KR20230101444A - 개과 동물의 her1 및 cd3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개과 동물의 HER1 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 이중특이적 항체는 개과 동물의 HER1 및 CD3에 대하여 높은 친화도 및 특이성을 가지므로, 개과 동물의 암종에 특화된 항암 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 인간의 HER1를 표적하는 인간 암 치료제인 세툭시맙(Cetuximab)에 비해 HER1에 대한 항원 결합 친화도가 더욱 높고, 인간의 CD3를 표적하는 인간 암 치료제인 블리나투모맙(Blinatumomab)에 비해 개과 동물의 CD3에 대한 항원 결합 친화도가 현저히 높으므로, 개과 동물의 암을 예방 또는 치료하는 효과가 높을 것으로 기대된다.

Description

개과 동물의 HER1 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도{BISPECIFIC ANTIBODY THAT SPECIFICALLY BINDS TO HER1 AND CD3 OF CANINES AND USE THEREOF}

본 발명은 개과 동물의 HER1 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

현대 사회는 고령화 및 독신가구의 증가에 따라 정신적으로 소외감을 느끼는 인구가 증가하고 경제성장과 더불어 미국, 유럽, 일본 등에서 반려동물의 수가 급격히 증가하고 있다. 미국과 유럽의 경우는 국민 1인당 GDP가 1만 달러에 도달한 경우 반려동물 문화가 시작되고, 2만 달러의 경우 발전단계, 3만 달러에 도달하면 동물의 인격화 단계가 나타난다고 한다. 국내의 경우도 반려동물 시장이 확장하면서 매년 동물 의료 산업이 증대되고 있으며 2020년에는 현재의 3 내지 4배 수준으로 증대될 것으로 예상되고 있다.

이에 따라 반려동물의 기대 수명 또한 증가하는 추세이고, 반려동물의 수명이 늘어남에 따라 암 발병률 또한 필연적으로 증가하고 있다.

현재, 반려동물에게 암이 발병하는 경우 암 세포가 전이된 조직을 절제하여 떼어내는 외과적 치료방법을 적용하고 있으나, 이러한 외과적 치료방법만으로는 암 치료 효과가 매우 낮아, 추가적으로 항암 치료제를 투여하는 화학적 치료방법의 적용이 필수적으로 요구된다. 그런데, 현재 반려동물, 특히 반려견에 적용하는 항암 치료제는 대부분 인간의 것이어서 매우 낮은 수준의 완치율을 보이므로, 개과 동물의 암종에 특화된 항암 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

KR 10-2017-0038835 A

본 발명의 목적은 개과 동물의 암종에 특화된 이중특이적 항체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중특이적 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 개과 동물의 HER1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 개과 동물의 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 이중특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 개과 동물의 HER1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 개과 동물의 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제작하는 단계; (2) 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; (3) 상기 발현벡터로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환시키는 단계; 및 (4) 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 배양하여 이중특이적 항체의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는 이중특이적 항체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 이중특이적 항체는 개과 동물의 HER1 및 CD3에 대하여 높은 친화도 및 특이성을 가지므로, 개과 동물의 암종에 특화된 항암 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 인간의 HER1를 표적하는 인간 암 치료제인 세툭시맙(Cetuximab)에 비해 HER1에 대한 항원 결합 친화도가 더욱 높고, 인간의 CD3를 표적하는 인간 암 치료제인 블리나투모맙(Blinatumomab)에 비해 개과 동물의 CD3에 대한 항원 결합 친화도가 더욱 높으므로, 개과 동물의 암을 예방 또는 치료하는 효과가 높을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 pHIL-S1 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 서열번호 1로 표시되는 이중특이적 항체 유전자(Mam-BiTE1)가 pHIL-S1 벡터에 삽입된 재조합 발현벡터(Mam-BiTE1/pHIL-S1)의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 피키아 파스토리스로부터 Mam-BiTE1를 발현 및 정제한 결과이다. 도 3A는 본 발명의 일 실시예에 따른 AKTA 프라임을 이용한 Ni-NTA 친화성 gradient chromatography curve를 나타낸 것이고, 도 3B는 본 발명의 일 실시예에 따라 발현된 Mam-BiTE1의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 HER1 항원에 대한 친화도(affinity)를 분석한 결과이고, 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 CD3ε에 대한 친화도를 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 암 세포에서의 항원 결합 친화도(K_d 값)를 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 5a는 Mam-BiTE1의 HER1 과발현 세포(A-431)에서의 HER1 항원에 대한 항원 결합 친화도(K_d 값)를 나타내는 것이고, 도 5b는 Mam-BiTE1의 CD3ε 발현 세포(PBMC)에서의 CD3에 대한 항원 결합 친화도(K_d 값)를 나타내는 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.

본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(Nmethylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:

알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.

