KR20230099307A - 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법 - Google Patents

자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법에 관한 것으로서, 생물학적 시료에서 핵산의 분리가 가능한 용해 버퍼(lysis buffer)가 포함된 제1용기에 샘플 시료를 투입하는 단계와; 상기 제1용기에 투입된 상기 샘플 시료로부터 핵산을 분리하는 단계와; 상기 제1용기에 자성 비드를 투입하고, 분리된 핵산을 상기 자성 비드에 부착하는 단계와; 핵산이 부착된 상기 자성 비드를 세척하는 단계와; 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 고체상의 왁스층과 용리 버퍼(elution buffer)가 순차적으로 적층된 제2용기의 상기 용리 버퍼에 핵산이 부착된 세척한 상기 자성 비드를 공급하는 단계와; 상기 제2용기의 상기 용리 버퍼에 공급된 상기 자성 비드로부터 상기 핵산을 용리하는 단계와; 핵산이 용리된 상기 자성 비드를 회수하는 단계와; 고체상의 상기 왁스층을 용해하는 단계와; 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 핵산이 용리된 상기 용리 버퍼가 혼합된 혼합 용액을 액체상의 상기 왁스층과 층분리하는 단계와; 상기 제2용기에서 상기 혼합 용액에 함유된 핵산을 증폭시키는 단계와; 상기 제2용기의 액체상의 상기 왁스층을 상온에서 고화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법 {NUCLEIC ACID EXTRACTION AND AMPLIFICATION METHOD USING MAGNETIC BEADS}
본 발명은 자성 비드를 이용하여 핵산을 추출하고 또한 추출되어지는 용기에서 동시에 핵산 증폭이 이루어지는 방법에 관한 것이다.
핵액이나 혈장 또는 소변 등의 여러 다양한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하고 추출된 핵산을 이용하여 증폭하는 절차는 진단 의학, 분자 생물학 또는 여러 분야에서 다양하게 사용되고 있다.
특히, 최근 Covid-19의 발발로 여러 가지 병원균의 빠르고 간편한 분자 진단 점점 중요하게 대두되어지고 있다.
이러한 요구에 충족하기 위해 핵산 추출과 핵산 증폭을 하나의 장비에서 실시할 수 있는 기술(U.S. Pat. No. 8048386B2(2011))를 응용한 올인원(all-in-one) 장비들이 개발되었다.
그런데, 종래의 올인원 장비는 장비 당 샘플 출력 수가 제한되어 있고, 진단 키트의 복잡성 때문에 진단 키트 단가가 고가여서, 일상적인 진단에 사용되지 않는 실정이다.
이러한 문제점을 개선하기 위해, 추출 후 용리(elution) 과정을 증폭 시약에서 실시하는 선행기술이 한국 공개특허공보 제10-2015-0107374호에 개시되어 있다.
선행기술에 개시된 바와 같이, 종래에는 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법을 오일 커버층이 형성된 핵산 증폭 시약(PCR Pre-mix)에서 핵산을 용리하는 과정으로 오일 커버층을 이용하여 핵산 증폭할 때, 용기의 상층을 캐핑(capping)하는 과정을 생략할 수 있게 하였다.
그러나, 이와 같이 용리를 핵산 증폭 시약에서 이루려는 과정은 핵산 증폭에 꼭 필요한 Tris-HCl, KCl 그리고 MgCl₂등의 화학적 성분이 용리 과정을 방해할 뿐만 아니라 용리 과정 중에 핵산 증폭 효소(polymerase)의 비특이 증폭(Non-specific nucleic acid amplification)의 가능성이 대두되어진다.
미국 특허 US8048386B2 (2011) 한국 공개특허공보 제10-2015-0107374호(2015.09.23.)
