대조군으로 사용하였고, PEI로 코팅을 하지 않은 UD/PLA 3 다공성 마이크로스피어(PMS) 및 PEI 코팅을 한 UD/PLA 3 다공성 마이크로스피어(PEI-PMS)를 실험군으로 선정하였다.

7-1: 박테리아 포자 준비

박테리아 포자의 일 예로서, 클로스트리디움 노비-NT (Clostridium novyi-NT, C. novyi-NT) 포자를 준비하였으며, C. novyi-NT 포자는 1L 당 5 g Na₂HPO₄, 30 g 펩톤, 0.5 g L-시스테인, 10 g 말토오스 및 5 % wt/vol cooked meat particles (Difco)를 포함하는 포자 형성 배지에서 혐기성 및 37 ℃조건에서 배양되었다. 최소 2주동안 배양된 포자는 퍼콜 밀도 구배(percoll density gradients) (55 및 70%)에 의해 분리되었다.

또한, FITC 표지된 C. novyi-NT 포자를 제조하기 위해, 100 uL FITC DMSO 용액(1 mg/mL)을 1 mL C. novyi-NT 용액(1Х10⁹ 포자)에 첨가하고 25 ℃에서 밤새 교반하였다. 그 후, 반응액을 4 ℃, 8000 rpm에서 10분간 원심분리하여 PBS로 3회 세척하였다.

7-2: 박테리아 포자 봉입 효율 평가

양이온성 고분자로 개질된 다공성 마이크로스피어의 박테리아 포자 봉입 효율을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, MS, PMS 또는 PEI-PMS 10 mg을 PBS에 분산시킨 후 1 Х 10⁸ FITC 표지된 C. novyi-NT 포자를 넣고, 진공을 가한 후, 4시간동안 섞어주었다. 이 후, 자성을 이용하여 마이크로스피어를 분리하고 상층액의 일부를 따서 각각의 형광감도를 측정하였다. 상층액의 형광감도는 마이크로스피어 내부로 봉입되지 않은 물질의 양으로 보고, 대조군으로부터 그 값을 빼주어 봉입률을 구하였다.

그 결과, MS군에서는 정전기 인력과 기공이 모두 없기 때문에 포자가 전혀 봉입되지 않았으며, PMS 군에서는 약 20%가 봉입되었고, PEI-PMS군에서는 내부 기공과 정전기적 인력에 의해 PMS와 비교하여 2배 이상 봉입이 이루어짐을 확인하였다(도 13). 또한, 각 마이크로스피어 내로 봉입된 박테리아 포자를 형광현미경으로 관찰한 결과 기공의 존재와 양이온성 고분자로의 표면 개질에 따라서 봉입 효율이 향상되는 것을 확인하였다(도 14).

7-3: 박테리아 포자 방출능 평가

양이온성 고분자로 개질된 다공성 마이크로스피어의 박테리아 포자 방출능을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이는, 내부 기공과 정전기적 인력에 의해 입자에 봉입된 포자가 생체 내에서 목표 부위로 안전하게 이동한 후, 저산소 환경에서 효과적으로 방출되어 발아하는지 확인하기 위해 수행되었다.

구체적으로, 포자가 봉입된 PEI-PMS 마이크로스피어 현탁액을 RCM 브로스에 접종했다. 봉입되지 않은 포자를 포함하는 상등액을 제거한 후, 마이크로스피어를 1 mL의 PBS에 재분산하고, 이를 RCM 액체 배지에 접종하고 24시간 후에 흡광도를 측정하였다. 또한, 혐기성 세균인 C. novyi-NT의 포자를 발아시키기 위해, EC-oxyrase(Oxyrase Inc.)를 RCM 브로쓰에 10% v/v로 첨가한 후, BD GasPak에서 배양하였다. 이후 4, 8, 및 12시간 후 배양액 200 uL를 취하여 RCM 고체배지에 도말하고, 24시간 후에 콜로니 이미지를 수득하였다.

그 결과, 포자가 봉입되지 않은 PEI-PMS군(대조군)은 발아가 이루어지지 않은 반면, 포자가 배지에서 천천히 방출되면서 발아가 일어나는 것을 확인하였다(도 15). 또한, 포자를 포함하는 마이크로스피어를 RCM 배지에 접종하고, 배양액을 4, 8, 12시간마다 채취하여 RCM oxyrase agar plate에 도말한 결과, 시간 경과에 따라 포자가 지속적으로 방출되고 있음을 확인하였다(도 16).

상기 결과를 토대로, 마이크로스피어의 기공과 정전기적 인력 유도에 의해 박테리아 포자를 효과적으로 봉입할 수 있고, 봉입된 포자가 입자에 의한 기능적 제한이나 간섭 없이 적절한 환경에서 방출되고 발아될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 8: 박테리아 포자가 봉입된 다공성 마이크로스피어의 세포 독성 평가

박테리아 포자가 봉입된 다공성 마이크로스피어의 세포 독성 및 항 종양 효과를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

8-1: 다공성 마이크로스피어의 세포 독성 평가

다공성 마이크로스피어의 자체의 세포 독성 여부를 확인하기 위해, PEI-PMS를 CT26 세포를 처리한 결과 대조군과 비교하여 독성이 없는 것으로 나타났다(도 17A).