본 발명에서 사용되는 용어 “scFv(single chain fragment variable)”는 유전자 재조합을 통해 항체의 가변영역만을 발현시켜 만든 단쇄 항체를 말하며, 항체의 VH 영역과 VL 영역을 짧은 펩티드 사슬로 연결한 단일쇄 형태의 항체를 말한다. 상기 용어 “scFv”는 달리 명시되지 않거나, 문맥상 달리 이해되는 것이 아니라면, 항원 결합 단편을 비롯한 scFv 단편을 포함하고자 한다. 이는 통상의 기술자에게 자명한 것이다.

이중특이적 항체

일 측면에서, 본 발명은 개과 동물의 HER1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 개과 동물의 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체에 관한 것이다.

본 명세서에서, 상기 개과 동물은 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 개일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "이중특이적 항체"는 동일한 항원 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프들에 각각 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다.

본 발명의 이중특이적 항체는 BiTE(이중특이적 T 세포 관여자) 항체일 수 있다. 상기 BiTE 항체는 두 개의 유연하게 연결된 항체 유도 결합 도메인으로부터 만들어진 재조합 단백질로서, 제1 결합 도메인은 개과 동물의 HER1에 특이적이고; 제2 결합 도메인은 개과 동물의 CD3, 즉 T 세포 상의 T 세포 수용체 복합체의 서브유닛에 대하여 특이적이다.

본 발명에 따른 구체적인 실시 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 HER1 과발현 종양 세포 표면 항원 및 T 세포 표면 항원에 동시적으로 결합할 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 HER1 과발 종양 세포 표면 항원 및 T 세포 표면 항원에 동시적으로 결합함으로써 T 세포와 종양 세포를 가교결합시킬 수 있다. 이러한 동시적인 결합은 종양 세포의 용해 및 T 세포의 활성화를 야기할 수 있다. 한 실시 양태에서, 표적 세포 항원과의 동시적인 결합의 부재 하에서의 상기 이중특이적 항체와 T 세포 표면 항원의 결합은 T 세포 활성화를 야기하지 않는다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 종양의 부위에서 특이적으로 면역 반응을 유발하여 결과적으로 표적 세포의 아폽토시스를 야기할 수 있다.

한 실시 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 방향 전환시킬 수 있다. 구체적인 실시 양태에서, 상기 방향 전환은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.

상기 이중특이적 항체는 개과 동물의 HER1 및 CD3에 특이적으로 결합하는 HER1×CD3 이중특이적 항체일 수 있다.

바람직하게는, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체는 Mam-BiTE1이라고 지칭될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 제1 결합 도메인은 개과 동물의 HER1에 특이적으로 결합하는 항-HER1 scFv일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

상기 HER1은 인간뿐만 아니라 개과 동물의 유선암 등에서도 발현이 확인되는 막단백질이다. HER1에 결합하여 암세포의 성장을 억제하는 단클론항체 의약품인 세툭시맙(Cetuximab)은 세계적으로 가장 판매량이 높은 항체 의약품 중 하나이며, HER1에 대한 표적성이 매우 우수하다. 상기 세툭시맙의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 링커로 연결하여 Mam-BiTE1의 항-개과 동물 HER1 scFv(anti-canine HER1 scFv) 서열로 사용하였다.

일 구현예에서, 상기 제2 결합 도메인은 개과 동물의 CD3ε에 특이적으로 결합하는 항-개과 동물 CD3ε scFv(anti-canine CD3ε scFv)일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 상기 제2 결합 도메인은 T 세포 항원과의 상호작용을 통해 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 유발함으로써 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 이중특이적 항체 Mam-BiTE1가 개과 동물의 CD3ε에 대하여 우수한 항원 결합력을 나타내는 반면, 인간의 CD3를 표적하는 인간 암 치료제인 블리나투모맙은 아무런 항원 결합력을 나타내지 않는 것을 구체적으로 확인하였다 (도 4b 참조).

일 구현예에서, 상기 상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 링커를 통해 연결된 것일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 정제를 위해 6X His tag를 더 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 개과 동물의 T 세포 및 HER1 발현 암세포에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체는 항-HER1 scFv에 의한 개과 동물의 HER1에 대한 표적성 및 항-CD3 scFv에 의한 개과 동물의 CD3에 대한 표적성을 동시에 발현할 수 있다.

또한, 본 발명의 이중특이적 항체는 인간의 HER1를 표적하는 인간 암 치료제인 세툭시맙(Cetuximab)에 비해 HER1에 대한 항원 결합 친화도가 더욱 높고, 인간의 CD3를 표적하는 인간 암 치료제인 블리나투모맙(Blinatumomab)에 비해 개과 동물의 CD3에 대한 항원 결합 친화도가 더욱 높으므로, 개과 동물의 암을 예방 또는 치료하는 효과가 높을 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 항체를 HER1 과발현 암이 발병된 개과 동물에 적용하는 경우 기존 인간 항암 치료제의 적용으로 인한 낮은 수준의 완치율을 현저히 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

본 명세서에서, "친화도(affinity)"는 항체의 결합 도메인과 항원 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명에서 사용된 "결합 친화도"는 항체 및 항원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 항원에 대한 항체의 친화도는 일반적으로 평형해리상수 K_d로 표시될 수 있다.