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 하나의 시스템에서 핵산 추출과 핵산 증폭이 중단없이 원 스텝(one-step)으로 이루어지며, 간편하고 신속한 진단이 가능할 뿐만 아니라 증폭된 핵산의 오염 방지가 가능한 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은, 생물학적 시료에서 핵산의 분리가 가능한 용해 버퍼(lysis buffer)가 포함된 제1용기에 샘플 시료를 투입하는 단계와; 상기 제1용기에 투입된 상기 샘플 시료로부터 핵산을 분리하는 단계와; 상기 제1용기에 자성 비드를 투입하고, 분리된 핵산을 상기 자성 비드에 부착하는 단계와; 핵산이 부착된 상기 자성 비드를 세척하는 단계와; 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 고체상의 왁스층과 용리 버퍼(elution buffer)가 순차적으로 적층된 제2용기의 상기 용리 버퍼에 핵산이 부착된 세척한 상기 자성 비드를 공급하는 단계와; 상기 제2용기의 상기 용리 버퍼에 공급된 상기 자성 비드로부터 상기 핵산을 용리하는 단계와; 핵산이 용리된 상기 자성 비드를 회수하는 단계와; 고체상의 상기 왁스층을 용해하는 단계와; 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 핵산이 용리된 상기 용리 버퍼가 혼합된 혼합 용액을 액체상의 상기 왁스층과 층분리하는 단계와; 상기 제2용기에서 상기 혼합 용액에 함유된 핵산을 증폭시키는 단계와; 상기 제2용기의 액체상의 상기 왁스층을 상온에서 고화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법에 의해 달성될 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 다른 실시예로서, 생물학적 시료에서 핵산의 분리가 가능한 용해 버퍼(lysis buffer)가 포함된 제1용기에 샘플 시료를 투입하는 단계와; 상기 제1용기에 투입된 상기 샘플 시료로부터 핵산을 분리하는 단계와; 상기 제1용기에 자성 비드를 투입하고, 분리된 핵산을 상기 자성 비드에 부착하는 단계와; 핵산이 부착된 상기 자성 비드를 세척하는 단계와; 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스가 고체상의 왁스층 내부에 포함(Embedded) 되어 있고 상부 영역에 용리 버퍼(elution buffer)가 투입되어 있는 제2용기의 상기 용리 버퍼에 핵산이 부착된 세척한 상기 자성 비드를 공급하는 단계와; 상기 제2용기의 상기 용리 버퍼에 공급된 상기 자성 비드로부터 상기 핵산을 용리하는 단계와; 핵산이 용리된 상기 자성 비드를 회수하는 단계와; 고체상의 상기 왁스층을 용해하는 단계와; 상기 핵산 증폭 시약과 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하고 핵산이 용리된 상기 용리 버퍼가 혼합된 혼합 용액을 액체상의 상기 왁스층과 층분리하는 단계와; 상기 제2용기에서 상기 혼합 용액에 함유된 핵산을 증폭시키는 단계와; 상기 제2용기의 액체상의 상기 왁스층을 고화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법에 의해서 달성될 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 또 다른 실시예로서, 생물학적 시료에서 핵산의 분리가 가능한 용해 버퍼(lysis buffer)와 자성 비드가 포함된 제1용기에 샘플 시료를 투입하는 단계와; 상기 제1용기에 투입된 상기 샘플 시료로부터 핵산을 분리하고, 분리된 핵산을 상기 자성 비드에 부착하는 단계와; 핵산이 부착된 상기 자성 비드를 세척하는 단계와; 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 고체상의 왁스층과 용리 버퍼(elution buffer)가 순차적으로 적층된 제2용기의 상기 용리 버퍼에 핵산이 부착된 세척한 상기 자성 비드를 공급하는 단계와; 상기 제2용기의 상기 용리 버퍼에 공급된 상기 자성 비드로부터 상기 핵산을 용리하는 단계와; 핵산이 용리된 상기 자성 비드를 회수하는 단계와; 고체상의 상기 왁스층을 용해하는 단계와; 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 핵산이 용리된 상기 용리 버퍼가 혼합된 혼합 용액을 액체상의 상기 왁스층과 층분리하는 단계와; 상기 제2용기에서 상기 혼합 용액에 함유된 핵산을 증폭시키는 단계와; 상기 제2용기의 액체상의 상기 왁스층을 상온에서 고화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법에 의해서도 달성될 수 있다.
