CN116103116A - 一种核酸分析卡盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种核酸分析卡盒,包括:卡盒本体和设置在卡盒本体底部的磁珠转移部件;其中,卡盒本体包括封闭膜、卡盒主体、基底;卡盒主体位于封闭膜与基底之间;磁珠转移部件设置磁铁阵列。本申请还公开了一种核酸提取及分析方法,本申请公开的核酸分析卡盒缩短了核酸检测实验的时间,提高科研人员的工作效率,促进分子诊断产品发展。
Description
技术领域
本说明书涉及分子诊断领域,特别涉及一种核酸分析卡盒。
背景技术
随着人们生活水平的提高,医疗卫生产业发展将不再局限于诊疗,而愈加重视预防性医学。分子诊断作为预防诊断的主要方法,既可以对个体遗传病进行检测,也能进行预防诊断筛查并提供用药指导。尤其在面对各种突发性传染性疾病的严峻情形,分子诊断技术可以提供快速、准确的诊断,最为经济有效。此外,分子诊断特异性强、灵敏度高,可进行定性定量检测。分子诊断检测对象主要为核酸(DNA和RNA)和蛋白质,以核酸分子为主。现在常用的核酸检测方法有很多,而基于核酸扩增的方法,包括基于聚合酶链式核酸扩增(PCR)以及等温扩增技术的方法,是最为常见的。
整个检测过程中,涉及到多种溶液、试剂,有很多移液步骤,较为复杂,需要专业人员进行操作。同时,目前的核酸检测步骤主要包括:样本采集、核酸提取与纯化、核酸扩增和检测等步骤,整个检测流程步骤繁琐、时间长(需要耗费数个小时),并且容易引发交叉污染,所以对医疗人员的实验操作能力和检测环境有较高要求。
目前,已有一些可以实现样本核酸提取、扩增和检测一体化的卡盒和设备,如Cepheid公司的GeneXpert系列产品,生物梅里埃的FilmArray等。但这些设备还存在结构复杂、价格昂贵等问题,不太适合基层使用。因此,亟需一种能够使检测过程简单化、节省时间、利于推广的核酸分析方法。
发明内容
本申请的一方面,提供了一种核酸分析卡盒,包括:卡盒本体和设置在所述卡盒本体底部的磁珠转移部件;其中,所述卡盒本体包括封闭膜、卡盒主体、基底;所述卡盒主体位于封闭膜与基底之间;所述磁珠转移部件设置磁铁阵列。
本申请的另一方面,提供一种核酸提取及分析方法,其特征在于,采用上述的核酸分析卡盒,所述方法包括以下步骤:
将矿物油填充到卡盒主体的储液腔中,得到装有矿物油的储液腔;
将裂解液、洗涤液、扩增试剂注入对应的所述装有矿物油的储液腔,分别形成裂解液试剂液滴、洗涤液1试剂液滴、洗涤液2试剂液滴、扩增试剂液滴,其中,所述裂解液中包含磁珠;
将样品加入到所述卡盒主体中装有矿物油的裂解液储液腔内,用封闭膜封闭,通过横向移动磁珠转移部件使所述样品、磁珠和裂解液试剂液滴混合,静置,得到结合有核酸分子的磁珠;
通过纵向移动所述磁珠转移部件,将所述结合有核酸分子的磁珠移动至装有矿物油的第一洗涤液储液分腔中,通过横向移动所述磁珠转移部件使所述结合有核酸分子的磁珠与所述洗涤液1试剂液滴混合,洗去所述结合有核酸分子的磁珠移动时携带的杂质,得到洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠;
继续纵向移动所述磁珠转移部件,将所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠,移动至装有矿物油的第二洗涤液储液分腔中,通过横向移动所述磁珠转移部件使所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠与所述洗涤液2试剂液滴混合,洗去所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠移动时携带的杂质,得到待扩增的磁珠;
继续纵向移动所述磁珠转移部件,将所述待扩增的磁珠移动至所述卡盒主体的装有矿物油的扩增试剂储液腔中,通过横向移动所述磁珠转移部件使所述待扩增的磁珠与所述扩增试剂液滴混合,核酸分子被洗脱下来进行扩增反应,得到待检测核酸分析卡盒;
将所述待检测核酸分析卡盒放置在荧光显微镜下观测其扩增结果,也可在其它适配仪器中监测其实时荧光变化。
本申请的另一方面,还提供上述的核酸分析卡盒在制备分子诊断产品中的用途。