폴리뉴클레오티드

다른 측면에서, 본 발명은 상기 이중특이적 항체를 코팅하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 명세서에서, "폴리뉴클레오티드"란 용어는 비변형 RNA 또는 DNA 또는 변형 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일쇄의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 명세서에 사용된, "폴리뉴클레오티드"란 용어는 변형 염기 및/또는 독특한 염기, 예컨대 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 상기 DNA 또는 RNA의 경우 공지된 유용한 목적을 제공하는 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 자명하다. 본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오티드"란 용어는 이러한 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

당업자들은 유전자 암호의 축퇴성으로 인해 상기의 이중특이적 항체가 여러 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있음을 알고 있을 것이다. 즉, 본 발명에서 이용 가능한 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함되는 것으로 해석된다. 바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. "분리된" 폴리뉴클레오티드란 용어는 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA와 같은, 이에 국한되지 않는 다른 핵산 서열이 거의 없는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 당업자에게 공지된 통상의 핵산 정제방법을 사용할 수 있다. 또한, 이 용어는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드도 포함한다.

이중특이적 항체 발현용 발현 시스템

발현 벡터

다른 측면에서, 본 발명은 상기 개과 동물의 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어, “발현 (expression)”이란 세포에서의 이중특이적 항체의 생성을 의미한다.

본 명세서에서 용어, “발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 상기 이중특이적 항체를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 발현 벡터는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어, “작동가능하게 연결된 (operably linked)”은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 상기 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 상기 이중표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결되어 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

일 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다 (Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).

본 발명의 발현벡터는 플라스미드, 벡터 또는 바이러스 벡터를 이용하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있고, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 발현벡터는 pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, pPICZαB, pPICZαC, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, pPIC6αB, pPIC6αC, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 및 pHIL-S1 중에서 선택되는 어느 하나의 피키아 파스토리스 유래의 벡터, 바람직하게는 pHIL-S1 벡터를 이용하여 제조되는 것이 효과 면에서 바람직하다. 구체적으로, 상기 pHIL-S1 벡터는 피키아 파스토리스에서 발현 시 목적 단백질을 배지로 분비하므로 목적 단백질의 정제에 더욱 유리하다.

일 구현예에서, 유전자가 작동가능하게 결합하는 프로모터는 AOX1 프로모터, GAPDH 프로모터, PHO5 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(TDH3) 프로모터, ADHI 프로모터, MFα1 프로모터, 및 GAL10 프로모터로 구성된 군에서 선택된다. AOX1 프로모터를 포함하는 플라스미드의 예로는 발현 플라스미드 pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K가 있다. 이들 플라스미드는 서열중, AOX1 프로모터, 구조 유전자를 삽입시키는 제한 부위, AOX1 전사 종결 단편, HIS4(히스티디놀 탈수소효소)를 암호화하는 개방 해독틀, 암피실린 내성 유전자 등을 포함한다.

일 구현예에서, 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드의 업스트림에 피키아 파스토리스 유래 PHO-1 분비 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 PHO-1 분비 신호 펩티드를 포함하는 경우, 발현되는 단백질을 세포 밖으로 안정적으로 분비시킬 수 있어 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 발현벡터는 도 2에 기재된 pHIL-S1의 개열지도로 표시될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 도 1에 기재된 pHIL-S1의 개열지도로 표시되는 발현벡터에는 발현된 단백질을 효모 밖으로 분비시키는 PHO-1 분비 신호 펩티드가 포함되어 있고, HIS4를 암호화하는 개방 해독틀, 암피실린 내성 유전자 등을 포함하고 있어서 숙주 내로의 형질 도입 여부를 확인할 수 있는 표지로 이용 가능하다. 따라서, 삽입되는 이중특이적 항체 유전자가 발현되면서 단독으로 숙주 밖으로 분비되기에, 고순도의 이중특이적 항체를 간단하게 분리할 수 있다.

숙주세포

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 숙주세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다. 이때 형질전환 방법으로는 통상의 방법인 예를 들어 전기천공법, 인산칼슘법, 스페로플라스트, 염화리튬법 등을 이용할 수 있다.

약학 조성물

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 이중특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 “이중특이적 항체”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

일 구현예에서, 상기 암은 HER1 과발현 암 또는 HER1 양성 암일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 암은 유방암, 대장암, 결장암, 간암, 비-호지킨 림프종, 림프종, 췌장암, 폐암, 위암, 전립선암, 뇌종양, 망막아세포종, 난소암, 자궁경부암, 조혈 악성종양, 식도암, 신장 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 신경교종 및 백혈병 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 유방암, 유선암, 난소암, 자궁경부암, 폐암 및 전립선암 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 유방암 또는 유선암일 수 있고, 가장 바람직하게는 유선암일 수 있다. 상기 유방암, 유선암, 난소암, 자궁경부암, 폐암 또는 전립선암은 HER1 발현 또는 과발현을 특징으로 한다.