8-2: 박테리아 포자의 세포 독성 평가

C. novyi-NT의 세포 독성을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, CT26 세포(3Х10⁵개 세포/mL) 또는 RAW264.7 세포(4Х10⁵개 세포/mL)를 24-웰 플레이트에 접종하고 하룻밤동안 배양하였다. 이 후, C. novyi-NT 상등액과 E. coli DH5α 상등액을 동일한 농도로 처리하였다. 4시간 후 세포를 PBS로 세척하고 CCK-8 용액을 첨가하였다. 1시간 후, CCK-8 분석법으로 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 세포 독성을 평가하였다.

그 결과, C. novyi-NT 배양 상등액의 농도 의존적으로 사멸 효과가 나타나는 것을 확인하였으며, 5 mg/mL의 C. novyi-NT 포자 배양 상등액으로 처리한 경우, 대부분의 세포가 사멸되는 것이 관찰되었다(도 17B 및 C).

다음으로, 상기 독성이 C. novyi-NT 포자의 특이적인 특성인지 확인하기 위해, 대장균 DH5α 균주의 배양 상등액을 동일한 농도로 처리한 결과, 대장균 DH5α 균주는 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 18A).

다음으로, C. novyi-NT에서 분비되는 리포소마아제(liposomase)가 독성을 유발하는 것인지 확인하기 위해, C. novyi-NT 배양 상등액을 열처리하여 불활성화한 후, CT26 세포에 처리한 결과, 열처리한 경우에는 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 18B).

다음으로, 생존 및 사멸 분석(live and dead assay)과 콜로니 형성 분석(colony formation assay)에서 C. novyi-NT 배양 상등액의 농도가 증가함에 따라 죽은 세포의 비율이 증가하는 것이 확인하였다(도 19, 도 20A 및 20B).

8-3: 박테리아 포자에 의한 세포 사멸 메커니즘 분석

C. novyi-NT 배양에 의한 세포 사멸을 분석하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, CT26 세포(3Х10⁵개 세포/mL)를 12-웰 플레이트에 접종하고, 하룻밤동안 배양하였다. 이 후 상기 세포에 C. novyi-NT 배양 배지를 농도별로 처리하였다. 4시간 후, 7-AAD (Biolegend)가 포함된 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit를 사용하여 세포를 염색한 다음, 유세포 분석기(CytoFLEX S, Beckman Coulter, Miami, FL, USA)로 분석했다.

그 결과, C. novyi-NT 배양 상등액의 농도가 증가함에 따라 후기 사멸/괴사 세포(late apoptotic/necrotic cells)의 비율이 증가하는 것을 확인하였다(도 21 및 도 22).

상기 결과들을 토대로 박테리아 포자가 분비하는 지질 분해 단백질(liposomase)들이 직접적으로 암세포 사멸을 일으키며, 이를 이용하여 박테리아 기반의 항 종양 치료를 진행할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 9: 박테리아 포자에 의한 면역 활성화 평가

박테리아 포자로 인한 면역 활성화를 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

9.1: DAMP 발현 분석

박테리아 포자에 의한 ICD (immunogenic cell death)-관련 손상 관련 분자 패턴(Damage-associated molecular patterns, DAMP)를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, CT26 세포(3Х10⁵개 세포/mL)를 12-웰 플레이트에 접종하고, 하룻밤동안 배양하였다. 이 후 상기 세포에 C. novyi-NT 배양 배지를 농도별로 처리하였다. 4시간 후, 세포 펠릿을 PBS로 세척하고, 세포 표면에 발현된 칼레티쿨린(calreticulin) 분자를 염색하기 위해 4 ℃에서 30분 동안 Alexa Fluor 488-접합 칼레티쿨린 항체(희석 1:500)로 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 세포를 2% FBS를 포함하는 PBS 용액에 재분산시키고 유세포 분석기로 분석하였다.

다음으로, CT26 세포(3Х10⁵개 세포/mL)를 12-웰 플레이트에 접종하고, 하룻밤동안 배양하였다. 이 후 상기 세포에 C. novyi-NT 배양 배지를 농도별로 처리하였다. 1시간 후, ATP 생물발광 키트(ATP bioluminescence kit)를 사용하여 세포 배지에서 방출된 ATP의 양을 측정했다.

그 결과, C. novyi-NT 상등액 처리 농도가 증가할수록 ATP 방출량이 증가하였으며, 5 mg/mL 처리한 경우 ATP 방출량이 대조군에 비해 약 12배 증가하였고, calreticulin(CRT)가 발현된 세포의 백분율(%)은 약 37배 증가했다 (도 23A 및 B).