여기서, 상기 왁스층은 소수성 파라핀(Paraffin) 왁스, 식물성 왁스, 비즈 왁스(beeswax) 또는 상기 왁스에 다이(dye), 오일을 포함한 왁스 중 하나이며, 액체 상태에서 상기 핵산 증폭 시약과 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스와 상기 용리 버퍼보다 비중이 낮은 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 왁스층의 용해 온도는 35℃∼80℃인 것을 특징으로 한다.
상기 제2용기의 상기 왁스층의 하부 영역에는, 상기 핵산 증폭 시약과 고체상의 상기 보조 왁스층과 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스가 순차적으로 적층되는 것을 특징으로 한다.
상기 왁스층과 상기 보조 왁스층은 소수성 파라핀 왁스, 식물성 왁스, 비즈 왁스(beeswax) 또는 상기 왁스에 다이(dye), 오일을 포함한 왁스 중 하나이며, 액체 상태에서 상기 핵산 증폭 시약과 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스와 상기 용리 버퍼보다 비중이 낮은 것을 특징으로 한다.
상기 왁스층과 상기 보조 왁스층의 용해 온도는 35℃∼80℃인 것을 특징으로 한다.
상기 왁스층을 용해하기에 앞서, 상기 핵산 증폭 시약은 액체상태 또는 냉동 동결 상태로 상기 제2용기에 수용되고, 상기 왁스층에 의해 커버되는 것을 특징으로 한다.
상기 자성 비드에서 상기 핵산을 용리하는 단계는 상기 왁스층의 용해 온도 미만에서 행해지는 것을 특징으로 한다.
상기 제2용기에서의 핵산 증폭은 PCR(Polymerase Chain Reaction), LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification) 중 어느 하나로 행해지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 기타 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 핵산추출과 핵산 증폭한 시스템에서 중단이 없이 원-스텝(one-step)과정으로 이루어질 수 있으며, 그로 인해 올인원 (All-in-one)의 효과를 누릴 수 있을 뿐만 아니라 핵산 증폭할 때, 왁스층이 핵산 증폭이 이루어지는 용기의 상층에 위치하며 또한 핵산 증폭 후 왁스층이 고체화되므로, 핵산 증폭할 때 발생하는 증발 문제, 에어졸 오염 및 핵산 증폭물의 오염을 줄일 수 있다.
본 발명의 효과들은 이상에서 언급된 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 과정을 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 과정을 도식화한 도면이다.
도 3은 다른 실시예로서 본 발명에서의 제1용기와 보조 용기를 자성 비드의 세척 과정을 도시한 도면이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 제한되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 명세서 전체에 걸쳐 동일한 도면 부호는 동일한 구성 요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 구성요소들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 비록 "제1", "제2" 등이 다양한 구성요소들을 서술하기 위해서 사용되나, 이들 구성요소들은 이들 용어에 의해 제한되지 않음은 물론이다. 이들 용어들은 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소와 구별하기 위하여 사용하는 것이다. 따라서, 이하에서 언급되는 제1 구성요소는 본 발명의 기술적 사상 내에서 제2 구성요소일 수도 있음은 물론이다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하, 첨부 도면들을 참조하여 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
설명에 앞서, 여러 실시예에 있어서, 동일한 구성을 가지는 구성요소에 대해서는 대표적으로 일 실시예에서 설명하고, 그 외의 실시예에서는 일 실시예와 다른 구성에 대해 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 과정을 도식화한 도면이다.