本申请公开的一种核酸分析卡盒,可能带来的有益效果包括但不限于:(1)底部的连接管道包括缩径设置,有利于磁珠移动时减少磁珠的残留,较窄的直管道结构有利于磁珠通过该处时受到较大的剪切力突破水性溶液和油相间的表面张力,从而防止扩增反应抑制物的残留。(2)裂解液储液腔容积设置为大于或等于扩增试剂储液腔容积,使得裂解液储液腔能够添加更多的样品,尤其在样品浓度较小时,可以避免因为裂解液储液腔不够大,而不能得到足够的核酸。(3)扩增试剂储液腔容积设置为小于或等于裂解液储液腔,这样既节省了试剂,同时在PCR仪中扩增时可以快速升温,节省时间。
附图说明
本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明,这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的,在这些实施例中,相同的编号表示相同的结构,其中:
图1为根据本申请一些实施例所示的核酸分析卡盒的结构示意图;
图2为根据本申请一些实施例所示的核酸分析卡盒的爆炸图;
图3为根据本申请一些实施例所示的核酸分析卡盒中任意一个反应单元的俯视图;
图4为根据本申请一些实施例所示的核酸分析卡盒中任意一个反应单元的纵截面图;
图5为根据本申请一些实施例所示的核酸分析卡盒中任意一个反应单元的横截面图;
图6为根据本申请一些实施例所示的核酸分析卡盒中任意一个反应单元的使用过程的结构示意图;
图7为根据本申请一些实施例所示的磁珠转移部件的结构示意图。
附图标记:
1 卡盒本体;
10 卡盒主体;
100 反应单元;
101 连接管道;
1011 弧形结构;
1012 直管道;
110 储液腔;
111 裂解液储液腔;
112 洗涤液储液腔;
1121 第一洗涤液储液分腔;
1122 第二洗涤液储液分腔;
114 扩增试剂储液腔;
120 进样孔;
121 裂解液与油相进样孔;
122 洗涤液进样孔;
1221 第一洗涤液进样孔;
1222 第二洗涤液进样孔;
124 扩增试剂进样孔;
130 试剂液滴;
131 裂解液试剂液滴;
132 洗涤液1试剂液滴;
133 洗涤液2试剂液滴;
134 扩增试剂液滴;
141 磁珠;
142 矿物油;
200 基底;
300 磁珠转移部件;
301 磁铁阵列;
400 封闭膜;
401 第一封闭膜区;
402 第二封闭膜区;
1000 反应室;
1001 裂解室;
1002 洗涤室;
10021 第一洗涤分室;
10022 第二洗涤分室;
1004 扩增室。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例,对于本领域的普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明,图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示,除非上下文明确提示例外情形,“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数,也可包括复数。一般说来,术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素,而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列,方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
以下是对本申请中一些术语的定义。
如本申请中所使用的,术语“核酸”是指是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称,是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物,为生命的最基本物质之一。
术语“聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)”是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
术语“磁珠”是指能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合,并且也可以解结合的的磁珠。例如,超顺磁性氧化硅纳米磁珠。