본 명세서에서 용어 “유효성분으로 함유하는”이란 상기 이중특이적 항체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 이중특이적 항체의 1일 투여량은 0.005 내지 500 mg/㎡일 수 있고, 바람직하게는 0.05 내지 50 mg/㎡, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/㎡, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/㎡일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체의 투여량의 상기 하한치 미만인 경우에는 암의 개선 또는 치료 효과가 원하는 정도로 나타나지 않을 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 투여량이 증가하는 만큼 암의 치료 효과가 증가하지 않거나 독성이 있을 수 있어 바람직하지 않다. 한편, 동물 실험 결과, 본 발명의 이중특이적 항체의 투여량이 상기 범위인 경우에는 유의적인 효과가 나타나면서도 세포독성 등의 부작용이 나타나지 않았다.

본 발명의 용어 "예방"이란, 상기 암을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 암의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독 투여할 수도 있고 또는 다른 치료제와 병용 투여할 수도 있다. 이러한 제제는 동일한 약제의 일부로서 포함될 수 있다. 이러한 제제의 일예는 세툭시맙 등의 항암 치료제이다.

이중특이적 항체의 제조방법

다른 측면에서, 본 발명은 (1) 개과 동물의 HER1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 개과 동물의 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제작하는 단계; (2) 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; (3) 상기 발현벡터로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환시키는 단계; 및 (4) 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 배양하여 이중특이적 항체의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는 이중특이적 항체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 “이중특이적 항체”, “폴리뉴클레오티드”, 및 “발현벡터”에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

상기 (4) 단계에서는 상기 형질전환된 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 배양하여 이중특이적 항체의 발현을 유도한다.

상기 형질 전환된 피키아 파스토리스는 배양 과정에서 이중특이적 항체를 생산하는 최적의 클론을 선별할 수 있다.

본 발명에서, 상기 이중특이적 항체의 발현은 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 ① 종균 배양한 후, ② 메탄올 첨가를 통해 발현을 유도하는 방법에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 이중특이적 항체의 발현은 먼저, ① 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 buffered glycerol-complex medium(BMGY)에서 30℃ shaking incubator를 사용하여 48시간 동안 종균 배양한 다음, 원심분리하고 효모를 회수하여 다시 ② buffered methanol-complex medium(BMMY)에 OD600이 1.0이 되도록 분산시킨 후 15℃ shaking incubator에서 배양하면서 매 24시간 마다 메탄올을 첨가하고 5~6일간 배양하여 발현을 유도시키는 방법으로 이루어질 수 있다. 이때, 상기 BMGY 배지는 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 및 1% Glycerol로 구성된 것일 수 있다. 또한, 상기 BMMY 배지는 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 및 0.5% Methanol로 구성된 것일 수 있다.

본 발명은 상기 메탄올을 이용한 발현 유도 과정에서, 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 10 내지 37 ℃, 바람직하게는 12 내지 30 ℃, 더욱 바람직하게는 14 내지 20 ℃, 가장 바람직하게는 14 내지 18 ℃에서 50 내지 200 시간, 바람직하게는 100 내지 200 시간, 더욱 바람직하게는 120 내지 150 시간 동안 배양하는 것이 바람직하다.

상기 피키아 파스토리스의 배양 온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 Pichia Pastoris의 생장에 문제가 생길 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 단백질 분해효소에 의해 목적하는 단백질이 분해되는 문제가 생길 수 있다.

또한, 상기 배양 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 단백질이 충분히 생산되지 않으며, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 단백질 침천 및 분해되는 문제가 생길 수 있다.

또한, 상기 형질전환된 피키아 파스토리스의 단백질 발현을 위하여, 상기 배양 배지 내의 메탄올을 최종농도 0.5 %~1.0 %(w/w)로 공급하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 기간 동안 24 시간 마다 메탄올을 계속 공급하는 것이 바람직하다.

원하는 단백질을 생산하는 상기 피키아 파스토리스 세포주는 현탁 배양 또는 다양한 고체 지지체 상에서 대량으로 증식될 수 있다. 상기 지지체의 예는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스를 기초로 한 마이크로 캐리어, 또는 중공 파이버 형태 또는 다양한 세라믹 재료 형태의 고체 지지체이다. 세포 현탁 배양에서 증식되거나 마이크로 캐리어에서 증식될 때, 상기 세포주의 배양은 배쓰(bath) 배양 또는 장시간에 걸쳐 조건 배지가 연속 생산되는 관류 배양으로서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 상기 세포주는 원하는 상기 항체 단백질을 생산하기 위한 산업용 공정의 개발에 매우 적합하다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: 이중특이적 항체(Mam-BiTE1)의 제조

1-1: 이중특이적 항체(Mam-BiTE1)의 제작

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 이중특이적 항체(Mam-BiTE1)를 진위즈(GENEWIZ, US)에 의뢰하여 합성하였다.