도 1의 (a)에 도시된 바와 같이, 먼저, 생물학적 시료에서 핵산의 분리가 가능한 용해 버퍼(lysis buffer)가 포함된 제1용기(100)에 샘플 시료를 투입한다.
다음, 제1용기(100)에 투입된 샘플 시료에서 핵산을 분리한다.
이어서, 도 1의 (b)에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)에 자성 비드를 투입하고, 분리된 핵산을 자성 비드에 바인딩(binding) 즉, 분리된 핵산을 자성 비드에 부착한다.
바인딩이 완료되면, 도 1의 (c)에 도시된 바와 같이, 핵산이 부착된 자성 비드를 세척 버퍼(washing buffer)가 수용된 별도의 세척 용기로 이동시켜, 세척한다.
그리고, 핵산이 부착된 세척한 자성 비드를 도 1의 (d)에 도시된 바와 같이, 제2용기(300)의 최상단에 위치한 용리 버퍼(elution buffer)에 공급한다.
한편, 제2용기(300)는 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 고체상의 왁스층과 용리 버퍼가 제2용기(300)의 하단부로부터 순차적으로 층분리하며 적층되어 있다. 즉, 제2용기(300)에 수용된 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 용리 버퍼는, 중간에 배치된 고체상의 왁스층에 의해 서로 분리되어 있다.
여기서 본 실시예는 용해 버퍼에서 샘플의 핵산 분리 후 자성비드를 투입하는 것으로 설명되어 있지만, 다른 실시예로서 자성 비드가 용해 버퍼에 선 투입 상태에서 샘플에서의 핵산 분리와 분리된 핵산이 자성 비드에 바인딩 되는 과정이 동시에 일어날 수도 있다.
여기서, 제2용기(300)의 하단부에 수용되는 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스는 각각 마련되어, 일정 비율로 혼합된다.
한편, 본 발명에 적용되는 왁스층에 대해 간단하게 설명하면, 왁스층은 소수성 파라핀 왁스, 소이(soy) 왁스 같은 소수성 식물성 왁스, 비즈 왁스(bees wax)등 여러 왁스가 사용될 수 있다. 또한 두 종류의 왁스가 혼합될 수도 있고 여러 종류의 색깔 다이(dye)나 오일(oil)이 첨가될 수도 있다. 그리고, 이 왁스층은 액체 상태에서 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스와 용리 버퍼보다 비중이 낮고, 용해 온도는 35℃∼80℃인 것이 바람직하다. 또한, 제2용기(300)의 하단에 위치한 핵산 증폭 시약은 액체 상태이거나, 동결 건조 (lyophilzation)된 상태일 수 있다. 그리고, 왁스층이 상온에서 고체화되는 특성상, 제2용기(300)의 하단에 액체 상태 또는 냉동 동결 상태의 핵산 증폭 시약을 투입시킨 후, 용해된 상태의 왁스를 핵산 증폭 시약의 상층에 투입하여 왁스층을 고체화하고, 왁스층의 상단에 용리 버퍼를 투입시킨 후 캡핑(capping)을 하면, 액체 또는 냉동 동결된 핵산증폭 시약은 왁스층에 의해 외부 공기와 차단되어 상온에서 좀 더 오랫동안 보관 유지가 가능하여 운송시 냉동상태에서 이동할 필요가 없게 된다.
계속해서, 제2용기(300)의 용리 버퍼에 공급된 자성 비드의 핵산을 용리시킨다.
이 때, 핵산의 용리는 왁스층의 용해점 미만의 온도에서 행하고, 이에 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 용리 버퍼는 고체상의 왁스층에 의해 서로 분리되어 혼합되지 않는다.
이어서, 제2용기(300)의 용리 버퍼에서 핵산이 용리된 자성 비드를 용리 버퍼로부터 회수하여 제거한다.
제2용기(300)의 용리 버퍼로부터 자성 비드의 회수가 완료되면, 고체상의 왁스층을 용해 온도 이상으로 가열하여 용해한다.