核酸检测技术在分子生物学实验和体外诊断领域中广泛应用。相对于免疫学检测,核酸分子检测对样品含量要求低、灵敏度高,可以从根本上检测出样品是否含有致病核酸分子。因此,有利于病人在疾病早期得到准确诊断,从而在黄金时间对病情进行有效控制。但是,目前的核酸检测流程复杂、耗时较长。为了加快检测效率,已有研究将核酸提取纯化或扩增检测集成在芯片或卡盒中,基于磁珠转移或驱动试剂流动分配实现检测流程的简化。目前检测方式存在的不足常为检测通量低、一体化集成检测难和操作方式繁琐等。
磁珠法核酸提取是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术,核酸分子可与磁珠表面的硅羟基发生特异性识别与结合,在外部磁场的作用下发生聚集或分散,彻底摆脱传统核酸提取过程中离心、抽取上清液等手工操作流程,从而实现核酸的自动化提取。
本申请提出,可以基于水和油表面不相混溶设计一种核酸分析卡盒,卡盒将核酸提取纯化与扩增过程中的试剂通过油相分隔在单独的腔室内形成试剂液滴,各个试剂液滴之间独立反应,不相干扰。核酸分子的转移通过磁珠转移部件的纵向运动来进完成,磁珠转移部件拖拽磁珠通过连接管道穿梭于各个试剂液滴中完成核酸分子的结合、洗涤和洗脱。通过试剂预先填充和可自动化操作的特点,使得该卡盒在使用过程中非常简便,极大程度地简化了多样本检测中带来的重复与繁琐的操作。
根据本申请的一些实施例,提供了一种核酸分析卡盒,如图1所示,包括:卡盒本体1和设置在卡盒本体1底部的磁珠转移部件300。
如图2所示,卡盒本体1可以包括封闭膜400、卡盒主体10、基底200,卡盒主体10位于封闭膜400与基底200之间。磁珠转移部件300设置磁铁阵列301。
为了提高样品检测量,如图1所示,卡盒主体10可以设有若干反应单元100。如图3所示,反应单元100可以包括连接管道101及多个顺序排列的反应室1000,同一反应单元100中的反应室1000经连接管道101依次连通。
如图3所示,反应单元100中,各反应室1000中分别设置储液腔110。如图4所示,基底200可以与卡盒主体10密封连接以形成储液腔110的腔底。如图3所示,各所述储液腔110均设置进样孔120,所述储液腔110底部连通所述连接管道101。
磁珠法核酸提取一般包括裂解、结合、洗涤、洗脱四个步骤,因本申请还需要分析所提取出的核酸,所以需要增加扩增步骤。为了实现整个提取和扩增流程,且各步骤独立反应,不相干扰,如图4所示,反应单元100中,反应室1000可以包括经连接管道101依次连通的裂解室1001、洗涤室1002和扩增室1004。
进行核酸分析的第一个前提就是能够将核酸从样品中复杂的生物大分子中提取出来。核酸提取包括样品的裂解和纯化两个步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化是使核酸与裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
如图4所示,裂解室1001设有裂解液储液腔111,在一些实施例中,裂解液储液腔111可以用于样品裂解释放核酸以及核酸与磁珠的结合。裂解液储液腔111顶部可以设置裂解液与油相进样孔121。在一些实施例中,油相、裂解液、样品和磁珠可以通过裂解液与油相进样孔121加入到裂解液储液腔111中。
核酸通常是在高盐高醇的条件下提取得到,产物中除了核酸还有不少的盐。如果不用洗涤液清洗,残留的盐会影响以后的实验,如酶切、连接、PCR等,因此需要洗涤步骤。洗涤室1002设有洗涤液储液腔112,在一些实施例中,洗涤液储液腔112可以用于核酸的洗涤。洗涤液储液腔112顶部设置洗涤液进样孔122,在一些实施例中,油相、洗涤液可以通过洗涤液进样孔122加入到洗涤液储液腔112中。
洗涤过后的核酸需要从磁珠上分离下来以进行后续的实验,此时核酸需要在撤去外加磁场的环境中洗脱,结合的核酸即与磁珠分离,从而得到纯化的核酸。另有些情况下提取出的核酸产量较少,因此需要让微量的核酸扩增以达到能够检测的程度。或者需要在提取出的核酸上加上某些易于检测的标记时,也需要扩增步骤。扩增室1004设有扩增试剂储液腔114,在一些实施例中,扩增试剂储液腔114可以用于核酸的洗脱和扩增。扩增试剂储液腔114顶部设置扩增试剂进样孔124,在一些实施例中,油相、扩增试剂可以通过扩增试剂进样孔124加入到扩增试剂储液腔114中。