1-2: Mam-BiTE1 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작

E.Coli Top10를 플라스미드 벡터의 증식을 위한 숙주로 사용하였고, 플라스미드 벡터를 구축하고 클로닝하기 위해 pHIL-S1 플라스미드 벡터(Invitrogen)를 골격 벡터로 사용하였다.

상기 실시예 1-1에서 합성된 항체 유전자를 XhoI과 BamHI 효소로 37℃에서 반응시켜 절단한 다음, T4 DNA ligase(NEB사)를 이용하여 동일한 제한효소로 처리된 pHIL-S1 벡터(도 1 참조)와 ligation함으로써 재조합 발현벡터 Mam-BiTE1/pHIL-S1(도 2 참조)을 제조하였다.

도 2는 본 발명에 따른 Mam-BiTE1/pHIL-S1 발현벡터의 개열지도이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 아미노산 서열(Mam-BiTE1)은 AOX1 프로모터의 제어 하에 pHIL-S1 벡터의 XhoⅠ/BamHⅠ 제한효소 절단 부위에 삽입되었다.

1-3: 형질전환

Pichia Pastoris GS115(Invitrogen)을 상기 (1)에서 합성된 Mam-BiTE1 유전자의 발현 및 정제를 위한 숙주세포로 사용하였다.

상기 실시예 1-2 단계에서 제조한 Mam-BiTE1/pHIL-S1 발현벡터를 spheroplasting 방법을 통해 피키아 파스토리스 GS115에 도입하여 형질전환체 GS115-Mam-BiTE1 클론을 수득하였다.

1-4: 발현 유도

상기 실시예 1-3 단계에서 제조된 형질전환체 GS115-Mam-BiTE1을 히스티딘 결핍 고체배지에 도말하여 6일간 배양한 후, colony PCR을 통해 우량 세포주를 선별하였다.

이후, 상기 선별된 우량 세포주를 BMGY(buffered glycerol-complex medium) 배지에서 28 ℃, 200 rpm에서 종균 배양(seed culture)하였다. 이때, BMGY 배지는 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 및 1% Glycerol로 구성된 것이다.

다음으로, 상기 배양액들을 원심분리(3,000xg, 10 mins)하여 각각의 형질전환체를 회수한 후 다시 BMMY(buffered methanol-complex medium) 배지에 O.D.600 (Optical Density at 600 nm) = 1.0이 되도록 접종한 뒤 24시간 간격으로 MeOH을 1%가 되도록 처리하여 발현을 유도하였으며, 이를 28 ℃에서 6일간 배양하였다. 상기 BMMY 배지는 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 및 0.5% Methanol로 구성된 것이다.

1-5: 분리 및 정제

상기 실시예 1-4 단계에서 얻은 배양액들을 원심분리(3,000xg, 10 mins)하여 상등액을 분리한 후 0.22㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. 상기 여과액을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 수지(Thermo Scientific, Cat # 88222)로 정제하였다. 상기 Ni-NTA 수지는 세척 완충액(10 mM Imidazole in PBS (pH 7.4))으로 예비-평형화시켰다. 이후, 상기 여과액 1000 mL와 예비-평형화된 Ni-NTA 수지를 3 ml/min 속도로 약 5.6 시간 동안 반응시키고 완충액으로 평형화될 때 까지 약 50 ml으로 세척한 후, Mam-BiTE1 단백질을 500 mM Imidazole in PBS (pH 7.4)로 농도 기울기를 주며 용리시켰다. 용리된 분획을 수집하고 12 % SDS-PAGE 겔로 분석하였다. 상기 Mam-BiTE1은 쿠마시 블루 R250 염색에 의해 확인되었다(도 3 참조).

상기 SDS-PAGE 분석 결과(도 3)에서, Blinatumomab은 양성대조군으로 이용되었고, Mam-BiTE1(HER1XCD3 이중특이적 항체)는 25개의 분획으로 각 2 ml씩 용리되었다. 이때, Mam-BiTE1 발현율이 가장 높은 분획 (#10 - #18)이 추가 연구를 위한 샘플로 이용되었다.

시험예 1: Mam-BiTE1의 분자량 및 순도 확인

본 발명의 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 분자량 및 순도를 확인하고자 하였다.