한편, 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 용리 버퍼 사이에서 중간 막의 역할을 하는 고체상의 왁스층이 용해하면, 도 1의 (e)에 도시된 바와 같이, 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스와 용리 버퍼보다 비중이 낮은 액체상의 왁스층은 제2용기(300)의 최상단으로 이동하고, 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 용리 버퍼는 제2용기(300)의 하단에서 서로 혼합되며, 핵산 증폭이 시작된다.
그리고, 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 용리 버퍼로 이루어진 혼합 용액은 제2용기(300)의 최상단에 위치한 액체상의 왁스층에 의해 캐핑(capping) 즉, 커버되며, 제2용기(300)의 하단에서 핵산 증폭을 하게 되고, 핵산 증폭을 통해 샘플 시료를 진단하게 된다.
이 때, 왁스층은 제2용기(300)의 상단을 완전히 커버시킬 수 있도록 충분한 양으로 이루어지고, 이에 핵산 증폭 과정 중에 발생하는 증발을 방지하고, 시료의 오염을 방지할 수 있다.
여기서, 제2용기(300)에서의 핵산 증폭은 PCR(Polymerase Chain Reaction), LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification) 중 어느 하나로 행해질 수 있다.
핵산 증폭을 통한 샘플 시료의 진단이 완료되면, 도 1의 (f)에 도시된 바와 같이, 제2용기(300)의 액체상의 왁스층을 상온에서 즉, 왁스층의 용해 온도 미만에서 고화시킨다.
이와 같이, 제2용기(300)의 최상단에 위치한 왁스층을 다시 고화함에 따라, 제2용기(300)에 수용된 핵산 증폭이 완료된 혼합 용액은 왁스층을 통해 밀폐되어, 혼합 용액은 외부로 누출되지 않게 되어 주변의 오염을 방지하며 안정적으로 보관, 폐기 처리할 수 있게 된다.
한편, 본 실시예에서는 제2용기(300)의 고체상의 왁스층의 하부 영역에 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스가 마련되고, 왁스층의 상부 영역에 용해 리퍼가 마련되는 것으로 설명하고 있지만 이에 한정되지 않고, 다른 실시예로서 도시되어 있지 않지만, 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스가 고체상의 왁스층 내부에 포함(Embedded) 되어 있고 상부 영역에 용리 버퍼에 투입되어 있는 제2용기(300)가 사용될 수도 있다.
또 다른 실시예로서 도시되어 있지 않지만, 제2용기(300)의 고체상의 왁스층의 하부 영역에 핵산 증폭 시약이 마련되고, 왁스층의 상부 영역에 용해 리퍼와 핵산 증폭 프라이머 믹스가 마련될 수도 있다.
이와 같이, 본 발명에 따르면, 하나의 용기에서 핵산 추출을 위한 용리 과정과 핵산 증폭 과정이 한 곳에서 이루어질 수 있게 하여, 핵산 추출 후 용리 버퍼를 사용자나 로봇 파이펫(pippet)에 의해 별도의 핵산 증폭 용기에 투입하는 과정을 생략시키므로, 샘플 시료의 투입 후 진단까지 원 스텝으로 가능하게 하며 하나의 장비로 올인원 진단 효과를 가질 수 있게 된다.
그리고, 핵산 증폭할 때, 왁스층이 핵산 증폭이 이루어지는 용기의 상층에 위치하고, 또한 왁스층이 핵산 증폭 후에 고체화되므로, 핵산 증폭할 때 발생하는 증발 문제, 에어졸 오염 및 핵산 증폭물의 오염을 줄일 수 있고, 핵산 증폭물을 안정적으로 폐기할 수 있게 된다.