实验过程中,当提取到的核酸杂质过多时,实验人员会考虑多进行几次洗涤,以得到更为纯净的核酸。因此,通常情况下,洗涤室1002包括若干经连接管道101串联相通的洗涤分室,具体的,洗涤分室可以是一个或多个。在一个具体实施方式中,洗涤分室可以包括底部经连接管道101串联相通的第一洗涤分室10021和第二洗涤分室10022。第一洗涤分室10021设有第一洗涤液储液分腔1121,第一洗涤液储液分腔1121顶部设置第一洗涤液进样孔1221。第二洗涤分室10022设有第二洗涤液储液分腔1122,第二洗涤液储液分腔1122顶部设置第二洗涤液进样孔1222。
在一些实施例中,第二洗涤液储液分腔1122内还可以设有PEG8000水溶液。在一些实施例中,PEG8000水溶液可以包括质量百分比为5%-20%的PEG8000。在一些实施例中,PEG8000在PEG8000水溶液中的质量百分比为可以为7%-18%。在一些实施例中,PEG8000在PEG8000水溶液中的质量百分比为可以为9%-16%。在一些实施例中,PEG8000在PEG8000水溶液中的质量百分比为可以为11%-14%。优选地,PEG8000在PEG8000水溶液中的质量百分比可以为13%。
在实验过程中,经常因为样本浓度偏小需要增加样本量,此时就需要增加储液腔110的容积。但是储液腔的容积增大会导致扩增试剂储液腔114中溶液体积增大,会使扩增实验步骤时间延长。为了缩短扩增实验步骤时间,同时可以加大样本量,如图5所示,在一些实施例中,裂解液储液腔111的容积可以大于或等于所述扩增试剂储液腔114的容积。在一些实施例中,裂解液储液腔111的容积可以大于或等于洗涤液储液腔112的容积。在一些实施例中,洗涤液储液腔112的容积可以大于或等于扩增试剂储液腔114的容积。裂解液储液腔111容积设置为大于或等于扩增试剂储液腔114容积,使得裂解液储液腔111能够添加更多的样品,尤其在样品浓度较小时,可以避免因为裂解液储液腔111不够大,而不能得到足够的核酸。扩增试剂储液腔114容积设置为小于或等于裂解液储液腔111,这样既节省了试剂,同时在PCR仪中扩增时可以快速升温,节省时间。
在一些实施例中,裂解液储液腔111的容积范围可以为100μL-2000μL。例如,裂解液储液腔111的容积可以为100μL、125μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、325μL、350μL、375μL、400μL、425μL、450μL、475μL、500μL、525μL、550μL、575μL、600μL、625μL、650μL、675μL、700μL、725μL、750μL、775μL、800μL、825μL、850μL、875μL、900μL、925μL、950μL、975μL、1000μL、1025μL、1050μL、1075μL、1100μL、1125μL、1150μL、1175μL、1200μL、1225μL、1250μL、1275μL、1300μL、1325μL、1350μL、1375μL、1400μL、1425μL、1450μL、1475μL、1500μL、1525μL、1550μL、1575μL、1600μL、1625μL、1650μL、1675μL、1700μL、1725μL、1750μL、1775μL、1800μL、1825μL、1850μL、1875μL、1900μL、1925μL、1950μL、1975μL、2000μL。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围,此处不再赘述。
在一些实施例中,洗涤液储液腔112的容积范围可以为50μL-1000μL。例如,洗涤液储液腔112的容积可以为50μL、75μL、100μL、125μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、325μL、350μL、375μL、400μL、425μL、450μL、475μL、500μL、525μL、575μL、600μL、625μL、650μL、675μL、700μL、725μL、750μL、775μL、800μL、825μL、850μL、875μL、900μL、925μL、950μL、975μL、1000μL。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围,此处不再赘述。