이를 위하여, 본 발명의 실시예에 따른 Mam-BiTE1 샘플을 centricon으로 농축한 뒤, thermo fisher scientific 사의 nanodrop을 이용해 농도를 측정하여 단백질을 정량하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에서 얻은 Mam-BiTE1의 Ni-NTA 친화성 gradient chromatography curve 및 SDS-PAGE 분석 결과이다. 도 3A는 본 발명의 일 실시예에 따른 AKTA 프라임을 이용한 Ni-NTA 친화성 gradient chromatography curve를 나타낸 것이고, 도 3B는 본 발명의 일 실시예에 따라 발현된 Mam-BiTE1의 SDS-PAGE 분석 결과이다. 상기 도 3B에서, 레인 M은 prestained 단백질 마커(BioFACT, SM307 -500)이고; 레인 1~25는 0.5 % 메탄올에 의해 발현 유도되고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 구배 정제된 Mam-BiTE1을 나타낸다.

상기와 같이 최종적으로 정제한 Mam-BiTE1 protein을 SDS-PAGE gel로 확인한 결과 순도가 95% 이상인 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 발현 시스템은 배지에 단백질이 분비되는 시스템이므로 정제에 유리하고, Ni affinity resin으로 쉽게 정제가 가능한 것을 확인할 수 있다.

시험예 2: 항원에 대한 친화도(affinity) 분석 - ELISA 분석

본 발명의 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 항원에 대한 친화도(결합력)를 알아보기 위하여 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA)를 수행하였다.

먼저, 인간 HER1 단백질에 대한 항원결합력을 확인하였다.

구체적으로, 인간 HER1 (Human Epidermal growth factor receptor1)(Acro biosystem, EGR-H522a) 단백질을 코팅 버퍼 (200 mM Na₂CO₃, 200 mM NaHCO₃, pH 9.6) 완충액에 500 ng/mL로 희석하고, 100 ㎕씩 96well ELISA plate에 분주하여 4 ℃에서 밤새 흡착시켰다. 이후, PBS-T (PBS, 0.05% Tween20) 완충액을 이용하여 3회 세척하여 흡착되지 않은 HER1 항원을 제거하였다. 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)을 각각의 well에 100 ㎕씩 넣고 실온에서 1시간 처리하여 블로킹한 후 블로킹 용액을 제거하였다. 이후, 각각의 well에 1차 항체로서 세툭시맙 (Cetuximab), 블리나투모맙 (Blinatumomab) 및 Mam-BiTE1 단백질을 각각 최소 1 pM부터 최대 40 nM의 농도로 100 ㎕씩 넣고 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 그리고, PBS-T (PBS, 0.05% Tween20) 완충액을 이용하여 3회 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 이후, 각각의 well에 2차 항체로서 Protein L-HRP (Genscript, M00098)를 50 ng/mL의 농도로 100 ㎕씩 넣고 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 그리고, PBS-T (PBS, 0.05% Tween20) 완충액을 이용하여 3회 세척하여 결합하지 않은 Protein L-HRP를 제거하였다. 또한, 각각의 well에 1.5% H₂O₂를 포함하는 TMB를 100 ㎕씩 넣고 상온에서 30분 동안 처리하여 발색반응을 유도하였다. 이후, 각각의 well에 1M HCl 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이후, 분광광도계(Thermo scientific, Multiskan GO, USA)를 이용하여 O.D _450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 각 농도에서의 측정값과 표준편차를 Prism8 프로그램을 이용하여 도표화 하였다.

이후, 동일한 방법으로 개과 동물의 CD3ε 단백질 (sinobiological, 70106-D02H)에 대한 항원결합력을 확인하였다.

도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 HER1 항원에 대한 친화도(affinity)를 분석한 결과이고, 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 CD3ε에 대한 친화도를 분석한 결과이다.

상기 도 4a 및 도 4b를 살펴보면, 본 발명의 Mam-BiTE1이 in vitro에서 HER1 및 CD3ε 각각에 결합하는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과는 본 발명의 Mam-BiTE1이 HER1 및 CD3ε를 이중으로 표적하는 항체임을 나타낸다.

구체적으로, 본 발명의 Mam-BiTE1이 양성 대조군인 세툭시맙에 비해 HER1에 대하여 현저히 우수한 항원 결합능 (Kd: 68.5 pM)을 가지는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 Mam-BiTE1이 개과 동물의 CD3ε에 대하여 우수한 항원 결합력 (Kd: 60.14 nM)을 가지는 것을 확인할 수 있다. 한편, 음성 대조군인 블리나투모맙은 인간의 CD3 및 CD19를 표적하는 항체이고, 상기 개과 동물의 CD3ε에 대하여 아무런 항원 결합력을 나타내지 않았다.

시험예 3: 암 세포에 대한 표적화 능력 분석 - Flow Cytometry 분석

본 발명의 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 암 세포에 대한 표적화 능력을 알아보기 위하여 유세포 분석(Flow cytometry analysis: FCM analysis)을 수행하였다.

먼저, HER1 과발현 세포주 A431에 대한 결합 친화성을 확인하였다.