한편, 도 2에는 본 발명의 다른 실시예에 따른 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 과정을 도식화한 도면이 도시되어 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 과정은 전술한 일 실시예와 달리, 제2용기(300)에 핵산 증폭 시약과, 고체상의 보조 왁스층과, 핵산 증폭 프라이머 믹스와, 고체상의 왁스층과, 용리 버퍼가 제2용기(300)의 하단부로부터 순차적으로 층분리하며 적층되어 있다. 즉, 제2용기(300)에 수용된 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스는 고체상의 보조 왁스층에 의해 서로 분리되어 있고, 핵산 증폭 프라이머 믹스와 용리 버퍼는 고체상의 왁스층에 의해 서로 분리되어 있다.
이에 따라, 본 발명의 다른 실시예에 따른 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 과정은 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스가 고체상의 보조 왁스층에 의해 서로 분리된 제2용기(300)를 이용하여 자성 비드로부터 핵산을 용리한다.
여기서, 보조 왁스층은 왁스층과 동일 또는 다른 물성의 소재로 이루어지며 동일한 기능을 가진다. 즉, 보조 왁스층은 소수성 파라핀 왁스, 소이(soy) 왁스 같은 소수성 식물성 왁스, 비즈 왁스(bees wax)등 여러 왁스가 사용될 수 있다. 또한 두 종류의 왁스가 혼합될 수도 있고 여러 종류의 색깔 다이(dye)나 오일(oil)이 첨가될 수도 있다. 그리고, 이 보조 왁스층은 액체 상태에서 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스와 용리 버퍼보다 비중이 낮고, 용해 온도는 35℃∼80℃인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 과정을 설명함에 있어서, 도 2의 (a) 내지 도 2의 (c)에 도시된 과정은 전술한 도 1의 (a) 내지 도 1의 (c)에 도시된 과정과 동일하므로 그 구체적인 설명을 생략하고, 이하에서는 전술한 일 실시예와 다른 과정으로서. 자성 비드로부터 핵산을 용리하는 단계에서 핵산을 증폭시키는 단계에 대해 구체적으로 설명한다.
도 2의 (d)에 도시된 바와 같이, 핵산이 부착된 세척한 자성 비드를 제2용기(300)의 최상단에 위치한 용리 버퍼(elution buffer)에 공급한 후, 자성 비드로부터 세척한 자성 비드에 부착된 핵산을 용리한다.
이 때, 핵산의 용리는 왁스층 및 보조왁스층의 용해점 미만의 온도에서 행하고, 이에 핵산 용리할 때, 핵산 증폭 프라이머 믹스와 핵산 증폭 시약과 용리 버퍼는 각각 고체상의 왁스층과 고체상의 보조왁스층에 의해 서로 분리되어 혼합되지 않는다.
그리고, 제2용기(300)의 용리 버퍼에서 핵산이 용리된 자성 비드를 용리 버퍼로부터 회수하여 제거한 후, 고체상의 왁스층과 보조 왁스층을 용해 온도 이상으로 가열하여 용해한다.
왁스층과 보조 왁스층이 용해됨에 따라, 도 2의 (e)에 도시된 바와 같이, 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스와 용리 버퍼보다 비중이 낮은 액체상의 왁스층과 액체상의 보조 왁스층은 제2용기(300)의 최상단으로 이동하고, 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스와 용리 버퍼는 제2용기(300)의 하단에서 서로 혼합되며, 핵산 증폭이 시작된다.
그리고, 핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스와 용리 버퍼로 이루어진 혼합 용액은 제2용기(300)의 최상단에 위치한 액체상의 왁스층과 보조 왁스층으로 이루어진 혼합 왁스층에 의해 커버되며, 제2용기(300)의 하단에서 핵산 증폭을 하게 되고, 핵산 증폭을 통해 샘플 시료를 진단하게 된다.
이어서, 핵산 증폭을 통한 샘플 시료의 진단이 완료되면, 도 2의 (f)에 도시된 바와 같이, 제2용기(300)의 액체상의 혼합 왁스층을 상온에서 예컨대, 혼합 왁스층의 용해 온도 미만에서 고화시킨다.