在一些实施例中,扩增试剂储液腔114的容积范围可以为50μL-500μL。例如,扩增试剂储液腔114的容积可以为50μL、75μL、100μL、125μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、325μL、350μL、375μL、400μL、425μL、450μL、475μL、500μL。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围,此处不再赘述。
为了防止操作前后核酸分析卡盒发生交叉污染,如图2所示,封闭膜400可以包括第一封闭膜区401和第二封闭膜区402。在一些实施例中,第一封闭膜区401可以包括用于封闭洗涤液进样孔122、扩增试剂进样孔124,在一些实施例中,第二封闭膜区402可以用于封闭裂解液与油相进样孔121。
为了减少实验过程中的污染,简化操作步骤,使整个反应流程能够在一个封闭环境中完成,如图5所示,反应单元100中,储液腔110的侧壁底部连通连接管道101,在一些实施例中,连接管道101可以用于磁珠在储液腔110中移动。例如,从裂解液储液腔111移动至洗涤液储液腔112,从洗涤液储液腔112移动至扩增试剂储液腔114。连接管道101自储液腔110端起缩径设置,形成弧形结构1011和较窄的直管道1012,以使储液腔110的侧壁与连接管道主体平滑连接。弧形结构1011有利于磁珠移动时减少磁珠在上一个储液腔110中的残留,较窄的直管道结构有利于磁珠通过该处时受到较大的剪切力突破水和油间的表面张力,从防止扩增反应抑制物的残留。
储液腔110和连接管道101内设有油性液体,在一些实施例中,储液腔110内还可以设有水性溶液。
油性液体可以选自矿物油、橄榄油、石蜡油中的一种或多种。在一些实施例中,水性溶液选自裂解液、洗涤液、扩增试剂中的任意一种。需要说明的是,油性液体密度低于水性溶液,且和水性溶液不相容。
在一些实施例中,裂解液可以包括盐酸胍、尿素、异硫氰酸胍、二硫苏糖醇、蛋白酶K中的任意一种或多种。在一些实施例中,洗涤液可以是包括乙醇和Tris-HCl的缓冲液。在一些实施例中,扩增试剂可以包括但不限于TaqDNA聚合酶、10×扩增缓冲液、dNTP、引物。
为了使各个实验步骤保持独立性,水性溶液之间不会混合,如图6所示,储液腔110和连接管道101内可以设有油性液体。在一些实施例中,可以通过裂解液与油相进样孔121将裂解液加入到裂解液储液腔111底部,形成裂解液试剂液滴131。在一些实施例中,可以通过第一洗涤液进样孔1221将洗涤液1加入到第一洗涤液储液分腔1121底部,形成洗涤液1试剂液滴132。在一些实施例中,可以通过第二洗涤液进样孔1222,将洗涤液2加入到第二洗涤液储液分腔1122底部,形成洗涤液2试剂液滴133。需要说明的是,洗涤液2是对PCR温和的PEG8000水溶液,除去杂质的同时,不会对PCR产生抑制作用。在一些实施例中,可以通过扩增试剂进样孔124将扩增试剂加入到扩增试剂储液腔114底部,形成扩增试剂液滴134。在一些实施例中,可以通过裂解液与油相进样孔121将样品和磁珠141加入到裂解液储液腔111底部,并通过横向移动卡盒主体10,使样品和磁珠141与裂解液试剂液滴131混合。在一些实施例中,磁珠转移部件300可以通过连接管道101将结合上核酸的磁珠141纵向移动到第一洗涤液储液分腔1121中。在一些实施例中,磁珠转移部件300可以通过连接管道101将结合上核酸的磁珠141纵向移动到第二洗涤液储液分腔1122中。在一些实施例中,磁珠转移部件300可以通过连接管道101将结合上核酸的磁珠141纵向移动到扩增试剂储液腔114中。
如图7所示,磁珠转移部件300上可以设置磁铁阵列301,而且磁铁阵列301可以包括若干圆柱形磁铁。如图4所示,磁珠转移部件300上的磁铁阵列301分布与卡盒主体10中的储液腔111中心位置对应。磁珠转移部件300可由手动或自动化位移装置控制。具体的,在一些实施例中,磁铁阵列301上的圆柱形磁铁的分布与卡盒主体10中储液腔111、洗涤液储液腔112、扩增试剂储液腔114的中心位置对应,并且可以沿连接管道101方向移动。
根据本申请的另一方面,提供了一种核酸提取及分析方法,采用上述的核酸分析卡盒,该方法包括以下步骤:
将矿物油填充到卡盒主体10的储液腔110中,得到装有矿物油的储液腔110;