37 ℃, 5% CO₂ 환경의 배양접시에서 배양된 A431 세포를 세척하고 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)에 재현탁하여 10⁶ 개씩 96 well γ-type bottom plate에 분주하였다. 이후, 각각의 well에 1차 항체로서 세툭시맙, Mam-BiTE1, 블리나투모맙을 각각 최소 0.1 nM부터 최대 1000 nM의 농도로 4 ℃에서 2시간 동안 처리하였다. 상기 처리된 세포를 4 ℃, 500 g으로 5분간 원심분리한 후 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)에 재현탁하였다. 이후, 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)로 2회 세척하였다. 다음으로, 2차 항체로서 FITC 표지된 Protein L-HRP를 1/1000으로 희석한 후 100 ㎕씩 넣고 4 ℃ 암실에서 1시간 동안 처리하였다. 그리고, 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)로 2회 세척하였다. 처리된 세포를 4 ℃, 500 g으로 5분간 원심분리후 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin) 300 ㎕에 재현탁하였다. 이후, FACSCalibur flow cytometer (BD, USA)를 이용해 Flow cytometry data를 측정하고 측정값과 표준편차를 Prism8 프로그램을 이용하여 도표화하였다.

이후, 동일한 방법으로 CD3ε 발현 세포인 개의 PBMC (Peripheral blood mononuclear cells)에 대한 결합친화성을 확인하였다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Mam-BiTE1의 암 세포에서의 항원 결합 친화도(K_d 값)를 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 5a는 Mam-BiTE1의 HER1 과발현 세포(A-431)에서의 HER1 항원에 대한 항원 결합 친화도(K_d 값)를 나타내는 것이고, 도 5b는 Mam-BiTE1의 CD3ε 발현 세포(PBMC)에서의 CD3에 대한 항원 결합 친화도(K_d 값)를 나타내는 것이다.

상기 도 5a 및 도 5b를 살펴보면, 본 발명의 Mam-BiTE1이 in vitro에서 HER1 과발현 세포주 A431 및 CD3ε 발현 세포 PMBC 각각에 결합하는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과는 본 발명의 Mam-BiTE1이 HER1 과발현 세포주 A431 및 CD3ε 발현 세포 PMBC를 이중으로 표적하는 항체임을 나타낸다.

구체적으로, 본 발명의 Mam-BiTE1이 A431 세포주에 대하여 우수한 결합친화도 (Kd: 27 nM)를 가지는 것을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 Mam-BiTE1이 개의 PBMC에 결합하는 것을 확인할 수 있다. 한편, 음성 대조군인 블리나투모맙은 아무 결합력을 나타내지 않았다.