한편, 전술한 실시예들에서의 본 발명에 따른 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 과정에서 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 제1용기(100)와 보조 용기(200)를 상호 연결하지 않고 각각 사용할 수 있지만, 도 3에 도시된 바와 같이 제1용기(100)와 보조 용기(200)를 자성 비드가 이동하는 이동 통로가 형성된 연결관(400)으로 연결하여, 밀폐된 상태에서 사용할 수도 있다.
이에 따라, 도 3의 (a)에 도시된 바와 같이 제1용기(100)에 용해 버퍼(lysis buffer)와 샘플 시료와 자성 비드를 투입하고, 보조 용기(200)에 세척 버퍼(washing buffer)를 투입한 후, 제1용기(100)와 보조 용기(200)를 연결관(400)으로 연결하여 제1용기(100)와 보조 용기(200)가 밀폐된 상태에서, 제1용기(100)에서 샘플 시료로부터 핵산을 분리하며, 분리된 핵산을 자성 비드에 부착시킨다.
그리고, 도 3의 (b)에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)의 외측에 자성체를 부착한다. 이 때, 핵산이 부착된 자성 비드는 자석(500)의 자력에 의해 자석(500)의 주변에 부착된다.
이어서, 도 3의 (c)에 도시된 바와 같이 제1용기(100)의 외측에 부착된 자석(500)을 연결관(400)의 이동 통로를 따라 보조 용기(200)에 수용된 세척 버퍼로 이동시켜, 도 3의 (d)에 도시된 바와 같이 보조 용기(200)의 외측에 부착된 자석(500)을 제거하여 핵산이 부착된 자성 비드를 세척 버퍼를 통해 세척할 수 있다.
이상, 첨부된 도면을 참조로 하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 제한적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
100: 제1용기
200: 보조 용기
300: 제2용기
400: 연결관
500: 자석

Claims (11)

  1. 생물학적 시료에서 핵산의 분리가 가능한 용해 버퍼(lysis buffer)가 포함된 제1용기에 샘플 시료를 투입하는 단계와;
    상기 제1용기에 투입된 상기 샘플 시료로부터 핵산을 분리하는 단계와;
    상기 제1용기에 자성 비드를 투입하고, 분리된 핵산을 상기 자성 비드에 부착하는 단계와;
    핵산이 부착된 상기 자성 비드를 세척하는 단계와;
    핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 고체상의 왁스층과 용리 버퍼(elution buffer)가 순차적으로 적층된 제2용기의 상기 용리 버퍼에 핵산이 부착된 세척한 상기 자성 비드를 공급하는 단계와;
    상기 제2용기의 상기 용리 버퍼에 공급된 상기 자성 비드로부터 상기 핵산을 용리하는 단계와;
    핵산이 용리된 상기 자성 비드를 회수하는 단계와;
    고체상의 상기 왁스층을 용해하는 단계와;
    상기 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 핵산이 용리된 상기 용리 버퍼가 혼합된 혼합 용액을 액체상의 상기 왁스층과 층분리하는 단계와;
    상기 제2용기에서 상기 혼합 용액에 함유된 핵산을 증폭시키는 단계와;
    상기 제2용기의 액체상의 상기 왁스층을 고화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  2. 생물학적 시료에서 핵산의 분리가 가능한 용해 버퍼(lysis buffer)가 포함된 제1용기에 샘플 시료를 투입하는 단계와;
    상기 제1용기에 투입된 상기 샘플 시료로부터 핵산을 분리하는 단계와;
    상기 제1용기에 자성 비드를 투입하고, 분리된 핵산을 상기 자성 비드에 부착하는 단계와;
    핵산이 부착된 상기 자성 비드를 세척하는 단계와;
    핵산 증폭 시약과 핵산 증폭 프라이머 믹스가 고체상의 왁스층 내부에 포함(Embedded) 되어 있고 상부 영역에 용리 버퍼(elution buffer)가 투입되어 있는 제2용기의 상기 용리 버퍼에 핵산이 부착된 세척한 상기 자성 비드를 공급하는 단계와;
    상기 제2용기의 상기 용리 버퍼에 공급된 상기 자성 비드로부터 상기 핵산을 용리하는 단계와;
    핵산이 용리된 상기 자성 비드를 회수하는 단계와;