将裂解液、洗涤液、扩增试剂注入对应的所述装有矿物油的储液腔110,分别形成裂解液试剂液滴131、洗涤液1试剂液滴132、洗涤液2试剂液滴133、扩增试剂液滴134,其中,所述裂解液中包含磁珠141;
将样品加入到所述卡盒主体10中装有矿物油的裂解液储液腔111内,用封闭膜400封闭,通过横向移动磁珠转移部件300使所述样品、磁珠141和裂解液试剂液滴131混合,静置,得到结合有核酸分子的磁珠141;
通过纵向移动所述磁珠转移部件300,将所述结合有核酸分子的磁珠141移动至装有矿物油的第一洗涤液储液分腔1121中,通过横向移动所述磁珠转移部件300使所述结合有核酸分子的磁珠141与所述洗涤液1试剂液滴132混合,洗去所述结合有核酸分子的磁珠141移动时携带的杂质,得到洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠141;
继续纵向移动所述磁珠转移部件300,将所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠141,移动至装有矿物油的第二洗涤液储液分腔1122中,通过横向移动所述磁珠转移部件300使所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠141与所述洗涤液2试剂液滴133混合,洗去所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠141移动时携带的杂质,得到待扩增的磁珠141;
继续纵向移动所述磁珠转移部件300,将所述待扩增的磁珠141移动至所述卡盒主体10的装有矿物油的扩增试剂储液腔114中,通过横向移动所述磁珠转移部件300使所述待扩增的磁珠141与所述扩增试剂液滴134混合,核酸分子被洗脱下来进行扩增反应,得到待检测核酸分析卡盒;
将所述待检测核酸分析卡盒放置在荧光显微镜下观测其扩增结果,也可在其它适配仪器中监测其实时荧光变化。
根据本申请的一些实施例,还提供了核酸分析卡盒在制备分子诊断产品中的用途。示例性的,核酸分析卡盒可以用于各种疾病预防、疾病筛查,例如唐氏综合征、新型冠状病毒肺炎。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
实施例
利用上述核酸分析卡盒进行核酸检测的步骤如下:
1、检测准备阶段:如图4所示,将矿物油由进样孔121注入储液腔111中,后将卡盒整体倾斜使矿物油经连接管道101流至储液腔112、114中,并填充。重复上述操作使每个储液腔中保持足够的矿物油量。将核酸分析试剂:核酸裂解液、洗涤液1、洗涤液2、扩增试剂,依次由进样孔121、1221、1222、124注入至储液腔111、1121、1122、114中,注入体积分别为8μL、4μL、4μL、4μL。
2、上样:如图4所示,取2-5μL样品由进样孔121注入至储液腔111中。如图2所示,用封闭膜402封闭进样孔121。
3、核酸提取纯化:如图6所示,核酸裂解液、洗涤液1、洗涤液2、扩增试剂在矿物油142中依次形成裂解液试剂液滴131、洗涤液1试剂液滴132、洗涤液2试剂液滴133、扩增试剂液滴134。在磁铁作用下磁珠141横向移动混合反应试剂,纵向移动将核酸依次转移至试剂洗涤液1试剂液滴132、洗涤液2试剂液滴133、扩增试剂液滴134中。其中,样品在裂解液试剂液滴131中释放核酸分子,核酸分子与磁珠141结合,在洗涤液1试剂液滴132、洗涤液2试剂液滴133中洗涤去残留的杂质,在扩增试剂液滴134中磁珠141携带的核酸分子被洗脱下来。
4、扩增检测:将核酸分析卡盒置于PCR仪中扩增,待扩增完毕且装置冷却至室温后,将卡盒放置在荧光显微镜下观测结果。
上文已对基本概念做了描述,显然,对于本领域技术人员来说,上述详细披露仅仅作为示例,而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明,本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议,所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时,本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此,应强调并注意的是,本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外,本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字,应当理解的是,此类用于实施例描述的数字,在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明,“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20%的变化。