9.2: 면역세포 활성화 평가

박테리아 포자에 의해 사멸된 암세포에 의한 면역세포 활성을 평가하기 위해(M0 대식세포의 M1 분극화 정도를 평가), 하기와 같은 실험을 수행하였다. M1 대식세포는 병원균과 종양 세포의 제거에 긍정적인 역할을 하며, 항원 제시 MHC 복합체를 높은 수준으로 발현하여 적응 면역 반응을 활성화하는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, CT26 대장암 세포(3Х10⁵ cells/mL) 및 RAW264.7 세포(3.5Х10⁵ cells/mL)를 12-웰 플레이트에 접종하여 간접적으로 공배양시켰다. 먼저, CT26 대장암 세포에 C. novyi-NT 상등액을 농도별로 처리하고 4시간동안 배양하였다. 이 후, CT26 대장암 세포의 배양액을 RAW264.7 세포에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포 펠릿을 PBS로 세척하고, 4 ℃에서 10분동안 Fc 수용체로 블락킹하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 세포 표면에 발현된 CD80 및 CD86 분자를 APC-접합 CD80 항체, PE-접합 CD86 항체 및 좀비 아쿠아 염료(zombie aqua dye)(1:500로 희석)로 4 ℃에서 1시간 동안 처리하여 염색하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 세포를 2% FBS를 포함하는 PBS 용액에 재분산시키고 유세포 분석기로 분석하였다.

그 결과, C. novyi-NT 상등액 처리 농도가 증가함에 따라 CD80 및 CD86 양성 세포의 비율이 유의하게 증가하였다(도 24A 내지 C).

상기 결과들을 토대로 박테리아 포자에 의해 파괴된 암세포가 종양 항원 또는 DAMP를 방출하여 면역 세포를 활성화한다는 것을 알 수 있다(도 25).

종양 용해성 박테리아를 암 치료에 적용하는 박테리아-매개 종양 치료의 경우 종양에 전달되는 포자의 비율이 적고, 전달된 포자가 혈류로 빠져나가면 전신 감염과 같은 유해한 부작용을 일으킬 수 있다는 단점이 있다. 따라서, 상기 박테리아-매개 종양 치료의 치료 효과와 부작용 감소를 위해 박테리아 농도를 조절하고 종양에 표적화하는 것이 중요하다.

본 발명의 다공성 마이크로스피어는 양이온성 고분자로 표면을 개질하였는 바, 음전하를 갖는 박테리아 포자를 정전기적 인력을 통해 효과적으로 봉입할 수 있다(도 26). 또한, 본 발명의 마이크로스피어는 자성 나노입자를 포함하고 있는 바, 외부 자기장으로 제어가 가능할뿐만 아니라, MRI를 통해 생체 내 위치를 확인할 수 있다는 장점이 있다(도 27).

진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

1. 생체적합성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는, 다공성 마이크로스피어.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로스피어는 자성 나노입자를 추가로 포함하는 것인, 다공성 마이크로스피어.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로스피어의 표면은 양이온성 고분자로 개질된 것인, 다공성 마이크로스피어.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로스피어는 박테리아 또는 박테리아 포자를 봉입할 수 있는 것인, 다공성 마이크로스피어.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로스피어의 기공의 크기는 1 내지 10 ㎛인 것인, 다공성 마이크로스피어.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로스피어의 면적 100㎛² 당 열린 공극(open pore/area)의 수는 0.1 내지 6인 것인, 다공성 마이크로스피어.
7. 1) 생체적합성 고분자 및 기공형성제를 포함하는 제1 용액을 제조하는 단계;
   2) 계면활성제를 포함하는 제2 용액 제조하는 단계;
   3) 상기 제1 용액 및 제2 용액을 이용하여 마이크로스피어를 제조하는 단계; 및
   4) 상기 제조된 마이크로스피어에서 기공형성제를 제거하는 단계
   를 포함하는, 다공성 마이크로스피어 제조방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 제1 용액은 기공형성제 및 생체적합성 고분자를 1:1 내지 6:1의 비율(w:w)로 포함하는 것인, 제조방법.
9. 청구항 7에 있어서, 상기 제1 용액은 자성 나노입자를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
10. 청구항 7에 있어서, 상기 방법은 제조된 다공성 마이크로스피어의 표면을 양이온성 고분자로 개질하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 다공성 마이크로스피어 제조방법.
11. 청구항 7에 있어서, 상기 방법은 제조된 다공성 마이크로스피어에 박테리아 또는 박테리아 포자를 봉입하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 다공성 마이크로스피어 제조방법.
12. 1) 청구항 1 내지 6 중 한 항의 다공성 마이크로스피어; 및
    2) 종양 용해(oncolytic) 박테리아 또는 이의 포자
    를 포함하는, 항암 마이크로스피어.
13. 청구항 12의 항암 마이크로스피어를 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학 조성물.
    

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