    고체상의 상기 왁스층을 용해하는 단계와;
    상기 핵산 증폭 시약과 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하고 핵산이 용리된 상기 용리 버퍼가 혼합된 혼합 용액을 액체상의 상기 왁스층과 층분리하는 단계와;
    상기 제2용기에서 상기 혼합 용액에 함유된 핵산을 증폭시키는 단계와;
    상기 제2용기의 액체상의 상기 왁스층을 고화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  3. 생물학적 시료에서 핵산의 분리가 가능한 용해 버퍼(lysis buffer)와 자성 비드가 포함된 제1용기에 샘플 시료를 투입하는 단계와;
    상기 제1용기에 투입된 상기 샘플 시료로부터 핵산을 분리하고, 분리된 핵산을 상기 자성 비드에 부착하는 단계와;
    핵산이 부착된 상기 자성 비드를 세척하는 단계와;
    핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 고체상의 왁스층과 용리 버퍼(elution buffer)가 순차적으로 적층된 제2용기의 상기 용리 버퍼에 핵산이 부착된 세척한 상기 자성 비드를 공급하는 단계와;
    상기 제2용기의 상기 용리 버퍼에 공급된 상기 자성 비드로부터 상기 핵산을 용리하는 단계와;
    핵산이 용리된 상기 자성 비드를 회수하는 단계와;
    고체상의 상기 왁스층을 용해하는 단계와;
    상기 핵산 증폭 프라이머 믹스를 포함하는 핵산 증폭 시약과 핵산이 용리된 상기 용리 버퍼가 혼합된 혼합 용액을 액체상의 상기 왁스층과 층분리하는 단계와;
    상기 제2용기에서 상기 혼합 용액에 함유된 핵산을 증폭시키는 단계와;
    상기 제2용기의 액체상의 상기 왁스층을 고화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 왁스층은 소수성 파라핀 왁스, 식물성 왁스, 비즈 왁스(beeswax) 또는 상기 왁스에 다이(dye), 오일을 포함한 왁스 중 하나이며, 액체 상태에서 상기 핵산 증폭 시약과 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스와 상기 용리 버퍼보다 비중이 낮은 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 왁스층의 용해 온도는 35℃∼80℃인 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 제2용기의 상기 왁스층의 하부 영역에는, 상기 핵산 증폭 시약과 고체상의 상기 보조 왁스층과 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스가 순차적으로 적층되는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 왁스층과 상기 보조 왁스층은 소수성 파라핀 왁스, 식물성 왁스, 비즈 왁스(beeswax) 또는 상기 왁스에 다이(dye), 오일을 포함한 왁스 중 하나이며, 액체 상태에서 상기 핵산 증폭 시약과 상기 핵산 증폭 프라이머 믹스와 상기 용리 버퍼보다 비중이 낮은 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 왁스층과 상기 보조 왁스층의 용해 온도는 35℃∼80℃인 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  9. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 왁스층을 용해하기에 앞서, 상기 핵산 증폭 시약은 액체상 또는 냉동 동결 상태로 상기 제2용기에 수용되고, 상기 왁스층에 의해 커버되는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자성 비드에서 상기 핵산을 용리하는 단계는 상기 왁스층의 용해 온도 미만에서 행해지는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2용기에서의 핵산 증폭은 PCR(Polymerase Chain Reaction), LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification) 중 어느 하나로 행해지는 것을 특징으로 하는 자성 비드를 이용한 핵산 추출 및 핵산 증폭 방법.

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