相应地,在一些实施例中,说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值,该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中,数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值,在具体实施例中,此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后,应当理解的是,本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此,作为示例而非限制,本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地,本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (12)
1.一种核酸分析卡盒,其特征在于,包括:卡盒本体(1)和设置在所述卡盒本体(1)底部的磁珠转移部件(300);
其中,所述卡盒本体(1)包括封闭膜(400)、卡盒主体(10)、基底(200);所述卡盒主体(10)位于封闭膜(400)与基底(200)之间;
所述磁珠转移部件(300)设置磁铁阵列(301)。
2.如权利要求1所述核酸分析卡盒,其特征在于,所述卡盒主体(10)设有若干反应单元(100);所述反应单元(100)包括连接管道(101)及多个顺序排列的反应室(1000),同一所述反应单元(100)中的所述反应室(1000)经连接管道(101)依次连通。
3.如权利要求2所述核酸分析卡盒,其特征在于,所述反应单元(100)中,各所述反应室(1000)中分别设置储液腔(110),各所述储液腔(110)均设置进样孔(120),所述储液腔(110)底部连通所述连接管道(101);
和/或,所述磁铁阵列(301)包括若干圆柱形磁铁;所述磁铁与所述反应室(1000)位置相匹配。
4.如权利要求3所述核酸分析卡盒,其特征在于,所述反应单元(100)中,所述反应室(1000)包括经所述连接管道(101)依次连通的裂解室(1001)、洗涤室(1002)和扩增室(1004);所述裂解室(1001)设有裂解液储液腔(111),所述裂解液储液腔(111)顶部设置裂解液与油相进样孔(121);所述洗涤室(1002)设有洗涤液储液腔(112),所述洗涤液储液腔(112)顶部设置洗涤液进样孔(122);所述扩增室(1004)设有扩增试剂储液腔(114),所述扩增试剂储液腔(114)顶部设置扩增试剂进样孔(124);
和/或,所述反应单元(100)中,所述储液腔(110)的侧壁底部连通所述连接管道(101),所述连接管道(101)自储液腔(110)端起缩径设置,以使所述储液腔(110)的侧壁与所述连接管道主体平滑连接;
和/或,所述储液腔(110)和所述连接管道(101)内设有油性液体;
和/或,所述基底(200)与所述卡盒主体(10)密封连接以形成所述储液腔(110)的腔底。
5.如权利要求4所述核酸分析卡盒,其特征在于,所述洗涤室(1002)包括若干经所述连接管道(101)串联相通的洗涤分室。
6.如权利要求4所述核酸分析卡盒,其特征在于,所述洗涤分室包括底部经所述连接管道(101)串联相通的第一洗涤分室(10021)和第二洗涤分室(10022);
所述第一洗涤分室(10021)设有第一洗涤液储液分腔(1121),所述第一洗涤液储液分腔(1121)顶部设置第一洗涤液进样孔(1221);
所述第二洗涤分室(10022)设有第二洗涤液储液分腔(1122),所述第二洗涤液储液分腔(1122)顶部设置第二洗涤液进样孔(1222)。
7.如权利要求4所述的核酸分析卡盒,其特征在于,所述裂解液储液腔(111)的容积大于或等于所述扩增试剂储液腔(114)的容积;