상기 실험 결과들로부터, 본 발명의 이중특이적 항체가 개과 동물의 HER1 및 CD3 각각에 대하여 항원 결합력을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 이중특이적 항체가 개과 동물의 암종에 특화된 항암 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> BISPECIFIC ANTIBODY THAT SPECIFICALLY BINDS TO HER1 AND CD3 OF CANINES AND USE THEREOF <130> HP10411 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CANNINE HER1xCD3 BISPECIFIC ANTIBODY <400> 1 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln 115 120 125 Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys 130 135 140 Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly 165 170 175 Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn 180 185 190 Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln 195 200 205 Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr 210 215 220 Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ala Gly Gly Gly Gly Ser Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn 245 250 255 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ile Cys Ser Gly Gly Ala Thr Phe Ala 260 265 270 Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala 275 280 285 Pro Val Thr Val Ile Tyr Gln Asn Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro 290 295 300 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile 305 310 315 320 Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Phe 325 330 335 Asp Ser Ser Asn Pro Ala Leu Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val 340 345 350 Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly 355 360 365 Gly Gly Ser Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr 370 375 380 Pro Gly Gly Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu 385 390 395 400 Ser Gly His Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 405 410 415 Glu Tyr Val Ala Ser Ile Ser Ser Asn Thr Gly Tyr Lys Thr Tyr Tyr 420 425 430 Ala Pro Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln 435 440 445 Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly 450 455 460 Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Asn Ile Gly Ser Gly Asn Lys Ile Gly Pro 465 470 475 480 Tyr Ile Asp Ala Trp Gly Arg Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr 485 490 495 Ser His His His His His His 500 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER1 scFv <400> 2 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln 115 120 125 Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys 130 135 140 Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly 165 170 175 Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn 180 185 190 Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln 195 200 205 Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr 210 215 220 Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ala <210> 3 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B7 <400> 3 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys 1 5 10 15 Ile Ile Cys Ser Gly Gly Ala Thr Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asn Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Phe Asp Ser Ser Asn Pro Ala 85 90 95 Leu Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg 100 105 110 Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Thr 115 120 125 Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Leu Ser 130 135 140 Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Gly His Gly Met Gly 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ala Ser Ile 165 170 175 Ser Ser Asn Thr Gly Tyr Lys Thr Tyr Tyr Ala Pro Ala Val Lys Gly 180 185 190 Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln 195 200 205 Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Lys 210 215 220 Asn Ile Gly Ser Gly Asn Lys Ile Gly Pro Tyr Ile Asp Ala Trp Gly 225 230 235 240 Arg Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser 245 250 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker connecting HER1 scFv and B7 <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 1509 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CANNINE HER1xCD3 BISPECIFIC ANTIBODY <400> 5 gatatattat taacgcagag tccagtcatc ctgtcagttt cacctggtga acgtgttagt 60 ttcagttgcc gtgcatccca atccattgga actaatatcc actggtatca gcagagaact 120 aatggcagtc caaggttact aataaagtac gcttcagaat ctatctccgg cataccttcc 180 agattttctg gttctggttc tggaacggac tttacccttt ctattaattc tgtagagtcc 240 gaagatattg ccgattatta ctgtcaacaa aataataact ggcccaccac gttcggcgcc 300 ggtaccaagt tagaactaaa aggtggtggc ggtagtggtg gtggcggttc tggaggcgga 360 ggctcacagg tgcagctgaa acagtccggc ccaggactag ttcaaccatc ccaatcactt 420 tcaataacct gtactgtatc aggattctca ttaaccaact acggcgtcca ctgggtccgt 480 cagagtcccg gtaaaggctt ggaatggcta ggcgtaatat ggagtggcgg taacacagac 540 tacaataccc cctttacatc ccgtttaagt attaataaag ataattcaaa gtctcaagtc 600 ttctttaaaa tgaactccct tcagtccaat gatacagcaa tctactactg cgctagggct 660 cttacatatt atgactatga atttgcatac tggggtcagg gaactctggt aacagtaagt 720 gctggaggtg gaggatccct tactcaaccc tcatccgtct ctgccaatcc aggagagaca 780 gtcaagatta tctgctccgg tggcgctaca ttcgcaggat cttattacta tggctggtat 840 caacagaagt cccctggatc tgccccagtt actgtgatct accaaaatga caagagacca 900 tctgacatac cttctaggtt ctccggttcc acttccggca gtacaggcac tctaactatt 960 actggcgtgc aagccgaaga tgaagccgtt tatttttgcg gttcctttga ctcatctaat 1020 cctgcattgt tcggcgcagg cacaacgctg accgtgttag gccaatcctc taggtcttct 1080 tcaggcggcg gttcaagtgg cggaggaggt tctgccgtga ccctagatga gagtggtggc 1140 ggtcttcaaa cgcccggtgg tggcttgagt ttagtgtgca aggcttccgg ttttactcta 1200 agtggacatg gaatgggctg ggttagacag gcaccaggca agggcttgga gtatgtcgca 1260 agtatatctt caaatacagg ctataagacc tattatgccc cagcagtaaa gggccgtgct 1320 actataagta gagataatgg ccaatccact gtacgtctgc agttgaataa cttacgtgca 1380 gaggatacgg gcatatactt ctgtgccaag aatattggtt ccggaaataa gataggaccc 1440 tatatagatg cttggggaag gggtactgag gtgattgttt cctctacgtc tcatcatcat 1500 catcaccac 1509

Claims (18)

1. 개과 동물의 HER1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 개과 동물의 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체.
2. 제1항에 있어서,
   상기 이중특이적 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체.
3. 제1항에 있어서,
   상기 제1 결합 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체.
4. 제1항에 있어서,
   상기 제2 결합 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체.
5. 제1항에 있어서,
   상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체.
6. 제5항에 있어서,
   상기 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체.
7. 제1항에 있어서,
   상기 이중특이적 항체는 개과 동물의 T 세포 및 HER1 발현 암세포에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-HER1/항-CD3 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
9. 제8항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
10. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
11. 제10항에 있어서,
    상기 벡터는 pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, pPICZαB, pPICZαC, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, pPIC6αB, pPIC6αC, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 및 pHIL-S1 중에서 선택되는 어느 하나의 피키아 파스토리스 유래의 벡터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
12. 제10항에 있어서,
    상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드의 업스트림에 피키아 파스토리스 유래 PHO-1 분비 신호 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
13. 제10항에 있어서,
    상기 발현벡터는 도 2에 기재된 pHIL-S1의 개열지도로 표시되는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
14. 제10항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
15. 제14항에 있어서,
    상기 숙주세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
16. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 이중특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
17. 제 16항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 대장암, 결장암, 간암, 비-호지킨 림프종, 림프종, 췌장암, 폐암, 위암, 전립선암, 뇌종양, 망막아세포종, 난소암, 자궁경부암, 조혈 악성종양, 식도암, 신장 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 신경교종 및 백혈병 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
18. (1) 개과 동물의 HER1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 개과 동물의 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제작하는 단계;
    (2) 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계;
    (3) 상기 발현벡터로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환시키는 단계; 및
    (4) 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 배양하여 이중특이적 항체의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는 이중특이적 항체의 제조방법.

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