和/或,所述裂解液储液腔(111)的容积大于或等于所述洗涤液储液腔(112)的容积;
和/或,所述洗涤液储液腔(112)的容积大于或等于所述扩增试剂储液腔(114)的容积。
8.如权利要求4所述的核酸分析卡盒,其特征在于,所述裂解液储液腔(111)的容积范围为100μL-2000μL,所述洗涤液储液腔(112)的容积范围为50μL-1000μL,所述扩增试剂储液腔(114)的容积范围为50μL-500μL。
9.如权利要求4所述核酸分析卡盒,其特征在于,所述封闭膜(400)包括用于封闭所述洗涤液进样孔(122)、所述扩增试剂进样孔(124)的第一封闭膜区(401)和用于封闭所述裂解液与油相进样孔(121)的第二封闭膜区(402)。
10.如权利要求6所述核酸分析卡盒,其特征在于,所述油性液体选自矿物油、橄榄油、石蜡油中的一种或多种;
和/或,所述储液腔(110)内还设有水性溶液,所述水性溶液选自裂解液、洗涤液、扩增试剂中的任意一种;
和/或,所述第二洗涤液储液分腔(1122)内还设有PEG8000水溶液,所述PEG8000水溶液包括质量百分比为5%-20%的PEG8000,优选地,所述PEG8000在所述PEG8000水溶液中的质量百分比为13%;
和/或,所述的油性液体密度低于水溶液,且和水性溶液不相容。
11.一种核酸提取及分析方法,其特征在于,采用权利要求1-10任一所述的核酸分析卡盒,所述方法包括以下步骤:
将矿物油填充到卡盒主体(10)的储液腔(110)中,得到装有矿物油的储液腔(110);
将裂解液、洗涤液、扩增试剂注入对应的所述装有矿物油的储液腔(110),分别形成裂解液试剂液滴(131)、洗涤液1试剂液滴(132)、洗涤液2试剂液滴(133)、扩增试剂液滴(134),其中,所述裂解液中包含磁珠(141);
将样品加入到所述卡盒主体(10)中装有矿物油的裂解液储液腔(111)内,用封闭膜(400)封闭,通过横向移动磁珠转移部件(300)使所述样品、磁珠(141)和裂解液试剂液滴(131)混合,静置,得到结合有核酸分子的磁珠(141);
通过纵向移动所述磁珠转移部件(300),将所述结合有核酸分子的磁珠(141)移动至装有矿物油的第一洗涤液储液分腔(1121)中,通过横向移动所述磁珠转移部件(300)使所述结合有核酸分子的磁珠(141)与所述洗涤液1试剂液滴(132)混合,洗去所述结合有核酸分子的磁珠(141)移动时携带的杂质,得到洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠(141);
继续纵向移动所述磁珠转移部件(300),将所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠(141),移动至装有矿物油的第二洗涤液储液分腔(1122)中,通过横向移动所述磁珠转移部件(300)使所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠(141)与所述洗涤液2试剂液滴(133)混合,洗去所述洗涤一次的所述结合有核酸分子的磁珠(141)移动时携带的杂质,得到待扩增的磁珠(141);
继续纵向移动所述磁珠转移部件(300),将所述待扩增的磁珠(141)移动至所述卡盒主体(10)的装有矿物油的扩增试剂储液腔(114)中,通过横向移动所述磁珠转移部件(300)使所述待扩增的磁珠(141)与所述扩增试剂液滴(134)混合,核酸分子被洗脱下来进行扩增反应,得到待检测核酸分析卡盒;
将所述待检测核酸分析卡盒放置在荧光显微镜下观测其扩增结果,也可在其它适配仪器中监测其实时荧光变化。
12.如权利要求1-10任一所述的核酸分析卡盒在制备分子诊断产品中的用途。
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CN117264750A (zh) * | 2023-11-23 | 2023-12-22 | 中国科学院空天信息创新研究院 | 检测卡盒及其使用方法 |
CN117568160A (zh) * | 2024-01-16 | 2024-02-20 | 浙江大学 | 一种集成核酸提取与数字式检测装置及其使用方法 |
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